CN110643734A - 一种转基因玉米das-40278-9的rpa引物与探针组合、试剂盒及检测方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种转基因玉米DAS‑40278‑9的RPA引物与探针组合、试剂盒及检测方法，属于分子生物学技术领域。采用所述RPA引物及探针组合检测转基因玉米DAS‑40278‑9的具体方法为：提取待测样品的DNA作为模板，利用所述的RPA引物和探针组合进行快速扩增及实时荧光检测，如果得到明显的扩增曲线，则表明样本中含有转基因玉米DAS‑40278‑9。本发明所提供的转基因玉米DAS‑40278‑9的RPA引物及探针组合扩增效果好，条带特异性强、灵敏度高，为转基因玉米DAS‑40278‑9及其衍生品种的检测提供了新的技术手段。
Description
技术领域
本发明属于分子生物学技术领域，具体涉及一种转基因玉米DAS-40278-9的RPA(Recombinase Polymerase Amplification，RPA)引物与探针组合、试剂盒及检测方法。
背景技术
转基因作物作为目前世界上最重要的转基因产品之一，已经带来了巨大社会和经济效益。转基因作物2017年全球市场价值达到了158亿美元，其中玉米是获批转化体最多的作物(29个国家和地区，218个转化体)。然而，转基因玉米对人和动物健康的风险和对生态环境与农业的风险不容忽视。我国于2001年5月9日公布并实施《农业转基因生物安全管理条例》，于2002年1月5日公布了农业转基因生物安全评价，标识和进口安全管理三个配套管理办法。转基因抗除草剂玉米DAS-40278-9品系由美国陶氏益农公司研发，其经过遗传改良后表达一种芳氧基链烷酸酯双加氧酶(AAD-1)的蛋白质，该AAD-1蛋白带有α酶酮戊二酸依赖性双加氧酶的活性而降解包括2，4-二氯苯氧基乙酸(2，4-D)和芳氧苯氧丙酸酯类(FOP)家族除草剂，从而产生2，4-D和FOP家族除草剂耐受性。转基因抗除草剂玉米DAS-40278-9已经获得欧盟、美国、澳大利亚、巴西、加拿大、哥伦比亚、新西兰、韩国等国家的批准。我国在2017年6月批准了该转基因玉米。
对转基因产品作出综合评价，除了需要各国政府和国际机构制定科学的安全评价体系以及严格的管理法规外，能够建立有效的转基因玉米便捷、快速检测方法是对转基因作物进行安全性评价和实施监管的基础，也是农产品国际贸易健康发展的重要保障。
转基因产品的检测需要快速、准确、灵敏，并且还要满足样品量大，目标基因种类多等特点。因此，目前转基因作物的检测方法一般是检测样品中是否含有外源基因。目前主要是PCR检测方法，包括普通PCR方法、实时荧光PCR检测方法。这两种方法都需要变温过程及其相应的快速升降温及温度控制，也就需要价格高昂的专用PCR设备。并且PCR方法反应体系和操作过程比较复杂，需要专业人员；PCR方法扩增时间2-3小时，扩增结果的电泳时间需要1小时左右；电泳常用染料EB为强致癌物质，有较强毒性，且难以实行现场检测。所以，在生产实践和口岸一线检测中PCR检测方法，包括普通PCR方法、实时荧光PCR检测方法。所以，在生产实践和口岸一线检测中需要一种快速、简便、易普及、安全可靠且适合于现场操作的转基因作物检测方法。环介导等温扩增法尽管可以在恒温条件下进行扩增并有简易的可视化结果判定方法，但是要准确的读取结果还需要借助核酸电泳分析设备，并且操作时间较长，极容易出现非特异性扩增。
重组酶聚合酶扩增(Recombinase Polymerase Amplification，RPA)是一种多种酶和蛋白参与，在恒定温度条件下实现核酸指数扩增的新技术，取代了模拟体内DNA复制和修复时双链模板的完全解离和引物退火时的温度循环模式，被称为是可以替代PCR的核酸检测技术。该方法不需要复杂的仪器设备，特别适用于现场快速检测。
目前尚未有将RPA法应用于快速检测转基因玉米DAS-40278-9及其衍生品种的试剂盒。
发明内容
针对现有技术存在的上述问题，本发明所要解决的技术问题在于提供一种转基因玉米DAS-40278-9的RPA检测引物和探针组合，用于检测转基因玉米DAS-40278-9及其衍生品种。本发明所要解决的另一技术问题在于提供一种转基因玉米DAS-40278-9检测试剂盒。本发明所要解决的最后一个技术问题是提供转基因玉米DAS-40278-9的RPA检测方法。
为了解决上述技术问题，本发明所采用的技术方案如下：
一种转基因玉米DAS-40278-9的RPA引物与探针组合，其正向引物序列如SEQ IDNo.1所示，反向引物序列如SEQ ID No.2所示，探针序列如SEQ ID No.3所示。
所述的引物和探针组合在检测转基因玉米DAS-40278-9或其衍生品种中的应用。
所述的引物和探针组合在制备转基因玉米DAS-40278-9或其衍生品种的检测试剂或检测试剂盒中的应用。
一种转基因玉米DAS-40278-9的检测试剂盒，至少包括1次用量以上的权利要求1所述的RPA引物和探针组合，所述RPA引物和探针组合，其正向引物序列如SEQ ID No.1所示，反向引物序列如SEQ ID No.2所示，探针序列如SEQ ID No.3所示。
所述转基因玉米DAS-40278-9的检测试剂盒在检测转基因玉米DAS-40278-9或其衍生品种中的应用。
一种检测转基因玉米DAS-40278-9的方法：提取待测样品的DNA作为模板，利用权利要求1所述的引物对及探针组合，或权利要求4所述转基因玉米DAS-40278-9的检测试剂盒进行快速扩增及实时荧光检测，如果得到明显的扩增曲线，则表明所检样品含有转基因玉米DAS-40278-9。
优选地，所述检测转基因玉米DAS-40278-9的方法，其特征在于，具体步骤如下：
1)采用CTAB法提取样品DNA；
2)在200μL PCR管配制50μL的反应体系：引物DAS-9-F6 2.1μL、DAS-9-R6 2.1μL、DAS-P2 1μL、2×reaction buffer 23.6μL、dNTP 8.2μL、10×Probe E-mix 5μL、20×Corereaction Mix 2.5μL、50×Exo 1μL、280mM MgOAc 2.5μL、DNA 2μL；
3)将PCR管置于荧光检测仪中，37～42℃孵育30min，如果得到明显的扩增曲线，则表明所检样品含有转基因玉米DAS-40278-9。
优选地，所述的DAS-9-F6、DAS-9-R6和DAS-P2均为0.21μM。
优选地，所述的DNA浓度不小于0.05％。
有益效果：相比于现有技术，本发明的优点为：
(1)快速高效：整个扩增只用20～30min即可完成；
(2)操作简便：不需要复杂的仪器，不需要特殊试剂，不需要预先进行双链DNA的变性等繁琐步骤，只需要一部恒定扩增荧光检测仪就能反应和检测，条件简单温和；
(3)高特异性：本发明根据转基因玉米DAS-40278-9的外源基因与内源基因结合处设计了两条特异性引物，一条探针，扩增靶序列的一个区域，具有很强的品系特异性，且非常稳定；
(4)高灵敏度：最低检测极限可达到0.05％，比普通PCR灵敏度高100倍；
(5)鉴定简便：可通过观察荧光信号的有无来判断扩增与否，无需电泳等其他任何分析步骤，适合基层实验室检测。
附图说明
图1为RPA探针DAS-9-P2的特异性检测结果图；从上到下：转基因玉米DAS-40278-9、转基因玉米MON88017、转基因玉米MIR162、转基因玉米MON863、转基因玉米
转基因玉米NK603、转基因玉米GA21、阴性对照；
图2为RPA探针DAS-9-P2的特异性检测结果图；从上到下：转基因玉米DAS-40278-9、转基因玉米MON87427、转基因玉米MIR604、转基因玉米4676、转基因玉米BT176、转基因玉米BT11，转基因大豆MON87701，阴性对照；
图3为RPA探针DAS-9-P2的特异性检测结果图；从上到下：转基因玉米DAS-40278-9、非转基因玉米、非转基因小麦、非转基因油菜、阴性对照；
图4为RPA探针DAS-9-P2的灵敏度检测结果图；从上到下：转基因玉米DAS-40278-9(含量5％)、转基因玉米DAS-40278-9(含量1％)、转基因玉米DAS-40278-9(含量0.5％)、转基因玉米DAS-40278-9(含量0.1％)、转基因玉米DAS-40278-9(含量0.05％)、转基因玉米DAS-40278-9(含量0.01％)、转基因玉米DAS-40278-9(含量0.005％)、阴性对照；
图5为PCR检测转基因玉米DAS-40278-9电泳结果图；从左到右：M，DL2000DNAMarker(DNA分子量标准，最大DNA片段为2000bp)；1.转基因玉米DAS-40278-9(含量5％)；2.转基因玉米DAS-40278-9(含量1％)；3.转基因玉米DAS-40278-9(含量0.5％)；4.转基因玉米DAS-40278-9(含量0.1％)；5.转基因玉米DAS-40278-9(含量0.05％)；6.转基因玉米DAS-40278-9(含量0.01％)；7.转基因玉米DAS-40278-9(含量0.005％)；8.阴性对照。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明进一步进行描述。以下实施例中未作具体说明的分子生物学实验方法，均可参照《分子克隆实验指南》(第三版)J.萨姆布鲁克一书中所列的方法或本领域的常规方法进行，或者按照试剂盒和产品说明书进行。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
实施例1：引物的设计及特异性实验
引物设计：RPA引物长度一般为30至35个核苷酸。引物过短会严重影响重组酶的活性，长引物并不一定能提高扩增性能，反而会增加形成二级结构的可能性，增大来自引物的噪音。此外，引物设计时应尽量避免容易形成二级结构、引物-引物互作、发夹结构的序列，减少引物二聚体的形成。
本申请根据转基因玉米DAS-40278-9转化体特异序列(GenBank No.AB201314)，设计了10条引物和2条探针(表1)，以DAS-40278-9玉米基因组DNA为模板对不同引物组合进行测试。在20组测试结果中有3对引物可以得到扩增曲线，最终选出一对扩增起飞时间短并且荧光信号强的引物(DAS-9-F6/R6)和探针(DAS-P2)用于RPA，探针序列DAS-P2中的FAM为发光基团，dSpacer为脱碱基位点，BHQ1为淬灭基团，THF为四氢呋喃。
表1转基因玉米DAS-40278-9的引物和探针
根据所设计的引物和探针，分别对分离纯化的转基因玉米DAS-40278-9、MON88017、MIR162、MON863、
NK603、GA21、MON87427、MIR604、4676、BT176、BT11，转基因大豆MON87701，非转基因玉米、小麦、油菜进行鉴定，同时参照农业部2122号公告-9-2014中检测DAS-40278-9的引物：
DAS-40278-9-F：5′-CCATTCAGGAGACCTCGCTTG-3′，
DAS-40278-9-R：5′-CGAGCTTCAATCACTTTATGG-3′。
同时提供一种转基因玉米DAS-40278-9及其衍生品种的RPA检测试剂盒，包括引物液、反应液和对照：
(1)引物液：含有上述的引物与探针组合，浓度分别为10μM DAS-9-F6、10μM DAS-9-R6、10μM DAS-P2，各100μL。
(2)反应液：含有10mM dNTP、2×reaction buffer、10×Probe E-mix，20×Corereaction Mix，50×Exo，280mM MgOAc。
其中：10Mm dNTP购自宝生物工程(大连)有限公司；2×reaction buffer、10×Probe E-mix，20×Core reaction Mix，50×Exo，280mM MgOAc来自TwistAmp Liquid exo试剂盒，购自TwistDX公司。
(3)对照：阳性对照为转基因玉米DAS-40278-9的DNA或含目的基因的大肠杆菌质粒DNA，阴性对照为不含目的基因的反应混合液。
用上述试剂盒按以下方法对样品进行检测：
1、待检样品DNA的提取：采用CTAB法提取纯化待测样品DNA；其中，CTAB法提取转基因玉米DAS-40278-9的方法为：
(1)将约100mg待检样品放入研钵中，加入少量液氮迅速磨碎，液氮反复加入3～4次，磨碎成粉末为止；
(2)加入1.5mL预热至65℃的CTAB提取缓冲液，充分混合、悬浮试样，65℃保育30min，期间不停颠倒混匀；
(3)约12000g离心10min。转移上清至一新离心管，加入1倍体积的苯酚∶氯仿∶异戊醇(25∶24∶1)，充分混合，约12000g离心15min。转移上清至一新离心管中；
(4)加入1倍体积的氯仿∶异戊醇(24∶1)，充分混合，约12000g离心15min。转移上清至一新离心管中；
(5)加入2倍体积的CTAB沉淀缓冲液，室温静置保育60min；12000g离心15min，弃上清加入350μL氯化钠溶液溶解沉淀；12000g离心10min，转移上清至一新离心管；
(6)加入0.6倍体积异丙醇，倒置离心管轻柔混合，室温放置20min，12000g离心15min，弃上清，加入500μL 70％乙醇溶液，并颠倒离心管数次，12000g离心10min，弃上清；
(7)干燥DNA沉淀，加100μL TE缓冲液溶解DNA。
2、恒温扩增反应体系：在200μL PCR管配制50μL的反应体系：引物DAS-9-F6 2.1μL、DAS-9-R6 2.1μL、DAS-P2 1μL、2×reaction buffer 23.6μL、dNTP 8.2μL、10×Probe E-mix 5μL、20×Core reaction Mix 2.5μL、50×Exo 1μL、280mM MgOAc 2.5μL、DNA 2μL。
3、结果判断：将PCR管置于荧光检测仪中，37～42℃孵育30min。根据荧光曲线扩增的有无，判断结果。
鉴定结果(图1、图2和图3)显示：荧光检测仪未检测到转基因玉米MON88017、MIR162、MON863、
NK603、GA21、MON87427、MIR604、4676、BT176、BT11，转基因大豆MON87701，非转基因玉米、小麦、油菜反应管中有荧光曲线的扩增；而荧光检测仪检测到转基因玉米DAS-40278-9的反应管中荧光曲线的扩增。本结果与农业部2122号公告-9-2014中的定性PCR检测结果相一致，显示出良好的特异性。
实施例2：本发明检测方法反应与PCR灵敏度的比较
采用实施例1的技术方案，分别对稀释成5％、1％、0.5％、0.1％、0.05％、0.01％、0.005％的转基因玉米DAS-40278-9的DNA进行鉴定；
1、恒温扩增反应：在200μL PCR管配制50μL的反应体系：引物DAS-9-F6 2.1μL、DAS-9-R6 2.1μL、DAS-P2 1μL、2×reaction buffer 23.6μL、dNTP 8.2μL、10×Probe E-mix 5μL、20×Core reaction Mix 2.5μL、50×Exo 1μL、280mM MgOAc 2.5μL、DNA 2μL。
2、结果判断：将PCR管置于荧光检测仪中，37～42℃孵育30min。根据荧光曲线扩增的有无，判断结果。
检测结果(图4)表明，5％、0.5％、0.1％、0.05％均显示为有扩增，0.01％、0.005％、阴性对照显示为无扩增。
PCR反应引物采用本方法反应中的DAS-9-F6、DAS-9-R6。PCR反应为25μL体系，10×PCR Buffer(PCR反应缓冲液，Promega公司)2.5μL，10mM dNTPs(Promega公司)0.5μL，上、下游引物分别对应DAS-9-F6、DAS-9-R6，各0.5μL，Taq酶(5U/μL，Promega公司)0.5μL，DNA模板1μL，用灭菌去离子水补至25μL。反应程序为：95℃预变性5min；95℃变性30s，58℃退火30s，72℃延伸30s，循环数30；72℃延伸7min。PCR产物取10μL与2％琼脂糖凝胶电泳，120V电压下40min，通过凝胶成像分析仪观察结果(图5)，对应条带分别为：M，DL2000DNAMarker(DNA分子量标准，最大DNA片段为2000bp)；1，5％；2，0.5％；3，0.1％；4，0.05％；5，0.01％；6，0.005％；7，阴性对照。其中PCR方法的灵敏度为0.5％，而4，5，6，7显示为阴性结果。
由两种方法比较可以看出，本发明的试剂盒的灵敏度的结果可以达到0.05％的浓度，而PCR方法的灵敏度为0.5％，而0.1％或以下显示为阴性结果；经比对，本发明的试剂盒及方法灵敏度明显高于PCR方法的敏感度，能检测出更低含量的样品。
序列表
<110> 上海海关动植物与食品检验检疫技术中心
<120> 一种转基因玉米DAS-40278-9的RPA引物与探针组合、试剂盒及检测方法
<130> 100
<160> 16
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 30
<212> DNA
<213> DAS-9-F6引物序列(Artificial)
<400> 1
attcaggaga cctcgcttgt aacccaccac 30
<210> 2
<211> 30
<212> DNA
<213> DAS-9-R6引物序列(Artificial)
<400> 2
ctttcttttg ttccaagtca ttgcgtattt 30
<210> 3
<211> 44
<212> DNA
<213> DAS-P2探针序列(Artificial)
<400> 3
ccgtaccttg aagcggaata caatgaaggt acacgattta cagc 44
<210> 4
<211> 21
<212> DNA
<213> DAS-40278-9-F引物序列(Artificial)
<400> 4
ccattcagga gacctcgctt g 21
<210> 5
<211> 21
<212> DNA
<213> DAS-40278-9-R:引物序列(Artificial)
<400> 5
cgagcttcaa tcactttatg g 21
<210> 6
<211> 33
<212> DNA
<213> DAS-9-F1引物序列(Artificial)
<400> 6
tctacctatc tcatcagctt ttctccattc agg 33
<210> 7
<211> 31
<212> DNA
<213> DAS-9-F2引物序列(Artificial)
<400> 7
tcaggagacc tcgcttgtaa cccaccacat a 31
<210> 8
<211> 33
<212> DNA
<213> DAS-9-F3引物序列(Artificial)
<400> 8
agacctcgct tgtaacccac cacatataga tcc 33
<210> 9
<211> 33
<212> DNA
<213> DAS-9-F4引物序列(Artificial)
<400> 9
cccaccacat atagatccat cccaagaagt agt 33
<210> 10
<211> 33
<212> DNA
<213> DAS-9-F5引物序列(Artificial)
<400> 10
gatccatccc aagaagtagt gtattacgcc tct 33
<210> 11
<211> 33
<212> DNA
<213> DAS-9-R1引物序列(Artificial)
<400> 11
atcactttat ggttcattgt attctggctt tgc 33
<210> 12
<211> 31
<212> DNA
<213> DAS-9-R2引物序列(Artificial)
<400> 12
attgtattcc gcttcaaggt acggtgctgt t 31
<210> 13
<211> 33
<212> DNA
<213> DAS-9-R3引物序列(Artificial)
<400> 13
caatggttcg tgctggacgc acgagagagg gat 33
<210> 14
<211> 33
<212> DNA
<213> DAS-9-R4引物序列(Artificial)
<400> 14
agctaacctt cattgtattc cgcttcaagg tac 33
<210> 15
<211> 33
<212> DNA
<213> DAS-9-R5引物序列(Artificial)
<400> 15
ccttcattgt attccgcttc aaggtacggt gct 33
<210> 16
<211> 45
<212> DNA
<213> DAS-P1探针序列(Artificial)
<400> 16
ctctctaagc ggcccaaact tgcagaaaac cgcccctctc tcgtg 45
Claims (9)
1.一种转基因玉米DAS-40278-9的RPA引物与探针组合，其特征在于：其正向引物序列如SEQ ID No.1所示，反向引物序列如SEQ ID No.2所示，探针序列如SEQ ID No.3所示。
2.权利要求1所述的引物与探针组合在检测转基因玉米DAS-40278-9或其衍生品种中的应用。
3.权利要求1所述的引物与探针组合在制备转基因玉米DAS-40278-9或其衍生品种的检测试剂或检测试剂盒中的应用。
4.一种转基因玉米DAS-40278-9的检测试剂盒，其特征在于，至少包括1次用量以上的权利要求1所述的RPA引物和探针组合，所述RPA引物和探针组合，其正向引物序列如SEQ IDNo.1所示，反向引物序列如SEQ ID No.2所示，探针序列如SEQ ID No.3所示。
5.权利要求4所述转基因玉米DAS-40278-9的检测试剂盒在检测转基因玉米DAS-40278-9或其衍生品种中的应用。
6.一种检测转基因玉米DAS-40278-9的方法，其特征在于：提取待测样品的DNA作为模板，利用权利要求1所述的引物对及探针组合，或权利要求4所述转基因玉米DAS-40278-9的检测试剂盒进行快速扩增及实时荧光检测，如果得到明显的扩增曲线，则表明所检样品含有转基因玉米DAS-40278-9。
7.根据权利要求6所述检测转基因玉米DAS-40278-9的方法，其特征在于，具体步骤如下：
1)采用CTAB法提取样品DNA；
2)在PCR管配制50μL的反应体系：引物DAS-9-F6 2.1μL、DAS-9-R6 2.1μL、DAS-P2 1μL、2×reaction buffer 23.6μL、dNTP 8.2μL、10×Probe E-mix 5μL、20×Core reactionMix2.5μL、50×Exo 1μL、280mM MgOAc 2.5μL、DNA2 μL；
3)将PCR管置于荧光检测仪中，37～42℃孵育30min，如果得到明显的扩增曲线，则表明所检样品含有转基因玉米DAS-40278-9。
8.根据权利要求7所述检测转基因玉米DAS-40278-9的方法，其特征在于，所述的DAS-9-F6、DAS-9-R6和DAS-P2均为0.21μM。
9.根据权利要求7所述检测转基因玉米DAS-40278-9的方法，其特征在于，所述的DNA浓度不小于0.05％。
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| CN (1) | CN110643734A (zh) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN112301144A (zh) * | 2020-10-13 | 2021-02-02 | 中国农业科学院生物技术研究所 | 用于检测转基因玉米dbn9958的rpa引物探针组合、试剂盒及检测方法 |
Citations (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US20110151441A1 (en) * | 2009-12-18 | 2011-06-23 | Dow Agrosciences Llc | Endpoint taqman methods for determining zygosity of corn comprising tc1507 events |
| CN103820566A (zh) * | 2014-03-13 | 2014-05-28 | 四川省农业科学院分析测试中心 | 转基因玉米das-40278-9品系特异定量pcr精准检测的引物和探针及方法 |
| CN104962522A (zh) * | 2009-08-19 | 2015-10-07 | 陶氏益农公司 | Aad-1事件das-40278-9、相关的转基因玉米品系及其事件特异性鉴定 |
| CN106801092A (zh) * | 2017-01-22 | 2017-06-06 | 中国农业科学院生物技术研究所 | 应用RPA技术对转基因玉米Bt176品系特异性鉴定 |
| CN109825632A (zh) * | 2019-04-03 | 2019-05-31 | 深圳出入境检验检疫局食品检验检疫技术中心 | 转基因玉米品系das40278-9检测方法和试剂 |
| CN110373488A (zh) * | 2019-06-12 | 2019-10-25 | 中国检验检疫科学研究院 | 一种检测转基因成分的dna标准样品及其应用 |
-
2019
- 2019-11-11 CN CN201911099360.0A patent/CN110643734A/zh active Pending
Patent Citations (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN104962522A (zh) * | 2009-08-19 | 2015-10-07 | 陶氏益农公司 | Aad-1事件das-40278-9、相关的转基因玉米品系及其事件特异性鉴定 |
| US20110151441A1 (en) * | 2009-12-18 | 2011-06-23 | Dow Agrosciences Llc | Endpoint taqman methods for determining zygosity of corn comprising tc1507 events |
| CN103820566A (zh) * | 2014-03-13 | 2014-05-28 | 四川省农业科学院分析测试中心 | 转基因玉米das-40278-9品系特异定量pcr精准检测的引物和探针及方法 |
| CN106801092A (zh) * | 2017-01-22 | 2017-06-06 | 中国农业科学院生物技术研究所 | 应用RPA技术对转基因玉米Bt176品系特异性鉴定 |
| CN109825632A (zh) * | 2019-04-03 | 2019-05-31 | 深圳出入境检验检疫局食品检验检疫技术中心 | 转基因玉米品系das40278-9检测方法和试剂 |
| CN110373488A (zh) * | 2019-06-12 | 2019-10-25 | 中国检验检疫科学研究院 | 一种检测转基因成分的dna标准样品及其应用 |
Non-Patent Citations (4)
| Title |
|---|
| 任君安: "重组酶聚合酶扩增技术及其在食品检测中的应用", 《食品安全质量检测学报》 * |
| 刘静: "重组酶聚合酶扩增技术检测转基因玉Bt11", 《上海农业学报》 * |
| 王晓勋: "重组酶聚合酶扩增技术及其在食品安全领域的应用", 《食品科技》 * |
| 郭正洋: "重组酶聚合酶扩增技术的研究进展", 《食品科技》 * |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN112301144A (zh) * | 2020-10-13 | 2021-02-02 | 中国农业科学院生物技术研究所 | 用于检测转基因玉米dbn9958的rpa引物探针组合、试剂盒及检测方法 |
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