CN113214349B - 一种酸枣仁皂苷及其制备与在制备降血糖药物中的应用 - Google Patents

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Abstract

本发明属于中药领域，公开了一种酸枣仁皂苷及其制备与在制备降血糖药物中的应用。方法：1)采用乙醇水溶液加热回流提取酸枣仁，得到酸枣仁乙醇提取物；将酸枣仁乙醇提取物与水混合，采用石油醚，乙酸乙酯，正丁醇进行萃取，收集正丁醇相萃取液，浓缩，干燥，得到酸枣仁一级皂苷；或者，2)将酸枣仁一级皂苷纯化，依次用水、不同浓度乙醇溶液进行梯度洗脱，将50％乙醇溶液洗脱得到的洗脱液浓缩，干燥，获得酸枣仁二级皂苷。酸枣仁皂苷为酸枣仁一级皂苷和/或酸枣仁二级皂苷。所述酸枣仁皂苷在制备降糖药物中的应用。本发明的酸枣仁皂苷能显著抑制α‑葡萄糖苷酶和α‑淀粉酶，改善HepG2细胞胰岛素抵抗而发挥降血糖功效。

Description

一种酸枣仁皂苷及其制备与在制备降血糖药物中的应用
技术领域
本发明属于中药领域，具体涉及一种酸枣仁皂苷及其制备与在制备降血糖药物中的应用。
背景技术
糖尿病是一组由多病因引起的以慢性高血糖为特征的代谢性疾病。糖尿病现分为四种，I型糖尿病、II型糖尿病、其他特殊类型糖尿病、妊娠糖尿病；其中II型糖尿病最为常见。II型糖尿病会引发糖尿病肾病、糖尿病精神疾病、糖尿病视网膜病变等多种并发症，此外，II型糖尿病还会大致脂蛋白水平升高，引发冠心病及中风等血管疾病，严重危害人类健康。
餐后血糖升高以及胰岛素抵抗都是导致II型糖尿病发病的重要因素。在II型糖尿病治疗中，控制餐后血糖水平是治疗的有效手段。α-淀粉酶与α-葡萄糖苷酶是碳水化合物消化的关键酶，它们能将碳水化合物分解成为葡萄糖，使血糖升高。临床上，常使用α-淀粉酶与α-葡萄糖苷酶抑制剂对高血糖进行治疗。II型糖尿病的另一种发病因素是胰岛素抵抗，体外模拟胰岛素抵抗状态，探究药物对胰岛素抵抗的改善作用是十分有意义的。肝脏作为胰岛素效应的主要器官，对维持机体血糖平衡其重要作用。人肝癌细胞HepG2数量多，容易获取与培养，且具有表达***和胰岛素受体的代谢反应，研究还发现，在高浓度胰岛素情况下HepG2细胞表面胰岛素受体减少数目与胰岛素水平及刺激时间呈正相关关系，这使得HepG细胞被广泛应用于体外模拟胰岛素抵抗。越来越多的研究发现天然活性物质不仅可以抑制α-淀粉酶与α-葡萄糖苷酶，还可以改善HepG细胞的的胰岛素抵抗状态，从而发挥降血糖效果。
酸枣(Ziziphus jujuba Mill.var spinosa(Bunge)Huex H.F.Chow)是鼠李科枣属植物，酸枣仁为酸枣的干燥种子，具有宁心安神、养肝、敛汗生津的功效，常用于治疗失眠多梦、体虚多汗等症状。酸枣仁皂苷是酸枣仁中主要的化学成分之一，目前国内外关于酸枣仁皂苷药理活性的研究以镇静催眠为主，而对酸枣仁皂苷的其他活性研究较少。不同的提取方法，所获得的酸枣仁皂苷成分不同。酸枣仁作为药食两用价值的天然保健品，其皂苷类成分的提取纯化和药理活性等方面的研究还有待进一步深入探讨，全面加强酸枣仁的生物利用，对于开发新药、指导临床用药具有重要的意义。
发明内容
为了克服现有技术的不足和缺点，本发明的首要目的在于提供一种酸枣仁皂苷及其制备方法。
本发明的另一目的在于提供上述酸枣仁皂苷在制备降血糖药物中的应用。
本发明的目的通过下述方案实现：
一种酸枣仁皂苷的制备方法，包含如下步骤：
(1)将酸枣仁干燥，粉碎过筛，得到酸枣仁粗粉；
(2)采用乙醇水溶液加热回流提取酸枣仁粗粉，获得提取液；将提取液浓缩，干燥，得到酸枣仁乙醇提取物；
(3)将酸枣仁乙醇提取物与水混合，获得混悬液；将混悬液采用石油醚进行萃取，取水相；将水相采用乙酸乙酯进行萃取，再次取水相；将乙酸乙酯萃取后的水相采用正丁醇进行萃取，收集正丁醇相萃取液，浓缩，干燥至恒重，得到酸枣仁一级皂苷，记为SZR I；
或者，(4)将酸枣仁一级皂苷采用大孔树脂纯化，依次选用水、30％乙醇溶液、50％乙醇溶液、70％乙醇溶液、90％乙醇溶液进行梯度洗脱，分别收集洗脱液，将50％乙醇溶液洗脱得到的洗脱液浓缩，干燥，获得酸枣仁二级皂苷，记为SZR II。
酸枣仁皂苷为酸枣仁一级皂苷和/或酸枣仁二级皂苷。
步骤(1)中所述干燥的温度为40～50℃；所述干燥的时间为12～32h；所述粉碎过筛为18～60目筛。
步骤(2)中所述乙醇水溶液的浓度为70～85％，所述浓度为体积浓度。
步骤(2)中所述乙醇水溶液与酸枣仁粗粉的体积质量比(醇料比)为1g∶(10～20)mL；
步骤(2)中所述加热回流提取的次数为1～3次，每次提取的温度为80～100℃；每次提取的时间为2～4h；
步骤(2)中加热回流提取后进行离心或过滤；所述离心的转速为3500～5000r/min；所述离心的时间为5～10min。
步骤(2)所述浓缩为减压浓缩；所述减压浓缩的温度为40～55℃。
步骤(2)中所述干燥为真空干燥，干燥的温度为40～50℃；
步骤(3)中，萃取时，待萃取的溶液与萃取剂的体积比为1∶1；萃取剂为石油醚、乙酸乙酯、正丁醇；如：混悬液与石油醚的体积比为1∶1，石油醚萃取后的水相与乙酸乙酯的体积比为1∶1，乙酸乙酯萃取后的水相与正丁醇的体积比为1∶1；
步骤(3)所述石油醚进行萃取，萃取次数为2～4次，每次萃取时间为0.5～1.5h；
乙酸乙酯进行萃取，萃取次数为2～4次，每次萃取时间为0.5～1.5h，每次萃取完，去除乙酸乙酯相，将水相采用乙酸乙酯继续进行萃取；
正丁醇进行萃取，萃取次数为2～4次，每次萃取时间为0.5～1.5h，每次萃取完，收集正丁醇相，将水相采用正丁醇继续进行萃取，多次萃取完后，收集所有的正丁醇相；
步骤(3)中混悬液中酸枣仁乙醇提取物与水的质量体积比为(1～5)g∶(20～100)mL。
步骤(3)所述浓缩为减压浓缩，减压浓缩温度为65～75℃；
步骤(3)所述干燥为真空干燥或鼓风干燥，干燥温度为45～50℃；
步骤(4)所述大孔树脂为大孔吸附树脂，大孔吸附树脂在使用前先进行预处理，预处理的方法为：将大孔吸附树脂先用95％乙醇溶液浸泡18～24h，水冲洗至无醇味，然后用质量分数为3～5％的盐酸溶液浸泡2～4h，水洗至中性，再用质量分数为3～5％的氢氧化钠溶液浸泡2～4h，水洗至中性，得到经过预处理的大孔吸附树脂；
步骤(4)中所述大孔吸附树脂为D101大孔树脂；
步骤(4)所述梯度洗脱为水、30％乙醇洗脱、50％乙醇洗脱、70％乙醇洗脱、90％乙醇洗脱；百分数为体积分数；
步骤(4)中所述浓缩为减压浓缩，浓缩温度为45～55℃；
步骤(4)中所述干燥的温度为40～50℃。
所述酸枣仁皂苷通过上述方法制备得到。
所述酸枣仁皂苷(SZR I、SZR II)在制备降血糖药物中的应用；
一种降血糖药物，含有上述酸枣仁皂苷(SZR I、SZR II)中的至少一种。
本发明的酸枣仁皂苷(SZR I、SZR II)作为抑制α-葡萄糖苷酶和/或α-淀粉酶的抑制剂。
本发明的酸枣仁皂苷(SZR I、SZR II)在制备增加胰岛素抵抗的HepG2细胞的增殖的制剂中的应用。
本发明的原理：本发明的酸枣仁皂苷(SZR I、SZR II)能显著抑制α-葡萄糖苷酶和α-淀粉酶，改善HepG2细胞胰岛素抵抗而发挥降血糖功效。本发明天然植物有效成分酸枣仁皂苷(SZR I、SZR II)具有显著的降糖活性，且使用剂量低，在同样剂量下的毒副作用也较低。
本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果：
(1)本发明的酸枣仁皂苷(SZR I、SZR II)在体外能显著抑制抑制α-葡萄糖苷酶和α-淀粉酶。
(2)本发明的酸枣仁皂苷(SZR I、SZR II)在体外能显著增加胰岛素抵抗的HepG2细胞的增殖。
(3)本发明使用剂量低，在同样剂量下的毒副作用也较低。
附图说明
图1是实施例3制备得到的SZR I与实施例5得到的SZR II对α-葡萄糖苷酶抑制率图；
图2是实施例3制备得到的SZR I与实施例5得到的SZR II对α-淀粉酶的抑制作用图；
图3是实施例3制备得到的SZR I与实施例5得到的SZR II对胰岛素抵抗的HepG2细胞葡萄糖消耗的影响图；
图4是实施例3制备得到的SZR I与实施例5得到的SZR II对胰岛素抵抗的HepG2细胞增殖作用图。
具体实施方式
下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。
实施例中，α-葡萄糖苷酶与α-淀粉酶购自上海源叶生物技术有限公司；人肝癌细胞HepG2购自中科院上海生命科学研究院细胞资源中心；酸枣仁购自广州清平药材市场。
实施例1从酸枣仁中制备得到酸枣仁乙醇提取物
(1)将酸枣仁(Citrus aurantium L.var.amara Engl)置于电热鼓风干燥箱中45℃干燥24h，用粉碎机粉碎后，过40目筛，得酸枣仁粗粉备用；
(2)称量酸枣仁粗粉200g于容器中，加入3000mL的75％乙醇水溶液，充分震荡摇匀，水浴锅80℃加热回流提取2次，每次加热3h；抽滤，取滤液，合并滤液，将滤液用旋转蒸发仪在45℃下减压浓缩，45℃下真空干燥箱干燥至恒重，即得酸枣仁乙醇提取物。
实施例2从酸枣仁中制备得到酸枣仁乙醇提取物
1)将酸枣仁(Citrus aurantium L.var.amara Engl)置于电热鼓风干燥箱中50℃干燥18h，用粉碎机粉碎后，过18目筛，得酸枣仁粗粉备用；
(2)称量酸枣仁粗粉300g于锥形瓶中，加入3000mL的70％乙醇，充分震荡摇匀，水浴锅80℃加热回流提取2次，每次加热3h；用布氏漏斗抽滤，取滤液，合并滤液，将滤液用旋转蒸发仪在45℃下减压浓缩，45℃下真空干燥箱干燥至恒重，即得酸枣仁乙醇提取物。
实施例3从酸枣仁中制备得到酸枣仁一级皂苷SZR I
取实施例1中的到酸枣仁乙醇提取物30g用800mL蒸馏水溶解为混悬液，将混悬液转移至分液漏斗中，加入等体积的石油醚，振摇，静置30min，待两相完全分层后，弃去上层石油醚层，水层待用，重复3次。在水层中加入等体积的乙酸乙酯，振摇，静置30min，待两相完全分层后，弃去上层的萃取液，收集水层，重复3次。在水层中加入同等体积的水饱和正丁醇，振摇，静置30min，待两相完全分层后，旋转分液漏斗的活塞，收集上层的萃取液，萃取三次，合并萃取液，65℃条件下减压浓缩，得到正丁醇浸膏，将浸膏置于45℃烘箱中烘干，即得到酸枣仁一级皂苷样品(SZR I)
实施例4从酸枣仁中制备得到酸枣仁一级皂苷SZR I
取实施例1中的酸枣仁乙醇提取物30g用1000mL蒸馏水溶解为混悬液，将混悬液转移至分液漏斗中，加入等体积的石油醚，振摇，静置30min，待两相完全分层后，弃去上层石油醚层，水层待用，重复2次。在水层中加入等体积的乙酸乙酯，振摇，静置30min，待两相完全分层后，弃去上层的萃取液，收集水层，重复2次。在水层中加入同等体积的水饱和正丁醇，振摇，静置30min，待两相完全分层后，旋转分液漏斗的活塞，收集上层的萃取液，萃取2次，合并萃取液，70℃条件下减压浓缩，得到正丁醇浸膏，将浸膏置于50℃烘箱中烘干，即得到酸枣仁一级皂苷样品(SZR I)
实施例5从酸枣仁一级皂苷中制备得到酸枣仁二级皂苷SZR II
(1)将D101大孔树脂先用95％乙醇浸泡24h，用蒸馏水冲洗至没有醇味，然后依次用质量分数为4％的盐酸溶液浸泡3h，用蒸馏水冲洗至中性，再用质量分数为4％的氢氧化钠溶液各自浸泡3h，用蒸馏水冲洗至中性，待用。
(2)取实施例3中得到的SZR I 5g，用100mL蒸馏水溶解，离心取上清液上样，吸附过夜，先用蒸馏水洗脱5个柱体积，除去糖和色素等水溶性杂质，再用30％乙醇洗脱5个柱体积，除去一些酚类物质，然后依次用50％、70％和95％乙醇洗脱5个柱体积，减压浓缩回收乙醇，45℃烘箱中烘干，皂苷含量检测，50％乙醇洗脱组分作为二级皂苷(SZR II)，50％乙醇洗脱组分中皂苷含量最高。皂苷含量测定方法为香草醛-冰醋酸-高氯酸法，以人参皂苷RB1为标准对照品。
实施例6测定SZR I与SZR II对α-葡萄糖苷酶的抑制率
用PH＝6.8的缓冲溶液配置25mmol/L的对硝基苯酚-α-D-葡萄糖苷(PNPG，麦克林试剂有限公司)溶液，1mol/L Na2CO3溶液。样品浓度为50、100、200、400、800μg/mL。在96孔板中按表1所示加入样品、PBS和α-葡萄糖苷酶，37℃水浴反应10min，再加入50μL PNPG溶液，37℃水浴30min，最后再加入100μL Na2CO3溶液，于405nm测定其吸光值，阳性对照为阿卡波糖。α-葡萄糖苷酶抑制率(I(％))计算公式如(1)所示。测试结果如图1所示。图1是实施例3制备得到的SZR I与实施例5得到的SZR II对α-葡萄糖苷酶的抑制作用图。
Figure BDA0003067246560000071
表1α-葡萄糖苷酶-样品反应体系
Figure BDA0003067246560000072
阳性对照组：阿卡波糖替换样品组中样品。
SZR I与SZR II在浓度为50～800μg/mL范围内对α-葡萄糖苷酶表现出良好抑制作用，其中SZR II的效果更好
实施例7测定SZR I与SZR II对α-淀粉酶的抑制率
DNS配置：18.2g酒石酸钾钠用50mL蒸馏水溶解(50℃水浴)，依次加入3-5二硝基水杨酸0.63g，加入26.2mL浓度为2mol/L的NaOH溶液，0.5g苯酚，0.5g无水亚硫酸钠，完全溶解后转移至棕色容量瓶中，定容至100mL，密封避光7天后使用。
在10mL离心管中加入不同浓度(0.125、0.25、0.5、1、2mg/mL)样品0.25mL，再加入浓度为1U/mL 0.25mL的α-淀粉酶(37℃预热10min)，然后加入质量分数为1％淀粉溶液0.5mL，37℃反应20min；加入DNS 0.5mL后沸水浴8min，立即冷却用，用5mL去离子水稀释后，540nm测吸光值。阳性对照为阿卡波糖，阿卡波糖替换样品组中样品。空白对照为以0.25mLDMSO代替样品溶液；本底对照以0.25mL PBS代替样品组中淀粉酶。抑制率按照式(2)计算。测试结果如图2所示。图2是实施例3制备得到的SZR I与实施例5得到的SZR II对α-淀粉酶的抑制作用图。
Figure BDA0003067246560000073
SZR I在浓度为500～2000μg/mL范围内对α-淀粉酶表现出良好抑制作用，而SZRII在浓度为125～2000μg/mL范围内对α-淀粉酶表现出良好抑制作用。可以看出SZR II的的抑制效果更显著。
实施例8 SZR I与SZR II对胰岛素抵抗的HepG2细胞葡萄糖消耗的影响
选择处于生长对数期的HepG2细胞，调整细胞密度为6×104个/mL，在96孔板中加入细胞悬液，每孔100μL，置于5％CO2，37℃培养箱中培养12h，弃上清液，每孔加入100μL浓度为10-6mol/L的胰岛素，诱导36h时间后，弃上清液，PBS清洗2次，加入含有SZR I(实施例3制得)与SZR II(实施例5制得)的DMEM培养基(SZR I与SZR II的终浓度分别为100、200、400μg/mL)，每孔100μL。培养24h，收集上清液用葡萄糖试剂盒测定其葡萄糖含量，计算葡萄糖消耗量ΔG(4-3)。以二甲双胍作为阳性对照。测试结果如图3所示。图3是实施例3制备得到的SZR I与实施例5得到的SZR II对胰岛素抵抗的HepG2细胞葡萄糖消耗的影响图。空白对照组：不加药物，即上述步骤中加入无药物的DMEM培养基；模型组：加入10-6mol/L的人重组胰岛素。
SZR I与SZR II在浓度为100～400μg/mL范围内显著增加胰岛素抵抗的HepG2细胞的葡萄糖消耗量，且SZR II的效果更好。
实施例9 MTT法检测酸枣仁皂苷SZR I、SZR II对胰岛素抵抗的HepG2细胞增殖的影响。
收集实施例8中的上清液后，PBS清洗两次，每孔加入180μL不含血清的DMEM基础培养基和20μL噻唑蓝(MTT)，放入培养箱中继续孵育4h，弃上清液，每孔加入150μL二甲基亚砜(DMSO)，避光放置于微量振荡器均匀震荡10min，用酶标仪测量在490nm波长下的OD值，计算细胞增殖率；测试结果如图4所示。图4是实施例3制备得到的SZR I与实施例5得到的SZR II对胰岛素抵抗的HepG2细胞增殖作用图。
SZR I与SZR II均能促进HepG细胞的增殖，对细胞没有致死作用，证明SZR I与SZRII在实验浓度下对细胞几乎没有毒害作用。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

Claims (8)

1.一种酸枣仁皂苷的制备方法，其特征在于：包含如下步骤：
（1）将酸枣仁干燥，粉碎过筛，得到酸枣仁粗粉；
（2）采用乙醇水溶液加热回流提取酸枣仁粗粉，获得提取液；将提取液浓缩，干燥，得到酸枣仁乙醇提取物；
（3）将酸枣仁乙醇提取物与水混合，获得混悬液；将混悬液采用石油醚进行萃取，取水相；将水相采用乙酸乙酯进行萃取，再次取水相；将乙酸乙酯萃取后的水相采用正丁醇进行萃取，收集正丁醇相萃取液，浓缩，干燥至恒重，得到酸枣仁一级皂苷，记为SZR I；
或者，（4）将酸枣仁一级皂苷采用大孔树脂纯化，依次选用水、30%乙醇溶液、50%乙醇溶液、70%乙醇溶液、90%乙醇溶液进行梯度洗脱，分别收集洗脱液，将50%乙醇溶液洗脱得到的洗脱液浓缩，干燥，获得酸枣仁二级皂苷，记为SZR II；
酸枣仁皂苷为酸枣仁一级皂苷和/或酸枣仁二级皂苷；
步骤（2）中所述乙醇水溶液的浓度为70~85%，所述浓度为体积浓度；
步骤（2）中所述加热回流提取的次数为1~3次，每次提取的温度为80～100℃；每次提取的时间为2~4 h；
步骤（4）中所述大孔吸附树脂为D101大孔树脂；
步骤（2）中所述酸枣仁粗粉与乙醇水溶液的质量体积比为1g：(10~20)mL；
步骤（3）所述石油醚进行萃取，萃取次数为2~4次，每次萃取时间为0.5~1.5h；
乙酸乙酯进行萃取，萃取次数为2~4次，每次萃取时间为0.5~1.5h，每次萃取完，去除乙酸乙酯相，将水相采用乙酸乙酯继续进行萃取；
正丁醇进行萃取，萃取次数为2~4次，每次萃取时间为0.5~1.5h，每次萃取完，收集正丁醇相，将水相采用正丁醇继续进行萃取，多次萃取完后，收集所有的正丁醇相。
2.根据权利要求1所述酸枣仁皂苷的制备方法，其特征在于：步骤（2）所述浓缩为减压浓缩；所述减压浓缩的温度为40~55℃；
步骤（2）中所述干燥为真空干燥，干燥的温度为40~50℃；
步骤（3）所述浓缩为减压浓缩，减压浓缩温度为65~75℃；
步骤（3）所述干燥为真空干燥或鼓风干燥，干燥温度为45~50℃；
步骤（1）中所述干燥的温度为40~50℃；所述干燥的时间为12~32 h；所述粉碎过筛为18~60目筛；
步骤（2）中加热回流提取后进行离心或过滤；所述离心的转速为3500～5000 r/min；所述离心的时间为5～10 min。
3.根据权利要求1所述酸枣仁皂苷的制备方法，其特征在于：步骤（4）所述大孔树脂为大孔吸附树脂，大孔吸附树脂在使用前先进行预处理，预处理的方法为：将大孔吸附树脂先用95%乙醇溶液浸泡18～24 h，水冲洗至无醇味，然后用质量分数为3～5%的盐酸溶液浸泡2~4h，水洗至中性，再用质量分数为3～5%的氢氧化钠溶液浸泡2~4 h，水洗至中性，得到经过预处理的大孔吸附树脂。
4.根据权利要求1所述酸枣仁皂苷的制备方法，其特征在于：步骤（4）中所述浓缩为减压浓缩，浓缩温度为45~55℃；
步骤（4）中所述干燥的温度为40~50℃。
5.一种由权利要求1~4任一项所述制备方法得到的酸枣仁皂苷，其特征在于：所述酸枣仁皂苷为酸枣仁一级皂苷和/或酸枣仁二级皂苷。
6.根据权利要求5所述酸枣仁皂苷在制备降血糖药物中的应用。
7.一种降血糖药物，其特征在于：含有酸枣仁皂苷中的至少一种，所述酸枣仁皂苷如权利要求5所定义。
8.根据权利要求5所述酸枣仁皂苷的应用，其特征在于：所述酸枣仁皂苷用于制备抑制α-葡萄糖苷酶和/或α-淀粉酶的抑制剂。
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