CN106526000A - 升麻葛根汤组合物指纹图谱的建立方法及指纹图谱 - Google Patents

Abstract

本发明公开了升麻葛根汤组合物的质量控制方法，属于中药分析领域。本发明方法采用高效液相色谱法建立指纹图谱，色谱条件为：色谱柱采用十八烷基硅烷键合硅胶色谱柱；流速0.9ml/min～1.1ml/min；柱温：25℃～35℃；检测仪器采用紫外检测器，检测波长210nm～250nm；理论塔板数以葛根素峰计不低于4000；参照物溶液为大豆苷的甲醇溶液；流动相为乙腈‑0.1％磷酸溶液为***，按如下顺序进行梯度洗脱：

Description

升麻葛根汤组合物指纹图谱的建立方法及指纹图谱

技术领域

本发明属于重要分析领域，具体涉及升麻葛根汤组合物的指纹图谱。

背景技术

升麻葛根汤组合物由升麻、葛根、白芍、炙甘草四味中药组成，具有辛凉解肌，透疹解毒的功效；现代临床除治疗麻疹外，亦用于治疗疱疹，水痘，急性痢疾、肝炎等病症，另外本方作为小儿的沿用方，对感冒高热发冷的老人、小儿疗效甚佳。为了更全面、有效的控制本中药组合物的质量控制水平，和国际接轨，让临床用药安全及疗效更加有所保证，需要对本中药组合物采用更为先进的质量控制手段。

由于中药及其复方制剂均为多组分复杂体系，因此评价其质量应采用与之相适应的，能提供丰富鉴别信息的检测方法，但现行的显微鉴别、理化鉴别和含量测定等方法都不足以解决这一问题。中药指纹图谱是指某些中药材或中药剖剂经适当处理后，采用一定的分析手段，得到的能够标示其化学特征的色谱图或光谱图。中药指纹图谱是一种综合的，可量化的鉴定手段，能较为全面地反映中药及其制剂中所含化学，成分的种类与数量进而对药品质量进行整体描述和评价。所以，中药指纹图谱已经成为目前国际上较为先进的中药质量控制手段。美国食品药品管理局(FDA)植物药产品工业指南、WHO草药评价指南中均指出，如果草药制剂的活性成分不能鉴别，可以通过指纹图谱(fingerprint spectrum)证明产品质量的一致。欧共体在草药质量指南注释中也指出，草药及其制剂是以整体作为有效物质，因此，草药的质量稳定性仅靠测定己知的有效成分是不够的，应该通过指纹图谱显示其所含的各种成分。印度草药典、英国草药典、德国药用植物协会、加拿大药用及芳香植物协会等，也接受用指纹图谱来保证有效成分未明的草药产品质量的一致性。目前国家药品监督管理局对中药注射剂己要求具有相关的指纹图谱，对提高中药注射剂的质量起到了关键作用，但对其他剂型的中药尚没有强制性要求。

中药指纹图谱包括中药化学指纹图谱、蛋白指纹图谱、DNA指纹图谱及生物效应指纹图谱等。通常说的指纹图谱是指化学指纹图谱，是中药材、中药提取物或中成药经适当处理后，采用一定分析手段，得到的能够标示该中药主要化学成分特性的色谱或光谱。

中药化学指纹图谱可以分为中药光谱指纹图谱，如红外光谱(IR)、紫外光谱(UV)、X射线衍射图谱等；色谱指纹图谱，如薄层色谱(TLC)、气相色谱(GC)、高效液相色谱(HPLC)、毛细管电泳图谱(CE)等；波谱指纹图谱，如质谱(MS)、核磁共振波谱(NMR)等；DNA指纹图图谱；以及采用多种现代分析仪器联用得到的多维多息特征谱(characteristicfingerprint of muhrdimension andmuhrdata)，如HPLC/MS、HPLC/Ms/MS、GC/MS、CE/MS等。

中药指纹图谱研究方法虽然较多，但色谱学方法应是主流方法，尤其是TLC，HPLC和GC色谱技术，已经成为大家所公认的三种常规的分析手段，是目前研究中药指纹图谱应优先考虑的方法。

中药指纹图谱有两个作用：一是通过指纹图谱的特征性，能有效鉴别中药材的真伪或产地：二是通过指纹图谱主要特征峰的面积或比例的制定，能有效控制产品的质量，确保产品质量的相对一致。

中药指纹图谱的制作和应用常包括：(1)采集具有代表性的中药样品，采取适当的方法制备供试品溶液，并选用适当的标准标准品(参照物)，进行分析方法的优选；(2)根据确定的分析方法，对一定批次的中药样品进干了分离分析，将所得的多批次数据进行处理，得到标准指纹图谱；(3)将样品按照与标准指纹图谱制作相同的方法进行样品处理、分离分析后，将所得的指纹图谱与标准指纹图谱进行相似度比较，一般相以度达到80％以上即可视为该样品为合格。相似度的计算和评价方法通常采用相关系数与相合系数或夹角余弦法。我国中南大学、浙江大学等单位提据以上方法，编制了相应的计算机软件用于完成相假度评价，其中以国家药典委员会推荐的“中药色谱指纹图谱相似度评价***”应用较多。因此采用指纹图谱技术全面反映组合物的整体特征，并进一步与其活性相关联，对于完善目前的质量控制方法，保证临床用药的安全有效是十分必要的。目前，关于升麻葛根汤组合物的指纹图谱的研究尚未有文献公开报道更没有建立升麻葛根汤的指纹图谱，从质量控制方面，有关升麻葛根汤组合物的标准指纹图谱亦没有报道。

发明内容

因此，本发明要解决的技术问题在于克服现有技术中的没有关于升麻葛根汤组合物的指纹图谱以及建立升麻葛根汤组合物的指纹图谱的文献报道的缺陷，从而提供一种升麻葛根汤组合物指纹图谱的建立方法及指纹图谱。

为此，本发明提供如下技术方案：

升麻葛根汤组合物的指纹图谱的建立方法包括采用高效液相色谱法建立升麻葛根汤组合物指纹图谱，色谱条件为：

色谱柱采用十八烷基硅烷键合硅胶色谱柱；

流速0.9ml/min～1.1ml/min；柱温：25℃～35℃；

检测仪器采用紫外检测器，指纹图谱的检测波长210nm～250nm；

理论塔板数以葛根素峰计不低于4000；

参照物溶液为大豆苷的甲醇溶液；

流动相为乙腈-0.1％磷酸溶液为***，按如下顺序进行梯度洗脱：

所述升麻葛根汤组合物是通过如下两种方法制备得到：

(1)分别称取升麻2g、葛根3g、白芍2g、炙甘草2g饮片，剪切成约2mm～8mm左右的粗颗粒，置于2L煎药砂锅中，加300ml水，浸泡30分钟，加盖煎煮，于220V的电压下加热至沸腾10分钟，于170V电压下保持微沸至药液约100ml，滤除药渣，即得第一升麻葛根汤组合物；或

(2)按照重量份计称取如下饮片升麻666.7g，葛根1000g，白芍666.7g，炙甘草666.7g，切制成粒度2mm～8mm的粗颗粒，加水12倍量水，煎煮30min，滤过，然后将滤液减压浓缩至稠膏，加麦芽糊精，干燥，混匀，加硬脂酸镁，干压颗粒，制成1000g，即得第二升麻葛根汤组合物。

所述指纹图谱包括21个共有峰：

1号峰相对保留时间RRT为8.944，2号峰相对保留时间RRT为14.111，3号峰相对保留时间RRT为20.583，4号峰相对保留时间RRT为24.036，5号峰相对保留时间RRT为27.333，6号峰相对保留时间RRT为32.806，7号峰相对保留时间RRT为37.305，8号峰相对保留时间RRT为40.061，9号峰相对保留时间RRT为42.859，10号峰相对保留时间RRT为45.699，11号峰相对保留时间RRT为54.817，S峰相对保留时间RRT为61.159，13号峰相对保留时间RRT为67.543，14号峰相对保留时间RRT为70.776，15号峰相对保留时间RRT为73.526，16号峰相对保留时间RRT为80.076，17号峰相对保留时间RRT为83.260，18号峰相对保留时间RRT为86.766，19号峰相对保留时间RRT为91.200，20号峰相对保留时间RRT为98.200，21号峰相对保留时间RRT为111.034，其中，12号S峰是参照物的色谱峰。

用于高效液相色谱测定的供试品溶液采用水作为溶剂，参照物溶液采用甲醇作溶剂。

参照物溶液的制备过程为：取大豆苷对照品适量，加甲醇配制成1ml甲醇含大豆苷200μg的参照物溶液。

供试品溶液的制备过程为：取第一升麻葛根汤组合物5ml，离心，取上清液，即得；或取第二升麻葛根汤组合物1.5g，置50ml容量瓶中，加水稀释，超声溶解，放冷，再加水定容，摇匀，取溶液，离心，取上清液，即得。

进样量为10μl，所述指纹图谱的检测波长为210nm～250nm。

升麻葛根汤组合物的指纹图谱采用高效液相色谱法，色谱条件为：

色谱柱采用十八烷基硅烷键合硅胶色谱柱；

流速0.9ml/min～1.1ml/min；柱温：25℃～35℃；

理论塔板数以葛根素峰计不低于4000；

参照物溶液为大豆苷的甲醇溶液；

流动相为乙腈-0.1％磷酸溶液为***，按如下顺序进行梯度洗脱：

所述检测波长为210nm～250nm。

所述指纹图谱包括21个共有峰：

1号峰相对保留时间RRT为8.944，2号峰相对保留时间RRT为14.111，3号峰相对保留时间RRT为20.583，4号峰相对保留时间RRT为24.036，5号峰相对保留时间RRT为27.333，6号峰相对保留时间RRT为32.806，7号峰相对保留时间RRT为37.305，8号峰相对保留时间RRT为40.061，9号峰相对保留时间RRT为42.859，10号峰相对保留时间RRT为45.699，11号峰相对保留时间RRT为54.817，S峰相对保留时间RRT为61.159，13号峰相对保留时间RRT为67.543，14号峰相对保留时间RRT为70.776，15号峰相对保留时间RRT为73.526，16号峰相对保留时间RRT为80.076，17号峰相对保留时间RRT为83.260，18号峰相对保留时间RRT为86.766，19号峰相对保留时间RRT为91.200，20号峰相对保留时间RRT为98.200，21号峰相对保留时间RRT为111.034，其中，12号S峰是参照物的色谱峰。

本发明技术方案，具有如下优点：

1、本发明提供的升麻葛根汤组合物指纹图谱，全面反映出升麻葛根汤组合物的质量信息，从而能够达到更加全面、有效地控制升麻葛根汤组合物制剂产品质量的目的。

2、本发明提供的升麻葛根汤组合物指纹图谱的建立方法采用国家药典委员会提供的中药色谱指纹图谱相似度评价***对所测指纹图谱进行辨认，操作方便、快捷；而且，以此得出的相以度结果对制剂指纹图谱进行评价，结论较为客观、准确。

3、本发明提供的升麻葛根汤组合物指纹图谱的建立方法参照中药注射剂指纹图谱的要求，对本发明涉及的指纹图谱进行了研究，经过对供试品制备方法的考察及测定指纹图谱的仪器，色谱柱、流动相、检测波长等条件进行***的优选，建立了指纹图谱测定条件并进行了方法学考察，在对多批本中药组合物指纹图谱检测结果的基础上，逐渐积累数据，提出了标准指纹图谱，作为本品指纹图谱标准，从而达到能够更全面、有效地控制制剂质量的目的。

4、本发明对所测得的指纹图谱的辨认采用国家药典委员会提供中药色谱指纹图谱相似度评价***作为本中药组合物指纹图谱相似度计算软件，经多次试验研究，通过与计算相对保留时间及相对峰面积的方法相比较，所得出的评价结论基本一致，使用中药色谱指纹图谱相似度评价***评价指纹图谱的相似度，操作方便、快捷，以其得出的相似度结果，对制剂指纹图谱进行评价，结论较为客观、准确。

附图说明

为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1是多波长检测结果；

图2是200～400nm扫描光谱3D图；

图3是色谱线由下至上：215nm、220nm、225nm、230nm、240nm、250nm；

图4是200～400nm扫描光谱3D图；

图5是两种溶剂***的色谱对比图；

图6是供试品溶液色谱图；

图7是供试品溶液色谱图；

图8是供试品溶解溶剂考察色谱对比图；

图9是参照物色谱峰与供试品溶液色谱峰对比图；

图10指纹图谱测定中200～400nm扫描光谱3D图；

图11指纹图谱测定中的大豆苷参照物溶液色谱图

图12指纹图谱测定中的对照指纹图谱

图13连续四批样品指纹图谱对比色谱图

图14是完整性试验色谱图；

具体实施方式

提供下述实施例是为了更好地进一步理解本发明，并不局限于所述最佳实施方式，不对本发明的内容和保护范围构成限制，任何人在本发明的启示下或是将本发明与其他现有技术的特征进行组合而得出的任何与本发明相同或相近似的产品，均落在本发明的保护范围之内。

实施例中未注明具体实验步骤或条件者，按照本领域内的文献所描述的常规实验步骤的操作或条件即可进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规试剂产品。

本发明试药及仪器：

试药：

升麻葛根汤组合物(实验室自制，制备方法见实施例2)；

异阿魏酸(批号：111698-201103中国药品生物制品检定研究院，纯度99.2％)；

芍药苷(批号：110736-201136，中国药品生物制品检定研究院，纯度96.0％)；

葛根素(批号：110752-201418，中国药品生物制品检定研究院，纯度95.5％)；

甘草酸铵对照品(批号：110731-201418，中国药品生物制品检定研究院，93.1％)，

甘草苷对照品(批号：111610-201106，中国药品生物制品检定研究院，纯度93.7％)，

升麻素(批号：111710-200602，中国药品生物制品检定研究院)，

大豆苷元对照品(批号：111502-2004021，中国药品生物制品检定研究院)，

大豆苷对照品(批号：111738-201302，中国药品生物制品检定研究院)，

芍药内酯苷对照品(批号：GR-133-141025，南京广洞生物制品有限公司，纯度98.0％)，

升麻(批号：160220，产地：吉林)；

葛根(批号：160222，产地：湖北)；

白芍(批号：160223，产地：安徽)；

炙甘草(批号：160221，产地：新疆)。试剂为分析纯，水为超纯水。

仪器：Agilent 1260高效液相色谱仪(1290DAD检测器)

Waters E2695高效液相色谱仪(2998DAD检测器)

实施例1.配制对照品溶液

异阿魏酸对照品溶液取异阿魏酸对照品适量，精密称定，置棕色量瓶中，加10％乙醇制成每1ml含异阿魏酸20μg的溶液，即得。

升麻素对照品溶液取升麻素对照品适量，精密称定，置棕色量瓶中，加10％乙醇制成每1ml含异阿魏酸80μg的溶液，即得。

芍药苷对照品溶液取芍药苷对照品适量，精密称定，加甲醇制成每1ml含60μg的溶液，即得。

芍药内酯苷对照品溶液取芍药内酯苷对照品适量，精密称定，置棕色量瓶中，加10％乙醇制成每1ml含异阿魏酸50μg的溶液，即得。

葛根素对照品溶液取葛根素对照品适量，精密称定，加30％乙醇制成每1ml含80μg的溶液，即得。

大豆苷元对照品溶液取葛根素对照品适量，精密称定，加甲醇制成每1ml含70μg的溶液，即得。

大豆苷对照品溶液取大豆苷对照品适量，精密称定，加甲醇制成每1ml含70μg的溶液，即得。

甘草苷对照品溶液取甘草苷对照品适量，精密称定，加70％乙醇分别制成每1ml含甘草苷20μg的溶液，即得。

甘草酸铵对照品溶液取甘草酸铵对照品适量，精密称定，加70％乙醇分别制成每1ml含甘草酸铵0.2mg的溶液，即得。

混合对照品溶液：分别吸取上述对照品1ml置5ml容量瓶中，混匀，即得。

实施例2.升麻葛根汤组合物的制备

第一升麻葛根汤组合物：称取如下重量配比的四味饮片：升麻300g；葛根450g；白芍300g；炙甘草300g，剪切成约2mm～8mm左右的粗颗粒，分别称取9g(升麻2g、葛根3g、白芍2g、炙甘草2g)置于2L煎药砂锅中，加300ml水，浸泡30分钟，加盖煎煮，加热(电压值约220V)至沸腾(约10分钟)，保持微沸(电压值约170V)至药液约100ml(约38分钟)，采用两层医用纱布滤除药渣，即得。

第二升麻葛根汤组合物：按照重量份计称取如下饮片升麻666.7g，葛根1000g，白芍666.7g，炙甘草666.7g，切制成粒度2mm～8mm的粗颗粒，加水12倍量水，煎煮30min，滤过，得滤液，将滤液减压浓缩至稠膏，加适量的麦芽糊精，干燥，混匀，加适量硬脂酸镁，干压颗粒，制成1000g，即得。组合物②采用聚酯镀铝/聚乙烯复合膜，包装规格为3.0g/袋。

实施例3：色谱条件的选择

(1)检测波长的选择

以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂：以甲醇为流动相A，0.1mol/L磷酸为流动相B，按照下表，进行梯度洗脱，进样量10μl，流速：1.0ml/min，柱温：30℃。梯度程序如下。

表1梯度洗脱程序1

采用HPLC多波长检测技术，检测波长分别为λ＝316、λ＝290，λ＝270，λ＝250，λ＝237，λ＝230，以色谱峰数、分离度等评价，所得结果见图1，2。

由3D光谱扫描图可知，升麻葛根汤煎液中所含大部分物质处于末端吸收(210nm～250nm)，结合图1所考察的波长可知，在尽可能的选择紫外末端波长能较全面的反应煎液的指纹信息，在优化色谱梯度条件下在210nm～250nm的波长范围内对多个波长进行进一步的考察，结果见图3，4。

综上可知，检测波长为220nm时，不仅基线平稳，色谱峰指认信息也更多，因此选择指纹图谱的检测波长为220nm。

(2)流动相组成的考察

由于组合物采用水提取，浸出成分往往极性较大，且四味饮片成分多为黄酮类、苷类等，极性亦较大。结合HPLC采用的常用流动相组成，分别对甲醇—水、乙腈—水***进行考察。试验结果见图5。

试验结果表明：乙腈—水***在色谱峰个数，色谱峰分离上均较甲醇—水***好，因此选择乙腈—水***进行色谱梯度优化研究。

(3)流动相比例的优化

在乙腈—水***的基础上，在其余条件均相同的情况下，对梯度洗脱程序进行优化研究。通过流动相梯度不断的调整和优化，试验结果见表2、3、图6、7。

色谱优化条件一：

表2梯度洗脱程序2

由图可知，色谱峰大部分分离度较好，但在保留时间37min、60min左右色谱峰分离较差，有必要进一步的优化。

色谱优化条件二：

表3梯度洗脱程序1

实施例4：供试品溶剂考察

溶剂、温度是影响物质溶解度的重要因素，相同的物质在不同溶剂中溶解度存在差异，相同溶剂中物质的溶解度随温度的升高而增大。升麻葛根汤组合物①在提取过程中温度较高，物质的溶解度相对较高，当冷却至室温后，部分物质因溶解度减少将析出，造成组合物①呈现一定的沉淀或混悬物，此沉淀或混悬物作为组合物组成的一部分，应该对其质量进行相应的研究，同时供试品溶液的制备过程应该考虑此部分物质的保留。

按制备方法制备第一升麻葛根汤组合物，冷却至30℃～35℃之间，分别按照系列方式制备供试品溶液：①直接离心进样(原液)：取第一升麻葛根汤组合物适量，12000r/min离心10min，取上清液进样，进样量10μl，即得。②30％甲醇、50％甲醇、70％甲醇作溶剂：分别精密量取5ml第一升麻葛根汤组合物置于10ml容量瓶中，分别加入甲醇3ml、5ml，摇匀，加水至刻度，分别作为30％、50％甲醇溶剂，精密量取3ml第一升麻葛根汤组合物置于10ml容量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，作为70％的甲醇溶剂；分别取上述三种溶液适量，12000r/min离心10min，取上清液进样，进样量20μl，即得。试验结果见图8.

由图8可知，四种方式处理的供试品在色谱峰分离、峰数上均一致，考虑到组合物本身采用水提取，水作为溶剂更能反应组合物本身的成分属性，因此选择指纹图谱供试品溶液的溶解溶剂为水。

实施例5.参照物的选择

参照物在指纹图谱中主要用于辨认和评价指纹图谱特征的指引，不等同于含量测定的对照品。按照《中药质量标准研究制定技术要求》指纹图谱的参照物一般选取容易获取的一个或一个以上制剂中的主要活性成分或指标成分，用于考察指纹图谱的稳定程度和重现性。中药复方制剂的参照物首选君药的活性成分或指标成分，而参照物应为保留时间适中、峰面积大小合适、分离稳定的色谱峰。

参照物溶液的制备：取异阿魏酸、阿魏酸、葛根素、芍药苷、甘草苷、芍药内酯苷、升麻素、大豆苷元、大豆苷、甘草酸铵对照品适量，加甲醇制备成每1ml含有异阿魏酸74.4μg、阿魏酸72.0μg、葛根素74.6μg、芍药苷77.4μg、甘草苷67.5μg、芍药内酯苷77.6μg、升麻素81.1μg、大豆苷73.1μg、大豆苷元56μg、甘草酸铵74.0μg的对照品溶液，即得。

由图9可知：在供试品溶液中大豆苷、甘草苷、甘草酸铵均能良好的分离，其中芍药内酯苷、大豆苷元因供试品种含量较低，色谱峰面积较小；芍药苷、葛根素在色谱图中没有得到较好分离；升麻素、异阿魏酸、阿魏酸三者因结构相似在色谱图中保留时间比较接近，因此分离情况不佳，且三者在供试品溶液中的峰面积均较小，均不适合作为参照物。大豆苷来源于葛根饮片，葛根为方中臣药，大豆苷在色谱图中保留时间、峰面积适中，且前后无干扰峰，最终确定大豆苷作为指纹图谱参照物。

实施例6.共有峰确定及对照指纹图谱的建立.

采用同一批次饮片，制备升麻葛根汤组合物①10份，分别升麻葛根汤组合物①供试品溶液，按指纹图谱测定法测定，记录图谱。通过分析，确定其共有特征峰为21个(见附图10-12)，所述的21个共有特征峰的相对保留时间偏差RSD均小于2％，即：

1号峰平均相对保留时间RRT为7.642，RSD％为0.41％；

2号峰平均相对保留时间RRT为9.853，RSD％为0.49％；

3号峰平均相对保留时间RRT为16.126，RSD％为0.33％；

4号峰平均相对保留时间RRT为22.259，RSD％为0.23％；

5号峰平均相对保留时间RRT为26.222，RSD％为0.37％；

6号峰平均相对保留时间RRT为28.988，RSD％为0.44％；

7号峰平均相对保留时间RRT为35.621，RSD％为0.21％；

8号峰平均相对保留时间RRT为39.980，RSD％为0.38％；

9号峰平均相对保留时间RRT为42.276，RSD％为0.41％；

10号峰平均相对保留时间RRT为45.416，RSD％为0.53％；

11号峰平均相对保留时间RRT为48.500，RSD％为0.51％；

12号峰平均相对保留时间RRT为59.605，RSD％为0.19％；

13号峰平均相对保留时间RRT为65.159，RSD％为0.25％；

14号峰平均相对保留时间RRT为70.071，RSD％为0.18％；

15号峰平均相对保留时间RRT为73.203，RSD％为0.15％；

16号峰平均相对保留时间RRT为75.359，RSD％为0.05％；

17号峰平均相对保留时间RRT为80.548，RSD％为0.10％；

18号峰平均相对保留时间RRT为85.038，RSD％为0.09％；

19号峰平均相对保留时间RRT为92.278，RSD％为0.08％；

20号峰平均相对保留时间RRT为99.758，RSD％为0.06％；

21号峰平均相对保留时间RRT为110.939，RSD％为0.03％；

其中，12号S峰是参照物的色谱峰。

运用中药色谱指纹图谱相似度评价软件(2012年版)处理图谱，以160511-1作为参照图谱，得到升麻葛根汤组合物①对照指纹图谱。采用夹角余弦法计算样品相似度，结果表明，煎煮的10份升麻葛根汤组合物①相似度在0.983～1.000之间，相似度较高。

表4 10份升麻葛根汤组合物①相似度评价结果

根据10批供试品溶液色谱图所给出的相关参数，选择具有特征性的21共有峰，以12号参照峰峰面积作为1，计算其他各共有特征指纹峰峰面积的比值，结果见表5。

表5 10份升麻葛根汤组合物①共有峰面积比值结果

取第一升麻葛根汤组合物所对应的饮片，制备连续三批次第二升麻葛根汤组合物样品，按指纹图谱测定方法测定，记录色谱图(见附图13)，以第一升麻葛根汤组合物生成的对照指纹图谱作为随行对照图谱，计算3批次第二升麻葛根汤组合物的相似度。结果见下表。

第二升麻葛根汤组合物相似度计算结果

实施例7.指纹图谱方法学验证.

1空白试验

为考察供试品溶解溶剂对指纹图谱中各色谱峰的干扰，进行空白试验。按拟定方法，进样10μl去离子水运行梯度，记录色谱图，结果表明空白样品基线平稳、基本无干扰。

2完整性试验

按拟定条件记录120min的色谱图后，再继续运行120min，并记录色谱图(见图14)。可见升麻葛根汤组合物120min后未见色谱峰，确定梯度运行120min。

3重复性试验

按照供试品溶液制备方法，制备6份供试品溶液，分别进样10μl，记录色谱图，采用中药色谱指纹图谱相似度评价***计算相似度，RSD值，所得结果见表6.

表6重复性试验相似度结果

试验结果表明：该方法重复性良好。

4供试品溶液稳定性

取供试品溶液，分别于0h、2h、4h、8h、16h、24h、36h时间点进样，记录色谱图，计算相似度及RSD值，所得结果见表7.

表7供试品稳定性试验相似度结果

试验结果表明：供试品溶液在36h以内相对标准偏差小于3％，稳定性良好。

显然，上述实施例仅仅是为清楚地说明所作的举例，而并非对实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。而由此所引伸出的显而易见的变化或变动仍处于本发明创造的保护范围之中。

Claims (10)

1.升麻葛根汤组合物的指纹图谱的建立方法，其特征在于，包括采用高效液相色谱法建立升麻葛根汤组合物指纹图谱，色谱条件为：

色谱柱采用十八烷基硅烷键合硅胶色谱柱；

流速0.9ml/min～1.1ml/min；柱温：25℃～35℃；

检测仪器采用紫外检测器，指纹图谱的检测波长210nm～250nm；

理论塔板数以葛根素峰计不低于4000；

参照物溶液为大豆苷的甲醇溶液；

流动相为乙腈-0.1％磷酸溶液为***，按如下顺序进行梯度洗脱：

2.根据权利要求1所述的指纹图谱的建立方法，所述升麻葛根汤组合物是通过如下两种方法制备得到：

(1)分别称取升麻2g、葛根3g、白芍2g、炙甘草2g饮片，剪切成约2mm～8mm左右的粗颗粒，置于2L煎药砂锅中，加300ml水，浸泡30分钟，加盖煎煮，于220V的电压下加热至沸腾10分钟，于170V电压下保持微沸至药液约100ml，滤除药渣，即得第一升麻葛根汤组合物；或

(2)按照重量份计称取如下饮片升麻666.7g，葛根1000g，白芍666.7g，炙甘草666.7g，切制成粒度2mm～8mm的粗颗粒，加水12倍量水，煎煮30min，滤过，然后将滤液减压浓缩至稠膏，加麦芽糊精，干燥，混匀，加硬脂酸镁，干压颗粒，制成1000g，即得第二升麻葛根汤组合物。

3.根据权利要求2所述的指纹图谱的建立方法，其特征在于，所述指纹图谱包括21个共有峰：

1号峰相对保留时间RRT为8.944，2号峰相对保留时间RRT为14.111，3号峰相对保留时间RRT为20.583，4号峰相对保留时间RRT为24.036，5号峰相对保留时间RRT为27.333，6号峰相对保留时间RRT为32.806，7号峰相对保留时间RRT为37.305，8号峰相对保留时间RRT为40.061，9号峰相对保留时间RRT为42.859，10号峰相对保留时间RRT为45.699，11号峰相对保留时间RRT为54.817，S峰相对保留时间RRT为61.159，13号峰相对保留时间RRT为67.543，14号峰相对保留时间RRT为70.776，15号峰相对保留时间RRT为73.526，16号峰相对保留时间RRT为80.076，17号峰相对保留时间RRT为83.260，18号峰相对保留时间RRT为86.766，19号峰相对保留时间RRT为91.200，20号峰相对保留时间RRT为98.200，21号峰相对保留时间RRT为111.034，其中，12号S峰是参照物的色谱峰。

4.根据权利要求3所述的指纹图谱的建立方法，其特征在于，用于高效液相色谱测定的供试品溶液采用水作为溶剂，参照物溶液采用甲醇作溶剂。

5.根据权利要求4所述的指纹图谱的建立方法，其特征在于，参照物溶液的制备过程为：取大豆苷对照品适量，加甲醇配制成1ml甲醇含大豆苷200μg的参照物溶液。

6.根据权利要求5所述的指纹图谱的建立方法，其特征在于，供试品溶液的制备过程为：取第一升麻葛根汤组合物5ml，离心，取上清液，即得；或取第二升麻葛根汤组合物1.5g，置50ml容量瓶中，加水稀释，超声溶解，放冷，再加水定容，摇匀，取溶液，离心，取上清液，即得。

7.根据权利要求6所述的指纹图谱的建立方法，其特征在于，进样量为10μl，所述指纹图谱的检测波长为210nm～250nm。

8.升麻葛根汤组合物的指纹图谱，其特征在于，采用高效液相色谱法，色谱条件为：

色谱柱采用十八烷基硅烷键合硅胶色谱柱；

流速0.9ml/min～1.1ml/min；柱温：25℃～35℃；

理论塔板数以葛根素峰计不低于4000；

参照物溶液为大豆苷的甲醇溶液；

流动相为乙腈-0.1％磷酸溶液为***，按如下顺序进行梯度洗脱：

9.根据权利要求8所述的升麻葛根汤组合物的指纹图谱，其特征在于，所述检测波长为210nm～250nm。

10.根据权利要求9所述的升麻葛根汤组合物的指纹图谱，其特征在于，所述指纹图谱包括21个共有峰：

1号峰相对保留时间RRT为8.944，2号峰相对保留时间RRT为14.111，3号峰相对保留时间RRT为20.583，4号峰相对保留时间RRT为24.036，5号峰相对保留时间RRT为27.333，6号峰相对保留时间RRT为32.806，7号峰相对保留时间RRT为37.305，8号峰相对保留时间RRT为40.061，9号峰相对保留时间RRT为42.859，10号峰相对保留时间RRT为45.699，11号峰相对保留时间RRT为54.817，S峰相对保留时间RRT为61.159，13号峰相对保留时间RRT为67.543，14号峰相对保留时间RRT为70.776，15号峰相对保留时间RRT为73.526，16号峰相对保留时间RRT为80.076，17号峰相对保留时间RRT为83.260，18号峰相对保留时间RRT为86.766，19号峰相对保留时间RRT为91.200，20号峰相对保留时间RRT为98.200，21号峰相对保留时间RRT为111.034，其中，12号S峰是参照物的色谱峰。