CN115697045A - 控制分生组织大小以改良作物的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及用于修饰植物中的CLAVATA3/EMBRYO SURROUNDING REGION‑RELATED(CLV3/ESR‑RELATED)(CLE)基因以增加穗行数、任选地没有实质性减小穗长度的组合物和方法。本发明还涉及使用本发明的方法和组合物生产的具有增加的穗行数、任选地没有实质性减小穗长度的植物。

Description

控制分生组织大小以改良作物的方法
关于序列表电子提交的声明
根据37C.F.R.§1.821，经由EFS-Web提交了文件名为1499.28.WO_ST25.txt的ASCII文本格式的序列表，以代替其纸质副本。序列表大小为395,444字节，于2021年4月14日生成。该序列表在此通过引用将其公开内容并入说明书中。
优先权声明
本申请根据35U.S.C.§119(e)要求2021年4月16日提交的美国临时申请No.63/010,887的权益，其全部内容通过引用并入本文。
技术领域
本发明涉及用于修饰植物中的CLAVATA3/EMBRYO SURROUNDING REGION-RELATED(CLV3/ESR-RELATED)(CLE)基因、任选地用于增加穗行数(kernel row number)的组合物和方法。本发明还涉及使用本发明的方法和组合物生产的具有增加的穗行数的植物。
背景技术
新的植物器官在植物的称为分生组织的生长尖端处起始。在分生组织中维持着未分化干细胞群。在生长期间，分生组织将干细胞分配给新形成的器官，包括种子，同时保留一些干细胞以连续维持分生组织。已经描述了几种保守的分子机制，其控制干细胞群的大小以确保组织化生长和适当的分生组织大小。
由于玉米穗发育的模块化性质，较大的分生组织倾向于启动更多的花，因此，分生组织尺寸对穗行数和产量具有直接影响。在玉米穗的发育期间启动的花的数量直接限制了谷粒产量。围绕穗周围启动的花的增加数量(穗行数或KRN)是在玉米驯化期间选择的一个主要性状。通过育种的显著进步已经导致了穗行数的急剧增加，从作为玉米先辈的teosinte中的2行，到现代优秀玉米品种中的～8-20行。在各种玉米品系中，穗行数可以高达36。
在模型植物拟南芥模型中描述的经典调控途径中，分生组织顶点中的细胞分泌CLAVATA3(CLV3)肽，其移动通过质外体进入中心干细胞结构域，在那里它与包括CLAVATA1(CLV1)和CLAVATA2(CLV2)的若干富含亮氨酸的受体(Leucine Rich Receptors，LRR)相互作用。这种受体-配体相互作用刺激信号传导，其最终起到降低WUS表达和限制干细胞群扩增的作用。WUS的靶标之一是CLV3基因本身，通过这种方式，WUS起到限制其自身表达并维持干细胞稳态的作用(Fletcher,J.C.,Plants 7:87(2018))。
CLV1、CLV2或CLV3中功能丧失突变(Loss of function mutations)导致WUS结构域的扩增和增加的分生组织大小(Schoof等人,Cell 100:635–644(2000))。这种分生组织大小的增加常常导致异常的植物生长，因为分生组织不受控制地扩张并且变得紊乱，这种现象被称为扁化(fasciation)(Je等人,Nat Genet 48:ng.3567(2016a))。重要的是，较大的分生组织不仅制造较大的器官，而且围绕较大区域的器官数量增加。由于分生组织大小和器官数目之间的这种关系，玉米CLV-WUS信号传导基因中的突变可能导致增加的花数目和产量。
需要用于调节分生组织大小的新策略以改善作物性能。
发明内容
本发明的一个方面提供了一种植物或其植物部分，其包含在编码CLE蛋白的内源CLAVATA3/EMBRYO SURROUNDING REGION-RELATED(CLV3/ESR-RELATED)(CLE)基因中的至少一个非天然突变。
本发明的第二方面提供了一种植物细胞，其包含编辑***，所述编辑***包含：(a)CRISPR-Cas效应子蛋白；和(b)指导核酸(例如gRNA、gDNA、crRNA、crDNA、sgRNA、sgDNA)，其包含与编码CLE蛋白的内源性靶基因具有互补性的间隔子序列。
本发明的第三方面提供了在CLE基因内包含至少一个非天然存在的突变的玉米植物细胞，其中所述突变是使用编辑***引入的取代、***、缺失或颠换(inversion)，所述编辑***包含与所述CLE基因中的靶位点结合的核酸结合结构域。
本发明的第四方面提供了一种产生/培育无转基因的经过编辑的玉米植物的方法，包括：将本发明的玉米植物与无转基因的玉米植物杂交，从而将所述至少一个非天然突变引入所述无转基因的玉米植物中；和选择包含所述至少一个非天然突变且无转基因的后代玉米植物，从而产生无转基因的经过编辑的玉米植物。
本发明的第五方面提供了一种提供具有增加的穗行数的多个玉米植物的方法，该方法包括在生长区域中种植本发明的两株或更多株植物，从而提供与不包含所述突变的多个对照玉米植物相比具有增加的穗行数的多个玉米植物。
本发明的第六方面提供了一种在成熟玉米CLE肽中产生变异的方法，包括：将编辑***引入玉米植物细胞中，其中所述编辑***靶向编码成熟玉米CLE肽蛋白的玉米CLE基因的区域，其中所述区域包含与SEQ ID NO：75、SEQ ID NO：76或SEQ ID NO：77的氨基酸序列中的任一个具有至少95％序列同一性的序列，或者所述区域由与SEQ ID NO：81-83的核苷酸序列中的任一个具有至少90％序列同一性的序列编码；以及使玉米CLE基因的区域与编辑***接触，从而在玉米植物细胞的成熟玉米CLE肽中引入突变；以及在成熟玉米CLE肽中产生变异。
本发明的第七方面提供了一种用于编辑玉米植物细胞的基因组中的特异性位点的方法，所述方法包括：以位点特异性方式切割玉米植物细胞中的内源CLE基因内的靶位点，所述内源CLE基因(a)包含(i)与SEQ ID NO：78-80的任何一个核苷酸序列具有至少90％序列同一性的序列，和/或(ii)与SEQ ID NO：81-83的任何一个核苷酸序列具有至少90％序列同一性的区域；和/或(b)编码(i)与SEQ ID NO：72-74的任何一个氨基酸序列具有至少95％序列同一性的序列；和/或(ii)与SEQ ID NO：75-77的任何一个氨基酸序列具有至少95％序列同一性的序列的结构域，从而在编码成熟CLE肽的玉米植物细胞的内源基因的部分中产生编辑并产生在所述内源基因的所述部分中包含所述编辑的植物细胞。
第八方面提供了一种用于制造玉米植物的方法，其包括：(a)使包含编码前体CLE多肽的内源CLE基因的玉米植物细胞群与连接了核酸结合结构域(例如，DNA结合结构域；例如，编辑***)的核酸酶接触，所述核酸结合结构域结合这样的序列，所述序列(i)与SEQ IDNO：78-80的任何一个核苷酸序列具有至少90％的序列同一性，(ii)与SEQ ID NO：81-83的任何一个核苷酸序列具有至少90％的序列同一性，(iii)编码与SEQ ID NO：72-74的任何一个氨基酸序列具有至少95％序列同一性的序列，或(ii)编码具有与SEQ ID NO：75-77的任何一个氨基酸序列有至少95％序列同一性的序列的结构域；(b)从所述细胞群中选择内源CLE基因已经突变的植物细胞，从而产生在所述内源CLE基因中包含突变的植物细胞；和(c)将所选择的植物细胞生长成植物。
第九方面提供了用于增加玉米植物中的穗行数的方法，其包括(a)使包含内源CLE基因的玉米植物细胞与靶向所述内源CLE基因的核酸酶接触，其中所述核酸酶与结合所述内源CLE基因中的靶位点的核酸结合结构域(例如，DNA结合结构域；例如，编辑***)连接，其中所述内源CLE基因：(i)包含与SEQ ID NO：78-80的核苷酸序列中的任一个具有至少90％序列同一性的序列；(ii)包含与SEQ ID NO：81-83的核苷酸序列中的任一个具有至少90％序列同一性的区域；(iii)编码与SEQ ID NO：72-74的氨基酸序列中的任一个具有至少95％序列同一性的序列；和/或(iv)编码具有与SEQ ID NO：75-77的氨基酸序列中的任一个有至少95％序列同一性的序列的结构域，以产生在所述内源CLE基因中包含突变的玉米植物细胞；和(b)将所述玉米植物细胞生长成在所述内源CLE基因中包含所述突变的玉米植物，从而产生具有突变的内源CLE基因和增加的穗行数的玉米植物。
第十方面提供了生产包含具有突变的内源CLE基因的至少一个细胞的玉米植物或其部分的方法，该方法包括使玉米植物或植物部分中的内源CLE基因中的靶位点与包含切割结构域和核酸结合结构域的核酸酶接触，其中所述核酸结合结构域与所述内源CLE基因中的靶位点结合，其中所述内源CLE基因(a)包含与SEQ ID NO：78-80的任何一个核苷酸序列具有至少90％序列同一性的序列；(b)包含与SEQ ID NO：81-83的任何一个核苷酸序列具有至少90％序列同一性的区域；(c)编码与SEQ ID NO：72-74的任何一个氨基酸序列具有至少95％序列同一性的序列；和/或(d)编码具有与SEQ ID NO：75-77的任何一个氨基酸序列有至少95％序列同一性的序列的结构域，从而生产包含在所述内源CLE基因中具有突变的至少一个细胞的玉米植物或其部分。
本发明的第十一方面提供了生产包含突变的内源CLE基因并显示增加的穗行数的玉米植物或其部分的方法，该方法包括使玉米植物或植物部分中的内源CLE基因中的靶位点与包含切割结构域和核酸结合结构域(例如，DNA结合结构域)的核酸酶接触，其中所述核酸结合结构域与所述内源CLE基因中的靶位点结合，其中所述内源CLE基因：(a)包含与SEQID NO：78-80的任何一个核苷酸序列具有至少90％序列同一性的序列；(b)包含与SEQ IDNO：81-83的任何一个核苷酸序列具有至少90％序列同一性的区域；(c)编码与SEQ ID NO：72-74的任何一个氨基酸序列具有至少95％序列同一性的序列；和/或(d)编码具有与SEQID NO：75-77的任何一个氨基酸序列有至少95％序列同一性的序列的结构域，从而生产包含具有突变的内源CLE基因并显示增加的穗行数的玉米植物或其部分。
第十二方面提供了一种与编码前体CLE肽的CLE基因中的靶位点的部分结合的指导核酸，所述靶位点包含与SEQ ID NO：81-83的核苷酸序列中的任一个具有至少90％序列同一性的序列或编码与SEQ ID NO：75-77的氨基酸序列中的任一个具有至少95％序列同一性的序列。
在第十三方面，提供了一种***，其包含本发明的指导核酸和与所述指导核酸结合的CRISPR-Cas效应子蛋白。
第十四方面提供了一种基因编辑***，其包含与指导核酸结合的CRISPR-Cas效应子蛋白，其中所述指导核酸包含与内源CLE基因结合的间隔子序列。
在第十五方面，提供了包含CRISPR-Cas效应子蛋白的复合物，所述复合物包含切割结构域和指导核酸，其中所述指导核酸结合编码前体CLE多肽的内源CLE基因中的靶位点，其中所述内源CLE基因：(a)包含与SEQ ID NO：78-80的任何一个核苷酸序列具有至少90％序列同一性的序列；(b)包含与SEQ ID NO：81-83的任何一个核苷酸序列具有至少95％序列同一性的区域；(c)编码与SEQ ID NO：72-74的任何一个氨基酸序列具有至少95％序列同一性的序列；和/或(d)编码具有与SEQ ID NO：75-77的任何一个氨基酸序列有至少95％序列同一性的序列的结构域，其中所述切割结构域切割所述CLE基因中的靶标链。
在第十六方面，提供了一种表达盒，所述表达盒包含(a)编码CRISPR-Cas效应子蛋白的多核苷酸，所述CRISPR-Cas效应子蛋白包含切割结构域和(b)结合编码前体CLE肽的内源CLE基因中的靶位点的指导核酸，其中所述指导核酸包含与以下互补并与之结合的间隔子序列：(a)包含与SEQ ID NO：78-80的任何一个核苷酸序列具有至少90％序列同一性的序列；(b)包含与SEQ ID NO：81-83的任何一个核苷酸序列具有至少95％序列同一性的区域；(c)编码与SEQ ID NO：72-74的任何一个氨基酸序列具有至少95％序列同一性的序列；和/或(d)编码具有与SEQ ID NO：75-77的任何一个氨基酸序列有至少95％序列同一性的序列的结构域。
在又一个方面，提供了一种在植物中的内源CLE基因中产生突变的方法，其包括：(a)将基因编辑***靶向CLE基因的编码位于位置3、5、6、8或9处的氨基酸残基的部分，所述位置是参考SEQ ID NO：75、SEQ ID NO：76或SEQ ID NO：77的氨基酸位置编号而言的，和(b)选择在位置3、5、6、8或9之一处包含备选氨基酸的植物，所述位置是参考SEQ ID NO：75、SEQID NO：76或SEQ ID NO：77的氨基酸位置编号而言的。
本发明的另一方面提供了编码玉米CLE蛋白的显性阴性突变(dominant negativemutation)、半显性突变(semi-dominant mutation)、弱的功能损失突变(weak loss-of-function mutation)、无效等位基因(null allele)或亚效突变(hypomorphic mutation)的核酸。
在另一方面，提供了包含本发明的核酸的玉米植物或其部分。
在另一方面，提供了一种玉米植物或其部分，其表现出增加的穗行数。
在一些方面，提供了一种玉米植物，其还表现出增加的产量，和改善的线虫抗性，以及表现出更大的分生组织。
还提供了在其基因组中包含通过本发明的方法产生的一个或多个突变的CLE基因的植物以及用于制造本发明的植物的多肽、多核苷酸、核酸构建体、表达盒和载体。
在下面的本发明描述中更详细地阐述了本发明的这些和其他方面。
序列的简要描述
SEQ ID NO：1-17是可用于本发明的示例性Cas12a氨基酸序列。
SEQ ID NO：18-20是可用于本发明的示例性Cas12a核苷酸序列。
SEQ ID NO：21-22是编码启动子和内含子的示例性调节序列。
SEQ ID NO：23-29是可用于本发明的示例性胞嘧啶脱氨酶序列。
SEQ ID NO：30-40是可用于本发明的示例性腺嘌呤脱氨酶氨基酸序列。
SEQ ID NO：41是可用于本发明的示例性尿嘧啶-DNA糖基化酶抑制剂(UGI)序列。
SEQ ID NO：42-44提供V型CRISPR-Cas12a核酸酶的原间隔子邻近基序位置的实例。
SEQ ID NO：45-47提供可用于本发明的示例性肽标签和亲和多肽。
SEQ ID NO：48-58提供可用于本发明的RNA募集基序示例和相应的亲和多肽。
SEQ ID NO：59-60是可用于本发明的示例性Cas9多肽序列。
SEQ ID NO：61-71是可用于本发明的示例性Cas9多核苷酸序列。
SEQ ID NO：72是未加工的FCP1多肽序列实例。
SEQ ID NO：73是未加工的CLE14多肽序列实例。
SEQ ID NO：74是未加工的CLE7多肽序列实例。
SEQ ID NO：75是加工的FCP1多肽序列实例。
SEQ ID NO：76是加工的CLE14多肽序列实例。
SEQ ID NO：77是加工的CLE7多肽序列实例。
SEQ ID NO：78是FCP1编码(cds)序列实例。
SEQ ID NO：79是CLE14编码(cds)序列实例。
SEQ ID NO：80是CLE7编码(cds)序列实例。
SEQ ID NO：81是FCP1编码(cds)序列的示例性靶区域。
SEQ ID NO：82是CLE14编码(cds)序列的示例性靶区域。
SEQ ID NO：83是CLE7编码(cds)序列的示例性靶区域。
SEQ ID NO：84-90是突变的FCP1多肽序列实例。
SEQ ID NO：91-93是突变的CLE14多肽序列实例。
SEQ ID NO：94-100是突变的CLE7多肽序列实例。
SEQ ID NO：101-104是可用于本发明的核酸指导的示例性间隔子序列。
SEQ ID NO：105-109是编码经加工的CLE多肽的示例性突变CLE多核苷酸。
附图说明
图1提供了FCP1编码序列的图，其中显示了FCP1肽结构域和示例性靶区域。
具体实施方式
现在将在下文中参考附图和实施例描述本发明，其中示出了本发明的一些实施方式。该描述并非意在详细列出可以执行本发明的所有不同方式或者可以添加到本发明中的所有特征。例如，关于一个实施方式示出的特征可以并入其他实施方式中，并且关于一个特定实施方式示出的特征可以从该实施方式中删除。因此，本发明中包括，在本发明的一些实施方式中，可以排除或省略本文示出的任何特征或特征组合。另外，基于本发明的本公开，对本文提出的各种实施方式的许多变化和添加对于本领域技术人员将是显而易见的，它们并不脱离本发明。因此，以下描述旨在说明本发明的一些具体实施方式，而不是详尽地指明其所有排列、组合和变化。
除非另外定义，否则本文使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属领域的普通技术人员通常理解的相同含义。本文在对本发明的描述中所使用的术语仅出于描述具体实施方式的目的，并不意图限制本发明。
本文引用的所有出版物、专利申请、专利和其他参考文献通过引用整体并入本文，以获得与呈现参考文献的句子和/或段落相关的教导。
除非上下文另有说明，否则本文描述的本发明的各种特征可以任何组合使用。此外，本发明还预期在本发明的一些实施方式中，可以排除或省略本文阐述的任何特征或特征组合。举例来说，如果说明书中陈述组合物包含组分A、B和C，则其具体地表明可以单独地或以任何组合省略何具体放弃A、B或C中的任何一个或其组合。
如在本发明的说明书和所附权利要求书中所使用的，单数形式“一种”、“一个”和“该”/“所述”旨在也包括其复数形式，除非上下文另有明确说明。
同样如本文所使用的，“和/或”是指示并且涵盖相关联的所列项目中的一个或多个的任何和所有可能组合，以及当以备选方式(“或”)理解时指没有组合。
当提及诸如量或浓度等的可测量值时，如本文所用的术语“约”意在涵盖指定值以及指定值的±10％、±5％、±1％、±0.5％或甚至±0.1％的变化。例如，“约X”(其中X是可测量值)是指包括X以及X的±10％、±5％、±1％、±0.5％或甚至±0.1％的变化。本文中针对可测量值提供的范围可包含其中的任何其它范围及/或具体值。
如本文所用，诸如“在X和Y之间”/“X-Y”和“在约X和Y之间”/“约X-Y”的短语应被解释为包括X和Y。如本文所用，短语诸如“在约X与Y之间”/“约X-Y”意指“在约X与约Y之间”，短语诸如“从约X至Y”意指“从约X至约Y”。
除非本文另有说明，否则本文中对数值范围的叙述仅旨在用作单独提及落入该范围内的每个单独值的简写方法，并且每个单独的值并入本说明书中，如同其在本文中被单独记载一样。例如，如果公开了范围10到15，则还公开了11、12、13和14。
如本文中所使用的术语“包括”、“具有”和“包含”等是指存在所陈述的特征、整数、步骤、操作、要素和/或组分，但不排除一个或多个其它特征、整数、步骤、操作、要素、组分和/或其群组的存在或添加。
如本文所用，过渡短语“基本上由……组成”是指权利要求的范围应被解释为涵盖权利要求中所述的指定材料或步骤以及不实质上影响所要求保护的本发明的基本和新颖特征的那些材料或步骤。因此，当在本发明的权利要求中使用时，术语“基本上由……组成”不旨在被解释为等同于“包括”。
如本文所用，术语“增加”、“增加的”、“增强”、“增强的”(及其语法变型)描述了与对照相比至少约5％、10％、15％、20％、25％、50％、75％、100％、150％、200％、300％、400％、500％或更多的升高。例如，包含如本文所述的CLE基因中的突变的植物可以表现出增加的穗行数，其比不包含相同突变的对照植物的穗行数多至少约5％或更多。对照植物通常是与被编辑的植物相同的植物，但是对照植物尚未被类似地编辑，因此缺乏所述突变。对照植物可以是等基因植物和/或野生型植物。因此，对照植物可以是与渐渗本文所述突变的受试植物相同的育种系、品种或栽培品种，但对照育种系、品种或栽培品种没有所述突变。在一些实施方案中，本发明的植物和对照植物之间的比较是在相同的生长条件下进行的，例如相同的环境条件(土壤、水合、光、热、营养物等)。
如本文所用，术语“减少”、“减少的”、“降低”、“降低的”(及其语法变体)描述了例如与对照物相比至少约5％、10％、15％、20％、25％、35％、50％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％、99.5％、99.6％、99.7％、99.8％、99.9％或100％的减少。在特定实施方式中，该减少可以导致没有或基本上没有(即，不显著的量，例如小于约10％或甚至5％)可检测的活性或量。
如本文所用，关于核酸分子和/或核苷酸序列(例如RNA或DNA)使用的术语“表达”、“表达的”等表示核酸分子和/或核苷酸序列被转录并任选地被翻译。因此，核酸分子和/或核苷酸序列可以表达感兴趣的多肽或例如功能性非翻译RNA。
“异源”或“重组”核苷酸序列是不与其被引入的宿主细胞天然关联的核苷酸序列，包括天然存在的核苷酸序列的非天然存在的多个拷贝。“异源”核苷酸/多肽可以源自外来物种，或者如果来自相同物种，则其通过有意的人类干预从组合物和/或基因组基因座的其天然形式被实质性修饰。
“天然”或“野生型”核酸、核苷酸序列、多肽或氨基酸序列是指天然存在的或内源的核酸、核苷酸序列、多肽或氨基酸序列。在一些情况下，“野生型”核酸是没有如本文所述进行编辑的核酸，其可以不同于可能如本文所述进行编辑的“内源”基因(例如，突变的内源基因)。在一些情况下，“野生型”核酸(例如，未编辑的)可以与在其中发现有所述野生型核酸的生物体(例如，转基因生物体)是异源的。作为示例，“野生型内源性CLAVATA3/EMBRYOSURROUNDING REGION-RELATED(CLV3/ESR-RELATED)(CLE)基因”是CLE基因，可选地FCP1基因、CLE14基因或CLE7基因，其天然存在于参考生物体(例如植物，例如玉蜀黍植物)中或是其内源性的，并且可以经受如本文所述的修饰，之后，这种修饰的内源性基因不再是野生型的。
如本文所用，术语“杂合”是指其中不同等位基因存在于同源染色体上的相应基因座处的遗传状态。
如本文所用，术语“纯合”是指其中相同等位基因存在于同源染色体上的相应基因座处的遗传状态。
如本文所用，术语“等位基因”是指在特定基因座处出现的两个或更多个不同核苷酸或核苷酸序列中的一个。
“无效等位基因”是由基因突变引起的非功能性等位基因，其导致完全缺乏相应蛋白质的产生或产生非功能性的蛋白质。
“显性阴性突变”是产生改变的基因产物(例如相对于野生型而言具有异常功能)的突变，该基因产物不利地影响野生型等位基因或基因产物的功能。例如，“显性阴性突变”可以阻断野生型基因产物的功能。显性阴性突变也可以被称为“反效等位基因突变”(anti-morphic mutation)。
“半显性突变”是指杂合生物体中表型的渐渗小于对纯合生物体观察到的渐渗的突变。
“弱的功能损失突变”(weak loss-of-function mutation)是导致与野生型基因产物相比具有部分功能或功能降低(部分失活)的基因产物的突变。
“亚效突变”(hypomorphic mutation)是导致基因功能的部分损失的突变，其可以通过降低的表达(例如，降低的蛋白质和/或降低的RNA)或降低的功能性能(例如，降低的活性)而不是功能/活性的完全丧失而发生。“亚效”等位基因是由遗传突变引起的半功能性等位基因，所述遗传突变导致产生以正常效率的1％与99％之间的任何水平发挥功能的对应蛋白质。
“基因座”是染色体上基因或标记或等位基因所在的位置。在一些实施方式中，基因座可以涵盖一或多个核苷酸。
如本文所用，术语“所需等位基因”、“靶等位基因”和/或“感兴趣的等位基因”可互换使用，以指代与所需性状相关的等位基因。在一些实施方案中，取决于所需表型的性质，所需等位基因可以与给定性状的增加或减少(相对于对照)相关联。
当性状与标记连锁时以及当标记的存在是所需性状或性状形式是否存在于和/或在何种程度上将存在于包含所述标记的植物/种质中的指标时，则所述标记与所述性状“相关联”。类似地，当标记与等位基因或染色体间隔连锁时并且当标记的存在是所述等位基因或染色体间隔是否存在于包含该标记的植物/种质中的指标时，则所述标记与所述等位基因或所述染色体间隔“相关联”。
如本文所用，术语“回交”和“进行回交”是指后代植物与其亲本之一进行一次或多次(例如1、2、3、4、5、6、7、8次等)回交的过程。在回交方案中，“供体”亲本是指具有待渐渗的所需基因或基因座的亲本植物。“接受者”亲本(使用一次或多次)或“回交”亲本(使用两次或更多次)是指基因或基因座被渐渗其中的亲本植物。例如参见Ragot,M.等人，Marker-assisted Backcrossing:A Practical Example,in Techniques et Utilisations desMarqueurs Moleculaires Les Colloques,Vol.72,pp.45-56(1995)；和Openshaw等人,Marker-assisted Selection in Backcross Breeding,in Proceedings of theSymposium"Analysis of Molecular Marker Data,"pp.41-43(1994)。初始杂交产生F1代。术语“BC1”是指回交亲本的第二次使用，“BC2”是指回交亲本的第三次使用，等等。
如本文所用，术语“杂交”或“杂交的”是指通过授粉而配子融合以产生子代(例如细胞、种子或植物)。该术语包括有性杂交(一株植物被另一株植物授粉)和自交(自花授粉，例如当花粉和胚珠来自同一植物时)。术语“杂交”是指通过授粉融合配子以产生子代的动作。
如本文中所用，术语“渐渗(introgression)”、“进行渐渗(introgressing)”和“渐渗的(introgressed)”是指一个或多个基因座的所需等位基因或所需等位基因的组合从一个遗传背景到另一个遗传背景的自然和人工传递。例如，指定基因座处的所需等位基因可以通过同一物种的两个亲本间的有性杂交而传递给至少一个(例如一个或多个)后代，其中至少一个亲本在其基因组中具有所需等位基因。或者，例如，等位基因的传递可以例如在融合的原生质体中通过两个供体基因组之间的重组发生，其中至少一个供体原生质体在其基因组中具有所需的等位基因。所需等位基因可以是标记、QTL、转基因等的选定等位基因。包含所需等位基因的后代可以与具有所需遗传背景的品系回交一次或多次(例如1次、2次、3次、4次或更多次)，选择所需等位基因，结果是所需等位基因变成固定在所需遗传背景中。例如，与非水分胁迫条件下产量增加相关联的标记可从供体渐渗到不包含该标记且在非水分胁迫条件下不显示产量增加的回交亲本中。然后可以将得到的后代回交一次或多次，并进行选择，直至后代具有与在回交亲本背景下非水分胁迫条件下产量增加相关联的遗传标记。
“遗传图谱”是对给定物种中一条或多条染色体上的基因座之间的遗传连锁关系的描述，通常以图表或表格的形式描述。对于每个遗传图谱，基因座之间的距离通过它们之间的重组频率来测量。可以使用多种标记来检测基因座之间的重组。遗传图谱是作图群体、所用标记类型和不同群体间每个标记的多态性潜力的产物。基因座之间的顺序和遗传距离可以因遗传图谱的不同而不同。
如本文中所用，术语“基因型”是指个体(或个体组)在一个或多个基因座处的遗传组成，与可观察和/或可检测和/或表现的性状(表型)形成对比。基因型由个体从其亲本遗传的一个或多个已知基因座的等位基因定义。术语基因型可用于指个体在单个基因座、多个基因座的遗传组成，或者更一般地，术语基因型可用于指个体基因组中所有基因的个体遗传组成。基因型可以例如使用标记间接表征和/或通过核酸测序直接表征。
如本文中所用，术语“种质”指个体(例如植物)、个体群(例如植物品系、品种或家族)或源自品系、品种、物种或培养物的克隆的遗传物质，或来自其的遗传物质。种质可以是生物体或细胞的一部分，或者可以与生物体或细胞分开。一般来说，种质提供了具有特定遗传组成的遗传物质，所述遗传物质为生物体或细胞培养物的一些或全部遗传性质提供了基础。如本文中所用，种质包括可从其生长出新植物的细胞、种子或组织，以及可培养成完整植物的植物部分(例如叶、茎、芽、根、花粉、细胞等)。
如本文中所用，术语“栽培品种”和“品种”是指一组相似的植物，它们通过结构或遗传特征和/或性能可以与同一物种内的其它品种相区别。
如本文中所用，术语“外来的”、“外来品系”和“外来种质”是指任何非优良的植物、品系或种质。一般来说，外来植物/种质不源自任何已知的优良植物或种质，而是被选择来将一种或多种所需遗传元件引入育种程序(例如以将新颖等位基因引入育种程序)。
如本文中所用，植物育种上下文中的术语“杂种”是指通过不同品系或品种或物种的植物杂交(包括但不限于两个近交系之间的杂交)产生的遗传上相异的亲本的后代。
如本文中所用，术语“近交”是指基本上纯合的植物或品种。该术语可以指在整个基因组中基本上纯合的植物或植物品种，或者就特别感兴趣的基因组部分而言基本上纯合的植物或植物品种。
“单倍型”是个体在多个基因座的基因型，即等位基因的组合。通常，定义单倍型的遗传基因座是物理和遗传连锁的，即在同一染色体区段上。术语“单倍型”可以指特定基因座处的多态性，诸如单个标记基因座，或沿染色体区段的多个基因座处的多态性。
如本文中所用，术语“异源的”是指这样的核苷酸/多肽，其源自外来物种，或者，如果源自同一物种，则是通过有意的人为干预而在组成和/或基因组基因座上由其天然形式进行了实质性的修饰。
与在所述至少一个CLE基因中不包含所述修饰的植物相比，其中至少一个(例如一个或多个，例如1、2、3或4或更多个)CLE基因(例如一个或多个CLE基因)如本文所述被修饰(例如，包含如本文所述的修饰)的植物可具有改善的产量性状。如本文所用，“改善的产量性状”是指与生长相关联的任何植物性状，例如生物量、产量、氮利用效率(NUE)、花序尺寸/重量、果实产量、果实质量、果实尺寸、种子尺寸、种子数量、叶组织重量、结瘤数、结瘤质量、结瘤活性、种子头数、分蘖数、分枝数、花数、块茎数、块茎质量、球茎质量、种子数、总种子质量、出叶率、分蘖/分枝出现率(rate of tiller/branch emergence)、出苗率、根的长度、根的数量、根团的尺寸和/或重量，或其任意组合。因此，在一些方面，“改善的产量性状”可包括但不限于与对照植物或其部分(例如，不包含突变的内源CLE核酸(例如突变的CLE基因)的植物)相比，具有增加的花序产生，增加的果实产生(例如，增加的果实的数量、重量和/或尺寸；例如，增加的例如玉米的穗的数量、重量和/或尺寸)、增加的果实品质、增加的根的数量、尺寸和/或重量、增加的分生组织尺寸、增加的种子尺寸、增加的生物量、增加的叶尺寸、增加的氮利用效率、增加的高度、增加的节间数和/或增加的节间长度。改善的产量性状也可以由本发明的植物的增加的种植密度产生。因此，在一些方面，本发明的植物能够以增加的密度种植(由于由所述内源性突变引起的植物结构改变所致)，与以相同密度种植的对照植物相比，这导致改善的产量性状。在一些方面，改善的产量性状可以表示为每土地面积生产的谷粒量(例如，每英亩土地的蒲式耳)。
如本文所用，“对照植物”意指不含有如本文所述的一个或多个编辑的CLE基因的植物，其赋予增强/改善的性状(例如产量性状)或改变的表型。对照植物用于识别和选择如本文所述进行编辑、并且与对照植物相比具有增强的性状或改变的表型的植物。合适的对照植物可以是用于产生包含突变的CLE基因的植物的亲本系的植物，例如，没有如本文所述的内源CLE基因中的编辑的野生型植物。合适的对照植物也可以是含有赋予其它性状的重组核酸的植物，例如具有增强的除草剂耐受性的转基因植物。在一些情况下，合适的对照植物可以是不含本文所述的突变CLE基因的杂合或半合转基因植物系的子代，称为阴性分离株(negative segregant)或阴性等基因系(negative isogenic line)。
增强的性状可以是例如与对照植物相比，从种植到成熟的天数减少、茎秆尺寸增加、叶子数量增加、营养阶段的植物高度生长速率增加、穗尺寸增加、每个植物的穗干重增加、每个穗的谷粒数量增加、每个谷粒的重量增加、每个植物的谷粒数量增加、穗空隙减少、谷粒填充期延长、植物高度降低、根分枝数量增加、总根长增加、产量增加、氮使用效率增加和水使用效率增加。改变的表型可以是例如植物高度、生物质、冠层面积、花色素苷含量、叶绿素含量、施用的水、水含量和水使用效率。
如本文所用，“性状”是植物或特定植物材料或细胞的生理、形态、生物化学或物理特征。在一些情况下，该特征对于人眼是可见的，并且可以机械地测量，例如种子或植物尺寸、重量、形状、形式、长度、高度、生长速率和发育阶段，或者可以通过生物化学技术测量，例如检测蛋白质、淀粉、某些代谢物或种子或叶子的油含量，或者通过观察代谢或生理过程，例如通过测量对缺水或者特定盐或糖浓度的耐受性，或者通过测量一个或多个基因的表达水平，例如通过采用Northern分析、RT-PCR、微阵列基因表达测定或报道基因表达***，或者通过农业观察，例如高渗胁迫耐受性或产量。然而，可以使用任何技术来测量转基因植物中任何选择的化合物或大分子的量、比较水平或差异。
如本文所用，“增强的性状”意指由如本文所述的CLE基因中的突变产生的植物特征。这样的性状包括但不限于以增强的植物形态、生理学、生长和发育、产量、营养增强、疾病或害虫抗性或者环境或化学耐受性为特征的增强的农学性状。在一些实施方案中，增强的性状/改变的表型可以是例如从种植到成熟的天数减少、茎秆大小增加、叶的数量增加、生长阶段的植物高度生长速率增加、穗大小增加、每个植物的穗干重增加、每个穗的谷粒数量增加、每个谷粒的重量增加、每个植物的谷粒数量增加、穗空隙减少、谷粒填充期延长、植物高度减少、根分枝数量增加、总根长增加、干旱耐受性、水使用效率增加、寒冷耐受性、氮使用效率增加和产量增加。在一些实施方案中，性状是在非胁迫条件下的产量增加或在环境胁迫条件(environmental stress conditions)下的产量增加。胁迫条件可包括生物胁迫和非生物胁迫，例如干旱、阴影、真菌疾病、病毒疾病、细菌疾病、昆虫侵袭、线虫侵袭、寒冷温度暴露、热暴露、渗透胁迫、氮养分可用性降低、磷养分可用性降低和高植物密度。“产量”可受许多性质的影响，包括但不限于植物高度、植物生物质、荚数目、植物上的荚位置、节间数目、荚破碎的发生率、谷粒尺寸、穗尺寸、穗尖填充、籽粒败育(kernel abortion)、结瘤和氮固定的效率、营养物同化的效率、对生物和非生物胁迫的抗性、碳同化、植物结构、对倒伏的抗性、种子萌发百分比、幼苗活力和早期性状。产量还可能受到出芽效率(包括在胁迫条件下的发芽)、生长速率(包括在胁迫条件下的生长速率)、开花时间和持续时间、穗数目、穗尺寸、穗重量、每只穗或荚的种子数、种子尺寸、种子组成(淀粉、油、蛋白质)和种子填充特性影响。
本文中还使用的术语“性状修饰”包括相对于不包含所述突变的植物(例如野生型植物或阴性分离物)而言，通过在包含如本文所述的内源CLE基因中的突变的植物中导致特征的可检测差异来改变所述性状。在一些情况下，可以定量评估所述性状修饰。例如，性状修饰可能是与对照植物相比，观察的性状特征或表型的增加或减少。已知修饰的性状可以存在自然变化。因此，与对照植物相比，观察到的性状修饰需要植物中的性状特征或表型的正态分布和幅度的改变。
本公开涉及具有改进的经济上重要的特性、更具体地提高的产量的植物。更具体地，本公开涉及包含本文所述的CLE基因中的突变的植物，其中与没有所述突变的对照植物相比，所述植物具有增加的产量。在一些实施方案中，与对照植物相比，如本文所述生产的植物表现出增加的产量或改善的产量性状组分。在一些实施方案中，本公开的植物表现出与产量相关的改进的性状，包括但不限于增加的氮使用效率、增加的氮胁迫耐受性、增加的水使用效率和增加的干旱耐受性，如下文所定义和讨论的。
产量可定义为作物的经济价值的可测量产量。产率可以在数量和/或质量的范围内定义。产量可以直接取决于若干因素，例如器官的数量和尺寸、植物结构(例如分枝的数量、植物生物质，例如增加的根部生物质、更陡的根部角度和/或更长的根部等)、开花时间和持续时间、谷物填充时间。根结构和发育、光合效率、营养物摄取、胁迫耐受性、早期活力、延迟衰老和功能保持绿色表型可以是确定产量的因素。因此，优化上述因素可以有助于增加作物产量。
本文提及产量相关性状的增加/改善也可以表示植物的一个或多个部分的生物质(重量)的增加，其可以包括地上和/或地下(可收获的)植物部分。特别地，这种可收获的部分是种子，并且本公开的方法的执行导致相对于合适的对照植物而言产量、特别是种子产量增加的植物。术语植物的“产量”可以涉及该植物的营养生物质(根和/或芽生物质)、繁殖器官和/或繁殖体(例如种子)。
本公开的植物的增加的产量可以以多种方式测量，包括测试重量、每个植物的种子数、种子重量、每单位面积的种子数(例如，每英亩的种子或种子重量)、每英亩的蒲式耳、每英亩的吨数或每公顷的千数。增加的产量可以因关键生化化合物(例如氮、磷和碳水化合物)的利用改进引起，或者因对环境胁迫(例如冷、热、干旱、盐、阴影、高植物密度和害虫或病原体的攻击)的响应改善引起。
“增加的产量”可以表现为以下中的一个或多个：(i)植物的一个或多个部分的增加的植物生物质(重量)，特别是植物的地上(可收获)部分，增加的根生物质(增加的根数量，增加的根厚度，增加的根长度)或任何其他可收获部分的增加的生物质；或(ii)增加的早期活力，本文定义为在萌发后大约三周的改进的幼苗地上区域。
“早期活力”是指特别是在植物生长的早期阶段期间的活性健康植物生长，可以由由于例如植物更好地适应其环境(例如，优化能源的使用、营养物的摄取以及在芽和根之间的碳分配)而引起的植物适应性增加导致。例如，早期的活力可以是种子在种植后发芽和出苗的能力和幼小植物在发育后生长和发育的能力的组合。具有早期活力的植物还显示出增加的幼苗存活和更好的作物长成，这通常导致高度均匀的田地，其中大多数植物基本上同时达到各种发育阶段，这通常导致产量增加。因此，早期活力可以通过测量各种因素来确定，例如谷粒重量、发芽百分比、出苗百分比、幼苗生长、幼苗高度、根长度、根和芽生物量、冠幅尺寸和颜色等。
此外，增加的产量也可以表现为增加的总种子产量，其可以由以下中的一个或多个引起：由于每个植物和/或基于单个种子的种子重量增加而导致的种子生物质(种子重量)的增加，例如每个植物的花/圆锥花序的数量增加；荚的数量增加；节点的数量增加；每个花序/植物的花(“小花”)的数量增加；种子填充速率增加；填充种子的数量增加；种子尺寸(长度、宽度、面积、周长)增加，其也可以影响种子的组成；和/或种子体积增加，其也可以影响种子的组成。在一个实施例中，增加的产量可以是增加的种子产量，例如增加的种子重量；增加的填充种子数量；以及增加的收获指数。
增加的产量也可能导致修饰的架构，或者可能由于改进的植物架构而发生。
产量增加也可以表现为收获指数增加，表示为可收获部分诸如种子的收率与总生物质的比率
本公开还扩展到植物的可收获部分，例如但不限于种子、叶、果实、花、棉铃(boll)、荚、角果(siliques)、坚果、茎、根茎、块茎和球茎。本公开还涉及源自这种植物的可收获部分的产品，例如干颗粒、粉末、油、脂肪和脂肪酸、淀粉或蛋白质。
本公开提供了一种用于增加植物的“产量”或者植物或植物部分的“宽英亩产量”的方法，所述植物或植物部分被定义为每单位面积可收获的植物部分，例如每英亩的种子或种子重量、每英亩的磅数、每英亩的蒲式耳数、每英亩的吨数、每英亩的吨数、每公顷的千克数。
如本文所用，“氮使用效率”是指导致所施加的每个氮单位的植物产量、生物质、活力和生长速率增加的过程。所述方法可包括植物摄取、同化、积累、信号传导、感测、重新易位(在植物内)和使用氮。
如本文所用，“增加的氮使用效率”是指当经受与正常或标准条件下相同量的可用/施加的氮时，植物比正常更快或更好地生长、发育或产生的能力；当经受少于最佳量的可用/施加的氮时，或在氮限制条件下，植物比正常更快或更好地生长、发育或产生的能力。
如本文所用，“氮限制条件”是指提供比足够或成功植物代谢、生长、繁殖成功和/或活力所需的少于最佳量的氮的生长条件或环境。
如本文所用，“增加的氮胁迫耐受性”(increased nitrogen stress tolerance)是指当经受少于最佳量的可用/施加的氮时，或在氮限制条件下，植物正常生长、发育或产量，或者生长、发育或产量更快或更好的能力。
增加的植物氮使用效率在本领域中可以理解为供应较少的氮而收获相似量的产量，或通过供应最佳/足够量的氮获得增加的产量。增加的氮使用效率可以改善植物氮胁迫耐受性，并且还可以改善种子的作物质量和生化成分，例如蛋白质产量和油产量。术语“提高的氮使用效率”、“增加的氮使用效率”和“氮胁迫耐受性”在本公开中可互换地用于指在氮限制条件下具有提高的生产率的植物。
如本文所用，“水使用效率”是指蒸腾的每单位水蒸气被叶同化的二氧化碳的量。它构成了控制干燥环境中的植物生产力的最重要特性之一。“干旱耐受性”是指植物适应干旱或干旱条件的程度。植物对水缺乏的生理反应包括叶萎缩、叶面积的减小、叶脱裂和通过将营养物引导到植物的地下部分来刺激根生长。通常，植物在开花和种子发育(生殖阶段)期间对干旱更易感，因为植物的资源被偏向支持根生长。此外，脱落酸(ABA)，一种植物胁迫激素，诱导叶气孔(涉及气体交换的微观孔隙)闭合，从而减少通过蒸腾的水损失，并降低光合作用的速率。这些响应在短期内提高了植物的用水效率。术语“增加的水使用效率”、“提高的水使用效率”和“增加的干旱耐受性”在本公开中可互换地用于指在水限制性条件下具有改善的生产力的植物。
如本文所用，“增加的水使用效率”是指当经受与正常或标准条件下相同量的可用/施加的水时，植物比正常更快或更好地生长、发育或收益的能力；当经受减少量的可用/施加的水(水输入)或在水分胁迫或水不足胁迫的条件下，植物正常地生长、发育或收益或者更快或更好地生长、发育或收益的能力。
如本文所用，“增加的干旱耐受性”是指当经受减少量的可用/施加的水和/或在急性或慢性干旱的条件下时，植物正常生长、发育或收益，或者比正常更快或更好地生长、发育或收益的能力；或者当经受减少量的可用/施加的水(水输入)或在缺水胁迫的条件下或在急性或慢性干旱的条件下时，植物正常生长、发育或收益的能力。
如本文所用，“干旱胁迫”是指导致缺水和使植物经受对植物组织的胁迫和/或损害和/或负面地影响谷物/作物产量的干燥期(急性或慢性/长期)；导致缺水和/或更高温度和使植物经受对植物组织的胁迫和/或损害和/或负面地影响谷物/作物产量的干燥期(急性或慢性/长期)。
如本文所用，“缺水”是指提供的水少于植物充分/成功生长和发育所需的最佳量的条件或环境。
如本文所用，“水分胁迫”(water stress)是指提供的水量比植物/作物的充分/成功生长和发育所需的量更不适当(更少/不足或更多/过量)的条件或环境，从而使植物经受对植物组织的胁迫和/或损害和/或不利地影响谷粒/作物产量。
如本文所用，“缺水胁迫”(water deficit stress)是指提供的水量比植物/作物的充分/成功生长和发育所需的水量更少/不足、从而使植物经受对植物组织的胁迫和/或损害和/或不利地影响谷粒产量的条件或环境。
如本文中所用，术语“核酸”、“核酸分子”、“核苷酸序列”和“多核苷酸”指线性或分支的、单链或双链的RNA或DNA，或其杂交体。该术语还包括RNA/DNA杂交体。当合成产生dsRNA时，不太常见的碱基，诸如肌苷、5-甲基胞嘧啶、6-甲基腺嘌呤、次黄嘌呤等也可用于反义、dsRNA和核酶配对。例如，含有尿苷和胞苷的C-5丙炔类似物的多核苷酸已经显示出以高亲和力结合RNA，并且是基因表达的强效反义抑制剂。也可以进行其他修饰，诸如对磷酸二酯骨架或RNA的核糖基团中的2’-羟基的修饰。
如本文中所用，术语“核苷酸序列”是指核苷酸的杂聚物或这些核苷酸从核酸分子的5’末端至3'末端的序列，包括DNA或RNA分子，包括cDNA、DNA片段或部分、基因组DNA、合成的(例如化学合成的)DNA、质粒DNA、mRNA和反义RNA，其中任一种都可以是单链或双链的。术语“核苷酸序列”、“核酸”、“核酸分子”、“核酸构建体”、“寡核苷酸”和“多核苷酸”在本文中也可互换使用，是指核苷酸的杂多聚体。本文提供的核酸分子和/或核苷酸序列在本文中以从左至右的5’至3’方向呈现，并且使用美国测序规则37CFR§§1.821-1.825和世界知识产权组织(WIPO)标准ST.25中阐述的用于表示核苷酸特征的标准代码来表示。如本文中所用，“5’区”可以指多核苷酸的最靠近多核苷酸5’末端的区域。因此，例如，多核苷酸的5’区中的元件可以位于从位于所述多核苷酸的5’末端的第一个核苷酸至位于该多核苷酸中间的核苷酸的任何位置。如本文中所用，“3’区”可以指多核苷酸的最靠近多核苷酸3’末端的区域。因此，例如，多核苷酸的3’区中的元件可以位于从位于所述多核苷酸的3’末端的第一个核苷酸至位于该多核苷酸中间的核苷酸的任何位置。
如本文中关于核酸所使用的，术语“片段”或“部分”是指相对于参考核酸而言长度缩短(例如缩短1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、20、40、50、60、70、80、90、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、200、210、220、230、240、250、260、270、280、290、300、310、320、330、340、350、400、450、500、550、600、650、700、750、800、850或900个或更多个核苷酸或者其间的任何范围或数值)的核酸，并且其包含与所述参考核酸的相应部分相同或几乎相同(例如70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％相同)的连续核苷酸的核苷酸序列、基本上由所述核苷酸序列组成和/或由所述核苷酸序列组成。如果合适，这种核酸片段可以包含在更大的多核苷酸中作为其组分。例如，本发明的指导核酸的重复序列可以包含野生型CRISPR-Cas重复序列(例如野生型CRISPR-Cas重复序列；例如来自例如Cas9、Cas12a(Cpf1)、Cas12b、Cas12c(C2c3)、Cas12d(CasY)、Cas12e(CasX)、Cas12g、Cas12h、Cas12i、C2c4、C2c5、C2c8、C2c9、C2c10、Cas14a、Cas14b和/或Cas14c等的CRISPR Cas***的重复)的“部分”。
在一些实施方案中，核酸片段可包含编码CLE多肽的核酸的约5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、200、210、220、230、240、250、260、270、280、285、290、300、310、320、330、340、350、360、370、380、390、395、396、397、398、399、400、410、411、412、413、414、415、420、425、430、435、440、445、450或500或者更多个连续核苷酸或者其中的任何范围或数值，基本上由其组成或由其组成，任选地，CLE基因的片段可以是约5、6、7、8、9、10个连续核苷酸至约35、36、37、3839或40个连续核苷酸长，约85、90、95、100个连续核苷酸至约300、320、350、375、400或更多个连续核苷酸长，或其中的任何范围或数值。在一些实施方案中，编码CLE多肽的核酸的片段可以是约36个连续核苷酸长。
在一些实施方案中，“序列特异性核酸结合结构域”可与编码例如本文所述的CLE多肽的核苷酸序列(例如DNA、RNA)的一个或多个片段或部分结合。
如本文关于多肽所使用的，术语“片段”或“部分”可指相对于参考多肽而言长度缩短的多肽，其包含与所述参考多肽的相应部分相同或几乎相同(例如90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％相同)的连续氨基酸的氨基酸序列或基本上由所述氨基酸序列组成或由所述氨基酸序列组成。在适当的情况下，这种多肽片段可以包含在一个更大的多肽中作为其构成部分。在一些实施方案中，所述多肽片段包含参考多肽的至少约2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、125、150、175、200、225、250、260、270、280或290个或更多个连续氨基酸，基本上由所述连续氨基酸组成或由所述连续氨基酸组成。在一些实施方式中，多肽片段可包含CLE多肽的约10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、111、112、113、114、115、116、117、118、119、120、121、122、123、124、125、126、127、128、129、130、131、132、133、134、135或136或更多个连续氨基酸残基，或其间的任何范围或数值(例如SEQ ID NO：66-68的片段或部分(例如SEQ ID NO：69-71))，基本上由其组成或由其组成。
在一些实施方案中，这种缺失可以是显性阴性等位基因、半显性等位基因、弱的功能损失等位基因、无效等位基因或亚效突变(hypomorphic mutation)，其被包含在植物中时可以导致植物与不包含所述缺失的植物相比表现出增加的穗行数。在一些实施方式中，这样的植物还可表现出增加的产量和增加的线虫抗性，以及更大的分生组织。可以在多于一个位置编辑CLE基因，从而提供包含多于一个突变的CLE基因。在一些实施方案中，如本文所述突变的CLE多肽可能包含多于一个编辑，其可能导致具有多于一个氨基酸取代的肽。
在一些实施方案中，针对核酸的“部分”是指来自基因(例如CLE基因)的至少2、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、200、210、220、230、240、250、260、270、280、285、290、300、310、320、330、340、350、360、370、380、390、395、396、397、398、399、400、410、411、412、413、414、415、420、425、430、435、440、445、450或500个或更多个连续的核苷酸。在一些实施方案中，编码CLE多肽的基因组序列的部分可以长度为约285、399或411个连续核苷酸(例如SEQ ID NO：78-80；例如CLE编码序列)。在一些实施方案中，CLE多肽基因的部分可以长度为约36个连续核苷酸(例如SEQ ID NO：81-83)。在一些实施方案中，针对多肽的“部分”意指来自多肽(例如CLE多肽)的至少10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52个或更多个连续氨基酸残基。在一些实施方案中，CLE多肽的“部分”可以具有约12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32或更多个连续氨基酸残基(例如SEQ IDNO：72或SEQ ID NO：73的氨基酸残基53-104、63-94、73-84；或者SEQ ID NO：74的氨基酸残基78-129、88-119、98-109)。
如本文关于核酸所使用的，术语“功能性片段”是指编码多肽的功能性片段的核酸。
如本文中所用，术语“基因”是指能够用于产生mRNA、反义RNA、miRNA、抗微小RNA反义寡脱氧核糖核苷酸(AMO)等的核酸分子。基因可以能够用于或不能够用于产生功能性蛋白质或基因产物。基因可以包括编码区和非编码区(例如内含子、调控元件、启动子、增强子、终止序列和/或5’和3’非翻译区)。基因可以是“分离的”，其是指核酸实质性或基本上不含通常被发现与以其天然状态存在的所述核酸相关联的组分。此类组分包括来自重组生产的其他细胞材料、培养基和/或用于化学合成所述核酸的各种化学物质。
术语“突变”是指点突变(例如错义或无义，或导致移框的单个碱基对的***或缺失)、***、缺失和/或截短。当突变是氨基酸序列中的残基被另一个残基取代，或者序列中一个或多个残基的缺失或***时，通常通过列出原始残基、随后是该残基在所述序列中的位置以及新取代的残基的身份来描述突变。截短可包括在多肽的C末端或在多肽的N末端的截短。多肽的截短可以是编码所述多肽的基因的相应5’端或3’端的缺失的结果。当将一个或多个碱基对的缺失或***引入基因时，可以发生移框突变。基因中的移框突变可以导致产生与野生型多肽相比更长、更短或相同长度的多肽，这取决于第一终止密码子在所述基因的突变区域之后何时出现。在一些实施方案中，突变可以是约10至约2000个连续碱基对的DNA颠换。
如本文中所用，术语“互补的”或“互补性”是指多核苷酸在允许的盐和温度条件下通过碱基配对的天然结合。例如，序列“A-G-T”(5’至3’)与互补序列“T-C-A”(3’至5’)结合。两个单链分子之间的互补性可以是“部分的”，其中只有一些核苷酸结合，或者当单链分子之间存在完全互补性时，互补性可以是完全的。核酸链之间的互补程度对核酸链之间杂交的效率和强度有显著影响。
如本文中所用，“互补”可以指与比较核苷酸序列有100％互补性，或者其可以指与比较核苷酸序列有小于100％互补性(例如约70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％等的互补性)。
具有同源性的不同核酸或蛋白质在本文中被称为“同源物”。术语同源物包括来自相同物种和其他物种的同源序列以及来自相同物种和其他物种的直向同源序列。“同源性”是指两个或更多个核酸和/或氨基酸序列之间以位置同一性百分比(即，序列相似性或同一性)表示的相似性水平。同源性也指不同核酸或蛋白质之间相似功能特性的概念。因此，本发明的组合物和方法还包含与本发明核苷酸序列和多肽序列的同源物。如本文中所用，“直向同源”是指在物种形成期间从共同的祖先基因产生的不同物种中的同源核苷酸序列和/或氨基酸序列。本发明核苷酸序列的同源物与本发明的所述核苷酸序列具有实质性的序列同一性(例如至少约70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、99.5％或100％)。
如本文中所用，“序列同一性”是指两个最佳比对的多核苷酸或多肽序列在组分(例如核苷酸或氨基酸)比对窗口中不变的程度。“同一性”可以通过已知的方法容易地计算，所述方法包括、但不限于在以下文献中描述的方法：Computational MolecularBiology(Lesk,A.M.编辑)Oxford University Press,New York(1988)；Biocomputing:Informatics and Genome Projects(Smith,D.W.编辑)Academic Press,New York(1993)；Computer Analysis of Sequence Data,Part I(Griffin,A.M.和Griffin,H.G.编辑)Humana Press,New Jersey(1994)；Sequence Analysis in Molecular Biology(vonHeinje,G.编辑)Academic Press(1987)；和Sequence Analysis Primer(Gribskov,M.和Devereux,J.编辑)Stockton Press,New York(1991)。
如本文中所用，术语“序列同一性百分比”或“同一性百分比”是指当两个序列最佳比对时，参考(“查询”)多核苷酸分子(或其互补链)的线性多核苷酸序列中与测试(“受试”)多核苷酸分子(或其互补链)的线性多核苷酸序列中相同核苷酸的百分比。在一些实施方案中，“序列同一性百分比”可以指与参照多肽相比，氨基酸序列中相同氨基酸的百分比。
如本文中所用，在两个核酸分子、核苷酸序列或多肽序列的上下文中，短语“实质性同一”/“实质性相同”或“实质性同一性”是指两个或更多个序列或亚序列在就最大对应性进行比较和比对时，具有如使用以下序列比较算法之一或通过目测检查所测量的至少约70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、99.5％或100％核苷酸或氨基酸残基同一性。在本发明的一些实施方案中，实质性同一性存在于本发明核苷酸序列的连续核苷酸区域中，所述连续核苷酸区域的长度为约10个核苷酸至约20个核苷酸、约10个核苷酸至约25个核苷酸、约10个核苷酸至约30个核苷酸、约15个核苷酸至约25个核苷酸、约30个核苷酸至约40个核苷酸、约50个核苷酸至约60个核苷酸、约70个核苷酸至约80个核苷酸、约90个核苷酸至约100个核苷酸、约100个核苷酸至约200个核苷酸、约100个核苷酸至约300个核苷酸、约100个核苷酸至约400个核苷酸、约100个核苷酸至约500个核苷酸、约100个核苷酸至约600个核苷酸、约100个核苷酸至约800个核苷酸、约100个核苷酸至约900个核苷酸、或更多个核苷酸，或者其间的任何范围，直至序列的全长。在一些实施方案中，核苷酸序列可以在至少约20个核苷酸(例如约20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、50、60、70或80个核苷酸或更多个)上实质性相同。
在本发明的一些实施方案中，实质性同一性存在于本发明多肽的连续氨基酸残基区域上，其为长度为约3个氨基酸残基至约20个氨基酸残基、约5个氨基酸残基至约25个氨基酸残基、约7个氨基酸残基至约30个氨基酸残基、约10个氨基酸残基至约25个氨基酸残基、约15个氨基酸残基至约30个氨基酸残基、约20个氨基酸残基至约40个氨基酸残基、约25个氨基酸残基至约40个氨基酸残基、约25个氨基酸残基至约50个氨基酸残基、约30个氨基酸残基至约50个氨基酸残基、约40个氨基酸残基至约50个氨基酸残基、约40个氨基酸残基至约70个氨基酸残基、约50个氨基酸残基至约70个氨基酸残基、约60个氨基酸残基至约80个氨基酸残基、约70个氨基酸残基至约80个氨基酸残基、约90个氨基酸残基至约100个氨基酸残基，或更多个氨基酸残基，以及其中的任何范围，直至序列的全长。在一些实施方案中，多肽序列可以在至少约8个连续的氨基酸残基(例如长度约8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、111、112、113、114、115、116、117、118、119、120、130、140、150、175、200、225、250、300、350个或更多个氨基酸，或更多连续氨基酸残基)上彼此实质性相同。在一些实施方式中，两种或更多种CLE多肽可以相同或基本上相同(例如至少70％至99.9％相同)；例如约70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、99.5％、99.9％相同或其间的任何范围或数值。
对于序列比较，通常一个序列作为与测试序列进行比较的参考序列。当使用序列比较算法时，将测试序列和参考序列输入计算机，如果需要，指定子序列坐标，并指定序列算法程序参数。然后，序列比较算法基于指定的程序参数，计算一个或多个测试序列相对于参考序列的序列同一性百分比。
用于比对比较窗口的序列的最佳比对是本领域技术人员公知的，并且可以通过诸如以下的工具进行：Smith和Waterman的局部同源性算法、Needleman和Wunsch的同源性比对算法、Pearson和Lipman的相似性搜索方法，以及任选地通过这些算法的计算机化实现(诸如GAP、BESTFIT、FASTA和TFASTA(可作为
Figure BDA0004000020750000301
Wisconsin
Figure BDA0004000020750000311
(AccelrysInc.,San Diego,Ca)的一部分获得))进行。测试序列和参考序列的比对区段的“同一性分数”是两个比对的序列共有的相同组分的数目除以参考序列区段(例如整个参考序列或参考序列的较小确定部分)中组分的总数。序列同一性百分比表示为同一性分数乘以100。一个或多个多核苷酸序列的比较可以是与全长多核苷酸序列或其一部分的比较，或者是与更长的多核苷酸序列的比较。出于本发明的目的，对于翻译的核苷酸序列，也可以使用BLASTX2.0版，对于多核苷酸序列，使用BLASTN 2.0版来确定“同一性百分比”。
当两个核苷酸序列在严格条件下相互杂交时，也可以认为这两个序列是实质性互补的。在一些实施方案中，被认为实质性互补的两个核苷酸序列在高度严格条件下相互杂交。
核酸杂交实验如Southern和Northern杂交上下文中的“严格杂交条件”和“严格杂交洗涤条件”是序列依赖性的，并且在不同的环境参数下是不同的。核酸杂交的详细指南可见于Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology-Hybridizationwith Nucleic Acid Probes第I部分第2章"Overview of principles of hybridizationand the strategy of nucleic acid probe assays”，Elsevier,New York(1993)。通常，在确定的离子强度和pH下，高度严格的杂交和洗涤条件被选择为比具体序列的热熔点(Tm)低约5℃。
Tm是50％的靶序列与完全匹配的探针杂交时的温度(在确定的离子强度和pH下)。选择非常严格的条件，使其等于特定探针的Tm。在Southern或Northern印迹中，用于具有超过100个互补残基的互补核苷酸序列在滤膜上杂交的严格杂交条件的实例是42℃下的50％甲酰胺和1mg肝素，其中杂交进行过夜。高度严格的洗涤条件的实例是在72℃下用0.1 5MNaCl洗涤约15分钟。严格洗涤条件的实例是在65℃下用0.2x SSC洗涤15分钟(关于SSC缓冲液的描述，参见Sambrook，同下)。通常，高严格洗涤之前是低严格性洗涤，以去除背景探针信号。对于例如超过100个核苷酸的双链体，中等严格洗涤的实例是在45℃下用1x SSC洗涤15分钟。对于例如超过100个核苷酸的双链体，低严格洗涤的实例是在40℃下用4-6x SSC洗涤15分钟。对于短探针(例如约10至50个核苷酸)，严格条件通常涉及小于约1.0M Na离子的盐浓度，在pH 7.0至8.3下通常为约0.01至1.0M Na离子浓度(或其他盐)，并且温度通常为至少约30℃。还可通过加入诸如甲酰胺等去稳定剂来达到严格条件。一般来说，在特定的杂交测定中，信噪比为对于无关探针观察的信噪比的2倍(或更高)表明检测到了特异性杂交。如果在严格条件下不相互杂交的核苷酸序列编码的蛋白质实质性相同，则所述核苷酸序列仍然是实质性相同的。这可以在例如使用遗传密码所允许的最大密码子简并性产生核苷酸序列的拷贝时发生。
可以对本发明的多核苷酸和/或重组核酸构建体(例如表达盒和/或载体)进行密码子优化以用于表达。在一些实施方案中，可以对本发明编辑***的多核苷酸、核酸构建体、表达盒和/或载体(例如包含/编码序列特异性核酸结合结构域(例如DNA结合结构域)(例如来自多核苷酸引导的核酸内切酶、锌指核酸酶、转录激活因子样效应核酸酶(TALEN)、Argonaute蛋白和/或CRISPR-Cas核酸内切酶(例如CRISPR-Cas效应子蛋白)(例如I型CRISPR-Cas效应子蛋白、II型CRISPR-Cas效应子蛋白、III型CRISPR-Cas效应子蛋白、IV型CRISPR-Cas效应子蛋白、V型CRISPR-Cas效应子蛋白或VI型CRISPR-Cas效应子蛋白)、核酸酶(例如核酸内切酶(例如Fok1)、多核苷酸引导的核酸内切酶、CRISPR-Cas核酸内切酶(例如CRISPR-Cas效应子蛋白)、锌指核酸酶和/或转录激活因子样效应核酸酶(TALEN))、脱氨酶蛋白/结构域(例如腺嘌呤脱氨酶、胞嘧啶脱氨酶)、编码逆转录酶或结构域的多核苷酸、编码5'-3’核酸外切酶多肽的多核苷酸和/或亲和多肽、肽标签等的序列特异性核酸结合结构域)进行密码子优化，以用于在植物中表达。在一些实施方案中，本发明的经密码子优化的核酸、多核苷酸、表达盒和/或载体与未经密码子优化的参考核酸、多核苷酸、表达盒和/或载体具有约70％至约99.9％(例如70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、99.5％、99.9％或100％)同一性或更高同一性。
在本文所述的任何实施方案中，本发明的多核苷酸或核酸构建体可以与多种启动子和/或其它调控元件可操作地连接，用于在植物和/或植物细胞中表达。因此，在一些实施方案中，本发明的多核苷酸或核酸构建体还可包含与一个或多个核苷酸序列可操作地连接的一个或多个启动子、内含子、增强子和/或终止子。在一些实施方案中，启动子可以与内含子(例如Ubi1启动子和内含子)可操作地相关联。在一些实施方案中，与内含子相关联的启动子可被称为“启动子区”(例如Ubi1启动子和内含子)。
如本文中提及多核苷酸时使用的“可操作地连接”或“可操作地相关联的”是指所示元件在功能上彼此相关，并且通常在物理上也相关。因此，如本文中所用，术语“可操作地连接”或“可操作地相关联的”是指单个核酸分子上功能上相关联的核苷酸序列。因此，与第二核苷酸序列可操作连接的第一核苷酸序列意指第一核苷酸序列被放置成与第二核苷酸序列处于功能关系中时的情况。例如，如果启动子实现核苷酸序列的转录或表达，则所述启动子与所述核苷酸序列可操作地相关联。本领域技术人员将会理解，控制序列(例如启动子)不需要与与其可操作地相关联的核苷酸序列毗邻，只要控制序列能够指导其表达即可。因此，例如居间的不翻译、但仍转录的核酸序列可存在于启动子与所述核苷酸序列之间，并且所述启动子仍然可以被认为是可与该核苷酸序列“可操作地连接”。
如本文中所用，涉及多肽时，术语“连接的”是指一个多肽与另一个多肽的附接。多肽可以直接(例如通过肽键)或通过接头与另一多肽(在N-末端或C-末端)连接。
术语“接头”是本领域公认的，是指连接两个分子或部分(例如,融合蛋白的两个结构域，例如核酸结合多肽或结构域和肽标签和/或逆转录酶和与肽标签结合的亲和多肽；或DNA核酸内切酶多肽或结构域和肽标签和/或逆转录酶和与肽标签结合的亲和多肽)的化学基团或分子。接头可以由单个连接分子组成，或者可以包含不止一个连接分子。在一些实施方案中，接头可以是有机分子、基团、聚合物或化学部分，诸如二价有机部分。在一些实施方案中，接头可以是氨基酸或者其可以是肽。在一些实施方案中，接头是肽。
在一些实施方案中，可用于本发明的肽接头的长度可为约2至约100个或更多个氨基酸，例如，约2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100个或更多个氨基酸(例如长度为约2至约40、约2至约50、约2至约60、约4至约40、约4至约50、约4至约60、约5至约40、约5至约50、约5至约60、约9至约40、约9至约50、约9至约60、约10至约40、约10至约50、约10至约60个，或长度为约2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25个氨基酸至约26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100个或更多个氨基酸(例如长度为约105、110、115、120、130、140、150个或更多个氨基酸))。在一些实施方案中，肽接头可以是GS接头。
如本文中所用，关于多核苷酸的术语“连接的”或“融合的”是指一个多核苷酸与另一个多核苷酸的附接。在一些实施方案中，两个或更多个多核苷酸分子可以通过接头连接，所述接头可以是有机分子、基团、聚合物或化学部分，诸如二价有机部分。多核苷酸可以通过共价或非共价键联或结合(包括例如Watson-Crick碱基配对)或通过一个或多个连接核苷酸与另一个多核苷酸(在5’末端或3’末端)连接或融合。在一些实施方案中，某一结构的多核苷酸基序可***另一多核苷酸序列中(例如引导RNA中发夹结构的延伸)。在一些实施方案中，连接核苷酸可以是天然存在的核苷酸。在一些实施方案中，连接核苷酸可以是非天然存在的核苷酸。
“启动子”是控制或调节与所述启动子可操作地相关联的核苷酸序列(例如编码序列)的转录的核苷酸序列。由启动子控制或调节的编码序列可以编码多肽和/或功能性RNA。通常，“启动子”是指含有RNA聚合酶II的结合位点并指导转录起始的核苷酸序列。通常，相对于相应编码序列的编码区的起始，启动子位于5’或上游。启动子可包含作为基因表达的调控子的其它元件；例如启动子区域。这些包括TATA盒共有序列，并且通常是CAAT盒共有序列(Breathnach和Chambon，(1981)Annu.Rev.Biochem.50:349)。在植物中，CAAT盒可用AGGA盒代替(Messing等，(1983)于Genetic Engineering of Plants,T.Kosuge,C.Meredith和A.Hollaender(编辑),Plenum Press，第211-227页中)。
可用于本发明的启动子可包括例如组成型、诱导型、时间调控型、发育调控型、化学调控型、组织优先型和/或组织特异性启动子，用于制备重组核酸分子，例如“合成核酸构建体”或“蛋白质-RNA复合物”。这些不同类型的启动子是本领域已知的。
启动子的选择可以根据表达的时间和空间要求而变化，也可以根据待转化的宿主细胞而变化。用于许多不同生物体的启动子是本领域公知的。基于本领域的广泛知识，可以为特定目标宿主生物选择合适的启动子。因此，例如，对模式生物中高度组成型表达的基因上游的启动子了解很多，此类知识可以容易地访问并在适当的情况下应用于其它***中。
在一些实施方案中，在植物中有功能的启动子可以与本发明的构建体一起使用。可用于在植物中驱动表达的启动子的非限制性实例包括RubisCo小亚基基因1的启动子(PrbcS1)、肌动蛋白基因的启动子(Pactin)、硝酸还原酶基因的启动子(Pnr)和重复碳酸酐酶基因1的启动子(Pdca1)(参见Walker等人，Plant Cell Rep.23:727-735(2005)；Li等人，Gene 403:132-142(2007)；Li等人，Mol Biol.Rep.37:1143-1154(2010))。PrbcS1和Pactin是组成型启动子，Pnr和Pdca1是诱导型启动子。Pnr受硝酸盐诱导，受铵抑制(Li等人，Gene403:132-142(2007))，Pdca1受盐诱导(Li等人，Mol Biol.Rep.37:1143-1154(2010))。在一些实施方案中，可用于本发明的启动子是RNA聚合酶II(Pol II)启动子。在一些实施方案中，来自玉米的U6启动子或7SL启动子可用于本发明的构建体。在一些实施方案中，来自玉米的U6c启动子和/或7SL启动子可用于驱动指导核酸的表达。在一些实施方案中，来自大豆的U6c启动子、U6i启动子和/或7SL启动子可用于本发明的构建体。在一些实施方案中，来自大豆的U6c启动子、U6i启动子和/或7SL启动子可用于驱动指导核酸的表达。
可用于植物的组成型启动子的实例包括但不限于，叶香树病毒启动子(cestrumvirus promotet,cmp)(美国专利第7,166,770号)、水稻肌动蛋白1启动子(Wang等人(1992)Mol.Cell.Biol.12:3399-3406；以及美国专利第5,641,876号)、CaMV 35S启动子(Odell等人(1985)Nature313:810-812)、CaMV 19S启动子(Lawton等人(1987)Plant Mol.Biol.9:315-324)、nos启动子(Ebert等人(1987)Proc.Natl.Acad.Sci USA 84:5745-5749)、Adh启动子(Walker等人(1987)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 84:6624-6629)、蔗糖合酶启动子(Yang&Russell(1990)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 87:4144-4148)和遍在蛋白启动子。来源于遍在蛋白的组成型启动子在许多细胞类型中积累。已经从几种植物物种中克隆了遍在蛋白启动子用于转基因植物，例如向日葵(Binet等人，1991.Plant Science 79:87-94)、玉米(Christensen等人，1989，Plant Molec.Biol.12:619-632)和拟南芥(Norris等人1993.Plant Molec.Biol.21:895-906)。已经在转基因单子叶植物***中开发了玉米遍在蛋白启动子(UbiP)，专利公开EP 0 342 926中公开了其序列和构建用于单子叶植物转化的载体。遍在蛋白启动子适用于在转基因植物，尤其是单子叶植物中表达本发明的核苷酸序列。另外，由McElroy等人描述的启动子表达盒(Mol.Gen.Genet.231:150-160(1991))可被容易地修饰以表达本发明的核苷酸序列，并且特别适用于单子叶宿主。
在一些实施方案中，组织特异性/组织偏好启动子可用于在植物细胞中表达异源多核苷酸。组织特异性或偏好性表达模式包括但不限于绿色组织特异性或偏好性、根特异性或偏好性、茎特异性或偏好性、花特异性或偏好性或者花粉特异性或偏好性表达模式。适于在绿色组织中表达的启动子包括许多调节参与光合作用的基因的启动子，这些启动子中的许多启动子已被从单子叶植物和双子叶植物中克隆出来。在一个实施方案中，可用于本发明的启动子是来自磷酸烯醇羧化酶基因的玉米PEPC启动子(Hudspeth&Grula,PlantMolec.Biol.12:579-589(1989))。组织特异性启动子的非限制性实例包括那些与编码种子贮藏蛋白(诸如β-伴大豆球蛋白、十字花科蛋白(cruciferin)、油菜籽蛋白(napin)和菜豆蛋白)、玉米蛋白或油体蛋白(诸如油质蛋白)、或参与脂肪酸生物合成的蛋白(包括酰基载体蛋白、硬脂酰-ACP去饱和酶和脂肪酸去饱和酶(fad 2-1))的基因相关联的启动子，以及在胚胎发育期间表达的其它核酸(诸如Bce4，参见例如Kridl等人(1991)Seed Sci.Res.1:209-219；以及欧洲专利第255378号)。可用于在植物，特别是玉米中表达本发明核苷酸序列的组织特异性或组织偏好性启动子包括但不限于在根、髓、叶或花粉中指导表达的启动子。此类启动子公开于例如WO 93/07278(通过引用以其整体并入本文)中。可用于本发明的组织特异性或组织偏好性启动子的其它非限制性实例：美国专利6,040,504中公开的棉花rubisco启动子；美国专利5,604,121中公开的水稻蔗糖合酶启动子；de Framond(FEBS290:103-106(1991)；属于Ciba-Geigy的EP 0 452 269)描述的根特异性启动子；美国专利5,625,136(属于Ciba-Geigy)中描述的茎特异性启动子，其驱动玉米trpA基因的表达；WO01/73087中公开的夜香树夜香树黄叶卷曲病毒启动子；和花粉特异性或偏好性启动子，包括但不限于来自水稻的ProOsLPS10和ProOsLPS11(Nguyen等人，PlantBiotechnol.Reports 9(5):297-306(2015))、来自玉米的ZmSTK2_USP(Wang等人，Genome60(6):485-495(2017))、来自番茄的LAT52和LAT59(Twell等人，Development 109(3):705-713(1990))、Zm13(美国专利第10,421,972号)、来自拟南芥的PLA2-δ启动子(美国专利第7,141,424号)和/或来自玉米的ZmC5启动子(国际PCT公布第WO1999/042587号)。
植物组织特异性/组织偏好性启动子的其他实例包括但不限于根毛特异性顺式元件(RHE)(Kim等人，The Plant Cell 18:2958-2970(2006))、根特异性启动子RCc3(Jeong等人，Plant Physiol.153:185-197(2010))和RB7(美国专利第5459252号)、植物凝集素启动子(Lindstrom等人(1990)Der.Genet.11:160-167；和Vodkin(1983)Prog.Clin.Biol.Res.138:87-98)、玉米醇脱氢酶1启动子(Dennis等人(1984)NucleicAcids Res.12:3983-4000)、S-腺苷-L-甲硫氨酸合成酶(SAMS)(Vander Mijnsbrugge等人(1996)Plant and Cell Physiology,37(8):1108-1115)、玉米光收获复合物启动子(Bansal等人(1992)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89:3654-3658)、玉米热休克蛋白启动子(O'Dell等人(1985)EMBO J.5:451-458；和Rochester等人(1986)EMBO J.5:451-458)、豌豆小亚基RuBP羧化酶启动子(Cashmore,"Nuclear genes encoding the small subunit ofribulose-l,5-bisphosphate carboxylase”第29-39页:Genetic Engineering of Plants(Hollaender编辑，Plenum Press 1983；和Poulsen等人(1986)Mol.Gen.Genet.205:193-200)、Ti质粒甘露碱合酶启动子(Langridge等人(1989)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86:3219-3223)、Ti质粒胭脂氨酸合酶启动子(Langridge等人(1989)，同上)，矮牵牛查尔酮异构酶启动子(van Tunen等人(1988)EMBO J.7:1257-1263)、大豆富含甘氨酸蛋白1启动子(Keller等人(1989)Genes Dev.3:1639-1646)、截短的CaMV 35S启动子(O'Dell等人(1985)Nature 313:810-812)、马铃薯块茎储藏蛋白(patatin)启动子(Wenzler等人(1989)PlantMol.Biol.13:347-354)、根细胞启动子(Yamamoto等人(1990)Nucleic Acids Res.18:7449)、玉米醇溶蛋白启动子(Kriz等人(1987)Mol.Gen.Genet.207:90-98；Langridge等人(1983)Cell 34:1015-1022；Reina等人(1990)Nucleic Acids Res.18:6425；Reina等人(1990)Nucleic Acids Res.18:7449；和Wandelt等人(1989)Nucleic Acids Res.17:2354)、球蛋白-1启动子(Belanger等人(1991)Genetics 129:863-872)、α-微管蛋白cab启动子(Sullivan等人(1989)Mol.Gen.Genet.215:431-440)、PEPCase启动子(Hudspeth&Grula(1989)Plant Mol.Biol.12:579-589)、R基因复合物相关启动子(Chandler等人(1989)Plant Cell 1:1175-1183)和查尔酮合酶启动子(Franken等人(1991)EMBO J.10:2605-2612)。
对种子特异性表达有用的是豌豆的豌豆球蛋白启动子(Czako等人(1992)Mol.Gen.Genet.235:33-40)；以及美国专利第5,625,136号中公开的种子特异性启动子。用于在成熟叶中表达的有用启动子是那些在衰老开始时被转换的启动子，诸如来自拟南芥的SAG启动子(Gan等人(1995)Science 270:1986-1988)。
另外，可以使用在叶绿体中有功能的启动子。此类启动子的非限制性实例包括噬菌体T3基因9的5’UTR和美国专利第7,579,516号中公开的其他启动子。可用于本发明的其它启动子包括但不限于S-E9小亚基RuBP羧化酶启动子和Kunitz胰蛋白酶抑制剂基因启动子(Kti3)。
可用于本发明的其它调控元件包括但不限于内含子、增强子、终止序列和/或5’和3’非翻译区。
可用于本发明的内含子可以是从植物中鉴定和分离的内含子，然后被***到用于植物转化的表达盒。如本领域技术人员所理解的，内含子可以包含自我切除所需的序列，并被框内整合到核酸构建体/表达盒中。内含子可以用作间隔子来分隔一个核酸构建体中的多个蛋白质编码序列，或者可在一个蛋白质编码序列内部使用内含子来例如稳定mRNA。如果它们被用在蛋白质编码序列中，则它们被***“框内”，其中包括切除位点。还可将内含子与启动子结合以改善或修饰表达。例如，可用于本发明的启动子/内含子组合包括但不限于玉米Ubi1启动子和内含子的组合(参见例如SEQ ID NO：21和SEQ ID NO：22)。
可用于本发明的内含子的非限制性实例包括来自ADHI基因(例如Adh1-S内含子1、2和6)、遍在蛋白基因(Ubi1)、RuBisCO小亚基(rbcS)基因、RuBisCO大亚基(rbcL)基因、肌动蛋白基因(例如肌动蛋白-1内含子)、丙酮酸脱氢酶激酶基因(pdk)、硝酸还原酶基因(nr)、重复碳酸酐酶基因1(Tdca1)、psbA基因、atpA基因或其任意组合的内含子。
在一些实施方案中，本发明的多核苷酸和/或核酸构建体可以是“表达盒”或可以包含在表达盒内。如本文中所用，“表达盒”意指包含例如一种或多种本发明的多核苷酸的重组核酸分子(例如编码序列特异性核酸结合结构域的多核苷酸、编码脱氨酶蛋白或结构域的多核苷酸、编码逆转录酶蛋白或结构域的多核苷酸、编码5’-3’核酸外切酶多肽或结构域的多核苷酸、指导核酸和/或逆转录酶(RT)模板)，其中一种或多种多核苷酸与一种或多种控制序列(例如启动子、终止子等)可操作地相关联。因此，在一些实施方案中，可以提供一个或多个表达盒，其被设计成表达例如本发明的核酸构建体(例如编码序列特异性核酸结合结构域的多核苷酸、编码核酸酶多肽/结构域的多核苷酸、编码脱氨酶蛋白/结构域的多核苷酸、编码逆转录酶蛋白/结构域的多核苷酸、编码5’-3’核酸外切酶多肽/结构域的多核苷酸、编码肽标签的多核苷酸和/或编码亲和多肽的多核苷酸等，或者包含指导核酸、延伸的指导核酸和/或RT模板等)。当本发明的表达盒包含不止一个多核苷酸时，所述多核苷酸可以与驱动所有多核苷酸表达的单个启动子可操作地连接，或者所述多核苷酸可以与一个或多个单独的启动子可操作地连接(例如三个多核苷酸可以由一个、两个或三个启动子以任意组合驱动)。当使用两个或更多个不同的启动子时，所述启动子可以是相同的启动子，也可以是不同的启动子。因此，当包含在单个表达盒中时，编码序列特异性核酸结合结构域的多核苷酸、编码核酸酶蛋白/结构域的多核苷酸、编码CRISPR-Cas效应子蛋白/结构域的多核苷酸、编码脱氨酶蛋白/结构域的多核苷酸、编码逆转录酶多肽/结构域的多核苷酸(例如RNA依赖性DNA聚合酶)、和/或编码5’-3’核酸外切酶多肽/结构域的多核苷酸、指导核酸、延伸的指导核酸和/或RT模板可以各自与单个启动子或任意组合的独立启动子可操作地连接。
包含本发明的核酸构建体的表达盒可以是嵌合的，意味着其至少一个(例如一个或多个)组分相对于其至少一个其它组分是异源的(例如来自宿主生物的启动子可操作地连接到将在该宿主生物中表达的感兴趣多核苷酸，其中所述感兴趣多核苷酸来自不同于宿主的生物体，或者通常被发现不与该启动子相关联)。表达盒也可以是天然存在的，但已经以用于异源表达的重组形式获得的表达盒。
表达盒可以任选地包括转录和/或翻译终止区(即终止区)和/或在所选宿主细胞中有功能的增强子区。多种转录终止子和增强子是本领域已知的，并且可获得用于表达盒中。转录终止子负责转录的终止和正确的mRNA多聚腺苷酸化。终止区和/或增强子区对于转录起始区可以是天然的，对于例如编码序列特异性核酸结合蛋白的基因、编码核酸酶的基因、编码逆转录酶的基因、编码脱氨酶的基因等可以是天然的，或者可以是宿主细胞天然的，或者可以是另一来源天然的(例如对于例如启动子、编码序列特异性核酸结合蛋白的基因、编码核酸酶的基因、编码逆转录酶的基因、编码脱氨酶的基因等，或对于宿主细胞或其任意组合是外来的或异源的)。
本发明的表达盒还可包括编码选择标记的多核苷酸，其可用于选择转化的宿主细胞。如本文中所用，“选择标记”是指这样的多核苷酸序列，当其被表达时，对表达该标记的宿主细胞赋予独特的表型，从而使此类转化的细胞与那些不具有该标记的细胞相区别。这种多核苷酸序列可以编码选择标记或可筛选的标记，这取决于该标记是否赋予可通过化学手段，诸如通过使用选择剂(例如抗生素等)选择的性状，或者取决于该标记是否只是可通过观察或测试，诸如通过筛选(例如荧光)鉴定的性状。合适的选择性标记的许多实例是本领域已知的，并且可用于本文所述的表达盒中。
除了表达盒之外，本文所述的核酸分子/构建体和多核苷酸序列也可与载体结合使用。术语“载体”是指用于将核酸(或多种核酸)转移、递送或引入细胞的组合物。载体包含含有待转移、递送或引入的一种或多种核苷酸序列的核酸构建体(例如表达盒)。用于转化宿主生物体的载体是本领域公知的。一般类别的载体的非限制性实例包括呈双链或单链线性或环状形式的病毒载体、质粒载体、噬菌体载体、噬菌粒载体、粘粒载体、fosmid载体、噬菌体、人工染色体、微环或土壤杆菌(Agrobacterium)二元载体，其可以是或可以不是自我传递的或可移动的。在一些实施方案中，病毒载体可以包括但不限于逆转录病毒、慢病毒、腺病毒、腺相关病毒或单纯疱疹病毒载体。本文定义的载体可以通过整合入细胞基因组或存在于染色体外(例如具有复制起点的自主复制质粒)来转化原核或真核宿主。另外还包括穿梭载体，所述穿梭载体是指天然地或通过设计能够在两种不同的宿主生物体中复制的DNA媒介物，所述宿主生物体可选自放线菌(actinomycetes)和相关物种、细菌和真核生物(例如高等植物、哺乳动物、酵母或真菌细胞)。在一些实施方案中，载体中的核酸处于合适的启动子或用于在宿主细胞中转录的其他调控元件的控制之下，并与其可操作地连接。载体可以是在多种宿主中起作用的双功能表达载体。在基因组DNA的情况下，这可能包含其自身的启动子和/或其它调控元件，而在cDNA的情况下，这可能处于合适的启动子和/或其它调控元件的控制之下，以便在宿主细胞中表达。因此，本发明的核酸或多核苷酸和/或包含其的表达盒可以包括在本文所述和本领域已知的载体中。
如本文中所用，“接触(contact)”、“接触(contacting)”、“接触(contacted)”及其语法变型是指在适于进行所需反应(例如转化、转录控制、基因组编辑、产生切口和/或切割)的条件下，将所需反应的组分放置在一起。例如，可在序列特异性DNA结合蛋白、逆转录酶和/或脱氨酶被表达并且序列特异性核酸结合蛋白与靶核酸结合的条件下，将靶核酸与序列特异性核酸结合蛋白(例如多核苷酸引导的核酸内切酶、CRISPR-Cas核酸内切酶(例如CRISPR-Cas效应子蛋白)、锌指核酸酶、转录激活因子样效应核酸酶(TALEN)和/或Argonaute蛋白))和脱氨酶或编码其的核酸构建体接触，并且可将逆转录酶和/或脱氨酶与序列特异性核酸结合蛋白融合，或者募集到序列特异性核酸结合蛋白(例如通过与序列特异性核酸结合蛋白融合的肽标签和与逆转录酶和/或脱氨酶融合的亲和标签)，因此，脱氨酶和/或逆转录酶位于靶核酸附近，从而修饰所述靶核酸。可以使用利用其他蛋白质-蛋白质相互作用募集逆转录酶和/或脱氨酶的其他方法，并且还可将RNA-蛋白质相互作用和化学相互作用用于蛋白质-蛋白质和蛋白质-核酸募集。
如本文中所用，涉及靶核酸的“修饰(modifying)”或“修饰(modification)”包括编辑(例如突变)、共价修饰、交换/取代核酸/核苷酸碱基、删除、切割、切刻和/或改变靶核酸的转录控制。在一些实施方案中，修饰可以包括任何类型的一个或多个单碱基改变(SNP)。
在感兴趣多核苷酸的上下文中，“引入(Introducing)”、“引入(introduce)”、“引入(introduced)”(及其语法变型)是指将感兴趣核苷酸序列(例如多核苷酸、RT模板、核酸构建体和/或指导核酸)以使得该核苷酸序列能够进入细胞内部的方式呈递至植物、其植物部分或其细胞。
术语“转化”或“转染”可以互换使用，并且如本文中所用，是指将异源核酸导入细胞。细胞的转化可以是稳定的或瞬时的。因此，在一些实施方案中，可用本发明的多核苷酸/核酸分子稳定转化宿主细胞或宿主生物体(例如植物)。在一些实施方案中，可用本发明的多核苷酸/核酸分子瞬时转化宿主细胞或宿主生物体。
多核苷酸上下文中的“瞬时转化”意指多核苷酸被引入细胞，但不整合到细胞的基因组中。
在引入细胞的多核苷酸的上下文中,“稳定地引入(stably introducing)”或“被稳定地引入(stably introduced)”旨在指引入的多核苷酸被稳定整合到细胞的基因组中，因此细胞被所述多核苷酸稳定地转化。
如本文中所用，“稳定的转化”或“被稳定地转化”意指将核酸分子引入细胞并整合到细胞的基因组中。因此，整合的核酸分子能够被其后代遗传，更具体地，被多个连续世代的后代遗传。如本文中所用，“基因组”包括细胞核和质体基因组，因此包括将核酸整合到例如叶绿体或线粒体基因组中。如本文中所用，稳定的转化也可指保持在染色体外的转基因(例如作为微小染色体或质粒)。
瞬时转化可以通过例如酶联免疫吸附测定(ELISA)或蛋白质印迹来检测，所述测定或蛋白质印迹可以检测由引入生物体的一种或多种转基因编码的肽或多肽的存在。细胞的稳定转化可以通过例如细胞基因组DNA与核酸序列的Southern印迹杂交分析来检测，所述核酸序列与导入生物体(例如植物)的转基因的核苷酸序列特异性杂交。细胞的稳定转化可以通过例如细胞的RNA与核酸序列的Northern印迹杂交测定来检测，所述核酸序列与引入宿主生物体的转基因的核苷酸序列特异性杂交。细胞的稳定转化还可以通过例如聚合酶链式反应(PCR)或本领域公知的其它扩增反应来检测，所述聚合酶链式反应或其它扩增反应使用与转基因的靶序列杂交的特异性引物序列，导致转基因序列的扩增，这可以根据标准方法来检测。转化也可以通过本领域公知的直接测序和/或杂交方案来检测。
因此，在一些实施方案中，本发明的核苷酸序列、多核苷酸、核酸构建体和/或表达盒可以瞬时表达，并且/或者它们可被稳定地整合到宿主生物体的基因组中。因此，在一些实施方案中，本发明的核酸构建体(例如包含如本文所述用于编辑的多核苷酸的一个或多个表达盒)可被瞬时引入具有指导核酸的细胞中，因此，细胞中不保留DNA。
可以通过本领域技术人员已知的任何方法将本发明的核酸构建体引入植物细胞。转化方法的非限制性实例包括通过细菌介导的核酸递送(例如通过土壤杆菌)、病毒介导的核酸递送、碳化硅或核酸晶须介导的核酸递送、脂质体介导的核酸递送、显微注射、微粒轰击、磷酸钙介导的转化、环糊精介导的转化、电穿孔、纳米颗粒介导的转化、超声处理、浸润、PEG介导的核酸摄取以及导致核酸引入植物细胞的任何其他电、化学、物理(机械)和/或生物机制(包括其任意组合)的转化。转化真核生物体和原核生物体的方法是本领域公知的常规方法，并在整个文献中有描述(参见例如Jiang等人2013.Nat.Biotechnol.31:233-239；Ran等人Nature Protocols 8:2281–2308(2013))。本领域已知的各种植物转化方法的一般指南包括Miki等人("Procedures for Introducing Foreign DNA into Plants"inMethods in Plant Molecular Biology and Biotechnology,Glick,B.R.和Thompson,J.E.编辑(CRC Press,Inc.,Boca Raton,1993)，第67-88页)和Rakowoczy-Trojanowska(Cell.Mol.Biol.Lett.7:849-858(2002))。
在本发明的一些实施方案中，细胞的转化可以包括核转化。在其他实施方案中，细胞的转化可以包括质体转化(例如叶绿体转化)。在又一另外的实施方案中，可以通过常规育种技术将本发明的核酸引入细胞。在一些实施方案中，可以通过土壤杆菌转化将多核苷酸、表达盒和/或载体中的一种或多种引入植物细胞。
因此，可以以本领域公知的许多方式将多核苷酸引入植物、植物部分、植物细胞。本发明的方法不依赖于将一种或多种核苷酸序列引入植物的特定方法，仅要它们进入细胞内部即可。当要引入不止一种多核苷酸时，它们可以作为单个核酸构建体的一部分装配，或者作为单独的核酸构建体装配，并且可以位于同一或不同的核酸构建体上。因此，所述多核苷酸可以在单个转化事件中或在分开的转化事件中被引入感兴趣细胞中，或者，多核苷酸可以被整合到植物中作为育种方案的一部分。
本发明提供了用于降低通常作用于限制分生组织尺寸的基因的影响的方法和组合物，以产生具有较大分生组织的植物，以增加穗行数，任选地基本上不减少穗长，以提供改良的产率性状，以及改善对线虫感染的抗性。在一些实施方式中，本发明的方法提供了显性阴性效果，其中基因功能以遗传显性方式降低，允许被引入的突变在杂交作物***中有效和/或当遗传冗余可能是一个问题时有效。
植物表达多种CLAVATA3/EMBRYO SURROUNDING REGION-RELATED(CLV3/ESR-RELATED)CLV3样肽(CLE)，其在植物的不同部分起作用以控制干细胞功能和生长，包括调节分生组织大小。CLE肽由许多富含亮氨酸的重复(LRR)蛋白感测，并且下游信号传导调节植物中的无数生长过程(Fletcher,J.C.,Plants 7:87(2018))。CLE蛋白被表达为更长的前肽原，其被加工成较短的活性肽，作为细胞外配体发挥功能。
因此，如本文所述，编辑技术用于靶向植物中的CLE基因，以改变干细胞稳态，从而产生具有较大分生组织、具有增加的穗行数、增加的产量和改善的线虫抗性的植物。可用于生产表现出增加的穗行数的植物的突变包括例如取代、缺失、***和/或颠换。在一些方面，由编辑技术生成的突变可以是点突变。在一些实施方案中，如本文所述产生的突变可以是显性阴性突变、半显性突变、无效突变、亚效突变或弱的功能损失突变。
CLE基因/肽包括三种相关基因/肽，CLE7(例如，玉米中的ZmCLE7)，拟南芥中的CLV3直系同源物，以及FCP1和CLE14(例如，玉米中的ZmFCP1和ZmCLE14)。在一些实施方式中，本发明描述了编辑内源CLE基因的成熟肽序列，以介导弱的功能损失或对分生组织生长的显性负面影响，从而增加产量。例如，产生导致弱的功能损失的P9L突变，以及提供显性阴性效果的G6T或D8A突变。
在一些实施方案中，本发明提供一种植物或其植物部分，所述植物或植物部分包含编码野生型前体CLE多肽的内源CLAVATA3/EMBRYO SURROUNDING REGION-RELATED(CLV3/ESR-RELATED)(CLE)基因中的至少一个(例如一个或多个)非天然突变。在一些实施方案中，所述至少一个非天然突变提供了显性阴性突变、半显性突变、无效突变、亚效突变和/或弱的功能损失突变。
在一些实施方案中，提供了一种植物细胞，所述植物细胞包含编辑***，所述编辑***包含：(a)CRISPR-Cas效应子蛋白；和(b)指导核酸(例如gRNA、gDNA、crRNA、crDNA、sgRNA、sgDNA)，所述指导核酸包含与编码CLE蛋白的内源性靶基因具有互补性的间隔子序列。所述编辑***可用于在编码CLE蛋白的内源性靶基因中产生突变。在一些实施方案中，所述突变是非天然突变。在一些实施方案中，编辑***的指导核酸可包含SEQ ID NO：101-104(例如，SEQ ID NO：101(FCP1)、SEQ ID NO：102(CLE14)、SEQ ID NO：103(CLE7)、SEQ IDNO：104(CLE7))中任一个的核苷酸序列(间隔子序列，例如一个或多个间隔子)和SEQ IDNO：110-117(例如，SEQ ID NO：110(CLE7)、SEQ ID NO：111(CLE7)、SEQ ID NO：112(FCP1)、SEQ ID NO：113(FCP1)、SEQ ID NO：114(FCP1)、SEQ ID NO：115(CLE14)、SEQ ID NO：116(CLE14)、SEQ ID NO：117(CLE14))中任一个的核苷酸序列(间隔子序列)。
在一些实施方案中，CLE基因的突变在编码成熟CLE肽的内源CLE基因的部分内，并且该突变导致成熟CLE肽与野生型成熟CLE肽相比具有氨基酸取代。
植物、其植物部分或植物细胞的CLE基因中的突变可以是任何类型的突变，包括碱基取代、碱基缺失、碱基***和/或颠换。在一些实施方案中，非天然突变可以包括对A、T、G或C的碱基取代。在一些实施方案中，非天然突变可以是至少一个碱基对(例如1个碱基对至约5个碱基对，例如1、2、3、4、5个连续碱基对)的缺失或至少一个碱基对(例如1个碱基对至约5个碱基对，例如1、2、3、4、5个连续碱基对)的***。在一些实施方案中，非天然突变可以是CLE基因的约10至约2000个连续碱基对的颠换。
在一些实施方案中，CLE基因的突变位于编码成熟CLE肽的内源CLE基因的部分内，并且该突变导致成熟CLE肽与野生型成熟CLE肽相比具有氨基酸取代。在一些实施方案中，所述突变产生位于位置3、5、6、8或9处的一个或更多个取代的氨基酸残基，所述位置是相对于SEQ ID NO：75、SEQ ID NO：76或SEQ ID NO：77的氨基酸位置编号而言的。
可用于本发明的内源CLE基因编码FON2-LIKE CLE PROTEIN1(FCP1)FCP1蛋白、CLE7蛋白或CLE14蛋白。在一些实施方案中，内源CLE基因(例如，靶基因)可以包含与SEQ IDNO：78、SEQ ID NO：79或SEQ ID NO：80的核苷酸序列中的任一个具有至少90％序列同一性的序列，包含与SEQ ID NO：81、SEQ ID NO：82或SEQ ID NO：83的核苷酸序列中的任一个具有至少90％序列同一性的区域；编码与SEQ ID NO：72、SEQ ID NO：73或SEQ ID NO：74具有至少95％序列同一性的序列，或编码具有与SEQ ID NO：75、SEQ ID NO：76或SEQ ID NO：77有至少95％序列同一性的序列的结构域。在一些实施方式中，所述野生型成熟肽包含具有12个氨基酸的长度和在位置1处的R、在位置3处的V、在位置4处的P、在位置6处的G、在位置9处的P、在位置11处的H和在位置12处的H的氨基酸序列，任选地，其中所述野生型加工肽包含SEQ ID NO：75、SEQ ID NO：76或SEQ ID NO：77的氨基酸序列中的任何一个。CLE基因中的示例性非天然突变可以提供突变的CLE基因。内源CLE基因中的示例性非天然突变可以编码突变的CLE蛋白。
在一些实施方案中，CLE肽包含相对于SEQ ID NO：75、SEQ ID NO：76或SEQ ID NO：77中任一个的氨基酸位置编号而言位于位置3、5、6、8或9处的一个或更多个氨基酸残基的突变。在一些实施方案中，所述突变可以是从C到T(C>T)、G到A(G>A)、A到G(A>G)或T到C(T>C)的碱基取代。在一些实施方案中，相对于SEQ ID NO：75、SEQ ID NO：76或SEQ ID NO：77中的任一个的氨基酸位置编号，突变的CLE肽包含位置3处缬氨酸(V)向异亮氨酸(I)或甲硫氨酸(M)、位置5处谷氨酸(E)向赖氨酸(K)、位置6处甘氨酸(G)向苏氨酸(T)、位置8处天冬氨酸(D)向丙氨酸(A)、位置8处天冬氨酸(D)向甘氨酸(G)和/或位置9处脯氨酸(P)向亮氨酸(L)的氨基酸取代(例如，包含V3I、V3M、E5K、G6T、D8A、D8G和/或P9L的突变)。在一些实施方案中，本发明的成熟的突变CLE肽可以包含SEQ ID NO：84-100的任何一个氨基酸序列的序列。
在一些实施方式中，与不具有所述至少一个非天然突变的植物相比，在内源CLE基因中包含至少一个(例如一个或多个)非天然突变的植物(例如玉米植物)表现出增加的穗行数(例如增加2、4、6、8、10、12、14或更多行)。在一些实施方案中，在内源CLE基因中包含至少一个突变的所述植物是展现增加的穗行数的玉米植物。在一些实施方案中，在内源CLE基因中包含至少一个突变的植物是展现增加的产量以及增加的线虫抗性的玉米植物。在一些实施方案中，可以从本发明的植物部分和/或植物细胞再生植物(例如玉米植物)，其中与缺乏相同CLE突变的植物相比，所述再生的植物(例如再生的玉米植物)包含内源性CLE基因中的所述突变，具有增加的穗行数的表型，任选地没有实质性减少穗的长度。
如本文所用，术语“没有实质性减小穗的长度”是指由于如本文所述在一个或多个CLE基因中的一个或多个突变而具有增加的穗行数的穗的长度，其中与在相同CLE基因中缺乏相同突变的植物的穗相比，穗的长度没有减小超过约5％、6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％、15％、for、17％、18％、19％、20％、21％、22％、23％、24％、25％、26％、27％、28％、29％或30％。
在一些实施方案中，提供了玉米植物细胞，所述玉米植物细胞包含内源CLE基因(例如CLE7,CLE14,FCP1)内的至少一个(例如一个或多个)非天然突变，其中所述突变是使用编辑***引入的取代、***、缺失或颠换，所述编辑***包含与CLE基因中的靶位点结合的核酸结合结构域。在一些实施方案中，所述取代、***、缺失或颠换产生显性阴性等位基因、半显性等位基因、弱的功能损失等位基因或亚效等位基因。在一些实施方案中，所述至少一个非天然突变是点突变。在一些实施方案中，CLE基因内的靶位点位于CLE基因的区域内，该区域包含与SEQ ID NO：81、SEQ ID NO：82或SEQ ID NO：83的核苷酸序列具有至少90％序列同一性(例如约90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、99.5、99.6、99.7、99.8、99.9或100％序列同一性)和/或编码与SEQ ID NO：75、SEQ ID NO：76或SEQ ID NO：77的氨基酸序列具有至少95％序列同一性(例如约95、96、97、98、99、99.5、99.5、99.6、99.7、99.8、99.9或100％序列同一性)的序列的序列。在一些实施方式中，所述CLE基因包含与SEQ ID NO：72或SEQ ID NO：73的核苷酸序列具有至少90％序列同一性的序列或者编码与SEQ ID NO：74的氨基酸序列具有至少95％序列同一性的序列。在一些实施方式中，所述突变在由编辑***切割后生成的，所述编辑***包含核酸酶和核酸结合结构域，所述核酸结合结构域结合与SEQ ID NO：81-83的任何一个核苷酸序列具有至少90％序列同一性的序列内的靶位点。在一些实施方案中，相对于SEQ ID NO：75、SEQ ID NO：76或SEQ ID NO：77的氨基酸位置编号而言，所述至少一个非天然突变产生位于位置3、5、6、8或9处的一个或多个取代的氨基酸残基(例如，V3I、V3M、E5K、G6T、D8A、D8G和/或P9L)。在一些实施方案中，所述玉米植物细胞再生成包含所述至少一个非天然突变的玉米植物，并且所述突变导致显性阴性等位基因。在一些实施方案中，从所述玉米植物细胞再生的玉米植物与不包含/缺乏所述等位基因的野生型植物(例如，等基因的野生型植物)相比展现增加的穗行数的表型(任选地没有实质性减少穗的长度；例如，与不包含所述相同CLE突变的植物的穗相比，没有减少穗长度超过约5％、6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％、15％、16％、17％、18％、19％、20％、21％、22％、23％、24％、25％、26％、27％、28％、29％或30％)。
在一些实施方案中，提供了一种产生/培育无转基因的经编辑的玉米植物的方法，所述方法包括：使本发明的玉米植物(例如在一个或多个CLE基因中包含一个或多个突变(例如非天然突变)并且具有增加的穗行数的玉米植物)与无转基因的玉米植物杂交，从而将所述突变引入所述无转基因的玉米植物中；以及选择包含所述突变并且无转基因的后代玉米植物，从而产生无转基因的经编辑的玉米植物。
本文还提供了一种具有增加的穗行数的多个玉米植物的方法，该方法包括在生长区域(例如田地(例如耕作田地、农田)、生长室、温室、娱乐区域、草坪和/或路边等)中种植本发明的两株或更多株玉米植物(例如2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多株玉米植物，其在一个或多个CLE多肽中包含一个或多个突变(例如非天然突变)并且具有增加的穗行数)，从而提供与缺乏所述突变的多个对照玉米植物相比具有增加的穗行数(任选地，没有实质性减小穗长度(例如穗长没有减小超过5-30％))的多个玉米植物。在一些实施方式中，所述多个植物还可以表现出更大的分生组织、增加的产量和增加的线虫抗性。
本发明还提供了一种在成熟玉米CLE肽中产生变异的方法，包括：将编辑***引入玉米植物细胞中，其中所述编辑***靶向编码所述成熟玉米CLE肽蛋白的玉米CLE基因的区域，其中所述区域包含与SEQ ID NO：81、SEQ ID NO：82或SEQ ID NO：83中的任一个氨基酸序列具有至少95％序列同一性的序列，或者所述区域由与SEQ ID NO：81-83中的任一个核苷酸序列具有至少90％序列同一性的序列编码；以及使玉米CLE基因的所述区域与编辑***接触，从而将突变引入玉米植物细胞中成熟玉米CLE肽内；以及在所述成熟玉米CLE肽中产生变异。在一些实施方式中，所述突变可以在由编辑***切割之后进行，所述编辑***包含核酸酶和核酸结合结构域，所述核酸结合结构域结合与SEQ ID NO：81-83的任何一个核苷酸序列具有至少90％序列同一性的序列内的靶位点。
在一些实施方案中，编辑玉米植物细胞的基因组中的特异性位点，所述方法包括：以位点特异性方式切割玉米植物细胞中的内源CLE基因内的靶位点，所述内源CLE基因(a)包含(i)与SEQ ID NO：78-80的任何一个核苷酸序列具有至少90％序列同一性的序列，和/或(ii)与SEQ ID NO：81-83的任何一个核苷酸序列具有至少90％序列同一性的区域；和/或(b)编码(i)与SEQ ID NO：72-74的任何一个氨基酸序列具有至少95％序列同一性的序列；和/或(ii)具有与SEQ ID NO：75-77的任何一个氨基酸序列有至少95％序列同一性的序列的结构域，从而在编码成熟CLE肽的玉米植物细胞的内源基因的部分中产生编辑，并产生在所述内源基因的所述部分中包含所述编辑的植物细胞。
在一些实施方案中，所述编辑导致非天然存在的突变，包括但不限于缺失、取代、***或颠换，其中所述编辑可以导致显性阴性突变、半显性突变、亚效突变或弱的功能损失突变。在一些实施方案中，所述编辑可以是C至T(C>T)、G至A(G>A)、A至G(A>G)或T至C(T>C)的核苷酸取代。在一些实施方案中，编辑导致CLE蛋白质的编码区中的氨基酸的变化。例如，相对于SEQ ID NO：75、SEQ ID NO：76或SEQ ID NO：77中任一个的氨基酸位置编号而言，编辑可以导致位于位置3、5、6、8或9处的氨基酸残基的变化。在一些实施方案中，相对于SEQID NO：75、SEQ ID NO：76或SEQ ID NO：77中任一个的氨基酸位置编号，所述编辑在CLE多肽中产生如下氨基酸取代：位置3处缬氨酸(V)至异亮氨酸(I)或甲硫氨酸(M)、位置5处谷氨酸(E)至赖氨酸(K)、位置6处甘氨酸(G)至苏氨酸(T)、位置8处天冬氨酸(D)至丙氨酸(A)、位置8处天冬氨酸(D)至甘氨酸(G)和/或位置9处脯氨酸(P)至亮氨酸(L)(例如，包含V3I、V3M、E5K、G6T、D8A、D8G和/或P9L的突变)。在一些实施方案中，本发明的经编辑的成熟CLE肽可以包含SEQ ID NO：84-100的任何一个氨基酸序列的序列。
在一些实施方案中，编辑方法可以进一步包括从在内源CLE基因中包含所述编辑的玉米植物细胞再生玉米植物，从而产生其内源CLE基因中包含该编辑并且与不包含所述编辑的对照玉米植物相比具有增加的穗行数的表型的玉米植物。
在一些实施方案中，用于制备玉米植物的方法，包括：(a)使包含编码前体CLE多肽的内源CLE基因的玉米植物细胞群与连接到核酸结合结构域(例如，DNA结合结构域，例如编辑***)的核酸酶接触，所述核酸结合结构域结合如下序列：其(i)与SEQ ID NO：78-80的任何一个核苷酸序列具有至少90％的序列同一性，(ii)与SEQ ID NO：81-83的任何一个核苷酸序列具有至少90％的序列同一性，(iii)编码与SEQ ID NO：72-74的任何一个氨基酸序列具有至少95％序列同一性的序列，或(ii)编码具有与SEQ ID NO：75-77的任何一个氨基酸序列有至少95％序列同一性的序列的结构域；(b)从所述群中选择内源CLE基因已突变的植物细胞，从而产生在内源CLE基因中包含突变的植物细胞；和(c)将所选的植物细胞生长成植物。
在一些实施方案中，增加玉米植物中的穗行数的方法包括：(a)使包含内源CLE基因的玉米植物细胞与靶向内源CLE基因的核酸酶接触，其中所述核酸酶与结合内源CLE基因中的靶位点的核酸结合结构域(例如，DNA结合结构域，例如编辑***)连接，其中所述内源CLE基因：(i)包含与SEQ ID NO：78-80的核苷酸序列中的任一个具有至少90％序列同一性的序列；(ii)包含与SEQ ID NO：81-83的核苷酸序列中的任一个具有至少90％序列同一性的区域；(iii)编码与SEQ ID NO：72-74的氨基酸序列中的任一个具有至少95％序列同一性的序列；和/或(iv)编码具有与SEQ ID NO：75-77的任何一个氨基酸序列有至少95％序列同一性的序列的结构域，以产生在内源CLE基因中包含突变的玉米植物细胞；和(b)将所述玉米植物细胞生长成在内源CLE基因中包含所述突变的玉米植物，从而产生具有突变的内源CLE基因和增加的穗行数的玉米植物。
在一些实施方案中，用于生产包含具有突变的内源CLE基因的至少一个细胞的玉米植物或其部分的方法，该方法包括使玉米植物或植物部分中的内源CLE基因中的靶位点与包含切割结构域和核酸结合结构域的核酸酶接触，其中所述核酸结合结构域结合内源CLE基因中的靶位点，其中所述内源CLE基因(a)包含与SEQ ID NO：78-80的任何一个核苷酸序列具有至少90％序列同一性的序列；(b)包含与SEQ ID NO：81-83的任何一个核苷酸序列具有至少90％5序列同一性的区域；(c)编码与SEQ ID NO：72-74的任何一个氨基酸序列具有至少95％序列同一性的序列；和/或(d)编码具有与SEQ ID NO：75-77的任何一个氨基酸序列有至少95％序列同一性的序列的结构域，从而生产包含在所述内源CLE基因中具有突变的至少一个细胞的玉米植物或其部分。
本文还提供了一种生产玉米植物或其部分的方法，所述玉米植物或其部分包含突变的内源CLE基因并且表现出增加的穗行数，所述方法包括使所述玉米植物或植物部分中的内源CLE基因中的靶位点与包含切割结构域和核酸结合结构域的核酸酶接触，其中所述核酸结合结构域与所述内源CLE基因中的靶位点结合，其中所述内源CLE基因：(a)包含与SEQ ID NO：78-80的核苷酸序列中的任一个具有至少90％序列同一性的序列；(b)包含与SEQ ID NO：81-83的核苷酸序列中的任一个具有至少90％序列同一性的区域；(c)编码与SEQ ID NO：72-74的氨基酸序列中的任一个具有至少95％序列同一性的序列；和/或(d)编码具有与SEQ ID NO：75-77的任何一个氨基酸序列有至少95％序列同一性的序列的结构域，从而生产包含具有突变的内源CLE基因并且表现出增加的穗行数的玉米植物或其部分。
在一些实施方案中，核酸酶可以切割内源CLE基因，从而将突变引入内源CLE基因。可用于本发明的核酸酶可以是可用于编辑/修饰靶核酸的任何核酸酶。此类核酸酶包括但不限于锌指核酸酶、转录激活因子样效应物核酸酶(TALEN)、核酸内切酶(例如，Fok1)和/或CRISPR-Cas效应子蛋白。同样，可用于本发明的任何核酸结合结构域可以是可用于编辑/修饰靶核酸的任何DNA结合结构域或RNA结合结构域。此类核酸结合结构域包括但不限于锌指、转录激活因子样DNA结合结构域(TAL)、argonaute和/或CRISPR-Cas效应物DNA结合结构域。
在一些实施方案中，提供了编辑玉米植物或植物部分中的内源CLE基因的方法，该方法包括使所述玉米植物或植物部分中的CLE基因中的靶位点与胞嘧啶碱基编辑***接触，该胞嘧啶碱基编辑***包含胞嘧啶脱氨酶和与CLE基因中的靶位点结合的核酸结合结构域，所述CLE基因(a)包含与SEQ ID NO：78-80的任何一个核苷酸序列具有至少90％序列同一性的序列；(b)包含与SEQ ID NO：81-83的任何一个核苷酸序列具有至少90％序列同一性的区域；(c)编码与SEQ ID NO：72-74的任何一个氨基酸序列具有至少95％序列同一性的序列；和/或(d)编码具有与SEQ ID NO：75-77的任何一个氨基酸序列有至少95％序列同一性的序列的结构域，从而编辑玉米植物或其部分中的内源CLE基因并产生包含在内源CLE基因中具有突变的至少一个细胞的玉米植物或其部分。
在一些实施方案中，提供了编辑玉米植物或植物部分中的内源CLE基因的方法，该方法包括使所述玉米植物或植物部分中的CLE基因中的靶位点与腺苷碱基编辑***接触，该腺苷碱基编辑***包含腺苷脱氨酶和与CLE基因中的靶位点结合的核酸结合结构域，所述CLE基因(a)包含与SEQ ID NO：78-80的任何一个核苷酸序列具有至少90％序列同一性的序列；(b)包含与SEQ ID NO：81-83的任何一个核苷酸序列具有至少90％序列同一性的区域；(c)编码与SEQ ID NO：72-74的任何一个氨基酸序列具有至少95％序列同一性的序列；和/或(d)编码具有与SEQ ID NO：75-77的任何一个氨基酸序列有至少95％序列同一性的序列的结构域，从而编辑玉米植物或其部分中的内源CLE基因并产生包含在内源CLE基因中具有突变的至少一个细胞的植物或其部分。
在一些实施方案中，提供了检测突变CLE基因(内源CLE基因中的突变)的方法，所述方法包括在植物的基因组中检测编码SEQ ID NO：72-77的氨基酸序列的核酸，其中SEQID NO：72-77的氨基酸序列包含相对于SEQ ID NO：75、SEQ ID NO：76或SEQ ID NO：77中任一个的氨基酸位置编号而言位于位置3、5、6、8或9处的一个或多个氨基酸残基的突变。在一些具体实施方案中，所述突变是C至T(C>T)、G至A(G>A)、A至G(A>G)或T至C(T>C)的核苷酸取代的结果。在一些实施方案中，突变的CLE肽包含至少一个突变，其包含相对于SEQ ID NO：75、SEQ ID NO：76或SEQ ID NO：77中的任一个的氨基酸位置编号而言位于位置3处V至I或M、位置5处E至K、位置6处G至T、位置8处D至A或G和/或位置9处P至L的突变。
在一些实施方案中，本发明提供了检测内源CLE基因中的突变的方法，其包括在植物的基因组中检测突变的CLE基因。作为一个实例，检测的突变的CLE基因可以包含与SEQID NO：105-109中任一个的核苷酸序列具有至少90％序列同一性的序列，或者检测的突变的CLE基因可以编码SEQ ID NO：84-100的任一个氨基酸序列的加工多肽。
在一些实施方案中，本发明提供了产生包含内源CLE基因中的突变和至少一个感兴趣多核苷酸的植物的方法，所述方法包括使包含内源CLE基因中的至少一个突变的本发明植物(第一植物)与包含所述至少一个感兴趣多核苷酸的第二植物杂交以产生后代植物；以及选择包含所述CLE基因中的至少一个突变和所述至少一个感兴趣多核苷酸的后代植物，从而产生包含内源CLE基因中的突变和至少一个感兴趣多核苷酸的植物。
本发明还提供了一种产生包含内源CLE基因中的突变和至少一个感兴趣多核苷酸的植物的方法，所述方法包括将至少一个感兴趣多核苷酸引入包含CLE基因中的至少一种突变的本发明植物中，从而产生包含CLE基因中的至少一个突变和至少一个感兴趣多核苷酸的植物。在一些实施方案中，所述植物是玉米植物。
在一些实施方案中，本发明提供了产生包含内源CLE基因中的突变和至少一个感兴趣多核苷酸的植物的方法，所述方法包括将至少一个感兴趣多核苷酸引入包含内源CLE基因中的至少一个突变的本发明植物中，从而产生包含CLE基因中的至少一个突变和至少一个感兴趣多核苷酸的植物。在一些实施方案中，所述植物是玉米植物。
感兴趣多核苷酸可以是能够赋予所需表型或以其它方式修饰植物的表型或基因型的任何多核苷酸。在一些实施方式中，感兴趣多核苷酸可以是赋予除草剂耐受性、昆虫抗性、线虫抗性、疾病抗性、产量增加、营养物使用效率增加或非生物胁迫抗性的多核苷酸。
可用于本发明的CLE包括任何CLE，其中如本文所述的突变可以在包含所述突变的植物或其部分中赋予增加的穗行数。在一些实施方案中，可用于本发明的CLE基因编码FCP1蛋白、CLE7蛋白或CLE14蛋白。
在一些实施方案中，内源前体CLE多肽包含与SEQ ID NO：72-74的任何一个氨基酸序列具有至少95％同一性(例如，约95、96、97、98、99、99.5、100％序列同一性)的氨基酸序列。在一些实施方案中，成熟内源CLE肽包含与SEQ ID NO：75-77的任何一个氨基酸序列具有至少95％同一性(例如，约95、96、97、98、99、99.5、100％序列同一性)的序列。在一些实施方案中，CLE基因可以包含与SEQ ID NO：78-80的任何一个核苷酸序列具有至少约90％序列同一性(例如，约90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、99.5、100％序列同一性)的序列，或者CLE基因可以在其中包含与SEQ ID NO：81-83和101-105的任何一个核苷酸序列具有至少90％同一性(例如，约90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、99.5、100％序列同一性)的序列(区域)。
在一些实施方案中，玉米植物中的内源CLE基因中的所述至少一个非天然突变可以是碱基取代、碱基缺失和/或碱基***或颠换。在一些实施方案中，与不包含所述编辑/突变的对照玉米植物相比，玉米植物中的内源CLE基因中的所述至少一个非天然突变可以是导致显性阴性突变、半显性突变、亚效突变或弱的功能损失突变的取代、缺失、***和/或颠换，并且植物具有增加的穗行数的表型。例如，所述突变可以是一个或多个氨基酸残基(例如CLE多肽的1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个氨基酸)的取代、缺失和/或***，或者突变可以是在编码CLE多肽的基因中的至少1个核苷酸至约15个核苷酸(例如约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或15个核苷酸、或其中的任何范围或数值)的碱基取代、碱基缺失和/或碱基***，或者可以是至少10个连续核苷酸至约2000个连续核苷酸(列入约10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、200、210、220、230、240、250、260、270、280、290、300、350、400、450、500、550、600、650、700、750、800、850、900、950、1000、1100、1110、1120、1130、1140、1150、1160、1170、1180、1190、1200、1210、1220、1230、1240、1250、1260、1270、1280、1290、1300、1350、1400、1450、1500、1550、1600、1650、1700、1750、1800、1850、1900、1950或2000或更多个连续核苷酸，或者其内的任何范围或数值)的DNA颠换。在一些实施方案中，所述至少一个非天然突变可以是对A、T、G或C的碱基取代。在一些实施方案中，所述至少一个非天然突变可以是从C到T(C>T)、G到A(G>A)、A到G(A>G)或T到C(T>C)的碱基取代。突变可以是点突变。在一些实施方案中，相对于SEQ ID NO：75、SEQ ID NO：76或SEQ ID NO：77的氨基酸位置编号，所述突变产生位于位置3、5、6、8或9处的一个或更多个取代的氨基酸残基(例如，V3I、V3M、E5K、G6T、D8A、D8G和/或P9L)。
在一些实施方案中，内源CLE基因中的突变可以在由编辑***切割之后生成，所述编辑***包含核酸酶和与靶核酸(例如，CLE基因)内的靶位点结合的核酸结合结构域，所述靶核酸包含与SEQ ID NO：78-83的任何一个核苷酸序列具有至少90％序列同一性的序列，或编码与SEQ ID NO：72-77的任何一个氨基酸序列具有至少95％序列同一性的序列(例如，CLE基因)。在一些实施方案中，所述核酸酶切割内源CLE基因，并且将突变引入所述内源CLE基因中。
本文还提供了与CLE基因中的靶位点结合的指导核酸(例如，gRNA、gDNA、crRNA、crDNA)，其中所述内源CLE基因：(a)包含与SEQ ID NO：78-80的任何一个核苷酸序列具有至少90％序列同一性的序列；(b)包含与SEQ ID NO：81-83的任何一个核苷酸序列具有至少95％序列同一性的区域；(c)编码与SEQ ID NO：72-74的任何一个氨基酸序列具有至少95％序列同一性的序列；和/或(d)编码具有与SEQ ID NO：75-77的任何一个氨基酸序列有至少95％序列同一性的序列的结构域。在一些实施方案中，指导核酸包含具有SEQ ID NO：101-104和/或SEQ ID NO：110-117中任一个的核苷酸序列的间隔子。
在一些实施方案中，提供了玉米植物或其植物部分，其包含在至少一个内源性CLAVATA3/EMBRYO SURROUNDING REGION-RELATED(CLV3/ESR-RELATED)(CLE)基因中的至少一个非天然突变，所述基因位于染色体2上由碱基对(bp)位置235,093,752至碱基对位置235,094,276限定并包括它们的染色体间隔内和/或染色体2上由碱基对(bp)位置40,126,538至碱基对位置40,127,030限定并包括它们的染色体间隔中，并且其中每个染色体间隔对应于MaizegDB互联网资源(maizegdb.org/assembly)的B73第4版(B73RefGen_v4)、AGPv4)的参考玉米基因组。在一些实施方案中，提供了玉米植物或其植物部分，其包含位于至少一个内源CLE基因中的至少一个非天然突变，其中所述内源CLE基因位于染色体2上由碱基对(bp)位置235,093,752至碱基对位置235,094,276限定并包括它们的染色体间隔，并且其中染色体间隔对应于MaizeGDB互联网资源(maizegdb.org/assembly)的B73第3版(B73RefGen_v3)的参考玉米基因组。
在一些实施方案中，提供了与玉米植物中的CLAVATA3/EMBRYO SURROUNDINGREGION-RELATED(CLV3/ESR-RELATED)(CLE)基因中的靶核酸结合的指导核酸，其中所述靶核酸位于染色体2上由碱基对(bp)位置235,093,752至碱基对位置235,094,276限定并包括它们的染色体间隔(Zm00001d007576(cle14-clavata3/esr-related14))内，或者位于染色体2上由碱基对(bp)位置40,126,538至碱基对位置40,127,030限定并包括它们的染色体间隔(Zm00001d003320(fcp1-fon2-like cle protein1))内，并且其中每个染色体间隔对应于MaizeGDB互联网资源(maizegdb.org/assembly)的B73第4版(B73_RefGen_v4)，AGPv4)的参考玉米基因组。在一些实施方案中，提供了与玉米植物中的CLE基因中的靶核酸结合的指导核酸，其中所述靶核酸位于内源CLE基因位于染色体4上由碱基对(bp)位置7,570,324至碱基对位置7,571,104限定并包括它们的染色体间隔中(GRMZM2G372364(cle7-clavata3/esr-related7))，并且其中所述染色体间隔对应于MaizeGDB互联网资源(maizegdb.org/assembly)的B73参考玉米基因组第3版(B73_RefGen_v3)。
在一些实施方案中，提供了包含指导核酸的***，所述指导核酸包含具有SEQ IDNO：101-104和/或SEQ ID NO：110-117中任一个的核苷酸序列的间隔子(例如，一个或多个间隔子)，以及与指导核酸缔合的CRISPR-Cas效应子蛋白。在一些实施方案中，所述***还可包含与指导核酸缔合的tracr核酸和CRISPR-Cas效应子蛋白，任选地其中tracr核酸和指导核酸共价连接。如本文所用，“与指导核酸缔合的CRISPR-Cas效应子蛋白”是指在CRISPR-Cas效应子蛋白和指导核酸之间形成的复合物，以将CRISPR-Cas效应子蛋白引导至基因中的靶位点。
本发明还提供了一种基因编辑***，其包含与指导核酸缔合的CRISPR-Cas效应子蛋白，并且所述指导核酸包含与CLE基因结合的间隔子序列，所述CLE基因(a)包含与SEQ IDNO：78-80的任何一个核苷酸序列具有至少90％序列同一性的序列；(b)包含与SEQ ID NO：81-83的任何一个核苷酸序列具有至少95％序列同一性的区域；(c)编码与SEQ ID NO：72-74的任何一个氨基酸序列具有至少95％序列同一性的序列；和/或(d)编码具有与SEQ IDNO：75-77的任何一个氨基酸序列有至少95％序列同一性的序列的结构域。在一些实施方案中，指导核酸的间隔子序列可以包含SEQ ID NO：101-104和/或SEQ ID NO：110-117中任一个的核苷酸序列。在一些实施方案中，基因编辑***还可包含与指导核酸和CRISPR-Cas效应子蛋白缔合的tracr核酸，任选地其中tracr核酸和指导核酸共价连接。
本发明还提供了包含CRISPR-Cas效应子蛋白的复合物，所述CRISPR-Cas效应子蛋白包含切割结构域和指导核酸，其中所述指导核酸结合内源CLE基因中的靶位点，其中所述内源CLE基因，其中所述内源CLE基因：(a)包含与SEQ ID NO：78-80的任何一个核苷酸序列具有至少90％序列同一性的序列；(b)包含与SEQ ID NO：81-83的任何一个核苷酸序列具有至少95％序列同一性的区域；(c)编码与SEQ ID NO：72-74的任何一个氨基酸序列具有至少95％序列同一性的序列；和/或(d)编码具有与SEQ ID NO：75-77的任何一个氨基酸序列有至少95％序列同一性的序列的结构域，其中所述切割结构域切割CLE基因中的靶标链。
在一些实施方案中，提供了包含下述的表达盒：(a)编码CRISPR-Cas效应子蛋白的多核苷酸，所述CRISPR-Cas效应子蛋白包含切割结构域，和(b)与编码前体CLE肽的内源CLE基因中的靶位点结合的指导核酸，其中所述指导核酸包含与下述互补并且与之结合的间隔子序列：(i)包含与SEQ ID NO：78-80的任何一个核苷酸序列具有至少90％序列同一性的序列；(ii)包含与SEQ ID NO：81-83的任何一个核苷酸序列具有至少95％序列同一性的区域；(iii)编码与SEQ ID NO：72-74的任何一个氨基酸序列具有至少95％序列同一性的序列；和/或(iv)编码具有与SEQ ID NO：75-77的任何一个氨基酸序列有至少95％序列同一性的序列的结构域。
本文还提供了编码突变的CLE基因的核酸，当存在于玉米植物或植物部分中时，与不包含所述CLE突变的玉米植物或植物部分相比，所述突变的CLE基因导致玉米植物包含增加的穗行数的表型。
示例性的突变的CLE蛋白可以包含与SEQ ID NO：84-100中任一个的氨基酸序列具有至少95％序列同一性的序列。示例性的突变的CLE基因可以包含与SEQ ID NO：105-109中任一个的核苷酸序列具有至少90％序列同一性的序列。
本发明的核酸构建体(例如包含序列特异性核酸结合结构域(例如序列特异性DNA结合结构域)、CRISPR-Cas效应结构域、脱氨酶结构域、逆转录酶(RT)、RT模板和/或指导核酸等的构建体)和包含其的表达盒/载体可以用作本发明的编辑***，用于修饰靶核酸(例如内源CLE基因)和/或其表达。
可以如本文所述(例如使用本发明的多肽、多核苷酸、RNPs、核酸构建体、表达盒和/或载体)修饰(例如突变，例如碱基编辑、切割、切口等)包含能够在如本文所述修饰时赋予增加的穗行数的内源CLE基因的任何玉米植物，以增加玉米植物中的穗行数。与不包含所述突变的内源CLE基因的植物或其部分相比，表现出增加的穗行数的植物(例如玉米植物)中的穗行数可以增加约5％至约100％(例如约5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99或100％或更多或其中的任何范围或数值；例如约5％至约10％、约5％至约15％、约5％至约20％、约10％至约50％、约10％至约80％、约10％至约90％、约10％至约100％、约20％至约50％、约20％至约80％、约20％至约90％、约20％至约100％、约30％至约50％、约30％至约80％、约30％至约90％、约30％至约100％、约50％至约100％、约75％至约100％或更多，或其中的任何范围或数值)。
可用于本发明的编辑***可以是现在已知或以后开发的任何位点特异性(序列特异性)基因组编辑***，所述***可以以靶特异性方式引入突变。例如，编辑***(例如位点特异性或序列特异性编辑***)可以包括、但不限于CRISPR-Cas编辑***、大范围核酸酶编辑***、锌指核酸酶(ZFN)编辑***、转录激活因子样效应子核酸酶(TALEN)编辑***、碱基编辑***和/或先导编辑***，其中的每一种都可以包含一种或多种多肽和/或一种或多种多核苷酸，当它们在细胞中作为***表达时，可以以序列特异性方式修饰(突变)靶核酸。在一些实施方案中，编辑***(例如位点特异性或序列特异性编辑***)可以包含一种或多种多核苷酸和/或一种或多种多肽，包括但不限于核酸结合结构域(DNA结合结构域)、核酸酶和/或其他多肽和/或多核苷酸。
在一些实施方案中，编辑***可以包含一个或多个序列特异性核酸结合结构域(DNA结合结构域)，其可以来自例如多核苷酸引导的核酸内切酶、CRISPR-Cas核酸内切酶(例如CRISPR-Cas效应子蛋白)、锌指核酸酶、转录激活因子样效应子核酸酶(TALEN)和/或Argonaute蛋白。在一些实施方案中，编辑***可包含一个或多个切割结构域(例如核酸酶)，包括、但不限于核酸内切酶(例如Fok1)、多核苷酸引导的核酸内切酶、CRISPR-Cas核酸内切酶(例如CRISPR-Cas效应子蛋白)、锌指核酸酶和/或转录激活因子样效应核酸酶(TALEN)。在一些实施方案中，编辑***可包含一种或多种多肽，所述多肽包括但不限于脱氨酶(例如胞嘧啶脱氨酶、腺嘌呤脱氨酶)、逆转录酶、Dna2多肽和/或5’flap核酸内切酶(FEN)。在一些实施方案中，编辑***可以包含一种或多种多核苷酸，包括但不限于CRISPR阵列(CRISPR引导)核酸、延伸的指导核酸和/或逆转录酶模板。
在一些实施方案中，修饰或编辑CLE基因的方法可包括将靶核酸(例如编码CLE的核酸)与和脱氨酶结构域(例如腺嘌呤脱氨酶和/或胞嘧啶脱氨酶)融合的碱基编辑融合蛋白(例如序列特异性DNA结合蛋白(例如CRISPR-Cas效应子蛋白或结构域))和指导核酸接触，其中所述指导核酸能够将所述碱基编辑融合蛋白引导/靶向靶核酸，从而编码所述靶核酸内的基因座。在一些实施方案中，碱基编辑融合蛋白和指导核酸可以包含在一种或多种表达盒中。在一些实施方案中，可将靶核酸与碱基编辑融合蛋白和包含指导核酸的表达盒接触。在一些实施方案中，所述序列特异性核酸结合融合蛋白和指导核酸可以以核糖核蛋白(RNP)的形式提供。在一些实施方案中，可将细胞与不止一种碱基编辑融合蛋白和/或一种或多种指导核酸接触，所述指导核酸可以靶向细胞中的一种或多种靶核酸。
在一些实施方案中，修饰或编辑CLE基因的方法可包括将靶核酸(例如编码CLE的核酸)与和肽标签融合的序列特异性核酸结合融合蛋白(例如序列特异性DNA结合蛋白(例如CRISPR-Cas效应子蛋白或结构域)、脱氨酶融合蛋白(其包含与能够与肽标签结合的亲和多肽融合的脱氨酶结构域(例如腺嘌呤脱氨酶和/或胞嘧啶脱氨酶))和指导核酸接触，其中所述指导核酸能够将序列特异性核酸结合融合蛋白引导至/靶向靶核酸，序列特异性核酸结合融合蛋白能够通过肽标签-亲和多肽相互作用将脱氨酶融合蛋白募集到靶核酸，从而编辑靶核酸内的基因座。在一些实施方案中，可将序列特异性核酸结合融合蛋白与结合肽标签的亲和多肽融合，以及可将脱氨酶与肽标签融合，从而将脱氨酶募集到所述序列特异性核酸结合融合蛋白和靶核酸处。在一些实施方案中，所述序列特异性结合融合蛋白、脱氨酶融合蛋白和指导核酸可以包含在一个或多个表达盒中。在一些实施方案中，可将靶核酸与序列特异性结合融合蛋白、脱氨酶融合蛋白和包含指导核酸的表达盒接触。在一些实施方案中，所述序列特异性核酸结合融合蛋白、脱氨酶融合蛋白和指导核酸可以以核糖核蛋白(RNP)的形式提供。
在一些实施方案中，诸如先导编辑(prime editing)等方法可用于在内源CLE基因中产生突变。在先导编辑中，将RNA依赖性DNA聚合酶(逆转录酶，RT)和逆转录酶模板(RT模板)与序列特异性DNA结合结构域组合使用，所述序列特异性核酸结合结构域赋予以序列特异性方式识别并结合靶标的能力，并且也能够在靶标内引起含PAM链的切口。所述核酸结合结构域可以是CRISPR-Cas效应子蛋白，并且在该情况下，CRISPR阵列或引导RNA可以是包含延伸部分的延伸的指导核酸，所述延伸部分包含引物结合位点(primer binding site,PSB)和待整合到基因组(模板)中的编辑。类似于碱基编辑，先导编辑可以利用各种将用于编辑的蛋白质募集到靶位点的方法，此类方法包括在基因组编辑的选定过程中使用的蛋白质与核酸之间的非共价和共价相互作用。
如本文所用，“CRISPR-Cas效应子蛋白”是切割或切开核酸、结合核酸(例如靶核酸和/或指导核酸)和/或鉴定、识别或结合如本文所定义的指导核酸的蛋白或多肽或其结构域。在一些实施方式中，CRISPR-Cas效应子蛋白可以是酶(例如核酸酶、内切核酸酶、切口酶等)或其部分，和/或可作为酶发挥功能。在一些实施方案中，CRISPR-Cas效应子蛋白是指CRISPR-Cas核酸酶多肽或其结构域，其包含核酸酶活性或其中核酸酶活性已被降低或消除，和/或包含切口酶活性或其中切口酶已被降低或消除，和/或包含单链DNA切割活性(ssDNAse活性)或其中ssDNAse活性已被降低或消除，和/或包含自加工RNAse活性或其中自加工RNAse活性已被降低或消除。CRISPR-Cas效应子蛋白可以与靶核酸结合。
在一些实施方案中，序列特异性核酸结合结构域可以是CRISPR-Cas效应子蛋白。在一些实施方案中，CRISPR-Cas效应子蛋白可以来自I型CRISPR-Cas***、II型CRISPR-Cas***、III型CRISPR-Cas***、IV型CRISPR-Cas***、V型CRISPR-Cas***或VI型CRISPR-Cas***。在一些实施方案中，本发明的CRISPR-Cas效应子蛋白可以来自II型CRISPR-Cas***或V型CRISPR-Cas***。在一些实施方案中，CRISPR-Cas效应子蛋白可以是II型CRISPR-Cas效应子蛋白，例如Cas9效应子蛋白。在一些实施方案中，CRISPR-Cas效应子蛋白可以是V型CRISPR-Cas效应子蛋白，例如Cas12效应子蛋白。
在一些实施方案中，CRISPR-Cas效应子蛋白可包括但不限于Cas9、C2c1、C2c3、Cas12a(也称为Cpf1)、Cas12b、Cas12c、Cas12d、Cas12e、Cas13a、Cas13b、Cas13c、Cas13d、Casl、CaslB、Cas2、Cas3、Cas3'、Cas3"、Cas4、Cas5、Cas6、Cas7、Cas8、Cas9(也称为Csnl和Csx12)、Cas10、Csyl、Csy2、Csy3、Csel、Cse2、Cscl、Csc2、Csa5、Csn2、Csm2、Csm3、Csm4、Csm5、Csm6、Cmrl、Cmr3、Cmr4、Cmr5、Cmr6、Csbl、Csb2、Csb3、Csxl7、Csxl4、Csx10、Csx16、CsaX、Csx3、Csxl、Csxl5、Csfl、Csf2、Csf3、Csf4(dinG)和/或Csf5核酸酶，任选地其中CRISPR-Cas效应子蛋白可以是Cas9、Cas12a(Cpf1)、Cas12b、Cas12c(C2c3)、Cas12d(CasY)、Cas12e(CasX)、Cas12g、Cas12h、Cas12i、C2c4、C2c5、C2c8、C2c9、C2c10、Cas14a、Cas14b和/或Cas14c效应子蛋白。
在一些实施方案中，用于本发明的CRISPR-Cas效应子蛋白可在其核酸酶活性位点(例如RuvC、HNH，例如Cas12a核酸酶结构域的RuvC位点，例如Cas9核酸酶结构域的RuvC位点和/或HNH位点)包含突变。在其核酸酶活性位点具有突变、因此不再包含核酸酶活性的CRISPR-Cas效应子蛋白通常被称为“无活力的(dead)”，例如dCas。在一些实施方案中，与无突变的相同CRISPR-Cas效应子蛋白(例如切口酶，例如Cas9切口酶、Cas12a切口酶)相比，在其核酸酶活性位点中具有突变的CRISPR-Cas效应子蛋白结构域或多肽可具有受损的活性或降低的活性。
可用于本发明的CRISPR Cas9效应子蛋白或CRISPR Cas9效应结构域可以是任何已知的或以后鉴定的Cas9核酸酶。在一些实施方案中，CRISPR Cas9多肽可以是来自例如链球菌属某些种(Streptococcus spp.)(例如化脓性链球菌(S.pyogenes)、嗜热链球菌(S.thermophilus))、乳杆菌属某些种(Lactobacillus spp.)、双歧杆菌属某些种(Bifidobacterium spp.)、坎德勒氏菌某些种(Kandleria spp.)、明串珠菌属某些种(Leuconostoc spp.)、酒球菌属某些种(Oenococcus spp.)、片球菌属某些种(Pediococcusspp.)、魏斯氏菌属某些种(Weissella spp.)和/或欧陆森氏菌属某些种(Olsenella spp.)的Cas9多肽。示例性的Cas9序列包括、但不限于SEQ ID NO：59和SEQ ID NO：60的氨基酸序列或者SEQ ID NO：61-71的核苷酸序列。
在一些实施方案中，CRISPR-Cas效应子蛋白可以是源自化脓性链球菌的Cas9多肽，其识别PAM序列基序NGG、NAG、NGA(Mali等人，Science 2013；339(6121):823-826)。在一些实施方案中，CRISPR-Cas效应子蛋白可以是来源于嗜热链球菌的Cas9多肽，其识别PAM序列基序NGGNG和/或NNAGAAW(W＝A或T)(参见例如Horvath等人，Science,2010；327(5962):167-170，以及Deveau等人，J Bacteriol 2008；190(4):1390-1400)。在一些实施方案中，CRISPR-Cas效应子蛋白可以是源自变形链球菌(Streptococcus mutans)的Cas9多肽，其识别PAM序列基序NGG和/或NAAR(R＝A或G)(参见例如Deveau等人，J BACTERIOL 2008；190(4):1390-1400)。在一些实施方案中，CRISPR-Cas效应子蛋白可以是源自金黄色葡萄球菌(Streptococcus aureus)的Cas9多肽，其识别PAM序列基序NNGRR(R＝A或G)。在一些实施方案中，CRISPR-Cas效应子蛋白可以是源自金黄色葡萄球菌(S.aureus)的Cas9蛋白，其识别PAM序列基序NGRRT(R＝A或G)。在一些实施方案中，CRISPR-Cas效应子蛋白可以是源自金黄色葡萄球菌的Cas9多肽，其识别PAM序列基序NGRRV(R＝A或G)。在一些实施方案中，CRISPR-Cas效应子蛋白可以是源自脑膜炎奈瑟氏球菌(Neisseria meningitidis)的Cas9多肽，其识别PAM序列基序N GATT或N GCTT(R＝A或G，V＝A、G或C)(参见，例如Hou等人，2013，1-6)。在上述实施方案中，N可以是任何核苷酸残基，例如A、G、C或T中的任一个。在一些实施方案中，CRISPR-Cas效应子蛋白可以是源自沙氏纤毛菌(Leptotrichia shahii)的Cas13a蛋白，其识别单个3’A、U或C的原间隔子侧翼序列(PFS)(或RNA PAM(rPAM))序列基序，所述序列基序可以位于靶核酸内。
在一些实施方案中，CRISPR-Cas效应子蛋白可源自Cas12a，其是V型成簇的规律间隔的短回文重复序列(CRISPR)-Cas核酸酶。参见例如SEQ ID NO：1-20。Cas12a在几个方面不同于更广为人知的II型CRISPR Cas9核酸酶。例如，Cas9识别位于其引导RNA(gRNA、sgRNA、crRNA、crDNA、CRISPR阵列)结合位点(原间隔子、靶核酸、靶DNA)3’的富含G的原间隔子邻近基序(PAM)(3’-NGG)，而Cas12a识别位于靶核酸5’的富含T的PAM(5’-TTN、5’-TTTN)。事实上，Cas9和Cas12a结合其引导RNA的方向与它们的N和C末端几乎相反。此外，Cas12a酶使用单引导RNA(gRNA，CRISPR阵列，crRNA)，而不是天然Cas9***中发现的双引导RNA(sgRNA(例如crRNA和tracrRNA))，并且Cas12a加工其自身的gRNA。另外，Cas12a核酸酶活性产生交错的DNA双链断裂，而不是由Cas9核酸酶活性产生的平端，并且Cas12a依赖于单个RuvC结构域来切割两条DNA链，而Cas9利用HNH结构域和RuvC结构域来切割。
可用于本发明的CRISPR Cas12a效应子蛋白/结构域可以是任何已知或后来鉴定的Cas12a多肽(以前称为Cpf1)(参见，例如美国专利第9,790,490号，就其中Cpf1(Cas12a)序列的公开内容将其通过引用并入本文)。术语“Cas12a”、“Cas12a多肽”或“Cas12a结构域”是指包含Cas12a多肽或其片段的RNA引导的核酸酶，其包含Cas12a的指导核酸结合结构域和/或Cas12a的活性、无活性或部分活性的DNA切割结构域。在一些实施方案中，可用于本发明的Cas12a可在核酸酶活性部位(例如Cas12a结构域的RuvC位点)中包含突变。在其核酸酶活性部位具有突变并因此不再包含核酸酶活性的Cas12a结构域或Cas12a多肽通常被称为deadCas12a(例如dCas12a)。在一些实施方案中，在其核酸酶活性部位中具有突变的Cas12a结构域或Cas12a多肽可能具有受损的活性，例如，可能具有切口酶活性。
任何可用于碱基编辑的脱氨酶结构域/多肽都可以用于本发明。在一些实施方案中，脱氨酶结构域可以是胞嘧啶脱氨酶结构域或腺嘌呤脱氨酶结构域。可用于本发明的胞嘧啶脱氨酶(或胞苷脱氨酶)可以是来自任何生物体的任何已知或后来鉴定的胞嘧啶脱氨酶(参见，例如美国专利第0,167,457号和Thuronyi等人Nat.Biotechnol.37:1070–1079(2019)，其中每一篇都就其胞嘧啶脱氨酶的公开内容通过引用并入本文)。胞嘧啶脱氨酶可分别催化胞苷或脱氧胞苷水解脱氨为尿苷或脱氧尿苷。因此，在一些实施方案中，可用于本发明的脱氨酶或脱氨酶结构域可以是胞苷脱氨酶结构域，催化胞嘧啶水解脱氨为尿嘧啶。在一些实施方案中，胞嘧啶脱氨酶可以是天然存在的胞嘧啶脱氨酶(包括但不限于灵长类动物(例如人、猴、黑猩猩、大猩猩)、狗、牛、大鼠或小鼠)的变体。因此，在一些实施方案中，可用于本发明的胞嘧啶脱氨酶可以与野生型胞嘧啶脱氨酶具有约70％至约100％同一性(例如与天然存在的胞嘧啶脱氨酶具有约70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性，以及其中的任何范围或数值)。
在一些实施方案中，可用于本发明的胞嘧啶脱氨酶可以是载脂蛋白B mRNA编辑复合物(APOBEC)家族脱氨酶。在一些实施方案中，胞嘧啶脱氨酶可以是APOBEC1脱氨酶、APOBEC2脱氨酶、APOBEC3A脱氨酶、APOBEC3B脱氨酶、APOBEC3C脱氨酶、APOBEC3D脱氨酶、APOBEC3F脱氨酶、APOBEC3G脱氨酶、APOBEC3H脱氨酶、APOBEC4脱氨酶、人活化诱导脱氨酶(hAID)、rAPOBEC1、FERNY和/或CDA1，任选地是pmCDA1、atCDA1(例如At2g 19570)及其进化形式(例如SEQ ID NO：27,SEQ ID NO：28或SEQ ID NO：29)。在一些实施方案中，胞嘧啶脱氨酶可以是具有SEQ ID NO：23的氨基酸序列的APOBEC1脱氨酶。在一些实施方案中，胞嘧啶脱氨酶可以是具有SEQ ID NO：24的氨基酸序列的APOBEC3A脱氨酶。在一些实施方案中，胞嘧啶脱氨酶可以是CDA1脱氨酶，任选地是具有SEQ ID NO：25的氨基酸序列的CDA1。在一些实施方案中，胞嘧啶脱氨酶可以是FERNY脱氨酶，任选地是具有SEQ ID NO：26的氨基酸序列的FERNY。在一些实施方案中，可用于本发明的胞嘧啶脱氨酶可以与天然存在的胞嘧啶脱氨酶(例如进化的脱氨酶)的氨基酸序列具有约70％至约100％同一性(例如70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、99.5％或100％同一性)。在一些实施方案中，可用于本发明的胞嘧啶脱氨酶可与SEQ ID NO：23、SEQ ID NO：24、SEQ ID NO：25或SEQ ID NO：26的氨基酸序列具有约70％至约99.5％同一性(例如约70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或99.5％同一性)(例如与SEQ ID NO：23、SEQ ID NO：24、SEQ ID NO：25、SEQ ID NO：26、SEQ ID NO：27、SEQ ID NO：28或SEQ ID NO：29的氨基酸序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少92％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或至少99.5％同一性)。在一些实施方案中，可以为了在植物中表达而对编码胞嘧啶脱氨酶的多核苷酸进行密码子优化，并且经密码子优化的多肽可与参考多核苷酸具有约70％至99.5％同一性。
在一些实施方案中，本发明的核酸构建体还可编码尿嘧啶糖基化酶抑制剂(UGI)(例如尿嘧啶-DNA糖基化酶抑制剂)多肽/结构域。因此，在一些实施方案中，编码CRISPR-Cas效应子蛋白和胞嘧啶脱氨酶结构域(例如编码包含与胞嘧啶脱氨酶结构域融合的CRISPR-Cas效应子蛋白结构域，和/或与肽标签或能够结合肽标签的亲和多肽融合的CRISPR-Cas效应子蛋白结构域，和/或与肽标签或能够结合肽标签的亲和多肽融合的脱氨酶蛋白结构域的融合蛋白)的核酸构建体还可编码尿嘧啶-DNA糖基化酶抑制剂(UGI)，任选地其中可以为了在植物中表达而对UGI进行密码子优化。在一些实施方案中，本发明提供了包含CRISPR-Cas效应多肽、脱氨酶结构域和UGI的融合蛋白和/或编码其的一种或多种多核苷酸，任选地，其中可以为了在植物中表达而对所述一种或多种多核苷酸进行密码子优化。在一些实施方案中，本发明提供了融合蛋白，其中可将CRISPR-Cas效应多肽、脱氨酶结构域和UGI与本文所述的肽标签和亲和多肽的任意组合融合，从而将脱氨酶结构域和UGI募集到CRISPR-Cas效应多肽和靶核酸。在一些实施方案中，可将指导核酸与募集RNA基序连接，并且可将一个或多个脱氨酶结构域和/或UGI与能够与募集RNA基序相互作用的亲和多肽融合，从而将脱氨酶结构域和UGI募集到靶核酸上。
可用于本发明的“尿嘧啶糖基化酶抑制剂”可以是能够抑制尿嘧啶-DNA糖基化酶碱基-切除修复酶的任何蛋白质。在一些实施方案中，UGI结构域包含野生型UGI或其片段。在一些实施方案中，可用于本发明的UGI结构域可以与天然存在的UGI结构域的氨基酸序列具有约70％至约100％同一性(例如70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、99.5％或100％同一性，以及其中的任何范围或数值)。在一些实施方案中，UGI结构域可包含SEQ ID NO：41的氨基酸序列或与SEQ ID NO：41的氨基酸序列具有约70％至约99.5％序列同一性(例如与SEQ ID NO：41的氨基酸序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少92％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或至少99.5％同一性)的多肽。例如，在一些实施方案中，UGI结构域可包含SEQ ID NO：41的氨基酸序列的片段，所述片段与SEQ ID NO：41的氨基酸序列的一部分连续核苷酸(例如10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80个连续核苷酸；例如约10、15、20、25、30、35、40、45个至约50、55、60、65、70、75、80个连续核苷酸)具有100％同一性。在一些实施方案中，UGI结构域可以是已知UGI(例如SEQ ID NO：41)的变体，其与已知UGI具有约70％至约99.5％序列同一性(例如70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、99.5％序列同一性，以及其中的任何范围或数值)。在一些实施方案中，可以为了在植物(例如植物)中表达而对编码UGI的多核苷酸进行密码子优化，并且经密码子优化的多肽可与参考多核苷酸具有约70％至约99.5％同一性。
可用于本发明的腺嘌呤脱氨酶(或腺苷脱氨酶)可以是来自任何生物体的任何已知的或后来鉴定的腺嘌呤脱氨酶(参见，例如美国专利第10,113,163号，其就其腺嘌呤脱氨酶的公开内容通过引用并入本文)。腺嘌呤脱氨酶可以催化腺嘌呤或腺苷的水解脱氨。在一些实施方案中，腺嘌呤脱氨酶可以分别催化腺苷或脱氧腺苷水解脱氨为肌苷或脱氧肌苷。在一些实施方案中，腺苷脱氨酶可以催化DNA中腺嘌呤或腺苷的水解脱氨。在一些实施方案中，由本发明的核酸构建体编码的腺嘌呤脱氨酶可在靶核酸的有义(例如“+”；模板)链中产生A→G转换或在靶核酸的反义(如“-”，互补)链中产生T→C转换。
在一些实施方案中，腺苷脱氨酶可以是天然存在的腺嘌呤脱氨酶的变体。因此，在一些实施方案中，腺苷脱氨酶可以与野生型腺嘌呤脱氨酶具有约70％至100％同一性(例如与天然存在的腺嘌吟脱氨酶具有约70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性，以及其中的任何范围或数值)。在一些实施方案中，所述脱氨酶不是天然存在的，并且可以被称为工程化的、突变的或进化的腺苷脱氨酶。因此，例如，工程化的、突变的或进化的腺嘌呤脱氨酶多肽或腺嘌呤脱氨酶结构域可以与天然存在的腺嘌呤脱氨酶多肽/结构域具有约70％至99.9％同一性(例如与天然存在的腺嘌呤脱氨酶多肽或腺嘌呤脱氨酶结构域具有约70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、99.1％、99.2％、99.3％、99.4％、99.5％、99.6％、99.7％、99.8％或99.9％同一性，以及其中的任何范围或数值)。在一些实施方案中，腺苷脱氨酶可以来自细菌(例如大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、流感嗜血杆菌(Haemophilus influenzae)、新月柄杆菌(Caulobacter crescentus)等)。在一些实施方案中，可以对编码腺嘌呤脱氨酶多肽/结构域的多核苷酸进行密码子优化以用于在植物中表达。
在一些实施方案中，腺嘌呤脱氨酶结构域可以是野生型tRNA特异性腺苷脱氨酶结构域，例如tRNA特异性腺苷脱氨酶(TadA)和/或突变/进化的腺苷脱氨酶结构域，例如突变/进化的tRNA特异性腺苷脱氨酶结构域(TadA*)。在一些实施方案中，TadA结构域可来自大肠杆菌。在一些实施方案中，TadA可以被修饰，例如被截短，可以相对于全长TadA缺失一个或多个N-末端和/或C-末端氨基酸(例如，可以相对于全长TadA缺失1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、6、17、18、19或20个N-末端和/或C-末端氨基酸残基)。在一些实施方案中，TadA多肽或TadA结构域不包含N-末端甲硫氨酸。在一些实施方案中，野生型大肠杆菌TadA包含SEQ ID NO：30的氨基酸序列。在一些实施方案中，突变/进化的大肠杆菌TadA*包含SEQID NO：31-40(例如SEQ ID NO：31、32、33、34、35、36、37、38、39或40)的氨基酸序列。在一些实施方案中，可以对编码TadA/TadA*的多核苷酸进行密码子优化而用于植物中表达。
胞嘧啶脱氨酶催化胞嘧啶脱氨并产生胸苷(通过尿嘧啶中间体)，引起基因组中C至T的转换或互补链内G至A的转换。因此，在一些实施方案中，由本发明的多核苷酸编码的胞嘧啶脱氨酶在靶核酸的有义(例如“+”；模板)链中产生C→T的转换或在靶核酸的反义(如“-”，互补)链中产生G→A的转换。
在一些实施方案中，由本发明的核酸构建体编码的腺嘌呤脱氨酶在靶核酸的有义(例如“+”；模板)链中产生A→G的转换或在靶核酸的反义(如“-”，互补)链中产生T→C的转换。
编码包含序列特异性核酸结合蛋白和胞嘧啶脱氨酶多肽的碱基编辑器的本发明核酸构建体，以及编码所述碱基编辑器的核酸构建体/表达盒/载体，可以与指导核酸组合用于修饰靶核酸，包括但不限于在靶核酸中产生C→T或G→A突变，所述靶核酸包括但不限于质粒序列；在编码序列中产生C→T或G→A突变以改变氨基酸身份；在编码序列中产生C→T或G→A突变以产生终止密码子；在编码序列中产生C→T或G→A突变以破坏起始密码子；在基因组DNA中产生点突变以破坏功能；和/或在基因组DNA中产生点突变以破坏剪接点。
编码包含序列特异性核酸结合蛋白和腺嘌呤脱氨酶多肽的碱基编辑器的本发明的核酸构建体，以及编码所述碱基编辑器的表达盒和/或载体可以与指导核酸组合用于修饰靶核酸，包括但不限于在靶核酸中产生A→G或T→C突变，所述靶核酸包括但不限于质粒序列；在编码序列中产生A→G或T→C突变以改变氨基酸身份；在编码序列中产生A→G或T→C突变以产生终止密码子；在编码序列中产生A→G或T→C突变以破坏起始密码子；在基因组DNA中产生点突变以破坏功能；和/或在基因组DNA中产生点突变以破坏剪接点。
包含CRISPR-Cas效应子蛋白或其融合蛋白的本发明核酸构建体可与引导RNA(gRNA、CRISPR阵列、CRISPR RNA、crRNA)组合使用，以修饰靶核酸，所述引导RNA被设计成与编码的CRISPR-Cas效应子蛋白或结构域一起发挥作用。可用于本发明的指导核酸包含至少一个间隔子序列和至少一个重复序列。指导核酸能够与由本发明的核酸构建体编码和表达的CRISPR-Cas核酸酶结构域形成复合物，并且所述间隔子序列能够与靶核酸杂交，从而将复合物(例如CRISPR-Cas效应子融合蛋白(例如与脱氨酶结构域融合的CRISPR-Cas效应子结构域，和/或与肽标签或亲和多肽融合的CRISPR-Cas效应子结构域，以募集脱氨酶结构域和任选地UGI)引导至靶核酸，其中靶核酸可以被脱氨酶结构域修饰(例如切割或编辑)或调节(例如调节转录)。
例如，编码与胞嘧啶脱氨酶结构域连接的Cas9结构域(例如融合蛋白)的核酸构建体可与Cas9指导核酸组合使用，以修饰靶核酸，其中融合蛋白的胞嘧啶脱氨酶结构域使靶核酸中的胞嘧啶碱基脱氨基，从而编辑靶核酸。在另一个实例中，编码与腺嘌呤脱氨酶结构域连接的Cas9结构域(例如融合蛋白)的核酸构建体可与Cas9指导核酸组合使用，以修饰靶核酸，其中融合蛋白的腺嘌呤脱氨酶结构域使靶核酸中的腺苷碱基脱氨基，从而编辑靶核酸。
同样，编码与胞嘧啶脱氨酶结构域或腺嘌脱氨酶结构域连接的Cas12a结构域(或其他选定的CRISPR-Cas核酸酶，例如C2c1、C2c3、Cas12b、Cas12c、Cas12d、Cas12e、Cas13a、Cas13b、Cas13c、Cas13d、Casl、CaslB、Cas2、Cas3、Cas3’、Cas3"、Cas4、Cas5、Cas6、Cas7、Cas8、Cas9(也称为Csnl和Csx12)、Cas10、Csyl、Csy2、Csy3、Csel、Cse2、Cscl、Csc2、Csa5、Csn2、Csm2、Csm3、Csm4、Csm5、Csm6、Cmrl、Cmr3、Cmr4、Cmr5、Cmr6、Csbl、Csb2、Csb3、Csxl7、Csxl4、Csx10、Csx16、CsaX、Csx3、Csxl、Csxl5、Csfl、Csf2、Csf3、Csf4(dinG)和/或Csf5)(例如融合蛋白)的核酸构建体可与Cas12a指导核酸(或用于其它选定的CRISPR-Cas核酸酶的指导核酸)组合使用，以修饰靶核酸，其中融合蛋白的胞嘧啶脱氨酶结构域或腺嘌呤脱氨酶结构域使靶核酸中的胞嘧啶碱基脱氨基，从而编辑所述靶核酸。
如本文中所用，“指导核酸”、“引导RNA”、“gRNA”、“CRISPR RNA/DNA”、“crRNA”或“crDNA”意指包含至少一个与靶DNA互补(并与之杂交)的间隔子序列(例如原间隔子)和至少一个重复序列(例如V型Cas12a CRISPR-Cas***的重复序列，或其片段或部分；II型Cas9CRISPR-Cas***的重复序列，或其片段；V型C2c1 CRISPR Cas***的重复序列或其片段；例如C2c3、Cas12a(也称为Cpf1)、Cas12b、Cas12c、Cas12d、Cas12e、Cas13a、Cas13b、Cas13c、Cas13d、Casl、CaslB、Cas2、Cas3、Cas3’、Cas3"、Cas4、Cas5、Cas6、Cas7、Cas8、Cas9(也称为Csnl和Csx12)、Cas10、Csyl、Csy2、Csy3、Csel、Cse2、Cscl、Csc2、Csa5、Csn2、Csm2、Csm3、Csm4、Csm5、Csm6、Cmrl、Cmr3、Cmr4、Cmr5、Cmr6、Csbl、Csb2、Csb3、Csxl7、Csxl4、Csx10、Csx16、CsaX、Csx3、Csxl、Csxl5、Csfl、Csf2、Csf3、Csf4(dinG)和/或Csf5的CRISPR-Cas***的重复序列或其片段)的核酸，其中重复序列可与间隔子序列的5’末端和/或3’末端连接。本发明的gRNA的设计可以基于I型、II型、III型、IV型、V型或VI型CRISPR-Cas***。
在一些实施方案中，Cas12a gRNA可以从5’至3’包含重复序列(全长或其部分(“柄(handle)”)；例如假结样结构)和间隔子序列。
在一些实施方案中，指导核酸可包含不止一个重复序列-间隔子序列(例如2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个或更多个重复序列-间隔子序列)(例如重复序列-间隔子序列-重复序列，例如重复序列-间隔子序列-重复序列-间隔子序列-重复序列-间隔子序列-重复序列-间隔子序列-重复序列-间隔子序列，等等)。本发明的指导核酸是合成的、人造的和不是在自然界中发现的。gRNA可以相当长，可以用作适体(如在MS2募集策略中那样)或其他从间隔子垂悬的RNA结构。
如本文中所用，“重复序列”是指例如野生型CRISPR Cas基因座(例如Cas9基因座、Cas12a基因座、C2c1基因座等)的任何重复序列或与本发明核酸构建体编码的CRISPR-Cas效应子蛋白一起发挥功能的合成crRNA的重复序列。可用于本发明的重复序列可以是CRISPR-Cas基因座(例如I型、II型、III型、IV型、V型或VI型)的任何已知或后来鉴定的重复序列，或者其可以是被设计成在I型、II型、III型、IV型、V型或VI型CRISPR-Cas***中起作用的合成重复序列。重复序列可以包含发夹结构和/或茎环结构。在一些实施方案中，重复序列可以在其5’末端形成假结样结构(即，“柄”)。因此，在一些实施方案中，重复序列可以与来自野生型I型CRISPR-Cas基因座、II型CRISPR-Cas基因座、III型CRISPR-Cas基因座、IV型CRISPR-Cas基因座、V型CRISPR-Cas基因座和/或VI型CRISPR-Cas基因座的重复序列相同或实质性相同。来自野生型CRISPR-Cas基因座的重复序列可以通过已建立的算法，诸如使用通过CRISPRdb提供的CRISPRfinder(参见，Grissa等人Nucleic Acids Res.35(网络服务器发行):W52-7)来确定。在一些实施方案中，重复序列或其部分在其3’末端与间隔子序列的5’末端连接，从而形成重复序列-间隔子序列(例如指导核酸、引导RNA/DNA、crRNA、crDNA)。
在一些实施方案中，重复序列包含至少10个核苷酸，或基本上由至少10个核苷酸组成，或由至少10个核苷酸组成，这取决于具体的重复序列和包含该重复序列的指导核酸被加工还是未被加工(例如约10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50至100个或更多个核苷酸，或其中的任何范围或数值)。在一些实施方案中，重复序列包含约10至约20、约10至约30、约10至约45、约10至约50、约15至约30、约15至约40、约15至约45、约15至约50、约20至约30、约20至约40、约20至约50、约30至约40、约40至约80、约50至约100个或更多个核苷酸，基本由所述核苷酸组成，或由所述核苷酸组成。
与间隔子序列的5’末端连接的重复序列可以包含重复序列的一部分(例如野生型重复序列的5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35个或更多个连续核苷酸)。在一些实施方案中，与间隔子序列的5’末端连接的重复序列的一部分在长度上可以是野生型CRISPR Cas重复核苷酸序列的约5至约10个连续核苷酸(例如约5、6、7、8、9、10个核苷酸)，并且与野生型CRISPR Cas重复核苷酸序列的相同区域(例如5’末端)具有至少90％序列同一性(例如至少约90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更多(例如99.1、99.2、99.3、99.4、99.5、99.6、99.7、99.8、99.9或100％))。在一些实施方案中，重复序列的一部分可在其5’末端包含假结样结构(例如“柄”)。
如本文中所用，“间隔子序列”是与靶核酸(例如靶DNA)(例如原间隔子)(例如如下序列的连续核苷酸)互补的核苷酸序列，其中所述序列(a)包含与SEQ ID NO：78-80中任一核苷酸序列具有至少90％序列同一性的序列；(b)包含与SEQ ID NO：81-83中任一核苷酸序列具有至少90％序列同一性的区域；(c)编码与SEQ ID NO：72-74中任一氨基酸序列具有至少95％序列同一性的序列；和/或(d)编码具有与SEQ ID NO：75-77中任一氨基酸序列有至少95％序列同一性的序列的结构域。在一些实施方案中，间隔子序列(例如一个或多个间隔子)可以包括、但不限于SEQ ID NO：101-104和/或SEQ ID NOs:110-117中任一个的核苷酸序列。间隔子序列可以与靶核酸完全互补或实质性互补(例如至少约70％(例如约70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高)(例如99.1、99.2、99.3、99.4、99.5、99.6、99.7、99.8、99.9或100％)互补)。因此，在一些实施方案中，与靶核酸相比，间隔子序列可具有一个、两个、三个、四个或五个错配，所述错配可以是连续的或不连续的。在一些实施方案中，间隔子序列可以与靶核酸具有70％的互补性。在其他实施方案中，间隔子核苷酸序列可以与靶核酸具有80％的互补性。在其他实施方案中，间隔子核苷酸序列可与靶核酸(原间隔子)具有85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或99.5％的互补性等。在一些实施方案中，间隔子序列与靶核酸100％互补。间隔子序列可具有约15个核苷酸至约30个核苷酸(例如15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30个核苷酸，或其中的任何范围或数值)的长度。因此，在一些实施方案中，间隔子序列可以在靶核酸(例如原间隔子)的长度为至少约15个核苷酸至约30个核苷酸的区域上具有完全互补性或实质性互补性。在一些实施方案中，间隔子长度约为20个核苷酸。在一些实施方案中，间隔子长度为约21个、22个或23个核苷酸。
在一些实施方案中，指导核酸的间隔子序列的5’区域可以与靶DNA相同，而所述间隔子的3’区域可以与靶DNA(例如V型CRISPR-Cas)实质性互补，或者指导核酸的间隔子序列的3’区域可与靶DNA相同，而所述间隔子的5’区域可以与靶DNA(例如II型CRISPR-Cas)实质性互补，因此，间隔子序列与靶DNA的总体互补性可以小于100％。因此，例如，在V型CRISPR-Cas***的指导核酸中，例如20个核苷酸的间隔子序列的5’区域(即，种子区域)中的前1、2、3、4、5、6、7、8、9、10个核苷酸可以与靶DNA 100％互补，而间隔子序列的3’区中的其余核苷酸与靶DNA实质性互补(例如至少约70％互补)。在一些实施方案中，间隔子序列5’末端的前1至8个核苷酸(例如前1、2、3、4、5、6、7、8个核苷酸以及其中的任何范围)可以与靶DNA100％互补，而间隔子序列3’区域的其余核苷酸与靶DNA实质性互补(例如至少约50％(例如50％、55％、60％、65％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高)互补)。
作为另外的实例，在II型CRISPR-Cas***的指导核酸中，例如20个核苷酸的间隔子序列的3’区域(即种子区)中的前1、2、3、4、5、6、7、8、9、10个核苷酸可以与靶DNA 100％互补，而间隔子序列的5’区域中的其余核苷酸与靶DNA实质性互补(例如至少约70％互补)。在一些实施方案中，间隔子序列3’端的前1至10个核苷酸(例如前1、2、3、4、5、6、7、8、9、10个核苷酸以及其中的任何范围)可以与靶DNA 100％互补，而间隔子序列5’区中的其余核苷酸与靶DNA实质性互补(例如至少约50％(例如至少约50％、55％、60％、65％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更多或其中的任何范围或数值)互补)。
在一些实施方案中，间隔子的种子区长度可为约8至约10个核苷酸，长度可为约5至约6个核苷酸，或长度可为约6个核苷酸。
如本文中所用，“靶核酸”、“靶DNA”、“靶核苷酸序列”、“靶区域”或“基因组中的靶区域”是指植物基因组中与本发明的指导核酸中的间隔子序列完全互补(100％互补)或实质性互补(例如至少70％(例如70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高)互补)的区域。对CRISPR-Cas***有用的靶区域可以紧邻生物体基因组(例如植物基因组)中PAM序列的3’(例如V型CRISPR-Cas***)或5’(例如II型CRISPR-Cas***)。靶区域可以选自紧邻PAM序列定位的至少15个连续核苷酸(例如16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30个核苷酸等)的任何区域。
“原间隔子序列”是指靶双链DNA，具体是指与CRISPR重复-间隔子序列(例如指导核酸、CRISPR阵列、crRNA)的间隔子序列完全互补或实质性互补(并杂交)的靶DNA的部分(例如，或基因组中的靶区域)。
在V型CRISPR-Cas(例如Cas12a)***和II型CRISPR-Cas(Cas9)***的情况下，原间隔子序列侧接(例如紧邻)原间隔子邻近基序(protospacer adjacent motif,PAM)。对于IV型CRISPR-Cas***，PAM位于非靶链的5’末端和靶链的3’末端(例如参见下文)。
Figure BDA0004000020750000801
在II型CRISPR-Cas(例如Cas9)***的情况下，PAM紧邻靶区域的3’。I型CRISPR-Cas***的PAM位于靶链的5’。III型CRISPR-Cas***没有已知的PAM。Makarova等人描述了CRISPR***的所有类别、类型和亚型的命名法(Nature Reviews Microbiology 13:722–736(2015))。引导结构和PAM由R.Barrangou(Genome Biol.16:247(2015))描述。
典型的Cas12a PAM富含T。在一些实施方案中，典型的Cas12aPAM序列可以是5’-TTN、5’-TTTN或5’-TTTV。在一些实施方案中，典型的Cas9(例如化脓性链球菌)PAM可以是5’-NGG-3’。在一些实施方案中，可以使用非典型的PAM，但是可能效率更低一些。
本领域技术人员可以通过已建立的实验和计算方法确定其他PAM序列。因此，例如，实验方法包括靶向两侧为所有可能的核苷酸序列的序列，并鉴定不经历靶向的序列成员，诸如通过靶质粒DNA的转化(Esvelt等人2013.Nat.Methods 10:1116-1121；Jiang等人2013.Nat.Biotechnol.31:233-239)。在一些方面，计算方法可包括对天然间隔子进行BLAST搜索以鉴定噬菌体或质粒中的原始靶DNA序列，并比对这些序列以确定邻近靶序列的保守序列(Briner和Barrangou 2014.Appl.Environ.Microbiol.80:994-1001；Mojica等人2009.Microbiology 155:733-740)。
在一些实施方案中，本发明提供了包含本发明核酸构建体的表达盒和/或载体(例如本发明编辑***的一个或多个组分)。在一些实施方案中，可以提供包含本发明的核酸构建体和/或一种或多种指导核酸的表达盒和/或载体。在一些实施方案中，编码碱基编辑器的本发明的核酸构建体(例如包含CRISPR-Cas效应子蛋白和脱氨酶结构域的构建体(例如融合蛋白))或用于碱基编辑的组分(例如与肽标签或亲和多肽融合的CRISPR-Cas效应子蛋白，与肽标签或亲和多肽融合的脱氨酶结构域，和/或与肽标签或亲和多肽融合的UGI)，可以包含在与包含所述一种或多种指导核酸的表达盒或载体相同的表达盒或载体上或者另外的表达盒或载体上。当编码碱基编辑器的核酸构建体或用于碱基编辑的组分包含在与包含指导核酸的表达盒或载体分开的表达盒或载体上时，可以例如在提供(例如与靶核酸接触)包含指导核酸的表达盒之前、与之同时或之后，将靶核酸以彼此之间的任何顺序与编码碱基编辑器或用于碱基编辑的组分的表达盒或载体和指导核酸接触(例如与其一起提供)。
如本领域已知的，本发明的融合蛋白可包含序列特异性核酸结合结构域(例如序列特异性DNA结合结构域)、CRISPR-Cas多肽和/或与肽标签或与肽标签相互作用的亲和多肽融合的脱氨酶结构域，用于将脱氨酶募集到靶核酸。募集方法还可包括与RNA募集基序和脱氨酶(其与能够与RNA募集基序相互作用的亲和多肽融合)连接的指导核酸，从而将脱氨酶募集到靶核酸上。或者，化学相互作用可用于将多肽(例如脱氨酶)募集到靶核酸上。
可用于本发明的肽标签(例如表位)可包括、但不限于GCN4肽标签(例如Sun标签)、c-Myc亲和标签、HA亲和标签、His亲和标签、S亲和标签、甲硫氨酸-His亲和标签、RGD-His亲和标签、FLAG八肽、strep标签或strep标签II、V5标签和/或VSV-G表位。可以与多肽连接的以及对于其存在可以与另一种多肽连接的相应的亲和多肽的任何表位，都可以在本发明中用作肽标签。在一些实施方案中，肽标签可包含1个或2个或更多个拷贝的肽标签(例如重复单元、多聚化表位(例如串联重复))(例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25个或更多个重复单元)。在一些实施方案中，与肽标签相互作用/结合的亲和多肽可以是抗体。在一些实施方案中，所述抗体可以是scFv抗体。在一些实施方案中，与肽标签结合的亲和多肽可以是合成的(例如为亲和相互作用而进化的)，包括但不限于亲和体、anticalin、单抗体(monobody)和/或DARPin(参见例如Sha等人，ProteinSci.26(5):910-924(2017))；Gilbreth(Curr Opin Struc Biol 22(4):413-420(2013))，美国专利第9,982,053号，就与亲和体、抗anticalin、单抗体和/或DARPin相关的教导将它们均通过引用整体并入本文。肽标签序列实例及其亲和多肽包括、但不限于氨基酸序列SEQID NO：45-47。
在一些实施方案中，指导核酸可与RNA募集基序连接，待募集的多肽(例如脱氨酶)可与和所述RNA募集基序结合的亲和多肽融合，其中所述指导核酸与靶核酸结合，并且所述RNA募集基序与亲和多肽结合，从而将多肽募集到指导核酸处，并使靶核酸与所述多肽(例如脱氨酶)接触。在一些实施方案中，两种或更多种多肽可被募集到指导核酸，从而使靶核酸与两种或更多种多肽(例如脱氨酶)接触。RNA募集基序实例及其亲和多肽包括但不限于SEQ ID NO：48-58的序列。
在一些实施方案中，与亲和多肽融合的多肽可以是逆转录酶，指导核酸可以是与RNA募集基序连接的延伸的指导核酸。在一些实施方案中，RNA募集基序可以位于延伸的指导核酸的延伸部分的3’末端(例如5’-3’，重复序列-间隔子-延伸的部分(RT模板-引物结合位点)-RNA募集基序)。在一些实施方案中，RNA募集基序可以嵌入延伸的部分。
在本发明的一些实施方案中，可将延伸的引导RNA和/或引导RNA与一个或两个或更多个RNA募集基序(例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10个或更多个基序，例如至少10至约25个基序)连接，任选地，其中所述两个或更多个RNA募集基序可以是相同的RNA募集基序或是不同的RNA募集基序。在一些实施方案中，RNA募集基序和相应的亲和多肽可以包括但不限于端粒酶Ku结合基序(例如Ku结合发夹)和相应的亲和多肽Ku(例如Ku异二聚体)、端粒酶Sm7结合基序和相应的亲和多肽Sm7、MS2噬菌体操纵子茎环和相应的亲和多肽MS2外壳蛋白(MCP)、PP7噬菌体操纵子茎环和相应的亲和多肽PP7外壳蛋白(PCP)、SfMu噬菌体Com茎环和相应的亲和多肽Com RNA结合蛋白、PUF结合位点(PBS)和亲和多肽Pumilio/fem-3mRNA结合因子(PUF)，和/或合成的RNA-适体和适体配体作为相应的亲和多肽。在一些实施方案中，RNA募集基序和相应的亲和多肽可以是MS2噬菌体操纵子茎环和亲和多肽MS2外壳蛋白(MCP)。在一些实施方案中，RNA募集基序和相应的亲和多肽可以是PUF结合位点(PBS)和亲和多肽Pumilio/fem-3mRNA结合因子(PUF)。
在一些实施方案中，用于募集多肽和核酸的组分可以是通过化学相互作用起作用的那些组分，包括但不限于：雷帕霉素诱导的FRB–FKBP的二聚化；生物素-链霉抗生物素蛋白素；SNAP标签；Halo标签；CLIP标签；由化合物诱导的DmrA-DmrC异二聚体；双功能配体(例如两种蛋白结合化学物质融合在一起，例如二氢叶酸还原酶(DHFR))。
在一些实施方案中，为了在植物中表达而优化的本发明的核酸构建体、表达盒或载体可以与包含相同多核苷酸(但其未针对在植物中表达而进行过密码子优化)的核酸构建体、表达盒或载体具有约70％至100％(例如约70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、99.5％或100％)同一性。
本文还提供了包含本发明的一种或多种多核苷酸、指导核酸、核酸构建体、表达盒或载体的细胞。
本发明的核酸构建体(例如，包含序列特异性DNA结合结构域、CRISPR-Cas效应子结构域、脱氨酶结构域、逆转录酶(RT)、RT模板和/或指导核酸等的构建体)和包含其的表达盒/载体可用作本发明的编辑***，用于修饰靶核酸和/或其表达。
可以使用本发明的多肽、多核苷酸、核糖核蛋白(RNP)、核酸构建体、表达盒和/或载体修饰(例如突变，例如碱基编辑、切割、切刻等)任何植物或植物部分(或植物的分组，例如分成属或更高级分类)的靶核酸，所述植物包括被子植物、裸子植物、单子叶植物、双子叶植物、C3植物、C4植物、CAM植物、苔藓植物、蕨类植物和/或拟蕨类植物、微藻和/或大型藻类。可以如本文所述进行修饰的植物和/或植物部分可以是任何植物物种/品种/栽培品种的植物和/或植物部分。在一些实施方案中，可以如本文所述进行修饰的植物是单子叶植物。在一些实施方案中，可以如本文所述进行修饰的植物是双子叶植物。
如本文中所用，术语“植物部分”包括、但不限于生殖组织(例如花瓣、萼片、雄蕊、雌蕊、花托、花药、花粉、花、果实、花芽、胚珠、种子、胚、坚果、谷粒、穗、玉米芯和外壳)；营养组织(例如叶柄、茎(stem)、根、根毛、根尖、髓、胚芽鞘、茎(stalk)、芽、枝、树皮、顶端分生组织、腋芽、子叶、下胚轴和叶)；维管组织(例如韧皮部和木质部)；特化细胞，诸如表皮细胞、薄壁细胞、厚角细胞、厚壁细胞、气孔、保卫细胞、角质层、叶肉细胞；愈伤组织；和插枝。术语“植物部分”还包括植物细胞，包括在植物和/或植物部分中完整的植物细胞、植物原生质体、植物组织、植物器官、植物细胞组织培养物、植物愈伤组织、植物团块等。如本文中所用，“芽”是指包括叶和茎在内的地上部分。如本文中所用，术语“组织培养物”包括组织、细胞、原生质体和愈伤组织的培养物。
如本文中所用，“植物细胞”是指植物的结构和生理单位，其通常包括细胞壁，但也包括原生质体。本发明的植物细胞可呈分离的单细胞形式，或者可以是培养的细胞，或者可以是更高组织单位的一部分，例如植物组织(包括愈伤组织)或植物器官。在一些实施方案中，植物细胞可以是藻类细胞。“原生质体”是没有细胞壁或只有部分细胞壁的分离的植物细胞。因此，在本发明的一些实施方案中，包含本发明核酸分子和/或核苷酸序列的转基因细胞是任何植物或植物部分的细胞，包括但不限于根细胞、叶细胞、组织培养物细胞、种子细胞、花细胞、果实细胞、花粉细胞等。在本发明的一些方面，植物部分可以是植物种质。在一些方面，植物细胞可以是不能再生为植物的非繁殖植物细胞。
“植物细胞培养物”意指植物单位例如原生质体、细胞培养细胞、植物组织中的细胞、花粉、花粉管、胚珠、胚囊、合子和不同发育阶段的胚的培养物。
如本文中所用，“植物器官”是植物的独特且明显结构化和分化的部分，例如根、茎、叶、花蕾或胚。
如本文中所用，“植物组织”是指组织成结构和功能单位的一群植物细胞。包括在植物中或培养中的任何植物组织。该术语包括、但不限于完整植物、植物器官、植物种子、组织培养物和组织成结构和/或功能单位的任何植物细胞群。该术语在结合上面列出的或以其它方式由本定义包含的任何特定类型的植物组织使用时，或者在不提及上面列出的或以其它方式由本定义包含的任何特定类型的植物组织而使用时，并不意图排除任何其他类型的植物组织。
在本发明的一些实施方案中，提供了转基因组织培养物或转基因植物细胞培养物，其中所述转基因组织或细胞培养物包含本发明的核酸分子/核苷酸序列。在一些实施方案中，可以通过将所述转基因植物与非转基因植物杂交，并在后代中选择包含所需基因编辑但不包含用于产生所述编辑的转基因的植物，从由所述转基因组织或细胞发育的植物中消除所述转基因。
可以如本文所述修饰包含内源CLE基因的任何植物，以增加穗行数，任选地没有实质性减少穗的长度(例如，穗长度没有减少超过5-30％)，并且任选地改善植物中的产量性状。可以如本文所述进行修饰的植物的非限制性实例可包括但不限于草坪草(例如，早熟禾(bluegrass)、翦股颖、黑麦草、羊茅草)、羽状苇草(feather reed grass)、丛生毛草、芒草、芦竹、柳枝稷、蔬菜作物，包括洋蓟、大头菜、芝麻菜、韭菜、芦笋、莴苣(例如，头、叶、长叶莴苣)、暗绿叶黄体芋(malanga)、瓜类(例如，甜瓜、西瓜、克伦肖瓜(crenshaw)、白兰瓜、罗马甜瓜)、油菜作物(例如,球芽甘蓝、卷心菜、花椰菜、西兰花、羽衣甘蓝、无头甘蓝、大白菜、小白菜)、刺菜蓟、胡萝卜、纳帕(napa)、秋葵、洋葱、芹菜、欧芹、鹰嘴豆、欧洲萝卜、菊苣、胡椒、马铃薯、葫芦科植物(例如，西葫芦、黄瓜、密生西葫芦、南瓜(pumpkin)、蜜瓜、西瓜、罗马甜瓜)、水萝卜、干球洋葱、芜菁甘蓝、茄子、婆罗门参、宽叶苦苣、青葱、菊苣、大蒜、菠菜、大葱、南瓜、绿叶蔬菜、甜菜(糖用甜菜和饲料用甜菜)、甘薯、牛皮菜、山葵、番茄、芜菁和香料；水果作物，诸如苹果、杏、樱桃、油桃、桃、梨、李子、梅子、樱桃、榅桲(quince)、无花果、坚果(例如，栗子、山核桃、开心果、榛子、开心果、花生、核桃、澳洲坚果、杏仁等)、柑橘(例如，克莱门氏小柑橘、金橘、橙子、葡萄柚、橘子、柑橘、柠檬、酸橙等)、蓝莓、黑树莓、波森莓、蔓越莓、醋栗果、醋栗、罗甘莓、覆盆子、草莓、黑莓、葡萄(葡萄酒和餐桌)、鳄梨、香蕉、奇异果、柿子、石榴、菠萝、热带水果、梨果、甜瓜、芒果、木瓜和荔枝，大田作物诸如三叶草、苜蓿、梯牧草、月见草、草地泡沫(meadow foam)、玉米/玉蜀黍(大田、甜玉米、爆米花)、啤酒花、霍霍巴、荞麦、红花、藜麦、小麦、水稻、大麦、黑麦、小米、高粱、燕麦、黑小麦、高粱、烟草、木棉、豆科植物(豆类(例如绿色和干燥的)、扁豆、豌豆、大豆)、油料植物(油菜(rape)、油菜(canola)、芥菜、罂粟、橄榄、向日葵、椰子、蓖麻油植物、可可豆、落花生、油棕)、浮萍、拟南芥、纤维植物(棉花、亚麻、***、黄麻)、***(例如，***(Cannabis sativa)、印度***和莠草***)、樟科(肉桂、樟脑)或诸如咖啡、甘蔗、茶和天然橡胶植物等植物；和/或诸如开花植物、仙人掌、肉质植物和/或诸如开花植物、仙人掌、肉质植物等花坛植物和/或观赏植物(例如，玫瑰、郁金香、紫罗兰)，以及诸如森林树木(阔叶树和常绿植物，诸如针叶树；例如，榆树、白蜡树、橡树、枫树、冷杉、云杉、雪松、松树、桦树、柏树、桉树、柳树)以及灌木和其他苗木等树木。在一些实施方案中，本发明的核酸构建体和/或编码其的表达盒和/或载体可用于修饰玉米、大豆、小麦、芸苔、水稻、番茄、辣椒或向日葵。
在一些实施方案中，可以如本文所述进行修饰的植物可包括但不限于玉米、大豆、油菜、小麦、水稻、棉花、甘蔗、糖用甜菜、大麦、燕麦、苜蓿、向日葵、红花、油棕、芝麻、椰子、烟草、马铃薯、甘薯、木薯、咖啡、苹果、李子、杏、桃、樱桃、梨、无花果、香蕉、柑橘、可可、鳄梨、橄榄、杏仁、胡桃、草莓、西瓜、胡椒、葡萄、番茄、黄瓜或芸苔属某些种(例如欧洲油菜(B.napus)、甘蓝(B.oleracea)、芜菁(B.rapa)、芥菜型油菜(B.juncea)和/或黑芥(B.nigra))。在一些实施方案中，可以如本文所述进行修饰的植物是双子叶植物。在一些实施方案中，可以如本文所述进行修饰的植物是单子叶植物。在一些实施方案中，可以如本文所述进行修饰的植物是玉米(即玉蜀黍)。在一些实施方案中，可以如本文所述进行修饰的植物是小麦(例如小麦属的各个种)。
因此，根据本发明优先处理的植物或植物栽培品种包括通过遗传修饰获得遗传物质的所有植物，所述遗传物质赋予这些植物特别有利的有用特性(“性状”)。此类特性的实例是更好的植物生长、活力、胁迫耐受性、站立能力、抗倒伏性、营养吸收、植物营养和/或产量，特别是改善的生长、对高温或低温的增强的耐受性、对干旱或水或土壤盐度水平的增强的耐受性、增强的开花性能、更容易收获、加速成熟、更高产量、收获产品的更高品质和/或更高营养价值、收获产品的更好储存寿命和/或可加工性。
此类性质的进一步实例是对动物和微生物害虫，诸如对昆虫、蛛形类、线虫类、螨虫类、蛞蝓和蜗牛的增强的抗性，这归因于例如植物中形成的毒素。在编码赋予对此类动物和微生物害虫(特别是昆虫)的耐受性的蛋白质的DNA序列中，将特别提及来自苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis)的编码Bt蛋白质的遗传物质，其广泛描述于文献中并且为本领域技术人员所熟知。还将提及从细菌诸如发光杆菌属(Photorhabdus)中提取的蛋白质(WO97/17432和WO98/08932)。具体而言，将提及Bt Cry或VIP蛋白质，其包括CrylA、CryIAb、CryIAc、CryIIA、CryIIIA、CryIIIB2、Cry9c Cry2Ab、Cry3Bb和CryIF蛋白或其毒性片段，以及还有其杂交体或组合，尤其是CrylF蛋白或衍生自CrylF蛋白质的杂交体(例如，杂交CrylA-CrylF蛋白或其毒性片段)、CrylA型蛋白或其毒性片段，优选地，CrylAc蛋白或衍生自CrylAc蛋白的杂交体(例如，杂交CrylAb-CrylAc蛋白)或CrylAb或Bt2蛋白或其毒性片段、Cry2Ae、Cry2Af或Cry2Ag蛋白或其毒性片段、CrylA.105蛋白或其毒性片段、VIP3Aa19蛋白、VIP3Aa20蛋白、COT202或COT203棉花事件中产生的VIP3A蛋白、VIP3Aa蛋白或其毒性片段(如Estruch等人(1996),Proc Natl Acad Sci US A.28；93(11):5389-94中所描述的)、如WO2001/47952中所述的Cry蛋白、来自致病杆菌属(Xenorhabdus)(如WO98/50427中所述的)、沙雷氏菌属(Serratia)(特别是来自嗜虫沙雷氏菌(S.entomophila))或发光杆菌属(Photorhabdus)物种菌株的杀虫蛋白，诸如WO98/08932中所述的来自发光杆菌属的Tc蛋白。此外，在某些氨基酸(1-10个，优选1-5个)上不同于任何上述序列(特别是它们的毒性片段的序列)的或者与转运肽(诸如质体转运肽)或另一种蛋白质或肽融合的这些蛋白质中任一种的任何变体或突变体，也包括在本文中。
此类性质的另一个特别强调的实例是赋予对一种或多种除草剂(例如,咪唑啉酮类、磺酰脲类、草甘膦或草丁膦)的耐受性。在编码赋予转化的植物细胞和植物对某些除草剂的耐受性的蛋白质的DNA序列(即目标多核苷酸)中，将特别提及WO2009/152359中描述的bar或PAT基因或天蓝色链霉菌(Streptomyces coelicolor)基因(所述基因赋予对草铵膦除草剂的耐受性)、编码合适的EPSPS(5-烯醇丙酮酰莽草酸-3-磷酸合酶)的基因(其赋予对以EPSPS为靶标的除草剂，特别是诸如草甘膦及其盐等除草剂的耐受性)、编码草甘膦-n-乙酰基转移酶的基因或编码草甘膦氧化还原酶的基因。其他合适的除草剂耐受性性状包括至少一种ALS(乙酰乳酸合酶)抑制剂(例如，WO2007/024782)、突变的拟南芥ALS/AHAS基因(例如，美国专利6,855,533)、编码赋予对2,4-D(2,4-二氯苯氧基乙酸)耐受性的2,4-D-单加氧酶的基因和编码赋予对麦草畏(3,6-二氯-2-甲氧基苯甲酸)的耐受性的麦草畏单加氧酶的基因。
此类性质的进一步实例是对植物病原性真菌、细菌和/或病毒的增强的抗性，这归因于例如***获得性抗性(SAR)、***素、植物抗毒素、诱发剂(elicitor)以及还有抗性基因和相应地表达的蛋白质和毒素。
可以根据本发明优先处理的转基因植物或植物栽培品种中特别有用的转基因事件包括事件531/PV-GHBK04(棉花，昆虫控制，于WO2002/040677中描述的)，事件1143-14A(棉花，昆虫控制，未保藏，于WO2006/128569中描述的)；事件1143-51B(棉花，昆虫控制，未保藏，于WO2006/128570中描述的)；事件1445(棉花，除草剂耐受性，未保藏，于US-A 2002-120964或WO2002/034946中描述)；事件17053(水稻，除草剂耐受性，以PTA-9843保藏，于WO2010/117737中描述的)；事件17314(水稻，除草剂耐受性，以PTA-9844保藏，于WO2010/117735中描述的)；事件281-24-236(棉花，昆虫控制-除草剂耐受性，以PTA-6233保藏，于WO2005/103266或US-A 2005-216969中描述的)；事件3006-210-23(棉花，昆虫控制-除草剂耐受性，以PTA-6233保藏，于US-A 2007-143876或WO2005/103266中描述的)；事件3272(玉米，品质性状，以PTA-9972保藏，于WO2006/098952或US-A 2006-230473中描述的)；事件33391(小麦，除草剂耐受性，以PTA-2347保藏，于WO2002/027004中描述的)，事件40416(玉米，昆虫控制-除草剂耐受性，以ATCC PTA-11508保藏，于WO 11/075593中描述的)；事件43A47(玉米，昆虫控制-除草剂耐受性，以ATCC PTA-11509保藏，于WO2011/075595中描述的)；事件5307(玉米，昆虫控制，以ATCC PTA-9561保藏，于WO2010/077816中描述的)；事件ASR-368(翦股颖，除草剂耐受性，以ATCC PTA-4816保藏，于US-A 2006-162007或WO2004/053062中描述的)；事件B16(玉米，除草剂耐受性，未保藏，于US-A 2003-126634中描述的)；事件BPS-CV127-9(大豆，除草剂耐受性，以NCIMB号41603保藏的，于WO2010/080829中描述的)；事件BLRl(欧洲油菜，雄性不育的恢复，NCIMB 41193保藏，于WO2005/074671中描述的)，事件CE43-67B(棉花，昆虫控制，以DSM ACC2724保藏的，于US-A 2009-217423或WO2006/128573中描述的)；事件CE44-69D(棉花，昆虫控制，未保藏，于US-A 2010-0024077中描述的)；事件CE44-69D(棉花，昆虫控制，未保藏，于WO2006/128571中描述的)；事件CE46-02A(棉花，昆虫控制，未保藏，于WO2006/128572中描述的)；事件COT102(棉花，昆虫控制，未保藏，于US-A 2006-130175或WO2004/039986中描述的)；事件COT202(棉花，昆虫控制，未保藏，于US-A 2007-067868或WO2005/054479中描述的)；事件COT203(棉花，昆虫控制，未保藏，于WO2005/054480中描述的)；事件DAS21606-3/1606(大豆，除草剂耐受性，以PTA-11028保藏，于WO2012/033794中描述的)，事件DAS40278(玉米，除草剂耐受性，以ATCCPTA-10244保藏，于WO2011/022469中描述的)；事件DAS-44406-6/pDAB8264.44.06.l(大豆，除草剂耐受性，以PTA-11336保藏，于WO2012/075426中描述的)，事件DAS-14536-7/pDAB8291.45.36.2(大豆，除草剂耐受性，以PTA-11335保藏，于WO2012/075429中描述的)，事件DAS-59122-7(玉米，昆虫控制-除草剂耐受性，以ATCC PTA 11384保藏，于US-A 2006-070139中描述的)、玉米事件DAS-59132(玉米，昆虫控制-除草剂耐受性，未保藏，于WO2009/100188中描述的)；事件DAS68416(大豆，除草剂耐受性，以ATCC PTA-10442保藏，于WO2011/066384或WO2011/066360中描述的)；事件DP-098140-6(玉米，除草剂耐受性，以ATCC PTA-8296保藏，于US-A 2009-137395或WO08/112019中描述的)；事件DP-305423-1(大豆，质量性状，未保藏，于US-A 2008-312082或WO2008/054747中描述的)；事件DP-32138-1(玉米，杂交***，以ATCC PTA-9158保藏，于US-A 2009-0210970或WO2009/103049中描述的)；事件DP-356043-5(大豆，除草剂耐受性，以ATCC PTA-8287保藏，于US-A 2010-0184079或WO2008/002872中描述的)；事件EE-I(brinjal，昆虫控制，未保藏，于WO07/091277中描述的)；事件Fil 17(玉米，除草剂耐受性，以ATCC 209031保藏，于US-A 2006-059581或WO98/044140中描述的)；事件FG72(大豆，除草剂耐受性，以PTA-11041保藏，于WO2011/063413中描述的)，事件GA21(玉米，除草剂耐受性，以ATCC 209033保藏，于US-A 2005-086719或WO98/044140中描述的)；事件GG25(玉米，除草剂耐受性，以ATCC 209032保藏，于US-A 2005-188434或WO98/044140中描述的)；事件GHB119(棉花，昆虫控制-除草剂耐受性，以ATCC PTA-8398保藏，于WO2008/151780中描述的)；事件GHB614(棉花，除草剂耐受性，以ATCC PTA-6878保藏，于US-A 2010-050282或WO2007/017186中描述的)；事件GJ11(玉米，除草剂耐受性，以ATCC209030保藏，于US-A 2005-188434或WO98/044140中描述的)；事件GM RZ13(糖用甜菜，病毒抗性，以NCIMB-41601保藏，于WO2010/076212中描述的)；事件H7-l(糖用甜菜，除草剂耐受性，以NCIMB 41158或NCIMB 41159保藏，于US-A 2004-172669或WO2004/074492中描述的)；事件JOPLINl(小麦，疾病耐受性，未保藏，于US-A 2008-064032中描述的)；事件LL27(大豆，除草剂耐受性，以NCIMB41658保藏，于WO2006/108674或US-A 2008-320616中描述的)；事件LL55(大豆，除草剂耐受性，以NCIMB 41660保藏，于WO2006/108675或US-A 2008-196127中描述的)；事件LLcotton25(棉花，除草剂耐受性，以ATCC PTA-3343保藏，于WO2003/013224或USA 2003-097687中描述的)；事件LLRICE06(水稻，除草剂耐受性，以ATCC 203353保藏，于美国专利第6,468,747号或WO2000/026345中描述的)；事件LLRice62(水稻，除草剂耐受性，以ATCC 20335保藏，于WO2000/026345中描述的)，事件LLRICE601(水稻，除草剂耐受性，以ATCC PTA-2600保藏，于US-A 2008-2289060或WO2000/026356中描述的)；事件LY038(玉米，品质性状，以ATCC PTA-5623保藏，于US-A 2007-028322或WO2005/061720中描述的)；事件MIR162(玉米，昆虫控制，以PTA-8166保藏，于US-A 2009-300784或WO2007/142840中描述的)；事件MIR604(玉米，昆虫控制，未保藏，于US-A 2008-167456或WO2005/103301中描述的)；事件MON15985(棉花，昆虫控制，以ATCC PTA-2516保藏，于US-A 2004-250317或WO2002/100163中描述的)；事件MON810(玉米，昆虫控制，未保藏，于US-A 2002-102582中描述的)；事件MON863(玉米，昆虫控制，以ATCC PTA-2605保藏，于WO2004/011601或US-A2006-095986中描述的)；事件MON87427(玉米，授粉控制，以ATCC PTA-7899保藏，于WO2011/062904中描述的)；事件MON87460(玉米，胁迫耐受性，以ATCC PTA-8910保藏，于WO2009/111263或US-A 2011-0138504中描述的)；事件MON87701(大豆，昆虫控制，以ATCC PTA-8194保藏，于US-A 2009-130071或WO2009/064652中描述的)；事件MON87705(大豆，品质性状-除草剂耐受性，以ATCC PTA-9241保藏，于US-A 2010-0080887或WO2010/037016中描述的)；事件MON87708(大豆，除草剂耐受性，以ATCC PTA-9670保藏，于WO2011/034704中描述的)；事件MON87712(大豆，产量，以PTA-10296保藏，于WO2012/051199中描述的)，事件MON87754(大豆，品质性状，以ATCC PTA-9385保藏，于WO2010/024976中描述的)；事件MON87769(大豆，品质性状，以ATCC PTA-8911保藏，于US-A 2011-0067141或WO2009/102873中描述的)；事件MON88017(玉米，昆虫控制-除草剂耐受性，以ATCC PTA-5582保藏，于US-A 2008-028482或WO2005/059103中描述的)；事件MON88913(棉花，除草剂耐受性，以ATCC PTA-4854保藏，于WO2004/072235或US-A 2006-059590中描述的)；事件MON88302(欧洲油菜，除草剂耐受性，以PTA-10955保藏，于WO2011/153186中描述的)，事件MON88701(棉花，除草剂耐受性，以PTA-11754保藏，于WO2012/134808中描述的)，事件MON89034(玉米，昆虫控制，以ATCC PTA-7455保藏，于WO 07/140256或US-A 2008-260932中描述的)；事件MON89788(大豆，除草剂耐受性，以ATCC PTA-6708保藏，于US-A 2006-282915或WO2006/130436中描述的)；事件MSl 1(欧洲油菜，授粉控制-除草剂耐受性，以ATCC PTA-850或PTA-2485保藏号，于WO2001/031042中描述的)；事件MS8(欧洲油菜，授粉控制-除草剂耐受性，以ATCC PTA-730保藏，于WO2001/041558或US-A 2003-188347中描述的)；事件NK603(玉米，除草剂耐受性，以ATCCPTA-2478保藏，于US-A 2007-292854中描述的)；事件PE-7(水稻，昆虫控制，未保藏，于WO2008/114282中描述的)；事件RF3(欧洲油菜，授粉控制-除草剂耐受性，以ATCC PTA-730保藏，于WO2001/041558或US-A 2003-188347中描述的)；事件RT73(欧洲油菜，除草剂耐受性，未保藏，于WO2002/036831或US-A 2008-070260中描述的)；事件SYHT0H2/SYN-000H2-5(大豆，除草剂耐受性，以PTA-11226保藏，于WO2012/082548中描述的)，事件T227-1(糖用甜菜，除草剂耐受性，未保藏，于WO2002/44407或US-A 2009-265817中描述的)；事件T25(玉米，除草剂耐受性，未保藏，于US-A 2001-029014或WO2001/051654中描述的)；事件T304-40(棉花，昆虫控制-除草剂耐受性，以ATCC PTA-8171保藏，于US-A 2010-077501或WO2008/122406中描述的)；事件T342-142(棉花，昆虫控制，未保藏，于WO2006/128568中描述的)；事件TC1507(玉米，昆虫控制-除草剂耐受性，未保藏，于US-A 2005-039226或WO2004/099447中描述的)；事件VIP1034(玉米，昆虫控制-除草剂耐受性，以ATCC PTA-3925保藏，于WO2003/052073中描述的)，事件32316(玉米，昆虫控制-除草剂耐受性，以PTA-11507保藏，于WO2011/084632中描述的)，事件4114(玉米，昆虫控制-除草剂耐受性，以PTA-11506保藏，于WO2011/084621中描述的)，任选地与事件EE-GM1/LL27或事件EE-GM2/LL55(WO2011/063413A2)叠加的事件EE-GM3/FG72(大豆，除草剂耐受性，ATCC登录号PTA-11041)，事件DAS-68416-4(大豆，除草剂耐受性，ATCC录号PTA-10442，WO2011/066360Al)，事件DAS-68416-4(大豆，除草剂耐受性，ATCC登录号PTA-10442，WO2011/066384Al)，事件DP-040416-8(玉米，昆虫控制，ATCC登录号PTA-11508,WO2011/075593Al)，事件DP-043A47-3(玉米，昆虫控制，ATCC登录号PTA-11509，WO2011/075595Al)，事件DP-004114-3(玉米，昆虫控制，ATCC登录号PTA-11506，WO2011/084621Al)，事件DP-032316-8(玉米，昆虫控制，ATCC登录号PTA-11507，WO2011/084632A1)、事件MON-88302-9(欧洲油菜，除草剂耐受性，ATCC登录号PTA-10955，WO2011/153186Al)，事件DAS-21606-3(大豆，除草剂耐受性，ATCC登录号PTA-11028，WO2012/033794A2)，事件MON-87712-4(大豆，品质性状，ATCC登录号PTA-10296，WO2012/051199A2)，事件DAS-44406-6(大豆，叠加的除草剂耐受性，ATCC登录号PTA-11336，WO2012/075426Al)，事件DAS-14536-7(大豆，叠加的除草剂耐受性，ATCC登录号PTA-11335，WO2012/075429Al)，事件SYN-000H2-5(大豆，除草剂耐受性，ATCC登录号PTA-11226，WO2012/082548A2)，事件DP-061061-7(欧洲油菜，除草剂耐受性，无保藏号可用，WO2012071039Al)，事件DP-073496-4(欧洲油菜，除草剂耐受性，无保藏号可用，US2012131692)，事件8264.44.06.1(大豆，叠加的除草剂耐受性，登录号PTA-11336，WO2012075426A2)，事件8291.45.36.2(大豆，叠加的除草剂耐受性，登录号登录号PTA-11335，WO2012075429A2)，事件SYHT0H2(大豆，ATCC登录号号PTA-11226，WO2012/082548A2)，事件MON88701(棉花，ATCC登录号PTA-11754，WO2012/134808Al)，事件KK179-2(苜蓿，ATCC登录号PTA-11833，WO2013/003558Al)，事件pDAB8264.42.32.1(大豆，叠加的除草剂耐受性，ATCC登录号PTA-11993，WO2013/010094Al)，事件MZDT09Y(玉米,ATCC登录号PTA-13025，WO2013/012775Al)。
赋予所述所需性状的基因/事件(例如，目标多核苷酸)也可以在转基因植物中彼此组合存在。可以提及的转基因植物的实例是重要的作物植物，诸如谷类(小麦、水稻、黑小麦、大麦、黑麦、燕麦)、玉米、大豆、马铃薯、糖用甜菜、甘蔗、番茄、豌豆和其他类型的蔬菜、棉花、烟草、欧洲油菜以及水果植物(水果苹果、梨、柑橘类水果和葡萄)，其中特别强调的是玉米、大豆、小麦、水稻、马铃薯、棉花、甘蔗、烟草和欧洲油菜。特别强调的性状是植物对昆虫、蛛形类、线虫类、蛞蝓和蜗牛的增强的抗性，以及植物对一种或多种除草剂的增强的抗性。
可根据本发明优先处理的此类植物、植物部分或植物种子的商购可得的实例包括以
Figure BDA0004000020750000951
Figure BDA0004000020750000952
RIB
Figure BDA0004000020750000953
ROUNDUP
Figure BDA0004000020750000954
VTDOUBLE
Figure BDA0004000020750000955
VT TRIPLE
Figure BDA0004000020750000956
BOLLGARD
Figure BDA0004000020750000957
ROUNDUPREADY 2
Figure BDA0004000020750000958
ROUNDUP
Figure BDA0004000020750000959
2XTENDTM、INTACTA RR2
Figure BDA00040000207500009510
VISTIVE
Figure BDA00040000207500009511
和/或XTENDFLEXTM商品名销售或分销的商品，诸如植物种子。
现在将参考以下实施例描述本发明。应该理解的是，这些实施例并不旨在限制本发明的权利要求的范围，而是意图作为某些实施方案的示例。技术人员想到的示例性方法的任何变化都落入本发明的范围内。
实施例
实施例1设计编辑构建体用于CLE编辑
在专有的玉蜀黍系中鉴定CLE7、CLE14和FCP1的基因组序列。根据这些参考序列，设计间隔子序列(SEQ ID NO：101-104和110-117)用于编辑构建体。将间隔子与Cas-效应子切割酶或Cas-效应子碱基编辑复合物一起安置。设计包含CRISPR-Cas效应物和间隔子序列的编辑构建体以产生四种不同的编辑结果。1)安置Cas-效应子碱基编辑复合物以修饰成熟CLE肽的氨基酸序列，产生CLE7中的D>G变化，CLE14中的V>I或M和E>K变化，以及FCP1中的V>I或M和P>L变化。2)部署Cas-效应子切割酶复合物以产生框架外碱基对缺失，导致通过破坏成熟CLE肽序列，在CLE7、CLE14和FCP1编码区中产生提前终止功能丧失突变。4)部署Cas效应子切割酶复合物以在编码CLE7、CLE14和FCP1成熟肽的序列中产生框架内缺失。5)部署Cas效应子切割酶复合物以在CLE7、CLE14和FCP1编码区内产生小DNA颠换，导致当处于het状态时来自编辑过和未编辑过的基因拷贝的基因转录都显性敲低。这些小DNA重排导致CLE功能的显性降低，这可能是多个CLE基因被靶向进行基于RNA干扰的转录减少的结果。
实施例2被编辑的E0植物的转化和选择
使用土壤杆菌将编码实施例1中产生的间隔子以及选择的CRISPR-Cas效应子的载体引入干燥的切下的玉米胚中。在体外用抗生素选择维持转化的组织以再生阳性转化体。选择健康的非嵌合植物(E0)并***生长盘中。从再生植物收集组织(E0代)用于DNA提取，随后进行分子筛选来鉴定编辑。将选择的E0植物自交以产生E1代。将所选择的E1自交以产生E2代，回交，以产生E2子代，或者与专有的杂合测试系杂交以在杂合状态下测试。
实施例3性状活性的表型评估
将E1、E2、回交的和杂交的材料的种子在平板上种植，然后在出苗后转移到罐中。所有材料在标准温室条件下栽培并生长至繁殖成熟。根据标准实践，在丝出现之前用小纸袋覆盖出现的穗，并且在花期覆盖穗以便基于植物靠植物捕获花粉。
在穗收获和干燥之后，对所有穗手动计数穗行数。数据表示从最明确的行谱线的穗的中间部分取得的每个穗三行计数的平均值。为了防止对行的双重计数，在计数开始的行之间***标记(例如纸夹)，并且指定行计数应该停止的位置。
用佳能数码相机和EOS应用对所有穗进行光记录。随后将图像导入ImageJ中，并使用线轨迹函数测量所有的穗。在图像分析程序中通过设定比例以厘米为单位确定穗长，以输出在用沿着穗的长度从其尖端到穗的基部的线跟踪穗之后以厘米为单位的距离。未被编辑的种质和用Gus质粒转化的品系被用作表型分型的野生型对照。
前述内容对本发明进行了说明，它们不应被解释为对本发明的限制。本发明由所附权利要求书限定，其中各权利要求的等同方式被包括在其中。
序列表
<110> Pairwise Plants Services, Inc.
O'Connor, Devin
<120> 控制分生组织大小以改良作物的方法
<130> 1499.28.WO
<150> US 63/010,887
<151> 2020-04-16
<160> 117
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 1228
<212> PRT
<213> 毛螺菌科的种(Lachnospiraceae sp.)
<400> 1
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Leu Arg Phe Lys Ala Ile Pro Val Gly Lys Thr Gln Glu Asn Ile Asp
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Gly Val Lys Lys Leu Leu Asp Arg Tyr Tyr Leu Ser Phe Ile Asn Asp
50 55 60
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Leu Glu Ile Asn Leu Arg Lys Glu Ile Ala Lys Ala Phe Lys Gly Asn
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180 185 190
Val Asp Ala Ile Phe Asp Lys His Glu Val Gln Glu Ile Lys Glu Lys
195 200 205
Ile Leu Asn Ser Asp Tyr Asp Val Glu Asp Phe Phe Glu Gly Glu Phe
210 215 220
Phe Asn Phe Val Leu Thr Gln Glu Gly Ile Asp Val Tyr Asn Ala Ile
225 230 235 240
Ile Gly Gly Phe Val Thr Glu Ser Gly Glu Lys Ile Lys Gly Leu Asn
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275 280 285
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305 310 315 320
Leu Glu Lys Leu Phe Lys Asn Phe Asp Glu Tyr Ser Ser Ala Gly Ile
325 330 335
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435 440 445
Asn Asp Ala Val Val Ala Ile Met Lys Asp Leu Leu Asp Ser Val Lys
450 455 460
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Asn Arg Asp Glu Ser Phe Tyr Gly Asp Phe Val Leu Ala Tyr Asp Ile
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Leu Leu Lys Val Asp His Ile Tyr Asp Ala Ile Arg Asn Tyr Val Thr
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<210> 2
<211> 1307
<212> PRT
<213> 氨基酸球菌属的种(Acidaminococcus sp.)
<400> 2
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Pro Ile Pro Asp Thr Leu Tyr Gln Glu Leu Tyr Asp Tyr Val Asn His
820 825 830
Arg Leu Ser His Asp Leu Ser Asp Glu Ala Arg Ala Leu Leu Pro Asn
835 840 845
Val Ile Thr Lys Glu Val Ser His Glu Ile Ile Lys Asp Arg Arg Phe
850 855 860
Thr Ser Asp Lys Phe Phe Phe His Val Pro Ile Thr Leu Asn Tyr Gln
865 870 875 880
Ala Ala Asn Ser Pro Ser Lys Phe Asn Gln Arg Val Asn Ala Tyr Leu
885 890 895
Lys Glu His Pro Glu Thr Pro Ile Ile Gly Ile Asp Arg Gly Glu Arg
900 905 910
Asn Leu Ile Tyr Ile Thr Val Ile Asp Ser Thr Gly Lys Ile Leu Glu
915 920 925
Gln Arg Ser Leu Asn Thr Ile Gln Gln Phe Asp Tyr Gln Lys Lys Leu
930 935 940
Asp Asn Arg Glu Lys Glu Arg Val Ala Ala Arg Gln Ala Trp Ser Val
945 950 955 960
Val Gly Thr Ile Lys Asp Leu Lys Gln Gly Tyr Leu Ser Gln Val Ile
965 970 975
His Glu Ile Val Asp Leu Met Ile His Tyr Gln Ala Val Val Val Leu
980 985 990
Glu Asn Leu Asn Phe Gly Phe Lys Ser Lys Arg Thr Gly Ile Ala Glu
995 1000 1005
Lys Ala Val Tyr Gln Gln Phe Glu Lys Met Leu Ile Asp Lys Leu
1010 1015 1020
Asn Cys Leu Val Leu Lys Asp Tyr Pro Ala Glu Lys Val Gly Gly
1025 1030 1035
Val Leu Asn Pro Tyr Gln Leu Thr Asp Gln Phe Thr Ser Phe Ala
1040 1045 1050
Lys Met Gly Thr Gln Ser Gly Phe Leu Phe Tyr Val Pro Ala Pro
1055 1060 1065
Tyr Thr Ser Lys Ile Asp Pro Leu Thr Gly Phe Val Asp Pro Phe
1070 1075 1080
Val Trp Lys Thr Ile Lys Asn His Glu Ser Arg Lys His Phe Leu
1085 1090 1095
Glu Gly Phe Asp Phe Leu His Tyr Asp Val Lys Thr Gly Asp Phe
1100 1105 1110
Ile Leu His Phe Lys Met Asn Arg Asn Leu Ser Phe Gln Arg Gly
1115 1120 1125
Leu Pro Gly Phe Met Pro Ala Trp Asp Ile Val Phe Glu Lys Asn
1130 1135 1140
Glu Thr Gln Phe Asp Ala Lys Gly Thr Pro Phe Ile Ala Gly Lys
1145 1150 1155
Arg Ile Val Pro Val Ile Glu Asn His Arg Phe Thr Gly Arg Tyr
1160 1165 1170
Arg Asp Leu Tyr Pro Ala Asn Glu Leu Ile Ala Leu Leu Glu Glu
1175 1180 1185
Lys Gly Ile Val Phe Arg Asp Gly Ser Asn Ile Leu Pro Lys Leu
1190 1195 1200
Leu Glu Asn Asp Asp Ser His Ala Ile Asp Thr Met Val Ala Leu
1205 1210 1215
Ile Arg Ser Val Leu Gln Met Arg Asn Ser Asn Ala Ala Thr Gly
1220 1225 1230
Glu Asp Tyr Ile Asn Ser Pro Val Arg Asp Leu Asn Gly Val Cys
1235 1240 1245
Phe Asp Ser Arg Phe Gln Asn Pro Glu Trp Pro Met Asp Ala Asp
1250 1255 1260
Ala Asn Gly Ala Tyr His Ile Ala Leu Lys Gly Gln Leu Leu Leu
1265 1270 1275
Asn His Leu Lys Glu Ser Lys Asp Leu Lys Leu Gln Asn Gly Ile
1280 1285 1290
Ser Asn Gln Asp Trp Leu Ala Tyr Ile Gln Glu Leu Arg Asn
1295 1300 1305
<210> 3
<211> 1241
<212> PRT
<213> Butyrivibrio proteoclasticus
<400> 3
Met Leu Leu Tyr Glu Asn Tyr Thr Lys Arg Asn Gln Ile Thr Lys Ser
1 5 10 15
Leu Arg Leu Glu Leu Arg Pro Gln Gly Lys Thr Leu Arg Asn Ile Lys
20 25 30
Glu Leu Asn Leu Leu Glu Gln Asp Lys Ala Ile Tyr Ala Leu Leu Glu
35 40 45
Arg Leu Lys Pro Val Ile Asp Glu Gly Ile Lys Asp Ile Ala Arg Asp
50 55 60
Thr Leu Lys Asn Cys Glu Leu Ser Phe Glu Lys Leu Tyr Glu His Phe
65 70 75 80
Leu Ser Gly Asp Lys Lys Ala Tyr Ala Lys Glu Ser Glu Arg Leu Lys
85 90 95
Lys Glu Ile Val Lys Thr Leu Ile Lys Asn Leu Pro Glu Gly Ile Gly
100 105 110
Lys Ile Ser Glu Ile Asn Ser Ala Lys Tyr Leu Asn Gly Val Leu Tyr
115 120 125
Asp Phe Ile Asp Lys Thr His Lys Asp Ser Glu Glu Lys Gln Asn Ile
130 135 140
Leu Ser Asp Ile Leu Glu Thr Lys Gly Tyr Leu Ala Leu Phe Ser Lys
145 150 155 160
Phe Leu Thr Ser Arg Ile Thr Thr Leu Glu Gln Ser Met Pro Lys Arg
165 170 175
Val Ile Glu Asn Phe Glu Ile Tyr Ala Ala Asn Ile Pro Lys Met Gln
180 185 190
Asp Ala Leu Glu Arg Gly Ala Val Ser Phe Ala Ile Glu Tyr Glu Ser
195 200 205
Ile Cys Ser Val Asp Tyr Tyr Asn Gln Ile Leu Ser Gln Glu Asp Ile
210 215 220
Asp Ser Tyr Asn Arg Leu Ile Ser Gly Ile Met Asp Glu Asp Gly Ala
225 230 235 240
Lys Glu Lys Gly Ile Asn Gln Thr Ile Ser Glu Lys Asn Ile Lys Ile
245 250 255
Lys Ser Glu His Leu Glu Glu Lys Pro Phe Arg Ile Leu Lys Gln Leu
260 265 270
His Lys Gln Ile Leu Glu Glu Arg Glu Lys Ala Phe Thr Ile Asp His
275 280 285
Ile Asp Ser Asp Glu Glu Val Val Gln Val Thr Lys Glu Ala Phe Glu
290 295 300
Gln Thr Lys Glu Gln Trp Glu Asn Ile Lys Lys Ile Asn Gly Phe Tyr
305 310 315 320
Ala Lys Asp Pro Gly Asp Ile Thr Leu Phe Ile Val Val Gly Pro Asn
325 330 335
Gln Thr His Val Leu Ser Gln Leu Ile Tyr Gly Glu His Asp Arg Ile
340 345 350
Arg Leu Leu Leu Glu Glu Tyr Glu Lys Asn Thr Leu Glu Val Leu Pro
355 360 365
Arg Arg Thr Lys Ser Glu Asp Ala Arg Tyr Asp Lys Phe Val Asn Ala
370 375 380
Val Pro Lys Lys Val Ala Lys Glu Ser His Thr Phe Asp Gly Leu Gln
385 390 395 400
Lys Met Thr Gly Asp Asp Arg Leu Phe Ile Leu Tyr Arg Asp Glu Leu
405 410 415
Ala Arg Asn Tyr Met Arg Ile Lys Glu Ala Tyr Gly Thr Phe Glu Arg
420 425 430
Asp Ile Leu Lys Ser Arg Arg Gly Ile Lys Gly Asn Arg Asp Val Gln
435 440 445
Glu Ser Leu Val Ser Phe Tyr Asp Glu Leu Thr Lys Phe Arg Ser Ala
450 455 460
Leu Arg Ile Ile Asn Ser Gly Asn Asp Glu Lys Ala Asp Pro Ile Phe
465 470 475 480
Tyr Asn Thr Phe Asp Gly Ile Phe Glu Lys Ala Asn Arg Thr Tyr Lys
485 490 495
Ala Glu Asn Leu Cys Arg Asn Tyr Val Thr Lys Ser Pro Ala Asp Asp
500 505 510
Ala Arg Ile Met Ala Ser Cys Leu Gly Thr Pro Ala Arg Leu Arg Thr
515 520 525
His Trp Trp Asn Gly Glu Glu Asn Phe Ala Ile Asn Asp Val Ala Met
530 535 540
Ile Arg Arg Gly Asp Glu Tyr Tyr Tyr Phe Val Leu Thr Pro Asp Val
545 550 555 560
Lys Pro Val Asp Leu Lys Thr Lys Asp Glu Thr Asp Ala Gln Ile Phe
565 570 575
Val Gln Arg Lys Gly Ala Lys Ser Phe Leu Gly Leu Pro Lys Ala Leu
580 585 590
Phe Lys Cys Ile Leu Glu Pro Tyr Phe Glu Ser Pro Glu His Lys Asn
595 600 605
Asp Lys Asn Cys Val Ile Glu Glu Tyr Val Ser Lys Pro Leu Thr Ile
610 615 620
Asp Arg Arg Ala Tyr Asp Ile Phe Lys Asn Gly Thr Phe Lys Lys Thr
625 630 635 640
Asn Ile Gly Ile Asp Gly Leu Thr Glu Glu Lys Phe Lys Asp Asp Cys
645 650 655
Arg Tyr Leu Ile Asp Val Tyr Lys Glu Phe Ile Ala Val Tyr Thr Arg
660 665 670
Tyr Ser Cys Phe Asn Met Ser Gly Leu Lys Arg Ala Asp Glu Tyr Asn
675 680 685
Asp Ile Gly Glu Phe Phe Ser Asp Val Asp Thr Arg Leu Cys Thr Met
690 695 700
Glu Trp Ile Pro Val Ser Phe Glu Arg Ile Asn Asp Met Val Asp Lys
705 710 715 720
Lys Glu Gly Leu Leu Phe Leu Val Arg Ser Met Phe Leu Tyr Asn Arg
725 730 735
Pro Arg Lys Pro Tyr Glu Arg Thr Phe Ile Gln Leu Phe Ser Asp Ser
740 745 750
Asn Met Glu His Thr Ser Met Leu Leu Asn Ser Arg Ala Met Ile Gln
755 760 765
Tyr Arg Ala Ala Ser Leu Pro Arg Arg Val Thr His Lys Lys Gly Ser
770 775 780
Ile Leu Val Ala Leu Arg Asp Ser Asn Gly Glu His Ile Pro Met His
785 790 795 800
Ile Arg Glu Ala Ile Tyr Lys Met Lys Asn Asn Phe Asp Ile Ser Ser
805 810 815
Glu Asp Phe Ile Met Ala Lys Ala Tyr Leu Ala Glu His Asp Val Ala
820 825 830
Ile Lys Lys Ala Asn Glu Asp Ile Ile Arg Asn Arg Arg Tyr Thr Glu
835 840 845
Asp Lys Phe Phe Leu Ser Leu Ser Tyr Thr Lys Asn Ala Asp Ile Ser
850 855 860
Ala Arg Thr Leu Asp Tyr Ile Asn Asp Lys Val Glu Glu Asp Thr Gln
865 870 875 880
Asp Ser Arg Met Ala Val Ile Val Thr Arg Asn Leu Lys Asp Leu Thr
885 890 895
Tyr Val Ala Val Val Asp Glu Lys Asn Asn Val Leu Glu Glu Lys Ser
900 905 910
Leu Asn Glu Ile Asp Gly Val Asn Tyr Arg Glu Leu Leu Lys Glu Arg
915 920 925
Thr Lys Ile Lys Tyr His Asp Lys Thr Arg Leu Trp Gln Tyr Asp Val
930 935 940
Ser Ser Lys Gly Leu Lys Glu Ala Tyr Val Glu Leu Ala Val Thr Gln
945 950 955 960
Ile Ser Lys Leu Ala Thr Lys Tyr Asn Ala Val Val Val Val Glu Ser
965 970 975
Met Ser Ser Thr Phe Lys Asp Lys Phe Ser Phe Leu Asp Glu Gln Ile
980 985 990
Phe Lys Ala Phe Glu Ala Arg Leu Cys Ala Arg Met Ser Asp Leu Ser
995 1000 1005
Phe Asn Thr Ile Lys Glu Gly Glu Ala Gly Ser Ile Ser Asn Pro
1010 1015 1020
Ile Gln Val Ser Asn Asn Asn Gly Asn Ser Tyr Gln Asp Gly Val
1025 1030 1035
Ile Tyr Phe Leu Asn Asn Ala Tyr Thr Arg Thr Leu Cys Pro Asp
1040 1045 1050
Thr Gly Phe Val Asp Val Phe Asp Lys Thr Arg Leu Ile Thr Met
1055 1060 1065
Gln Ser Lys Arg Gln Phe Phe Ala Lys Met Lys Asp Ile Arg Ile
1070 1075 1080
Asp Asp Gly Glu Met Leu Phe Thr Phe Asn Leu Glu Glu Tyr Pro
1085 1090 1095
Thr Lys Arg Leu Leu Asp Arg Lys Glu Trp Thr Val Lys Ile Ala
1100 1105 1110
Gly Asp Gly Ser Tyr Phe Asp Lys Asp Lys Gly Glu Tyr Val Tyr
1115 1120 1125
Val Asn Asp Ile Val Arg Glu Gln Ile Ile Pro Ala Leu Leu Glu
1130 1135 1140
Asp Lys Ala Val Phe Asp Gly Asn Met Ala Glu Lys Phe Leu Asp
1145 1150 1155
Lys Thr Ala Ile Ser Gly Lys Ser Val Glu Leu Ile Tyr Lys Trp
1160 1165 1170
Phe Ala Asn Ala Leu Tyr Gly Ile Ile Thr Lys Lys Asp Gly Glu
1175 1180 1185
Lys Ile Tyr Arg Ser Pro Ile Thr Gly Thr Glu Ile Asp Val Ser
1190 1195 1200
Lys Asn Thr Thr Tyr Asn Phe Gly Lys Lys Phe Met Phe Lys Gln
1205 1210 1215
Glu Tyr Arg Gly Asp Gly Asp Phe Leu Asp Ala Phe Leu Asn Tyr
1220 1225 1230
Met Gln Ala Gln Asp Ile Ala Val
1235 1240
<210> 4
<211> 1238
<212> PRT
<213> Candidatus Methanoplasma termitum
<400> 4
Met Asn Asn Tyr Asp Glu Phe Thr Lys Leu Tyr Pro Ile Gln Lys Thr
1 5 10 15
Ile Arg Phe Glu Leu Lys Pro Gln Gly Arg Thr Met Glu His Leu Glu
20 25 30
Thr Phe Asn Phe Phe Glu Glu Asp Arg Asp Arg Ala Glu Lys Tyr Lys
35 40 45
Ile Leu Lys Glu Ala Ile Asp Glu Tyr His Lys Lys Phe Ile Asp Glu
50 55 60
His Leu Thr Asn Met Ser Leu Asp Trp Asn Ser Leu Lys Gln Ile Ser
65 70 75 80
Glu Lys Tyr Tyr Lys Ser Arg Glu Glu Lys Asp Lys Lys Val Phe Leu
85 90 95
Ser Glu Gln Lys Arg Met Arg Gln Glu Ile Val Ser Glu Phe Lys Lys
100 105 110
Asp Asp Arg Phe Lys Asp Leu Phe Ser Lys Lys Leu Phe Ser Glu Leu
115 120 125
Leu Lys Glu Glu Ile Tyr Lys Lys Gly Asn His Gln Glu Ile Asp Ala
130 135 140
Leu Lys Ser Phe Asp Lys Phe Ser Gly Tyr Phe Ile Gly Leu His Glu
145 150 155 160
Asn Arg Lys Asn Met Tyr Ser Asp Gly Asp Glu Ile Thr Ala Ile Ser
165 170 175
Asn Arg Ile Val Asn Glu Asn Phe Pro Lys Phe Leu Asp Asn Leu Gln
180 185 190
Lys Tyr Gln Glu Ala Arg Lys Lys Tyr Pro Glu Trp Ile Ile Lys Ala
195 200 205
Glu Ser Ala Leu Val Ala His Asn Ile Lys Met Asp Ile Val Phe Ser
210 215 220
Leu Glu Tyr Phe Asn Lys Val Leu Asn Gln Glu Gly Ile Gln Arg Tyr
225 230 235 240
Asn Leu Ala Leu Gly Gly Tyr Val Thr Lys Ser Gly Glu Lys Met Met
245 250 255
Gly Leu Asn Asp Ala Leu Asn Leu Ala His Gln Ser Glu Lys Ser Ser
260 265 270
Lys Gly Arg Ile His Met Thr Pro Leu Phe Lys Gln Ile Leu Ser Glu
275 280 285
Lys Glu Ser Phe Ser Tyr Ile Pro Asp Val Phe Thr Glu Asp Ser Gln
290 295 300
Leu Leu Pro Ser Ile Gly Gly Phe Phe Ala Gln Ile Glu Asn Asp Lys
305 310 315 320
Asp Gly Asn Ile Phe Asp Arg Ala Leu Glu Leu Ile Ser Ser Tyr Ala
325 330 335
Glu Tyr Asp Thr Glu Arg Ile Tyr Ile Arg Gln Ala Asp Ile Asn Arg
340 345 350
Val Ser Asn Val Ile Phe Gly Glu Trp Gly Thr Leu Gly Gly Leu Met
355 360 365
Arg Glu Tyr Lys Ala Asp Ser Ile Asn Asp Ile Asn Leu Glu Arg Thr
370 375 380
Cys Lys Lys Val Asp Lys Trp Leu Asp Ser Lys Glu Phe Ala Leu Ser
385 390 395 400
Asp Val Leu Glu Ala Ile Asp Arg Thr Gly Asn Asn Asp Ala Phe Asn
405 410 415
Glu Tyr Ile Ser Lys Met Arg Thr Ala Arg Glu Lys Ile Asp Ala Ala
420 425 430
Arg Lys Glu Met Lys Phe Ile Ser Glu Lys Ile Ser Gly Asp Glu Glu
435 440 445
Ser Ile His Ile Ile Lys Thr Leu Leu Asp Ser Val Gln Gln Phe Leu
450 455 460
His Phe Phe Asn Leu Phe Lys Ala Arg Gln Asp Ile Pro Leu Asp Gly
465 470 475 480
Ala Phe Tyr Ala Glu Phe Asp Glu Val His Ser Lys Leu Phe Ala Ile
485 490 495
Val Pro Leu Tyr Asn Lys Val Arg Asn Tyr Leu Thr Lys Asn Asn Leu
500 505 510
Asn Thr Lys Lys Ile Lys Leu Asn Phe Lys Asn Pro Thr Leu Ala Asn
515 520 525
Gly Trp Asp Gln Asn Lys Val Tyr Asp Tyr Ala Ser Leu Ile Phe Leu
530 535 540
Arg Asp Gly Asn Tyr Tyr Leu Gly Ile Ile Asn Pro Lys Arg Lys Lys
545 550 555 560
Asn Ile Lys Phe Glu Gln Gly Ser Gly Asn Gly Pro Phe Tyr Arg Lys
565 570 575
Met Val Tyr Lys Gln Ile Pro Gly Pro Asn Lys Asn Leu Arg Pro Val
580 585 590
Phe Leu Thr Ser Thr Lys Gly Lys Lys Glu Tyr Lys Pro Ser Lys Glu
595 600 605
Ile Ile Glu Gly Tyr Glu Ala Asp Lys His Ile Arg Gly Asp Lys Phe
610 615 620
Asp Leu Asp Phe Cys His Lys Leu Ile Asp Phe Phe Lys Glu Ser Ile
625 630 635 640
Glu Lys His Lys Asp Trp Ser Lys Phe Asn Phe Tyr Phe Ser Pro Thr
645 650 655
Glu Ser Tyr Gly Asp Ile Ser Glu Phe Tyr Leu Asp Val Glu Lys Gln
660 665 670
Gly Tyr Arg Met His Phe Glu Asn Ile Ser Ala Glu Thr Ile Asp Glu
675 680 685
Tyr Val Glu Lys Gly Asp Leu Phe Leu Phe Gln Ile Tyr Asn Lys Asp
690 695 700
Phe Val Lys Ala Ala Thr Gly Lys Lys Asp Met His Thr Ile Tyr Trp
705 710 715 720
Asn Ala Ala Phe Ser Pro Glu Asn Leu Gln Asp Val Val Val Lys Leu
725 730 735
Asn Gly Glu Ala Glu Leu Phe Tyr Arg Asp Lys Ser Asp Ile Lys Glu
740 745 750
Ile Val His Arg Glu Gly Glu Ile Leu Val Asn Arg Thr Tyr Asn Gly
755 760 765
Arg Thr Pro Val Pro Asp Lys Ile His Lys Lys Leu Thr Asp Tyr His
770 775 780
Asn Gly Arg Thr Lys Asp Leu Gly Glu Ala Lys Glu Tyr Leu Asp Lys
785 790 795 800
Val Arg Tyr Phe Lys Ala His Tyr Asp Ile Thr Lys Asp Arg Arg Tyr
805 810 815
Leu Asn Asp Lys Ile Tyr Phe His Val Pro Leu Thr Leu Asn Phe Lys
820 825 830
Ala Asn Gly Lys Lys Asn Leu Asn Lys Met Val Ile Glu Lys Phe Leu
835 840 845
Ser Asp Glu Lys Ala His Ile Ile Gly Ile Asp Arg Gly Glu Arg Asn
850 855 860
Leu Leu Tyr Tyr Ser Ile Ile Asp Arg Ser Gly Lys Ile Ile Asp Gln
865 870 875 880
Gln Ser Leu Asn Val Ile Asp Gly Phe Asp Tyr Arg Glu Lys Leu Asn
885 890 895
Gln Arg Glu Ile Glu Met Lys Asp Ala Arg Gln Ser Trp Asn Ala Ile
900 905 910
Gly Lys Ile Lys Asp Leu Lys Glu Gly Tyr Leu Ser Lys Ala Val His
915 920 925
Glu Ile Thr Lys Met Ala Ile Gln Tyr Asn Ala Ile Val Val Met Glu
930 935 940
Glu Leu Asn Tyr Gly Phe Lys Arg Gly Arg Phe Lys Val Glu Lys Gln
945 950 955 960
Ile Tyr Gln Lys Phe Glu Asn Met Leu Ile Asp Lys Met Asn Tyr Leu
965 970 975
Val Phe Lys Asp Ala Pro Asp Glu Ser Pro Gly Gly Val Leu Asn Ala
980 985 990
Tyr Gln Leu Thr Asn Pro Leu Glu Ser Phe Ala Lys Leu Gly Lys Gln
995 1000 1005
Thr Gly Ile Leu Phe Tyr Val Pro Ala Ala Tyr Thr Ser Lys Ile
1010 1015 1020
Asp Pro Thr Thr Gly Phe Val Asn Leu Phe Asn Thr Ser Ser Lys
1025 1030 1035
Thr Asn Ala Gln Glu Arg Lys Glu Phe Leu Gln Lys Phe Glu Ser
1040 1045 1050
Ile Ser Tyr Ser Ala Lys Asp Gly Gly Ile Phe Ala Phe Ala Phe
1055 1060 1065
Asp Tyr Arg Lys Phe Gly Thr Ser Lys Thr Asp His Lys Asn Val
1070 1075 1080
Trp Thr Ala Tyr Thr Asn Gly Glu Arg Met Arg Tyr Ile Lys Glu
1085 1090 1095
Lys Lys Arg Asn Glu Leu Phe Asp Pro Ser Lys Glu Ile Lys Glu
1100 1105 1110
Ala Leu Thr Ser Ser Gly Ile Lys Tyr Asp Gly Gly Gln Asn Ile
1115 1120 1125
Leu Pro Asp Ile Leu Arg Ser Asn Asn Asn Gly Leu Ile Tyr Thr
1130 1135 1140
Met Tyr Ser Ser Phe Ile Ala Ala Ile Gln Met Arg Val Tyr Asp
1145 1150 1155
Gly Lys Glu Asp Tyr Ile Ile Ser Pro Ile Lys Asn Ser Lys Gly
1160 1165 1170
Glu Phe Phe Arg Thr Asp Pro Lys Arg Arg Glu Leu Pro Ile Asp
1175 1180 1185
Ala Asp Ala Asn Gly Ala Tyr Asn Ile Ala Leu Arg Gly Glu Leu
1190 1195 1200
Thr Met Arg Ala Ile Ala Glu Lys Phe Asp Pro Asp Ser Glu Lys
1205 1210 1215
Met Ala Lys Leu Glu Leu Lys His Lys Asp Trp Phe Glu Phe Met
1220 1225 1230
Gln Thr Arg Gly Asp
1235
<210> 5
<211> 1281
<212> PRT
<213> 挑剔真杆菌(Eubacterium eligens)
<400> 5
Met Asn Gly Asn Arg Ser Ile Val Tyr Arg Glu Phe Val Gly Val Ile
1 5 10 15
Pro Val Ala Lys Thr Leu Arg Asn Glu Leu Arg Pro Val Gly His Thr
20 25 30
Gln Glu His Ile Ile Gln Asn Gly Leu Ile Gln Glu Asp Glu Leu Arg
35 40 45
Gln Glu Lys Ser Thr Glu Leu Lys Asn Ile Met Asp Asp Tyr Tyr Arg
50 55 60
Glu Tyr Ile Asp Lys Ser Leu Ser Gly Val Thr Asp Leu Asp Phe Thr
65 70 75 80
Leu Leu Phe Glu Leu Met Asn Leu Val Gln Ser Ser Pro Ser Lys Asp
85 90 95
Asn Lys Lys Ala Leu Glu Lys Glu Gln Ser Lys Met Arg Glu Gln Ile
100 105 110
Cys Thr His Leu Gln Ser Asp Ser Asn Tyr Lys Asn Ile Phe Asn Ala
115 120 125
Lys Leu Leu Lys Glu Ile Leu Pro Asp Phe Ile Lys Asn Tyr Asn Gln
130 135 140
Tyr Asp Val Lys Asp Lys Ala Gly Lys Leu Glu Thr Leu Ala Leu Phe
145 150 155 160
Asn Gly Phe Ser Thr Tyr Phe Thr Asp Phe Phe Glu Lys Arg Lys Asn
165 170 175
Val Phe Thr Lys Glu Ala Val Ser Thr Ser Ile Ala Tyr Arg Ile Val
180 185 190
His Glu Asn Ser Leu Ile Phe Leu Ala Asn Met Thr Ser Tyr Lys Lys
195 200 205
Ile Ser Glu Lys Ala Leu Asp Glu Ile Glu Val Ile Glu Lys Asn Asn
210 215 220
Gln Asp Lys Met Gly Asp Trp Glu Leu Asn Gln Ile Phe Asn Pro Asp
225 230 235 240
Phe Tyr Asn Met Val Leu Ile Gln Ser Gly Ile Asp Phe Tyr Asn Glu
245 250 255
Ile Cys Gly Val Val Asn Ala His Met Asn Leu Tyr Cys Gln Gln Thr
260 265 270
Lys Asn Asn Tyr Asn Leu Phe Lys Met Arg Lys Leu His Lys Gln Ile
275 280 285
Leu Ala Tyr Thr Ser Thr Ser Phe Glu Val Pro Lys Met Phe Glu Asp
290 295 300
Asp Met Ser Val Tyr Asn Ala Val Asn Ala Phe Ile Asp Glu Thr Glu
305 310 315 320
Lys Gly Asn Ile Ile Gly Lys Leu Lys Asp Ile Val Asn Lys Tyr Asp
325 330 335
Glu Leu Asp Glu Lys Arg Ile Tyr Ile Ser Lys Asp Phe Tyr Glu Thr
340 345 350
Leu Ser Cys Phe Met Ser Gly Asn Trp Asn Leu Ile Thr Gly Cys Val
355 360 365
Glu Asn Phe Tyr Asp Glu Asn Ile His Ala Lys Gly Lys Ser Lys Glu
370 375 380
Glu Lys Val Lys Lys Ala Val Lys Glu Asp Lys Tyr Lys Ser Ile Asn
385 390 395 400
Asp Val Asn Asp Leu Val Glu Lys Tyr Ile Asp Glu Lys Glu Arg Asn
405 410 415
Glu Phe Lys Asn Ser Asn Ala Lys Gln Tyr Ile Arg Glu Ile Ser Asn
420 425 430
Ile Ile Thr Asp Thr Glu Thr Ala His Leu Glu Tyr Asp Asp His Ile
435 440 445
Ser Leu Ile Glu Ser Glu Glu Lys Ala Asp Glu Met Lys Lys Arg Leu
450 455 460
Asp Met Tyr Met Asn Met Tyr His Trp Ala Lys Ala Phe Ile Val Asp
465 470 475 480
Glu Val Leu Asp Arg Asp Glu Met Phe Tyr Ser Asp Ile Asp Asp Ile
485 490 495
Tyr Asn Ile Leu Glu Asn Ile Val Pro Leu Tyr Asn Arg Val Arg Asn
500 505 510
Tyr Val Thr Gln Lys Pro Tyr Asn Ser Lys Lys Ile Lys Leu Asn Phe
515 520 525
Gln Ser Pro Thr Leu Ala Asn Gly Trp Ser Gln Ser Lys Glu Phe Asp
530 535 540
Asn Asn Ala Ile Ile Leu Ile Arg Asp Asn Lys Tyr Tyr Leu Ala Ile
545 550 555 560
Phe Asn Ala Lys Asn Lys Pro Asp Lys Lys Ile Ile Gln Gly Asn Ser
565 570 575
Asp Lys Lys Asn Asp Asn Asp Tyr Lys Lys Met Val Tyr Asn Leu Leu
580 585 590
Pro Gly Ala Asn Lys Met Leu Pro Lys Val Phe Leu Ser Lys Lys Gly
595 600 605
Ile Glu Thr Phe Lys Pro Ser Asp Tyr Ile Ile Ser Gly Tyr Asn Ala
610 615 620
His Lys His Ile Lys Thr Ser Glu Asn Phe Asp Ile Ser Phe Cys Arg
625 630 635 640
Asp Leu Ile Asp Tyr Phe Lys Asn Ser Ile Glu Lys His Ala Glu Trp
645 650 655
Arg Lys Tyr Glu Phe Lys Phe Ser Ala Thr Asp Ser Tyr Ser Asp Ile
660 665 670
Ser Glu Phe Tyr Arg Glu Val Glu Met Gln Gly Tyr Arg Ile Asp Trp
675 680 685
Thr Tyr Ile Ser Glu Ala Asp Ile Asn Lys Leu Asp Glu Glu Gly Lys
690 695 700
Ile Tyr Leu Phe Gln Ile Tyr Asn Lys Asp Phe Ala Glu Asn Ser Thr
705 710 715 720
Gly Lys Glu Asn Leu His Thr Met Tyr Phe Lys Asn Ile Phe Ser Glu
725 730 735
Glu Asn Leu Asp Lys Ile Ile Lys Leu Asn Gly Gln Ala Glu Leu Phe
740 745 750
Tyr Arg Arg Ala Ser Val Lys Asn Pro Val Lys His Lys Lys Asp Ser
755 760 765
Val Leu Val Asn Lys Thr Tyr Lys Asn Gln Leu Asp Asn Gly Asp Val
770 775 780
Val Arg Ile Pro Ile Pro Asp Asp Ile Tyr Asn Glu Ile Tyr Lys Met
785 790 795 800
Tyr Asn Gly Tyr Ile Lys Glu Ser Asp Leu Ser Glu Ala Ala Lys Glu
805 810 815
Tyr Leu Asp Lys Val Glu Val Arg Thr Ala Gln Lys Asp Ile Val Lys
820 825 830
Asp Tyr Arg Tyr Thr Val Asp Lys Tyr Phe Ile His Thr Pro Ile Thr
835 840 845
Ile Asn Tyr Lys Val Thr Ala Arg Asn Asn Val Asn Asp Met Val Val
850 855 860
Lys Tyr Ile Ala Gln Asn Asp Asp Ile His Val Ile Gly Ile Asp Arg
865 870 875 880
Gly Glu Arg Asn Leu Ile Tyr Ile Ser Val Ile Asp Ser His Gly Asn
885 890 895
Ile Val Lys Gln Lys Ser Tyr Asn Ile Leu Asn Asn Tyr Asp Tyr Lys
900 905 910
Lys Lys Leu Val Glu Lys Glu Lys Thr Arg Glu Tyr Ala Arg Lys Asn
915 920 925
Trp Lys Ser Ile Gly Asn Ile Lys Glu Leu Lys Glu Gly Tyr Ile Ser
930 935 940
Gly Val Val His Glu Ile Ala Met Leu Ile Val Glu Tyr Asn Ala Ile
945 950 955 960
Ile Ala Met Glu Asp Leu Asn Tyr Gly Phe Lys Arg Gly Arg Phe Lys
965 970 975
Val Glu Arg Gln Val Tyr Gln Lys Phe Glu Ser Met Leu Ile Asn Lys
980 985 990
Leu Asn Tyr Phe Ala Ser Lys Glu Lys Ser Val Asp Glu Pro Gly Gly
995 1000 1005
Leu Leu Lys Gly Tyr Gln Leu Thr Tyr Val Pro Asp Asn Ile Lys
1010 1015 1020
Asn Leu Gly Lys Gln Cys Gly Val Ile Phe Tyr Val Pro Ala Ala
1025 1030 1035
Phe Thr Ser Lys Ile Asp Pro Ser Thr Gly Phe Ile Ser Ala Phe
1040 1045 1050
Asn Phe Lys Ser Ile Ser Thr Asn Ala Ser Arg Lys Gln Phe Phe
1055 1060 1065
Met Gln Phe Asp Glu Ile Arg Tyr Cys Ala Glu Lys Asp Met Phe
1070 1075 1080
Ser Phe Gly Phe Asp Tyr Asn Asn Phe Asp Thr Tyr Asn Ile Thr
1085 1090 1095
Met Gly Lys Thr Gln Trp Thr Val Tyr Thr Asn Gly Glu Arg Leu
1100 1105 1110
Gln Ser Glu Phe Asn Asn Ala Arg Arg Thr Gly Lys Thr Lys Ser
1115 1120 1125
Ile Asn Leu Thr Glu Thr Ile Lys Leu Leu Leu Glu Asp Asn Glu
1130 1135 1140
Ile Asn Tyr Ala Asp Gly His Asp Ile Arg Ile Asp Met Glu Lys
1145 1150 1155
Met Asp Glu Asp Lys Lys Ser Glu Phe Phe Ala Gln Leu Leu Ser
1160 1165 1170
Leu Tyr Lys Leu Thr Val Gln Met Arg Asn Ser Tyr Thr Glu Ala
1175 1180 1185
Glu Glu Gln Glu Asn Gly Ile Ser Tyr Asp Lys Ile Ile Ser Pro
1190 1195 1200
Val Ile Asn Asp Glu Gly Glu Phe Phe Asp Ser Asp Asn Tyr Lys
1205 1210 1215
Glu Ser Asp Asp Lys Glu Cys Lys Met Pro Lys Asp Ala Asp Ala
1220 1225 1230
Asn Gly Ala Tyr Cys Ile Ala Leu Lys Gly Leu Tyr Glu Val Leu
1235 1240 1245
Lys Ile Lys Ser Glu Trp Thr Glu Asp Gly Phe Asp Arg Asn Cys
1250 1255 1260
Leu Lys Leu Pro His Ala Glu Trp Leu Asp Phe Ile Gln Asn Lys
1265 1270 1275
Arg Tyr Glu
1280
<210> 6
<211> 1300
<212> PRT
<213> 新凶手弗朗西斯菌(Francisella novicida)
<400> 6
Met Ser Ile Tyr Gln Glu Phe Val Asn Lys Tyr Ser Leu Ser Lys Thr
1 5 10 15
Leu Arg Phe Glu Leu Ile Pro Gln Gly Lys Thr Leu Glu Asn Ile Lys
20 25 30
Ala Arg Gly Leu Ile Leu Asp Asp Glu Lys Arg Ala Lys Asp Tyr Lys
35 40 45
Lys Ala Lys Gln Ile Ile Asp Lys Tyr His Gln Phe Phe Ile Glu Glu
50 55 60
Ile Leu Ser Ser Val Cys Ile Ser Glu Asp Leu Leu Gln Asn Tyr Ser
65 70 75 80
Asp Val Tyr Phe Lys Leu Lys Lys Ser Asp Asp Asp Asn Leu Gln Lys
85 90 95
Asp Phe Lys Ser Ala Lys Asp Thr Ile Lys Lys Gln Ile Ser Glu Tyr
100 105 110
Ile Lys Asp Ser Glu Lys Phe Lys Asn Leu Phe Asn Gln Asn Leu Ile
115 120 125
Asp Ala Lys Lys Gly Gln Glu Ser Asp Leu Ile Leu Trp Leu Lys Gln
130 135 140
Ser Lys Asp Asn Gly Ile Glu Leu Phe Lys Ala Asn Ser Asp Ile Thr
145 150 155 160
Asp Ile Asp Glu Ala Leu Glu Ile Ile Lys Ser Phe Lys Gly Trp Thr
165 170 175
Thr Tyr Phe Lys Gly Phe His Glu Asn Arg Lys Val Asn Tyr Ser Ser
180 185 190
Asn Asp Ile Pro Thr Ser Ile Ile Tyr Arg Ile Val Asp Asp Asn Leu
195 200 205
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210 215 220
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225 230 235 240
Glu Leu Thr Phe Asp Ile Asp Tyr Lys Thr Ser Glu Val Asn Gln Arg
245 250 255
Val Phe Ser Leu Asp Glu Val Phe Glu Ile Ala Asn Phe Asn Asn Tyr
260 265 270
Leu Asn Gln Ser Gly Ile Thr Lys Phe Asn Thr Ile Ile Gly Gly Lys
275 280 285
Phe Val Asn Gly Glu Asn Thr Lys Arg Lys Gly Ile Asn Glu Tyr Ile
290 295 300
Asn Leu Tyr Ser Gln Gln Ile Asn Asp Lys Thr Leu Lys Lys Tyr Lys
305 310 315 320
Met Ser Val Leu Phe Lys Gln Ile Leu Ser Asp Thr Glu Ser Lys Ser
325 330 335
Phe Val Ile Asp Lys Leu Glu Asp Asp Ser Asp Val Val Thr Thr Met
340 345 350
Gln Ser Phe Tyr Glu Gln Ile Ala Ala Phe Lys Thr Val Glu Glu Lys
355 360 365
Ser Ile Lys Glu Thr Leu Ser Leu Leu Phe Asp Asp Leu Lys Ala Gln
370 375 380
Lys Leu Asp Leu Ser Lys Ile Tyr Phe Lys Asn Asp Lys Ser Leu Thr
385 390 395 400
Asp Leu Ser Gln Gln Val Phe Asp Asp Tyr Ser Val Ile Gly Thr Ala
405 410 415
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420 425 430
Pro Ser Lys Lys Glu Gln Glu Leu Ile Ala Lys Lys Thr Glu Lys Ala
435 440 445
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450 455 460
Lys His Arg Asp Ile Asp Lys Gln Cys Arg Phe Glu Glu Ile Leu Ala
465 470 475 480
Asn Phe Ala Ala Ile Pro Met Ile Phe Asp Glu Ile Ala Gln Asn Lys
485 490 495
Asp Asn Leu Ala Gln Ile Ser Ile Lys Tyr Gln Asn Gln Gly Lys Lys
500 505 510
Asp Leu Leu Gln Ala Ser Ala Glu Asp Asp Val Lys Ala Ile Lys Asp
515 520 525
Leu Leu Asp Gln Thr Asn Asn Leu Leu His Lys Leu Lys Ile Phe His
530 535 540
Ile Ser Gln Ser Glu Asp Lys Ala Asn Ile Leu Asp Lys Asp Glu His
545 550 555 560
Phe Tyr Leu Val Phe Glu Glu Cys Tyr Phe Glu Leu Ala Asn Ile Val
565 570 575
Pro Leu Tyr Asn Lys Ile Arg Asn Tyr Ile Thr Gln Lys Pro Tyr Ser
580 585 590
Asp Glu Lys Phe Lys Leu Asn Phe Glu Asn Ser Thr Leu Ala Asn Gly
595 600 605
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Asp Asp Lys Tyr Tyr Leu Gly Val Met Asn Lys Lys Asn Asn Lys Ile
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645 650 655
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660 665 670
Phe Phe Ser Ala Lys Ser Ile Lys Phe Tyr Asn Pro Ser Glu Asp Ile
675 680 685
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690 695 700
Lys Gly Tyr Glu Lys Phe Glu Phe Asn Ile Glu Asp Cys Arg Lys Phe
705 710 715 720
Ile Asp Phe Tyr Lys Gln Ser Ile Ser Lys His Pro Glu Trp Lys Asp
725 730 735
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755 760 765
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Ile Ala Asn Lys Asn Lys Asp Asn Pro Lys Lys Glu Ser Val Phe Glu
850 855 860
Tyr Asp Leu Ile Lys Asp Lys Arg Phe Thr Glu Asp Lys Phe Phe Phe
865 870 875 880
His Cys Pro Ile Thr Ile Asn Phe Lys Ser Ser Gly Ala Asn Lys Phe
885 890 895
Asn Asp Glu Ile Asn Leu Leu Leu Lys Glu Lys Ala Asn Asp Val His
900 905 910
Ile Leu Ser Ile Asp Arg Gly Glu Arg His Leu Ala Tyr Tyr Thr Leu
915 920 925
Val Asp Gly Lys Gly Asn Ile Ile Lys Gln Asp Thr Phe Asn Ile Ile
930 935 940
Gly Asn Asp Arg Met Lys Thr Asn Tyr His Asp Lys Leu Ala Ala Ile
945 950 955 960
Glu Lys Asp Arg Asp Ser Ala Arg Lys Asp Trp Lys Lys Ile Asn Asn
965 970 975
Ile Lys Glu Met Lys Glu Gly Tyr Leu Ser Gln Val Val His Glu Ile
980 985 990
Ala Lys Leu Val Ile Glu Tyr Asn Ala Ile Val Val Phe Glu Asp Leu
995 1000 1005
Asn Phe Gly Phe Lys Arg Gly Arg Phe Lys Val Glu Lys Gln Val
1010 1015 1020
Tyr Gln Lys Leu Glu Lys Met Leu Ile Glu Lys Leu Asn Tyr Leu
1025 1030 1035
Val Phe Lys Asp Asn Glu Phe Asp Lys Thr Gly Gly Val Leu Arg
1040 1045 1050
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Lys Gln Thr Gly Ile Ile Tyr Tyr Val Pro Ala Gly Phe Thr Ser
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Lys Ile Cys Pro Val Thr Gly Phe Val Asn Gln Leu Tyr Pro Lys
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Tyr Glu Ser Val Ser Lys Ser Gln Glu Phe Phe Ser Lys Phe Asp
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Lys Ile Cys Tyr Asn Leu Asp Lys Gly Tyr Phe Glu Phe Ser Phe
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Asp Tyr Lys Asn Phe Gly Asp Lys Ala Ala Lys Gly Lys Trp Thr
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Phe Ala Lys Leu Thr Ser Val Leu Asn Thr Ile Leu Gln Met Arg
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Asn Ser Lys Thr Gly Thr Glu Leu Asp Tyr Leu Ile Ser Pro Val
1220 1225 1230
Ala Asp Val Asn Gly Asn Phe Phe Asp Ser Arg Gln Ala Pro Lys
1235 1240 1245
Asn Met Pro Gln Asp Ala Asp Ala Asn Gly Ala Tyr His Ile Gly
1250 1255 1260
Leu Lys Gly Leu Met Leu Leu Gly Arg Ile Lys Asn Asn Gln Glu
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Gly Lys Lys Leu Asn Leu Val Ile Lys Asn Glu Glu Tyr Phe Glu
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Phe Val Gln Asn Arg Asn Asn
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<210> 7
<211> 1206
<212> PRT
<213> 毛螺菌科的种
<400> 7
Met Tyr Tyr Glu Ser Leu Thr Lys Gln Tyr Pro Val Ser Lys Thr Ile
1 5 10 15
Arg Asn Glu Leu Ile Pro Ile Gly Lys Thr Leu Asp Asn Ile Arg Gln
20 25 30
Asn Asn Ile Leu Glu Ser Asp Val Lys Arg Lys Gln Asn Tyr Glu His
35 40 45
Val Lys Gly Ile Leu Asp Glu Tyr His Lys Gln Leu Ile Asn Glu Ala
50 55 60
Leu Asp Asn Cys Thr Leu Pro Ser Leu Lys Ile Ala Ala Glu Ile Tyr
65 70 75 80
Leu Lys Asn Gln Lys Glu Val Ser Asp Arg Glu Asp Phe Asn Lys Thr
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Gln Asp Leu Leu Arg Lys Glu Val Val Glu Lys Leu Lys Ala His Glu
100 105 110
Asn Phe Thr Lys Ile Gly Lys Lys Asp Ile Leu Asp Leu Leu Glu Lys
115 120 125
Leu Pro Ser Ile Ser Glu Asp Asp Tyr Asn Ala Leu Glu Ser Phe Arg
130 135 140
Asn Phe Tyr Thr Tyr Phe Thr Ser Tyr Asn Lys Val Arg Glu Asn Leu
145 150 155 160
Tyr Ser Asp Lys Glu Lys Ser Ser Thr Val Ala Tyr Arg Leu Ile Asn
165 170 175
Glu Asn Phe Pro Lys Phe Leu Asp Asn Val Lys Ser Tyr Arg Phe Val
180 185 190
Lys Thr Ala Gly Ile Leu Ala Asp Gly Leu Gly Glu Glu Glu Gln Asp
195 200 205
Ser Leu Phe Ile Val Glu Thr Phe Asn Lys Thr Leu Thr Gln Asp Gly
210 215 220
Ile Asp Thr Tyr Asn Ser Gln Val Gly Lys Ile Asn Ser Ser Ile Asn
225 230 235 240
Leu Tyr Asn Gln Lys Asn Gln Lys Ala Asn Gly Phe Arg Lys Ile Pro
245 250 255
Lys Met Lys Met Leu Tyr Lys Gln Ile Leu Ser Asp Arg Glu Glu Ser
260 265 270
Phe Ile Asp Glu Phe Gln Ser Asp Glu Val Leu Ile Asp Asn Val Glu
275 280 285
Ser Tyr Gly Ser Val Leu Ile Glu Ser Leu Lys Ser Ser Lys Val Ser
290 295 300
Ala Phe Phe Asp Ala Leu Arg Glu Ser Lys Gly Lys Asn Val Tyr Val
305 310 315 320
Lys Asn Asp Leu Ala Lys Thr Ala Met Ser Val Ile Val Phe Glu Asn
325 330 335
Trp Arg Thr Phe Asp Asp Leu Leu Asn Gln Glu Tyr Asp Leu Ala Asn
340 345 350
Glu Asn Lys Lys Lys Asp Asp Lys Tyr Phe Glu Lys Arg Gln Lys Glu
355 360 365
Leu Lys Lys Asn Lys Ser Tyr Ser Leu Glu His Leu Cys Asn Leu Ser
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Glu Asp Ser Cys Asn Leu Ile Glu Asn Tyr Ile His Gln Ile Ser Asp
385 390 395 400
Asp Ile Glu Asn Ile Ile Ile Asn Asn Glu Thr Phe Leu Arg Ile Val
405 410 415
Ile Asn Glu His Asp Arg Ser Arg Lys Leu Ala Lys Asn Arg Lys Ala
420 425 430
Val Lys Ala Ile Lys Asp Phe Leu Asp Ser Ile Lys Val Leu Glu Arg
435 440 445
Glu Leu Lys Leu Ile Asn Ser Ser Gly Gln Glu Leu Glu Lys Asp Leu
450 455 460
Ile Val Tyr Ser Ala His Glu Glu Leu Leu Val Glu Leu Lys Gln Val
465 470 475 480
Asp Ser Leu Tyr Asn Met Thr Arg Asn Tyr Leu Thr Lys Lys Pro Phe
485 490 495
Ser Thr Glu Lys Val Lys Leu Asn Phe Asn Arg Ser Thr Leu Leu Asn
500 505 510
Gly Trp Asp Arg Asn Lys Glu Thr Asp Asn Leu Gly Val Leu Leu Leu
515 520 525
Lys Asp Gly Lys Tyr Tyr Leu Gly Ile Met Asn Thr Ser Ala Asn Lys
530 535 540
Ala Phe Val Asn Pro Pro Val Ala Lys Thr Glu Lys Val Phe Lys Lys
545 550 555 560
Val Asp Tyr Lys Leu Leu Pro Val Pro Asn Gln Met Leu Pro Lys Val
565 570 575
Phe Phe Ala Lys Ser Asn Ile Asp Phe Tyr Asn Pro Ser Ser Glu Ile
580 585 590
Tyr Ser Asn Tyr Lys Lys Gly Thr His Lys Lys Gly Asn Met Phe Ser
595 600 605
Leu Glu Asp Cys His Asn Leu Ile Asp Phe Phe Lys Glu Ser Ile Ser
610 615 620
Lys His Glu Asp Trp Ser Lys Phe Gly Phe Lys Phe Asp Thr Gln Ala
625 630 635 640
Ser Tyr Asn Asp Ile Ser Glu Phe Tyr Arg Glu Val Glu Lys Gln Gly
645 650 655
Tyr Lys Leu Thr Tyr Thr Asp Ile Asp Glu Thr Tyr Ile Asn Asp Leu
660 665 670
Ile Glu Arg Asn Glu Leu Tyr Leu Phe Gln Ile Tyr Asn Lys Asp Phe
675 680 685
Ser Met Tyr Ser Lys Gly Lys Leu Asn Leu His Thr Leu Tyr Phe Met
690 695 700
Met Leu Phe Asp Gln Arg Asn Ile Asp Asp Val Val Tyr Lys Leu Asn
705 710 715 720
Gly Glu Ala Glu Val Phe Tyr Arg Pro Ala Ser Ile Ser Glu Asp Glu
725 730 735
Leu Ile Ile His Lys Ala Gly Glu Glu Ile Lys Asn Lys Asn Pro Asn
740 745 750
Arg Ala Arg Thr Lys Glu Thr Ser Thr Phe Ser Tyr Asp Ile Val Lys
755 760 765
Asp Lys Arg Tyr Ser Lys Asp Lys Phe Thr Leu His Ile Pro Ile Thr
770 775 780
Met Asn Phe Gly Val Asp Glu Val Lys Arg Phe Asn Asp Ala Val Asn
785 790 795 800
Ser Ala Ile Arg Ile Asp Glu Asn Val Asn Val Ile Gly Ile Asp Arg
805 810 815
Gly Glu Arg Asn Leu Leu Tyr Val Val Val Ile Asp Ser Lys Gly Asn
820 825 830
Ile Leu Glu Gln Ile Ser Leu Asn Ser Ile Ile Asn Lys Glu Tyr Asp
835 840 845
Ile Glu Thr Asp Tyr His Ala Leu Leu Asp Glu Arg Glu Gly Gly Arg
850 855 860
Asp Lys Ala Arg Lys Asp Trp Asn Thr Val Glu Asn Ile Arg Asp Leu
865 870 875 880
Lys Ala Gly Leu Tyr Leu Gln Val Val Asn Val Val Ala Lys Leu Val
885 890 895
Leu Lys Tyr Asn Ala Ile Ile Cys Leu Glu Asp Leu Asn Phe Gly Phe
900 905 910
Lys Arg Gly Arg Gln Lys Val Glu Lys Gln Val Tyr Gln Lys Phe Glu
915 920 925
Lys Met Leu Ile Asp Lys Leu Asn Tyr Leu Val Ile Asp Lys Ser Arg
930 935 940
Glu Gln Thr Ser Pro Lys Glu Leu Gly Gly Ala Leu Asn Ala Leu Gln
945 950 955 960
Leu Thr Ser Lys Phe Lys Ser Phe Lys Glu Leu Gly Lys Gln Ser Gly
965 970 975
Val Ile Tyr Tyr Val Pro Ala Tyr Leu Thr Ser Lys Ile Asp Pro Thr
980 985 990
Thr Gly Phe Ala Asn Leu Phe Tyr Met Lys Cys Glu Asn Val Glu Lys
995 1000 1005
Ser Lys Arg Phe Phe Asp Gly Phe Asp Phe Ile Arg Phe Asn Ala
1010 1015 1020
Leu Glu Asn Val Phe Glu Phe Gly Phe Asp Tyr Arg Ser Phe Thr
1025 1030 1035
Gln Arg Ala Cys Gly Ile Asn Ser Lys Trp Thr Val Cys Thr Asn
1040 1045 1050
Gly Glu Arg Ile Ile Lys Tyr Arg Asn Pro Asp Lys Asn Asn Met
1055 1060 1065
Phe Asp Glu Lys Val Val Val Val Thr Asp Glu Met Lys Asn Leu
1070 1075 1080
Phe Glu Gln Tyr Lys Ile Pro Tyr Glu Asp Gly Arg Asn Val Lys
1085 1090 1095
Asp Met Ile Ile Ser Asn Glu Glu Ala Glu Phe Tyr Arg Arg Leu
1100 1105 1110
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Trp Val Leu Glu Gln Ile Arg Gln Lys Ser Glu Gly Glu Lys Ile
1175 1180 1185
Asn Leu Ala Met Thr Asn Ala Glu Trp Leu Glu Tyr Ala Gln Thr
1190 1195 1200
His Leu Leu
1205
<210> 8
<211> 1233
<212> PRT
<213> 毛螺菌科的种
<400> 8
Met Asp Tyr Gly Asn Gly Gln Phe Glu Arg Arg Ala Pro Leu Thr Lys
1 5 10 15
Thr Ile Thr Leu Arg Leu Lys Pro Ile Gly Glu Thr Arg Glu Thr Ile
20 25 30
Arg Glu Gln Lys Leu Leu Glu Gln Asp Ala Ala Phe Arg Lys Leu Val
35 40 45
Glu Thr Val Thr Pro Ile Val Asp Asp Cys Ile Arg Lys Ile Ala Asp
50 55 60
Asn Ala Leu Cys His Phe Gly Thr Glu Tyr Asp Phe Ser Cys Leu Gly
65 70 75 80
Asn Ala Ile Ser Lys Asn Asp Ser Lys Ala Ile Lys Lys Glu Thr Glu
85 90 95
Lys Val Glu Lys Leu Leu Ala Lys Val Leu Thr Glu Asn Leu Pro Asp
100 105 110
Gly Leu Arg Lys Val Asn Asp Ile Asn Ser Ala Ala Phe Ile Gln Asp
115 120 125
Thr Leu Thr Ser Phe Val Gln Asp Asp Ala Asp Lys Arg Val Leu Ile
130 135 140
Gln Glu Leu Lys Gly Lys Thr Val Leu Met Gln Arg Phe Leu Thr Thr
145 150 155 160
Arg Ile Thr Ala Leu Thr Val Trp Leu Pro Asp Arg Val Phe Glu Asn
165 170 175
Phe Asn Ile Phe Ile Glu Asn Ala Glu Lys Met Arg Ile Leu Leu Asp
180 185 190
Ser Pro Leu Asn Glu Lys Ile Met Lys Phe Asp Pro Asp Ala Glu Gln
195 200 205
Tyr Ala Ser Leu Glu Phe Tyr Gly Gln Cys Leu Ser Gln Lys Asp Ile
210 215 220
Asp Ser Tyr Asn Leu Ile Ile Ser Gly Ile Tyr Ala Asp Asp Glu Val
225 230 235 240
Lys Asn Pro Gly Ile Asn Glu Ile Val Lys Glu Tyr Asn Gln Gln Ile
245 250 255
Arg Gly Asp Lys Asp Glu Ser Pro Leu Pro Lys Leu Lys Lys Leu His
260 265 270
Lys Gln Ile Leu Met Pro Val Glu Lys Ala Phe Phe Val Arg Val Leu
275 280 285
Ser Asn Asp Ser Asp Ala Arg Ser Ile Leu Glu Lys Ile Leu Lys Asp
290 295 300
Thr Glu Met Leu Pro Ser Lys Ile Ile Glu Ala Met Lys Glu Ala Asp
305 310 315 320
Ala Gly Asp Ile Ala Val Tyr Gly Ser Arg Leu His Glu Leu Ser His
325 330 335
Val Ile Tyr Gly Asp His Gly Lys Leu Ser Gln Ile Ile Tyr Asp Lys
340 345 350
Glu Ser Lys Arg Ile Ser Glu Leu Met Glu Thr Leu Ser Pro Lys Glu
355 360 365
Arg Lys Glu Ser Lys Lys Arg Leu Glu Gly Leu Glu Glu His Ile Arg
370 375 380
Lys Ser Thr Tyr Thr Phe Asp Glu Leu Asn Arg Tyr Ala Glu Lys Asn
385 390 395 400
Val Met Ala Ala Tyr Ile Ala Ala Val Glu Glu Ser Cys Ala Glu Ile
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Met Arg Lys Glu Lys Asp Leu Arg Thr Leu Leu Ser Lys Glu Asp Val
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Tyr Gly Ser Ala Leu Arg Pro Asn Ser Arg Trp Trp Ser Pro Gly Glu
515 520 525
Lys Phe Asn Val Lys Phe His Thr Ile Val Arg Arg Asp Gly Arg Leu
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545 550 555 560
Met Asp Gly Asp Ile Glu Cys Leu Gln Met Arg Lys Ile Pro Asn Pro
565 570 575
Thr Ile Phe Leu Pro Lys Leu Val Phe Lys Asp Pro Glu Ala Phe Phe
580 585 590
Arg Asp Asn Pro Glu Ala Asp Glu Phe Val Phe Leu Ser Gly Met Lys
595 600 605
Ala Pro Val Thr Ile Thr Arg Glu Thr Tyr Glu Ala Tyr Arg Tyr Lys
610 615 620
Leu Tyr Thr Val Gly Lys Leu Arg Asp Gly Glu Val Ser Glu Glu Glu
625 630 635 640
Tyr Lys Arg Ala Leu Leu Gln Val Leu Thr Ala Tyr Lys Glu Phe Leu
645 650 655
Glu Asn Arg Met Ile Tyr Ala Asp Leu Asn Phe Gly Phe Lys Asp Leu
660 665 670
Glu Glu Tyr Lys Asp Ser Ser Glu Phe Ile Lys Gln Val Glu Thr His
675 680 685
Asn Thr Phe Met Cys Trp Ala Lys Val Ser Ser Ser Gln Leu Asp Asp
690 695 700
Leu Val Lys Ser Gly Asn Gly Leu Leu Phe Glu Ile Trp Ser Glu Arg
705 710 715 720
Leu Glu Ser Tyr Tyr Lys Tyr Gly Asn Glu Lys Val Leu Arg Gly Tyr
725 730 735
Glu Gly Val Leu Leu Ser Ile Leu Lys Asp Glu Asn Leu Val Ser Met
740 745 750
Arg Thr Leu Leu Asn Ser Arg Pro Met Leu Val Tyr Arg Pro Lys Glu
755 760 765
Ser Ser Lys Pro Met Val Val His Arg Asp Gly Ser Arg Val Val Asp
770 775 780
Arg Phe Asp Lys Asp Gly Lys Tyr Ile Pro Pro Glu Val His Asp Glu
785 790 795 800
Leu Tyr Arg Phe Phe Asn Asn Leu Leu Ile Lys Glu Lys Leu Gly Glu
805 810 815
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885 890 895
Lys Asn Gly Lys Val Leu Lys Gln Arg Ser Leu Asn Ile Ile Asn Asp
900 905 910
Gly Ala Arg Asp Val Asp Trp Lys Glu Arg Phe Arg Gln Val Thr Lys
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Asp Leu Lys Glu Val Tyr Leu Asn Tyr Ala Leu Lys Glu Ile Ala Glu
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Ala Val Ile Glu Tyr Asn Ala Ile Leu Ile Ile Glu Lys Met Ser Asn
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Ala Phe Lys Asp Lys Tyr Ser Phe Leu Asp Asp Val Thr Phe Lys Gly
980 985 990
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Met Val Pro Asn Ser Met Thr Arg Ser Leu Asp Pro Asp Thr Gly
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<210> 9
<211> 1227
<212> PRT
<213> 毛螺菌科的种
<400> 9
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1 5 10 15
Leu Arg Phe Lys Ala Ile Pro Val Gly Lys Thr Gln Glu Asn Ile Asp
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115 120 125
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Met Phe Ser Glu Glu Ala Lys Ser Thr Ser Ile Ala Phe Arg Cys Ile
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Val Asp Ala Ile Phe Asp Lys His Glu Val Gln Glu Ile Lys Glu Lys
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Phe Asn Phe Val Leu Thr Gln Glu Gly Ile Asp Val Tyr Asn Ala Ile
225 230 235 240
Ile Gly Gly Phe Val Thr Glu Ser Gly Glu Lys Ile Lys Gly Leu Asn
245 250 255
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260 265 270
Phe Lys Pro Leu Tyr Lys Gln Val Leu Ser Asp Arg Glu Ser Leu Ser
275 280 285
Phe Tyr Gly Glu Gly Tyr Thr Ser Asp Glu Glu Val Leu Glu Val Phe
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325 330 335
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Ile His Leu Lys Lys Lys Ala Val Val Thr Glu Lys Tyr Glu Asp Asp
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930 935 940
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Lys Lys Ser Asn Pro Cys Ala Thr Gly Gly Ala Leu Lys Gly Tyr Gln
965 970 975
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<210> 10
<211> 1264
<212> PRT
<213> Leptospira inadai
<400> 10
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65 70 75 80
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245 250 255
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325 330 335
Tyr Leu Lys Leu Asp Lys Lys Lys Lys Ser Ile Ile Ala Glu Leu Lys
340 345 350
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355 360 365
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Ile Arg Leu Glu Ala Tyr Phe Ala Glu Phe Lys Ser Lys Asp Asp Ala
450 455 460
Lys Lys Gln Phe Asp Leu Leu Glu Arg Ile Glu Glu Ala Tyr Ala Ile
465 470 475 480
Val Glu Pro Leu Leu Gly Ala Glu Tyr Pro Arg Asp Arg Asn Leu Lys
485 490 495
Ala Asp Lys Lys Glu Val Gly Lys Ile Lys Asp Phe Leu Asp Ser Ile
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Lys Ser Leu Gln Phe Phe Leu Lys Pro Leu Leu Ser Ala Glu Ile Phe
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Glu Ile Asp Ile Ser Gly His Leu Tyr Asn Lys Val Arg Asn Tyr Leu
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565 570 575
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Asn Pro Ser Lys Ser Ile Leu Lys Ile Arg Glu Ala Lys Ser Phe Lys
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675 680 685
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Lys Phe Ser Lys Thr Ser Ser Tyr Glu Asn Ile Ser Glu Phe Tyr Arg
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725 730 735
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Ile Tyr Asn Lys Asp Phe Ser Ile Phe Ser Lys Gly Lys Pro Asn Leu
755 760 765
His Thr Ile Tyr Phe Arg Ser Leu Phe Ser Lys Glu Asn Leu Lys Asp
770 775 780
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785 790 795 800
Ser Ile Asn Tyr Asp Glu Lys Lys Lys Arg Glu Gly His His Pro Glu
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Leu Phe Glu Lys Leu Lys Tyr Pro Ile Leu Lys Asp Lys Arg Tyr Ser
820 825 830
Glu Asp Lys Phe Gln Phe His Leu Pro Ile Ser Leu Asn Phe Lys Ser
835 840 845
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850 855 860
Asn Lys Asp Ile Asn Ile Ile Gly Ile Asp Arg Gly Glu Arg Asn Leu
865 870 875 880
Leu Tyr Leu Val Met Ile Asn Gln Lys Gly Glu Ile Leu Lys Gln Thr
885 890 895
Leu Leu Asp Ser Met Gln Ser Gly Lys Gly Arg Pro Glu Ile Asn Tyr
900 905 910
Lys Glu Lys Leu Gln Glu Lys Glu Ile Glu Arg Asp Lys Ala Arg Lys
915 920 925
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930 935 940
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945 950 955 960
Ile Val Val Leu Glu Asp Leu Asn Ile Gly Phe Lys Arg Gly Arg Gln
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Lys Val Glu Arg Gln Val Tyr Gln Lys Phe Glu Lys Met Leu Ile Asp
980 985 990
Lys Leu Asn Phe Leu Val Phe Lys Glu Asn Lys Pro Thr Glu Pro Gly
995 1000 1005
Gly Val Leu Lys Ala Tyr Gln Leu Thr Asp Glu Phe Gln Ser Phe
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Glu Lys Leu Ser Lys Gln Thr Gly Phe Leu Phe Tyr Val Pro Ser
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1115 1120 1125
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1145 1150 1155
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Leu Ser Leu Arg Gln Asn Asn Gly Lys Lys Gly Glu Glu Glu Lys
1175 1180 1185
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1190 1195 1200
Asn Ser Leu Glu Ala Ser Asp Asp Glu Pro Lys Asp Ala Asp Ala
1205 1210 1215
Asn Gly Ala Tyr His Ile Ala Leu Lys Gly Leu Met Asn Leu Leu
1220 1225 1230
Val Leu Asn Glu Thr Lys Glu Glu Asn Leu Ser Arg Pro Lys Trp
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Lys Ile Lys Asn Lys Asp Trp Leu Glu Phe Val Trp Glu Arg Asn
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Arg
<210> 11
<211> 1373
<212> PRT
<213> 牛眼莫拉氏菌(Moraxella bovoculi)
<400> 11
Met Leu Phe Gln Asp Phe Thr His Leu Tyr Pro Leu Ser Lys Thr Val
1 5 10 15
Arg Phe Glu Leu Phe Ile Asp Arg Thr Leu Glu His Ile His Ala Lys
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Asn Phe Leu Ser Gln Asp Glu Thr Met Ala Asp Met His Gln Lys Val
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Lys Val Ile Leu Asp Asp Tyr His Arg Asp Phe Ile Ala Asp Met Met
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Lys Asp Leu Gln Ala Val Leu Arg Lys Glu Ile Val Lys Pro Ile Gly
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Asn Gly Gly Lys Tyr Lys Ala Gly Tyr Asp Arg Leu Phe Gly Ala Lys
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Leu Phe Lys Asp Gly Lys Glu Leu Gly Asp Leu Ala Lys Phe Val Ile
130 135 140
Ala Gln Glu Gly Glu Ser Ser Pro Lys Leu Ala His Leu Ala His Phe
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Glu Lys Phe Ser Thr Tyr Phe Thr Gly Phe His Asp Asn Arg Lys Asn
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Met Tyr Ser Asp Glu Asp Lys His Thr Ala Ile Ala Tyr Arg Leu Ile
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His Glu Asn Leu Pro Arg Phe Ile Asp Asn Leu Gln Ile Leu Thr Thr
195 200 205
Ile Lys Gln Lys His Ser Ala Leu Tyr Asp Gln Ile Ile Asn Glu Leu
210 215 220
Thr Ala Ser Gly Leu Asp Val Ser Leu Ala Ser His Leu Asp Gly Tyr
225 230 235 240
His Lys Leu Leu Thr Gln Glu Gly Ile Thr Ala Tyr Asn Thr Leu Leu
245 250 255
Gly Gly Ile Ser Gly Glu Ala Gly Ser Pro Lys Ile Gln Gly Ile Asn
260 265 270
Glu Leu Ile Asn Ser His His Asn Gln His Cys His Lys Ser Glu Arg
275 280 285
Ile Ala Lys Leu Arg Pro Leu His Lys Gln Ile Leu Ser Asp Gly Met
290 295 300
Ser Val Ser Phe Leu Pro Ser Lys Phe Ala Asp Asp Ser Glu Met Cys
305 310 315 320
Gln Ala Val Asn Glu Phe Tyr Arg His Tyr Ala Asp Val Phe Ala Lys
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Val Gln Ser Leu Phe Asp Gly Phe Asp Asp His Gln Lys Asp Gly Ile
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355 360 365
Asp Phe Ala Leu Leu Gly Arg Val Leu Asp Gly Tyr Tyr Val Asp Val
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Ala Lys Ala Lys Leu Thr Lys Glu Lys Asp Lys Phe Ile Lys Gly Val
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His Ser Leu Ala Ser Leu Glu Gln Ala Ile Glu His Tyr Thr Ala Arg
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His Asp Asp Glu Ser Val Gln Ala Gly Lys Leu Gly Gln Tyr Phe Lys
435 440 445
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His Ser Thr Ile Lys Gly Phe Leu Glu Arg Glu Arg Pro Ala Gly Glu
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645 650 655
Glu Ile Lys Asp Lys Gly Arg Gln Arg Ser Asp Asp Glu Arg Leu Lys
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675 680 685
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690 695 700
Lys Lys Gly Arg Glu Val Pro Ile Ser Glu Lys Asp Leu Phe Lys Asp
705 710 715 720
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Phe Ile Gly Glu Phe Lys Arg Tyr Asn Pro Ser Gln Asp Leu Val Asp
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Tyr Asp Glu Val Asn Val Ile Gly Ile Asp Arg Gly Glu Arg His Leu
980 985 990
Leu Tyr Leu Thr Val Ile Asn Ser Lys Gly Glu Ile Leu Glu Gln Cys
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1010 1015 1020
Thr Thr Pro Tyr His Lys Ile Leu Asp Lys Arg Glu Ile Glu Arg
1025 1030 1035
Leu Asn Ala Arg Val Gly Trp Gly Glu Ile Glu Thr Ile Lys Glu
1040 1045 1050
Leu Lys Ser Gly Tyr Leu Ser His Val Val His Gln Ile Ser Gln
1055 1060 1065
Leu Met Leu Lys Tyr Asn Ala Ile Val Val Leu Glu Asp Leu Asn
1070 1075 1080
Phe Gly Phe Lys Arg Gly Arg Phe Lys Val Glu Lys Gln Ile Tyr
1085 1090 1095
Gln Asn Phe Glu Asn Ala Leu Ile Lys Lys Leu Asn His Leu Val
1100 1105 1110
Leu Lys Asp Lys Ala Asp Asp Glu Ile Gly Ser Tyr Lys Asn Ala
1115 1120 1125
Leu Gln Leu Thr Asn Asn Phe Thr Asp Leu Lys Ser Ile Gly Lys
1130 1135 1140
Gln Thr Gly Phe Leu Phe Tyr Val Pro Ala Trp Asn Thr Ser Lys
1145 1150 1155
Ile Asp Pro Glu Thr Gly Phe Val Asp Leu Leu Lys Pro Arg Tyr
1160 1165 1170
Glu Asn Ile Gln Ala Ser Gln Ala Phe Phe Gly Lys Phe Asp Lys
1175 1180 1185
Ile Cys Tyr Asn Ala Asp Lys Asp Tyr Phe Glu Phe His Ile Asp
1190 1195 1200
Tyr Ala Lys Phe Thr Asp Lys Ala Lys Asn Ser Arg Gln Ile Trp
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Thr Ile Cys Ser His Gly Asp Lys Arg Tyr Val Tyr Asp Lys Thr
1220 1225 1230
Ala Asn Gln Asn Lys Gly Ala Ala Lys Gly Ile Asn Val Asn Asp
1235 1240 1245
Ile Leu Lys Ser Leu Phe Ala Arg His His Ile Asn Glu Lys Gln
1250 1255 1260
Pro Asn Leu Val Met Asp Ile Cys Gln Asn Asn Asp Lys Glu Phe
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1310 1315 1320
Thr Gln Pro Gln Asn Ala Asp Ala Asn Gly Ala Tyr His Ile Ala
1325 1330 1335
Leu Lys Gly Leu Trp Leu Leu Asn Glu Leu Lys Asn Ser Asp Asp
1340 1345 1350
Leu Asn Lys Val Lys Leu Ala Ile Asp Asn Gln Thr Trp Leu Asn
1355 1360 1365
Phe Ala Gln Asn Arg
1370
<210> 12
<211> 1352
<212> PRT
<213> Parcubacteria bacterium
<400> 12
Met Glu Asn Ile Phe Asp Gln Phe Ile Gly Lys Tyr Ser Leu Ser Lys
1 5 10 15
Thr Leu Arg Phe Glu Leu Lys Pro Val Gly Lys Thr Glu Asp Phe Leu
20 25 30
Lys Ile Asn Lys Val Phe Glu Lys Asp Gln Thr Ile Asp Asp Ser Tyr
35 40 45
Asn Gln Ala Lys Phe Tyr Phe Asp Ser Leu His Gln Lys Phe Ile Asp
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Ala Ala Leu Ala Ser Asp Lys Thr Ser Glu Leu Ser Phe Gln Asn Phe
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Ala Asp Val Leu Glu Lys Gln Asn Lys Ile Ile Leu Asp Lys Lys Arg
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Glu Met Gly Ala Leu Arg Lys Arg Asp Lys Asn Ala Val Gly Ile Asp
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Tyr Ala Ala Asp Gly Thr Ser Thr Ala Val Ala Thr Arg Ile Ala Asp
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385 390 395 400
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Lys Val Lys Lys Phe Ile Ser Ile Ala Glu Ile Lys Asn Ala Val Glu
450 455 460
Glu Leu Asp Gly Asp Ile Phe Lys Ala Val Phe Tyr Asp Lys Lys Ile
465 470 475 480
Ile Ala Gln Gly Gly Ser Lys Leu Glu Gln Phe Leu Val Ile Trp Lys
485 490 495
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500 505 510
Lys Leu Leu Gly Tyr Asp Ser Cys Leu Lys Ile Ala Lys Gln Leu Gly
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Lys Gly Asp Arg Ala Tyr Lys Tyr Arg Arg Tyr Thr Glu Lys Lys Ile
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Asn Leu Phe Ile Ser Asn Ala Glu Trp Asp Glu Ala Ala Arg Asp
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<210> 13
<211> 1260
<212> PRT
<213> 狗口腔卟啉单胞菌(Porphyromonas crevioricanis)
<400> 13
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Met Leu Gln Ser Phe Cys Glu Leu Tyr Lys Lys Asp His Arg Thr Glu
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210 215 220
Ile Ala Lys Glu Leu Glu His Ile Arg Ala Asp Phe Ser Ala Gly Gly
225 230 235 240
Tyr Ile Lys Lys Asp Glu Arg Leu Glu Asp Ile Phe Ser Leu Asn Tyr
245 250 255
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260 265 270
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Leu Ser Tyr Leu Pro Glu Ser Phe Glu Lys Asp Glu Glu Leu Leu Arg
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Ala Leu Lys Glu Phe Tyr Asp His Ile Ala Glu Asp Ile Leu Gly Arg
340 345 350
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355 360 365
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370 375 380
Gly Asp Trp Asn Ala Ile Tyr Met Ala Arg Glu Arg Ala Tyr Asp His
385 390 395 400
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435 440 445
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485 490 495
Val Leu Ile Lys Asn Leu Leu Asp Asn Ile Ser Asp Leu Gln Arg Phe
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515 520 525
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530 535 540
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595 600 605
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645 650 655
Lys Leu Leu Glu Gln Tyr Gly His Gly Thr His Lys Lys Gly Asp Thr
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Phe Ser Met Asp Asp Leu His Glu Leu Ile Asp Phe Phe Lys His Ser
675 680 685
Ile Glu Ala His Glu Asp Trp Lys Gln Phe Gly Phe Lys Phe Ser Asp
690 695 700
Thr Ala Thr Tyr Glu Asn Val Ser Ser Phe Tyr Arg Glu Val Glu Asp
705 710 715 720
Gln Gly Tyr Lys Leu Ser Phe Arg Lys Val Ser Glu Ser Tyr Val Tyr
725 730 735
Ser Leu Ile Asp Gln Gly Lys Leu Tyr Leu Phe Gln Ile Tyr Asn Lys
740 745 750
Asp Phe Ser Pro Cys Ser Lys Gly Thr Pro Asn Leu His Thr Leu Tyr
755 760 765
Trp Arg Met Leu Phe Asp Glu Arg Asn Leu Ala Asp Val Ile Tyr Lys
770 775 780
Leu Asp Gly Lys Ala Glu Ile Phe Phe Arg Glu Lys Ser Leu Lys Asn
785 790 795 800
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805 810 815
Gln Lys Lys Gly Glu Glu Ser Leu Phe Glu Tyr Asp Leu Val Lys Asp
820 825 830
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835 840 845
Asn Phe Lys Cys Ser Ala Gly Ser Lys Val Asn Asp Met Val Asn Ala
850 855 860
His Ile Arg Glu Ala Lys Asp Met His Val Ile Gly Ile Asp Arg Gly
865 870 875 880
Glu Arg Asn Leu Leu Tyr Ile Cys Val Ile Asp Ser Arg Gly Thr Ile
885 890 895
Leu Asp Gln Ile Ser Leu Asn Thr Ile Asn Asp Ile Asp Tyr His Asp
900 905 910
Leu Leu Glu Ser Arg Asp Lys Asp Arg Gln Gln Glu His Arg Asn Trp
915 920 925
Gln Thr Ile Glu Gly Ile Lys Glu Leu Lys Gln Gly Tyr Leu Ser Gln
930 935 940
Ala Val His Arg Ile Ala Glu Leu Met Val Ala Tyr Lys Ala Val Val
945 950 955 960
Ala Leu Glu Asp Leu Asn Met Gly Phe Lys Arg Gly Arg Gln Lys Val
965 970 975
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980 985 990
Asn Tyr Leu Val Asp Lys Lys Lys Arg Pro Glu Asp Ile Gly Gly Leu
995 1000 1005
Leu Arg Ala Tyr Gln Phe Thr Ala Pro Phe Lys Ser Phe Lys Glu
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1100 1105 1110
Arg Asn Ser Gln Lys Asn Gly Gln Trp Asp Ser Glu Glu Phe Ala
1115 1120 1125
Leu Thr Glu Ala Phe Lys Ser Leu Phe Val Arg Tyr Glu Ile Asp
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1145 1150 1155
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1160 1165 1170
Met Arg Asn Ser Trp Lys Glu Lys Asp Leu Asp Tyr Leu Ile Ser
1175 1180 1185
Pro Val Ala Gly Ala Asp Gly Arg Phe Phe Asp Thr Arg Glu Gly
1190 1195 1200
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1205 1210 1215
Ile Ala Leu Lys Gly Leu Trp Ala Leu Arg Gln Ile Arg Gln Thr
1220 1225 1230
Ser Glu Gly Gly Lys Leu Lys Leu Ala Ile Ser Asn Lys Glu Trp
1235 1240 1245
Leu Gln Phe Val Gln Glu Arg Ser Tyr Glu Lys Asp
1250 1255 1260
<210> 14
<211> 1324
<212> PRT
<213> 解糖胨普雷沃菌(Prevotella disiens)
<400> 14
Met Glu Asn Tyr Gln Glu Phe Thr Asn Leu Phe Gln Leu Asn Lys Thr
1 5 10 15
Leu Arg Phe Glu Leu Lys Pro Ile Gly Lys Thr Cys Glu Leu Leu Glu
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Glu Gly Lys Ile Phe Ala Ser Gly Ser Phe Leu Glu Lys Asp Lys Val
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Leu Leu Lys Gln Tyr Phe Asp Cys Tyr Asn Glu Leu Lys Ala Phe Lys
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Lys Asp Cys Lys Ser Asp Glu Glu Glu Val Lys Lys Thr Ala Leu Arg
100 105 110
Asn Lys Cys Thr Ser Ile Gln Arg Ala Met Arg Glu Ala Ile Ser Gln
115 120 125
Ala Phe Leu Lys Ser Pro Gln Lys Lys Leu Leu Ala Ile Lys Asn Leu
130 135 140
Ile Glu Asn Val Phe Lys Ala Asp Glu Asn Val Gln His Phe Ser Glu
145 150 155 160
Phe Thr Ser Tyr Phe Ser Gly Phe Glu Thr Asn Arg Glu Asn Phe Tyr
165 170 175
Ser Asp Glu Glu Lys Ser Thr Ser Ile Ala Tyr Arg Leu Val His Asp
180 185 190
Asn Leu Pro Ile Phe Ile Lys Asn Ile Tyr Ile Phe Glu Lys Leu Lys
195 200 205
Glu Gln Phe Asp Ala Lys Thr Leu Ser Glu Ile Phe Glu Asn Tyr Lys
210 215 220
Leu Tyr Val Ala Gly Ser Ser Leu Asp Glu Val Phe Ser Leu Glu Tyr
225 230 235 240
Phe Asn Asn Thr Leu Thr Gln Lys Gly Ile Asp Asn Tyr Asn Ala Val
245 250 255
Ile Gly Lys Ile Val Lys Glu Asp Lys Gln Glu Ile Gln Gly Leu Asn
260 265 270
Glu His Ile Asn Leu Tyr Asn Gln Lys His Lys Asp Arg Arg Leu Pro
275 280 285
Phe Phe Ile Ser Leu Lys Lys Gln Ile Leu Ser Asp Arg Glu Ala Leu
290 295 300
Ser Trp Leu Pro Asp Met Phe Lys Asn Asp Ser Glu Val Ile Asp Ala
305 310 315 320
Leu Lys Gly Phe Tyr Ile Glu Asp Gly Phe Glu Asn Asn Val Leu Thr
325 330 335
Pro Leu Ala Thr Leu Leu Ser Ser Leu Asp Lys Tyr Asn Leu Asn Gly
340 345 350
Ile Phe Ile Arg Asn Asn Glu Ala Leu Ser Ser Leu Ser Gln Asn Val
355 360 365
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Ala Lys Asp Ile Phe Lys Lys Asp Glu Asn Ser Lys Leu Ile Lys Glu
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Leu Leu Asp Ala Thr Lys Gln Phe Gln His Phe Ile Lys Pro Leu Leu
515 520 525
Gly Thr Gly Glu Glu Ala Asp Arg Asp Leu Val Phe Tyr Gly Asp Phe
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595 600 605
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Lys Ala Gln Leu Phe Arg Lys Asn Glu Ala Val Ile Gly Asp Tyr Glu
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645 650 655
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675 680 685
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Leu Asp Leu Gly Ser Gly Ala Ile Phe Tyr Arg Ala Lys Ser Leu Asp
850 855 860
Gly Asn Lys Pro Thr His Pro Ala Asn Glu Ala Ile Lys Cys Arg Asn
865 870 875 880
Val Ala Asn Lys Asp Lys Val Ser Leu Phe Thr Tyr Asp Ile Tyr Lys
885 890 895
Asn Arg Arg Tyr Met Glu Asn Lys Phe Leu Phe His Leu Ser Ile Val
900 905 910
Gln Asn Tyr Lys Ala Ala Asn Asp Ser Ala Gln Leu Asn Ser Ser Ala
915 920 925
Thr Glu Tyr Ile Arg Lys Ala Asp Asp Leu His Ile Ile Gly Ile Asp
930 935 940
Arg Gly Glu Arg Asn Leu Leu Tyr Tyr Ser Val Ile Asp Met Lys Gly
945 950 955 960
Asn Ile Val Glu Gln Asp Ser Leu Asn Ile Ile Arg Asn Asn Asp Leu
965 970 975
Glu Thr Asp Tyr His Asp Leu Leu Asp Lys Arg Glu Lys Glu Arg Lys
980 985 990
Ala Asn Arg Gln Asn Trp Glu Ala Val Glu Gly Ile Lys Asp Leu Lys
995 1000 1005
Lys Gly Tyr Leu Ser Gln Ala Val His Gln Ile Ala Gln Leu Met
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Leu Lys Tyr Asn Ala Ile Ile Ala Leu Glu Asp Leu Gly Gln Met
1025 1030 1035
Phe Val Thr Arg Gly Gln Lys Ile Glu Lys Ala Val Tyr Gln Gln
1040 1045 1050
Phe Glu Lys Ser Leu Val Asp Lys Leu Ser Tyr Leu Val Asp Lys
1055 1060 1065
Lys Arg Pro Tyr Asn Glu Leu Gly Gly Ile Leu Lys Ala Tyr Gln
1070 1075 1080
Leu Ala Ser Ser Ile Thr Lys Asn Asn Ser Asp Lys Gln Asn Gly
1085 1090 1095
Phe Leu Phe Tyr Val Pro Ala Trp Asn Thr Ser Lys Ile Asp Pro
1100 1105 1110
Val Thr Gly Phe Thr Asp Leu Leu Arg Pro Lys Ala Met Thr Ile
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1130 1135 1140
Asn Asp Lys Gly Tyr Phe Glu Phe Glu Thr Asn Tyr Asp Lys Phe
1145 1150 1155
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1160 1165 1170
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1235 1240 1245
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1310 1315 1320
Lys
<210> 15
<211> 1484
<212> PRT
<213> Peregrinibacteria bacterium
<220>
<221> misc_feature
<222> (1073)..(1073)
<223> Xaa可以是任何天然氨基酸
<400> 15
Met Ser Asn Phe Phe Lys Asn Phe Thr Asn Leu Tyr Glu Leu Ser Lys
1 5 10 15
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115 120 125
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Asn Phe Cys Lys Tyr Phe Leu Ser Lys Tyr Pro Lys Thr Thr Leu Phe
835 840 845
Asn Tyr Ser Phe Lys Glu Ser Glu Asn Tyr Asn Ser Leu Asp Glu Phe
850 855 860
Tyr Arg Asp Val Asp Ile Cys Ser Tyr Lys Leu Asn Ile Asn Thr Thr
865 870 875 880
Ile Asn Lys Ser Ile Leu Asp Arg Leu Val Glu Glu Gly Lys Leu Tyr
885 890 895
Leu Phe Glu Ile Lys Asn Gln Asp Ser Asn Asp Gly Lys Ser Ile Gly
900 905 910
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915 920 925
Phe Asp Asn Arg Pro Lys Leu Asn Gly Glu Ala Glu Ile Phe Tyr Arg
930 935 940
Lys Ala Ile Ser Lys Asp Lys Leu Gly Ile Val Lys Gly Lys Lys Thr
945 950 955 960
Lys Asn Gly Thr Trp Ile Ile Lys Asn Tyr Arg Phe Ser Lys Glu Lys
965 970 975
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980 985 990
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1010 1015 1020
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1085 1090 1095
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1100 1105 1110
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1160 1165 1170
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Tyr Gly Asp Ile Glu Asn Lys Lys Gln Ala Gly Ile Met Leu Tyr
1190 1195 1200
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1220 1225 1230
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1235 1240 1245
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1250 1255 1260
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1265 1270 1275
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1280 1285 1290
Ser Leu Asp Arg Phe Arg Gly Glu Arg Glu Lys Asp Lys Tyr Glu
1295 1300 1305
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1310 1315 1320
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1325 1330 1335
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1340 1345 1350
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1430 1435 1440
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1445 1450 1455
Lys Lys Gln Leu Asn Ile Phe Ser Ser Arg Lys Ala Met Ala Lys
1460 1465 1470
Arg Lys Lys Lys Arg Pro Ala Ala Thr Lys Lys
1475 1480
<210> 16
<211> 1245
<212> PRT
<213> 猕猴卟啉单胞菌(Porphyromonas macacae)
<400> 16
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Asn Ile Lys Lys Asn Gly Leu Ile Arg Arg Asp Glu Gln Arg Leu Asp
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Ile Ala Asn Ile Leu Ser Ser Phe Ser Phe Ser Glu Glu Ile Leu Gln
65 70 75 80
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100 105 110
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115 120 125
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260 265 270
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275 280 285
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340 345 350
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355 360 365
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435 440 445
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450 455 460
Asp Lys Asp Phe Thr Glu Lys Lys Leu Gly Lys Asp Glu Glu Ala Val
465 470 475 480
Ser Val Ile Lys Lys Ala Leu Asp Ser Ala Leu Arg Leu Arg Lys Phe
485 490 495
Phe Asp Leu Leu Ser Gly Thr Gly Ala Glu Ile Arg Arg Asp Ser Ser
500 505 510
Phe Tyr Ala Leu Tyr Thr Asp Arg Met Asp Lys Leu Lys Gly Leu Leu
515 520 525
Lys Met Tyr Asp Lys Val Arg Asn Tyr Leu Thr Lys Lys Pro Tyr Ser
530 535 540
Ile Glu Lys Phe Lys Leu His Phe Asp Asn Pro Ser Leu Leu Ser Gly
545 550 555 560
Trp Asp Lys Asn Lys Glu Leu Asn Asn Leu Ser Val Ile Phe Arg Gln
565 570 575
Asn Gly Tyr Tyr Tyr Leu Gly Ile Met Thr Pro Lys Gly Lys Asn Leu
580 585 590
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595 600 605
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610 615 620
Phe Phe Pro Lys Lys Thr Lys Pro Ala Phe Ala Pro Asp Gln Ser Val
625 630 635 640
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645 650 655
Asn Lys Lys Asp Leu Tyr Arg Leu Ile Asp Phe Tyr Lys Glu Ala Leu
660 665 670
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675 680 685
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Ser Pro Tyr Ser Lys Gly Ile Pro Asn Leu His Thr Leu Tyr Trp Lys
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Lys Gly Glu Thr Ser Leu Phe Asn Tyr Asp Leu Val Lys Asp Lys Arg
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Lys Asn Lys Lys Ile Thr Asn Val Asn Gln Met Val Arg Asp Tyr Ile
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1085 1090 1095
Arg Ile Ala Lys Ser Lys Lys Ser Gly Lys Trp Met Val Glu Arg
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Ile Glu Asn Leu Ser Leu Cys Phe Leu Glu Leu Phe Glu Gln Phe
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Asn Ile Gly Tyr Arg Val Glu Lys Asp Leu Lys Lys Ala Ile Leu
1130 1135 1140
Ser Gln Asp Arg Lys Glu Phe Tyr Val Arg Leu Ile Tyr Leu Phe
1145 1150 1155
Asn Leu Met Met Gln Ile Arg Asn Ser Asp Gly Glu Glu Asp Tyr
1160 1165 1170
Ile Leu Ser Pro Ala Leu Asn Glu Lys Asn Leu Gln Phe Asp Ser
1175 1180 1185
Arg Leu Ile Glu Ala Lys Asp Leu Pro Val Asp Ala Asp Ala Asn
1190 1195 1200
Gly Ala Tyr Asn Val Ala Arg Lys Gly Leu Met Val Val Gln Arg
1205 1210 1215
Ile Lys Arg Gly Asp His Glu Ser Ile His Arg Ile Gly Arg Ala
1220 1225 1230
Gln Trp Leu Arg Tyr Val Gln Glu Gly Ile Val Glu
1235 1240 1245
<210> 17
<211> 1250
<212> PRT
<213> Smithella sp.
<400> 17
Met Gln Thr Leu Phe Glu Asn Phe Thr Asn Gln Tyr Pro Val Ser Lys
1 5 10 15
Thr Leu Arg Phe Glu Leu Ile Pro Gln Gly Lys Thr Lys Asp Phe Ile
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145 150 155 160
Met Tyr Val Ala Asp Glu Lys Arg Thr Ala Ile Ala Ser Arg Leu Ile
165 170 175
His Glu Asn Leu Pro Lys Phe Ile Asp Asn Ile Lys Ile Phe Glu Lys
180 185 190
Met Lys Lys Glu Ala Pro Glu Leu Leu Ser Pro Phe Asn Gln Thr Leu
195 200 205
Lys Asp Met Lys Asp Val Ile Lys Gly Thr Thr Leu Glu Glu Ile Phe
210 215 220
Ser Leu Asp Tyr Phe Asn Lys Thr Leu Thr Gln Ser Gly Ile Asp Ile
225 230 235 240
Tyr Asn Ser Val Ile Gly Gly Arg Thr Pro Glu Glu Gly Lys Thr Lys
245 250 255
Ile Lys Gly Leu Asn Glu Tyr Ile Asn Thr Asp Phe Asn Gln Lys Gln
260 265 270
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275 280 285
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290 295 300
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Leu Leu His Phe Ser Asn Glu Gly Lys Ser Thr Asn Val Leu Asp Ala
325 330 335
Ile Lys Asn Ala Val Ser Asn Leu Glu Ser Phe Asn Leu Thr Lys Met
340 345 350
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355 360 365
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370 375 380
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385 390 395 400
Lys Glu Lys Trp Leu Lys Gln Asp Phe Asn Val Ser Leu Ile Gln Thr
405 410 415
Ala Ile Asp Glu Tyr Asp Asn Glu Thr Val Lys Gly Lys Asn Ser Gly
420 425 430
Lys Val Ile Ala Asp Tyr Phe Ala Lys Phe Cys Asp Asp Lys Glu Thr
435 440 445
Asp Leu Ile Gln Lys Val Asn Glu Gly Tyr Ile Ala Val Lys Asp Leu
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545 550 555 560
Gly Gly Trp Asp Leu Asn Lys Glu Thr Asp Asn Thr Ala Ile Ile Leu
565 570 575
Arg Lys Asp Asn Leu Tyr Tyr Leu Gly Ile Met Asp Lys Arg His Asn
580 585 590
Arg Ile Phe Arg Asn Val Pro Lys Ala Asp Lys Lys Asp Phe Cys Tyr
595 600 605
Glu Lys Met Val Tyr Lys Leu Leu Pro Gly Ala Asn Lys Met Leu Pro
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Lys Val Phe Phe Ser Gln Ser Arg Ile Gln Glu Phe Thr Pro Ser Ala
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Lys Leu Leu Glu Asn Tyr Ala Asn Glu Thr His Lys Lys Gly Asp Asn
645 650 655
Phe Asn Leu Asn His Cys His Lys Leu Ile Asp Phe Phe Lys Asp Ser
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Ile Asn Lys His Glu Asp Trp Lys Asn Phe Asp Phe Arg Phe Ser Ala
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Asp Leu Val Asn Glu Gly Lys Leu Tyr Leu Phe Gln Ile Tyr Asn Lys
725 730 735
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1250
<210> 18
<211> 3987
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的多核苷酸
<400> 18
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<210> 19
<211> 3987
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aaccacgaga gccgcaagca cttcctggag ggcttcgact tcctgcacta cgacgtgaag 3360
accggggact tcatccttca cttcaagatg aaccggaacc tcagcttcca gcggggcctg 3420
ccggggttca tgcccgcctg ggacatcgtg ttcgagaaga acgagaccca gttcgacgcg 3480
aagggcacgc ccttcatcgc cgggaagcgt atcgtgccgg tgatcgagaa ccatcgtttc 3540
acgggtcgct accgtgacct ctacccggcg aacgagctta tcgcactcct ggaggagaag 3600
ggcatcgtct tccgggacgg ctccaacatc ctcccgaaac tgctggaaaa cgacgactct 3660
cacgccatcg acacgatggt ggccctcatc cggtccgtgc tccaaatgcg gaacagcaac 3720
gccgccaccg gtgaggacta catcaacagc ccggtccggg atctgaacgg ggtgtgcttc 3780
gattcgcggt tccagaatcc tgagtggccg atggacgcgg atgcaaacgg ggcgtaccac 3840
atcgcgctca agggccagtt acttctgaac caccttaagg agtctaaaga tttgaaactc 3900
cagaacggga tctcgaacca ggactggctg gcctacatcc aagagttgcg gaacggcagc 3960
aagaagcggc ggattaagca agattag 3987
<210> 21
<211> 1592
<212> DNA
<213> 蒺藜苜蓿(Medicago truncatula)
<400> 21
actgttaata atttttaaac gtcagcgcac taaaaaaacg aaaagacgga cacgtgaaaa 60
taaaaaacac acactagttt atgacgcaat actattttac ttatgatttg ggtacattag 120
acaaaaccgt gaaagagatg tatcagctat gaaacctgta tacttcaata cagagactta 180
ctcatatcgg atacgtacgc acgaagtatc atattaatta ttttaatttt taataaatat 240
tttatcggat acttatgtga tactctacat atacacaagg atatttctaa gatactttat 300
agatacgtat cctagaaaaa catgaagagt aaaaaagtga gacaatgttg taaaaattca 360
ttataaatgt atatgattca attttagata tgcatcagta taattgattc tcgatgaaac 420
acttaaaatt atatttcttg tggaagaacg tagcgagaga ggtgattcag ttagacaaca 480
ttaaataaaa ttaatgttaa gttcttttaa tgatgtttct ctcaatatca catcatatga 540
aaatgtaata tgatttataa gaaaattttt aaaaaattta ttttaataat cacatgtact 600
attttttaaa aattgtatct tttataataa tacaataata aagagtaatc agtgttaatt 660
tttcttcaaa tataagtttt attataaatc attgttaacg tatcataagt cattaccgta 720
tcgtatctta attttttttt aaaaaccgct aattcacgta cccgtattgt attgtacccg 780
cacctgtatc acaatcgatc ttagttagaa gaattgtctc gaggcggtgc aagacagcat 840
ataatagacg tggactctct tataccaaac gttgtcgtat cacaaagggt taggtaacaa 900
gtcacagttt gtccacgtgt cacgttttaa ttggaagagg tgccgttggc gtaatataac 960
agccaatcga tttttgctat aaaagcaaat caggtaaact aaacttcttc attcttttct 1020
tccccatcgc tacaaaaccg gttcctttgg aaaagagatt cattcaaacc tagcacccaa 1080
ttccgtttca aggtataatc tactttctat tcttcgatta ttttattatt attagctact 1140
atcgtttaat cgatcttttc ttttgatccg tcaaatttaa attcaattag ggttttgttc 1200
ttttctttca tctgattgaa atccttctga attgaaccgt ttacttgatt ttactgttta 1260
ttgtatgatt taatcctttg tttttcaaag acagtcttta gattgtgatt aggggttcat 1320
ataaattttt agatttggat ttttgtattg tatgattcaa aaaatacgtc ctttaattag 1380
attagtacat ggatattttt tacccgattt attgattgtc agggagaatt tgatgagcaa 1440
gtttttttga tgtctgttgt aaattgaatt gattataatt gctgatctgc tgcttccagt 1500
tttcataacc catattcttt taaccttgtt gtacacacaa tgaaaaattg gtgattgatt 1560
catttgtttt tctttgtttt ggattataca gg 1592
<210> 22
<211> 2000
<212> DNA
<213> 玉米(Zea mays)
<400> 22
gtcgtgcccc tctctagaga taaagagcat tgcatgtcta aagtataaaa aattaccaca 60
tatttttttg tcacacttat ttgaagtgta gtttatctat ctctatacat atatttaaac 120
ttcactctac aaataatata gtctataata ctaaaataat attagtgttt tagaggatca 180
tataaataaa ctgctagaca tggtctaaag gataattgaa tattttgaca atctacagtt 240
ttatcttttt agtgtgcatg tgatctctct gttttttttg caaatagctt gacctatata 300
atacttcatc cattttatta gtacatccat ttaggattta gggttgatgg tttctataga 360
ctaattttta gtacatccat tttattcttt ttagtctcta aattttttaa aactaaaact 420
ctattttagt tttttattta ataatttaga tataaaatga aataaaataa attgactaca 480
aataaaacaa atacccttta agaaataaaa aaactaagca aacatttttc ttgtttcgag 540
tagataatga caggctgttc aacgccgtcg acgagtctaa cggacaccaa ccagcgaacc 600
agcagcgtcg cgtcgggcca agcgaagcag acggcacggc atctctgtag ctgcctctgg 660
acccctctcg agagttccgc tccaccgttg gacttgctcc gctgtcggca tccagaaatt 720
gcgtggcgga gcggcagacg tgaggcggca cggcaggcgg cctcttcctc ctctcacggc 780
accggcagct acgggggatt cctttcccac cgctccttcg ctttcccttc ctcgcccgcc 840
gtaataaata gacaccccct ccacaccctc tttccccaac ctcgtgttcg ttcggagcgc 900
acacacacgc aaccagatct cccccaaatc cagccgtcgg cacctccgct tcaaggtacg 960
ccgctcatcc tccccccccc cctctctcta ccttctctag atcggcgatc cggtccatgg 1020
ttagggcccg gtagttctac ttctgttcat gtttgtgtta gagcaaacat gttcatgttc 1080
atgtttgtga tgatgtggtc tggttgggcg gtcgttctag atcggagtag gatactgttt 1140
caagctacct ggtggattta ttaattttgt atctgtatgt gtgtgccata catcttcata 1200
gttacgagtt taagatgatg gatggaaata tcgatctagg ataggtatac atgttgatgc 1260
gggttttact gatgcatata cagagatgct ttttttctcg cttggttgtg atgatatggt 1320
ctggttgggc ggtcgttcta gatcggagta gaatactgtt tcaaactacc tggtggattt 1380
attaaaggat aaagggtcgt tctagatcgg agtagaatac tgtttcaaac tacctggtgg 1440
atttattaaa ggatctgtat gtatgtgcct acatcttcat agttacgagt ttaagatgat 1500
ggatggaaat atcgatctag gataggtata catgttgatg cgggttttac tgatgcatat 1560
acagagatgc tttttttcgc ttggttgtga tgatgtggtc tggttgggcg gtcgttctag 1620
atcggagtag aatactgttt caaactacct ggtggattta ttaattttgt atctttatgt 1680
gtgtgccata catcttcata gttacgagtt taagatgatg gatggaaata ttgatctagg 1740
ataggtatac atgttgatgt gggttttact gatgcatata catgatggca tatgcggcat 1800
ctattcatat gctctaacct tgagtaccta tctattataa taaacaagta tgttttataa 1860
ttattttgat cttgatatac ttggatgatg gcatatgcag cagctatatg tggatttttt 1920
agccctgcct tcatacgcta tttatttgct tggtactgtt tcttttgtcc gatgctcacc 1980
ctgttgtttg gtgatacttc 2000
<210> 23
<211> 228
<212> PRT
<213> 大鼠(Rattus norvegicus)
<400> 23
Ser Ser Glu Thr Gly Pro Val Ala Val Asp Pro Thr Leu Arg Arg Arg
1 5 10 15
Ile Glu Pro His Glu Phe Glu Val Phe Phe Asp Pro Arg Glu Leu Arg
20 25 30
Lys Glu Thr Cys Leu Leu Tyr Glu Ile Asn Trp Gly Gly Arg His Ser
35 40 45
Ile Trp Arg His Thr Ser Gln Asn Thr Asn Lys His Val Glu Val Asn
50 55 60
Phe Ile Glu Lys Phe Thr Thr Glu Arg Tyr Phe Cys Pro Asn Thr Arg
65 70 75 80
Cys Ser Ile Thr Trp Phe Leu Ser Trp Ser Pro Cys Gly Glu Cys Ser
85 90 95
Arg Ala Ile Thr Glu Phe Leu Ser Arg Tyr Pro His Val Thr Leu Phe
100 105 110
Ile Tyr Ile Ala Arg Leu Tyr His His Ala Asp Pro Arg Asn Arg Gln
115 120 125
Gly Leu Arg Asp Leu Ile Ser Ser Gly Val Thr Ile Gln Ile Met Thr
130 135 140
Glu Gln Glu Ser Gly Tyr Cys Trp Arg Asn Phe Val Asn Tyr Ser Pro
145 150 155 160
Ser Asn Glu Ala His Trp Pro Arg Tyr Pro His Leu Trp Val Arg Leu
165 170 175
Tyr Val Leu Glu Leu Tyr Cys Ile Ile Leu Gly Leu Pro Pro Cys Leu
180 185 190
Asn Ile Leu Arg Arg Lys Gln Pro Gln Leu Thr Phe Phe Thr Ile Ala
195 200 205
Leu Gln Ser Cys His Tyr Gln Arg Leu Pro Pro His Ile Leu Trp Ala
210 215 220
Thr Gly Leu Lys
225
<210> 24
<211> 199
<212> PRT
<213> 人(Homo sapiens)
<400> 24
Met Glu Ala Ser Pro Ala Ser Gly Pro Arg His Leu Met Asp Pro His
1 5 10 15
Ile Phe Thr Ser Asn Phe Asn Asn Gly Ile Gly Arg His Lys Thr Tyr
20 25 30
Leu Cys Tyr Glu Val Glu Arg Leu Asp Asn Gly Thr Ser Val Lys Met
35 40 45
Asp Gln His Arg Gly Phe Leu His Asn Gln Ala Lys Asn Leu Leu Cys
50 55 60
Gly Phe Tyr Gly Arg His Ala Glu Leu Arg Phe Leu Asp Leu Val Pro
65 70 75 80
Ser Leu Gln Leu Asp Pro Ala Gln Ile Tyr Arg Val Thr Trp Phe Ile
85 90 95
Ser Trp Ser Pro Cys Phe Ser Trp Gly Cys Ala Gly Glu Val Arg Ala
100 105 110
Phe Leu Gln Glu Asn Thr His Val Arg Leu Arg Ile Phe Ala Ala Arg
115 120 125
Ile Tyr Asp Tyr Asp Pro Leu Tyr Lys Glu Ala Leu Gln Met Leu Arg
130 135 140
Asp Ala Gly Ala Gln Val Ser Ile Met Thr Tyr Asp Glu Phe Lys His
145 150 155 160
Cys Trp Asp Thr Phe Val Asp His Gln Gly Cys Pro Phe Gln Pro Trp
165 170 175
Asp Gly Leu Asp Glu His Ser Gln Ala Leu Ser Gly Arg Leu Arg Ala
180 185 190
Ile Leu Gln Asn Gln Gly Asn
195
<210> 25
<211> 621
<212> DNA
<213> Petromyzon marinus
<400> 25
acagatgcag agtatgtgag aattcacgaa aagctggaca tctatacctt caagaagcag 60
ttctttaaca ataagaagtc tgtgagccat aggtgctacg tgctgttcga gctgaagaga 120
aggggtgaaa gaagggcatg tttttggggg tatgctgtga acaagcccca gtctggaact 180
gagagaggca ttcacgccga aattttcagc atcagaaagg tggaggaata cctgagggat 240
aaccctggac agtttacaat taattggtat tctagctggt ctccatgcgc tgactgtgcc 300
gagaagatcc tggaatggta caaccaggag ctgagaggaa atggccatac cctgaagatt 360
tgggcctgca agctgtacta tgaaaagaac gcaagaaatc agatcggact gtggaacctg 420
agggataatg gtgtggggct gaacgtgatg gtgtccgagc actatcagtg ctgtagaaag 480
attttcattc agtcctcaca taatcagctg aacgagaata gatggctgga aaagactctg 540
aagagggctg agaagagaag gtccgaactg tcaattatga tccaggtgaa gatcctgcac 600
accactaagt cacctgccgt g 621
<210> 26
<211> 160
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的多肽
<400> 26
Phe Glu Arg Asn Tyr Asp Pro Arg Glu Leu Arg Lys Glu Thr Tyr Leu
1 5 10 15
Leu Tyr Glu Ile Lys Trp Gly Lys Ser Gly Lys Leu Trp Arg His Trp
20 25 30
Cys Gln Asn Asn Arg Thr Gln His Ala Glu Val Tyr Phe Leu Glu Asn
35 40 45
Ile Phe Asn Ala Arg Arg Phe Asn Pro Ser Thr His Cys Ser Ile Thr
50 55 60
Trp Tyr Leu Ser Trp Ser Pro Cys Ala Glu Cys Ser Gln Lys Ile Val
65 70 75 80
Asp Phe Leu Lys Glu His Pro Asn Val Leu Glu Ile Tyr Val Ala Arg
85 90 95
Leu Tyr Tyr His Glu Asp Glu Arg Asn Arg Gln Gly Leu Arg Asp Leu
100 105 110
Val Asn Ser Gly Val Thr Ile Arg Ile Met Asp Leu Pro Asp Tyr Asn
115 120 125
Tyr Cys Trp Lys Thr Phe Val Ser Asp Gln Gly Gly Asp Glu Asp Tyr
130 135 140
Trp Pro Gly His Phe Ala Pro Trp Ile Lys Gln Tyr Ser Leu Lys Leu
145 150 155 160
<210> 27
<211> 207
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的多肽
<400> 27
Thr Asp Ala Glu Tyr Val Arg Ile His Glu Lys Leu Asp Ile Tyr Thr
1 5 10 15
Phe Lys Lys Gln Phe Ser Asn Asn Lys Lys Ser Val Ser His Arg Cys
20 25 30
Tyr Val Leu Phe Glu Leu Lys Arg Arg Gly Glu Arg Arg Ala Cys Phe
35 40 45
Trp Gly Tyr Ala Val Asn Lys Pro Gln Ser Gly Thr Glu Arg Gly Ile
50 55 60
His Ala Glu Ile Phe Ser Ile Arg Lys Val Glu Glu Tyr Leu Arg Asp
65 70 75 80
Asn Pro Gly Gln Phe Thr Ile Asn Trp Tyr Ser Ser Trp Ser Pro Cys
85 90 95
Ala Asp Cys Ala Glu Lys Ile Leu Glu Trp Tyr Asn Gln Glu Leu Arg
100 105 110
Gly Asn Gly His Thr Leu Lys Ile Trp Val Cys Lys Leu Tyr Tyr Glu
115 120 125
Lys Asn Ala Arg Asn Gln Ile Gly Leu Trp Asn Leu Arg Asp Asn Gly
130 135 140
Val Gly Leu Asn Val Met Val Ser Glu His Tyr Gln Cys Cys Arg Lys
145 150 155 160
Ile Phe Ile Gln Ser Ser His Asn Gln Leu Asn Glu Asn Arg Trp Leu
165 170 175
Glu Lys Thr Leu Lys Arg Ala Glu Lys Arg Arg Ser Glu Leu Ser Ile
180 185 190
Met Phe Gln Val Lys Ile Leu His Thr Thr Lys Ser Pro Ala Val
195 200 205
<210> 28
<211> 228
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的多肽
<400> 28
Ser Ser Lys Thr Gly Pro Val Ala Val Asp Pro Thr Leu Arg Arg Arg
1 5 10 15
Ile Glu Pro His Glu Phe Glu Val Phe Phe Asp Pro Arg Glu Leu Arg
20 25 30
Lys Glu Thr Cys Leu Leu Tyr Glu Ile Asn Trp Gly Gly Arg His Ser
35 40 45
Ile Trp Arg His Thr Ser Gln Asn Thr Asn Lys His Val Glu Val Asn
50 55 60
Phe Ile Glu Lys Phe Thr Thr Glu Arg Tyr Phe Cys Pro Asn Thr Arg
65 70 75 80
Cys Ser Ile Thr Trp Phe Leu Ser Trp Ser Pro Cys Gly Glu Cys Ser
85 90 95
Arg Ala Ile Thr Glu Phe Leu Ser Arg Tyr Pro Asn Val Thr Leu Phe
100 105 110
Ile Tyr Ile Ala Arg Leu Tyr His Leu Ala Asn Pro Arg Asn Arg Gln
115 120 125
Gly Leu Arg Asp Leu Ile Ser Ser Gly Val Thr Ile Gln Ile Met Thr
130 135 140
Glu Gln Glu Ser Gly Tyr Cys Trp His Asn Phe Val Asn Tyr Ser Pro
145 150 155 160
Ser Asn Glu Ser His Trp Pro Arg Tyr Pro His Leu Trp Val Arg Leu
165 170 175
Tyr Val Leu Glu Leu Tyr Cys Ile Ile Leu Gly Leu Pro Pro Cys Leu
180 185 190
Asn Ile Leu Arg Arg Lys Gln Ser Gln Leu Thr Ser Phe Thr Ile Ala
195 200 205
Leu Gln Ser Cys His Tyr Gln Arg Leu Pro Pro His Ile Leu Trp Ala
210 215 220
Thr Gly Leu Lys
225
<210> 29
<211> 162
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的多肽
<400> 29
Ser Phe Glu Arg Asn Tyr Asp Pro Arg Glu Leu Arg Lys Glu Thr Tyr
1 5 10 15
Leu Leu Tyr Glu Ile Lys Trp Gly Lys Ser Gly Lys Leu Trp Arg His
20 25 30
Trp Cys Gln Asn Asn Arg Thr Gln His Ala Glu Val Tyr Phe Leu Glu
35 40 45
Asn Ile Phe Asn Ala Arg Arg Phe Asn Pro Ser Thr His Cys Ser Ile
50 55 60
Thr Trp Tyr Leu Ser Trp Ser Pro Cys Ala Glu Cys Ser Gln Lys Ile
65 70 75 80
Val Asp Phe Leu Lys Glu His Pro Asn Val Asn Leu Glu Ile Tyr Val
85 90 95
Ala Arg Leu Tyr Tyr Pro Glu Asn Glu Arg Asn Arg Gln Gly Leu Arg
100 105 110
Asp Leu Val Asn Ser Gly Val Thr Ile Arg Ile Met Asp Leu Pro Asp
115 120 125
Tyr Asn Tyr Cys Trp Lys Thr Phe Val Ser Asp Gln Gly Gly Asp Glu
130 135 140
Asp Tyr Trp Pro Gly His Phe Ala Pro Trp Ile Lys Gln Tyr Ser Leu
145 150 155 160
Lys Leu
<210> 30
<211> 166
<212> PRT
<213> 大肠杆菌(Escherichia coli)
<400> 30
Ser Glu Val Glu Phe Ser His Glu Tyr Trp Met Arg His Ala Leu Thr
1 5 10 15
Leu Ala Lys Arg Ala Trp Asp Glu Arg Glu Val Pro Val Gly Ala Val
20 25 30
Leu Val His Asn Asn Arg Val Ile Gly Glu Gly Trp Asn Arg Pro Ile
35 40 45
Gly Arg His Asp Pro Thr Ala His Ala Glu Ile Met Ala Leu Arg Gln
50 55 60
Gly Gly Leu Val Met Gln Asn Tyr Arg Leu Ile Asp Ala Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Val Thr Leu Glu Pro Cys Val Met Cys Ala Gly Ala Met Ile His Ser
85 90 95
Arg Ile Gly Arg Val Val Phe Gly Ala Arg Asp Ala Lys Thr Gly Ala
100 105 110
Ala Gly Ser Leu Met Asp Val Leu His His Pro Gly Met Asn His Arg
115 120 125
Val Glu Ile Thr Glu Gly Ile Leu Ala Asp Glu Cys Ala Ala Leu Leu
130 135 140
Ser Asp Phe Phe Arg Met Arg Arg Gln Glu Ile Lys Ala Gln Lys Lys
145 150 155 160
Ala Gln Ser Ser Thr Asp
165
<210> 31
<211> 166
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的多肽
<400> 31
Ser Glu Val Glu Phe Ser His Glu Tyr Trp Met Arg His Ala Leu Thr
1 5 10 15
Leu Ala Lys Arg Ala Arg Asp Glu Arg Glu Val Pro Val Gly Ala Val
20 25 30
Leu Val Leu Asn Asn Arg Val Ile Gly Glu Gly Trp Asn Arg Ala Ile
35 40 45
Gly Leu His Asp Pro Thr Ala His Ala Glu Ile Met Ala Leu Arg Gln
50 55 60
Gly Gly Leu Val Met Gln Asn Tyr Arg Leu Ile Asp Ala Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Val Thr Phe Glu Pro Cys Val Met Cys Ala Gly Ala Met Ile His Ser
85 90 95
Arg Ile Gly Arg Val Val Phe Gly Val Arg Asn Ala Lys Thr Gly Ala
100 105 110
Ala Gly Ser Leu Met Asp Val Leu His Tyr Pro Gly Met Asn His Arg
115 120 125
Val Glu Ile Thr Glu Gly Ile Leu Ala Asp Glu Cys Ala Ala Leu Leu
130 135 140
Cys Tyr Phe Phe Arg Met Pro Arg Gln Val Phe Asn Ala Gln Lys Lys
145 150 155 160
Ala Gln Ser Ser Thr Asp
165
<210> 32
<211> 166
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的多肽
<400> 32
Ser Glu Val Glu Phe Ser His Glu Tyr Trp Met Arg His Ala Leu Thr
1 5 10 15
Leu Ala Lys Arg Ala Trp Asp Glu Arg Glu Val Pro Val Gly Ala Val
20 25 30
Leu Val Leu Asn Asn Arg Val Ile Gly Glu Gly Trp Asn Arg Ser Ile
35 40 45
Gly Leu His Asp Pro Thr Ala His Ala Glu Ile Met Ala Leu Arg Gln
50 55 60
Gly Gly Leu Val Met Gln Asn Tyr Arg Leu Ile Asp Ala Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Val Thr Phe Glu Pro Cys Val Met Cys Ala Gly Ala Met Ile His Ser
85 90 95
Arg Ile Gly Arg Val Val Phe Gly Val Arg Asn Ala Lys Thr Gly Ala
100 105 110
Ala Gly Ser Leu Met Asp Val Leu His Tyr Pro Gly Met Asn His Arg
115 120 125
Val Glu Ile Thr Glu Gly Ile Leu Ala Asp Glu Cys Ala Ala Leu Leu
130 135 140
Cys Tyr Phe Phe Arg Met Arg Arg Gln Val Phe Asn Ala Gln Lys Lys
145 150 155 160
Ala Gln Ser Ser Thr Asp
165
<210> 33
<211> 166
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的多肽
<400> 33
Ser Glu Val Glu Phe Ser His Glu Tyr Trp Met Arg His Ala Leu Thr
1 5 10 15
Leu Ala Lys Arg Ala Leu Asp Glu Arg Glu Val Pro Val Gly Ala Val
20 25 30
Leu Val Leu Asn Asn Arg Val Ile Gly Glu Gly Trp Asn Arg Ala Ile
35 40 45
Gly Leu His Asp Pro Thr Ala His Ala Glu Ile Met Ala Leu Arg Gln
50 55 60
Gly Gly Leu Val Met Gln Asn Tyr Arg Leu Ile Asp Ala Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Val Thr Phe Glu Pro Cys Val Met Cys Ala Gly Ala Met Ile His Ser
85 90 95
Arg Ile Gly Arg Val Val Phe Gly Val Arg Asn Ala Lys Thr Gly Ala
100 105 110
Ala Gly Ser Leu Met Asp Val Leu His Tyr Pro Gly Met Asn His Arg
115 120 125
Val Glu Ile Thr Glu Gly Ile Leu Ala Asp Glu Cys Asn Ala Leu Leu
130 135 140
Cys Tyr Phe Phe Arg Met Arg Arg Gln Val Phe Asn Ala Gln Lys Lys
145 150 155 160
Ala Gln Ser Ser Thr Asp
165
<210> 34
<211> 166
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的多肽
<400> 34
Ser Glu Val Glu Phe Ser His Glu Tyr Trp Met Arg His Ala Leu Thr
1 5 10 15
Leu Ala Lys Arg Ala Leu Asp Glu Arg Glu Val Pro Val Gly Ala Val
20 25 30
Leu Val Leu Asn Asn Arg Val Ile Gly Glu Gly Trp Asn Arg Ala Ile
35 40 45
Gly Leu His Asp Pro Thr Ala His Ala Glu Ile Met Ala Leu Arg Gln
50 55 60
Gly Gly Leu Val Met Gln Asn Tyr Arg Leu Ile Asp Ala Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Val Thr Phe Glu Pro Cys Val Met Cys Ala Gly Ala Met Ile His Ser
85 90 95
Arg Ile Gly Arg Val Val Phe Gly Val Arg Asn Ala Lys Thr Gly Ala
100 105 110
Ala Gly Ser Leu Met Asp Val Leu His Tyr Pro Gly Met Asn His Arg
115 120 125
Val Glu Ile Thr Glu Gly Ile Leu Ala Asp Glu Cys Asn Ala Leu Leu
130 135 140
Cys Tyr Phe Phe Arg Met Pro Arg Gln Val Phe Asn Ala Gln Lys Lys
145 150 155 160
Ala Gln Ser Ser Thr Asp
165
<210> 35
<211> 1763
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的多肽
<400> 35
Ser Glu Val Glu Phe Ser His Glu Tyr Trp Met Arg His Ala Leu Thr
1 5 10 15
Leu Ala Lys Arg Ala Trp Asp Glu Arg Glu Val Pro Val Gly Ala Val
20 25 30
Leu Val His Asn Asn Arg Val Ile Gly Glu Gly Trp Asn Arg Pro Ile
35 40 45
Gly Arg His Asp Pro Thr Ala His Ala Glu Ile Met Ala Leu Arg Gln
50 55 60
Gly Gly Leu Val Met Gln Asn Tyr Arg Leu Ile Asp Ala Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Val Thr Leu Glu Pro Cys Val Met Cys Ala Gly Ala Met Ile His Ser
85 90 95
Arg Ile Gly Arg Val Val Phe Gly Ala Arg Asp Ala Lys Thr Gly Ala
100 105 110
Ala Gly Ser Leu Met Asp Val Leu His His Pro Gly Met Asn His Arg
115 120 125
Val Glu Ile Thr Glu Gly Ile Leu Ala Asp Glu Cys Ala Ala Leu Leu
130 135 140
Ser Asp Phe Phe Arg Met Arg Arg Gln Glu Ile Lys Ala Gln Lys Lys
145 150 155 160
Ala Gln Ser Ser Thr Asp Ser Gly Gly Ser Ser Gly Gly Ser Ser Gly
165 170 175
Ser Glu Thr Pro Gly Thr Ser Glu Ser Ala Thr Pro Glu Ser Ser Gly
180 185 190
Gly Ser Ser Gly Gly Ser Ser Glu Val Glu Phe Ser His Glu Tyr Trp
195 200 205
Met Arg His Ala Leu Thr Leu Ala Lys Arg Ala Arg Asp Glu Arg Glu
210 215 220
Val Pro Val Gly Ala Val Leu Val Leu Asn Asn Arg Val Ile Gly Glu
225 230 235 240
Gly Trp Asn Arg Ala Ile Gly Leu His Asp Pro Thr Ala His Ala Glu
245 250 255
Ile Met Ala Leu Arg Gln Gly Gly Leu Val Met Gln Asn Tyr Arg Leu
260 265 270
Ile Asp Ala Thr Leu Tyr Val Thr Phe Glu Pro Cys Val Met Cys Ala
275 280 285
Gly Ala Met Ile His Ser Arg Ile Gly Arg Val Val Phe Gly Val Arg
290 295 300
Asn Ala Lys Thr Gly Ala Ala Gly Ser Leu Met Asp Val Leu His Tyr
305 310 315 320
Pro Gly Met Asn His Arg Val Glu Ile Thr Glu Gly Ile Leu Ala Asp
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Glu Cys Ala Ala Leu Leu Cys Tyr Phe Phe Arg Met Pro Arg Gln Val
340 345 350
Phe Asn Ala Gln Lys Lys Ala Gln Ser Ser Thr Asp Ser Gly Gly Ser
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Ser Gly Gly Ser Ser Gly Ser Glu Thr Pro Gly Thr Ser Glu Ser Ala
370 375 380
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<220>
<223> 合成的多肽
<400> 36
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1565
<210> 37
<211> 1565
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的多肽
<400> 37
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Leu Ser Gly Glu Gln Lys Lys Ala Ile Val Asp Leu Leu Phe Lys Thr
740 745 750
Asn Arg Lys Val Thr Val Lys Gln Leu Lys Glu Asp Tyr Phe Lys Lys
755 760 765
Ile Glu Cys Phe Asp Ser Val Glu Ile Ser Gly Val Glu Asp Arg Phe
770 775 780
Asn Ala Ser Leu Gly Thr Tyr His Asp Leu Leu Lys Ile Ile Lys Asp
785 790 795 800
Lys Asp Phe Leu Asp Asn Glu Glu Asn Glu Asp Ile Leu Glu Asp Ile
805 810 815
Val Leu Thr Leu Thr Leu Phe Glu Asp Arg Glu Met Ile Glu Glu Arg
820 825 830
Leu Lys Thr Tyr Ala His Leu Phe Asp Asp Lys Val Met Lys Gln Leu
835 840 845
Lys Arg Arg Arg Tyr Thr Gly Trp Gly Arg Leu Ser Arg Lys Leu Ile
850 855 860
Asn Gly Ile Arg Asp Lys Gln Ser Gly Lys Thr Ile Leu Asp Phe Leu
865 870 875 880
Lys Ser Asp Gly Phe Ala Asn Arg Asn Phe Met Gln Leu Ile His Asp
885 890 895
Asp Ser Leu Thr Phe Lys Glu Asp Ile Gln Lys Ala Gln Val Ser Gly
900 905 910
Gln Gly Asp Ser Leu His Glu His Ile Ala Asn Leu Ala Gly Ser Pro
915 920 925
Ala Ile Lys Lys Gly Ile Leu Gln Thr Val Lys Val Val Asp Glu Leu
930 935 940
Val Lys Val Met Gly Arg His Lys Pro Glu Asn Ile Val Ile Glu Met
945 950 955 960
Ala Arg Glu Asn Gln Thr Thr Gln Lys Gly Gln Lys Asn Ser Arg Glu
965 970 975
Arg Met Lys Arg Ile Glu Glu Gly Ile Lys Glu Leu Gly Ser Gln Ile
980 985 990
Leu Lys Glu His Pro Val Glu Asn Thr Gln Leu Gln Asn Glu Lys Leu
995 1000 1005
Tyr Leu Tyr Tyr Leu Gln Asn Gly Arg Asp Met Tyr Val Asp Gln
1010 1015 1020
Glu Leu Asp Ile Asn Arg Leu Ser Asp Tyr Asp Val Asp His Ile
1025 1030 1035
Val Pro Gln Ser Phe Leu Lys Asp Asp Ser Ile Asp Asn Lys Val
1040 1045 1050
Leu Thr Arg Ser Asp Lys Asn Arg Gly Lys Ser Asp Asn Val Pro
1055 1060 1065
Ser Glu Glu Val Val Lys Lys Met Lys Asn Tyr Trp Arg Gln Leu
1070 1075 1080
Leu Asn Ala Lys Leu Ile Thr Gln Arg Lys Phe Asp Asn Leu Thr
1085 1090 1095
Lys Ala Glu Arg Gly Gly Leu Ser Glu Leu Asp Lys Ala Gly Phe
1100 1105 1110
Ile Lys Arg Gln Leu Val Glu Thr Arg Gln Ile Thr Lys His Val
1115 1120 1125
Ala Gln Ile Leu Asp Ser Arg Met Asn Thr Lys Tyr Asp Glu Asn
1130 1135 1140
Asp Lys Leu Ile Arg Glu Val Lys Val Ile Thr Leu Lys Ser Lys
1145 1150 1155
Leu Val Ser Asp Phe Arg Lys Asp Phe Gln Phe Tyr Lys Val Arg
1160 1165 1170
Glu Ile Asn Asn Tyr His His Ala His Asp Ala Tyr Leu Asn Ala
1175 1180 1185
Val Val Gly Thr Ala Leu Ile Lys Lys Tyr Pro Lys Leu Glu Ser
1190 1195 1200
Glu Phe Val Tyr Gly Asp Tyr Lys Val Tyr Asp Val Arg Lys Met
1205 1210 1215
Ile Ala Lys Ser Glu Gln Glu Ile Gly Lys Ala Thr Ala Lys Tyr
1220 1225 1230
Phe Phe Tyr Ser Asn Ile Met Asn Phe Phe Lys Thr Glu Ile Thr
1235 1240 1245
Leu Ala Asn Gly Glu Ile Arg Lys Arg Pro Leu Ile Glu Thr Asn
1250 1255 1260
Gly Glu Thr Gly Glu Ile Val Trp Asp Lys Gly Arg Asp Phe Ala
1265 1270 1275
Thr Val Arg Lys Val Leu Ser Met Pro Gln Val Asn Ile Val Lys
1280 1285 1290
Lys Thr Glu Val Gln Thr Gly Gly Phe Ser Lys Glu Ser Ile Leu
1295 1300 1305
Pro Lys Arg Asn Ser Asp Lys Leu Ile Ala Arg Lys Lys Asp Trp
1310 1315 1320
Asp Pro Lys Lys Tyr Gly Gly Phe Asp Ser Pro Thr Val Ala Tyr
1325 1330 1335
Ser Val Leu Val Val Ala Lys Val Glu Lys Gly Lys Ser Lys Lys
1340 1345 1350
Leu Lys Ser Val Lys Glu Leu Leu Gly Ile Thr Ile Met Glu Arg
1355 1360 1365
Ser Ser Phe Glu Lys Asn Pro Ile Asp Phe Leu Glu Ala Lys Gly
1370 1375 1380
Tyr Lys Glu Val Lys Lys Asp Leu Ile Ile Lys Leu Pro Lys Tyr
1385 1390 1395
Ser Leu Phe Glu Leu Glu Asn Gly Arg Lys Arg Met Leu Ala Ser
1400 1405 1410
Ala Gly Glu Leu Gln Lys Gly Asn Glu Leu Ala Leu Pro Ser Lys
1415 1420 1425
Tyr Val Asn Phe Leu Tyr Leu Ala Ser His Tyr Glu Lys Leu Lys
1430 1435 1440
Gly Ser Pro Glu Asp Asn Glu Gln Lys Gln Leu Phe Val Glu Gln
1445 1450 1455
His Lys His Tyr Leu Asp Glu Ile Ile Glu Gln Ile Ser Glu Phe
1460 1465 1470
Ser Lys Arg Val Ile Leu Ala Asp Ala Asn Leu Asp Lys Val Leu
1475 1480 1485
Ser Ala Tyr Asn Lys His Arg Asp Lys Pro Ile Arg Glu Gln Ala
1490 1495 1500
Glu Asn Ile Ile His Leu Phe Thr Leu Thr Asn Leu Gly Ala Pro
1505 1510 1515
Ala Ala Phe Lys Tyr Phe Asp Thr Thr Ile Asp Arg Lys Arg Tyr
1520 1525 1530
Thr Ser Thr Lys Glu Val Leu Asp Ala Thr Leu Ile His Gln Ser
1535 1540 1545
Ile Thr Gly Leu Tyr Glu Thr Arg Ile Asp Leu Ser Gln Leu Gly
1550 1555 1560
Gly Asp
1565
<210> 38
<211> 364
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的多肽
<400> 38
Ser Glu Val Glu Phe Ser His Glu Tyr Trp Met Arg His Ala Leu Thr
1 5 10 15
Leu Ala Lys Arg Ala Trp Asp Glu Arg Glu Val Pro Val Gly Ala Val
20 25 30
Leu Val His Asn Asn Arg Val Ile Gly Glu Gly Trp Asn Arg Pro Ile
35 40 45
Gly Arg His Asp Pro Thr Ala His Ala Glu Ile Met Ala Leu Arg Gln
50 55 60
Gly Gly Leu Val Met Gln Asn Tyr Arg Leu Ile Asp Ala Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Val Thr Leu Glu Pro Cys Val Met Cys Ala Gly Ala Met Ile His Ser
85 90 95
Arg Ile Gly Arg Val Val Phe Gly Ala Arg Asp Ala Lys Thr Gly Ala
100 105 110
Ala Gly Ser Leu Met Asp Val Leu His His Pro Gly Met Asn His Arg
115 120 125
Val Glu Ile Thr Glu Gly Ile Leu Ala Asp Glu Cys Ala Ala Leu Leu
130 135 140
Ser Asp Phe Phe Arg Met Arg Arg Gln Glu Ile Lys Ala Gln Lys Lys
145 150 155 160
Ala Gln Ser Ser Thr Asp Ser Gly Gly Ser Ser Gly Gly Ser Ser Gly
165 170 175
Ser Glu Thr Pro Gly Thr Ser Glu Ser Ala Thr Pro Glu Ser Ser Gly
180 185 190
Gly Ser Ser Gly Gly Ser Ser Glu Val Glu Phe Ser His Glu Tyr Trp
195 200 205
Met Arg His Ala Leu Thr Leu Ala Lys Arg Ala Arg Asp Glu Arg Glu
210 215 220
Val Pro Val Gly Ala Val Leu Val Leu Asn Asn Arg Val Ile Gly Glu
225 230 235 240
Gly Trp Asn Arg Ala Ile Gly Leu His Asp Pro Thr Ala His Ala Glu
245 250 255
Ile Met Ala Leu Arg Gln Gly Gly Leu Val Met Gln Asn Tyr Arg Leu
260 265 270
Ile Asp Ala Thr Leu Tyr Val Thr Phe Glu Pro Cys Val Met Cys Ala
275 280 285
Gly Ala Met Ile His Ser Arg Ile Gly Arg Val Val Phe Gly Val Arg
290 295 300
Asn Ala Lys Thr Gly Ala Ala Gly Ser Leu Met Asp Val Leu His Tyr
305 310 315 320
Pro Gly Met Asn His Arg Val Glu Ile Thr Glu Gly Ile Leu Ala Asp
325 330 335
Glu Cys Ala Ala Leu Leu Cys Tyr Phe Phe Arg Met Pro Arg Gln Val
340 345 350
Phe Asn Ala Gln Lys Lys Ala Gln Ser Ser Thr Asp
355 360
<210> 39
<211> 167
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的多肽
<400> 39
Met Ser Glu Val Glu Phe Ser His Glu Tyr Trp Met Arg His Ala Leu
1 5 10 15
Thr Leu Ala Lys Arg Ala Arg Asp Glu Arg Glu Val Pro Val Gly Ala
20 25 30
Val Leu Val Leu Asn Asn Arg Val Ile Gly Glu Gly Trp Asn Arg Ala
35 40 45
Ile Gly Leu His Asp Pro Thr Ala His Ala Glu Ile Met Ala Leu Arg
50 55 60
Gln Gly Gly Leu Val Met Gln Asn Tyr Arg Leu Tyr Asp Ala Thr Leu
65 70 75 80
Tyr Ser Thr Phe Glu Pro Cys Val Met Cys Ala Gly Ala Met Ile His
85 90 95
Ser Arg Ile Gly Arg Val Val Phe Gly Val Arg Asn Ala Lys Thr Gly
100 105 110
Ala Ala Gly Ser Leu Met Asp Val Leu His His Pro Gly Met Asn His
115 120 125
Arg Val Glu Ile Thr Glu Gly Ile Leu Ala Asp Glu Cys Ala Ala Leu
130 135 140
Leu Cys Arg Phe Phe Arg Met Pro Arg Arg Val Phe Asn Ala Gln Lys
145 150 155 160
Lys Ala Gln Ser Ser Thr Asp
165
<210> 40
<211> 167
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的多肽
<400> 40
Met Ser Glu Val Glu Phe Ser His Glu Tyr Trp Met Arg His Ala Leu
1 5 10 15
Thr Leu Ala Lys Arg Ala Arg Asp Glu Arg Glu Val Pro Val Gly Ala
20 25 30
Val Leu Val Leu Asn Asn Arg Val Ile Gly Glu Gly Trp Asn Arg Ala
35 40 45
Ile Gly Leu His Asp Pro Thr Ala His Ala Glu Ile Met Ala Leu Arg
50 55 60
Gln Gly Gly Leu Val Met Gln Asn Tyr Arg Leu Ile Asp Ala Thr Leu
65 70 75 80
Tyr Val Thr Phe Glu Pro Cys Val Met Cys Ala Gly Ala Met Ile His
85 90 95
Ser Arg Ile Gly Arg Val Val Phe Gly Val Arg Asn Ser Lys Arg Gly
100 105 110
Ala Ala Gly Ser Leu Met Asn Val Leu Asn Tyr Pro Gly Met Asn His
115 120 125
Arg Val Glu Ile Thr Glu Gly Ile Leu Ala Asp Glu Cys Ala Ala Leu
130 135 140
Leu Cys Asp Phe Tyr Arg Met Pro Arg Gln Val Phe Asn Ala Gln Lys
145 150 155 160
Lys Ala Gln Ser Ser Ile Asn
165
<210> 41
<211> 83
<212> PRT
<213> 芽孢杆菌噬菌体AR9
<400> 41
Thr Asn Leu Ser Asp Ile Ile Glu Lys Glu Thr Gly Lys Gln Leu Val
1 5 10 15
Ile Gln Glu Ser Ile Leu Met Leu Pro Glu Glu Val Glu Glu Val Ile
20 25 30
Gly Asn Lys Pro Glu Ser Asp Ile Leu Val His Thr Ala Tyr Asp Glu
35 40 45
Ser Thr Asp Glu Asn Val Met Leu Leu Thr Ser Asp Ala Pro Glu Tyr
50 55 60
Lys Pro Trp Ala Leu Val Ile Gln Asp Ser Asn Gly Glu Asn Lys Ile
65 70 75 80
Lys Met Leu
<210> 42
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的寡核苷酸
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(19)
<223> n是a, c, g或u
<400> 42
nnnnnnnnnn nnnnnnnnn 19
<210> 43
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的寡核苷酸
<220>
<221> misc_feature
<222> (4)..(22)
<223> n是a, c, g或t
<400> 43
aaannnnnnn nnnnnnnnnn nn 22
<210> 44
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的寡核苷酸
<220>
<221> misc_feature
<222> (4)..(22)
<223> n是a, c, g或t
<400> 44
tttnnnnnnn nnnnnnnnnn nn 22
<210> 45
<211> 24
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的肽
<400> 45
Glu Glu Leu Leu Ser Lys Asn Tyr His Leu Glu Asn Glu Val Ala Arg
1 5 10 15
Leu Lys Lys Gly Ser Gly Ser Gly
20
<210> 46
<211> 241
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的多肽
<400> 46
Glu Glu Glu Leu Leu Ser Lys Asn Tyr His Leu Glu Asn Glu Val Ala
1 5 10 15
Arg Leu Lys Lys Gly Ser Gly Ser Gly Glu Glu Leu Leu Ser Lys Asn
20 25 30
Tyr His Leu Glu Asn Glu Val Ala Arg Leu Lys Lys Gly Ser Gly Ser
35 40 45
Gly Glu Glu Leu Leu Ser Lys Asn Tyr His Leu Glu Asn Glu Val Ala
50 55 60
Arg Leu Lys Lys Gly Ser Gly Ser Gly Glu Glu Leu Leu Ser Lys Asn
65 70 75 80
Tyr His Leu Glu Asn Glu Val Ala Arg Leu Lys Lys Gly Ser Gly Ser
85 90 95
Gly Glu Glu Leu Leu Ser Lys Asn Tyr His Leu Glu Asn Glu Val Ala
100 105 110
Arg Leu Lys Lys Gly Ser Gly Ser Gly Glu Glu Leu Leu Ser Lys Asn
115 120 125
Tyr His Leu Glu Asn Glu Val Ala Arg Leu Lys Lys Gly Ser Gly Ser
130 135 140
Gly Glu Glu Leu Leu Ser Lys Asn Tyr His Leu Glu Asn Glu Val Ala
145 150 155 160
Arg Leu Lys Lys Gly Ser Gly Ser Gly Glu Glu Leu Leu Ser Lys Asn
165 170 175
Tyr His Leu Glu Asn Glu Val Ala Arg Leu Lys Lys Gly Ser Gly Ser
180 185 190
Gly Glu Glu Leu Leu Ser Lys Asn Tyr His Leu Glu Asn Glu Val Ala
195 200 205
Arg Leu Lys Lys Gly Ser Gly Ser Gly Glu Glu Leu Leu Ser Lys Asn
210 215 220
Tyr His Leu Glu Asn Glu Val Ala Arg Leu Lys Lys Gly Ser Gly Ser
225 230 235 240
Gly
<210> 47
<211> 277
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的多肽
<400> 47
Met Gly Pro Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala
1 5 10 15
Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ser Ser Thr Gly Ala
20 25 30
Val Thr Thr Ser Asn Tyr Ala Ser Trp Val Gln Glu Lys Pro Gly Lys
35 40 45
Leu Phe Lys Gly Leu Ile Gly Gly Thr Asn Asn Arg Ala Pro Gly Val
50 55 60
Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Leu Ile Gly Asp Lys Ala Thr Leu Thr
65 70 75 80
Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Phe Cys Ala Leu
85 90 95
Trp Tyr Ser Asn His Trp Val Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Leu
100 105 110
Lys Arg Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly
115 120 125
Ser Ser Gly Gly Gly Ser Glu Val Lys Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly
130 135 140
Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Val Ser Gly
145 150 155 160
Phe Ser Leu Thr Asp Tyr Gly Val Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly
165 170 175
Arg Gly Leu Glu Trp Ile Gly Val Ile Trp Gly Asp Gly Ile Thr Asp
180 185 190
Tyr Asn Ser Ala Leu Lys Asp Arg Phe Ile Ile Ser Lys Asp Asn Gly
195 200 205
Lys Asn Thr Val Tyr Leu Gln Met Ser Lys Val Arg Ser Asp Asp Thr
210 215 220
Ala Leu Tyr Tyr Cys Val Thr Gly Leu Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly
225 230 235 240
Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Tyr Pro Tyr Asp Val Pro Asp Tyr Ala
245 250 255
Gly Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
260 265 270
Gly Gly Gly Gly Ser
275
<210> 48
<211> 66
<212> DNA
<213> 贝酵母(Saccharomyces bayanus)
<400> 48
ttcttgtcgt acttatagat cgctacgtta tttcaatttt gaaaatctga gtcctgggag 60
tgcgga 66
<210> 49
<211> 605
<212> PRT
<213> 人
<400> 49
Met Ser Gly Trp Glu Ser Tyr Tyr Lys Thr Glu Gly Asp Glu Glu Ala
1 5 10 15
Glu Glu Glu Gln Glu Glu Asn Leu Glu Ala Ser Gly Asp Tyr Lys Tyr
20 25 30
Ser Gly Arg Asp Ser Leu Ile Phe Leu Val Asp Ala Ser Lys Ala Met
35 40 45
Phe Glu Ser Gln Ser Glu Asp Glu Leu Thr Pro Phe Asp Met Ser Ile
50 55 60
Gln Cys Ile Gln Ser Val Tyr Ile Ser Lys Ile Ile Ser Ser Asp Arg
65 70 75 80
Asp Leu Leu Ala Trp Phe Tyr Gly Thr Glu Lys Asp Lys Asn Ser Val
85 90 95
Asn Phe Lys Ile Tyr Val Leu Gln Glu Leu Asp Asn Pro Gly Ala Lys
100 105 110
Arg Ile Leu Glu Leu Asp Gln Phe Lys Gly Gln Gln Gly Gln Lys Arg
115 120 125
Phe Gln Asp Met Met Gly His Gly Ser Asp Tyr Ser Leu Ser Glu Val
130 135 140
Leu Trp Val Cys Ala Asn Leu Phe Ser Asp Val Gln Phe Lys Met Ser
145 150 155 160
His Lys Arg Ile Met Leu Phe Thr Asn Glu Asp Asn Pro His Gly Asn
165 170 175
Asp Ser Ala Lys Ala Ser Arg Ala Arg Thr Lys Ala Gly Asp Leu Arg
180 185 190
Asp Thr Gly Ile Phe Leu Asp Leu His Leu Lys Lys Pro Gly Gly Phe
195 200 205
Asp Ile Ser Leu Phe Tyr Arg Asp Ile Ile Ser Ile Ala Glu Asp Glu
210 215 220
Asp Leu Arg Val His Phe Glu Glu Ser Ser Lys Leu Glu Asp Leu Leu
225 230 235 240
Arg Lys Val Arg Ala Lys Glu Thr Arg Lys Arg Ala Leu Ser Arg Leu
245 250 255
Lys Leu Lys Leu Asn Lys Asp Ile Val Ile Ser Val Gly Ile Tyr Asn
260 265 270
Leu Val Gln Lys Ala Leu Lys Pro Pro Pro Ile Lys Leu Tyr Arg Glu
275 280 285
Thr Asn Glu Pro Val Lys Thr Lys Thr Arg Thr Phe Asn Thr Ser Thr
290 295 300
Gly Gly Leu Leu Leu Pro Ser Asp Thr Lys Arg Ser Gln Ile Tyr Gly
305 310 315 320
Ser Arg Gln Ile Ile Leu Glu Lys Glu Glu Thr Glu Glu Leu Lys Arg
325 330 335
Phe Asp Asp Pro Gly Leu Met Leu Met Gly Phe Lys Pro Leu Val Leu
340 345 350
Leu Lys Lys His His Tyr Leu Arg Pro Ser Leu Phe Val Tyr Pro Glu
355 360 365
Glu Ser Leu Val Ile Gly Ser Ser Thr Leu Phe Ser Ala Leu Leu Ile
370 375 380
Lys Cys Leu Glu Lys Glu Val Ala Ala Leu Cys Arg Tyr Thr Pro Arg
385 390 395 400
Arg Asn Ile Pro Pro Tyr Phe Val Ala Leu Val Pro Gln Glu Glu Glu
405 410 415
Leu Asp Asp Gln Lys Ile Gln Val Thr Pro Pro Gly Phe Gln Leu Val
420 425 430
Phe Leu Pro Phe Ala Asp Asp Lys Arg Lys Met Pro Phe Thr Glu Lys
435 440 445
Ile Met Ala Thr Pro Glu Gln Val Gly Lys Met Lys Ala Ile Val Glu
450 455 460
Lys Leu Arg Phe Thr Tyr Arg Ser Asp Ser Phe Glu Asn Pro Val Leu
465 470 475 480
Gln Gln His Phe Arg Asn Leu Glu Ala Leu Ala Leu Asp Leu Met Glu
485 490 495
Pro Glu Gln Ala Val Asp Leu Thr Leu Pro Lys Val Glu Ala Met Asn
500 505 510
Lys Arg Leu Gly Ser Leu Val Asp Glu Phe Lys Glu Leu Val Tyr Pro
515 520 525
Pro Asp Tyr Asn Pro Glu Gly Lys Val Thr Lys Arg Lys His Asp Asn
530 535 540
Glu Gly Ser Gly Ser Lys Arg Pro Lys Val Glu Tyr Ser Glu Glu Glu
545 550 555 560
Leu Lys Thr His Ile Ser Lys Gly Thr Leu Gly Lys Phe Thr Val Pro
565 570 575
Leu Lys Glu Ala Cys Arg Ala Tyr Gly Leu Lys Ser Gly Leu Lys Lys
580 585 590
Gln Glu Leu Leu Glu Ala Leu Thr Lys His Phe Gln Asp
595 600 605
<210> 50
<211> 482
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的多肽
<400> 50
Met Val Arg Ser Gly Asn Lys Ala Ala Trp Leu Cys Met Asp Val Gly
1 5 10 15
Phe Thr Met Ser Asn Ser Ile Pro Gly Ile Glu Ser Pro Phe Glu Gln
20 25 30
Ala Lys Lys Val Ile Thr Met Phe Val Gln Arg Gln Val Phe Ala Glu
35 40 45
Asn Lys Asp Glu Ile Ala Leu Val Leu Phe Gly Thr Asp Gly Thr Asp
50 55 60
Asn Pro Leu Ser Gly Gly Asp Gln Tyr Gln Asn Ile Thr Val His Arg
65 70 75 80
His Leu Met Leu Pro Asp Phe Asp Leu Leu Glu Asp Ile Glu Ser Lys
85 90 95
Ile Gln Pro Gly Ser Gln Gln Ala Asp Phe Leu Asp Ala Leu Ile Val
100 105 110
Ser Met Asp Val Ile Gln His Glu Thr Ile Gly Lys Lys Phe Glu Lys
115 120 125
Arg His Ile Glu Ile Phe Thr Asp Leu Ser Ser Arg Phe Ser Lys Ser
130 135 140
Gln Leu Asp Ile Ile Ile His Ser Leu Lys Lys Cys Asp Ile Ser Glu
145 150 155 160
Arg His Ser Ile His Trp Pro Cys Arg Leu Thr Ile Gly Ser Asn Leu
165 170 175
Ser Ile Arg Ile Ala Ala Tyr Lys Ser Ile Leu Gln Glu Arg Val Lys
180 185 190
Lys Thr Thr Trp Asp Ala Lys Thr Leu Lys Lys Glu Asp Ile Gln Lys
195 200 205
Glu Thr Val Tyr Cys Leu Asn Asp Asp Asp Glu Thr Glu Val Leu Lys
210 215 220
Glu Asp Ile Ile Gln Gly Phe Arg Tyr Gly Ser Asp Ile Val Pro Phe
225 230 235 240
Ser Lys Val Asp Glu Glu Gln Met Lys Tyr Lys Ser Glu Gly Lys Cys
245 250 255
Phe Ser Val Leu Gly Phe Cys Lys Ser Ser Gln Val Gln Arg Arg Phe
260 265 270
Phe Met Gly Asn Gln Val Leu Lys Val Phe Ala Ala Arg Asp Asp Glu
275 280 285
Ala Ala Ala Val Ala Leu Ser Ser Leu Ile His Ala Leu Asp Asp Leu
290 295 300
Asp Ile Trp Ala Ile Val Arg Tyr Ala Tyr Asp Lys Arg Ala Asn Pro
305 310 315 320
Gln Val Gly Val Ala Phe Pro His Ile Lys His Asn Tyr Glu Cys Leu
325 330 335
Val Tyr Val Gln Leu Pro Phe Met Glu Asp Leu Arg Gln Tyr Met Phe
340 345 350
Ser Ser Leu Lys Asn Ser Lys Lys Tyr Ala Pro Thr Glu Ala Gln Leu
355 360 365
Asn Ala Val Asp Ala Leu Ile Asp Ser Met Ser Leu Ala Lys Lys Asp
370 375 380
Glu Lys Thr Asp Thr Leu Glu Asp Leu Phe Pro Thr Thr Lys Ile Pro
385 390 395 400
Asn Pro Arg Phe Gln Arg Leu Phe Gln Cys Leu Leu His Arg Ala Leu
405 410 415
His Pro Arg Glu Pro Leu Pro Pro Ile Gln Gln His Ile Trp Asn Met
420 425 430
Leu Asn Pro Pro Ala Glu Val Thr Thr Lys Ser Gln Ile Pro Leu Ser
435 440 445
Lys Ile Lys Thr Leu Phe Pro Leu Ile Glu Ala Lys Lys Lys Asp Gln
450 455 460
Val Thr Ala Gln Glu Ile Phe Gln Asp Asn His Glu Asp Gly Pro Thr
465 470 475 480
Ala Lys
<210> 51
<211> 10
<212> DNA
<213> Methanobacterium thermoautotrophicum
<400> 51
aatttttgga 10
<210> 52
<211> 83
<212> PRT
<213> Methanobacterium thermoautotrophicum
<400> 52
Gly Ser Val Ile Asp Val Ser Ser Gln Arg Val Asn Val Gln Arg Pro
1 5 10 15
Leu Asp Ala Leu Gly Asn Ser Leu Asn Ser Pro Val Ile Ile Lys Leu
20 25 30
Lys Gly Asp Arg Glu Phe Arg Gly Val Leu Lys Ser Phe Asp Leu His
35 40 45
Met Asn Leu Val Leu Asn Asp Ala Glu Glu Leu Glu Asp Gly Glu Val
50 55 60
Thr Arg Arg Leu Gly Thr Val Leu Ile Arg Gly Asp Asn Ile Val Tyr
65 70 75 80
Ile Ser Pro
<210> 53
<211> 25
<212> DNA
<213> 噬菌体 MS2
<400> 53
gcgcacatga ggatcaccca tgtgc 25
<210> 54
<211> 116
<212> PRT
<213> 噬菌体MS2
<400> 54
Met Ala Ser Asn Phe Thr Gln Phe Val Leu Val Asp Asn Gly Gly Thr
1 5 10 15
Gly Asp Val Thr Val Ala Pro Ser Asn Phe Ala Asn Gly Ile Ala Glu
20 25 30
Ile Ser Ser Asn Ser Arg Ser Gln Ala Tyr Lys Val Thr Cys Ser Val
35 40 45
Arg Gln Ser Ser Ala Gln Asn Arg Lys Tyr Thr Ile Lys Val Glu Val
50 55 60
Pro Lys Gly Ala Trp Arg Ser Tyr Leu Asn Met Glu Leu Thr Ile Pro
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Ile Phe Ala Thr Asn Ser Asp Cys Glu Leu Ile Val Lys Ala Met Gln
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65 70 75 80
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<211> 1367
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<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的多肽
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Val Ile Leu Ala Asp Ala Asn Leu Asp Lys Val Leu Ser Ala Tyr
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1295 1300 1305
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<210> 61
<211> 4101
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的多核苷酸
<400> 61
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accaggctga agcggactgc gcgccggagg tacaccagga ggaagaatcg gatctgctac 240
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gaggagtcgt tcctcgttga ggaggacaag aagcatgaga ggcatcccat tttcgggaat 360
atcgttgacg aggtggctta ccatgagaag tacccgacca tctaccatct gcggaagaag 420
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attaagttcc ggggccattt cctcatcgag ggcgacctca acccggacaa ctcggacgtg 540
gataagctct tcattcagct cgtgcagaca tacaaccagc tcttcgagga gaatcccatt 600
aacgcctcgg gggtcgacgc taaggctatt ctctcggctc ggctgtcgaa gtcgcgccgg 660
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gctaagctcc agctcagcaa ggatacttac gatgatgacc tcgataacct gctcgcccag 840
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cagctccccg agaagtacaa ggagattttc ttcgatcagt caaagaatgg gtacgcgggc 1080
tacattgatg gcggcgcgtc ccaggaggag ttctacaagt tcattaagcc catcctggag 1140
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<223> 合成的多核苷酸
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<210> 72
<211> 94
<212> PRT
<213> 玉米
<400> 72
Met Ala His Ala Ala Val Val Ala Leu Leu Ala Val Ala Val Ile Leu
1 5 10 15
Ala Cys Leu Pro Pro Pro Ala Ala Ser Ser Tyr Arg Gly Ala Ala Ala
20 25 30
Leu Arg Arg Leu Glu Thr Ala Glu Pro Met Asp Thr Ala Gln Gly Leu
35 40 45
Arg Glu Lys Ala Asp Val Asn Lys Gly Ala Glu Glu Asp Leu Ser Thr
50 55 60
Thr Gly Phe Gly Ala Glu Ser Glu Arg Glu Val Pro Thr Gly Pro Asp
65 70 75 80
Pro Ile His His His Ala Arg Gly Pro Arg Arg Gln Ser Pro
85 90
<210> 73
<211> 132
<212> PRT
<213> 玉米
<400> 73
Met Ser Arg Phe Ser Leu Cys Leu Ala Ala Ala Cys Cys Cys Cys Cys
1 5 10 15
Leu Ala Leu Leu Leu Pro Ala Ala Gln Gly Arg Pro Asp Thr Gly Gly
20 25 30
Asp His Arg Pro Leu Phe Ser Glu Pro His Pro His Ser Asp Ala Val
35 40 45
Glu Lys Lys Ala Thr Pro Ser Trp Ser Pro Arg Pro Pro Thr Ala Gly
50 55 60
Gly Val Val Val Thr Pro Glu Leu Arg Thr Val Pro Glu Gly Ala Asn
65 70 75 80
Pro Leu His His Arg Gly Ser Thr Thr Arg His Arg Gln Glu Arg Ala
85 90 95
Leu Pro Ala Val Ala Ala Gly Ser Val Ser Val Val Val Arg Pro Glu
100 105 110
Leu Arg Thr Ala Pro Cys Gly Ala Asn Pro Leu His Asn His Gly Ser
115 120 125
Thr Pro Ser Pro
130
<210> 74
<211> 136
<212> PRT
<213> 玉米
<400> 74
Met Ala Arg Ile Phe Leu Cys Met Ser Leu Ala Ala Ala Cys Cys Cys
1 5 10 15
Phe Ser Ile Ala Leu Leu Pro Pro Pro Ala Gln Gly Arg Pro Gly Leu
20 25 30
Pro Ala Gly Gly Arg Ile Asn His Leu Pro Glu Pro Thr Thr Glu Val
35 40 45
Pro His Val Pro Phe Ile Val Ser Val Ser Leu Ser Pro Ala Ala Ala
50 55 60
Ala Glu Gln Glu Gln Gln Gln Arg Gly Val Gln Val Arg Lys Thr Arg
65 70 75 80
Pro Ala Trp Ser Pro Ala Ala Ala Ala Glu Gly Ser Val Arg Pro Glu
85 90 95
Met Arg Ala Val Pro Gly Gly Pro Asp Pro Leu His His His Gly Gly
100 105 110
Ser Pro Ser Arg Arg Pro Ala Ala Gly Thr His Pro Val Thr Arg Pro
115 120 125
Ala Gly Gln Pro Ala Trp Leu Gly
130 135
<210> 75
<211> 12
<212> PRT
<213> 玉米
<400> 75
Arg Glu Val Pro Thr Gly Pro Asp Pro Ile His His
1 5 10
<210> 76
<211> 12
<212> PRT
<213> 玉米
<400> 76
Arg Thr Val Pro Glu Gly Ala Asn Pro Leu His His
1 5 10
<210> 77
<211> 12
<212> PRT
<213> 玉米
<400> 77
Arg Ala Val Pro Gly Gly Pro Asp Pro Leu His His
1 5 10
<210> 78
<211> 285
<212> DNA
<213> 玉米
<400> 78
atggctcacg cggccgtcgt cgccttgctc gccgtcgctg tgatcttggc ctgcttgccg 60
ccgcccgccg cctcgtccta ccggggagcg gctgcattgc gacggctcga gacagcggag 120
cccatggaca ccgcgcaggg cttgcgggag aaggcggacg tgaacaaggg cgcggaggag 180
gacctgagca cgacagggtt cggcgccgag tcggagaggg aggtgccgac gggaccggac 240
cccatccacc accacgcccg ggggccaagg cggcagtcgc cttga 285
<210> 79
<211> 399
<212> DNA
<213> 玉米
<400> 79
atgtcccggt tctcgctgtg ccttgcggcg gcgtgctgct gctgctgcct tgcgctgctc 60
ctgccggcgg cgcagggccg tcctgacacc ggcggcgacc atcgtccact gttctccgag 120
ccacacccac actccgatgc cgtagagaag aaggcgacgc cgtcgtggtc accgcgtccg 180
ccgacggcag gtggcgtcgt cgtcacgcct gagctgcgga cggtgcctga aggcgcgaac 240
ccgctgcacc accgcggcag taccaccagg cacaggcagg agcgcgccct accggcggtg 300
gcggcgggga gcgtgagcgt cgtcgtcagg ccggagttgc ggacggcacc ttgtggggcg 360
aacccgttgc acaaccacgg aagcaccccg tccccgtga 399
<210> 80
<211> 411
<212> DNA
<213> 玉米
<400> 80
atggcccgga tcttcctctg catgagcttg gcggcggcgt gctgctgctt ctccattgcg 60
ctgcttccac cgccggcgca gggccgtcct gggctgccag ccggcggccg cataaatcat 120
ctgccagagc caaccacaga ggtaccgcac gttccgttta ttgtttccgt ttctttatcg 180
ccggccgcgg cggcggagca ggagcagcag cagcgcggcg tgcaggtgag gaagacgagg 240
ccggcatggt cgccagcggc ggcggcggag gggagcgtga ggccggagat gcgggcggtg 300
cccggggggc cagacccgct gcaccaccac ggcggcagcc ccagcaggcg gcctgcagca 360
gggacgcacc cggtgacccg gccggccggc cagccggcat ggctaggcta g 411
<210> 81
<211> 36
<212> DNA
<213> 玉米
<400> 81
agggaggtgc cgacgggacc ggaccccatc caccac 36
<210> 82
<211> 36
<212> DNA
<213> 玉米
<400> 82
cggacggtgc ctgaaggcgc gaacccgctg caccac 36
<210> 83
<211> 36
<212> DNA
<213> 玉米
<400> 83
cgggcggtgc ccggggggcc agacccgctg caccac 36
<210> 84
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的肽
<400> 84
Arg Glu Val Pro Thr Thr Pro Asp Pro Ile His His
1 5 10
<210> 85
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的肽
<400> 85
Arg Glu Val Pro Thr Thr Pro Ala Pro Ile His His
1 5 10
<210> 86
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的肽
<400> 86
Arg Glu Val Pro Thr Gly Pro Asp Leu Ile His His
1 5 10
<210> 87
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的肽
<400> 87
Arg Glu Val Pro Thr Thr Pro Ala Pro Ile His His
1 5 10
<210> 88
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的肽
<400> 88
Arg Glu Val Pro Thr Thr Pro Ala Leu Ile His His
1 5 10
<210> 89
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的肽
<400> 89
Arg Glu Val Pro Thr Thr Pro Asp Leu Ile His His
1 5 10
<210> 90
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的肽
<400> 90
Arg Glu Val Pro Thr Thr Pro Ala Leu Ile His His
1 5 10
<210> 91
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的肽
<400> 91
Arg Thr Val Pro Glu Gly Ala Asn Pro Leu His His
1 5 10
<210> 92
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的肽
<400> 92
Arg Thr Val Pro Glu Gly Ala Asn Leu Leu His His
1 5 10
<210> 93
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的肽
<400> 93
Arg Thr Val Pro Glu Gly Ala Asn Leu Leu His His
1 5 10
<210> 94
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的肽
<400> 94
Arg Ala Val Pro Gly Thr Pro Asp Pro Leu His His
1 5 10
<210> 95
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的肽
<400> 95
Arg Ala Val Pro Gly Gly Pro Ala Pro Leu His His
1 5 10
<210> 96
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的肽
<400> 96
Arg Ala Val Pro Gly Gly Pro Asp Leu Leu His His
1 5 10
<210> 97
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的肽
<400> 97
Arg Ala Val Pro Gly Thr Pro Ala Pro Leu His His
1 5 10
<210> 98
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的肽
<400> 98
Arg Ala Val Pro Gly Thr Pro Asp Leu Leu His His
1 5 10
<210> 99
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的肽
<400> 99
Arg Ala Val Pro Gly Gly Pro Ala Leu Leu His His
1 5 10
<210> 100
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的肽
<400> 100
Arg Ala Val Pro Gly Thr Pro Ala Leu Leu His His
1 5 10
<210> 101
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的寡核苷酸
<400> 101
accccatcca ccaccacgcc cgg 23
<210> 102
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的寡核苷酸
<400> 102
gcgaacccgc tgcaccaccg cgg 23
<210> 103
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的寡核苷酸
<400> 103
gacccgctgc accaccacgg cgg 23
<210> 104
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的寡核苷酸
<400> 104
ccagacccgc tgcaccacca cgg 23
<210> 105
<211> 36
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的寡核苷酸
<400> 105
agggaggtgc cgacgggacc ggatcccatc caccac 36
<210> 106
<211> 36
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的寡核苷酸
<400> 106
agggaggtgc cgacgggacc ggacctcatc caccac 36
<210> 107
<211> 36
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的寡核苷酸
<400> 107
agggaggtgc cgacgggacc ggatctcatc caccac 36
<210> 108
<211> 33
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的寡核苷酸
<400> 108
cggacggtgc ctgaagcgaa cctgctgcac cac 33
<210> 109
<211> 36
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的寡核苷酸
<400> 109
cgggcggtgc ccggggggcc agacctgctg caccac 36
<210> 110
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的寡核苷酸
<400> 110
tcacctgcac gccgcgctgc tgc 23
<210> 111
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的寡核苷酸
<400> 111
tgctgcaggc cgcctgctgg ggc 23
<210> 112
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的寡核苷酸
<400> 112
ggcgtgcagg gcgcggagga gga 23
<210> 113
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的寡核苷酸
<400> 113
gttcacgccc gcctgatcaa gac 23
<210> 114
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的寡核苷酸
<400> 114
gtcccgtcgg cacctccctc tcc 23
<210> 115
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的寡核苷酸
<400> 115
cagctcaggc gtgacgacga cgc 23
<210> 116
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的寡核苷酸
<400> 116
tgtgcccttg tgcgcagcta gca 23
<210> 117
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的寡核苷酸
<400> 117
cgccttcagg caccgtccgc agc 23

Claims (79)

1.一种植物或其植物部分，其包含在编码野生型前体CLE多肽的内源性CLAVATA3/EMBRYO SURROUNDING REGION-RELATED(CLV3/ESR-RELATED)(CLE)基因中的至少一个非天然突变。
2.根据权利要求1所述的植物或其部分，其中所述突变位于编码成熟CLE肽的内源CLE基因的部分内，并且所述突变导致所述成熟CLE肽与野生型成熟CLE肽相比具有氨基酸取代。
3.根据权利要求1或2所述的植物或其部分，其中所述CLE基因编码FON2-LIKE CLEPROTEIN1(FCP1)FCP1蛋白、CLE7蛋白或CLE14蛋白。
4.根据前述权利要求中任一项所述的植物或其部分，其中所述至少一个非天然突变产生显性阴性等位基因、半显性等位基因、弱的功能损失等位基因、无效等位基因或亚效突变。
5.根据前述权利要求中任一项所述的植物或其部分，其中所述至少一个非天然突变是碱基取代、碱基缺失、碱基***和/或反转。
6.根据前述权利要求中任一项所述的植物或其部分，其中所述至少一个非天然突变包括对A、T、G或C的碱基取代。
7.根据前述权利要求中任一项所述的植物或其部分，其中所述至少一个非天然突变是至少一个碱基对(例如1、2、3、4或5个碱基对)的取代。
8.根据前述权利要求中任一项所述的植物或其部分，其中所述至少一个非天然突变产生位置3、5、6、8或9处的一个或多个取代的氨基酸残基，所述位置是相对于SEQ ID NO：75、SEQ ID NO：76或SEQ ID NO：77的氨基酸位置编号而言的。
9.根据前述权利要求中任一项所述的植物或其部分，其中所述至少一个非天然突变导致在位置3处缬氨酸(V)取代为异亮氨酸(I)或甲硫氨酸(M)，在位置5处谷氨酸(E)取代为赖氨酸(K)，在位置6处甘氨酸(G)取代为苏氨酸(T)，位置8处天冬氨酸(D)取代为丙氨酸(A)，在位置8处天冬氨酸(D)取代为甘氨酸(G)，和/或在位置9处脯氨酸(P)取代为亮氨酸(L)，所述位置是相对于SEQ ID NO：75、SEQ ID NO：76或SEQ ID NO：77的氨基酸位置编号而言的。
10.根据前述权利要求中任一项所述的植物或其部分，其中所述内源CLE基因包含与SEQ ID NO：78、SEQ ID NO：79或SEQ IDNO：80的核苷酸序列中的任一个具有至少90％序列同一性的序列，包含与SEQ ID NO：81、SEQ ID NO：82或SEQ ID NO：82的核苷酸序列中的任一个具有至少90％序列同一性的区域；编码与SEQ IDNO：72、SEQ ID NO：73或SEQ ID NO：74具有至少95％序列同一性的序列，或编码具有与SEQ ID NO：75、SEQ ID NO：76或SEQ IDNO：77具有至少95％序列同一性的序列的结构域。
11.根据权利要求2-9中任一项所述的植物或其部分，其中所述野生型成熟肽包含具有12个氨基酸的长度、以及在位置1处的R、在位置3处的V、在位置4处的P、在位置6处的G、在位置9处的P、在位置11处的H和在位置12处的H的氨基酸序列，任选地其中所述野生型加工的肽包含SEQ ID NO：75、SEQ ID NO：76或SEQ ID NO：77的氨基酸序列中的任一个。
12.根据前述权利要求中任一项所述的植物或其部分，其中包含至少一个非天然突变的CLE基因包含SEQ ID NO：105-109中任一个的序列。
13.根据前述权利要求中任一项所述的植物或其部分，其中包含至少一个非天然突变的成熟CLE肽包含SEQ ID NO：84-100的氨基酸序列中的任一个。
14.根据前述权利要求中任一项所述的植物或其部分，其中所述植物是玉米。
15.根据前述权利要求中任一项所述的玉米植物或其部分，其中在内源CLE基因中包含所述至少一个非天然突变的玉米植物的穗行数增加，任选地没有实质性减少穗的长度。
16.一种植物细胞，其中包含编辑***，所述编辑***包含：
(a)CRISPR-Cas效应子蛋白；和
(b)指导核酸，其具有与编码前体CLE多肽的内源靶基因的区域具有互补性的间隔子序列。
17.根据权利要求16所述的植物细胞，其中所述内源靶基因包含与SEQ ID NO：78、SEQID NO：79或SEQ ID NO：80的核苷酸序列具有至少90％序列同一性的序列。
18.根据权利要求16或17所述的植物细胞，其中所述内源靶基因编码前体CLE多肽，所述前体CLE多肽包含与SEQ ID NO：72、SEQ ID NO：73或SEQ ID NO：74的氨基酸序列具有至少95％序列同一性的序列。
19.根据权利要求16-18中任一项所述的植物细胞，其中所述指导核酸包含间隔子序列，所述间隔子序列包含SEQ ID NO：101-104和/或SEQ ID NO：110-117的核苷酸序列中的任一个。
20.根据权利要求16-19中任一项所述的植物细胞，其中所述植物细胞为玉米细胞。
21.由权利要求1-15中任一项所述的植物部分或权利要求16-20中任一项所述的植物细胞再生的植物。
22.根据权利要求21所述的植物，其中所述植物是玉米植物并且包含增加的穗行数的表型，任选地没有实质性减少穗的长度。
23.一种玉米植物细胞，其在编码前体CLE多肽的CLE基因内包含至少一个非天然突变，其中所述突变是使用编辑***引入的取代、***或缺失，所述编辑***包含与CLE基因中的靶位点结合的核酸结合结构域。
24.根据权利要求23所述的玉米植物细胞，其中所述CLE基因编码FCP1蛋白、CLE7蛋白或CLE14蛋白。
25.根据权利要求23或权利要求24所述的玉米植物细胞，其中所述至少一个非天然突变是显性阴性等位基因(dominant negative allele)、半显性等位基因、弱的功能损失等位基因或亚效等位基因。
26.根据权利要求23-25中任一项所述的玉米植物细胞，其中所述靶位点在CLE基因的区域内，所述区域包含与SEQ ID NO：81-83的核苷酸序列中的任何一个具有至少90％序列同一性的序列。
27.根据权利要求23-26中任一项所述的玉米植物细胞，其中所述靶位点编码与SEQ IDNO：75-77的任何一个氨基酸序列具有至少95％序列同一性的序列。
28.根据权利要求23-27中任一项所述的玉米植物细胞，其中所述突变是在由编辑***切割之后生成的，所述编辑***包含核酸酶和核酸结合结构域，所述核酸结合结构域结合与SEQ ID NO：81-83中的任何一个核苷酸序列具有至少90％序列同一性的序列内的靶位点。
29.根据权利要求28所述的玉米植物细胞，其中所述核酸酶是锌指核酸酶、转录激活因子样效应物核酸酶(TALEN)、内切核酸酶(例如Fok1)或CRISPR-Cas效应子蛋白。
30.根据权利要求23-29中任一项所述的玉米植物细胞，其中所述核酸结合结构域是锌指、转录激活因子样DNA结合结构域(TAL)、argonaute或CRISPR-Cas效应子DNA结合结构域。
31.根据权利要求23-30中任一项所述的玉米植物细胞，其中CLE基因内的所述至少一个非天然突变是点突变。
32.根据权利要求23-31中任一项所述的玉米植物细胞，其中所述至少一个非天然突变导致位于位置3、5、6、8或9处的一个或多个取代的氨基酸残基，所述位置是参考SEQ ID NO：75、SEQ ID NO：76或SEQ ID NO：77的氨基酸位置编号而言的。
33.由根据权利要求23-32中任一项所述的玉米植物细胞再生的玉米植物，其中所述植物包含所述至少一个非天然突变，并且所述突变产生显性阴性等位基因。
34.根据权利要求33所述的玉米植物，其中当与不包含所述等位基因的野生型植物(例如等基因的野生型植物)相比时，所述玉米植物表现出增加的穗行数的表型，任选地没有实质性减少穗的长度。
35.一种产生/培育无转基因的编辑过的玉米植物的方法，其包括：
用无转基因的玉米植物与权利要求1-15、21、22、33或34中任一项所述的玉米植物杂交，从而将所述至少一个非天然突变引入所述无转基因的玉米植物中；和
选择包含所述至少一个非天然突变并且无转基因的后代玉米植物，从而产生无转基因的编辑过的玉米植物。
36.一种提供具有增加的穗行数的多个玉米植物的方法，所述方法包括在生长区域中种植权利要求1-15、21、22或33-35中任一项所述的两个或更多个植物，从而提供与不包含所述突变的多个对照玉米植物相比具有增加的穗行数的多个玉米植物。
37.一种在成熟玉米CLE肽中产生变异的方法，所述方法包括：
将编辑***引入玉米植物细胞中，其中所述编辑***靶向编码成熟玉米CLE肽蛋白的玉米CLE基因的区域，其中所述区域包含与SEQ ID NO：75、SEQ ID NO：76或SEQ ID NO：77的氨基酸序列中的任一个具有至少95％序列同一性的序列，或者所述区域由与SEQ ID NO：81-83的任一个核苷酸序列具有至少90％序列同一性的序列编码；以及
使所述玉米CLE基因的区域与所述编辑***接触，从而在玉米植物细胞的成熟玉米CLE肽中引入突变；并在成熟玉米CLE肽中产生变异。
38.根据权利要求37所述的方法，其中所述突变是在由所述编辑***切割之后引入的，所述编辑***包含核酸酶和核酸结合结构域，所述核酸结合结构域结合到与SEQ ID NO：81-83中的任一个核苷酸序列具有至少90％序列同一性的序列内的靶位点。
39.一种用于编辑玉米植物细胞的基因组中的特异性位点的方法，所述方法包括：以位点特异性方式切割所述玉米植物细胞中的内源CLE基因内的靶位点，所述内源CLE基因：
(a)包含(i)与SEQ ID NO：78-80中的任一个核苷酸序列具有至少90％序列同一性的序列，和/或(ii)与SEQ ID NO：81-83中的任一个核苷酸序列具有至少90％序列同一性的区域；和/或
(b)编码(i)与SEQ ID NO：72-74中的任一个氨基酸序列具有至少95％序列同一性的序列；和/或(ii)具有与SEQ ID NO：75-77中的任一个氨基酸序列具有至少95％序列同一性的序列的结构域，从而在编码成熟CLE肽的玉米植物细胞的内源基因的部分中产生编辑并产生在所述内源基因的部分中包含所述编辑的植物细胞。
40.根据权利要求38至39中任一项所述的方法，还包括从在所述内源CLE基因中包含所述编辑或突变的玉米植物细胞再生玉米植物，以产生在其内源CLE基因中包含所述编辑或突变的玉米植物。
41.根据权利要求37-40中任一项所述的方法，其中所述CLE基因编码FCP1蛋白、CLE7蛋白或CLE14蛋白。
42.根据权利要求39-41中任一项所述的方法，其中所述编辑导致非天然突变。
43.根据权利要求42所述的方法，其中所述非天然突变导致位于位置3、5、6、8或9处的一个或多个取代的氨基酸残基，所述位置是参考SEQ ID NO：75、SEQ ID NO：76或SEQ IDNO：77的氨基酸位置编号而言的。
44.一种用于制造玉米植物的方法，其包括：
(a)使包含编码前体CLE多肽的内源CLE基因的玉米植物细胞群与连接到核酸结合结构域的核酸酶(例如编辑***)接触，所述核酸结合结构域结合以下序列：(i)与SEQ ID NO：78-80中的任何一个核苷酸序列具有至少90％序列同一性，(ii)与SEQ ID NO：81-83中的任何一个核苷酸序列具有至少90％序列同一性，(iii)编码与SEQ ID NO：72-74中的任何一个氨基酸序列具有至少95％序列同一性的序列，或(ii)编码与SEQ ID NO：75-77中的任何一个氨基酸序列具有至少95％序列同一性的序列的结构域；
(b)从所述群体中选择其中内源CLE基因已经被突变的植物细胞，从而产生在内源CLE基因中包含突变的植物细胞；和
(c)将所选择的植物细胞生长成植物。
45.一种用于增加玉米植物中的穗行数的方法，其中包括：
(a)使包含内源CLE基因的玉米植物细胞与靶向所述内源CLE基因的核酸酶接触，其中所述核酸酶与核酸结合结构域(例如，编辑***)连接，所述核酸结合结构域结合所述内源CLE基因中的靶位点，其中所述内源CLE基因：
(i)包含与SEQ ID NO：78-80中的任一个核苷酸序列具有至少90％序列同一性的序列；
(ii)包括与SEQ ID NO：81-83中的任一个核苷酸序列具有至少90％序列同一性的区域；
(iii)编码与SEQ ID NO：72-74中的任一个氨基酸序列具有至少95％序列同一性的序列；和/或
(iv)编码具有与SEQ ID NO：75-77中的任一个氨基酸序列有至少95％序列同一性的序列的结构域，以产生在内源CLE基因中包含突变的玉米植物细胞；和
(b)将所述玉米植物细胞生长成在所述内源CLE基因中包含所述突变的玉米植物，由此生产具有突变的内源性CLE基因和增加的穗行数的玉米植物。
46.生产包含具有突变的内源CLE基因的至少一个细胞的玉米植物或其部分的方法，所述方法包括：
使所述玉米植物或植物部分中的内源CLE基因中的靶位点与包含切割结构域和核酸结合结构域的核酸酶接触，其中所述核酸结合结构域结合所述内源CLE基因中的靶位点，
其中所述内源CLE基因：
(a)包含与SEQ ID NO：78-80的核苷酸序列中的任一个具有至少90％序列同一性的序列；
(b)包含与SEQ ID NO：81-83的核苷酸序列中的任一个具有至少90％序列同一性的区域；
(c)编码与SEQ ID NO：72-74的氨基酸序列中的任一个具有至少95％序列同一性的序列；和/或
(d)编码具有与SEQ ID NO：75-77的任何一个氨基酸序列有至少95％序列同一性的序列的结构域，
从而产生包含在所述内源CLE基因中具有突变的至少一个细胞的所述玉米植物或其部分。
47.生产包含突变的内源CLE基因并显示增加的穗行数的玉米植物或其部分的方法，该方法包括：
使所述玉米植物或植物部分中的内源CLE基因中的靶位点与包含切割结构域和核酸结合结构域的核酸酶接触，其中所述核酸结合结构域结合所述内源CLE基因中的靶位点，
其中所述内源CLE基因：
(a)包含与SEQ ID NO：78-80的核苷酸序列中的任一个具有至少90％序列同一性的序列；
(b)包括与SEQ ID NO：81-83的核苷酸序列中的任一个具有至少90％序列同一性的区域；
(c)编码与SEQ ID NO：72-74的氨基酸序列中的任一个具有至少95％序列同一性的序列；和/或
(d)编码具有与SEQ ID NO：75-77的氨基酸序列中的任一个有至少95％序列同一性的序列的结构域，
从而产生包含具有突变的内源CLE基因并且表现出增加的穗行数的玉米植物或其部分。
48.根据权利要求44-47中任一项所述的方法，其中所述核酸酶切割所述内源CLE基因，从而将所述突变引入所述内源CLE基因。
49.根据权利要求44-48中任一项所述的方法，其中所述CLE基因编码FCP1蛋白、CLE7蛋白或CLE14蛋白。
50.根据权利要求44-49中任一项所述的方法，其中所述突变是显性阴性突变、半显性突变、弱的功能损失突变、亚效突变或无效突变。
51.根据权利要求44-50中任一项所述的方法，其中所述突变是碱基取代、碱基缺失和/或碱基***。
52.根据权利要求44-51中任一项所述的方法，其中所述突变包括点突变。
53.根据权利要求43-52中任一项所述的方法，其中所述突变产生位于位置3、5、6、8或9处的一个或多个取代的氨基酸残基，所述位置是相对于SEQ ID NO：75、SEQ ID NO：76或SEQID NO：77的氨基酸位置编号而言的。
54.根据权利要求44-53中任一项所述的方法，其中所述核酸酶是锌指核酸酶、转录激活因子样效应物核酸酶(TALEN)、核酸内切酶(例如Fok1)或CRISPR-Cas效应子蛋白。
55.根据权利要求44-54中任一项所述的方法，其中所述核酸结合结构域是锌指、转录激活因子样DNA结合结构域(TAL)、argonaute或CRISPR-Cas效应物DNA结合结构域。
56.一种与编码前体CLE肽的CLE基因中的靶位点的部分结合的指导核酸，所述靶位点包含与SEQ ID NO：81-83的任何一个核苷酸序列具有至少90％序列同一性的序列或编码与SEQ ID NO：75-77的任何一个氨基酸序列具有至少95％序列同一性的序列。
57.根据权利要求56的指导核酸，其中所述指导核酸包含含有SEQ ID NO：101-104和/或SEQ ID NO：110-117的任一核苷酸序列的间隔子。
58.一种***，其包含权利要求56或权利要求57的指导核酸和与所述指导核酸缔合的CRISPR-Cas效应子蛋白。
59.根据权利要求58所述的***，其还包含与所述指导核酸缔合的tracr核酸和CRISPR-Cas效应子蛋白，任选地其中所述tracr核酸和所述指导核酸共价连接。
60.一种基因编辑***，其包含与指导核酸缔合的CRISPR-Cas效应子蛋白，其中所述指导核酸包含与编码前体CLE肽的内源CLE基因结合的间隔子序列。
61.根据权利要求60所述的基因编辑***，其中所述CLE基因编码FCP1蛋白、CLE7蛋白或CLE14蛋白。
62.根据权利要求60或61所述的基因编辑***，其中所述CLE基因：
(a)包含与SEQ ID NO：78-80的核苷酸序列中的任一个具有至少90％序列同一性的序列；
(b)包括与SEQ ID NO：81-83的核苷酸序列中的任一个具有至少95％序列同一性的区域；
(c)编码与SEQ ID NO：72-74的氨基酸序列中的任一个具有至少95％序列同一性的序列；和/或
(d)编码具有与SEQ ID NO：75-77的氨基酸序列中的任一个有至少95％序列同一性的序列的结构域。
63.根据权利要求60-62中任一项所述的基因编辑***，其中所述指导核酸包含具有SEQ ID NO：101-104和/或SEQ ID NO：110-117中任一所示的核苷酸序列的间隔子序列。
64.根据权利要求60-63中任一项所述的基因编辑***，其还包含与所述指导核酸和CRISPR-Cas效应子蛋白缔合的tracr核酸，任选地其中所述tracr核酸和所述指导核酸共价连接。
65.一种复合物，其包含含有切割结构域的CRISPR-Cas效应子蛋白和指导核酸，其中所述指导核酸结合编码前体CLE多肽的内源CLE基因中的靶位点，其中所述内源CLE基因:
(a)包含与SEQ ID NO：78-80的核苷酸序列中的任一个具有至少90％序列同一性的序列；
(b)包括与SEQ ID NO：81-83的核苷酸序列中的任一个具有至少95％序列同一性的区域；
(c)编码与SEQ ID NO：72-74的氨基酸序列中的任一个具有至少95％序列同一性的序列；和/或
(d)编码具有与SEQ ID NO：75-77的任何一个氨基酸序列有至少95％序列同一性的序列的结构域，
其中所示切割结构域切割CLE基因中的靶链。
66.一种表达盒，其包含(a)编码包含切割结构域的CRISPR-Cas效应子蛋白的多核苷酸，和(b)与编码前体CLE肽的内源CLE基因中的靶位点结合的指导核酸，其中所述指导核酸包含与以下序列互补并与之结合的间隔子序列：
(i)包含与SEQ ID NO：78-80的核苷酸序列中的任一个具有至少90％序列同一性的序列；
(ii)包括与SEQ ID NO：75-77的核苷酸序列中的任一个具有至少95％序列同一性的区域；
(iii)编码与SEQ ID NO：72-74的氨基酸序列中的任一个具有至少95％序列同一性的序列；和/或
(iv)编码具有与SEQ ID NO：75-77的氨基酸序列中的任一个有至少95％序列同一性的序列的结构域。
67.编码玉米CLE基因的显性阴性等位基因的核酸，其中所述玉米CLE基因编码前体CLE多肽。
68.根据权利要求67所述的核酸，其中所述核酸包含SEQ ID NO：105-109中任一个的核苷酸序列。
69.根据权利要求67所述的核酸，其中所述核酸包含编码SEQ ID NO：84-100的任一个氨基酸序列的序列。
70.包含权利要求67-69中任一项所述的核酸的玉米植物或其部分。
71.一种在植物中的内源CLE基因中产生突变的方法，其包含：
(a)将基因编辑***靶向CLE基因的部分，所述部分编码具有与SEQ ID NO：75-71的任何一个氨基酸序列有至少95％序列同一性的序列的结构域，和
(b)选择在位置3、5、6、8或9之一处包含氨基酸残基取代的植物，其中所述位置是参考SEQ ID NO：75、SEQ ID NO：76或SEQ ID NO：77的氨基酸位置编号而言的。
72.一种玉米植物或其植物部分，其包含位于至少一个内源CLE基因中的至少一个非天然突变，其中所述内源CLE基因位于染色体2上由碱基对(bp)位置235,093,752至碱基对位置235,094,276限定并包括它们的染色体间隔和/或染色体2上由碱基对(bp)位置40,126,538至碱基对位置40,127,030限定并包括它们的染色体间隔中。
73.一种玉米植物或其植物部分，其包含在至少一个内源CLE基因中的至少一个非天然突变，其中所述内源CLE基因位于染色体4上由碱基对(bp)位置7,570,324至碱基对位置7,571,104限定并包括它们的染色体间隔中。
74.根据权利要求72所述的玉米植物或其部分，其中所述染色体间隔对应于B73第4版(B73 RefGen_v4)的参考玉米基因组。
75.根据权利要求73所述的玉米植物或其部分，其中所述染色体间隔对应于B73第3版(B73 RefGen_v3)的参考玉米基因组。
76.一种与玉米植物中的CLE基因中的靶核酸结合的指导核酸，其中所述靶核酸位于染色体2上由碱基对(bp)位置235,093,752至碱基对位置235,094,276限定并包括它们的染色体间隔和/或染色体2上由碱基对(bp)位置40,126,538至碱基对位置40,127,030限定并包括它们的染色体间隔中。
77.一种与玉米植物中的CLE基因中的靶核酸结合的指导核酸，其中所述靶核酸位于位于染色体2上由碱基对(bp)位置235,093,752至碱基对位置235,094,276限定并包括它们的染色体间隔内。
78.根据权利要求75所述的指导核酸，其中所述染色体间隔对应于B73第4版(B73RefGen_v4)的参考玉米基因组。
79.根据权利要求76所述的指导核酸，其中所述染色体间隔对应于B73第3版(B73RefGen_v3)的参考玉米基因组。
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