CN106814157B

CN106814157B - 青皮对照提取物的制备方法

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Publication number: CN106814157B
Application number: CN201710031828.7A
Authority: CN
Inventors: 郭隆钢; 许舜军; 孙帅; 许艺镌; 巫少娟; 赵岳锐; 谢培山; 许铮弟
Original assignee: Guangzhou Hao Yiwan Pharmaceutical Technology Co Ltd
Current assignee: Guangzhou Koman Biotechnology Co., Ltd.
Priority date: 2017-01-17
Filing date: 2017-01-17
Publication date: 2018-11-20
Anticipated expiration: 2037-01-17
Also published as: CN106814157A

Abstract

本发明提供了一种青皮对照提取物的制备方法，包括对不同来源或批次的青皮药材粉末进行多次提取，得到不同来源或批次的青皮提取物，然后对不同来源或批次的青皮提取物进行调配，得到青皮对照提取物。本发明的青皮对照提取物的制备方法操作简便、成本低、重复性好且提取率高；用此制备方法制备青皮对照提取物，保证了不同批次的青皮对照提取物的一致性；同时选取具有代表性的药材作为原料，得到的产物具有代表性，作为对照提取物更能直观反映待检测药材的质量，而且性状稳定、均匀且便于使用。

Description

青皮对照提取物的制备方法

技术领域

本发明涉及中药质量控制技术领域，特别是涉及一种青皮对照提取物的制备方法。

背景技术

青皮为芸香科植物橘及其栽培变种的干燥幼果或未成熟果实的果皮。5～6月收集自落的幼果，晒干，习称“个青皮”；7～8月采收未成熟的果实，在果皮上纵剖成四瓣至基部，除尽瓤瓣，晒干，习称“四花青皮”。

青皮药用历史悠久，为常用的疏肝破气、消积化滞的药。国家药典委员会发布的2015版中国药典质量标准中，对青皮作为药材时有效成分之一的橙皮苷的含量做了规定：青皮药材中含橙皮苷(C₂₈H₃₄O₁₅)不得少于5.0％，饮片含橙皮苷(C₂₈H₃₄O₁₅)不得少于4.0％，醋青皮中含橙皮苷(C₂₈H₃₄O₁₅)不得少于3.0％。

现行中药质量控制模式基本上是沿着天然药物化学的发展，对中药某一种或几种有效成分为目标的分析方法和既有定性又可定量的质量标准的构思，参照国外植物药的质量控制方法，借鉴化学药品质量控制的模式，并借助文献报道建立相应的简单理化鉴别，再发展到以光谱、色谱为主的鉴别和含量测定的质量标准。每一味中药材都是多成分的综合体，这决定了其特有的整体性和模糊性，也表明以药材中一两个甚至几个成分作为药材质量的评价方法存在很大的局限性。

1990版《中国药典》增加了对照药材的薄层色谱鉴别，使得中药及中成药的鉴别有了很大的进展。目前中药和国外的草药越来越重视多成分或多组分的检测，例如德国银杏叶提取物的质量控制。指纹图谱的分析方法，可以从整体上对药材进行质量控制，现在仍然有很大的研究价值。目前中国药典在控制药材质量方面有两种“对照品”，化学对照品和中药对照药材。其中化学对照品可用于药材的定性鉴别和定量分析，中药对照药材则用于显微鉴别和薄层鉴别。然而，化学对照品和中药对照药材在中药质量控制上都有其局限性。首先，中药中化学成分多样化，单一或者几个化合物并不能反映药材的全貌，而现有的标准往往有很多漏洞，以次充好的现象时有发生。中药对照药材受到产地、生长环境的影响，很难保证每一批的质量一致，而且只能用于定性鉴别，无法反映药材成分含量的高低。

中药对照提取物有四个基本要求(ASCS):Authenticity，药材来源可靠，具有代表性；Specificity，使用的检测方法专属性；Con-sistency，不同批次对照提取物应保持一致；Stability，性状稳定、均匀、便于使用。运用薄层色谱指纹图谱以及高效液相色谱指纹图谱的方法，中药对照提取物能满足定性鉴别的需要。通过标化的对照提取物还可以进一步进行半定量甚至定量的分析。中药对照提取物将对中药质量控制有重要意义。但是也正由于中药对照提取物有上述特定的要求，目前现有技术还未有或未有成熟的青皮对照提取物的制备方法。

发明内容

本发明解决的技术问题是提供一种操作简便、成本低、重复性好且提取率高的青皮对照提取物的制备方法，用此制备方法制备而成的青皮对照提取物批次一致性好、性状稳定、均匀且便于使用，能够反映药材的全貌。

本发明提供了一种青皮对照提取物的制备方法，包括对不同来源或批次的青皮药材粉末进行多次提取，得到不同来源或批次的青皮提取物，然后对不同来源或批次的青皮提取物进行调配，得到青皮对照提取物；

在一优选例中，所述对不同来源或批次的青皮药材粉末进行多次提取，是使其含有的黄酮苷元类成分和/或黄酮苷类成分的纯度和/或浓度提高，从而得到不同来源或批次的青皮提取物；

在一优选例中，所述黄酮苷元类成分为川陈皮素和红橘素；

在一优选例中，所述黄酮苷类成分为橙皮苷。

在一优选例中，上述青皮对照提取物的制备方法，包括以下步骤：

步骤一、粗提：取不同来源或批次的青皮药材粉末分别与甲醇混合，超声提取后过滤，得到滤液1和滤渣1，并将滤液1蒸干得到青皮粗提物；

步骤二、精制：将所得青皮粗提物，溶解于水并抽滤，得到滤渣；将滤渣用水冲洗至水无色，收集滤液2和滤渣2，滤液2用大孔树脂层析；然后先用水冲洗大孔树脂，得到洗脱液1；再用甲醇冲洗大孔树脂，收集洗脱液2；最后将洗脱液2和滤渣2混合，蒸干，得到青皮精制物；

步骤三、拌硅胶研磨过滤：在青皮精制物中添加微粉硅胶，研磨过滤，即得不同来源或批次的青皮提取物；

步骤四、调配：将不同来源或批次的青皮提取物进行调配，得到青皮对照提取物。

在一优选例中，在步骤一前还包括对不同来源或批次的青皮药材粉末对应的不同来源或批次的原料药材的筛选；

在一优选例中，所述对不同来源或批次的青皮药材粉末对应的不同来源或批次的原料药材的筛选包括：将不同来源或批次的原料药材以薄层色谱法和/或高效液相色谱法进行检测；然后对不同来源或批次的原料药材的通过薄层色谱法和/或高效液相色谱法得到的色谱图和/或测定的含量进行比较分析，剔除色谱图和/或测定的含量异常的原料药材，保留色谱图和/或测定的含量一致的原料药材进行下一步的粗提；

在一优选例中，所述薄层色谱法和/或高效液相色谱法进行检测包括对黄酮苷类成分和/或黄酮苷元类成分的检测；

在一优选例中，所述黄酮苷元类成分为川陈皮素和红橘素；

在一优选例中，所述黄酮苷类成分为橙皮苷。

在一优选例中，所述步骤一中所述的滤渣1按照步骤一的提取方法经过N次提取，并将N次提取收集的滤液与滤液1合并即为提取液，将提取液蒸干得到青皮粗提物；其中6≥N≥0，且N为整数；

在一优选例中，所述N为2。

在一优选例中，所述步骤一中的不同来源或批次的青皮药材粉末与甲醇的重量体积比为1:8～1:50；

在一优选例中，所述步骤一中的不同来源或批次的青皮药材粉末与甲醇的重量体积比为1：10；

在一优选例中，所述步骤一中的超声时间为30～60min，功率为100W～3kW；

在一优选例中，所述步骤一中的超声时间为30min，功率为500W；

在一优选例中，所述步骤一的过滤是用中速滤纸或者2000目筛网过滤。

在一优选例中，所述步骤二中的滤液2是用其重量1～4倍的大孔树脂层析；

在一优选例中，所述步骤二中的滤液2是用其重量2倍的大孔树脂层析；

在一优选例中，所述大孔树脂为非极性大孔树脂；

在一优选例中，所述大孔树脂的孔径为100～1000nm；

在一优选例中，所述大孔树脂为D101型大孔树脂。

在一优选例中，所述步骤二中的大孔树脂层析后，是先用5～10个柱体积纯净水冲洗大孔树脂，收集洗脱液1；再用3～10个柱体积70％～100％甲醇冲洗大孔树脂，收集洗脱液2；

在一优选例中，所述大孔树脂层析后，是先用8个柱体积纯净水冲洗大孔树脂，收集洗脱液1；再用4个柱体积100％甲醇冲洗大孔树脂，收集洗脱液2。

在一优选例中，所述步骤三是在青皮精制物加入其重量的20％～50％的微粉硅胶；

在一优选例中，所述步骤三是在青皮精制物加入其重量的40％的微粉硅胶；

在一优选例中，所述步骤三研磨后是过90～200目筛网过滤。

在一优选例中，所述步骤三与步骤四之间还包括以薄层色谱法和/或高效液相色谱法对不同来源或批次的青皮提取物的黄酮苷元类成分和/或黄酮苷类成分进行检测的步骤；

在一优选例中，所述黄酮苷元类成分为川陈皮素和红橘素；

在一优选例中，所述黄酮苷类成分为橙皮苷。

在一优选例中，所述步骤四中调配的标准为：应使最终的青皮对照提取物中橙皮苷的重量百分比含量维持在16％-20％；

在一优选例中，对所述青皮对照提取物采用薄层色谱法和/或高效液相色谱法得到的图谱与其对应的原料药材一致；

在一优选例中，对所述青皮对照提取物采用薄层色谱法检测得到的色谱图中的川陈皮素、红橘素和橙皮苷位置处的荧光斑点和采用高效液相色谱法检测得到的色谱图在橙皮苷位置处的色谱峰应分别与其对应的化学对照品或其对应的原料药材一致。

本发明还提供了一种药材或中药制剂的鉴别方法，或青皮或含青皮/青皮有效成分的药材或中药制剂的质量控制方法，将上述制备得到的所述青皮对照提取物、待测样品以薄层色谱法和/或高效液相色谱法进行检测，对比判别；

在一优选例中，所述薄层色谱法和/或高效液相色谱法包括黄酮苷类和/或黄酮苷元类检测；

在一优选例中，所述黄酮苷类检测条件为：

薄层板:硅胶预制板

展开剂：氯仿:甲醇:水:冰乙酸＝13:4:1:1.5

检视:5％AlCl₃乙醇显色，UV366nm下检视

在一优选例中，所述黄酮苷元类检测条件为：

薄层板:硅胶预制板

展开剂：展开剂1：甲苯：乙酸乙酯：甲酸：水＝20:20:1:1

展开剂2：甲苯：乙酸乙酯：甲酸：水＝20:10:1:1

检视：366nmUV下检视；

在一优选例中，所述的高效液相色谱法检测条件：

固定相：色谱柱C18色谱柱；流动相：A乙腈，B水；

流动相梯度：

流速：0.8ml/min；柱温：20℃；检测器：二极管阵列检测器；

检测波长：280nm。

本发明中出现的术语“四花青皮ERS”指代四花青皮对照提取物QPERS-1或其缩略名QPERS-1，本发明中出现的术语“个青皮ERS“指代个青皮对照提取物QPERS-2或其缩略名QPERS-2。

与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

本发明的青皮对照提取物的制备方法采用了粗提、精制、加辅料干燥、研磨过筛和调配的步骤，操作简便、成本低、重复性好且提取率高。用此制备方法制备得到的青皮对照提取物因是多次或不同批次的提取物进行调配而成，克服了因中药对照药材受到产地、生长环境的影响，很难保证每一批的质量一致的缺陷，从而保证了不同批次的青皮对照提取物的一致性；同时选取具有代表性的药材作为原料，得到的产物具有代表性，作为对照提取物更能直观反映待检测药材的质量；而且其性状稳定、均匀且便于使用。采用本发明的青皮对照提取物的制备方法最终得到的对照提取物中橙皮苷的含量在16％～20％，且对照提取物薄层色谱指纹图谱、HPLC指纹图谱与药材对应一致。本发明还提供了药材或中药制剂的鉴别方法，或青皮或含青皮/青皮有效成分的药材或中药制剂的质量控制方法，不仅可以对药材或中药制剂进行定性鉴别，而且还可以用于半定量甚至定量分析。

附图说明

图1为药材青皮A的表型特征。

图2为药材青皮B的表型特征。

图3为药材青皮C的表型特征。

图4为药材青皮D的表型特征。

图5为药材青皮E的表型特征。

图6为药材青皮F的表型特征。

图7为药材青皮G的表型特征。

图8为药材个青皮H的表型特征。

图9为药材个青皮I的表型特征。

图10为药材个青皮J的表型特征。

图11为购于广州市区某药店(编号1)的青皮1的表型特征。

图12为购买于广州市区某药店(编号2)的青皮2的表型特征。

图13为购买于广州市区某药店(编号3)的青皮3的表型特征。

图14为购买于广州市区某药店(编号4)的青皮4的表型特征。

图15为购买于广州市区某药店(编号5)的青皮5的表型特征。

图16为购买于广州市区某药店(编号6)的青皮6的表型特征。

图17为购买于广州市区某药店(编号7)的青皮7的表型特征。

图18为购买于广州市区某药店(编号8)的青皮8的表型特征。

图19为购买于广州市区某药店(编号9)的青皮9的表型特征。

图20为购买于广州市区某药店(编号10)的青皮10的表型特征。

图21为青皮对照提取物制备流程图；

图22为针对黄酮苷类的青皮药材TLC图谱，条带1-10分别表示：1药材青皮A；2药材青皮B；3药材青皮C；4药材青皮D；5药材青皮E；6药材青皮F；7药材青皮G；8药材个青皮H；9药材个青皮I；10药材个青皮J。

图23为针对黄酮苷元类的青皮药材TLC图谱，条带1-10分别表示：1药材青皮A；2药材青皮B；3药材青皮C；4药材青皮D；5药材青皮E；6药材青皮F；7药材青皮G；8药材个青皮H；9药材个青皮I；10药材个青皮J。

图24为青皮药材的HPLC图谱，从下到上依次为：药材青皮A、药材青皮B、药材青皮C、药材青皮D、药材青皮E、药材青皮F、药材青皮G、药材个青皮H、药材个青皮I、药材个青皮J。

图25为针对黄酮苷类的青皮提取物TLC图谱，条带1-9分别表示：1青皮B的青皮提取物；2青皮C的青皮提取物；3青皮D的青皮提取物；4青皮E的青皮提取物；5青皮F的青皮提取物；6青皮G的第一批次青皮提取物(G1)；7青皮G的第二批次青皮提取物(G2)；8个青皮H1的第一批次青皮提取物(H1)；9个青皮的第二批次青皮提取物(H2)。S代表橙皮苷。

图26为针对黄酮苷元检测的青皮提取物TLC图谱，条带1-9分别表示：1青皮B的青皮提取物；2青皮C的青皮提取物；3青皮D的青皮提取物；4青皮E的青皮提取物；5青皮F的青皮提取物；6青皮G的第一批次青皮提取物(G1)；7青皮G的第二批次青皮提取物(G2)；8个青皮H1的第一批次青皮提取物(H1)；9个青皮的第二批次青皮提取物(H2)。S：从下到上依次为川陈皮素，红橘素。

图27为青皮提取物HPLC图谱，从下到上为：青皮B的青皮提取物、青皮C的青皮提取物、青皮D的青皮提取物、青皮E的青皮提取物、青皮F的青皮提取物、青皮G的第一批次青皮提取物(G1)、青皮G的第二批次青皮提取物(G2)、个青皮H1的第一批次青皮提取物(H1)、个青皮的第二批次青皮提取物(H2)。

图28为青皮对照提取物TLC图谱(黄酮苷检测)，S：橙皮苷；1-2：四花青皮对照提取物QPERS-1，2是1的平行对照；3-4：个青皮对照提取物QPERS-2，4是3的平行对照。

图29为青皮对照提取物TLC图谱(黄酮苷元检测)，S：从上至下分别为红橘素、川陈皮素；1-2：四花青皮对照提取物QPERS-1，2是1的平行对照；3-4：个青皮对照提取物QPERS-2，2是1的平行对照。

图30为青皮对照提取物HPLC-DAD色谱图，下：个青皮ERS(QPERS-2)；上：四花青皮ERS(QPERS-1)；S：橙皮苷。

图31为青皮对照提取物及10批市售药材的薄层图谱，1：从上到下为：橙皮苷、新橙皮苷、柚皮苷；2：四花青皮ERS(QPERS-1)；3：个青皮ERS(QPERS-2)；4-13：广州市区10家药店购得青皮药材，分别为：青皮1、青皮2、青皮3、青皮4、青皮5、青皮6、青皮7、青皮8、青皮9和青皮10。

图32为青皮对照提取物及10批市售药材的薄层图谱，1：从上到下为：红橘素，川陈皮素；2：四花青皮ERS(QPERS-1)；3：个青皮ERS(QPERS-2)；4-13：广州市区10家药店购得青皮药材，分别为：青皮1、青皮2、青皮3、青皮4、青皮5、青皮6、青皮7、青皮8、青皮9和青皮10。

图33为青皮对照提取物及10批市售药材HPLC-DAD图谱，从下到上为：四花青皮ERS(QPERS-1)、个青皮ERS(QPERS-2)、广州市区10家药店购得青皮药材：青皮1、青皮2、青皮3、青皮4、青皮5、青皮6、青皮7、青皮8、青皮9和青皮10。

具体实施方式

下面详细描述本发明的实施例。下面描述的实施例是示例性的，仅用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。实施例中未注明具体技术或条件的，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。本文所使用的术语“和/或”包括一个或多个相关的所列项目的任意的和所有的组合。

以下实施例中使用到的材料及来源如下：

拟用于制备对照提取物的药材(10批):青皮A(产地：广西)、青皮B(产地：湖南)、青皮C(产地：广西)、青皮D(产地：广西)、青皮E(产地：广西)、青皮F(产地：广西)、青皮G(产地：广西)、个青皮H(产地：江西)、个青皮I(产地：江西)、个青皮J(产地：江西)。

上述所述拟用于制备对照提取物的药材的表型特征见图1-10。

橙皮苷对照品：中检院，批号110721-201316。

红橘素对照品：宝鸡辰光生物科技有限公司，批号20140512。

川陈皮素对照品：宝鸡辰光生物科技有限公司，批号20140728。

新橙皮苷对照品：中检院，批号111857-201102。

柚皮苷对照品：中检院，批号110722-201312。

微粉硅胶：山河药辅，皖药准字F20100001。

测试药材青皮：

青皮1：购买于采芝林药店，编号1；青皮2：购买于大参林药店，编号2；青皮3：购买于金康药房，编号3；青皮4：购买于海王星辰，编号4；青皮5：购买于集和堂，编号5；青皮6：购买于健民医药，编号6；青皮7：购买于仁和堂，编号7；青皮8：购买于同仁堂，编号8；青皮9：购买于二天堂，编号9；青皮10：购买于老百姓大药房，编号10。

上述测试药材青皮1-10的表型特征依次见图11-20。

实施例1：青皮对照提取物的制备

本实施例提供了本发明青皮对照提取物的制备方法，其方法流程图如图21所示。

一：原料药材的筛选

本步骤采用薄层色谱法和高效液相色谱法结合对原料药材进行筛选。

1原料药材的薄层色谱法筛选

1.1供试品的制备

化学对照品溶液的制备：取橙皮苷、川陈皮素、红橘素对照品精密称定，分别用甲醇配制成0.1mg/ml的溶液。

药材供试品溶液的制备：取青皮A、青皮B、青皮C、青皮D、青皮E、青皮F、青皮G、个青皮H、个青皮I、个青皮J药材粉末(过二号筛)各0.5g，分别加甲醇5ml于15ml离心管中，室温浸泡15分钟，超声(功率500w)处理15分钟后取出，离心10分钟(离心力3200crf)，取上清液即得药材供试品溶液，或不离心直接过0.22μm滤膜即得药材供试品溶液。

1.2薄层色谱检测

1.2.1针对黄酮苷类

检测条件如下：

薄层板：TLC G60普通硅胶预制板(Merck)

点样：化学对照品供试品溶液点样量5μl，药材供试品溶液点样量1μl，条带状点样；

展开剂：氯仿:甲醇:水:冰乙酸＝13:4:1:1.5(10℃以下分层，取下层)

展开：于双槽展开缸(20cm×10cm)一侧加展开剂10ml，预平衡15分钟，展开上行8.5cm。

检视：喷以5％AlCl₃乙醇溶液，薄层板置薄层加热板上105℃加热5分钟。置于UV紫外光灯366nm下检视。

检测结果如图22所示，为UV366nm下检视薄层色谱图(T:19℃,RH:55％)。标号S为橙皮苷对照品，1-10分别对应上述供试品青皮A、青皮B、青皮C、青皮D、青皮E、青皮F、青皮G、个青皮H、个青皮I和个青皮J的药材。

结果分析：由图22可知，10批药材的黄酮苷类图谱比较一致，说明这10种药材中黄酮苷类类成分的含量也比较一致。

1.2.2：针对黄酮苷元类

薄层板和点样同步骤一的1.2.1。

其余检测条件如下：

展开剂：

展开剂1：甲苯：乙酸乙酯：甲酸：水＝20:20:1:1(10℃以下分层，取上层)

展开剂2：甲苯：乙酸乙酯：甲酸：水＝20:10:1:1(10℃以下分层，取上层)

展开：先用展开剂1展开8.5cm，再用展开剂2展开8.5cm。每次展开前双槽展开缸(20cm×10cm)应用10ml展开剂预平衡15分钟，薄层板置薄层加热板上50℃加热15分钟。

检视：展开后挥干薄层板表面溶剂，于UV紫外光灯366nm下检视，拍照。

检测结果如图23所示，为UV366nm下检视薄层色谱图(T:19℃,RH:55％)。标号S：从上到下依次为红橘素对照品、川陈皮素对照品，1-10分别对应上述供试品青皮A、青皮B、青皮C、青皮D、青皮E、青皮F、青皮G、个青皮H、个青皮I和个青皮J的药材。

结果分析：由图23可知，青皮A的黄酮苷元类成分与其他的药材相差较大；青皮B、青皮C、青皮D、青皮E、青皮F和青皮G为四花青皮，与个青皮H、个青皮I和个青皮J比较，黄酮苷元类成分含量较多。

2原料药材的高效液相色谱法筛选

2.1供试品制备

化学对照品溶液的制备：取橙皮苷对照品精密称定，用甲醇配制成0.1mg/ml的溶液。

药材供试品溶液的制备：取青皮A、青皮B、青皮C、青皮D、青皮E、青皮F、青皮G、个青皮H、个青皮I、个青皮J药材粉末各0.2g，精密称定，置50ml量瓶中，加甲醇30ml，超声(功率500w)处理30分钟，放冷，加甲醇至50ml刻度，摇匀，中速定性滤纸过滤，精密量取滤液2ml，置5ml量瓶中，加甲醇至5ml刻度，摇匀，过0.22μm滤膜即得药材供试品溶液。

2.2高效液相色谱检测

高效液相色谱法检测条件如下：

色谱仪器：安捷伦HPLC1260高效液相色谱仪；检测器：Agilent DAD检测器；

色谱柱：Zorbax SB C₁₈(4.6×250mm,5μm；Agilent)；

流动相：流动相A为乙腈，流动相B为水；

按照以下表1的梯度洗脱程序进行：

表1

时间(分钟)	流动相A(％)	流动相B(％)
			0	5	95
30	25	75
			55	95	5
65	95	5

流速：0.8ml/min；进样量：10μl；柱温：20℃；检测波长：280nm；运行时间：65min。

高效液相色谱法检测方法：分别精密吸取化学对照品溶液和药材供试品溶液各10μl，注入液相色谱仪。

高效液相色谱法检测结果：

(1)测定，记录色谱图，即得图24所示的青皮药材HPLC图谱，从下到上分别对应上述青皮A、青皮B、青皮C、青皮D、青皮E、青皮F、青皮G、个青皮H、个青皮I和个青皮J的药材。

(2)计算青皮A、青皮B、青皮C、青皮D、青皮E、青皮F、青皮G、个青皮H、个青皮I和个青皮J中的橙皮苷的含量(含量以wt％计)，结果如下表2所示。

表2

药材含量测定	橙皮苷含量(％)
		A	4.60
B	5.69
		C	6.91
D	6.46
		E	6.62
F	5.69
		G	6.43
个青皮H	8.84
		个青皮I	6.22
个青皮J	5.79

高效液相色谱法检测结果分析：

图24所示的青皮A的HPLC图谱中与其它类的不同：青皮A图谱在45min-50min区域内色谱峰很少，与其他样品明显不一致，且A的橙皮苷含量也相对较低(橙皮苷含量为4.60％，低于药典要求的5.0％)根据药典规定属于不合格品种，故青皮A不适用于用作青皮对照提取物的制备的原料药材。由此在青皮对照提取物的制备中选用青皮B、青皮C、青皮D、青皮E、青皮F、青皮G、个青皮H、个青皮I和个青皮J作为制备青皮对照提取物的原料药材。

二：粗提

根据步骤一的筛选结果选取青皮B、青皮C、青皮D、青皮E、青皮F、青皮G、个青皮H、个青皮I和个青皮J共9个批次药材，制成粉末，药材粉末过二号筛(850±29μm，24目)，然后加入其质量10倍体积的的甲醇(即固液比为1：10(w/V))，超声(功率500w，常温)提取30min后中速定性滤纸过滤，收集滤渣1和滤液1，滤渣1按相同方法再次提取二次，并将再次提取二次收集的滤液与滤液1合并即为提取液，将提取液用旋转蒸发仪蒸干得到青皮粗提物。

三：精制

取青皮粗提物，用纯净水溶解并抽滤得到滤渣，滤渣再用纯净水冲洗至水无色(青皮粗提物与总共用的纯净水的质量体积比为1：5，共冲洗5次)，收集滤渣2，合并多次滤液得到滤液2，滤液2用其2倍重量的D101型大孔树脂层析，先用8个柱体积(1100ml)的纯净水洗脱，洗脱液弃去；再用4个柱体积(550ml)的体积百分浓度为100％的甲醇洗脱，得到洗脱液2，然后将洗脱液2和滤渣2混合，蒸干，得到青皮精制物。

四：拌硅胶研磨过滤

在青皮精制物中添加微粉硅胶，添加量为青皮精制物重量的40％，研磨并过110目筛网，即得青皮B、青皮C、青皮D、青皮E、青皮F、青皮G、个青皮H、个青皮I和个青皮J的青皮提取物。

1青皮提取物分析

1.1薄层色谱分析

1.1.1样品制备

青皮提取物供试品溶液的制备：取实施例1步骤四得到的取青皮提取物(B、C、D、E、F、G1、G2、个青皮H1、个青皮H2)9批各20mg，精密称定，置2ml量瓶中，加甲醇1.5ml，超声(功率500w)处理15分钟，放冷，加甲醇至2ml刻度，摇匀，过0.22μm滤膜即得青皮提取物溶液。

其中青皮提取物G1、G2是青皮G的两个不同批次的青皮提取物；青皮提取物-个青皮H1、青皮提取物-个青皮H2是个青皮H的两个不同批次的青皮提取物，下同。

1.1.2薄层色谱检测

检测条件如下：

针对黄酮苷类的检测，薄层板、展开剂、展开方法同实施例1步骤一中1.2.1；针对针对黄酮苷元类的检测，薄层板、展开剂、展开方法同实施例1步骤一中1.2.2。

点样：化学对照品供试品溶液点样量5μl，青皮提取物供试品溶液点样量1μl，条带状点样。

显色：针对黄酮苷类的检测，方法与实施例1步骤一中1.2.1中的一致；针对针对黄酮苷元类的检测，方法与实施例1步骤一中1.2.2中的一致。

针对黄酮苷类的薄层色谱检测结果如图25所示，针对针对黄酮苷元类的检测结果如图26所示。

1.2高效液相色谱法(HPLC)含量测定

1.2.1供试品制备

青皮提取物供试品溶液的制备：取青皮提取物(B、C、D、E、F、G1、G2、个青皮H1、个青皮H2、个青皮H3、四花青皮、个青皮I1)各25mg，精密称定，置50ml量瓶中，加甲醇30ml，超声(功率500w)处理15分钟，放冷，加甲醇至50ml刻度，摇匀，过0.22μm滤膜即得青皮提取物溶液。

其中青皮提取物-个青皮H3为个青皮H的青皮提取物，与实施例1步骤二不同的是，其是加入甲醇提取7次(对比实施例1步骤二的3次)，合并7次滤液得到的青皮提取物。

其中青皮提取物-四花青皮为将步骤二青皮B-G用甲醇提取3次后的药渣合并继续提取4次，得到四花青皮提取物。

其中青皮提取物-个青皮I1为个青皮I的青皮提取物，与实施例1步骤二不同的是，其是加入甲醇提取7次(对比实施例1步骤二的3次)，合并7次滤液得到的青皮提取物。

1.1.2高效液相色谱检测

检测条件及测定方法同实施例1步骤一中的2.2。

高效液相色谱法检测结果：

(1)测定，记录色谱图，即得图27所示的青皮提取物HPLC图谱，从下到上分别为：青皮B的青皮提取物、青皮C的青皮提取物、青皮D的青皮提取物、青皮E的青皮提取物、青皮F的青皮提取物、青皮G的第一批次青皮提取物(G1)、青皮G的第二批次青皮提取物(G2)、个青皮H1的第一批次青皮提取物(H1)、个青皮的第二批次青皮提取物(H2)(其中青皮提取物-个青皮H3、青皮提取物-四花青皮、青皮提取物-个青皮I1省略)。

(2)计算青皮((B、C、D、E、F、G1、G2、个青皮H1、个青皮H2、个青皮H3、四花青皮、个青皮I1)中的橙皮苷的含量(含量以wt％计)，结果如下表3所示。

表3

编号	对应药材	橙皮苷含量(％)
			1	B	12.46
2	C	16.63
			3	D	16.87
4	E	16.00
			5	F	13.57
6	G1	8.02
			7	G2	8.18
8	个青皮H1	19.19
			9	个青皮H2	17.60

另外三个青皮提取物采用相同方法进行含量测定，结果如表4所示：

表4

编号	对应药材	橙皮苷含量(％)
			10	个青皮H3	39.45
11	四花青皮	19.20
			12	个青皮I1	37.31

分析结果：

1)九批提取物的TLC、HPLC谱图重现性和重复性好，较为一致。由TLC图谱看出四花青皮提取物(B-G)黄酮苷元类成分比个青皮提取物多，暂将两者分开制备最终ERS。

2)HPLC-DAD色谱图显示，各批青皮提取物相似性较好，各指标成分特征峰明显，但提取物G1与G2橙皮苷含量较其他几批为低，故可用青皮提取物-个青皮H3或者青皮提取物-个青皮I1进行调配。

五：调配

经过薄层色谱TLC法和高效液相色谱HPLC法检测，合格的不同来源或批次的青皮提取物按一定比例混合得到青皮对照提取物。调配标准为：应使最终的青皮对照提取物中橙皮苷的含量维持在16％-20％(含量以wt％计)。此调配标准中的橙皮苷的含量的范围也是经过多次反复实验综合保持稳定性、一致性以及后面的应用等得出的最佳数据。

本批次青皮对照提取物的调配方法：取青皮提取物B-G2共7批各取6g，以及10号提取物即青皮提取物-个青皮H3 6g混匀，得到QPERS-1；取8号提取物即青皮提取物-个青皮H17.5g与9号提取物即青皮提取物-个青皮H2 11g混匀，得到QPERS-2。QPERS-1为四花青皮对照提取物，QPERS-2为个青皮对照提取物。对QPERS-1和QPERS-2进行色谱分析：

1薄层色谱分析

1.1样品准备

1)化学对照品(CRS)溶液：取橙皮苷、川陈皮素、红橘素对照品精密称定，分别用甲醇配制成0.1mg/ml的溶液。

2)对照提取物(ERS)溶液：取青皮对照提取物2批(QPERS-1、QPERS-2)适量精密称定，加入甲醇超声(500w)提取30分钟，加甲醇配制成浓度为10mg/ml的溶液，通过0.22μm滤膜，取滤液作为对照提取物溶液。

1.2薄层色谱检测

1.2.1黄酮苷类

薄层板:TLC G60普通硅胶预制板(Merck)。

点样:化学对照品溶液：5μl，条带点样。

对照提取物溶液：1μl，条带点样。

展开剂：氯仿:甲醇:水:冰乙酸＝13:4:1:1.5(10℃以下分层，取下层)。

展开：于双槽展开缸(10cm×10cm)一侧加展开剂10ml，预平衡15分钟。展开上行8.5cm。

检视:先喷以5％AlCl₃乙醇溶液，置薄层加热板上105℃加热5分钟，于UV366nm下检视，拍照。再用5％香草醛10％硫酸乙醇溶液浸渍，置薄层加热板上105℃加热5分钟，于可见光下检视，拍照。

检测结果如图28所示。

1.2.2黄酮苷元类

薄层板和点样同本实施例本步骤1.2.1。

展开：先用展开剂1展开8.5cm，再用展开剂2展开8.5cm。每次展开前双槽展开缸(10cm×10cm)应用10ml展开剂预平衡15分钟，薄层板置薄层加热板上50℃加热15分钟。

检视：展开后挥干薄层板表面溶剂，于366nmUV下检视，拍照。

检测结果如图29所示。

黄酮苷类与黄酮苷元的检测结果分析：从图28、图29可看出青皮ERS及化学对照品TLC色谱图显示，川陈皮素、红橘素化学对照品色谱相应的位置上，青皮ERS色谱显相同颜色的荧光斑点。

2HPLC指纹图谱及含量测定

2.1样品制备

对照品溶液的制备：取橙皮苷对照品适量，精密称定，用甲醇配制成0.1mg/ml的溶液即可。

供试品溶液的制备：取四花青皮ERS(QPERS-1)和个青皮ERS(QPERS-2)适量，精密称定，加入甲醇超声(500w)处理30分钟，放冷，配制成浓度为0.5mg/ml的溶液，过0.22μm的滤膜，取续滤液，即得供试品溶液。

2.2高效液相色谱检测

检测条件：

色谱柱：Zorbax SB C₁₈(4.6×250mm,5μm；Agilent)；流动相：流动相A为乙腈，流动相B为水；

流动相梯度如表5所示。

表5

时间(分钟)	流动相A(％)	流动相B(％)
			0	5	95
30	25	75
			55	95	5
65	95	5

高效液相色谱法检测方法：分别精密吸取参照物溶液和供试品溶液各10μl，注入液相色谱仪。

高效液相色谱法检测结果：

(1)测定，记录色谱图，即得图30所示的青皮药材HPLC图谱，下代表个青皮ERS(QPERS-2)；上代表四花青皮ERS(QPERS-1)，S代表橙皮苷。

(2)并以参照物作为对照品的HPLC的色谱峰计算上述个青皮ERS和四花青皮ERS中的橙皮苷的含量(以干燥品计算，含量以wt％计)，结果如下表6所示。

表6

青皮ERS	橙皮苷含量(％)
		QPERS1	16.21
QPERS2	17.95

因此，本实施例制备得到的四花青皮ERS(QPERS-1)、个青皮ERS(QPERS-2)的经薄层色谱检测黄酮苷类成分和黄酮苷元类成分均符合要求，经高效液相色谱法检测其橙皮苷含量在调配标准范围之内，可作为青皮及含青皮/青皮有效成分的中药制剂的对照提取物。

实施例2青皮对照提取物的性状分析

1表观状态：实施例1得到的青皮对照提取物QPERS-1和QPERS-2均为黄绿色干燥粉末。

2.水分测定：按照2010版中国药典附录IX G(减压干燥法)进行。检测结果为QPERS1含水量为2.70％，QPERS2含水量为2.30％。

3.一致性测试：按照实施例1的方法制备10批次四花青皮ERS(QPERS-1)(6批次)和个青皮ERS(QPERS-2)(4批次)，经测定各批次间的针对黄酮苷类成分和黄酮苷元类成分的薄层色谱检测结果差异很小，橙皮苷、红橘素和川陈皮素的荧光斑点均有明显的显示，且分布非常一致；经高效液相色谱检测其橙皮苷含量均在调配标准范围之内。因此利用本发明的青皮对照提取物的制备方法制备得到的青皮对照提取物一致性非常好。

4.稳定性测试：

取10个不同批次的四花青皮ERS(QPERS-1)(6批次)和个青皮ERS(QPERS-2)(4批次)的供试品，按照国家药典委员会制订的“国家药品标准物质研制技术要求”的相关规定，考察指标包括性状和溶解性。

供试品开口置适宜的洁净容器中，60℃温度下放置10天，于第5天和第10天取样，按稳定性重点考察项目进行检测。

结果显示，高温试验前后供试品性状无明显变化，高温试验前后薄层色谱图也无明显变化，溶出率测定结果用SPSS进行独立样本t-检验，计算结果P＞0.05，说明无显著性差异。

对比例1

与实施例1的区别在于：对实施例1中的步骤一中采用70％乙醇代替甲醇进行，最后得到的青皮提取物的含量为1％～5％(远小于本发明-的8.02-19.19％)，由此可见，其值明显比甲醇提取的得率低的多，只有加大提取量或者次数才有可能调配其橙皮苷含量以达到调配标准范围之内。

实施例3

本实施例提供了对实施例1的青皮对照提取物的应用。

用薄层色谱法以及高效液相色谱法分别以化学对照品和青皮对照提取物为参照物质对市售药材进行分析。

1薄层色谱

1.1样品制备

化学对照品溶液：精密称取橙皮苷、川陈皮素、红橘素、新橙皮苷、柚皮苷各2.5mg，置于25ml容量瓶，加入20ml甲醇，超声(500w)15分钟处理至完全溶解，放冷，定容到25ml刻度线并过0.22μm滤膜即得。

青皮对照提取物溶液：精密称取实施例1制备得到的青皮对照提取物QPERS-1和QPERS-2各20mg，置2ml量瓶中，分别加甲醇1.5ml，超声(500w)处理15分钟，放冷，加甲醇至2ml刻度，摇匀，过0.22μm滤膜即得青皮对照提取物溶液。

药材供试品溶液：取药店药材各0.5g，加甲醇5ml于15ml离心管中，室温浸15分钟，超声(500w)15分钟后取出，离心3分钟(转速为每分钟3200转)，取上清液过0.22um滤膜即得药材供试品溶液。药店药材均买自广州，分别为：青皮1、青皮2、青皮3、青皮4、青皮5、青皮6、青皮7、青皮8、青皮9和青皮10。

1.2薄层色谱检测

检测条件如下：

针对黄酮苷类的检测，条件同实施例1步骤五中1.2.1；针对黄酮苷元类的检测，条件同实施例1步骤五中1.2.2。

针对黄酮苷类的薄层色谱检测结果如图31所示，针对针对黄酮苷元类的检测结果如图32所示。

检测结果：

四花青皮ERS、个青皮ERS及化学对照品TLC色谱图显示，橙皮苷、川陈皮素、红橘素化学对照品色谱相应的位置上，四花青皮ERS、个青皮ERS色谱显相同颜色的荧光斑点。四花青皮ERS和个青皮ERS中未找到与新橙皮苷、柚皮苷相应位置显相同颜色的荧光斑点。

2高效液相色谱

2.1供试品溶液制备

化学对照品溶液：精密称取橙皮苷2.5mg，置于25ml容量瓶，加入20ml甲醇，超声(500w)15分钟处理至完全溶解，放冷，定容到25ml刻度线并过0.22μm滤膜即得。

青皮对照提取物溶液：精密称取实施例1制备得到的青皮对照提取物QPERS-1和QPERS-2各25mg，置于50ml容量瓶中，加入30ml甲醇，超声(500w)15分钟，放冷，加甲醇定容到50ml刻度，并过0.22μm滤膜即得青皮对照提取物溶液。

药材供试品溶液：取药店药材细粉约0.2g，精密称定，置50ml量瓶中，加甲醇30ml，超声(500w)处理30分钟，放冷，加甲醇至50ml刻度，摇匀，滤过，精密量取续滤液2ml，置5ml量瓶中，加甲醇定容至5ml刻度，摇匀，过0.22μm滤膜即得药材供试品溶液。药店药材均买自广州，分别为：青皮1、青皮2、青皮3、青皮4、青皮5、青皮6、青皮7、青皮8、青皮9和青皮10。

2.2高效液相色谱检测

检测条件及检测方法同实施例1的步骤五的2.2。

检测结果如图33所示。

分别利用化学对照品以及对照提取物对药材的橙皮苷含量进行含量测定，结果如表7所示：

表7

两种测定结果的RSD在1.94～4.86之间。将两个测定结果用SPSS进行独立样本t-检验，计算结果P＝0.883＞0.05，说明两种测定方法的结果无显著性差异。结果分析：

根据TLC及HPLC指纹图谱的结果可知，对所述青皮对照提取物(QPERS-1和QPERS-2)采用薄层色谱法检测得到的色谱图与其对应的原料药材一致，更确切的说，对所述青皮对照提取物(QPERS-1和QPERS-2)采用薄层色谱法检测得到的色谱图中的川陈皮素、红橘素和橙皮苷位置处的荧光斑点和采用高效液相色谱法检测得到的色谱图在橙皮苷位置处的色谱峰分别与其对应的化学对照品或其对应的原料药材一致，因此本发明的青皮对照提取物(QPERS-1和QPERS-2)可应用于药材或中药制剂的定性鉴别，例如对药材或中药制剂的黄酮苷类成分和/或黄酮苷元类成分进行定性分析，所述黄酮苷元类成可以是川陈皮素和/或红橘素；所述黄酮苷类成分可以是橙皮苷。

根据HPLC测定结果以及统计分析，说明使用本发明的青皮对照提取物(QPERS-1和QPERS-2)对药材进行橙皮苷的含量测定与使用化学对照品无显著性差异，因此本发明的青皮对照提取物(QPERS-1和QPERS-2)可应用于药材或中药制剂的半定量鉴别分析，也可应用于青皮及含青皮/青皮有效成分的药材或中药制剂的质量控制中，例如对药材或中药制剂的黄酮苷类成分进行半定量鉴别分析，或者对青皮及含青皮/青皮有效成分的药材或中药制剂进行半定量检测进而控制其质量，所述黄酮苷类成分可以是橙皮苷。

Claims

1.一种青皮对照提取物的制备方法，其特征在于，包括对不同来源或批次的青皮药材粉末进行多次提取，得到不同来源或批次的青皮提取物，然后对不同来源或批次的青皮提取物进行调配，得到青皮对照提取物；

所述对不同来源或批次的青皮药材粉末进行多次提取，是使其含有的黄酮苷元类成分和/或黄酮苷类成分的纯度和/或浓度提高，从而得到不同来源或批次的青皮提取物；

所述黄酮苷元类成分为川陈皮素和红橘素；

所述黄酮苷类成分为橙皮苷；

其制备方法具体包括以下步骤：

步骤二、精制：取青皮粗提物，用纯净水溶解并抽滤得到滤渣，滤渣再用纯净水冲洗至水无色，收集滤渣2，合并多次滤液得到滤液2，滤液2用大孔树脂层析；然后先用水冲洗大孔树脂，得到洗脱液1；再用甲醇冲洗大孔树脂，收集洗脱液2；最后将洗脱液2和滤渣2混合，蒸干，得到青皮精制物；

2.根据权利要求1所述的青皮对照提取物的制备方法，其特征在于，在步骤一前还包括对不同来源或批次的青皮药材粉末对应的不同来源或批次的原料药材的筛选。

3.根据权利要求2所述的青皮对照提取物的制备方法，其特征在于，所述对不同来源或批次的青皮药材粉末对应的不同来源或批次的原料药材的筛选包括：将不同来源或批次的原料药材以薄层色谱法和/或高效液相色谱法进行检测；然后对不同来源或批次的原料药材的通过薄层色谱法和/或高效液相色谱法得到的色谱图和/或测定的含量进行比较分析，剔除色谱图和/或测定的含量异常的原料药材，保留色谱图和/或测定的含量一致的原料药材进行下一步的粗提。

4.根据权利要求3所述的青皮对照提取物的制备方法，其特征在于，所述薄层色谱法和/或高效液相色谱法进行检测包括对黄酮苷类成分和/或黄酮苷元类成分的检测。

5.根据权利要求4所述的青皮对照提取物的制备方法，其特征在于，所述黄酮苷元类成分为川陈皮素和红橘素。

6.根据权利要求4所述的青皮对照提取物的制备方法，其特征在于，所述黄酮苷类成分为橙皮苷。

7.根据权利要求1所述的青皮对照提取物的制备方法，其特征在于，所述步骤一中所述的滤渣1按照步骤一的提取方法经过N次提取，并将N次提取收集的滤液与滤液1合并即为提取液，将提取液蒸干得到青皮粗提物；其中6≥N≥0，且N为整数。

8.根据权利要求7所述的青皮对照提取物的制备方法，其特征在于，所述N为2。

9.根据权利要求1所述的青皮对照提取物的制备方法，其特征在于，所述步骤一中的不同来源或批次的青皮药材粉末与甲醇的重量体积比为1:8～1:50。

10.根据权利要求9所述的青皮对照提取物的制备方法，其特征在于，所述步骤一中的不同来源或批次的青皮药材粉末与甲醇的重量体积比为1：10。

11.根据权利要求1所述的青皮对照提取物的制备方法，其特征在于，所述步骤一中的超声时间为30～60min，功率为100W～3kW。

12.根据权利要求11所述的青皮对照提取物的制备方法，其特征在于，所述步骤一中的超声时间为30min，功率为500W。

13.根据权利要求1所述的青皮对照提取物的制备方法，其特征在于，所述步骤一的过滤是用中速滤纸或者2000目筛网过滤。

14.根据权利要求1所述的青皮对照提取物的制备方法，其特征在于，所述步骤二中的滤液2是用其重量1～4倍的大孔树脂层析。

15.根据权利要求14所述的青皮对照提取物的制备方法，其特征在于，所述步骤二中的滤液2是用其重量2倍的大孔树脂层析。

16.根据权利要求14所述的青皮对照提取物的制备方法，其特征在于，所述大孔树脂为非极性大孔树脂。

17.根据权利要求14所述的青皮对照提取物的制备方法，其特征在于，所述大孔树脂的孔径为100～1000nm。

18.根据权利要求14所述的青皮对照提取物的制备方法，其特征在于，所述大孔树脂为D101型大孔树脂。

19.根据权利要求1所述的青皮对照提取物的制备方法，其特征在于，所述步骤二中的大孔树脂层析后，是先用5～10个柱体积纯净水冲洗大孔树脂，收集洗脱液1；再用3～10个柱体积70％～100％甲醇冲洗大孔树脂，收集洗脱液2。

20.根据权利要求19所述的青皮对照提取物的制备方法，其特征在于，所述大孔树脂层析后，是先用8个柱体积纯净水冲洗大孔树脂，收集洗脱液1；再用4个柱体积100％甲醇冲洗大孔树脂，收集洗脱液2。

21.根据权利要求1所述的青皮对照提取物的制备方法，其特征在于，所述步骤三是在青皮精制物加入其重量的20％～50％的微粉硅胶。

22.根据权利要求21所述的青皮对照提取物的制备方法，其特征在于，所述步骤三是在青皮精制物加入其重量的40％的微粉硅胶。

23.根据权利要求1所述的青皮对照提取物的制备方法，其特征在于，所述步骤三研磨后是过90～200目筛网过滤。

24.根据权利要求1所述的青皮对照提取物的制备方法，其特征在于，所述步骤三与步骤四之间还包括以薄层色谱法和/或高效液相色谱法对不同来源或批次的青皮提取物的黄酮苷元类成分和/或黄酮苷类成分进行检测的步骤。

25.根据权利要求24所述的青皮对照提取物的制备方法，其特征在于，所述黄酮苷元类成分为川陈皮素和红橘素。

26.根据权利要求24所述的青皮对照提取物的制备方法，其特征在于，所述黄酮苷类成分为橙皮苷。

27.根据权利要求1所述的青皮对照提取物的制备方法，其特征在于，所述步骤四中调配的标准为：应使最终的青皮对照提取物中橙皮苷的重量百分比含量维持在16％-20％。

28.根据权利要求1所述的青皮对照提取物的制备方法，其特征在于，对所述青皮对照提取物采用薄层色谱法和/或高效液相色谱法得到的图谱与其对应的原料药材一致。

29.根据权利要求1所述的青皮对照提取物的制备方法，其特征在于，对所述青皮对照提取物采用薄层色谱法检测得到的色谱图中的川陈皮素、红橘素和橙皮苷位置处的荧光斑点和采用高效液相色谱法检测得到的色谱图在橙皮苷位置处的色谱峰应分别与其对应的化学对照品或其对应的原料药材一致。