CN104962522B - Aad-1事件das-40278-9、相关的转基因玉米品系及其事件特异性鉴定 - Google Patents

Abstract

本发明部分涉及植物育种和除草剂耐受植物。更具体地涉及AAD‑1事件DAS‑40278‑9、相关的转基因玉米品系及其事件特异性鉴定。本发明包括玉米植物中的新颖aad‑1转化事件，所述事件包含如本文中所述的多核苷酸序列，其***玉米细胞的基因组内的特定位点。在一些实施方案中，所述事件/多核苷酸序列可与其他性状包括，例如其他除草剂耐受基因和/或昆虫抑制性蛋白相“层叠”。此外，本主题发明提供了用于检测(例如玉米粒的)样品中本主题事件的存在的测定法。所述测定法可基于***玉米基因组的重组构建体的DNA序列，和基于所述***位点侧翼的基因组序列。亦提供了可用于进行所述测定的试剂盒和条件。

Description

AAD-1事件DAS-40278-9、相关的转基因玉米品系及其事件特 异性鉴定

本申请是2010年8月18日提交的申请号为201080047187.0(PCT申请号为PCT/US2010/045869)、发明名称为“AAD-1事件DAS-40278-9、相关的转基因玉米品系及其事件特异性鉴定”的发明专利申请的分案申请。

发明背景

aad-1基因(最初来自Sphingobium herbicidovorans)编码芳氧基链烷酸酯双加氧酶(aryloxyalkanoate dioxygenase，AAD-1)蛋白。该性状赋予针对2,4-二氯苯氧基乙酸和芳氧基苯氧基丙酸酯(一般称作“fop”除草剂，如喹禾灵(quizalofop))除草剂的耐受性，并可在植物转化过程中和育种苗圃中用作选择性标记。aad-1基因自身，首先在WO 2005/107437(亦参见US 2009-0093366)中公开其涉及除草剂耐受性。

植物中异源或外源基因的表达受外源基因***染色体的位置影响。这可能由于例如染色质结构(例如异染色质)或转录调节元件(例如增强子)与整合位点的靠近程度(Weising等,Ann.Rev.Genet 22:421-477,1988)。相同类型的转基因植物(或其他生物)中的相同基因可在不同事件的表达水平中呈现广泛的差异。在表达的空间或时间样式上也可能存在差异。举例而言，在多种植物组织中转基因的相对表达的差异可能不对应于因导入的基因构建体中存在的转录调节元件而期待的样式。

因此，常常构建并筛选大量的事件以对于给定目的鉴定表达导入的感兴趣的基因至令人满意的程度的事件。对于商业目的，通常产生成百上千的不同事件，并就具有所需转基因表达水平和样式的单个事件对这些事件进行筛选。具有所需的转基因表达的样式和/或水平的事件可用于将所述转基因通过使用常规育种方法的有性异型杂交(outcross)而渐渗入其他遗传背景。此类杂交的后代保持起始转化体的转基因表达特征。该策略在多种良好适应于当地生长条件的品种中用于确保可靠的基因表达。

美国专利申请20020120964A1和20040009504涉及棉花事件PV-GHGT07(1445)，及其组合物和检测方法。WO 02/100163涉及棉花事件MONI5985，及其组合物和检测方法。WO2004/011601涉及棉花事件MON863，及其组合物和检测方法。WO 2004/072235涉及棉花事件MON88913，及其组合物和检测方法。

WO 2006/098952涉及玉米事件3272。WO 2007/142840涉及玉米事件MIR162。

美国专利号7,179,965涉及具有cry1F事件和cry1Ac事件的棉花。

具有本文中公开的特定事件的AAD-1玉米之前并未公开。

发明内容

本发明涉及命名为DAS-40278-9(具有保藏于美国典型培养物保藏中心(ATCC)的登录号PTA-10244的种子)的AAD-1玉米事件，及由其衍生的后代。本发明的其他方面包括玉米事件DAS-40278-9的后代和种子和植物的可再生(regenerable)部分或谷粒和种子、后代植物，以及从任何上述所制备食物或饲料产品。本发明还包括玉米事件DAS-40278-9的植物部分，其包括但不限于花粉、胚珠、花、茎(shoots)、根和叶，以及营养细胞、花粉细胞和***的细胞核。本发明进一步涉及具有对苯氧基植物生长素性(phenoxy auxinic)和/或芳氧基链烷酸酯除草剂具有耐受性的玉米植物，玉米事件DAS-40278-9的新颖遗传组合物，和包含玉米事件DAS-40278-9的玉米植物的农艺学表现(agronomic performance)方面。

本发明部分涉及植物育种和除草剂耐受性植物。本发明包括玉米植物中的新颖aad-1转化事件，其包含如本文中所述的多核苷酸序列***玉米细胞的基因组内的特异性位点。

在一些实施方案中，所述事件/多核苷酸序列可与其他性状“层叠”，包括，例如其他除草剂耐受性基因和/或昆虫抑制性蛋白。然而，本主题发明包括具有如本文中所述的单一事件的植物。

其他性状可通过含有玉米事件DAS-40278-9的转基因植物的植物育种、重新转化，或通过藉由同源重组的靶向整合添加新性状来层叠入植物基因组。

其他实施方案包括切出包含玉米事件DAS-40278-9的多核苷酸序列，包括例如，pat基因表达盒。当切出多核苷酸序列之后，可将修饰的事件重新靶向特定染色***点，其中其他多核苷酸序列与玉米事件DAS-40278-9层叠。

在一个实施方案中，本发明涵盖了位于在染色体2上在2008DAS玉米连锁图上大约20cM处在SSR标志物UMC1265(参见SEQ ID NO:30和SEQ ID NO:31)和MMC0111(参见SEQ IDNO:32和SEQ ID NO:33)之间的大约20cM处的玉米染色体靶位点，其中所述靶位点包含异源核酸。在另一个实施方案中，如本领域技术人员会理解，本发明涵盖包含在如本文中所述的SEQ ID NO:29及其残基中定义或由如本文中所述的SEQ ID NO:29及其残基定义的位置的玉米染色体靶位点。

在一个实施方案中，本发明涵盖了制备转基因玉米植物的方法，包括将异源核酸***2008DAS玉米连锁图上大约20cM处的SSR标志物UMC1265(参见SEQ ID NO:30和SEQ IDNO:31)和MMC0111(参见SEQ ID NO:32和SEQ ID NO:33)之间的大约20cM处的位置。还在另一个实施方案中，***的异源核酸的5’侧为对于SEQ ID NO:29如本文中所定义的5’侧翼序列的全部或部分，且3’侧为对于SEQ ID NO:29如本文中所定义的3’侧翼序列的全部或部分。

此外，本发明提供了用于检测样品(例如玉米粒)中本主题事件的存在的测定法。所述测定法可基于重组构建体的DNA序列***玉米基因组，和基于在***位点侧翼的基因组序列。还提供了可用于进行所述测定法的试剂盒和条件。

因此，本主题发明部分涉及全部AAD-1***及其边界区(在转基因玉米品系中)的DNA序列的克隆和分析。这些序列是独特的。基于这些***和边界序列，生成了事件特异性引物。PCR分析阐明了可通过对用这些事件特异性引物组生成的PCR扩增子的分析来鉴定这些事件。因此，这些和其他相关方法可用于独特地鉴定包含本主题发明的事件的玉米品系。

附图说明

图1显示pDAS1740的质粒图，标有限制性酶位点。

图2是DAS-40278-9(pDAS1740)玉米的基因组中存在的单个***位点的限制图。显示对于DAS-40278-9(pDAS1740)的***的组分。

图3是DAS-40278-9玉米的基因组中存在的单个***位点的限制图。显示对于DAS-40278-9(pDAS1740)的***的限制图和组分。

图4是玉米事件DAS-40278-9中的DNA***的克隆策略。显示对于DAS-40278-9的DNA***和边界的扩增子、引物和克隆策略。

图5是供确认玉米事件DAS-40278-9的侧翼边界区的PCR扩增中使用的引物的示意图。该概略示意图从5’至3’边界描述了供确认AAD-1玉米事件DAS-40278-9的全长测序的引物位置。图示相对于DAS-40278-9的***和边界的引物位置。

图6图示DAS-40278-9的连接区和***。显示了玉米事件DAS-40278-9的连接区中的DNA序列***。在5’整合连接处的21bp***(斜体)导致从起始基因组基因座的2bp缺失(下划线)。在3’-整合连接处亦发现1bp***(斜体)。

图7是实施例7中提及的育种概略。显示了40278玉米和用于分析的世代的育种示意图。

序列简述

SEQ ID NO:1-28为本文中所述的引物。

SEQ ID NO:29提供了对于本主题事件DAS-40278-9的***和侧翼序列。

SEQ ID NO:30-33为用于实施例4中所述的侧翼标志物的引物。

具体实施方式

本发明部分涉及植物育种和除草剂耐受性植物。本发明包括玉米植物(玉米)的新颖转化事件，其包含如本文中所述的本主题aad-1多核苷酸序列***玉米细胞的基因组内的特异性位点。在一些实施方案中，所述多核苷酸序列可与其他性状“层叠”，(例如如其他除草剂耐受性基因和/或编码昆虫抑制性蛋白的基因)。在一些实施方案中，可以将所述多核苷酸序列切出，其后用别的多核苷酸序列重新靶向。然而，本主题发明包括具有如本文中所述的单一事件的植物。

此外，本主题发明提供了用于检测样品中本主题事件的存在的测定法。本主题发明的诸方面包括设计和/或产生任何本文中例示或提出的诊断性核酸分子，特别是那些全部或部分基于本主题侧翼序列的方法。

更具体而言，本主题发明部分涉及转基因玉米事件DAS-40278-9(亦称作pDAS1740-278)，包含这些事件的植物品系，和该***和/或其边界区的DNA序列的克隆和分析。可使用本文中公开和提出的序列检测本主题发明的植物品系。

在一些实施方案中，本发明涉及除草剂耐受性玉米品系及其鉴定。本主题发明部分涉及检测本主题事件的存在以确定有性杂交的后代是否含有感兴趣的事件。此外，包括了用于检测所述事件的方法，且其有助于例如，遵守要求来源于重组作物植物的食物的上市前批准和标记的规定。可以通过任何公知的核酸检测方法如聚合酶链式反应(PCR)或使用核酸探针的DNA杂交来检测本主题事件的存在。例如，Windels等(Med.Fac.Landbouww,Univ.Gent 64/5b:459462,1999)讨论事件特异性PCR测定法。其涉及使用跨越***和侧翼DNA之间的连接的引物组通过PCR来鉴定草甘膦耐受性大豆事件40-3-2。更具体而言，一个引物含有来自***的序列，而第二引物含有来自侧翼DNA的序列。

通过来自Sphingobium herbicidovorans、编码芳氧基链烷酸双加氧酶(AAD-1)蛋白的aad-1基因的***来修饰玉米。该性状赋予针对2,4-二氯苯氧基乙酸和芳氧基苯氧基丙酸酯(一般称作“fop”除草剂，如喹禾灵)除草剂的耐受性，并可在植物转化过程中和育种苗圃中用作选择性标记。用来自质粒pDAS1740的DNA片段来通过育种进行玉米的转化，以产生事件DAS-40278-9。

从就AAD-1玉米事件DAS-40278-9的分子表征选择的来源于事件DAS-40278-9的五个世代和每世代四株植物的二十株个体玉米植物提取基因组DNA样品。使用AAD-1特异性快速测试条试剂盒(AAD-1specific rapid test strip kit)测试AAD-1蛋白表达。仅选择就AAD-1蛋白表达测试为阳性的植物用于后续的分子表征。Southern杂交确证aad-1基因存在于就AAD-1蛋白表达测试为阳性的玉米植物，且所述aad-1基因当与aad-1基因探针杂交时作为单个完整的拷贝***这些植物。

本文中亦描述了AAD-1玉米事件DAS-40278-9中***的DNA的分子表征。该事件是通过用质粒pDAS1740的Fsp I片段的Whiskers转化来产生的。使用Southern印迹分析建立***的DNA片段的整合样式，并确定事件DAS-40278-9中的aad-1基因的***/拷贝数。生成数据以阐明所述aad-1转基因***玉米基因组的整合和完整性。评价了非编码区(设计用于调节编码区)如启动子和终止子，基质连接区RB7Mar v3和RB7Mar v4的整合的表征，以及世代之间该转基因***的稳定性。在植物的五个不同世代之间阐述了***的DNA的稳定性。此外，通过几乎覆盖质粒pDAS1740的限制性位点(Fsp I)侧翼的整个骨架区的探针阐明了不存在包括氨苄青霉素抗性基因(Ap^r)区的转化质粒骨架序列。基于事件DAS-40278-9的这些Southern印迹分析绘制***的具体物理图。

在玉米组织中确定AAD-1蛋白的水平。此外，对玉米草料(forage)和谷粒进行了组成分析以调查同基因非转化的玉米品系和转基因玉米品系DAS-40278-9(未喷洒的，喷洒2,4-D的，喷洒喹禾灵，以及喷洒2,4-D和喹禾灵)的等价性。亦将同基因非转化的玉米品系的农艺学特征与DAS-40278-9玉米相比。

在同一年在位于Iowa,Illinois(2个位置)，Indiana,Nebraska和Ontario,Canada的六个位置进行非转基因对照和含有芳氧基链烷酸双加氧酶-1(AAD-1)的杂交玉米品系的田间表达，营养组成和农艺学试验。在本文中总结了叶、花粉、根、草料、整株植物和谷粒中AAD-1蛋白的表达水平，农艺学确定的结果，和来自对照和DAS-40278-9AAD-1玉米的草料和谷粒样品的组成分析。

在玉米叶、花粉、根、草料、整株植物和谷粒中使用定量酶联免疫吸附分析(ELISA)方法来测量可溶性、可提取的AAD-1蛋白。如本文中更加详细讨论的，在根和花粉组织中观察到良好的平均表达值。对于所有的喷洒处理以及对于用2,4-D和喹禾灵除草剂喷洒和未喷洒的地块(plot)表达值是类似的。

进行组成分析，包括营养成分(proximates)、矿物质、氨基酸、脂肪酸、维生素、抗营养和次级代谢物，以调查DAS-40278-9AAD-1玉米(经或不经除草剂处理)与对照的等价性。自对照和DAS-40278-9AAD-1玉米地块收集的农艺学分析，对于DAS-40278-9AAD-1组合物样品的结果均相对于对照品系和/或常规玉米一样或更加良好(生物学上和农艺学上)。

如上文在背景部分所提及，转基因导入和整合植物基因组涉及一些随机事件(因此对于表达的给定***使用名称“事件”)。即，存在多种转化技术如土壤杆菌转化，“基因枪(gene gun)”，和WHISKERS的情况下，无法预测转基因会***基因组的何处。因此，鉴定***两侧的侧翼植物基因组DNA对于鉴定具有给定***事件的植物可为重要的。举例而言，可设计生成跨越***和宿主基因组连接区的PCR扩增子的PCR引物。该PCR扩增子可用于鉴定独特或不同类型的***事件。

由于“事件”原本为随机事件，因此作为本公开的一部分，在美国典型培养物保藏中心(American Type Culture Collection(ATCC)，10801University Boulevard,Manassas,VA,20110)保藏了包含所述事件的玉米品系的至少2500个种子，并使公众可以不受限制的获得(但专利权适用)。该保藏命名为ATCC保藏号PTA-10244(黄色马齿型玉米(Yellow Dent maize)杂交种子(Zea Mays L.)：DAS-40278-9，代表Dow AgroSciences LLC保藏；ATTC接收种子/菌株的日期：2009年7月10日，2009年8月17日确认存活)。该保藏是，并会维持是为了专利程序的目的依照布达佩斯条约进行的，并受其涉及种子保藏的条款约束。该保藏会不设限地保持在ATCC保藏机构(其为公开保藏机构)至下述之中最晚者：30年，或最后一次要求之后五年，或本专利的有效期限，并在此期间，若其不具生活力，则会加以替换。

保藏的种子是本主题发明的一部分。显然，可从这些种子培育玉米植物，且此植物是本主题发明的一部分。本主题发明还涉及这些玉米植物中所含的DNA序列，其可用于检测这些植物及其后代。本主题发明的检测方法和试剂盒可涉及鉴定任何一个、两个或甚至所有三个这些事件，取决于该测试的最终目的。

本文中提供的定义和实例是为了帮助描述本发明并指导本领域一般技术人员实施本发明。除非临行指明，应根据相关领域的一般技术人员的常规用法来理解术语。使用如列于37CFR§1.822的DNA碱基命名法。

如用于本文，术语“后代”指包含AAD-1玉米事件DAS-40278-9的亲本植物的任何世代的后代。

转基因“事件”是通过用异源DNA，即含有感兴趣的转基因的核酸构建体转化植物细胞，重新产生由将所述转基因***植物基因组所得的植物群体，并选择由***特定基因组位置所表征的特定植物来产生。术语“事件”指起始转化体和转化体含有所述异源DNA的后代。术语“事件”还指通过转化体和含有基因组/转基因DNA的另一品种之间的有性异型杂交(outcross)产生的后代。即使在与回归(recurrent)亲本的反复回交之后，***的转基因DNA和来自转化的亲本的侧翼基因组DNA(基因组/转基因DNA)仍存在于杂交后代的相同染色***置处。术语“事件”还指来自起始转化体及其包含***的DNA和直接邻接***的DNA的侧翼基因组序列的后代的DNA，期待其会转移至下述后代，所述后代作为一个含有所述***的DNA的亲本系(例如起始转化体和其自交所得的后代)和不含有该***的DNA的亲本系有性杂交的结果而接受了含有感兴趣的转基因的***的DNA。

“连接序列”跨越了***基因组的DNA与来自***点侧翼的玉米天然基因组的DNA连接的点，其中植物基因物质中一种或其他连接序列的鉴定或检测足以对所述事件具诊断性。包括了跨越本文中所述的玉米事件中的***和类似长度的侧翼DNA的DNA序列。本文中提供了此类诊断性序列的具体实例；然而，其他与***的连接处或***和基因组序列的连接处重叠的序列也具诊断性，并可根据本发明使用。

本主题发明涉及此类侧翼、连接处和***序列的鉴定。本发明包括相关的PCR引物和扩增子。根据本主题发明，使用跨越***的DNA及其边界的扩增子的PCR分析方法可用于检测或鉴定商业化的转基因玉米品种或来源于本主题专利的转基因玉米品系的品系。

这些***的每一个的整个序列，以及相应的侧翼序列的部分，在本文中提供为SEQID NO:29。相对于SEQ ID NO:29(总共8557碱基对)的本事件的***和侧翼序列的坐标列于下表。例如，这在实施例3.8中更加详细地讨论。

该***事件，及其其他的组分，进一步图示于图1和2。这些序列(特别是侧翼序列)是独特的。基于这些***和边界序列，生成了事件特异性引物。PCR分析阐明了可通过用对这些事件特异性引物组生成的PCR扩增子的分析来在不同的玉米基因型中鉴定这些玉米品系。因此，这些和其他相关步骤可用于独特地鉴定这些玉米品系。本文中鉴定的序列是独特的。举例而言，针对GENBANK数据库的BLAST检索并未揭示克隆的边界序列与数据库中的序列具有任何显著的同源性。

本主题发明的检测技术特别地可与植物育种一同使用，以确定在为了将一种或多种其他感兴趣的性状赋予后代，将包含感兴趣的事件的亲本植物与另一种植物品系杂交之后，哪些后代植物包含给定事件。这些PCR分析方法有利于玉米育种项目以及质量控制，特别是对于商业化转基因玉米种子。现在亦可制备并使用用于这些转基因玉米品系的PCR检测试剂盒。这亦可帮助产品登记和产品管理。

此外，可使用侧翼玉米/基因组序列以特异性鉴定每个***的基因组位置。该信息可用于制作特异于每一个事件的分子标志物***。这可用于加速育种策略和构建连锁数据。

此外，可使用侧翼序列信息以研究和表征转基因整合过程，基因组整合位点特征，事件分选，转基因及其侧翼序列的稳定性，和基因表达(特别涉及基因静默，转基因甲基化样式，位置效应，和潜在的表达相关元件，如MARS(基质连接区)等)。

对于所有主题公开，应显而易见本主题发明包括以ATCC登录号PTA-10244可获得的种子。本主题发明还包括从以登录号PTA-10244保藏于ATCC的种子培育的除草剂抗性玉米植物。本主题发明进一步包括所述植物的部分，如叶、组织样品、由所述植物产生的种子、花粉等。

此外，本主题发明包括从保藏的种子培育的植物的后裔和/或后代植物，优选为除草剂抗性玉米植物，其中所述植物具有包含如本文所述的可检测的野生型基因组DNA/***DNA接头序列的基因组。如用于本文，术语“玉米”意指玉米(Zea mays)，并包括所有其可与玉米杂交的品种。

本发明进一步包括使用本主题发明的植物作为至少一个亲本来进行杂交的过程。举例而言，本主题发明包括具有本文中例示的任何植物作为一个或两个亲本的F₁杂交植物。本主题发明还包括由此类本主题发明的F₁杂合体产生的种子。本发明包括用于产生F₁杂合体的方法，即将例示的植物与不同(例如，近交的亲本)植物杂交和收获所得的杂交种子。本主题发明包括作为母本或父本的示例性植物。所得的植物的特征亦可通过慎重选择亲本植物来改善。

可培育除草剂耐受性玉米植物，即首先将由本文中提及的任何一种品系种子培育的玉米植物组成的第一亲本玉米植物和第二亲本植物有性杂交，由此产生多株第一后代植物，然后选择对除草剂有抗性的(或拥有本主题发明的至少一种事件的)第一后代植物；并将第一后代植物自交，由此产生多株第二后代植物，然后从第二后代植物选择对除草剂有抗性的(或拥有本主题发明的至少一种事件的)植物。这些步骤可进一步包括将第一后代植物或第二后代植物与第二亲本玉米植物或第三亲本玉米植物回交。然后可种植包含本主题发明或其后代的玉米种子的玉米作物。

亦可理解的是，亦可使两种不同转基因植物交配以产生含有两种独立分离添加的外源基因的后代。合适后代的自交可产生对于两种添加的外源基因为纯合的植物。亦考虑了回交于亲本植物和与非转基因植物的异型杂交，以及营养繁殖。其他常用于不同性状和作物的育种方法在本领域是已知的。使用了回交育种以将简单遗传的高度可遗传性状的基因转移至期望的纯合栽培种或近交系，其为回归亲本。待转移的性状的来源称为供体亲本。期待所得的植物具有回归亲本(例如栽培种)的特征和从供体亲本转移的期望的性状。在起始杂交之后，选择了拥有供体亲本的表型的个体，并将其反复与回归亲本杂交(回交)。预期所得的亲本具有回归亲本(例如栽培种)的特征，和从供体亲本转移的期望的性状。

本发明的DNA分子可作为分子标志物用于标志物协助育种(MAB)方法。本发明的DNA分子可如本领域已知地用于鉴定遗传连锁的农艺学上可用的性状的方法(如AFLP标志物，RFLP标志物，RAPD标志物，SNP和SSR)。可使用MAB方法在与本主题发明的玉米植物的杂交(或其后代和任何其他玉米栽培种或品种)的后代中追踪除草剂抗性性状。所述DNA分子为针对该性状的标志物，且本领域中公知的MAB方法可用于追踪玉米植物中的除草剂抗性性状，其中至少一种本主题发明的玉米品系或其后代为亲本或祖先。本发明的方法可用于鉴定具有本主题事件的任何玉米品种。

本主题发明的方法包括产生除草剂耐受玉米植物的方法，其中所述方法包括用本主题发明的植物育种。更具体而言，所述方法可包括将两株本主题发明的植物杂交，或一株本主题发明的植物与任何其他植物杂交。优选的方法进一步包括通过就根据本主题发明可检测的事件分析所述后代来选择所述杂交的后代。举例而言，本主题发明可用于通过与包含其他所需的性状如农艺学性状(如本文中在多个实施例中测试的那些)的植物的育种循环来追踪本主题事件。可检测、鉴定、选择包含本主题事件和所需的性状的植物，并例如在进一步的育种轮次中快速使用。本主题事件/性状亦可通过育种来与昆虫抗性性状和/或其他的除草剂耐受性状组合，并根据本主题发明进行追踪。后者的一种优选实施方案为包含与编码对除草剂麦草畏(dicamba)的抗性的基因组合的本主题事件的植物。

因此，本主题发明可与，例如编码草甘膦抗性(例如抗性植物或细菌EPSPS，GOX，GAT)，草铵膦抗性(例如Pat，bar)，乙酰乳酸合酶(ALS)抑制性除草剂抗性(例如咪唑啉酮[如咪草烟(imazethapyr)]、磺酰脲、***并嘧啶磺酰苯胺、嘧啶基硫代苯甲酸类和其他化学物[Csr1，SurA等])，溴苯腈抗性(例如Bxn)，对HPPD酶(4-羟基苯基丙酮酸双加氧酶)抑制剂的抗性，对八氢番茄红素去饱和酶(phytoene desaturase)(PDS)的抑制剂的抗性，对光***II抑制性除草剂(例如psbA)的抗性，对光***I抑制性除草剂的抗性，对原卟啉原氧化酶(protoporphyrinogen oxidase IX(PPO))抑制性除草剂(例如PPO-1)的抗性，对苯基脲除草剂(例如CYP76B1)的抗性，麦草畏降解酶(dicamba-degrading enzyme)(参见，例如US20030135879)，和其他可单独或以多种组合层叠的性状相组合，以提供有效控制或预防杂草演替(weed shift)的能力和/或对于任何前述类型的除草剂的抗性。

考虑其他除草剂，一些其他的优选ALS(亦称作AHAS)抑制剂包括***并嘧啶磺酰苯胺(如氯酯磺草胺(cloransulam-methyl)，双氯磺草胺(diclosulam)，双氟磺草胺(florasulam)，氟唑啶草(flumetsulam)，磺草唑胺(metosulam)和五氟磺草胺(penoxsulam))，嘧啶基硫代苯甲酸类(如双嘧草醚(bispyribac)和嘧草硫醚(pyrithiobac))，和氟酮磺隆(flucarbazone)。一些优选的HPPD抑制剂包括甲基磺草酮(mesotrione)，异氟草(isoxaflutole)和磺草酮(sulcotrione)。一些优选的PPO抑制剂包括氟烯草酸(flumiclorac)，丙炔氟草胺(flumioxazin)，氟哒嗪草酯(flufenpyr)，吡草醚(pyraflufen)，哒草氟(fluthiacet)，氟丙嘧草酯(butafenacil)，氟酮唑草(carfentrazone)，磺酰唑草酮(sulfentrazone)和二苯基醚类(diphenylethers)(如三氟羧草醚(acifluorfen)，氟磺胺草醚(fomesafen)，乳氟禾草灵(lactofen)和乙氧氟草醚(oxyfluorfen))。

此外，AAD-1自身或与一种或多种其他HTC性状层叠的AAD-1，可与一种或多种其他输入(例如，昆虫抗性，真菌抗性，或应激耐受性等)或输出(例如增加的产量，改善的油分布(profile)，改善的纤维品质等)性状层叠。因此本主题发明可用于提供改善的作物品质与灵活且合算地控制任何数量的农艺学病虫害的能力的完整农艺学套组(package)。

本领域内已描述了通过同源重组将多核苷酸序列整合在植物细胞的特定染色***点内的方法。举例而言，描述于美国专利申请公开号2009/0111188A1的位点特异性整合描述了使用重组酶或整合酶介导将供体多核苷酸序列导入染色体靶。此外，国际专利申请号WO 2008/021207描述了将一种或多种供体多核苷酸序列整合入基因组特定位置内的锌指介导的同源重组。可利用重组酶如描述于美国专利号6720475的FLP/FRT或描述于美国专利号5658772的CRE/LOX的用途来将多核苷酸序列整合入特定染色***点。最后，大范围核酸酶在将供体多核苷酸靶向具体染色***置的用途描述于Puchta等,PNAS USA 93(1996)pp.5055-5060。

其他多种用于在植物细胞内位点特异性整合的方法一般是已知并可使用的(Kumar等,Trands in Plant Sci.6(4)(2001)pp.155-159)。此外，在数种原核和低等真核生物中鉴定的位点特异性重组***可适用于在植物中使用。此类***的实例包括但不限于：来自酵母Zygosaccharomyces rouxii的pSR1质粒的R/RS重组酶***(Araki等(1985)J.Mol.Biol.182:191-203)，和噬菌体Mu的Gin/gix***(Maeser和Kahlmann(1991)Mol.Gen.Genet.230:170-176)。

在本发明的一些实施方案中，可需要将新的转基因整合或层叠至既存的转基因时间附近。该转基因事件可视为基于下述独特的特征而选择的优选的基因组位点：如单个***位点，正常的孟德尔分离和稳定表达，以及下述效力的优越组合，包括在多个环境位置及其之间的除草剂耐受性和农艺学表现。新整合的抓基因应维持现存转化体的转基因表达特征。而且，因为已经鉴定了新整合事件的基因组侧翼序列和染色***置，会解决新整合事件的确认和检测方法的开发。最后，将新转基因整合入与既存转基因连锁的特定染色***置会加速该转基因通过使用常规育种方法的有性异型杂交而渐渗入其他遗传背景。

在本发明的一些实施方案中，会需要从转基因事件切出多核苷酸序列。举例而言，如描述于美国专利临时申请号61/297,628的转基因切出描述了使用锌指核酸酶以从染色体整合的转基因事件去除由基因表达盒组成的多核苷酸序列。去除的多核苷酸序列可为选择性标记。在切出和去除多核苷酸序列之后，可通过***多核苷酸序列重新靶向修饰的转基因事件。多核苷酸的切出及之后修饰的转基因事件的重新靶向提供了优点如重新使用选择性标记或克服特定基因的表达所致的对植物转录组(transcriptome)的非意图变化的能力。

在本文中，本主题发明公开了玉米基因组中染色体2上的特定位点，其非常适于***异源核酸。还公开了可用于鉴定染色体2上靶位点的位置的5’分子标志物，3’分子标志物，5’侧翼序列和3’侧翼序列。因此，本主题发明提供了将感兴趣的异源核酸导入该预制的靶位点或该靶位点附近的方法。本主题发明还涵盖了包含任何***在公开的靶位点处或在该位点大致附近的异源核苷酸序列的玉米种子和/或玉米植物。一个实现此种靶向整合的选项是在本文中例示的pat表达盒的位置处切出和/或取代为不同的***。就此一般性考虑，可根据本主题发明使用例如靶向同源重组，但不限于此。

如用于本文，将基因、事件或性状“层叠”是将所需的性状组合入一个转基因品系。植物育种者通过在各具有所需性状的亲本之间进行杂交，然后鉴定具有所有这些所需性状的后代来将转基因性状层叠。另一种层叠基因的方式是通过在转化过程中同时将两种或更多种基因转移至植物细胞核中。另一种层叠基因的方式是通过用另一种感兴趣的基因重新转化转基因植物。举例而言，可使用基因层叠以组合两种或更多种不同性状，包括例如两种或更多种不同昆虫性状，昆虫抗性性状和疾病抗性性状，两种或更多种除草剂抗性性状，和/或昆虫抗性性状和除草剂抗性性状。除了感兴趣的基因之外还使用选择性标记亦可视为基因层叠。

“同源重组”指任何具有包含类似核苷酸序列的对应位点的核苷酸序列对之间的反应，且通过该反应两种核苷酸序列可相互作用(重组)形成新的、重组的DNA序列。类似核苷酸序列的位点在本文中各自称作“同源序列”。一般地，同源重组的频率随着同源序列的长度的增加而增加。因此，尽管同源重组可在两种并非完全相同的核苷酸序列之间发生，其重组频率(或效率)随着两种序列之间的差异的增加而衰减。重组可使用每个供体和靶分子上各一个同源序列来实现，由此生成了“单交叉”重组产物。或者，可在每个靶和供体核苷酸序列上配置两个同源序列。供体上的两个同源序列与靶上的两个同源序列之间的重组生成了“双交叉”重组产物。若供体分子上的同源序列位于待操纵的序列(例如，感兴趣的序列)两侧，与靶分子的双交叉重组会得到下述重组产物，其中感兴趣的序列替代起初位于靶分子上的同源序列之间的DNA序列。靶和供体之间通过双交叉重组事件所致的DNA序列交换命名为“序列替代”。

本主题的AAD-1酶使得转基因表达能够发生，得到了对本应控制几乎所有宽叶和禾本科杂草的除草剂组合的耐受性。AAD-1可充当优异的除草剂耐受性作物(HTC)性状以与例如其他HTC性状(例如草甘膦抗性，草铵膦抗性，咪唑啉酮抗性，溴苯腈抗性等)，和昆虫抗性性状(Cry1F、Cry1Ab、Cry34/45等)相层叠。此外，AAD-1可充当选择性标记以协助选择用第二基因或基因集合遗传工程改造的植物初级转化体。

本主题发明的HTC性状可用于与其他HTC性状(包括但不限于草甘膦耐受性)的新颖组合。这些性状的组合，由于对除草剂(例如草甘膦)新获得的抗性或固有的耐受性而导致新颖的控制杂草(等)物种的方法。因此，除了HTC性状之外，本发明的范围还包括使用除草剂(对其已经通过转基因作物中的所述酶而构建了除草剂耐受性)控制杂草的新颖方法。

此外，全世界范围内草甘膦耐受性作物是普遍的。许多时候，当与其他草甘膦耐受性作物轮作时，在轮作作物中控制草甘膦抗性自发生长的植物(volunteer)可为困难的。因此，层叠或分别转化入作物的本主题转基因性状的使用，提供了供控制其他HTC自发生长作物的工具。

本主题发明的优选的植物或种子在其基因组中包含本文中鉴定的***序列，以及本文中鉴定的在所述***的两侧至少20-500或更多个连续的侧翼核苷酸。除非另行指明，当提及侧翼序列时，是指相对于SEQ ID NO:29(参见上标)鉴定的那些。同样，SEQ ID NO:29含有在起始转化体中***的异源DNA，和紧邻着***的DNA的例示性侧翼基因组序列。可期待将这些侧翼序列的全部或部分转移至作为含有该事件的亲本品系的有性杂交的结果而接收该***的DNA的后代。

本主题发明包括本主题发明的植物的可再生细胞的组织培养。还包括了从此种组织培养再生的植物，特别是当所述植物能够表达例示的品种的所有形态和生理特性时。本主题发明的优选植物具有从保藏的种子培育的植物的所有生理和形态特征。本发明进一步包括拥有感兴趣的品质性状的种子和此种种子的后代。

对植物或种子或其部分的操纵(如突变，进一步转染和进一步育种)，可导致可命名为“基本上衍生”的品种的构建。International Union for the Protection of NewVarieties of Plants(UPOV)提供了下述规程以供确定某品种是否基本上衍生自受保护的品种：

[A]在下述情况下，该品种应视为基本上衍生自另一品种(“起始品种”)：

(i)其主要衍生自起始品种，或来源于自身主要衍生自起始品种的品种，而保留所述起始品种的基因型或基因型组合所致的基本特征的表达；

(ii)其与所述起始品种明显可区分；和

(iii)除了衍生作用所致的差别，其与所述起始品种在所述起始品种的的基因型或基因型组合所致的基本特征的表达方面一致。

UPOV,Sixth Meeting with International Organizations,Geneva,Oct.30,1992；由Office of the Union准备的文件。

如用于本文，“品系”为一组对于至少一种性状在个体间显示很少或没有遗传差异的植物。此类品系可通过几个世代的自花授粉和选择，或从单个亲本使用组织或细胞培养技术进行的营养繁殖来构建。

如用于本文，术语“栽培种”和“品种”是同义词，并指用于商业生产的品系。

“稳定性”或“稳定的”意指对于给定组分，该组分在世代间，且优选至少三个世代保持在基本上相同的水平，例如优选±15％，更优选±10％，最优选±5％。稳定性可受温度、位置、应激和种植时间影响。在田间条件下后续世代的比较应以类似方式产生所述组分。

“商业实用性”定义为具有良好的植物活力(vigor)和高可育性，使得该作物可由农民使用常规耕作设备来产生，且可使用常规压榨和提取设备从种子提取具有所述组分的油。为了具有商业实用性，如通过种子重量、油含量和每英亩产生的全部的油测量的产率在其他方面相同的在相同区域种植的不具有优等价值性状的商业性芸苔品种的平均产率的15％以内。

“农艺学上优秀的”意指品系除了由于本主题事件的昆虫抗性之外，还具有期望的农艺学特征如产率、成熟性、疾病抗性等。如下文实施例中所示，本主题发明的范围还包括在包含本主题发明的事件的植物中单独或以任何组合采用农艺学性状。这些农艺学特征和数据点中的任何和全部可用于鉴定这类植物，或者作为一系列用于鉴定这类植物的特征中的一个点或者作为任一端或两端。

如本领域技术人员根据本公开可知，检测试剂盒的优选实施方案，例如，可含有涉及和/或包含“连接序列”或“过渡序列”(在此玉米基因组侧翼序列连接***序列)的引物和/或探针。举例而言，这包括涉及用于鉴定一个或两个连接序列(在此***连接侧翼序列)的多核苷酸探针、引物和/或扩增子，如表1中所示。一种常见设计是具有一个在侧翼区中杂交的引物和一个在***中杂交的引物。此类引物通常每个的长度为约至少～15个残基。有了这种配置，所述引物可用于生成/扩增可检测的扩增子，其指示本主题发明的事件的存在。这些引物可用于生成跨越(并含有)如上所指示的连接序列。

在侧翼序列中“触地(touch down)”的引物通常设计为不超越约200个碱基或超越连接处而杂交。因此，通常的侧翼引物应设计为包含从***起始位置进入侧翼序列200个碱基以内的任一链的至少15个残基。即，包含SEQ ID No:29的残基～1674-1873和/或～6690-6890中的合适大小的序列的引物落在本主题发明的范围内。同样，***引物可设计为在***上任何位置，但例如可将残基～1874-2074和～6489-6689非排他性地用于此种引物设计。

本领域技术人员亦会知道可将引物和探针设计为在一定范围的标准杂交和/或PCR条件下杂交于SEQ ID No:29(或其互补物)的片段，及其互补物，其中所述引物或探针并不完美地互补于所例示的序列。即，可容忍一定程度的错配。对于大约20个核苷酸的引物，例如，若错配的碱基在引物的内部或与扩增子相反的末端，通常一个或两个左右的核苷酸并不需要与相反链结合。下面提供了多种适当的杂交条件。合成的核苷酸类似物，如次黄嘌呤核苷，亦可用于探针。亦可使用肽核酸(PNA)探针，以及DNA和RNA探针。重要的是此类探针和引物对于本主题发明的事件的存在是诊断性的(diagnostic)(能够独一无二地鉴定和区分)。

应指出PCR扩增中可发生错误，其可例如导致次要的测序错误。即，除非另行指明，本文中列出的序列是通过从玉米基因组DNA生成长扩增子，然后克隆所述扩增子并对其测序而确定的。考虑到为了从基因组DNA测序而生成充足扩增子所需的多轮次扩增，在以此方式生成和确定的序列中发现细微差别和次要抵牾并非异常。本领域技术人员应理解并留意由于这些类型的常见测序错误或抵牾所需的任何调整落在本主题发明的范围内。

亦应指出一些基因组序列的缺失并非罕见，例如，当在构建事件过程中***序列时。因此，例如可在本主题的侧翼序列和GENBANK中列出的基因组序列之间存在一些差异。

一些这类差异在下文中实施例部分讨论。可相应地对探针和引物进行调整。

每种“***”的组分图示于图1和2，并在下文实施例中更加详细地讨论。这些组分，或其片段的DNA多核苷酸序列，可在本发明的方法中用作DNA引物或探针。

在本发明的一些实施方案中，提供了在来自玉米植物的植物和种子等中用于检测转基因/基因组***区的存在的组合物和方法。提供了包含本文中提供的本主题转基因/基因组***区连接序列的DNA序列(SEQ ID No:29的残基1873-1874和6689-6690之间)，其区段，及例示序列的互补物及其任何区段。该***区连接序列跨越***基因组的异源DNA和来自所述***位点侧翼的玉米细胞的DNA之间的连接。此类序列对于给定事件可具诊断性。

基于这些***和边界序列，可生成事件特异性引物。PCR分析阐明可通过分析用这些事件特异性引物组生成的PCR扩增子来在不同玉米基因组中鉴定本主题发明的玉米品系。这些和其他相关的方法可用于独特地鉴定这些玉米品系。因此衍生自此类引物对的PCR扩增子是独特的，且可用于鉴定这些玉米品系。

在一些实施方案中，本发明的一个方面是包含新颖转基因/基因组***区的连续片段的DNA序列。包括了下述DNA序列，其包含充足长度的转基因***序列的多核苷酸和充足长度来自三种前述玉米植物中的一种或多种的玉米基因组序列的多核苷酸和/或可用作引物序列的序列以供产生对于一种或多种这些玉米植物具有诊断性的扩增子产物。

相关的实施方案涉及本文中鉴定的DNA序列的转基因区(如SEQ ID No:29及其片段)包含至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25或更多个连续核苷酸或其互补物的DNA序列，和来自这些序列的类似长度的侧翼玉米DNA序列，或其互补物。此类序列可作为DNA引物用于DNA扩增方法。使用这些引物产生的扩增子对于本文中提及的任意玉米事件具有诊断性。因此，本发明还包括通过此类DNA引物和同源引物产生的扩增子。

本发明还包括在样品中检测对应于本文中提及的玉米事件的DNA存在的方法。此类方法可包括：(a)将包含DNA的样品与引物组相接触，所述引物组当用于用来自这些玉米事件至少之一的DNA进行的核酸扩增反应时，产生对于所述事件具诊断性的扩增子；(b)进行核酸扩增反应，由此产生所述扩增子；和(c)检测所述扩增子。

本主题发明的进一步的检测方法包括在样品中检测对应于至少一种所述事件的DNA的存在的方法，其中所述方法包括：(a)将包含DNA的样品与在严格杂交条件下与来自所述玉米事件至少之一的DNA杂交，而不在严格杂交条件下与对照玉米植物(非感兴趣的事件的DNA)杂交的探针相接触；(b)对所述样品和探针施以严格杂交条件；和(c)检测所述探针对所述DNA的杂交。

仍在进一步的实施方案中，本主题发明包括产生玉米植物的方法，所述玉米植物包括本发明的aad-1事件，其中所述方法包括下述步骤：(a)将第一亲本玉米品系(包含本发明的表达盒，其赋予所述品系的植物以所述除草剂抗性性状)与第二亲本玉米品系(其缺乏该除草剂耐受性性状)有性杂交，由此产生多株后代植物；和(b)通过使用分子标志物选择后代植物。此方法可任选地包括将所述后代植物与第二亲本玉米品系回交以产生包含所述昆虫耐受性状的真育种(true-breeding)玉米植物的进一步步骤。

根据本发明的另一个方面，提供了确定与所述三种事件至任一(或多个)杂交的后代的接合性(zygosity)的方法。所述方法可包括将包含玉米DNA的样品与本主题的引物组相接触。此种引物，当用于使用来自所述玉米事件至少之一的基因组DNA的核酸扩增时，产生对于所述玉米事件至少之一具诊断性的第一扩增子。此方法进一步包括进行核酸扩增反应，由此产生第一扩增子；检测所述第一扩增子，并将包含玉米DNA的样品与所述引物组相接触，当将所述引物组用于使用来自玉米植物的基因组DNA的核酸扩增反应中时，产生包含与所述玉米基因组区同源的天然玉米基因组DNA的第二扩增子；并进行核酸扩增反应，由此产生第二扩增子。所述方法进一步包括检测所述第二扩增子，和在样品中比较所述第一和第二扩增子，其中两种扩增子的存在表明该样品对于所述转基因***是杂合的。

可使用本文中公开的组合物和DNA检测领域公知的方法开发DNA检测试剂盒。所述试剂盒可用于在样品中鉴定本主题玉米事件DNA，并可应用于供育种含有该DNA的玉米植物的方法。所述制剂盒含有与所述扩增子同源或互补的DNA序列，所述扩增子例如本文中公开的扩增子，或同与本主题事件的转基因遗传元件中所含DNA同源或互补的DNA序列同源或互补的DNA序列。这些DNA序列可用于DNA扩增反应，或作为DNA杂交方法中的探针。所述试剂盒亦可含有进行检测方法所需的试剂和材料。

“探针”是附于常规的可检测标记或报道分子(如放射性同位素、配体，化学发光剂或酶)的分离的核酸分子。此种探针与靶核酸的链互补，在本发明的情况下，与来自所述玉米事件之一的基因组DNA的链互补，无论所述其来自玉米植物或来自含有由所述事件所得的DNA的样品。本发明的探针不仅包括脱氧核糖核酸或核糖核酸，且还包括聚酰胺和其他特异性结合于靶DNA序列并可用于检测所述靶DNA序列存在的探针物质。

“引物”为通过核酸杂交与互补靶DNA链退火以形成引物和靶DNA链之间的杂合体，然后由聚合酶例如DNA聚合酶沿所述靶DNA链延伸的分离的/合成的核酸。本发明的引物对涉及其用于扩增靶核酸序列(例如通过聚合酶式反应(PCR)或其他常规核酸扩增方法)的用途。

探针和引物的长度一般为5，6，7，8，9，10，11，12，13，14，15，16，17，18，19，20，21，22，23，24，25，26，27，28，29，30，31，32，33，34，35，36，37，38，39，40，41，42，43，44，45，46，47，48，49，50，51，52，53，54，55，56，57，58，59，60，61，62，63，64，65，66，67，68，69，70，71，72，73，74，75，76，77，78，79，80，81，82，83，84，85，86，87，88，89，90，91，92，93，94，95，96，97，98，99，100，101，102，103，104，105，106，107，108，109，110，111，112，113，114，115，116，117，118，119，120，121，122，123，124，125，126，127，128，129，130，131，132，133，134，135，136，137，138，139，140，141，142，143，144，145，146，147，148，149，150，151，152，153，154，155，156，157，158，159，160，161，162，163，164，165，166，167，168，169，170，171，172，173，174，175，176，177，178，179，180，181，182，183，184，185，186，187，188，189，190，191，192，193，194，195，196，197，198，199，200，201，202，203，204，205，206，207，208，209，210，211，212，213，214，215，216，217，218，219，220，221，222，223，224，225，226，227，228，229，230，231，232，233，234，235，236，237，238，239，240，241，242，243，244，245，246，247，248，249，250，251，252，253，254，255，256，257，258，259，260，261，262，263，264，265，266，267，268，269，270，271，272，273，274，275，276，277，278，279，280，281，282，283，284，285，286，287，288，289，290，291，292，293，294，295，296，297，298，299，300，301，302，303，304，305，306，307，308，309，310，311，312，313，314，315，316，317，318，319，320，321，322，323，324，325，326，327，328，329，330，331，332，333，334，335，336，337，338，339，340，341，342，343，344，345，346，347，348，349，350，351，352，353，354，355，356，357，358，359，360，361，362，363，364，365，366，367，368，369，370，371，372，373，374，375，376，377，378，379，380，381，382，383，384，385，386，387，388，389，390，391，392，393，394，395，396，397，398，399，400，401，402，403，404，405，406，407，408，409，410，411，412，413，414，415，416，417，418，419，420，421，422，423，424，425，426，427，428，429，430，431，432，433，434，435，436，437，438，439，440，441，442，443，444，445，446，447，448，449，450，451，452，453，454，455，456，457，458，459，460，461，462，463，464，465，466，467，468，469，470，471，472，473，474，475，476，477，478，479，480，481，482，483，484，485，486，487，488，489，490，491，492，493，494，495，496，497，498，499或500个核苷酸或更长。此类探针和引物在高严格杂交条件下与靶序列特异性杂交。优选地，本发明的探针和引物与靶序列具有完全的序列类似性，尽管可通过常规方法设计与靶序列不同并保留与靶序列杂交能力的探针。

用于制备和使用探针和引物的方法描述于例如Molecular Cloning:ALaboratory Manual,2nd ed.,vol.1-3,ed.Sambrook等,Cold Spring Harbor LaboratoryPress,Cold Spring Harbor,N.Y.,1989。PCR-引物对可从已知序列，例如通过使用为此目的的计算机程序来衍生。

基于本文中公开的侧翼DNA和***序列的引物和探针可用于确证(且视需要，改正)通过常规方法，例如通过重新克隆和对此类序列测序而披露的序列。

本发明的核酸探针和引物在严格条件下与靶DNA序列杂交。可使用任何常规核酸杂交或扩增方法以鉴定样品中来自转基因事件的DNA的存在。核酸分子或其片段能够在某些情况下特异性杂交于其他核酸分子。如用于本文，若两个核酸分子能够形成反平行双链核酸结构，则称该两个分子能够彼此特异性杂交。若两个核酸分子呈现完全互补性，则称一个核酸分子为另一个核酸分子的“互补物”。如用于本文，当一个分子的每一个核苷酸互补于另一个分子的核苷酸时，称这些分子呈现“完全互补性”。若两个分子可以以足够的稳定性相互杂交以允许其在至少常规的“低严格”条件下维持彼此粘合(anneal)，则称其为“最低限度互补的(minimally complementary)”。类似地，若两个分子可以以足够的稳定性相互杂交以允许其在常规的“高严格”条件下维持彼此粘合，则称其为“互补的”。常规的严格条件描述于Sambrook等,1989。因此，可允许与完全互补的偏离，只要该偏离并不完全排除分子形成双链结构的能力。为了使核酸分子充当引物或探针，仅需其序列充分互补以能够在采用的特定溶剂和盐浓度下形成稳定的双联结构。

如用于本文，基本上同源的序列是会与其在高严格条件下进行比较的核酸序列的互补物特异性杂交的核酸序列。术语“严格条件”是对于核酸探针对靶核酸通过Sambrook等,1989在9.52-9.55处讨论的特异性杂交步骤而杂交进行的功能限定(还可见于Sambrook等，1989,9.47-9.52和9.56-9.58)。相应地，本发明的核苷酸序列可就其与DNA片段的互补段选择性低形成双链体分子的能力而使用。

取决于考虑到的应用，可使用多种杂交条件以获得探针对靶序列的不同程度的选择性。对于需要高选择性的应用，可通常采用相对严格的条件来形成杂合体，例如，会选择相对低盐和/或高温度的条件，如由约0.02M至约0.15M NaCl在约50℃至约70℃的温度提供的条件。严格条件，例如，可涉及用高严格性洗涤缓冲液(0.2X SSC，0.1％SDS，65℃)洗涤杂交滤纸至少两次。促进DNA杂交的适当严格条件，例如在约45℃的6.0X氯化钠/柠檬酸钠(SSC)，接着在50℃用2.0X SSC的洗涤，对于本领域技术人员是已知的,6.3.1-6.3.6。举例而言，洗涤步骤中的盐浓度可选自在50℃的约2.0X SSC的低严格度至在50℃的约0.2X SSC的高严格度。此外，洗涤步骤中的温度可从室温约22℃的低严格条件增加至约65℃的高严格条件。温度和盐均可变化，或可将温度或盐浓度之一维持恒定的同时改变另一个变量。此类选择性条件几乎不容忍探针和模板或靶链之间的错配(若有的话)。通过杂交检测DNA序列对于本领域技术人员是公知的，且美国专利号4,965,188和5,176,995的教导是杂交分析方法的实例。

在一个特别优选的实施方案中，本发明的核酸会在高严格条件下特异性杂交于本文中例示或提出的一种或多种引物(或扩增子或其他序列)，包括其互补物和片段。在本发明的一个方面，本发明的标志物核酸分子具有SEQ ID NO:3-14中列出的核酸序列，或其互补物和/或片段。

在本发明的另一个方面，本发明的标志物核酸分子与此类核酸序列分享80％至100％或90％至100％的序列同一性。在本发明的进一步的方面，本发明的标志物核酸分子与此种序列分享95％至100％的序列同一性。此类序列可用作植物育种方法中的标志物以鉴定遗传杂交的后代。探针对靶DNA分子的杂交可通过任何本领域技术人员已知的数种方法来检测，其可包括但不限于荧光标记，放射性标记，基于抗体的标记和化学发光标记。

对于使用特定扩增引物对扩增靶核酸序列(例如，通过PCR)，“严格条件”为允许引物对仅杂交于会与具有对应的野生型序列(或其互补物)的引物结合并优选产生独特扩增产物即扩增子的靶核酸序列的条件。

术语“特异于(靶序列)/对(靶序列)特异性的”表明探针或引物在严格杂交条件下仅与包含所述靶序列的样品中的靶序列杂交。

如用于本文，“扩增的DNA”或“扩增子”指作为核酸模板一部分的靶核酸序列的核酸扩增产物。举例而言，为了确定从有性杂交获得的玉米植物是否含有来自本发明的玉米植物的转基因事件基因组DNA，可对从玉米植物组织提取的DNA进行使用引物对的核酸扩增方法以产生对于所述事件DNA的存在为诊断性的扩增子，所述引物对包括来源于所述植物基因组中邻近***的异源DNA***位点的侧翼序列的引物，和来源于***的异源DNA的第二引物。所述扩增子的长度和具有的序列使其亦对该事件具诊断性。所述扩增子的长度的范围可为引物对的合并长度加上一个核苷酸碱基对，和/或引物对的合并长度加上约2，3，4，5，6，7，8，9，10，11，12，13，14，15，16，17，18，19，20，21，22，23，24，25，26，27，28，29，30，31，32，33，34，35，36，37，38，39，40，41，42，43，44，45，46，47，48，49，50，51，52，53，54，55，56，57，58，59，60，61，62，63，64，65，66，67，68，69，70，71，72，73，74，75，76，77，78，79，80，81，82，83，84，85，86，87，88，89，90，91，92，93，94，95，96，97，98，99，100，101，102，103，104，105，106，107，108，109，110，111，112，113，114，115，116，117，118，119，120，121，122，123，124，125，126，127，128，129，130，131，132，133，134，135，136，137，138，139，140，141，142，143，144，145，146，147，148，149，150，151，152，153，154，155，156，157，158，159，160，161，162，163，164，165，166，167，168，169，170，171，172，173，174，175，176，177，178，179，180，181，182，183，184，185，186，187，188，189，190，191，192，193，194，195，196，197，198，199，200，201，202，203，204，205，206，207，208，209，210，211，212，213，214，215，216，217，218，219，220，221，222，223，224，225，226，227，228，229，230，231，232，233，234，235，236，237，238，239，240，241，242，243，244，245，246，247，248，249，250，251，252，253，254，255，256，257，258，259，260，261，262，263，264，265，266，267，268，269，270，271，272，273，274，275，276，277，278，279，280，281，282，283，284，285，286，287，288，289，290，291，292，293，294，295，296，297，298，299，300，301，302，303，304，305，306，307，308，309，310，311，312，313，314，315，316，317，318，319，320，321，322，323，324，325，326，327，328，329，330，331，332，333，334，335，336，337，338，339，340，341，342，343，344，345，346，347，348，349，350，351，352，353，354，355，356，357，358，359，360，361，362，363，364，365，366，367，368，369，370，371，372，373，374，375，376，377，378，379，380，381，382，383，384，385，386，387，388，389，390，391，392，393，394，395，396，397，398，399，400，401，402，403，404，405，406，407，408，409，410，411，412，413，414，415，416，417，418，419，420，421，422，423，424，425，426，427，428，429，430，431，432，433，434，435，436，437，438，439，440，441，442，443，444，445，446，447，448，449，450，451，452，453，454，455，456，457，458，459，460，461，462，463，464，465，466，467，468，469，470，471，472，473，474，475，476，477，478，479，480，481，482，483，484，485，486，487，488，489，490，491，492，493，494，495，496，497，498，499，或500，750，1000，1250，1500，1750，2000或更多个核苷酸碱基对(加上或减去任何上述列出的增量)。或者，引物对可来源于***的DNA两侧的侧翼序列从而产生包括整个***核苷酸序列的扩增子。来源于植物基因组序列的引物对的成员可位于距***的DNA序列一定距离处。该距离的范围可为一个核苷酸碱基对至约两万个核苷酸碱基对。术语“扩增子”的使用特别排除了可在DNA热扩增反应中形成的引物二聚体。

核酸扩增可通过任何本领域中已知的多种核酸扩增方法，包括聚合酶链式反应(PCR)来实现。多种扩增方法在本领域是已知的，并描述于除其他之外，美国专利号4,683,195和美国专利号4,683,202。开发了PCR扩增方法以扩增高至22kb的基因组DNA。这些方法，以及本领域已知的其他DNA扩增的方法可用于本发明的实践。可验证(视需要，可校正)来自主题玉米事件的异源转基因DNA***的序列或侧翼基因组序列，即使用来源于本文中提供的序列的引物来扩增此类序列，接着对PCR扩增子或克隆的DNA进行标准DNA测序。

可通过多种技术检测由这些方法产生的扩增子。琼脂糖凝胶电泳和用溴乙锭的染色是检测DNA扩增子的常见公知方法。另一此类方法是Genetic Bit Analysis，其中设计了与邻接的侧翼基因组DNA序列和***的DNA序列两者重叠的DNA寡核苷酸。将所述寡核苷酸固定于微孔板的孔中。在对感兴趣的区域的PCR(使用一个在***序列中的引物和一个在邻接侧翼基因组序列中的引物)之后，可将单链PCR产物与固定的寡核苷酸杂交，并充当模板用于单碱基延伸反应，所述反应使用DNA聚合酶和对预期的接下来的碱基具有特异性的标记的ddNTP。读数可为荧光性的或基于ELISA的。信号表明由于成功的扩增、杂交和单碱基延伸所致的***/侧翼序列的存在。

另一种方法是如Winge(Innov.Pharma.Tech.00:18-24,2000)所述的Pyrosequencing技术。在该方法中，设计了与邻近基因组DNA和***DNA连接处重叠的寡核苷酸。将所述寡核苷酸杂交于来自感兴趣的区的单链PCR产物(一个引物在***序列中，而一个在侧翼基因组序列中)，并在DNA聚合酶、ATP、硫酰酶(sulfurylase)、萤光素酶、腺苷三磷酸双磷酸酶(apyrase)、腺苷5’磷硫酸(adenosine 5'phosphosulfate)和萤光素的存在下温育。单独添加DNTP，且其组入导致光信号，对该光信号进行测量。光信号表明由于成功的扩增、杂交和单碱基或多碱基延伸而导致的转基因***/侧翼序列的存在。

荧光偏振是另一种可用于检测本发明的扩增子的方法。遵循该方法，设计了与基因组侧翼和***的DNA连接处重叠的寡核苷酸。将寡核苷酸杂交于来自感兴趣的区的单链PCR产物(一个引物在***的DNA中，一个在侧翼基因组DNA序列中)，并在DNA聚合酶和荧光标记的ddNTP的存在下温育。单碱基延伸导致ddNTP的组入。组入可使用荧光计作为偏振改变来测量。偏振中的改变表明由于成功的扩增、杂交和单碱基延伸所致的转基因***/侧翼序列的存在。

TAQMAN(PE Applied Biosystems,Foster City,Calif.)，是检测和量化DNA序列的存在的方法。简言之，设计了与基因组侧翼和***DNA连接处重叠的FRET寡核苷酸探针。在热稳定性聚合酶和dNTP存在下循环FRET探针和PCR引物(一个引物在***DNA序列中，一个在侧翼基因组序列中)。在特异性扩增过程中，Taq DNA聚合酶将FRET探针上的荧光模块从淬灭模块清除并释放。荧光信号表明由于成功的扩增和杂交所致的侧翼/转基因***序列的存在。

已描述了分子灯塔(Molecular Beacon)用于序列检测。简言之，设计了与侧翼基因组和***DNA连接处重叠的FRET寡核苷酸探针。FRET探针的独特结构导致其含有保持荧光和淬灭模块彼此接近的二级结构。在热稳定性聚合酶和dNTP的存在下循环FRET探针和PCR引物(一个引物在***DNA序列中，一个在侧翼基因组序列中)。在成功的PCR扩增之后，FRET探针对靶序列的杂交导致探针二级结构的去除和荧光和淬灭模块的空间上的分离。其结果为荧光信号。荧光信号表明由于成功的扩增和杂交所致的侧翼基因组/转基因***序列的存在。

已经公开了对于***为优秀的玉米基因组中的位置，本主题发明还包括在该基因组位置大致附近包含至少一个非aad1***的玉米种子和/或玉米植物。一种选项是在本文中例示的aad-1***位置处用不同的***取代。在此一般性考虑下，可根据本主题发明使用例如靶向同源重组。该类型的技术是例如WO 03/080809A2及其相应的公开的美国申请(US20030232410)的主题。因此，本主题发明包括植物和植物细胞，其包含侧翼为本文中鉴定的侧翼序列(例如SEQ ID No:29的残基1-1873和6690-8557)的全部或可识别部分的异源***(取代aad-1多拷贝或与aad-1多拷贝一同)。

本文中提及或引用的所有专利、专利申请、临时申请和公开以其不与本说明书的明确教导不一致的程度通过全文提述并入本文。

包括了下述实施例以说明供实践本发明的步骤，和阐明本发明的某些优选实施方案。这些实施例不应视为限制性的。本领域技术人员应理解下述实施例中公开的技术代表用于说明供其实践的优选模式的具体方法。然而，本领域技术人员根据本公开，应理解可在这些具体实施方案中进行许多变化，而仍旧获得相似或类似的结果，而不背离本发明的精神和范围。除非另行指明，所有百分比为重量百分比，而所有溶剂混合物部分为体积，除非另行指明。

除非另行指明，使用下述缩写：

AAD-1 芳氧基链烷酸酯双加氧酶-1

bp 碱基对

℃ 摄氏度

DNA 脱氧核糖核酸

DIG 地高辛(digoxigenin)

EDTA 乙二胺四乙酸

kb 千碱基

μg 微克

μL 微升

mL 毫升

M 分子量

OLP 重叠探针

PCR 聚合物链式反应

PTU 植物转录单元

SDS 十二烷基硫酸钠

SOP 标准操作方法

SSC 含有氯化钠和柠檬酸钠的混合物pH 7.0的缓冲溶液

TBE 含有Tris碱，硼酸和EDTA的混合物，pH 8.3的缓冲溶液

V 伏特

实施例

实施例1：AAD1事件pDAS1740-278的转化和选择

AAD1事件pDAS1740-278是通过对玉米品系Hi-II进行的WHISKER介导的转化来产生的。使用的转化方法描述于美国专利申请号20090093366。将质粒pDAS1740的FspI片段，亦称作pDAB3812(图1)，转化入玉米品系。该质粒构建体含有包含B7MARv3::玉米泛素1启动子v2//AAD1v3//玉米PER53’UTR::RB 7MARv4植物转录单元(PTU)的植物表达盒。

产生了多个事件。向那些存活并产生健康的、氟吡氯禾灵抗性愈伤组织的事件分配独特的、代表推定的转化事件的鉴定代码，并连续转移至新鲜选择性培养基。从来源于每个独特事件的组织重新产生了植物，并将其转移至温室。

取叶样进行分子分析以通过Southern印迹、DNA边界确认和基因组标志物协助确认来验证AAD-1转基因的存在。将阳性T0植物与近交系授粉以获得T1种子。选择事件pDAS1470-278-9(DAS-40278-9)的T1植物，并对其进行自花授粉，并对于五个世代进行表征。同时，将T1植物通过标志物协助选择回交并渐渗入优秀种质(XHH13)几个世代。该事件是从独立的转化分离株生成的。该事件是基于其独特特征如单***位点、正常孟德尔分离和稳定表达，以及在广阔基因型背景和多种环境位置之间的效力包括除草剂耐受性和农艺学表现的优越组合而选择的。下述实施例包括用于表征事件pDAS-1740-278-9的数据。

实施例2：通过Southern印迹的pDAS1740-278-9事件表征

使用Southern印迹建立***的DNA片段的整合样式，并确定事件pDAS-1740-278-9(DAS-40278-9)中aad-1基因的***/拷贝数。生成了数据以阐明***玉米基因组中的aad-1转基因的整合和完整性。

Southern印迹数据表明玉米事件DAS-40278-9中的pDAS1740/Fsp I片段***作为来自质粒pDAS1740的aad-1PTU的单个、完整拷贝的简单整合而发生。使用特异于质粒区中含有的基因、启动子、终止子和其他调节元件的探针和描述性限制性酶(其具有位于所述质粒内的切割位点，并产生质粒或跨越质粒与玉米基因组DNA的连接处的片段(边界片段)内部的杂交片段)进行了详细的Southern印迹分析。从对于限制性酶和探针的组合的Southern杂交指示的分子量对于事件是独特的，并建立了其鉴定样式。这些分析亦显示质粒片段***玉米基因组DNA而并无aad-1PTU的重排。在转基因玉米事件DAS-40278-9的五个不同世代中观察到相同的杂交片段，表明aad-1PTU***在世代间遗传的稳定性。与质粒pDAS1740上位于Fsp I限制性位点之外的三个骨架探针的混合物的杂交并未检测出任何特异性DNA/基因片段，表明转基因玉米事件DAS-40278-9中紧邻着质粒pDAS1740的Fsp I限制位点的其他载体骨架区不存在和氨苄青霉素抗性基因不存在。aad-1玉米事件DAS-40278-9的图示图谱呈于图2-3。

实施例2.1玉米叶样品收集和基因组DNA(gDNA)分离

从aad-1玉米事件DAS-40278-9的个体植物的叶制备了gDNA。从来自携带aad-1玉米事件DAS-40278-9的个体植物收获的叶组织提取了gDNA。使用了来自事件DAS-40278-9五个不同世代的转基因玉米种子。就事件DAS-40278-9选择了来源于每世代四株植物的二十株个体玉米植物。此外，从常规玉米植物XHH13分离了gDNA，其含有代表不存在aad-1基因的基础品系的遗传背景。

在分离gDNA之前，从每株植物取叶环切片(punch)以使用快速测试条试剂盒(American Bionostica,Swedesboro,NJ)依照生产商推荐的步骤测试aad-1蛋白表达。就aad-1的存在或不存在对每个叶环切片样品给予+或-的评分。仅对来自事件DAS-40278-9五个世代的阳性植物进行进一步表征。

从事件DAS-40278-9和常规对照XHH13的个体植物收集玉米植物样品。将叶样品在液氮中迅速冷冻，并在大约-80℃储藏直至使用。

遵循标准CTAB方法从冷冻的玉米叶组织提取个体基因组DNA。当需要时，用QiagenGenomic-Tip(Qiagen,Valencia,CA)依照生产商推荐的步骤进一步纯化一些基因组DNA。在提取之后，使用Pico Green试剂(Invitrogen,Carlsbad,CA)用分光荧光光度法对DNA进行定量。然后在琼脂糖凝胶上将DNA显影以确认来自Pico Green分析的值并确定DNA品质。

实施例2.2 DNA消化和分离

对于DNA的分子表征，将来自玉米事件DAS-40278-9DNA样品和常规对照的九微克(9μg)的基因组DNA通过将大约每μg DNA的五至十一单位的选定的限制性酶和相应的反应缓冲液添加至每个DNA样品来进行消化。将每个样品在大约37℃温育过夜。使用限制性酶EcoR I，Nco I，Sac I，Fse I和Hind III进行消化(New England Biolabs,Ipswich,MA)。通过将质粒DNA，pDAS1740(pDAB3812)与来自常规对照的基因组DNA以大约等于每玉米基因组1拷贝的转基因比例来制备阳性杂交对照样品，并使用与测试样品相同的步骤和限制性酶进行消化。使用与测试样品相同的步骤和限制性酶来消化来自常规玉米对照(XHH13)的DNA作为阴性对照。

用Quick-Precip(Edge BioSystems,Gaithersburg,MD)沉淀消化的DNA样品，并将其重悬于1X Blue Juice(Invitrogen,Carlsbad,CA)以获得凝胶加载所需的体积。然后将DNA样品和分子大小标记通过0.8％琼脂糖凝胶用1X TBE缓冲液(Fisher Scientific,Pittsburgh,PA)在55-65伏特电泳大约18-22小时以获得片段分离。用溴乙锭(Invitrogen,Carlsbad,CA)对凝胶进行染色，并在紫外(UV)光下使DNA显影。

实施例2.3 Southern转移和膜处理

Southern印迹分析基本上如Memelink,等(1994)Southern,Northern,andWestern Blot Analysis.Plant Mol.Biol.Manual F1:1-23所述进行。简言之，在DNA片段的电泳分离和显影之后，用0.25N HCl(Fisher Scientific,Pittsburgh,PA)对凝胶进行脱嘌呤大约15分钟，然后将其暴露于变性溶液(AccuGENE,Sigma,St.Louis,MO)大约30分钟，然后暴露于中和溶液(AccuGENE,Sigma,St.Louis,MO)至少30分钟。使用用10XSSC(Sigma,St.Louis,MO)的wicking***过夜进行至尼龙膜上的Southern转移。在转移之后，在2X SSC溶液中洗涤膜，并通过UV交联将DNA结合于膜。该过程使得Southern印迹膜已可用于杂交。

实施例2.4 DNA探针标记和杂交

使用标记的探针检测结合于尼龙膜的DNA片段。用于该研究的探针从通过特异于来自质粒pDAS1740的基因元件和其他区域的引物生成的片段通过基于PCR的地高辛(DIG)标记核苷酸[DIG-11]-dUTP的组入来生成。通过PCR合成生成DNA探针使用PCR DIG ProbeSynthesis Kit(Roche Diagnostics,Indianapolis,IN)遵循生产商推荐的步骤进行。用于该研究的探针的列表描述于表1。

表1：Southern分析中使用的探针的位置和长度

通过琼脂糖凝胶电泳分析标记的探针来确定其品质和数量。然后将所需量的标记探针用于在尼龙膜上对靶DNA的杂交以供使用对于DIG Easy Hyb Solution(RocheDiagnostics,Indianapolis,IN)描述的步骤来检测特异性片段。简言之，将固定DNA的尼龙膜印迹在2X SSC中迅速洗涤，并在杂交烤箱中用杂交瓶中的20-25mL的预温热的DIG EasyHyb溶液以大约50℃预杂交至少30分钟。然后倾去预杂交溶液，并用20mL含有所需量的通过在水中煮沸5分钟而预变性的特异性探针的预温热的DIG Easy Hyb溶液替代。然后在大约40-60℃在杂交烤箱中进行杂交步骤过夜。

实施例2.5检测

在探针杂交结束时，将含有探针的DIG Easy Hyb溶液倾入干净试管，并储藏在-20℃。可根据生产商推荐的步骤将这些探针重新使用2-3次。将膜印迹短暂漂洗并在干净塑料容器中用低严格性洗涤缓冲液(2XSSC,0.1％SDS)在室温洗涤约5分钟两次，然后用高严格度洗涤缓冲液(0.1X SSC,0.1％SDS)在大约65℃洗涤15分钟两次。然后将膜印迹转移至其他干净的塑料容器，并用来自DIG Wash and Block Buffer Set(Roche Diagnostics,Indianapolis,IN)的1X洗涤缓冲液短暂洗涤大约2分钟，接着在1X封闭缓冲液中封闭至少30分钟，然后用1X封闭溶液中的抗DIG-AP(碱性磷酸酶)抗体(1:5,000稀释,RocheDiagnostics,Indianapolis,IN)温育至少30分钟。在用1X洗涤缓冲液洗涤2-3次之后，特异性DNA探针仍结合于膜印迹，并使用CDP-Star Chemiluminescent Nucleic AcidDetection System(Roche Diagnostics,Indianapolis,IN)遵循生产商的推荐对DIG标记的DNA标样进行显影。将印迹暴露于化学发光底片(Roche Diagnostics,Indianapolis,IN)一个或多个时间点以检测杂交片段，并使分子大小标样显影。然后用All-Pro 100Plus底片显影剂(Konica SRX-101)使底片显现，并扫描图像以供报道。对于每个探针记录检测出的条带的数量和大小。使用在所述的DIG检测之后可见的DIG标记的DNA Molecular WeightMarker II(MWM DIG II)以确定Southern印迹上的杂交片段大小。

实施例2.6探针剥除(stripping)

在获得Southern杂交数据之后，将DNA探针从膜印迹剥离(strip off)，并可将膜印迹重新用于根据生产商推荐的步骤(DIG Application Manual for FilterHybridization,(2003).Roche Diagnostics)用不同的DNA探针进行杂交。简言之，在信号检测和底片曝光之后，用Milli-Q水彻底漂洗膜印迹，然后在剥除缓冲液(0.2N NaOH,0.1％SDS)中在室温或在37℃洗涤两次大约15分钟。然后在2X SSC中短暂洗涤膜印迹，其已可用于用另一种DNA探针的预杂交和杂交。将膜印迹暴露于新的化学发光底片以确保在进行下一次杂交之前剥除了所有的DNA探针。将重新暴露的底片与研究档案中的之前的杂交数据包一同保持作为记录。

实施例2.7 Southern印迹研究

基于pDAS1740/Fsp I片段的已知限制性酶位点的用特定消化和探针所得的预期的和观察到的片段大小在表2中给出。从这些消化和杂交鉴定了两种类型的片段：内部片段，其中已知酶位点在探针区侧翼，并完全包含于pDAS1740/Fsp I片段内，以及边界片段，其中已知酶位点位于探针区一端，而预期第二片段在玉米基因组中。边界片段的大小随事件变化，因为在多数情况下，DNA片段整合位点对于每个事件是独特的。边界片段提供了相对于整合的DNA对限制性酶位点进行定位和衡量DNA***数的手段。基于本研究中完成的Southern印迹分析，结论为来自质粒pDAS1740/Fsp I的完整aad-1PTU的单一拷贝如***图中详述而***事件DAS-40278-9的玉米基因组中(图2-3)。

表2：Southern印迹分析中预测的和观察到的杂交片段

备注：*观察到的片段大小之后的星号表明在所有样品(包括阴性对照)之间检测到的内源序列杂交

#在常规对照、BC3S1和一些BC3S2样品中的双联子

1.预测的片段大小基于图1中所示的pDAS1740(pDAB3812)的质粒图谱。

2.从这些分析大致地考虑观察到的片段大小，且其基于DIG标记的DNA MolecularWeight Marker II片段指示的大小。由于供显影的DIG分子的组入，标志物片段与其实际指明的分子量相比，其在运行中通常显得变大大约5-10％。

选择在质粒pDAS1740中具有独特限制性位点的限制性酶：EcoR I，Nco I，Sac I，Fse I/Hind III以表征事件DAS-40278-9中的aad-1基因***。预测>3382bp，>2764bp，>4389bp的边界片段分别与进行EcoR I，Nco I和Sac I消化之后的aad-1基因探针杂交(表2)。当分别使用EcoR I，Nco I和Sac I时，观察到～12000bp，～4000bp和～16000bp的单个aad-1杂交条带，表明事件DAS-40278-9的玉米基因组中的aad-1基因***的单个位点。选择用Fse I和Hind III的双重消化以释放3361bp的、含有aad-1植物转录单元的片段(PTU，启动子/基因/终止子)(表2)。在Fse I/Hind III消化之后，用aad-1基因探针观察到预期的3361bp片段。用所有四种酶/酶组合消化DAS-40278-9样品，然后进行aad-1基因探针杂交的结果表明来自质粒pDAS1740的完整的aad-1PTU的单拷贝***了事件DAS-40278-9的玉米基因组。

选择限制性酶Nco I，Sac I和Fse I/Hind III表征事件DAS-40278-9中aad-1的启动子(ZmUbi1)区。预期Nco I和Sac I消化当杂交于对ZmUbi1启动子区具特异性的DNA探针时，分别生成>3472bp和>4389bp的边界区片段(表2)。在Nco I消化之后用ZmUbi1启动子探针检测出～6300bp和～3600bp的两个杂交条带。然而，～3600bp条带在所有样品泳道包括常规对照中均存在，表明～3600bp条带是来自玉米来源的泛素启动子(ZmUbi1)探针对玉米内源ubi基因的同源结合所得的非特异性信号条带。相反，～6300bp信号条带在测试的DAS-40278-9样品中检测出，但未在常规对照中检测出，表明～6300bp条带对来自质粒pDAS1740的ZmUbi1启动子探针具有特异性，且因此其为表2中所示的预测的Nco I/ZmUbi1条带。类似地，在Sac I消化之后用ZmUbi1启动子探针检测出～3800bp和～16000bp的两个杂交条带。～3800bp条带出现于所有样品泳道包括常规对照中，并因此视为ZmUbi1启动子探针对玉米内源ubi基因的非特异性杂交。仅存在于DAS-40278-9样品中的～16000bp杂交条带视作预期的Sac I/ZmUbi1条带。预期用Fse I/Hind III的双重消化释放杂交于ZmUbi1启动子探针的3361bp的aad-1PTU片段(表2)。该3361bp条带和～6400bp的非特异性杂交条带在Fse I/Hind III消化之后通过ZmUbi1启动子探针检测出。～6400bp条带视作ZmUbi1启动子探针对玉米内源ubi基因的非特异性结合，因为该条带存在于所有样品泳道包括常规对照中。此外。在常规对照，BC3S1，和一些BC3S2样品中观察到非常靠近～6400bp的另一个条带。该非常靠近～6400bp的其他条带亦视作非特异性的，因为其存在于常规对照XHH13样品泳道中，并更可能与XHH13的遗传背景相关。

选择相同的限制性酶/酶组合Nco I，Sac I和Fse I/Hind III以表征事件DAS-40278-9中的aad-1的终止子(ZmPer5)区。预期Nco I消化当杂交于对ZmPer5终止子区具特异性的DNA探针时，生成>2764bp的边界区片段(表2)。在Nco I消化之后，用ZmPer5终止子探针检测出～4000bp和～3900bp的两条杂交条带。～3900bp条带存在于所有样品泳道，包括常规对照中，表明该～3900bp条带可能是由于玉米来源的过氧化物酶基因终止子(ZmPer5)探针对玉米内源per基因的同源结合所致的非特异性信号条带。相反，～4000bp信号条带在测试的DAS-40278-9样品中检测出，但未在常规对照中检测出，表明该～4000bp条带对来自质粒pDAS1740的ZmPer5终止子探针具特异性，并因此其为表2中所示的预期的Nco I/ZmPer5条带。在Sac I消化之后，预期>1847bp边界条带杂交于ZmPer5终止子探针。在Sac I消化之后，用ZmPer5终止子探针检测出～1900bp和～9000bp的两个杂交条带。～9000bp条带似乎存在于所有样品泳道包括常规对照中，并因此视为ZmPer5终止子探针对玉米内源per基因的非特异性杂交。仅存在于DAS-40278-9样品中的～1900bp杂交条带视为预期的Sac I/ZmPer5条带。预期用Fse I/Hind III的双重消化释放杂交于ZmPer5终止子探针的3361bp的aad-1PTU片段(表2)。该3361bp条带和其他的～2100bp的非特异性杂交条带是在Fse I/Hind III消化之后通过ZmPer5终止子探针所检测的。所述其他的～2100bp条带是ZmPer5终止子探针对玉米内源基因的非特异性结合，因为该条带存在于所有样品泳道包括阴性对照中。用这些DAS-40278-9样品的消化继以ZmUbi1启动子和ZmPer5终止子探针杂交获得的结果进一步确证了来自质粒pDAS1740的完整的aad-1PTU的单拷贝***事件DAS-40278-9的玉米基因组中。

选择限制性酶Nco I和Sac I以表征来自AAD-1玉米事件DAS-40278-9中的pDAS1740/Fsp I片段的剩余组分(表2)。组分RB7Mar v3和RB7Mar v4的DNA序列具有超过99.7％同一性，因此预期特异于RB7Mar v3或RB7Mar v4的DNA探针杂交于含有RB7Mar任一型式的DNA片段。在Nco I消化之后，预期>2765bp和>3472bp的两个边界片段与RB7Mar v4和RB7Mar v3探针杂交(表2)。在DAS-40278-9样品中的Nco I消化之后用RB7Mar v4或RB7Marv3探针观察到～4000bp和～6300bp的两个杂交条带。类似地，在Sac I消化之后，用RB7Marv4和RB7Mar v3探针预测出>1847bp和>4389bp的两个边界条带。在Sac I消化之后用RB7Marv4或RB7Mar v3探针在DAS-40278-9样品中检测出～1900bp和～16000bp的杂交条带。

综上所述，用这些元件探针获得的Southern杂交结果表明玉米事件DAS-40278-9中***的DNA含有完整的aad-1PTU以及分别在***的5’和3’端的基质连接区RB7Mar v3和RB7Mar v4。

实施例2.8骨架序列的不存在

将三种覆盖质粒pDAS1740的几乎整个Fsp I骨架区(质粒pDAS1740中的4867-7143bp)的等摩尔比例组合用作骨架探针以表征AAD-1玉米事件DAS-40278-9。使用质粒pDAS1740/Fsp I片段生成事件DAS-40278-9，因此，未预期在任何限制性酶消化之后骨架探针组合具有特异性杂交信号(表2)。确认在所有DAS-40278-9样品中在Nco I或Sac I消化之后用骨架探针未检测出特异性杂交信号。阳性对照条带含有预期的杂交条带，表明探针能够杂交于任何同源DNA片段(若其存在于样品中)。该数据表明事件玉米事件DAS-40278-9中的***并不含有除了来自质粒pDAS1740的Fsp I区之外的任何载体骨架序列。

使用来自事件DAS-40278-9的五个不同世代的叶样品进行Southern印迹分析以供分子表征。使用选定的限制性酶消化和探针组合调查整合样式以表征***的基因，aad-1，以及非编码区包括启动子，基因表达的终止子，和基质连接区。

***事件DAS-40278-9的DNA的Southern印迹表征表明单个完整拷贝的aad-1PTU已整合入事件DAS-40278-9。对于限制性酶和探针的组合由Southern杂交指示的分子量对于该事件是独特的，并确立了其鉴定样式。该杂交样式在所有五个世代均为相同的，表明***在玉米基因组中是稳定的。用覆盖来自质粒pDAS1740的pDAS1740/Fsp I转化片段之外的骨架区的探针进行的杂交确证并无载体骨架序列组入事件DAS-40278-9。

实施例3：玉米事件DAS-40278-9的***和侧翼边界区中DNA序列的克隆和表征

为了表征***的DNA并描述基因组***位点，确定了事件DAS-40278-9的***和边界区的DNA序列。总体而言，确认了事件DAS-40278-9基因组序列为8557bp，包含1873bp的5’侧翼边界序列，1868bp的3’侧翼边界序列，和4816bp的DNA***。该4816bp DNA***含有完整的aad-1表达盒，在5’端的259bp部分MARv3，和3’端的1096bp部分MARv4。序列分析揭示了在5’整合连接处的21bp***和玉米基因组***座的两个碱基对的缺失。在玉米基因组和DAS-40278-9***之间的3’整合连接处发现了一个碱基对***。同样，在3’UTR的非编码区中位置5212处的***发现单个碱基变化(T至C)。这些变化均不影响aad-1表达盒的开读框组成。

基于事件DAS-40278-9***和边界序列的PCR扩增确证了边界区为玉米来源，和该连接区可用于DAS-40278-9的事件特异性鉴定。跨越连接区的序列的分析表明未从事件DAS-40278-9中的DNA***导致新的开读框(ORF>＝200个密码子)，且DAS-40278-9在天然玉米基因组中的整合也未打断任何基因组开读框。总体而言，AAD-1玉米事件DAS-40278-9的***和边界序列的表征表明单个完整拷贝的aad-1表达盒整合入天然玉米基因组。

实施例3.1：基因组DNA提取和定量

使用修改的CTAB方法从冻干的或新鲜粉碎的叶组织提取基因组DNA。将DNA样品溶解于1X TE(10mM Tris pH8.0,1mM EDTA)(Fluka,Sigma,St.Louis,MO)，并用Pico Green方法根据生产商的指示(Molecular Probes,Eugene,OR)定量。对于PCR分析，用分子生物学级的水(5PRIME,Gaithersburg,MD)稀释DNA样品以得到10-100ng/μL的浓度。

实施例3.2：PCR引物

表3列出了用于克隆事件DAS-40278-9的DNA***和侧翼边界区的引物序列，其位置和描述标于图4。表4列出了用于确认***和边界序列的引物序列。引物位置分别标于图4和5。由Integrated DNA Technologies,Inc.(Coralville,IA)合成所有引物。对于储液将引物溶解于水(5PRIME,Gaithersburg,MD)至100μM的浓度，而对于工作溶液用水稀释至10μM的浓度。

表3：用于克隆玉米事件DAS-40278-9中的***和侧翼边界序列的引物序列的列表

(+)：直接序列；

(-)：互补序列；

表4：用于确认玉米基因组DNA的引物序列的列表

(+)：直接序列；

(-)：互补序列；

实施例3.3：基因组步移

使用GenomeWalker^TMUniversal Kit(Clontech Laboratories,Inc.,MountainView,CA)克隆玉米事件DAS-40278-9的5’和3’侧翼边界序列。根据生产商的指示，将约2.5μg的来自AAD-1玉米事件DAS-40278-9的基因组DNA用EcoR V，Stu I(均由试剂盒提供)或ScaI(New England Biolabs,Ipswich,MA)消化过夜。使用DNA Clean&Concentrator^TM-25(ZYMOResearch,Orange,CA)纯化消化的DNA，接着连接于GenomeWalker^TM接头以构建GenomeWalker^TM文库。使用每个GenomeWalker^TM文库作为DNA模板以供用试剂盒中提供的接头引物AP1和对于每个构建体具特异性的引物5End3812_A和3End3812_C进行初级PCR扩增。然后使用一微升的初级PCR反应的1:25稀释用作模板，以供用嵌套接头引物AP2和对于每个嵌套构建体具特异性的引物5End3812_B和3End3812_D进行次级PCR扩增。使用TaKaRa LATaq^TMHS(Takara Bio Inc.,Shiga,Japan)进行PCR扩增。在50μL PCR反应物中，使用1μL的DNA模板，8μL的2.5mM的dNTP混合物，0.2μM的每种引物，2.5单位的TaKaRa LA Taq^TMHS DNAPolymerase，5μl的10×LA PCR Buffer II(Mg2+plus)，和1.5μL的25mM MgCl₂。具体PCR条件列于表5。

表5：用于对AAD-1玉米事件DAS-40278-9进行基因组步移以扩增侧翼边界区的条件

实施例3.4：常规PCR

使用标准PCR克隆并确认玉米事件DAS-40278-9中的DNA***和边界序列。使用TaKaRa LA Taq^TM(Takara Bio Inc.,Shiga,Japan)，HotStarTaq DNA Polymerase(Qiagen,Valencia,CA)，Expand High Fidelity PCR System(Roche Diagnostics,Inc.,Indianapolis,IN)或High-Fidelity PCR Cloning Enzyme&Master Mix(Stratagene,LaJolla,CA)用于根据生产商推荐的步骤进行常规PCR扩增。具体PCR条件和扩增子描述列于表6。

表6：玉米事件DAS-40278-9中边界区的标准PCR扩增的条件

实施例3.5：PCR产物检测，纯化，PCR产物的亚克隆和测序

通过使用1.2％或2％E-凝胶(Invitrogen,Carlsbad,CA)的电泳根据产品说明检查PCR产物。通过与DNA标记相比较估计片段大小。若需要，使用QIAquick Gel ExtractionKit(Qiagen,Carlsbad,CA)纯化PCR片段，即将片段从用溴乙锭染色的1X TBE中的1％琼脂糖凝胶切出。

使用TOPO TAKit for Sequencing(Invitrogen,Carlsbad,CA)根据产品说明将PCR片段亚克隆入。具体而言，将二至五微升克隆反应物遵循生产商的指示转化入One Shot化学感受态TOP10细胞。通过小量制备质粒DNA(QIAprep Spin Miniprep Kit,Qiagen,Carlsbad,CA)，接着用EcoR I限制性消化，或者通过使用试剂盒中提供的T3和T7引物进行的直接菌落PCR，来验证克隆的片段。然后将选定的菌落的甘油储备或质粒DNA送去测序。

在亚克隆之后，首先对推定的靶PCR产物进行测序以确证克隆了期待的DNA片段。选择含有适当DNA序列的菌落以供引物步移以确定完整的DNA序列。由Cogenics(Houston,TX)进行测序。

使用Sequencher软件(Version 4.8Gene Codes Corporation,Ann Arbor,MI)完成***和边界序列的最终装配。使用Vector NTI(Version 10和11,Invitrogen,Carlsbad,CA)进行玉米事件DAS-40278-9的***和边界序列的标注(annotation)

使用BLAST程序对GenBank数据库进行同源性检索。进行使用Vector NTI(Version11,Invitrogen)的开读框(ORF)分析以鉴定完整***和侧翼边界序列中的ORF(>＝200个密码子)。

实施例3.6. 5’端边界序列

使用针对转基因5’端的特异性嵌套引物组从每个玉米事件DAS-40278-9GenomeWalker^TM文库扩增DNA片段。从事件DAS-40278-9EcoR V和Stu I GenomeWalker^TM文库两者均观察到大约800bp的PCR产物。Sca I GenomeWalker^TM文库生成2kb左右的产物。将所述片段克隆入，并随机从每个文库挑取六个菌落以供末端测序以确认***含有期待的序列。通过***的引物步移进行的完整测序揭示从玉米事件DAS-40278-9Stu I，EcoR V，和Sca I GenomeWalker^TM文库扩增的片段分别为793，822和2132bp。从StuI和EcoR V GenomeWalker^TM文库生成的DNA片段与从Sca I GenomeWalker^TM文库生成的DNA片段为100％匹配，表明这些DNA片段从转基因***的5’区扩增。对所得的1873bp玉米基因组序列的BLAST检索表明与玉米BAC克隆序列的高相似性。而且，对***连接处的序列分析表明在其5’端区的917bp的MAR v3与质粒pDAS1740/Fsp I片段相比是截短的，在aad-1表达盒的5’区处留下259bp部分MAR v3。

实施例3.7：3’末端边界序列

使用对转基因3’端具特异性的嵌套引物组从玉米事件DAS-40278-9Stu IGenomeWalker^TM文库扩增了大约3kb大小的DNA片段。将该DNA片段克隆入，并随机挑取十个菌落以供末端测序以确认期待的序列的***。对三个具有期待的***的克隆进行完全测序，生成2997bp的DNA片段。对该DNA片段的序列分析揭示了部分MAR v4元件(缺失其5’区的70个bp)和1867bp的玉米基因组序列。BLAST检索显示该1867bp基因组DNA序列与用5’边界序列鉴定出的相同的玉米BAC克隆中的序列为100％匹配。

实施例3.8：DNA***和连接序列

从玉米事件DAS-40278-9使用如前所述的基于PCR的方法克隆DNA***和连接区。基于5’和3’侧翼边界序列和期待的转基因序列设计五对引物。总体而言，克隆并测序了五个重叠的DNA片段(1767bp的扩增子1，1703bp的扩增子2，1700bp的扩增子3，1984bp的扩增子4和1484bp的扩增子5)(图4)。基于所述五个片段之间的重叠序列装配了完整的***和侧翼边界序列。最终的序列确认了来源于pDAS1740/Fsp I的4816bp的DNA***，1873bp的5’侧翼边界序列和1868bp的3’侧翼边界序列的存在。所述4816bp DNA***含有完整的aad-1表达盒，在5’端的259bp的部分MAR v3，和在3’端的1096bp的部分MAR v4(SEQ ID NO:29)。

对于每个引物对使用至少两个克隆以供引物步移以获得关于DNA***及其边界序列的完整序列信息。序列分析表明在玉米基因组DNA和来自pDAS1740/Fsp I的整合的部分MAR v3之间的5’-整合连接处的21bp***。BLAST检索和Vector NTI分析结果表明所述21bp***DNA并未展示与任何植物物种DNA或pDAS1740质粒DNA的同源性。在玉米基因组DNA和来自pDAS1740/Fsp I的部分MAR v4之间的3’整合连接处发现了单碱基对***。DNA整合亦导致在玉米基因组的***基因座处的两个碱基对的缺失(图6)。此外，在DNA***的未翻译的3’UTR区观察到5212bp位置处的一个核苷酸差异(T至C)(SEQ ID NO:29)。然而这些变化无一表现为对aad-1表达至关重要，或构建任何跨越DAS-40278-9的***中的连接处的新ORF(>＝200个密码子)。

实施例3.9：玉米基因组序列的确认

为了确认事件DAS-40278-9转基因在玉米基因组中的***位点，用不同对引物实施了PCR扩增(图4)。使用来自事件DAS-40278-9和其他转基因或非转基因玉米品系的基因组DNA作为模板。使用两个aad-1特异性引物，AI5End01和AI5End02，和两个根据5’端边界序列设计的引物，1F5End01和1F5End02，以扩增包含(span)aad-1基因至5’端边界序列的DNA片段。类似地，为了扩增包含(span)aad-1至3’端边界序列的DNA片段，使用了来源于3’端边界序列的1F3End05引物和aad-1特异性AI3End01引物。仅从AAD-1玉米事件DAS-40278-9的基因组DNA用由一个位于AAD-1玉米事件DAS-40278-9的侧翼边界上的引物和一个aad-1特异性引物组成的每个引物对扩增出具有预期大小的DNA片段。对照DNA样品用相同的引物对并未产生PCR产物，表明克隆的5’和3’端边界序列确实分别是***的aad-1基因构建体的上游和下游序列。注意到当使用引物对1F5End01和AI5End01进行PCR扩增时，在所有包含AAD-1玉米事件DAS-40278-9，AAD-1玉米事件DAS-40474和非转基因玉米品系XHH13的玉米样品中观察到具有约8kb大小的淡条带。观察到的淡条带(在制备的凝胶上)可为用该对引物在玉米基因组中进行的非特异性扩增的结果。

为了进一步确认玉米基因组中的DNA***，使用两个位于5’端边界序列的引物1F5End03和1F5End04，和两个位于3’端边界序列的引物1F3End03和1F3End04以扩增跨越***基因座的DNA片段。用引物对1F5End03/1F3End03或引物对1F5End04/1F3End04的PCR扩增得到来自AAD-1玉米事件DAS-40278-9的基因组DNA的具有大约8kb的预期大小的片段。与之相对，未从AAD-1玉米事件DAS-40474-7或非转基因玉米品系XHH13的基因组DNA得到PCR产物。既然已知AAD-1玉米事件DAS-40278-9和事件DAS-40474-7是通过HiII的转化，接着将起始转基因事件与玉米品系XHH13回交而生成的，这两个事件中每一个中的基因组的绝大部分理论上来自玉米品系XHH13。非常有可能仅靠近aad-1转基因的侧翼边界序列是继承自起始基因组DNA，并在AAD-1事件的渐渗过程中保留，而基因组序列的其他区可能已由XHH13的基因组序列替代。因此，用引物对1F5End03/1F3End03或引物对1F5End04/1F3End04均未从AAD-1玉米事件DAS-40474-7和XHH13的基因组DNA扩增出片段并不令人惊讶。分别用引物对1F5End03/1F3End03和1F5End04/1F3End04在玉米品系HiII和B73的基因组DNA中扩增出大约3.1和3.3kb的片段，但在玉米品系A188中则否。该结果表明边界序列来源于玉米品系B73的基因组。

进行对来自B73/HiII的玉米基因组DNA的进一步克隆以确保侧翼边界序列的有效性。对PCR扩增的片段进行测序以证明***的DNA区整合入B73/HiII基因组DNA的特定位置。基于获得的序列设计了引物。使用引物组Amp 1F/Amp 5R从不含***DNA的天然B73/HiII基因组扩增了跨越5’至3’连接处的2212bp片段。序列分析揭示了在转基因***基因座存在来自天然B73基因组的两个碱基对的缺失。来自克隆的天然B73基因组片段的DNA序列的分析鉴定出一个位于3’-整合连接区下游的ORF(>＝200个密码子)。此外，并无跨越ADD-1玉米事件DAS-40278-9整合的原始基因座的其他ORF。BLAST检索亦确证来自事件DAS40278-9的5’端和3’端边界序列并列地位于相同玉米BAC克隆上。

既然已知AAD-1玉米事件DAS-40278-9的5’整合连接处的独特性，设计了两对特异性PCR引物1F5EndT1F/1F5EndT1R和Corn278-F/Corn278-R以扩增该***对植物基因组的连接处。不出所料，仅在AAD-1玉米事件DAS-40278-9的基因组DNA中，而未在任何其他的转基因或非转基因的玉米品系中生成了期望的DNA片段。因此可使用这两个引物对作为AAD-1玉米事件DAS-40278-9事件特异性标识物(identifier)。

实施例4：通过DAS-40278-9的侧翼SSR标志物的基因组表征

为了表征和描述基因组***位点，确定了位于***附近的标志物序列。使用一组多态性SSR标志物鉴定并定位转基因位置。事件pDAS1740-278位于染色体2上在2008DAS玉米连锁图上大约20cM处的SSR标志物UMC1265和MMC0111之间大约20cM处。表6总结了对于这两个发现靠近转基因pDAS1740-278的标志物的引物信息。

表6：对于与事件pDAS1740-278相关的侧翼标志物的引物名称，染料标记，基因座位置，正向和反向引物序列和重要备注。

实施例4.1：gDNA分离

使用DNEasy 96Plant Test Kit(Qiagen,Valencia,California)从叶环切片提取gDNA。对实验方案进行修改使之适于自动化。使用来自Molecular Probes,Inc.(Eugene,OR)的染料对分离的gDNA进行定量。对于所有样品使用灭菌的去离子水将gDNA浓度稀释至5ng/μl。

实施例4.2：用标志物筛选gDNA

用一亚类的简单序列重复(SSR)标志物对稀释的gDNA进行基因分型。由AppliedBiosystems(Foster City,California)合成SSR标志物，其中用6-FAM、HEX/VIC或NED(分别为蓝、绿和黄)荧光标记来标记正向引物。基于其荧光标记和扩增子大小将标志物归类为组或小组以协助PCR后的多路化(multiplexing)和分析。

在384孔测定板中实施PCR，其中每个反应含有5ng的基因组DNA，1.25X PCR缓冲液(Qiagen,Valencia,California)，各0.20μM的正向和反向引物，1.25mM MgCl₂，各0.015mM的dNTP，和0.3单位的HotStart Taq DNA聚合酶(Qiagen，Valencia，California)。在具有384-双头模块(dual head module)的GeneAmp PCR System 9700(Applied Biosystems,Foster City,California)中进行扩增。扩增程序如下所述：(1)在95℃起始激活12分钟；(2)在94℃进行30秒；(3)在55℃进行30秒；(4)在72℃进行30秒；(5)重复步骤2-4进行40个循环；和(6)在72℃进行30分钟最终延伸。通过将2μl的来自相同植物的每种PCR产物添加至灭菌的去离子水至总体积60μl将对于每个SSR标志物小组的PCR产物多路化。在多路的PCR产物中，将0.5μl注入(stamp into)含有5μl包含1:100比例的GeneScan 500碱基对LIZ标样和ABI HiDi Formamide(Applied Biosystems,Foster City,California)的上样缓冲液的384孔上样板中。然后将样品上样于ABI Prism 3730xl DNA Analyzer(AppliedBiosystems,Foster City,California)以供使用生产商的推荐进行总运行时间为36分钟的毛细管电泳。通过ABI Prism 3730xl Automated Sequencer Data Collection软件Version 4.0收集标志物数据，并通过GeneMapper 4.0软件(Applied Biosystems)提炼以供等位基因表征和片段大小标记。

实施例4.3：SSR标志物结果

在最靠近转基因处鉴定出的侧翼标志物的引物数据列于表6。两个最接近的相关标志物UMC1265和MMC0111位于染色体2上距离转基因***大约20cM处。

实施例5：在事件DAS-40278-9中aad-1蛋白的表征

表征了来源于转基因玉米事件DAS-40278-9的重组aad-1蛋白的生化性质。使用十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE，用考马斯蓝染色，和糖蛋白检测方法)，western印迹，免疫诊断测试条测定(immunodiagnostic test strip assay)，基质辅助的激光解吸/电离飞行时间质谱(MALDI-TOF MS)和通过串联MS的蛋白测序分析以表征蛋白的生化性质。

实施例5.1：免疫诊断条测定

使用来自American Bionostica的商业性制备的免疫诊断测试条带确认DAS-40278-9的叶组织中aad-1蛋白的存在。所述条能够通过测试粗叶提取物区分转基因和非转基因植物(数据未显示)。非转基因提取物(XHH13)并不含有可检测量的免疫反应性蛋白。该结果亦通过western印迹分析确认。

为了测试aad-1蛋白的表达，进行了免疫诊断性条分析。对于XHH13(对照植物)和事件DAS-40278-9通过在分别标记的1.5-mL微离心管的可以啪嗒打开的盖子(snap-caplid)之间掐捏从每个植物收集四个叶环切片。在实验室收到时，立即将0.5mL aad-1提取缓冲液(American Bionostica,Swedesboro,NJ)添加至每个试管，并使用一次性杵对组织进行匀浆，接着振荡样品～10秒。在匀浆之后，将测试条置于试管中，并允许其显色～5分钟。基于免疫诊断条上测试线的显现(或不显现)来确认植物提取物中aad-1蛋白的存在与否。一旦对于转基因事件确认了aad-1蛋白的表达，收获并冻干玉米茎组织，并将其储藏于大约-80℃直至使用。

实施例5.2：从玉米纯化aad-1蛋白

制备了免疫纯化的、玉米来源的aad-1蛋白(分子量：～33kDa)或来自玉米茎组织的粗水性提取物。如下所述收获了所有的叶和茎组织，并转运至实验室：用剪刀将叶从植物剪下，并置于布袋中，并储藏于大约-20℃以供将来使用。此外，在恰好土壤线之上剪去茎，置于布袋中，并立即在大约-80℃冷冻～6小时。然后将茎置于冻干器5日以去除水。一旦组织完全干燥，将其用干冰粉碎至细微粉末并储藏于大约-80℃直至需要。

从在基于磷酸盐的缓冲液中冻干的茎组织提取来源于玉米的aad-1蛋白(对于缓冲液组成参见表7)，即将～30克的冻干的组织称取至经冷冻的1000mL玻璃混合器，并添加500mL提取缓冲液。将组织以高档混合60秒，然后通过以30,000×g离心样品20分钟来收获可溶性蛋白。如所述重新提取沉淀，并合并上清，并通过0.45μ过滤器过滤。将过滤的上清在大约+4℃加载于抗aad-1免疫亲和柱，所述柱与由Strategic Biosolution Inc.(MAb473F185.1；Protein A纯化的；Lot#:609.03C-2-4；6.5mg/mL(总计～35.2mg))(Windham,ME)制备的单克隆抗体相缀合；缀合于CNBr活化的Sepharose 4B(GE Healthcare,Piscataway,NJ)。收集了未结合的蛋白，并用预冷冻的20mM碳酸氢铵缓冲液，pH 8.0充分洗涤柱。用3.5M NaSCN,(Sigma,St.Louis,MO),50mM Tris(Sigma,St.Louis,MO)pH 8.0缓冲液洗脱结合的蛋白。收集了七个5-mL级分，并在大约+4℃对级分数2→7针对10mM Tris，pH8.0缓冲液透析过夜。通过SDS-PAGE和western印迹检查级分，并将剩余的样品储藏于大约+4℃直至用于后续分析。

表7：用于该研究的商业上可获得的参照物质列于下表：

通过SDS-PAGE检查结合于免疫亲和柱的蛋白，而结果显示洗脱的级分含有大约33kDa分子量的aad-1蛋白。此外，亦进行了western印迹，其对于aad-1也是阳性的。从～30g的冻干的茎材料分离来源于玉米的aad-1蛋白。

实施例5.3：SDS-PAGE和Western印迹

在2mL离心管中称取来自事件DAS-40278-9和XHH13茎(～100mg)的冻干组织，并用含有10％植物蛋白酶抑制剂混合物(Sigma,St.Louis,MO)的～1mL的PBST(Sigma,St.Louis,MO)提取。通过添加四个小球状轴承促进提取，并将样品Geno-Grind 1分钟。在粉碎之后，将样品以20,000×g离心5分钟，并将上清与5x Laemmli样品缓冲液(2％SDS,50mMTris pH 6.8,0.2mg/mL溴酚蓝,50％(w/w)含有10％新鲜添加的2-巯基乙醇的甘油)4:1混合，并在～100℃加热5分钟。在短暂离心之后，将45μL的上清直接加载于配置在CriterionCell凝胶模块中的BioRad Criterion SDS-PAGE凝胶(Bio-Rad,Hercules,CA)。将微生物来源的aad-1的阳性参照标准以1mg/mL重悬于PBST pH 7.4，并进一步用PBST稀释。然后将样品与含5％2-巯基乙醇的Bio-Rad Laemmli缓冲液混合，并如前所述处理。用Tris/glycine/SDS缓冲液(Bio-Rad,Hercules,CA)以150-200V的电压进行电泳，直至染色前端接近凝胶末端。在分离之后，将凝胶切成两半，并将一半用Pierce GelCode Blue蛋白染料染色，并将另一半以Mini转印迹电泳转移槽(Bio-Rad,Hercules,CA)在100伏特的恒定电压下电印迹60分钟至硝酸纤维素膜(Bio-Rad,Hercules,CA)。转移缓冲液含有20％甲醇和来自Bio-Rad的Tris/甘氨酸缓冲液。对于免疫检测，用aad-1特异性多克隆兔抗体(StrategicBiosolution Inc.,Newark,DE,蛋白A纯化的兔多克隆抗体，Lot#:DAS F1197-151,1.6mg/mL)探查膜。将山羊抗兔IgG(H+L)和碱性磷酸酶的缀合物(Pierce Chemical,Rockford,IL)用作二抗。使用SigmaFast BCIP/NBT底物进行免疫反应性蛋白条带的显色和显影。用水充分洗涤膜以停止反应，并用数字扫描仪(Hewlett Packard,Palo Alto,CA)捕获结果的记录。

在萤光假单胞菌(P.fluorescens)产生的aad-1中，如在考马斯染色的SDS-PAGE凝胶上显影出的主要蛋白条带为大约33kDa。不出所料，相应的玉米来源的aad-1蛋白(事件DAS-40278-9)与微生物表达的蛋白在大小上相同。意料之中，植物纯化级分除了aad-1之外还含有少量非免疫反应性杂质。共纯化的蛋白同样通过与柱基质的弱相互作用或在严酷洗脱条件下单克隆抗体从柱沥去而保留于柱上。其他研究者亦报道肽和氨基酸在经溴化氰活化的Sepharose 4B免疫吸附剂上的非特异性吸附(Kennedy和Barnes,1983；Holroyde等,1976；Podlaski和Stern,2008)。

根据多克隆抗体的western印迹分析，假单胞菌来源的aad-1蛋白显示预期大小的阳性信号。这亦在DAS-40278-9转基因玉米茎提取物中观察到。在aad-1western印迹分析中，未在对照的XHH13提取物中观察到免疫反应性蛋白，且未在转基因样品中发现不同大小的蛋白(聚集物或降解产物)。

实施例5.4：翻译后糖基化的检测

将经免疫亲和层析纯化的，玉米来源的aad-1蛋白(级分#3)与5x Laemmli缓冲液以4:1混合。将微生物来源的aad-1、大豆胰蛋白酶抑制剂、牛血清白蛋白和辣根过氧化物酶用Milli-Q水稀释至近似植物来源的aad-1的浓度，并与Bio-Rad Laemmli缓冲液混合。然后将蛋白在～95℃加热5分钟，并以20000×g离心2分钟以获得澄清的上清。将所得上清直接施于Bio-RadCriterion Gel，基本上如上所述用XT MES运行缓冲液(Bio-Rad,Hercules,CA)进行电泳，但将电泳在170V运行60分钟。在电泳之后，将凝胶切成两半，并将一半就总蛋白用GelCode Blue染料根据生产商的实验方案进行染色。在染色完成之后，用MolecularDynamics光密度计扫描凝胶以获得该凝胶的永久显影记录。将另一半凝胶用GelCodeGlycoprotein Staining Kit(Pierce Chemical,Rockford,IL)根据生产商的实验方案进行染色以显影糖蛋白。糖蛋白(具有低至每条带0.625ng的检出限)在淡粉色背景上作为品红色条带显影。在糖蛋白染色完成之后，用Hewlett Packard数字扫描仪扫描凝胶以获得凝胶的永久显影记录。在捕捉了糖基化染色的图像之后，用GelCode Blue对凝胶染色以验证非糖基化蛋白的存在。结果显示玉米和微生物来源的aad-1蛋白不具有可检测的共价连接的糖。该结果亦通过肽质量指纹法(peptide mass fingerprinting)确认。

实施例5.5：玉米和假单胞菌来源的aad-1的质谱肽质量指纹法和测序

进行假单胞菌和玉米来源的aad-1的质谱分析。对来源于转基因玉米茎(事件DAS-40278-9)的aad-1蛋白进行用胰蛋白酶的溶液中消化，接着进行MALDI-TOF MS和ESI-LC/MS。将检测的肽的质量与基于玉米来源的aad-1蛋白的序列中的潜在蛋白酶切割位点而推出的那些相比较。使用来自Proteometrics LLC的Protein Analysis Worksheet(PAWS)免费软件以计算机模拟(in silico)生成理论上的切割。aad-1蛋白，一旦变性，很容易受蛋白酶消化，并会生成无数肽峰。

在转基因玉米来源的aad-1蛋白(事件DAS-40278-9)的胰蛋白酶消化中，检测出的肽片段覆盖了几乎整个蛋白序列，仅缺失蛋白C端的一个小胰蛋白酶消化片段，F²⁴⁸至R²⁵³，和一个短的肽片段(2个氨基酸)。该分析确认玉米来源的蛋白氨基酸序列与微生物来源的aad-1蛋白相匹配。这些分析的结果表明玉米来源的aad-1蛋白的氨基酸序列等同于萤光假单胞菌表达的蛋白。

实施例5.5.1：胰蛋白酶消化的肽片段测序

除了肽质量指纹法之外，对玉米来源的aad-1蛋白(从玉米事件DAS-40278-9免疫亲和纯化)的N和C端的氨基酸残基进行测序，并与微生物来源的蛋白的序列相比较。通过串联质谱法，对于微生物和玉米来源的蛋白的前11个残基获得了蛋白序列(表8)。两个蛋白的氨基酸序列均为A'H A A L S P L S Q R”(SEQ ID NO:30)，显示N端甲硫氨酸由氨肽酶去除(表8)。期待N端aad-1蛋白序列为M'A H A A L S P L S Q R'²(SEQ ID NO:31)。这些结果表明在玉米和萤光假单胞菌中的翻译过程中或之后，由甲硫氨酸氨肽酶切割了N端甲硫氨酸。当蛋白上的第二个残基较小，如Gly、Ala、Ser、Cys、Thr、Pro和Val时，MAP迅速切割甲硫氨酸残基(Walsh,2006)。除了去除甲硫氨酸，显示在切割了N端甲硫氨酸之后，aad-1蛋白的N端肽的小部分已受乙酰化(表8)。对于真核(植物)表达的蛋白，频繁遇到该结果，因为大约80-90％的N端残基经修饰(Polevoda和Sherman,2003)。同样，已显示在N端处具有丝氨酸和丙氨酸的蛋白最频繁乙酰化(Polevoda和Sherman,2002)。这两个共翻译过程，N端甲硫氨酸残基的切割和N端乙酰化，迄今为止为最常见的修饰，并发生于绝大多数(～85％)的真核蛋白(Polevoda和Sherman,2002)。然而，显示与N端乙酰化相关的生物学显著性的实例是罕见的(Polevoda和Sherman,2000)。

表8：AAD-1玉米和微生物来源的蛋白的N端序列数据的总结

¹萤光假单胞菌和玉米来源的AAD-1的最初12个氨基酸残基的预期的N端序列。

²萤光假单胞菌和玉米来源的AAD-1的检测出的N端序列

³对于N端肽的串联MS数据揭示了AHAALSPLSQR(乙酰化的)和N-乙酰基-AHAALSPLSQR(乙酰化的)混合物。亦检测出了“不整齐的N端”(对应于氨基酸序列HAALSPLSQR、AALSPLSQR和ALSPLSQR的肽)。相对丰度，即对相对肽片段量的估计，是基于在214nm处测量的对应的LC峰面积进行的。

备注：

上标数字(R^x)表明序列中氨基酸残基编号。

氨基酸残基缩写：

A：丙氨酸 H：组氨酸

L：亮氨酸 M：甲硫氨酸

P：脯氨酸 Q：谷氨酰胺

R：精氨酸 S：丝氨酸

T：苏氨酸

除了N乙酰化之外，在玉米来源的aad-1蛋白的纯化过程中亦显示了少量N端截短(表8)。这些“不整齐的末端”导致氨基酸A2、H³和A⁴从玉米来源的蛋白的丧失(不同形式和量)。认为该截短发生于aad-1蛋白的纯化过程中，因为粗叶提取物的western印迹探查含有与微生物来源的aad-1蛋白相同MW的单个清晰的(crisp)条带。对于经western印迹的样品的提取缓冲液含有过量的蛋白酶抑制剂混合物，其含有对于抑制丝氨酸、半胱氨酸、天冬氨酸和金属蛋白酶以及氨肽酶具广泛特异性的蛋白酶抑制剂的混合物。

如上所述确定了玉米和微生物来源的aad-1蛋白的C端序列，并将其与预期的氨基酸序列相比较(表9)。其结果表明测量的序列与期待的序列相同，且玉米和微生物来源的aad-1蛋白在C端均是相同且未改变的。

表9：AAD-1玉米和微生物来源的蛋白的C端序列数据的总结

¹萤光假单胞菌和玉米来源的AAD-1的最后10个氨基酸残基的预期的C端序列。

²萤光假单胞菌和玉米来源的AAD-1的检测出的C端序列。

备注：

上标数字(R^x)表明序列中氨基酸残基编号。

氨基酸残基缩写：

A：丙氨酸 G：甘氨酸

P：脯氨酸 R：精氨酸

T：苏氨酸 V：缬氨酸

实施例6：含有事件DAS-40278-9的杂合体玉米品系的田间表达、营养组成分析和 农艺学特征

本研究的目的是确定见于玉米组织的AAD-1蛋白的水平。此外，对玉米草料和谷粒进行了组成分析以调查等基因的非转化玉米品系和转基因玉米品系DAS-40278-9(未喷洒的，用2,4-D喷洒的，用喹禾灵喷洒的，和用2,4-D和喹禾灵喷洒的)之间的等价性。亦将等基因的非转化玉米品系的农艺学特征与DAS-40278-9玉米相比较。在位于美国和加拿大内的主要玉米生产区的六个测试地点进行田间表达、组成和农艺学试验。这些地点代表歧异的农艺学实践和环境条件的区。该试验位于Iowa、Illinois(2个位置)、Indiana、Nebraska和Ontario,Canada。

对于对照、未喷洒AAD-1、AAD-1+喹禾灵、AAD-1+2,4-D和AAD-1+两个登录样品的所有地点平均值在文献记载的对于玉米的范围内。在未喷洒AAD-1，AAD-1+喹禾灵，AAD-1+2,4-D或AAD-1+两种玉米和对照之间观察到有限数量的显著性差异，但不认为这些差异具有生物学意义，因为其较小，且结果落在见于商业性玉米的范围内。对组成结果的作图并未表明在未喷洒AAD-1，AAD-1+喹禾灵，AAD-1+2,4-D或AAD-1+两种玉米和对照玉米品系之间有任何生物学上有意义的处理相关的组成差异。结论是，未喷洒AAD-1，AAD-1+喹禾灵，AAD-1+2,4-D和AAD-1+两种玉米的组成结果确认了AAD-1(事件DAS 40278-9)玉米与常规玉米品系之间的等价性。

实施例6.1：测试的玉米品系

含有DAS-40278-9事件的杂交种子和作为与测试物质品系具有相同遗传背景，但不含DAS-40278-9事件的常规杂交种子的对照植物列于表10。

表10：

测试组	描述
		1	非aad-1对照
2	未喷洒aad-1
		3	与喹禾灵一起喷洒的aad-1
4	与2,4-D一起喷洒的aad-1
		5	与2,4-D和喹禾灵一起喷洒的aad-1

将如上所述的玉米植物种植于美国和加拿大主要玉米生长区内的位置。六个田间测试设施：Richland,IA；Carlyle,IL；Wyoming,IL；Rockville,IN；York,NE；和Branchton,Ontario,Canada(称作IA、IL1、IL2、IN、NE和ON)代表了对于玉米的歧异的农艺学实践和环境条件。

将测试和对照玉米种子以大约每行24个种子的播种率及每行间种子间隔大约10英寸(25cm)进行种植。在每个地点，建立了每种处理的4个重复的地块(plot)，每个地块由2-25英尺的行组成。以随机化完全区组(RCB)设计配置地块，在每个地点使用独特的随机化方式。每个玉米地块的边界是两行类似成熟程度的非转基因玉米杂合体相邻。整个试验地点由至少12行(或30英尺)的类似相对成熟程度的非转基因玉米杂合体所包围。

施加合适的昆虫、杂草和疾病控制以产生农艺学上可接受的作物。对于所述地点，每月的最高和最低温度以及降雨量和灌溉是通常水平的(average)。通常在玉米生产中遭遇这些范围。

实施例6.2：除草剂施用

以大约20加仑每英亩(187L/ha)的喷洒量施加除草剂处理。这些施用设计为重现最高标注率的商业性实践(to replicate maximum label rate commercial practices)。表11列出了使用的除草剂。

表11

除草剂	TSN	浓度
			Weedar 64	026491-0006	39％,3.76lb ae<sup>a</sup>/gal,451g ae/l
Assure II	106155	10.2％,0.87lb ai<sup>b</sup>/gal,104g ai/l

^a ae＝酸当量。

^b ai＝活性成分

将2,4-D(Weedar 64)作为3次过量撒播施用而施于测试组4和5(季度总量为3lbae/A)。单次施用是在出土前(pre-emergence)和大约V4和V8–V8.5期。对于Weedar 64，单次靶施用率为1.0lb ae/A，或1120g ae/ha。实际施用率范围为1096–1231g ae/A。

将喹禾灵(Assure II)作为单次过量撒播施用而施于测试组3和5。施用时机为大约V6生长期。对于Assure II，靶施用率为0.0825lb ai/A，或92g ai/ha。实际施用率范围为90.8–103g ai/ha。

实施例6.3：农艺学数据收集和结果

在每个位置的区组2、3和4内的所有测试组记录了农艺学特征。表12列出了下列测量的特征。

表12

备注：热单位＝((最高温度+最低温度)/2)–50°F

进行了对从对照，未喷洒aad-1，aad-1+2,4-D，aad-1+喹禾灵和aad-1+两者收集的农艺学数据的分析。对于地点间分析，对于早期群体(V1和V4)，活力，最终群体，作物损伤，至抽丝的时间，至花粉散发的时间，茎倒伏，根倒伏，疾病率，昆虫损害，至成熟的日数，植物高度和花粉生活力(形状和颜色)值，在位置间总体分析中未观察到统计学上显著的差异(表13)。对于保持绿色和穗高度，在对照和aad-1+喹禾灵组之间观察到配对t检验具显著性，但对于总体处理效果或False Discovery Rates(FDR)调整的p值则未伴以显著性(表13)。

Table13.对于DAS-40278-9add-1玉米(喷洒和未喷洒)和对照的位置间农艺学特 征结果的总体分析

^a 使用F检验估计的总体处理作用。

^b 使用t检验比较喷洒的和未喷洒的处理与对照。

^c 使用False Discovery Rate(FDR)步骤调整的P值。

^d 以1-9尺度肉眼估计；9＝具有大而鲁棒的叶的高植物。

^e 0-100％尺度；其中0＝无损伤，而100＝死亡的植物。

^f 从种植时累积的热单位数。

^g 0-100％尺度；其中为％具有塌陷的壁的花粉粒。

^h 0-100％尺度；其中为％具有强烈黄色的花粉粒。

ⁱ 以1-9尺度肉眼估计，其中1为无肉眼可见的绿色组织。

^j 以1-9尺度肉眼估计，其中1为不良疾病抗性。

^k 以1-9尺度肉眼估计，其中1为不良昆虫抗性。

^l NA＝因重复或处理之间无差异而未进行统计分析。

^m P值<0.05指示的统计学差异

实施例6.4：样品收集

用于表达和组成分析的样品如表14中所列进行收集。

表14：

实施例6.5：在玉米样品中确定aad-1蛋白

就aad-1蛋白的量分析玉米样品。使用从Beacon Analytical System,Inc.(Portland,ME)购买的酶联免疫吸附测定(ELISA)试剂盒对可溶的、可提取的aad-1蛋白进行定量。

玉米组织的样品从测试植物分离，并通过粗糙地研磨，冻干并用Geno/Grinder(Certiprep,Metuchen,New Jersey)精细研磨(若需要)以供表达分析。对于花粉无需进一步制备。用含有去污剂Tween-20(PBST)、含有0.5％牛血清白蛋白(BSA)的磷酸盐缓冲盐水溶液从玉米组织提取aad-1蛋白。对于花粉，用含有1mg/mL抗坏血酸钠和2％蛋白酶抑制剂混合物的0.5％PBST/BSA缓冲液提取蛋白。将植物组织和花粉提取物离心，收集水性上清，若需要，用合适的缓冲液稀释，并使用夹心形式的aad-1ELISA试剂盒进行分析。该试剂盒使用下述步骤。将稀释样品的等分试样和生物素化的抗aad-1单克隆抗体在用固定化的抗aad-1单克隆抗体涂覆的微滴定板的孔中进行温育。这些抗体与aad-1蛋白在孔中结合，并形成“夹心”，其中aad-1蛋白结合于可溶性和固定化的抗体之间。然后通过用PBST洗涤从板去除未结合的样品和缀合物。将过量的抗生蛋白链菌素-酶(碱性磷酸酶)缀合物添加至孔进行温育。在温育期间结束时，通过洗涤从板去除未结合的试剂。酶底物的后续添加生成了有色产物。因为aad-1结合于抗体夹心中，显色水平与样品中aad-1的浓度相关(即较低的残余浓度导致较低的显色)。使用Molecular Devices V-max或Spectra Max 190读板器测量405nm处的吸光度。生成了校正曲线，并使用与所述读板器兼容的Soft-MAX Pro^TM软件根据多项式回归方程计算未知样品中的aad-1浓度。对两次重复的孔分析样品，并报道两次重复的孔的平均浓度。

在多种玉米基质中aad-1蛋白浓度(各地点之间取平均值)的总结示于表15。aad-1平均蛋白浓度范围从R1期的根中的2.87ng/mg干重量至花粉中的127ng/mg。对于未喷洒的和喷洒的地块表达结果是类似的。在所有对照样品中均未检测出aad-1蛋白，仅有一个来自Indiana地点的对照根样品例外。

表15：在玉米组织中在未喷洒aad-1，aad-1+喹禾灵，aad-1+2,4-D和aad-1+喹禾灵 和2,4-D测量的aad-1蛋白的平均浓度水平的总结

^a ND＝值低于方法的检出限(LOD)。

^b括号中的值在方法LOD和定量限(LOQ)之间。

实施例6.6：组成分析

用多种测试就营养含量分析玉米草料和谷粒的样品。对于草料进行的分析包括灰分、总脂肪、水分、蛋白、糖、粗纤维、酸性洗涤纤维(acid detergent fiber)、中性洗涤纤维(neutral detergent fiber)、钙和磷。对于谷粒进行的分析包括营养成分(灰分、总脂肪、水分、蛋白、糖、粗纤维、酸性洗涤纤维)、中性洗涤纤维(NDF)、无机物、氨基酸、脂肪酸、维生素、次级代谢物和抗营养剂。将对于玉米草料和谷粒的营养分析的结果与在文献中报道的值相比较(参见Watson,1982(4)；Watson,1984(5)；ILSI Crop Composition Database,2006(6)；OECD Consensus Document on Compositional Considerations for maize,2002(7)；以及Codex Alimentarius Commission 2001(8))。

实施例6.6.1：对草料的营养成分、纤维和无机物分析

进行了对来自对照、未喷洒AAD-1、aad-1+喹禾灵、aad-1+2,4-D和aad-1+两者组的玉米草料样品中的蛋白、脂肪、灰分、水分、糖、ADF、NDF、钙和磷的分析。所有地点之间的结果的总结示于表16。对于地点间和单地点分析，所有的营养成分、纤维和无机物平均值在文献记载的范围内。对于水分、ADF、NDF、钙和磷，未在对照和转基因组之间的地点间分析中观察到统计学差异。对于蛋白和灰分，对于未喷洒AAD-1(蛋白)，aad-1+喹禾灵(蛋白)和aad-1+两者(灰分)观察到了显著的配对t校验结果，但并未伴以显著的总体处理效果或FDR调整的p值。对于脂肪，对于aad-1+喹禾灵与对照的比较观察到显著的配对t检验和调整的p值，但未观察到显著的总体处理效果。对于糖，在aad-1+喹禾灵和对照之间观察到统计学上显著的总体处理效果，配对t检验结果和FDR调整的p值。对糖，对于未喷洒AAD-1组亦观察到显著的配对t检验结果，但并无显著的FDR调整的p值。这些差异不具有生物学意义，因为所有这些分析物的地点间结果是在报道的对于玉米的文献范围内，且与对照的差异较小(<23％)。

表16：对来自所有地点的玉米草料的营养成分、纤维和无机物分析的总结

纤维

(％干重量)

无机物

(％干重量)

^a合并的范围。

^b使用F检验估计的总体处理效果。

^c使用t检验比较转基因处理与对照。

^d使用False Discovery Rate(FDR)步骤调整的P值。

^e由P值<0.05指示的统计学差异。

实施例6.6.2：谷粒的营养成分和纤维分析

对于所有位置之间的玉米粒中的营养成分(蛋白、脂肪、灰分、水分、胆固醇和糖)和纤维(ADF、NDF和总膳食纤维)的结果的总结示于表17。所有营养成分和纤维的结果在文献记载的范围内，且在地点间分析中，对于脂肪、灰分、NDF和总膳食纤维，并未在对照和转基因组之间观察到显著性差异。对于水分，观察到显著的总体处理效果，但并未伴以显著的配对t检验结果或FDR调整的p值。对于ADF，对于aad-1+两者观察到显著的配对t检验结果，但并未发现显著的总体处理效果或FDR调整的p值。对于蛋白和糖，对于未喷洒AAD-1、aad-1+喹禾灵以及aad-1+两者发现了显著的配对检验结果，调整的p值和总体处理效果。因为这些差异较小(<12％)，且所有值在文献记载的范围内，所述差异不视为具有生物学意义。

表17：对来自所有地点的玉米粒的营养成分和纤维分析的总结

纤维

(％干重)

^a 合并的范围。

^b 使用F检验估计的总体处理效果。

^c 使用t检验比较转基因处理与对照。

^d 使用False Discovery Rate(FDR)步骤调整的P值。

^e 由P值<0.05指示的统计学差异。

^f NR＝未报道。

^g NA＝因为大部分数据<LOQ而未进行统计学分析。

实施例6.6.3：谷粒的无机物分析

就无机物钙、铬、铜、碘、铁、镁、锰、钼、磷、钾、硒、钠和锌进行了对玉米粒样品的分析。所有位置间结果的总结示于表18。所有结果在文献报道的范围内。对于地点间分析，对于钙、铜、铁和钾未观察到显著性差异。对于铬、碘、硒和钠的平均结果低于方法的定量限。对于镁和磷，对于未喷洒aad-1和aad-1+喹禾灵组观察到显著性配对t检验结果，但并未伴以显著的总体处理效果或FDR调整的p值。对于锰和钼，对于未喷洒aad-1观察到显著性配对t检验结果，但未发现显著的FDR调整的p值和总体处理效果。对于aad-1+两者组，对于锌观察到显著性配对t检验结果，但并不存在显著性FDR调整的p值或总体处理效果。此外，这些与对照的差异较小(<13％)，且所有值在文献记载的范围(当可获得时)内。

表18：对来自所有地点的玉米粒的无机物分析的总结

^a 合并的范围。

^b 使用F检验估计的总体处理效果。

^c 使用t检验比较转基因处理与对照。

^d 使用False Discovery Rate(FDR)步骤调整的P值。

^e NA＝因为大部分数据<LOQ而未进行统计学分析。

^f 由P值<0.05指示的统计学差异。

实施例6.6.4：谷粒的氨基酸分析

就对照、未喷洒aad-1、aad-1+喹禾灵、aad-1+2,4-D以及aad-1+两者的玉米中的氨基酸含量分析了玉米样品，且对于所有位置的结果和单个田间地点的结果的总结示于表19。所有氨基酸的水平在文献报道的范围内，且对于精氨酸、赖氨酸和酪氨酸并未观察到地点间分析中的显著性差异。在地点间分析中对于几种氨基酸观察到显著性差异。在这些情况下，对照的氨基酸含量低于aad-1转基因品系，这可能与对照谷粒与aad-1品系相比整体蛋白含量较低有关。对于未喷洒aad-1的组，对于除了精氨酸、甘氨酸、赖氨酸、色氨酸和酪氨酸之外的所有氨基酸发现了显著性总体处理效果以及显著性配对t检验结果和FDR调整的p值。对于aad-1+喹禾灵组，对于除了精氨酸、半胱氨酸、甘氨酸、赖氨酸、色氨酸和酪氨酸之外的所有氨基酸发现了显著性总体处理效果以及显著性配对t检验结果和FDR调整的p值。对于aad-1+2,4-D组，对于除了精氨酸、天冬氨酸、甘氨酸、组氨酸、赖氨酸、酪氨酸和缬氨酸之外的所有氨基酸发现了显著性总体处理效果以及显著性配对t检验结果(及FDR调整的p值)。对于aad-1+两者组，对于除了精氨酸、甘氨酸、赖氨酸、丝氨酸、色氨酸和酪氨酸之外的所有氨基酸发现了显著性总体处理效果以及显著性配对t检验结果和FDR调整的p值。尽管对于氨基酸观察到许多差异，所述差异较小(<15％)，并未在所有地点观察到，且所有平均值在文献报道的范围内。

表19：对来自所有地点的玉米粒的氨基酸分析的总结

^a合并的范围。

^b使用F检验估计的总体处理效果。

^c使用t检验比较转基因处理与对照。

^d使用False Discovery Rate(FDR)步骤调整的P值。

^e由P值<0.05指示的统计学差异。

实施例6.6.5：谷粒的脂肪酸分析

就脂肪酸对玉米粒样品进行了分析。对于所有位置间结果的总结示于表20。对于这些脂肪酸，所有对于对照、未喷洒aad-1的、aad-1+喹禾灵、aad-1+2,4-D以及aad-1+两者的玉米粒样品分析的结果在公开的文献记载范围内。对于羊脂酸(8:0)、羊蜡酸(10:0)、月桂酸(12:0)、豆蔻酸(14:0)、豆蔻脑酸(14:1)、十五酸(15:0)、十五烯酸(pentadecenoic)(15:1)、十七酸(17:0)、十七烯酸(heptadecenoic)(17:1)、γ-亚麻酸(18:3)、二十碳二烯酸(20:2)、二十碳三烯酸(20:3)、和花生四烯酸(20:4)的结果低于方法的定量限(LOQ)。在地点间分析中，对于16:0棕榈酸、16:1棕榈油酸、18:0硬脂酸、18:2亚油酸、18:3亚麻酸、和20:0花生酸未观察到显著性差异。对于18:1油酸和20:1二十烯酸，对于未喷洒aad-1(18:1)和aad-1+2,4-D(18:1和20:1)组观察到显著性配对t检验结果，但并未伴以显著性总体处理效果或FDR调整的p值。对于22:0山嵛酸，对于aad-1+2,4-D和aad-1+两者发现了显著性总体处理效果和显著性配对t检验结果，但不存在显著性FDR调整的p值。

表20：对于来自所有地点的玉米粒的脂肪酸分析的总结

^a 从％干重量的单位换算为％脂肪酸的结果。

^b 合并的范围。

^c 使用F检验估计的总体处理效果。

^d 使用t检验比较转基因处理与对照。

^e 使用False Discovery Rate(FDR)步骤调整的P值。

^f NA＝因为大部分数据<LOQ而未进行统计学分析。

^g 由P值<0.05指示的统计学差异。

实施例6.6.6：谷粒的维生素分析

确定了来自对照、未喷洒aad-1、aad-1+喹禾灵、aad-1+2,4-D和aad-1+两者的玉米组的玉米粒样品中的维生素A、B1、B2、B5、B6、B12、C、D、E、烟酸和叶酸水平。所有位置间的结果的总结示于表21。维生素B12、D和E无法通过使用的分析方法定量。对于维生素所有报道的平均值结果与文献报道的值(当可获得时)类似。对于无文献报道的范围的维生素(维生素B5和C)的结果类似于获得的对照值(与对照差距<22％)。对于地点间分析，除了维生素B1、C和烟酸例外之外未观察到统计学差异。对于维生素B1，在对照与未喷洒aad-1、aad-1+喹禾及aad-1+两者之间观察到显著性配对t检验结果，但并未伴以显著性总体处理效果或FDR调整的p值。对于维生素C，对于aad-1+喹禾灵和aad-1+2,4-D观察到显著性总体处理效果以及显著性配对t检验结果和FDR调整的p值。类似地，对于烟酸，对于aad-1+喹禾灵和aad-1+两者，观察到显著性总体处理效果以及显著性配对t检验结果和ADR调整的p值。亦对烟酸，对于aad-1+2,4-D组发现了对于aad-1+2,4-D的显著性配对t检验结果，但并未伴以显著性总体处理效果或FDR调整的p值。因为在地点间未观察到差异，且值在文献记载的范围(当可获得时)内，所述差异不视为具有生物学意义。

表21：对于来自所有地点的玉米粒的维生素分析的总结

^a 合并的范围。

^b 使用F检验估计的总体处理效果。

^c 使用t检验比较转基因处理与对照。

^d 使用False Discovery Rate(FDR)步骤调整的P值。

^e 由P值<0.05指示的统计学差异。

^f NR＝未报道。

^g NA＝因为大部分数据<LOQ而未进行统计学分析。

实施例6.6.7：谷粒的抗营养剂和次级代谢物分析

确定了来自对照、未喷洒aad-1、aad-1+喹禾灵、aad-1+2,4-D和aad-1+两者的玉米组的玉米粒样品中的次级代谢物(香豆酸、阿魏酸、糠醛和肌醇)和抗营养剂(植酸、棉子糖和胰蛋白酶抑制剂)水平。所有位置间的结果的总结示于表22和23。对于地点间分析，所有值在文献记载的范围内。未在地点间分析中对于肌醇和胰蛋白酶抑制剂观察到各aad-1组和对照组结果之间有显著性差异。对于糠醛和棉子糖的结果低于方法的定量限。对于香豆酸(未喷洒aad-1、aad-1+2,4-D和aad-1+两者)，和阿魏酸(aad-1+喹禾灵和aad-1+两者)观察到显著性配对t检验结果。这些差异并未伴以显著性总体处理效果或FDR调整的p值，且类似于对照(<10％差异)。对于植酸(未喷洒aad-1)，发现显著性总体处理效果、配对t检验结果和FDR调整的p值。因为所有结果在文献记载的范围内，并类似于对照(<11％)，这些差异不视为具有生物学意义。

表22：对于来自所有地点的玉米粒的次级代谢物的总结

^a 合并的范围。

^b 使用F检验估计的总体处理效果。

^c 使用t检验比较转基因处理与对照。

^d 使用False Discovery Rate(FDR)步骤调整的P值。

^e 由P值<0.05指示的统计学差异。

^f NA＝因为大部分数据<LOQ而未进行统计学分析。

表23：对于来自所有地点的玉米粒的抗营养剂分析的总结

^a 合并的范围。

^b 使用F检验估计的总体处理效果。

^c 使用t检验比较转基因处理与对照。

^d 使用False Discovery Rate(FDR)步骤调整的P值。

^e 由P值<0.05指示的统计学差异。

^f NA＝因为大部分数据<LOQ而未进行统计学分析。

实施例7：其他农艺学试验

在歧异的环境间衡量玉米品系40278的农艺学特征与近等基因系(near-isoline)玉米品系的比较。处理包括总共21个位置间测试的四种遗传上不同的杂合体及其合适的近等基因系对照杂合体。

四个测试杂合体对于99至113日相对成熟度范围的迟熟杂合体而言是中等的。实验A在遗传背景Inbred C x BC3S1转换中测试事件DAS-40278-9。该杂合体具有109日的相对成熟度，并在16个位置测试(表24)。实验B测试杂合体背景Inbred E x BC3S1转换，113日相对成熟度的杂合体。在14个位置，使用与实验A略微不同的位置组合测试了该杂合体(表24)。实验C和D分别测试了杂合体背景BC2S1转换x Inbred D和BC2S1转换x Inbred F。这些杂合体具有99日相对成熟度并在相同的10个位置测试。

表24：农艺学试验的位置

对于每次试验，使用具有每个位置两次重复和两行地块的随机化完全区组设计。行长度为20英尺，每行以34个种子每行播种。在试验管理中使用标准区域农艺学实践。

就八个农艺学特征收集和分析了数据：植物高度、穗高度、茎倒伏、根倒伏、最终群体、谷粒水分、测试重量和产量。参数植物高度和穗高度提供了关于杂合体外观的信息。农艺学特征百分比茎倒伏和根倒伏确定了杂合体的可收获性。最终群体计数测量了种子的品质和影响产量的季节性生长条件。在收获时的百分比谷粒水分限定了杂合体的成熟度，而产量(就水分调整的蒲式耳/英亩)和测试重量(调整至15.5％水分的每蒲式耳玉米以磅计的重量)描述了杂合体的生殖能力。

使用线性模型在田间地点之间进行了方差分析。在模型中将组和位置作为固定作用。探索了包括位置和按组的位置作为随机作用的混合模型，但按组的位置仅仅解释了一小部分的方差，且其方差分量常常并不显著地不同于零。对于茎和根倒伏，使用对数变换以稳定方差，然而平均值和范围仍报道为起始的规模。在95％的置信水平表明了显著性差异。使用t检验估计总体处理效果的显著性。

来自这些农艺学特征试验的结果可见于表2。对于所有四个40278杂合体相对于等基因系对照，对于参数穗高度、茎倒伏、根倒伏、谷粒水分、测试重量和产量未发现统计学上的显著性差异(在p<0.05)。最终群体计数和植物高度在实验A和B中分别具有显著性差异，但与其他测试的40278杂合体相比并未发现类似的差异。所见的一些差异可归于从DAS-40278-9事件回交于优秀的近交系残留的低水平的遗传差异。对于测量的参数的值的总体范围均在对于传统的玉米杂合体获得的值的范围内，且并不导致增加的杂草状的结论。总而言之，农艺学表征数据表明40278玉米与常规玉米是生物学等价的。

表25：农艺学特征的分析

实验A

实验B

表25：(续)对于农艺学特征的分析

实验C

实验D

实施例8：使用玉米事件DAS-40278-9***位点进行靶向整合

在田间条件下几个世代的玉米事件DAS-40278-9的转基因的持续农艺学性能表明在玉米事件DAS-40278-9***位点周围的这些鉴定的区提供了对于其他感兴趣的转基因的靶向整合的良好基因组位置。此种靶向整合克服了所谓“位置作用”的问题，和在转基因整合入宿主时在基因组中产生突变的风险。此种靶向整合进一步的优点包括但不限于，减少在获得呈现所需水平的转基因表达，而不呈现转基因意外***宿主基因组的重要基因座所致的异常的转基因植物之前，必需筛选和测试的转化事件的巨大数量。而且，此种靶向整合允许层叠转基因，使得具有两种基因的优秀植物品系的育种更加有效。

使用公开的教导，本领域技术人员能够将感兴趣的多聚核酸靶向与玉米事件DAS-40278-9中相同的在染色体2上的***位点，或靶向非常靠近玉米事件DAS-40278-9中的所述***位点的位点。一种此种方法公开于国际专利申请号WO2008/021207，通过全文提述并入本文。

简言之，使用多至20Kb的在***位点5’侧翼的基因组序列和多至20Kb的在***位点3’侧翼的基因组序列(其部分鉴定为涉及SEQ ID NO:29)置于旨在通过同源重组***染色体2上的基因组位置的感兴趣基因的侧翼。所述感兴趣的一个或多个基因可置于与玉米事件DAS-40278-9***位点完全相同的位置或可置于玉米事件DAS-40278-9***位点周围20Kb区之内以赋予持续水平的转基因表达并对植物没有损害作用的任何位置。可将含有感兴趣的一个或多个基因和侧翼序列的DNA载体通过本领域技术人员已知的几种方法(包括但不限于土壤杆菌介导的转化)之一递送入植物细胞。供体DNA载体对玉米事件DAS-40278-9靶位点的***可进一步通过几种方法之一加强，所述方法包括但不限于重组增强基因的共表达或上调，或内源重组抑制基因的下调。此外，本领域已知基因组中特定序列的双链切割可用于增加同源重组频率，因此可通过表达天然或设计的用于切割这些序列的序列特异性内切核酸酶来增强对玉米事件DAS-40278-9***位点及其侧翼区的***。因此，使用本文中提供的教导，可将任何异源核酸在位于实施例4中讨论的5’分子标志物和实施例4中讨论的3’分子标志物之间的靶位点，优选在SEQ ID NO:29内，和/或如本文中另行讨论的其区域内***。

实施例9：pat具有表达盒从玉米事件DAS-40278-9的切出

对于靶向***玉米事件DAS-40278-9的基因座，选择性标志物基因表达盒的去除是有利的。pat选择性标志物从玉米事件DAS-40278-9的去除允许在后续的玉米世代中在多聚核酸靶向整合入染色体4中重新使用pat选择性标志物。

使用公开的教导，本领域技术人员能够从玉米事件DAS-40278-9切出感兴趣的多聚核酸。一种此种方法公开于临时美国专利申请号61/297,628，通过全文提述并入本文。

简言之，设计了识别、结合并切割在基因表达盒侧翼的特定DNA序列的序列特异性内切核酸酶，如锌指核酸酶。通过将含有转基因锌指核酸酶表达盒的亲本植物杂交于含有玉米事件DAS-40278-9的第二亲本植物来将锌指核酸酶递送至植物细胞。将所得的后代生长至成熟，并通过用含有草铵膦的除草剂涂抹叶来分析pat表达盒的丧失。以分子方法确认对除草剂不具抗性的后代植物，并进一步对其进行自体受精。在通过自体受精而获得后代中以分子方法确认pat表达盒的切出和去除。使用本文中提供的教导，可从玉米染色体2在位于实施例4中讨论的5’分子标志物和3’分子标志物之间的靶位置，优选在SEQ ID NO:29或其指明的区域内，切出任何异源核酸。

实施例10：对脆折(brittlesnap)的抗性

脆折指在施用生长调节剂型除草剂之后，强风所致的玉米茎断裂，通常发生于快速生长期。对含有事件DAS-40278-9的杂合体玉米和不含有事件DAS-40278-9的对照植物进行了机械的“推压(push)”测试，其使用物理性推压玉米以模拟由于强风所致的损害。在四个不同的地理位置进行了处理，并重复四次(有一个试验例外，其仅重复三次)。地块由八行组成：两种杂合体的每种各四行，其中两行含有事件DAS-40278-9而两行不含有事件。每行长度为二十英尺。使玉米植物生长至V4发育期，并将含有2,4-D(Weedar 64,Nufarm Inc.,Burr Ridge,IL)的商业性除草剂以1120g ae/ha、2240g ae/ha和4480g ae/ha的比例施用。在施用除草剂七日之后，进行了机械推压测试。用于脆折的机械推压测试包括将4英尺的横杆拖过两排玉米以模拟风造成的损害。横杆高度和移动速度设定为对于未处理的植物产生低水平的茎折断(10％或更低)以确保测试对于表明处理之间的差异足够苛刻。脆折处理的方向以与玉米倾倒相反的方向施加(applied against leaning corn)。

两个试验位置在施用2,4-D除草剂之后经历强风和暴雨。在连续两日，在HuxleyIA开始了雷雨。在田间地块的地点报道了2至17m s^-1的风速，其最高速度为33m s^-1。风向是多变的。某日，在Lanesboro MN报道了雷雨。在该田间地块的地点报道了高速度的风。此外，两次风暴均产生了降雨。风和雨的组合导致了报道的脆折损害。

对于机械推压测试(以及附加的天气状况)所致的脆折损害的评价是通过对损伤百分比进行肉眼评分来进行的。在机械脆折横杆处理之前，对含有事件DAS-40278-9和对照的杂合体玉米进行了植物直立计数(stand count)。在脆折横杆处理之后数日，重新评价了地块的直立计数。确定了地块内倾斜的百分比和减少直立的百分比(表26)。来自试验的数据表明在施用2,4-D之后，含有事件DAS-40278-9的杂合体玉米与不含的植物相比更加不易脆折。

表26：对于V4施用2,4-D胺的DAS-40278-9玉米脆折耐受性。对于含有事件DAS-40278-9的杂合体玉米植物计算了脆折百分比，并与不含该事件的对照植物进行了比较。

¹在两次试验中在施用之后2-3日发生了暴雨和强风

²以随机化完全区块设计重复四次处理(一次试验仅完成了三次重复)

³对于未处理中发生率校正的平均值(将未处理的平均值强行定为零)

实施例11：谷粒的蛋白分析

从含有事件DAS-40278-9的杂合体玉米与不含有所述事件的对照植物相比，产生了总蛋白含量增加的谷粒。进行了两次连续的多地点田间试验，包括未喷洒的和用三个不同除草剂组合进行的除草剂处理。在8个统计学比较中的7个中，DAS-40278-9事件产生了具有显著更高总蛋白含量的谷粒(表27)。对单个氨基酸进行的分析巩固了该数据。

表27：来自多地点田间试验的谷粒的蛋白含量

实施例12：其他农艺学试验

对于一个生长季从歧异的地理环境间的多个田间试验收集了含有事件DAS-40278-9的杂合体玉米的农艺学特征与近等基因系玉米的比较。对于如实施例7中所述的农艺学特征收集并分析了数据。对于含有DAS-40278-9的杂合体玉米品系与不含的植物的比较的结果列于表28。此外，对于在发育V3期喷洒除草剂喹禾灵(280g ae/ha)和在发育V6期喷洒2,4-D(2,240g ae/ha)的含有事件DAS-40278-9的杂合体玉米品系和不含的植物的农艺学特征描述于表29。

表28：对于含有事件DAS-40278-9的杂合体玉米与近等基因系对照比较的产量、水分百分比和最终群体结果。

表29：对于含有事件DAS-40278-9的杂合体玉米品系与近等基因系对照比较的产量、水分百分比、茎倒伏百分比、根倒伏百分比和总群体

Claims (6)

1.一种控制杂草的方法，包括对转基因玉米植物施用选自2,4-二氯苯氧基乙酸和芳氧基苯氧基丙酸酯除草剂的除草剂，所述转基因玉米植物包含基因组，所述基因组包含SEQID NO:29。

2.权利要求1的方法，其中所述转基因玉米植物包含如以登录号PTA-10244保藏于美国典型培养物保藏中心(ATCC)的种子中存在的AAD-1事件DAS-40278-9。

3.权利要求1或2的方法，其中所述除草剂是喹禾灵。

4.权利要求1或2的方法，其中所述转基因玉米植物具有对一种或多种其他除草剂的额外抗性。

5.权利要求4的方法，其中所述一种或多种其他除草剂选自草甘膦，草铵膦，乙酰乳酸合酶抑制性除草剂，咪唑啉酮，咪草烟，磺酰脲，***并嘧啶磺酰苯胺，嘧啶基硫代苯甲酸类，溴苯腈，4-羟基苯基丙酮酸双加氧酶抑制剂，八氢番茄红素去饱和酶的抑制剂，光***II抑制性除草剂，光***I抑制性除草剂，原卟啉原氧化酶抑制性除草剂，苯基脲除草剂，和麦草畏。

6.权利要求5的方法，其中所述方法还包括对所述转基因玉米植物施用一种或多种该植物对其有额外抗性的其他除草剂。