CN108546298A

CN108546298A - 一种特异性结合pd-1的单克隆抗体

Info

Publication number: CN108546298A
Application number: CN201810273628.7A
Authority: CN
Inventors: 陈国江; 罗龙龙; 冯健男; 乔春霞; 李新颖; 肖鹤; 吕忠霖; 沈倍奋
Original assignee: Institute of Pharmacology and Toxicology of AMMS
Current assignee: Institute of Pharmacology and Toxicology of AMMS
Priority date: 2018-03-29
Filing date: 2018-03-29
Publication date: 2018-09-18
Anticipated expiration: 2038-03-29
Also published as: CN108546298B

Abstract

本发明公开了一种特异性结合PD‑1蛋白的单克隆抗体或其抗原结合片段，本发明的单克隆抗体能特异性与PD‑1蛋白结合，并能阻断PD‑L1与PD‑1结合。本发明的抗体可以用于***，在临床上具有广泛的应用前景。

Description

一种特异性结合PD-1的单克隆抗体

技术领域

本发明属于细胞免疫学、分子生物学领域，涉及一种特异性结合PD-1的单克隆抗体。

背景技术

癌症是严重威胁人类健康的疾病之一，我国每年癌症的发病率和死亡率居高不下。单克隆抗体因治疗效果好、靶点明确、副作用小等优势广泛应用于肿瘤的治疗。随着抗体工程技术的发展以及对肿瘤发病机理深入认识，抗体用于肿瘤治疗的策略除了直接靶向癌细胞表面癌抗原分子(如CD20，HER2等)还发展了许多新的治疗策略。如靶向肿瘤微环境血管生成因子VEGF切断肿瘤营养供给来源；阻断CTLA4，PD-1等免疫检查点分子增强T细胞杀伤肿瘤活性，或者基于ScFv结构设计CART(Chimeric Antigen Receptor-Modified TCells)或双功能抗体(如BITE)等新型的抗体模式；也有基于“裸抗”偶联放射性物质、毒素物质增强杀伤肿瘤的活性。其中，抗体靶向免疫卡控点分子如CTLA-4，PD-1，PD-L1以及基于新型抗体结构的CART细胞在临床上取得的突出的疗效让沉寂多年的肿瘤免疫疗法再次出现在公众视野。据此，2013年《科学》杂志将肿瘤免疫治疗列为十大科学突破之首。而抗体靶向PD-1分子在临床上显著的抗肿瘤活性以及广泛的抗肿瘤效应是目前肿瘤免疫治疗中最具前景的治疗策略。

PD-1(程序性死亡受体-1)是一类重要的免疫负性调控分子(也称“免疫检查点分子”)，属于CD28超家族成员。结构上，该分子由268个氨基酸组成的I型跨膜糖蛋白，由胞外区、跨膜区和胞内区三部分构成。其中，PD-1分子的胞外区是一个免疫球蛋白样可变区(IgV)结构域，胞内部分含有一个免疫受体酪氨酸抑制基序(immunoreceptor tyrosinebased inhibitory motif,ITIlVI)和一个免疫受体酪氨酸转换基序(immunoreceptortyrosine based switch motif,ITSM)，文献报道，ITSM是PD-1分子向胞内传递抑制信号的关键基序。功能上，PD-1与其配体PD-L1或PD-L2相互作用可下调T细胞活性或导致T细胞“失能”。在生理条件下，T细胞活化过程中，PD-L1分子组成性表达在APC细胞表面，维持T细胞免疫稳态。而在许多肿瘤环境中，肿瘤细胞高表达PD-L1分子与肿瘤浸润的T淋巴细胞表面的PD-1分子结合下调T细胞活性，进而使得肿瘤逃逸免疫***的杀伤。由于PD-1,PD-L1广泛参与到肿瘤的免疫逃逸过程，而通过阻断PD-1/PD-L1信号通路能够有效释放T淋巴细胞杀伤肿瘤的活性。因此，国外各大制药公司纷纷针对这两个热门靶点研发相应治疗性抗体。其中，针对PD-1的抗体药物进展迅速。代表性的公司有百时美施贵宝(BMS)研发的nivolumab(商品名为Opdivo)和默沙东的embrolizumab(商品名为Keytruda)。其中，BMS研发的nivolumab进展最快，己经在转移性恶性黑色素瘤、鳞状非小细胞肺癌、肾癌获得FDA上市批准，而且，nivolumab单独使用或者联合其它药物在多种肿瘤适应症上开展临床试验。而我国还没有自主研发的针对PD-1的抗体获得上市批准。因此，筛选更多的全新抗PD-1单抗药物不仅有助于提高我国抗体药物国际地位，而且能够帮助打破国外大制药的公司专利保护下价格垄断的壁垒。

发明内容

本发明的目的之一在于提供一种特异性结合PD-1的单克隆抗体，具有高效和安全的特点。

本发明的目的之二在于提供上述抗体的重链、轻链或其片段。

本发明的目的之三在于提供编码上述单克隆抗体或其抗原结合片段的核酸分子或其片段，以及***这些核酸分子以用于重组表达上述抗体的重组载体和重组细胞。

本发明的目的之四在于提供上述单克隆抗体的制备方法和用途。

为了实现上述目的，本发明采用了如下技术方案：

本发明提供了一种特异性结合PD-1蛋白的单克隆抗体或其抗原结合片段，所述单克隆抗体或其抗原结合片段包括轻链CDR1、轻链CDR2、轻链CDR3、重链CDR1、重链CDR2和重链CDR3；

重链CDR1具有SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列或与其具有至少80％同源性的氨基酸序列；

重链CDR2具有SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列或与其具有至少80％同源性的氨基酸序列；

重链CDR3具有SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列或与其具有至少80％同源性的氨基酸序列；

轻链CDR1具有SEQ ID NO:4所示的氨基酸序列或与其具有至少80％同源性的氨基酸序列；

轻链CDR2具有SEQ ID NO:5所示的氨基酸序列或与其具有至少80％同源性的氨基酸序列；

轻链CDR3具有SEQ ID NO:6所示的氨基酸序列或与其具有至少80％同源性的氨基酸序列。

优选地，重链CDR1具有SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列；重链CDR2具有SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列；重链CDR3具有SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列；轻链CDR1具有SEQ IDNO:4所示的氨基酸序列；轻链CDR2具有SEQ ID NO:5所示的氨基酸序列；轻链CDR3具有SEQID NO:6所示的氨基酸序列。

进一步，所述单克隆抗体的重链可变区具有SEQ IDNO:7所示的氨基酸序列或与其具有至少80％同源性的氨基酸序列，所述单克隆抗体的轻链可变区具有SEQ ID NO:8所示的氨基酸序列或与其具有至少80％同源性的氨基酸序列。

优选地，所述单克隆抗体的重链可变区具有SEQ IDNO:7所示的氨基酸序列；所述单克隆抗体的轻链可变区具有SEQ ID NO:8所示的氨基酸序列。

包括优选抗体氨基酸序列的保守序列变体的抗体也包括在本发明的范围之内。保守氨基酸序列变体包括不显著改变本发明的单克隆抗体结合性质的氨基酸序列的修饰，如源于本领域熟知的相似氨基酸替代的变体，氨基酸的缺失、增加导致的变体。

本发明的单克隆抗体还包括人源与非人源抗体，以及具有与上述单克隆抗体相同功能或改造及优化的一切抗体。

进一步，所述单克隆抗体的抗原结合片段包括Fab、Fab′、F(ab′)2、Fv或单链抗体。

Fab是指含有一条轻链的可变区和恒定区和一条重链的可变区和恒定区经二硫键结合起来的抗体分子的一部分。

Fab’是指包含了部分铰链区的Fab片段。

F(ab’)2指的是Fab’的二聚体。

Fv指的是含有抗体重链可变区、轻链可变区并具有全部抗原结合位点的最小抗体片段。

单链抗体指的是由轻链可变区与重链可变区直接相连或通过一个肽链连接而成的工程抗体。

本发明的公开的单克隆抗体可以在重链和轻链可变区包含一个或多个糖基化位点，如本领域内熟知的，在可变区中存在的一个或多个糖基化位点可以导致增强的抗体免疫原性，或者由于改变了抗原结合而改变抗体的药物动力学。

本发明的单克隆抗体可以被设计为在Fc区域内包含修改，通常是改变抗体的1个或多个功能特性，如血清半衰期、补体结合、Fc受体结合、和/或抗原依赖的细胞毒性。此外，本发明的抗体可以被化学修饰(如，可以将一个或多个化学基团连接于抗体)，或被修饰以改变其糖基化，从而再改变抗体的一个或多个功能特性。

本发明的单克隆抗体可以被设计的另一个修饰是聚乙二醇化。抗体可被聚乙二醇化，从而，例如，增加抗体的生物(如血清)半衰期。为了使抗体聚乙二醇化，该抗体或其片段通常在适合于一个或多个聚乙二醇(PEG)基团连接到该抗体或抗体片段的条件下，与PEG反应，如聚乙二醇的活性酯或醛衍生物。优选地，该聚乙二醇化是通过与活性的PEG分子(或类似的活性水溶性聚合物)进行酰化反应或烷基化反应而实现。

本发明还提供了编码前面所述的单克隆抗体或其抗原结合片段的核酸分子，所述核酸分子包括编码单克隆抗体轻链可变区的核苷酸序列，编码单克隆抗体重链可变区的核苷酸序列，编码单克隆抗体重链的核苷酸序列，或编码单克隆抗体轻链的核苷酸序列。

本发明的编码前面所述的单克隆抗体或其抗原结合片段的核酸分子包括具有优选的核苷酸序列的保守核苷酸序列变体的核酸分子。所谓的保守核苷酸序列变体源于遗传密码简并和沉默的变体，核苷酸的替代、缺失和增加也包含在内。

本发明还提供了一种重组载体，所述重组载体包含前面所述的核酸分子，此外，还包括与所述核酸分子序列操作性相连的表达调控序列。

本发明中“载体”一词指的是，可将编码某蛋白的多聚核苷酸***其中并使蛋白获得表达的一种核酸运载工具。载体可通过转化、转导或转染宿主细胞，使其携带的遗传物质元件在宿主细胞内得以表达。举例来说，载体包括：质粒；噬菌粒；柯斯质粒；人工染色体如酵母人工染色体(YAC)、细菌人工染色体(BAC)或P1来源的人工染色体(PAC)；噬菌体如λ噬菌体或M13噬菌体及动物病毒等。用作载体的动物病毒种类有逆转录病毒(包括慢病毒)、腺病毒、腺相关病毒、疱疹病毒(如单纯疱疹病毒)、痘病毒、杆状病毒、***瘤病毒、***多瘤空泡病毒(如SV40)。一种载体可能含有多种控制表达的元件，包括启动子序列、转录起始序列、增强子序列、选择元件及报告基因。另外，载体还可含有复制起始位点。载体还有可能包括协助其进入细胞的成分，如病毒颗粒、脂质体或蛋白外壳，但不仅仅只有这些物质。

本发明还提供了一种重组细胞，所述重组细胞中导入了前面所述的核酸分子或转染了前面所述的重组载体。

本发明中“重组细胞”一词指的是导入核酸分子或载体的细胞，包括如下许多细胞类型，如大肠杆菌或枯草菌等原核细胞，如酵母细胞或曲霉菌等真菌细胞，如S2果蝇细胞或Sf9等昆虫细胞，或者如纤维原细胞，CHO细胞，COS细胞，NSO细胞，HeLa细胞，BHK细胞，HEK293细胞或人细胞的动物细胞。

在本发明的具体实施方案中，所述重组细胞是293细胞。

本发明还提供了一种利用前面所述的重组细胞产生抗体或抗原结合片段的方法，所述方法包括在合适的条件下培养前面所述的重组细胞并回收所述抗体。

本发明还提供了一种通过上述方法产生的抗体或抗原结合片段。

本发明还提供了一种检测产品，所述检测产品包括本发明前面所述的单克隆抗体或其抗原结合片段。

所述检测产品包括但不限于检测试剂、试剂盒、芯片或试纸。凡是能够检测出PD-1表达量的检测产品均包括在本发明的范围之内。

本发明还提供了一种药物组合物，所述药物组合物包括治疗有效量的本发明的前面所述的单克隆抗体或其抗原结合片段。

进一步，所述药物组合物还包括可药用载体或稀释剂。可以用任何适当的药用载体施用根据本发明的药物组合物用于治疗。

用于肠胃外给药和局部给药时，本发明的药物组合物包括无菌水或非水溶剂、悬液和乳剂。非水溶剂的例子是丙二醇、聚乙二醇、植物油、鱼油、和可注射的有机酯。水性载体包括水、水-乙醇溶液，其中包括盐和缓冲的一般肠胃外载体，其包括氯化钠溶液、林格氏葡萄糖溶液、葡萄糖加氯化钠溶液、含有乳糖的林格氏液、或非挥发性油。静脉载体包括流体和营养补充剂、电解质补充剂，如那些基于林格氏葡萄糖等的电解质补充剂。组合物可能包括其它赋形剂，如稳定化试剂或防腐剂。实用的稳定赋形剂包括表面活性剂(聚山梨酯20&80、泊咯沙姆407)、聚合物(聚乙二醇，聚乙烯吡咯酮)、糖类(蔗糖、甘露醇、葡萄糖、乳糖)、醇(山梨醇，甘油丙二醇，乙二醇)、适当的蛋白质(白蛋白)、合适的氨基酸(甘氨酸，谷氨酸)、脂肪酸(乙醇胺)、抗氧化剂(抗坏血酸，半胱氨酸等)、螯合剂(EDTA盐类、组氨酸、天门冬氨酸)或金属离子(钙、镍、镁、锰)。有用的防腐剂有苯甲醇、氯代丁醇、苯扎氯铵，也可使用对羟基苯甲酸酯类。

可以以浓缩的形式或者以粉末的形式以根据需要重构提供根据本发明的药物组合物。这样的粉剂可以使用上述赋形剂。在冷冻干燥的情况下，某些冷冻保护剂是优选的，其包括聚合物(聚乙烯吡咯酮、聚乙二醇、葡聚糖)、糖(蔗糖、葡萄糖、乳糖)、氨基酸(甘氨酸、精氨酸、谷氨酸)和白蛋白。

本发明的药物组合物可以与其他抗肿瘤药联合使用，所述抗肿瘤药，所述的抗肿瘤药物包括目前经过FDA批准的所有抗肿瘤药。

所述的抗肿瘤药包括经FDA批准的药物或未批准的药物。

所述的抗肿瘤药包括已知靶向抗肿瘤药与未知靶向抗肿瘤药。

所述的抗肿瘤药还包括任意的化疗药或化合物。

所述的抗肿瘤药还包括RNA药物、蛋白或多肽药物、抗体药物、基因治疗药物。

靶向抗肿瘤药包括(但不限于)17-AAG、2-deoxyglucose、阿比特龙(Abiraterone)、ABT-263、AC-220、AT-406、AZD4547、AZD5363、AZD7762、BI-2536、Birinapant、BMS-754807、硼替佐米(Bortezomib)、BX-795、卡博替尼(Cabozantinib)、CAL-101、卡非佐米(Carfilzomib)、克唑替尼(crizotinib)、danusertib、达沙替尼(Dasatinib)、Dovitinib、Elesclomol、Embelin、恩替诺特(Entinostat)(MS-275)、Enzastaurin、依维莫司(Everolimus)、Foretinib、氟维司群(Fulvestrant)、Ganetespib、GDC0941、GSK429286A、JQ1、KU-55933、KX2-391、Lenvatinib、Linifanib、Linsitinib、LY2157299、Masitinib、MK-1775、MK-2206、MLN-4924、Neratinib、NU7441、Nutlin-3、NVP-BEZ235、NVP-BKM120、Orantinib、PCI-32765、PD-0325901、PD-0332991、PD-173074、PH-797804、PRT062607、R-406、Refametinib、瑞戈非尼(Regorafenib)、SCH900776、sgi-1776、索拉非尼(Sorafenib)、舒尼替尼(Sunitinib)、TAE684、替西莫司(Temsirolimus)、TG-101348、Tideglusib、Tipifarnib、Tivantinib、Toremifene、Tozasertib、曲美替尼(Trametinib)、维甲酸(Tretinoin)、Triptolide、伐地考昔(Valdecoxib)、维莫德吉(Vismodegib)、Volasertib、伏立诺他(Vorinostat)、YM-155、CHIR-99021、NVP-BGJ398、LY2090314。

所述的化疗药包括(但不限于)六甲蜜胺、氨鲁米特、阿那罗唑、阿扎胞苷、苯达莫司汀、白消安、卡巴他赛、卡培他滨、卡铂、顺铂、克拉曲滨、氯法拉宾、环磷酰胺、阿糖胞苷、达卡巴嗪、柔红霉素、地西他滨、多西他赛、多柔比星、表柔比星、依托泊甙、伊西美坦、氟尿苷、氟达拉滨、氟尿嘧啶、吉西他滨、羟基脲、依达比星、异环磷酰胺、伊立替康、来那度胺、来曲唑、亚叶酸、洛莫司丁、6-巯基嘌呤、美司钠、甲胺喋呤、米托坦、米托蒽醌、奥沙利铂、紫杉醇、奈拉滨、培美曲塞、喷司他汀、普拉曲沙、甲苄肼、雷替曲噻、链脲霉素、替莫唑胺、替尼泊苷、硫鸟嘌呤、拓扑替康、长春花碱、长春瑞滨、唑来膦酸。

本发明还提供了一种非诊断目的的检测PD-1蛋白表达水平的方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：

(1)提取含有PD-1蛋白的样品；

(2)将步骤(1)获取的样品与前面所述的特异性结合PD-1蛋白的单克隆抗体或其抗原结合片段接触；

(3)检测样品与抗体或其抗原结合片段的免疫反应。

本发明还提供了前面所述的单克隆抗体或其抗原结合片段在制备检测PD-1蛋白表达量的产品中的应用。

所述检测产品包括但不限于检测试剂、试剂盒、芯片或试纸。

本发明还提供了前面所述的单克隆抗体或其抗原结合片段在制备治疗免疫障碍的药物中的应用。

可通过给受试者施用PD-1特异性抗体来治疗的免疫障碍的非限定性实例包括但不限于，类风湿性关节炎、多发性硬化、炎性肠病、克罗恩病、全身性红斑狼疮、I型糖尿病、移植排斥、移植物抗宿主病、过度增生性免疫障碍、肿瘤和感染性疾病。

本发明的单克隆抗体或其抗原结合片段可以用于治疗的肿瘤种类没有特别限制，任何实体的、非实体的、恶性的或良性的肿瘤均包括在本发明的范围之内。肿瘤的实例包括但不限于：皮肤癌，白血病，肾上腺皮质癌，胆管癌，膀胱癌，骨癌，脑癌，乳腺癌，气管及支气管肿瘤，淋巴瘤，神经***肿瘤，***，肠癌，***癌，子宫内膜癌、食管癌，鼻咽癌，卵巢癌，肉瘤，眼癌，恶性纤维组织细胞癌，胆囊癌，胃癌，结直肠癌、胃肠道类癌瘤，胃肠道间质瘤，胚细胞瘤，头颈癌，肝癌，下咽癌，黑色素瘤，胰腺癌，肾癌，喉癌，唇癌，口腔癌，口咽癌，肺癌，间皮瘤，骨髓瘤，甲状旁腺癌，***癌，嗜络细胞瘤，垂体瘤，***癌，视网膜母细胞瘤，涎腺癌，皮肤癌，睾丸癌，喉癌，胸腺瘤，甲状腺癌，尿道癌，***癌，外阴癌。

本发明前面所述的单克隆抗体或其抗原结合片段可以以化学方法或者通过基因工程与其他因子缀合。这些因子提供将抗体靶向所需功能位点的作用或者为抗体提高或提供其他性能。

根据本发明的单克隆抗体可以以化学方法或者通过基因工程标记，以提供可检测的抗体。

本发明的“治疗”意在包括为受治疗者施用特异性结合PD-1的单克隆抗体，其目的包括改善、***。

本发明的“治疗有效量”是指对肿瘤的有害影响至少有所改善的水平。本领域技术人员能很容易地确定本发明的单克隆抗体的给药量和方案。

本发明的“PD-1”与“PD-1蛋白”通用。

本发明的优点和有益效果：

本发明提供了一种新的特异性结合PD-1的单克隆抗体，该抗体具有亲和力高，无副作用，成本低廉，成分清晰，实现生产标准化，质量控制简单等竞争优势。

附图说明

图1显示pcDNA^TM5/FRT的物理图谱；

图2显示利用琼脂糖电泳检测PCR产物和酶切产物的电泳图，其中：A：Kappa-BGHpoly A片段PCR产物，泳道1代表DL2000，泳道2代表PCR产物，B：Kappa-BGH poly A片段XbaI，BamHI酶切，泳道1代表DL2000，泳道2代表酶切片段，C：PCMV/T7片段PCR产物，泳道1代表DL2000，泳道2代表PCR产物，D：PCMV/T7片段BamHI，NotI酶切，泳道1代表DL2000，泳道2代表酶切片段，E：重链恒定区片段PCR产物，泳道1代表DL2000，泳道2代表PCR产物，F：重链恒定区片段NotI，PmeI酶切，泳道1代表DL2000，泳道2代表酶切产物。

图3显示利用显示利用琼脂糖电泳检测构建载体的酶切产物电泳图，其中泳道1代表DL2000，泳道2代表EcoRI酶切片段，泳道3代表HindIII酶切片段，泳道4代表Bsiwl酶切片段，泳道5代表ClaI酶切片段，泳道6代表NheI酶切片段，泳道7代表XbaI酶切片段，泳道8代表BamHI+NotI酶切片段，泳道9代表NotI+PmeI酶切片段；

图4显示PRT/KIgGl载体的结构示意图；

图5显示利用双夹心ELISA检测抗体表达量的统计图；

图6显示利用间接ELISA检测抗体结合能力的曲线图；

图7显示利用间接ELISA检测抗体结合特异性的统计图；

图8显示利用Biacore检测抗体亲和能力的曲线图；

图9显示利用ELISA检测抗体竞争结合抗原的结合曲线图；

图10显示利用ELISA检测抗体对T细胞IFN-γ表达的影响的统计图；

图11显示利用ELISA检测抗体对CD4⁺T细胞IFN-γ表达的影响的统计图。

具体实施方式

下面通过实施例进一步说明本发明。应该理解的是，本发明的实施例是用于说明本发明而不是对本发明的限制。根据本发明的实质对本发明进行的简单改进都属于本发明要求保护的范围。

实施例1 抗PD-1抗体制备

1、PRT/KIgG1全长抗体表达载体构建

构建全长抗体表达载体需要在pcDNA^TM5/FRT载体骨架(图1)的基础上依次引入轻链可变区克隆位点、CK基因、BGH polyA、PCMV/T7启动子基因序列、抗体重链可变区克隆位点、抗体重链恒定区基因等。

采用overlap PCR、定点克隆等分子生物学手段构建全长抗体表达载体，所用引物如下：

Kappa-BGH poly A基因序列引物

P-Kappa-TY：

5’-CCTCTAGAGAATTCAAGCTTTAGCGTACGGTGGCTGCACCATC-3’

Kappa-BGH3：

5’-GTCGAGGCTGATCAGCGGCTAACACTCTCCCCTGTTG-3’

Kappa-BGH5：

5’-CAACAGGGGAGAGTGTTAGCCGCTGATCAGCCTCGAC-3’

Kappa3：

5’-CCGGATCCACATTCCACAGGGGCCATCC-3’

PCMV/T7基因序列引物

Pcmv/t7-up:5’-GGGGATCCTAGTTATTAATAGTAATCAA-3’

Pcmv/t7-down:5’-GCGGCCGCTTGGGTCTCCCTATAGTGAG-3’

Heavy链恒定区基因引物：

P-Ig G1H-TY：

5’-ATCGGCGGCCGCGAATTCATCGATTAGGCTAGCACCAAGGGCCCATC-3’

Heavy-3：

5’-GTTTAAACTCATTTACCCGGAGACAGGGAGAGGCTCTTCTGCGTGTA-3’。

借助overlap PCR将轻链可变区克隆位点(酶A、酶B)、Kappa链恒定区、BGH Poly A序列进行拼接，获得大小为650bp目标片段，并构建T载体，酶切测序正确(图2A，B)，通过XbaI，BamHI酶切位点克隆入pcDNA^TM5/FRT载体。在此基础上，通过BamHI，NotI酶切位点，将测序正确的PCMV/T7启动子基因序列(图2C，D)克隆入载体中。

PCR拼接重链可变区克隆位点(酶C，酶D)，IgGl重链恒定区基因序列(CH1，CH2，CH3获得大小约1000bp的目标片段，克隆T载体，测序正确(图2E，F)，并通过NotI，PmeI酶切位点定向克隆入前述载体中。

根据载体构建过程，以及载体自身的酶切位点特征，选择EcoRI，HinIII，BsiwI，C1aI，NheI，Xbai对目标载体进行酶切鉴定(图3)。理论上，该载体中一共含有3个EcoRI酶切位点，ECORI单酶切将载体切成三条线性片段，结果与预期相符；HinIII，BsiwI，C1aI，NheI，Xbai均为载体中单一酶切位点，将载体切成单一的线性片段，结果与预期相符。进一步分别用酶BamHI+NotI以及NotI+PmeI进行酶切(图3泳道8,9)，分别获得载体大片段与PCMV/T7(约650bp)以及Heavy表达盒(约1000bp)小片段，与预期一致。

上述结果表明，目标载体构建成功，命名为PRT/KIgGl，其结构示意图见图4。理论而言，该载体适用于各种全长抗体的表达。

2、抗PD-1抗体表达量测定

(1)利用基因合成的方法合成抗体重链可变区序列(序列如SEQ ID NO.7所示)、轻链可变区序列(序列如SEQ ID NO.8所示)，并将其利用分子克隆的方法将片段克隆入PRT/KIgGl中。

(2)瞬时转染

将处于对数生长期的293T细胞以5*10⁵个/孔密度接种于6孔板中，12h后弃换新鲜培养基。4μg抗体表达质粒加入250μL MEM培养基中，充分混匀后往里加8μLLipofectamine^TM 2000脂质体，混匀室温放置20min，将混合物加入对应的6孔板中，培养48h后收获上清，同时以PRT/KIgGl-MIL75载体(MIL75的重链可变区序列为：QVQLVESGGGVVQPGRSLRLDCKASGITFSNSGMHWVRQAPGKGLEWVAVIWYDGSKRYYADSVKGRFTISRDNSKNTLFLQMNSLRAEDTAVYYCATNDDYWGQGTLVTVSS；轻链可变区序列为：EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASQSVSSYLAWYQQKPGQAPRLLIYDASNRATGIPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQQSSNWPRTFGQGTKVEIK)作为对照。

(3)双夹心ELISA测定瞬时表达上清中抗体表达量

用包被液稀释GAH-IgG抗体至2μg/mL，100μL每孔加入酶联板中，置于湿盒中4℃过夜。洗板机清洗酶联板3次，1.5％酪蛋白封闭，每孔200μL，湿盒37℃封闭lh。1xPBS稀释Herceptin至0.5μg/mL，在此基础上进行2倍稀释获得8个浓度梯度，同时用1xPBS稀释瞬时表达上清至625倍、3125倍、15625倍。将Herceptin与瞬时表达上清按照100μL/每孔加入酶联板中37℃反应1h，清洗酶联板3次，加入羊抗人酶标二抗室温反应45min，清洗酶联板5次并加入100μL TMB底物显色，反应3min并用100μL 2N H₂SO₄终止反应，酶联免疫检测仪450nm读数。以标准品浓度LN值为横坐标，相应的OD值为纵坐标，绘制一条标准曲线并添加线性回归曲线及其相关系数R²(R²>0.95)，并用y＝kx+b直线方程计算样品中抗体浓度。

(4)结果

结果如图5所示，利用上述方法能够表达出抗PD-1抗体。

实施例2 抗PD-1抗体结合能力测定

1、抗体大量表达与纯化鉴定

将抗体表达质粒按照以上的转染方法大量转染293T细胞并利用Protein A纯化获得抗体的纯化样品。

2、间接ELISA检测抗体抗原结合能力

2.1步骤

包被液稀释PD-1/Fc抗原至1μg/mL，100μL每孔加入酶联板中，置于湿盒中4℃过夜。洗板机清洗酶联板3次，1.5％酪蛋白封闭，每孔200μL，湿盒37℃封闭1h。用1xPBS稀释抗体至3μg/mL，并以100μL每孔加入酶联板中，湿盒中37℃反应1h，清洗酶联板3次，加入羊抗人(Fab')2-HRP二抗室温反应45min，清洗酶联板5次并加入100μLTMB底物显色，反应3min并用100μL 2N H₂SO₄终止反应，酶联免疫检测仪450nm读数。并以抗体浓度为横坐标，OD值为纵坐标绘制抗体-抗原结合曲线。利Graphpad分析软件拟合四参数方程曲线，方程为y＝(A-D)/(1+(X/C)^B)+D，其中B代表斜率，C代表EC50。

2.2结果

结果如图6所示，本发明制备的抗PD-1抗体结合活性与MIL75相近，能够特异性识别固相载体上的PD-1抗原分子，且随着抗体浓度的增加抗原一抗体之间结合具有良好的剂量依赖性。

3、抗体结合抗原特异性检测

3.1步骤

包被液稀释PD-1/Fc，CD28/Fc，CTLA4/Fc，BTLA/Fc，ICOS/Fc抗原至1μg/mL，100μL每孔加入酶联板中，以平行孔作为复孔。置于湿盒中4℃过夜。洗板机清洗酶联板3次，1.5％酪蛋白封闭，每孔200μL，湿盒中37℃封闭1h。用1xPBS稀释抗体至1μg/mL，并以100μL每孔加入酶联板中，湿盒中37℃反应1h，清洗酶联板3次，加入羊抗人(Fab')a-HRP二抗室温反应45min，清洗酶联板5次并加入100μL TMB底物显色，反应5min并用100μL 2N H₂SO₄终止反应，酶联免疫检测仪450nm读数。并以抗体名称为横坐标，OD值为纵坐标绘制柱形图。

3.2结果

结果如图7所示，本发明制备的抗PD-1抗体只特异性识别PD-1分子，而与其他分子不存在交叉识别现象。

4、抗PD-1抗体亲和力测定

4.1步骤

利用Biacore测定抗体的亲和力。

将抗人Fab抗体偶联到CM5芯片上，将抗体样品稀释到1-2μg/ml并以30ml/min流速进样60-150秒。将PD-1/Fc融合蛋白进行梯度稀释至浓度为3.125，6.25，12.5，25，50，100nM并以30μL/min流速进样抗原结合120秒，解离1200S。实验结束后用10mM Glycine-HClpH2.1进行再生60秒。利用Biacore T200分析软件分析结果。

4.2结果

结果如表1所示，本发明制备的抗PD-1抗体与MIL75的亲和力相当，图8是抗体的亲和力动力学曲线(选择3.125nM、6.25nM、12.5nM、25nM、50nM五个浓度进行拟合)。

表1抗体亲和力测定结果

	Ka(1/Ms)	Kd(1/s)	KD(M)
				MIL75	5.594E+5	7.900E-5	1.412E-10
本发明制备抗体	4.575E+5	6.405E-5	1.400E-10

实施例3 抗PD-1抗体阻断PD-1/PD-L1作用

1、ELISA检测PDL1/Fc-Biotin与PD-1结合活性

1.1步骤

包被液稀释PD-1/Fc抗原至1μg/mL，100μL每孔加入酶联板中，置于湿盒中4℃过夜。洗板机清洗酶联板3次，1.5％酪蛋白封闭，每孔200μL，湿盒37℃封闭1h。用1xPBS稀释PD-L1/Fc-Biotin至48μg/mL，进行3倍稀释共获得12个浓度点。以100μL每孔加入酶联板中，湿盒中37℃反应1h，清洗酶联板3次，加入Peroxidase-Labeled Streptavidin(1:4000)室温反应45min，清洗酶联板5次并加入100μL TMB底物显色，反应3min并用100μL 2N H₂SO₄终止反应，酶联免疫检测仪450nm读数。以PD-L1/Fc-Biotin浓度为横坐标，OD值为纵坐标绘制PD-1/PD-L1结合曲线，选取PD-L1结合PD-1最低饱和浓度进行抗体阻断实验。

1.2结果

摸索出PD-L1/Fc-Biotin参与结合固相抗原PD-1分子最低饱和浓度为5μg/mL。

2、抗体阻断PD-1/PD-L1相互作用

2.1步骤

包被液稀释PD-1/Fc抗原至1μg/mL，100μL每孔加入酶联板中，置于湿盒中4℃过夜。洗板机清洗酶联板3次，1.5％酪蛋白封闭，每孔200μL，湿盒37℃封闭lh。用1xPBS稀释PD-L1/Fc-Biotin至5μg/mL，以上述溶液作为稀释液稀释抗体至抗体浓度500μg/mL，并进行5倍稀释共获得12个浓度梯度。100μL每孔加入酶联板中湿盒中37℃反应1h，清洗酶联板3次，加入Peroxidase-Labeled Streptavidin(1:4000)室温反应45min，清洗酶联板5次并加入100μL TMB底物显色，反应3min并用100μL2N H₂SO₄终止反应，酶联免疫检测仪450nm读数。以抗体浓度为横坐标，OD值为纵坐标绘制结合曲线。

2.2结果

结果如图9所示，结果表明本发明制备的抗体可以有效阻断PD-1/PD-L1相互作用。

实施例4 抗PD-1抗体的体外活性检测

1、外周血单个核细胞活性实验

取1名健康志愿者全血10-15mL，利用人淋巴细胞分离液分离人PBMC细胞，生理盐水洗细胞2遍，10％FBS 1640培养基重悬细胞并计数，以1*10⁵/孔接种于96孔板中，每孔接种50μL。将梯度的CD3抗体以及CD28抗体以25μL/孔加入对应的培养孔中至二者的终浓度均为1μg/mL，0.8μg/mL，0.6μg/mL，0.4μg/mL，0.2μg/mL，0.1μg/mL。同时在培养体系中以25μL/孔加入梯度PD-L1/Fc融合蛋白至终浓度为0μg/mL，5μg/mL，10μg/mL，20μg/mL。置于37℃细胞培养箱培养72h，收获上清并利用人IFN-γELISA检测试剂盒测定上清中IFN-γ的表达情况。

基于上述方法测定刺激PBMC活化的最适CD3，CD28浓度以及PD-L1抑制浓度。同样的方法分离人PBMC细胞并以同样的细胞密度接种于96孔板中。配置最适抗体刺激浓度以及PD-L1抑制浓度加入相应的孔中。10％FBS 1640培养基稀释抗体至终浓度为0μg/mL、2.5μg/mL、10μg/mL、40μg/mL加入对应的反应体系，37℃细胞培养箱培养72h，收获上清并利用人IFN-γELISA检测试剂盒测定上清中IFN-γ的表达情况。

结果如图10所示，CD3/CD28抗体能够有效激活T细胞，PD-L1的加入则在一定程度抑制T细胞活性，本发明制备的抗体的加入能够有效逆转T细胞被抑制的状态，进而上调IFN-γ的表达，而且抗体的逆转效果具有剂量依赖性。利用未配对t检验对各抗体浓度点IFN-γ的表达量进行统计学分析，结果显示本发明制备的抗体与MIL75各浓度点IFN-γ的表达水平无统计学差异。表明本发明制备的抗体与阳性抗体MIL75具有一致的体外生物学活性。

2、混合淋巴细胞活性实验

混合淋巴细胞活性实验是将分离的单核细胞诱导为成熟的DC细胞与异源CD4⁺T进行混合培养，抗PD-1抗体的加入能够有效激活T细胞的活性，通过检测上清中IFN-γ的表达水平间接反映抗体的细胞活性。实验不同时间点所用人全血来源于2名健康志愿者。

首先，利用人淋巴细胞分离液分离1名健康志愿者全血中PBMC细胞，并利用单核细胞磁珠分选试剂盒分选单核细胞。10％FBS 1640培养基重悬细胞并记数，以2*10⁴/孔接种于96孔板，利用50ng/mL IL-4以及25ng/mL GM-CSF刺激单核细胞向DC细胞分化，置于37℃细胞培养箱培养7天，期间每三天换一次液。培养第7天，同样的方法分离另一名健康志愿者全血中的PBMC细胞，用CD4^十T细胞磁珠分选试剂盒分选CD4^十T阳性的细胞，10％FBS 1640培养基重悬细胞并记数，以2*10⁵/孔接种于96孔板，同时用10％FBS 1640培养基稀释抗PD-1抗体至合适浓度，吸尽96孔板中培养上清，将梯度抗体随CD4^十T细胞一同加入96孔板中使得抗体的终浓度分别为50μg/mL，10μg/mL，2μg/mL，0.4μg/mL，0.08μg/mL，0.016μg/mL，设置无关抗体对照(本实验室制备的抗蓖麻毒素人源化抗体MIL50)和阴性对照(不加抗体)。继续置于37℃细胞培养箱培养5天收获上清，并利用人IFN-γELISA检测试剂盒测定上清中IFN-γ的表达情况。

结果如图11所示，本发明制备的抗体能够有效激活CD4^十T细胞释放IFN-γ，且抗体的激活效应随着抗体浓度增加具有良好的剂量依赖性。

虽然以上仅描述了本发明的具体实施方式范例，但是本领域的技术人员应当理解，这些仅是举例说明，本发明的保护范围是由所附权利要求书限定的。本领域的技术人员在不背离本发明的原理和实质的前提下，可以对这些实施方式做出多种变更或修改，但这些变更或修改均落入本发明的保护范围。

序列表

<110> 中国人民解放军军事科学院军事医学研究院

<120> 一种特异性结合PD-1的单克隆抗体

<160> 8

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

Gly Ile Thr Phe Ser Asn Ser

1 5

<210> 2

<211> 6

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

Trp Tyr Asp Gly Ser Lys

1 5

<210> 3

<211> 4

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

Glu Gly Asp Tyr

1

<210> 4

<211> 11

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Tyr Leu Ala

1 5 10

<210> 5

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

Asp Ser Ser Asn Arg Ala Thr

1 5

<210> 6

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

Gln Gln Ser Ser Asn Trp Pro Arg Thr

1 5

<210> 7

<211> 113

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly Ile Thr Phe Ser Asn Ser

20 25 30

Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ala Val Ile Trp Tyr Asp Gly Ser Lys Phe Tyr Tyr Ala Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Phe

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Thr Glu Gly Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser

100 105 110

Ser

<210> 8

<211> 107

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly

1 5 10 15

Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Tyr

20 25 30

Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile

35 40 45

Tyr Asp Ser Ser Asn Arg Ala Thr Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Pro

65 70 75 80

Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Ser Asn Trp Pro Arg

85 90 95

Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys

100 105

Claims

1.一种特异性结合PD-1蛋白的单克隆抗体或其抗原结合片段，其特征在于，所述单克隆抗体或其抗原结合片段包括轻链CDR1、轻链CDR2、轻链CDR3、重链CDR1、重链CDR2和重链CDR3；

重链CDR1具有SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列；

重链CDR2具有SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列；

重链CDR3具有SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列；

轻链CDR1具有SEQ ID NO:4所示的氨基酸序列；

轻链CDR2具有SEQ ID NO:5所示的氨基酸序列；

轻链CDR3具有SEQ ID NO:6所示的氨基酸序列。

2.根据权利要求1所述的单克隆抗体或其抗原结合片段，其特征在于，所述单克隆抗体的重链可变区具有SEQ ID NO:7所示的氨基酸序列；所述单克隆抗体的轻链可变区具有SEQIDNO:8所示的氨基酸序列。

3.根据权利要求1所述的单克隆抗体或其抗原结合片段，其特征在于，所述单克隆抗体的抗原结合片段包括Fab、Fab′、F(ab′)2、Fv或单链抗体。

4.编码权利要求1-3中任一项所述的单克隆抗体或其抗原结合片段的核酸分子。

5.一种重组载体，其特征在于，所述重组载体包括权利要求4所述的核酸分子。

6.一种重组细胞，其特征在于，所述重组细胞中导入了权利要求4所述的核酸分子或转染了权利要求5所述的重组载体。

7.一种药物组合物、其特征在于，所述药物组合物包括治疗有效量的权利要求1-3中任一项所述的单克隆抗体或其抗原结合片段。

8.一种检测PD-1的产品，其特征在于，所述产品包括权利要求1-3中任一项所述的单克隆抗体或其抗原结合片段。

9.权利要求1-3中任一项所述的单克隆抗体或其抗原结合片段在制备检测PD-1的产品中的应用。

10.权利要求1-3中任一项所述的单克隆抗体或其抗原结合片段在制备治疗免疫障碍的药物中的用途。