CN104749306B - 一种构建淫羊藿提取物的指纹图谱的方法 - Google Patents
一种构建淫羊藿提取物的指纹图谱的方法 Download PDFInfo
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Abstract
本发明属于中药制剂领域，具体涉及一种淫羊藿药材的提取物的指纹图谱的构建方法。本发明所述构建淫羊藿提取物的指纹图谱的方法针对性的开发了适用于淫羊藿提取物的构建方法，确定其共有指纹特征，得到标准指纹图谱。本方法简便、稳定、精密度高，重复性好，能有效地用于淫羊藿提取物的质量控制。
Description
技术领域
本发明属于中药制剂领域，具体涉及一种构建淫羊藿药材的提取物的指纹图谱的方法。
背景技术
淫羊藿是小檗科淫羊藿属的植物，是中医的常用中药材，一般为淫羊藿（EpimediumbrevicornuMaxim.）、箭叶淫羊藿（Epimediumsagittatum(Sieb.etZucc)Maxim.）、柔毛淫羊藿（EpimediumpubescensMaxim.）或朝鲜淫羊藿（EpimediumkorenumNakai）的干燥叶。
药理研究表明，淫羊藿具有补肾阳、强筋骨、祛风湿的作用。而随着中药提取技术的日益发展，淫羊藿的提取物作为淫羊藿药材的加工产物，逐渐成为众多中药制剂的重要原料。
目前，淫羊藿提取物多采用溶剂提取后经树脂纯化所得，且具有较好的药用价值。然而受限于关于淫羊藿提取物的检测手段较为单一，基本以测定指标成分的含量为主，也使得关于淫羊藿提取物的质量控制的方法较为单一。然而，由于中药提取物作为中药材的加工产物，是由众多的化合物组成的复杂体系，仅由单个或数个成分的检测是难以全面反映中药提取物的质量情况，这也成为了中药质量检测的难题。
中药指纹图谱技术是一种控制中药质量的现代化关键技术，在国际上已经得到认可，其最大的特点在于能全面的反映中药的整体化学信息，从而达到控制中药质量的目的。因此，为中药材、中药提取物、中药制剂建立相应的指纹图谱，是现阶段控制中药质量的有效手段，也为解决淫羊藿提取物的质量控制提供了有效途径。
发明内容
为此，本发明所要解决的技术问题在于提供一种构建淫羊藿提取物的指纹图谱的方法，并利用指纹图谱技术对所述淫羊藿提取物的质量进行有效控制。
本发明还提供了一种构建淫羊藿提取物的指纹图谱的方法，其包括如下操作步骤：
供试品溶液的制备：精密称定淫羊藿提取物0.05-0.15重量份，置锥形瓶中，精密加入体积浓度为35%-100%的甲醇溶液15-50体积份，称定，超声10-50min，放凉后称重，以体积浓度为35%-100%的甲醇补足减失的重量，过微孔滤膜，取续滤液，即得；
对照品溶液的制备：精密称定朝藿定A、朝藿定B、朝藿定C、淫羊藿苷、宝藿苷Ⅰ对照品适量，用甲醇配成每1ml份含0.05-0.50mg的朝藿定A、朝藿定B、朝藿定C、淫羊藿苷、宝藿苷Ⅰ的溶液，作为对照品溶液；
高效液相色谱条件：色谱柱以十八烷基硅烷键合硅胶为填料；流动相A为乙腈，流动相B为体积浓度0.05-2%的磷酸水溶液；柱温：20℃-40℃；检测波长：260nm-280nm；流速：0.5-1.5ml﹒min－1，进行梯度洗脱，具体梯度洗脱程序为：从0-10min，流动相A：流动相B为15%：85%；从10-20min，流动相A：流动相B由15%：85%→20%：80%；从20-45min，流动相A：流动相B由20%：80%→24%：76%；从45-65min，流动相A：流动相B为24%：76%；从65-70min，流动相A：流动相B由24%：76%→30%：70%；从70-90min，流动相A：流动相B由30%：70%→40%：60%；从90-105min，流动相A：流动相B由40%：60%→90%：10%；
样品测定法：分别吸取供试品溶液与对照品溶液2-25μl，注入高效液相色谱仪，测定，即得指纹图谱；
所述重量份与体积份的关系为g/mL的关系。
所述由上述方法构建得到的淫羊藿提取物的指纹图谱中有16个共有特征峰，与对照品指纹图谱对照品出峰时间对比，按出峰时间顺序确定第6号峰为朝藿定A色谱峰，第7号峰为朝藿定B色谱峰，第8号峰为朝藿定C色谱峰，第9号峰为淫羊藿苷色谱峰，第16号峰为宝藿苷Ⅰ色谱峰，以第9号峰为参照峰，16个色谱峰保留时间比依次为：0.110-0.140、0.490-0.520、0.525-0.555、0.560-0.600、0.810-0.840、0.850-0.880、0.890-0.920、0.940-0.970、1.000、1.290-1.320、1.350-1.380、1.450-1.480、1.540-1.570、1.595-1.625、1.605-1.635、1.670-1.700。
进一步的，所述的构建淫羊藿提取物的指纹图谱的方法，包括如下操作步骤：
供试品溶液的制备：精密称定淫羊藿提取物0.1重量份，置锥形瓶中，精密加入体积浓度为50%的甲醇溶液25体积份，称定，超声15min，放凉后称重，以体积浓度为50%的甲醇补足减失的重量，过微孔滤膜，取续滤液，即得；
对照品溶液的制备：精密称定朝藿定A、朝藿定B、朝藿定C、淫羊藿苷、宝藿苷Ⅰ对照品适量，用甲醇配成每1ml份含0.1mg的朝藿定A、朝藿定B、朝藿定C、淫羊藿苷、宝藿苷Ⅰ的溶液，作为对照品溶液；
高效液相色谱条件：色谱柱以十八烷基硅烷键合硅胶为填料；流动相A为乙腈，流动相B为体积浓度0.1%的磷酸水溶液；柱温：30℃；检测波长：270nm；流速：1.0ml﹒min－1，进行梯度洗脱，具体梯度洗脱程序为：从0-10min，流动相A：流动相B为15%：85%；从10-20min，流动相A：流动相B由15%：85%→20%：80%；从20-45min，流动相A：流动相B由20%：80%→24%：76%；从45-65min，流动相A：流动相B为24%：76%；从65-70min，流动相A：流动相B由24%：76%→30%：70%；从70-90min，流动相A：流动相B由30%：70%→40%：60%；从90-105min，流动相A：流动相B由40%：60%→90%：10%；
样品测定法：分别吸取供试品溶液与对照品溶液10μl，注入高效液相色谱仪，测定，即得指纹图谱。
检测所得淫羊藿提取物指纹图谱中有16个共有特征峰，与对照品指纹图谱对照品出峰时间对比，按出峰时间顺序确定第6号峰为朝藿定A色谱峰，第7号峰为朝藿定B色谱峰，第8号峰为朝藿定C色谱峰，第9号峰为淫羊藿苷色谱峰，第16号峰为宝藿苷Ⅰ色谱峰，以第9号峰为参照峰，16个色谱峰保留时间比依次为：0.126、0.510、0.532、0.570、0.821、0.865、0.907、0.955、1.000、1.308、1.363、1.467、1.559、1.609、1.618、1.685。
进一步的，所述的构建淫羊藿提取物的指纹图谱的方法，包括如下操作步骤：
供试品溶液的制备：精密称定淫羊藿提取物0.05重量份，置锥形瓶中，精密加入体积浓度为35%的甲醇溶液50体积份，称定，超声10min，放凉后称重，以体积浓度为35%的甲醇补足减失的重量，过微孔滤膜，取续滤液，即得；
对照品溶液的制备：精密称定朝藿定A、朝藿定B、朝藿定C、淫羊藿苷、宝藿苷Ⅰ对照品适量，用甲醇配成每1ml份含0.05mg的朝藿定A、朝藿定B、朝藿定C、淫羊藿苷、宝藿苷Ⅰ的溶液，作为对照品溶液；
高效液相色谱条件：色谱柱以十八烷基硅烷键合硅胶为填料；流动相A为乙腈，流动相B为体积浓度0.05%的磷酸水溶液；柱温：20℃；检测波长：260nm；流速：0.5ml﹒min－1，进行梯度洗脱，具体梯度洗脱程序为：从0-10min，流动相A：流动相B为15%：85%；从10-20min，流动相A：流动相B由15%：85%→20%：80%；从20-45min，流动相A：流动相B由20%：80%→24%：76%；从45-65min，流动相A：流动相B为24%：76%；从65-70min，流动相A：流动相B由24%：76%→30%：70%；从70-90min，流动相A：流动相B由30%：70%→40%：60%；从90-105min，流动相A：流动相B由40%：60%→90%：10%；
样品测定法：分别吸取供试品溶液与对照品溶液2μl，注入高效液相色谱仪，测定，即得指纹图谱。
检测所得淫羊藿提取物指纹图谱中有16个共有特征峰，与对照品指纹图谱对照品出峰时间对比，按出峰时间顺序确定第6号峰为朝藿定A色谱峰，第7号峰为朝藿定B色谱峰，第8号峰为朝藿定C色谱峰，第9号峰为淫羊藿苷色谱峰，第16号峰为宝藿苷Ⅰ色谱峰，以第9号峰为参照峰，16个色谱峰保留时间比依次为：0.115、0.495、0.525、0.565、0.810、0.855、0.890、0.945、1.000、1.295、1.355、1.455、1.545、1.595、1.610、1.675。
进一步的，所述的构建淫羊藿提取物的指纹图谱的方法，包括如下操作步骤：
供试品溶液的制备：精密称定淫羊藿提取物0.15重量份，置锥形瓶中，精密加入体积浓度为100%的甲醇溶液15体积份，称定，超声50min，放凉后称重，以体积浓度为100%的甲醇补足减失的重量，过微孔滤膜，取续滤液，即得；
对照品溶液的制备：精密称定朝藿定A、朝藿定B、朝藿定C、淫羊藿苷、宝藿苷Ⅰ对照品适量，用甲醇配成每1ml份含0.50mg的朝藿定A、朝藿定B、朝藿定C、淫羊藿苷、宝藿苷Ⅰ的溶液，作为对照品溶液；
高效液相色谱条件：色谱柱以十八烷基硅烷键合硅胶为填料；流动相A为乙腈，流动相B为体积浓度2%的磷酸水溶液；柱温：40℃；检测波长：280nm；流速：1.5ml﹒min－1，进行梯度洗脱，具体梯度洗脱程序为：从0-10min，流动相A：流动相B为15%：85%；从10-20min，流动相A：流动相B由15%：85%→20%：80%；从20-45min，流动相A：流动相B由20%：80%→24%：76%；从45-65min，流动相A：流动相B为24%：76%；从65-70min，流动相A：流动相B由24%：76%→30%：70%；从70-90min，流动相A：流动相B由30%：70%→40%：60%；从90-105min，流动相A：流动相B由40%：60%→90%：10%；
样品测定法：分别吸取供试品溶液与对照品溶液25μl，注入高效液相色谱仪，测定，即得指纹图谱。
检测所得淫羊藿提取物指纹图谱中有16个共有特征峰，与对照品指纹图谱对照品出峰时间对比，按出峰时间顺序确定第6号峰为朝藿定A色谱峰，第7号峰为朝藿定B色谱峰，第8号峰为朝藿定C色谱峰，第9号峰为淫羊藿苷色谱峰，第16号峰为宝藿苷Ⅰ色谱峰，以第9号峰为参照峰，16个色谱峰保留时间比依次为：0.138、0.518、0.550、0.585、0.835、0.880、0.915、0.965、1.000、1.315、1.380、1.475、1.565、1.625、1.635、1.695。
本发明所述的淫羊藿提取物由如下方法提取得到：取淫羊藿药材粉碎，称取1重量份，加入20-40体积份的水和/或50-95%的乙醇为溶剂提取1-3小时，将提取液回收乙醇后滤过，通过JD-1（WLD）型或D101型大孔吸附树脂柱，然后用60-80%乙醇洗脱，当流出液颜色明显变深时开始收集洗脱液，当洗脱液颜色变得极浅时洗脱完毕，洗脱液回收乙醇、浓缩、干燥得到淫羊藿提取物；所述重量份与体积份的关系为g/mL的关系。
进一步的，所述淫羊藿提取物由如下方法提取得到：取淫羊藿药材粉碎，称取1重量份，加入水和/或50-95%的乙醇为溶剂提取两次，第一次加10-20体积份（g/mL）溶剂提取1小时，第二次加入10-20体积份（g/mL）溶剂提取1小时，将提取液合并，回收乙醇后滤过，通过JD-1（WLD）型或D101型大孔吸附树脂柱，然后用70%乙醇洗脱，当流出液颜色明显变深时开始收集洗脱液，当洗脱液颜色变得极浅时洗脱完毕，洗脱液回收乙醇、浓缩、干燥得到淫羊藿提取物。
优选的，所述淫羊藿提取物由如下方法提取得到：取淫羊藿药材粉碎，称取1重量份，加水提取两次，第一次加15体积份（g/mL）提取1小时，第二次加入10体积份（g/mL）提取1小时，将两次提取液合并，滤过，通过JD-1（WLD）型大孔吸附树脂柱分离，然后用70%乙醇洗脱，当流出液颜色明显变深时开始收集洗脱液，当洗脱液颜色变得极浅时洗脱完毕，洗脱液回收乙醇、浓缩、干燥得到淫羊藿提取物。
优选的，所述淫羊藿提取物由如下方法提取得到：取淫羊藿药材粉碎，称取1重量份，加50%乙醇提取两次，第一次加20体积份（g/mL）提取1小时，第二次加入10体积份（g/mL）提取1小时，将两次提取液合并，回收乙醇后滤过，通过D101型大孔吸附树脂柱分离，然后用70%乙醇洗脱，当流出液颜色明显变深时开始收集洗脱液，当洗脱液颜色变得极浅时洗脱完毕，洗脱液回收乙醇、浓缩、干燥得到淫羊藿提取物。
优选的，所述淫羊藿提取物由如下方法提取得到：取淫羊藿药材粉碎，称取1重量份，加95%乙醇提取两次，第一次加10体积份（g/mL）提取1小时，第二次加入20体积份（g/mL）提取1小时，将两次提取液合，回收乙醇后滤过，通过JD-1（WLD）型大孔吸附树脂柱分离，然后用70%乙醇洗脱，当流出液颜色明显变深时开始收集洗脱液，当洗脱液颜色变得极浅时洗脱完毕。洗脱液回收乙醇、浓缩、干燥得到淫羊藿提取物。
本发明还提供了根据上述方法提取得到的淫羊藿提取物。
本发明还公开了上述构建淫羊藿提取物指纹图谱的方法在检测淫羊藿含量及质量控制领域的应用。
本发明所述构建淫羊藿提取物的指纹图谱的方法，以淫羊藿提取物为检测对象，针对性的开发了适用于该提取物的指纹图谱的构建方法，获得了较为全面的图谱信息，且能够结合指纹图谱中多个色谱峰的信息，更加全面反映淫羊藿提取物的质量，区别于现有技术中从单独一个或者数个化学成分来判定淫羊藿提取物整体整理的片面性的问题，能够更加有效、合理的对产品质量进行监控。同时，本发明所述构建指纹图谱的方法具有稳定性高、精密度高，重复性好的优点。
本发明所述的淫羊藿提取物优选由水和/或体积浓度为50-95%的乙醇提取并经由JD-1（WLD）型或D101型大孔吸附树脂柱分离而得，所获得的指纹图谱的信息更为全面有效。
实验例淫羊藿提取物指纹图谱的建立实验
1、仪器与试药
1.1仪器
BS110S型电子天平（MadebySartorius，d=0.1mg）；
CP225D型精密电子天平（MadebySartorius，d=0.01mg）；
Agilent1200型高效液相色谱仪（带DAD检测器）；
AgilentZORBAXXDB-C18（250×4.6mm,5μm）色谱柱；
SB-5200DTD超声波处理器（宁波新芝生物科技股份有限公司）。
1.2试药
朝藿定A（批号100723，购自成都普瑞法科技开发有限公司，纯度>98%）；
朝藿定B（批号100806，购自成都普瑞法科技开发有限公司，纯度>98%）；
朝藿定C（批号100412，购自成都普瑞法科技开发有限公司，纯度>98%）；
淫羊藿苷(批号110737-200312，中国药品生物制品检定所提供)；
宝藿苷Ⅰ（批号113558-15-9，购自SHANGHAITAUTOBIOTECHCO.,LTD，纯度>98%）；
乙腈，色谱纯（美国Dikma公司）；
水为屈臣氏纯净水；
其他试剂为分析纯。
1.3样品
所述淫羊藿提取物样品由如下方法得到：取淫羊藿药材10g，粉碎，加水提取两次，第一次加150ml提取1小时，第二次加入100ml再次提取1小时，将两次提取液合并，滤过，并通过JD-1（WLD）型大孔吸附树脂柱，然后用70%乙醇洗脱，当流出液颜色明显变深时开始收集洗脱液，当洗脱液颜色变得极浅时洗脱完毕，洗脱液回收乙醇、浓缩、干燥得到淫羊藿提取物。
将上述得到的提取物依次编号为S1-S12（批号依次为11016、11025、11036、11040、11045、12004、12012、12022、12036、12040、12051、12060）进行检测。
2、方法与结果
2.1对照品溶液的制备
精密称定朝藿定A、朝藿定B、朝藿定C、淫羊藿苷、宝藿苷Ⅰ对照品适量，置25mL量瓶中，用甲醇配成每1ml含0.1mg的朝藿定A、朝藿定B、朝藿定C、淫羊藿苷、宝藿苷Ⅰ对照品溶液，即得。
2.2供试品溶液的制备
称取上述干燥后的淫羊藿提取物0.1g，精密称定，精密加入体积浓度为50%的甲醇溶液25mL，称定，超声10min，放凉后称重，以体积浓度为50%的甲醇溶液补足减失的重量，摇匀，过0.45μm滤膜，取续滤液，即得。2.3色谱条件
色谱柱：AgilentZORBAXXDB-C18（250×4.6mm,5μm）色谱柱；流动相：以乙腈为流动相A，以体积浓度为0.1%的磷酸水为流动相B，进行梯度洗脱，洗脱程序如下；流速为1ml/min；柱温：30℃；检测波长：270nm；梯度洗脱程序：
0-10分钟，流动相A为15%，流动相B为85%；
10-20分钟，流动相A从15%变为20%，流动相B从85%变为80%；
20-45分钟，流动相A从20%变为24%，流动相B从80%变为76%；
45-65分钟，流动相A为24%，流动相B为76%；
65-70分钟，流动相A从24%变为30%，流动相B从76%变为70%；
70-90分钟，流动相A从30%变为40%，流动相B从70%变为60%；
90-105分钟，流动相A从40%变为90%，流动相B从60%变为10%。2.4样品测定法
分别吸取供试品溶液与对照品溶液10μl，注入高效液相色谱仪，测定，按供试品记录图谱，其中所述对照品溶液的图谱见图1，检测样品的图谱见图2。可见各个特征峰清晰得到分离。
2.5方法学考察
2.5.1精密度试验
取同一供试品溶液，连续进样6次，所得指纹图谱叠加图见附图3。采用《中药色谱指纹图谱评价分析***》（2004年A版）对其指纹图谱进行分析，与生成的对照指纹图谱相比，6份样品的相似度均大于0.950。以9号峰淫羊藿苷峰为参照峰，其共有峰的相对保留时间和相对峰面积的RSD均小于5%，表明仪器稳定，精密度良好，符合指纹图谱技术的要求。
2.5.2重复性试验
取同一批号供试品，按供试品制备方法平行制备6份，进样，所得指纹图谱叠加图见图4。采用《中药色谱指纹图谱评价分析***》（2004年A版）对其指纹图谱进行分析，与生成的对照指纹图谱相比，6份样品的相似度均大于0.950。以9号峰为参照峰，其共有峰的相对保留时间和相对峰面积的RSD均小于5%，表明重复性良好，符合指纹图谱技术的要求。
2.5.3稳定性试验
取同一供试品溶液，分别于0、2、8、12、16、24、48小时时进样，所得指纹图谱叠加图见图5。采用《中药色谱指纹图谱评价分析***》（2004年A版）对其指纹图谱进行分析，与生成的对照指纹图谱相比，6份样品的相似度均大于0.950。以9号峰淫羊藿苷峰为参照峰，其共有峰的相对保留时间和相对峰面积的RSD均小于5%，表明样品稳定性良好，符合指纹图谱技术的要求。
2.6指纹图谱的建立
2.6.1共有模式的建立
将12批样品的指纹图谱导入《中药色谱指纹图谱评价分析***》（2004年A版），形成所述各提取物样品的指纹图谱叠加图（图6），并建立淫羊藿提取物指纹图谱的共有模式（图7），从共有模式的色谱峰中标定16个共有峰。经过对照品指纹图谱进行对照，对色谱峰进行归属，鉴定了峰6为朝藿定A，峰7为朝藿定B，峰8为朝藿定C，峰9为淫羊藿苷，峰16为宝藿苷Ⅰ，以第9号峰为参照峰，各个色谱峰保留时间为：0.126、0.510、0.532、0.570、0.821、0.865、0.907、0.955、1.000、1.308、1.363、1.467、1.559、1.609、1.618、1.685。
2.6.2相似度分析
将12批样品指纹图谱导入《中药色谱指纹图谱评价分析***》（2004年A版），计算相似度，见下表1，
表112批样品指纹图谱相似度
可见，本发明所述构建淫羊藿提取物指纹图谱的方法，可准确反应淫羊藿提取物的全面信息，且方法准确、可行。
附图说明
为了使本发明的内容更容易被清楚的理解，下面根据本发明的具体实施例并结合附图，对本发明作进一步详细的说明，其中
图1为对照品溶液的检测图谱；
图2为检测样品的指纹图谱；
图3为所述提取物的指纹图谱的精密度实验叠加图；
图4为所述提取物的指纹图谱的重复性实验叠加图；
图5为所述提取物的指纹图谱的稳定性实验叠加图；
图6为所述各提取物样品的指纹图谱叠加图；
图7为所述各提取物样品的指纹图谱共有模式图。
具体实施方式
实施例1
本实施例所述淫羊藿提取物由如下方法得到：取淫羊藿药材10g粉碎，加50%乙醇提取两次，第一次加200mL提取1小时，第二次加入100mL提取1小时，将两次提取液合并，回收乙醇后滤过，通过D101型大孔吸附树脂柱分离，然后用70%乙醇洗脱，当流出液颜色明显变深时开始收集洗脱液，当洗脱液颜色变得极浅时洗脱完毕，洗脱液回收乙醇、浓缩、干燥得到淫羊藿提取物。
本实施例所述构建淫羊藿指纹图谱的方法，包括如下步骤：
供试品溶液的制备：精密称定上述的淫羊藿提取物0.5g，置锥形瓶中，精密加入体积浓度为35%的甲醇溶液500ml，称定，超声10min，放凉后称重，以体积浓度为35%的甲醇补足减失的重量，过微孔滤膜，取续滤液，即得。
对照品溶液的制备：精密称定朝藿定A、朝藿定B、朝藿定C、淫羊藿苷、宝藿苷Ⅰ对照品适量，用甲醇配成每1ml份含0.05mg的朝藿定A、朝藿定B、朝藿定C、淫羊藿苷、宝藿苷Ⅰ的溶液，作为对照品溶液。
高效液相色谱条件：以AgilentZORBAXXDB-C18（250×4.6mm,5μm）色谱柱；流动相A为乙腈，流动相B为体积浓度0.05%的磷酸水溶液；柱温：20℃；检测波长：260nm；流速：0.5ml﹒min－1，进行梯度洗脱，具体梯度洗脱程序为：
0-10分钟，流动相A为15%，流动相B为85%；
10-20分钟，流动相A从15%变为20%，流动相B从85%变为80%；
20-45分钟，流动相A从20%变为24%，流动相B从80%变为76%；
45-65分钟，流动相A为24%，流动相B为76%；
65-70分钟，流动相A从24%变为30%，流动相B从76%变为70%；
70-90分钟，流动相A从30%变为40%，流动相B从70%变为60%；
90-105分钟，流动相A从40%变为90%，流动相B从60%变为10%。
样品测定法：分别吸取供试品溶液与对照品溶液2μl，注入高效液相色谱仪，测定，即得指纹图谱。
检测所得淫羊藿提取物指纹图谱中有16个共有特征峰，与对照品指纹图谱对照品出峰时间对比，按出峰时间顺序确定第6号峰为朝藿定A色谱峰，第7号峰为朝藿定B色谱峰，第8号峰为朝藿定C色谱峰，第9号峰为淫羊藿苷色谱峰，第16号峰为宝藿苷Ⅰ色谱峰，以第9号峰为参照峰，16个色谱峰保留时间比依次为：0.115、0.495、0.525、0.565、0.810、0.855、0.890、0.945、1.000、1.295、1.355、1.455、1.545、1.595、1.610、1.675。
实施例2
本实施例所述淫羊藿提取物由如下方法得到：取淫羊藿药材10g粉碎，加95%乙醇提取两次，第一次加100mL提取1小时，第二次加入200mL提取1小时，将两次提取液合并，回收乙醇后滤过，通过JD-1（WLD）型大孔吸附树脂柱分离，然后用70%乙醇洗脱，当流出液颜色明显变深时开始收集洗脱液，当洗脱液颜色变得极浅时洗脱完毕。洗脱液回收乙醇、浓缩、干燥得到淫羊藿提取物。
本实施例所述构建淫羊藿指纹图谱的方法，包括如下步骤：
供试品溶液的制备：精密称定上述的淫羊藿提取物0.15g，置锥形瓶中，精密加入体积浓度为100%的甲醇溶液15ml，称定，超声50min，放凉后称重，以体积浓度为100%的甲醇补足减失的重量，过微孔滤膜，取续滤液，即得。
对照品溶液的制备：精密称定朝藿定A、朝藿定B、朝藿定C、淫羊藿苷、宝藿苷Ⅰ对照品适量，用甲醇配成每1ml份含0.50mg的朝藿定A、朝藿定B、朝藿定C、淫羊藿苷、宝藿苷Ⅰ的溶液，作为对照品溶液。
高效液相色谱条件：以AgilentZORBAXXDB-C18（250×4.6mm,5μm）色谱柱；流动相A为乙腈，流动相B为体积浓度2%的磷酸水溶液；柱温：40℃；检测波长：280nm；流速：1.5ml﹒min－1，进行梯度洗脱，具体梯度洗脱程序为：
0-10分钟，流动相A为15%，流动相B为85%；
10-20分钟，流动相A从15%变为20%，流动相B从85%变为80%；
20-45分钟，流动相A从20%变为24%，流动相B从80%变为76%；
45-65分钟，流动相A为24%，流动相B为76%；
65-70分钟，流动相A从24%变为30%，流动相B从76%变为70%；
70-90分钟，流动相A从30%变为40%，流动相B从70%变为60%；
90-105分钟，流动相A从40%变为90%，流动相B从60%变为10%。
样品测定法：分别吸取供试品溶液与对照品溶液25μl，注入高效液相色谱仪，测定，即得指纹图谱。
检测所得淫羊藿提取物指纹图谱中有16个共有特征峰，与对照品指纹图谱对照品出峰时间对比，按出峰时间顺序确定第6号峰为朝藿定A色谱峰，第7号峰为朝藿定B色谱峰，第8号峰为朝藿定C色谱峰，第9号峰为淫羊藿苷色谱峰，第16号峰为宝藿苷Ⅰ色谱峰，以第9号峰为参照峰，16个色谱峰保留时间比依次为：0.138、0.518、0.550、0.585、0.835、0.880、0.915、0.965、1.000、1.315、1.380、1.475、1.565、1.625、1.635、1.695。
实施例3
本实施例所述淫羊藿提取物由如下方法得到：取淫羊藿药材10g粉碎，加水提取两次，第一次加100mL提取1小时，第二次加入200mL提取1小时，将两次提取液合并滤过，通过JD-1（WLD）型大孔吸附树脂柱分离，然后用70%乙醇洗脱，当流出液颜色明显变深时开始收集洗脱液，当洗脱液颜色变得极浅时洗脱完毕。洗脱液回收乙醇、浓缩、干燥得到淫羊藿提取物。
本实施例所述构建淫羊藿指纹图谱的方法，包括如下步骤：
供试品溶液的制备：精密称定上述的淫羊藿提取物0.1g，置锥形瓶中，精密加入体积浓度为50%的甲醇溶液25ml，称定，超声15min，放凉后称重，以体积浓度为50%的甲醇补足减失的重量，过微孔滤膜，取续滤液，即得。
对照品溶液的制备：精密称定朝藿定A、朝藿定B、朝藿定C、淫羊藿苷、宝藿苷Ⅰ对照品适量，用甲醇配成每1ml份含0.1mg的朝藿定A、朝藿定B、朝藿定C、淫羊藿苷、宝藿苷Ⅰ的溶液，作为对照品溶液。
高效液相色谱条件：以AgilentZORBAXXDB-C18（250×4.6mm,5μm）色谱柱；流动相A为乙腈，流动相B为体积浓度0.1%的磷酸水溶液；柱温：30℃；检测波长：270nm；流速：1.0ml﹒min－1，进行梯度洗脱，具体梯度洗脱程序为：
0-10分钟，流动相A为15%，流动相B为85%；
10-20分钟，流动相A从15%变为20%，流动相B从85%变为80%；
20-45分钟，流动相A从20%变为24%，流动相B从80%变为76%；
45-65分钟，流动相A为24%，流动相B为76%；
65-70分钟，流动相A从24%变为30%，流动相B从76%变为70%；
70-90分钟，流动相A从30%变为40%，流动相B从70%变为60%；
90-105分钟，流动相A从40%变为90%，流动相B从60%变为10%。
样品测定法：分别吸取供试品溶液与对照品溶液10μl，注入高效液相色谱仪，测定，即得指纹图谱。
检测所得淫羊藿提取物指纹图谱中有16个共有特征峰，与对照品指纹图谱对照品出峰时间对比，按出峰时间顺序确定第6号峰为朝藿定A色谱峰，第7号峰为朝藿定B色谱峰，第8号峰为朝藿定C色谱峰，第9号峰为淫羊藿苷色谱峰，第16号峰为宝藿苷Ⅰ色谱峰，以第9号峰为参照峰，16个色谱峰保留时间比依次为：0.126、0.510、0.532、0.570、0.821、0.865、0.907、0.955、1.000、1.308、1.363、1.467、1.559、1.609、1.618、1.685。
显然，上述实施例仅仅是为清楚地说明所作的举例，而并非对实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。而由此所引伸出的显而易见的变化或变动仍处于本发明创造的保护范围之中。
Claims (9)
1.一种构建淫羊藿提取物的指纹图谱的方法，其特征在于，包括如下操作步骤：
供试品溶液的制备：精密称定淫羊藿提取物0.05-0.15重量份，置锥形瓶中，精密加入体积浓度为35％-100％的甲醇溶液15-50体积份，称定，超声10-50min，放凉后称重，以体积浓度为35％-100％的甲醇补足减失的重量，过微孔滤膜，取续滤液，即得；
对照品溶液的制备：精密称定朝藿定A、朝藿定B、朝藿定C、淫羊藿苷、宝藿苷Ⅰ对照品适量，用甲醇配成每1ml份含0.05-0.50mg的朝藿定A、朝藿定B、朝藿定C、淫羊藿苷、宝藿苷Ⅰ的溶液，作为对照品溶液；
高效液相色谱条件：色谱柱以十八烷基硅烷键合硅胶为填料；流动相A为乙腈，流动相B为体积浓度0.05-2％的磷酸水溶液；柱温：20℃-40℃；检测波长：260nm-280nm；流速：0.5-1.5ml﹒min－1，进行梯度洗脱，具体梯度洗脱程序为：从0-10min，流动相A：流动相B为15％：85％；从10-20min，流动相A：流动相B由15％：85％→20％：80％；从20-45min，流动相A：流动相B由20％：80％→24％：76％；从45-65min，流动相A：流动相B为24％：76％；从65-70min，流动相A：流动相B由24％：76％→30％：70％；从70-90min，流动相A：流动相B由30％：70％→40％：60％；从90-105min，流动相A：流动相B由40％：60％→90％：10％；
样品测定法：分别吸取供试品溶液与对照品溶液2-25μl，注入高效液相色谱仪，测定，即得指纹图谱；
所述重量份与体积份的关系为g/mL的关系。
2.根据权利要求1所述的构建淫羊藿提取物的指纹图谱的方法，其特征在于，包括如下操作步骤：
供试品溶液的制备：精密称定淫羊藿提取物0.1重量份，置锥形瓶中，精密加入体积浓度为50％的甲醇溶液25体积份，称定，超声15min，放凉后称重，以体积浓度为50％的甲醇补足减失的重量，过微孔滤膜，取续滤液，即得；
对照品溶液的制备：精密称定朝藿定A、朝藿定B、朝藿定C、淫羊藿苷、宝藿苷Ⅰ对照品适量，用甲醇配成每1ml份含0.1mg的朝藿定A、朝藿定B、朝藿定C、淫羊藿苷、宝藿苷Ⅰ的溶液，作为对照品溶液；
高效液相色谱条件：色谱柱以十八烷基硅烷键合硅胶为填料；流动相A为乙腈，流动相B为体积浓度0.1％的磷酸水溶液；柱温：30℃；检测波长：270nm；流速：1.0ml﹒min－1，进行梯度洗脱，具体梯度洗脱程序为：从0-10min，流动相A：流动相B为15％：85％；从10-20min，流动相A：流动相B由15％：85％→20％：80％；从20-45min，流动相A：流动相B由20％：80％→24％：76％；从45-65min，流动相A：流动相B为24％：76％；从65-70min，流动相A：流动相B由24％：76％→30％：70％；从70-90min，流动相A：流动相B由30％：70％→40％：60％；从90-105min，流动相A：流动相B由40％：60％→90％：10％；
样品测定法：分别吸取供试品溶液与对照品溶液10μl，注入高效液相色谱仪，测定，即得指纹图谱。
3.根据权利要求1所述的构建淫羊藿提取物的指纹图谱的方法，其特征在于，包括如下操作步骤：
供试品溶液的制备：精密称定所述的淫羊藿提取物0.05重量份，置锥形瓶中，精密加入体积浓度为35％的甲醇溶液50体积份，称定，超声10min，放凉后称重，以体积浓度为35％的甲醇补足减失的重量，过微孔滤膜，取续滤液，即得；
对照品溶液的制备：精密称定朝藿定A、朝藿定B、朝藿定C、淫羊藿苷、宝藿苷Ⅰ对照品适量，用甲醇配成每1ml份含0.05mg的朝藿定A、朝藿定B、朝藿定C、淫羊藿苷、宝藿苷Ⅰ的溶液，作为对照品溶液；
高效液相色谱条件：色谱柱以十八烷基硅烷键合硅胶为填料；流动相A为乙腈，流动相B为体积浓度0.05％的磷酸水溶液；柱温：20℃；检测波长：260nm；流速：0.5ml﹒min－1，进行梯度洗脱，具体梯度洗脱程序为：从0-10min，流动相A：流动相B为15％：85％；从10-20min，流动相A：流动相B由15％：85％→20％：80％；从20-45min，流动相A：流动相B由20％：80％→24％：76％；从45-65min，流动相A：流动相B为24％：76％；从65-70min，流动相A：流动相B由24％：76％→30％：70％；从70-90min，流动相A：流动相B由30％：70％→40％：60％；从90-105min，流动相A：流动相B由40％：60％→90％：10％；
样品测定法：分别吸取供试品溶液与对照品溶液2μl，注入高效液相色谱仪，测定，即得指纹图谱。
4.根据权利要求1所述的构建淫羊藿提取物的指纹图谱的方法，其特征在于，包括如下操作步骤：
供试品溶液的制备：精密称定所述的淫羊藿提取物0.15重量份，置锥形瓶中，精密加入体积浓度为100％的甲醇溶液15体积份，称定，超声50min，放凉后称重，以体积浓度为100％的甲醇补足减失的重量，过微孔滤膜，取续滤液，即得；
对照品溶液的制备：精密称定朝藿定A、朝藿定B、朝藿定C、淫羊藿苷、宝藿苷Ⅰ对照品适量，用甲醇配成每1ml份含0.50mg的朝藿定A、朝藿定B、朝藿定C、淫羊藿苷、宝藿苷Ⅰ的溶液，作为对照品溶液；
高效液相色谱条件：色谱柱以十八烷基硅烷键合硅胶为填料；流动相A为乙腈，流动相B为体积浓度2％的磷酸水溶液；柱温：40℃；检测波长：280nm；流速：1.5ml﹒min－1，进行梯度洗脱，具体梯度洗脱程序为：从0-10min，流动相A：流动相B为15％：85％；从10-20min，流动相A：流动相B由15％：85％→20％：80％；从20-45min，流动相A：流动相B由20％：80％→24％：76％；从45-65min，流动相A：流动相B为24％：76％；从65-70min，流动相A：流动相B由24％：76％→30％：70％；从70-90min，流动相A：流动相B由30％：70％→40％：60％；从90-105min，流动相A：流动相B由40％：60％→90％：10％；
样品测定法：分别吸取供试品溶液与对照品溶液25μl，注入高效液相色谱仪，测定，即得指纹图谱。
5.根据权利要求1-4任一项所述的构建淫羊藿提取物的指纹图谱的方法，其特征在于，所述淫羊藿提取物由如下方法提取得到：
取淫羊藿药材粉碎，称取1重量份，加入20-40体积份的水和/或50-95％的乙醇为溶剂提取1-3小时，将提取液回收乙醇后滤过，通过JD-1(WLD)型或D101型大孔吸附树脂柱，然后用60-80％乙醇洗脱，当流出液颜色明显变深时开始收集洗脱液，当洗脱液颜色变得极浅时洗脱完毕，洗脱液回收乙醇、浓缩、干燥得到淫羊藿提取物；
所述重量份与体积份的关系为g/mL的关系。
6.根据权利要求5所述的构建淫羊藿提取物的指纹图谱的方法，其特征在于，所述淫羊藿提取物由如下方法提取得到：
取淫羊藿药材粉碎，称取1重量份，加入水和/或50-95％的乙醇为溶剂提取两次，第一次加10-20体积份溶剂提取1小时，第二次加入10-20体积份溶剂提取1小时，将提取液合并，回收乙醇后滤过，通过JD-1(WLD)型或D101型大孔吸附树脂柱，然后用70％乙醇洗脱，当流出液颜色明显变深时开始收集洗脱液，当洗脱液颜色变得极浅时洗脱完毕，洗脱液回收乙醇、浓缩、干燥得到淫羊藿提取物。
7.根据权利要求1、2、3、4或6所述的构建淫羊藿提取物的指纹图谱的方法，其特征在于，所述淫羊藿提取物指纹图谱中有16个共有特征峰，与对照品指纹图谱对照品出峰时间对比，按出峰时间顺序确定第6号峰为朝藿定A色谱峰，第7号峰为朝藿定B色谱峰，第8号峰为朝藿定C色谱峰，第9号峰为淫羊藿苷色谱峰，第16号峰为宝藿苷Ⅰ色谱峰，以第9号峰为参照峰，16个色谱峰保留时间比依次为：0.110-0.140、0.490-0.520、0.525-0.555、0.560-0.600、0.810-0.840、0.850-0.880、0.890-0.920、0.940-0.970、1.000、1.290-1.320、1.350-1.380、1.450-1.480、1.540-1.570、1.595-1.625、1.605-1.635、1.670-1.700。
8.根据权利要求5所述的构建淫羊藿提取物的指纹图谱的方法，其特征在于，所述淫羊藿提取物指纹图谱中有16个共有特征峰，与对照品指纹图谱对照品出峰时间对比，按出峰时间顺序确定第6号峰为朝藿定A色谱峰，第7号峰为朝藿定B色谱峰，第8号峰为朝藿定C色谱峰，第9号峰为淫羊藿苷色谱峰，第16号峰为宝藿苷Ⅰ色谱峰，以第9号峰为参照峰，16个色谱峰保留时间比依次为：0.110-0.140、0.490-0.520、0.525-0.555、0.560-0.600、0.810-0.840、0.850-0.880、0.890-0.920、0.940-0.970、1.000、1.290-1.320、1.350-1.380、1.450-1.480、1.540-1.570、1.595-1.625、1.605-1.635、1.670-1.700。
9.权利要求1-6任一项所述的构建淫羊藿提取物指纹图谱的方法在检测淫羊藿含量及质量控制领域的应用。
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