CN106596759B - 一种红豆杉枝叶提取物及其制剂的hplc分析方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种红豆杉枝叶提取物及其制剂的HPLC分析方法。首先，称取至少6个合格的红豆杉枝叶提取物样品或其制剂样品，分别与甲醇混合、过滤，得到各样品的供试品溶液，进行HPLC分析，得到各样品的HPLC指纹图谱，以此建立红豆杉枝叶提取物或其制剂的HPLC对照指纹图谱；然后，将待测样品与甲醇混合、过滤，得到待测样品的供试品溶液，然后进行HPLC分析，得到该待测样品的HPLC指纹图谱；将该指纹图谱与相应的HPLC对照指纹图谱进行比较，依据比较结果判断红豆杉枝叶提取物及其制剂质量的优劣。本发明能很好地控制红豆杉枝叶提取物及其制剂的质量。
Description
技术领域
本发明属于药物分析技术领域。更具体地，涉及一种红豆杉枝叶提取物及其制剂的HPLC分析方法。
背景技术
红豆杉枝叶为红豆杉科植物红豆杉的干燥叶，红豆杉枝叶主要含二环紫杉烷类、各种三环紫杉烷类、松香烷类和海松烷类二萜，以及木脂素类、黄酮类和酚类化合物等成分。红豆杉枝叶具有利尿消肿、温肾通经、抗肿瘤、抑制糖尿病等作用，因而可以作为药物来利用。
由于红豆杉枝叶具有上述的药效，因而在现有技术中，红豆杉枝叶的提取得到多方研究。红豆杉枝叶提取物是指经法定工艺制得的中间提取物，其工艺路线为：取干红豆杉枝叶，加水煎煮二次，第一次2小时，第二次1小时，合并煎液，滤过，滤液浓缩至相对密度1.12～1.15（60℃），加乙醇至含醇量达85%，静置过夜，滤取上清液，备用沉淀物用65%乙醇洗涤两次，合并洗涤液，静置过夜，滤取上清液，与备用上清液合并，回收乙醇，加入适量的水，混匀，滤过，滤液用乙酸乙酷提取四次，合并乙酸乙酷液，回收乙酸乙酷并浓缩成稠膏，喷雾干燥，即得。
红豆杉枝叶提取物目前主要用于制备紫杉醇注射剂，由于不用产地、不同气候及提取工艺都会影响红豆杉枝叶提取物有效成分含量，从而影响红豆杉枝叶提取物的质量，而红豆杉枝叶提取物的质量又决定了紫杉醇注射剂的质量好坏，所以，需要对红豆杉枝叶提取物及其制剂的主要成分进行分析，考察红豆杉枝叶提取物及其制剂质量好坏及各批次产品之间的质量差异。在现有技术中，仅存在对不同产地红豆杉枝叶进行质量分析的方法，具体为：精密称取2 g样品粉末，室温下加20 mL体积分数95%乙醇浸泡24 h后超声处理2 h;4000r·min-1离心5 min，上清液过滤，沉淀分别用体积分数95%乙醇超声提取2次，每次30min，均经4000 r·min-1离心5 min，上清液过滤;合并3次滤液，置于旋转蒸发仪中蒸干;然后用V( 三氯甲烷)∶V ( 水) = 1∶1混合溶剂10 mL进行萃取，重复萃取3次，合并三氯甲烷相萃取液，用旋转蒸发仪于35 ℃蒸干；浸膏用甲醇溶解并定容至10 mL，用0.45 μm 微孔滤膜过滤，滤液即为供试样液。参照上述色谱条件进行HPLC分析，进样量5 μL。采用以下色谱条件进行洗脱：汉邦C18色谱柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；检测波长227 nm；柱温为室温；流速0.8 mL·min-1；进样量5 μL。流动相为乙腈一水溶液，二元梯度洗脱，0～20 min，15%乙腈变化至50%，20～50 min，50%乙腈变化至100%，50～60 min，100%乙腈。
综上所述，目前对于红豆杉枝叶提取物的质量分析技术存在如下缺点：（1）主要是对不同产地的红豆杉枝叶药材进行指纹图谱分析，考察不同产地红豆杉枝叶的质量稳定性；而没有考虑不同气候及提取工艺等因素的影响。（2）上述现有技术所得的指纹图谱中含有12个特征色谱峰，只对其中的3个进行了指认，反映的信息量小。因此，到目前为止，仍无较好的方法来全面分析红豆杉枝叶提取物及其制剂中主要化学成分以及考察它们的质量稳定性。
发明内容
本发明要解决的技术问题是克服上述现有技术的缺陷和技术不足，提供一种利用高效液相色谱法进行的一种红豆杉枝叶提取物及其制剂的HPLC分析方法，对红豆杉枝叶提取物及其制剂的主要成分进行综合分析，对不同批次的红豆杉枝叶提取物及其制剂的指纹图谱相进行测试，建立红豆杉枝叶提取物及其制剂的HPLC对照指纹图谱，通过测试红豆杉枝叶提取物及其制剂样品的指纹图谱与对照指纹图谱的相似度，来鉴别红豆杉枝叶提取物及其制剂质量的优劣程度，达到控制红豆杉枝叶提取物及其制剂质量的目的。
本发明的目的是提供一种红豆杉枝叶提取物及其制剂的HPLC分析方法。
本发明上述目的通过以下技术方案实现：
一种红豆杉枝叶提取物及其制剂的HPLC分析方法，包括如下步骤：
S1. 建立HPLC对照指纹图谱
S11.称取至少6个合格的红豆杉枝叶提取物样品或红豆杉枝叶提取物制剂样品，分别与甲醇混合、过滤，得到各样品的供试品溶液；
S12.对步骤S11的各样品的供试品溶液进行HPLC分析，得到各样品的HPLC指纹图谱，根据各样品的HPLC指纹图谱建立红豆杉枝叶提取物或红豆杉枝叶提取物制剂的HPLC对照指纹图谱；
S2. 待测样品检测
S21.将待测样品与甲醇混合、过滤，得到待测样品的供试品溶液，然后进行HPLC分析，得到该待测样品的HPLC指纹图谱；
S22.将该指纹图谱与相应的HPLC对照指纹图谱进行比较，依据比较结果判断红豆杉枝叶提取物及其制剂质量的优劣。
该方法能够达到控制红豆杉枝叶提取物及其制剂质量的目的。
其中，优选地，步骤S12所述HPLC分析的色谱条件和流动相设定如下：
乙腈-水溶液，二元梯度洗脱：洗脱时间为0～10 min，浓度为30%的乙腈；
洗脱时间为10～70 min，浓度从30%变化至45%的乙腈；
洗脱时间为70～99 min，浓度从45%变化至70%的乙腈；
洗脱时间为99～114 min，浓度从70%变化至90%的乙腈；
洗脱时间为114～120 min，浓度从90%变化至30%的乙腈；
洗脱时间为120～130 min，浓度为30%的乙腈。
优选地，其中所述水溶液为纯水。
优选地，步骤S11所述红豆杉枝叶提取物制剂需先碾成粉末，制成红豆杉枝叶提取物制剂粉末样品。
优选地，步骤S11所述过滤之前，先将样品与甲醇的混合物超声后放凉。
更优选地，所述超声的功率为40～60kHz。
更优选地，所述超声的功率为60kHz。
更优选地，超声的时间为20～40min。
更优选地，所述超声的时间为30min。
优选地，步骤S11或S21所述甲醇的浓度为100%。
优选地，步骤S11或S21所述过滤采用微孔滤膜进行。
更优选地，所述微孔滤膜的孔径为0.35～0.45μm。
更优选地，所述微孔滤膜的孔径为0.45 μm。
优选地，步骤S21所述HPLC分析中，平衡时间为10 min～30 min。
优选地，步骤S21所述HPLC分析中，采用二极管阵列检测器采集波长，采集范围为：从190 nm～210 nm至390 nm～410 nm；检测波长227 nm。
另外，具体地，步骤S12所述根据各样品的HPLC指纹图谱建立红豆杉枝叶提取物或红豆杉枝叶提取物制剂的HPLC对照指纹图谱的方法为：在色谱仪上安装国家药典委员会中药色谱指纹图谱相似度评价***，通过该***建立红豆杉枝叶提取物对照指纹图谱，红豆杉枝叶提取物应具有7个共有特征峰。
步骤S22所述依据比较结果判断红豆杉枝叶提取物及其制剂质量的优劣的标准为：如果待测样品具有7个与对照指纹图谱相对应的特征峰，且通过中药色谱指纹图谱相似度评价***得出其与对照指纹图谱的相似度大于或等于0.90，则该待测样品的质量较好。
具体是：利用中药色谱指纹图谱相似度评价***将该指纹图谱与对照指纹图谱进行比较，得出该指纹图谱与对照指纹图谱的相似度；在使用对照指纹图谱对红豆杉枝叶提取物样品进行鉴别时，样品的指纹图谱中，应呈现7个与对照指纹图谱相对应的特征峰，同时，样品的指纹图谱与对照图谱的相似度应该不低于0.90；如果该待测样品具有7个与对照指纹图谱相对应的特征峰，且通过中药色谱指纹图谱相似度评价***得出其与对照指纹图谱的相似度大于或等于0.90，可以认为该待测样品的质量较好。
本发明经过大量的研究和探索，总结得出上述红豆杉枝叶提取物及其制剂的HPLC分析方法，其基本构思是：建立红豆杉枝叶提取物及其制剂的HPLC分析方法，对不同厂家、不同批次的红豆杉枝叶提取物及制剂HPLC指纹图谱进行对比研究，建立红豆杉枝叶提取物及制剂的HPLC对照指纹图谱，然后将待测样品的指纹图谱与该对照指纹图谱进行比较、鉴别，辨别红豆杉枝叶提取物及其制剂质量的好坏、优劣，达到控制红豆杉枝叶提取物及其制剂质量的目的。
本发明具有以下有益效果：
与现有的技术相比，本发明由于对色谱条件进行了合理设置，使得采用本发明的方法所得的指纹图谱中含有7个特征峰，并对其中的7个进行了指认，相比于现有技术中所得的指纹图谱中含有12个特征峰，只对其中的3个进行指认，本发明反映的信息量大，能更好地达到控制红豆杉枝叶提取物及其制剂质量的目的。
本发明建立的红豆杉枝叶提取物及其制剂的HPLC分析方法，对不同厂家、不同批次的红豆杉枝叶提取物及制剂HPLC指纹图谱进行对比研究，建立红豆杉枝叶提取物及制剂的HPLC对照指纹图谱，从而对红豆杉枝叶提取物及其制剂的质量进行分析，可辨别红豆杉枝叶提取物及其制剂质量的好坏、优劣，实现控制红豆杉枝叶提取物及其制剂质量的目的。
附图说明
图1为本发明实施例1建立的红豆杉枝叶提取物的对照指纹图谱。
图2为本发明实施例2建立的红豆杉枝叶提取物制剂—红豆杉片的对照指纹图谱。
具体实施方式
以下结合说明书附图和具体实施例来进一步说明本发明，但实施例并不对本发明做任何形式的限定。除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备。
除非特别说明，本发明所用试剂和材料均为市购。
以上所述的HPLC为高效液相色谱的简称。
实施例1
1、建立对照指纹图谱：
（1）取红豆杉枝叶提取物30 mg，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入适量甲醇，摇匀，定容至5 mL，微孔滤膜（0.45 μm）过滤，即得供试品溶液。
（2）精密吸取供试品溶液10 μL进样，采用以下色谱条件进行洗脱：
色谱柱（Phenomenex Luna C18色谱柱（4.6 mm×250 mm，5 μm））；
乙腈-水溶液，二元梯度洗脱：洗脱时间为0～10min，浓度为30%的乙腈；洗脱时间为10～70 min，浓度从30%变化至45%的乙腈；洗脱时间为70～99 min，浓度从45%变化至70%的乙腈；洗脱时间为99～114 min，浓度从70%变化至90%的乙腈；洗脱时间为114～120min，浓度从90%变化至30%的乙腈；洗脱时间为120～130min，浓度为30%的乙腈；平衡时间20min；流速1 mL·min-1；进样量10μL；柱温35℃；PDA检测器采集范围：200 nm～400nm；检测波长227 nm。
（3）通过上述方法对十个批次的红豆杉枝叶提取物样品进行指纹图谱测定，色谱仪上安装国家药典委员会中药色谱指纹图谱相似度评价***，通过该***建立红豆杉枝叶提取物对照指纹图谱，红豆杉枝叶提取物应具有7个共有特征峰（其中有7个特征峰得到指认），结果如图1所示，其中：
峰1：10-DAB Ⅲ；峰2：Baccatin Ⅲ；峰3：Taxinine M；峰4：10-DAT；峰5：Cephalomannine；峰6：7-表-10-DAT；峰7：Paclitaxel。
2、待测样品检测
（1）取待测红豆杉枝叶提取物30 mg，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入适量甲醇，摇匀，定容至5 mL，微孔滤膜（0.45 μm）过滤，即得待测样品的供试品溶液。
（2）精密吸取供试品溶液10 μL进样，采用以下色谱条件进行洗脱：
色谱柱（Phenomenex Luna C18色谱柱（4.6mm×250mm，5μm））；
乙腈-水溶液，二元梯度洗脱：洗脱时间为0～10 min，浓度为30%的乙腈；洗脱时间为10～70 min，浓度从30%变化至45%的乙腈；洗脱时间为70～99 min，浓度从45%变化至70%的乙腈；洗脱时间为99～114 min，浓度从70%变化至90%的乙腈；洗脱时间为114～120 min，浓度从90%变化至30%的乙腈；洗脱时间为120～130 min，浓度为30%的乙腈；平衡时间20min；流速1 mL·min-1；进样量10 μL；柱温35 ℃；PDA检测器采集范围：200 nm～400 nm；检测波长227 nm。
（3）用上述测试方法得到该待测红豆杉枝叶提取物样品的指纹图谱后，再利用中药色谱指纹图谱相似度评价***将该指纹图谱与对照指纹图谱进行比较，得出该指纹图谱与对照指纹图谱的相似度。在使用对照指纹图谱对红豆杉枝叶提取物样品进行鉴别时，样品的指纹图谱中，应呈现7个与对照指纹图谱相对应的特征峰，同时，样品的指纹图谱与对照图谱的相似度应该不低于0.90。如果该待测样品具有7个与对照指纹图谱相对应的特征峰，且通过中药色谱指纹图谱相似度评价***得出其与对照指纹图谱的相似度大于或等于0.90，可以认为该待测样品的质量较好。使用本发明的对照指纹图谱能很好地达到控制红豆杉枝叶提取物质量的目的。
实施例2
1、建立对照指纹图谱
（1）取红豆杉枝叶提取物制剂-红豆杉片6片，碾碎，称取粉末30 mg，置具塞锥形瓶中，加入适量甲醇，超声30 min，放冷，定容至5 mL。微孔滤膜（0.45 μm）过滤，即得供试品溶液。
（2）精密吸取供试品溶液10 μL进样，采用以下色谱条件进行洗脱：
色谱柱（Phenomenex Luna C18色谱柱（4.6 mm×250 mm，5 μm））；
乙腈-水溶液，二元梯度洗脱：洗脱时间为0～10 min，浓度为30%的乙腈；洗脱时间为10～70 min，浓度从30%变化至45%的乙腈；洗脱时间为70～99 min，浓度从45%变化至70%的乙腈；洗脱时间为99～114 min，浓度从70%变化至90%的乙腈；洗脱时间为114～120 min，浓度从90%变化至30%的乙腈；洗脱时间为120～130 min，浓度为30%的乙腈；平衡时间20min；流速1 mL·min-1；进样量10 μL；柱温35 ℃；PDA检测器采集范围：200 nm～400 nm；检测波长227 nm。
（3）通过上述方法对十个批次的红豆杉枝叶提取物制剂-红豆杉片进行指纹图谱进行测定，色谱仪上安装国家药典委员会中药色谱指纹图谱相似度评价***，通过该***建立红豆杉片对照指纹图谱，红豆杉片对照指纹图谱应具有7个共有特征峰（其中有7个特征峰得到指认），结果如图2所示，其中：
峰1：10-DAB Ⅲ；峰2：Baccatin Ⅲ；峰3：Taxinine M；峰4：10-DAT；峰5：Cephalomannine；峰6：7-表-10-DAT；峰7：Paclitaxel。
2、待测样品检测
（1）取红豆杉枝叶提取物制剂-红豆杉片6片，碾碎，称取粉末30 mg，置具塞锥形瓶中，加入适量甲醇，超声30 min，放冷，定容至5 mL。微孔滤膜（0.45 μm）过滤，即得供试品溶液。
（2）精密吸取供试品溶液10 μL进样，采用以下色谱条件进行洗脱：
色谱柱（Phenomenex Luna C18色谱柱（4.6 mm×250 mm，5 μm））；
乙腈-水溶液，二元梯度洗脱：洗脱时间为0～10 min，浓度为30%的乙腈；洗脱时间为10～70 min，浓度从30%变化至45%的乙腈；洗脱时间为70～99 min，浓度从45%变化至70%的乙腈；洗脱时间为99～114 min，浓度从70%变化至90%的乙腈；洗脱时间为114～120 min，浓度从90%变化至30%的乙腈；洗脱时间为120～130 min，浓度为30%的乙腈；平衡时间20min；流速1 mL·min-1；进样量10 μL；柱温35 ℃；PDA检测器采集范围：200 nm～400 nm；检测波长227 nm。
（3）用上述测试方法得到该待测红豆杉枝叶提取物制剂-红豆杉片样品的指纹图谱，再利用中药色谱指纹图谱相似度评价***将该指纹图谱与特征图谱进行比较，得出该指纹图谱与对照指纹图谱的相似度，同时观察该指纹图谱相对应的特征峰个数，最后评价红豆杉枝叶提取物制剂-红豆杉片样品的质量。在使用对照指纹图谱对红豆杉枝叶提取物制剂-红豆杉片样品进行鉴别时，样品的指纹图谱中，应呈现7个与对照指纹图谱相对应的特征峰，同时，样品的指纹图谱与对照指纹图谱的相似度应该不低于0.90。如果该待测样品具有7个与对照指纹图谱相对应的特征峰，且通过中药色谱指纹图谱相似度评价***得出其与对照指纹图谱的相似度大于或等于0.90，可以认为该待测样品的质量较好。使用本发明的对照指纹图谱能很好地达到控制红豆杉枝叶提取物制剂-红豆杉片质量的目的。
Claims (6)
1.一种红豆杉枝叶提取物及其制剂的HPLC分析方法，其特征在于，包括如下步骤：
S1. 建立HPLC对照指纹图谱
S11.称取至少6个合格的红豆杉枝叶提取物样品或红豆杉枝叶提取物制剂样品，分别与甲醇混合、过滤，得到各样品的供试品溶液；
S12.对步骤S11的各样品的供试品溶液进行HPLC分析，得到各样品的HPLC指纹图谱，根据各样品的HPLC指纹图谱建立红豆杉枝叶提取物或红豆杉枝叶提取物制剂的HPLC对照指纹图谱；
S2. 待测样品检测
S21.将待测样品与甲醇混合、过滤，得到待测样品的供试品溶液，然后进行HPLC分析，得到该待测样品的HPLC指纹图谱；
S22.将该指纹图谱与相应的HPLC对照指纹图谱进行比较，依据比较结果判断红豆杉枝叶提取物及其制剂质量的优劣；
步骤S12所述HPLC分析的色谱条件和流动相设定如下：
乙腈-水溶液，二元梯度洗脱：洗脱时间为0～10 min，浓度为30%的乙腈；
洗脱时间为10～70 min，浓度从30%变化至45%的乙腈；
洗脱时间为70～99 min，浓度从45%变化至70%的乙腈；
洗脱时间为99～114 min，浓度从70%变化至90%的乙腈；
洗脱时间为114～120 min，浓度从90%变化至30%的乙腈；
洗脱时间为120～130 min，浓度为30%的乙腈；
步骤S11所述过滤之前，先将样品与甲醇的混合物超声后放凉；所述超声的功率为40～60kHz，超声的时间为20～40min；
步骤S22所述依据比较结果判断红豆杉枝叶提取物及其制剂质量的优劣的标准为：如果待测样品具有7个与对照指纹图谱相对应的特征峰，且通过中药色谱指纹图谱相似度评价***得出其与对照指纹图谱的相似度大于或等于0.90，则该待测样品的质量较好。
2.根据权利要求1所述的HPLC分析方法，其特征在于，步骤S11所述红豆杉枝叶提取物制剂需先碾成粉末，制成红豆杉枝叶提取物制剂粉末样品。
3.根据权利要求1所述的HPLC分析方法，其特征在于，步骤S11或S21所述过滤采用微孔滤膜进行。
4.根据权利要求3所述的HPLC分析方法，其特征在于，所述微孔滤膜的孔径为0.35～0.45μm。
5.根据权利要求1所述的HPLC分析方法，其特征在于，步骤S12所述根据各样品的HPLC指纹图谱建立红豆杉枝叶提取物或红豆杉枝叶提取物制剂的HPLC对照指纹图谱的方法为：在色谱仪上安装国家药典委员会中药色谱指纹图谱相似度评价***，通过该***建立红豆杉枝叶提取物对照指纹图谱，红豆杉枝叶提取物应具有7个共有特征峰。
6.根据权利要求1所述的HPLC分析方法，其特征在于，步骤S11或S21所述甲醇的浓度为100%。
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