KR20050084439A - 안과 질환 치료에 유용한 단백질 키나제 저해제로서의2-(1ｈ-인다졸-6-일아미노)-벤즈아미드 화합물 - Google Patents

안과 질환 치료에 유용한 단백질 키나제 저해제로서의2-(1ｈ-인다졸-6-일아미노)-벤즈아미드 화합물 Download PDF

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Abstract

본 발명은 안과 질환 및 특정 단백질 키나제의 활성을 조절하고(하거나) 저해하는 인다졸 화합물에 관한 것이다. 이들 화합물 및 이들을 함유하는 제약 조성물은 티로신 키나제 신호 전달을 매개할 수 있으며, 따라서 원하지 않는 세포 증식을 조절하고(하거나) 저해할 수 있다. 본 발명은 또한 상기 화합물을 함유하는 제약 조성물의 치료적 또는 예방적 용도, 및 유효량의 상기 화합물을 투여함으로써 안과 질환들, 암 및 그밖에 원하지 않는 혈관신생 및(또는) 세포 증식과 관련된 질환 상태들, 예를 들어 당뇨성 망막병증, 신생혈관성 녹내장, 류마티스 관절염 및 건선을 치료하는 방법에 관한 것이다.

Description

안과 질환 치료에 유용한 단백질 키나제 저해제로서의 2-(1Ｈ-인다졸-6-일아미노)-벤즈아미드 화합물{2-(1H-INDAZOL-6-YLAMINO)-BENZAMIDE COMPOUNDS AS PROTEIN KINASES INHIBITORS USEFUL FOR THE TREATMENT OF OPHTALMIC DISEASES}
본 출원은 미국 특허 가출원 제60/434,902호(2002. 12. 19. 출원; 본원에 그 전체가 참고로 인용됨)의 이익을 주장한다.
본 발명은 안과 질환 및 특정 단백질 키나제의 활성을 매개하고(하거나) 저해하는 인다졸 화합물, 및 이같은 화합물을 함유하는 제약 조성물에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 이같은 화합물 및 조성물의 치료적 또는 예방적 용도, 및 이같은 화합물의 유효량을 투여하여 안과 질환, 암 및 그밖에 원하지 않는 혈관신생 및(또는) 세포 증식과 관련된 질환 증상들을 치료하는 방법에 관한 것이다.
안구의 후부 구역의 다수의 질환 및 증상은 시력을 위협한다. 노인성 황반변성(ARMD 또는 AMD), 맥락막 혈관신생(CNV), 망막병증(예를 들어, 당뇨성 망막병증, 유리체 망막병증, 미숙아 망막병증), 망막염(예를 들어, 사이토메갈로바이러스(CMV) 망막염), 포도막염, 황반부종 및 녹내장이 다수의 예이다.
노인성 황반병성(ARMD 또는 AMD)은 중장년층에 있어서 시력상실의 주요 원인이다. ARMD는 시각 중심부를 공격하여 흐릿하게 하고, 독서, 운전 및 기타 세밀한 작업을 곤란하게 하거나 불가능하게 한다. 매년 미국에서만 약 200,000건의 신규 ARMD가 발생한다. 현재 추정치는 75세 이상의 사람들 중에서 약 40%, 및 60세 이상의 사람들 중에서 약 20%가 어느 정도의 황반변성을 앓고 있다는 것을 보여준다. "습윤성" ARMD는 가장 흔히 시력상실을 유도하는 ARMD 유형이다. 습윤성 ARMD에서 새로 생성된 맥락막 혈관(맥락막 혈관신생(CNV))은 액체를 흘리고, 망막에 점진적인 손상을 일으킨다. ARMD 중에서 특히 CNV의 경우, 두가지 주요 치료 방법으로 현재 개발 중인 것은, (a) 광응고술 및 (b) 혈관신생 저해제의 사용이다.
그러나, 광응고술은 망막에 해로울 수 있고, CNV가 망막중심오목 근처에 존재하는 경우에는 실시할 수 없다. 아울러, 광응고술은 흔히 시간이 흐름에 따라 재발성 CNV를 초래한다. 항혈관신생제 화합물의 경구적 투여가 또한 ARMD의 전신적 치료로 시험되고 있다. 그러나, 약물 특이적 신진대사 제한으로 인해, 전신적 투여는 흔히 안구에 치료수준 이하의 약물을 제공한다. 따라서, 효과적인 안구내 약물 농도를 달성하기 위해서는, 용인할 수 없는 높은 투여량을 투여하거나 또는 통상적인 투여량의 반복적인 투여가 필요하다. 항-혈관신생 화합물을 안구에 국부적으로 전달하기 위해 다양한 삽입물도 개발되어 왔다. 이같은 삽입물의 예는 미국 특허 제5,824,072호(Wong), 미국 특허 제5,476,511호(Gwon 등) 및 미국 특허 제5,773,019호(Ashton 등)에 개시되어 있다(이들 각각은 그 전체가 본원에서 모든 목적을 위해 참고로 인용된다).
안구의 신생혈관 질환
상기에서 언급된 바와 같이, 본 발명은 안구의 신생혈관 질환, 예를 들어, 각막 혈관신생, 신생혈관 녹내장, 증식성 당뇨성 망막병증, 수정체뒤 섬유증식 및 황반변성을 치료하기 위한 방법을 제공한다.
간단히 말해, 각막 혈관신생은 앞 구역의 손상의 결과로, 시력 감소 및 시력상실의 중요한 원인이 되고, 각막 동종이식 거부의 주요 위험 요소이다. 문헌[Burger 등, Lab, Invest. 48:169-180, 1983] (본원에서 모든 목적을 위해 그 전체가 참고로 인용되었음)에 기술된 바와 같이, 각막 혈관신생은 3 단계로 일어난다: 전혈관 잠재기, 활성 혈관신생 및 혈관 성숙 및 퇴화. 염증성 반응의 요소, 예를 들어, 백혈구, 혈소판, 사이토킨 및 에이코사노이드 또는 미확인된 혈장 성분을 비롯한 다양한 혈관신생 인자의 정체 및 기작은 아직 더 밝혀져야 한다.
현재 각막 혈관신생의 저해 또는 존재하고 있는 각막의 신규 혈관의 퇴행을 위한 임상적으로 만족스러운 치료법은 존재하지 않는다. 국소적 코르티코스테로이드가 아마도 기질 염증을 저해함으로 인해 일부 임상적 유용성이 있는 것으로 보인다.
따라서, 본 발명의 한 양태에서, 환자에게 치료적 유효량의 항혈관신생 조성물(상기에서 기술된 것과 같음)을 각막에 투여하여 혈관 생성을 저해하는 단계를 포함하는, 각막 혈관신생(각막 이식편 혈관신생)과 같은 안구의 혈관신생 질환을 치료하기 위한 방법을 제공한다. 간단히 말해, 각막은 일반적으로 혈관이 결여되어 있는 조직이다. 그러나, 특정 병리적 증상에서, 모세혈관이 윤부의 각막주위 혈관의 망상조직으로부터 각막으로 확장될 수 있다. 각막에 혈관이 생성되면, 흐릿하게 되고, 환자의 시력 감퇴를 가져온다. 시력 손상은 각막이 완전히 불투명하게 되었을 때 종결될 수 있다.
혈관신생을 자극하는 과정에 따라서, 혈관은 다양한 패턴 및 깊이로 각막 중으로 들어갈 수 있다. 이들 패턴은 안과의사에 의해 다음 유형으로 일반적으로 정의되어 왔다: 트라코마성 판누스(pannus trachomatosus), 레프로성 판누스(pannus leprosus), 픽테눌로성 판누스(pannus phylctenulosus), 변성 판누스(pannus degenerativus) 및 녹내장 판누스(glaucomatous pannus). 또한, 각막 기질은 수개의 상이한 임상적 병변을 일으키는 전방 섬모체 동맥의 가지(말단 루프, "브러시형" 패턴, 산형화형, 격자형, 사이질 아케이드(공막위혈관 유래) 및 비정상적 불규칙적 동맥)에 의해 침범당할 수 있다(사이질 혈관신생).
폭넓은 범위의 질환, 예를 들어, 각막 감염(예를 들어, 트라코마, 헤르페스 단순 각막염, 리슈만편모충증 및 쇠전사상충증), 면역학적 과정(예를 들어, 이식편 거부반응 및 스티븐-존슨 증후군), 알칼리 화상, 외상, 염증반응(임의의 원인에 의한 것), 독성 및 영양 결핍 상태 및 콘텍트 렌즈 착용으로 인한 합병증이 각막 혈관신생을 초래할 수 있다.
각막 혈관신생의 원인은 다양할 수 있지만, 원인과는 상관없이 손상에 대한 각막의 반응 및 이어지는 혈관이 안으로 자라는 것은 비슷하다. 즉, 윤부의 임계 거리 내에 위치하는 병변만이 혈관형성 반응을 일으키기 때문에 병변의 위치가 중요한 것으로 보인다. 이는 혈관 침투를 이끌어내는데 관여하는 혈관형성 인자가 병변 부위에서 생성되고, 그 효과를 발휘하기 위해 가장 가까운 혈관(윤부) 부위로 확산된다는 점 때문일 것이다. 이는 윤부의 일정 거리를 지나서는 더 이상 가능하지 않을 것이고, 윤부 내피는 각막으로 자라도록 유도되지 않을 것이다. 수개의 혈관신생 인자가 이 과정에 관여할 것이고, 이들 중 대다수는 염증 반응의 생성물이다. 실제로, 각막의 혈관신생은 염증 세포의 침윤물과 공동으로만 일어나는 것으로 보이고, 혈관신생 정도는 염증 반응의 정도에 비례한다. 각막 부종은 각막 간질 골격을 느슨하게 하고, 모세혈관이 생장할 수 있는 "최소한의 저항"의 통로를 제공하여, 혈관이 안으로 자라는 것을 보다 용이하게 한다.
최초 염증 반응 후, 각막 중으로의 모세혈관 성장은 다른 조직에서 일어나는 것과 동일한 방식으로 진행된다. 일반적으로 윤부 모세혈관 및 세정맥의 휴지기 내피 세포가 분열되고 이동하도록 자극된다. 내피세포는 이들 혈관의 기원으로부터 돌출되어 나가고, 이들이 나아갈 주변 기저막 및 조직을 소화하며, 혈관신생 자극원을 향해 이동한다. 끝이 막힌 아상 돌기가 관내강을 획득한 후, 서로 문합되어 모세혈관 루프를 형성한다. 그 결과는 각막 간질 내의 혈관얼기의 확립이다.
본 발명의 항혈관신생 인자 및 조성물은 혈관신생 프로모터의 자극 효과를 차단하고, 내피세포의 분열을 감소시키며, 내피세포의 이동을 감소시키고, 내피로부터 분비되는 단백질 분해효소의 활성을 손상시킴으로써 유용하다.
발명의 개요
본 발명의 특히 바람직한 실시태양에서, 항혈관신생 인자는 식염수 중에서 (안과 제제에서 통상적으로 사용되는 임의의 보존제 및 항미생물제와 결합되어) 국부적 투여를 위해 제조될 수 있고, 점안제 형태로 투여된다. 항혈관신생 인자 용액 또는 현탁액은 그 순수한 형태로 제조될 수 있고, 매일 수차례 투여될 수 있다. 별법으로, 상기에서 제조된 것과 같은 항혈관신생 조성물은 또한 각막에 직접 투여될 수 있다.
바람직한 실시태양 내에서, 항혈관신생 조성물은 각막에 결합되는 점막 접착성 중합체와 함께 제조된다. 추가의 실시태양 내에서, 항혈관신생 인자 또는 항혈관신생 조성물은 통상의 스테로이드 치료법의 보조 요법으로 사용될 수 있다.
또한, 국부적 치료법이 혈관신생 반응(예를 들어, 화학적 범(chemical bums))을 유도하는 가능성이 큰 것으로 알려진 각막 병변 내에서 예방적으로 유용할 수 있다. 이러한 경우에서, 치료(아마도 스테로이드와 조합한)는 후속 합병증을 방지하기 위해서 즉각적으로 실시될 수 있다.
다른 실시태양에서, 상기에서 기술된 항혈관신생 조성물을 현미경적 관찰 하에서 안과의사가 각막 간질 중으로 직접 주입할 수 있다. 바람직한 주입 부위는 개별 병변의 형태에 따라 달라질 수 있지만, 투여 목적은 혈관구조의 전진하는 전면(즉, 혈관과 정상 각막 사이에 산재함)에 조성물을 위치시키는 것이다. 대부분은, 이는 전진 혈관으로부터 각막을 "보호하기" 위해서 윤부주위의 각막 주입을 수반할 것이다. 이 방법은 또한 각막 혈관신생을 예방적으로 방지하기 위해서 각막 손상 바로 후에 사용될 수 있다. 이 상황에서, 물질은 각막 병변과 바람직하지 않은 잠재적인 윤부 혈액 공급 사이에 산재한 윤부주위의 각막 중에 주입될 수 있다. 또한, 이 같은 방법은 이식된 각막의 모세혈관 침투를 방지하기 위해서 비슷한 방식으로 사용될 수 있다. 서방성 형태에서, 주입은 일 년에 단 2-3회만 요구될 수 있다. 또한, 주입 자체에 의해 발생하는 염증을 감소시키기 위해서 주입 용액 중에 스테로이드가 첨가될 수 있다.
본 발명의 다른 양태로, 혈관의 형성이 저해되도록 치료적 유효량의 항혈관신생 조성물을 환자의 안구에 투여하는 단계를 포함하는 녹내장을 치료하기 위한 방법이 제공된다.
간단히 말해, 신생혈관성 녹내장은 신규한 모세혈관이 안구의 홍채 중으로 전개되어 나가는 병적 증상이다. 신생혈관은 일반적으로, 동공 경계에 위치한 혈관으로부터 시작되고, 홍채의 뿌리를 지나 전진하고, 섬유주 망상조직 중으로 진행한다. 섬유모세포 및 기타 결합조직 요소들은 홍채의 앞면을 가로질러 나가는 모세관 성장 및 섬유혈관막 발달과 관련이 있다. 결국, 이 조직은 전방각에 도달하여 유착증을 형성한다. 이들 유착증은 이어서 합체하여, 상처를 남기고, 최종적으로 전방각을 고립시키도록 수축한다. 상처 형성은 전방각을 통해서 섬유주 망상조직으로 들어가는 안구방수의 적절한 배수를 방해해서, 시력상실을 가져올 수 있는 안압의 증가를 일으킨다.
신생혈관성 녹내장은 일반적으로 망막허혈이 주로 나타나는 합병증으로 발생한다. 특히, 이 장애를 가진 환자의 약 1/3이 당뇨성 망막병증이 있으며, 28%가 망막중심정맥폐쇄가 있다. 다른 사례로는 만성망막분리, 말기 녹내장, 경동맥 협착질환, 수정체후 섬유증식증, 겸상적혈구빈혈증, 안구내 종양 및 경동맥 해면루를 포함한다. 초기 단계에서, 신생혈관성 녹내장은 홍채 표면 상에서 작고 팽창된 무질서한 모세혈관(플루오레세인이 새어나옴)을 보여주는 고확대 슬릿램프 생체현미경을 사용하여 진단할 수 있다. 후에, 전방각경검사는 섬유혈관 밴드에 의한 전방각의 점진적 소멸을 입증한다. 전방각이 열려 있는 경우라도, 대증요법이 도움이 될 수 있다. 그러나, 일단 전방각이 닫히면, 압력을 완화하기 위해서 수술적 개입이 필요하다.
따라서, 본 발명의 한 실시태양에서, 신생혈관성 녹내장의 초기 형태를 치료하기 위해서 항혈관신생 인자(상기에서 기술된 것과 같이 단독으로 또는 항혈관신생 조성물로)가 안구에 국부적으로 투여될 수 있다.
본 발명의 다른 실시태양에서, 항혈관신생 조성물은 전방각 영역 내에 조성물을 주입하여 이식될 수 있다. 이는 항혈관신생 인자의 지연된 국부적 증가를 제공하고, 이 영역으로 혈관이 성장하는 것을 방해한다. 홍채의 전진 모세혈관과 전방각 사이에 위치한, 이식된 또는 주입된 항혈관신생 조성물은 혈관신생으로부터 개방된 전방각을 "방어"한다. 모세혈관이 항혈관신생 조성물의 상당한 반경 범위 내에서 성장하지 않으므로, 각의 개방성은 유지될 수 있다. 다른 실시태양에서, 항혈관신생 조성물은 또한 항혈관신생 인자가 안구방수 중으로 계속해서 방출되도록 임의의 위치 중에 놓여질 수 있다. 이는 방수 중의 항혈관신생 인자의 농도를 증가시키고, 이는 이어서 홍채 표면 및 그 비정상적인 모세혈관을 뒤덮게 되고, 이로써 약물을 전달하기 위한 다른 기작을 제공한다. 또한, 이들 치료적 양식은 예방적으로 유용할 수 있으며, 기존의 치료법과 조합될 수 있다.
본 발명의 다른 양태에서, 혈관 형성이 저해되도록 치료적 유효량의 항혈관신생 조성물을 환자의 안구에 투여하는 단계를 포함하는, 증식성 당뇨성 망막병증을 치료하는 방법이 제공된다.
간단히 말해서, 당뇨성 망막병증은 신생혈관성 녹내장에 대해서 기술된 것과 유사한 것으로 생각된다. 특히, 비증식성 당뇨성 망막병증은 망막 저산소증의 영향 하에서 증식성 당뇨성 망막병증으로 전환되는 것으로 생각된다. 일반적으로, 신생혈관 조직은 시각 신경(일반적으로 말단 10mm 이내)으로부터 유래하고, 조직 관류가 좋지 않은 영역 중의 망막 표면으로부터 유래한다. 초기에 모세혈관은 망막의 내경계막과 유리체의 후면 사이에서 성장한다. 최종적으로, 혈관은 유리체 중으로 성장하고, 내경계막을 통과한다. 유리체가 수축함에 따라, 견인력이 맥관에 부여되어서, 흔히 혈관의 전단 및 출혈에 의한 유리체의 실명을 가져온다. 또한, 망막 중의 상처 유래의 섬유성 견인력이 망막 박리를 생성할 수 있다.
선택되는 통상적인 치료법은 망막 조직을 감소시켜서, 망막의 산소 요구를 감소시키기 위한 범망막 광응고술이다. 처음에는 효과적이지만, 망막의 다른 부위에서 새로운 병변이 생성되며, 재발율이 높다. 이 치료법의 합병증은 환자의 50%까지 주변시각의 감소를 가져오고, 각막의 기계적 마멸, 레이저 유도된 백내장 형성, 급성 녹내장 및 망막하 신생혈관 성장의 자극(시력의 손상을 가져올 수 있음)을 포함한다. 그 결과, 이 방법은 다수의 위험 인자가 존재하고, 위험 대 이점의 비율이 명백히 시술이 유리하다고 나타날 때만 시행된다.
따라서, 본 발명의 특히 바람직한 실시태양에서, 증식성 당뇨성 망막병증은 항혈관신생 인자(들)(또는 항혈관신생 조성물)를 망막 중의 항혈관신생 인자의 국소적 농도를 증가시키기 위해 방수 또는 유리체 중으로 주입하여 치료될 수 있다. 바람직하게는, 이 치료법은 광응고술을 요구하는 다수의 질환을 얻기 전에 개시되어야 한다. 본 발명의 다른 실시태양에서, 신생혈관 병변에 영양을 공급하는 동맥은 색전형성될 수 있다(상기에서 기술한 것과 같이 항혈관신생 조성물을 사용).
본 발명의 다른 양태에서, 혈관 형성이 저해되도록 치료적 유효량의 항혈관신생 인자(또는 항혈관신생 조성물)를 환자의 안구에 투여하는 단계를 포함하는, 수정체후 섬유증식증을 치료하는 방법이 제공된다.
간단히 말해서, 수정체후 섬유증식증은 산소 치료법을 받는 미숙아에서 일어나는 병이다. 말초 망막 맥관구조, 특히 측두측 상의 맥관구조는 태아기 마지막까지 완전히 형성되지 않는다. 과량의 산소(임신 말기에서는 생리적인 수준일 정도라도) 및 산소 자유 라디칼의 형성은 미성숙 망막의 혈관에 손상을 일으키므로 중요한 것으로 생각된다. 이들 혈관은 수축하고, 이어서 산소에 노출되면 구조적으로 제거된다. 그 결과, 말초망막이 혈관을 발달시킬 수 없게 되고, 망막 허혈이 이어진다. 허혈에 대한 반응으로, 혈관신생은 정상 망막과 허혈성 막막의 접합점에서 유도된다.
이들 사례 중 75%에서, 이들 혈관은 자연적으로 퇴화한다. 그러나, 나머지 25%에서는, 연속적인 모세혈관 성장, 섬유혈관성 성분의 수축 및 혈관과 망막 모두에서의 견인력이 있다. 이는 실명에 이를 수 있는 유리체의 출혈 및(또는) 망막 이탈을 초래한다. 또한, 신생혈관성 폐쇄각 녹내장이 이 병의 합병증이다.
어떤 증상이 자연적으로 치유되고, 어떤 증상이 심각한 증상으로 진행되는지 결정하는 것이 흔히 불가능하기 때문에, 통상의 치료법(즉, 수술)은 일반적으로 만성적 질환을 나타내고 잘 발달된 병변을 가진 환자에게만 개시된다. 이러한 "기다리고 관찰하는" 접근법은 초기 개입을 배제하여, 합병증이 나타날 25%의 환자에서 질환의 진행을 허용한다. 따라서, 본 발명의 한 실시태양에서, 수정체후 섬유증식의 진행의 발병률을 감소시키기 위한 시도로, 이 증상을 나타낼 위험이 큰 유아에서 항혈관신생 인자(또는 상기에서 기술된 것과 같이 항혈관신생 조성물)의 국부적 투여를 수행할 수 있다. 다른 실시태양에서, 항혈관신생 조성물의 수정체내 주입 및(또는) 안구내 삽입물이 사용될 수 있다. 이같은 방법은 수술의 필요를 감소시키기 위해서 특히 만성적 질환의 경우 특히 바람직하다.
단백질 키나제
단백질 키나제는 단백질 중의 특이적 티로신, 세린 또는 트레오닌의 히드록실기의 인산화를 촉매하는 효소 계열이다. 일적으로, 이같은 인산화는 단백질의 기능을 극적으로 교란하고, 따라서, 단백질 키나제는 대사, 세포 증식, 세포 분화 및 세포 생존을 비롯한 폭 넓은 다양한 세포내 과정의 조절에서 중추적이다. 단백질 키나제의 활성이 요구되는 것으로 알려진 많은 상이한 세포내 기능 중에서, 일부 과정은 특정 질환 상태의 치료적 개입을 위한 매력적인 표적을 나타낸다. 두가지 예는 혈관신생과 세포-주기 조절로, 여기서 단백질 키나제는 중추적 역할을 하고, 이들 과정은 고형암의 성장과 아울러 기타 질환에 필수적이다.
혈관신생은 신규 모세혈관이 기존의 혈관으로부터 생성되는 기작이다. 필요한 경우, 혈관계는 조직 및 기관의 적절한 기능을 유지하기 위해서 신규한 모세혈관 망상조직을 생성할 수 있는 능력을 가진다. 그러나, 성인의 경우, 혈관신생은 상당히 제한적이고 상처 치유 과정 및 월경 중 자궁내막의 혈관신생 과정에서만 일어난다. 문헌[Merenmies 등, Cell Growth & Differentiation, 8, 3-10(1997)](본원에서 모든 목적을 위해 그 전체가 참고로 인용되었음). 반면, 불필요한 혈관신생은 다수의 질환, 예를 들어, 망막병증, 건선, 류마티스성 관절염, 노인성 황반변성(AMD) 및 암(충실성 종양)의 특징이다. 문헌[Folkman, Nature Med ., 1, 27-31(1995)](본원에서 모든 목적을 위해 그 전체가 참고로 인용되었음). 혈관신생 과정에 관여하는 것으로 나타난 단백질 키나제는 성장 인자 수용체 티로신 키나제 계열의 세 구성원을 포함한다: VEGF-R2(혈관 내피세포 성장 인자 수용체 2, KDR(키나제 삽입 도메인 수용체) 및 FLK-1으로도 알려져 있음); FGF-R(섬유모세포 성장 인자 수용체); 및 TEK(Tie-2로도 알려져 있음).
내피세포 상에서만 발현되는 VEGF-R2는 잠재적 혈관신생 성장 인자 VEGF에 결합하고, 그 세포내 키나제 활성의 활성화를 통해 후속적 신호 전달을 매개한다. 따라서, VEGF-R2의 돌연변이체가 신호 전달에 실패하는 것으로 나타난 것으로 보아서, VEGF-R2의 키나제 활성을 직접적으로 저해하면 외인성 VEGF가 존재하는 경우라도 혈관신생의 감소를 가져올 수 있는 것으로 예상된다(Strawn 등, Cancer Research, 56, 3540-3545 (1996) 참조). 문헌[Millauer 등, Cancer Research, 56, 1615-1620 (1996)]. 아울러, VEGF-R2는 VEGF의 혈관신생 활성을 매개하는 것 이상으로는 성인에서 기능을 갖지 않는 것으로 보인다. 따라서, VEGF-R2의 키나제 활성의 선택적 저해제는 독성이 거의 없을 것으로 예상된다.
또한, FGF-R은 혈관신생 성장 인자 aFGF 및 bFGF에 결합하고, 후속적 세포내 신호 전달을 매개한다. 최근에 bFGF와 같은 성장 인자가 일정한 크기에 도달한 충실성 종양에서 혈관신생을 유도하는 중요한 역할을 할 것이라고 제안되었다. 문헌[Yoshiji 등, Cancer Research, 57, 3924-3928 (1997)]. 그러나, VEGF-R2와는 달리 FGF-R은 몸 전체에 퍼져 있는 다수의 상이한 세포 유형에서 발현되고 성인에서 기타 정상적인 생리적 과정에서 중요한 역할을 할 수도 있고 하지 않을 수도 있다. 그럼에도, FGF-R의 키나제 활성의 소분자 저해제의 전신적 투여가 마우스에서 외견상 독성이 나타나지 않으면서, bFGF-유도된 혈관신생을 저해하는 것으로 보고되었다. 문헌[Mohammad 등, EMBO Journal, 17, 5996-5904 (1998)] 참조.
TEK(Tie-2로도 알려져 있음)는 혈관신생에서 역할하는 것으로 나타난, 내피세포에서만 발현되는 또 다른 수용체 티로신 키나제이다. 엔지오포이에틴-1(angiopoietin-1) 인자가 결합하면, TEK의 키나제 도메인의 자가인산화를 초래하고, 내피세포와 주변 내피세포 지지 세포와의 상호작용을 매개하는 것으로 나타난 신호 전달을 일으켜서, 새로 형성된 혈관의 성숙을 촉진시킨다. 반면, 엔지오포이에틴-2 인자는 TEK 상의 엔지오포이에틴-1의 작용을 길항하고, 혈관신생을 중단시키는 것으로 나타났다. 문헌[Maisonpierre 등, Science, 277, 55-60 (1997)] 참조.
상기에서 기술한 전개 양상의 결과로, VEGF-R2, FGF-R 및(또는) TEK의 키나제 활성을 저해하는 화합물을 사용하여 혈관신생을 치료하는 것이 제안되었다. 예를 들어, WIPO 국제 출원 공개 제WO 97/34876호는 VEGF-R2의 저해제로, 비정상적인 혈관신생 및(또는) 증가한 혈관 투과성과 관련된 질환 상태들, 예를 들어, 암, 당뇨병, 건선, 류마티스성 관절염, 카포시 육종, 혈관종, 급성 및 만성 신장병증, 죽종, 동맥 재협착, 자가면역 질환, 급성 염증 및 망막 혈관 증식이 있는 안과 질환의 치료에 사용될 수 있는, 특정 신놀린 유도체를 개시하고 있다.
포스포릴라제 키나제는 글리코겐 포스포릴라제를 활성화시켜서, 글리코겐 분해 및 간 글루코스 방출을 증가시킨다. 제2 유형 당뇨병에서는 간 글루코스 생성의 조절이 안되며, 이는 공복시 과혈당증의 주원인으로, 이들 환자를 괴롭히는 다수의 2차 합병증을 일으킨다. 따라서, 간으로부터 글루코스 방출을 감소시키는 것이 상승된 혈장 글루코스 수준을 감소시킬 것이다. 따라서, 포스포릴라제 키나제의 저해제는 포스포릴라제 활성 및 글리코겐 분해를 감소시켜서, 환자의 과혈당증을 감소시킬 것이다.
VEGF에 대한 다른 생리적 반응은 혈관 과투과성으로, 이는 혈관신생의 초기 단계에서 중요한 역할을 하는 것으로 제안되어 왔다. 뇌졸중 피해자의 뇌에서 발생하는 것과 같은 허혈성 조직에서, 저산소증은 VEGF의 발현을 개시시키고, 증가된 혈관 투과성 및 최종적으로 주변 조직 중의 부종을 발생시킨다. 뇌졸중에 대한 래트(rat) 모델에서, 반 브루겐(van Bruggen) 등[J. Clinical Invest., 104, 1613-20 (1990)]은 VEGF에 대한 모노클로날 항체의 투여가 경색 부피를 감소시킴을 보였다. 따라서, VEGFR의 저해제는 뇌경색의 치료에 유용한 것으로 기대된다.
혈관신생에서의 역할 외에, 단백질 키나제는 세포-주기 조절에서도 중요한 역할을 한다. 조절되지 않은 세포 증식은 암의 표지이다. 다양한 자극에 대한 반응으로 세포 증식은 세포가 증가되고 분열되는 과정인, 세포 분열 주기의 탈조절로 명백히 나타난다. 종양 세포는 일반적으로 세포 분열 주기를 통한 진행을 직접적으로 또는 간접적으로 조절하는 유전자에 손상을 갖고 있다.
사이클린-의존적 키나제(CDK)는 세포 주기의 서로 다른 단계 사이의 이행을 조절하는데 중요한 역할을 하는 세린-트레오닌 단백질 키나제이다. 예를 들어, 문헌[Science, 274, 1643-1677 (1996)]에 수집된 문헌들을 참조. CDK 복합체는 조절성 사이클린 서브유닛(예를 들어, 사이클린 A, B1, B2, D1, D2, D3 및 E)과 촉매적 키나제 서브유닛(예를 들어, cdc2(CDK1), CDK2, CDK4, CDK5 및 CDK6)의 회합을 통해 형성된다. 그 이름이 의미하는 것과 같이, CDK는 그 표적 기질을 인산화하기 위해서 사이클린 서브유닛에 대한 절대적 의존성을 나타내고, 상이한 키나제/사이클린 쌍이 세포 주기의 특정 단계를 통한 진행을 조절하기 위해 작용한다.
CDK4는 휴지기 또는 정지기로부터 세포 분열 주기를 개시하여 세포가 세포 분열로 나아가게 되는데 중요한 역할을 하는 D 사이클린과 복합체를 이룬다. 이 진행 과정은 다양한 성장 조절 기작(음성적 및 양성적 기작 모두)의 영향을 받는다. 이 조절 시스템의 이상, 특히 CDK4의 작용에 영향을 주는 이상은 세포가 악성종양, 특히, 가족성 멜라닌종, 식도 암종 및 췌장암의 특징적인 고도의 증식성 상태로 진행하는데 관련되어 있다. 문헌[Kamb, Trends in Genetics, 11, 136-140 (1995); Kamb 등, Science, 264, 436-440 (1994)] 참조.
무수히 많은 논문들이 다양한 치료적 표적에 대해 유용한 다양한 화합물을 기술하고 있다. 예를 들어, WIPO 국제 출원 공개 제WO 99/23077호 및 제WO 99/23076호는 카테콜 바이오이소스티어(bioisostere) 대체용 인다졸에 의해 생성되는 포스포디에스터라제 IV형 저해 활성을 갖는 인다졸-함유 화합물을 기술하고 있다. 미국 특허 제5,760,028호는 ανβ3 인테그린 및 관련 세포 표면 부착성 단백질 수용체의 길항제로 유용한 3-[1-[3-(이미다졸린-2-일아미노)프로필]인다졸-5-일카르보닐아미노]-2-(벤질옥시카르보닐아미노)프로피온산을 비롯한 헤테로시클을 개시하고 있다. WIPO 국제 출원 공개 제WO 98/09961호는 특정 인다졸 유도체, 및 포유동물에서 IV형 포스포디에스터라제(PDE)의 저해제로서 또는 종양 괴사 인자(TNF)의 생성을 위한 이들의 용도를 개시하고 있다. 최근에 공지된 화합물들의 가상 라이브러리에 추가된 것들은 CDK를 저해하는 항-증식성 치료제로서 기술된 것들을 포함한다. 예를 들어, 미국 특허 제5,621,082호(Xiong 등)는 CDK6의 저해제를 코딩하는 핵산을 개시하고 있고, 유럽 특허 출원 공개 제0 666 270 A2호는 CDK1 및 CDK2의 저해제로서 작용하는 펩티드 및 펩티드 모의체를 기술하고 있다. WIPO 국제 출원 공개 제WO 97/16447호는 과도한 또는 비정상적인 세포 증식을 저해하는데 사용될 수 있고, 따라서 암을 치료할 수 있는, 사이클린-의존적 키나제, 특히 CDK4/사이클린 D1과 같은 CDK/사이클린 복합체의 저해제인 크로몬의 특정 유사체를 개시하고 있다. WIPO 국제 출원 공개 제WO 99/21845호는 CDK 저해제로 유용한 4-아미노티아졸 유도체를 기술하고 있다. 상기에서 열거된 특허 및(또는) 출원 각각은 본원에 모든 목적을 위해 그 전체가 참고로 인용되었다.
그러나, 하나 이상의 CDK 또는 CDK/사이클린 복합체를 저해하는데 효과적이며, 용이하게 합성될 수 있는 소분자 화합물이 여전히 필요하다. CDK4는 대부분의 세포에서 세포 분열의 일반적인 활성제로 기능하고, CDK4와 D-형 사이클린의 복합체가 세포 주기의 초기 G1 단계를 지배하기 때문에, 한 종류 이상의 종양을 치료하기 위해서 CDK4 및 CDK4와 D-형 사이클린 복합체의 효과적인 저해제가 필요하다. 또한, G1/S기 및 G2/M 이행 단계에서 각각 사이클린 E/CDK2 및 사이클린 B/CDK1 키나제 역할의 중요성이 암에서 탈조절된 세포-주기의 진행을 억제하는데 있어서 치료적 개입을 위한 추가적인 표적을 제공한다.
다른 단백질 키나제, CHK1은 세포-주기 진행에서 체크포인트로 중요한 역할을 한다. 체크포인트는 사이클린-의존적 키나제의 형성, 활성화 및 이후의 비활성화에 영향을 미쳐서 세포-주기의 진행을 조화시키는 조절 시스템이다. 체크포인트는 부적절한 시간대에서의 세포-주기의 진행을 방지하고, 세포가 정지된 상태에서 세포의 대사적 균형을 유지하며, 어떤 경우에는 체크포인트의 요구가 충족되지 않았을 때 아포프토시스(프로그램화된 세포 사멸)를 유도할 수 있다. 예를 들어, 문헌[O'Connor, Cancer Surveys, 29, 151-182 (1997); Nurse, Cell, 91, 865-867 (1997); Hartwell 등, Science, 266, 1821-1828 (1994); Hartwell 등, Science, 246, 629-634 (1989)] 참조.
한 일련의 체크포인트는 게놈이 흠이 없는지를 모니터링하며, DNA 손상을 감지했을 때, 이들 "DNA 손상 체크포인트"가 G1 및 G2기에서 세포-주기 진행을 차단하고, S기를 통한 진행 속도를 늦춘다. 문헌[O'Connoer, Cancer Surveys, 29, 151-182 (1997); Hartwell 등, Science, 266, 1821-1828 (1994)] 참조. 이 작용은 게놈의 복제 및 이어서 그 유전자 물질이 새로운 딸세포로 분할되는 과정이 일어나기 전에 DNA 복구 과정이 그 작업을 완결할 수 있도록 한다. 중요하게는, 인간 암에서 가장 흔히 돌연변이되는 유전자인 p53 암 억제인자 유전자는 G1기에서 세포-주기 진행을 차단하고(하거나) DNA 손상 후의 아포프토시스(프로그램화된 세포 사멸)를 유도하는 DNA 손상 체크포인트 단백질을 생성한다. 문헌[Hartwell 등, Science, 266, 1821-1828 (1994)]. 또한, p53 종양 억제인자는 세포 주기의 G2기에서 DNA 손상 체크포인트의 작용을 강화하는 것으로 나타났다. 문헌[Bunz 등, Science, 28, 1497-1501 (1998); Winters 등, Oncogene, 17, 673-684 (1998); Thompson, Oncogene, 15, 3025-3035 (1997)] 참조.
인간 암에서 p53 종양 억제인자 경로의 중추적인 성질을 고려할 때, p53-손상된 암에서의 취약성을 이용하는 치료적 개입을 찾으려는 시도가 적극적으로 수행되어 왔다. 한가지 신규한 취약성은 p53 손상 암 세포에서 G2 체크포인트의 작동에 있다. 암 세포는 G1 체크포인트 조절이 결여되어 있기 때문에, DNA-손상 약물의 암세포 살생 작용으로부터 이들을 보호하는 마지막 남은 장벽인 G2 체크포인트의 중단에 특히 취약하다. G2 체크포인트는 효모에서부터 인간에까지 보존된 조절 시스템에 의해 조절된다. 이 보존된 시스템에서 중요한 것은 키나제 CHK1으로, 이는 유사분열 진입을 촉진시키는 사이클린 B/Cdc2 키나제의 활성화를 저해하기 위해서, DNA-손상 감지 복합체로부터 신호를 전달한다. 문헌[예를 들어, Peng 등, Science, 277, 1501-1505 (1997); Sanchez 등, Science, 277, 1497-1501 (1997)] 참조. CHK1의 비활성화는 항암제 또는 내인성 DNA 손상에 의해 가해진 DNA 손상에 의해 유도되는 G2 정지를 중단하고, 아울러 생성되는 체크포인트 손상된 세포를 선택적으로 죽이는 것으로 나타났다. 문헌[예를 들어, Nurse, Cell, 91, 865-867 (1997); Weinert, Science, 277, 1450-1451 (1997); Walworth 등, Nature, 363, 368-371 (1993); 및 Al-Khodairy 등, Molec . Biol . Cell, 5, 147-160 (1994)] 참조.
암 세포에서 체크포인트 조절의 선택적인 조작은 암 화학치료법 및 방사능 치료법에서의 폭넓은 이용을 제공할 수 있고, 아울러 암 세포의 파괴를 위한 선택적 기준으로 이용될 수 있는 인간 암의 "유전적 불안정성"의 통상적 특징을 제공한다. 다수의 인자가 CHK1을 DNA-손상 체크포인트 조절에서 중추적 표적으로 한다. CHK1 및 기능적으로 관련된 키나제들, 예를 들어 S기 진행을 조절하는데 있어서 CHK1과 협력하는 것으로 최근에 발견된 키나제인 Cds1/CHK2(Zeng 등, Nature, 395, 507-510 (1998); Matsuoka, Science, 282, 1893-1897 (1998) 참조)의 저해제의 해명이 암 치료에 유용한 신규한 치료적 실체를 제공할 수 있었다.
ECM으로의 인테그린 수용체의 결합은 세포 운동, 세포 증식 및 생존에 관여하는 FAK(초점 부착 키나제)에 의해 매개되는 세포내 신호를 개시한다. 인간 암에서, FAK 과발현은 종양 형성 및 인테그린 매개된 신호 경로에서의 그 역할을 통한 전이력과 관련이 있다.
티로신 키나제는 수용체 유형(세포외, 트랜스멤브레인 및 세포내 도메인을 가짐) 또는 비수용체 유형(전적으로 세포내)일 수 있다. 최소한 하나 이상의 비수용체 단백질 티로신 키나제, 즉, LCK가 세포 표면 단백질(Cd4)과 교차 결합된 항-Cd4 항체와의 상호작용으로부터 유래한 신호의 T-세포내 전달을 매개하는 것으로 생각된다. 비수용체 티로신 키나제에 대한 보다 자세한 논의는 문헌[Bolen, Oncogene, 8, 2025-2031 (1993)](본원에서 모든 목적을 위해 그 전체가 참고로 인용되었음)에 나와 있다.
상기에서 확인된 단백질 키나제 이외에, 다수의 기타 단백질 키나제가 치료적 표적으로 생각되고, 이하에서 살펴본 바와 같이 다수의 문헌이 키나제 활성의 저해제를 개시하고 있다: 미국 특허 제6,534,524호(2003. 3. 18. 등록), 미국 특허 제6,531,491호(2003. 3. 11. 등록), PCT 국제 특허 출원 공개 제WO 00/38665호(2001. 7. 6. 공개), PCT 국제 특허 출원 공개 제WO 97/49688호(1997. 12. 31. 공개), PCT 국제 특허 출원 공개 제WO 98/23613호(1998. 6. 4. 공개), 미국 특허 제6,071,935호(2000. 6. 6. 등록), PCT 국제 특허 출원 공개 제WO 96/30347호(1996. 10. 3. 공개), PCT 국제 특허 출원 공개 제WO 96/40142호(1996. 12. 19. 공개), PCT 국제 특허 출원 공개 제WO 97/13771호(1997. 4. 17. 공개), PCT 국제 특허 출원 공개 제WO 95/23141호(1995. 8. 31. 공개), PCT 국제 특허 출원 공개 제WO 03/006059호(2003. 1. 23. 공개), PCT 국제 특허 출원 공개 제WO 03/035047호(2003. 5. 1. 공개), PCT 국제 특허 출원 공개 제WO 02/064170호(2002. 8. 22. 공개), PCT 국제 특허 출원 공개 제WO 02/41882호(2002. 5. 30. 공개), PCT 국제 특허 출원 공개 제WO 02/30453호(2002. 4. 18. 공개), PCT 국제 특허 출원 공개 제WO 01/85796호(2001. 11. 15. 공개), PCT 국제 특허 출원 공개 제WO 01/74360호(2001. 10. 11. 공개), PCT 국제 특허 출원 공개 제WO 01/74296호(2001. 10. 11. 공개), PCT 국제 특허 출원 공개 제WO 01/70268호(2001. 9. 27. 공개), 유럽 특허 출원 공개 제EP 1086705호(2001. 3. 28. 공개) 및 PCT 국제 특허 출원 공개 제WO 98/51344호(1998. 11. 19. 공개). 상기 특허 및 출원 각각은 그 전체 내용이 본원에서 모든 목적을 위해 참고로 인용되었다.
그러나, 단백질 키나제의 효과적인 저해제가 여전히 필요하다. 또한, 당업자들이 이해하고 있는 바와 같이, 키나제 저해제가 표적 키나제 또는 키나제들에 대한 높은 친화도와 아울러 다른 단백질 키나제에 비해 높은 선택성을 갖는 것이 바람직하다.
따라서, 본 발명의 목적은 안과 질환, 예를 들어 노인성 황반변성(ARMD), 맥락막 혈관신생(CNV), 망막병증(예를 들어, 당뇨성 망막병증, 유리체 망막병증, 미숙아 망막병증), 망막염(예를 들어, 사이토메갈로바이러스(CMV) 망막염), 포도막염, 황반부종 및 녹내장의 치료를 위한 효능있는 약물을 발견하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 단백질 키나제의 효능있는 저해제를 발견하는 것이다.
본 발명의 또다른 목적은 하나 이상의 특정 키나제에 대한 강하고 선택적인 친화도를 갖는 효과적인 키나제 저해제를 발견하는 것이다.
하기 설명으로부터 명백하게 될 본 발명의 이들 목적 및 다른 목적은 단백질 키나제의 활성을 조절하고(하거나) 저해하는, 이하에서 기술되는 인다졸 화합물, 그의 제약학상 허용되는 전구약물, 제약학상 활성 대사산물 및 제약학상 허용되는 염(이같은 화합물, 전구약물, 대사산물 및 염은 총괄하여 "약물"로 지칭된다)의 발견으로 달성되었다. 이같은 약물을 함유하는 제약 조성물은 키나제 활성에 의해 매개되는 질환, 예를 들어, 암과 아울러 불필요한 혈관신생 및(또는) 세포내 증식과 관련된 기타 질환 상태, 예를 들어, 당뇨성 망막병증, 신생혈관성 녹내장, 류마티스성 관절염 및 건선을 치료하는데 유용하다. 아울러, 약물은 VEGF-R, FGF-R, CDK 복합체, CHK1, LCK, TEK, FAK 및(또는) 포스포릴라제 키나제와 관련된 키나제 활성의 조절 및(또는) 저해에 관련된 유리한 성질을 갖는다. 일반적인 측면에서, 본 발명은 하기 화학식의 화합물에 관한 것이다:
또한, 본 발명은 화학식 I, II, III 또는 IV의 화합물, 또는 그의 제약학상 허용되는 전구약물, 제약학상 활성 대사산물 또는 제약학상 허용되는 염을 투여하여, VEGF-R, FGF-R, CDK 복합체, CHK1, LCK, TEK, FAK 및(또는) 포스포릴라제 키나제의 키나제 활성을 조절 및(또는) 저해하는 방법에 관한 것이다. 본 발명의 바람직한 화합물은 선택적 키나제 활성을 갖는 것, 즉, 하나 이상의 특정 키나제에 대해서 상당한 활성을 가지면서, 하나 이상의 다른 키나제에 대해서는 적은 또는 최소한의 활성을 갖는 것이다. 본 발명의 한 바람직한 실시태양에서, 본 발명의 화합물은 FGF-R1 수용체 티로신 키나제보다 VEGF 수용체 티로신 키나제에 대해서 상당히 높은 효능을 갖는 화학식 I의 화합물이다. 또한, 본 발명은 FGF 수용체 티로신 키나제 활성을 상당히 조절하지 않으면서, VEGF 수용체 티로신 키나제 활성을 조절하는 방법에 관한 것이다.
본 발명의 화합물은 기타 공지의 치료제와 조합하여 유리하게 사용될 수 있다. 예를 들어, 항혈관신생 활성을 갖는 화학식 I, II, III 또는 IV의 화합물이 세포독성 화학치료제, 예를 들어, 탁솔, 탁소티어, 빈블라스틴, 시스-플라틴, 독소루비신, 아드리아마이신 등과 함께 투여되어 증가된 항종양 활성을 생성할 수 있다. 또한, 치료적 효과의 부가적인 또는 상승적인 증대는 항혈관신생 활성을 갖는 화학식 I, II, III 또는 IV의 화합물과 다른 항혈관신생제, 예를 들어, 콤브레타스타틴 A-4, 엔도스타틴, 프리노매스타트, 셀레콕시브, 로포콕시브, EMD121974, IM862, 항-VEGF 모노클로날 항체 및 항-KDR 모노클로날 항체를 함께 투여하여 얻을 수 있다. 추가적인 배합은 제WO 0038716호, 제WO 00387171호, 제WO 0038715호, 제WO 0038730호, 제WO 0038718호, 제WO 0038665호, 제WO 0037107호, 제WO 0038786호, 제WO 0038719호(모두 1999. 12. 22.자로 동시에 출원되었고, 본원에서 모든 목적을 위해 참고로 그 전체가 인용되었음)에 예시되어 있다.
또한, 본 발명은 각각이 화학식 I의 화합물 및 그의 제약학상 허용되는 염, 제약학상 활성 대사산물 및 제약학상 허용되는 전구약물로부터 선택되는 약물의 유효량, 및 제약학상 허용되는 담체 또는 비히클을 포함하는 제약 조성물에 관한 것이다. 추가적으로, 본 발명은 치료를 필요로 하는 환자에게 이같은 약물의 유효량을 투여하는 것을 포함하는, 안과 질환/증상 및 암과 아울러 불필요한 혈관신생 및(또는) 세포 증식과 관련된 기타 질환을 치료하는 방법을 제공한다.
본 발명의 화학식 I, II, III 및 IV의 화합물은 안과 질환을 치료하고, 단백질 키나제의 활성을 매개하는데 유용하다. 보다 구체적으로, 화합물들은 항혈관신생제로 유용하고, 단백질 키나제의 활성을 조절하고(하거나) 저해하는 약물로 유용해서, 안과 질환 및 암 또는 단백질 키나제에 의해 매개되는 세포 증식과 관련된 기타 질환의 치료법을 제공한다.
본원에서 사용된 "알킬"이란 용어는 탄소 원자 수가 1 내지 12개인 직쇄 또는 분지쇄의 알킬기를 지칭한다. 예시적인 알킬기는 메틸(Me), 에틸(Et), n-프로필, 이소프로필, 부틸, 이소부틸, 2급-부틸, 3급-부틸(t-Bu), 펜틸, 이소펜틸, 3급-펜틸, 헥실, 이소헥실 등을 포함한다. "저급 알킬"이란 용어는 탄소 원자 수가 1 내지 8개인 알킬을 나타낸다(C1 -8-알킬). 적절하게 치환된 알킬은 플루오로메틸, 디플루오로메틸, 트리플루오로메틸, 2-플루오로에틸, 3-플루오로프로필, 히드록시메틸, 2-히드록시에틸, 3-히드록시프로필 등을 포함한다.
"알킬리덴"이란 용어는 탄소 원자 수가 1 내지 12개인 이가 라디칼을 지칭한다. 예시적인 알킬리덴기는 CH2, CHCH3, (CH3)2 등을 포함한다.
"알케닐"이란 용어는 탄소 원자 수가 2 내지 12개인 직쇄 및 분지쇄 알케닐기를 지칭한다. 예시적인 알케닐기는 프로프-2-에닐, 부트-2-에닐, 부트-3-에닐, 2-메틸프로프-2-에닐, 헥스-2-에닐 등을 포함한다.
"알키닐"이란 용어는 탄소 원자 수가 2 내지 12개인 직쇄 및 분지쇄 알키닐기를 지칭한다.
"시클로알킬"이란 용어는 탄소 원자 수가 3 내지 12개인 포화 또는 부분적으로 포화된 카르보시클을 지칭하며, 바이시클릭 및 트리시클릭 시클로알킬 구조를 포함한다. 적합한 시클로알킬은 시클로프로필, 시클로부틸, 시클로펜틸, 시클로헥실, 시클로헵틸 등을 포함한다.
"헤테로시클로알킬"기는 탄소 원자, 바람직하게는 4 또는 5개의 환 탄소 원자를 포함하고, 질소, 산소 및 황으로부터 선택되는 하나 이상의 헤테로원자를 포함하는, 포화 또는 부분적으로 불포화된 모노시클릭 라디칼을 의미한다.
"아릴" 및 "헤테로아릴"이란 용어는 모노시클릭 및 폴리시클릭 불포화 또는 방향족 환 구조를 지칭하고, "아릴"은 카르보시클인 것들을 지칭하며, "헤테로아릴"은 헤테로시클인 것들을 지칭한다. 방향족 환 구조의 예는 페닐, 나프틸, 1,2,3,4-테트라히드로나프틸, 푸릴, 티에닐, 피롤릴, 피리디닐, 피라졸릴, 이미다졸릴, 피라지닐, 피리다지닐, 1,2,3-트리아지닐, 1,2,4-옥사디아졸릴, 1,3,4-옥사디아졸릴, 1-H-테트라졸-5-일, 인돌릴, 퀴놀리닐, 벤조푸라닐, 벤조티오페닐(티아나프테닐) 등을 포함한다. 이러한 잔기들은 융합된-환 구조 또는 브릿지, 예를 들어 OCH2-O에 의해 임의로 치환될 수 있다.
"알콕시"란 용어는 라디칼 -O-알킬을 의미한다. 예시적인 예는 메톡시, 에톡시, 프로폭시 등을 포함한다.
"아릴옥시"란 용어는 -O-아릴(여기서, 아릴은 상기에서 정의된 것)을 나타낸다.
"시클로알콕시"란 용어는 -O-시클로알킬(여기서, 시클로알킬은 상기에서 정의된 것)을 의미한다.
"할로겐"이란 용어는 염소, 불소, 브롬 또는 요오드를 나타낸다. "할로"란 용어는 클로로, 플루오로, 브로모 또는 요오도를 나타낸다.
일반적으로, 화학식들에서 변화시킬 수 있는 다양한 잔기 또는 관능기는 하나 이상의 적합한 치환기로 임의로 치환될 수 있다. 예시적인 치환기는 할로겐(F, Cl, Br, 또는 I), 저급 알킬, -OH, -NO2, -CN, -CO2H, -O-저급 알킬, -아릴, -아릴-저급 알킬, -CO2CH3, -CONH2, -OCH2CONH2, -NH2, -SO2NH2, 할로알킬(예를 들어, -CF3, -CH2CF3), -O-할로알킬(예를 들어, -OCF3, -OCHF2) 등을 포함한다.
"포함하는" 및 "함유하는"이란 용어는 개방적 비제한적인 의미로 사용된다.
화학식 I의 화합물이 호변이성현상을 나타낼 수 있고, 본 명세서 내의 화학식의 도면은 가능한 호변이성 형태 중 단 하나만을 명시하고 있음은 이해될 것이다. 따라서, 본 발명의 범위 내에서, 화학식은 나타낸 화합물의 임의의 호변이성 형태를 나타내도록 의도된 것이고, 화학식 도면에 의해 나타낸 특정 호변이성 형태만으로 제한되는 것으로 해석되지는 않는다는 것이 이해될 것이다.
본 발명의 일부 화합물들은 단일 입체이성질체(즉, 본질적으로 다른 입체이성질체가 결여된 것), 라세미체, 및(또는) 거울상이성질체 및(또는) 부분입체이성질체의 혼합물로 존재할 수 있다. 이같은 단일 입체이성질체, 라세미체 및 이들의 혼합물은 모두 본 발명의 범위 내에 있는 것으로 의도된다. 바람직하게는, 광학적으로 활성이 있는 본 발명의 화합물들은 광학적으로 순수한 형태로 사용된다.
당업자들이 일반적으로 이해하는 바와 같이, 하나의 키랄 중심을 갖는 광학적으로 순수한 화합물은 두개의 가능한 거울상이성질체 중 하나로 실질적으로 이루어지는 것이고(즉, 거울상이성질체 면에서 순수하고), 하나 이상의 키랄 중심을 갖는 광학적으로 순수한 화합물은 부분입체이성질체적으로 순수하고, 거울상이성질체적으로 순수한 것이다. 바람직하게는, 본 발명의 화합물은 광학적으로 90% 이상 순수한 형태, 즉 90% 이상의 단일 이성질체를 포함하는 형태(80% 거울상이성질체 과량 ("e.e.") 또는 부분입체이성질체 과량("d.e."))이고, 더욱 바람직하게는, 95% 이상(90% e.e. 또는 d.e.), 더욱더 바람직하게는 97.5% 이상(95% e.e.또는 d.e.), 가장 바람직하게는 99% 이상(98% e.e. 또는 d.e.)인 형태이다.
아울러, 화학식은 확인된 구조의 비용매화된 형태와 아울러 용매화된 형태를 포괄하는 것으로 의도된다. 예를 들어, 화학식 I은 수화된 형태 및 비수화된 형태 모두를 나타내는 구조의 화합물을 포함한다. 용매화물의 다른 예는 이소프로판올, 에탄올, 메탄올, DMSO, 에틸 아세테이트, 아세트산, 또는 에탄올아민과 조합된 구조를 포함한다.
화학식 I, II, III 및 IV의 화합물과 아울러, 본 발명의 화합물은 이같은 화합물의 제약학상 허용되는 전구약물, 제약학상 활성 대사산물 및 제약학상 허용되는 염을 포함한다.
"제약학상 허용되는 전구약물"은 생리학적 조건 하에서 또는 가용매분해에 의해 특정 화합물 또는 이같은 화합물의 제약학상 허용되는 염으로 전환될 수 있는 화합물이다.
"제약학상 활성 대사산물"은 특정 화합물 또는 그 염의 생체 내에서의 대사를 통해 생성되는 제약학상 활성 산물을 의미한다. 화합물의 대사산물은 당업계에 공지된 통상적인 기술을 사용하여 확인될 수 있고, 그 활성은 본원에서 기술된 것과 같은 시험을 이용하여 측정될 수 있다.
화합물의 전구약물 및 활성 대사산물은 당업계에 공지된 통상적인 기술을 이용하여 확인될 수 있다. 예를 들어, 문헌[Bertolini, G. 등, J. Med . Chem ., 40, 2011-2016 (1997); Shan, D. 등, J. Pharm . Sci., 86(7), 765-767; Bagshawe K., Drug Dev . Res., 34, 220-230 (1995); Bodor, N., Advances in Drug Res., 13, 224-331 (1984); Bundgaard, H., Design of Prodrugs (Elsevier Press 1985); 및 Larsen, I. K., Design and Application of Prodrugs, Drug Design and Development (Krogsgaard-Larsen 등, eds., Harwood Academic Publishers, 1991)]을 참조한다.
"제약학상 허용되는 염"은 특정 화합물의 유리 산 및 염기의 생물학적 효능을 보유하고, 생물학적으로 또는 달리 바람직하지 않은 것이 아닌 염을 의미하도록 의도된다. 본 발명의 화합물은 충분히 산성이거나, 충분히 염기성이거나, 또는 양쪽 관능기를 모두 가질 수 있으며, 따라서, 임의의 다수의 무기 또는 유기 염기, 및 무기 및 유기 산과 반응하여 제약학상 허용되는 염을 형성할 수 있다. 예시적인 제약학상 허용되는 염은 본 발명의 화합물과 무기산 또는 유기산 또는 무기 염기와 반응하여 제조되는 염, 예를 들어, 술페이트, 피로술페이트, 비술페이트, 술파이트, 비술파이트, 포스페이트, 모노히드로겐포스페이트, 디히드로겐포스페이트, 메타포스페이트, 피로포스페이트, 클로리드, 브로미드, 요오디드, 아세테이트, 프로피오네이트, 데카노에이트, 카프릴레이트, 아크릴레이트, 포르메이트, 이소부티레이트, 카프로에이트, 헵타노에이트, 프로피올레이트, 옥살레이트, 말로네이트, 숙시네이트, 수베레이트, 세바케이트, 푸마레이트, 말레이트, 부틴-1,4-디오에이트, 헥신-1,6-디오에이트, 벤조에이트, 클로로벤조에이트, 메틸벤조에이트, 디니트로벤조에이트, 히드록시벤조에이트, 메톡시벤조에이트, 프탈레이트, 술포네이트, 크실렌술포네이트, 페닐아세테이트, 페닐프로피오네이트, 페닐부티레이트, 시트레이트, 락테이트, γ-히드록시부티레이트, 글리콜레이트, 타르트레이트, 메탄-술포네이트, 프로판술포네이트, 나프탈렌-1-술포네이트, 나프탈렌-2-술포네이트 및 만델레이트와 같은 염을 포함한다.
본 발명의 화합물이 염기라면, 바람직한 제약학상 허용되는 염은 당업계에서 이용가능한 임의의 적합한 방법, 예를 들어, 유리 염기를 염산, 브롬산, 황산, 질산, 인산 등과 같은 무기산으로 처리하거나, 또는 아세트산, 말레산, 숙신산, 만델산, 푸마르산, 말론산, 피루브산, 옥살산, 글리콜산, 살리실산, 피라노시딜산(예를 들어, 글루쿠론산 또는 갈락투론산), 알파-히드록시산(예를 들어, 시트르산 또는 타르타르산), 아미노산(예를 들어, 아스파르트산 또는 글루탐산), 방향족산(예를 들어, 벤조산 또는 신남산), 술폰산(예를 들어, p-톨루엔술폰산 또는 에탄술포산) 등으로 처리하여 제조될 수 있다.
본 발명의 화합물이 산이라면, 바람직한 제약학상 허용되는 염은 임의의 적합한 방법, 예를 들어, 유리 산을 아민(1급, 2급 또는 3급), 알칼리 금속 수산화물 또는 알칼리 토금속 수산화물 등과 같은 무기 또는 유기 염기로 처리하여 제조될 수 있다. 적합한 염의 예시적인 예는 글리신 및 아르기닌과 같은 아미노산, 암모니아, 1급, 2급 및 3급 아민, 및 시클릭 아민(예를 들어, 피페리딘, 모르폴린 및 피페라진)으로부터 유래한 유기염 및 나트륨, 칼슘, 칼륨, 마그네슘, 망간, 철, 구리, 아연, 알루미늄 및 리튬으로부터 유래한 무기염을 포함한다.
고형 약물의 경우, 본 발명의 화합물 및 염이 상이한 결정 또는 다형성 형태로 존재할 수 있고, 이들 모두가 본 발명의 범위 및 특정된 화합물에 들어가도록 의도된 것이라는 점이 당업자들에게 이해될 것이다.
치료적 유효량의 본 발명의 약물을 단백질 키나제의 조정 또는 조절에 의해 매개되는 질환을 치료하기 위해 사용될 수 있다. "유효량"이란 이같은 치료를 필요로 하는 포유동물에게 투여되었을 때, 하나 이상의 단백질 키나제, 예를 들어, 티로신 키나제의 활성에 의해 매개되는 질환을 치료하기에 충분한 약물의 양을 의미하도록 의도된다. 따라서, 예를 들어, 치료적 유효량의 화학식 I의 화합물, 그의 염, 활성 대사산물 또는 전구약물은 하나 이상의 단백질 키나제에 의해 매개되는 질환 증상이 감소되거나 또는 완화되도록 이같은 활성을 조정, 조절 또는 저해하는데 충분한 양이다.
이같은 양에 해당하는 해당 약물의 양은 특정 화합물, 질환 증상 및 그 중증도, 치료를 필요로 하는 동물의 특성(예를 들어, 체중)과 같은 인자에 따라 달라질 것이지만, 그럼에도 불구하고, 당업자들은 이를 통상적으로 결정할 수 있을 것이다. "치료"는 티로신 키나제와 같은 하나 이상의 단백질 키나제의 활성에 의해 최소한 부분적으로 병에 걸리는 사람과 같은 포유동물의 질환 증상이 최소한 완화되는 것을 의미하고, 특히 포유동물이 이같은 질환 증상에 걸리기 쉬운 것으로 발견되었으나, 아직 걸리지 않은 것으로 진단되었을 때, 포유동물에서 질환 증상이 발생하는 것을 예방하는 것; 질환 증상을 조정 및(또는) 저해하는 것; 및(또는) 질환 증상을 완화하는 것을 포함한다.
본 발명의 약물은 용이하게 구입할 수 있는 출발물질을 이용하여 당업계에서 이용할 수 있는 기술을 사용하여 하기에서 기술되는 반응 경로 및 합성 반응식을 이용하여 제조될 수 있다.
한 일반적인 합성 방법에서, 화학식 I의 화합물은 하기 반응식 1에 따라 제조된다:
6-니트로인다졸(화합물 V)을 수성/유기성 혼합물중에서, 바람직하게는, 디옥산과 함께, 요오드와 염기, 예를 들어, NaOH로 처리한다. 혼합물을 산성화하고, 생성물을 여과하여 단리한다. 디클로로메탄-50% 수성 KOH 중의 생성된 3-요오도-6-니트로인다졸에 0℃에서 보호기("Pg") 시약(여기서, X=할로), 바람직하게는 트리메틸실릴에톡시메틸 클로리드(SEM-Cl) 및 상 전이 촉매, 예를 들어, 3급-부틸암모늄 브로미드(TBABr)를 첨가한다. 1-4 시간 후, 두 상을 희석하고, 유기상을 분리한 후, 황산나트륨으로 건조시키고, 여과하고, 농축시킨다. 조 생성물을 실리카겔 크로마토그래피로 정제하여 화학식 VI의 화합물을 생성한다. 적합한 유기 용매 중의 화학식 VI의 화합물을 적합한 R1-유기금속 시약, 바람직하게는, R1-보론산으로, 수성 염기(예를 들어, 탄산나트륨) 및 적합한 촉매, 바람직하게는 Pd(PPh3)4 존재 하에서 처리하여, 추출 후처리 및 실리카겔 크로마토그래피 후, 화학식 VII의 화합물을 생성한다. R1 치환기는 산화적 절단(예를 들어, 오존분해) 후에 생성된 알데히드 관능기에 비티그(Wittg)의 첨가 또는 축합 변형에 의해 화학식 VII의 화합물 또는 이 반응 전체에서 이후의 중간체 내에서 교환될 수 있다(실시예 42(a-e)에 예시됨). 환원제, 바람직하게는 SnCl2를 이용하여 화학식 VII의 화합물을 처리하면, 통상적인 수성 후처리 및 정제 후에 화학식 VIII의 화합물을 생성한다. Y=NH 또는 N-저급 알킬인 일련의 유도체의 경우, 화학식 VIII의 화합물은 염기, 바람직하게는 Cs2CO3, 및 촉매, 바람직하게는, Pd-BINAP 존재 하에서, 아릴 또는 헤테로아릴 클로리드, 브로미드, 요오디드 또는 트리플레이트로 처리하여(여기서, Y=N-저급 알킬인 경우, 후속 알킬화 단계 처리) 화학식 X의 화합물을 생성한다. 다른 Y 결합을 생성하기 위해서, 냉각된 표준 수용성 산성 조건 하에서 아질산나트륨이 화학식 VIII의 화합물에 첨가된 후, 요오드화칼륨을 첨가하고, 적당하게 가온한다. 표준 후처리 및 정제하여 화학식 IX의 요오디드 화합물을 생성한다.
화학식 IX의 화합물을 유기금속 시약, 예를 들어, 부틸리튬으로 처리하여 리튬 할로겐 교환을 촉진시킨다. 이후 이 중간체를 R2 친전자체, 예를 들어, 카르보닐 또는 트리플레이트와 추가적인 금속 및 촉매, 바람직하게는 염화아연 및 Pd(PPh3)4의 적절한 매개를 통해 반응시켜 화학식 X의 화합물을 생성한다. 별법으로, 화학식 IX의 화합물을 유기보론산과 같은 유기금속 시약을 사용하여, 촉매, 예를 들어, Pd(PPh3)4의 존재 및 일산화탄소 분위기 하에서 처리하여 화학식 X의 화합물을 생성한다. 별법으로, Y=NH 또는 S인 유도체의 경우, 화학식 IX의 화합물을 염기, 바람직하게는 Cs2CO3 또는 K3PO4 및 촉매, 바람직하게는 Pd-BINAP 또는 Pd-(비스-시클로헥실)비페닐포스핀 존재 하에서 적절한 아민 또는 티올을 사용하여 처리하여서 화학식 X의 화합물을 생성한다. 통상적인 관능기 교환, 예를 들어, 산화, 환원, 알킬화, 아실화, 축합 및 탈보호가 이후 사용되어 추가적으로 이들 일련의 화합물을 유도체화하여 화학식 I의 최종 화합물을 생성할 수 있다.
또한, 본 발명의 화학식 I의 화합물은 하기 반응식 2에 나타낸 일반적인 방법에 따라서도 제조될 수 있다.
6-요오도인다졸 (XI)을 수성/유기성 혼합물 중에서, 바람직하게는 디옥산과 함께 요오드 및 염기, 예를 들어 NaOH로 처리한다. 혼합물을 산성화하고 생성물 XII를 여과 단리한다. 그 결과 생성된 디클로로메탄-50% 수성 KOH 중의 3,6 디-요오도인다졸에 보호기 시약, 바람직하게는 SEM-Cl, 및 상 전이 촉매, 예를 들어 TBABr을 0℃에서 첨가한다. 2상을 희석하여 유기상을 분리하고, 황산나트륨으로 건조시켜 여과 및 농축시킨다. 조 생성물을 실리카겔 크로마토그래피로 정제하여, 화학식 XIII의 화합물을 얻는다. 적합한 유기 용매 중의 화학식 XIII의 화합물을 적합한 R2-유기금속 시약, 예를 들어 R2-ZnCl 또는 보론 R2-보론 시약, 및 적합한 촉매, 바람직하게는 Pd(PPh3)4로 처리하고, 추출 후처리 및 실리카겔 크로마토그래피 후 화학식 XIV의 화합물을 얻는다. 적합한 유기 용매 중의 화학식 XIV의 화합물을 수성 염기, 탄산나트륨 및 적합한 촉매, 바람직하게는 Pd(PPh3)4의 존재하에 적합한 R1-유기금속 시약 (예를 들어, 보론 R1-보론 시약 또는 R1-ZnCl)으로 처리하고, 추출 후처리 및 실리카겔 크로마토그래피 후 화학식 XV의 화합물을 얻는다. 그리고, 통상적인 관능기 교환, 예를 들면 산화, 환원, 알킬화, 아실화, 축합 및 탈보호로 이들 일련의 화합물을 추가로 유도체화하여 화학식 I의 최종 화합물을 얻을 수 있다.
별법으로, R2가 치환된 또는 비치환된 Y-Ar (여기서, Y는 O 또는 S임)인 화학식 I의 화합물은 하기 반응식 3에 따라 제조할 수 있다.
3-클로로-시클로헥스-2-에논 (XV), H-R2 및 무수 탄산칼륨의 교반된 아세톤 용액을 15-24시간 동안 환류하고, 냉각 및 여과한다. 여액의 농축 및 실리카겔 상에서의 크로마토그래피로, 3-R2-시클로헥스-2-에논 (XVI)을 얻는다.
화학식 XVI의 케톤을 적합한 염기 (M-B), 바람직하게는 리튬 비스(트리메틸실릴)아미드와 반응시킬 수 있고, R1-CO-X (여기서, X = 할로겐)와 반응시킬 수 있으며, 이후 표준적인 산 후처리 및 정제로 화학식 XVII의 화합물을 얻는다. 히드라진 일수화물과 합한 HOAc/EtOH 중의 이 생성물을 적합한 온도에서 적절한 시간 주기 동안, 바람직하게는 60-80℃에서 2-4시간 동안 가열한다. 냉각 후 혼합물을 포화 중탄산나트륨 용액에 붓고, 유기 용매로 추출하여 농축시키고 실리카겔 상에서 정제하여, 화학식 XVIII의 화합물을 얻는다. 화학식 XVIII의 화합물은 다양한 공지의 방법으로 산화하여 화학식 I의 화합물을 얻을 수 있다.
본 발명의 화합물을 합성하는 별법은 다음과 같다.
단계 a) 내지 i)의 조건은 이하와 같다:
a) NaNO2, Br2, HBr, 0℃ 내지 -5℃; 48% 수율;
b) Pd(OAc)2, Pd(o-톨릴)3, 디-이소프로필 에틸 아민 (DIEA), DMF, H2O, 탈기, 마이크로파, 110℃, 1시간; 68% 수율;
c) 철 분말, 포화 수성 NH4OH, EtOH, 45℃; 72% 수율;
d) 메틸-2-브로모벤조에이트, R-BINAP, Pd2(dba)3, Cs2CO3, 톨루엔, 탈기, 110℃ 하룻밤; 74% 수율;
e) KOH, MeOH:THF:H2O (3:1:1) 70℃, 2-3시간; 정량;
f) 보호된 아민, HATU, NEt3, DMF, 실온에서 2시간 동안; 80% 수율;
g) TsOH (HOAc 중의 12% TsOH), EtOH (10% 수성); 44% 수율;
h) 트리부틸비닐틴, Pd(PP3)4, 2,6-디-t-부틸-4-메틸페놀, 톨루엔, 탈기, 105℃; 31% 수율;
i) Pd(OAc)2, Pd(o-톨릴)3, DIEA, DMF, 탈기, 100℃; 약 70% 수율.
화학식 I의 기타 화합물은 상기 기술된 통상적인 방법 또는 본원의 실시예에 기술된 상세한 방법과 유사한 방식으로 제조될 수 있다. 수용체에 대한 본 발명의 화합물의 친화도는 바람직하게는, 운반체 잔기에 의해 제공되는 스캐폴딩(scaffolding)을 사용하여 가깝게 근접된 다수 카피의 리간드를 제공함으로써 향상될 수 있다. 잔기 간에 최적의 간격을 갖는 이러한 다가 화합물은, 수용체에 대한 결합을 현저하게 개선시키는 것으로 입증되었다. 예를 들어, 문헌 [Lee 등, Biochem, 23, 4255 (1984)] 참조. 다가성 (multivalency) 및 간격은 적합한 운반체 잔기 또는 링커 유닛을 선택함으로써 조절될 수 있다. 이러한 잔기들은 본 발명의 화합물과 관련된 관능기와 반응할 수 있는 다수의 관능기를 포함하는 분자 지지체들을 포함한다. 물론, 단백질, 예를 들어 BSA 또는 HAS, 예를 들어 펜타펩티드, 데카펩티드, 펜타데카펩티드 등을 포함하는 다수의 펩티드를 포함하는 다양한 운반체가 사용될 수 있다. 펩티드 또는 단백질은 그 측쇄에 유리 아미노기를 갖는 아미노산 잔기를 원하는 수로 함유할 수 있지만, 기타 관능기, 예를 들면 술프히드릴기 또는 히드록실기도 안정한 결합을 얻는데 사용될 수 있다.
다른 것중에서도, 수용체 VEGF, FGF, CDK 복합체, TEK, CHK1, LCK, FAK, 및 특히 포스포릴라제 키나제와 관련된 단백질 키나제 활성을 강력하게 조절, 조정 또는 저해하고 혈관신생 및(또는) 세포 증식을 저해하는 화합물이 바람직하며 본 발명의 하나의 바람직한 실시태양이다. 또한, 본 발명은 본 발명의 약물을 투여함으로써, 예를 들어 포유동물 조직에서 단백질 키나제 활성을 조정 또는 저해하는 방법에 관한 것이다. 단백질 키나제 활성, 예를 들어 키나제 활성의 조정자로서의 본 발명의 화합물의 활성은, 생체내 및(또는) 시험관내 검정법을 비롯하여 당업자에게 이용가능한 임의의 방법으로 측정할 수 있다. 활성 측정을 위한 적합한 검정법은, 예를 들어 문헌 [Parast C. 등, BioChemistry, 37, 16788-16801 (1998); Jeffrey 등, Nature, 376, 313-320 (1995); WIPO 국제 공개 제WO 97/34876호; 및 WIPO 국제 공개 제WO 96/14843호]에 기술된 것들을 포함한다. 이러한 성질들은, 예를 들면 이하 실시예에서 기술하는 생물학적 시험 방법 중 하나 이상을 사용하여 평가할 수 있다.
본 발명의 활성 약물은 이하 기술하는 바와 같이, 제약 조성물로 제제화될 수 있다. 본 발명의 제약 조성물은 조정, 조절 또는 저해에 유효한 양의 화학식 I, II, III 또는 IV의 화합물, 및 불활성의 제약학상 허용되는 담체 또는 희석제를 포함한다. 제약 조성물의 일 실시태양에서, 유효 수준의 본 발명의 약물은 단백질 키나제의 조절을 포함하는 치료적 이익을 얻기 위해 제공된다. "유효 수준"이란 단백질 키나제의 효과가 최소한, 조절되는 수준을 의미한다. 이러한 조성물은 투여 방식, 예를 들어 비경구 또는 경구 투여에 적절한 단위-투여 형태로 제조된다.
본 발명의 약물은 통상적인 방법에 따라, 활성 성분으로서 치료적 유효량의 약물(예를 들어, 화학식 I의 화합물)을 적절한 제약학상 담체 또는 희석제와 배합하여 제조된 통상적인 투여형으로 투여된다. 이러한 방법은 목적하는 제제에 적절하도록 성분들을 혼합, 과립화, 및 압축 또는 용해시키는 것을 포함할 수 있다.
사용되는 제약학상 담체는 고체 또는 액체일 수 있다. 예시적인 고체 담체는 락토스, 수크로스, 활석, 젤라틴, 아가, 펙틴, 아카시아, 스테아르산마그네슘, 스테아르산 등이다. 예시적인 액체 담체는 시럽, 피넛 오일, 올리브 오일, 물 등이다. 이와 마찬가지로, 담체 또는 희석제는 당 분야에 공지된 시간-지연 또는 시간-방출 물질, 예를 들어 글리세릴 모노스테아레이트 또는 글리세릴 디스테아레이트를 단독으로, 또는 왁스, 에틸셀룰로오스, 히드록시프로필메틸셀룰로오스, 메틸메타크릴레이트 등과 함께 포함할 수 있다.
다양한 제약학상의 형태가 사용될 수 있다. 따라서, 만일 고체 담체가 사용된다면, 제제는 정제화되거나, 분말 또는 펠렛형으로 경질 젤라틴 캡슐 내에 넣거나, 트로키 또는 로젠지 형태일 수 있다. 고체 담체의 양은 변할 수 있지만, 일반적으로는 약 25 mg 내지 약 1 g일 것이다. 만일 액체 담체가 사용된다면, 제제는 시럽, 유화액, 드롭, 연질 젤라틴 캡슐, 앰플이나 바이알 중의 무균 주사 용액이나 현탁액, 또는 비수성 액체 현탁액의 형태일 것이다.
안정한 수용성 투여형을 얻기 위해, 본 발명의 약물의 제약학상 허용되는 염을 유기산 또는 무기산 수용액, 예를 들어 0.3 M의 숙신산 또는 시트르산 용액에 용해시킨다. 만일 가용성인 염 형태를 얻을 수 없다면, 약물을 적합한 공용매, 또는 공용매의 배합물에 용해시킬 수 있다. 적합한 공용매는, 예를 들어 총 부피의 0-60% 농도 범위의 알코올, 프로필렌 글리콜, 폴리에틸렌 글리콜 300, 폴리소르베이트 80, 글리세린 등을 포함하지만, 이에 한정되지는 않는다. 예시적인 실시태양에서, 화학식 I의 화합물은 DMSO에 용해되고 물로 희석된다. 조성물은 또한, 적절한 수성 비히클, 예를 들어 물 또는 등장성 식염수 또는 덱스트로스 용액 중의 염 형태인 활성 성분의 용액 형태일 수 있다.
본 발명의 조성물에 사용된 약물의 실제 용량은 사용되는 특정 복합체, 제제화된 특정 조성물, 투여 방식, 및 치료되는 특정 부위, 숙주 및 질환에 따라 변화할 수 있음을 이해할 것이다. 당업자는 약물에 대한 실험 데이터에 비추어 통상적인 용량-결정 시험으로, 주어진 조건 세트에 대한 최적 용량을 확정할 수 있다. 경구 투여에 대해 일반적으로 사용되는 예시적인 1일 용량은, 약 0.001 내지 약 1000 mg/체중 kg, 보다 바람직하게는 약 0.001 내지 약 50 mg/체중 kg이고, 적절한 간격으로 반복되는 치료 과정을 갖는다. 전구약물의 투여는 통상적으로, 완전한 활성 형태의 중량 수준과 화학적으로 동등한 중량 수준으로 투여된다.
본 발명의 조성물은 제약 조성물의 제조에 대해 일반적으로 공지된 방식으로, 예를 들면 통상적인 기술, 예컨대 혼합, 용해, 과립화, 당의정-제조, 분말화 (levigating), 유화, 캡슐화, 트랩핑 또는 동결건조를 사용하여 제조될 수 있다. 제약 조성물은 하나 이상의 생리학상 허용되는 담체를 사용하여 통상적인 방식으로 제제화될 수 있고, 상기 담체는 활성 화합물의 제약학상 사용될 수 있는 제제로의 처리를 용이하게 하는 부형제 및 보조제로부터 선택될 수 있다.
적절한 제제는 선택된 투여 경로에 의해 좌우된다. 주사하기 위해서는, 본 발명의 약물을 바람직하게는 생리학상 적합한 완충액, 예를 들어 행크스 (Hanks) 용액, 링거 용액, 또는 생리 식염수 완충액 중의 수용액으로 제제화할 수 있다. 경점막 투여를 위해서는, 통과할 방어벽에 적절한 투과제가 제제화에 사용된다. 상기 투과제는 통상적으로 당 분야에 공지되어 있다.
경구 투여를 위해서는, 활성 화합물을 당 분야에 공지된 제약학상 허용되는 담체와 배합함으로써 화합물을 용이하게 제제화할 수 있다. 상기 담체는 본 발명의 화합물을 치료받는 환자가 경구로 섭취하기 위해 정제, 환제, 당의정, 캡슐, 액체, 겔, 시럽, 슬러리, 현탁액 등으로 제제화할 수 있다. 경구용 제약 제제는 활성 성분 (약물)과 혼합된 고체 부형제를 사용하고, 임의로 생성된 혼합물을 분쇄하며, 필요에 따라 적합한 보조제의 첨가 후 과립 혼합물을 가공하여 정제 또는 당의정 코어를 수득함으로써 얻을 수 있다. 적합한 부형제는 충전제, 예를 들어 락토스, 수크로스, 만니톨 또는 소르비톨을 포함하는 당류; 및 셀룰로스 제제, 예를 들어 옥수수 전분, 밀 전분, 쌀 전분, 감자 전분, 젤라틴, 검, 메틸 셀룰로오스, 히드록시프로필메틸-셀룰로오스, 소듐 카르복시메틸셀룰로오스 또는 폴리비닐피롤리돈 (PVP)을 포함한다. 필요에 따라, 붕해제, 예를 들어 가교결합된 폴리비닐 피롤리돈, 아가, 또는 알긴산이나 알긴산나트륨과 같은 그의 염을 첨가할 수 있다.
당의정 코어에는 적합한 코팅이 제공된다. 이를 위해 농축된 당 용액을 사용할 수 있는데, 이는 임의로 아라비아 검, 폴리비닐 피롤리돈, 카르보폴 겔, 폴리에틸렌 글리콜, 및(또는) 이산화티탄, 락커 용액, 및 적합한 유기 용매 또는 용매 혼합물을 함유할 수 있다. 상이한 활성 약물 조합을 확인하거나 그 특징을 나타내기 위해, 염료 또는 안료를 정제 또는 당의정 코팅에 첨가할 수 있다.
경구로 사용될 수 있는 제약 제제는 젤라틴으로 제조된 푸쉬-핏 (push-fit) 캡슐, 뿐만 아니라 젤라틴 및 가소제, 예를 들어 글리세롤 또는 소르비톨로 제조된 연질의 밀폐된 캡슐을 포함한다. 푸쉬-핏 캡슐은 락토스와 같은 충전제, 전분과 같은 결합제, 및(또는) 활석 또는 스테아르산마그네슘과 같은 윤활제, 및 임의로 안정제와 혼합된 활성 성분을 함유할 수 있다. 연질 캡슐에서, 활성 약물은 적합한 액체, 예를 들어 지방 오일, 액체 파라핀 또는 액체 폴리에틸렌 글리콜에 용해 또는 현탁될 수 있다. 또한, 안정제가 첨가될 수 있다. 경구 투여를 위한 모든 제제는 그러한 투여에 적합한 용량이어야 한다. 협측 투여를 위해서는, 조성물이 통상적인 방식으로 제제화된 정제 또는 로젠지 형태일 수 있다.
비강내 또는 흡입에 의한 투여를 위해, 본 발명에 따라 사용되는 화합물은 통상적으로 적합한 추진제, 예를 들어, 디클로로디플루오로메탄, 트리클로로플루오로메탄, 디클로로테트라플루오로에탄, 이산화탄소 또는 기타 적합한 기체를 사용하여 가압 팩 또는 분무기로부터 제공되는 에어로졸 스프레이 형태로 편리하게 전달된다. 가압 에어로졸의 경우, 용량 단위는 계량된 양을 전달하기 위한 밸브를 제공함으로써 결정될 수 있다. 흡입기 또는 주입기 등에 사용하기 위한 젤라틴 캡슐 및 카트리지는 화합물 및 적합한 분말 베이스(예를 들어, 락토스 또는 전분)의 분말 믹스(mix)를 함유하도록 제제화될 수 있다.
화합물은 주사에 의한 비경구 투여, 예를 들어 볼루스 주사 또는 지속적인 주입을 위해 제제화될 수 있다. 주사를 위한 제제는, 예를 들어 보존제가 첨가된 앰플 또는 다용량 용기에 담긴 단위-투여 형태로 제공될 수 있다. 조성물은 유성 또는 수성 비히클 중의 현탁액, 용액 또는 유화액과 같은 형태를 취할 수 있고, 제제화제, 예를 들어 현탁화제, 안정화제 및(또는) 분산제를 함유할 수 있다.
비경구 투여를 위한 제약 제제는 수용성 형태의 활성 화합물의 수용액을 포함한다. 또한, 활성 약물의 현탁액은 적절한 유성 주사 현탁액으로서 제조될 수 있다. 적합한 친유성 용매 또는 비히클은 지방 오일, 예를 들어 참깨씨유, 또는 합성 지방산 에스테르, 예를 들어 에틸올리에이트 또는 트리글리세리드, 또는 리포좀을 포함한다. 수성 주사 현탁액은 현탁액의 점성을 증가시키는 성분, 예를 들어 소듐 카르복시메틸 셀룰로오스, 소르비톨 또는 덱스트란을 함유할 수 있다. 또한 현탁액은 임의로, 고도로 농축된 용액이 제조되도록 하기 위해 화합물의 용해도를 증가시키는 적합한 안정화제 또는 약물을 함유할 수 있다.
안구에 투여하기 위해 화학식 I, II, III 또는 IV의 화합물은 예를 들어 전방, 후방, 유리체, 방수, 유리체 액, 각막, 홍체/모양체, 수정체, 맥락막/망막 및 공막을 비롯한 각막 및(또는) 공막 및 안구의 내부 영역을 통과하기에 충분한 시간 주기 동안 화합물이 안구 표면과 접촉하여 유지되도록, 제약학상 허용되는 안과용 비히클 내에서 전달된다. 제약학상 허용되는 안과용 비히클은 연고, 식물유, 또는 캡슐화 물질일 수 있다. 본 발명의 화합물은 또한, 유리체 액 또는 방수 내로 직접적으로 주사할 수 있다.
또한, 화합물은 공지된 허용되는 방법, 예를 들어 테논하 (subtenon) 및(또는) 결막하 주사로 투여될 수도 있다. 안과 분야에서 잘 알려진 바와 같이, 황반은 주로 망막 추체로 구성되며 망막에서 시력이 최대인 영역이다. 테논 (Tenon) 캡슐 또는 테논 막은 공막 상에 위치하고 있다. 결막 36은 안구 후방에서 가장자리로의 짧은 영역(안구 결막)을 덮고 있고, 위로 (상부 맹낭(cul-de-sac)) 또는 아래로 (하부 맹낭) 접혀 윗눈꺼풀 및 아랫눈꺼풀의 내부 영역을 각각 덮는다. 결막은 테논 캡슐의 최상부에 배치되어 있다.
공막 및 테논 캡슐은 안구의 외부 표면을 한정하고 있다. ARMD, CNV, 망막병증, 망막염, 포도막염, 낭포 황반 부종 (CME), 녹내장, 및 안구 후방부의 기타 질병 또는 증상을 치료하기 위해서는, 특정량의 안과학상 허용되는 제약 활성 약물의 데포를 공막의 외부 표면 상에, 그리고 테논 캡슐의 아래쪽에 직접 배치하는 것이 바람직하다. 또한 ARMD 및 CME의 경우, 공막의 외부 표면 상에, 테논 캡슐의 아래쪽에, 그리고 일반적으로는 황반 위에 데포를 직접 배치하는 것이 가장 바람직하다. 뉴질랜드 백색 토끼를 사용한 연구에서, 스테랄로이즈 사 (Steraloids, Inc., 뉴햄프셔 윌톤)로부터 입수가능한 혈관신생 스테로이드인 4,9(11)-프레그나디엔-17.알파.,21-디올-3,20-디온-21-아세테이트의 약물 데포를 공막의 외부 표면 상에, 테논 캡슐의 아래쪽에, 그리고 토끼 안구 적도의 약간 후방부에 직접 배치했다. 상기 약물 데포는 주입한 후 측정한 날에 망막 전체 상에서 평균치를 구했을 때, 토끼 안구의 결막 아래쪽이지만 테논 캡슐 위에 위치한 데포로 유사한 농도를 전달했을 때보다 약 10배 높은 혈관신생 스테로이드의 농축을 야기했다. 뉴질랜드 백색 토끼의 테논 캡슐이 매우 얇다는 사실을 고려하면, 이와 같은 유리한 결과는 전혀 예상 밖의 것이었다. 인간 안구의 테논 캡슐도 매우 얇다는 것을 주지하는 것이 중요하다. 4,9(11)-프레그나디엔-17.알파.,21-디올-3,20-디온-21-아세테이트, 및 관련 화합물인 4,9(11)-프레그나디엔-17.알파.,21-디올-3,20-디온은, 미국 특허 제5,770,592호 및 제5,679,666호 (이는 본원에서 모든 목적을 위해 참고로 인용됨)에 상세하게 기재되어 있다.
별법으로, 활성 성분은 사용하기 전에 적합한 비히클, 예를 들어 무균 무발열원성의 물로 구성하기 위한 분말 형태일 수 있다. 또한, 화합물은, 예를 들어 코코아 버터나 기타 글리세리드와 같은 통상적인 좌제 베이스를 함유하는 직장 조성물, 예를 들어 좌제 또는 정체 관장약으로도 제제화될 수도 있다.
상기 기술한 제제 이외에, 화합물은 데포 제제로도 제제화될 수 있다. 이러한 지속형 제제는 이식 (예를 들어, 피하 또는 근육내), 근육내 주사, 또는 상기 언급한 테논하 또는 유리체내 주사로 투여될 수 있다.
본 발명의 특히 바람직한 실시태양에서, 화합물은 식염수 중에서 (안구용 제제에 흔히 사용되는 임의의 보존제 및 항미생물제와 배합되어) 국부적으로 투여하기 위해 제조될 수 있고, 점안제 형태로 투여될 수 있다. 항-혈관신생 인자 용액 또는 현탁액은 순수한 형태로 제조되어 매일 수 회 투여될 수 있다. 별법으로, 상기 기술한 바와 같이 제조된 항-혈관신생 조성물은 각막에 직접 투여될 수도 있다.
바람직한 실시태양에서, 조성물은 각막에 결합하는 점막-점착성 중합체와 함께 제조된다. 따라서, 예를 들어, 화합물은 적합한 중합성 또는 소수성 물질 (예를 들어, 허용되는 오일 중의 유화액으로서) 또는 이온-교환 수지와 함께, 또는 난용성 유도체, 예를 들어 난용성 염으로서 제제화될 수 있다. 추가의 실시태양에서, 항-혈관신생 인자 또는 항-혈관신생 조성물은 통상적인 스테로이드 요법에 부가적으로 사용될 수 있다.
소수성 화합물에 대한 제약학상 담체는 벤질 알코올, 비극성 계면활성제, 수-혼화성 유기 중합체 및 수성상을 포함하는 공용매계이다. 공용매계는 VPD 공-용매계일 수 있다. VPD는 무수 알코올 중의 부피로 3% w/v의 벤질 알코올, 8% w/v의 비극성 계면활성제 폴리소르베이트 80, 및 65% w/v 폴리에틸렌 글리콜 300의 용액이다. VPD 공-용매계 (VPD:5W)는 수용액 중에 5% 덱스트로스와 1:1로 희석된 VPD를 함유한다. 이러한 공-용매계는 소수성 화합물을 잘 용해시키고, 전신적인 투여시 자체 독성이 낮다. 물론, 공-용매계의 비율은 용해도 및 독성 특징들을 파괴하지 않으면서 상당히 변화할 수 있다. 또한, 공-용매 성분들은 바꿀 수 있는데, 예를 들어 폴리소르베이트 80 대신 기타 저독성의 비극성 계면활성제가 사용될 수 있고, 폴리에틸렌 글리콜 분획의 크기는 변화할 수 있으며, 기타 생체적합성 중합체는 폴리에틸렌 글리콜, 예를 들어 폴리비닐 피롤리돈을 대체할 수 있고, 기타 당 또는 다당류는 덱스트로스를 대체할 수 있다.
별법으로, 소수성 제약 화합물에 대해 기타 전달 시스템을 사용할 수 있다. 리포좀 및 유화액은 소수성 약물에 대한 전달 비히클 또는 담체의 공지된 예이다. 또한 특정 유기 용매, 예를 들어 디메틸술폭시드를 보통 독성이 보다 높아지긴 하지만 사용할 수 있다. 또한, 화합물은 서방성 시스템, 예를 들어 치료제를 포함하는 고체 소수성 중합체의 반투과성 매트릭스를 사용하여 전달될 수 있다. 다양한 서방성 물질이 확립되어 왔고 당업자들에게 공지되어 있다. 서방성 캡슐은 그의 화학적 성질에 따라, 수 주에서 100일에 걸쳐 화합물을 방출한다. 치료제의 화학적 성질 및 생물학적 안정성에 따라, 단백질 안정화를 위한 추가의 방법을 사용할 수 있다.
또한, 제약 조성물은 적합한 고체- 또는 겔-상 담체 또는 부형제를 포함할 수 있다. 상기 담체 또는 부형제는 예를 들어 탄산칼슘, 인산칼슘, 당, 전분, 셀룰로스 유도체, 젤라틴, 및 폴리에틸렌 글리콜과 같은 중합체를 포함한다.
본 발명의 일부 화합물은 제약학상 적합한 상대 이온과의 염으로 제공될 수 있다. 제약학상 적합한 염은 염산, 황산, 아세트산, 락트산, 타르타르산, 말산, 숙신산 등을 비롯한 다수의 산과 형성될 수 있다. 염은 상응하는 유리-염기 형태보다 수성 또는 기타 양성자성 용매에서 용해성이 보다 높은 경향이 있다.
본 발명의 바람직한 화합물의 제조는 이하 실시예에서 상세하게 기술하지만, 당업자는 본 발명의 기타 다수의 단백질 키나제 저해제를 제조하는데 본원에 기술한 화학 반응들이 용이하게 적용될 수 있음을 인식할 것이다. 예를 들어, 당업자들에게 명백한 변형을 가함으로써, 예를 들어 간섭기를 적절하게 보호하거나, 당 분야에 공지된 기타 적합한 시약을 변화시키거나, 반응 조건을 통상적으로 변화시킴으로써, 예시하지 않은 화합물들을 본 발명에 따라 성공적으로 합성할 수 있을 것이다. 아니면, 본 발명에 개시되거나 당 분야에 공지된 기타 반응들이 본 발명의 기타 화합물을 제조하는데 적용될 수 있음이 인식될 것이다.
본 발명 및 바람직한 실시태양의 상세한 설명
하기 기술한 실시예에서, 다르게 나타내지 않으면 모든 온도는 섭씨로 나타내고, 모든 부 및 백분율은 중량 기준이다. 시약은 알드리히 케미칼 캄파니 (Aldrich Chemical Company) 또는 랑캐스터 신테시스 리미티드 (Lancaster Synthesis Ltd.)와 같은 상업적 공급처로부터 구입했고, 다르게 나타내지 않으면 추가의 정제없이 사용했다. 테트라히드로푸란 (THF), N,N-디메틸포름아미드 (DMF), 디클로로메탄, 톨루엔 및 디옥산은 슈어 실 병 (Sure seal bottle)에 담긴 것을 알드리히로부터 구입했고, 받은 채로 사용했다. 모든 용매는 다르게 나타내지 않으면, 당업자가 용이하게 알 수 있는 표준 방법으로 정제했다.
하기 기술하는 반응은 통상적으로 양압의 아르곤 또는 질소하에서, 또는 건조 튜브와 함께, 상온에서 (다르게 기재하지 않으면), 무수 용매 중에서 수행했고, 반응 플라스크에는 기질 및 시약을 주사기로 도입하기 위해 고무 마개를 끼웠다. 유리 제품은 오븐으로 건조시키고(시키거나) 열건조시켰다. 분석 박층 크로마토그래피 (TLC)는 유리-지지 (backed) 실리카겔 60 F 254 플레이트 아날테크(Analtech)(0.25 mm) 상에서 수행했고, 적절한 용매비 (v/v)로 용리했으며, 적절한 경우 표시했다. 반응을 TLC로 분석했고, 출발물질의 소모로 판정하여 종결시켰다.
TLC 플레이트는 p-아니스알데히드 스프레이 시약 또는 포스포몰리브덴산 시약 (알드리히 케미칼, 에탄올 중의 20 중량%)으로 시각화했고, 열로 활성화했다. 후처리는 다르게 나타내지 않으면, 반응물의 부피를 반응 용매 또는 추출 용매로 배가시킨 다음, 지정된 수용액으로 추출 부피의 25 부피%를 사용하여 세척하여 통상적으로 수행했다. 생성물 용액을 무수 Na2SO4 상에서 건조시킨 후 여과하여 감압하 회전 증발기 상에서 용매를 증발시키고, 용매를 진공하에서 제거했다. 플래쉬 칼럼 크로마토그래피 (Still 등, J. Org . Chem ., 43, 2923 (1978))는 다르게 나타내지 않으면, 베이커 그레이드(Baker grade) 플래쉬 실리카겔 (47-61 ㎛)을 약 20:1 내지 50:1 비율의 실리카겔:조질 물질로 사용하여 수행했다. 가수소분해는 실시예에 나타낸 압력 또는 대기압에서 수행했다.
1H-NMR 스펙트럼은 300 MHz에서 작동하는 브루커 (Bruker) 기기 상에서 기록했고, 13C-NMR 스펙트럼은 75 MHz에서 작동시켜 기록했다. NMR 스펙트럼은 적절한 경우 기준 표준으로서 클로로포름 (7.25 ppm 및 77.00 ppm) 또는 CD3OD (3.4 및 4.8 ppm 및 49.3 ppm), 또는 내부 기준으로 테트라메틸실란 (0.00 ppm)을 사용하여 CDCl3 용액으로 수득했다 (ppm으로 기재). 필요에 따라 다른 NMR 용매를 사용했다. 다중 피크(peak)가 나타나는 경우에는 다음과 같은 약어를 사용했다: s (단일선), d (이중선), t (삼중선), m (다중선), br (넓음), dd (이중선의 이중선), dt (삼중선의 이중선). 주어지는 경우에 커플링 상수는 헤르쯔 (Hz)로 기재했다.
적외선 (IR) 스펙트럼은 순수 오일, KBr 펠렛 또는 CDCl3 용액을 사용하여 퍼킨-엘머 (Perkin-Elmer) FT-IR 분광계 상에서 기록했고, 주어지는 경우에는 파동수 (cm-1)로 기재했다. 질량 스펙트럼은 LSIMS 또는 전자스프레이를 사용하여 수득했다. 모든 융점 (mp)은 보정하지 않았다.
실시예 1(a): 2-(4-클로로-2-니트로-페닐)-말론산 디메틸 에스테르
NMP(0.1L)중의 NaH(36.0g, 1500mmol)의 교반 슬러리에 디메틸 말로네이트(137.4㎖, 1200mmol)를 적가하였다. 내부 온도를 30℃ 미만으로 유지하기에 필요한 만큼 반응물을 냉각시켰다. 기체 발생이 멈춘 후, 2,4-디클로로니트로벤젠(192g, 1000mmol)을 상기 반응물에 첨가하였다. HPLC로 측정시 반응이 완료된 것으로 나타날 때까지 조심스럽게 65℃로 가열하였다. 반응물을 실온으로 냉각시킨 후, 150㎖의 진한 HCl과 혼합된 500㎖ 얼음상에 부었다. 수층의 pH를 1N NaOH를 사용하여 중성으로 조정하였다. 성긴 프릿(fritted) 필터를 통해 여과하여 고체를 제거하고, 물(3L)로 세정하였다. 황색 고체를 하룻밤 동안 건조되도록 놓아두었다. 수율 261.5g, 91%.
실시예 1(b): (4-클로로-2-니트로-페닐)-아세트산 메틸 에스테르
물(100㎖) 및 NMP(1000㎖)중의 2-(4-클로로-2-니트로-페닐)-말론산 디메틸 에스테르(195g, 679.4mmol)의 용액을 3.5시간 동안 가열 환류시켰다. 용매를 회전 증발시켜 제거하여 오일을 수득하였다. 이 오일을 EtOAc에 용해시킨 후, 물(5x300㎖)로 세척하였다. 그다음 수층을 EtOAc(4x300㎖)로 추출하였다. 유기층을 물로 세척하였다. 유기층을 합치고 MgSO4상에서 건조시켰다. 여과하여 고체를 제거한 후에, 용매를 증발시켜 주황색/갈색 고체로서 원하는 생성물을 수득하였다(160.0g, 95%).
실시예 1(c): (2- 아세틸아미노 -4-클로로-페닐)-아세트산 메틸 에스테르
아르곤 충전된 플라스크에 (4-클로로-2-니트로-페닐)-아세트산 메틸 에스테르(40g, 175mmol), 10% Pd/C(2.5g), 아세트산 무수물(64㎖, 677mmol), 물(9㎖) 및 아세트산(150㎖)을 투입하였다. 이 플라스크를 수소 기체로 30PSI에서 진공 플러싱하고 격렬하게 진탕시켰다. 2시간 후에, 10% Pd/C(2g)를 더 첨가하고 총 4시간의 반응 시간 후에 반응을 완료하였다. 10% Pd/C를 여과하여 제거하고, 용매를 회전 증발시켜 제거하였다.
실시예 1(d): 6-클로로-1H-인다졸-3- 카르복실산 메틸 에스테르
90℃에서 교반된 아세트산(200㎖)중의 (2-아세틸아미노-4-클로로-페닐)-아세트산 메틸 에스테르(32.0g, 133mmol)의 용액에 1시간에 걸쳐 3급-부틸 니트라이트(20.5㎖, 172.3mmol)를 첨가하였다. 반응물을 물(1.4L)에 붓고, 고체를 여과하여 회수하였다. 황색 침전물을 EtOAc에 용해시킨 후, 포화 NaCl로 세척하였다. 유기층을 MgS04상에서 건조시키고, 여과하고, 고체로 농축시켰다. 고체를 헥산으로 바수고 여과하여 원하는 물질(21.63g, 77%)을 수득하였다.
실시예 1(e): 6-클로로-1-( 테트라히드로 -피란-2-일)- lH -인다졸-3- 카르복실산 메틸 에스테르
MeCN(200mL)중의 6-클로로-1H-인다졸-3-카르복실산 메틸 에스테르(8.3g, 39.5mmol)의 슬러리에 3,4-디히드로-2H-피란(5.4mL, 59.3mmol) 및 p-톨루엔설폰산(237mg, 1.25mmol)을 첨가하였다. 반응물을 10분간 교반한 후에, 포화 NaHCO3(1mL)를 첨가하고 용매를 회전 증발시켜 제거하여 100mL의 부피로 하였다. 혼합물을 EtOAc로 희석하고 물(50mL)로 세척한 후, 포화 NaCl(50mL)로 세척하였다. 유기층을 그다음 Na2SO4상에서 건조시켰다. 고체를 여과하여 제거한 후에, 유기층을 회전 증발시켜 오일로 농축시켰다. 생성물을 헥산을 사용하여 오일로부터 침전시켜 원하는 생성물을 수득하였다(7.667g, 66% 수율).
실시예 1(f): 6-(2- 메톡시카르보닐 - 페닐아미노 )-1-( 테트라히드로 -피란-2-일)-1H-인다졸-3-카르복실산 메틸 에스테르
1,2-디메톡시에탄(30mL)중의 6-클로로-1H-인다졸-3-카르복실산 메틸 에스테르(2.94g, 10.0mmol)의 용액에 K3PO4(5.32g, 25.0mmol), 트리스(디벤질리덴아세톤)디팔라듐(459mg, 0.05mmol), 2-(디시클로헥실포스피노)비페닐(701mg, 2.0mmol), 및 메틸 안트라닐레이트(2.59mL, 20.0mmol)를 첨가하였다. 용액을 아르곤으로 3회 진공 플러싱한 후, 18시간 동안 80℃로 가열하였다. 반응물을 실온으로 냉각시키고, 고체를 여과하여 제거하였다. 고체를 에틸 아세테이트로 세척한 후, 용매를 회전 증발시켜 제거하였다. 잔류 오일을 크로마토그래피하여(150g 실리카겔, 10-30% EtOAc/Hex) 1.23g(51 %)의 원하는 생성물을 수득하였다.
실시예 1(g): 6-(2- 메톡시카르보닐 - 페닐아미노 )-1-( 테트라히드로 -피란-2-일)- lH -인다졸-3-카르복실산
메탄올(18mL) 및 테트라히드로푸란(8mL)중의 6-(2-메톡시카르보닐-페닐아미노)-1-(테트라히드로-피란-2-일)-1H-인다졸-3-카르복실산 메틸 에스테르(2.05g, 5mmol)의 용액에 물(2.7mL)중의 수산화나트륨(0.30g, 7.5mmol)의 용액을 첨가하였다. 반응물을 3시간 동안 실온에서 교반한 후, 1N HCl로 pH 1로 중화시켰다. 혼합물을 EtOAc(25mL) 및 물(25mL)로 희석하였다. 층들을 분리한 후, 수층을 CH2Cl2(3x25mL)로 세척하였다. 합친 유기 추출물을 포화 NaCl(100mL)로 세척한 후, Na2SO4상에서 건조시켰다. 고체를 여과하고 액체를 오일로 농축시켰다. 생성물을 EtOAc 및 헥산으로부터 결정화하여 원하는 생성물을 수득하였다(1.616g, 82%).
실시예 1(h): 2-[3- 메틸카르바모일 -1-( 테트라히드로 -피란-2-일)-1H-인다졸-6- 일아미노 ]-벤조산 메틸 에스테르
DMF중의 6-(2-메톡시카르보닐-페닐아미노)-1-(테트라히드로-피란-2-일)-1H-인다졸-3-카르복실산(0.50g, 1.27mmol)의 용액에 트리에틸아민(0.42mL, 3.04mmol), 메틸아민(1.9mL, 3.81mmol), 및 HATU(0.578g, 1.52mmol)를 첨가하였다. 반응물을 3시간 동안 교반한 후, 회전 증발시켜 농축시켰다. 조질 오일을 크로마토그래피하여(50g 실리카겔, 25-50% EtOAc/헥산) 원하는 생성물을 수득하였다(214mg, 42%).
실시예 1(i): 2-[3- 메틸카르바모일 -1-( 테트라히드로 -피란-2-일)- lH -인다졸-6- 일아미노 ]-벤조산
메탄올(1.4mL) 및 테트라히드로푸란(0.6mL)중의 2-[3-메틸카르바모일-l-(테트라히드로-피란-2-일)-lH-인다졸-6-일아미노]-벤조산 메틸 에스테르(0.20g, 0.49mmol)의 용액에 물(0.3mL)중의 수산화나트륨(59mg, 1.47mmol)의 용액을 첨가하였다. 반응물을 1시간 동안 60℃로 가열한 후, 실온으로 냉각시켰다. pH를 2N HCl로 pH 2로 조정하였다. EtOAc(30mL) 및 물(30mL)을 첨가하고, 층들을 분리하였다. 수층을 EtOAc(3x20mL)로 추출하고, 유기층을 합쳤다. 물(15mL)로 세척한 후, 유기층을 Na2SO4상에서 건조시켰다. 고체를 여거하고, 유기층을 증발시켜 황색 고체를 수득하였다(193mg, 100%).
실시예 1(j): 6-(2- 프로프 -2- 이닐카르바모일 - 페닐아미노 )-1-( 테트라히드로 -피란-2-일)-lH-인다졸-3-카르복실산 메틸아미드
DMF(3.6mL)중의 2-[3-메틸카르바모일-l-(테트라히드로-피란-2-일)-lH-인다졸-6-일아미노]-벤조산(150mg, 0.381mmol)의 용액에 프로파길 아민(0.052mL, 0.761mmol), TEA(0.264mL, 1.90mmol), 및 HATU(217mg, 0.571mmol)를 첨가하였다. 반응물을 4시간 동안 교반한 후, EtOAc(30mL) 및 물(30mL)로 희석하였다. 층들을 분리하고, 수층을 EtOAc(2x20mL)로 추출하였다. 합친 유기층을 포화 NaCl(15mL)로 세척한 후, Na2SO4상에서 건조시켰다. 고체를 여과하여 제거하고, 액체를 회전 증발시켜 황색 오일로 농축시켰다(164mg, 100%).
실시예 1(k): 6-(2- 프로프 -2- 이닐카르바모일 - 페닐아미노 )-1H-인다졸-3- 카르복실산 메틸아미드
CH2Cl2:TFA:트리에틸 실란의 90:10:1 혼합물 1.5mL중에 6-(2-프로프-2-이닐카르바모일-페닐아미노)-1-(테트라히드로-피란-2-일)-1H-인다졸-3-카르복실산 메틸아미드(30mg)를 용해시키고, 2시간 동안 가열 환류시켰다. 이 용액을 톨루엔(40mL)으로 희석하고 회전 증발시켜 오일로 농축시켰다. 이 오일을 DMF(1mL)에 용해시키고, 0.2-마이크론 주사기 필터를 사용하여 여과하였다. 분취용 HPLC를 사용하여 원하는 화합물을 수득하였다(12mg, 50%).
실시예 2(a): [6-클로로-1-( 테트라히드로 -피란-2-일)-1H-인다졸-3-일]-메탄올
-78℃로 냉각된 무수 CH2Cl2(50mL)중의 6-클로로-1H-인다졸-3-카르복실산 메틸 에스테르(2.94g, 10.0mmol)의 용액에 DIBAL-H(3.56mL, 20.0mmol)를 천천히 첨가하였다. 완전히 첨가한 후, 반응물이 실온으로 가온되도록 놓아두었고, 이때 HPLC는 10%의 출발물질이 잔존함을 나타내었다. 그다음 여분의 DIBAL-H(0.35mL)를 첨가하고 10분간 교반하였다. 반응물을 EtOAc(1000mL)로 희석하고 1N HCl(2x100mL)로 세척하였다. 1N NaHCO3(100mL)로 추가로 세척한 후, 포화 NaCl(100mL)로 세척하였다. 유기층을 MgS04상에서 건조시키고, 여과한 후, 백색 고체로 농축시켰다(2.65g, 99.5%).
실시예 2(b): 6-클로로-1-( 테트라히드로 -피란-2-일)-1H-인다졸-3- 카르브알데히드
[6-클로로-1-(테트라히드로-피란-2-일)-1H-인다졸-3-일]-메탄올(1.75g, 6.58mmol), IBX(2.76g, 9.87mmol) 및 DMSO(27mL)의 용액을 하룻밤 동안 교반하였다. 반응물을 EtOAc 및 물로 희석하였다. 층들을 분리하고, 수층을 EtOAc(3x100mL)로 추출하였다. 유기층을 합치고 포화 NaCl(100mL)로 세척하였다. 유기층을 MgS04상에서 건조시키고, 여과한 후, 고체로 농축시켰다. 고체를 CH2Cl2에 용해시키고 여과하였다. 유기층을 증발시켜 원하는 생성물을 수득하였다(1.707g, 92%).
실시예 2(c): 1-(6-클로로-1H-인다졸-3-일)-2-(5-에틸-피리딘-2-일)-에탄올
THF(4mL)중의 4-에틸-2-메틸피리딘(0.458g, 3.79mmol)의 교반 용액에 -50℃에서 부틸 리튬(1.5mL, 2.5M, 3.79mmol)을 천천히 첨가하고 10분간 교반하였다. 이 반응물에, THF(4mL)중의 6-클로로-lH-인다졸-3-카르브알데히드(0.5g, 1.89mmol)의 용액을 천천히 첨가하였다. 10분간 교반한 후, 반응을 1N 시트르산(10mL)으로 정지시켰다. 혼합물을 EtOAc(50mL), 물(20mL), 및 포화 NaCl(10mL)로 희석하였다. 층들을 분리하고, 수층을 EtOAc(3x15mL)로 추출하였다. 유기층을 합치고 포화 NaCl(20mL)로 세척하였다. 유기층을 Na2SO4상에서 건조시킨 후, 고체를 여과하여 제거하고, 액체를 회전 증발시켜 오일로 농축시켰다. 크로마토그래피(40g 실리카겔, 60-100% EtOAc/hex)하여 원하는 생성물을 수득하고(142mg, 32%), 6-클로로-1H-인다졸-3-카르브알데히드(348mg)를 회수하였다.
실시예 2(d): 6-클로로-3-[2-(5-에틸-피리딘-2-일)-비닐]-1H-인다졸
CH2Cl2중의 1-(6-클로로-1H-인다졸-3-일)-2-(5-에틸-피리딘-2-일)-에탄올(232mg, 0.60mmol)의 교반 용액에 TEA(0.25mL, 1.81mmol) 및 메실 클로리드(0.070mL, 0.90mmol)를 첨가하였다. 반응물을 30분간 교반한 후, DBU(2mL)를 첨가하였다. 반응물을 18시간 동안 환류시킨 후, 40mL의 1N 시트르산으로 반응정지시켰다. 층들을 분리하고, 수층을 20mL CH2Cl2로 추출하였다. 합친 유기층을 Na2SO4상에서 건조시키고, 회전 증발시켜 농축시켰다. 크로마토그래피(12g 실리카겔, 50-70% EtOAc/헥산)로 정제하여 원하는 화합물을 수득하였다(135mg, 71%).
실시예 2(e): 2-{3-[2-(5-에틸-피리딘-2-일)-비닐]- lH -인다졸-6- 일아미노 }-벤조산 메틸 에스테르
1,2-디메톡시메탄(2mL)을 6-클로로-3-[2-(5-에틸-피리딘-2-일)-비닐]-1H-인다졸(130mg, 0.354mmol), 트리스(디벤질리덴아세톤)디팔라듐(16mg, 0.018mmol), -(디시클로헥실포스피노)비페닐(25mg, 0.071mmol), K3PO4(0.188g, 0.885mmol), 및 메틸 안트라닐레이트(0.092mL, 0.71mmol)에 첨가하였다. 반응물을 아르곤(4x)으로 진공 플러싱한 후, 19시간 동안 80℃로 가열하였다. 반응물을 EtOAc(20mL)로 희석하고 실리카겔 플러그(plug)를 통해 여과하였다. EtOAc(50mL)로 세척한 후, 용매를 회전 증발시켜 제거하였다. 조질 오일을 크로마토그래피(40g 실리카겔, 30-40% EtOAc/헥산)에 의해 정제하여 원하는 생성물을 수득하였다(54mg, 32%).
실시예 2(f): 2-{3-[2-(5-에틸-피리딘-2-일)-비닐]- lH -인다졸-6- 일아미노 }-벤조산
메탄올(0.42mL) 및 THF(0.10mL)중의 2-{3-[2-(5-에틸-피리딘-2-일)-비닐]-1H-인다졸-6-일아미노}-벤조산 메틸 에스테르(50mg, 0.104mmol)의 용액에 물(0.05mL)중의 수산화나트륨(12mg, 0.311mmol)의 용액을 첨가하였다. 이 용액을 3.5시간 동안 60℃로 가열한 후, 포화 NH4Cl로 중화시켰다. 반응물을 물(20mL)로 희석한 후, EtOAc(2x20mL)로 추출하였다. 합친 추출물을 Na2S04상에서 먼저 건조시킨 후, 고체를 여과하여 제거하였다. 원하는 생성물(48.7mg, 100%)을 회전 증발시켜 용매를 제거한 후 회수하였다.
실시예 2(g): 2-{3-[2-(5-에틸-피리딘-2-일)-비닐]-1H-인다졸-6- 일아미노 }-N- 프로프 -2-이닐-벤즈아미드
CH2Cl2:TFA:TES의 90:10:1 혼합물 2mL를 2-{3-[2-(5-에틸-피리딘-2-일)-비닐]-1H-인다졸-6-일아미노}-벤조산(49mg, 0.105mmol)에 첨가하였다. 반응물을 1시간 동안 가열 환류시킨 후, 톨루엔 (20mL)으로 희석하였다. 용매를 회전 증발시켜 제거하여 점성의 오일을 수득하였다. 이 오일을 DMF(1mL)에 용해시키고, 이 용액에 TEA(0.072mL, 0.52mmol), 프로파길 아민(0.014mL, 0.208mmol), 및 HATU(59mg, 0.156mmol)를 첨가하였다. 반응물을 3시간 동안 교반한 후, 분취용 HPLC에 의해 정제하여 원하는 생성물을 수득하였다(29mg, 66%).
실시예 2(h): N-시클로프로필-2-{3-[(E)-2-(4-메틸-피리딘-2-일)-비닐]-1H-인다졸-6-일아미노}-벤즈아미드
1-(6-클로로-1H-인다졸-3-일)-2-(5-에틸-피리딘-2-일)-에탄올을 제조하는 단계에서 4-에틸-2-메틸-피리딘을 2,4-디메틸-피리딘으로 치환하고, 일련 반응의 최종 단계에서 프로파길 아민을 시클로프로필 아민으로 치환하면서, 표제 화합물을 전술한 2-{3-[2-(5-에틸-피리딘-2-일)-비닐]-1H-인다졸-6-일아미노}-N-프로프-2-이닐-벤즈아미드와 유사하게 제조하였다.
실시예 3(a): N- 메톡시 -2-[3-((E)-2-피리딘-2-일-비닐)-1H-인다졸-6- 일아미노 ]- 벤즈아미드
DMF(0.8mL)중에 용해된 2-[3-(2-피리딘-2-일-비닐)-1H-인다졸-6-일아미노]-벤조산(50.0mg, 0.084mmol), 0-메틸-히드록실아민 히드로클로리드(15mg, 0.17mmol) 및 트리에틸아민(58㎕, 0.42mmol)의 용액을 HATU(48mg, 0.13mmol)로 처리하였다. 혼합물을 하룻밤 동안 교반한 후, 역상 HPLC에 의해 정제하여 황색 고체로서 21.6mg(67%)의 표제 화합물을 수득하였다.
실시예 3(b): N- 알릴옥시 -2-[3-((E)-2-피리딘-2-일-비닐)-1H-인다졸-6- 일아미노 ]-벤즈아미드
DMF(0.8mL)중에 용해된 2-[3-(2-피리딘-2-일-비닐)-1H-인다졸-6-일아미노]-벤조산(50.0mg, 0.084mmol), 0-알릴-히드록실아민 히드로클로리드(18.3mg, 0.17mmol) 및 트리에틸아민(58㎕, 0.42mmol)의 용액을 HATU(48mg, 0.13mmol)로 처리하였다. 혼합물을 하룻밤 동안 교반한 후, 역상 HPLC에 의해 정제하여 황색 고체로서 25.5mg(74%)의 표제 화합물을 수득하였다.
실시예 3(c): N- 이소프로폭시 -2-[3-((E)-2-피리딘-2-일-비닐)- lH -인다졸-6- 일아미노 ]-벤즈아미드
DMF(0.8mL)중에 용해된 2-[3-(2-피리딘-2-일-비닐)-1H-인다졸-6-일아미노]-벤조산(50.0mg, 0.084mmol), 0-이소프로필-히드록실아민 히드로클로리드(18.7mg, 0.17mmol) 및 트리에틸아민(58㎕, 0.42mmol)의 용액을 HATU(48mg, 0.13mmol)로 처리하였다. 혼합물을 하룻밤 동안 교반한 후, 역상 HPLC에 의해 정제하여 황색 고체로서 17.4mg(50%)의 표제 화합물을 수득하였다.
실시예 3(d): N-시클로프로필-2-[3-((E)-2-피리딘-2-일-비닐)-1H-인다졸-6- 일아미노 ]-벤즈아미드
DMF(0.8mL)중에 용해된 2-[3-(2-피리딘-2-일-비닐)-1H-인다졸-6-일아미노]-벤조산(50.0mg, 0.084mmol), 시클로프로필 아민(11.6㎕, 0.17mmol) 및 트리에틸아민(58㎕, 0.25mmol)의 용액을 HATU(48mg, 0.13mmol)로 처리하였다. 혼합물을 하룻밤 동안 교반한 후, 역상 HPLC에 의해 정제하여 황색 고체로서 11.7mg(35%)의 표제 화합물을 수득하였다.
실시예 3(f): 1-메틸-1H-피롤-2- 카르복실산 N'-(1-{2-[3-((E)-2-피리딘-2-일-비닐)-1H-인다졸-6-일아미노]-페닐}-메타노일)-히드라지드
DMF(0.8mL)중에 용해된 2-[3-(2-피리딘-2-일-비닐)-1H-인다졸-6-일아미노]-벤조산(50.0mg, 0.084mmol), 1-메틸-1H-피롤-2-카르복실산 히드라지드(23.3mg, 0.17mmol) 및 트리에틸아민(58㎕, 0.42mmol)의 용액을 HATU(48mg, 0.13mmol)로 처리하였다. 혼합물을 하룻밤 동안 교반한 후, 역상 HPLC에 의해 정제하여 황색 고체로서 16.1mg(40%)의 표제 화합물을 수득하였다.
실시예 3(g): N-벤질-2-[3-((E)-2-피리딘-2-일-비닐)-1H-인다졸-6- 일아미노 ]- 벤즈아미드
DMF(0.8mL)중에 용해된 2-[3-(2-피리딘-2-일-비닐)-1H-인다졸-6-일아미노]-벤조산(50.0mg, 0.084mmol), 벤질아민(18.2㎕, 0.17mmol) 및 트리에틸아민(58㎕, 0.42mmol)의 용액을 HATU(48mg, 0.13mmol)로 처리하였다. 혼합물을 하룻밤 동안 교반한 후, 역상 HPLC에 의해 정제하여 TFA 염으로서 45.2mg(76%)의 표제 화합물을 수득하였다(1.5 H2O, 2.1 TFA, 유효 MW=711.98).
실시예 3(h): N-(2- 메톡시 -벤질)-2-[3-((E)-2-피리딘-2-일-비닐)-1H-인다졸-6- 일아미노 ]-벤즈아미드
DMF(0.8mL)중에 용해된 2-[3-(2-피리딘-2-일-비닐)-1H-인다졸-6-일아미노]-벤조산(50.0mg, 0.084mmol), o-메톡시벤질아민(21.8㎕, 0.17mmol) 및 트리에틸아민(58㎕, 0.42mmol)의 용액을 HATU(48mg, 0.13mmol)로 처리하였다. 혼합물을 하룻밤 동안 교반한 후, 역상 HPLC에 의해 정제하여 TFA 염으로서 46mg(81%)의 표제 화합물을 수득하였다.
실시예 3(i): N-푸란-2- 일메틸 -2-[3-((E)-2-피리딘-2-일-비닐)-1H-인다졸-6- 일아미노 ]-벤즈아미드
DMF(0.8mL)중에 용해된 2-[3-(2-피리딘-2-일-비닐)-1H-인다졸-6-일아미노]-벤조산(50.0mg, 0.084mmol), C-푸란-2-일-메틸아민(19㎕, 0.17mmol) 및 트리에틸아민(58㎕, 0.42mmol)의 용액을 HATU(48mg, 0.13mmol)로 처리하였다. 혼합물을 하룻밤 동안 교반한 후, 역상 HPLC에 의해 정제하여 TFA 염으로서 45mg(85%)의 표제 화합물을 수득하였다(1.5 H2O, 1.5 TFA, 유효 MW=633.52).
실시예 3(j): N- 시클로부틸 -2-[3-((E)-2-피리딘-2-일-비닐)-1H-인다졸-6- 일아미노 ]-벤즈아미드
DMF(0.8mL)중에 용해된 2-[3-(2-피리딘-2-일-비닐)-1H-인다졸-6-일아미노]-벤조산(50.0mg, 0.084mmol), 시클로부틸아민(18.2㎕, 0.17mmol) 및 트리에틸아민(58㎕, 0.42mmol)의 용액을 HATU(48mg, 0.13mmol)로 처리하였다. 혼합물을 하룻밤 동안 교반한 후, 역상 HPLC에 의해 정제하여 TFA 염으로서 43.2mg(92%)의 표제 화합물을 수득하였다(1.5 H2O, 1.1 TFA, 유효 MW=561.92).
실시예 3(k): N-(2-메틸-알릴)-2-[3-((E)-2-피리딘-2-일-비닐)- lH -인다졸-6- 일아미노 ]-벤즈아미드
DMF(0.8mL)중에 용해된 2-[3-(2-피리딘-2-일-비닐)-1H-인다졸-6-일아미노]-벤조산(50.0mg, 0.084mmol), 2-메틸-알릴아민(16.4㎕, 0.17mmol) 및 트리에틸아민(58㎕, 0.42mmol)의 용액을 HATU(48mg, 0.13mmol)로 처리하였다. 혼합물을 하룻밤 동안 교반한 후, 역상 HPLC에 의해 정제하여 TFA 염으로서 45mg(91%)의 표제 화합물을 수득하였다(1.6 H2O, 1.3 TFA, 유효 MW=586.53).
실시예 3(l): 6-니트로-3-피리딘-2- 일에티닐 -1-(2- 트리메틸실라닐 - 에톡시메틸 )- lH -인다졸
3-요오도-6-니트로-1-(2-트리메틸실라닐-에톡시메틸)-1H-인다졸(838mg, 2.0mmol), 2-에티닐-피리딘(242㎕, 2.4mmol) 및 트리에틸아민(6.0mL)의 혼합물을 탈기시키고 아르곤으로 플러싱한 후, CuI(8mg, 0.042mmol) 및 Pd(PPh3)2Cl2(16mg, 0.023mmol)로 처리하였다. 생성된 혼합물을 실온에서 하룻밤 동안 교반하였고, 이때 HPLC는 모든 출발물질이 소모되었음을 나타내었다. 혼합물을 고진공하에 휘발물질을 스트리핑(stripping)시켜 정제한 후, 에틸 아세테이트로 용리하면서 실리카 플러그를 통과시켰다. 생성물을 추가로 정제하지 않고 다음 단계에 사용하였다.
실시예 3(m): 3-피리딘-2- 일에티닐 -1-(2- 트리메틸실라닐 - 에톡시메틸 )-1H-인다졸-6- 일아민
6-니트로-3-피리딘-2-일에티닐-1-(2-트리메틸실라닐-에톡시메틸)-1H-인다졸(2mmol), SnCl2(1.37g, 6.0mmol), 물(0.5mL) 및 MeOH(10mL)의 혼합물을 60℃에서 30분간 오일욕에서 교반하였고, 이때 HPLC는 환원이 완료되었음을 나타내었다. 생성된 혼합물을 메탄올을 스트리핑시키고, EtOAc(50mL)에 현탁시킨 후, 1M NaOH(18mL)로 희석하였다. 생성된 유화액을 EtOAc(10x25㎖)로 서서히 추출하였다. 합친 유기층을 1M Na2CO3, 염수로 추출하고, MgSO4상에서 건조시킨 후, 농축시키고 EtOAc로 용리하면서 실리카 패드를 통해 여과하였다. 2단계 동안의 조질 생성물의 수율은 701mg, 96% 질량 회수율이었다.
실시예 3(n): 2-[3-피리딘-2- 일에티닐 -1-(2- 트리메틸실라닐 - 에톡시메틸 )-1H-인다졸-6-일아미노]-벤조산 메틸 에스테르
3-피리딘-2-일에티닐-1-(2-트리메틸실라닐-에톡시메틸)-1H-인다졸-6-일아민(560mg, 1.54mmol), 2-브로모메틸벤조에이트(647.5㎕, 4.61mmol), 비페닐-2-일-디시클로헥실-포스판(107.8mg, 0.308mmol), Pd2(dba)3(70.5mg, 0.0768mmol), K3PO4(816mg, 3.844mmol) 및 디메톡시에탄(1.7mL)의 혼합물을 질소로 진공 플러싱한 후, 오일욕에서 24시간 동안 70℃에서 가열하였다. 흑색 혼합물을 메틸렌 클로리드로 희석하고, 여과하고, 농축시키고, 크로마토그래피(20% 내지 40% 에틸 아세테이트/헥산)하였다. 황색/주황색 오일의 수율은 3단계 동안 260mg, 35%이었다.
실시예 3(o): 2-[3-피리딘-2- 일에티닐 -1-(2- 트리메틸실라닐 - 에톡시메틸 )-1H-인다졸-6-일아미노]-벤조산
2-[3-피리딘-2-일에티닐-1-(2-트리메틸실라닐-에톡시메틸)-1H-인다졸-6-일아미노]-벤조산 메틸 에스테르(253mg, 0.517mmol)를 THF(1.0mL), MeOH(2.25mL) 및 물(0.5mL)에 용해된 NaOH(62mg, 1.55mmol)의 용액에 첨가하였다. 반응물을 실온에서 1시간 동안 교반하였고, 이때 HPLC는 모든 출발물질이 소모되었음을 나타내었다. 반응물을 1N HCl로 중화시키고, 에틸 아세테이트로 추출한 후, 염수로 세척하고, MgSO4로 건조시켰다. 진공하에서 농축시킨 후, 249mg의 황색 고체를 수득하였다(99% 질량 회수율). 이 물질은 추가로 정제하지 않고 사용하였다.
실시예 3(p): 2-[3-피리딘-2- 일에티닐 -1H-인다졸-6- 일아미노 ]-벤조산
2-[3-피리딘-2-일에티닐-1-(2-트리메틸실라닐-에톡시메틸)-1H-인다졸-6-일아미노]-벤조산(231mg, 0.477), THF중의 1M 3급-부틸암모늄 플루오리드(3.8mL, 3.816mmol) 및 에틸렌디아민(127㎕, 1.908mmol)의 용액을 6시간 동안 80℃에서 오일욕에서 교반하였다. 반응을 아세트산(218㎕, 3.816mmol)으로 반응정지시키고, 물로 희석한 후, EtOAc(10x50mL)로 추출하였다. 합친 유기층을 염수로 세척하고, MgS04상에서 건조시켰다. CH2Cl2로 바순 고체 형태를 농축시킨 후에, 황색 분말로서 생성물을 수득하였다(124mg, 73%).
실시예 3(q): N- 프로프 -2- 이닐 -2-[3-((E)-2-피리딘-2-일-비닐)-1H-인다졸-6- 일아미노 ]-벤즈아미드
DMF(0.5mL)중에 용해된 2-(3-피리딘-2-일에티닐-1H-인다졸-6-일아미노)-벤조산(41mg, 0.117mmol), 프로파길 아민(24㎕, 0.35mmol) 및 트리에틸아민(81㎕, 0.58mmol)의 용액을 HATU(89mg, 0.233mmol)로 처리하였다. 혼합물을 하룻밤 동안 교반한 후, 역상 HPLC에 의해 정제하여 황색 고체로서 27mg(59%)의 표제 화합물을 수득하였다.
실시예 4(a): 2- 브로모 -4,6-디메틸-피리딘
48% HBr(수용액)(알드리히, 65mL, 1.2mol, 10당량)의 용액을 -5℃로 냉각시키고, 4,6-디메틸-피리딘-2-일아민(알드리히, 15.0g, 0.12mol, 1.0당량)으로 처리하였다. 점성의 백색 염 혼합물을 브롬(알드리히, 19.7mL, 0.38mol, 3.1당량)을 적가하면서 기계식 교반기로 교반하였다. 생성된 적색 혼합물을 1시간에 걸쳐 NaN02(알드리히, 22.1g, 0.32mol, 2.6당량)의 수용액(32mL H2O)으로 처리하였다. 니트라이트를 첨가하는 동안 온도를 5℃ 미만으로 유지한 후, 2시간에 걸쳐 점차적으로 20℃로 가온시켰다. 반응 혼합물을 NaOH(수용액)로 pH 14로 조정하고, MTBE로 추출하였다. 유기 추출물을 물 및 염수로 세척하고, 황산마그네슘상에서 건조시킨 후, 여과하고 감압하에 농축시켰다. 조질 생성물((29g의 적색 오일)을 플래쉬 크로마토그래피(실리카, 350g)에 의해 정제하고 2-7% 에틸 아세테이트-시클로헥산으로 용리하여 주황색 오일을 수득하였다(11.0g, 48%).
실시예 4(b): 3-[2-(4,6-디메틸-피리딘-2-일)-비닐]-6-니트로-1-( 테트라히드로 -피란-2-일)-1H-인다졸
수성 DMF(85%, 34.5mL)중의 2-브로모-4,6-디메틸피리딘(2.42g, 13mmol), 3-비닐-6-니트로-1-(테트라히드로-피란-2-일)-1H-인다졸(2.37g, 8.67mmol), 아세트산팔라듐(0.145g, 0.65mmol), 트리-오르토-톨릴포스핀(0.791g, 2.6mmol) 및 디이소프로필에틸아민(2.4mL, 13.8mmol)의 현탁액을 5분간 아르곤을 폭기시켜 탈기시킨 후, 5분간 음파처리한 다음 마이크로파 장치((300와트, 10% 전력)에서 40분간 110℃에서 가열하였다. 냉각시킨 후, 혼합물을 냉수에 적하시켰다. 생성된 황색 침전물을 여과하여 수거하였다. 고체를 에틸 아세테이트에 용해시키고, 건조시킨 후(황산나트륨), 감압하에 농축시켰다. 잔류물을 실리카겔상에서 용리액으로서 클로로포름 및 헥산(1:1)의 혼합물중의 0 내지 20% 에틸 아세테이트 구배를 사용하여 정제하였다. 크로마토그래피로부터의 생성물을 MTBE/헥산으로 바수어 황색 고체로서 순수한 생성물을 수득하였다. 모액을 유사한 방식으로 실리카겔상에서 재결정화시킨 후, 바수어 더욱 순수한 생성물을 68% 수율로 수득하였다.
실시예 5: 3-[2-(4,6-디메틸-피리딘-2-일)-비닐]-1-( 테트라히드로 -피란-2-일)-1H-인다졸-6- 일아민
25mL의 에탄올중의 3-[2-(4,6-디메틸-피리딘-2-일)-비닐]-6-니트로-1-(테트라히드로-피란-2-일)-1H-인다졸(4.22g, 11.16mmol), 철 분말(2.71g, 48.51mmol) 및 포화 수성 NH4Cl(25mL)의 현탁액을 18시간 동안 45℃에서 가열하였다. 반응물을 냉각시키고 메탄올로 세척하면서 필터지를 통해 여과하였다. 용매를 감압하에 제거하고, 수층을 EtOAc(2x)로 추출하였다. 합친 유기층을 염수로 세척하고, 건조시킨 후(MgS04) 감압하에 농축시켜 4.02g(정량)의 녹빛 착색된 고체를 수득하였으며, 이를 추가로 정제하지 않고 사용하였다.
실시예 6: 2-[3-[2-(4,6-디메틸-피리딘-2-일)-비닐]-1-( 테트라히드로 -피란-2-일)-1H-인다졸-6-일아미노]-벤조산 메틸 에스테르
톨루엔(6ml)중의 3-[2-(4,6-디메틸-피리딘-2-일)-비닐]-1-(테트라히드로-피란-2-일)-1H-인다졸-6-일아민(870mg, 2.5mmol), 2-브로모-벤조산 메틸 에스테르(0.44ml, 3.12mmol), R-BINAP(78mg, 0.125mmol), Pd2(dba)3(29mg, 0.03mmol) 및 탄산세슘(1.22g, 3.75mmol)의 교반 현탁액을 탈기시키고, 100℃에서 18시간 동안 가열하였다. 반응 혼합물을 냉각시키고, 포화 NaHCO3에 부은 후, EtOAc(2x)로 추출하였다. 합친 유기층을 염수로 세척하고, 건조시킨 후(MgS04) 감압하에 농축시켰다. 잔류물을 실리카겔상에서 CH2Cl2중의 5-10% EtOAc 구배로 용리하면서 플래쉬 크로마토그래피하여 964mg(80%)의 황색 발포체를 수득하였다.
실시예 7: 2-[3-[2-(4,6-디메틸-피리딘-2-일)-비닐]-1-( 테트라히드로 -피란-2-일)-1H-인다졸-6-일아미노]-벤조산
THF:MeOH(12ml, 3:1)중의 2-[3-[2-(4,6-디메틸-피리딘-2-일)-비닐]-1-(테트라히드로-피란-2-일)-1H-인다졸-6-일아미노]-벤조산 메틸 에스테르(1.98g, 4.11mmol)의 교반 용액에 H2O(3ml)에 용해된 수산화칼륨(1.15g, 20.5mmol)을 첨가하였다. 반응물을 2시간 동안 70℃에서 가열하고, 냉각시킨 후, 감압하에서 약 5mL로 농축시키고 더 많은 물로 희석하였다. 용액을 2N HCl로 중화시키고, 침전물을 여과하여 수거한 후, 물로 세척하여 2.00g(정량)의 선명한 황색 고체를 수득하였다.
실시예 8: 2-{3-[2-(4,6-디메틸-피리딘-2-일)-비닐]-1H-인다졸-6- 일아미노 }-벤조산 p-톨루엔 설포네이트
수성 메탄올(90%, 20mL)중의 2-[3-[2-(4,6-디메틸-피리딘-2-일)-비닐]-1-(테트라히드로-피란-2-일)-1H-인다졸-6-일아미노]-벤조산(2mmol) 및 p-톨루엔 설폰산(10mmol)의 혼합물을 18시간 동안 70℃에서 교반하였다. 냉각시킨 후, 생성된 점성의 황색 슬러리를 여과하고, 고체를 메탄올로 세척하여 담황색 고체의 토실레이트 염으로서 2-{3-[2-(4,6-디메틸-피리딘-2-일)-비닐]-1H-인다졸-6-일아미노}-벤조산을 85% 수율로 수득하였다.
실시예 9: N-[4-(3급-부틸-디메틸-실라닐옥시)-부트-2-이닐]-2-[3-[2-(4,6-디메틸-피리딘-2-일)-비닐]-1-( 테트라히드로 -피란-2-일)-1H-인다졸-6- 일아미노 ]- 벤즈아미드
4-(3급-부틸-디메틸-실라닐옥시)-부트-2-이닐아민 및 2-[3-(2-(4,6-디메틸-피리딘-2-일)-비닐]-1-(테트라히드로-피란-2-일)-1H-인다졸-6-일아미노]-벤조산을 사용한 것을 제외하고는, 2000년 6월 30일자로 출원되고 본원에 그 전체가 모든 목적을 위해 참고로 인용된 미국 특허원 제09/609,335호의 실시예 33(a), 단계 (v)에 기재된 바와 유사한 방식으로 제조하였다.
실시예 10: 2-{3-[(E)-2-(4,6-디메틸-피리딘-2-일)-비닐]-1H-인다졸-6- 일아미노 }-N-(4-히드록시-부트-2-이닐)-벤즈아미드
N-[4-(3급-부틸-디메틸-실라닐옥시)-부트-2-이닐]-2-[3-[2-(4,6-디메틸-피리딘-2-일)-비닐]-1-(테트라히드로-피란-2-일)-1H-인다졸-6-일아미노]-벤즈아미드(737mg, 1.13mmol) 및 p-톨루엔-설폰산(8.2ml, HOAc중의 12%)의 교반 용액을 2시간 동안 70℃에서 가열하였다. 반응물을 냉각시키고, 조심스럽게 포화 NaHCO3에 부은 후, EtOAc(2x)로 추출하였다. 합친 유기층을 염수(2x)로 세척하고, 건조시킨 후(MgS04) 감압하에서 농축시켰다. 잔류물을 실리카겔상에서 CH2Cl2:EtOAc:MeOH(1:1:0.1)로 용리하면서 플래쉬 크로마토그래피하여 225mg(44%)의 백색 고체를 수득하였다.
실시예 11: 4-(3급-부틸-디메틸- 실라닐옥시 )- 부트 -2- 이닐아민
THF(50ml)중의 공지된 4-(3급-부틸-디메틸-실라닐옥시)-부트-2-인-1-올(3.14g, 15.7mmol)의 빙냉된 교반 용액에 DBU(2.6ml, 17.4mmol) 및 DPPA(3.8ml, 17.6mmol)를 첨가하였다. 이 용액을 실온으로 가온시키고, 불활성 분위기하에서 하룻밤 동안 교반하였다. 반응물을 포화 NaHCO3에 붓고, 층들을 분리하였다. 수층을 EtOAc(2x)로 재추출하고, 합친 유기층을 건조시킨 후(Na2SO4), 진공하에서 농축시켰다. 트리페닐포스핀(4.61g, 17.6mmol)을 THF(50ml)에 용해된 상기 조질 아지드에 첨가한 후, H2O(0.44ml)를 첨가하였다. 생성된 용액을 실온에서 하룻밤 동안 교반하고, 감압하에서 농축시킨 후, 잔류물을 Et2O/석유 에테르의 1:1 혼합물에서 슬러리화하였다. 고체를 제거하고, 여액을 농축시킨 후 실리카겔상에서 CH2Cl2/MeOH(19:1)로 용리하면서 플래쉬 크로마토그래피하여 호박색 오일을 수득하였다.
실시예 12: 2-[3-[2-(4,6-디메틸-피리딘-2-일)-비닐]-1-( 테트라히드로 -피란-2-일)-1H-인다졸-6-일아미노]-N-프로프-2-이닐-벤즈아미드
2-[3-[2-(4,6-디메틸-피리딘-2-일)-비닐]-1-(테트라히드로-피란-2-일)-1H-인다졸-6-일아미노]-벤조산 및 프로파길 아민을 사용한 것을 제외하고는, 상기 실시예 6에 기재된 바와 유사한 방식으로 제조하였다.
실시예 13: N-( 프로프 -2- 이닐 )-2-{3-[(E)-2-(2,4-디메틸-피리딘-2-일)-비닐]-1H-인다졸-6-일아미노}-벤즈아미드
N-[4-(3급-부틸-디메틸-실라닐옥시)-부트-2-이닐]-2-[3-[2-(4,6-디메틸-피리딘-2-일)-비닐]-1-(테트라히드로-피란-2-일)-1H-인다졸-6-일아미노]-벤즈아미드 대신 N-(3-시클로프로필-프로프-2-이닐)-2-[3-[2-(4,6-디메틸-피리딘-2-일)-비닐]-1-(테트라히드로-피란-2-일)-1H-인다졸-6-일아미노]-벤즈아미드를 사용한 것을 제외하고는, 실시예 7에 기재된 바와 유사한 방식으로 제조하였다.
실시예 14: 2-[3-[2-(4,6-디메틸-피리딘-2-일)-비닐]-1-( 테트라히드로 -피란-2-일)-1H-인다졸-6-일아미노]-N-(2-메틸-알릴)-벤즈아미드
2-[3-[2-(4,6-디메틸-피리딘-2-일)-비닐]-1-(테트라히드로-피란-2-일)-1H-인다졸-6-일아미노]-벤조산 및 2-메틸-알릴아민을 사용한 것을 제외하고는, 상기 실시예 6에 기재된 바와 유사한 방식으로 제조하였다.
실시예 15: 2-{3-[2-(4,6-디메틸-피리딘-2-일)-비닐]-1H-인다졸-6- 일아미노 }-N-(2-메틸-알릴)- 벤즈아미드
N-[4-(3급-부틸-디메틸-실라닐옥시)-부트-2-이닐]-2-[3-[2-(4,6-디메틸-피리딘-2-일)-비닐]-1-(테트라히드로-피란-2-일)-1H-인다졸-6-일아미노]-벤즈아미드 대신 N-(2-메틸-알릴)-2-[3-[2-(4,6-디메틸-피리딘-2-일)-비닐]-1-(테트라히드로-피란-2-일)-1H-인다졸-6-일아미노]-벤즈아미드를 사용한 것을 제외하고는, 실시예 7에 기재된 바와 유사한 방식으로 제조하였다
실시예 16(a) 시클로프로필- 프로프 -2-인-1-올
-10℃ 얼음욕에서 냉각된 70mL 무수 THF를 함유하는 둥근바닥 플라스크에 헥산중의 1.6M BuLi 65.6mL(105mmol)를 첨가하였다. 5-클로로-펜트-1-인(5.13g, 50mmol)을 온도를 -10℃ 내지 0℃로 유지하면서 천천히 도입시켰다. 이 혼합물을 아르곤하에서 2시간 동안 0℃에서 교반하였다. 파라포름알데히드(3g, 100mmol)를 고체로서 첨가하였다. 이 혼합물을 실온으로 천천히 가온시키고 하룻밤 동안 아르곤하에서 교반하였다. 다음날, 물을 첨가하고, 약 50mL의 1N 수성 HCl을 첨가하였다. 이 혼합물을 에틸 아세테이트로 추출하고, 합친 유기층을 염수로 세척한 후, Na2SO4상에서 건조시키고, 여과하고 농축시켰다. 조질 생성물을 헥산중의 20% Et2O로 용리하면서 칼럼에 의해 정제하여 오일로서 3g의 3-시클로프로필-프로프-2-인-1-올을 수득하였다(62% 수율).
실시예 16(b): 3-시클로프로필- 프로프 -2- 이닐아지드
3-시클로프로필-프로프-2-인-1-올(3.28g, 34.1mmol)을 40mL 톨루엔에 용해시키고, 온도를 수욕으로 유지하면서 DPPA(11.26g, 40.9mmol) 및 이어서 DBU(6.24g, 40.9mmol)를 첨가하였다. 혼합물을 실온에서 1시간 동안 교반하고, 100mL 헥산 및 15mL CH2Cl2로 희석하였다. 이 혼합물을 물로 4회 세척하고 염수로 1회 세척한 후, Na2SO4상에서 건조시키고, 여과하고, 냉수욕과 함께 회전 증발시키면서 농축시켜 대부분의 유기 용매를 제거하고 일부 톨루엔만 남겼다(휘발성 생성물). 잔류 오일을 다음 단계에 사용하였다.
실시예 16(c): 3-시클로프로필- 프로프 -2- 이닐아민
3-시클로프로필-프로프-2-이닐아지드(약 34mmol)를 100mL THF에 용해시키고, 1mL 물을 첨가한 후, 온도를 수욕으로 유지하면서 백색 고체로서 PPh3(13.37g, 51mmol)를 첨가하였다. 이 혼합물을 실온에서 1시간 동안 교반하였다. 150mL의 1N 수성 HCl을 상기 혼합물에 첨가하였다. 이 혼합물을 메틸렌 클로리드로 3회 세척하였다. 수층을 5N NaOH로 pH 10-12로 염기화하였다. 혼합물을 에틸 아세테이트로 추출하였다. 수층을 TLC 염색법으로 확인하여 아민이 유기상으로 추출되는 과정을 모니터링하였다. 합친 유기층을 Na2SO4상에서 건조시키고, 여과한 후, 농축시켜 1.62g의 원하는 생성물을 수득하였다(휘발성 생성물, 잔류 EtOAc 용매를 함유함)(2단계 동안 50% 수율).
실시예 17: N-(3-시클로프로필- 프로프 -2- 이닐 )-2-[3-[2-(4,6-디메틸-피리딘-2-일)-비닐]-1-(테트라히드로-피란-2-일)-1H-인다졸-6-일아미노]-벤즈아미드
2-[3-[2-(4,6-디메틸-피리딘-2-일)-비닐]-1-(테트라히드로-피란-2-일)-1H-인다졸-6-일아미노]-벤조산 E 및 3-시클로프로필-프로프-2-이닐아민을 사용한 것을 제외하고는, 상기 실시예 6에 기재된 바와 유사한 방식으로 제조하였다.
실시예 18: N-(3- 시클로프로프 -2- 이닐 )-2-{3-[(E)-2-(4,6-디메틸-피리딘-2-일)-비닐]-1H-인다졸-6-일아미노}-벤즈아미드
N-[4-(3급-부틸-디메틸-실라닐옥시)-부트-2-이닐]-2-[3-[2-(4,6-디메틸-피리딘-2-일)-비닐]-1-(테트라히드로-피란-2-일)-1H-인다졸-6-일아미노]-벤즈아미드 대신 2-[3-[2-(4,6-디메틸-피리딘-2-일)-비닐]-1-(테트라히드로-피란-2-일)-1H-인다졸-6-일아미노]-N-프로프-2-이닐-벤즈아미드를 사용한 것을 제외하고는, 상기 실시예 7에 기재된 바와 유사한 방식으로 제조하였다.
실시예 19(a): 2-부틴-1,4- 디올 , 모노아세테이트
무수 THF중의 부틴-1,4-디올(5g, 58mmol)의 용액에 실온에서 수소화나트륨(오일중의 60% 분산액, 2.32g, 58mmol)을 부분씩 첨가하였다. 4.3시간 후에, 아세틸 클로리드(4.12mL, 58mmol)를 첨가하였다. 실온에서 22시간 동안 교반한 후에, 혼합물을 감압하에 농축시켰다. 잔류물을 톨루엔으로부터 2회 농축시킨 후, 실리카겔상에서 용리액으로서 에틸 아세테이트/디클로로메탄(1:3)을 사용하여 정제하여 오일로서 2-부틴-1,4-디올, 모노아세테이트를 49% 수율로 수득하였다.
실시예 19(b): 아세트산 4-아미노- 부트 -2- 이닐 에스테르
4-(3급-부틸-디메틸-실라닐옥시)-부트-2-인-1-올 대신 2-부틴-1,4-디올 모노아세테이트를 사용한 것을 제외하고는, 실시예 8에 기재된 바와 유사한 방식으로 제조하였다.
실시예 20: 아세트산 4-(2-{3-[(E)-2-(4,6-디메틸-피리딘-2-일)-비닐]-1H-인다졸-6-일아미노}-벤조일아미노)-부트-2-이닐 에스테르
2-[3-[2-(4,6-디메틸-피리딘-2-일)-비닐]-1H-인다졸-6-일아미노]-벤조산 p-톨루엔 설포네이트 및 아세트산 4-아미노-부트-2-이닐 에스테르를 사용한 것을 제외하고는, 상기 실시예 6에 기재된 바와 유사한 방식으로 제조하였다.
실시예 21: 2-[3-[(E)-2-(4,6-디메틸-피리딘-2-일)-비닐]-l-( 테트라히드로 -피란-2-일)-1H-인다졸-6-일아미노]-니코틴산 메틸 에스테르
2-브로모-벤조산 메틸 에스테르 대신 2-브로모-니코틴산 메틸 에스테르를 사용한 것을 제외하고는, 상기 실시예 3에 기재된 바와 유사한 방식으로 제조하였다.
실시예 22: 2-[3-[(E)-2-(4,6-디메틸-피리딘-2-일)-비닐]-1-( 테트라히드로 -피란-2-일)-1H-인다졸-6-일아미노]-니코틴산
2-[3-[2-(4,6-디메틸-피리딘-2-일)-비닐]-1-(테트라히드로-피란-2-일)-1H-인다졸-6-일아미노]-벤조산 메틸 에스테르 대신 2-[3-[(E)-2-(4,6-디메틸-피리딘-2-일)-비닐]-1-(테트라히드로-피란-2-일)-1H-인다졸-6-일아미노]-니코틴산 메틸 에스테르를 사용한 것을 제외하고는, 상기 실시예 4에 기재된 바와 유사한 방식으로 제조하였다.
실시예 23: 2-{3-[(E)-2-(4,6-디메틸-피리딘-2-일)-비닐]-1H-인다졸-6- 일아미노 }-N-(4-히드록시-부트-2-이닐)-니코틴아미드
N-(4-히드록시-부트-2-이닐)-2-[3-[2-(4,6-디메틸-피리딘-2-일)-비닐]-1-(테트라히드로-피란-2-일)-1H-인다졸-6-일아미노]-니코틴아미드 및 N-[4-(3급-부틸-디메틸-실라닐옥시)-부트-2-이닐]-2-[3-[2-(4,6-디메틸-피리딘-2-일)-비닐]-1-(테트라히드로피란-2-일)-1H-인다졸-6-일아미노]-니코틴아미드의 조질 혼합물을 상기 실시예 6에 기재된 바와 유사한 방식으로 2-[3-[(E)-2-(4,6-디메틸-피리딘-2-일)-비닐]-1-(테트라히드로-피란-2-일)-1H-인다졸-6-일아미노]-니코틴산 및 4-(3급-부틸-디메틸-실라닐옥시)-부트-2-이닐아민으로부터 제조하고, N-[4-(3급-부틸-디메틸-실라닐옥시)-부트-2-이닐]-2-[3-[2-(4,6-디메틸-피리딘-2-일)-비닐]-1-(테트라히드로-피란-2-일)-1H-인다졸-6-일아미노]-벤즈아미드 대신 N-(4-히드록시-부트-2-이닐)-2-[3-[2-(4,6-디메틸-피리딘-2-일)-비닐]-1-(테트라히드로-피란-2-일)-1H-인다졸-6-일아미노l-니코틴아미드 및 N-[4-(3급-부틸-디메틸-실라닐옥시)-부트-2-이닐]-2-[3-[2-(4,6-디메틸-피리딘-2-일)-비닐]-1-(테트라히드로-피란-2-일)-1H-인다졸-6-일아미노]-니코틴아미드의 혼합물을 사용한 것을 제외하고는 실시예 7에 기재된 바와 유사한 방식으로 2-{3-[(E)-2-(4,6-디메틸-피리딘-2-일)-비닐]-1H-인다졸-6-일아미노}-N-(4-히드록시-부트-2-이닐)-니코틴아미드로 전환시켰다.
실시예 24: 2-{3-[2-(4,6-디메틸-피리딘-2-일)-비닐]-1H-인다졸-6- 일아미노 }-니코틴산 p-톨루엔 설포네이트
2-[3-[2-(4,6-디메틸-피리딘-2-일)-비닐]-1-(테트라히드로-피란-2-일)-1H-인다졸-6-일아미노]-벤조산 대신 2-[3-[(E)-2-(4,6-디메틸-피리딘-2-일)-비닐]-1-(테트라히드로-피란-2-일)-1H-인다졸-6-일아미노]-니코틴산을 사용한 것을 제외하고는, 상기 실시예 5에 기재된 바와 유사한 방식으로 제조하였다.
실시예 25: N-(3-시클로프로필- 프로프 -2- 이닐 )-2-{3-[(E)-2-(4,6-디메틸-피리딘-2-일)-비닐]-1H-인다졸-6-일아미노}-니코틴아미드
2-{3-[2-(4,6-디메틸-피리딘-2-일)-비닐]-1H-인다졸-6-일아미노}-니코틴산 p-톨루엔 설포네이트 및 3-시클로프로필-프로프-2-이닐아민을 사용한 것을 제외하고는, 상기 실시예 6에 기재된 바와 유사한 방식으로 제조하였다.
실시예 26: 4-메틸-2-비닐-피리딘
톨루엔(100mL)중의 2-브로모-4-메틸-피리딘(알드리히, 5.2g, 30.5mmol, 1.0당량), 2,6-디-3급-부틸-4-메틸-페놀(알드리히, 67mg, 0.3mmol, 1mol%), 트리부틸-비닐-스탄난(알드리히, 26.8mL, 91.5mmol, 3.0당량) 및 테트라키스(트리페닐포스핀) 팔라듐(0)(스트렘(Strem), 1.8g, 1.5mmol, 5mol%)의 황색 혼합물을 탈기시키고 아르곤으로 퍼징(purging)하였다. 혼합물을 100℃로 가온시킨 후에 호박색 용액을 수득하였다. 반응 혼합물을 18시간 후에 1.0M HCl을 첨가하여 반응정지시켰다. 산성 추출물을 에테르로 세척하고, 고체 중탄산나트륨으로 pH 9로 조정한 후, 에틸 아세테이트로 추출하였다. 유기 추출물을 염수로 세척하고, 황산마그네슘상에서 건조시킨 후, 여과하고, 감압하에서 농축시켰다. 조질 생성물(3.7g의 갈색 오일)을 플래쉬 크로마토그래피(실리카)로 정제하고 0-5% 에틸 아세테이트-디클로로메탄으로 용리시켜, 투명한 오일(1.9g, 53%)을 수득하였다.
실시예 27: 3-[2-(4-메틸-피리딘-2-일)-비닐]-6-니트로-1-( 테트라히드로 -피란-2-일)-1H-인다졸
탈기된 DMF(50ml)중의 4-메틸-2-비닐-피리딘(실시예 23)(1.9g, 15.97mmol), 6-니트로-1-(테트라히드로-피란-2-일)-3-비닐-1H-인다졸(4.96g, 13.3mmol), Pd(OAc)2(149mg, 0.66mol), P(o-톨릴)3 및 DIEA(3.5ml, 19.96mmol)의 현탁액을 18시간 동안 100℃에서 아르곤하에 가열하였다. 반응 혼합물을 냉각시키고, EtOAc로 세척하면서 고체를 여과하여 제거하였다. 여액을 EtOAc로 희석하고 염수(2x)로 세척한 후, 건조시키고(MgS04) 감압하에 농축시켰다. 잔류물을 실리카겔상에서 헥산:EtOAc(3:1)로 용리하면서 크로마토그래피하여 3.40g(70%)의 선명한 황색 고체를 수득하였다.
실시예 28: 3-[2-(4-메틸-피리딘-2-일)-비닐]-1-( 테트라히드로 -피란-2-일)-1H-인다졸-6-일아민
3-[2-(4,6-디메틸-피리딘-2-일)-비닐]-6-니트로-1-(테트라히드로-피란-2-일)-1H-인다졸 대신 [2-(4-메틸-피리딘-2-일)-비닐]-6-니트로-1-(테트라히드로-피란-2-일)-1H-인다졸(실시예 24)을 사용한 것을 제외하고는, 상기 실시예 2에 기재된 바와 유사한 방식으로 제조하였다.
실시예 29: 2-[3-[2-(4-메틸-피리딘-2-일)-비닐]-1-( 테트라히드로 -피란-2-일)-1H-인다졸-6-일아미노]-벤조산 메틸 에스테르
3-[2-(4,6-디메틸-피리딘-2-일)-비닐]-1-(테트라히드로-피란-2-일)-1H-인다졸-6-일아민 대신 3-[2-(4-메틸-피리딘-2-일)-비닐]-1-(테트라히드로-피란-2-일)-1H-인다졸-6-일아민을 사용한 것을 제외하고는, 상기 실시예 3에 기재된 바와 유사한 방식으로 제조하였다.
실시예 30: 2-[3-[2-(4-메틸-피리딘-2-일)-비닐]-1-( 테트라히드로 -피란-2-일)-1H-인다졸-6-일아미노]-벤조산
2-[3-[2-(4,6-디메틸-피리딘-2-일)-비닐]-1-(테트라히드로-피란-2-일)-1H-인다졸-6-일아미노]-벤조산 메틸 에스테르(실시예 3) 대신 2-[3-[2-(4-메틸-피리딘-2-일)-비닐]-1-(테트라히드로-피란-2-일)-1H-인다졸-6-일아미노]-벤조산 메틸 에스테르를 사용한 것을 제외하고는, 상기 실시예 4에 기재된 바와 유사한 방식으로 제조하였다.
실시예 31: 2-[3-[2-(4-메틸-피리딘-2-일)-비닐]-1-( 테트라히드로 -피란-2-일)-1H-인다졸-6-일아미노]-N-프로프-2-이닐-벤즈아미드
프로파길 아민 및 2-[3-[2-(4-메틸-피리딘-2-일)-비닐]-1-(테트라히드로-피란-2-일)-1H-인다졸-6-일아미노]-벤조산을 사용한 것을 제외하고는, 상기 실시예 6에 기재된 바와 유사한 방식으로 제조하였다.
실시예 32: 2-{3-[(E)-2-(4-메틸-피리딘-2-일)-비닐]-1H-인다졸-6- 일아미노 }-N- 프로프 -2-이닐-벤즈아미드
N-[4-(3급-부틸-디메틸-실라닐옥시)-부트-2-이닐]-2-[3-[2-(4,6-디메틸-피리딘-2-일)-비닐]-1-(테트라히드로-피란-2-일)-1H-인다졸-6-일아미노]-벤즈아미드 대신 2-[3-[2-(4-메틸-피리딘-2-일)-비닐]-1-(테트라히드로-피란-2-일)-1H-인다졸-6-일아미노]-N-프로프-2-이닐-벤즈아미드를 사용한 것을 제외하고는, 상기 실시예 7에 기재된 바와 유사한 방식으로 제조하였다.
실시예 33: N-(2-메틸-알릴)-2-[3-[2-(4-메틸-피리딘-2-일)-비닐]-1-( 테트라히드로 -피란-2-일)-1H-인다졸-6-일아미노]-벤즈아미드
2-메틸-알릴아민 및 2-[3-[2-(4-메틸-피리딘-2-일)-비닐]-1-(테트라히드로-피란-2-일)-1H-인다졸-6-일아미노]-벤조산을 사용한 것을 제외하고는, 상기 실시예 6에 기재된 바와 유사한 방식으로 제조하였다.
실시예 34: N-(2-메틸-알릴)-2-{[(E)-2-(4-메틸-피리딘-2-일)-비닐]-1H-인다졸-6-일아미노}-벤즈아미드
N-[4-(3급-부틸-디메틸-실라닐옥시)-부트-2-이닐]-2-[3-[2-(4,6-디메틸-피리딘-2-일)-비닐]-1-(테트라히드로-피란-2-일)-1H-인다졸-6-일아미노]-벤즈아미드 대신 N-(2-메틸-알릴)-2-[3-[2-(4-메틸-피리딘-2-일)-비닐]-1-(테트라히드로-피란-2-일)-1H-인다졸-6-일아미노]-벤즈아미드를 사용한 것을 제외하고는, 상기 실시예 7에 기재된 바와 유사한 방식으로 제조하였다.
실시예 35: N-(3-시클로프로필- 프로프 -2- 이닐 )-2-[3-[2-(4-메틸-피리딘-2-일)-비닐]-1-(테트라히드로-피란-2-일)-1H-인다졸-6-일아미노]-벤즈아미드
2-[3-[2-(4-메틸-피리딘-2-일)-비닐]-1-(테트라히드로-피란-2-일)-1H-인다졸-6-일아미노]-벤조산 및 3-시클로프로필-프로프-2-이닐아민을 사용한 것을 제외하고는, 상기 실시예 6에 기재된 바와 유사한 방식으로 제조하였다.
실시예 36: N-(3- 시클로프로프 -2- 이닐 )-2-{3-[(E)-2-(4-메틸-피리딘-2-일)-비닐]-1H-인다졸-6-일아미노}-벤즈아미드
N-[4-(3급-부틸-디메틸-실라닐옥시)-부트-2-이닐]-2-[3-[2-(4,6-디메틸-피리딘-2-일)-비닐]-1-(테트라히드로-피란-2-일)-1H-인다졸-6-일아미노]-벤즈아미드 대신 N-(3-시클로프로프-2-이닐)-2-[3-[2-(4-메틸-피리딘-2-일)-비닐]-1-(테트라히드로-피란-2-일)-1H-인다졸-6-일아미노]-벤즈아미드를 사용한 것을 제외하고는, 상기 실시예 7에 기재된 바와 유사한 방식으로 제조하였다.
실시예 37: 2-{3-[2-(4-메틸-피리딘-2-일)-비닐]-1H-인다졸-6- 일아미노 }-N-피리딘-2-일메틸-벤즈아미드
2-[3-[2-(4-메틸-피리딘-2-일)-비닐]-1-(테트라히드로-피란-2-일)-1H-인다졸-6-일아미노]-벤조산 및 C-피리딘-2-일-메틸아민을 사용한 것을 제외하고는, 상기 실시예 6 및 7에 기재된 바와 유사한 방식으로 제조하였다.
실시예 38: 2-{3-[2-(4-메틸-피리딘-2-일)-비닐]-1H-인다졸-6- 일아미노 }-N-피리딘-4-일메틸-벤즈아미드
2-[3-[2-(4-메틸-피리딘-2-일)-비닐]-l-(테트라히드로-피란-2-일)-1H-인다졸-6-일아미노]-벤조산 및 C-피리딘-4-일-메틸아민을 사용한 것을 제외하고는, 상기 실시예 6 및 7에 기재된 바와 유사한 방식으로 제조하였다.
실시예 39: N-(6-메틸-피리딘-2- 일메틸 )-2-{3-[2-(4-메틸-피리딘-2-일)-비닐]-1H-인다졸-6-일아미노}-벤즈아미드
2-[3-[2-(4-메틸-피리딘-2-일)-비닐]-1-(테트라히드로-피란-2-일)-1H-인다졸-6-일아미노]-벤조산 및 C-(6-메틸-피리딘-2-일)-메틸아민을 사용한 것을 제외하고는, 상기 실시예 6 및 7에 기재된 바와 유사한 방식으로 제조하였다.
실시예 40 : N-(2,5-디메틸-2H- 피라졸 -3- 일메틸 )-2-[(E)-3-[2-(4-메틸-피리딘-2-일)-비닐]-1-(테트라히드로-피란-2-일)-1H-인다졸-6-일아미노]-벤즈아미드
2-{3-[2-(4-메틸-피리딘-2-일)-비닐]-1-(테트라히드로-피란-2-일)-1H-인다졸-6-일아미노}-벤조산 및 C-(2,5-디메틸-2H-피라졸-3-일)-메틸아민을 사용한 것을 제외하고는, 상기 실시예 6에 기재된 바와 유사한 방식으로 제조하였다.
실시예 41: N-(2,5-디메틸-2H- 피라졸 -3- 일메틸 )-2-{3-[(E)-2-(4-메틸-피리딘-2-일)-비닐]-1H-인다졸-6-일아미노}-벤즈아미드
N-[4-(3급-부틸-디메틸-실라닐옥시)-부트-2-이닐]-2-[3-[2-(4,6-디메틸-피리딘-2-일)-비닐]-1-(테트라히드로-피란-2-일)-1H-인다졸-6-일아미노]-벤즈아미드 대신 N-(2,5-디메틸-2H-피라졸-3-일메틸)-2-[(E)-3-[2-(4-메틸-피리딘-2-일)-비닐]-1-(테트라히드로-피란-2-일)-1H-인다졸-6-일아미노]-벤즈아미드를 사용한 것을 제외하고는, 상기 실시예 7에 기재된 바와 유사한 방식으로 제조하였다.
실시예 42: 1-메틸-1H- 벤조이미다졸 -2- 카르브알데히드 옥심
H2O(10ml)중의 1-메틸-1H-벤조이미다졸-2-카르브알데히드(980mg, 6. 61mmol)의 교반 현탁액에 10ml의 H2O중의 아세트산나트륨(3.25g, 39.68mmol) 및 히드록실아민 히드로클로리드(1.38g, 19.84mmol)의 용액을 첨가하였다. 반응물을 실온에서 2시간 동안 교반하고, 점성의 침전물을 여과하여 수거한 후, 물로 세척하고, 진공하에 건조시켜 1.02g(94%)의 백색 고체를 수득하였다.
실시예 43: C-(1-메틸-1H- 벤조이미다졸 -2-일)-메틸아민 디히드로클로리드
파르(Parr) 압력병에 1-메틸-1H-벤조이미다졸-2-카르브알데히드 옥심 M(267mg,1.6mmol), 10% 탄소상 팔라듐(75mg), 진한 HCl(2액적) 및 EtOH(25mol)를 투입하였다. 반응 혼합물을 2시간 동안 45psi의 H2하에서 진탕시킨 후, 촉매를 여과하여 제거하였다. 여액을 감압하에 농축시키고, 잔류물을 Et2O로 바수어 디히드로클로리드 염으로서 340mg(90%)의 백색 고체를 수득하였고, 이를 추가로 정제하지 않고 사용하였다.
실시예 44: N-(1-메틸-1H- 벤조이미다졸 -2- 일메틸 )-2-[3-[2-(4-메틸-피리딘-2-일)-비닐]-1-(테트라히드로-피란-2-일)-1H-인다졸-6-일아미노]-벤즈아미드
C-(1-메틸-1H-벤조이미다졸-2-일)-메틸아민 히드로클로리드 N 및 2-[3-[2-(4-메틸-피리딘-2-일)-비닐]-1-(테트라히드로-피란-2-일)-1H-인다졸-6-일아미노]-벤조산을 사용한 것을 제외하고는, 상기 실시예 6에 기재된 바와 유사한 방식으로 제조하였다.
실시예 45: N-(1-메틸-1H- 벤조이미다졸 -2- 일메틸 )-2-{3-[(E)2-(4-메틸-피리딘-2-일)-비닐]-1H-인다졸-6-일아미노}-벤즈아미드
N-[4-(3급-부틸-디메틸-실라닐옥시)-부트-2-이닐]-2-[3-[2-(4,6-디메틸-피리딘-2-일)-비닐]-1-(테트라히드로-피란-2-일)-1H-인다졸-6-일아미노J-벤즈아미드 대신 N-(1-메틸-1H-벤조이미다졸-2-일메틸)-2-[3-[2-(4-메틸-피리딘-2-일)-비닐]-1-(테트라히드로-피란-2-일)-1H-인다졸-6-일아미노]-벤즈아미드를 사용한 것을 제외하고는, 상기 실시예 7에 기재된 바와 유사한 방식으로 제조하였다.
실시예 46: 1-메틸-1H- 이미다졸 -2- 카르브알데히드 옥심
1-메틸-1H-벤조이미다졸-2-카르브알데히드 대신 1-메틸-1H-이미다졸-2-카르브알데히드를 사용한 것을 제외하고는, 상기 실시예 39에 기재된 바와 유사한 방식으로 제조하였다.
실시예 47: C-(1-메틸-1H- 이미다졸 -2-일)-메틸아민 디히드로클로리드
1-메틸-1H-벤조이미다졸-2-카르브알데히드 옥심 대신 1-메틸-1H-이미다졸-2-카르브알데히드를 사용한 것을 제외하고는, 상기 실시예 40에 기재된 바와 유사한 방식으로 제조하였다.
실시예 48: N-(1-메틸-1H- 이미다졸 -2- 일메틸 )-2-[3-[2-(4-메틸-피리딘-2-일)-비닐]-1-(테트라히드로-피란-2-일)-1H-인다졸-6-일아미노]-벤즈아미드
C-(1-메틸-1H-이미다졸-2-일)-메틸아민 히드로클로리드 및 2-[3-[2-(4-메틸-피리딘-2-일)-비닐]-1-(테트라히드로-피란-2-일)-1H-인다졸-6-일아미노]-벤조산을 사용한 것을 제외하고는, 상기 실시예 6에 기재된 바와 유사한 방식으로 제조하였다.
실시예 49: N-(1-메틸-1H- 이미다졸 -2- 일메틸 )-2-{3-[2-(4-메틸-피리딘-2-일)-비닐]-1H-인다졸-6- 일아미노 }- 벤즈아미드
N-[4-(3급-부틸-디메틸-실라닐옥시)-부트-2-이닐]-2-[3-[2-(4,6-디메틸-피리딘-2-일)-비닐]-1-(테트라히드로-피란-2-일)-1H-인다졸-6-일아미노]-벤즈아미드 대신 N-(1-메틸-1H-이미다졸-2-일메틸)-2-[3-[2-(4-메틸-피리딘-2-일)-비닐]-1-(테트라히드로-피란-2-일)-1H-인다졸-6-일아미노]-벤즈아미드를 사용한 것을 제외하고는, 상기 실시예 7에 기재된 바와 유사한 방식으로 제조하였다.
실시예 50: N-(4-히드록시- 부트 -2- 이닐 )-2-[3-[2-(4-메틸-피리딘-2-일)-비닐]-1-(테트라히드로-피란-2-일)-1H-인다졸-6-일아미노]-벤즈아미드
2-[3-[2-(4-메틸-피리딘-2-일)-비닐]-1-(테트라히드로-피란-2-일)-1H-인다졸-6-일아미노]-벤조산 및 4-(3급-부틸-디메틸-실라닐옥시)-부트-2-이닐아민을 사용한 것을 제외하고는, 상기 실시예 6에 기재된 바와 유사한 방식으로 제조하였다.
실시예 51: 2-{3-[(E)-2-(4-메틸-피리딘-2-일)-비닐]-1H-인다졸-6- 일아미노 }-N-(4-히드록시-부트-2-이닐)-벤즈아미드
N-[4-(3급-부틸-디메틸-실라닐옥시)-부트-2-이닐]-2-[3-[2-(4,6-디메틸-피리딘-2-일)-비닐]-1-(테트라히드로-피란-2-일)-1H-인다졸-6-일아미노]-벤즈아미드 대신 N-(4-히드록시-부트-2-이닐)-2-[3-[2-(4-메틸-피리딘-2-일)-비닐]-1-(테트라히드로-피란-2-일)-1H-인다졸-6-일아미노]-벤즈아미드 및 N-[4-(3급-부틸-디메틸-실라닐옥시)-부트-2-이닐]-2-[3-[2-(4-메틸-피리딘-2-일)-비닐]-1-(테트라히드로-피란-2-일)-1H-인다졸-6-일아미노]-벤즈아미드의 혼합물을 사용한 것을 제외하고는, 상기 실시예 7에 기재된 바와 유사한 방식으로 제조하였다.
실시예 52: 2-[3-(피롤-1- 일이미노메틸 )-1-(2- 트리메틸실라닐 - 에톡시메틸 )-1H-인다졸-6-일아미노]-벤조산 메틸 에스테르
6-요오도-3-스티릴-1-(2-트리메틸실라닐-에톡시메틸)-1H-인다졸 대신 6-니트로-3-스티릴-1-(2-트리메틸실라닐-에톡시메틸)-1H-인다졸로부터 출발한 것을 제외하고는, 상기 실시예 2 및 3에 기재된 바와 유사한 방식으로 제조하였다.
이 물질을 다음 단계에서 생성물과 2-아미노-벤조산 메틸 에스테르의 조질 혼합물로서 사용하였다.
실시예 53: 2-[3-(피롤-1- 일이미노메틸 )-1-(2- 트리메틸실라닐 - 에톡시메틸 )-1H-인다졸-6-일아미노]-벤조산
2000년 6월 30일자로 출원되고 본원에 모든 목적을 위해 그 전체가 참고로 인용된 미국 특허원 제09/609,335호의 실시예 11과 유사한 절차를 사용하여 N-[4-(3급-부틸-디메틸-실라닐옥시)-부트-2-이닐]-2-[3-(피롤-1-일이미노메틸)-1-(2-트리메틸실라닐-에톡시메틸)-1H-인다졸-6-일아미노]-벤즈아미드 및 TBAF를 반응시켜 부산물로서 단리하였다.
실시예 54: N-(3-시클로프로필- 프로프 -2- 이닐 )-2-[3-(피롤-1- 일이미노메틸 )-1-(2-트리메틸실라닐-에톡시메틸)-1H-인다졸-6-일아미노]-벤즈아미드
2-[3-(피롤-1-일이미노메틸)-1-(2-트리메틸실라닐-에톡시메틸)-1H-인다졸-6-일아미노]-벤조산 및 3-시클로프로필-프로프-2-이닐아민을 사용한 것을 제외하고는, 상기 실시예 6에 기재된 바와 유사한 방식으로 제조하였다.
실시예 55: N-(3-시클로프로필- 프로프 -2- 이닐 )-2-[3-(피롤-1- 일이미노메틸 )-1H-인 다졸 -6- 일아미노 ]- 벤즈아미드
N-메틸-N-{3-스티릴-1-[2-(트리메틸-실라닐)-에톡시메틸]-1H-인다졸-6-일}-벤젠-1,3-디아민 대신 N-(3-시클로프로필-프로프-2-이닐)-2-[3-(피롤-1-일이미노메틸)-1-(2-트리메틸실라닐-에톡시메틸)-1H-인다졸-6-일아미노]-벤즈아미드를 사용한 것을 제외하고는, 2000년 6월 30일자로 출원되고 본원에서 모든 목적을 위해 그 전체가 참고로 인용된 미국 특허원 제09/609,335호의 실시예 11에 기재된 바와 유사한 방식으로 제조하였다.
실시예 56: N-[4-(3급-부틸-디메틸- 실라닐옥시 )- 부트 -2- 이닐 ]-2-[3-(피롤-1- 일이미노메틸 )-1-(2-트리메틸실라닐-에톡시메틸)-1H-인다졸-6-일아미노]-벤즈아미드
2-[3-(피롤-1-일이미노메틸)-1-(2-트리메틸실라닐-에톡시메틸)-1H-인다졸-6-일아미노]벤조산 및 4-(3급-부틸-디메틸-실라닐옥시)-부트-2-이닐아민을 사용한 것을 제외하고는, 상기 실시예 6에 기재된 바와 유사한 방식으로 제조하였다.
실시예 57: N-(4-히드록시- 부트 -2- 이닐 )-2-[3-(피롤-1- 일이미노메틸 )-1H-인다졸-6-일아미노]-벤즈아미드
N-메틸-N-{3-스티릴-1-[2-(트리메틸-실라닐)-에톡시메틸]-1H-인다졸-6-일}-벤젠-1,3-디아민 대신 N-[4-(3급-부틸-디메틸-실라닐옥시)-부트-2-이닐]-2-[3-(피롤-1-일이미노메틸)-1-(2-트리메틸실라닐-에톡시메틸)-1H-인다졸-6-일아미노]-벤즈아미드를 사용한 것을 제외하고는, 2000년 6월 30일자로 출원되고 본원에서 모든 목적을 위해 그 전체가 참고로 인용된 미국 특허원 제09/609,335호의 실시예 11에 기재된 바와 유사한 방식으로 제조하였다.
실시예 58: 2,5-디메틸-2H- 피라졸 -3- 카르보니트릴
카스텔라노스(Castellanos, Maria) 및 몬트세라트(Montserrat, Llinas)(문헌[JCS Perkins Trans I, 1209-1215, 1985])에 의해 1-메틸-피라졸-5-카르보니트릴에 대해 공개된 절차에 따라 에틸 1,3-디메틸피라졸-5-카르복실레이트로부터 2,5-디메틸-2H-피라졸-3-카르보니트릴을 제조하였다.
실시예 59: C-(2,5-디메틸-2H- 피라졸 -3-일)-메틸아민
에탄올(15mL)중의 2,5-디메틸-2H-피라졸-3-카르보니트릴(654mg, 5.4mmol) 및 10% 탄소상 팔라듐(200mg)의 현탁액을 파르 수소화 장치에서 17시간 동안 45psi H2하에서 진탕시켰다. 혼합물을 셀라이트를 통해 여과하고 여액을 감압하에 농축시켜 608mg의 오일을 수득하였고, 이를 추가로 정제하지 않고 사용하였다.
실시예 60: N-(2,5-디메틸-2H- 피라졸 -3- 일메틸 )-2-[3-(피롤-1- 일이미노메틸 )-1-(2-트리메틸실라닐-에톡시메틸)-1H-인다졸-6-일아미노]-벤즈아미드
2-[3-(피롤-1-일이미노메틸)-1-(2-트리메틸실라닐-에톡시메틸)-1H-인다졸-6-일아미노]-벤조산 및 C-(2,5-디메틸-2H-피라졸-3-일)-메틸아민을 사용한 것을 제외하고는, 상기 실시예 6에 기재된 바와 유사한 방식으로 제조하였다.
실시예 61: N-(2,5-디메틸-2H- 피라졸 -3- 일메틸 )-2-[3-(피롤-1- 일이미노메틸 )-1H-인다졸-6-일아미노]-벤즈아미드
N-메틸-N-{3-스티릴-1-[2-(트리메틸-실라닐)-에톡시메틸]-1H-인다졸-6-일}-벤젠-1,3-디아민 대신 N-(2,5-디메틸-2H-피라졸-3-일메틸)-2-[3-(피롤-1-일이미노메틸)-1-(2-트리메틸실라닐-에톡시메틸)-1H-인다졸-6-일아미노]-벤즈아미드를 사용한 것을 제외하고는, 2000년 6월 30일자로 출원되고 본원에서 모든 목적을 위해 그 전체가 참고로 인용된 미국 특허원 제09/609,335호의 실시예 11에 기재된 바와 유사한 방식으로 제조하였다.
실시예 62: 2-[3-(피롤-1- 일이미노메틸 )-1H-인다졸-6- 일아미노 ]-벤조산
N-메틸-N-{3-스티릴-1-[2-(트리메틸-실라닐)-에톡시메틸]-1H-인다졸-6-일}-벤젠-1,3-디아민 대신 2-[3-(피롤-1-일이미노메틸)-1-(2-트리메틸실라닐-에톡시메틸)-1H-인다졸-6-일아미노]-벤조산을 사용한 것을 제외하고는, 2000년 6월 30일자로 출원되고 본원에서 모든 목적을 위해 그 전체가 참고로 인용된 미국 특허원 제09/609,335호의 실시예 11에 기재된 바와 유사한 방식으로 제조하였다.
실시예 63: N- 프로프 -2- 이닐 -2-[3-(피롤-1- 일이미노메틸 )-1H-인다졸-6- 일아미노 ]- 벤즈아미드
2-[3-(피롤-1-일이미노메틸)-1H-인다졸-6-일아미노]-벤조산 및 프로파길 아민을 사용한 것을 제외하고는, 상기 실시예 6에 기재된 바와 유사한 방식으로 제조하였다.
실시예 64: N-(4-히드록시- 부트 -2- 이닐 )-2-[3-(2-피리딘-2-일-비닐)-1H-인다졸-6-일아미노]-벤즈아미드
3급-부틸 암모늄 2-[3-(2-피리딘-2-일-비닐)-1H-인다졸-6-일아미노]-벤조에이트 및 4-아미노-부트-2-인-1-올을 사용한 것을 제외하고는, 상기 실시예 6에 기재된 바와 유사한 방식으로 제조하였다.
실시예 65: N-(2,5-디메틸-2H- 피라졸 -3- 일메틸 )-2-[3-(2-피리딘-2-일-비닐)-1H-인다졸-6-일아미노]-벤즈아미드
3급-부틸 암모늄 2-[3-(2-피리딘-2-일-비닐)-1H-인다졸-6-일아미노]-벤조에이트 및 C-(2,5-디메틸-2H-피라졸-3-일)-메틸아민을 사용한 것을 제외하고는, 상기 실시예 6에 기재된 바와 유사한 방식으로 제조하였다.
전술한 예시적인 화합물들은 하기 시험 방법을 사용하여 그들의 활성에 대해 시험할 수 있다.
생물학적 시험 : 효소 검정법
성장 인자, 예를 들어 VEGF, FGF 및 기타에 의한 세포 증식의 자극은, 그들 각각의 수용체에서 티로신 키나제의 자가인산화 유도에 의해 좌우된다. 따라서, 단백질 키나제 저해제가 자가인산화를 차단하는 능력은 펩티드 기질의 저해로 측정할 수 있다. 화합물의 단백질 키나제 저해 활성을 측정하기 위해, 다음과 같은 구조물을 고안했다.
검정을 위한 VEGF - R2 구조물: 이 구조물로 시험 화합물이 티로신 키나제 활성을 저해하는 능력을 측정했다. 68개 잔기의 키나제 삽입 도메인 중 50개의 중앙 잔기가 결여된, 인간 혈관 내피세포 성장 인자 수용체 2 (VEGF-R2) 세포질 도메인의 구조물 (VEGF-R2Δ50)을 배큘로바이러스/곤충 세포 시스템에서 발현시켰다. 전체 길이 VEGF-R2의 1356개 잔기 중에서 VEGF-R2Δ50은 잔기 806-939 및 990-1171을 포함하고, 야생형 VEGF-R2와 비교하여 키나제 삽입 도메인 내에 1개의 점 돌연변이 (E990V)도 포함한다. 정제된 구조물의 자가인산화는 100 mM HEPES (pH 7.5) 중의 40 mM MgCl2 및 3 mM ATP의 존재하에 (5% 글리세롤 및 5 mM DTT를 함유), 4 μM 농도의 효소를 4℃에서 2시간 동안 항온처리하여 수행했다. 자가인산화 후, 상기 구조물은 야생형의 자가인산화된 키나제 도메인 구조물과 실질적으로 동등한 촉매 활성을 갖는 것으로 나타났다. 문헌 [Parast 등, Biochemistry, 37, 16788-16801 (1998)] 참조.
검정을 위한 FGF - R1 구조물: 내인성 메티오닌 잔기 456부터 시작해서 글루타메이트 766까지의 배큘로바이러스 벡터 발현 시스템 (잔기 번호부여 체계는 문헌 [Mohammadi 등, Mol . Cell. Biol, 16, 977-989 (1996)]에 따름)을 사용하여, 인간 FGF-R1의 세포내 키나제 도메인을 발현시켰다. 또한, 구조물은 L457V, C488A 및 C584S의 3개의 아미노산 치환도 갖고 있다.
검정을 위한 LCK 구조물: N-말단에 P233M 및 C224D의 2개의 아미노산 치환을 갖는, 아미노산 잔기 223부터 잔기 509의 단백질 말단까지의 N-말단 결실체로서의 LCK 티로신 키나제를 곤충 세포에서 발현시켰다.
검정을 위한 CHK1 구조물: C-말단이 His-태그된 전체 길이 인간 CHK1 (FL-CHK1)을 배큘로바이러스/곤충 세포 시스템을 사용하여 발현시켰다. 이는 476 아미노산 인간 CHK1의 C-말단에 6개의 히스티딘 잔기 (6 x His-태그)를 포함한다. 통상적인 크로마토그래피 기술로 단백질을 정제했다.
검정을 위한 CDK2 /사이클린 A 구조물: 배큘로바이러스 발현 벡터로 감염시킨 곤충 세포로부터, CDK2를 공개된 방법 (Rosenblatt 등, J. Mol Biol ., 230, 1317-1319 (1993))으로 정제했다. 전체 길이 재조합 사이클린 A를 발현하는 대장균 (E. coli) 세포로부터 사이클린 A를 정제하고, 절단된 사이클린 A 구조물을 제한 단백질 분해하여 생성하고 문헌 [Jeffrey 등, Nature, 376, 313-320 (1995)]에 이미 기술된 바와 같이 정제했다.
검정을 위한 CDK4 /사이클린 D 구조물: 인간 CDK4 및 사이클린 D3의 복합체, 또는 사이클린 D1 및 인간 CDK4와 글루타치온-S-트랜스퍼라제 (GST-CDK4)의 융합 단백질의 복합체를, 상응하는 배큘로바이러스 발현 벡터로 함께 감염시킨 곤충 세포로부터 전형적인 생화학적 크로마토그래피 기술을 사용하여 정제했다.
검정을 위한 FAK 구조물: 인간 FAK (FAKcd409)의 촉매 도메인을 배큘로바이러스 벡터 발현 시스템으로 발현시켰다. 발현된 280개 아미노산 도메인은 메티오닌 409부터 글루타메이트 689 잔기를 포함한다. 문헌 [Whithey, G. S. 등, DNA Cell Biol, 9, 823-30 (1993)]에 공개된 서열 할당 번호 L13616과 비교하여 1개의 아미노산 치환 (P410T)이 존재했다. 고전적인 크로마토그래피 기술을 사용하여 단백질을 정제했다.
검정을 위한 TIE-2 ( TEK ) 구조물
아미노산 잔기 774부터 잔기 1124의 단백질 말단까지의 N-말단 결실체로서, TIE-2 티로신 키나제 도메인을 곤충 세포에서 발현시켰다. 이 구조물은 번역시 개시 메티오닌 잔기로 작용하는 R774M 돌연변이도 가지고 있다.
VEGF - R2 검정법
커플링된 분광광도측정 ( FLVK -P) 검정법
인산기 전달을 수반하는 ATP로부터의 ADP 생성은 포스포에놀피루베이트 (PEP) 및 피루베이트 키나제 (PK)와 락틱 디히드로게나제 (LDH)를 갖는 시스템을 사용하는 NADH의 산화와 커플링시켰다. NADH의 산화는 벡크만 (Beckman) DU 650 분광광도계를 사용하여, 340 nm에서 흡광도 (e340 = 6.22 cm-1 mM-1)의 감소를 관찰함으로써 모니터링했다. 인산화된 VEGF-R2Δ50 (하기 표 1a 및 1b에서는 FLVK-P로 표시함)에 대한 검정 조건은 다음과 같았다: 1 mM PEP; 250 μM NADH; 50 유닛의 LDH/mL; 20 유닛의 PK/mL; 5 mM DTT; 5.1 mM 폴리(E4Y1); 1 mM ATP; 및 200 mM HEPES (pH 7.5) 중의 25 mM MgCl2. 비인산화된 VEGF-R2Δ50 (하기 표 1a 및 1b에서는 FLVK로 나타냄)에 대한 검정 조건은 다음과 같았다: 1 mM PEP; 250 μM NADH; 50 유닛의 LDH/mL; 20 유닛의 PK/mL; 5 mM DTT; 20 mM 폴리(E4Y1); 3 mM ATP; 및 200 mM HEPES (pH 7.5) 중의 60 mM MgCl2 및 2 mM MnCl2. 5 내지 40 nM의 효소로 검정을 개시했다. 다양한 농도의 시험 화합물의 존재하에 효소 활성을 측정함으로써 Ki 수치를 측정했다. 엔자임 키네틱 (Enzyme Kinetic) 및 칼레이다그래프 (Kaleidagraph) 소프트웨어를 사용하여 데이터를 분석했다.
ELISA 검정법
기질로서 비오틴화된 가스트린 펩티드 (1-17)를 사용하여, 포스포가스트린의 형성을 모니터링했다. 비오틴화된 포스포가스트린을 스트렙트아비딘 코팅된 96-웰 미세역가 플레이트를 사용하여 고정화시킨 다음, 홍당무 퍼옥시다제에 컨쥬게이션된 항-포스포티로신-항체를 사용하여 검출했다. 홍당무 퍼옥시다제의 활성은 2,2'-아지노-디-[3-에틸벤자티아졸린 술포네이트(6)] 이암모늄염 (ABTS)을 사용하여 모니터링했다. 통상적인 검정 용액은 2 μM의 비오틴화된 가스트린 펩티드; 5 mM DTT; 20 μM ATP; 26 mM MgCl2; 및 200 mM HEPES (pH 7.5) 중의 2 mM MnCl2를 포함했다. 0.8 nM의 인산화된 VEGF-R2Δ50으로 검정을 개시했다. 홍당무 퍼옥시다제 활성은 ABTS, 10 mM을 사용하여 평가했다. 산 (H2S04)을 첨가하여 홍당무 퍼옥시다제 반응을 정지시킨 후, 405 nm에서 흡광도를 판독했다. Ki 수치는 다양한 농도의 시험 화합물의 존재하에 효소 활성을 측정하여 결정했다. 엔자임 키네틱 및 칼레이다그래프 소프트웨어를 사용하여 데이터를 분석했다.
FGF -R 검정법
농도를 다음과 같이 변화시킨 것을 제외하고는, VEGF-R2에 대해 상기 기술한 바와 같이 분광광도 검정법을 수행했다: FGF-R = 50 nM, ATP = 2 mM, 및 폴리(E4Y1)= 15 mM.
LCK 검정법
농도를 다음과 같이 변화시킨 것을 제외하고는, VEGF-R2에 대해 상기 기술한 바와 같이 분광광도 검정법을 수행했다: LCK = 60 nM, MgCl2 = 0 mM, 폴리(E4Y1) = 20 mM.
CHK1 검정법
합성 기질 펩티드 신타이드-2 (Syntide-2; PLARTLSVAGLPGKK)로의 인산기 전달을 수반하는 ATP로부터의 ADP 생성을, 피루베이트 키나제 (PK) 및 락틱 디히드로게나제 (LDH)의 작용을 통해 포스포에놀피루베이트 (PEP)를 사용하는 NADH의 산화에 커플링시켰다. NADH의 산화는 HP8452 분광광도계를 사용하여, 340 nm에서의 흡광도 (e340 = 6.22 cm-1 mM-1)의 감소를 관찰함으로써 모니터링했다. 통상적인 반응 용액은 4 mN PEP; 0.15 mM NADH; 28 유닛의 LDH/mL; 16 유닛의 PK/mL; 3 mM DTT; 0.125 mM 신타이드-2; 0.15 mM ATP; 50 mM TRIS (pH 7.5) 중의 25 mM MgCl2; 및 400 mM NaCl을 포함했다. 10 nM의 FL-CHK1으로 검정을 개시했다. 다양한 농도의 시험 화합물의 존재하에 초기 효소 활성을 측정하여 Ki 수치를 결정했다. 엔자임 키네틱 및 칼레이다그래프 소프트웨어를 사용하여 데이터를 분석했다.
CDK2 /사이클린 A 및 CDK4 /사이클린 D 검정법
[32P]ATP로부터 망막 모세포종 단백질 재조합 단편으로의 방사성 인산기의 효소-촉매된 시간-의존적 도입을 정량함으로써, 사이클린-의존성 키나제 활성을 측정했다. 다르게 나타내지 않으면, 10 mM의 HEPES (N-[2-히드록시에틸]피페라진-N'-[2-에탄술폰산])(pH 7.4), 10 mM의 MgCl2, 25 μM의 아데노신 트리포스페이트 (ATP), 1 mg/mL의 오브알부민, 5 μg/mL의 루펩틴, 1 mM의 디티오트레이톨, 10 mM의 β-글리세로포스페이트, 0.1 mM의 바나듐산나트륨, 1 mM의 불화나트륨, 2.5 mM의 에틸렌 글리콜-비스(β-아미노에틸 에테르)-N,N,N'N'-테트라아세트산 (EGTA), 2% (v/v) 디메틸술폭시드, 및 0.03 - 0.2 μCi의 [32P]ATP의 존재하에, 총 부피 50 μL의 96-웰 플레이트에서 검정을 수행했다. 기질 (0.3-0.5 ㎍)은 정제된 재조합 망막 모세포종 단백질 단편 (Rb)이었다 (천연 망막 모세포종 단백질의 잔기 386-928; 62.3 kDa, 천연의 106-kDa 단백질에서 발견되는 대부분의 인산화 부위, 뿐만 아니라 정제를 용이하게 하기 위한 6개 히스티딘 잔기의 태그를 포함). CDK2 (150 nM CDK2/사이클린 A 복합체) 또는 CDK4 (50 nM CDK4/사이클린 D3 복합체)로 반응을 개시했고, 30℃에서 항온처리하여 20분 후에 에틸렌디아민테트라아세트산 (EDTA)을 250 mM까지 첨가하여 종결시켰다. 그 다음, 96-웰 여과 매니폴드로 니트로셀룰로스 막 상에 인산화된 기질을 포획시키고, 혼입되지 않은 방사성 물질을 0.85%의 인산으로 반복 세척하여 제거했다. 건조시킨 니트로셀룰로스 막을 포스포이미저에 노출시켜 방사능을 정량화했다. 상이한 농도의 화합물의 존재하에 효소 활성을 검정하고, 효소의 부재하에 측정한 배경 방사능을 감산함으로써, 겉보기 Ki 수치를 측정했다. 초기 속도의 ATP 농도에 대한 의존성을 측정함으로써, 통상의 검정 조건하에서 효소 각각에 대해 동역학적 매개변수 (kcat, ATP에 대한 Km)를 측정했다. 데이터를 칼레이다그래프 (시너지 소프트웨어)를 사용하여 경쟁적 저해에 대한 방정식에 근사화하거나, 키네틱 (KineTic, 바이오킨 리미티드 (BioKin, Ltd.)) 소프트웨어를 사용하여 경쟁적인 강한-결합 저해에 대한 방정식에 근사화했다. CDK4 및 CDK2에 대한 공지된 저해제의 측정된 Ki 수치는 알려진 IC50 수치와 일치했다. 전체 길이 사이클린 D3에 복합체화되든 절단된 사이클린 D3 구조물에 복합체화되든 CDK4의 특이적 활성은 동일했고, 또한 두 복합체 모두 선택된 저해제에 대해 매우 유사한 Ki 수치를 나타냈다.
FAK 검정법
FAK HTS에서는 LJL 바이오시스템즈에 의해 제공되는 형광 편극 검정법을 사용했다. 키나제 반응물은 100 mM의 HEPES pH 7.5, 10 mM MgCl2, 1 mM DTT, 1 mM ATP, 및 1 mg/ml의 폴리 Glu-Tyr (4:1)을 포함했다. 5 nM의 FAKcd409를 첨가하여 반응을 개시했다. EDTA를 첨가한 후 형광-표지된 펩티드 및 항-포스포티로신 항체 (모두 LJL 바이오시스템즈에 의해 제공)를 첨가하여 반응을 종결시켰다. 저해 결과는 아날리스트 (LJL) 검출기 상에서 판독했다.
TIE-2 분광광도 검정법
랜덤(randum) 공중합체 폴리(Glu4Tyr)로의 인산기 전달을 수반하는 ATP로부터의 ADP의 키나제-촉매된 생산을 피루베이트 키나제 (PK) 및 락테이트 디히드로게나제 (LDH)의 활성을 통한 NADH의 산화에 커플링시켰다. NADH에서 NAD+로의 전환은 벡크만 DU650 분광광도계를 사용하여 340 nm에서 흡광도 (ε = 6.22 cm-1 mM-1)의 감소로써 모니터링했다. 통상적인 반응 용액은 100 mM HEPES (pH 7.5) 중의 1 mM 포스포에놀피루베이트, 0.24 mM NADH, 40 mM MgCl2, 5 mM DTT, 2.9 mg/mL 폴리(Glu4Tyr), 0.5 mM ATP, 15 유닛/mL의 PK, 15 유닛/mL의 LDH를 포함한다. 4 내지 12 nM의 인산화된 Tie-2 (aa 775-1122)를 첨가하여 검정을 개시했다. 1 μM 수준의 저해제에서 저해율을 3중으로 측정했다.
TIE-2 DELFIA 검정법
기질로서 비오틴화된 p34cdc2(aa 6-20 = KVEKIGEGTYGVVYK) 펩티드를 사용하여 포스포티로신의 형성을 모니터링했다. 비오틴화된 펩티드를 뉴트르아비딘™ (NeutrAvidin™) 코팅된 96-웰 미세역가 플레이트를 사용하여 고정화한 다음, 유로피움 N1 킬레이트에 컨쥬게이션된 항-포스포티로신-항체 (PY20)로 검출했다. 통상적인 검정 용액은 1 μM의 비오틴화된 p34cdc2 펩티드, 150 μM ATP, 5 mM MgCl2, 1 mM DTT, 0.01% BSA, 5% 글리세롤, 2% DMSO, 25 mM HEPES (pH 7.5)를 포함했다. 뉴트르아비딘 플레이트에서 50 nM의 TIE2 세포내 도메인으로 검정을 개시했다. 50 mM의 EDTA로 키나제 반응을 종결시켰다. 그 다음, 플레이트를 세척하고 유로피움 항체를 첨가했다. 항온처리 후 재세척하고, 델피아™ (DELFIA™) 증강 용액을 첨가했다. 표준 유로피움 시간-분해된 세팅 (ex 340 nm, em 615 nm, 지연 400 μ초, 윈도우 400 μ초)에서 플레이트를 판독했다. DMSO 중의 화합물보다 DMSO를 첨가한 플레이트내 웰을 기준으로 저해율 %를 계산했고, 효소 첨가 전에 EDTA를 첨가한 플레이트내 웰을 기준으로 실험군 및 대조군 모두로부터 배경값을 감산했다.
HUVEC 증식 검정법
이 검정법은 시험 화합물이 인간 제대 정맥 내피세포 ("HUVEC")의 성장 인자-자극된 증식을 저해하는 능력을 측정한다. HUVEC 세포 (계대 3-4, 클로네틱스 코포레이션 (Clonetics, Corp.))를 T75 플라스크 중의 EGM2 배양 배지 (클로네틱스 코포레이션)에서 녹였다. 24시간 후에 신선한 EGM2 배지를 플라스크에 첨가했다. 4 또는 5일 후, 세포를 다른 배양 배지 (10% 소 태아 혈청 (FBS), 60 ㎍/mL의 내피세포 성장 보충제 (ECGS), 및 0.1 mg/mL의 헤파린을 보충한 F12K 배지)에 노출시켰다. 기하급수적으로 성장하는 HUVEC 세포를 이후 실험에 사용했다. 1만 내지 1만 2천개의 HUVEC 세포를 96-웰 접시의 100 ㎕의 풍부한 배양 배지 (상기 기술됨)에 평판배양했다. 이 배지에서 24시간 동안 세포가 접착되도록 하였다. 그리고, 배지를 흡인하여 제거하고 105 ㎕의 기아 배지 (F12K + 1% FBS)를 각 웰에 첨가했다. 24시간 후, 기아 배지 중의 1% DMSO에 용해된 15 ㎕의 시험 약물, 또는 이 비히클만을 각 처리 웰에 첨가했고, 최종 DMSO 농도는 0.1%였다. 1시간 후, 기아 배지 중의 30 ㎕의 VEGF (30 ng/mL)를 미처리 대조군을 포함하는 웰을 제외하고 모든 웰에 첨가했으며, 최종 VEGF 농도는 6 ng/mL였다. 72시간 후 MTT 염료 환원으로 세포 증식을 정량화하고, 그 시간에 세포를 4시간 동안 MTT (프로메가 코포레이션(Promega Corp.))에 노출시켰다. 정지 용액 (프로메가 코포레이션)을 첨가하여 염료 환원을 정지시키고, 96-웰 분광광도계 플레이트 판독기 상에서 595 λ에서의 흡광도를 측정했다.
IC50 수치는 다양한 농도의 시험 약물(전형적으로는, 0.5 로그 간격의 7가지의 농도를 사용했고, 각 농도에서 3중 웰을 사용했다)에 대한 A595의 반응을 곡선-근사화하여 계산했다. 화합물 라이브러리 플레이트를 스크리닝하기 위해 1 또는 2개의 농도 (농도 당 1개의 웰)를 사용했고, 저해율 %는 다음의 식으로 계산했다:
저해율 % = (대조군 - 시험군)÷(대조군 - 기아)
여기서,
대조군 = VEGF가 시험 약물 없이 존재하는 경우의 A595
시험군 = VEGF가 시험 약물과 함께 존재하는 경우의 A595
기아 = VEGF 및 시험 약물이 모두 없는 경우의 A595.
마우스 PK 검정법
다음과 같은 실험을 사용하여, 마우스에서 약물의 약동학 (예를 들어, 흡수 및 제거)을 분석했다. 시험 화합물을 30:70 (PEG 400:산성화한 H2O) 비히클 중의 용액 또는 현탁액으로서, 또는 0.5% CMC 중의 현탁액으로서 제제화했다. 이를 다양한 용량으로 2개의 다른 그룹 (n=4)의 B6 암컷 마우스에게 경구적으로 (p.o.) 그리고 복강내로 (i.p.) 투여했다. 0시간(h) (투여전), 투여 후 0.5 h, 1.0 h, 2.0 h 및 4.0 h, 그리고 7.0 h의 시점에서 혈액 샘플을 안와 출혈로 수집했다. 2500 rpm에서 5분 동안 원심분리하여, 각 샘플로부터 혈장을 수득했다. 유기 단백질 침전법으로 혈장으로부터 시험 화합물을 추출했다. 각 출혈 시간마다 50 ㎕의 혈장을 1.0 mL의 아세토니트릴과 합하고, 2분 동안 볼텍싱한 다음 4000 rpm에서 15분 동안 회전시켜, 단백질을 침전시키고 시험 화합물을 추출해냈다. 그 다음, 아세토니트릴 상청액 (시험 화합물을 함유하는 추출물)을 새로운 시험관에 붓고, N2 기체 스트림하에 뜨거운 플레이트 (25℃) 상에서 증발시켰다. 건조시킨 시험 화합물 추출물을 포함하는 각 시험관에, 125 ㎕의 이동상 (60:40, 0.025 M의 NH4H2PO4 + 2.5 mL/L TEA:아세토니트릴)을 첨가했다. 시험 화합물을 볼텍싱하여 이동상에 재현탁시키고, 4000 rpm에서 5분 동안 원심분리하여 단백질을 더 제거했다. 시험 화합물을 UV 검출로 휴렛 팩커드 1100 시리즈 HPLC 상에서 분석하기 위해, 각 샘플을 HPLC 바이알에 부었다. 각 샘플로부터 95 ㎕를 페노메넥스-프로디지 역상 C-18, 150 x 3.2 mm 칼럼 상에 주입하고, 45-50%의 아세토니트릴 구배로 10분에 걸쳐 용리했다. 상기 기술한 방식으로 혈장 샘플로부터 추출한 공지된 농도의 시험 화합물을 사용하여, 표준 곡선 (피크 영역 대 농도 ㎍/mL)과 비교함으로써 시험-화합물 혈장 농도 (㎍/mL)를 결정했다. 표준 및 미지 물질과 함께, 3개의 품질 관리 그룹 (n=4) (0.25 ㎍/mL, 1.5 ㎍/mL 및 7.5 ㎍/mL)에 대한 실험도 실시하여 분석의 일관성을 확실하게 했다. 표준 곡선은 R2 > 0.99이었고, 품질 관리 대조군은 모두 예상 수치의 10% 이내였다. 정량화한 시험 샘플을 칼레이다그래프 소프트웨어로 시각적 디스플레이에 플롯팅하고, 윈 논린 (WIN NONLIN) 소프트웨어로 그의 약동학적 매개변수를 측정했다. 실시예 1(a)는 다음과 같은 결과를 나타냈다: 0.69 (마우스 pK, AUC, ip, ㎍-h/ml); 0.33 (마우스 pK, AUC, po, ㎍-h/ml).
PAE - KDR 세포 검정법에서 KDR ( VEGFR2 ) 인산화
이 검정법은 시험 화합물이 돼지 대동맥 내피 (PAE)-KDR 세포에서 KDR의 자가인산화를 저해하는 능력을 측정한다. 인간 KDR을 과다발현하는 PAE 세포를 본 검정법에 사용했다. 10% 소 태아 혈청 (FBS) 및 400 ㎍/mL의 G418을 보충한 햄스 (Ham's) F12 배지에서 세포를 배양했다. 75 ㎕의 성장 배지를 넣은 96-웰 플레이트의 각 웰에 3만 개의 세포를 접종하고, 37℃에서 6시간 동안 접착되도록 하였다. 그 다음, 세포를 기아 배지 (0.1% FBS를 보충한 햄스 F12 배지)에 16시간 동안 노출시켰다. 기아 기간이 종료한 후, 기아 배지 중의 5% DMSO 중의 10 ㎕의 시험 약물을 시험 웰에 첨가하고, 10 ㎕의 비히클 (기아 배지 중의 5% DMSO)을 대조군 웰에 첨가했다. 각 웰의 최종 DMSO 농도는 0.5%였다. 플레이트를 37℃에서 1시간 동안 항온처리한 다음, 세포를 8분 동안 2 mM의 Na3VO4의 존재하에 500 ng/ml의 VEGF (R & D 시스템에서 시판함)로 자극했다. 세포를 HBSS 중의 1 mm Na3VO4로 1회 세척하고, 웰 당 50 ㎕의 용해 완충액을 첨가하여 용해시켰다. 100 ㎕의 희석 완충액을 각 웰에 첨가한 다음, 희석된 세포 용해물을 토끼 항 인간 항-flk-1 C-20 항체 (산타크루즈(Santa Cruz)에서 시판)로 미리 코팅된 96-웰 염소 항-토끼 코팅된 플레이트 (피어스(Pierce)에서 시판)로 옮겼다. 플레이트를 실온에서 2시간 동안 항온처리하고, PBS 중의 1% 트윈 20으로 7회 세척했다. HRP-PY20 (산타크루즈에서 시판)을 희석하고, 플레이트에 첨가하여 30-분 항온처리했다. 그 다음, 플레이트를 재세척하고 TMB 퍼옥시다제 기질 (커크가드 & 페리(Kirkegaard & Perry)에서 시판)을 첨가하여 10-분 항온처리했다. 0.09 N의 H2SO4 100 ㎕를 96-웰 플레이트의 각 웰에 첨가하여 반응을 정지시켰다. 450 nm에서의 분광광도계 판독값으로 인산화 상태를 평가했다. 4개-매개변수 분석으로 곡선 근사화하여 IC50 수치를 계산했다.
PAE - PDGFR β 세포 검정법에서 PAE - PDGFR β 인산화
이 검정법은 시험 화합물이 돼지 대동맥 내피 (PAE)-PDGFRβ 세포에서 PDGFRβ의 자가인산화를 저해하는 능력을 측정한다. 인간 PDGFRβ를 과다발현하는 PAE 세포를 본 검정법에 사용했다. 10%의 소 태아 혈청 (FBS) 및 400 ㎍/mL의 G418을 보충한 햄스 F12 배지에서 세포를 배양했다. 50 ㎕의 성장 배지를 넣은 96-웰 플레이트의 각 웰에 2만 개의 세포를 접종하고, 37℃에서 6시간 동안 접착되도록 하였다. 그 다음, 세포를 기아 배지 (0.1% FBS를 보충한 햄스 F12 배지)에 16시간 동안 노출시켰다. 기아 기간이 종료한 후, 기아 배지 중의 5% DMSO 중의 10 ㎕의 시험 약물을 시험 웰에 첨가하고, 10 ㎕의 비히클 (기아 배지 중의 5% DMSO)을 대조군 웰에 첨가했다. 각 웰의 최종 DMSO 농도는 0.5%였다. 플레이트를 37℃에서 1시간 동안 항온처리한 다음, 세포를 8분 동안 2 mM의 Na3VO4의 존재하에 1 ㎍/ml의 PDGF-BB (R & D 시스템)로 자극했다. 세포를 HBSS 중의 1 mm Na3VO4로 1회 세척하고, 웰 당 50 ㎕의 용해 완충액을 첨가하여 용해시켰다. 100 ㎕의 희석 완충액을 각 웰에 첨가한 다음, 희석된 세포 용해물을 토끼 항 인간 PDGFRβ 항체 (산타크루즈)로 미리 코팅된 96-웰 염소 항-토끼 코팅된 플레이트 (피어스)로 옮겼다. 플레이트를 실온에서 2시간 동안 항온처리하고, PBS 중의 1% 트윈 20으로 7회 세척했다. HRP-PY20 (산타크루즈)을 희석하고, 플레이트에 첨가하여 30-분 항온처리했다. 그 다음, 플레이트를 재세척하고 TMB 퍼옥시다제 기질 (커크가드 & 페리)을 첨가하여 10-분 항온처리했다. 0.09 N의 H2SO4 100 ㎕를 96-웰 플레이트의 각 웰에 첨가하여 반응을 정지시켰다. 450 nm에서의 분광광도계 판독값으로 인산화 상태를 평가했다. 4개-매개변수 분석으로 곡선 근사화하여 IC50 수치를 계산했다.
인간 간 마이크로좀 ( HLM ) 검정법
인간 간 마이크로좀에서의 화합물 대사는, 다음과 같은 LC-MS 분석 검정 방법으로 측정했다. 먼저, 인간 간 마이크로좀 (HLM)을 해동하고 차가운 100 mM의 인산칼륨 (KPO4) 완충액으로 5 mg/mL로 희석했다. 적절한 양의 KPO4 완충액, NADPH-재생성 용액 (B-NADP, 글루코스-6-포스페이트, 글루코스-6-포스페이트 디히드로게나제, 및 MgCl2를 함유), 및 HLM을 37℃에서 10분 동안 13 x 100 mm 유리 시험관에서 미리 항온처리했다 (시험 화합물 당 3개의 시험관-3중 실험). 시험 화합물 (최종 5 μM)을 각 시험관에 첨가하여 반응을 개시하고 부드럽게 볼텍싱한 다음, 37℃에서 항온처리했다. t=0, 2 h에서 250-μL의 샘플을 각 항온처리 시험관으로부터 취하여 0.05 μM의 레세르핀과 1 mL의 빙냉 아세토니트릴을 함유하는 12 x 75 mm 유리 시험관에 분주했다. 샘플을 4000 rpm에서 20분 동안 원심분리하여 단백질 및 염을 침전시켰다 (벡크만 알레그라 6KR, S/N ALK98D06, #634). 상청액을 새로운 12 x 75 mm 유리 시험관으로 옮기고, 스피드-백 원심분리 진공 증발기로 증발시켰다. 샘플을 0.1%의 포름산/아세토니트릴 (90/10) 200 ㎕에 다시 용해시키고, 강하게 볼텍싱하여 용해시켰다. 그 다음, 샘플을 별도의 폴리프로필렌 미세원심분리관으로 옮기고, 14000 x g에서 10분 동안 원심분리했다 (피셔 마이크로(Fisher Micro) 14, S/N M0017580). 각 시점 (0 및 2 h)에서 각각의 반복실험 (#1-3)에 대해, 각 시험 화합물의 분취 샘플을 LC-MS 분석을 위해 단일 HPLC 바이알 삽입체 (총 6개 샘플)에서 합했고, 이를 아래에 기술한다.
합한 화합물 샘플을 휴렛-팩커드 HP1100 다이오드 어레이 HPLC, 및 양전자 스프레이 SIR 방식 (각 시험 화합물의 분자 이온을 특이적으로 스캐닝하도록 프로그래밍됨)으로 작동하는 마이크로매스 쿼트로 II 트리플 쿼드러플 (Micromass Quattro II triple quadruple) 질량 분광계로 구성된 LC-MS 시스템에 주입했다. 각 시험 화합물 피크를 각 시점에서 통합했다. 각 화합물에 대해, 각 시점에서의 피크 면적 (n=3)을 평균하고, 2 h에서의 상기 평균 피크 면적을 0시간에서의 평균 피크 면적으로 나누어, 2 h에 잔류하는 시험 화합물의 퍼센트를 얻었다.
다양한 검정법을 사용한 화합물의 시험 결과를 하기 표 1a 및 1b에 요약했고, 여기서 다르게 나타내지 않으면 "%@"라는 표시는 기재된 농도에서의 저해율 %를 나타내고, "*" 수치는 *에 대해 1 μM 또는 **에 대해 50 nM의 화합물 농도에서의 Ki (nM) 또는 저해율 %를 나타낸다. "NT"는 현저한 저해가 없었거나 시험하지 않았음을 나타낸다.
신생 래트에서 망막 혈관 발달의 생체내 검정법
래트에서 망막 혈관의 발달은 생후 1일 내지 생후 14일 (P1-P14)에 일어난다. 이 과정은 VEGF의 활성에 의해 좌우된다 (J. Stone, 등, J. Neurosci ., 15, 4738 (1995)). 과거 연구에 의하면, VEGF도 조기 혈관 발달 동안 망막 혈관에 대해 생존 인자로 작용하는 것으로 밝혀졌다 (Alon, 등, Nat. Med ., 1, 1024 (1995)). 특정 화합물이 VEGF의 생체내 활성을 저해하는 능력을 평가하기 위해, 화합물을 적절한 비히클 (일반적으로 50%의 폴리에틸렌 글리콜, 평균 분자량 400 달톤, 및 탈이온수 중의 300 mM 수크로스의 50% 용액)에 제제화했다. 통상적으로, 2 ㎕의 약물 용액을 생후 8일 또는 9일인 래트 새끼의 안구 중앙 유리체 (midvitreous) 내에 주사했다. 유리체내에 주사한지 6일 후, 동물을 희생시키고 망막을 남은 안구 조직으로부터 박리시켰다. 그리고, 단리된 망막에 내피세포를 특이적으로 염색하는 조직화학적 염색 프로토콜 (Lutty 및 McLeod, Arch. Ophthalmol., 110, 267 (1992))을 실시하여, 조직 샘플 내에서의 혈관형성 정도를 규명했다. 그리고, 각각의 망막을 유리 슬라이드 상에 편평하게 놓고, 혈관형성 정도를 측정하기 위해 검사했다. 효과적인 화합물은 망막 맥관의 추가적인 발달을 저해하고 망막 내의 가장 큰 혈관을 제외하고는 혈관의 퇴행을 유도했다. 혈관 퇴행의 양을 사용하여, 생체내 투여 후 화합물의 상대적인 효능을 평가했다. 혈관 퇴행은 1 내지 3 플러스의 주관적 스케일로 등급을 매겼는데, 1 플러스는 약 25% 이하로 판단되는 검출가능한 퇴행이고, 2 플러스는 약 25-75% 퇴행으로 판단되며, 3 플러스는 망막에 거의 전체적인 퇴행 (약 75% 이상)을 야기하는 것이다.
퇴행을 보다 정량적으로 분석하기 위해, ADPase-염색된 편평하게 놓은 망막의 영상을 해부 현미경에 부착된 디지털 카메라로 캡쳐했다. 그리고, 망막 영상을 영상 분석 소프트웨어 (이미지 프로 플러스 4.0, 미디어 사이버네틱스(Media Cybernetics), 미국 메릴랜드주 실버 스프링) 내에 입력했다. 소프트웨어를 사용하여 염색된 혈관이 포함된 망막 영역의 백분율을 결정했다. 실험 안구에 대한 이 수치를, 비히클을 주사한 같은 동물의 반대쪽 안구에 대해 측정된 수치와 비교했다. 그 다음, 비히클을 주사한 안구에 비해 화합물을 투여한 안구에서 관찰된 혈관 영역의 감소를, 그 샘플에 대한 "퇴행율 %"로 표현했다. 퇴행율 %를 5-8마리의 동물 군에 대해 평균했다.
현미경을 통해 관찰시 거의 전체적인 퇴행으로 나타난 샘플에서는, 65-70%의 퇴행율 % 수치가 일상적으로 측정되었다. 이는 망막의 접힌 부분 내에서의 염색제 침착으로 인한 것이고, 접힘은 약물 주사시 사용된 비히클에 의해 유도되었다. 영상 분석 소프트웨어는 이러한 착색-함유 접힘을 혈관으로 해석했다. 이러한 접힘은 안구마다 다르기 때문에, 이를 보정하기 위한 시도는 하지 않았다. 따라서 보고된 퇴행율 % 수치가, 화합물의 순서는 정확하게 랭크하지만 그의 절대적인 효능은 과소 평가하는 보존적 측정으로 인한 것임을 주의해야 한다.
미숙아 망막병증의 신생 래트 모델에서 망막 혈관 발달의 생체내 검정법
VEGF 의존성 망막 혈관신생의 제2 모델을 사용하여, 상기 계열 화합물의 활성을 평가했다. 이 모델 (Penn 등, Invest. Ophthalmol . Vis . Sci ., 36, 2063 (1995))에서, 산소 농도를 조절하는 컴퓨터로 제어되는 방에 래트 새끼 (n=16)를 그 어미와 함께 넣었다. 동물을 24시간 동안 50% 산소 농도에 노출시킨 후, 10% 산소 농도에 24시간 노출시켰다. 이러한 산소 과잉 후 산소 부족이라는 교대되는 주기를 7회 반복한 후, 동물들을 실내 공기로 이동시켰다 (P14). 실내 공기로 이동시킬 때 화합물을 유리체내 주사로 투여하고, 6일 후 동물들을 희생시켰다 (P20). 그 다음, 단리된 망막을 분리하고 염색하여, 발달 모델에서 상기 상세히 기술한 바와 같이 분석했다. 또한, 발달 모델에 대해 기술한 바와 같이 효능을 등급으로 매겼다.
상기 기술한 예시적 화합물은 하기 일반 실시예에 따라 제약 조성물로 제제화될 수 있다.
실시예 1: 비경구 조성물
주사로 투여하기에 적합한 비경구 제약 조성물을 제조하기 위해, 화학식 I의 화합물의 수용성 염 100 mg을 DMSO에 용해시킨 다음, 0.9%의 무균 식염수 10 mL와 혼합했다. 혼합물을 주사로 투여하기에 적합한 투여량 단위 형태로 혼입했다.
실시예 2: 경구 조성물
경구로 전달하기 위한 제약 조성물을 제조하기 위해, 100 mg의 화학식 I의 화합물을 750 mg의 락토스와 혼합했다. 혼합물을 경구 투여에 적합한 경구 투여량 단위, 예를 들어 경질 젤라틴 캡슐 내로 혼입했다.
실시예 3: 안구내 조성물
안구내로 전달하기 위한 서방성 제약 조성물을 제조하기 위해, 화학식 I의 화합물을 인산염 완충액 (pH 7.4) 중의 히알루론산 (1.5% 농도)의 중성, 등장성 용액에 현탁하여 1% 현탁액을 형성하였다.
상기 설명은 사실상 예시적이고 설명하기 위한 것이며, 본 발명 및 그의 바람직한 실시태양을 예증하기 위한 것임을 이해해야 한다. 당업자들은 일상적인 실험을 통해 본 발명의 사상에 벗어남이 없이 명백하게 변형 및 변화가 가능함을 인식할 것이다. 따라서, 본 발명은 상기 설명으로 정의하고자 하는 것이 아니라, 이하의 청구 범위 및 그의 균등물로 정의하고자 하는 것이다.

Claims (15)

  1. 하기 화학식의 화합물들로 구성된 군에서 선택된 화합물, 제약학상 허용되는 전구약물, 제약학상 활성 대사산물 또는 제약학상 허용되는 염.
  2. 하기 화학식의 화합물, 또는 그의 제약학상 허용되는 전구약물, 제약학상 활성 대사산물 또는 제약학상 허용되는 염.
  3. 포유동물에서 노인성 황반변성을 치료하기 위해 치료적 유효량의 제1항 또는 제2항에 정의된 바와 같은 화합물, 제약학상 허용되는 전구약물, 제약학상 활성 대사산물 또는 제약학상 허용되는 염을 사용하는 방법.
  4. 포유동물에서 맥락막 혈관신생을 치료하기 위해 치료적 유효량의 제1항 또는 제2항에 정의된 바와 같은 화합물, 제약학상 허용되는 전구약물, 제약학상 활성 대사산물 또는 제약학상 허용되는 염을 사용하는 방법.
  5. 포유동물에서 망막병증을 치료하기 위해 치료적 유효량의 제1항 또는 제2항에 정의된 바와 같은 화합물, 제약학상 허용되는 전구약물, 제약학상 활성 대사산물 또는 제약학상 허용되는 염을 사용하는 방법.
  6. 제5항에 있어서, 망막병증이 당뇨성 망막병증, 유리체 망막병증 또는 미숙아 망막병증을 포함하는 것인 방법.
  7. 포유동물에서 망막염을 치료하기 위해 치료적 유효량의 제1항 또는 제2항에 정의된 바와 같은 화합물, 제약학상 허용되는 전구약물, 제약학상 활성 대사산물 또는 제약학상 허용되는 염을 사용하는 방법.
  8. 제7항에 있어서, 망막염이 사이토메갈로바이러스 망막염을 포함하는 것인 방법.
  9. 포유동물에서 황반부종을 치료하기 위해 치료적 유효량의 제1항 또는 제2항에 정의된 바와 같은 화합물, 제약학상 허용되는 전구약물, 제약학상 활성 대사산물 또는 제약학상 허용되는 염을 사용하는 방법.
  10. 포유동물에서 안과 질환을 치료하기 위해 치료적 유효량의 제1항 또는 제2항에 정의된 바와 같은 화합물, 제약학상 허용되는 전구약물, 제약학상 활성 대사산물 또는 제약학상 허용되는 염을 사용하는 방법.
  11. (a) 치료적 유효량의 제1항 또는 제2항의 화합물, 제약학상 허용되는 전구약물, 제약학상 활성 대사산물 또는 제약학상 허용되는 염; 및
    (b) 상기 화합물을 위한 제약학상 허용되는 담체, 희석제 또는 비히클
    을 포함하는 제약 조성물.
  12. 단백질 키나제 활성에 의해 매개된 포유동물 질환 상태를 치료하기 위해 치료적 유효량의 제1항 또는 제2항에 정의된 바와 같은 화합물, 제약학상 허용되는 전구약물, 제약학상 활성 대사산물 또는 제약학상 허용되는 염을 사용하는 방법.
  13. 제12항에 있어서, 포유동물 질환 상태가 종양 성장, 세포 증식 또는 혈관신생과 관련된 것인 방법.
  14. 단백질 키나제 수용체를 유효량의 제1항 또는 제2항에 정의된 바와 같은 화합물, 제약학상 허용되는 전구약물, 제약학상 활성 대사산물 또는 제약학상 허용되는 염과 접촉시킴을 포함하는, 단백질 키나제 수용체의 활성을 조절하는 방법.
  15. 제14항에 있어서, 단백질 키나제 수용체가 VEGF(혈관 내피세포 성장 인자) 수용체인 방법.
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