ES2612119T3

ES2612119T3 - Nuevos genes de resistencia a herbicidas

Info

Publication number: ES2612119T3
Application number: ES11010162.3T
Authority: ES
Inventors: Terry Wright; Justin Lira; Terence Anthony Walsh; Donald Merlo; Pon Samuel Jayakumar; Gaofeng Lin
Original assignee: Dow AgroSciences LLC
Current assignee: Corteva Agriscience LLC
Priority date: 2005-10-28
Filing date: 2006-10-27
Publication date: 2017-05-12
Anticipated expiration: 2026-10-27
Also published as: CN101553111A; ZA200803982B; NZ567807A; WO2007053482A3; US10167483B2; JP2009513139A; EP1947926A2; EP2484767B1; US11371055B2; US20150080218A1; ES2637948T3; EP1947926B1; EP2484767A1; EP3241430A1; US20170009214A9; US20170211087A1; AU2006308959A1; JP5647204B2; NZ595200A; ES2843401T3

Abstract

Un polinucleótido aislado que codifica una proteína que proporciona a una célula de planta tolerancia a un herbicida seleccionado del grupo que consiste en una fenoxi auxina o una piridiloxi auxina, en el que dicho polinucleótido está unido operativamente a un promotor que es funcional en dicha célula de planta, en el que una molécula de ácido nucleico que codifica dicha proteína se hibrida en condiciones rigurosas con el complemento completo de una secuencia seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:3, y SEQ ID NO:5, y en el que dicha proteína es al menos 96% idéntica a una secuencia seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 2 y SEQ ID NO: 4.

Description

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relativamente económico y robusto que puede proporcionar excelente utilidad para los productores si se puede proporcionar mayor tolerancia del cultivo en los cultivos de dicotiledóneas y monocotiledóneas similares. Los cultivos de dicotiledóneas transgénicas tolerantes a 2,4-D también pueden tener mayor flexibilidad en el tiempo y tasa de aplicación. Una utilidad adicional del presente rasgo de tolerancia a los herbicidas para 2,4-D es su utilidad para 5 evitar daños a los cultivos normalmente sensibles a la deriva, volatilización, inversión de de 2,4-D, (o de otro tipo fuera del sitio fenómeno de movimiento fuera del sitio), mala aplicación, vandalismo, y similares. Un beneficio adicional del gen AAD-12 es que a diferencia de todos los homólogos de WA caracterizados hasta la fecha, AAD-12 es capaz de degradar las auxinas de piridiloxiacetatos (por ejemplo, triclopir, fluroxipir) además de auxinas fenoxi aquirales (por ejemplo, 2,4-D, MCPA, ácido 4-clorofenoxiacético). Véase la Tabla 1. Una ilustración general de las 10 reacciones químicas catalizadas por la presente enzima AAD-12 se muestra en la Figura 1. (La adición de O2 es estereoespecífica; la degradación del producto intermedio a fenol y glioxilato es espontánea). Se debe entender que las estructuras químicas de la Figura 1 ilustran los esqueletos moleculares y que varios grupos R y similares (tales como los que se muestran en la Tabla 1) se incluyen, pero no se ilustran necesariamente en forma específica en la Figura 1. Se ha usado múltiples mezclas de diferentes combinaciones de fenoxi auxina a nivel mundial a la dirección 15 espectros malas hierbas específica y las condiciones ambientales en las distintas regiones. El uso del gen de AAD12 en las plantas proporciona protección a un espectro mucho más amplio de los herbicidas de auxina, lo que aumenta la flexibilidad y los espectros de malas hierbas que se pueden controlar. La presente invención también se puede usar para proteger de la deriva o la lesión del herbicida de auxina sintético fuera de sitio para toda la amplitud de las auxinas fenoxi comercialmente disponibles. La Tabla 1 define piridiloxi y fenoxi auxinas disponibles en el

20 comercio y proporciona las estructuras químicas pertinentes.

Tabla 1. Fenoxiacetato y piridiloxiacetato auxinas comercialmente disponibles. La referencia a los herbicidas de fenoxi auxina y de piridiloxi auxina se refiere generalmente al ácido activo pero algunos se formulan comercialmente como cualquiera de una variedad de formulaciones del correspondiente éster y asimismo se consideran como sustratos para la enzima AAD-12 en planta, ya que las esterasas generales de la planta convierten estos ésteres a los ácidos activos en la planta. Asimismo la referencia también puede ser para la sal orgánica o inorgánica correspondiente del ácido correspondiente. Los intervalos de tasa de uso posibles pueden ser tratamientos independientes o en combinación con otros herbicidas en usos para cultivos y no cultivos.

Nombre químico: CAS nº Intervalos de tasa uso posibles (g ae/ha) Intervalos de tasa uso preferidos (g ae/ha) Estructura

2,4-D: 94-75-7 25 — 4000 280-1120

2,4,5-T: 93-76-5 25 – 4000 25 – 4000 imagen4

4-CPA: 122-88-3 25 – 4000 25 – 4000

3,4-DA: 588-22-7 25 – 4000 25 – 4000 imagen5

MCPA: 94-74-6 25 — 4000 125-1550 imagen6

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Triclopir: 55335-06-3 50 —2000 70 — 840 imagen7

Fluroxipir: 69377-81-7 25 — 2000 35 — 560 imagen8

Un solo gen (AAD-12) se ha identificado ahora que, cuando se manipulan genéticamente para la expresión en plantas, tiene las propiedades que permitan el uso de herbicidas de fenoxi auxina en las plantas donde la tolerancia inherente nunca existió o no era suficientemente alto para permitir el uso de estos herbicidas. Además, AAD-12 puede proporcionar protección en planta a herbicidas de piridiloxiacetatos donde la tolerancia natural tampoco fue suficiente para permitir la selectividad, ampliando la utilidad potencial de estos herbicidas. Las plantas que contienen AAD-12 solo se pueden tratar secuencialmente o mezclar en tanque con uno, dos, o una combinación de varios herbicidas de fenoxi auxina. La tasa para cada herbicida de fenoxi auxina puede variar desde 25 hasta 4000 g ae/ha, y más típicamente de 100 a 2.000 g ae/ha para el control de un amplio espectro de malas hierbas dicotiledóneas. Del mismo modo, uno, dos, o una mezcla de varios compuestos de piridiloxiacetato auxina se puede aplicar a plantas que expresan AAD-12 con un menor riesgo de lesión a partir de dicho herbicidas. La tasa para cada herbicidas de piridiloxiacetato puede variar desde 25 hasta 2.000 g ar/ha, y más típicamente 35 a 840 g ae/ha para el control de malas hierbas dicotiledóneas adicionales.

El glifosato se utiliza ampliamente debido a que controla un espectro muy amplio de especies de malas hierbas hoja ancha y gramíneas. Sin embargo, el uso repetido del glifosato en el GTC y en aplicaciones no agrícolas ha seleccionado y continuará produciendo cambios de las malas hierbas a especies naturalmente más tolerantes o biotipos resistentes al glifosato. Los compañeros del herbicida de mezcla en tanque utilizados en tasas eficaces que ofrecen un control de la misma especie pero que tienen diferentes modos de acción están indicados en la mayoría de las estrategias de manejo de resistencia a los herbicidas como método para retrasar la aparición de malas hierbas resistentes. El apilamiento de AAD-12 con un rasgo de tolerancia a glifosato (y/o con otros rasgos de tolerancia a herbicidas) podría proporcionar un mecanismo para permitir el control de especies de malas hierbas dicotiledóneas resistentes al glifosato en GTCs al permitir el uso de glifosato, herbicidas de fenoxi auxinas (por ejemplo, 2,4-D) y piridiloxiacetatos auxinas (por ejemplo, triclopir) de forma selectiva en el mismo cultivo. Las aplicaciones de estos herbicidas pueden ser simultáneamente en una mezcla de tanque que comprende dos o más herbicidas de diferentes modos de acción; aplicaciones individuales de composición de herbicida único en aplicaciones secuenciales como antes de la plantación, en preemergencia o pos-emergencia y tiempo dividido de aplicaciones que van desde aproximadamente 2 horas a aproximadamente 3 meses; o, alternativamente, cualquier combinación de cualquier número de herbicidas que representan cada clase química se puede aplicar en cualquier momento dentro de aproximadamente 7 meses de la plantación del cultivo hasta la cosecha del cultivo (o el intervalo de antes de la cosecha para el herbicida individual, el que sea más corto).

Es importante disponer de flexibilidad en el control de un amplio espectro de malas hierbas de pastos y hoja ancha en términos de tiempo de la aplicación, tasa de herbicidas individuales, y la capacidad de controlar las malas hierbas difíciles o resistentes. Las aplicaciones de glifosato en un cultivo con un apilamiento de gen de resistencia a glifosato/AAD-12 podrían variar de aproximadamente 250 a 2500 g ae/ha; herbicidas de fenoxi auxina (uno o más) se puede aplicar de aproximadamente 25 a 4000 g ae/ha; y herbicidas de piridiloxiacetatos auxina (uno o más) se puede aplicar de 25-2000 g ae/ha. La combinación y tiempo de estas aplicaciones óptimos dependerán de la situación particular de las especies y el ambiente, y será determinado mejor por una persona experta en la técnica de control de malas hierbas y que tenga el beneficio de la presente descripción.

Las plántulas son típicamente resistentes a largo de todo el ciclo de cultivo. Las plantas transformadas típicamente serán resistentes a la nueva aplicación de herbicidas en cualquier momento que se expresa el gen. La tolerancia se

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algodón, soja, canola, y el arroz se han transformado con constructos que contienen AAD-12-y han demostrado altos niveles de resistencia a los herbicidas de fenoxi y piridiloxi auxina. Por lo tanto, la presente invención también se refiere a genes "optimizados en planta” que codifican las proteínas de la presente invención.

Los grupos oxialcanoato son útiles para la introducción de una funcionalidad de ácido estable en herbicidas. El grupo ácido puede impartir movilidad en el floema por "captura ácida", un atributo deseable para la acción herbicida y por lo tanto se podría incorporar a nuevos herbicidas con fines de movilidad. También se describe un mecanismo de creación de los HTC. Existen muchos potenciales herbicidas comerciales y experimentales que pueden servir como sustratos para AAD-12. Por lo tanto, el uso de los presentes genes también puede producir tolerancia a los herbicidas a los otros herbicidas también.

Los rasgos de HTC de la presente invención se pueden usar en nuevas combinaciones con otros rasgos HTC (que incluyen pero sin limitación la tolerancia al glifosato). Estas combinaciones de rasgos dan origen a nuevos métodos de control de especies de malas hierbas (y similares), debido a la resistencia recién adquirida o tolerancia inherente a los herbicidas (por ejemplo, glifosato). Por lo tanto, además de los rasgos de HTC, se describen los nuevos métodos para el control de malas hierbas utilizando herbicidas, para los cuales la tolerancia a los herbicidas fue creada por dicha enzima en cultivos transgénicos.

Esta invención se puede aplicar en el contexto de la comercialización de un rasgo de resistencia 2,4-D apilado con por ejemplo, rasgos de resistencia al glifosato actuales en la soja. Por lo tanto, esta invención proporciona una herramienta para combatir los cambios en las especies de malas hierbas de hoja ancha turnos y/o la selección de malas hierbas de hoja ancha resistentes a los herbicidas, que termina con la dependencia extremadamente alta de los productores sobre el glifosato para el control de malas hierbas con diversos cultivos.

La expresión transgénica de los genes de AAD-12 presentes se ejemplifica en, por ejemplo, Arabidopsis, tabaco, soja, algodón, arroz, maíz y canola. La soja es un cultivo preferido para la transformación de acuerdo con la presente invención. Sin embargo, esta invención se puede usar en otros múltiples cultivos monocotiledóneos (tales como pastos o césped) y los cultivos de dicotiledóneas como alfalfa, trébol, especies de árboles, y otros. Del mismo modo, 2,4-D (u otros sustratos de AAD-12) se pueden utilizar de manera más positiva en los cultivos de pastos donde la tolerancia es moderada, y el aumento de la tolerancia a través de este rasgo puede proporcionar a los cultivadores la oportunidad de utilizar estos herbicidas a tasas más eficaces y en un tiempo de aplicación más amplio sin el riesgo de daño al cultivo.

Aún más, la presente invención proporciona un único gen que puede proporcionar resistencia a los herbicidas que controlan las malas hierbas de hoja ancha. Este gen se puede usar en múltiples cultivos para permitir el uso de una combinación de herbicidas de amplio espectro. La presente invención también puede controlar las malas hierbas resistentes a los productos químicos actuales, y ayuda en el control del cambio de los espectros de malas hierbas como resultado de las prácticas agronómicas actuales. AAD-12 presente también se puede utilizar en los esfuerzos para desintoxicar efectivamente sustratos herbicidas adicionales a las formas no herbicidas. Por lo tanto, la presente invención proporciona el desarrollo de rasgos HTC adicionales y/o tecnología del marcador seleccionable.

Aparte de o además del uso de los presentes genes para producir HTC, los presentes genes también se pueden usar como marcadores seleccionables para la selección de transformantes con éxito en cultivos celulares, invernaderos, y en el campo. Hay un alto valor inherente para los presentes genes simplemente como un marcador seleccionable para proyectos de biotecnología. La promiscuidad de AAD-12 para otros herbicidas auxínicos de ariloxialcanoato proporciona muchas oportunidades para utilizar este gen para fines de HTC y/o marcadores seleccionables.

Proteínas (y cepas fuente). Se describen proteínas funcionales. Por "actividad funcional" (o "activo") se entiende en este documento que las proteínas/enzimas para uso de acuerdo con la presente invención tienen la capacidad de degradar o disminuir la actividad de un herbicida (solo o en combinación con otras proteínas). Las plantas productoras de proteínas de acuerdo con la presente invención preferentemente producirán "una cantidad efectiva" de la proteína de modo que cuando la planta se trata con un herbicida, el nivel de expresión de la proteína es suficiente para volver a la planta completa o parcialmente resistentes o tolerantes al herbicida (a una tasa típica, a menos que se especifique lo contrario, las tasas de aplicación típicas se pueden hallar por ejemplo en el Herbicide Handbook bien conocido (Weed Science Society of America, Octava edición, 2002)). El herbicida se puede aplicar a tasas que normalmente eliminarían a la planta blanco, en las tasas de uso y concentraciones de campo normales. (Debido a la presente invención, el nivel y/o la concentración opcionalmente pueden ser superiores a las que se utilizaron previamente). Preferiblemente, las células de plantas y las plantas de la presente invención están protegidas contra la inhibición del crecimiento o lesión causada por el tratamiento herbicida. Las plantas y células de plantas transformadas de la presente invención preferiblemente se convirtieron en resistentes o tolerantes a un herbicida, como se discute en la presente, lo que significa que las células de planta y plantas transformadas pueden crecer en la presencia de cantidades efectivas de uno o más herbicidas como se discute en la presente. Las proteínas preferidas tienen actividad catalítica para metabolizar uno o más compuestos de ariloxialcanoato.

Se puede discutir fácilmente el término "resistencia" y no utilizar el verbo "tolerar" o el adjetivo "tolerante". La industria ha pasado innumerables horas debatiendo sobre cultivos con tolerancia a herbicidas (HTC) frente a los

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de lavado expuestas en la presente, y como puede ser conocido por los expertos en la técnica (por ejemplo, se puede usar SSPE como la sal en lugar de SSC). El SSC 2x/SDS 0,1% se puede preparar mediante la adición de 50 ml de 20x SSC y 5 ml de 10% SDS a 445 ml de agua. 20x SSC se puede preparar mediante la combinación de NaC1 (175,3 g/0,150 M), citrato de sodio (88,2 g/0,015 M), y agua, ajustando el pH a 7,0 con NaOH 10 N, a continuación, se ajusta el volumen a 1 litro. Se puede preparar SDS 10% disolviendo 10 g de SDS en 50 ml de agua esterilizada en autoclave, posteriormente se diluye hasta 100 ml.

La detección de la sonda proporciona un medio para determinar de una manera conocida si la hibridación se ha mantenido. Tal análisis de la sonda proporciona un método rápido para identificar genes de la presente invención. Los segmentos de nucleótidos utilizados como sondas pueden ser sintetizados utilizando un sintetizador de ADN y métodos estándar. Estas secuencias de nucleótidos también se pueden utilizar como cebadores de PCR para los amplificar genes de la presente invención.

Las características de hibridación de una molécula se pueden usar para definir los polinucleótidos de la presente invención. En consecuencia, la presente invención incluye polinucleótidos (y/o sus complementos, preferiblemente sus complementos completos) que hibridan con un polinucleótido ejemplificado en la presente. Es decir, una manera de definir un gen (y la proteína que codifica), por ejemplo, es por su capacidad para hibridar (bajo cualquiera de las condiciones específicamente descritas en la presente) con un gen conocido o ejemplificado específicamente.

[Tal como se usa en la presente, las condiciones "rigurosas" para la hibridación se refieren a las condiciones que logran el mismo, o aproximadamente el mismo grado de especificidad de la hibridación que las condiciones empleadas por los solicitantes actuales. Específicamente, la hibridación del ADN inmovilizado en las transferencias Southern con sondas específicas del gen marcadas con 32P se puede realizar por métodos estándares (véase, por ejemplo, Maniatis et al, 1982). En general, la hibridación y los lavados posteriores pueden llevarse a cabo bajo condiciones que permiten la detección de secuencias blanco. Para las sondas de genes de ADN de cadena doble, la hibridación se puede llevar a cabo durante la noche a 20-25 ºC por debajo de la temperatura de fusión (Tm) del híbrido de ADN en 6x SSPE, solución de Denhardt 5x, SDS 0,1%, ADN desnaturalizado 0,1 mg/ml. La temperatura de fusión se describe mediante la siguiente fórmula (Beltz et al., 1983):

Tm 81,5 ºC + 16,6 Log [Na +] + 0,41 (% G + C)-0,61 (% de formamida) 600/longitud del dúplex en pares de bases.

Los lavados se pueden llevar a cabo normalmente de la siguiente manera:

(1): Dos veces a temperatura ambiente durante 15 minutos en 1x SSPE, SDS 0,1% (lavado de baja rigurosidad).

(2): Una vez a Tm-20 °C durante 15 minutos en SSPE 0,2x, SDS 0,1% (lavado de rigurosidad moderada).

Para las sondas de oligonucleótidos, la hibridación puede llevarse a cabo durante la noche a 10-20 ºC por debajo de la temperatura de fusión (Tm) del híbrido en 6x SSPE, solución de Denhardt 5x, SDS 0,1%, ADN desnaturalizado 0,1 mg/ml. La Tm para las sondas de oligonucleótidos se puede determinar por la siguiente fórmula:

Tm (°C) = 2 + 4 (número de pares de bases G/C) (número T/A pares de bases)

(Suggs et al., 1981).

Los lavados se pueden llevar a cabo normalmente de la siguiente manera:

(2): Una vez a la temperatura de hibridación durante 15 minutos en SSPE 1x, SDS 0,1% (lavado de rigurosidad moderada).

En general, la sal y/o temperatura se pueden alterar para cambiar la rigurosidad. Con un fragmento de ADN marcado > 70 o más bases de longitud, las siguientes condiciones se pueden utilizar:

Baja:: 1 o 2x SSPE, temperatura ambiente

Baja:: 1 o 2x SSPE, 42ºC

Moderado:: 0,2x o 1x SSPE, 65ºC

Alto:: 0,1x SSPE, 65ºC.

La formación y estabilidad del dúplex depende de la complementariedad sustancial entre las dos cadenas de un híbrido, y, como se señaló anteriormente, se puede tolerar un cierto grado de falta de coincidencia. Por lo tanto, las 5

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secuencias de la sonda de la presente invención incluyen mutaciones (tanto simples como múltiples), supresiones, inserciones de las secuencias descritas, y combinaciones de los mismos, donde dichas mutaciones, inserciones y supresiones permiten la formación de híbridos estables con el polinucleótido blanco de interés. Las mutaciones, inserciones, y supresiones pueden producirse en una secuencia de polinucleótidos dada de muchas maneras, y estos métodos son conocidos por los expertos en la materia. Otros métodos se pueden dar a conocer en el futuro.

Tecnología PCR. La reacción en cadena de polimerasa (PCR) es una síntesis activada, ezimática repetitiva de una secuencia de ácidos nucleicos. Este método es bien conocido y comúnmente utilizado por los expertos en esta técnica (véase, Mullis, patente U.S. Nros 4.683.195, 4.683.202, y 4.800.159; Saiki et al., 1985). PCR se basa en la amplificación enzimática de un fragmento de ADN de interés que está flanqueado por dos cebadores de oligonucleótidos que hibridan con cadenas opuestas de la secuencia blanco. Los cebadores se orientan preferiblemente con los extremos 3 'apuntando uno hacia el otro. Los ciclos repetidos de desnaturalización por calor del molde, apareamiento de los cebadores a sus secuencias complementarias, y extensión de los cebadores hibridados con una ADN polimerasa produce la amplificación del segmento definido por los extremos 5 'de los cebadores de PCR. El producto de extensión de cada cebador puede servir como un molde para el otro cebador, por lo que cada ciclo duplica esencialmente la cantidad de fragmento de ADN producida en el ciclo anterior. Esto produce la acumulación exponencial del fragmento blanco específico, hasta varios millones de veces en unas pocas horas. Mediante el uso de una ADN polimerasa termoestable tal como polimerasa Taq, aislada de la bacteria termófila Thermus aquaticus, el proceso de amplificación puede ser completamente automatizado. Otras enzimas que pueden utilizarse son conocidas por los expertos en la técnica.

Las secuencias de ADN ejemplificado, o segmentos de los mismos, se pueden utilizar como cebadores para la amplificación PCR. En la realización de la amplificación por PCR, se puede tolerar un cierto grado de falta de coincidencia entre el cebador y el molde. Por lo tanto, son posibles mutaciones, supresiones e inserciones (especialmente adiciones de nucleótidos al extremo 5') de los cebadores ejemplificados. Las mutaciones, inserciones, y supresiones se pueden producir en un cebador dado mediante métodos conocidos por un experto en la técnica.

Modificación de genes y proteínas. Los presentes genes y proteínas se pueden fusionar a otros genes y proteínas para producir proteínas quiméricas o de fusión. Los genes y proteínas útiles de acuerdo con la presente invención incluyen no sólo las secuencias de longitud completa ejemplificadas específicamente, pero también porciones, segmentos y/o fragmentos (que incluyen fragmentos contiguos y supresiones internas y/o terminales en comparación con las moléculas de longitud completa) de estas secuencias, variantes, mutantes, quiméricos y fusiones de los mismos. Las proteínas de la presente invención pueden tener aminoácidos sustituidos siempre que retengan la actividad funcional. Las “variantes” de los genes tienen secuencias de nucleótidos que codifican las mismas proteínas o proteínas equivalentes que tienen actividad equivalente o similar a una proteína ejemplificada.

Los dos mejores resultados de las búsquedas BLAST con la secuencia de nucleótidos aad-12 nativa muestran un nivel razonable de homología (aproximadamente 85%) de más de 120 pares de bases de secuencia. Se puede esperar que la hibridación en ciertas condiciones incluya estas dos secuencias. Ver GENBANK Acc. Nos DQ406818.1 (89.329.742; Rhodoferax). AJ6288601.1 y (44903451; Sphingomonas). Rhodoferax es muy similar a Delftia pero Sphingomonas es una clase filogenética totalmente diferente.

Los términos "variantes de proteínas" y "proteínas equivalentes" se refieren a proteínas que tienen la misma o esencialmente la misma actividad biológica/funcional contra los sustratos blanco y secuencias equivalentes a las proteínas ejemplificadas. Tal como se usa en la presente, la referencia a una secuencia de "equivalente" se refiere a secuencias que tienen sustituciones, supresiones, adiciones o inserciones de de aminoácidos que mejoran o que no afectan adversamente la actividad en un grado significativo. Los fragmentos que retienen actividad también están incluidos en esta definición. Los fragmentos y otros equivalentes que retienen la misma o similar función o actividad como un fragmento correspondiente de una proteína ejemplificada están dentro del alcance de la presente invención. Los cambios, tales como sustituciones o adiciones de aminoácidos, se pueden realizar para una variedad de propósitos, tales como el aumento (o disminución) de la estabilidad de la proteasa de la proteína (sin disminuir material/sustancialmente la actividad funcional de la proteína), eliminación o adición de un sitio de restricción, y similares. Las variaciones de los genes se pueden construirse fácilmente por ejemplo usando técnicas estándares para realizar mutaciones puntuales.

Además, la Patente U.S Nº 5.605.793, por ejemplo, describe métodos para generar diversidad molecular adicional usando el reensamblaje de ADN después de la fragmentación aleatoria o centrada. Esto se puede denominar como "transposición" del gen que típicamente involucra mezclar fragmentos (de un tamaño deseado) de dos o más diferentes moléculas de ADN, seguido de rondas repetidas de renaturalización. Esto puede mejorar la actividad de una proteína codificada por un gen de partida. El resultado es una proteína quimérica que tiene una mejor actividad, especificidad de sustrato alterada, aumento de la estabilidad de la enzima, estereoespecificidad alterado, u otras características.

La “transposición" se puede diseñar y dirigir después de obtener y examinar las coordenadas 3D atómicas (tridimensional) y la estructura cristalina de una proteína de interés. Por lo tanto, la “transposición centrada” se puede dirigir a determinados segmentos de una proteína que son ideales para la modificación, tal como los segmentos

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expuestos en la superficie, y preferiblemente no los segmentos internos que están involucrados con el plegamiento de proteínas y la integridad estructural 3D esencial.

Los cambios específicos en el "sitio activo" de la enzima se pueden hacer para afectar a la funcionalidad de inherente con respecto a la actividad o la estereoespecificidad (véase el alineamiento de la Figura 2). Muller et. al. (2006). La estructura cristalina tauD conocida fue usada como dioxigenasa modelo para determinar los residuos del sitio activo, mientras que está unido a su taurina del sustrato inherente. Elkins y otros. (2002) "X-ray crystal structure of Escerichia coli taurine/alphα-cetoglutarato dioxigenase complexed to ferrous iron and substrates," Biochemistry 41(16):5185-5192. En cuanto a la optimización de la secuencia y facilidad de diseño de los sitios activos de enzimas, véase Chakrabarti et al, PNAS, (23 de agosto 2005), 102 (34):. 12.035-12.040.

Las variantes de genes se pueden usar para producir variantes de proteínas; huéspedes recombinantes para producir las variantes de proteínas. Mediante el uso de estas técnicas de "transposición de genes", se pueden construir genes y proteínas equivalentes que comprenden los 5, 10, o 20 residuos contiguos (de aminoácidos o nucleótidos) de cualquier secuencia ejemplifica en la presente. Como los expertos en la técnica conocen, las técnicas de transposición de genes, por ejemplo, se pueden ajustar para obtener equivalentes que tienen, por ejemplo 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 101, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 110, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 117, 118, 119, 120, 121, 122, 123, 124, 125, 126, 127, 128, 129, 130, 131, 132, 133, 134, 135, 136, 137, 138, 139, 140, 141, 142, 143, 144, 145, 146, 147, 148, 149, 150, 151, 152, 153, 154, 155, 156, 157, 158, 159, 160, 161, 162, 163, 164, 165, 166, 167, 168, 169, 170, 171, 172, 173, 174, 175, 176, 177, 178, 179, 180, 181, 182, 183, 184, 185, 186, 187, 188, 189, 190, 191, 192, 193, 194, 195, 196, 197, 198, 199, 200, 201, 202, 203, 204, 205, 206, 207, 208, 209, 210, 211, 212, 213, 214, 215, 216, 217, 218, 219, 220, 221, 222, 223, 224, 225, 226, 227, 228, 229, 230, 231, 232, 233, 234, 235, 236, 237, 238, 239, 240, 241, 242, 243, 244, 245, 246, 247, 248, 249, 250, 251, 252, 253, 254, 255, 256, 257, 258, 259, 260, 261, 262, 263, 264, 265, 266, 267, 268, 269, 270, 271, 272, 273, 274, 275, 276, 277, 278, 279, 280,281, 282, 283, 284, 285, 286, 287, 288, 289, 290, 291, 292, o 293 residuos contiguos ((aminoácido o nucleótido), correspondiente a un segmento (del mismo tamaño) en cualquiera de las secuencias ejemplificadas o sugeridas (o los complementos (Complementos completos) de los mismos). Los segmentos de tamaño similar, especialmente los de regiones las conservadas, también se pueden utilizar como sondas y/o cebadores.

Los fragmentos de genes de longitud completa se pueden obtener usando exonucleasas o endonucleasas comercialmente disponibles de acuerdo con los métodos estándares. Por ejemplo, las enzimas tales como Bal31 o mutagénesis dirigida al sitio se pueden utilizar para cortar sistemáticamente nucleótidos de los extremos de estos genes. También, los genes que codifican fragmentos activos se pueden obtener usando una variedad de enzimas de restricción. Las proteasas se pueden usar para obtener directamente fragmentos activos de estas proteínas.

Está dentro del alcance de la invención como se describe en la presente que las proteínas se pueden truncar y todavía retienen la actividad funcional. Por "proteína truncada" se entiende que una porción de una proteína se puede escindir, mientras que la proteína truncada restante conserva y exhibe la actividad deseada después de la escisión. La escisión se puede lograr mediante diversas proteasas. Además, las proteínas escindidas efectivamente se pueden producir usando técnicas de biología moleculares en la que las bases de ADN que codifican dicha proteína se eliminan a través de la digestión con endonucleasas de restricción u otras técnicas disponibles para el experto en la materia. Después del truncamiento, dichas proteínas se pueden expresar en sistemas heterólogos tales como E. coli, baculovirus, sistemas virales de origen vegetal, levadura, y similares, y posteriormente se coloca en ensayos de insectos descritos en la presente para determinar la actividad. Es bien conocido en la técnica que las proteínas truncadas se pueden producir con éxito de modo de retener la actividad funcional, mientras que tiene menos de la de la secuencia de longitud completa entera. Por ejemplo, las proteínas Bt se pueden usar de forma truncada (proteína del núcleo) (véase, por ejemplo, Höfte et al. (1989), y Adang et al. (1985)). Como se usa en la presente, el término "proteína" puede incluir truncamientos funcionalmente activos.

En algunos casos, especialmente para la expresión en plantas, puede ser ventajoso utilizar genes truncados que expresan proteínas truncadas. Los genes truncados preferidos típicamente tendrán 96, 97, 98, o 99% de la proteína de longitud completa.

Ciertas proteínas de la presente invención se han ejemplificado específicamente en la presente. Como estas proteínas son meramente ilustrativas de las proteínas de la presente invención, debe ser fácilmente evidente que la presente invención comprende variantes o equivalentes de proteínas (y secuencias de nucleótidos que codifican equivalentes de las mismas) que tienen la misma o similar actividad de las proteínas ejemplificadas. Las proteínas equivalentes tendrán semejanza de aminoácidos (y/u homología) con una proteína ejemplificada. La identidad de aminoácidos será típicamente al menos 96, 97, 98, o 99% en comparación con una secuencia ejemplificada o sugerida en la presente. Cualquier número que aparece arriba se puede utilizar para definir los límites superior e inferior.

A menos que se especifique lo contrario, como se usa en la presente, el porcentaje de identidad y/o semejanza de secuencia de dos ácidos nucleicos se determina usando el algoritmo de Karlin y Altschul, 1990, modificado como en

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vegetal infectado (por ejemplo, trozos de hoja, segmentos de tallo, raíces, pero también protoplastos o células cultivadas en suspensión) en un medio adecuado, que puede contener antibióticos o biocidas para la selección. Las plantas así obtenidas después se pueden analizar para determinar la presencia del ADN insertado. No se realizan exigencias especiales de los plásmidos en el caso de inyección y electroporación. Es posible utilizar plásmidos ordinarios, tales como, por ejemplo, derivados de pUC.

Las células transformadas crecen dentro de las plantas de la manera usual. Pueden formar células germinales y transmitir el rasgo transformado en plantas de la progenie. Tales plantas se pueden cultivar de la manera normal y cruzar con plantas que tienen los mismos factores hereditarios transformados u otros factores hereditarios. Los individuos híbridos resultantes tienen las propiedades fenotípicas correspondientes.

En algunas realizaciones preferidas de la invención, los genes que codifican la proteína bacteriana se expresan a partir de unidades transcripcionales insertadas en el genoma de la planta. Preferiblemente, dichas unidades transcripcionales son vectores recombinantes capaces de una integración estable en el genoma de la planta y permiten la selección de líneas de plantas transformadas que expresan el ARNm que codifican las proteínas.

Una vez que el ADN insertado se ha integrado en el genoma, es relativamente estable allí (y no sale de nuevo). Normalmente contiene un marcador de selección que confiere a las células de planta transformadas resistencia a un biocida o un antibiótico, tal como kanamicina, G418, bleomicina, higromicina o cloranfenicol, entre otras. Los marcadores seleccionables de planta típicamente también pueden proporcionar resistencia a varios herbicidas tales como glufosinato (por ejemplo, PAT/bar), glifosato (EPSPS), inhibidores de ALS (por ejemplo, imidazolinonas, sulfonilureas, triazolopirimidina sulfonanilida y otros), bromoxinilo, resistencia al inhibidor de HPPD, inhibidores de la PPO, los inhibidores de la ACC-asa, y muchos otros. El marcador empleado individualmente en consecuencia debe permitir la selección de células transformadas en vez de células que no contienen el ADN insertado. Los genes de interés se expresan preferiblemente mediante promotores constitutivos o inducibles en la célula de planta. Una vez expresado, el ARNm se traduce en proteínas, de este modo incorpora los aminoácidos de interés en la proteína. Los genes que codifican una proteína expresada en las células de planta pueden estar bajo el control de un promotor constitutivo, un promotor específico de tejido, o un promotor inducible.

Existen varias técnicas para introducir vectores recombinantes extraños en las células de planta y obtener plantas que mantienen de forma estable y expresan el gen introducido. Tales técnicas incluyen la introducción de material genético recubierto sobre micropartículas directamente en las células (Patentes U.S. Nros. 4,945.050 para Cornell y

5.141.13 para DowElanco, ahora Dow AgroSciences, LLC). Además, las plantas pueden transformarse utilizando la tecnología de Agrobacterium, ver las patentes U.S. Nros 5.177.010 para University of Toledo.; 5.104.310 para Texas A & M; Solicitud de Patente Europea 0131624B1; Solicitud de patente europea 120.516, 159418B1 y 176.112 de Schilperoot; patentes U.S. Nros 5.149.645, 5.469,976, 5.464.763 y 4,940.838 y 4.693,976 para Schilperoot.; Solicitudes de patente europea 116.718, 290.799, 320.500, todas para Max Planck; Solicitudes de patente europea

604.662 y 627.752, y patente U.S. N.º 5.591.616, para Japan Tobacco; Solicitudes de patente europea 0267159 y 0292435, y patente U.S. N.º 5.231.019, todas para Ciba Geigy, ahora Syngenta; patentes U.S. Nros. 5.463.174 y 4.762.785, ambas de Calgene.; y patentes U.S. Nros. 5.004.863 y 5.159.135, ambas para Agracetus. Otra tecnología de transformación incluye la tecnología de los filamentos (whiskers). Ver las patentes U.S. Nros.

5.302.523 y 5.464.765, ambas para Zeneca, ahora Syngenta. Otra tecnología de transformación por administración directa de ADN incluye la tecnología de haz de aerosol. Véase la Patente U.S N.º 6.809.232. La tecnología de electroporación también se ha utilizado para transformar plantas. Véase el documento WO 87/06614 de Boyce Thompson Institute; patentes U.S. Nros. 5.472.869 y 5.384.253, ambas de Dekalb.; y los documentos WO 92/09696 y WO 93/21335, ambos para Plant Genetic Systems. Además, los vectores virales también se pueden usar para producir plantas transgénicas que expresan la proteína de interés. Por ejemplo, las plantas monocotiledóneas se pueden transformar con un vector viral utilizando los métodos descritos en la Patente U.S. N.º 5.569.597 de Mycogen Plant Science y Ciba-Geigy (ahora Syngenta), así como las patentes U.S. Nros. 5.589.367 y 5.316,931, ambas de Biosource, ahora Large Scale Biology.

Como se mencionó previamente, la manera en que se introduce el constructo de ADN en el huésped de planta no es crítica para esta invención. Se puede emplear cualquier método que proporciona la transformación eficiente. Por ejemplo, diversos métodos para la transformación de células vegetales se describen en el presente documento e incluyen el uso de plásmidos Ti o Ri y similares para realizar la transformación mediada por Agrobacterium. En muchos casos, será deseable tener el constructo usado para la transformación limitado en uno o ambos lados por límites de ADN-T, más específicamente el límite derecho. Esto es particularmente útil cuando el constructo utiliza Agrobacterium tumefaciens o Agrobacterium rhizogenes como modo para la transformación, aunque los límites de ADN-T se pueden usar con otros modos de transformación. Cuando se utiliza Agrobacterium para la transformación de células de planta, se puede usar un vector que se puede introducir en el huésped para la recombinación homóloga con ADN-T o el plásmido Ti o Ri presente en el huésped. La introducción del vector se puede realizar a través de la electroporación, apareamiento triparental y otras técnicas para transformar bacterias gram-negativas que son conocidas para los expertos en la técnica. La manera de transformación del vector en el huésped Agrobacterium no es crítica para esta invención. El plásmido Ti o Ri que contiene el ADN-T para la recombinación puede ser capaz o incapaz de provocar la formación de agallas, y no es crítico para dicha invención siempre que los genes vir estén presentes en dicho huésped.

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estabilizar aún más esta proteína y ARNm (incluyendo el bloqueo de la degradación del ARNm), y en consecuencia las técnicas conocidas en la técnica se pueden aplicar. Las proteínas de la presente se pueden diseñar para resistir la degradación por proteasas y similares (sitios de escisión de la proteasa puede ser eliminado eficazmente por la reingeniería de la secuencia de aminoácidos de la proteína). Tales realizaciones incluyen el uso de 5' y 3' de estructuras de bucle y tallo 5' y 3' como UTR de osmotina, y per5 (secuencias 5' no traducidas ricas en AU). También se pueden utilizar capuchones 5' como los grupos 7-metilo o 2'-O-metilo, por ejemplo, residuo de ácido 7metilguanílico. Véase, por ejemplo:. Proc. Natl. Acad. Sci. EE.UU. Vol. 74, No. 7, pp. 2734-2738 (julio de 1977) Importance of 5'-terminal blocking structure to stabilize mRNA in eukaryotic protein synthesis. También se pueden usar los complejos de proteínas o grupos de bloqueo del ligando.

Diseño computacional de UTR 5' o 3' más adecuado para AAD-12 (horquillas sintéticas) también puede llevarse a cabo dentro del alcance de la presente invención. El modelado por computadora en general, así como la transposición de genes y la evolución dirigida, se discuten en otra parte de la presente. Más específicamente con respecto a la modelado por computadora y UTRs, técnicas de modelado por computadora ordenador para su uso en la predicción/evaluación dederivados de UTR 5' y 3' de la presente invención incluyen, pero sin limitación: MFold versión 3.1 disponible en Genetics Corporation Group, Madison, WI (ver Zucker y otros., Algorithms and Thermodynamics for RNA Secondary Structure Prediction: A Practical Guide. In RNA Biochemistry and Biotechnology, 11-43, J. Barciszewski & B.F.C. Clark, eds., NATO ASI Series, Kluwer Academic Publishers, Dordrecht, NL, (1999); Zucker y otros., Expanded Sequence Dependence of Thermodynamic Parameters Improves Prediction of RNA Secondary Structure. J. Mol. Biol. 288, 911-940 (1999); Zucker y otros., RNA Secondary Structure Prediction.In Current Protocols in Nucleic Acid Chemistry S. Beaucage, D.E. Bergstrom, C.D. Glick, and R.A. Jones eds., John Wiley & Sons, New York, 11.2.1-11.2.10, (2000)), COVE (RNA structure analysis using covariance models (stochastic context free grammar methods)) v.2.4.2 (Eddy & Durbin, Nuci. Acids Res. 1994, 22: 2079-2088) que está libremente distribuido como código fuente y que se puede descargar mediante el acceso al sitio web genetics.wustl.edu/eddy/software/, y FOLDALIGN, también libremente distribuido y disponible para descargar en el sitio web bioinf.au.dk. FOLDALIGN, (ver Finding the most significant common sequence and structure motifs in a set of RNA sequences. J. Gorodkin, L. J. Heyer and G. D. Stormo. Nucleic Acids Research, Vol. 25, no. 18 pp 37243732, 1997; Finding Common Sequence and Structure Motifs in a set of RNA Sequences J. Gorodkin, L. J. Heyer, and G. D. Stormo. ISMB 5;120-123, 1997).

Las realizaciones de la presente invención se pueden utilizar en conjunto con mutantes de evolución natural o inducidos químicamente (las mutantes se pueden seleccionar mediante las técnicas de análisis, después se transformaron con AAD-12 y posiblemente otros genes). Las plantas de la presente invención se pueden combinar con la resistencia a ALS y/o resistencia al glifosato evolucionado. La resistencia aminopiralida, por ejemplo, también se puede combinar o "apilar" con un gen AAD-12.

Las técnicas de mejoramiento tradicionales también se pueden combinar con la presente invención para combinar poderosamente, introgresar y mejorar las características deseadas.

Otras mejoras también incluyen el uso de antídotos apropiados para proteger aún más las plantas y/o añadir resistencia cruzada a más herbicidas. (Los antídotos normalmente actúan para aumentar el sistema inmunológico de las plantas mediante la activación/expresión de cP450. Los antídotos son agentes químicos que reducen la fitotoxicidad de los herbicidas a las plantas de cultivo por un mecanismo fisiológico o molecular, sin comprometer la eficacia de control de malas hierbas).

Los antídotos herbicidas incluyen benoxacor, cloquintocet, ciometrinilo, diclormid, diciclonon, dietolato, fenclorazol, fenclorim, flurazol, fluxofenim, furilazol, isoxadifeno, mefenpir, mefenato, anhídrido naftálico, y oxabetrinilo. Los activadores de plantas (una nueva clase de compuestos que protegen a las plantas mediante la activación de sus mecanismos de defensa) también se pueden usar. Estos incluyen acibenzolar y probenazol.

Los antídotos comercializados se pueden utilizar para la protección de cultivos de gramíneas de semilla grande, tal como maíz, sorgo y arroz de siembra húmeda, contra herbicidas de incorporados antes de la plantación o aplicados en preemergencia de las familias de tiocarbamato y cloroacetanilidas. Los antídotos también se han desarrollado para proteger los cultivos de cereales de invierno, tales como el trigo contra aplicaciones pos-emergencia de herbicidas de ariloxifenoxipropionato y sulfonilurea. El uso de antídotos para la protección de maíz y arroz contra los herbicidas de sulfonilurea, imidazolinona, ciclohexanodiona, isoxazol, y trictones también está bien establecido. Una mejora inducida por los antídotos de desintoxicación de herbicidas en las plantas con antídoto es ampliamente aceptado como el principal mecanismo involucrado en la acción del antídoto. Los antídotos inducen cofactores tales como glutatión y enzimas desintoxicantes herbicidas tales como glutatión S-transferasas, citocromo P450 monooxigenasas, y glucosil transferasas. Hatzios KK, Burgos N (2004) "Metabolism-based herbicide resistance: regulation by safeners," Weed Science: Vol. 52, No. 3 pp. 45`001434467.

El uso de un gen de citocromo P450 monooxigenasa apilado con AAD-12 es una realización preferida. Hay P450 involucradas en el metabolismo de los herbicidas; CP450 puede ser por ejemplo de origen mamífero o una planta. En las plantas superiores, la citocromo P450 monooxigenasa (P450) es conocida por llevar a cabo el metabolismo secundario. También cumple un papel importante en el metabolismo oxidativo de los xenobióticos en cooperación con NADPH citocromo P450 oxidorreductasa (reductasa). Se ha informado resistencia a algunos herbicidas como

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resultado del metabolismo por P450, así como la glutatión S-transferasa. Numerosas especies de P450 microsomal involucradas en el metabolismo de xenobióticos en los mamíferos se han caracterizado mediante clonación molecular. Se informó que algunos de estos metabolizan varios herbicidas de manera eficiente. Así, las plantas transgénicas con P450 de plantas o mamíferos pueden mostrar resistencia a varios herbicidas.

Una realización preferida de la anterior es el uso de CP450 para la resistencia al acetoclor (los productos basados en acetoclor incluyen los herbicidas Surpass®, Keystone®, Keystone LA, FulTime® y TopNotch®) y/o trifluralina (como Treflan4p). Tal resistencia en la soja y/o maíz está incluida en algunas realizaciones preferidas. Para orientación adicional con respecto a este tipo de realizaciones, véase, por ejemplo Inui et al., A selectable marker using cytochrome P450 monooxigenases for Arabidopsis transformation," Plant Biotechnology 22, 281-286 (2005) (en relación con un sistema de selección para la transformación de Arabidopsis thaliana a través de Agrobacterium tumefaciens que utiliza citocromo P450 monooxigenasas humanos que metabolizan herbicidas; plántulas tolerantes a herbicidas se transformaron y seleccionaron con los herbicidas acetoclor, amiprofos-metilo, clorprofam, clorsulfurona, norflurazona, y pendimetalina); Siminszky et al., "Expression of a soybean cytochrome P450 monooxigenasc cDNA in yeast and tobacco enhances the metabolism of phenilurea herbicides," PNAS Vol. 96, Issue 4, 1750-1755, February 16, 1999; Sheldon y otros, Weed Science: Vol. 48, No. 3, pp. 291-295, "A cytochrome P450 monooxigenase cDNA (CYP71A10) confers resistance to linuron in transgenic Nicotiana tabacum"; and "Phytoremediation of the herbicides atrazine and metolaclor by transgenic rice plants expressing human CYP1A1, CYP2B6, and CYP2C19," J Agric Food Chem. 2006 Apr 19;54(8):2985-91 (en relación con el análisis de una citocromo P450 monooxigenasa humana en el arroz, donde las plantas de arroz según los informes mostraron alta tolerancia a cloroacetomidas (acetoclor, alaclor, metoaclor, pretilaclor, y tenilclor), oxiacetamidas (mefenacet), piridazinonas (norflurazona), 2,6-dinitroanalinas (trifluralina y pendimetalina), fosfamidatos (amiprofos-metilo, tiocarbamatos (piributicarb), y ureas (clortolurona).

También existe la posibilidad de alterar o usar diferentes químicas 2,4-D para que hacer más eficientes los presentes genes de AAD-12. Tales cambios posibles incluyen la creación de mejores sustratos y mejores grupos salientes (mayor electronegatividad).

Los inhibidores del transporte de auxina (por ejemplo diflufenzopir) también se pueden utilizar para aumentar la actividad herbicida con 2,4-D.

A menos que se indique o implique específicamente, los términos "un", "una" y "el/la" significan "al menos uno", como se usa en el presente documento.

Los siguientes son ejemplos que ilustran los métodos para la práctica de la invención. Estos ejemplos no deben interpretarse como limitantes. Todos los porcentajes son en peso y todas las proporciones de mezclas de disolventes son en volumen a menos que se indique lo contrario.

Ejemplo 1 — Procedimiento para identificar genes que imparten resistencia a 2A-D en la planta

Como una manera de identificar los genes que poseen actividades de degradación de herbicidas en planta, es posible explorar las bases de datos públicas actuales, tales como NCBI (Centro Nacional de Información sobre Biotecnología). Para comenzar el proceso, es necesario tener una secuencia de gen funcional ya identificada que codifica una proteína con las características deseadas (es decir, la actividad α-cetoglutarato dioxigenasa). Esta secuencia de la proteína se utiliza entonces como la entrada para el algoritmo BLAST (Básico Local Alignment Search Tool) (Altschul et al., 1997) para comparar con las secuencias de proteínas NCBI depositadas disponible. Mediante el uso de ajustes predeterminados, esta búsqueda devuelve más de 100 secuencias de proteínas homólogas a diferentes niveles. Estas varían desde altamente idénticas (85-98%) a identidad muy baja (23-32%) en el nivel de aminoácidos. Tradicionalmente se puede esperar que solo las secuencias con alta homología retengan propiedades similares a la secuencia de entrada. En este caso, solo se eligieron las secuencias con ≤ 50% de homología. Como se ejemplifica en la presente, la clonación y expresión recombinante de homólogos con conservación de aminoácidos como mínimo de 31% (en relación con tfdA de Ralstonia eutropha) se puede utilizar para impartir los niveles comerciales de resistencia no solo para el herbicida deseado, sino también a sustratos no probado previamente con estas enzimas.

Un gen único (sdpA) se identificó a partir de la base de datos NCBI (véase el sitio web ncbi.nlm.nih.gov; acceso MF516752) como un homólogo con solo 31% de identidad de aminoácidos con tfdA. El porcentaje de identidad se determinó primero mediante la traducción de las secuencias de ADN de sdpA y tdfA depositadas en la base de datos a las proteínas, a continuación, se usa el ClustalW en el paquete de software VectorNTI para realizar el alineamiento de secuencias múltiples.

Ejemplo 2 — Optimización de la secuencia para la expresión en plantas y bacterias

2.1 — Antecedentes.

Para obtener mayores niveles de expresión de genes heterólogos en las plantas, se puede preferir la reingeniería de la secuencia que codifica la proteína de los genes de modo que se expresen de manera más eficiente en las células de plantas. El maíz es una de tales plantas donde se puede preferir el rediseño de la región codificadora de la

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proteína heteróloga antes de la transformación para aumentar el nivel de expresión del gen y el nivel de proteína codificada en la planta. Por lo tanto, una etapa adicional en el diseño de genes que codifican una proteína bacteriana es la reingeniería de un gen heterólogo para la expresión óptima.

Una razón para la reingeniería de una proteína bacteriana para la expresión en el maíz es debido al contenido de G

+ C no óptimo del gen nativo. Por ejemplo, el muy bajo contenido de G + C de muchos genes nativos bacterianos (y el consiguiente sesgo hacia el alto contenido de A + T) produce la generación de secuencias que imitan o duplican las secuencias de control de genes de plantas que se sabe que son altamente ricas en A + T. La presencia de algunas secuencias ricas en A + T dentro del ADN del gen introducidas en las plantas (por ejemplo, regiones de caja TATA que se encuentran normalmente en los promotores de genes) pueden producir la transcripción aberrante del gen. Por otro lado, la presencia de otras secuencias regulatorias que residen en el ARNm transcrito (por ejemplo, secuencias señal de poliadenilación (AAUAAA), o secuencias complementarias para los ARN nucleares pequeños implicados en el empalme de pre-ARNm) puede llevar a la inestabilidad del ARN. Por lo tanto, un objetivo en el diseño de genes que codifican una proteína bacteriana para la expresión de maíz, más preferiblemente denominado como gen optimizado de planta, es generar una secuencia de ADN que tiene un contenido de G + C mayor, y preferiblemente uno cerca de la de genes del maíz que codifican enzimas metabólicas. Otro objetivo en el diseño del gen optimizado de planta que codifica una proteína bacteriana es generar una secuencia de ADN en la que las modificaciones de la secuencia no dificulten la traducción.

La Tabla 3 ilustra qué atan alto es el contenido de G + C en el maíz. Para los datos de la Tabla 3, las regiones codificadoras de los genes se extrajeron de las entradas de GenBank (versión 7-1), y las composiciones de bases se calcularon utilizando el programa MacVectorTM (Accelerys, San Diego, California). Las secuencias de los intrones se ignoraron en los cálculos.

Tabla 3: Compilación de los contenidos de G + C de regiones codificadoras de proteína de los genes de maíz

Clase de proteínaa: Intervalo % G + C % G + Cb promedio

Enzimas metabólicas (76): 44,4-75,3 59,0 (.+-.8,0)

Proteínas estructurales (18): 48,6-70,5 63,6 (.+-.6,7)

Proteínas regulatorias (5): 57,2-68,8 62,0 (.+-.4,9)

Proteínas no caracterizadas (9): 41,5-70,3 64,3 (.+-.7,2)

Proteínas totales (108): 44,4-75,3 60,8 (.+-.5,2)c

a Número de genes de la clase dada entre paréntesis. b Desviaciones estándares dadas entre paréntesis.C Grupos combinados promedio ignorados en el cálculo de la media

Debido a la plasticidad provista por la redundancia/degeneración del--código genético (es decir, algunos aminoácidos se especifican en más de un codón), la evolución de los genomas en diferentes organismos o clases de organismos ha dado como resultado el uso diferencial de los codones redundantes. Este "sesgo de codón" se refleja en la composición de bases media de las regiones codificadoras de proteínas. Por ejemplo, los organismos con contenidos relativamente bajos de G + C utilizan codones que tienen A o T en la tercera posición de los codones redundantes, mientras que los que tienen mayores contenidos de G + C utilizan codones que tienen G o C en la tercera posición. Se cree que la presencia de codones "menores" dentro de un ARNm puede reducir la velocidad de traducción absoluta de ese ARNm, especialmente cuando la abundancia relativa del ARNt cargado que corresponde al codón menor es baja. Una extensión de esto es que la disminución de la velocidad de traducción por los codones menores individuales puede ser al menos aditiva para múltiples codones menores. Por lo tanto, los ARNm que tienen altos contenidos relativos de codones menores pueden tener velocidades de traducción correspondientemente bajas. Esta tasa se puede reflejar en los bajos niveles subsiguientes de la proteína codificada.

En la ingeniería de genes que codifican una proteína bacteriana para la expresión en maíz (u otra planta, tales como algodón o soja), se ha determinado el sesgo de codones de la planta. El sesgo de codones para el maíz es la distribución estadística de codones que usa la planta para codificar sus proteínas y el uso de codones preferido se muestra en la Tabla 4. Después de determinar el sesgo, se determina el porcentaje de frecuencia de los codones en el gen de interés. Se debe determinar los codones primarios preferidos por la planta, así como la segunda, tercera y cuarta opciones de codones preferidos cuando existen múltiples opciones. Se puede diseñar una nueva secuencia de ADN que codifica la secuencia de aminoácidos de la proteína bacteriana, pero la nueva secuencia de ADN difiere de la secuencia de ADN bacteriano nativo (que codifica la proteína) por la sustitución de los codones de la planta (primero preferido, segundo preferido, tercero preferido o cuarto preferido) para especificar el aminoácido en cada posición dentro de la secuencia de aminoácidos de la proteína. A continuación se analiza la nueva secuencia por los sitios de enzimas de restricción que podrían haberse creado por la modificación. Los sitios identificados se modifican adicionalmente reemplazando los codones con codones de primera, segunda, tercera, o cuarta elección preferida. Otros sitios de la secuencia que podrían afectar a la transcripción o traducción del gen de interés son las uniones

exón:ntrón (5 'o 3'), señales de adición de poliA, o señales de terminación de ARN polimerasa. La secuencia se analiza adicionalmente y se modifica para reducir la frecuencia de dobletes TA o GC. Además de los dobletes, los bloques de secuencias G o C que tienen más de aproximadamente cuatro residuos que son iguales pueden afectar a la transcripción de la secuencia. Por lo tanto, estos bloques también se modifican mediante la sustitución de los codones de primera o segunda elección, etc., con el siguiente codón de elección preferido.

Tabla 4. Codones de aminoácidos preferidos para las proteínas expresadas en maíz

Aminoácido: Codón*

Alanina: GCC/GCG

Cisteína: TGC/TGT

Ácido aspártico: GAC/GAT

Ácido glutámico: GAG/GAA

Fenialanina: TTC/TTT

Glicina: GGC/GGG

Histidina: CAC/CAT

Isoleucina: ATC/ATT

Lisina: AAG/AAA

Leucina: CTG/CTC

Metionina: ATG

Asparagina: AAC/AAT

Prolina: CCG/CCA

Glutamina: CAG/CAA

Arginina: AGG/CGC

Serina: AGC/TCC

Treonina: ACC/ACG

Valina: GTG/GTC

Triptpfano: TGG

Tirosina: TAC/TAT

Detención: TGA/TAG

Se prefiere que el gen optimizado de planta que codifica una proteína bacteriana contenga aproximadamente 63%

de codones de primera elección, entre aproximadamente 22% a aproximadamente 37% segunda codones de 10 elección, y entre aproximadamente 15% a aproximadamente 0% codones de tercera o cuarta elección, en el que el

porcentaje total es 100%. El más preferido es el gen optimizado de planta que contiene aproximadamente 63% de

codones de primera elección, al menos aproximadamente 22% codones de segunda elección, aproximadamente

7,5% codones de tercera elección, y aproximadamente 7,5% codones de cuarta elección, en el que el porcentaje

total es 100%. El método descrito anteriormente permite a un experto en la técnica modificar los genes que son 15 extraños para una planta en particular de manera que los genes se expresan de manera óptima en las plantas. El

método se ilustra adicionalmente en la solicitud PCT WO 97/13402.

Por lo tanto, con el fin de diseñar genes optimizados en la plantas que codifican una proteína bacteriana, se diseña

una secuencia de ADN para codificar la secuencia de aminoácidos de dicha proteína utilizando un código genético

redundante establecido de una tabla de sesgo de codón compilada a partir de las secuencias génicas para la planta 20 o plantas particulares. La secuencia de ADN resultante tiene un mayor grado de diversidad de codones, una

composición de base deseable, puede contener sitios de reconocimiento de enzimas de restricción estratégicamente

colocados y carece de secuencias puedan interferir en la transcripción del gen, o la traducción del ARNm producto.

En consecuencia, los genes sintéticos que son funcionalmente equivalentes a las proteínas/genes de la presente invención se pueden utilizar para transformar huéspedes, que incluyen las plantas. La orientación adicional en cuanto a la producción de genes sintéticos se puede encontrar en, por ejemplo, la Patente U.S N.º 5.380.831.

2.2 — Análisis de la reconstrucción de AAD-12 de planta.

5 El análisis extenso de los pares de bases 876 (pb) de la secuencia de ADN de la región codificadora de AAD-12 nativa (SEQ ID NO: 1) reveló la presencia de varios motivos de secuencia que se consideraron perjudiciales para expresión en plantas óptima, así como una composición de codón no óptima. La proteína codificada por SEQ ID NO: 1 (AAD-12) se presenta como SEQ ID NO: 2. Para mejorar la producción de la proteína recombinante en monocotiledóneas así como dicotiledóneas, se desarrolló una secuencia de ADN de AAD-12 “optimizada en planta"

10 (v1) (SEQ-ID NO: 3) fue desarrollado que codifica una proteína (SEQ ID NO: 4), que es la misma que la SEQ ID NO: 2 nativa excepto por la adición de un residuo de alanina en la segunda posición (subrayada en la SEQ ID NO: 4). El codón de alanina adicional (GCT; subrayado en la SEQ ID NO: 3) codifica parte de un sitio de reconocimiento de la enzima de restricción Ncol (CCATGG) que abarca el codón de inicio de la traducción ATG. Por lo tanto, sirve al doble propósito de facilitar las operaciones de clonación posteriores al tiempo que mejora el contexto de la

15 secuencia que rodea el codón de inicio ATG para optimizar iniciación de la traducción. Las proteínas codificadas por las regiones codificadoras nativas y optimizadas en planta (v1) son 99,3% idénticas, solo difieren en el número de aminoácidos 2. En contraste, las secuencias de ADN nativas y optimizadas en planta (v1) de las regiones codificadoras son sólo 79,7% idénticas. La Tabla 5 muestra las diferencias en las composiciones de codones de las secuencias nativas (Columnas y D) y las secuencias optimizadas en planta (Columnas B y E), y permite la

20 comparación de una secuencia optimizada en plantas teórica (columnas C y F).

Tabla 5. Comparación de las composiciones de codones de regiones codificadoras de AAD-12 nativa, versión optimizada en planta (v1) y versión optimizada en planta teórica.

A: B C D E F

Aminoácido: Codón Nativo # Opt planta v1# Opt planta teórica. # Aminoácido Codón Nativo # Opt planta v1# Opt planta teórica. #

ALA (A): GCA 1 10 11 LEU (L) CTA 0 0 0

GCC: 35 16 15 CTC 1 8 8

GCG: 7 0 0 CTG 23 0 0

GCT: 0 18 17 CTT 0 8 8

ARG (R): AGA 0 4 5 TTA 0 0 0

AGG: 0 4 6 TTG 0 8 8

CGA: 0 0 0 LYS (K) AAA 1 1 2

CGC: 15 6 4 AAG 5 _ 5 4

CGG: 3 0 0 MET (M) ATG 10 10 10

CGT: 0 4 3 PHE (F) TTC 7 5 5

ASN (N): AAC 3 2 2 TTT 1 3 3

AAT: 1 2 2 PRO (P) CCA 0 5 6

ASP (D): GAC 15 9 9 CCC 9 4 4

GAT: 2 8 8 CCG 5 0 0

CYS (C): TGC 3 2 2 CCT 0 5 5

TGT: 0 1 1 SER (S) AGC 5 4 3

END: TAA 1 0 1 AGT 0 0 0

TAG: 0 0 TCA 0 3 3

TGA: 0 1 TCC 2 3 3

GLN (Q): CAA 1 8 7 TCG 6 0 0

CAG: 13 6 7 TCT 0 3 3

GLU (E): GAA 3 4 4 THR (T) ACA 1 4 5

GAG: 8 7 7 ACC 11 7 7

GLY (G): GGA 0 8 ACG 5 0 0

imagen17

Tabla 6. Comparaciones de la composición de codón de las regiones codificadoras de AAD-12 nativa, versión optimizada en E. coli (v2) y una versión optimizada de clase II en E. coli teórica.

A: B C I D E F

Aminoácido: Codón Nativo # Opt en E. coli v2 # Clase II teórica II # Aminoácido Codón Nativo # Opt en E. coli v2 # Clase II teórica #

ALA (A): GCA 1 13 13 LEU (L) CTA 0 0 0

GCC: 35 0 0 CTC 1 2 0

GCG: 7 18 17 CTG 23 20 24

GCT: 0 13 14 CTT 0 1 0

ARG (R): AGA 0 0 0 TTA 0 1 0

AGG: 0 0 0 TTG 0 0 0

CGA: 0 0 0 LYS (K) AAA 1 4 5

CGC: 15 6 6 AAG 5 2 1

CGG: 3 0 0 MET (M) ATG 10 10 10

CGT: 0 12 12 PHE (F) TTC 7 6 6

ASN (N): AAC 3 4 4 TTT 1 2 2

AAT: 1 0 0 PRO (P) CCA 0 3 2

ASP (D): GAC 15 10 9 CCC 9 0 0

GAT: 2 7 8 CCG 5 11 12

CYS (C): TGC 3 2 2 CCT 0 0 0

TGT: 0 1 1 SER (S) AGC 5 4 4

END: TAA 1 1 1 AGT 0 0 0

TAG: 0 0 0 TCA 0 0 0

TGA: 0 0 0 TCC 2 5 4

GLN (Q): CAA 1 3 3 TCG 6 0 0

CAG: 13 11 11 TCT 0 4 5

GLU (E): GAA 3 8 8 THR (T) ACA 1 0 0

GAG: 8 3 3 ACC 11 12 12

GLY (G): GGA 0 0 0 ACG 5 0 0

GGC: 24 12 11 ACT 1 6 6

GGG: 1 0 0 TRP (W) TGG 8 8 8

GGT: 0 13 14 TYR (Y) TAC 4 3 3

HIS (H): CAC 8 11 11 TAT 1 2 2

CAT: 8 5 5 VAL (V) GTA 0 6 6

ILE (I): ATA 0 0 0 GTC 6 0 0

ATC: 10 7 7 GTG 18 8 7

ATT: 1 4 4 GTT 0 10 11

Totales: 163 164 164 Totales 130 130 130

Es evidente a partir del examen de la Tabla 6 que las regiones codificadoras nativas y optimizadas en E. coli, si bien codifican proteínas casi idénticas, son sustancialmente diferentes entre sí. La versión optimizada en E. coli (v2) imita 5 estrechamente la composición de codón de una región codificadora optimizada en E. coli teórica que codifica la proteína AAD-12.

2,4 — Diseño de una secuencia de ADN con sesgo de codón de soja que codifica una EPSPS de soja que tiene mutaciones que confieren tolerancia de glifosato. Este ejemplo enseña el diseño de una nueva secuencia de ADN que codifica una 5-enolpiruvoilshiquimato 3-fosfato sintasa de soja mutada (EPSPS), pero está optimizada para la 10 expresión en células de soja. La secuencia de aminoácidos de una EPSPS de soja triplemente mutada se describe

como la SEQ ID NO: 5 del documento WO 2004/009761. Los aminoácidos mutados en la secuencia así descripta son en el residuo 183 (treonina de la proteína nativa reemplazada por isoleucina), residuo 186 (arginina de la proteína nativa reemplazada por lisina), y residuo 187 (prolina de la proteína nativa reemplazada por serina). Por lo tanto, se puede deducir la secuencia de aminoácidos de la proteína de EPSPS de soja nativa mediante el reemplazo 5 de los aminoácidos sustituidos de la SEQ ID NO: 5 del documento WO 2004/009761 con los aminoácidos nativos en las posiciones apropiadas. Tal secuencia de la proteína nativa se describe como SEQ ID NO: 20 del documento PCT/US2005/014737 (presentado el 2 de mayo de 2005). Una proteína de EPSPS de soja con mutación doble, que contiene una mutación en el residuo 183 (treonina de la proteína nativa reemplazada con isoleucina), y en el residuo 187 (prolina en la proteína nativa reemplazada con serina) se describe como SEQ ID NO: 21 del documento

10 PCT/US2005/014,737.

Una tabla de uso de codones para las secuencias codificadoras de proteínas de la soja (Glycine max), calculado a partir de 362,096 codones (aproximadamente 870 secuencias codificadoras), se obtuvo de la "kazusa.or.jp/codon" sitio World Wide Web. –Estos datos se reformatearon como se muestra en la Tabla 7. Las columnas D y H de la Tabla 7 presentan las distribuciones (en % del uso de todos los codones para ese aminoácido) de codones 15 sinónimos para cada aminoácido, como se encuentra en las regiones codificadoras de proteína de los genes de soja. Es evidente que algunos codones sinónimos para algunos aminoácidos (un aminoácido puede estar especificado por 1, 2, 3, 4, o 6 codones) están presentes relativamente rara vez en las regiones codificadoras de la proteína de soja (por ejemplo, comparar el uso de los codones GCG y GCT para especificar alanina). Una tabla de uso de codones sesgada de soja se calculó a partir de los datos en la Tabla 7. Los codones hallados en los genes

20 de soja con menos de aproximadamente 10% de apariciones totales se ignoraron. Para equilibrar la distribución de las opciones de codones restantes para un aminoácido, se calculó una representación promedio ponderada para cada codón, usando la fórmula:

% ponderado de C1 = 1(% C1 + %C2 +% C3 + etc.) x% Cl x 100

donde C1 es el codón en cuestión, C2, C3, etc. representan los restantes codones sinónimos, y los valores en %

25 para los codones relevantes se toman de las columnas D y H de la Tabla 7 (ignorando los valores de codones raros en negrita). El valor de % ponderado para cada codón se indica en las columnas C y G de la Tabla 7. TGA se eligió arbitrariamente como el terminador de la traducción. Las frecuencias de uso de codones parciales se ingresaron en una tabla de código genético especializado para usar en el programa de diseño génico de OptGeneTM (Ocimum Biosolutions LLC, Indianapolis, Indiana).

Tabla 7. Representación de codones sinónimos en secuencias codificadoras de proteína de soja, y cálculo de un conjunto de representación de codones sesgado para diseño de genes sintéticos optimizados en soja

A: B C D E F G H

Aminoácido: Codón % ponderado % en soja Aminoácido Codón % ponderado % en soja

ALA (A): GCA 33,1 30,3 LEU (L) CTA DNU 9,1

GCC: 24,5 22,5 CTC 22,4 18,1

GCG: DNU* 8,5 CTG 16,3 13,2

GCT: 42,3 38,7 CTT 31,5 25,5

ARG (R): AGA 36,0 30,9 TTA DNU 9,8

AGG: 32,3 27,6 TTG 29,9 24,2

CGA: DNU 8,2 LYS (K) AAA 42,5 42,5

CGC: 14,8 12,7 AAG 57,5 57,5

CGG: DNU 6,0 MET (M) ATG 100,0 100

CGT: 16,9 14,5 PHE (F) TTC 49,2 49,2

ASN (N): AAC 50,0 50,0 TTT 50,8 50,8

AAT: 50,0 50,0 PRO (P) CCA 39,8 36,5

ASP (D): GAC 38,1 38,1 CCC 20,9 19,2

GAT: 61,9 61,9 CCG DNU 8,3

CYS (C): TGC 50,0 50,0 CCT 39,3 36,0

TGT: 50,0 50,0 SER (S) AGC 16,0 15,1

END: TAA DNU 40,7 AGT 18,2 17,1

TAG: DNU 22,7 TCA 21,9 20,6

TGA: 100,0 36,6 TCC 18,0 16,9

5

10

15

20

25

30

A: B C D E F G H

GLN (Q): CAA 55,5 55,5 TCG DNU 6,1

CAG: 44,5 44,5 TCT 25,8 24,2

GLU (E): GAA 50,5 50,5 THR (T) ACA 32,4 29,7

GAG: 49,5 49,5 ACC 30,2 27,7

GLY (G): GGA 31,9 31,9 ACG DNU 8,3

GGC: 19,3 19,3 ACT 37,4 34,3

GGG: 18,4 18,4 TRP (W) TGG 100,0 100.

GGT: 30,4 30,4 TYR (Y) TAC 48,2 48,2

HIS (H): CAC 44,8 44,8 TAT 51,8 51,8

CAT: 55,2 55,2 VAL (V) GTA 11,5 11,5

ILE (I): ATA 23,4 23,4 GTC 17,8 17,8

ATC: 29,9 29,9 GTG 32,0 32,0

ATT: 46,7 46,7 GTT 38,7 38,7

*DNU = No usar

Para derivar una secuencia de ADN de optimizado en soja que codifica la proteína EPSPS doblemente mutado, la secuencia de proteína de la SEQ ID NO: 21 de PCT/US2005/014737 se tradujo en forma inversa mediante el programa OptGeneTM utilizando el código genético sesgado de soja anteriormente. La secuencia de ADN inicial así derivada luego se modificó mediante la compensación de los cambios de codones (mientras que se retiene la representación media ponderada global de los codones) para reducir el número de dobletes CG y TA entre los codones adyacentes, aumentar el número de dobletes de CT y TG entre los codones adyacentes, eliminar las estructuras secundarias intracatenarias muy estables, suprimir o añadir los sitios de reconocimiento de enzimas de restricción, y eliminar otras secuencias que podrían ser perjudiciales para las manipulaciones de expresión o clonación del gen manipulado genéticamente. Se realizaron nuevos refinamientos de la secuencia para eliminar los potenciales sitios de empalme de los intrones de planta, corridas largas de residuos de A/T o C/G, y otros motivos que podrían interferir en la estabilidad del ARN, transcripción o traducción de la región codificadora en las células de planta. Se realizaron otros cambios para eliminar los marcos de lectura abierta internos largos (marcos distintos de +1). Estos cambios se realizaron dentro de las restricciones para retener la composición codón sesgada de soja como se describió anteriormente y mientras que preserva la secuencia de aminoácidos descrita como SEQ ID NO: 21 del documento PCT/US2005/014737.

La secuencia de ADN sesgada de soja que codifica la proteína EPSPS de la SEQ ID NO: 21 se describe como bases 1 a 1575 de la SEQ ID NO: 22 del documento PCT/US2005/014737. La síntesis de un fragmento de ADN que comprende la SEQ ID NO: 22 del documento PCT/US2005/014737 fue realizada por un proveedor comercial (PicoScript, Houston TX).

Ejemplo 3-Clonación y expresión de los vectores de transformación

3,1 Construcción del vector de expresión pET de E, coli

Usando las enzimas de restricción correspondientes a los sitios añadidos con los ligadores de clonación adicionales (Xba 1, Xho 1) AAD-12 (v2) se cortó del vector picoscript, y se ligó en un vector resistente a estreptomicina/espectinomicina pET280. Los productos ligados luego se transformaron en TOP1OF' E. coli, y se sembraron en caldo Luria a + 50 μg/ml de placas de agar con estreptomicina y espectinomicina (LB S/S).

Para diferenciar entre los ligamientos de AAD-12 (v2): pET280 y pCR2,1: pET280, se seleccionaron aproximadamente 20 colonias aisladas en 6 ml de LB-S/S, y se cultivaron a 37 °C durante 4 horas con agitación. A continuación, cada cultivo se sembró en placas de LB + kanamicina μg/ml, que se incubaron a 37 °C durante la noche. Se asumió que las colonias que crecieron en el LB-K tienen el vector pCR2.1 ligado y se descartaron. Se aislaron plásmidos a partir de los cultivos restantes como antes, y se verificó la corrección con la digestión por XbaI/XhoI. Al constructo de expresión final se le dio la denominación de pDAB3222.

3,2-Construcción del vector de expresión de Pseudomonas

El marco de lectura abierto AAD-12 (v2) se clonó inicialmente en el vector de expresión pET modificado (Novagen),

imagen18

Tabla 8. Constructos binarios usados en la transformación de varias especies de planta. .

pDAB #: pDAS # Especies* transformadas en Gen de interés (GOI) Promotor Rasgo 1 Rasgo 2 GOI2 Promotor i Gen de selección bacteriana Gen de selección bacteriana 2 Gen de selección de planta Promotor Procedimiento Trxn

724: - A, Ct, S i AAD12 v1 AtUbi10 NtOsm - - - Eritromicina pat CsVMV Agro binary

3274: - A AAD12 v1 AtUbi10 NtOsm RB7v2Mar - - Espectinomicina - - - Agro binary

3278: 1580 T AAD12 v1 CsVMV NtOsm RB7 Mar v2 Espectinomicina - pat AtUbi10 Agro binary

3285: - A AAD12 v1 CsVMV NtOsm RB7v2Mar - - Espectinomicina - pat AtUbi10 Agro binary

3759: - A, Ca, S AAD12 v1 CsVMV NtOsm RB7v2 Mar EPSPS AtUbi10 Espectinomicina - pat Agro binary AtUbi10 ry

4101: 1863 Cn, R AAD12 v1 ZmUbi1 - RB7 Mar v2 - - i Ampicilina - AHAS v3 OsAct1 Whiskers / Gun

4464: - S AAD12 v1 CsVMV - RB7 Mar v2 - 1 - Espectinomicina - pat CsVMV Agro binary

4468: - S AAD12 v1 AtUbi10 - RB7v2M ar - - Espectinomicina - pat CsVMV Agro binary

4472: - S AAD12 v1 AtUbi3 - RB7 Mar v2 - - Espectinomicina - pat CsVMV Agro binary

4476: - S AAD12 v1 ZmUbi1 - RB7v2Mar - - Espectinomicina - pat CsVMV Agro binary

4480: - S AAD12 v1 AtAct2 - RB7v2Mar - - Espectinomicina - pat CsVMV Agro binary

*A = Arabidopsis T = Tabaco S = Soj Ct = algodón R = arroz Cn = maíz Ca = Canola CsVMV = Promotor del virus de mosaico de la nervadura de yuca ZmUbi1 = = Promotor de ubiquitina 1 de Zea mays AtUbl10 = Promotor de ubiquitina 10 de Arabidopsis thaliana Hptll = higromicina fosfotransferasa Atubl3 = Promotor de ubiquitina 3 de Arabidopsis thaliana AtAct2 = Promotor de acitina 2 de Arabidopsis thaliana RB7 Mar v2 = región asociada matriz de Nicotiana tabacum (MAR) Nt Osm = región no traducida 5’ de osmotina de Nicotiana tabacum y región no traducida 3’ de de osmotina de Nicotiana tabacum

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5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

concentración de proteína más exacta se determinó mediante el uso de la hidrólisis total de aminoácidos. La muestra se analizó en el sistema de HPLC Agilent 1100 (Agilent Technologies, Santa Clara, CA) con estándares de calibración de aminoácidos (cat # PN5061-3330) adquiridos en Agilent.

La actividad de AAD-12 se determinó a través de los procesos para asegurar que no hay pérdida de la actividad de la enzima por cada tratamiento y manipulación, como se describe en el siguiente Ejemplo 5. La pureza de la proteína se controló mediante el uso de SDS-PAGE y cromatografía de exclusión por tamaño analítica. La muestra de proteína purificada se verificó y confirmó por secuenciación de aminoácidos N-terminal, y se muestra que consiste en los residuos de AQTTLQITPT esperados en su extremo N-terminal. Las estabilidad de la proteína a corto y largo plazo se analizó mediante la actividad enzimática y por análisis en gel de PAGE nativa y SDS-PAGE bajo ambas condiciones no reductoras y reductoras. Y se observó que AAD-12 es propenso a la oligomerización a través de formación de enlaces disulfuro, por lo tanto, normalmente se usó DTT 2 mM para el almacenamiento de proteínas. Se analizaron la solución salina regulada con fosfato (PBS) y solución salina de tampón Tris (TBS) para la liofilización de proteínas, con y sin la presencia de 1% de trehalosa. Además, la endotoxina y contexto de ADN contaminante de la muestra purificada se midieron respectivamente, y la integridad de la proteína AAD-12 también se evaluó por análisis de isoelectroenfoque (IEF).

Diez miligramos de AAD-12 (v2) purificado se administraron a Zymed Laboratories, Inc. (South San Francisco, CA) para la producción de anticuerpo policlonal de conejo. El conejo recibió 5 inyecciones en el periodo de 5 semanas con cada inyección que contiene 0,5 mg de la proteína purificada suspendido en 1 ml de adyuvante completo de Freund. Los sueros se analizaron en los experimentos de ELISA y transferencia Western para confirmar la especificidad y afinidad antes de la purificación de afinidad, y conjugación con peroxidasa de rábano picante (HRP) (Zymed Lab Inc).

Ejemplo 5 — Ensayos in vitro de la actividad de AAD-12

5.1 — Ensayo por medio de la detección colorimétrica de fenol.

La actividad enzimática se midió mediante la detección colorimétrica del producto fenol utilizando un protocolo modificado del de Fukumori y Hausinger (1993) (I. Biol Chem 268: 24311¬24317) para permitir la utilización en un formato de microplaca de 96 pocillos. El ensayo colorimétrico se ha descrito para uso en la medición de la actividad de las dioxigenasas que escinden 2,4-D y diclorprop para liberar el producto de 2,4-diclorofenol. El rendimiento de color de varios fenoles se comparó con la de 2,4-diclorofenol usando el método de detección descrito anteriormente para determinar qué productos de fenol pueden ser fácilmente detectados. Los fenoles y análogos de fenol se analizaron a una concentración final de 100 μM en 0,15 ml de MOPS 20 mM pH 6,75 que contiene 200 μM de NH4(FeSO4)2, 200 μM de ascorbato de sodio. Los piridinoles derivados de fluroxipir y triclopir no produjeron color significativo. El rendimiento de color de 2,4-diclorofenol era lineal y proporcional a la concentración de fenol en el ensayo hasta ~ 500 μM. Una curva de calibración se realiza bajo condiciones de ensayo estándar (160 μl volumen de ensayo final) indicó que se obtuvo una absorbancia a 510 nm de 0,1 de fenol 17,2 μM.

Los ensayos enzimáticos se realizaron en un volumen total de 0,16 ml de MOPS 20 mM, pH 6,75 que contiene 200 μM de NH4FeSO4, 200 μM de ascorbato de sodio, 1 mM de α-cetoglutarato, el sustrato apropiado (añadido de un patrón de 100 mM preparada en DMSO), y enzima. Los ensayos se iniciaron mediante la adición del sustrato ariloxialcanoato, enzima o α-cetoglutarato en el tiempo cero. Después de 5 minutos de incubación a 25 °C, la reacción se terminó por adición de 30 μl de una mezcla 1: 1: 1 de NaEDTA 50 mM; buffer pH 10 (3,09 g de ácido bórico + 3,73 g de KCl + 44 ml y KOH 1N) y 0,2% de 4-aminoantipirina. Entonces se añadió 10 μl de ferricianuro de potasio 0,8% y después de 5 o 10 min, la absorbancia de 510 nm se registró en un lector de microplaca espectrofotométrica. Los blancos contenían todos los reactivos excepto la enzima para representar la ligera contaminación ocasional de algunos de los sustratos por pequeñas cantidades de fenoles.

5.2 Ensayo por medio de la detección de cloropiridinol

La acción de AAD-12 sobre los sustratos potenciales, tales como el herbicida triclopir que contiene una piridina sustituida (más que anillos de benceno) liberará un piridinol en la escisión del enlace de ariloxialcanoato. Los piridinoles no se detectaron usando la detección de aminoantipirina/ferricianuro de fenol descripta en la sección anterior. Sin embargo, se encontró que los cloropiridinoles producto absorben fuertemente en el UV cercano con λmax

M-1

de 325 nm a pH 7 (coeficiente de extinción ~8,400 .cm-1). Esto se utilizó para crear un ensayo espectrofotométrico basado en una microplaca continuo Los ensayos se realizaron en un volumen total de 0,2 ml de MOPS 20 mM pH 6,75 que contiene 200 μM de NH4FeSO4, 200 μM de ascorbato de sodio, 1 mM de α-cetoglutarato, el sustrato-apropiado (añadido de un patrón de 100 mM preparado en DMSO), y enzima. Los ensayos se iniciaron mediante la adición del sustrato ariloxialcanoato, enzima o α-cetoglutarato en tiempo cero y se siguió el aumento en la absorbancia durante 10 minutos a 325 nm en un lector de microplacas. Los primeros 2 minutos de la reacción se utilizaron para determinar las tasas iniciales. Una curva de calibración realizada en las condiciones de ensayo estándar (200 μl de volumen de ensayo final) indicó que la absorbancia a 510 nm de 0,1 se obtuvo de 11,9 μM de cloropiridinol.

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5.3 — Ensayo colorimétrico usando 2-(2-cloro,4-nitrofenoxi)propionato

Un ensayo conveniente de AAD-12 fue diseñado usando 2-(2-cloro, 4-nitrofenoxi) propionato de etilo (CNPP) como sustrato. La escisión del CNPP por AAD-12 libera 2-cloro, 4-nitrofenol. Este fenol tiene una absorbancia de color amarillo brillante a 410 nm a pH 7 que permite que la reacción se sida de forma continua o por análisis de punto final. La presencia de actividad AAD-12 se puede controlar visualmente sin la necesidad de adición de otros reactivos. Los ensayos espectrofotométricos basados en microplaca se realizaron en un volumen total de 0,2 ml de MOPS 20 mM, pH 6,75 que contiene 200 μM de NH4FeSO4, 200 μM de ascorbato de sodio, 1 mM de αcetoglutarato, la cantidad apropiada de CNPP (añadida de un patrón de 10 mM preparado en DMSO), y la enzima. Los ensayos se iniciaron mediante la adición del CNPP, enzima o α-cetoglutarato en tiempo cero y se siguió el aumento en la absorbancia seguido durante 10 minutos a 325 nm en un lector de microplacas. Los primeros 2 minutos de la reacción se utilizaron para determinar las tasas iniciales. Una curva de calibración realizada en las condiciones de ensayo estándar (200 μl de volumen de ensayo) indicó que la absorbancia a 410 nm de 0,1 se obtuvo de 25,1 μM de 2-cloro,4-nitrofenol. Mediante este ensayo, se determinó que las constantes cinéticas para CNPP como un sustrato fueron Km = 31 ± 5,5 μM y kcat =16,2 ±0,79 min-1

Ejemplo 6 — Actividad in vitro de AAD-12 sobre varios sustratos

6.1 — Actividad de AAD-12 (v2) sobre (R,S)-diclorprop, (R)-diclorprop, (S)-diclorprop y 2,4-D

Usando el ensayo de detección de fenol descrito en el Ejemplo 5,1, cuatro fenoxialcanoatos se ensayaron en una mezcla de reacción que contiene 4,4 μg de AAD-12 (v2) purificado. (R, S)-diclorprop (R,S-DP) se analizó a 1 mM y (R)-diclorprop, (S)-diclorprop y 2,4-D se analizaron a 0,5 mM. Los resultados se muestran en la Figura 3, que ilustra la actividad de AAD-12 (v2) sobre 2,4-D y enantiómeros de diclorprop. Se incubaron 4,4 μg de AAD-12 (v2) con sustrato 0,5 mM (1 mM para la (R,S)-diclorprop) y la reacción se inició por adición de α-cetoglutarato. Después de 5 minutos, la reacción se inactivó, y la absorbancia a 510 nm determinada después de la adición de reactivos de detección colorimétricos. Se sustrajo el valor de fondo sin enzima.

AAD-12 (v2) tiene una actividad excelente en (R,S)-diclorprop y (S)-diclorprop y tiene una actividad mínima sobre (R)-diclorprop. Esto indica que AAD-12 (v2) tiene una clara preferencia (S)-enantiomérica. La actividad de AAD-12 (v2) sobre 2,4-D fue equivalente a la de (S)-diclorprop lo que indica que la enzima puede procesar oxipropionato y oxiacetatos en forma efectiva.

6.2 — Actividad de AAD-12 (v2) sobre los piridiloxialcanoatos

Usando el ensayo de piridinol descrito en el Ejemplo 5.2, cinco piridiloxialcanoatos se analizaron a 1 mM en una mezcla de reacción que contiene 6,8 μg de AAD-12 (v2) purificado. Las tasas de cada reacción se controlaron y se presentan en la Tabla 9. Los cinco piridiloxialcanoatos se escindieron para liberar piridinoles por AAD-12 (v2). Las tasas de los sustratos oxipropionato 116844 y 91767 eran algo más rápido que las de los acetatos correspondientes (triclopir y 93833, respectivamente) que indica una preferencia de las cadenas laterales de 12-AAD (v2) para oxipropionato respecto del oxiacetato. Estos datos muestran que AAD-12 (v2) es capaz de degradar efectivamente herbicidas piridiloxialcanoatos tales como triclopir.

Tabla 9. Tasas de escisión de piridiloxialcanoato por AAD-12 (v2), 6,8 μg de AAD-12 (v2) se incubó con 1 mM de sustrato, la reacción se inició por la adición de α-cetoglutarato y el posterior aumento de la absorbancia controlada a 325 nm. La tasa umbral de 1,4 mAU/min sin α-cetoglutarato se sustrajo de las tasas con sustrato.

ESTRUCTURA: ID TASA (mAU/min) Tasa con respecto a triclopir

triclopir: 97 1

66357: 225 2,3

ESTRUCTURA: ID TASA (mAU/min) Tasa con respecto a triclopir

91767: 190 0,8

116844: 257 1,4

93833: 118 0,5

6.3 — Constantes cinéticas de AAD-12 (v2) para 2,4-D,(R,S)-DCP y triclopir

[002011 Los valores de Km y kcat de AAD-12 (v2) purificado para los herbicidas 2,4-D,(R,S)-diclorprop y triclopir se determinaron utilizando el método de ensayo apropiado. La inhibición del sustrato se produjo a altas concentraciones (> 1 mM) de 2,4-D y (R,S)-DCP de modo que las concentraciones por debajo de esta se usaron para ajustar los datos a la ecuación de Michaelis-Menten usando (R,S)Grafit 4.0 (Erithacus Software, Reino Unido). No se observó inhibición de sustrato para triclopir hasta 2 mM. Las constantes cinéticas se resumen en la Tabla 10. A partir de estos datos, la tasa de escisión de AAD-12 (v2) de triclopir es ~5% de la de 2,4-D, en condiciones de velocidad máxima.

Tabla 10. Constantes cinéticas de AAD-12 (v2) para tres sustratos herbicida

Sustrato: Km, μM (±SE) kcat, min-1 (±SE) Procedimiento del ensayo Inhibición del sustrato a 2 nM

2,4-D: 102 (±18,4) 54,1 (±3,1) Detección de fenol 55%

(R,S)-diclorprop: 122 (±2,7)* 63,4 (±0,5) Detección de fenol 55%

Triclopir: 241 (W3O) 2,6 (±0,1) ∆A325 nm 0%

10 *Debido a la preferencia (S)-enantiomérica de AAD-12, el valor de Km se calculó asumiendo 50% de la mezcla racémica fue disponible como un sustrato.

Ejemplo 7 — Transformación en Arabidopsis y selección

7.1 — Condiciones de cultivo de Arabidopsis thaliana.

La semilla de Arabidopsis de tipo salvaje se suspendió en una solución de agarosa 0,1% (Sigma Chemical Co., St. 15 Louis, MO). La semilla suspendida se almacenó a 4 °C durante 2 días para completar los requerimientos de latencia y asegurar la germinación de semillas sincrónica (estratificación).

Sunshine Mix LP5 (Sun Gro Horticulture, Bellevue, WA) se cubrió con vermiculita fina y se sub-irrigó con solución de Hoagland hasta húmeda. La mezcla de tierra se dejó drenar durante 24 horas. La semilla estratificada se sembró en la vermiculita y se cubrió con cúpulas de humedad (KORD Products, Bramalea, Ontario, Canadá) durante 7 días.

20 Las semillas germinaron y las plantas se cultivaron en un Conviron (modelos CMP4030y CMP3244, ambientes

imagen20

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3200 g ae/ha (o tasa de campo 6x). También en estas altas tasas, la solución de pulverización se vuelve altamente ácido a menos regulada. La Arabidopsis creció en la mayor parte en la cámara de crecimiento tiene una cutícula muy fina y efectos ardientes graves puede complicar la prueba en estas tasas elevadas. Sin embargo, muchos individuos han sobrevivido a 3200 g ae/ha 2,4-D con poca o ninguna lesión.

Tabla 11. Respuesta a Arabidopsis T1 transformados por AAD-12 (v1) a un rango de las tasas de 2,4-D aplicados pos-emergencia, en comparación con una población resistente homocigota (T4) AAD-1 v3 o un control sensible a auxina, transformado a Pat-Cry1F

Transformantes T1 del gen AAD-12 (v1): % de lesión % de lesión

Promedios: <20% 20-40% >40% Prom Desv est

Buffer control no tratado: 6 0 0 0 0

50 g ae/ha 2,4-D: 6 0 2 16 24

200 g ae/ha 2,4-D: 6 1 1 11 18

800 g ae/ha 2,4-D: 5 2 1 15 20

3200 g ae/ha 2,4-D: 8 0 0 6 6

% de lesión
% de lesión

PAT/Cry1F (control transformado): Prom Desv est

Promedios: <20% 20-40% >40%

Buffer control no tratado: 10 0 0 0 0

50 g ae/ha 2,4-D: 4 1 5 31 16

200 g ae/ha 2,4-D: 0 0 10 70 2

800 g ae/ha 2,4-D: 0 0 10 81 8

3200 g ae/ha 2,4-D: 0 0 10 91 2

Plantas T4 de gen AAD-1 (v3) homocigota: % de lesión % de lesión Ave Std

Promedios: <20% 20-40% >40% Dev

Buffer control no tratado: 10 0 0 0 0

50 g ae/ha 2,4-D: 10 0 0 0 0

200 g ae/ha 2,4-D: 10 0 0 0 0

800 g ae/ha 2,4-D: 10 0 0 0 0

3200g ae/ha 2,4-D: 9 1 0 2 6

La tabla 12 muestra una respuesta de dosis realizada de modo similar de Arabidopsis T1 al ácido fenoxipropiónico,

10 diclorprop. Los datos muestran que la actividad del isómero (R-) activo como herbicida de diclorprop no sirve como un sustrato adecuado para AAD-12 (v1). El hecho de que AAD-1 metabolizará R-diclorprop lo suficientemente bien como para impartir tolerancia comercialmente aceptable es una característica distintiva que separa los dos genes. (Tabla 12). AAD-1 y AAD¬12 se consideran α-cetoglutarato dioxigenasas específicas de R y S, respectivamente.

Tabla 12. Respuesta de Arabidopsis T1 a una variedad de tasas de R-diclorprop aplicadas pos-emergencia.

Gen AAD-12 v1: % de lesión % de lesión

Promedios: <20% 20-40% >40% Prom Desv est

Control no tratado: 6 0 0 0 0

50 g ae/ha R-diclorprop: 0 0 8 63 7

200 g ae/ha R-diclorprop: 0 0 8 85 10

800 g ae/ha R-diclorprop: 0 0 8 96 4

3200 g ae/ha R-diclorprop: 0 0 8 98 2

PAT/Cry1F: % de lesión % de lesión

Promedios: <20% 20-40% >40% Prom Desv est

Control no tratado: 10 0 0 0 0

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50 g ae/ha R-diclorprop: 0 10 0 27 2

200 g ae/ha R-diclorprop: 0 0 10 69 3

800 g ae/ha R-diclorprop: 0 0 10 83 6

3200 g ae/ha R-diclorprop: 0 0 10 90 2

Gen AAD-1 (v3) homocigota: % de lesión % de lesión

Plantas T4: <20% 20-40% >40% Prom Desv est

Control no tratado: 10 0 0 0 .0

50g ae/ha R-diclorprop: 10 0 0 0 0

200 g ae/ha R-diclorprop: 10 0 0 0 0

800 g ae/ha R-diclorprop: 10 0 0 0 0

3200-g ae/ha R-diclorprop: 10 0 0 0 0

7.6 — AAD-12 (v1) como un marcador seleccionable

La capacidad de utilizar AAD-12 (v1) como un marcador seleccionable utilizando 2,4-D como el agente de selección se analizó inicialmente con Arabidopsis transformada como se describió anteriormente. Aproximadamente 50 semillas de Arabidopsis de generación T4 (homocigotas para un AAD-12 (v1)) se enriquecieron en aproximadamente

5.000 semillas de tipo salvaje (sensibles). Se compararon varios tratamientos, cada placa de plantas reciben uno o dos tiempos de aplicación de 2,4-D en uno de los siguientes esquemas de tratamiento: 7 DAP, 11 DAP, o 7 seguido por 11 DAP. Dado que todos los individuos también contenían el gen PAT en el mismo vector de transformación, AAD-12 seleccionados con 2,4-D podría compararse directamente con PAT seleccionado con glufosinato.

Los tratamientos se aplicaron con una punta de pulverización DeVilbiss como se describió previamente. Las plantas se identificaron como resistente o sensible 17 DAP. El tratamiento óptimo fue de 75 g ae/ha 2,4-D aplicado 7 y 11 días después de la plantación (DAP), fue igualmente efectivo en la frecuencia de selección, y produjo menor lesión herbicida a los individuos transformados que el esquema de selección de Liberty. Estos resultados indican que AAD12 (v1) se puede utilizar efectivamente como un marcador seleccionable alternativo para una población de Arabidopsis transformado.

7.7 — Heredabilidad

[002271 Una variedad de eventos T1 se autopolinizaron para producir semillas T2. Estas semillas se analizaron por progenie mediante la aplicación de 2,4-D (200 g ae/ha) a 100 hermanos T2 aleatorios. Cada planta T2 individual se trasplantó a macetas de 7,5 cm cuadrados antes de la aplicación de pulverización (pulverizador en una tasa de aplicaciones 187 L/ha). El setenta y cinco por ciento de las familias T1 (plantas T2) segregadas en el modelo 3 Resistente: 1 sensible esperado para un locus único heredado de modo dominante con herencia mendeliana de acuerdo con lo determinado por análisis de Chi cuadrado (P> 0,05).

Las semillas se recolectaron de 12 a 20 individuos T2 (semilla T3). Veinticinco hermanos T3 de cada uno de las ocho familias T2 seleccionadas aleatoriamente se analizaron por progenie como se describió anteriormente. Aproximadamente un tercio de las familias T2 previstas como homocigotas (poblaciones no segregantes) se han identificado en cada línea. Estos datos muestran AAD-12 (v1) está integrado de forma estable y se hereda de una forma mendeliana en al menos tres generaciones.

7.8 — Aplicaciones foliares adicionales para resistencia a herbicidas en AAD-12 de Arabidopsis.

La capacidad de AAD-12 (v1) para proporcionar la resistencia a otros herbicidas de ariloxialcanoato auxina en Arabidopsis transgénica se determinó por aplicación foliar de varios sustratos. Las semillas de Arabidopsis de generación T2 se estratificaron, y se sembraron en las placas de selección al igual que el de Arabidopsis (Ejemplo 6.4). Una línea de control transformada que contiene PAT y el gen de resistencia al insecto CryIF se plantaron de manera similar. Las plántulas se transfirieron a macetas individuales de 3 pulgadas en el invernadero. Todas las plantas se pulverizaron con el uso de un conjunto pulverizador de pista en 187 L/ha. Las plantas se pulverizaron con una variedad de herbicidas piridiloxiacetato: 280-2240 g ae/ha triclopir (Garlon 3A, Dow AgroSciences) y 280-2.240 g ae/ha fluroxipir (Starane, Dow AgroSciences); y el metabolito 2,4-D resultante de la actividad AAD-12, 2,4diclorofenol (DCP, Sigma) (en un equivalente molar de 280 a 2240 g ae/ha de 2,4¬D, se utilizó DCP de grado técnico). Todas las aplicaciones se formularon en el agua. Cada tratamiento se repitió 3-4 veces. Las plantas se evaluaron a los 3 y 14 días después del tratamiento.

No hay efecto del metabolito 2,4-D, 2,4-diclorofenol (DCP), sobre Arabidopsis control no AAD-12 transgénico (Pat/Cry1F). Las plantas transformadas con AAD42 también fueron claramente protegidos de la lesión del herbicida triclopir y fluroxipir que se observó en los controles no resistentes transformados (ver Tabla 13). Estos resultados confirman que AAD-12 (v1) en Arabidopsis proporciona resistencia a las piridiloxiacético auxinas analizadas. Este es

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el primer informe de una enzima con actividad significativa sobre los herbicidas de ácido piridiloxiacético. No se ha informado ninguna otra enzima degradadora de 2,4-D con una actividad similar.

Tabla 13. Comparación de la respuesta de AAD-12 (v1) T2 y planta de Arabidopsis control transformada a los diversos herbicidas auxínicos aplicados foliares.

Auxinas piridiloxiacéticas

Tratamiento herbicida: % de lesión 14 DAT promedio

Plantas T2 AAD-12 segregantes (pDAB724.01.120): Pat/Cry1F-Control

280 g ae/ha Triclopir: 0 52

560 g ae/ha Triclopir: 3 58

1120 g ae/ha Triclopir: 0 75*

280 g ae/ha Fluroxipir: 0 75*

560 g ae/ha Fluroxipir: 2 75*

1120 g ae/ha Fluroxipir: 3 75*

2240 g ae/ha Fluroxipir: 5 75*

Metabolito DCP inactivo

280 g ae/ha 2,4-DCP: 0 0

560 g ae/ha 2,4-DCP: 0 0

1120 g ae/ha 2,4-DCP: 0 0

2240 g ae/ha 2,4-DCP: 0 0

* Las plantas de este experimento estaban atrofiadas y severamente epinásticas, pero se mantuvieron verde y no recibió calificaciones de lesiones> 75%.

7.9 — Análisis molecular de AAD-12 (v1) Arabidopsis.

Se realizó el ensayo Invader (métodos de Third Wave Agbio Kit Procedures) para el análisis del número de copia del gen PAT con el ADN total obtenido de un kit Qiagen DNeasy en múltiples líneas homocigotas AAD-12 (v1) para determinar la integración estable de la unidad de transformación de planta que contiene PAT y AAD-12 (v1). El análisis asumió la unión física directa de estos genes ya que estaban contenidos en el mismo plásmido.

Los resultados mostraron que todas las plantas resistentes 2,4-D analizadas, contenían PAT (y, por tanto, por inferencia, AAD-12 (v1)). El análisis del número de copias mostró insertos totales que variaron de 1 a 3 copias. Esto se correlaciona, también, con los datos de expresión de la proteína AAD-12 (v1) proteína que indica que la presencia de la enzima produce niveles significativamente altos de resistencia para todos los ácidos fenoxiacético y piridiloxiacético disponibles en el comercio.

7.10 — Arabidopsis transformada con el apilamiento molecular de AAD-12 (v1) y un gen de resistencia a glifosato

Se produjo la semilla de Arabidopsis T1, como se describió previamente, que contiene el plásmido pDAB3759 (AAD-12 (v1) + EPSPS), que contiene el plásmido pDAB3759 (AAD-12 (v1) + EPSPS) que codifica un rasgo de resistencia a glifosato putativo. Los transformantes T1 se seleccionaron usando AAD-12 (v1) como el marcador seleccionable tal como se describe en el ejemplo 7.6. Las plantas T1 (eventos transformados individualmente) se recuperaron de la primera tentativa de selección y se transfirieron a macetas de tres pulgadas en el invernadero como se describió anteriormente. También se analizaron tres líneas de Arabidopsis de control diferentes: Columbia-0 tipo salvaje, líneas homocigotas AAD-12 (v1) + PAT T4 (transformada pDAB724) y líneas homocigotas PAT + Cry1F (control transformado). Las plantas transformadas pDAB3759 y pDAB724 se preseleccionó en la etapa de plántula por la tolerancia a 2,4-D. Cuatro días después del trasplante, las plantas se dividieron uniformemente para tratamiento foliar mediante un pulverizador de pista como se describió anteriormente con 0, 26,25, 105, 420, o 1.680 g ae/ha de glifosato (Glyphomax Plus, Dow AgroSciences) en agua. Todos los tratamientos fueron replicados de 5 a 20 veces. Las plantas se evaluaron 7 y 14 días después del tratamiento.

La evaluación de la resistencia inicial indicó que las plantas tolerantes al 2,4-D fueron posteriormente tolerantes al glifosato cuando se comparó con la respuesta de las tres líneas de control. Estos resultados indican que la resistencia se puede impartir a las plantas a dos herbicidas con diferentes modos de acción, que incluyen 2,4-D y la tolerancia al glifosato, que permite la aplicación de ambos herbicidas de pos-emergencia. Además, AAD-12 + 2,4-D se usó efectivamente como un marcador seleccionable para una selección de resistencia verdadera.

Tabla 14. Respuesta de T1 de Arabidopsis a una variedad de tasas de glifosato aplicadas pos-emergencia (14 DAT).

Gen de AAD-12 v1 + EPSPS + HptII (pDAB3759) (Promedios): % de lesión % de lesión

<20%: 20-40% >40% Prom Desv est

Control no tratado: 5 0 0 0 0

26,25 g ae/ha glifosato: 13 2 1 11 16

105 g ae/ha glifosato: 10 1 5 34 38

420 g ae/ha glifosato: 5 6 5 44 37

1680 g ae/ha glifosato: 0 0 16 85 9

PAT/Cry1F Promedios: % de lesión % de lesión

<20%: 20-40% >40% Prom Desv est

Control no tratado: 5 0 0 0 0

26,25 g ae/ha glifosato: 0 0 5 67 7

105 g ae/ha glifosato: 0 0 5 100 0

420 g ae/ha glifosato: 0 0 5 100 0

1680 g ae/ha glifosato: 0 0 5 100 0

Tipo salvaje(Col-0): % de lesión % de lesión

Promedios: <20% 20-40% >40% Prom Desv est

Control no tratado: 5 0 0 0 0

26,25 g ae/ha glifosato: 0 0 5 75 13

105 g ae/ha glifosato: 0 0 5 100 0

420 g ae/ha glifosato: 0 0 5 100 0

1680 g ae/ha glifosato: 0 0 5 100 0

pDAB724 T4 (PAT + AAD-12): % de lesión % de lesión

Promedios: <20% 20-40% >40% Prom Desv est

Control no tratado: 5 0 0 0 0

26,25 g ae/ha glifosato: 0 0 5 66 8

105 g ae/ha glifosato: 0 0 5 100 0

420 g ae/ha glifosato: 0 0 5 100 0

1680 g ae/ha glifosato: 0 0 5 100 0

7.11 Arabidopsis AAD-12 genéticamente apilado con AAD-1 para proporcionar un espectro más amplio de la tolerancia al herbicida.

5 Las plantas AAD-12 (v1) (pDAB724) y AAD-1 (v3) (pDAB721) se cruzaron recíprocamente y se recolectaron las semillas F1. Ocho semillas F1 se plantaron y se dejaron crecer para producir semillas. Las muestras de tejido se tomaron de ocho plantas F1 y se sometieron a análisis de Western para confirmar la presencia de ambos genes. Se concluyó que las 8 plantas examinadas expresan ambas proteínas AAD-1 y AAD-12. Las semillas se pesaron y dejaron secar durante una semana antes de la plantación.

10 Se sembraron cien semillas F2 y se aplicaron 280 g ai/ha de glufosinato. Noventa y seis plantas F2 sobrevivieron a la selección de glufosinato que ajusta una proporción de segregación esperada por dos locus del reagrupamiento independiente para la resistencia al glufosinato (15 R: 1 S). Las plantas resistentes a glufosinato se trataron luego con 560 g de ae/ha de R-diclorprop + 560 g ae/ha de triclopir, aplicada a las plantas bajo el mismo régimen de pulverización que se usó para la otra prueba. Las plantas se calificaron a 3 y 14 DAT. Sesenta y tres de las 96

15 plantas que sobrevivieron a la selección con glufosinato también sobrevivieron a la aplicación de herbicidas. Estos datos son compatibles con un patrón de segregación esperado (9R: 6S) de dos rasgos dominantes de reagrupamiento independiente donde cada gen proporciona resistencia a solo uno de los herbicidas auxínicos (Rdiclorprop o triclopir). Los resultados indican que AAD-12 (pDAB724) se puede apilar con éxito con AAD-1 (pDAB721), de este modo aumenta los herbicidas de espectro que se pueden aplicar a los cultivos de interés [(2,4-D

20 + R-diclorprop) y (2,4-D + fluroxipir + triclopir), respectivamente]. Esto puede ser útil para producir tolerancia a 2,4-D en una especie muy sensible a través del apilamiento convencional de dos genes de resistencia a 2,4-D separados.

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Tabla 20. Los eventos T0 de tabaco transformados con pDAS1580

#: Planta ID Copia PCR PTU PTU completa y PTU completa y Tolerancia al herbicida relativa@

Tubo: PAT AAD-12 Bajo 2 1 copia

1: 1580[1]-001 6 + No analizado

2: 1580[1]-002 8 + No analizado

3: 1580[1]-003 10 + No analizado

4: 1580[1]-004 1 + * * Alto

5: 1580[1]-005 2 + * Variable

6: 1580[1]-006 6 + No analizado

7: 1580[1]-007 4 + No analizado

8: 1580[1]-008 3 + Variable

9: 1580[1]-009 4 + No analizado

10: 1580[1]-010 8 + No analizado

11: 1580[1]-011 3 + Alto

12: 1580[1]-012 12 + No analizado

13: 1580[1]-013 13 + No analizado

14: 1580[1]-014 4 + No analizado

15: 1580[1]-015 2 + * Alto

16: 1580[1]-016 1 ? + * * Alto

17: 1580[1]-017 3 + Alto

18: 1580[1]-018 1 + * * Variable

19: 1580[1]-019 1 + * * Variable

20: 1580[1]-020 1 + * * No analizado

21: 1580[1]-021 1 + * * No analizado

22: 1580[1]-022 3 + Variable

23: 1580[1]-023 1 + * * Variable

24: 1580[1]-024 1 +, * * Variable

25: 1580[1]-025 5 + No analizado

26: 1580[1]-026 3 + Variable

27: 1580[1]-027 3 + Bajo

28: 1580[1]-028 4 + No analizado

29: 1580[1]-029 3 + Variable

30: 1580[1]-030 1 + * * Alto

31: 1580[1]-031 1 + * * Alto

32: 1580[1]-032 2 + * Alto

@ El rendimiento de tolerancia al herbicida diferenciado de los eventos requirió la evaluación de tolerancia relativa cuando se trata con 560 g ae/ha de fluroxipir cuando la tolerancia era variable a los largo de los eventos.

10.2 Verificación de tolerancia a 2,4-D alta en tabaco T1.

5 Dos a cuatro individuos T0 que sobreviven a altas tasas de 2,4-D y fluroxipir se guardaron de cada evento y se dejaron autofertilizar en el invernadero para dar origen a las semillas T1. La semilla T1 se estratificó y se sembró en placas de selección parecidas a las de Arabidopsis (Ejemplo 7.4), seguido de la eliminación selectiva de los nulos no transformadas en esta población segregada con 560 g ai/ha de glufosinato (selección de genes PAT). Los sobrevivientes se transfirieron a macetas individuales de 3 pulgadas en el invernadero. Estas líneas proporcionaron

10 altos niveles de resistencia al 2,4-D en la generación T0. La mejora de la consistencia de la respuesta se prevé en las plantas T1 que no provienen directamente del cultivo de tejidos. Estas plantas se compararon contra el tabaco KY160 tipo salvaje. Todas las plantas se pulverizaron con un pulverizador de pista ajustado a 187 L/ha. Las plantas se pulverizaron de un intervalo de 140-2240 g ae/ha de sal de 2,4-D dimetilamina (DMA), 70 a 1120 g ae/ha de

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10.6 Apilamiento de AAD-12 para aumentar el espectro herbicida

Las plantas homocigotas AAD-12 (v1) (PDA 1580) y AAD-1 (v3) (pDAB721) (ver PCT/US2005/014737 para el último) se cruzaron recíprocamente y se recolectó semilla F1. Las semillas F1 de dos cruzamientos recíprocos de cada gen se estratificaron y se trataros 4 repeticiones de cada cruzamientos bajo el mismo régimen de pulverización y se usaron para la otra prueba con uno de los siguientes tratamientos: 70, 140, 280 g ae/ha fluroxipyr (selectivo para el gen de AAD-12 (v1)); 280, 560, 1,120 g ae/ha R-dicloroprop (selectivo para el gen de AAD-1 (v3)); o 560, 1120, 2240 g ae/ha de 2,4-D DMA (para confirmar la tolerancia 2,4-D). Las plantas T2 homocigóticas de cada gen también se plantaron para usar como controles. Las plantas se clasificaron a 3 y 14 DAT. Los resultados de pulverizacio´n se muestran en la Tabla 24.

Los resultados confirman que AAD-12 (v1) se pueden apilar con éxito con AAD-1 (v3), de este modo aumenta el espectro de herbicidas que se pueden aplicar para el cultivo de interés (ácidos fenoxiacéticos + ácidos fenoxipropiónico versus ácidos fenoxiacéticos + ácidos piridiloxiacéticos para AAD-1 y AAD-12, respectivamente). La naturaleza complementaria de los patrones de resistencia cruzada a herbicidas permite el uso conveniente de estos dos genes como marcadores seleccionables en campo complementarios y apilables. En cultivos donde la tolerancia con un único gen puede ser marginal, un experto en la técnica reconoce que se puede aumentar la tolerancia mediante el apilamiento de un segundo gen de tolerancia para el mismo herbicida. Esto se puede realizar utilizando el mismo gen con los mismos o diferentes promotores, sin embargo, como se observa en la presente, el apilamiento y seguimiento de dos rasgos complementarios puede ser facilitado por la protección cruzada distintiva a los ácidos fenoxipropiónicos [de AAD-1 (v3)] o ácidos piridiloxiacéticos [AAD-12 (v1)]

Tabla 24. Comparación de tolerancia cruzada a herbicidas auxínicos de las plantas T2 AAD-12 (v1) (pDAS1580) y AAD-1 (v3) (pDAB721) en comparación con el cruzamiento AAD-12 x AAD-1 F1 y tipo salvaje.

Tratamiento .: KY160 control tipo salvaje AAD-12 (v1) (pDAS1580) AAD-1(v3) (pDAB721) AAD-12 (v1) x AAD (v3) F1

% promedio de de lesión 14 DAT

560 g ae/ha 2,4-D: 63 0 0 0

1120 g ae/ha 2,4-D: 80 4 0

2240 g ae/ha 2,4-D: 90 0 9 0

280g ae/ha R-diclorprop: 25 15 0 0

560 g ae/ha R-diclorprop: 60 50 0 0

1120 g ae/ha R-diclorpron: 80 70 3 0

76g ae/ha fluroxipir: 40 0 40 0

140 g ae/ha fluroxipir: 65 60 0

280 g ae/ha fluroxipir: 75 3 75 3

Ejemplo 11 – Transformación de soja

La mejora de la soja a través de técnicas de transferencia de genes se ha logrado para rasgos tales como tolerancia a herbicidas (Padgette et al., 1995), modificación de aminoácidos (Falco et al., 1995), y resistencia a insectos (Parrott et al., 1994). La introducción de los rasgos extraños en especies de cultivo requiere métodos que permitan la producción de rutina de las líneas transgénicas utilizando secuencias marcadoras seleccionables, que contienen insertos simples. Los transgenes se deben heredar como locus único funcional con el fin de simplificar el fitomejoramiento. Se ha informado la administración de genes extraños en soja cultivada por bombardeo de microproyectiles en los ejes embrionarios cigóticos (McCabe et al., 1988) o cultivos embriogénicos somáticos (Finer y McMullen, 1991), y transformación mediada por Agrobacterium de explantes de cotiledones (Hinchee et al., 1988)

o embriones cigóticos (1989 Chee et al.)

Los transformantes derivados de las transformaciones mediadas por Agrobacterium tienden a poseer inserciones simples con bajo número de copias (Birch, 1991). Hay ventajas y desventajas asociadas con cada uno de los tres tejidos blanco investigados para la transferencia génica en soja, eje embrionario cigóticos (Chee et aL, 1989; McCabe et al, 1988), cotiledón (Hinchee et al, 1988) y cultivo embriogénico somático (Finer y McMullen, 1991). Estos últimos han sido investigados extensivamente como un tejido blanco para la transferencia génica directa. Los cultivos embriogénicos tienden a ser relativamente prolíficos y se pueden mantener durante un período prolongado.

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Tabla 25. Respuesta de la soja a pintura de hoja 2,4-D y aplicación de pulverización con 2,4-Dn.

Constructo: Gen Promotor Evento Ensayo volteo de hoja NODO 2,4-D @ (18 HAT) Pulverización POST Sobre la parte superior con 2,4-D (g ae/ha) Etapa en appl (# nodos) ELISA (ng/ml) Número de copias Southern Región codificadora PCR % de lesión 2 DAT % de lesión 7 DAT % de lesión 14 DAT

HOJA PINTADA: Nodo N-1 N-2

4464: AAD-12 CsVMV D-1-14 N-1 0 0 >10 5246,83 2 + X X 0

4464: MD-12 CsVMV D-2-9 N-2 0 0 >10 20427 1 + X X 0

4468: AAD-12 AtUbi10 D-3-7 N-2 0 0 >10 4,65 1 + 0 0 0

4468: AAD-12 AtUbi10 D-4-11B N-2 0 0 8 1452,84 2 + 0 0 0

4468: MD-12 AtUbi10 D-4-16 N-2 0 0 >10 65321 2 + X X 0

4480: AAD-12 AtAct2 D-9-1 N-2 0 0 >10 248,33 3 or 4 + X X 0

4464: AAD-12 CsVMV D-2-14 N-2 0 560 7 4917,43 2 + 0 0 0

4468: AAD-12 AtUbi10 D-3-5 N-2 0 560 365,75 1 + 0 0 0

4468: AAD-12 AtUbi10 D-3-6 N-1 0 560 5 714,79 3 + 0 0 0

4472: AAD-12 AtUbi3 D-5-2 N-1 0 560 6 0,58 1 + 5 0 0

4468: AAD-12 AtUbi10 D-3-9 N-2 0 1120 6 2657,26 3 + 0 0 0

4468: AAD-12 AtUbi10 D-4-17 N-2 0 1120 7 286,14 5 4 5 0 0

4499: PAT CsVMV D-2-3 N-2 1 0 >10 2,36 5 + X X 0

Maverick: WT WT-10 NT 1 ND ND ND ND ND ND ND ND

Maverick: WT WT-2 NT 1 ND ND ND ND ND ND ND ND

Maverick: WT WT 3 NT , 0 4 ND ND ND 0 0 0

Maverick: WT WT-4 NT 0 4 ND ND ND 0 0 0

Maverick: WT WT-5 NT 560 4 ND ND ND 50 60 60

Maverick: WT WT-6 NT 560 4 ND ND ND 70 90 80

Maverick: WT WT-7 NT 560 4 ND ND ND 70 80 80

Maverick: WT WT-10 NT 1120 4 ND ND ND 70 90 100

Maverick: WT I WT-8 NT 1120 4 ND ND ND 70 95 100

Maverick: WT WT-9 NT 1120 4 ND ND ND 70 95 100

1=Volteo: ND=No determiando

0= Sin volteo

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regenerar poco después y son de color verde distinto. El algodón puede tardar en regenerarse y formar embriones, una de las formas de acelerar este proceso es someter a estrés al tejido. La desecación es una forma común de lograr esto, por medio de los cambios en el microambiente del tejido y la placa, mediante el uso de menos medios de cultivo y/o la adopción de diversos modos de cierre de placa (cinta adhesiva frente Parafilm).

5 Los embriones más grandes y bien desarrollados se aíslan y transfieren al medio DK (Tabla 26) para el desarrollo del embrión. Después de 3 semanas (o cuando los embriones se han desarrollado), los embriones germinados se transfieren a medio fresco para el desarrollo de brotes y raíces. Después de 4-8 semanas, las plantas bien desarrolladas se transfieren a tierra y se cultivan hasta la madurez. Después de un par de meses, la planta ha crecido hasta un punto que se puede pulverizar para determinar si hay alguna resistencia al 2,4-D.

10 10/05/2007

Tabla 26. Medios para transformación de algodón

Ingredientes en 1 litro: G M líquido M MG CG D DK Y

Sales LS (5X): 200 ml 200 ml 200 ml 200 ml 200 ml

Glucosa: 30 gramos 30 gramos 30 gramos 30 gramos 20 gramos

vit B5 modificada (1000x): 1 ml 1 ml 1 ml 1 ml 1 ml, 10 ml 1 ml

kinetina (1 mM): 1 ml 1 ml 1 ml 4,6 ml 0,5 ml

2,4-D (1 mM): 1 ml 1 ml 1 ml

Agar: 8 gramos 8 gramos 8 gramos 8 gramos 8 gramos 8 gramos

Sales DKW (D190): 1 paquete 1 paquete

Mio-inositol (100x): 1 ml 10 ml

Sacarosa 3%: 30 gramos 30 gramos 10 gramos

NAA: i

Carbenicilina (250 mg/ml): 2 ml 0,4 ml

GLA (10rag/m1): 0,5 ml 0,3 ml

Peptona: 10 gramos

Extracto de levaduras: 10 gramos

NaCl: 5 gramos

12.2 — Transformación celular.

Se iniciaron varios experimentos en los que los segmentos de cotiledones se trataron con Agrobacterium que contiene pDAB724. Más de 2000 de los segmentos resultantes se trataron con varias opciones de auxina para la 15 proliferación de callo de algodón pDAB724, ya sea: 0,1 o 0,5 mg/L R-diclorprop, concentración de 2,4-D estándar y tratamiento sin auxina. El callo se seleccionó en glufosinato de amonio, debido a la inclusión del gen PAT en el constructo. El análisis de la línea de callo en forma de PCR e Invader se utilizará para determinar si hay y para asegurarse de que el gen estaba presente en la fase de callo; luego las líneas de callos que son embriogénico se enviarán para el análisis Western, esencialmente como se describe en la sección 11.2.3. El callo embriogénico de

20 algodón se sometió a estrés usando las técnicas de desecación para mejorar la calidad y la cantidad del tejido recuperado.

Casi 200 eventos de callos se han analizado para determinar la PTU y expresión intacta usando análisis Western para el gen AAD-12 (v1). A continuación se muestra un subconjunto de los datos para algunos de los callos de algodón que se han analizado.

Constructo: Número de línea AAD-12 PTU AAD-12 Invader AAD-12 ng/mI

pDAB724: 1 + + 79,89

pDAB724: 2 + + 17,34

pDAB724: 3 + + 544,80

pDAB724: 4 + + 32,63

pDAB724: 5 + 82,77

pDAB724: 83 + + 795,50

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Claims

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