CN102892786A

CN102892786A - Pd-1抗体

Info

Publication number: CN102892786A
Application number: CN2011800196295A
Authority: CN
Inventors: K·L·泰森
Original assignee: UCB Pharma SA
Current assignee: UCB Pharma SA
Priority date: 2010-03-11
Filing date: 2011-03-09
Publication date: 2013-01-23
Anticipated expiration: 2031-03-09
Also published as: US20130095098A1; WO2011110604A1; US8993731B2; JP5920929B2; CA2791930A1; CN102892786B; JP2013521768A; EP2545078A1

Abstract

结合人PD-1的包含重链的人源化激动性抗体，其中重链的可变结构域包含SEQ ID NO:1中给出的CDR-H1的序列、SEQ ID NO:2中给出的CDR-H2的序列和SEQ ID NO:3中给出的CDR-H3的序列，并且重链构架区来源于人亚组序列VH4 3-1 4-30.4+JH4(SEQ ID NO:33)。本发明还扩展至抗体分子的治疗性用途、组合物和用于产生所述抗体分子的方法。

Description

PD-1抗体

本发明涉及对人PD-1的抗原决定簇具有特异性的抗体分子和包含所述抗体分子的组合物。本发明还涉及抗体分子、组合物的治疗性用途和用于产生所述抗体分子的方法。

程序化死亡1(PD-1)，也称为CD279；基因名称PDCD1；登录号NP_005009为在调节免疫***的刺激性与抑制性信号之间的平衡和维持外周耐受性中具有至关重要的作用的细胞表面受体(Ishida,Y等人1992EMBO J 113887；Kier,Mary E等人2008Annu Rev Immunol 26677-704；Okazaki,Taku等人2007Int erna tional Immunology 19813-824)。其为与CD28具有同源性的免疫球蛋白超家族的抑制性成员。PD-1的结构为单体1型跨膜蛋白，其由一个免疫球蛋白可变区样细胞外结构域以及含有免疫受体酪氨酸抑制基序(ITIM)和免疫受体酪氨酸转换基序(ITSM)的细胞质结构域组成。PD-1的表达在T细胞、B细胞、天然杀伤(NK)细胞和单核细胞上是可诱导的，例如在通过T细胞受体(TCR)或B细胞受体(BCR)信号转导活化淋巴细胞后(Ki er,MaryE等人2008Annu Rev Immunol 26677-704；Agata,Y等人1996IntImmunol 8765-72)。PD-1具有两个已知的配体，PD-L1(B7-H1,CD274)和PD-L2(B7-DC,CD273)，它们为B7家族的细胞表面表达的成员(Freeman,Gordon等人2000J Exp Med 1921027；Latchman,Y等人2001Nat Immunol 2261)。当衔接配体时，PD-1将磷酸酶例如SHP-1和SHP-2招募至其细胞内酪氨酸基序，所述基序随后使被TCR或BCR信号转导激活的效应分子脱去磷酸(Chemnitz,J等人2004J Immunol173945-954；Riley,James L 2009Immunological Reviews 229114-125)。由此，仅当其同时与TCR或BCR衔接时，PD-1才可将抑制性信号转导入T细胞和B细胞。

已证明PD-1通过细胞内在(cell-intrinsic)和细胞外在(cell-extrinsic)功能机制下调效应T细胞应答。经由PD-1的抑制性信号转导诱导T细胞的无反应或无应答性状态，从而导致细胞不能克隆性扩增或产生最佳水平的效应细胞因子。PD-1还可通过其抑制来自共刺激的存活信号的能力(这导致关键抗细胞凋亡分子例如Bcl-_XL的减少的表达)来诱导T细胞的细胞凋亡(Kier,Ma ry E等人2008AnnuRev Immunol 26677-704)。除了这些直接作用外，最近的公开案已显示，PD-1通过促进调节性T细胞(T_REG)的诱导和维持来参与效应细胞的抑制。例如，已显示在树突细胞上表达的PD-L1与TGF-β协同作用来促进具有增强的抑制功能的CD4⁺FoxP 3⁺T_REG的诱导(Francisco,LoiseM等人2009J Exp Med 2063015-3029)。

PD-1在外周耐受性和炎性疾病中的重要性的第一指标来自观察结果：PD-1敲除(Pdcd1^-/-)小鼠产生自发的自身免疫性。50%的C57BL/6背景的Pdcd1^-/-小鼠到14月龄时产生狼疮样肾小球肾炎和关节炎并且BALB/c-Pdcd1^-/-小鼠从第5周开始产生致命性扩张型心肌病和产生抗心肌肌钙蛋白I的自身抗体(Nishimura,H等人1999Immunity 11141-151；Nishimura,H等人2001Science 291319-322)。此外，将PD-1缺陷引入非肥胖糖尿病(NOD)小鼠品系显著地加速了糖尿病的发作和发病率，导致所有NOD-Pdcd11^-/-小鼠在10周龄时发生糖尿病(Wang,J等人2005Proc Natl Acad Sci USA 10211823)。此外，通过使用自身免疫的诱导型鼠模型例如实验性自身免疫性脑脊髓炎(EAE)或移植/移植物抗宿主(GVHD)模型，几个研究小组已显示阻断PD-1-PD-L相互作用可恶化疾病，这进一步确认了PD-1在炎性疾病中的至关重要的作用。重要地，有证据表明，PD-1在人中与在小鼠中具有相当的免疫调节功能，因为人PDCD1的多态性与许多自身免疫疾病包括全身性红斑狼疮(SLE)、多发性硬化(MS)、I型糖尿病(TID)、类风湿性关节炎(RA)和格雷斯夫病相关(Okazaki,Taku等人2007Internat ional Immunology 19813-824；Prokunina,L等人2002NatGenet 32666-669；Kroner,A等人2005Ann Neurol 5850-57；Prokunina,L等人2004Arthritis Rheum 501770)。

通过使用自身免疫的鼠模型，已报导了几个增强PD-1信号转导和调节炎性疾病的治疗方法。一个这样的方法是产生过表达PD-L1的人工树突细胞。在通过免疫接种MOG肽诱导EAE之前或之后，用载有抗原的PD-L1-树突细胞注射小鼠减轻了脊髓的炎症以及疾病的临床严重度(Hirata,S等人2005J Immunol 1741888-1897)。另一个方法是，尝试通过使用表达小鼠PD-L1的重组腺病毒递送PD-1信号来治愈BXSB小鼠的狼疮样综合征。该病毒的注射部分阻止了肾炎的发展，如通过更低频率的蛋白尿、减少的血清抗-dsDNA Ig以及更好的肾脏病理所显示的(Ding,H等人2006Clin Immunol 118258)。这些结果表明，增强PD-1信号可在人自身免疫疾病中具有治疗益处。更适合用作人药物治疗的可选择的治疗方法可以为使用抗人PD-1的激动性单克隆抗体。此类抗体可通过结合PD-1的配体结合位点并由此以与内源性PD-1配体的衔接相同的方式诱导抑制信号转导级联，而作为‘配体模拟物’起作用。预期激动性抗-PD-1mAb调节参与炎性疾病的许多免疫细胞类型，包括T细胞、B细胞、NK细胞和单核细胞，从而在治疗多种人自身免疫或炎性障碍中具有效用。

已描述了许多拮抗性抗-PD-1抗体，并且一些激动性抗体可参见例如，WO2004/056875。

本领域仍然需要适用于治疗患者的改进的激动性抗-PD-1抗体。

我们现已鉴定了适用于治疗或预防免疫障碍(例如通过减弱T细胞应答)的高亲和力激动性抗-PD-1抗体。可通过给受试者施用PD-1特异性抗体来治疗的免疫障碍的非限定性实例包括但不限于,类风湿性关节炎、多发性硬化、炎性肠病、克罗恩病、全身性红斑狼疮、I型糖尿病、移植排斥、移植物抗宿主病、过度增生性免疫障碍、癌症和感染性疾病。

附图概述

图1-3显示与根据本公开内容的抗体948相关的氨基酸序列。

图3-11显示与根据本公开内容的抗体相关的某些氨基酸或DNA序列。

图12显示948嵌合和人源化移植物(graft)对细胞表达的人PD-1的结合的比较。

图13显示鼠的轻链和重链、接纳体构架和人源化轻链和重链的比对。

人源化抗体所源自的亲代鼠抗体杂交瘤在本文中称为克隆10。来源于克隆10的克隆的重组抗体在本文中称为抗体CA051_00948，在本文中也称为948。

抗体可变结构域中的残基可按照由Kabat等人设计的***方便地进行编号。该***示于Kabat等人,1987,Sequences of Proteins ofImmunological Interes t,US Department of Health and HumanServices,NIH,USA(此后简写为“Kaba t等人(同上)”)中。除非另外指明，本说明书中使用该编号***。

Kaba t残基命名并非总是直接相应于氨基酸残基的线性编号。实际的线性氨基酸序列可包含比严格Kaba t编号更少或更多的氨基酸，对应于基本可变结构域结构的结构组件(无论是构架还是互补决定区(CDR))的缩短或至所述结构组件中的***。可通过将抗体序列中同源的残基与“标准”Kaba t编号的序列比对来确定给定的抗体的残基的正确Kaba t编号。

按照Kabat编号***，重链可变结构域的CDR位于残基31-35(CDR-H1)、残基50-65(CDR-H2)和残基95-102(CDR-H 3)上。然而，根据Chothia(Chothia,C.and Lesk,A.M.J.Mol.Biol.,196,901-917(1987))，等同于CDR-H1的环从残基26延伸至残基32。因此，除非另外指明，否则本文中使用的‘CDR-H1’意欲指残基26至35，如通过Kabat编号***与Chothia’s拓扑环定义的组合所描述的。

根据Kabat编号***，轻链可变结构域的CDR位于残基24-34(CDR-L1)、残基50-56(CDR-L2)和残基89-97(CDR-L3)。

如本文中使用的，术语“激动性抗体”描述了能够刺激PD-1的生物学信号转导活性，导致磷酸酶至其细胞内结构域的招募，从而使T或B细胞受体信号转导以及与激活相关的表型特征失活的抗体。

可使用本领域已知的任何适当方法获得本发明中使用的抗体。PD-1多肽/蛋白质(包括融合蛋白，例如PD-1-Fc融合蛋白)或(重组或天然地)表达所述多肽的细胞(例如活化的T细胞)可用于产生特异性识别PD-1的抗体。PD-1多肽可以是‘成熟’多肽或其生物学活性片段或衍生物。适当地，PD-1多肽为成熟人多肽或其细胞外结构域或片段。细胞外结构域通常包含PD-1蛋白的氨基酸21-170(SWISS PROT登录号Q15116)。PD-1多肽可通过本领域公知的方法从遗传工程宿主细胞(其包含表达***)制备，或它们可从天然生物学来源回收而来。在本申请中，术语“多肽”包括肽、多肽和蛋白质。除非另外明确指出，否则这些术语可互换使用。PD-1多肽在一些情况下可以为更大的蛋白质例如融合蛋白(例如与亲和标签融合的融合蛋白)的一部分。可通过使用公知和常规的方案，给动物，优选非人动物施用多肽来获得针对PD-1多肽产生的抗体，其中动物的免疫接种是必需的，参见例如Handbook of Experimental Immunology,D.M.Weir(ed.),第4卷,Blackwell Scientific Publishers,Oxford,England,1986)。可以免疫许多温血动物例如兔子、小鼠、大鼠、绵羊、牛、骆驼或猪。然而，小鼠、兔子、猪和大鼠通常是最适合的。

可利用本领域已知的任何方法例如杂交瘤技术(Kohler&Milstein,1975,Nature,256:495-497)、三源杂交瘤技术、人B细胞杂交瘤技术(Kozbor等人,1983,Immunology Today,4:72)和EBV-杂交瘤技术(Cole等人,Monoclonal Ant ibodies and Cancer Therapy,pp77-96,Alan R Liss,Inc.,1985)来制备单克隆抗体。

还可使用单淋巴细胞抗体法，通过克隆和表达免疫球蛋白可变区cDNA来产生本发明中使用的抗体，所述cDNA通过例如由Babcook,J.等人,1996,Proc.Na t l.Acad.Sci.USA 93(15):7843-7848l；WO92/02551；WO2004/051268和国际专利申请号WO2004/106377描述的方法从就特异性抗体的产生而选择的单个淋巴细胞产生。

可使用测量对人PD-1的结合的测定和/或测量激发PD1活性的能力的测定进行抗体的筛选。结合测定的实例为ELISA，特别是这样的ELISA，其使用人PD-1与人Fc的融合蛋白，所述融合蛋白被固定在板上，并使用缀合的二抗检测结合融合蛋白的抗-PD-1抗体。

人源化抗体(其包括CDR-移植抗体)为具有来自非人物种的一个或多个互补决定区(CDR)和来自人免疫球蛋白分子的构架区的抗体分子(参见，例如，US 5,585,089；WO91/09967)。应理解，可能仅需转移CDR的特异性决定残基而非整个CDR(参见例如，Kashmiri等人,2005,Methods,36,25-34)。人源化抗体可任选地还包括来源于CDR所源自的非人物种的一个或多个构架残基。

本发明提供了具有对于人PD-1的特异性的激动性人源化抗体。

激动性鼠抗-PD-1抗体(克隆10)描述于PCT/I B2009/06946(未公布)中并且该抗体的可变区和CDR的序列提供于图1和2中。特别地，该抗体的CDR提供于图1,SEQ ID NO 1-6中。

如本文中使用的，术语‘人源化抗体分子’是指这样的抗体分子，其中重链和/或轻链包含移植入接纳体抗体(例如人抗体)的重链和/或轻链可变区构架的来自供体抗体(例如鼠单克隆抗体)的一个或多个CDR(必要时包括一个或多个经修饰的CDR)。关于综述，参见Vaughan等人,Nature Biotechnology,16,535-539,1998。在一个实施方案中，并非转移完整的CDR，而是仅将上文描述的任一CDR的一个或多个特异性决定残基转移至人抗体构架(参见例如，Kashmiri等人,2005,Me thod s,36,25-34)。在一个实施方案中，仅将上文描述的一个或多个CDR的特异性决定残基转移至人抗体构架。在另一个实施方案中，仅将上文描述的每一个CDR的特异性决定残基转移至人抗体构架。

当移植CDR或特异性确定残基时，考虑到CDR所源自的供体抗体的种类/类型，可使用任何适当的接纳体可变区构架序列，包括小鼠、灵长类动物和人构架区。适当地，根据本发明的人源化抗体具有可变结构域，其包含人接纳体构架区以及一个或多个图1(SEQ ID NO 1-6)中提供的CDR。因此，在一个实施方案中提供了结合人PD-1的激动性人源化抗体，其中可变结构域包含人接纳体构架区和非人供体CDR。

可用于本发明的人构架的实例为KOL、NEWM、REI、EU、TUR、TEI、LAY和POM(Kaba t等人，同上)。例如，KOL和NEWM可用于重链，REI可用于轻链，和EU，LAY和POM可用于重链和轻链。或者，可使用人种系序列；此类序列可在http://vbase.mrc-cpe.cam.ac.uk/上获得。

在本发明的人源化抗体中，接纳体重链和轻链不必一定来源于相同抗体，并且必要时，可包含具有来源于不同链的构架区的复合链(composite chain)。

本发明的人源化抗体的重链的一个这样的适当的构架区来源于与JH4一起的人亚组VH4序列3-14-30.4(SEQ ID NO:33)。因此，在一个实例中，提供了包含SEQ ID NO:1中给出的CDR-H1的序列、SEQIDNO:2中给出的CDR-H2的序列和SEQ ID NO:3中给出的CDRH3的序列的激动性人源化抗体，其中重链构架区来源于与JH4一起的人亚组VH4序列3-14-30.4。人JH4的序列如下：(YFDY)WGQGTLVTVS(Seq ID No:35)。YFDY基序为CDR-H 3的一部分，而不是构架4的一部分(Ravetch,JV.等人,1981,Cell，27,583-591)。

本发明的人源化抗体的轻链的适当的构架区来源于与JK2一起的人种系亚组VK2序列4-1-1A18(SEQ ID NO:31)。因此，在一个实例中，提供了包含SEQ ID NO:4中给出的CDR-L1的序列、SEQ ID NO:5中给出的CDR-L2的序列和SEQ ID NO:6中给出的CDRL3的序列的激动性人源化抗体，其中轻链构架区来源于与JK2一起的人亚组序列VK24-1-1A18。JK2序列如下：(YT)FGQGTKLEIK(Seq ID No:36)。YT基序为CDR-L3的一部分，而不是构架4的一部分(Hieter,PA.,等人,1982,J.Biol.Chem.,257,1516-1522)。

同样地，在本发明的人源化抗体中，构架区不必具有与接纳体抗体的构架区完全相同的序列。例如，可将罕见残基改变成对于该接纳体链种类或类型而言更常存在的残基。或者，可改变接纳体构架区中的选择的残基以便它们相应于供体抗体中相同位置上发现的残基(参见Reichmann等人,1998,Na t ure,332,323-324)。应当将此类改变保持至恢复供体抗体的亲和力所需的最低限度。用于选择接纳体构架区中可能需要改变的残基的方案示于WO 91/09967中。

适当地，在本发明的人源化抗体分子中，如果接纳体重链具有与JH4一起的人VH4序列3-14-30.4，则除3个供体CDR(SEQ ID NO:1、2和3)外，重链的接纳体构架区还在位置25、44、48和71(按照Kaba t等人,(同上))中的至少一个上包含供体残基。因此，在一个实例中，提供了人源化抗体，其中至少重链可变结构域的位置25、44、48和71的每一个位置上的残基为供体残基，参见例如SEQ ID NO:23中给出的序列。

适当地，在本发明的人源化抗体分子中，如果接纳体轻链具有与JK2一起的人亚组VK2序列4-1-1A18，则除3个供体CDR(SEQ ID NO:4、5和6)外，轻链的接纳体构架区还可在位置2、3、45、62和87的至少一个上包含供体残基。因此，在一个实例中，提供了人源化抗体，其中至少轻链可变结构域的位置2、3、45、62和87的每一个上的残基为供体残基，参见例如SEQ ID NO:15。

供体残基为来自供体抗体(即CDR最初所源自的抗体)的残基。供体残基可被来源于人接纳体构架的适当残基(接纳体残基)替代。

替代各个构架的供体残基的适当的人接纳体残基列于下文中:

轻链

重链

本发明的抗体分子适当地分别包含互补轻链或互补重链。因此，在一个实施方案中，本发明提供了结合人PD-1的人源化激动性抗体，所述抗体具有包含SEQ ID NO:23中给出的序列的重链和包含SEQ ID NO:15中给出的序列的轻链。

应理解，可对由本发明提供的CDR或其它序列(例如可变结构域)进行一个或多个氨基酸的置换、添加和/或缺失，而不显著改变抗体结合PD-1和激动PD-1活性的能力。任何氨基酸置换、添加和/或缺失的作用可由本领域技术人员容易地测试，例如通过使用本文中特别是实施例中描述的方法来测定PD-1结合和PD-1激动。

在另一个实施方案中，本发明的抗体包含重链，其中重链的可变结构域包含与SEQ ID NO:23给出的序列具有至少60%的同一性或相似性的序列。在一个实施方案中，本发明的抗体包含重链，其中重链的可变结构域包含与SEQ ID NO:23中给出的序列具有至少70%、80%、90%、95%或98%的同一性或相似性的序列。

如本文中使用的，“同一性”表示在比对的序列中任何特定位置上，序列之间的氨基酸残基是相同的。如本文中使用的，“相似性”表示在比对的序列中任何特定位置上，序列之间的氨基酸残基具有相似的类型。例如，亮氨酸可置换异亮氨酸或缬氨酸。通常可彼此置换的其它氨基酸包括但不限于：

-苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸(具有芳香族侧链的氨基酸);

-赖氨酸、精氨酸和组氨酸(具有碱性侧链的氨基酸);

-天冬氨酸和谷氨酸(具有酸性侧链的氨基酸);

-天冬酰胺和谷氨酰胺(具有酰胺侧链的氨基酸)；和

-半胱氨酸和甲硫氨酸(具有含硫侧链的氨基酸)。可容易地计算同一性和相似性的程度(Computational Molecular Biology,Lesk,A.M.,ed.,Oxford University Press,New York,1988；Biocomputing.Informatics and Genome Projects,Smith,D.W.,ed.,AcademicPress,New York,1993；Computer Analysis of Sequence Data,第1部分,Griffin,A.M.和Griffin,H.G.,eds.,Humana Press,NewJersey,1994；Sequence Analysis in Molecular Biology,von Heinje,G.,Academic Press,1987,Sequence Analysis Primer,Gribskov,M和Devereux,J.,eds.,MStockton Press,New York,1991,可从NCBI获得的BLAST^TM软件(Altschul,S.F.等人,1990,J.Mol.Biol.215:403-410；Gish,W.&States,D.J.1993,Nature Genet.3:266-272.Madden,T.L.等人,1996,Meth.Enzymol.266:131-141；Altschul,S.F.等人,1997,Nucleic Acids Res.25:3389-3402；Zhang,J.&Madden,T.L.1997,Genome Res.7:649-656)。

在另一个实施方案中，本发明的抗体包含轻链，其中轻链的可变结构域包含与SEQ ID NO:15给出的序列具有至少60%的同一性或相似性的序列。

在一个实施方案中，本发明的抗体包含轻链，其中轻链的可变结构域包含与SEQ ID NO:15给出的序列具有至少70%、80%、90%、95%或98%的同一性或相似性的序列。

在本发明的另一个实施方案中，抗体包含重链和轻链，其中重链的可变结构域包含与SEQ I D NO:23中给出的序列具有至少60%的同一性或相似性的序列，并且轻链的可变结构域包含与SEQ ID NO:15中给出的序列具有至少60%的同一性或相似性的序列。

适当地，抗体包含重链和轻链，其中重链的可变结构域包含与SEQID NO:23中给出的序列具有至少70%、80%、90%、95%或98%的同一性或相似性的序列，其中轻链的可变结构域包含与SEQ I D NO:15中给出的序列具有至少70%、80%、90%、95%或98%的同一性或相似性的序列。

本发明的抗体分子可包括具有全长重链和轻链的完全抗体分子或其片段，并且可以为但不限于Fab、经修饰的Fab、Fab'、经修饰的Fab'、F(ab')₂、Fv、单结构域抗体(例如，VH或VL或VHH)、scFv、二、三或四价抗体、Bis-scFv、双链抗体(diabody)、三链抗体(triabody)、四链抗体(tetrabody)和上述之任一的表位结合片段(参见例如Holliger和Hudson,2005,Nature Biotech.23(9):1126-1136；Adair和Lawson,2005,Drug Design Reviews-Online2(3),209-217)。用于产生和制造此类抗体片段的方法在本领域是公知的(参见例如Verma等人,1998,Journal of ImmunologicalMethods,216,165-181)。用于本发明的其它抗体片段包括国际专利申请WO2005/003169、WO2005/003170和WO2005/003171中描述的Fab和Fab'片段。多价抗体可包含多重特异性例如双特异性或可以是单特异性的(参见例如WO 92/22853和WO05/113605)。

在一个实施方案中，根据本公开内容的抗体以结合PD-1的抗体融合蛋白的形式提供，其包含免疫球蛋白部分例如Fab或Fab'片段，和直接或间接与其连接的一个或二个单结构域抗体(dAb)，例如如WO2009/040562中所描述的。

在一个实施方案中，融合蛋白包含两个结构域抗体，例如作为任选地通过二硫键连接的可变重链(VH)和可变轻链(VL)配对。

在一个实施方案中，融合蛋白的Fab或Fab'元件具有与单结构域抗体相同或相似的特异性。在一个实施方案中，Fab或Fab'具有与单结构域抗体不同的特异性，也就是说融合蛋白是多价的。在一个实施方案中，根据本发明的多价融合蛋白具有白蛋白结合位点，例如本文中的VH/VL对提供了白蛋白结合位点。

考虑到提及的抗体分子功能，特别地可能需要的效应子功能，可选择本发明的抗体分子的恒定区结构域，如果存在的话。例如，恒定区结构域可以为人IgA,IgD,IgE,IgG或IgM结构域。特别地，当欲意将抗体分子用于治疗性应用并且需要抗体效应子功能时，可使用人IgG恒定区结构域，特别是IgG1和IgG3同种型的恒定区结构域。或者，当欲意将抗体分子用于治疗目的并且不需要抗体效应子功能(例如仅用于激动PD-1活性)时，可使用IgG2和IgG4同种型。应理解，还可使用这些恒定区结构域的序列变体。例如，可使用其中在位置241上的丝氨酸已被改变成脯氨酸的I gG4分子(如Anga l等人,MolecularImmunology,1993,30(1),105-108中所描述的)。本领域技术人员还将理解，抗体可经历多种翻译后修饰。此类修饰的类型和程度通常取决于用于表达抗体的宿主细胞系以及培养条件。此类修饰可包括糖基化、甲硫氨酸氧化、哌嗪二酮形成、天冬氨酸异构化和天冬酰胺脱酰胺。常见的修饰为因羧肽酶的作用而引起的羧基末端碱性残基(例如赖氨酸或精氨酸)的丢失(如Harris,RJ.Journal of Chroma tography705:129-134,1995中所描述的)。因此，图7(SEQ ID NO:27)中给出的抗体重链的C末端赖氨酸可以不存在。

在一个实施方案中，抗体重链包含CH1结构域并且抗体轻链包含CL结构域(κ或λ)。

包含恒定结构域的合适的序列的实例提供于SEQ ID NO 19和27中。

生物学分子例如抗体或片段包含酸性和/或碱性官能团，从而给予分子净正电荷或负电荷。总的“观察到的”电荷的量将取决于实体的绝对氨基酸序列、3D结构中的带电荷基团的局部环境和分子的环境条件。等电点(pI)为特定分子或其溶剂可及表面不携带净电荷时的pH。在一个实例中，可对本发明的PD-1抗体和片段进行工程改造以具有适当的等电点。这可导致具有更强劲性质，特别是适当的溶解度和/或稳定性特征和/或改进的纯化特征的抗体和/或片段。

因此，在一个方面，本发明提供了经工程改造而具有与原始鉴定的抗体948的等电点不同的等电点的人源化PD-1抗体。可以例如通过替代氨基酸残基(例如用一个或多个碱性氨基酸残基替代酸性氨基酸残基)来对抗体进行工程改造。或者，可引入碱性氨基酸残基或可除去酸性氨基酸残基。或者，如果分子具有不可接受的高pI值，则可根据需要引入酸性残基以降低p I。重要的是，当操作pI时，必须小心以保持抗体或片段的期望的活性。因此，在一个实施方案中，工程改造的抗体或片段具有与“未修饰的”抗体或片段相同或基本上相同的活性。

程序例如**ExPASY http://www.expasy.ch/tools/pi_tool.html和 http://www.iut-arles.up.univ-mrs.fr/w3bb/d_abim/compo-p.html可用于预测抗体或片段的等电点。

应理解，可使用本领域已知的任何适当方法改变本发明提供的抗体的亲和力。可使用本领域已知的任何适当方法包括BIAcore，使用分离的天然或重组PD-1或适当的融合蛋白/多肽测量抗体或其变体的亲和力。在一个实例中，使用重组人PD-1细胞外结构域测量亲和力。在一个实例中，使用的重组人PD-1细胞外结构域为单体。因此，本发明还涉及本发明的抗体分子的变体，其具有改善的对PD-1的亲和力。此类变体可通过许多亲和力成熟方案包括突变CDR(Yang等人,J.Mol.Biol.,254,392-403,1995)、链改组(Marks等人,Bio/Technology,10,779-783,1992)、大肠杆菌(E.coli)的增变株的使用(Low等人,J.Mol.Biol.,250,359-368,1996)、DNA改组(Patten等人,Curr.Opin.Biotechnol.,8,724-733,1997)、噬菌体展示(Thompson等人,J.Mol.Biol.,256,77-88,1996)和有性PCR(sexual PCR)(Crameri等人,Nature,391,288-291,1998)来获得。Vaughan等人(同上)论述了此类亲和力成熟的方法。

在一个实施方案中，本发明的抗体分子激动人PD-1活性。适于测定抗体激动PD-1的能力的测定法是本领域已知的。

必要时，可将用于本发明的抗体缀合至一个或多个效应分子。应理解，效应分子可包括单个效应分子，或两个或更多个此类分子，其这样连接以形成可连接至本发明的抗体的单个部分。当期望获得连接于效应分子的抗体片段时，可利用标准化学或重组DNA法来进行制备，在所述方法中将抗体片段直接或通过偶联剂连接于效应分子。用于将此类效应分子缀合于抗体的技术在本领域是公知的(参见，Hellstrom等人,Controlled Drug Delivery,第2版,Robinson等人,eds.,1987,pp.623-53；Thorpe等人,1982,Immunol.Rev.,62:119-58和Dubowchik等人,1999,Pha rmacology and Therapeutics,83,67-123)。具体的化学方法包括例如WO 93/06231、WO 92/22583、WO89/00195、WO 89/01476和WO 03031581中描述的化学方法。或者，当效应分子为蛋白质或多肽时，可使用重组DNA法例如WO 86/01533和EP0392745中描述的方法来实现连接。

如本文中使用的，术语效应分子包括例如抗肿瘤试剂、药物、毒素、生物学活性蛋白质例如酶、其它抗体或抗体片段、合成或天然存在的聚合物、核酸和其片段例如DNA、RNA及其片段、放射性核素特别是放射性碘、放射性同位素、螯合金属、纳米颗粒和报道基团例如荧光化合物或可通过NMR或ESR光谱学检测的化合物。

效应分子的实例可包括细胞毒素或细胞毒性剂，包括对细胞有害(例如杀伤细胞)的任何试剂。实例包括考布他汀(combrestatins)、多拉司他汀(dolastatins)、埃博霉素(epothilones)、星形孢菌素(staurosporin)、美登素(maytansinoids)、海绵抑制素(spongistatins)、根霉素(rhizoxin)、软海绵素、杆孢菌素(roridins)、hemiasterlins、泰素(taxol)、细胞松弛素B、短杆菌肽D、溴化乙锭、依米丁(emetine)、丝裂霉素、依托泊甙、tenoposide、长春新碱、长春碱、秋水仙碱、多柔比星、柔红霉素,二羟基蒽二酮(dihydroxy anthracindione)、米托蒽醌、光神霉素(mithramycin)、放线菌素D、1-去氢睾酮、糖皮质激素、普鲁卡因、丁卡因、利多卡因、***和嘌呤霉素及其类似物或同源物。

效应分子还包括但不限于抗代谢药(例如，氨甲蝶呤、6-巯嘌呤、6-硫鸟嘌呤、阿糖胞苷、5-氟尿嘧啶达卡巴嗪)、烷化剂(例如氮芥(mechlorethamine)、噻替派(thioepa)、苯丁酸氮芥、美法仑、卡莫司汀(BSNU)和洛莫司汀(CCNU)、环磷酰胺(cyclothosphamide)、白消安、二溴甘露醇、链脲霉素、丝裂霉素C和顺-二氯二胺铂(II)(DDP)顺铂)、蒽环类(例如柔红霉素(先前称为道诺霉素)和多柔比星)、抗生素(例如放线菌素D(先前称为放线菌素)、博莱霉素、光神霉素、安曲霉素(AMC)、卡奇霉素或多卡米星)以及抗有丝***剂(例如长春新碱和长春碱)。

其它效应分子可包括螯合放射性核素例如¹¹¹In和⁹⁰Y、Lu¹⁷⁷、铋²¹³、锎²⁵²、铱¹⁹²和钨¹⁸⁸/铼¹⁸⁸；或药物例如但不限于烷基磷酸胆碱、拓扑异构酶I抑制剂、紫杉烷和舒拉明。其它效应分子包括蛋白质、肽和酶。感兴趣的酶包括但不限于蛋白水解酶、水解酶、裂合酶、异构酶、转移酶。感兴趣的蛋白质、多肽和肽包括但不限于免疫球蛋白、毒素例如相思豆毒蛋白、蓖麻蛋白A、假单胞菌外毒素或白喉毒素、蛋白质例如胰岛素、肿瘤坏死因子、α-干扰素、β-干扰素、神经生长因子、血小板衍生的生长因子或组织型纤溶酶原激活物、血栓形成剂或抗血管生成剂例如血管抑素(angiostatin)或内皮抑素，或生物应答调节剂例如淋巴因子、白细胞介素-1(IL-1)、白细胞介素-2(IL-2)、粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)、粒细胞集落刺激因子(G-CSF)、神经生长因子(NGF)或其它生长因子和免疫球蛋白。

其它效应分子可包括用于例如诊断的可检测物质。可检测物质的实例包括各种酶、辅基、荧光材料、发光材料、生物发光材料、放射性核素、正电子发射金属(用于正电子发射断层摄影术)、和非放射性顺磁性金属离子。关于可缀合于抗体以用作诊断剂的金属离子，通常参见美国专利No.4,741,900。适当的酶包括辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶、β-半乳糖苷酶或乙酰胆碱酯酶；适当的辅基包括链霉抗生物素蛋白、抗生物素蛋白和生物素；适当的荧光材料包括伞形酮、荧光素、异硫氰酸荧光素、罗丹明、二氯三嗪胺(dichlorotriazinylamine)荧光素、丹磺酰氯和藻红蛋白；适当的发光材料包括鲁米诺；适当的生物发光材料包括萤光素酶、萤光素和水母发光蛋白；以及适当的放射性核素包括¹²⁵I、¹³¹I、¹¹¹I n和⁹⁹Tc。

在另一个实例中，效应分子可在体内延长抗体的半衰期和/或减小抗体的免疫原性和/或增强抗体穿过上皮屏障至免疫***的递送。该类型的适当效应分子的实例包括聚合物、白蛋白、白蛋白结合蛋白或白蛋白结合化合物，例如WO05/117984中描述的化合物。

当效应分子为聚合物时，其一般可以为合成或天然存在的聚合物，例如任选地取代的直链或支链聚亚烷基、聚亚链烯基(polyalkenylene)或聚氧亚烷基聚合物或分支的或未分支的多糖例如同或异多糖。

可存在于上述合成聚合物上的具体的任选取代基包括一个或多个羟基、甲基或甲氧基。

合成聚合物的具体实例包括任选地取代的直链或支链聚(乙二醇)、聚(丙二醇)、聚(乙烯醇)或其衍生物，特别是任选地取代的聚(乙二醇)例如甲氧基聚(乙二醇)或其衍生物。

具体的天然存在的聚合物包括乳糖、直链淀粉、葡聚糖、糖原或其衍生物。

如本文中使用的，“衍生物”意欲包括反应性衍生物，例如巯基选择性反应基团例如马来酰亚胺等。反应性基团可直接或通过接头区段连接于聚合物。应理解，此类基团的残基在一些情况下作为抗体片段与聚合物之间的连接基团构成产物的一部分。

必要时，聚合物的大小可进行改变，但其通常在500Da至50000Da，例如5000至40000Da，例如20000至40000Da的平均分子量范围内。可特别地基于产物的期望的用途(例如定位至某些组织例如肿瘤或延长循环半衰期的能力)来选择聚合物大小(关于综述，参见Chapman,2002,Advanced Drug Delivery Reviews,54,531-545)。因此，例如，当期望产物离开循环并且渗入组织，例如用于***时，可以有利地使用小分子量聚合物，例如具有约5000Da的分子量的聚合物。关于其中产物保持在循环中的应用，可以有利地使用更高分子量的聚合物，例如具有20000Da至40000Da的分子量的聚合物。

适当的聚合物包括聚亚烷基聚合物例如聚(乙二醇)或，特别是甲氧基聚(乙二醇)或其衍生物，并且特别是具有约15000Da至约40000Da的分子量。

在一个实例中，将用于本发明的抗体连接至聚(乙二醇)(PEG)部分。在一个具体的实施方案中，抗体为抗体片段并且可通过位于抗体片段中的任何可获得的氨基酸侧链或末端氨基酸官能团(例如任何游离氨基、亚胺基、巯基、羟基或羧基)连接PEG部分。此类氨基酸可天然存在于抗体片段中或可使用重组DNA法将其工程改造入片段(参见例如US 5,219,996；US 5,667,425；WO98/25971,WO2008/038024)。在一个实例中，本发明的抗体分子为经修饰的Fab片段，其中修饰为允许效应分子的连接的一个或多个氨基酸至其重链C末端的添加。适当地，额外的氨基酸形成包含可将效应分子连接至其的一个或多个半胱氨酸残基的经修饰的铰链区。可将多个位点用于连接两个或更多个PEG分子。

适当地，PEG分子通过至少一个位于抗体片段中的半胱氨酸残基的巯基共价连接。可将每一个连接至经修饰的抗体片段的聚合物分子共价连接于位于片段中的半胱氨酸残基的硫原子。共价键通常为二硫键或特别地硫-碳键。当巯基用作连接点时，可使用适当地激活的效应分子，例如巯基选择性衍生物例如马来酰亚胺和半胱氨酸衍生物。激活的聚合物可在聚合物修饰的抗体片段的制备中用作起始材料，如上文中描述的。激活的聚合物可以是包含巯基反应性基团例如α-卤代羧酸或酯例如碘乙酰胺、酰亚胺例如马来酰亚胺、乙烯基砜或二硫化物的任何聚合物。此类起始材料可商购获得(例如来自Nektar，先前为Shearwater Polymers Inc.,Huntsville,AL,USA)或可使用常规化学方法从商购可得的起始材料制备。具体的PEG分子包括20K甲氧基-PEG-胺(可获自Nektar,先前为Shearwater；Rapp Polymere；和SunBio)和M-PEG-SPA(可获自Nektar,先前为Shearwater)。

在一个实施方案中，抗体为经修饰的Fab片段或diFab，其是PEG化的，即具有共价连接于其的PEG(聚(乙二醇))，例如按照EP 0948544或EP1090037中公开的方法[也参见"Poly(ethyleneglycol)Chemistry,Biotechnicaland Biomedical Applications",1992,J.Milton Harris(ed),Plenum Press,New York,"Poly(ethyleneglycol)Chemistry and Biological Applications",1997,J.Milton Harris和S.Zalipsky(eds),American Chemical Society,Washington DC和"Bioconjugation Protein Coupling Techniques for theBiomedical Sciences",1998,M.Aslam和A.Dent,GrovePublishers,New York；Chapman,A.2002,Advanced Drug DeliveryReviews 2002,54:531-545]。在一个实例中，PEG被连接至铰链区中的半胱氨酸。在一个实例中，PEG修饰的Fab片段具有共价连接于经修饰的铰链区中的单个巯基的马来酰亚胺基团。赖氨酸残基可共价连接于马来酰亚胺基团，并且赖氨酸残基上的每一个氨基可连接具有约20,000Da分子量的甲氧基聚(乙二醇)聚合物。因此，连接于Fab片段的PEG的总分子量可以为约40,000Da。

具体的PEG分子包括N,N'-二(甲氧基聚(乙二醇)MW 20,000)修饰的赖氨酸的2-[3-(N-马来酰亚胺基)丙酰胺基]乙酰胺，也称为PEG2MAL40K(可获自Nektar，选前为Shearwater)。

PEG接头的可选择的来源包括NOF，其提供GL2-400MA2(其中下面结构中的m为5)和GL2-400MA(其中m为2)并且n为约450:

m为2或5

即，每一个PEG为约20,000Da。

下列类型的其它可选择的PEG效应分子：

可从Dr Reddy,NOF and Jenkem获得。

在一个实施方案中，提供了通过链中的氨基酸226(例如重链的氨基酸226(按照连续编号))上或大致氨基酸226上的半胱氨酸氨基酸残基连接的PEG化(例如利用本文中描述的PEG)的抗体。

本发明还提供了编码本发明的抗体分子的重链和/或轻链的分离的DNA序列。适当地，DNA序列编码本发明的抗体分子的重链或轻链。本发明的DNA序列可包括合成的DNA(例如通过化学处理产生的)、cDNA、基因组DNA或其任何组合。可通过本领域技术人员公知的方法获得编码本发明的抗体分子的DNA序列。例如，需要时，可从确定的DNA序列或基于相应的氨基酸序列合成编码抗体重链和轻链的部分或全部的DNA序列。

编码接纳体构架序列的DNA对于本领域技术人员来说是可广泛获得的，并且可基于它们已知的氨基酸序列容易地合成。

分子生物学的标准技术可用于制备编码本发明的抗体分子的DNA序列。可使用寡核苷酸合成技术完全或部分地合成期望的DNA序列。适当时，可使用定点诱变和聚合酶链式反应(PCR)技术。

适当的DNA序列的实例提供于图3-12中，特别地SEQ ID NO 16、18、20、22、24、26、28和30。

本发明还涉及包含一个或多个本发明的DNA序列的克隆性或表达载体。因此，提供了包含一个或多个编码本发明的抗体的DNA序列的克隆性或表达载体。适当地，克隆性或表达载体包含两个DNA序列(分别编码本发明的抗体分子的轻链和重链)和适当的信号序列。在一个实例中，载体包含重链与轻链之间的基因间序列(参见WO03/048208)。

可籍以构建载体的一般方法、转染方法和培养方法对于本领域技术人员来说是公知的。在这方面，参考“Current Protocols inMolecular Biology”,1999,F.M.Ausubel(ed),Wiley Interscience,New York和Cold Spring Harbor Publishi ng生产的ManiatisManual。

还提供了宿主细胞，所述细胞包含一个或多个包含一个或多个编码本发明的抗体的DNA序列的克隆性或表达载体。任何适当的宿主细胞/载体***可用于表达编码本发明的抗体分子的DNA序列。可使用细胞例如大肠杆菌和其它微生物***或还可使用真核生物(例如哺乳动物)宿主细胞表达***。适当的哺乳动物宿主细胞包括CHO、骨髓瘤或杂交瘤细胞。

本发明还提供了用于产生根据本发明的抗体分子的方法，包括在适合于导致蛋白质从编码本发明的抗体分子的DNA表达的条件下培养包含本发明的载体的宿主细胞，和分离抗体分子。

抗体分子可以仅包含重链或轻链多肽，在该情况下仅重链或轻链多肽编码序列需要被用于转染宿主细胞。为了产生包含重链和轻链的产物，可用两个载体转染细胞系，第一载体编码轻链多肽并且第二载体编码重链多肽。或者，可使用单个载体，所述载体包含编码轻链和重链多肽的序列。

根据本说明书的抗体和片段以良好水平从宿主细胞表达。因此，抗体和/或片段的性质是最优化的并且有助于商业加工。

由于本发明的抗体在病理病况的治疗和/或预防中是有用的，因此本发明还提供了药物或诊断组合物，所述组合物包含与一种或多种药学上可接受的赋形剂、稀释剂或载体组合的本发明的抗体分子。因此，提供了本发明的抗体用于制造药物的用途。组合物通常作为通常包括药学上可接受的载体的无菌药物组合物的部分提供。本发明的药物组合物可额外地包含药学上可接受的佐剂。

本发明还提供了用于制备药物或诊断组合物的方法，包括添加本发明的抗体分子并且将其与药学上可接受的赋形剂、稀释剂或载体中的一种或多种混合在一起。

抗体分子可以是药物或诊断组合物中的唯一活性成分或可伴随其它活性成分，包括其它抗体成分，例如抗-TNF、抗-IL-1β、抗-T细胞、抗-IFNγ或抗-LPS抗体或非-抗体成分例如黄嘌呤。

在其它实施方案中，将根据本公开内容的抗体、片段或组合物与其它药学活性剂例如皮质类固醇(例如丙酸氟替卡松(fluticasonoepropionate))和/或β-2-激动剂(例如柳丁氨醇、沙美特罗或福莫特罗)或细胞生长和增殖的抑制剂(例如雷帕霉素,环磷酰胺、甲氨蝶呤)或可选择地CD28和/或CD40抑制剂组合使用。在一个实施方案中，抑制剂为小分子。在另一个实施方案中，抑制剂为特异于靶的抗体。

药物组合物适当地包含治疗有效量的本发明的抗体。如本文中使用的，术语“治疗有效量”是指治疗、缓解或预防靶疾病或病况或展示可检测的治疗或预防作用所需的治疗剂的量。对于任何抗体，最初可在细胞培养测定中或动物模型中(通常在啮齿类动物、兔、狗、猪或灵长类动物中)估计治疗有效量。动物模型还可用于确定施用的适当浓度范围和途径。随后可将此类信息用于确定施用给人的有用剂量和途径。

用于人受试者的精确治疗有效量将取决于疾病状态的严重度、受试者的总体健康状况、受试者的年龄、体重和性别、饮食、施用的时间和频率、药物组合、对治疗的反应灵敏度和耐受性/反应。该量可通过常规实验测定并且在临床医生的判断内。通常，治疗有效量为0.01mg/kg至50mg/kg，例如0.1mg/kg至20mg/kg。药物组合物可方便地以每剂量包含预定量的本发明的活性剂的单位剂量形式提供。

可将组合物单独地给患者施用或可将其与其它试剂、药物或激素组合(例如同时、相继或分开地)施用。

本发明的抗体分子的施用剂量取决于待治疗的病况的性质、呈现的炎症的程度，以及取决于将预防性使用抗体分子还是将其用于治疗存在的病况。

给药频率将取决于抗体分子的半衰期和其作用的持续时间。如果抗体分子具有短的半衰期(例如2至10小时)，则可能必需每天施用一个或多个剂量。或者，如果抗体分子具有长的半衰期(例如2至15天)，则可能仅需每天一次，每周一次或甚至每1或2个月一次施用一个剂量。

药学上可接受的载体本身不应当诱导对接受组合物的个体有害的抗体产生并且不应当具有毒性。适当的载体可以是大的缓慢代谢的大分子例如蛋白质、多肽、脂质体、多糖、聚乳酸、聚乙醇酸、多聚氨基酸、氨基酸共聚物和灭活的病毒颗粒。

可使用药学上可接受的盐，例如无机酸盐，例如盐酸盐、氢溴酸盐、磷酸盐和硫酸盐，或有机酸盐，例如醋酸盐、丙酸盐、丙二酸盐和苯甲酸盐。

治疗性组合物中的药学上可接受的载体可另外包含液体例如水、盐水、甘油和乙醇。此外，辅助物质例如湿润剂或乳化剂或pH缓冲物质，可存在于这样的组合物中。此类载体使得药物组合物能够被配制为片剂、丸剂、锭剂、胶囊剂、液体、凝胶、糖浆剂、膏剂和悬液，以用于患者摄入。

施用的适当形式包括适用于胃肠外施用的形式(例如通过注射或输注，例如通过快速浓注或连续输注)。当产物用于注射或输注时，其可采取油性或水性媒介物中的悬液、溶液或乳液的形式以及其可包含配制剂(formulatory agent)例如混悬剂、防腐剂、稳定剂和/或分散剂。或者，抗体分子可以以干燥形式存在，其在使用之前用适当的无菌液体进行重建。

配制后，可将本发明的组合物给受试者直接施用。待治疗的受试者可以是动物。然而，在一个或多个实施方案中，组合物经改造适用于给人受试者施用。

适当地，在根据本发明的制剂中，终制剂的pH与抗体或片段的等电点的值不相似，如果制剂的pH为7，则8-9或以上的p I可以是合适的。然而不希望受理论束缚，据认为这可最终提供具有增强的稳定性的终制剂，例如抗体或片段保持在溶液中。

在一个实施方案中，pH在4.0至7.0的范围内的药物制剂包含：1至200mg/mL的根据本公开内容的抗体、1至100mM的缓冲剂、0.001至1%的表面活性剂，a)10至500mM的稳定剂，b)10至500mM的稳定剂和5至500mM的张度剂(tonicity agent)或c)5至500mM的张度剂。

例如约pH6的制剂可包含1至50mg/mL的抗体、20mM L-组氨酸HCl、240mM海藻糖和0.02%的聚山梨醇酯20。或者pH为约5.5的制剂可包含1至50mg/mL的抗体、20mM柠檬酸盐缓冲剂、240mM蔗糖、20mM精氨酸和0.02%聚山梨醇酯20。

本发明的药物组合物可通过许多途径施用，包括但不限于口服、静脉内、肌内、动脉内、髓内、鞘内、心室内、经真皮(transdermal)、经皮(transcutaneous)(例如，参见WO98/20734)、皮下、腹膜内、鼻内、经肠、局部、舌下、***内或直肠途径。皮下注射器(Hypospray)也可用于施用本发明的药物组合物。通常地，可将治疗性组合物配制为可注射的液体溶液或悬液。还可制备适用于在注射之前溶解于或悬浮于液体媒介物中的固体形式。

组合物的直接递送通常通过注射(皮下、腹膜内、静脉内或肌内)或递送至组织的间质间隙来实现。还可将组合物施用至损伤处。剂量处理可以是单剂量方案或多剂量方案。

应理解，组合物中的活性成分将是抗体分子。由此，其将易于在胃肠道中降解。因此，如果将通过使用胃肠道的途径施用组合物，则组合物必须包含保护抗体免受降解并且一旦其已从胃肠道吸收就释放抗体的试剂。

可在Remington's Pharmaceutical Sciences(Mack PublishingCompany,N.J.1991)中获得药学上可接受的载体的详尽论述。

在一个实施方案中，以用于局部施用(包括吸入)的制剂形式提供制剂。

适当的可吸入制剂包括可吸入粉剂、包含喷射气体的计量气雾剂或不含喷射气体的可吸入溶液。包含活性物质的根据本公开内容的可吸入粉剂可仅由上述活性物质组成或由上述活性物质与生理学上可接受的赋形剂的混合物组成。

此类可吸入粉剂可包括单糖(例如葡萄糖或***糖)、二糖(例如乳糖、蔗糖、麦芽糖)、寡糖和多糖(例如葡聚糖)、多元醇(例如山梨醇、甘露醇、木糖醇)、盐(例如氯化钠、碳酸钙)或此类物质彼此的混合物。适当地，使用单糖或二糖，特别地但非唯一地以它们的水合物形式使用乳糖或葡萄糖。

用于在肺中沉积的颗粒需要小于10微米例如1-9微米例如0.1至5μm，特别地1至5μm的粒度。活性成分(例如抗体或片段)的粒度是特别重要的。

可用于制备可吸入气雾剂的喷射气体在本领域是已知的。适当的喷射气体选自烃类例如正丙烷、正丁烷或异丁烷以及卤代烃例如甲烷、乙烷、丙烷、丁烷、环丙烷或环丁烷的氯化或氟化衍生物。可单独地或以其混合物形式使用上述喷射气体。

特别适合的喷射气体为选自TG 11、TG 12、TG 134a和TG227的卤代烷衍生物。在上述卤代烃中，TG134a(1,1,1,2-四氟乙烷)和TG227(1,1,1,2,3,3,3-七氟丙烷)及其混合物是特别合适的。

含喷射气体的可吸入气雾剂还可包含其它成分例如共溶剂、稳定剂、表面活性试剂(表面活性剂)、抗氧化剂、润滑剂和用于调整pH的工具。所有此类成分在本领域是已知的。

根据本发明的含喷射气体的可吸入气雾剂可包含多达按重量计5%的活性物质。根据本发明的气雾剂包含例如按重量计0.002至5%、按重量计0.01至3%、按重量计0.015至2%、按重量计0.1至2%、按重量计0.5至2%或按重量计0.5至1%的活性成分。

或者至肺的局部施用还可以是液体溶液或悬液制剂的施用，例如使用装置例如喷雾器，例如连接于压缩器的喷雾器(例如，由PariRespiratory Equipment,Inc.,Richmond,Va.制造的连接于PariMaster(R)压缩器的Pari LC-Jet Plus(R)喷雾器)。

可递送分散在溶剂中例如以液体或悬液形式存在的本发明的抗体。可将其悬浮在适当的生理学溶液，例如盐水或其它药理学可接受的溶剂或缓冲溶液中。本领域已知的缓冲溶液可包含0.05mg至0.15mg依地酸二钠、8.0mg至9.0mg NaCl、0.15mg至0.25mg聚山梨酯、0.25mg至0.30mg无水柠檬酸和0.45mg至0.55mg柠檬酸钠/1ml水以获得约4.0至5.0的pH。悬液可利用例如冷冻干燥的抗体。

治疗性悬液或溶液制剂还可包含一种或多种赋形剂。赋形剂在本领域是公知的并且包括缓冲剂(例如，柠檬酸盐缓冲剂、磷酸盐缓冲剂、醋酸盐缓冲剂和碳酸氢盐缓冲剂)、氨基酸、尿素、醇、抗坏血酸、磷脂、蛋白质(例如，血清白蛋白)、EDTA、氯化钠、脂质体、甘露醇、山梨醇和甘油。可将溶液或悬液封装在脂质体或生物可降解的微球体中。利用无菌制造方法，通常以大体上无菌的形式提供制剂。

这可包括生产和灭菌(通过过滤用于配制的缓冲溶剂/溶液)抗体在无菌缓冲溶剂溶液中的无菌悬液，然后通过本领域技术人员熟知的方法将制剂分配入无菌容器内。

可以例如以包装在箔封袋中的单个剂量单位(例如，密封的塑料容器或小瓶)的形式提供根据本发明的可喷雾制剂。每一个小瓶在一定体积例如2mL的溶剂/溶液缓冲剂中包含单位剂量。

本文中公开的抗体可适用于通过喷雾法的递送。

还预期,可通过使用基因疗法施用本发明的抗体。为了实现该目的，将在适当的DNA组件的控制下编码抗体分子的重链和轻链的DNA序列引入患者，以便抗体链从DNA序列表达并且原位装配。

本发明还提供了用于控制炎性疾病例如急性或慢性炎性疾病的抗体分子(或包含所述抗体分子的组合物)。适当地，抗体分子(或包含所述抗体分子的组合物)可用于减少炎性过程或预防炎性过程。在一个实施方案中，提供了激活的T细胞特别地参与不适当的炎性免疫应答的T细胞(例如被招募至此类应答的附近/位置处的T细胞)的体内减少。

如本文中使用的，激活的T细胞的减少可以为与处理前或无处理相比，10、20、30、40、50、60、70、80、90%或更多的减少。有利地，利用根据本发明的抗体、片段或组合物的处理可允许激活的T细胞的水平的降低，而不降低患者的总T细胞(未激活的T细胞)水平。这可导致更少的副作用，并且可能防止患者的T细胞耗尽。

本发明还提供了用于治疗或预防免疫障碍的本发明的抗体分子。免疫障碍可以例如选自感染(病毒、细菌、真菌和寄生虫)、与感染相关的内毒素性休克、关节炎、类风湿性关节炎、哮喘、COPD、***性疾病、阿尔兹海默病、炎性肠病、克罗恩病、溃疡性结肠炎、派若尼氏症(Peyronie's Disease)、乳糜泻(coeliac disease)、胆囊疾病、藏毛病(Pilonidal disease)、腹膜炎、银屑病、血管炎、手术粘连(surgical adhesions)、中风(stroke)、I型糖尿病、莱姆病、关节炎、脑膜脑炎、自身免疫性葡萄膜炎、中枢和外周神经***的免疫介导的炎性障碍例如多发性硬化、狼疮(例如***性红斑狼疮)和格林-巴利综合征、特应性皮炎、自身免疫性肝炎、纤维化肺泡炎(fibrosingalveolitis)、格雷夫斯病(Grave's disease)、IgA肾病、特发性血小板减少性紫癜、梅尼埃病(Meniere'sdisease)、天疱疮、原发性胆汁性肝硬化、结节病、硬皮病、韦格纳肉芽肿(Wegener'sgranul omatosis)、其它自身免疫疾病、胰腺炎、创伤(手术)、移植物抗宿主病、移植排斥、心脏病包括缺血性疾病例如心肌梗塞以及动脉粥样硬化、血管内凝血、骨质吸收、骨质疏松、骨关节炎、牙周炎和胃酸过少(hypochlorhyd i a)或与胎儿-母源耐受性的缺失相关的不育。

在一个实施方案中，根据本发明的抗体用于治疗***反应、COPD、自身免疫疾病或类风湿性关节炎。

本发明还提供了用于治疗或预防疼痛特别地与炎症相关的疼痛的根据本发明的抗体分子。

本发明还提供了根据本发明的抗体分子、片段或组合物用于制造药物的用途，所述药物用于治疗或预防免疫障碍，特别地免疫障碍为类风湿性关节炎、哮喘或COPD。

本发明还提供了根据本发明的抗体分子、片段或组合物用于制造药物的用途，所述药物用于治疗或预防一种或多种本文中描述的医学适应症。

可将本发明的抗体分子、片段或组合物用于其中期望增强PD-1在人或动物体内的作用的任何疗法。

在一个实施方案中，本发明的抗体分子或包含所述抗体分子的组合物用于控制炎性疾病，例如如本文中所描述的炎性疾病。

本发明还提供了治疗患有免疫障碍或处于发生免疫障碍的风险中的人或动物受试者的方法，所述方法包括给受试者施用有效量的本发明的抗体分子或包含所述抗体分子的组合物。

在一个实施方案中，提供了用于纯化抗体(特别地根据本发明的抗体或片段)的方法，包括步骤：

以非结合模式进行阴离子交换层析，以便杂质保留在柱子上并且抗体被洗脱。

用于所述方法的适当的离子交换树脂包括Q.FF树脂(由GE-Healthcare提供)。该步骤可以例如在约pH 8下进行。

该方法还可包括利用阳离子交换层析(例如在约4至5例如4.5的pH下进行)的初始捕获步骤。阳离子交换层析可以例如利用树脂例如CaptoS树脂或SP琼脂糖FF(由GE-Healthcare提供)。随后可以利用离子盐溶液例如氯化钠(例如浓度为200mM)从树脂洗脱抗体或片段。

因此，适当时，层析步骤可包括一个或多个洗涤步骤。

纯化方法还可包括一个或多个过滤步骤，例如透析过滤步骤。

因此，在一个实施方案中，提供了以充分纯化的形式(特别地不含或大体上不含内毒素和/或宿主细胞蛋白质或DNA)存在的纯化的抗-PD-1抗体或片段，例如人源化抗体或片段，特别地根据本发明的抗体或片段。

如上文中所用，纯化的形式意欲指，至少90%的纯度，例如91、92、93、94、95、96、97、98、99%w/w或更高的纯度。

大体上不含内毒素通常意欲指，每mg抗体产物1EU或更少的内毒素含量，例如每mg产物0.5或0.1EU。

大体上不含宿主细胞蛋白质或DNA通常意欲指，每mg抗体产物400μg或更少的宿主细胞蛋白质或DNA含量，例如每mg抗体产物100μg或更少，特别地每mg抗体产物20μg(适当时)。

本发明的抗体分子还可用于诊断，例如用于牵涉PD-1的疾病状态的体内诊断和成像。

本说明书上下文中的包含意指包括。

当技术上适当时，可组合本发明的实施方案。

在本文中将实施方案描述为包括某些特征/元素。本公开内容还扩展至由所述特征/元素组成或基本上由所述特征/元素组成的单独的实施方案。

在下列实施例中仅通过举例说明的方式进一步描述本发明，所述实施例参考附图，其中：

具体地图1:

抗体948的CDRH1(SEQ ID NO:1)、CDRH2(SEQ ID NO:2)、CDRH3(SEQ ID NO:3)、CDRL1(SEQ ID NO:4)、CDRL2(SEQ ID NO:5)、CDRL3(SEQ ID NO:6)

抗体948的轻链V区(SEQ ID NO:7)

抗体948的轻链V区DNA(SEQ I D NO:8)

抗体948的具有信号序列的轻链V区(SEQ ID NO:9)

图2

抗体948的具有信号序列的轻链V区DNA(SEQ ID NO:10)

小鼠Ab948VH区(SEQ ID NO:11)

小鼠Ab948VH区DNA(SEQ ID NO:12)

具有信号序列的小鼠Ab948VH区(SEQ ID NO:13)

图3

具有信号序列的小鼠Ab948VH区DNA(SEQ ID NO:14)

948 VL gL1V区(SEQ ID NO:15)

948 VL gL1V区DNA(SEQ ID NO:16)

具有信号序列的948 VL gL1 V区(SEQ ID NO:17)

图4

具有信号序列的948 VL gL1V区DNA(SEQ ID NO:18)

948 VL gL1轻链V+恒定(SEQ ID NO:19)

图5

948 VL gL1轻链V+恒定DNA(SEQ ID NO:20)

具有信号序列的948VL gL1轻链V+恒定(SEQ ID NO:21)

图6

具有信号序列的948VL gL1轻链V+恒定(SEQ ID NO:22)

948VH g1(SEQ ID NO:23)

948VH g1DNA(SEQ ID NO:24)

图7

具有信号序列的948VH g1(SEQ ID NO:25)

具有信号序列的948VH g1DNA(SEQ ID NO:26)

948VH g1和恒定结构域(SEQ ID NO:27)

图8

948VH g1和恒定结构域DNA(SEQ ID NO:28)

图9

948VH g1和恒定结构域和信号序列(SEQ ID NO:29)

图10

948VH g1和恒定结构域和信号序列DNA(SEQ ID NO:30)

图11

人VK24-1-(1)A18JK2接纳体构架(SEQ ID NO:31)

人VK24-1-(1)A18JK2接纳体构架DNA(SEQ ID NO:32)

人VH43-14-30.4JH4接纳体构架(SEQ ID NO:33)

人VH43-14-30.4JH4接纳体构架(SEQ ID NO:34)

图12显示948嵌合和人源化移植物对细胞表达的人PD-1的结合的比较。利用流式细胞术测量指定浓度的948移植物对用人全长PD-1转染的HEK293细胞的结合。数据表示为PD-1抗体相关荧光的几何平均值。

图13显示鼠的轻链、接纳体构架和人源化轻链的比对，以及鼠的重链、接纳体构架和人源化重链的比对。CDR以粗体和下划线标示。供体残基以粗体、斜体标示并且高亮显示。

实施例

实施例1:用于产生抗-PD-1抗体克隆10的方法

抗体克隆10的产生已描述于国际申请PCT/I B2009/006946(未公布)中。

1.1骨髓瘤细胞系

为了进行融合，使用来自German Collect ion of Microorgani smsand CellCul tures(DSMZ GmbH,Braunschweig)的骨髓瘤细胞系SP2/0-Ag14。该细胞系为BALB/c脾细胞与骨髓瘤细胞系P3x63Ag8之间的杂种(hybrid)。该细胞已被描述为不合成或分泌免疫球蛋白链，抗20μg/ml的8-氮杂鸟嘌呤并且在HAT(次黄嘌呤、氨基蝶呤、胸苷)培养基中不生长。将SP2/0细胞常规地于标准生长培养基(具有10%FCS)中维持在组织培养瓶中。在2周的时期后使用冷冻SP2/0细胞的新等分试样，以避免HGPRT-阳性回复体(revertant)的产生。骨髓瘤细胞经显示在所有支原体测试中为阴性的。

1.2用于免疫和筛选的抗原

使用针对CD28Fc的产生而描述的方法(Evans等人Nat Immunol.6,271-9(2005))制备重组蛋白PD-1Fc，将其在0.01M HEPES,150mMNaCl,pH 7.4中浓缩至5.1mg/ml。在还原和非还原条件下进行的抗原的SDS-PAGE分析确定，蛋白质的纯度大于95%。

1.3免疫

在60天内，使用免疫方案通过腹腔免疫5只小鼠(约8周龄)。为了进行免疫，制备免疫原的明矾沉淀。对于每一次加强，新鲜制备明矾沉淀。用50μg蛋白质免疫小鼠，用25μg蛋白质进行加强。将3只小鼠用于融合。

1.4细胞的一般操作

在无菌条件下使用分层式气流***、无菌材料和无菌溶液操作细胞。将细胞在37℃下于含有5%二氧化碳的潮湿大气中进行温育。为了培养杂交瘤细胞，使用完全生长培养基(CGM)，所述培养基包含补充有2-巯基乙醇、L-谷氨酰胺、GlutaMax、HT、非必需氨基酸、丙酮酸钠、抗生素/抗霉菌溶液(以提供商推荐的浓度)和不同浓度的FCS(10%、15%或20%)的DMEM。

1.5脾细胞和细胞融合物的制备

在CO₂中窒息3只免疫的小鼠后，无菌地取出脾。制备混合的脾的单细胞悬液。用DMEM洗涤脾细胞和骨髓瘤细胞数次，在1ml 50%(w/v)PEG 3550存在的情况下融合2次(脾细胞对SP2/0的比率2.5:1和2.4:1)。将产生的杂交瘤重悬浮于含有20%FCS和氨基蝶呤的CGM(HAT培养基)中。每一个融合物的细胞悬液(140Cl/孔)于含有20%FCS的CGM中铺板至8个含有140Cl/孔腹膜渗出细胞作为饲养细胞的96孔组织培养平底板(Corning-Costar)。将板温育10天。在该时期中，用HAT培养基饲养细胞2次。将脾细胞制备物的等分试样(约8x10⁶个脾细胞)于24孔板的孔中培养10天，细胞培养物上清液用作ELISA中的阳性对照。

1.6筛选测定

ELISA用于筛选细胞培养上清液中的IgG。用50μl/孔的于0.5M碳酸盐/碳酸氢盐缓冲剂,pH 9.6中的PD-1Fc抗原(5μg/ml)包被96孔平底聚苯乙烯微量滴定板(Greiner,Cat.No 655061)。在于保湿室中4℃下温育过夜后，用含有0.01%TritonX-100的tris-缓冲盐溶液(TBS,50mM Tris,pH 7.8,500mM氯化钠)(洗涤缓冲液)洗涤板，然后在摇床上用200μl/孔的TBS中的2%FCS(封闭缓冲液)在室温(RT)下温育1小时。用洗涤缓冲液洗涤孔，将100μl细胞培养上清液添加在适当的孔中。将来自SP 2/0骨髓瘤细胞的细胞培养上清液用作阴性对照。将来自脾细胞培养物的细胞培养上清液用作阳性对照。将板在摇床上于RT下温育1小时，然后洗涤数次。为了检测结合的抗体，在摇床上在RT下用50μl/孔的在封闭缓冲液中的缀合有碱性磷酸酶的山羊抗-小鼠IgG(Fab特异性)(1:5000)温育板1小时，然后洗涤数次，添加150μl/孔的底物缓冲液(5%二乙醇胺+0.5mM MgCl₂,pH9.8中的2mM 4-硝基苯基磷酸盐)。在12-信道Dynex Opsys MR微量板读数器中估计405nm处的光密度(OD)。将其OD405nm为平均板值的OD405nm的2倍的孔选择为阳性。

1.7稳定的抗体生产者的选择

将来自阳性I gG产生性培养物的细胞转移至48孔板的孔中，培养数天(取决于细胞的生长特征)。进行ELISA(在PD-1Fc上和在无预包被的抗原的情况下)以选择特异性结合剂。将来自ELISA-阳性孔的细胞冷冻在冷冻培养基(90%FCS,10%DMSO)中。进一步培养细胞的等分试样以产生细胞培养上清液，用于进一步的表征。

1.8有限稀释克隆

一旦鉴定阳性孔，就克隆杂交瘤细胞以减少非产生性细胞的过度生长的风险(第一次克隆)。为了确保抗体为真实单克隆的，再次克隆杂交瘤(第二次克隆)。将有限稀释的方法用于两个克隆过程。将I gG产生性细胞以每孔1-3个细胞的密度分配入一个含有饲养细胞的96孔板。在8-10天(取决于生长特征)后，在显微镜下视觉观察所有板以检测单克隆生长。使用上述筛选测定法，就特异性免疫球蛋白含量筛选来自这些孔的培养上清液。针对生长特征和ELISA信号选择适当的克隆，将其转移至24孔板的孔中，培养数天。进行筛选测定。重复该过程2至3次。分别选择适当的亚克隆以进行第二克隆法或进行培养(用于冷冻保存)。该方法导致称为克隆10的抗-PD-1抗体的产生。

1.9抗体的制备和分型

制备杂交瘤上清液，将其稀释至无菌无叠氮化物的PBS中。使用IsoStrip小鼠单克隆抗体分型试剂盒(Santa Cruz；s c-24958)以1μg/ml于PBS中对纯化的单克隆抗体原液进行分型。发现克隆10为同种型IgG_1К。

1.10克隆10的测序

克隆编码克隆10的基因，进行测序，并提供于图1中。该抗体命名为抗体CA051_00948(通常缩写成948)。

实施例2:抗体CA051_00948的人源化

抗体CA051_00948通过将来自小鼠抗体V-区的互补决定区(CDR)移植至人种系抗体V-区构架上来进行人源化。为了恢复抗体的活性，也将许多来自小鼠V-区的构架残基保留在人源化序列中。使用由Adair等人(1991)(Humani sed ant ibodies.WO91/09967)概述的方案选择这些残基。小鼠抗体(供体)V-区序列与人种系抗体(接纳体)V-区序列的比对与设计的人源化序列一起示于图13中。

从供体移植至接纳体序列的CDR如Kabat(Kaba t等人Sequenceof proteins of immunological interest(1987).Bethesda MD,National Institutes of Health,US)所定义，除其中使用组合的Chothia/Kabat定义的CDR-H1外(参见Adair等人(1991)Humanisedantibodies.WO91/09967)。

选择人V-区VH43-14-30.4+JH4J-区(V BASE,http://vba se.mrc-cpe.cam.ac.uk/)作为重链CDR的接纳体。重链构架残基全都来自人种系基因，除残基25、44、48和71(Kabat编号)外，其中供体残基苏氨酸(T25)、赖氨酸(K44)、甲硫氨酸(M48)和精氨酸(R71)分别得到保留。用谷氨酸(E1)替代人构架的位置1上的谷氨酰胺残基以提供均质产物的表达和纯化：抗体和抗体片段的N端上的谷氨酰胺至焦谷氨酸的转化已被广泛报导。

选择人V-区VK24-1-(1)A18+JK2J-区(V BASE,http://vbase.mrc-cpe.cam.ac.uk/)作为轻链CDR的接纳体。轻链构架残基全部来自人种系基因，除残基2、3、45、62和87(Kaba t编号)外，其中供体残基缬氨酸(V2)、亮氨酸(L3)、赖氨酸(K44)、异亮氨酸(I62)和苯丙氨酸(F87)分别得到保留。

由Entelechon GmbH通过自动化合成法设计和构建编码948.g1轻链和重链V-区序列的基因。将948.g 1轻链V-区基因序列克隆入UCB-Celltech人轻链表达载体pKH10.1，该载体包含编码人κ链恒定区(Km3同种异型)的DNA。将948.g 1重链V-区基因序列克隆入UCB-Celltech 人γ-4重链表达载体pVhγ4P FL(该载体包含编码具有铰链稳定化突变S241P的人γ-4重链恒定区的DNA(Angal等人,Mol Immunol.1993,30(1):105-8)。使用293Fectin(12347-019Invitrogen)将轻链和重链载体瞬时共转染入HEK293悬浮细胞，然后表达重组抗体948.g1。

序列提供于图3-11和图13中。

用于人源化的Ab948残基的概括

轻链

重链

或者

轻链

重链

实施例3.实施例2中产生的人源化抗体的表征

3.1抗体948嵌合体和948人源化移植物对细胞表达的PD-1的结合的流式细胞术分析

为了确定对抗体948的人源化是否改变其结合PD-1的能力，在表达PD-1的HEK293细胞上，对948(小鼠亲代)，948嵌合体和948人源化移植物进行结合比较。

方法

通过在6孔板中用5μg人PD-1DNA和293fectin(Invitrogen)以5x10⁶/孔培养HEK293细胞过夜来瞬时转染所述细胞。第2天，将表达PD-1的HEK293细胞在4℃下用指定浓度的948嵌合、948人源化移植物、948嵌合(纯化的)或948鼠亲代(纯化的)抗体温育1小时。用PBS洗涤细胞，然后用适当的二抗，FITC小鼠抗IgG(05-4211Zymed,1:20稀释)或者大鼠抗小鼠IgG(04-6111Zymed,1:20稀释)在4℃下温育1小时。在FACSCalibur(Becton Dickinson)上进行流式细胞术分析。

结果

图12中所示的流式细胞术结合曲线显示，抗体948的所有形式都特异性结合细胞表达的PD-1，并且948的人源化移植物以与抗体的亲代和嵌合形式等同或更大的效率结合人PD-1。

当然应理解，本发明已仅通过举例说明的方式进行了描述，其决不意味着是限定性的，并且可在下文权利要求书的范围内对细节进行变动。本发明的各个实施方案的优选特征在细节上做必要修正后可用于每一个其它实施方案。本说明书中引用的所有公开案，包括但不限于专利和专利申请，通过引用并入本文，就如同明确且单独地指明每一个公开案通过引用整体并入本文一样。

Claims

1.结合人PD-1的包含重链的人源化激动性抗体，其中所述重链的可变结构域包含SEQ ID NO:1中给出的CDR-H1的序列、SEQ ID NO:2中给出的CDR-H2的序列和SEQ ID NO:3中给出的CDR-H3的序列，并且重链构架区来源于人亚组序列VH4 3-1 4-30.4+JH4(SEQ ID NO:33)。

2.权利要求1的人源化抗体，其中所述重链的可变结构域的位置25、44、48和71中的至少一个上的残基为供体残基。

3.权利要求2的人源化抗体，其具有SEQ ID NO:23中给出的重链可变结构域序列。

4.结合人PD-1的包含轻链的人源化激动性抗体，其中所述轻链的可变结构域包含SEQ ID NO:4中给出的CDR-L1的序列、SEQ ID NO:5中给出的CDR-L2的序列和SEQ ID NO:6中给出的CDR-L3的序列，并且轻链构架区来源于人亚组序列VK2 4-1-1 A18+JK2(SEQ ID NO:31)。

5.权利要求4的人源化抗体，其中所述轻链的可变结构域的位置2、3、45、62和87中的至少一个上的残基为供体残基。

6.权利要求5的人源化抗体，其具有SEQ ID NO:15中给出的轻链可变结构域序列。

7.结合人PD-1的具有重链和轻链的人源化激动性抗体，其中所述重链包含SEQ ID NO:23中给出的序列，并且所述轻链包含SEQ IDNO:15中给出的序列。

8.权利要求1至7的任一项的激动性抗体分子，其中所述抗体分子选自：具有全长重链和轻链的完全抗体分子或其片段，例如Fab、经修饰的Fab'、Fab'、F(ab')₂、Fv、VH、VL或s cFv片段。

9.结合人PD-1的人源化激动性抗体，其中轻链的可变结构域包含与权利要求7的抗体的轻链可变结构域具有至少80%的同一性或相似性的序列，并且其中重链的可变结构域包含与权利要求7的抗体的重链可变结构域具有至少80%的同一性或相似性的序列。

10.分离的DNA序列，其编码权利要求1至9的任一项的抗体的重链和/或轻链。

11.克隆性或表达载体，其包含一个或多个权利要求10的DNA序列。

12.宿主细胞，其包含一个或多个权利要求11的克隆性或表达载体。

13.用于产生权利要求1至9的任一项的抗体的方法，包括培养权利要求12的宿主细胞和分离所述抗体。

14.一种药物组合物，其包含与药学上可接受的赋形剂、稀释剂或载体中的一种或多种组合的权利要求1至9的任一项的抗体。

15.权利要求14的药物组合物，其还包含其它活性成分。

16.权利要求1至9的任一项的抗体或权利要求14或权利要求15的药物组合物，用于治疗或预防免疫障碍。

17.权利要求1至9的任一项的抗体在制造用于治疗或预防免疫障碍的药物中的用途。