PT1585743E - Compostos de 2- (1h-indazol-6-ilamin)-benzamida como inibidores de proteína-cinases úteis para o tratamento de doenças aftálmicas. - Google Patents

Description

ΡΕ1585743 1 DESCRIÇÃO "COMPOSTOS DE 2-(1H-INDAZOL-6-ILAMINO)-BENZAMIDA COMO INIBIDORES DE PROTEÍNA-CINASES ÚTEIS PARA O TRATAMENTO DE DOENÇAS AFTÁLMICAS"

Referência Cruzada a Pedidos Relacionados

Este pedido reivindica o beneficio do Pedido de Patente Provisório dos E.U.A. N° 60/434 902, apresentado em 19 de Dezembro de 2002.

Campo da Invenção

Esta invenção diz respeito a compostos de inda-zole que medeiam e/ou inibem doenças oftálmicas e a actividade de certas proteína-cinases e a composições farmacêuticas contendo tais compostos. A invenção diz também respeito ao uso terapêutico ou profiláctico de tais compostos e composições, e diz respeito a métodos de tratamento de doenças oftálmicas e cancro bem como outros estados de doença associados com angiogénese e/ou proliferação celular não desejadas, pela administração de quantidades eficazes de tais compostos.

Antecedentes da Invenção Várias doenças e condições do segmento posterior 2 ΡΕ1585743 do olho pões em perigo a visão. A Degenerescência Macular Relacionada com a Idade (DMRI ou DMI), neovascularização coroidiana (NVC), retinopatias (e.g., retinopatia diabética, vitreorretinopatia, retinopatia de prematuridade), retinite (e.g., retinite por citomegalovirus (CMV), uveite, edema macular e glaucoma são exemplos vários. A Degenerescência Macular Relacionada com a Idade (DMRI ou DMI) é a causa conducente da cegueira na velhice. DMRI ataca o centro da visão e obscurece-a, tornando a leitura, condução e outras tarefas pormenorizadas difíceis ou impossíveis. Cerca de 200 000 novos casos de DMRI ocorrem cada ano apenas nos E.U.A. Estimativas correntes revelam que aproximadamente quarenta porcento da população com mais de 75 anos de idade, e aproximadamente vinte porcento da população com mais de 60 anos de idade, sofre de algum grau de degenerescência macular. A DMRI "húmida" é o tipo de DMRI que mais vezes causa a cegueira. Na DMRI húmida, vasos sanguíneos coroidais recentemente formados (neovascularização coroidiana (NVC)) vazam fluido e causam lesão progressiva da retina. No caso particular de NVC na DMRI, dois métodos principais de tratamento estão correntemente a ser desenvolvidos, (a) fotocoagulação e (b) o uso de inibidores de angiogénese.

Contudo, a fotocoagulação pode ser prejudicial para a retina e é impraticável quando a NVC está na proximidade da fóvea. Além disso, a fotocoagulação resulta muitas vezes em NVC recorrente ao longo do tempo. A 3 ΡΕ1585743 administração oral de compostos antiangiogénicos está também a ser testada como tratamento sistémico para DMRI: Contudo, devido a restrições metabólicas especificas do fármaco, a administração sistémica produz usualmente níveis de fármaco subterapêuticos para o olho. Por conseguinte, para alcançar concentrações de fármaco intra-oculares eficazes, são requeridas ou uma dose inaceitavelmente alta ou doses convencionais repetitivas. Vários implantes também têm sido desenvolvidos para entrega de compostos antiangiogénicos localmente ao olho. Exemplos de tais implantes são revelados na Pat. dos E.U.A. N° 5 824 072 de Wong, Pat. dos E.U.A. N° 5 476 511 de Gwon et al. e Pat. dos E.U.A. N° 5 773 019 de Ashton et al., cada uma das quais é aqui incorporada por referência nas suas globalidades para todos os propósitos.

Doenças Neovasculares do Olho

Conforme acima anotado, a presente invenção também proporciona métodos para o tratamento de doenças neovasculares do olho, incluindo, por exemplo, neovascula-rização corneai, glaucoma neovascular, retinopatia diabética proliferativa, fibroblasia retrolental e degenerescência macular.

Resumindo, a neovascularização corneai como resultado de lesão do segmento anterior é uma causa significativa de acuidade visual diminuída e cegueira, e um 4 ΡΕ1585743 factor de risco principal para a rejeição de enxertos da córnea. Conforme descrito por Burger et al., Lab. Invest., 48:169-180, 1983, aqui incorporado por referência na sua globalidade e propósitos, a angiogénese corneai envolve três fases: um periodo latente pré-vascular, neovascula-rização activa e maturação vascular e regressão. A identidade e mecanismo de vários factores angiogénicos, incluindo elementos da resposta inflamatória, tais como leucócitos, plaquetas, citocinas e icosanóides, ou constituintes do plasma não identificados, têm ainda sido revelados.

Correntemente, não existe terapia clinicamente satisfatória para a inibição da neovascularização corneai ou regressão de novos vasos corneais existentes. Os corticosteróides tópicos parecem ter alguma utilidade clinica, presumivelmente por limitarem a inflamação estro-mática. WO 01/002369 e WO 01/053268 descreve compostos indazole que inibem a actividade de certas proteina-cinases e, deste modo, inibem a proliferação celular indesejada. Tais compostos são descritos como sendo úteis para o tratamento do cancro e outros estados de doença associados com angiogénese e/ou proliferação celular indesejadas, tais como retinopatia diabética, glaucoma neovascular, artrite reumatóide e psoriase.

Deste modo, num aspecto da presente invenção são proporcionados métodos para o tratamento de doenças neovas- 5 ΡΕ1585743 culares do olho tais como neovascularização do enxerto corneai), compreendendo o passo de administração a um paciente de uma quantidade terapeuticamente eficaz de uma composição antiangiogénica (conforme acima descrito) à córnea, tal que a formação de vasos sanguíneos seja inibida. Resumindo, a córnea é um tecido que normalmente carece de vasos sanguíneos. Em certas condições patológicas, contudo, os capilares podem estender-se na córnea desde o plexo vascular pericorneal do limbo. Quando a córnea se torna vascularizada, torna-se também enevoada, resultando num declínio da acuidade visual do paciente. A perda visual pode tornar-se completa se a córnea ficar completamente opaca.

Os vasos sanguíneos podem entrar na córnea numa variedade de padrões e profundidades, dependendo do processo que inicia a neovascularização. Estes padrões têm sido tradicionalmente definidos pelos oftalmologistas nos seguintes tipos: pano tracomatoso, pano leproso, pano filctenuloso, pano degenerativo e pano glaucomatoso. 0 estroma corneai pode também ser invadido por ramos da artéria ciliar anterior (chamada vascularização intersticial) o que causa várias lesões clínicas distintas: ansas («loops») terminais, um padrão "tipo escova", uma forma de umbela, uma forma de rede, arcadas intersticiais (de vasos episclerais) e vasos irregulares aberrantes.

Uma larga variedade de desordens pode resultar em neovascularização corneai, incluindo por exemplo, infecções 6 ΡΕ1585743 corneais (e.g., tracoma, queratite de herpes simples, leishmaniose e oncocerciase), processos imunológicos (e.g., rejeição de enxerto e sindrome de Stevens-Johnson), queimaduras de álcalis, trauma, inflamação (de qualquer causa), estados de deficiência tóxicos e nutricionais e como complicação de desgaste de lentes de contacto.

Ainda que a causa de neovascularização corneai possa variar, a resposta da córnea ao insulto e subsequente crescimento para dentro é semelhante independentemente da causa. Resumindo, a localização da injúria parece ser de importância visto que apenas as lesões situadas no interior de uma distância critica do limbo incitarão uma resposta angiogénica. Isto é provavelmente devido ao facto de que os factores angiogénicos responsáveis pela eliciação da invasão vascular são criados no sítio da lesão e devem difundir para o sítio dos vasos sanguíneos mais próximos (o limbo) de maneira a exercer o seu efeito. Para lá de uma certa distância do limbo, isto não mais será possível e o endotélio límbico não será induzido a crescer para o interior da córnea. Vários factores angiogénicos estão provavelmente envolvidos neste processo, muitos dos quais são produtos da resposta inflamatória. Na verdade, a neovascularização da córnea parece apenas ocorrer em associação com um infiltrado celular inflamatório, e o grau de angiogénese é proporcional à extensão da reacção inflamatória. 0 edema corneai facilita ainda o crescimento para dentro do vaso sanguíneo por perda da estrutura estromática corneai e proporcionando um caminho de 7 ΡΕ1585743 "resistência mínima" através do qual os capilares podem crescer. A seguir à reacção inflamatória inicial, o crescimento capilar para o interior da córnea prossegue da mesma maneira que ocorre em outros tecidos. As células endoteliais normalmente quiescentes dos capilares e vénulas límbicos são estimuladas a dividirem-se e migrarem. As células endoteliais projectam-se para fora dos seus vasos de origem, digerem a membrana de base envolvente e o tecido através do qual elas viajarão, e migram na direcção da fonte do estímulo angiogénico. Os rebentos terminais encobertos adquirem um lume e em seguida ocorre anastomose para formarem ansas capilares. 0 resultado final é o estabelecimento de um plexo vascular no interior do estroma corneai.

Factores e composições antiangiogénicos da presente invenção são úteis para o bloqueio de efeitos estimulantes de promotores de angiogénese, reduzindo a divisão celular endotelial, diminuindo a migração celular endotelial e enfraquecendo a actividade das enzimas proteolíticas segregadas pelo endotélio.

Sumário da Invenção

De entre as formas de realização particularmente preferidas da invenção, um factor antiangiogénico pode ser preparado para administração tópica em salina (combinado ΡΕ1585743 com qualquer dos conservantes e aqentes antimicrobianos comummente usados em preparações oculares) e administrado em forma de gota para o olho. A solução ou suspensão do factor antiangiogénico pode ser preparada na sua forma pura e administrada várias vezes por dia. Alternativamente, as composições antiangiogénicas, preparadas conforme acima descrito, também podem ser administradas directamente à córnea.

De entre as formas de realização preferidas, a composição antiangiogénica é preparada com um polímero muco-adesivo que se liga à córnea. Dentro de outras formas de realização, os factores antiangiogénicos ou composições antiangiogénicas podem ser utilizados como um adjunto à terapia de esteróide convencional. A terapia tópica também pode ser útil profilacticamente em lesões da córnea que são conhecidas por terem uma alta probabilidade de induzir a resposta angiogénica (tal como queimaduras químicas). Nestes casos, o tratamento, provavelmente em combinação com esteróides, pode ser instituído imediatamente para ajudar a prevenir complicações subsequentes.

De entre outras formas de realização, as composições antiangiogénicas acima descritas podem ser injectadas directamente no estroma da córnea por um oftalmologista com auxílio de microscópio. 0 sítio preferido de injecção pode variar com a morfologia da lesão 9 ΡΕ1585743 individual, mas o alvo da administração será colocar a composição na frente de avanço da vasculatura (isto é, entremeada entre os vasos sanguíneos e a córnea normal). Na maioria dos casos isto envolverá injecção corneai perlímbica para "proteger" a córnea dos vasos sanguíneos que avançam. Este método também pode ser utilizado de modo curto após um insulto da córnea de maneira a prevenir profilacticamente a neovascularização corneai. Nesta situação, o material poderá ser injectado na córnea perlímbica entremeado entre a lesão da córnea e a sua fonte sanguínea límbica potencial não desejada. Tais métodos podem também ser utilizados de uma maneira semelhante para prevenir a invasão capilar de córneas transplantadas. Numa forma de libertação sustentada as injecções podem apenas ser requeridas 2-3 vezes por ano. Esteróides também podem ser adicionados à solução de injecção para reduzir a inflamação resultante da própria injecção.

Outro aspecto da presente invenção, é o composto indazole para utilização como medicamento para o tratamento de glaucoma neovascular, compreendendo o passo de administração a um paciente de uma quantidade terapeuticamente eficaz de uma composição antiangiogénica para o olho, tal que a formação de vasos sanguíneos seja inibida.

Resumindo, o glaucoma neovascular é uma condição patológica em que novos capilares se desenvolvem na íris do olho. A angiogénese origina-se usualmente a partir de vasos localizados na margem pupilar, e progressos através da raiz 10 ΡΕ1585743 da íris e para o interior da malha trabecular. Fibroblastos e outros elementos de tecido conjuntivo estão associados com o crescimento capilar e uma membrana fibrovascular desenvolve-se espalhando-se através da superfície anterior da íris. Eventualmente este tecido alcança o ângulo da câmara anterior onde forma sinequias. Estas sinequias por sua vez coalescem, cicatrizam e contraem-se para por fim fecharem o ângulo da câmara anterior. A formação de cicatriz previne a drenagem adequada do humor aquoso através do ângulo e para o interior da malha trabecular, resultando no aumento da pressão intra-ocular que pode resultar em cegueira. O glaucoma neovascular ocorre geralmente como uma complicação de doenças nas quais a isquemia retiniana é predominante. Em particular, cerca de um terço dos pacientes com esta desordem têm retinipatia diabética e 28% têm oclusão da veia retiniana central. Outras causas incluem deslocamento da retina crónico, glaucoma de fase final, doença obstrutiva da artéria carótida, fibroplasia retrolental, anemia drepanocitária, tumores intra-oculares e fistulas cavernosas da carótida. Nas suas fases precoces, o glaucoma neovascular pode ser diagnosticado por biomicroscopia de lâmpada de fenda de alta ampliação, onde revela pequenos, dilatados e desorganizados capilares (aos quais falta fluorescência) sobre a superfície da íris. Gonioscopia posterior demonstra obliteração progressiva do ângulo da câmara anterior por bandas fibrovasculares. Enquanto o ângulo da câmara anterior estiver ainda aberto, 11 ΡΕ1585743 as terapias conservativas podem ser de assistência. Contudo, uma vez fechado o ângulo, é requerida intervenção cirúrgica de maneira a aliviar a pressão.

Por conseguinte, numa forma de realização da invenção, factores antiangiogénicos (quer isolados quer numa composição antiangiogénica, conforme acima descrito) podem ser administrados topicamente ao olho de maneira a tratar formas precoces de glaucoma neovascular.

Noutras formas de realização da invenção, composições antiangiogénicas podem ser implantadas por injecção da composição no interior da região do ângulo da câmara anterior. Isto proporciona um aumento localizado sustentado de factor antiangiogénico e previne o crescimento do vaso sanguíneo para o interior da área. As composições antiangiogénicas implantadas ou injectadas que são colocadas entre os capilares avançados da íris e o ângulo da câmara anterior podem "defender" o ângulo aberto de neovascularização. Na medida em que os capilares não crescerão dentro de um raio significativo da composição antiangiogénica, a desobstrução do ângulo poderá ser mantida. Noutras formas de realização, a composição antiangiogénica também pode ser colocada em qualquer lugar tal que o factor antiangiogénico seja continuamente libertado para o interior do humor aquoso. Isto aumentará a concentração do factor antiangiogénico no interior do humor, o qual por sua vez banha a superfície da íris e seus capilares anormais, proporcionando por esse meio outro 12 ΡΕ1585743 mecanismo pelo qual entregar a medicação. Estas modalidades terapêuticas também podem ser úteis profilacticamente e em combinação com tratamentos existentes.

Num outro aspecto da presente invenção, é proporcionado um composto indazole para utilização como medicamento para o tratamento de retinopatia diabética proliferativa, compreendendo o passo de administração a um paciente de uma quantidade terapeuticamente eficaz de uma composição antiangiogénica aos olhos, tal que a formação de vasos sanguíneos seja inibida.

Resumindo, pensa-se que a patologia da retinopatia diabética seja semelhante à acima descrita para o glaucoma neovascular. Em particular, acredita-se que a retinopatia diabética de fundo se converte a retinopatia diabética proliferativa sob a influência de hipoxia retiniana. Geralmente, o tecido neovascular brota a partir do nervo óptico (usualmente dentro de 10 mm da margem) e a partir da superfície da retina em regiões onde a perfusão de tecido é pobre. Inicialmente, os capilares crescem entre a membrana limitante interna da retina e a superfície posterior do vítreo. Eventualmente, os vasos crescem no interior do vítreo e através da membrana limitante interna. À medida que contacta o vítreo, a tracção é aplicada aos vasos, resultando muitas vezes na partilha dos vasos e obscurecimento do vítreo devido a hemorragia. A tracção fibrosa a partir da cicatriz na retina pode também produzir deslocamento da retina. 13 ΡΕ1585743 A terapia convencional de escolha é a foto-coagulação pan-retiniana para diminuir o tecido retiniano e por esse meio diminuir a exigência retiniana de oxigénio. Ainda que inicialmente eficaz, existe uma alta taxa de recaídas com formação de novas lesões em outras partes da retina. Complicações desta terapia incluem uma diminuição na visão periférica de até 50% de pacientes, abrasões mecânicas da córnea, formação de catarata induzida por laser, glaucoma agudo e estimulação do crescimento neovascular sub-retiniano (o que pode resultar em perda de visão). Como resultado, este procedimento é realizado apenas quando vários factores de risco estão presentes e a razão benefício-risco é claramente a favor da intervenção.

Por conseguinte, dentro das formas de realização particularmente preferidas da invenção, a retinipatia diabética proliferativa pode ser tratada por injecção de um ou mais factores antiangiogénicos (ou composição angiogénica) no humor aquoso ou no vítreo, de maneira a aumentar a concentração local de factor antiangiogénico na retina. Preferivelmente, este tratamento deverá ser iniciado antes da aquisição de doença severa requerendo fotocoagulação. Noutras formas de realização da invenção, as artérias que alimentam as lesões neovasculares podem ser embolizadas (utilizando composições antiangiogénicas, conforme descrito acima).

Noutro aspecto da presente invenção, é propor- 14 ΡΕ1585743 cionado um composto indazole para utilização como medicamento para o tratamento de fibroblasia retrolental, compreendendo o passo de administração a um paciente de uma quantidade terapeuticamente eficaz de um factor antiangiogénico (ou composição antiangiogénica) ao olho, tal que a formação de vasos sanguíneos seja inibida.

Resumindo, a fibroblasia retrolental é uma condição que ocorre em crianças prematuras que recebem terapia de oxigénio. A vasculatura retiniana periférica, particularmente no lado temporal, não fica completamente formada até ao fim da vida fetal. Pensa-se serem importantes o oxigénio excessivo (mesmo níveis que serão psicológicos no termo) e a formação de radicais livres de oxigénio por causarem danos aos vasos sanguíneos da retina imatura. Estes vasos contraem-se e em seguida tornam-se estruturalmente obliterados na exposição a oxigénio. Como resultado, a retina periférica falha a vascularizar e segue-se isquemia retiniana. Em resposta à isquemia, a neovasculari-zação é induzida na junção da retina normal e isquémica.

Em 75% dos casos estes vasos regridem espontaneamente. Contudo, nos restantes 25% há crescimento capilar continuado, contracção do componente fibrovascular e tracção em ambos os vasos e retina. Isto resulta em hemorragia do vítreo e/ou deslocamento da retina que pode conduzir à cegueira. 0 glaucoma de fecho de ângulo neovas-cular é também uma complicação desta condição. 15 ΡΕ1585743

Como é muitas vezes impossível determinar que casos se resolverão espontaneamente e em quais progredirá a severidade, o tratamento convencional (isto é, cirurgia) é geralmente iniciado apenas em pacientes com doença estabelecida e uma patologia bem desenvolvida. Esta aproximação "esperar para ver" evita intervenção precoce e permite a progressão da doença nos 25% que seguem um decurso complicado. Por conseguinte, numa forma de realização da invenção, a administração tópica de factores antiangiogénicos (ou composições antiangiogénicas, conforme descrito acima) pode ser realizada em crianças que estão em alto risco de desenvolver esta condição numa tentativa de reduzir a incidência da progressão de fibroplasia retrolental. Em outras formas de realização, podem ser utilizadas injecções intravítreo e/ou implantes intra-oculares de uma composição antiangiogénica. Tais métodos são particularmente preferidos em casos de doença estabelecida, em ordem a reduzir a necessidade de cirurgia.

Proteínas-Cinases

Proteína-cinases são uma família de enzimas que catalisam a fosforilação do grupo hidroxilo de resíduos de tirosina, serina ou treonina em proteínas. Tipicamente, tal fosforilação perturba dramaticamente a função da proteína e deste modo as proteína-cinases são fundamentais na regulação de uma larga variedade de processos celulares, incluindo metabolismo, proliferação celular, diferenciação 16 ΡΕ1585743 celular e sobrevivência celular. Das muito diferentes funções celulares em que a actividade das proteína-cinases é conhecida como requerida, alguns processos representam alvos atractivos para intervenção terapêutica para certos estados de doença. Dois exemplos são angiogénese e controlo do ciclo celular, nos quais as proteina-cinases desempenham um papel central; estes processos são essenciais para o crescimento de tumores sólidos bem como para outras doenças. A angiogénese é o mecanismo pelo qual novos capilares são formados a partir de vasos existentes. Quando requerido, o sistema vascular tem o potencial de gerar novas redes de capilares de modo a manter o funcionamento próprio de tecidos e órgãos. No adulto, contudo, a angiogénese é razoavelmente limitada, ocorrendo apenas no processo de cura de ferimentos e neovascularização do endométrio durante a menstruação. Ver Merenmies et al., Cell Growth & Differentiation, 8, 3-10 (1997) . Por outro lado, a angiogénese não desejada é uma indicação legitima de várias doenças, tais como retinopatias, psoríase, artrite reumatóide, degenerescência macular relacionada com a idade (DMI) e cancro (tumores sólidos). Folkman, Nature Med., 1, 27-31 (1995). As proteína-cinases que tem sido mostrado estarem envolvidas no processo angiogénico incluem três membros da família da tirosina-cinase receptora do factor de crescimento: VEGF-R2 (receptor 2 do factor de crescimento endotelial vascular, também conhecido como KDR (receptor do domínio de inserção de cinase) e como FLK-1), 17 ΡΕ1585743 FGF-R (receptor do factor de crescimento de fibroblasto) e TEK (também conhecido como Tie-2). VEGF-R2, o qual é expresso apenas nas células endoteliais, liga-se ao factor de crescimento angiogénico potente VEGF e medeia a subsequente transdução de sinal através da activação da sua actividade de cinase intracelular. Assim, é esperado que a inibição directa da actividade de cinase do VEGF-R2 resultará na redução da angiogénese mesmo na presença de VEGF exógeno (ver Strawn et al., Câncer Research, 56, 2540-3545 (1996)), como foi mostrado com mutantes de VEGF-R2 que falharam na mediação da transdução de sinal. Millauer et al., Câncer Research, 56, 1615-1620 (1996) . Além disso, VEGF-R2 parece não ter função no adulto além da de mediação da actividade angiogénica de VEGF. Por conseguinte, será esperado que o inibidor selectivo da actividade de cinase do VEGF-R2 exiba pequena toxicidade.

De modo semelhante, FGF-R liga-se a factores de crescimento angiogénico aFGF e bFGF e medeia a subsequente transdução de sinal. Recentemente, foi sugerido que factores de crescimento tais como bFGF podem desempenhar um papel critico na indução da angiogénese em tumores sólidos que alcançaram um certo tamanho. Yoshiji et al., Câncer Research, 57, 3924-3928 (1997). Ao contrário do VEGF-2, contudo, o FGF-R é expresso em numerosos tipos de células diferentes em todo o corpo e pode ou não desempenhar papéis importantes noutros processos fisiológicos normais no 18 ΡΕ1585743 adulto. Não obstante, a administração sistémica de um inibidor de molécula pequena da actividade de cinase do FGF-R foi reportada a bloquear a angiogénese induzida por bFGF em ratos sem toxicidade aparente. Mohammad et al., EMBO Journal, 17, 5996-5904 (1998) . TEK (também conhecido por Tie-2) é uma outra tirosina-cinase receptora expressa apenas em células endo-teliais que se demonstrou desempenharem um papel na angiogénese. A ligação do factor angiopoietina-1 resulta em autofosforilação do dominio de cinase de TEK e resulta num processo de transdução de sinal que aparenta mediar a interacção de células endoteliais com células de suporte periendoteliais, facilitando desta maneira a maturação de vasos sanguíneos formados recentemente. O factor angiopoietina-2, por outro lado, parece antagonizar a acção da angiopoietina-1 sobre TEK e interrompe a angiogénese. Maisonpierre et al., Science, 277, 55-60 (1997).

Como resultado dos desenvolvimentos acima descritos, foi proposto tratar a angiogénese pelo uso de compostos que inibem a actividade de cinase de VEGF-R2, FGF-R e/ou TEK. Por exemplo, a Publicação Internacional WIPO N° 97/34876 revela certos derivados de cinolina que são inibidores de VEGF-R2, os quais podem ser usados para o tratamento de estados de doença associados com angiogénese anormal e/ou permeabilidade vascular aumentada tal como cancro, diabetes, psoríase, artrite reumatóide, sarcoma de Kaposi, hemangioma, nefropatias aguda e crónica, ateroma, 19 ΡΕ1585743 restenose arterial, doenças auto-imunes, inflamação aguda e doenças oculares com proliferação de vasos retinianos. A fosforilase-cinase activa a glicogénio--fosforilase, aumentando assim a desagregação do glicogénio e a libertação de glucose hepática. A produção de glucose hepática é desregulada na diabetes do tipo 2 e é a principal causa de hiperglicemia em jejum, a qual resulta em muitas das complicações secundárias que afligem estes pacientes. Deste modo, a redução da libertação de glucose do figado baixará os niveis de glucose no plasma elevados. Os inibidores da fosforilase-cinase diminuirão por conseguinte a actividade da fosforilase e a glicogenólise, reduzindo assim a hiperglicemia em pacientes.

Uma outra resposta fisiológica a VEGF é a permeabilidade vascular, a qual foi proposta como desempenhando um papel nas fases precoces da angiogénese. Em tecidos isquémicos, tais como os que ocorrem no cérebro de vitimas de acidente vascular cerebral, a hipoxia desencadeia a expressão de VEGF, conduzindo a permeabilidade vascular aumentada e por fim edema nos tecidos envolventes. Num modelo de ratazana para acidente vascular cerebral, foi mostrado por van Bruggen et al., J. Clinicai Invest., 104, 1613-20 (1999), que a administração de um anticorpo mono-clonal para VEGF reduz o volume do enfarte. Assim, os inibidores de VEGFR são antecipados como sendo úteis para o tratamento do acidente vascular cerebral. 20 ΡΕ1585743

Para além deste papel na angiogénese, as proteí-na-cinases também desempenham um papel crucial no controlo do ciclo celular. A proliferação celular incontrolada é o emblema do cancro. A proliferação celular em resposta a vários estímulos é manifestada por uma desregulação do ciclo da divisão celular, processo pelo qual as células se multiplicam e dividem. As células tumorais têm tipicamente danificado os genes que directamente ou indirectamente regulam a progressão através do ciclo da divisão celular.

As cinases dependentes de ciclina (CDKs) são proteína-cinases de serina-treonina que desempenham papéis críticos na regulação das transições entre diferentes fases do ciclo celular. Ver, e.g., os artigos compilados em Science, 274, 1643-1677 (1996) . Os complexos de CDK são formados através da associação de uma subunidade de ciclina reguladora (e.g., ciclina A, Bl, B2, Dl, D2, D3 e E) e uma subunidade de cinase catalítica (e.g., cdc2 (CDK1), CDK2, CDK4, CDK5 e CDK6) . Como o nome implica, as CDKs revelam uma dependência absoluta da subunidade de ciclina de maneira a fosforilar os seus substratos alvos e diferentes pares cinase/ciclina funcionam para regular a progressão através de fases específicas do ciclo celular. É a CDK4 complexada às ciclinas D que desempenha uma parte crítica na iniciação do ciclo de divisão celular de uma fase de repouso ou quiescente para uma na qual as células se submetem a divisão celular. Esta progressão está sujeita a uma variedade de mecanismos reguladores do 21 ΡΕ1585743 crescimento, não só negativos mas também positivos. Aberrações neste sistema de controlo, particularmente as que afectam a função de CDK4, têm sido implicadas na progressão de células para um estado altamente proliferativo caracteristico de malignidades, particularmente melanomas familiares, carcinomas esofágicos e cancros pancreáticos. Ver, e.g., Kamb, Trends in Genetics, 11, 136-140 (1995);

Kamb et al., Science, 264, 436-440 (1994).

Inumeráveis publicações descrevem uma variedade de compostos químicos úteis contra uma variedade de alvos terapêuticos. Por exemplo, as Publicações Internacionais WIPO Nos WO 99/23077 e WO 99/23076 descrevem compostos que contêm indazole tendo actividade inibidora de fosfodies-terase tipo IV produzidos por uma troca de bioisóstero indazole por catecol. A Patente dos E.U.A. N° 5 760 028 revela heterociclos incluindo ácido 3-[1-[3-(imidazolin-2-ilamino)propil]indazol-5-ilcarbonilamino]-2-(benziloxi-carbonilamino)propiónico, os quais são úteis como antagonistas da avp3-integrina e receptores de proteína adesiva a superfície celular relacionados. A Publicação Internacional WIPO N° 98/09961 revela certos derivados de indazole e seu uso como inibidores de fosfodiesterase (PDE) tipo IV ou a produção de factor de necrose tumoral (TNF) num mamífero. Recentes adições à biblioteca virtual de compostos conhecidos incluem os descritos como sendo agentes terapêuticos antiproliferativos que inibem CDKs. Por exemplo, a Patente dos E.U.A. N° 5 621 082 de Xiong et al. revela ácido nucleico que codifica um inibidor de CDK6, e a 22 ΡΕ1585743

Publicação da Patente Europeia N° 0 666 270 A2 descreve péptidos e miméticos de péptido que actuam como inibidores de CDK1 e CDK2. A Publicação Internacional WIPO N° 97/16447 revela certos análogos de cromonas que são inibidores de cinases dependentes de ciclina, em particular de complexos CDK/ciclina tais como CDK4/ciclina Dl, que podem ser usados para a inibição excessiva ou proliferação celular anormal, e por conseguinte para o tratamento de cancro. A Publicação Internacional WIPO N° 99/21845 descreve derivados de 4-aminotiazole que são úteis como inibidores de CDK.

Existe ainda uma necessidade, contudo, de compostos de molécula pequena que possam ser prontamente sintetizados e sejam eficazes na inibição de uma ou mais CDKs ou complexos CDK/ciclina. Porque a CDK4 pode servir como activador geral da divisão celular na maioria das células, e os complexos de CDK4 e ciclinas do tipo D governam a fase G1 precoce do ciclo celular, existe uma necessidade de inibidores eficazes de CDK4, e seus complexos de ciclina do tipo D, para o tratamento de um ou mais tipos de tumor. Do mesmo modo, os papéis centrais das cinases ciclina E/CDK2 e ciclina B/CDK1 na fase Gi/S e transições G2/M, respectiva-mente, oferecem alvos para a intervenção terapêutica na supressão da progressão do ciclo celular desregulado no cancro.

Uma outra proteína-cinase, CHKl, desempenha um importante papel como dispositivo de controlo («check-point») na progressão do ciclo celular. Os «checkpoints» 23 ΡΕ1585743 são sistemas de controlo que coordenam a progressão do ciclo celular influenciando a formação, activação e subsequente inactivação das cinases dependentes de ciclina. Os «checkpoints» previnem a progressão do ciclo celular em momentos oportunos, mantêm o equilíbrio metabólico de células enquanto a célula está presa e, em alguns casos, podem induzir apoptose (morte celular programada) quando os requisitos do «checkpoint» não foram verificados. Ver, e.g., 0'Connor, Câncer Surveys, 29, 151-182 (1997); Nurse, Cell, 91, 865-867 (1997); Hartwell et al., Science, 266, 1821-1828 (1994); Hartwell et al., Science, 246, 629-634 (1989).

Uma série de «checkpoints» monitoriza a integridade do genoma e, no dano do DNA de sentido, estes «checkpoints» de dano de DNA" bloqueiam a progressão do ciclo celular nas fases Gi e G2, e retardam a progressão ao longo da fase S. 0'Connor, Câncer Surveys, 29, 151-182 (1997); Hartwell et al., Science, 266, 1821-1828 (1994).

Esta acção capacita o DNA para reparar processos para completar as suas tarefas antes da replicação do genoma e ocorre a subsequente separação deste material genético em novas células filhas. De modo importante, o gene mais comummente mutado no cancro humano, o gene supressor de tumor p53, produz uma proteína «checkpoint» de dano de DNA que bloqueia a progressão ciclo celular na fase Gi e/ou induz apoptose (morte celular programada) a seguir ao dano do DNA. Hartwell et al., Science, 266, 1821-1828 (1994).

Tem sido mostrado que o supressor de tumor p53 fortalece a 24 ΡΕ1585743 acção de um «checkpoint» de dano no DNA na fase G2 do ciclo celular. Ver, e.g., Bunze et al., Sience, 28, 1497-1501 (1998); Winters et al., Oncogene, 17, 673-684 (1998); Thompson, Oncogene, 15, 3025-3035 (1997).

Dada a natureza central do caminho de supressor de tumor p53, as intervenções terapêuticas que exploram vulnerabilidades no cancro defectivo de p53 foram pensadas activamente. Uma vulnerabilidade emergente repousa na operação do «checkpoint» G2 em células de cancro defectivas de p53. As células de cancro, porque elas carecem de controlo de «checkpoint» Gl, são particularmente vulneráveis à ab-rogação da última barreira restante que as protege dos efeitos mortais do cancro de agentes danifica-dores do DNA: o «checkpoint» G2. O «checkpoint» G2 é regulado por um sistema de controlo que foi preservado de levedura para humanos. Importante neste sistema preservado é uma cinase, CHKl, que faz a transdução de sinais do complexo sensorial de dano a DNA para inibir a activação da ciclina B/cinase Cdc2, que promove a entrada mitótica. Ver, e.g., Peng et al., Science, 277, 1501-1505 (1997); Sanchez et al., Science 277, 1497-1501 (1997). Foi mostrado que a inactivação de CHKl ab-roga a prisão de G2 induzida por dano de DNA infligido quer por agentes anticancro quer por dano de DNA endógeno, bem como resulta na morte preferencial das células defectivas de «checkpoint» resultantes. Ver, e.g., Nurse, Cell, 91, 865-867 (1997); Weinert, Science, 211, 1450-1451 (1997); Walworth et al., Nature, 363, 368-371 (1993); e Al-Khodairy et al., Molec. Biol. Cell, 5, 147-160 (1994). 25 ΡΕ1585743 A manipulação selectiva do controlo de «checkpoint» em células de cancro poderia propiciar larga utilização em regimes quimioterapêuticos e de radioterapia do cancro e podem, alem disso, oferecer um emblema comum da "instabilidade genómica" do cancro humano para ser explorado como base selectiva para a destruição de células de cancro. Numerosos factores colocam a CHKl como alvo central no controlo de «checkpoint» de dano de DNA. A elucidação de inibidores disto e cinases funcionalmente relacionadas tais como Cdsl/CHK2, uma cinase recentemente descoberta para cooperar com CHKl na regulação da progressão em fase S (ver Zeng et al., Nature, 395, 507-510 (1998); Matsuoka, Science, 282, 1893-1897 (1998), poderia proporcionar novas entidades terapêuticas valiosas para o tratamento do cancro. A ligação do receptor de integrina a ECM inicia sinais intracelulares mediados por FAK (Cinase de Adesão Focal) que estão envolvidos na mortalidade celular, proliferação celular e sobrevivência. Em cancros humanos, a sobreexpressão de FAK está implicada em tumorgénese e potencial metastático através do seu papel em caminhos de sinalização mediados por integrina.

As tirosina-cinases podem ser do tipo receptor (tendo domínios extracelular, de transmembrana e intracelular) ou do tipo não receptor (sendo completamente intracelular) . Acredita-se que pelo menos uma das tirosina-cinases 26 ΡΕ1585743 de proteína não receptoras, nomeadamente, LCK, medeia a transdução em células T de um sinal proveniente da interacção de uma proteína da superfície celular (Cd4) com um anticorpo anti-Cd4 de ligação cruzada. Uma discussão mais detalhada de tirosinas-cinases não receptoras é proporcionada em Bolen, Oncogene, 8, 2025-2031 (1993).

Em aditamento às proteína-cinases acima identificadas, muitas outras proteína-cinases foram consideradas ser alvos terapêuticos e numerosas publicações revelam inibidores da actividade de cinase, como revisto no que se segue: Patente dos Estados Unidos da América N° 6 534 524, emitida em 18 de Março de 2003, Patente dos Estados Unidos da América N° 6 531 491, emitida em 11 de Março de 2003, Publicação do Pedido de Patente Internacional PCT Número WO 00/38665 (publicado em 6 de Julho de 2001), Publicação do Pedido de Patente Internacional PCT Número WO 97/49688 (publicado em 31 de Dezembro de 1997), Publicação do Pedido de Patente Internacional PCT Número WO 98/23613 (publicado em 4 de Junho de 1998), Patente dos Estados Unidos da América N° 6 071 935, emitida em 6 de Junho de 2000, Publicação do Pedido de Patente Internacional PCT Número WO 96/30347 (publicado em 3 de Outubro de 1996), Publicação do Pedido de Patente Internacional PCT Número WO 96/40142 (publicado em 19 de Dezembro de 1996), Publicação do Pedido de Patente Internacional PCT Número WO 97/13771 (publicado em 17 de Abril de 1997), Publicação do Pedido de Patente Internacional PCT Número WO 95/23141 (publicado em 31 de Agosto de 1995), Publicação do Pedido de Patente Interna- 27 ΡΕ1585743 cional PCT Número WO 03/006059 (publicado em 23 de Janeiro de 2003), Publicação do Pedido de Patente Internacional PCT Número WO 03/035047 (publicado em 1 de Maio de 2003), Publicação do Pedido de Patente Internacional PCT Número WO 02/064170 (publicado em 22 de Agosto de 2002), Publicação do Pedido de Patente Internacional PCT Número WO 02/41882 (publicado em 30 de Maio de 2002), Publicação do Pedido de Patente Internacional PCT Número WO 02/30453 (publicado em 18 de Abril de 2002), Publicação do Pedido de Patente Internacional PCT Número WO 01/85796 (publicado em 15 de Novembro de 2001), Publicação do Pedido de Patente Internacional PCT Número WO 01/74360 (publicado em 11 de Outubro de 2001), Publicação do Pedido de Patente Internacional PCT Número WO 01/74296 (publicado em 11 de Outubro de 2001), Publicação do Pedido de Patente Internacional PCT Número WO 01/70268 (publicado em 27 de Setembro de 2001), Publicação do Pedido de Patente Europeia Número EP 1086705 (publicado em 28 de Março de 2001) e Publicação do Pedido de Patente Internacional PCT Número WO 98/51344 (publicado em 19 de Novembro de 1998).

Existe ainda uma necessidade, contudo, de inibi-dores eficazes de proteina-cinases. Além disso, como é compreendido pelos peritos na técnica, é desejável para inibidores de cinase possuir não só alta afinidade para a cinase ou cinases alvos mas também alta selectividade versus outras proteina-cinases.

Assim, um objectivo da invenção é descobrir 28 ΡΕ1585743 agentes potentes para o tratamento de doenças oftálmicas, tais como degenerescência macular relacionada com a idade (DMRI), neovascularização coroidiana (NVC) , retinopatias (e.g., retinopatia diabética, vitreorretinopatia, retinopatia de prematuridade), retinite (e.g., retinite por citomegalovirus (CMV), uveíte, edema macular e glaucoma.

Um outro objectivo da presente invenção é descobrir inibidores potentes de proteina-cinases.

Um outro objectivo da presente invenção é descobrir inibidores de cinase eficazes tendo uma afinidade forte e selectiva para uma ou mais cinases particulares.

Estes e outros objectivos da invenção, que se tornarão evidentes a partir da descrição que segue, foram alcançados pela descoberta dos compostos de indazole seus sais farmaceuticamente aceitáveis (tais compostos, pró-fármacos, metabolitos e sais são colectivamente referidos como "agentes") descritos abaixo, que modulam e/ou inibem a actividade de proteina-cinases. As composições farmacêuticas contendo tais agentes são úteis no tratamento de doenças mediadas por actividade de cinase, tais como cancro, bem como outros estados de doença associados com angiogénese e/ou proliferação celular não desejadas, tais como retinopatia diabética, glaucoma neovascular, artrite reumatóide e psoríase. Além disso, os agentes têm propriedades vantajosas que se relacionam com a modulação e/ou inibição da actividade de cinase associada com VEGF-R, 29 ΡΕ1585743 FGF-R, complexos de CDK, CHKl, LCK, TEK, FAK e/ou fosforilase-cinase. Num aspecto geral, a invenção diz respeito ao composto tendo as seguinte estrutura:

Os compostos preferidos da presente invenção que têm actividade de cinase selectiva - isto é, eles possuem actividade significativa contra uma ou mais cinases especificas enquanto possuem menos ou minima actividade contra uma ou mais cinases diferentes. Numa forma de realização preferida da invenção, os compostos da presente invenção são os de Fórmula I possuindo potência substancialmente mais alta contra tirosina-cinase receptora de VEGF do que contra tirosina-cinase receptora de FGF-R1. A invenção diz também respeito a métodos de modulação da actividade de tirosina-cinase receptora de VEGF sem significativamente modular a actividade de tirosina-cinase receptora de FGF. A invenção proporciona também a utilização de um composto de fórmula I ou um seu sal farmaceuticamente aceitável, no fabrico de um medicamento para a modulação da actividade de um receptor de proteina-cinase, preferencialmente um receptor de VEGF. 30 ΡΕ1585743

Os compostos da invenção podem ser usados vantajosamente em combinação com outros agentes terapêuticos conhecidos. Por exemplo, os compostos de Fórmula I, que possuem actividade antiangiogénica podem ser co-adminis-trados com agentes quimioterapêuticos citotóxicos tais como taxol, taxotere, vimblastina, cis-platina, doxorrubicina, adriamicina e semelhantes, para produzirem um efeito antitumor equilibrado. A acentuação do efeito terapêutico aditivo ou sinergistico também pode ser obtido por co-administração de compostos de Fórmula I, II, III ou IV que possuem actividade antiangiogénica com outros agentes antiangiogénicos, tais como combretastatina A-4, endosta-tina, prinomastat, celecoxibe, rofocoxibe, EMD121974, IM862, anticorpos monoclonais anti-VEGF e anticorpos mono-clonais anti-KDR. Combinações adicionais são exemplificadas em WO 0038716, WO 00387171, WO 0038715, WO 0038730, WO 0038718, WO 0038665, WO 0037107, WO 0038786, WO 0038719, todos correntemente apresentados em 22 de Dezembro de 1999. A invenção proporciona também a utilização de um composto de fórmula I ou um seu sal farmaceuticamente aceitável, no fabrico de um medicamento para o tratamento de degenerescência macular relacionada com a idade, neovas-cularização coroidiana, retinopatia, em particular a reti-nopatia diabética, vitreorretinopatia ou retinopatia de prematuridade, retinite, em particular retinite por cito-megalovírus, edema macular, uma doença oftálmica num mamífero ou uma condição de doença mediada pela actividade 31 ΡΕ1585743 de proteína-cinase, em particular uma condição associada com crescimento tumoral, proliferação celular ou angiogénese.

Noutra forma de realização, a invenção proporciona um composto de Fórmula I ou um seu sal farmaceuti-camente aceitável, para utilização em medicina. A invenção também diz respeito a composições farmacêuticas, compreendendo conforme descrito acima uma quantidade eficaz de um agente seleccionado de entre os compostos de Fórmula I e seus sais farmaceuticamente aceitáveis, metabolitos farmaceuticamente aceitáveis e pró-fármacos farmaceuticamente aceitáveis; e um agente de suporte ou veiculo farmaceuticamente aceitável para tal agente. A invenção proporciona ainda métodos de tratamento de doenças/condições oftálmicas e cancro bem como outros estados de doença associados com angiogénese e/ou proliferação celular não desejadas, compreendendo a administração de quantidades eficazes de um tal agente a um paciente com necessidade de tal tratamento.

Os compostos da invenção de Fórmula I são úteis para o tratamento de doenças oftálmicas e mediação da actividade de proteina-cinases. Mais particularmente, os compostos são úteis como agentes antiangiogénese e como agentes para a modulação e/ou inibição da actividade de proteina-cinases, proporcionando assim tratamentos para 32 ΡΕ1585743 doenças oftálmicas e cancro ou outras doenças associados com proliferação celular mediada por proteina-cinases. 0 termo "alquilo", conforme aqui usado, refere-se a grupos alquilos de cadeia linear ou ramificada tendo de um a doze átomos de carbono. Exemplos de grupos alquilo incluem metilo (Me), etilo (Et), n-propilo, isopropilo, butilo, isobutilo, sec-butilo, terc-butilo (t-Bu), pentilo, isopentilo, terc-pentilo, hexilo, iso-hexilo e semelhantes. 0 termo "alquilo inferior" desiqna um alquilo tendo desde 1 a 8 átomos de carbono (um alquilo Ci-Cs) . Alquilos substituídos adequados incluem fluorometilo, difluorometilo, 2-fluoroetilo, 3-fluoropropilo, hidroximetilo, 2-hidroxi-etilo, 3-hidroxipropilo e semelhantes. 0 termo "alquilideno" refere-se a um grupo divalente tendo de um a doze átomos de carbono. Grupos alquilideno ilustrativos incluem CH2, CHCH3, (CH3)2 e semelhantes. 0 termo "alcenilo" refere-se a grupos alcenilo de cadeia linear e ramificada tendo desde dois a doze átomos de carbono. Grupos alcenilo ilustrativos incluem prop-2--enilo, but-2-enilo, but-3-enilo, 2-metilprop-2-enilo, hex-2-enilo e semelhantes. 0 termo "alcinilo" refere-se a grupos alcinilo de cadeia linear e ramificada tendo desde dois a doze átomos de carbono. 33 ΡΕ1585743 0 termo "cicloalquilo" refere-se a carbociclos saturados ou parcialmente insaturados tendo desde três a doze átomos de carbono, incluindo estruturas de cicloalquilo biciclicas e triciclicas. Cicloalquilos adequados incluem ciclopropilo, ciclobutilo, ciclopentilo, ciclo-hexilo, ciclo-heptilo e semelhantes. 0 termo "heterocicloalquilo" pretende significar um grupo monociclico saturado ou parcialmente insaturado contendo átomos de carbono, preferivelmente 4 ou 5 átomos de carbono, e pelo menos um heteroátomo seleccionado de entre azoto, oxigénio e enxofre. 0 termo "arilo" e "heteroarilo" refere-se a estruturas monociclicas e policiclicas insaturadas ou em anel aromático, referindo-se arilo às que são carbociclos e referindo-se "heteroarilo" às que são heterociclos. Exemplos de estruturas em anel aromático incluem fenilo, naftilo, 1,2,3,4-tetra-hidronaftilo, furilo, tienilo, pirrolilo, piridinilo, pirazolilo, imidazolilo, pirazinilo, piridazinilo, 1,2,3-triazinilo, 1,2,4-oxadiazolilo, 1,3,4--oxadiazolilo, lH-tetrazol-5-ilo, indolilo, quinolinilo, benzofuranilo, benzotiofenilo (tianaftenilo) e semelhantes. Tais porções podem ser facultativamente substituídas por uma estrutura em anel condensado ou ponte, por exemplo 0CH2-0. 34 ΡΕ1585743 0 termo "alcoxi" pretende significar o grupo -O-alquilo. Exemplos ilustrativos incluem metoxi, etoxi, propoxi e semelhantes. 0 termo "ariloxi" representa -O-arilo, em que arilo é definido acima. 0 termo "cicloalcoxilo" representa -O-ciclo-alquilo, em que cicloalquilo é definido acima. 0 termo "halogéneo" representa cloro, flúor, bromo ou iodo. 0 termo "halo" representa cloro, fluoro, bromo ou iodo.

Em geral, em várias porções ou grupos funcionais para variáveis nas fórmulas podem ser facultativamente substituídos por um ou mais substituintes adequados. Exemplos de substituintes incluem um halogéneo (F, Cl, BR ou I), alquilo inferior, -OH, -N02, -CN, -C02H, -O-alquilo inferior, -arilo, -aril-alquilo inferior, -C02CH3, -CONH2, -OCH2CONH2, -NH2, -S02NH2, haloalquilo (e.g., -CF3, -CH2CF3), -O-haloalquilo (e.g., -OCF3, -CCHF2) e semelhantes.

Os termos "compreendendo" e "incluindo" são usados num sentido aberto, não limitante.

Fica compreendido que ainda que um composto de Fórmula I possa exibir o fenómeno de tautomerismo, os desenhos da fórmula nesta descrição delineiam expressamente 35 ΡΕ1585743 apenas uma das possíveis formas tautoméricas. Deve por conseguinte ser compreendido que na invenção as fórmulas pretendem representar qualquer forma tautomérica do composto delineado e não para serem limitadas meramente a uma forma tautomérica específica delineada pelos desenhos da fórmula.

Alguns dos compostos da invenção podem existir como estereoisómeros isolados (isto é, essencialmente livres de outros estereoisómeros), racematos e/ou misturas de enantiómeros e/ou diastereómeros. Todos estes estereoisómeros isolados, racematos e suas misturas pretendem estar dentro do âmbito e alcance da presente invenção. Preferivelmente, os compostos da invenção que são opticamente activos são usados em forma opticamente pura.

Conforme geralmente entendido pelos peritos na técnica, um composto opticamente puro tendo um centro quiral é um que consiste essencialmente de um dos dois enantiómeros possíveis (isto é, é enantiomericamente puro) e um composto opticamente puro tendo um centro quiral é um que é não só diastereomericamente puro mas também enantiomericamente puro. Preferivelmente, os compostos da presente invenção são usados numa forma que é pelo menos 90% opticamente pura, quer dizer, uma forma que consiste de pelo menos 90% de um isómero isolado (80% de excesso enantiomérico ("e.e.") ou excesso diastereomérico ("e.d.")), mais preferivelmente pelo menos 95% (90% e.e. ou e.d.), mesmo mais preferivelmente pelo menos 97,5% (95% 36 ΡΕ1585743 e.e. ou e.d.) e sendo o mais preferível 99% (98% e.e. ou e.d.) .

Além disso, as fórmulas pretendem cobrir formas solvatadas bem como não solvatadas. Por exemplo, a Fórmula I inclui compostos da estrutura indicada em ambas as formas hidratada e não hidratada. Outros exemplos de solvatos incluem as estruturas em combinação com isopropanol, etanol, metanol, DMSO, acetato de etilo, ácido acético e etanolamina.

Em adição aos compostos das Fórmulas I, a invenção inclui sais farmaceuticamente aceitáveis de tais compostos.

Um "pró-fármaco farmaceuticamente aceitável" é um composto que pode ser convertido sob condições fisiológicas ou por solvólise ao composto especificado ou a um sal farmaceuticamente aceitável de tal composto.

Um "metabolito farmaceuticamente aceitável" pretende significar um pró-fármaco farmacologicamente activo produzido através do metabolismo no corpo de um composto especificado ou seu sal. Os metabolitos de um composto podem ser identificados usando técnicas de rotina conhecidas na técnica e as suas actividades determinadas usando testes tais como os aqui descritos.

Os pró-fármacos e metabolitos activos de um 37 ΡΕ1585743 composto podem ser identificadas usando técnicas de rotina conhecidas na técnica. Ver, e.g., G. Bertolini et ai., J. Med. Chem., 40, 2011-2016 (1997); D. Shan et ai., J. Pharm. Sei., 86 (7), 765-767; K. Bagshawe, Drug Dev. Res., 34 (1995), 220-230; N. Bodor, Advances in Drug Res., 13, 224-331 (1984); H. Bundgaard, Design of Prodrugs (Elsevier Press 1985); e I. K. Larsen, Design and Application of Prodrugs, Drug Design and Development (Krogsgaard-Larsen et al., eds., Harwood Academic Publishers, 1991).

Um "sal farmaceuticamente aceitável" pretende significar um sal que retém a eficácia biológica dos ácidos e bases livres do composto especificado e que não é biologicamente ou de outra maneira indesejável. Um composto da invenção pode possuir um grupo funcional suficientemente acidico, suficientemente básico ou ambos, e em concordância, reage com qualquer de numerosas bases inorgânicas ou orgânicas, e ácidos inorgânicos e orgânicos, para formar um sal farmaceuticamente aceitável. Exemplos de sais farmaceuticamente aceitáveis incluem os sais preparados por reacção dos compostos da presente invenção com um ácido mineral ou orgânico ou uma base inorgânica, incluindo tais sais os sais sulfatos, pirossulfatos, bissulfatos, sulfitos, bissulfitos, fosfatos, mono-hidrogenofosfatos, di-hi-drogenofosfatos, metafosfatos, pirofosfatos, cloretos, brometos, iodetos, acetatos, propionatos, decanoatos, caprila-tos, acrilatos, formatos, isobutiratos, caproatos, heptano-atos, propiolatos, oxalatos, malonatos, succinatos, subera-tos, sebacatos, fumaratos, maleatos, butino-1,4-dioatos, 38 ΡΕ1585743 hexino-1,6-dioatos, benzoatos, clorobenzoatos, metilbenzo-atos, dinitrobenzoatos, hidroxibenzoatos, metoxibenzoatos, ftalatos, sulfonatos, xilenossulfonatos, fenilacetatos, fenilpropionatos, fenilbutiratos, citratos, lactatos, γ-hidroxibutiratos, glicolatos, tartaratos, metanossul-fonatos, propanossulfonatos, naftaleno-l-sulfonatos, nafta-leno-2-sulfonatos e mandelatos.

Se o composto da invenção é uma base, o sal farmaceuticamente aceitável desejado pode ser preparado por qualquer método adequado disponível na técnica, por exemplo, tratamento da base livre com um ácido inorgânico, tal como ácido clorídrico, ácido bromídrico, ácido sulfúrico, ácido nítrico, ácido fosfórico e semelhantes, ou com um ácido orgânico, tal como ácido acético, ácido maleico, ácido succínico, ácido mandélico, ácido fumárico, ácido malónico, ácido pirúvico, ácido oxálico, ácido glicólico, ácido salicílico, um ácido de piranosidilo tal como ácido glucorónico ou ácido galacturónico, um alfa-hidroxiácido tal como ácido cítrico ou ácido tartárico, um aminoácido tal como ácido aspártico ou ácido glutâmico, um ácido aromático tal como ácido benzóico ou ácido cinâmico, um ácido sulfónico, tal como ácido p-toluenossulfónico ou ácido etanossulfónico, ou semelhantes.

Se o composto da invenção é um ácido, o sal farmaceuticamente aceitável desejado pode ser preparado por qualquer método adequado, por exemplo, tratamento do ácido livre com uma base inorgânica ou orgânica, tal como uma 39 ΡΕ1585743 amina (primária, secundária ou terciária), um hidróxido de metal alcalino ou hidróxido de metal alcalino-terroso, ou semelhante. Exemplos ilustrativos de sais adequados incluem sais orgânicos derivados de aminoácidos, tais como glicina e arginina, amónia, aminas primárias, secundárias e terciárias, e aminas cíclicas tais como benzilaminas, pirrolidinas, piperidina, morfolina e piperazina, e sais inorgânicos derivados de sódio, cálcio, potássio, magnésio, manganês, ferro, cobre, zinco, alumínio e lítio.

No caso dos agentes que são sólidos, é compreendido pelos peritos na técnica que os compostos e sais da invenção podem existir em diferentes formas cristalinas ou polimórficas, todas elas pretendendo estar dentro do âmbito e alcance da presente invenção e fórmulas especificadas.

Quantidades terapeuticamente eficazes dos agentes da invenção podem ser usadas para tratar doenças mediadas pela modulação ou regulação de proteína-cinases. Uma "quantidade eficaz" pretende significar aquela quantidade de um agente que, quando administrado a um mamífero com necessidade de tal tratamento, é suficiente para efectuar o tratamento para uma doença mediada pela actividade de uma ou mais proteína-cinases, tais como tirosina-cinases. Por conseguinte, e.g., uma quantidade terapeuticamente eficaz de um composto de Fórmula I, seu sal, metabolito activo ou pró-fármaco, é uma quantidade suficiente para modular, regular ou inibir a actividade de uma ou mais proteína- 40 ΡΕ1585743 cinases tal que uma condição de doença que é mediada por essa actividade seja reduzida ou aliviada. A quantidade de um dado aqente que corresponderá a uma tal quantidade variará dependendo de factores tais como o composto particular, a condição de doença e sua severidade, a identidade (e.g., peso) do mamífero com necessidade de tal tratamento, mas pode contudo ser rotineiramente determinada por um perito na técnica. "Tratamento" pretende significar pelo menos a mitigação de uma condição de doença num mamífero, tal como um humano, que está afectado, pelo menos em parte, pela actividade de uma ou mais proteína-cinases, tais como tirosina-cinases, e inclui: a prevenção da condição de doença ocorrer num mamífero, particularmente quando o mamífero é encontrado como predisposto a ter a condição de doença mas ainda não foi diagnosticado como a tendo; modulação e/ou inibição da condição de doença; e/ou alívio da condição de doença.

Os agentes da invenção podem ser preparados usando os caminhos de reacção e esquemas de síntese conforme abaixo descrito, empregando as técnicas disponíveis na técnica usando materiais de partida que estão prontamente disponíveis.

Num processo sintético geral, os compostos de Fórmula I são preparados de acordo com o seguinte esquema de reacção: 41 ΡΕ1585743

1) modificaçàes 3-pg

6-Nitroindazole (composto V) é tratado com iodo e base, e.g., NaOH, numa mistura aquosa/orgânica, preferivelmente com dioxano. A mistura é acidificada e o produto é isolado por filtração. Ao 3-iodo-6-nitroindazole em diclorometano-KOH aquoso 50% a 0 °C é adicionado um reagente grupo de protecção ("Pg") (em que X = halo), 42 ΡΕ1585743 preferivelmente cloreto de trimetilsililetoximetilo (SEM-Cl), e um catalisador de transferência de fase, e.g., brometo de tetrabutilamónio (TBABr). Após 1-4 horas, as duas fases são diluídas, os orgânicos são separados, secos sobre sulfato de sódio, filtrados e concentrados. 0 produto cru é purificado por cromatografia sobre gel de sílica para dar compostos de fórmula VI. 0 tratamento de compostos de fórmula VI num solvente orgânico adequado com um ^-reagente organometálico adequado, preferivelmente um í^-ácido borónico, na presença de base aquosa, e.g., carbonato de sódio, e um catalisador adequado, preferivelmente Pd(PPh3) 4, dá, após manipulação extractiva e cromatografia sobre gel de sílica, compostos de fórmula VII. 0 substituinte R1 pode ser trocado no interior dos compostos de fórmula VII ou intermediários posteriores através deste esquema por clivagem oxidante (e.g., ozonólise) seguido por adições à funcionalidade aldeído resultante com transformações de Wittig ou de condensação (tipificado no Exemplo 42 (a-e)). 0 tratamento de compostos de fórmula VII com um agente de redução, preferivelmente SnCl2, produz, após manipulação aquosa convencional e purificação, compostos de fórmula VIII. Para a série de derivados onde Y = NH ou N-alquilo inferior, os compostos de fórmula VIII podem ser tratados com cloretos, brometos, iodetos ou triflatos de arilo ou heteroarilo na presença de uma base, preferivelmente CS2CO3, e catalisador, preferivelmente Pd-BINAP, (e onde Y = N-alquilo inferior, 43 ΡΕ1585743 com um passo de alquilação subsequente) para produzir compostos de fórmula X. Para produzir outros encadeamentos Y, é adicionado nitrito de sódio a compostos de fórmula VIII sob condições acidicas aquosas padrão com arrefecimento seguido por adição de iodeto de potássio e aquecimento suave. A manipulação padrão e purificação produzem compostos iodeto de fórmula IX. 0 tratamento de compostos de fórmula VIX com um reagente organometálico, e.g., butil-lítio, promove a troca de litio por halogéneo. Este intermediário reage em seguida com um electrófilo R2, e.g., um carbonilo ou triflato, através da mediação possível de metais e catalisadores adicionais, preferivelmente cloreto de zinco e Pd(PPh3)4 para proporcionar compostos de fórmula X. Alternativamente, os compostos de fórmula IX podem ser tratados com um reagente organometálico tal como um ácido organoborónico na presença de um catalisador, e.g., Pd(PPh3)4, sob uma atmosfera de monóxido de carbono para dar compostos de fórmula X. Alternativamente, para derivados onde Y = NH ou S, os compostos de fórmula IX podem ser tratados com aminas ou tióis apropriados na presença de base, preferivelmente Cs2C03 ou K3P04 e um catalisador, preferivelmente Pd-BINAP ou Pd-(bis-ciclo-hexil)bifenilfosfina para proporcionar compostos de fórmula X. Trocas de grupos funcionais convencionais, tais como oxidações, reduções, alquilações, acilações, condensações e desprotecções podem em seguida 44 ΡΕ1585743 ser empregues para ainda derivatizar esta série dando compostos finais de Fórmula I.

Os compostos de Fórmula da invenção também podem ser preparados de acordo com o procedimento geral mostrado no esquema seguinte:

6-Iodoindazole (IX) é tratado com iodo e base, e.g., NaOH, numa mistura aquosa/orgânica, preferivelmente com dioxano. A mistura é acidificada e o produto XII é isolado por filtração. Ao 3, β-diiodoindazole resultante em diclorometano-KOH aquoso 50% a 0 °C é adicionado um 45 ΡΕ1585743 reagente grupo de protecção, preferivelmente SEM-C1, e um catalisador de transferência de fase, e.g., TBABr. As duas fases são diluídas, os orgânicos são separados, secos sobre sulfato de sódio, filtrados e concentrados. 0 produto cru é purificado por cromatografia sobre gel de sílica para dar compostos de fórmula XIII. 0 tratamento de compostos de fórmula XIII num solvente orgânico adequado com um R2-reagente organometálico adequado, e.g., R2-ZnCl ou reagente de boro R2-boro e um catalisador adequado, preferivelmente Pd(PPh3)4, dá, após manipulação extractiva e cromatografia sobre gel de sílica, compostos de fórmula XIV. 0 tratamento de compostos de fórmula XIV num solvente orgânico adequado com um R2-reagente organometálico adequado (e.g., reagente de boro R1-boro ou R1-ZnCl), na presença de base aquosa, carbonato de sódio e um catalisador adequado, preferivelmente Pd(PPh3)4, dá, após manipulação extractiva e cromatografia sobre gel de sílica, compostos de fórmula XV. As trocas de grupos funcionais convencionais, tais como oxidações, reduções, alquilações, acilações, condensações e desprotecções podem em seguida ser empregues para ainda derivatizar esta série dando compostos finais de Fórmula I.

Alternativamente, os compostos de Fórmula I onde R2 é um Y-Ar substituído ou não substituído, onde Y é 0 ou S, podem ser preparados de acordo com o seguinte esquema geral: XVIΡΕ1585743 46 -¾ χν M-aseo-R'

XVII

XVI

catalisador, calor ou DDR

DOQ modificações

Uma solução agitada em acetona de 3-cloro-ciclo--hex-2-enona (XV), H-R2, e carbonato de potássio anidro é refluxada durante 15-24 horas, arrefecida e filtrada. A concentração e cromatografia do filtrado sobre gel de silica dá 3-R2-ciclo-hex-2-enona (XVI).

As cetonas de fórmula XVI podem reagir com uma base adequada (M-B), preferivelmente bis(trimetilsilil)ami-deto de litio, e reagir com R1-CO-X (onde X = halogéneo), o que após manipulação acidica estândar e purificação produz compostos de fórmula XVII. Este produto, em HOAc/EtOH, combinado com mono-hidrato de hidrazina, é aquecido a uma temperatura adequada durante um periodo de tempo apropriado, preferivelmente a 60-80 °C durante 2-4 horas. Após arrefecimento, a mistura é vertida em solução saturada 47 ΡΕ1585743 de bicarbonato de sódio, extraída com um solvente orgânico, concentrada e purificada sobre gel de sílica para dar compostos de Fórmula XVIII. Os compostos de Fórmula XVIII podem ser oxidados usando uma variedade de métodos conhecidos para darem compostos de Fórmula I.

Um processo alternativo para a síntese dos compostos da presente invenção é como segue: 48 ΡΕ1585743

Onde as condições dos passos A até i) são como se segue: a) NaN02, Br2, HBr, 0 °C - -5 °C; rendimento de 48%; b) Pd(OAc)2, Pd(o-tolil)3, diisopropiletilamina (DIEA), DMF, H20, desgaseado, microondas, 110 °C, 1 h; rendimento de 68%; c) ferro em pó, NH4OH aquoso saturado, EtOH, 45 °C; rendimento de 72%; d) 2-bromobenzoato de metilo, R-BINAP, Pd2(dba)3, Cs2C03, tolueno, desgaseado, 110 °C durante a noite; rendimento de 74%; e) KOH, MeOH:THF:H20 (3:1:1), 70 °C, 2-3 h; quantitativo; f) amina protegida, HATU, NEt3, DMF, temperatura ambiente durante 2 horas; rendimento de 80%; g) TsOH (TsOH 12% em HOAc), EtOH (aquoso 10%); rendimento de 4 4%; h) tributilvinilestanho, Pd(PPh3)4, 2,6-di-t-butil--4-metilfenol, tolueno, desgaseado, 105 °C; rendimento de 31%; i) Pd(OAc)2, Pd(o-tolil)3, DIEA, DMF, desgaseado, 100 °C; rendimento de aproximadamente 70%.

Outros compostos de Fórmula I podem ser preparados de maneiras análogas aos procedimentos gerais descritos acima ou procedimentos detalhados descritos nos exemplos presentes. A afinidade dos compostos da invenção para um receptor pode ser acentuada providenciando cópias múltiplas do ligando em proximidade estreita, preferível- 49 ΡΕ1585743 mente usando uma armação proporcionada por uma porção agente de suporte. Foi mostrado que a provisão de tais compostos de valência múltipla com espaçamento óptimo entre as porções melhora dramaticamente a ligação a um receptor. Ver, e.g., Lee et al., Biochem., 23, 4255 (1984). A multivalência e espaçamento podem ser controlados por selecção de uma porção agente de suporte adequada ou unidades ligadoras. Tais porções incluem suportes moleculares que contêm uma multiplicidade de grupos funcionais que podem reagir com grupos funcionais associados com os compostos da invenção. Certamente, uma variedade de suportes pode ser usada, incluindo aqueles como BSA ou HAS, uma multiplicidade de péptidos incluindo, por exemplo, pentapéptidos, decapéptidos, pentadecapéptidos e semelhantes. Os péptidos ou proteínas podem conter o número desejado de resíduos de aminoácido nas suas cadeias laterais; contudo, outros grupos funcionais, tais como grupos sulfidrilo ou grupos hidroxilo, também podem ser usados para obter encadeamentos estáveis.

Os compostos que potencialmente regulam, modulam ou inibem a actividade de proteína-cinase associados com receptores de VEGF, FGF, complexos de CDK, TEK, CHK1, LCK, FAK e fosforilase-cinase entre outros, e que inibem a angiogénese e/ou proliferação celular são desejáveis e é uma incorporação preferida da presente invenção. A presente invenção é ainda dirigida a métodos in vitro de modulação ou inibição da actividade de proteína-cinase, por exemplo num tecido de mamífero, pela administração de um agente da 50 ΡΕ1585743 invenção. A actividade dos compostos da invenção como moduladores da actividade de proteína-cinase, tal como a actividade de cinases, pode ser medida por qualquer dos métodos disponíveis aos peritos na técnica, incluindo ensaios in vitro. Exemplos de ensaios adequados para medições de actividade incluem os descritos em C. Parast et al., BioChemistry, 37 (1998) 16788-16801; Jeffrey et ai., Nature, 376 (1995) 313-320; Publicação Internacional WIPO N° WO 97/34876; e Publicação Internacional WIPO N° WO 96/14843. Estas propriedades podem ser avaliadas, por exemplo, usando um ou mais dos procedimentos de testagem biológica indicados nos exemplos abaixo.

Os agentes activos da invenção podem ser formulados em composições farmacêuticas conforme descrito abaixo. As composições farmacêuticas desta invenção compreendem uma quantidade de modulação, regulação ou inibição eficaz de um composto de Fórmula I, num agente de suporte ou diluente inerte, farmaceuticamente aceitável. Numa forma de realização das composições farmacêuticas, níveis eficazes dos agentes da invenção são proporcionados de maneira a proporcionarem benefícios terapêuticos envolvendo a modulação de proteína-cinases. Por "níveis eficazes" deve entender-se níveis em que os efeitos de proteína-cinases são, no mínimo, regulados. Estas composições são preparadas em formas de dosagem unitária apropriadas para o modo de administração, e.g., administração parentérica ou oral. 51 ΡΕ1585743

Um agente da invenção é administrado em forma de dosagem convencional preparada pela combinação de uma quantidade terapeuticamente eficaz de um agente (e.g., um composto de Fórmula I) como ingrediente activo com agentes de suporte ou diluentes farmacêuticos apropriados de acordo com procedimentos convencionais. Estes procedimentos podem envolver mistura, granulação e compressão ou dissolução dos ingredientes conforme apropriado para a preparação desejada. 0 agente de suporte farmacêutico empregue pode ser ou um sólido ou um liquido. Exemplos de agentes de suporte sólidos são lactose, sacarose, talco, gelatina, ágar, pectina, acácia, estearato de magnésio, ácido esteárico e semelhantes. Exemplos de agentes de suporte liquidos são xarope, óleo de amendoim, azeite, água e semelhantes. De modo semelhante, o agente de suporte ou diluente podem incluir material de libertação retardada ou no momento conhecido na técnica, tal como monostearato de glicerilo ou distearato de glicerilo isolado ou com uma cera, etilcelulose, hidroxipropilmetilcelulose, metacrilato de metilo e semelhantes.

Uma variedade de formas farmacêuticas pode ser empregue. Assim, se um agente de suporte sólido for usado, a preparação pode ser feita em comprimidos, colocada numa cápsula de gelatina dura em forma de pó ou pélete ou na forma de um trocisco ou pastilha. A quantidade de agente de suporte pode variar, mas geralmente será desde cerca de 52 ΡΕ1585743 25 mg até cerca de 1 g. Se um agente de suporte líquido for usado, a preparação será na forma de xarope, emulsão, gota, cápsula de gelatina mole, solução ou suspensão injectável estéril numa ampola ou frasco ou suspensão em líquido não aquoso.

Para obter uma forma de dose solúvel em água estável, um sal farmaceuticamente aceitável de um agente da invenção pode ser dissolvido numa solução aquosa de um ácido orgânico ou inorgânico, tal como solução 0,3 M de ácido succínico ou ácido cítrico. Se uma forma de sal solúvel não estiver disponível, o agente pode ser dissolvido num co-solvente ou combinação de co-solventes adequados. Exemplos de co-solventes adequados incluem, mas sem constituir limitação, álcool, propilenoglicol, polietilenoglicol 300, polissorbato 80, glicerina e semelhantes, em concentrações no intervalo de 0-60% do volume total. Numa forma de realização exemplar, um composto de Fórmula I é dissolvido em DMSO e diluído com água. A composição também pode estar na forma de uma solução de uma forma de sal do ingrediente activo num veículo aquoso apropriado tal como água ou salina isotónica ou solução de dextrose.

Será apreciado que as dosagens actuais dos agentes usados nas composições desta invenção variarão de acordo com o complexo particular a ser usado, a composição particular formulada, o modo de administração e o sítio, hospedeiro e doença particulares a serem tratados. Dosagens 53 ΡΕ1585743 óptimas para um dado conjunto de condições podem ser determinadas pelos peritos na técnica usando testes de determinação de dosagem convencionais tendo em vista os dados experimentais para um agente. Para administração oral, uma dose diária exemplar geralmente empregue é desde cerca de 0,001 até cerca de 1000 mg/kg de massa corporal, mais preferivelmente desde cerca de 0,001 até cerca de 50 mg/kg de massa corporal, com cursos de tratamento repetidos em intervalos apropriados. A administração de pró-fármacos é tipicamente doseada em niveis de massa que são quimicamente equivalentes aos niveis de massa da forma completamente activa.

As composições da invenção podem ser fabricadas de maneiras geralmente conhecidas para a preparação de composições farmacêuticas, e.g. usando técnicas convencionais tais como mistura, dissolução, granulação, feitura de drageias, levigação, emulsificação, encapsulamento, enreda-mento ou liofilização. As composições farmacêuticas podem ser formuladas de uma maneira convencional usando um ou mais agentes de suporte fisiologicamente aceitáveis, os quais podem ser seleccionados de entre excipientes e auxiliares que facilitam o processamento dos compostos activos em preparações que podem ser usadas farmaceutica-mente. A formulação apropriada depende da via de administração escolhida. Para injecção, os agentes da invenção podem ser formulados em soluções aquosas, 54 ΡΕ1585743 preferivelmente em tampões fisiologicamente compatíveis tais como solução de Hank, solução de Ringer ou tampão de salina fisiológica. Para administração transmucosa, os penetrantes apropriados à barreira a ser permeada são usados na formulação. Tais penetrantes são geralmente conhecidos na técnica.

Para administração oral, os compostos podem ser formulados prontamente por combinação dos compostos com agentes de suporte farmaceuticamente aceitáveis conhecidos na técnica. Tais agentes de suporte possibilitam que os compostos da invenção sejam formulados em comprimidos, pílulas, drageias, cápsulas, líquidos, géis, xaropes, magmas, suspensões e semelhantes, para ingestão oral por um paciente a ser tratado. As preparações farmacêuticas para uso oral podem ser obtidas usando um excipiente sólido em mistura com o ingrediente activo (agente), moendo facultativamente a mistura resultante e processando a mistura de grânulos após a adição de auxiliares adequados, se desejado, para obter núcleos de comprimidos ou drageias. Os excipientes adequados incluem: agentes de enchimento tais como açúcares, incluindo lactose, sacarose, manitol ou sorbitol; e preparações de celulose, por exemplo, amido de maís, amido de trigo, amido de arroz, amido de batata, gelatina, goma, metilcelulose, hidroxipropilmetilcelulose, carboximetilcelulose sódica ou polivinilpirrolidona (PVP). Se desejado, podem ser adicionados agentes de desintegração, tais como polivinilpirrolidona de ligação cruzada, ágar ou ácido algínico ou um seu sal tal como alginato de sódio. 55 ΡΕ1585743

Os núcleos de drageia são produzidos com revestimentos adequados. Para este propósito, soluções concentradas de açúcar podem ser usadas, as quais podem facultativamente conter goma arábica, polivinilpirrolidona, gel Carbopol, polietilenoglicol e/ou dióxido de titânio, soluções de laca e solventes ou misturas de solventes orgânicos adequados. Tintas ou pigmentos podem ser adicionados aos revestimentos de comprimidos ou drageias para identificação ou para caracterizar diferentes combinações de agentes activos.

As preparações farmacêuticas que podem ser usadas oralmente incluem cápsulas de ajustamento por compressão feitas de gelatina, bem como cápsulas moles vedadas feitas de gelatina e um plasticizante, tal como glicerol ou sorbitol. As cápsulas de ajustamento por compressão podem conter os ingredientes activos em mistura com agentes de enchimento tais como lactose, ligantes tais como amidos e/ou lubrificantes tais como talco ou estearato de magnésio, e, facultativamente, estabilizantes. Em cápsulas moles, os agentes activos podem ser dissolvidos ou suspensos em líquidos adequados, tais como óleos gordos, parafina líquida ou polietilenoglicóis líquidos. Em aditamento, podem ser adicionados estabilizantes. Todas as formulações para administração oral deverão ser em dosagens adequadas para tal administração. Para administração bucal, a composição toma a forma de comprimidos ou pastilhas formulados de maneiras convencionais. 56 ΡΕ1585743

Para administração intranasal ou por inalação, os compostos para uso de acordo com a presente invenção são convenientemente administrados na forma de uma apresentação em spray aerossol a partir de embalagens pressurizadas ou um nebulizador, com o uso de um propelente adequado, e.g., diclorofluorometano, triclorofluorometano, diclorotetra-fluoroetano, dióxido de carbono ou outro gás adequado. No caso de um aerossol pressurizado, a unidade de dosagem pode ser determinada providenciando uma válvula para libertar uma quantidade medida. Cápsulas e cartuchos de gelatina para uso num inalador ou insuflador e semelhantes podem ser formulados contendo uma mistura em pó do composto e uma base de pó adequada tal como lactose ou amido.

Os compostos podem ser formulados para administração parentérica por injecçâo, e.g. por injecção de bolo ou infusão continua. As formulações para injecção podem ser apresentadas em forma de dosagem unitária, e.g., em ampolas ou em contentores multidose, com um conservante adicionado. As composições podem tomar formas tais como suspensões, soluções ou emulsões em veículos oleosos ou aquosos e podem conter agentes de formulação tais como agentes de suspensão, de estabilização e/ou de dispersão.

As formulações farmacêuticas para administração parentérica incluem soluções aquosas dos compostos activos em forma solúvel em água. Além disso, suspensões dos agentes activos podem ser preparadas na forma de suspensões 57 ΡΕ1585743 de injecção oleosa apropriadas. Os solventes ou veículos lipofílicos adequados incluem óleos gordos tais como óleo de sésamo, ou ésteres de ácido gordo sintéticos, tais como oleato de etilo ou triglicéridos, ou lipossomas. As suspensões de injecção aquosas podem conter substâncias que aumentam a viscosidade da suspensão, tais como carboxi-metilcelulose sódica, sorbitol ou dextrano. Facultativamente, a suspensão também pode conter estabilizantes adequados ou agentes que aumentam a solubilidade dos compostos para permitirem a preparação de soluções altamente concentradas.

Para administração ao olho, um composto da Fórmula I, é administrado num veículo oftálmico farmaceu-ticamente aceitável tal que o composto é mantido em contacto com a superfície ocular durante um período de tempo suficiente para permitir ao composto penetrar na córnea e/ou esclerótica regiões internas do olho, incluindo, por exemplo, a câmara anterior, a câmara posterior, corpo vítreo, humor aquoso, humor vítreo, córnea, íris/cílios, lente, coróide/retina e esclerótica. 0 veículo oftálmico farmaceuticamente aceitável pode ser uma pomada, óleo vegetal ou um material de encapsulamento. Um composto da invenção também pode ser injectado directamente no humor vítreo e humor aquoso.

Além disso, um composto também pode ser administrado por métodos aceitáveis bem conhecidos, tais como injecções subtenonianas e/ou subconjuntivais. Como é bem 58 ΡΕ1585743 conhecido na técnica oftálmica, a mácula compreende principalmente os cones retinianos e é a região de máxima acuidade visual na retina. A cápsula de Tenon ou membrana de Tenon está disposta na esclerótica. A conjuntiva 36 cobre uma curta área do globo ocular posterior ao limbo (a conjuntiva bulbar) e dobra-se para cima (o fundo-de-saco superior) ou para baixo (o fundo-de-saco inferior) para cobrir as áreas internas da pálpebra superior e pálpebra inferior, respectivamente. A conjuntiva está disposta no topo da cápsula de Tenon. A esclerótica e a cápsula de Tenon definem a superfície exterior do globo ocular. Para tratamento de DMRI, NVC, retinopatias, retinite, uveíte, edema macular cistóide (EMC), glaucoma e outras doenças e condições do segmento posterior do olho, é preferível dispor um depósito de uma quantidade específica de um agente farmaceuticamente activo oftalmicamente aceitável directamente sobre a superfície exterior da esclerótica e abaixo da cápsula de Tenon. Em aditamento, nos casos de DMRI e EMC o mais preferível é dispor o depósito directamente sobre a superfície exterior da esclerótica e abaixo da cápsula de Tenon e geralmente acima da mácula. Num estudo usando coelhos brancos da Nova Zelândia («New Zealand White»), um depósito de fármaco de 4,9 (11)-pregnadien-17.alfa., 21-diol--3,20-diona-21-acetato, um esteróide angiostático disponível em Steraloids, Inc. de Wilton, New Hampshire, foi colocado directamente sobre a superfície exterior da esclerótica, abaixo da cápsula de Tenon, e ligeiramente posterior ao equador dos olhos do coelho. Um tal depósito 59 ΡΕ1585743 de fármaco resultou numa concentração do esteróide angiostático, distribuída regularmente sobre a retina inteira e medida no dia a seguir à injecção, cerca de dez vezes maior do que uma concentração semelhante administrada por um depósito localizado abaixo da conjuntiva mas acima da cápsula de Tenon dos olhos do coelho. Dado o facto de que a cápsula de Tenon de um coelho branco da Nova Zelândia é muito fina, estes resultados benéficos são altamente inesperados. É importante notar que a cápsula de Tenon do olho humano é também muito fina. 4,9 (11)-Pregnadien--17.alfa.,21-diol-3,20-diona-21-acetato, e o composto relacionado 4,9(11)-pregnadien-17.alfa.,21-diol-3,20-diona, são mais completamente descritos nas Pat. dos E.U.A. Nos 5 770 592 e 5 679 666.

Alternativamente, o ingrediente activo pode estar em forma de pó para constituição com um veículo adequado, e.g., água estéril livre de pirogénios, antes do uso. Os compostos também podem ser formulados em composições rectais tais como supositórios ou clisteres de retenção, e.g., contendo bases de supositório convencionais tais como manteiga de cacau ou outros glicéridos.

Em aditamento às formulações acima descritas, os compostos também podem ser formulados como uma preparação de depósito. Tais formulações de longa acção podem ser administradas por injecção intramuscular de implantação (por exemplo, subcutaneamente ou intramuscularmente) ou pela acima mencionada injecção subteniana ou intravítrea. 60 ΡΕ1585743

Dentre as formas de realização particularmente preferidas da invenção, os compostos podem ser preparados para administração tópica em salina (combinados com qualquer dos agentes conservantes e antimicrobianos comummente usados em preparações oculares) e administrados na forma de gotas para os olhos. A solução ou suspensão do factor antiangiogénico pode ser preparada na sua forma pura e administrada várias vezes ao dia. Alternativamente, as composições antiangiogénicas, preparadas conforme acima descrito, também podem ser administradas directamente à córnea.

Dentre as formas de realização preferidas, a composição é preparada com um polímero muco-adesivo que se liga à córnea. Assim, por exemplo, os compostos podem ser formulados com materiais poliméricos ou hidrofóbicos adequados (por exemplo, na forma de uma emulsão num óleo aceitável) ou resinas de troca iónica, ou como derivados escassamente solúveis, por exemplo, na forma de um sal escassamente solúvel. Dentre outras formas de realização, os factores antiangiogénicos ou composições antiangiogénicas podem ser utilizados como adjuntos para terapia de esteróides convencional.

Um agente de suporte farmacêutico para compostos hidrofóbicos é um sistema de co-solvente compreendendo álcool benzílico, um tensioactivo não polar, um polímero orgânico miscível em água e uma fase aquosa. O sistema 61 ΡΕ1585743 co-solvente pode ser um sistema co-solvente VPD. VPD é uma solução de 3% m/v de álcool benzílico, 8% m/v do tensioactivo não polar polissorbato 80 e 65% m/v de polietilenoglicol 300, feita até ao volume em etanol absoluto. O sistema co-solvente VPD (VPD:5W) contém VPD diluído 1:1 com dextrose a 5% em solução de água. Este sistema co-solvente dissolve bem compostos hidrofóbicos e ele próprio produz baixa toxicidade na administração sistémica. Naturalmente, as proporções de um sistema co-solvente podem ser variadas consideravelmente sem a destruição das suas características de solubilidade e de toxicidade. Além disso, a identidade dos componentes do co-solvente pode ser variada: por exemplo, outros tensioactivos não polares de baixa toxicidade podem ser usados em vez de polissorbato 80; o tamanho da fracção de polietilenoglicol pode ser variado; outros polímeros biocompatíveis podem substituir polietilenoglicol, e.g. polivinilpirrolidona; e outros açúcares ou polissacáridos podem ser substituídos por dextrose.

Alternativamente, podem ser empregues outros sistemas de entrega para compostos farmacêuticos hidrofóbicos. Lipossomas e emulsões são exemplos conhecidos de veículos ou agentes de suporte de entrega para fármacos hidrofóbicos. Certos solventes orgânicos tais como dimetilsulfóxido também podem ser empregues, ainda que usualmente à custa de maior toxicidade. Além disso, os compostos podem ser administrados usando um sistema de libertação sustentada, tal como matrizes semi-permeáveis de 62 ΡΕ1585743 polímeros hidrofóbicos sólidos contendo o agente terapêutico. Vários materiais de libertação sustentada foram estabelecidos e são conhecidos dos peritos na técnica. Cápsulas de libertação sustentada podem, dependendo da sua natureza química, libertar os compostos durante umas poucas semanas até além de 100 dias. Dependendo da natureza química e da estabilidade biológica do reagente terapêutico, podem ser empregues estratégias adicionais para a estabilização da proteína.

As composições farmacêuticas também podem compreender agentes de suporte ou excipientes em fase sólida ou de gel adequados. Exemplos de tais agentes de suporte ou excipientes incluem carbonato de cálcio, fosfato de cálcio, açúcares, amidos, derivados de celulose, gelatina e polímeros tais como polietilenoglicóis. O composto da invenção pode ser proporcionado na forma de sais com contra-iões farmaceuticamente compatíveis. Os sais farmaceuticamente compatíveis podem ser formados com muitos ácidos, incluindo clorídrico, sulfú-rico, acético, láctico, tartárico, málico, succínico, etc. Os sais tendem a ser mais solúveis em solventes aquosos ou outros protónicos do que o são as correspondentes formas em base livre. A preparação do composto da fórmula I e compostos de referência é descrita em detalhe nos exemplos seguintes, mas o técnico reconhecerá que as reacções químicas 63 ΡΕ1585743 descritas podem ser prontamente adaptadas para preparar numerosos outros inibidores de proteína-cinase da invenção. Por exemplo, a sintese de compostos não exemplificados de acordo com a invenção pode ser realizada com sucesso por modificações evidentes aos peritos na técnica, e.g., protegendo apropriadamente grupos interferentes, mudando para outros reagentes adequados conhecidos na técnica ou fazendo modificações de rotina das condições de reacção. Alternativamente, outras reacções aqui reveladas ou geralmente conhecidas na técnica serão reconhecidas como tendo aplicabilidade para a preparação de outros compostos da invenção.

Descrição Detalhada da Invenção e Formas de Realização Preferidas

Exemplos

Nos exemplos descritos abaixo, a menos que indicado de maneira diferente, todas as temperaturas estão indicadas em graus Celsius e todas as partes e percentagens são ponderais. Os reagentes foram comprados em fornecedores comerciais tais como Aldrich Chemical Company ou Lancaster Synthesis Ltd. e foram usados sem purificação adicional a menos que indicado de maneira diferente. Tetra-hidrofurano (THF) e N,N-dimetilformamida (DMF), diclorometano, tolueno e dioxano foram comprados em Aldrich em garrafas seladas Sure e usados conforme recebidos. Todos os solventes foram 64 ΡΕ1585743 purificados usando métodos padrão prontamente conhecidos dos peritos na técnica, a menos que indicado de maneira diferente.

As reacções indicadas abaixo foram feitas geralmente sob uma pressão positiva de árgon ou azoto ou com um tubo de secagem à temperatura ambiente (a menos que indicado de maneira diferente), em solventes anidros, e os balões de reacção foram equipados com septos de borracha para a introdução de substratos e reagentes via seringa. 0 material de vidro foi seco em estufa e/ou seco ao calor. A cromatografia de camada fina (TLC) analítica foi realizada sobre placas F254 de gel de sílica 60 de recozido em vidro da Analtech (0,25 mm) e eluídas com as razões de solvente apropriadas (v/v) e são indicadas onde apropriado. As reacções foram avaliadas por TLC e terminadas conforme juízo feito pelo consumo do material de partida. A visualização das placas de TLC foi feita com um reagente de pulverização de p-anisaldeído ou reagente de ácido fosfomolíbdico (Aldrich Chemical 20% m/m em etanol) e activadas com calor. As manipulações foram feitas tipicamente por duplicação do volume de reacção com o solvente de reacção ou solvente de extracção e em seguida lavando com as soluções aquosas indicadas usando 25% por volume do volume de extracção a menos que indicado de maneira diferente. As soluções de produto foram secas sobre Na2S04 anidro antes da filtração e evaporação dos solventes sob pressão reduzida num evaporador rotativo e indicado como solventes removidos em vácuo. A cromatografia flash em 65 ΡΕ1585743 coluna (Still et al., J. Org. Chem., 43 (1978) 2923) foi feita usando gel de sílica flash (47-61 μπι) grau Baker e com uma razão gel de sílica imaterial cru de cerca de 20:1 até 50:1 a menos que indicado de maneira diferente. A hidrogenólise foi feita à pressão indicada nos exemplos ou à pressão ambiente.

Os espectros 1H-NMR foram registados num instrumento Bruker operando a 300 MHz e os espectros 13C-NMR foram registados operando em 75 MHz. Os espectros NMR foram obtidos como soluções de CDC13 (registados em ppm) , usando clorofórmio como padrão de referência (7,25 ppm e 77,00 ppm) ou CD3OD (3,4 e 4,8 ppm e 49,3 ppm), ou internamente tetrametilsilano (0,00 ppm) quando apropriado. Foram usados outros solventes de RMN conforme a necessidade. Quando é registada uma multiplicidade de picos, são usadas as seguintes abreviaturas: s (singleto), d (dupleto), t (tripleto), m (multipleto), br (alargado), dd (dupleto de dupletos), dt (dupleto de tripletos). As constantes de acoplamento, quando dadas, são registadas em Hertz (Hz) .

Os espectro de infravermelhos (IR) foram registados num espectrómetro Perkin-Elmer FT-IR Spectrometer como óleos puros, como péletes de KBr ou como soluções de CDCI3, e quando dados são registados em números de onda (cm'1) . Os espectros de massa foram obtidos usando LSIMS ou electrospray. Todos os pontos de fusão (p.f.) são não corrigidos. ΡΕ1585743 66

Exemplo 1 (a) Éster de dimetilo do ácido 2-(4-cloro-2-nitro-fenil)-malónico

'Cl A uma lama agitada de NaOH (36,0 g; 1500 mmol) em NMP (1,0 L) foi adicionado malonato de dimetilo (137,4 mL; 1200 mmol) gota a gota. A reacção foi arrefecida quando necessário para manter a temperatura interna abaixo de 30 graus Celsius. Após cessar a evolução de gás, 2,4-dicloro-nitrobenzeno (192 g; 1000 mmol) foi adicionado à reacção. Esta foi cuidadosamente aquecida até 65 graus Celsius até a reacção estar completa conforme determinado por HPLC. A reacção foi arrefecida até à temperatura ambiente e em seguida vertida sobre 500 mL de gelo misturado com 150 mL de HCl conc. O pH da camada aquosa foi ajustado até ficar neutro usando NaOH 1 N. Os sólidos foram removidos por filtração através de um filtro de frita de grão grosso e lavados com água (3 L). Os sólidos amarelos foram deixados a secar durante a noite. Rendimento de 261,5 g, 91%.

Exemplo 1 (b) Éster de metilo do ácido (4-cloro-2-nitro-fenil)-acético

67 ΡΕ1585743

Uma solução de éster de dimetilo do ácido 2-(4-cloro-2-nitro-fenil)-malónico (195 g; 679,4 mmol) em água (100 mL) e NMP (1000 mL) foi aquecida em refluxo durante 3,5 horas. O solvente foi removido por evaporação rotativa até um óleo. O óleo foi dissolvido em EtOAc e, em seguida, lavado com água (5 x 300 mL). A camada aquosa foi em seguida extraída com EtOAc (4 x 300 mL). A orgânica foi lavada com água. As camadas orgânicas foram combinadas e secas sobre MgS04. Após remoção dos sólidos por filtração, o solvente foi evaporado para produzir o produto desejado na forma de um sólido laranja/castanho (160,0 g; 95%).

Exemplo 1 (c) Éster de metilo do ácido (2-acetilamino-4-cloro-fenil)-acético

Um balão cheio de árgon foi carregado com éster de metilo do ácido (4-cloro-2-nitro-fenil)-acético (40 g; 175 mmol), Pd 10%/C (2,5 g), anidrido acético (64 mL; 677 mmol), água (9 mL) e ácido acético (150 mL) . O balão foi jorrado em vácuo com gás hidrogénio a 30 psi e agitado vigorosamente. Após 2 horas, foi adicionado mais Pd 10%/C (2 g) e a reacção ficou completa após um total de 4 horas de tempo de reacção. O Pd 10%/C foi removido por filtração e o solvente removido por evaporação rotativa. 68 ΡΕ1585743

Exemplo 1 (d) Éster de metilo do ácido 6-cloro-lH-indazole-3-carboxílico

Cl A uma solução de éster de metilo do ácido (2-acetilamino-4-cloro-fenil)-acético (32,0 g; 133 mmol) em ácido acético (200 mL) agitada a 90 graus Celsius foi adicionado nitrito de terc-butilo (20,5 mL; 172,3 mmol) ao longo de 1 hora. A reacção foi vertida em água (1,4 L) e os sólidos foram recuperados por filtração. O precipitado amarelo foi dissolvido em EtOAc, em seguida lavado com NaCl saturado. O orgânico foi seco sobre MgSCU, filtrado e concentrado até um sólido. Os sólidos foram triturados com hexanos e filtrados para produzirem o material desejado (21,63 g; 77%) .

Exemplo 1 (e) Éster de metilo do ácido 6-cloro-l-(tetra-hidro--piran-2-il)-lH-indazole-3-carboxílico

A uma lama de éster de metilo do ácido 6-cloro--lH-indazole-3-carboxílico (8,3 g; 39,5 mmol) em MeCN (200 mL) foi adicionado 3,4-di-hidro-2H-pirano (5,4 mL; 69 ΡΕ1585743 59,3 mmol) e ácido p-toluenossulfónico (237 mg; 1,25 mmol). Depois de se deixar a reacção em agitação durante 10 minutos, NaHCC>3 saturado (1 mL) foi adicionado e o solvente foi removido por evaporação rotativa até um volume de 100 mL. A mistura foi diluida com EtOAc e lavada com água (50 mL) e em seguida com NaCl saturado (50 mL) . A camada orgânica foi em seguida seca sobre Na2S04. Depois dos sólidos serem removidos por filtração, a camada orgânica foi concentrada até um óleo por evaporação rotativa. O produto foi precipitado no óleo usando hexanos para produzir o produto desejado (7,667 g; rendimento de 66%).

Exemplo 1 (f) Éster de metilo do ácido 6-(2-metoxicarbonil-fenilamino)--1-(tetra-hidro-piran-2-il)-lH-indazole-3-carboxílico

A uma solução de éster de metilo do ácido 6-cloro-l-(tetra-hidro-piran-2-il)-lH-indazole-3-carboxili-co (2,94 g; 10,0 mmol) em 1,2-dimetoxietano (30 mL) foi adicionado K3P04 (5,32 g; 25,0 mmol), tris(dibenzilideno-acetona)dipaládio (459 mg; 0,05 mol), 2-(diciclo-hexilfos-fino)bifenilo (701 mg; 2,0 mmol) e antranilato de metilo (2,59 mL; 20,0 mmol). A solução foi jorrada em vácuo com árgon três vezes antes de ser aquecida até 80 graus Celsius 70 ΡΕ1585743 durante 18 horas. A reacção foi arrefecida até à temperatura ambiente e os sólidos foram removidos por filtração. Após lavagem dos sólidos com acetato de etilo, o solvente foi removido por evaporação rotativa. O óleo residual foi cromatografado (150 g de gel de sílica; EtOAc/Hex 10-30%) para produzir 1,23 g (51%) do produto desejado.

Exemplo 1 (g) Ácido 6-(2-metoxicarbonil-fenilamino)--1-(tetra-hidro-piran-2-il)-lH-indazole-3-carboxílico

A uma solução de éster de metilo do ácido 6-(2-metoxicarbonil-fenilamino)-1-(tetra-hidro-piran-2-il)--lH-indazole-3-carboxílico (2,05 g; 5 mmol) em metanol (18 mL) e tetra-hidrofurano (8 mL), foi adicionada uma solução de hidróxido de sódio (0,30 g; 7,5 mmol) em água (2,7 mL) . A reacção foi agitada à temperatura ambiente durante 3 horas e em seguida foi neutralizada com HC1 1 N até pH 1. A mistura foi diluída com EtOAc (25 mL) e água (25 mL) . Após separação das camadas, a camada aquosa foi lavada com CH2C12 (3 x 25 mL). Os extractos orgânicos combinados foram lavados com NaCl saturado (100 mL) e em seguida secos sobre Na2S04. Os sólidos foram filtrados e o líquido foi concentrado até um óleo. O produto foi 71 ΡΕ1585743 cristalizado em EtOAc e hexanos para produzir o produto desejado (1,616 g; 82%).

Exemplo 1 (h) Éster de metilo do ácido 2-[3-metilcarbamoil--1-(tetra-hidro-piran-2-il)-lH-indazole-6-ilamino]benzóico

A uma solução de ácido 6-(2-metoxicarbonil-fe-nilamino)-1-(tetra-hidro-piran-2-il)-lH-indazole-3-carboxí-lico (0,50 g; 1,27 mmol) em DMF foi adicionada trietilamina (0,42 mL; 3,04 mmol), metilamina (1,9 mL; 3,81 mmol) e HATU (0,578 g; 1,52 mmol). A reacção foi agitada durante 3 horas e em seguida concentrada por evaporação rotativa. O óleo cru foi cromatografado (20 g de gel de sílica; EtOAc/hexanos 25-50%) para produzir o produto desejado (214 mg; 42%) .

Exemplo 1 (i) Ácido 2-[3-metilcarbamoil-l-(tetra-hidro-piran-2-il)--lH-indazole-6-ilamino]benzóico

72 ΡΕ1585743 A uma solução de éster de metilo do ácido 2-[3-metilcarbamoil-l-(tetra-hidro-piran-2-il)-lH-indazole--6-ilamino]benzóico (0,20 g; 0,49 mmol) em metanol (1,4 mL) e tetra-hidrofurano (0,6 mL) foi adicionada uma solução de hidróxido de sódio (59 mg; 1,47 mmol) em água (0,3 mL). A reacção foi aquecida a 60 graus Celsius durante 1 hora e em seguida foi arrefecida até à temperatura ambiente. O pH foi ajustado com HC1 2 N até pH 2. EtOAc (30 mL) e água (30 mL) foram adicionados e as camadas foram separadas. O aquoso foi extraído com EtOAc (3 x 20 mL) e as camadas orgânicas foram combinadas. Após lavagem com água (15 mL) , a camada orgânica foi seca sobre Na2S04. Os sólidos foram separados por filtração e o orgânico foi evaporado para produzir um sólido amarelo (193 mg; 100%).

Exemplo 1 (j)

Metilamida do ácido 6-(2-prop-2-inilcarbamoil-fenilamino)--1-(tetra-hidro-piran-2-il)-lH-indazole-3-carboxílico

A uma solução de ácido 2-[3-metilcarbamoil-l--(tetra-hidro-piran-2-il)-lH-indazole-6-ilamino]benzóico (150 mg; 0,381 mmol) em DMF (3,6 mL) foi adicionado 73 ΡΕ1585743 propargilamina (0,052 mL; 0,761 mmol), TEA (0,264 mL; 1,90 mmol) e HATU (217 mg; 0,571 mmol). A reacção foi agitada durante 4 horas e em seguida diluida com EtOAc (30 mL) e água (30 mL) . As camadas foram separadas e a aquosa foi extraída com EtOAc (2 x 20 mL) . Os orgânicos combinados foram lavados com NaCl (15 mL) e em seguida secos sobre Na2S04. Os sólidos foram removidos por filtração e o líquido foi concentrado por evaporação rotativa até um óleo amarelo (164 mg; 100%) .

Exemplo de Referência 1 (k)

Metilamida do ácido 6-(2-prop-2-inilcarbamoil--fenilamino)-lH-indazole-3-carboxílico

Dissolveu-se metilamida do ácido 6-(2-prop-2--inilcarbamoil-fenilamino)-1-(tetra-hidro-piran-2-il)-1H--indazole-3-carboxílico (30 mg) em 1,5 mL de uma mistura de CH2CI2: TFA:trietilsilano (90:10:1) e aquecida em refluxo durante 2 horas. A solução foi diluída com tolueno (40 mL) e concentrada por evaporação rotativa até um óleo. O óleo foi dissolvido em DMF (1 mL) e filtrado usando um filtro de seringa de 0,2 micros. Foi usada prep-HPLC para isolar o composto desejado (12 mg; 50%). 1H-NMR (CDCl3-d) δ 9,96 74 ΡΕ1585743 (1Η, s), 8,28 (1H, d, J= 8,85 Hz), 7,47 (1H, m) , 7,34 (1H, m) , 7,22 (1H, m) , 7,15 (1H, dd, Jl=8,76 Hz, J2=l,79 Hz), 6,99 (1H, m) , 6,86 (1H, t, J= 6,97 Hz), 6,31 (1H, m) , 4,23 (2 H, dd, Jl=5,18 Hz, J2=2,54 Hz), 3,49 (3H, s) , 2,29 (s, 1H) .

Anál. calca para Ci9Hi7N502·!, 0 MeOH*0,l TFA: C-62,08; H-5,44; N-17,92. Encontrado: C-61,78; H-5,45; N-18,04.

Exemplo 2 (a) [6-Cloro-l- (tetra-hidro-piran-2-il) -lH-indazol-3-il] -metanol

A uma solução de éster de metilo do ácido 6-cloro-lH-indazole-3-carboxílico (2,94 g; 10,0 mmol) em CH2CI2 seco (50 mL) arrefecida até -78 graus Celsius foi adicionado DIBAL-H (3,56 mL; 20,0 mmol) lentamente. Depois da adição estar completa, a reacção foi deixada aquecer até à temperatura ambiente, onde HPLC mostrou que existia um resto de 10% do material de partida. DIBAL-H (0,35 mL) extra foi adicionado em seguida e agitado durante 10 minutos. A reacção foi diluída com EtOAc (1000 mL) e lavada com HC1 1 N (2 x 100 mL) . Foi ainda lavada com NaHC03 1 N (100 mL) e em seguida com NaCl saturado (100 mL). O orgânico foi seco sobre MgSCL, filtrado e em seguida concentrado até um sólido branco (2,65 g; 99,5%). ΡΕ1585743 75

Exemplo 2 (b) 6-Cloro-l-(tetra-hidro-piran-2-il)-lH-indazole-3-carbaldeído

A uma solução de [6-cloro-l-(tetra-hidro-piran-2--il)-lH-indazol-3-il]-metanol (1,75 g; 6,58 mmol), IBX (2,76 g; 9,87 mmol) e DMSO (27 mL) foi agitada durante a noite. A reacção foi diluída em EtOAc e água. As camadas foram separadas e a aquosa foi extraída com EtOAc (3 x 100 mL) . Os orgânicos foram combinados e lavados com NaCl saturado (100 mL) . O orgânico foi seco sobre MgSC>4, filtrado e em seguida concentrado até um sólido. O sólido foi dissolvido em CH2CI2 e filtrado. O orgânico foi evaporado para produzir o produto desejado (1,707 g; 92%).

Exemplo 2 (c) 1-(6-Cloro-lH-indazole-3-il)-2-(5-etil-piridin-2-il)-etanol

HC

Cl 76 ΡΕ1585743 A uma solução agitada de 4-etil-2-metilpiridina (0,458 g; 3,79 mol) em THF (4 mL) a -50 graus Celsius foi adicionado butil-litio (1,5 mL; 2,5 M; 3,79 mmol) lentamente e agitada durante 10 minutos. À reacção, foi lentamente adicionada uma solução de 6-cloro-lH-indazole-3-carbaldeído (0,5 g; 1,89 mmol) em THF (4 mL) . Após agitação durante 10 minutos, a reacção foi extinta com ácido cítrico 1 N (10 mL). A mistura foi diluída com EtOAc (50 mL), água (20 mL) e NaCl saturado (10 mL) . As camadas foram separadas e a aquosa foi extraída com EtOAc (3 x 15 mL). Os orgânicos foram combinados e lavados com NaCl saturado (20 mL) . Após secagem da camada orgânica sobre Na2S04, os sólidos foram removidos por filtração e o líquido foi concentrado até um óleo por evaporação rotativa. A cromatografia (4 0 g de gel de sílica; EtOAc/Hex 60-100%) produz o produto desejado (142 mg; 32%) e 6-cloro-lH-indazole-3-carbaldeído recuperado (348 mg).

Exemplo 2 (d) 6-Cloro-3-[2-(5-etil-piridin-2-il)-vinil]-lH-indazole

A uma solução agitada de 1- (6-cloro-lH-indazole-3--il)-2-(5-etil-piridin-2-il)-etanol (232 mg; 0,60 mol) em CH2CI2 foi adicionada TEA (0,25 mL; 1,81 mmol) e cloreto de 77 ΡΕ1585743 mesilo (0,070 mL; 0,90 mmol). A reacção foi agitada durante 30 minutos e em seguida DBU (2 mL) foi adicionado. A reacção foi refluxada durante 18 horas e em seguida extinta com 40 mL de ácido cítrico 1 N. As camadas foram separadas e o aquoso foi extraído com 20 mL de CH2CI2. Os orgânicos combinados foram secos sobre Na2S04, filtrados e concentrados por evaporação rotativa. A purificação por cromatografia (12 g de gel de sílica; EtOAc/hexanos 50-70%) produziu 0 composto desejado (135 mg; 71%) .

Exemplo 2 (e) Éster de metilo do ácido 2-{3-[2-(5-etil-piridin-2-il)--vinil]-lH-indazol-6-ilamino}-benzóico

1,2-Dimetoximetano (2 mL) foi adicionado a 6-clo-ro-3-[2-(5-etil-piridin-2-il)-vinil]-lH-indazole (130 mg; 0,354 mmol), tris(dibenzilidenoacetona)dipaládio (16 mg; 0,018 mmol), 2-(diciclo-hexilfosfino)bifenilo (25 mg; 0,071 mmol), K3PO4 (0,188 g; 0,885 mmol) e antranilato de metilo (0,092 mL; 0,71 mmol) . A reacção foi jorrada em vácuo com árgon (4x) e em seguida aquecida até 80 graus Celsius durante 19 horas. A reacção foi diluída com EtOAc (20 mL) e filtrada através de um tampão de gel de sílica. Após 78 ΡΕ1585743 lavagem com EtOAc (50 mL) e o solvente foi removido por evaporação rotativa. O óleo cru foi purificado por cromatografia (40 g de gel de sílica; EtOAc/hexanos 30-40%) para produzir o produto desejado 54 mg; 32%) .

Exemplo 2 (f) Ácido 2-{3-[2-(5-etil-piridin-2-il)-vinil]--lH-indazol-6-ilamino}-benzóico

A uma solução de éster de metilo do ácido 2—{3—[2-(5-etil-piridin-2-il)-vinil]-lH-indazol-6-ilamino}--benzóico (50 mg; 0,104 mmol) em metanol (0,42 mL) e THF (0,10 mL) foi adicionada uma solução de hidróxido de sódio (12 mg; 0,311 mmol) em água (0,05 mL). A solução foi aquecida a 60 graus Celsius durante 3,5 horas e em seguida neutralizada com NH4C1 saturado. A reacção foi diluída com água (20 mL) e em seguida extraída com EtOAc (2 x 20 mL) . Os extractos combinados foram primeiro secos sobre Na2S04 e em seguida os sólidos foram removidos por filtração. O produto desejado (48,7 mg; 100%) foi recuperado após evaporação rotativa para remover os solventes. 79 ΡΕ1585743

Exemplo de Referência 2 (g) 2-{3-[2-(5-Etil-piridin-2-il)-vinil]--lH-indazol-6-ilamino}-N-prop-2-inil-benzamida

A ácido 2—{3—[2-(5-etil-piridin-2-il)-vinil]-1H--indazol-6-ilamino}-benzóico (49 mg; 0,105 mmol) foram adicionados 2 mL de uma mistura 90:10:1 de CH2CI2:TFA:TES. A reacção foi agitada em refluxo durante 1 hora e em seguida diluida com tolueno (20 mL) . O solvente foi removido por evaporação rotativa para produzir um óleo espesso. O óleo foi dissolvido em DMF (1 mL) e a esta solução foi adicionada TEA (0,072 mL; 0,52 mmol), propargilamina (0,014 mL; 0,208 mmol) e HATU (59 mg; 0,156 mmol). A reacção foi agitada durante 3 horas e em seguida purificada por HPLC preparativa para produzir 0 produto desejado (29 mg; 66%). 1H-NMR (CDCl3-d) δ 9,83 (1H, s), 8,63 (2H, s) , 8,04 (2H, m) , 7,68 (2H, s) , 7,47 (1H, m), 7,32 (1H, d, J=l,51 Hz), 7,10 (1H, dd,

Jl=8,67 Hz, J2=l,88 Hz), 6,93 (1H, m), 6,07 (2H, dd,

Jl=5,09 Hz, J2=2,26 Hz), 3,15 (1H, t, J=2,35 Hz), 2,97 (2H, s), 2,74 (1H, s), 2,29 (1H, s), 1,27 (3H, t, J=7,44 Hz).

Anál. calca para C26H23N5O·0,3 H20*l,2 TFA: C-60,51; H-4,43; N-12,42. Encontrado: C-60,38; H-4,73; N-12,44. 80 ΡΕ1585743

Exemplo de Referência 2 (h) N-Ciclopropil-2-{3-[(E)-2-(4-metil-piridin-2-il)-vinil]--lH-indazol-6-ilamino}-benzamida

H

O composto mencionado em título foi preparado analogamente a 2—{3—[2-(5-etil-piridin-2-il)-vinil]-lH-in-dazol-6-ilamino}-N-prop-2-inil-benzamida descrito acima, substituindo 4-etil-2-metilpiridina por 2,4-dimetilpiridina no passo onde 1-(6-cloro-lH-indazole-3-il)-2-(5-etil-piri-din-2-il)-etanol foi preparado, e substituindo propar-gilamina por ciclopropilamina no passo final da sequência.

1H-NMR (DMSO-de) δ 9, 85 (1H, s), 8,56 (2 H, m) , 8,20 (3H, m) , 7, 53 (5H, m) , 7,35 (1H, s), 7 ,2 (1H, d, J= 6, 5 Hz) , 7,0 (1H, s), 2,83 (1H , m) , 0,70 (2H, m) , 0,56 (2 H, m) . ESIMS (M+H+) : 410,3.

Exemplo de Referência 3 (a) N-Metoxi-2-[3-((E)-2-piridin-2-il-vinil)--lH-indazol-6-ilamino]-benzamida

H

81 ΡΕ1585743

Uma solução de ácido 2-[3-(2-piridin-2-il-vinil)--lH-indazol-6-ilamino]-benzóico (50,0 mg; 0,084 mmol), hidrocloreto de O-metil-hidroxilamina (15 mg; 0,17 mmol), trietilamina (58 pL; 0,42 mmol), dissolvida em DMF (0,8 mL), foi tratada com HATU (48 mg; 0,13 mmol). A mistura foi agitada durante a noite e em seguida purificada por HPLC de inversão de fases produzindo 21,6 mg (67%) do composto mencionado em titulo na forma de um sólido amarelo. 1H-NMR (DMSO-d6) δ 9,23 (1H, s) , 8,71 (1H, d, J=2,2), 8,05 (4H, m), 7,51 (5H, m), 7,25 (1H, s), 7,10 (1H, d, J=7,7 Hz), 6,91 (1H, m), 5,98 (1H, m), 4,31 (1H, d,

J=14,3), 7,20 (1H, d, J=7,3) , 4,42 (2H, d, J= 3,2). ESIMS (M+H+) : 412,1.

Exemplo de Referência 3 (b) N-Aliloxi-2-[3-((E)-2-piridin-2-il-vinil)--lH-indazol-6-ilamino]-benzamida

H

Uma solução de ácido 2-[3-(2-piridin-2-il-vinil)--lH-indazol-6-ilamino]-benzóico (50,0 mg; 0,084 mmol), hidrocloreto de O-metil-hidroxilamina (18,3 mg; 0,17 mmol), trietilamina (58 pL; 0,42 mmol), dissolvida em DMF (0,8 mL), foi tratada com HATU (48 mg; 0,13 mmol). A mistura foi agitada durante a noite e em seguida purificada 82 ΡΕ1585743 por HPLC de inversão de fases produzindo 25,5 mg (74%) do composto mencionado em titulo na forma de um sólido amarelo. 1H-NMR (DMSO-d6) δ 9,28 (1H, s), 8,67 (2H, d, J=3,4) , 8,05 (4H, m), 7,48 (5H, m), 7,23 (1H, s), 7,04 (1H, d, J=7,6 Hz), 6,91 (1H, m) , 3,69 (3H, s) . ESIMS (M+H+) : 386,1.

Exemplo de Referência 3 (c) N-Isopropoxi-2-[3-((E)-2-piridin-2-il-vinil)--lH-indazol-6-ilamino]-benzamida

Uma solução de ácido 2-[3-(2-piridin-2-il-vinil)--lH-indazol-6-ilamino]-benzóico (50,0 mg; 0,084 mmol), hidrocloreto de O-isopropil-hidroxilamina (18,7 mg; 0,17 mmol), trietilamina (58 yL; 0,42 mmol), dissolvida em DMF (0,8 mL) , foi tratada com HATU (48 mg; 0,13 mmol). A mistura foi agitada durante a noite e em seguida purificada por HPLC de inversão de fases produzindo 17,4 mg (50%) do composto mencionado em titulo na forma de um sólido amarelo. 1H-NMR (DMSO-d6) δ 9,23 (1H, s) , 8,69 (H, d, J=2,l), 8,03 (4H, m) , 7,50 (5H, m), 7,23 (1H, s), 7,04 (1H, d, J=6,7 Hz), 6,92 (1H, m) , 5,98 (1H, m) , 4,13 (1H, m) , 1,29 (6H, d, J=8,1) . ESIMS (M+H+) : 414,1. 83 ΡΕ1585743

Exemplo de Referência 3 (d) N-Ciclopropil-2-[3-((E)-2-piridin-2-il-vinil)--lH-indazol-6-ilamino]-benzamida

H

Uma solução de ácido 2-[3-(2-piridin-2-il-vinil)--lH-indazol-6-ilamino]-benzóico (50,0 mg; 0,084 mmol), ciclopropilamina (11,6 yg; 0,17 mmol), trietilamina (58 yL; 0,25 mmol), dissolvida em DMF (0,8 mL), foi tratada com HATU (48 mg; 0,13 mmol). A mistura foi agitada durante a noite e em seguida purificada por HPLC de inversão de fases produzindo 11,7 mg (35%) do composto mencionado em titulo na forma de um sólido amarelo. ^-NMR (DMSO-dê) δ 9,81 (1H, s), 8,68 (1H, d, J=l, 7) , 8,51 (1H, s) , 8,01 (4H, m) , 7,50 (5H, m), 7,24 (1H, s) , 7,03 (1H, d, J=5,3), 6,89 (1H, t, J=4,2) , 2,84 (1H, m) , 0,72 (2H, m) , 0,56 (2H, m) . ESIMS (M+H+) : 396, 1.

Exemplo de Referência 3 (f) Ν' - (1 — {2 —[3-((E)-2-piridin-2-il-vinil)-lH-indazol--6-ilamino]-fenil}-metanoil)hidrazida do ácido l-metil-lH-pirrole-2-carboxílico

84 ΡΕ1585743

Uma solução de ácido 2-[3-(2-piridin-2-il-vinil)--lH-indazol-6-ilamino]-benzóico (50,0 mg; 0,084 mmol), hidrazida do ácido l-metil-lH-pirrole-2-carboxílico (23,3 mg; 0,17 mmol), trietilamina (58 pL; 0,42 mmol), dissolvida em DMF (0,8 mL), foi tratada com HATU (48 mg; 0,13 mmol). A mistura foi agitada durante a noite e em seguida purificada por HPLC de inversão de fases produzindo 16,1 mg (40%) do composto mencionado em titulo na forma de um sólido amarelo. 1H-NMR (DMSO-d6) δ 10,39 (1H, s) , 10,00 (1H, s), 9,52 (1H, s), 8,67 (1H, d, J=2,4), 8,07 (4H, m) , 7,77 (1H, d, J= 5,2), 7,51 (4H, m) , 7,32 (1H, s) , 7,09 (1H, d, J=6,3), 6,98 (3H, m) , 6,13 (1H, m), 3,87 (3H, s) . ESIMS (M+H+) : 478,1.

Exemplo de Referência 3 (g) N-Benzil-2-[3-((E)-2-piridin-2-il-vinil)--lH-indazol-6-ilamino]-benzamida

Uma solução de ácido 2-[3-(2-piridin-2-il-vinil)--lH-indazol-6-ilamino]-benzóico (50,0 mg; 0,084 mmol), benzilamina (18,2 pL; 0,17 mmol), trietilamina (58 pL; 0,42 mmol), dissolvida em DMF (0,8 mL) , foi tratada com HATU (48 mg; 0,13 mmol). A mistura foi agitada durante a 85 ΡΕ1585743 noite e em seguida purificada por HPLC de inversão de fases produzindo 45,2 mg (76%) do composto mencionado em titulo

na forma de um sal de TFA (1,5 H2O, 2,1 TFA, MM efectiva=711,98. 1H-NMR (DMSO-cU δ 9,86 (1H, s), 9,14 (1H, t, J=5,4) , 8,73 (1H, d, J=4,8) , 8,29 (4H, m) , 7,56 (1H, d,

J=7,0), 7,74 (2H, m), 7,89 (2H, m), 7,31 (5H, m) , 7,16 (1H, d, J=7,8), 6,93 (1H, t, J=7,3) , 4,46 (2H, d, J=6,l). ESIMS (M+H+) : 446, 5.

Exemplo de Referência 3 (h) N- (2-Metoxibenzil)-2-[3-((E)-2-piridin-2-il-vinil)--lH-indazol-6-ilamino]-benzamida

Uma solução de ácido 2-[3-(2-piridin-2-il-vinil)--lH-indazol-6-ilamino]-benzóico (50,0 mg; 0,084 mmol), o-metoxibenzilamina (21,8 pL; 0,17 mmol), trietilamina (58 pL; 0,42 mmol), dissolvida em DMF (0,8 mL), foi tratada com HATU (48 mg; 0,13 mmol). A mistura foi agitada durante a noite e em seguida purificada por HPLC de inversão de fases produzindo 46 mg (81%) do composto mencionado em titulo na forma de um sal de TFA (1,5 H20, 1,5 TFA, MM efectiva=673, 59. 1H-NMR (DMSO-d6) δ 9,83 (1H, s) , 9,03 (1H, t, J=3,4), 8,70 (1H, d, J=3,7), 8,08 (4H, m), 7,82 (1H, d, J=7,4), 7,49 (4H, m), 7,21 (3H, m), 6,96 (4H, m), 4,48 (2H, d, J= 6,3). ESIMS (M+H+) : 476,1. 86 ΡΕ1585743

Exemplo de Referência 3 (i) N-Furan-2-ilmetil)-2-[3-((E)-2-piridin-2-il-vinil)--lH-indazol-6-ilamino]-benzamida

Uma solução de ácido 2-[3-(2-piridin-2-il-vinil)--lH-indazol-6-ilamino]-benzóico (50,0 mg; 0,084 mmol), C-furan-2-il-metilamina (19 pL; 0,17 mmol), trietilamina (58 pL; 0,42 mmol), dissolvida em DMF (0,8 mL), foi tratada com HATU (48 mg; 0,13 mmol). A mistura foi agitada durante a noite e em seguida purificada por HPLC de inversão de fases produzindo 45 mg (85%) do composto mencionado em

titulo na forma de um sal de TFA (1,5 H20, 1,5 TFA, MM efectiva=633, 52. 1H-NMR (DMSO-cfe) δ 9,82 (1H, s) , 9,05 (1H, t, J= 2,6), 8,73 (1H, d, J=3,7), 8,13 (4H, m) , 7,73 (1H, d, J= 6,8), 7,57 (2H, m) , 7,26 (1H, s) , 7,03 (1H, d, J=7,5),

6,40 (1H, m), 6,28 (1H, m) , 4,48 (2H, d, J=6,5). ESIMS (M+H+) : 436, 1.

Exemplo de Referência 3 (j) N-Ciclobutil-2-[3-((E)-2-piridin-2-il-vinil)- -lH-indazol-6-ilamino]-benzamida

H 87 ΡΕ1585743

Uma solução de ácido 2-[3-(2-piridin-2-il-vinil)--lH-indazol-6-ilamino]-benzóico (50,0 mg; 0,084 mmol), C-furan-2-il-metilamina (18,2 pL; 0,17 mmol), trietilamina (58 pL; 0,42 mmol), dissolvida em DMF (0,8 mL), foi tratada com HATU (48 mg; 0,13 mmol). A mistura foi agitada durante a noite e em seguida purificada por HPLC de inversão de fases produzindo 43,2 mg (92%) do composto mencionado em titulo na forma de um sal de TFA (1,5 H2O, 1,1 TFA, MM efectiva=561, 92. 1H-NMR (DMSO-d6) δ 9,78 (1H, s) , 8,72 (2H, m), 8,13 (4H, m) , 7,70 (1H, d, J=7,l), 7,58 (2H, m) , 7,41 (2H, m) , 7,27 (1H, s) , 6,89 (1H, t, J=4,2), 2,84 (1H, m) , 0,72 (2H, m) , 0,56 (2H, m) . ESIMS (M+H+) : 396, 1.

Exemplo de Referência 3 (k) N-(2-Metil-alil)-2-[3-((E)-2-piridin-2-il-vinil)--lH-indazol-6-ilamino]-benzamida

Uma solução de ácido 2-[3-(2-piridin-2-il-vinil)--lH-indazol-6-ilamino]-benzóico (50,0 mg; 0,084 mmol), 2-metil-alilamina (16,4 pL; 0,17 mmol), trietilamina (58 pL; 0,42 mmol), dissolvida em DMF (0,8 mL), foi tratada com HATU (48 mg; 0,13 mmol). A mistura foi agitada durante a noite e em seguida purificada por HPLC de inversão de 88 ΡΕ1585743

fases produzindo 45 mg (91%) do composto mencionado em titulo na forma de um sal de TFA (1,6 H20, 1,3 TFA, MM efectiva=586, 53. 1H-NMR (DMSO-d6) δ 9,78 (1H, s) , 8,72 (2H, m) , 8,13 (4H, m) , 7,70 (1H, d, J=7,l), 7,58 (2H, m) , 7,41 (2H, m) , 7,27 (1H, s) , 7,06 (1H, d, J=7,l), 6,91 (1H, t, J=7,5) , 4,42 (1H, m), 2,22 (2H, m), 2,08 (2H, m), 1,68 (2H, m) . ESIMS (M+H+) : 410,1.

Exemplo 3 (1) 6-Nitro-3-piridin-2-iletinil--1-(2-trimetilsilanil-etoximetil)-lH-indazole

Uma mistura de 3-iodo-6-nitro-l-(2-trimetilsilanil-etoximetil) -lH-indazole (838 mg; 2,0 mmol), 2-etinilpi-ridina (242 pL; 2,4 mmol) e trietilamina (6,0 mL) foi desgaseada e jorrada com árgon e em seguida tratada com Cul (8 mg; 0,042 mol) e PD(PPh3)2Cl2 (16 mg; 0,023 mmol). A mistura resultante foi agitada à temperatura ambiente durante a noite, momento em que HPLC indicou ter sido consumido todo o material de partida. A mistura foi purificada por vaporização dos voláteis sob alto vácuo, passando em seguida por um tampão de sílica eluída com acetato de etilo. O produto resultante foi usado no passo seguinte sem demais purificação. ESIMS (M+H+) : 395, 1. 89 ΡΕ1585743

Exemplo 3 (m) 3-Piridin-2-iletinil-l-(2-trimetilsilanil-etoximetil)--lH-indazol-6-ilamina

Uma mistura de 6-nitro-3-piridin-2-iletinil-l-(2--trimetilsilanil-etoximetil)-lH-indazole (2 mmol), SnCl2 (1,37 g; 6,0 mmol), água (0,5 mL) e MeOH (10 mL) foi agitada a 60 °C em banho de óleo durante 30 min, momento em que HPLC indicou estar completa a redução. A mistura resultante foi livre do metanol por vaporização, suspensa em EtOAc (50 mL) e diluída com NaOH 1 M (18 mL). A emulsão resultante foi suavemente extraída com EtOAc (10 x 25 mL) . Os orgânicos combinados foram extraídos com Na2C03 1 M e água salgada, secos sobre MgS04, concentrados e filtrados através de uma almofada de sílica eluída com EtOAc. O rendimento do produto cru para os dois passos foi de 701 mg, recuperação de massa de 96%. ESIMS (M+H+) : 365, 1.

Exemplo 3 (n) Éster de metilo do ácido 2-[3-piridin-2-iletinil-l-(2-tri-metilsilanil-etoximetil)-lH-indazol-6-ilamino]-benzóico

90 ΡΕ1585743

Uma mistura de 3-piridin-2-iletinil-l-(2-trime-tilsilanil-etoximetil)-lH-indazol-6-ilamina (560 mg; 1,54 mmol), benzoato de 2-bromometilo (647,5 pL; 4,61 mmol), bifenil-2-il-diciclo-hexil-fosfano (107,8 mg; 0,308 mmol), Pd2(dba)3 (70,5 mg; 0,0768 mmol), K3P04 (816 mg; 3,844 mmol) e dimetoxietano (1,7 mL) foi jorrada em vácuo com azoto e em seguida aquecida num banho de óleo a 70 °C durante 24 h. A mistura preta foi diluída com cloreto de metileno e filtrada, concentrada e cromatografada (acetato de etilo 20% a 40%/hexanos) . O rendimento de do óleo amarelo/laranja foi de 260 mg, 35% para os três passos.

Exemplo 3 (o) Ácido 2-[3-piridin-2-iletinil-l-(2-trimetilsilanil--etoximetil)-lH-indazol-6-ilamino]-benzóico

Éster de metilo do ácido 2-[3-piridin-2-iletinil--1-(2-trimetilsilanil-etoximetil)-lH-indazol-6-ilamino]--benzóico (253 mg; 0,517 mmol) foi adicionado a uma solução de NaOH (62 mg; 1,55 mmol), dissolvido em THF (1,0 mL) , MeOH (2,25 mL) e água (0,5 mL) . A reacção foi agitada à 91 ΡΕ1585743 temperatura ambiente durante 1 h, momento em que HPLC indicou ter sido consumido todo o material de partida. A reacção foi neutralizada com HC1 1 N e extraída com acetato de etilo, o qual foi em seguida lavado com água salgada e seco com MgSC>4. Após concentração sob vácuo, 249 mg de sólido amarelo foi obtido (recuperação de massa de 99%) . Este material foi usado sem demais purificação. ESIMS (M-H~) : 483, 0.

Exemplo 3 (p) Ácido 2- [3-piridin-2-iletinil-lH-indazol-6-ilamino]-benzóico

Uma solução de ácido 2-[3-piridin-2-iletinil-l--(2-trimetilsilanil-etoximetil)-lH-indazol-6-ilamino]-benzóico (231 mg; 0,477 mmol), fluoreto de tetrabutilamónio 1 M em THF (3,8 mL; 3,816 mmol) e etilenodiamina (127 pL; 1, 908 mmol) foi agitada num banho de óleo a 80 °C durante 6 h. A reacção foi extinta com ácido acético (218 pL; 3,816 mmol), diluída com água e extraída com EtOAc (10 x 50 mL) . Os orgânicos combinados foram lavados com água salgada e secos com MgS04. Após concentração formou-se um sólido que foi triturado com CH2CI2, dando o produto na forma de um pó amarelo (124 mg; 73%) . ESIMS (M-H“) : 353,0. ΡΕ1585743 92

Exemplo de Referência 3 (q) N-Prop-2-inil-2-[3-((E)-2-piridin-2-ilvinil)- -lH-indazol-6-ilamino]-benzamida

Uma solução de ácido 2-(3-piridin-2-ileti-nil-lH-indazol-6-ilamino)-benzóico (41 mg; 0,117 mmol), propargilamina (24 pL; 0,35 mL), trietilamina (81 pL; 0,58 mmol), dissolvida em DMF (0,5 mL) foi tratada com HATU 89 mg; 0,233 mmol). A mistura foi agitada durante a noite, e em seguida purificada por HPLC de inversão de fases produzindo (59%) do composto mencionado em titulo na forma de um sólido amarelo. 1H-NMR (DMSO-cU δ 9,78 (1H, s), 8,99 (1H, m) , 8,61 (1H, d, J=2,l), 7,88 (1H, s) , 7,72 (3H, m) , 7,43 (4H, m), 7,29 (1H, s) , 7,04 (1H, d, J=7,3), 6,91 (1H, t, J=5,2), 4,04 (2H, s), 3,04 (1H, s). ESIMS (M+H+) : 392, 1.

Exemplo 4 (a) 2-Bromo-4,6-dimetil-piridina

Uma solução de HBr (aq) 48% (Aldrich; 65 mL; 93 ΡΕ1585743 1,2 mol; 10 eq) foi arrefecida até -5 °C e tratada com 4,6-dimetil-piridin-2-ilamina (Aldrich; 15,0 g; 0,12 mol; 1,0 eq). A mistura de sal branco espesso foi agitada com um agitador mecânico enquanto bromo (Aldrich; 19,7 mL; 0,38 mol; 3,1 eq) foi adicionado gota a gota. A mistura vermelha resultante foi tratada com uma solução aquosa (32 mL H20) de NaN02 (Aldrich; 22,1 g; 0,32 mol; 2,6 eq) ao longo de uma hora. A temperatura foi mantida abaixo de 5 °C durante a adição do nitrito e em seguida gradualmente aquecida até 20 C ao longo de 2 horas. A mistura reaccional foi ajustada até pH 14 com NaOH (aq) e extraída com MTBE. Os extractos orgânicos foram lavados com água, água salgada, secos sobre sulfato de magnésio, filtrados e concentrados sob pressão reduzida. O produto cru (29 g de um óleo vermelho) foi purificado por cromatografia flash (sílica, 350 g) e eluído com acetato de etilo 2-7%/ciclo--hexano, o que deu um óleo laranja (11,0 g; 48%). 1H-NMR (DMSO-d6, 300 MHz) δ 7,30 (1H, s) , 7,13 (1H, s) , 2,39 (3H, s), 2,26 (3H, s) . 13C-NMR (DMSO-de, 75 MHz) δ 159,4, 151,3, 140,9, 125,7, 124,0, 23,7, 20,3. ESI m/z 186/188 (M+H)\

Exemplo 4 (b) 3-[2-(4,6-Dimetil-piridin-2-il)-vinil]-6-nitro--1-(tetra-hidro-piran-2-il)-lH-indazole

94 ΡΕ1585743

Uma suspensão de 2-bromo-4,6-dimetilpiridina (2,42 g; 8,67 mmol), acetato de paládio (0,145 g; 0,65 mmol), tri-orto-tolilfosfina (0,791 g; 2,6 mmol) e diisopropiletilamina (2,4 mL; 13,8 mol) em DMF aquosa (85%; 34,5 mL) foi desgaseada com árgon borbulhando durante 5 minutos seguido por tratamento com ultra-sons durante 5 minutos antes de aquecimento em aparelho de microondas (300 W; potência 10%) a 110 °C durante 40 minutos. Após arrefecimento, a mistura foi gotejada para dentro de água fria. O precipitado amarelo resultante foi recolhido por filtração. Os sólidos foram dissolvidos em acetato de etilo, secos (sulfato de sódio) e concentrados sob pressão reduzida. O resíduo foi purificado sobre gel de sílica usando um gradiente de acetato de etilo 0 a 20% numa mistura de clorofórmio e hexanos (1:1) como eluente. O produto da cromatografia foi triturado com MTBE/hexanos para se obter um produto limpo na forma de sólido amarelo. A água-mãe foi repurificada de uma maneira semelhante sobre gel de sílica seguido por trituração para se obter mais produto limpo com um rendimento de 68%. 1H-NMR (CDCI3) δ 8.54 (1H, s), 8,15 (1H, d, J=9,4 Hz), 8,08 (1H, dd, J=9,04, 1,9 Hz), 7,87 (1H, d, J=16,6 Hz), 7,55 (1H, d, J=16,6 Hz), 7,14 (1H, s), 6,90 (1H, s) , 5,82 (1H, dd, J=9,0, 3,0 Hz), 4,08-4,01 (1H, m) , 3, 84-3,76 (1H, m) , 2,56 (3H, s), 2,62- 2.54 (1H, m) , 2,34 (3H, s) , 2,24-2,10 (2H, m) , 1,88-1,68 (3H, m) . 95 ΡΕ1585743

Exemplo 5 3-[2-(4,6-Dimetil-piridin-2-il)-vinil]--1-(tetra-hidro-piran-2-il)-lH-indazol-6-ilamina

Uma suspensão de 3-[2-(4,6-dimetil-piridin-2-il)--vinil]-6-nitro-l-(tetra-hidro-piran-2-il)-lH-indazole (4,22 g; 11,16 mmol), ferro em pó (2,71 g; 48,51 mmol) e NH4CI aq. sat. (25 mL) em 25 mL de etanol foi aquecida a 45 °C durante 18 h. A reacção foi arrefecida e filtrada através de papel de filtro lavando com metanol. Os solventes foram removidos sob pressão reduzida e a camada aquosa foi extraída com EtOAc (2x) . As camadas orgânicas combinadas foram lavadas cpm água salgada, secas (MgS04) e concentradas sob pressão reduzida para darem 4,02 g (quantitativo) de um sólido cor de ferrugem e foi usado sem demais purificação. 1H-NMR (DMSO-cy δ 7,79 (1H, s), 7,74 (1H, d, J=16,4 Hz), 7,35 (1H, d, J=16,4 Hz), 7,29 (1H, s), 6,96 (1H, s), 6,63 (2H, m) , 5,57 (1H, dd, J=2,4, 9,5 Hz), 5,44 (2H, s largo), 3,88 (1H, m) , 3,67 (1H, m) , 2,45 (3H, s), 2,37 (1H, m), 2,29 (3H, s), 1,99 (2H, m), 1,73 (1H, m), 1,57 (2H, m). 96 ΡΕ1585743

Exemplo 6 Éster de metilo do ácido 2-{3-[2-(4,6-dimetil-piridin-2-il)-vinil]--1-(tetra-hidro-piran-2-il)-lH-indazol-6-ilamino}-benzóico

Uma suspensão agitada de 3-[2-(4,6-dimetil-piri-din-2-il)-vinil]-1-(tetra-hidro-piran-2-il)-lH-indazol-6--ilamina (870 mg; 2,5 mmol), éster de metilo do ácido 2-bromo-benzóico (0,44 mL; 3,12 mmol), R-BINAP (78 g; 0,125 mmol), Pd2(dba)3 (29 mg; 0,03 mmol) e carbonato de césio (1,22 g; 3,75 mmol) em tolueno (6 mL) foi desgaseada e aquecida a 100 °C durante 18 h. A mistura reaccional foi arrefecida, vertida em NaHCCu sat. e extraída com EtOAc (2x) . As camadas orgânicas combinadas foram lavadas com água salgada, secas (MgS04) e concentradas sob pressão reduzida. O resíduo foi sujeito a cromatografia flash sobre gel de sílica eluindo um gradiente de EtOAc 5-10% em CH2CI2 para dar 964 g (80%) de uma espuma amarela. 1H-NMR (DMSO-de) δ 9,49 (1H, s) , 8,13 (1H, d, J= 8,7 Hz), 7,94 (1H, dd, J=1,5, 8,0 Hz), 7,85 (1H, d, J=16,4 Hz), 7,58 (1H, d, J=1,5 Hz), 7,48 (1H, d, J=16,4 Hz), 7,47 (1H, m), 7,37 (1H, d, J=7,7 Hz), 7,34 (1H, s) , 7,19 (1H, dd, J=l,7, 8,7 Hz), 97 ΡΕ1585743 6,99 (1Η, s), 6,89 (1H, t, J=8,l Hz), 5,83 (1H, d, J=7,2 Hz), 3,88 (3H, s), 3,75 (1H, m) , 2,48 (3H, s) , 2,41 (2H, m) , 2,31 (3H, s) , 2,02 (2H, m) , 1,75 (1H, m) , 1,59 (2H, m) . Anál. calca para C29H30N4O30,15 EtOAc: C-71,71; H-6,34; N-11,30. Encontrado: C-71,60; H-6,14; N-11,37.

Exemplo 7 Ácido 2-{3-[2-(4,6-dimetil-piridin-2-il)-vinil]--1-(tetra-hidro-piran-2-il)-lH-indazol-6-ilamino}-benzóico

A uma solução agitada de éster de metilo do ácido 2-{3-[2-(4,6-dimetil-piridin-2-il)-vinil]-1-(tetra-hidro-piran-2-il)-lií-indazol-6-ilamino}-benzóico (1,98 g; 4,11 mmol) em THF:MeOH (12 mL; 3:1) foi adicionado hidróxido de potássio (1,15 g; 20,5 mmol) dissolvido em H20 (3 mL). A reacção foi aquecida a 70 °C durante 2 h, arrefecida, concentrada sob pressão reduzida até cerca de 5 mL e diluída com mais água. A solução foi neutralizada com HC1 2 N e o precipitado foi recolhido por filtração e lavado com água para dar 2,00 g (quantitativo) de um sólido amarelo brilhante. 1H-NMR (DMSO-d6) δ 13,12 (1H, s largo), 98 ΡΕ1585743 9,82 (1Η, s), 8,13 (1H, d, J=8,7 Hz), 7,95 (1H, dd, J=l,5, 8,0 Hz), 7,89 (1H, d, J=16,4 Hz), 7,60 (1H, s) , 7,50 (1H, d, J=16,4 Hz), 7,46 (1H, d, J= 6,9 Hz), 7,37 (1H, d, J=7,7

Hz), 7,20 (1H, d, J=8,7 Hz), 7,06 (1H, s) , 6,86 (1H, t, J=6,9 Hz), 5,85 (1H, d, J=7,3 Hz), 3,82 (2H, m), 2,50 (3H, s, obscurecido por DMSO), 2,48 (2H, m), 2,34 (3H, s), 2,03 (2H, m) , 1,76 (1H, m) , 1,59 (2H, m) . Anál. calca para C28H28N4O30,5 KOH: C-67,72; H-5,79; N-11,28. Encontrado: C-67,65; H-5,88; N-11,07.

Exemplo 8 p-Toluenossulfonato do ácido 2-{3-[2-(4,6-dimetil--piridin-2-il)-vinil]-lH-indazol-6-ilamino}-benzóico

Uma mistura de ácido 2—{3—[2-(4,6-dimetil-piri-din-2-il) -vinil] -1- (tetra-hidro-piran-2-il) -liJ-indazol-6--ilamino}-benzóico (2 mmol) e ácido p-toluenossulfónico (10 mmol) em metanol aquoso (90%; 20 mL) foi agitada a 70 °C durante 18 h. Após arrefecimento, a lama amarela espessa resultante foi filtrada e os sólidos lavados com metanol para darem o ácido 2—{3— [2-(4,6-dimetil-piridin-2--il) -vinil]-lfí-indazol-6-ilamino}-benzóico na forma do sal tosilato com rendimento de 85% na forma de um sólido 99 ΡΕ1585743 amarelo pálido. 1H-NMR (DMSO-de) δ 13,43 (1H, s) , 9,78 (1H, s), 8,24-8,19 (2 H, m) , 8,09 (1H, d, J=9,04 Hz), 7,95 (1H, dd, J= 7,9, 1,1 Hz), 7,62-7,55 (2H, m) , 7, 49-7,38 (5H, m) , 7,20 (1H, dd, J= 9,0, 1,9 Hz ), 7,09 (2H, d, J= 8,3 Hz), 6,86 (1H, dt, J= 7,9, 1,1 Hz), 2,67 (3H, s) , 2,54 (3H, s) , 2,27 (3H, s) .

Exemplo 9 N-[4-(terc-Butil-dimetil-silaniloxi)-but-2-inil--2-{3-[2-(4,6-dimetil-piridin-2-il)-vinil]--1-(tetra-hidro-piran-2-il)-lfí-indazol-6-ilamino}-benzamida

Preparado de uma maneira semelhante à descrita para o Exemplo 33(a) Passo (v), no Pedido de Patente dos E.U.A. com o N° de Série 09/609 335, apresentado em 30 de Junho de 2000, excepto usando 4-(terc-butil-dimetil-sila-noxi)-but-2-inilamina e ácido 2 — {3—[2-(4, 6-dimetil-piri-din-2-il)-vinil]-1-(tetra-hidro-piran-2-il)-lH-indazol-6-ilamino} -benzóico. 1H-NMR (DMSO-de) δ 9,56 (1H, s) , 9,01 (1H, t, J= 5,7 Hz), 8,06 (1H, d, J= 8,7 Hz), 7,81 (1H, d, J=16,4 Hz), 7,66 (1H, d, J=7,5 Hz), 7,41 (4H, m), 7,32 (1H, s), 7,09 (1H, dd, J=l,8, 8,7 Hz), 6,98 (1H, s) , 6,89 (1H, t, J=8,0 Hz), 5,79 (1H, dd, J=2,4, 9,2 Hz), 4,28 (2H, s) , 100 ΡΕ1585743 4,09 (2H, m), 3, 86 (1H, m) , 3,72 (1H, m) , 2,46 (3H, 2,42 (1H, m), 2,30 (3H, s), 2,08 (2 H, m) , 1,74 (1H, 1,57 (2H, m), 0,80 (9H, s), 0,03 ( 6H, s) . Anál. calca C38H47N5O3S1 ·0,7 Η20: C—68,89; Η-7,36; Ν-10,57. Encontrado: C-68,99; Η-7,36; Ν-10,21.

Exemplo 10 2-{3-[(Ε)-2-(4,6-Dimetil-piridin-2-il)-vinil]--lfí-indazol-6-ilamino}-N-(4-hidroxi-but-2-inil)-benzamida

Uma solução agitada de N-[4-(terc-butil-dimetil--silaniloxi)-but-2-inil-2-{3-[2-(4,6-dimetil-piridin-2-il)--vinil]-1-(tetra-hidro-piran-2-il)-líf-indazol-6-ilamino}--benzamida (737 mg; 1,13 mmol) e ácido p-toluenossulfónico (8,2 mL; 12% em HOAc) foi aquecida a 70 °C durante 2 h. A reacção foi arrefecida e cuidadosamente vertida em NaHCC>3 sat. e extraída com EtOAc (2x). As camadas orgânicas combinadas foram lavadas com água salgada (2x), secas (MgSCt) e concentradas sob pressão reduzida. O resíduo foi sujeito a cromatografia flash sobre gel de sílica eluindo com CH2CI2: EtOAc:MeOH (1:1:0,1) para dar 225 mg (44%) de um sólido branco. 1H-NMR (DMSO-dg) δ 12,91 (1H, s) , 9,84 (s, 1H) , 9,01 (1H, t, J=5, 3 Hz), 8,07 (1H, d, J=8,7 Hz), 7,84 (1H, d, J=16,4 Hz), 7,70 (1H, d, J=7,2 Hz), 7,43 (3H, m) , 101 ΡΕ1585743 7,31 (1H, s), 7,26 (1H, s), 7,02 (1H, dd, J=l, 6, 8,7 Hz), 6, 97 (1H, s), 6,89 (1H, t, J= 6,7 Hz), 5,12 (1H, t, J=5, 8 Hz) , 4,10 (2H, - d, J= 5, 3 Hz), 4,07 (2H, d, J=5,8 Hz), 2,47 (3H, s) , 2,31 (3H, s) . Anál. calca para 027Η25Ν502·1,3 - H20: C-68, 80; H-5, 82; N-14, 86. Encontrado: C-68,72; H- 5,81; N-14, 65.

Exemplo 11 4-(terc-Butil-dimetil-silaniloxi)-but-2-inilamina

A uma solução agitada arrefecida em gelo do 4-(terc-butil-dimetil-silaniloxi)-but-2-in-l-ol conhecido (3,14 g; 15,7 mmol) em THF (50 mL) foi adicionado DBU (2,6 mL; 17,4 mmol) e DPPA (3,8 mL; 17,6 mmol). A solução foi aquecida até à temperatura ambiente e agitada sob uma atmosfera inerte durante a noite. A reacção foi vertida em NaHC03 sat. e as camadas foram separadas. A camada aquosa foi re-extraida com EtOAc (2x) e as camadas orgânicas combinadas foram secas (Na2S04) e concentradas em vácuo. Trifenilfosfina (4,61 g; 17,6 mmol) foi adicionada a este azoteto cru dissolvido em THF (50 mL) , seguido por adição de H2O (0,44 mL) . A solução resultante foi agitada à temperatura ambiente durante a noite, concentrada sob pressão reduzida e o residuo fez uma lama numa mistura 1:1 de Et20/éter pet. Os sólidos foram removidos e o filtrado 102 ΡΕ1585743 foi concentrado e purificado por cromatografia flash sobre gel de sílica eluindo com CH2Cl2/MeOH (19:1) para dar um óleo âmbar. 1H-NMR (CDC13) δ 4,19 (2H, t, J=l,9 Hz), 3,33 (2 H, t, J=1,9 Hz), 0,79 (9H, s) , 0,00 (6H, s)

Exemplo 12 2-{3-[2- (4,6-Dimetil-piridin-2-il)-vinil]-1-(tetra-hidro--piran-2-il)-lH-indazol-6-ilamino}-N-prop-2-inil-benzamida

Preparado de uma maneira semelhante à descrita para o Exemplo 6 acima, excepto usando ácido 2—{3—[2-(4,6--dimetil-piridin-2-il)-vinil]-1-(tetra-hidro-piran-2-il)--lH-indazol-6-ilamino}-benzóico e propargilamina. 1H-NMR (DMSO ~d6) δ 9,87 (1H , s) , 9,04 (1H , t, J= 5,8 Hz) , 8,08 (1H, d, J= 8,7 Hz) , 7,83 (1H, d, J= =16, 4 Hz) , 7,69 (1H, d, J=7,5 Hz) , 7,44 (4H, m) , 7,34 (1H, s) , 7,12 (1H, dd, J-- -1,7, 8,7 Hz) , 6,99 (1H, s) , 6, 91 (1H, t, J= 5, 8 Hz) , 5, 81 (1H, dd, J=2,4 , 9,; 2 Hz), , 4,07 (2 H, . dd, J= 2, 5, 5, 7 Hz) , 3,88 (1H, m) , 3, 74 (1H, m) , 3,12 (1H, t, J-- =2,5 Hz) , 2,48 (3H, s) , 2,43 (1H, m) , 2,31 (3 H, s) , 2,01 (2H, m) , 1, 74 (1H, m) , 1,58 (2 H, m) . Anál. calca para C3iH3iN502 · 1,1 Η2Ο·0,3 TBME : C-70,73; H-6,72; N-12,69. Encontrado: C-70,56; H-6,45; N-12,49. 103 ΡΕ1585743

Exemplo de Referência 13 N-(Prop-2-inil)-2-{3-[(E)-2-(2,4-dimetil-piridin-2-il)--vinil]-lH-indazol-6-ilamino}-benzamida

Preparado de uma maneira semelhante à descrita para o Exemplo 7, excepto usando N- (3-ciclopropil-prop-2--inil)—2 — {3—[2-(4,6-dimetil-piridin-2-il)-vinil]-1-(tetra--hidro-piran-2-il)-lH-indazol-6-ilamino}-benzamida em vez de N-[4-(terc-butil-dimetil-silanoxi)-but-2-inil)—2—{3—[2— - (4, 6-dimetil-piridin-2-il)-vinil]-1-(tetra-hidro-piran-2--il)-lfí-indazol-6-ilamino}-benzamida. 1H-NMR (DMSO-d6) δ 12,90 (1H, s), 9,78 (1H, s) , 9,01 (1H, t, J=5,3 Hz), 8,06 (1H, d, J= 8,3 Hz), 7,84 (1H, d, J=16,2 Hz), 7,68 (1H, dd, J= 7,9, 1,1 Hz), 7,45-7,36 (3H, m) , 7,30 (1H, s) , 7,25 (1H, d, J=1,5 Hz), 7,01 (1H, dd, J=8,7, 1,9 Hz), 6,96 (1H, s) , 6,88 (1H, dt, J=6,8, 1,9 Hz), 4,04 (2H, dd, J=5,6, 2,6 Hz), 3,11 (1H, t, J= 2,6 Hz), 2,46 (3H, s) , 2,29 (3H, s) .

Exemplo 14 2-{3-[2-(4,6-Dimetil-piridin-2-il)-vinil]-1-(tetra-hidro--piran-2-il) -lH-indazol-6-ilamino}-N- (2-metil-alil) -benzamida

104 ΡΕ1585743

Preparado de uma maneira semelhante à descrita para o Exemplo 6 acima, excepto usando ácido 2—{3—[2—(4,6— -dimetil-piridin-2-il)-vinil]-1-(tetra-hidro-piran-2-il)--lH-indazol-6-ilamino}-benzóico e 2-metil-alilamina. 1H-NMR (DMSO-dg) δ 9,87 (1H, s) , 8,82 (1H, t, J=5,8 Hz), 8,07 (1H, d, J=8,7 Hz), 7,82 (1H, d, J=16,4 Hz), 7,74 (1H, d, J=7,3

Hz), 7,43 (4 H, m), 7,33 (1H, s) , 7,10 (1H, d, J=8,7 Hz), 6,99 (1H, s), 6,92 (1H, t, J= 7,8 Hz), 5,80 (1H, dd, J= 2,2, 9,2 Hz), 4,83 (2H, d, J=ll,8 Hz), 3,83 (4H, m) , 2,47 (3H, s), 2,44 (1H, m), 2,31 (3H, s), 2,00 (2H, m), 1,75 (1H, m), 1,73 (3H, s), 1,58 (2H, m). Anál. calca para C32H35N5O2*1,09 H20: C-71,00; H-6,92; N-12,94. Encontrado: C-71,40; H-6,89; N-12,54.

Exemplo de Referência 15 2-{3-[2-(4,6-dimetil-piridin-2-il) --vinil]-lH-indazol-6-ilamino}-N-(2-metil-alil)-benzamida

Preparado de uma maneira semelhante à descrita para o Exemplo 7, excepto usando N-(2-metil-alil)—2 — {3—[2--(4,6-dimetil-piridin-2-il)-vinil]-1-(tetra-hidro-piran-2--il)-l/í-indazol-6-ilamino}-benzamida em vez de N-[4- (terc- 105 ΡΕ1585743 -butil-dimetil-silanoxi)-but-2-inil)—2—{3—[2—(4,6-dimetil--piridin-2-il)-vinil]-1-(tetra-hidro-piran-2-il)-lH-inda-zol-6-ilamino}-benzamida. 1H-NMR (DMSO-dg) δ 12,89 (1H, s), 9,75 (1H, s), 8,79 (1H, t, J=5,6 Hz), 8,05 (1H, d, J=8,7

Hz), 7,85 (1H, d, J=16,2 Hz), 7,74 (1H, d, J=7,9 Hz), 7,45- 7,33 (4H, m), 7,23 (1H, d, J=l,5 Hz), 7,00-6, 97 (2H, m) , 6,90 (1H, dt, J=7,9, 1,1 Hz), 4,81 (2H, d, J=ll,3 Hz), 3,81 (2H, d, J= 5,6 Hz), 2,47 (3H, s), 2,30 (3H, s), 1,71 (3H, s) .

(1) BuLi DPPA

H

(2) (CHaO)n ho DBU \ ---" X.......3Ξ--<| - C! THF Tolueno

PPh3, H20 THF

Exemplo 16 (a)

Ciclopropil-prop-2-in-l-ol

<1 A um balão de fundo redondo contendo 70 mL de THF anidro arrefecido em banho de gelo a -10 °C foram adicionados 65,6 mL de BuLi 1,6 M em hexanos (105 mmol) . 5-Cloro-pent-l-ino (5,13 g; 50 mmol) foi lentamente introduzido enquanto se manteve a temperatura a -10 a 0 °C. A mistura foi agitada a 0 °C durante duas horas sob árgon. Paraformaldeido (3 g; 100 mmol) foi adicionado na forma de 106 ΡΕ1585743 um sólido. A mistura foi aquecida lentamente até à temperatura ambiente e agitada durante a noite sob árgon. No dia seguinte, foi adicionada água e cerca de 50 mL de HC1 aquoso 1 N foram adicionados. A mistura foi extraída com acetato de etilo e as camadas orgânicas combinadas foram lavadas com água salgada e secas sobre Na2S04, filtradas e concentradas. O produto cru foi purificado em coluna eluindo com Et20 20% em hexanos para dar 3 g de 3-ciclopropil-prop-2-in-l-ol na forma de um óleo (rendimento de 62%). 1H-NMR (CDC13) δ 4,22 (dd, 2H, J=6,04, 2,01 Hz), 1,46 (t, 1H, J=6,04 Hz), 1,26 (m, 1H) , 0,77 (m, 2H), 0,70 (m, 2H).

Exemplo 16 (b) 3-Ciclopropil-prop-2-inilazida

N3 v 3-Ciclopropil-prop-2-in-l-ol (3,28 g; 34,1 mmol) foi dissolvido em 40 mL de tolueno, DPPA (11,26 ; 40.9 mmol) foi adicionada, seguido por DBU (6,24 G; 40.9 mmol) enquanto se manteve a temperatura com um banho de água. A mistura foi agitada à temperatura ambiente durante uma hora e foi diluída com 100 mL de hexano e 15 mL de CH2CI2. A mistura foi lavada com água quatro vezes e uma vez com água salgada, seca sobre Na2S04, filtrada e concentrada sob evaporação rotativa com banho de água fria para remover a maioria do solvente orgânico deixando algum 107 ΡΕ1585743 tolueno (produto volátil): O óleo residual foi usado para o passo seguinte. 1H-NMR (CDCI3) δ 3,85 (s, 2H), 1,26 (m, 1H), 0,80 (m, 2H), 0,72 (m, 2H) .

Exemplo 16 (c) 3-Ciclopropil-prop-2-inilamina

HoN 3-Ciclopropil-prop-2-inilazida (ca. 34 mmol) foi dissolvida em 100 mL de THF, 1 mL de água foi adicionado, seguido pela adição de PPh3 (13,37 g; 51 mmol) na forma de um sólido branco enquanto se manteve a temperatura com um banho de água. A mistura foi agitada à temperatura ambiente durante uma hora. Foram adicionados à mistura 150 mL de HC1 aquoso 1 N. A mistura foi lavada com cloreto de metileno três vezes. A camada aquosa foi basificada com NaOH 5 N até pH 10-12. A mistura foi extraída com acetato de etilo. A camada aquosa foi avaliada com coloração de TLC para monitorizar o progresso da extracção de amina para a fase orgânica. As camadas orgânicas combinadas foram secas sobre Na2S04, filtradas e concentradas para darem 1,62 g do produto desejado (produto volátil, contém solvente EtOAc residual) (rendimento de 50% para dois passos) . 1H-NMR (CDCls-d) δ 3,37 (d, 2H, J= 2 Hz), 1,22 (m, 1H) , 0,74 (m, 2H), 0,65 (m, 2H). 108 ΡΕ1585743

Exemplo 17 N-(3-Ciclopropil-prop-2-inil)-2-{3-[2-(4,6-dimetil-piridin--2-il)-vinil]-1-(tetra-hidro-piran-2-il)--lH-indazol-6-ilamino}-benzamida

Foi preparado de uma maneira semelhante à descrita para o Exemplo 6 acima, excepto usando o ácido E—2 — {3—[2-(4, 6-dimetil-piridin-2-il)-vinil]-1-(tetra-hidro--piran-2-il)-lfí-indazol-6-ilamino}-benzóico e 3-ciclopro-pil-prop-2-inilamina. 1H-NMR (CDCI3) δ 9,51 (1H, s), 7,97 (1H, d, J= 8 ,7 Hz) , 7,81 l :ih, d, J=16 ,6 Hz) , j—1 LO r-- 7 ,42 (3H, m) , 7,34-7, 29 (2 H, m) , 7, ,16 (1H, s), 7 ,11 ( 1H, dd , J= = 9,0, 1,9 Hz), 6, 85 (1H, s) , 6 ,81 (1H, dt, J= =7,2, 1,1 Hz) , 6,23 (1H, t, J=7 ,2 Hz) , 5,61 ( ;ih, dd, J= 9 ,0, 2,6 Hz) , 4 ,17 (2 H, dd, J= 5,3, 2,8 5 Hz) , 4,07- -4,00 (1H, m) , 3, 75 -3,66 (1H, m) , 2,63 -2,50 ( 1H, m) , 2,54 (3H, s) , 2, 32 (3 H, s) , 2 ,20- 2,02 (2H, m) , 1, , 79- -1,62 (3H, m) , 1,29-1, 19 (1H, m) , 0 ,77- 0, 67 (4H, m). 109 ΡΕ1585743

Exemplo de Referência 18 N-(3-Cicloprop-2-inil)-2-{3-[(E)-2-(4,6-dimetil-piridin- -2-il)-vinil]-lH-indazol-6-ilamino}-benzamida

Preparado de uma maneira semelhante à descrita para o Exemplo 7 acima, excepto usando 2-{3-[2-(4,6-di-metil-piridin-2-il)-vinil]-1-(tetra-hidro-piran-2-il)-1H--indazol-6-ilamino}-N-prop-2-inil-benzamida em vez de N-[4-(terc-butil-dimetil-silanoxi)-but-2-inil)-2-{3-[2--(4 , 6-dimetil-piridin-2-il)-vinil]-1-(tetra-hidro-piran-2- -il)- lH-i ndazol-6-ilamino}-benz amida. 1H-NMR ( DMSO- d6) δ 12, 90 (1H , s) , 9,79 (1H, s) , 8 ,91 (1H, t, J= :5, 6 Hz) , 8,06 (1H, d, J= 8,7 Hz) , 7,83 (1H, d , J= =16,2 Hz) , 7, 68 (1H, dd, J= 7,9 , 1, 1 Hz) , 7,4! 5-7,38 (3H t m) , 7,29 (1H, s) t 7,25 (1H, d, J= d,9 Hz) , 6,99 (1H, dd, t 1= 9,0, 2,3 Hz) , 6, 96 (1H, s), 6,88 (1H, dt, J= 7,9, 1,5 Hz), 4 ,00 (2 H, dd, J= =5, 6, 1,9 Hz) , 2,46 (3H, s) , 2,29 (3H, s), 1 ,31- 1,23 (1H, m) f 0, 75- -0,70 (2H, m) , 0,57-0,52 (2H, m) .

Exemplo 19 (a)

Monoacetato de 2-butino-l,4-diol

1 o 110 ΡΕ1585743 A uma solução de butino-1,4-diol (5 g; 58 mmol) em THF seco à temperatura ambiente foi adicionado em porções hidreto de sódio (dispersão a 60% em óleo; 2,32 g; 58 mmol). Após 4,3 h, cloreto de acetilo (4,12 L; 58 mmol) foi adicionado. Após agitação à temperatura ambiente durante 22 h, a mistura foi concentrada sob pressão reduzida. O resíduo foi concentrado sob pressão reduzida. O resíduo foi concentrado duas vezes em tolueno antes de purificação sobre gel de sílica usando acetato de etilo/diclorometano (1:3) como eluente para dar monoacetato de 2-butino-l,4-diol na forma de um óleo com rendimento de 49%. 1H-NMR (DMSO-dg) δ 5,23 (1H, bs) , 4,70 (2H, t, J=l,8 Hz), 4,09 (2H, s), 2,03 (3H, s).

Exemplo 19 (b) Éster de 4-amino-but-2-inilo do ácido acético

O

Preparado de uma maneira semelhante à descrita para o Exemplo 8 excepto que foi usado 2-butino-l,4-diol em vez de 4-(terc-butil-dimetil-silaniloxi)-but-2-in-l-ol. 1H-NMR (DMSO-de) δ 4,77 (2H, s) , 4,20 (2H, s) , 2,04 (3H, 111 ΡΕ1585743

Exemplo de Referência 20 Éster de 4-(2—{3—[(E)-2-(4,6-dimetil-piridin-2-il)-vinil]--lH-indazol-6-ilamino}-benzoilamino)-but-2-inilo

Preparado de uma maneira semelhante à descrita para o Exemplo 6 acima, excepto usando o p-toluenossulfona-to do ácido 2—{3—[2-(4,6-dimetil-piridin-2-il)-vinil]-1H--indazol-6-ilamino}-benzóico e éster de 4-amino-but-2-inilo do ácido acético. 1H-NMR (CDC13) δ 11, 00 (1H, bs), 9,59 (1H, s) , 7,99 (1H, d, J-- =8,6 Hz) , 7,86 (1H, d, J=16,4 Hz) , 7, 58 (1H, d, J= 7,8 Hz) , 7,49-7,37 (4H, m) , 7,32 (1H, s ) , 7, 21 (1H, s), 7,06 (1H, dd, J=8,8 , 1,8 Hz) , 6,96 (1H , s) , 6, 90 (1H, t, J=7,8 Hz) , 4,63 (2H, s), 4,16 (2H, d, J= 5, 6 Hz ), 2,49 (3H, s), 2,32 (3H, s), 2 ,01 (3H, s; ) .

Exemplo 21 Éster de metilo do ácido 2-{3-[(E)--2-(4,6-dimetil-piridin-2-il)-vinil]-1-(tetra--hidro-piran-2-il)-lH-indazol-6-ilamino}-nicotinico

112 ΡΕ1585743

Preparado de uma maneira semelhante à descrita para o Exemplo 6 acima, excepto usando o éster de metilo do ácido 2-bromo-nicotínico em vez do éster de metilo do ácido 2-bromo-benzóico. 1H-NMR (DMS0-CÍ6) δ 10,36 (1H, s), 8,50 (1H, dd, J= 4, 7, 1,9 Hz) , 8,36 (1H, d, J-- =1,4 Hz) , 8 ,30 (1H, dd, J=7,8 r 2, 0 Hz), 8, 08 (1H, d, J= 8,8 Hz) , 7,83 (1H , d, J=16 ,4 Hz ), 7, r 4 8 (1H, d , J= 7,5 Hz) , , 7,44 (1H , s), 7 ,33 (1H, s), 6, 98- 6, 93 (2H, m) , 5,80 ( 1H, d, J= 7,0 Hz) , 2 ,93 (3H, s), 3, 93- 3, 90 (1H, m), 3,80-3 ,75 (1H, m) , 2,46 (3H, s), 2,30 (3H, s ), 2 ,10-1,97 (2H, m) , i- ,89-1, 60 (3H, m).

Exemplo 22 Ácido 2 — {3—[(E)-2-(4,6-dimetil-piridin-2-il)-vinil]-1--(tetra-hidro-piran-2-il)-lH-indazol-6-ilamino}-nicotínico

Preparado de uma maneira semelhante à descrita para o Exemplo 4, excepto usando o éster de metilo do ácido 2—{3—[(E)—2 —(4,6-dimetil-piridin-2-il)-vinil]-1-(tetra-hi-dro-piran-2-il)-lH-indazol-6-ilamino}-nicotinico em vez do éster de metilo do ácido 2—{3—[2-(4,6-dimetil-piridin-2--il) -vinil] -1- (tetra-hidropiran-2-il) -lfí-indazol-6-ilami- 113 ΡΕ1585743 no}-benzóico. 1H-NMR (DMSO-de) δ 10,73 (1H, s), 8,49 (1H, d, J=l, 9 Hz), 8,45 (1H, s), 8,31 (1H, dd, J=7,7, 1,8 Hz), 8,16-7,97 (3H, m) , 7,70 (1H, d, J=16,4 Hz), 7,50 (1H, d, J= 8,6 Hz), 7,37 (1H, s), 6,96 (1H, dd, J=7,7, 4,8 Hz), 5,87 (1H, d, J=8,4 Hz ), 3, 95-3, 90 (1H, m) , 3, 79-3, 70 (1H, m), 2,63 (3H, s), 2,47 (3H, s) , 2,07-1, 99 (2H, m) , 1,81-1,62 (3H, m) .

Exemplo de Referência 23 2—{3—[(E)-2-(4,6-Dimetil-piridin-2-il)-vinil]-lH-indazol--6-ilamino}-N-(4-hidroxi-but-2-inil)-nicotinamida

Uma mistura crua de N-(4-hidroxi-but-2-inil)-2--{3-[2-(4,6-dimetil-piridin-2-il)-vinil]-1-(tetra-hidro-pi-ran-2-il)-lfí-indazol-6-ilamino}-nicotinamida e N-[4-(terc--butil-dimetil-silaniloxi)-but-2-inil-2-{3-[2-(4,6-dimetil-piridin-2-il)-vinil]-1-(tetra-hidro-piran-2-il)-lH-indazol--6-ilamino}-nicotinamida foi preparado a partir do ácido 2 —{3 —[ (E)—2—(4,6-dimetil-piridin-2-il)-vinil]-1-(tetra-hi-dro-piran-2-il)-lfí-indazol-6-ilamino}-nicotínico e 4-(terc--butil-dimetil-silaniloxi)-but-2-inilamina numa maneira semelhante à descrita para o Exemplo 6 acima e subsequentemente convertida a 2—{3—[(E)-2-(4,6-dimetil-piridin-2-il)- 114 ΡΕ1585743 -vinil] -lfí-indazol-6-ilamino}-N- (4-hidroxi-but-2-inil) -ni-cotinamida de uma maneira semelhante à descrita para o Exemplo 7 usando uma mistura de N-(4-hidroxi-but-2-inil)-2--{3-[(E)-2-(4,6-dimetil-piridin-2-il)-vinil]-1-(tetra-hi-dro-piran-2-il)-lH-indazol-6-ilamino}-nicotinamida e N-[4--(terc-butil-dimetil-silaniloxi)-but-2-inil-2-{3-[2-(4,6--dimetil-piridin-2-il)-vinil]-1-(tetra-hidro-piran-2-il)--lH-indazol-6-ilamino}-nicotinamida em vez de N-[4-(terc--butil-dimetil-silaniloxi)-but-2-inil-2-{3-[2-(4,6-dimetil--piridin-2-il) -vinil] -1- (tetra-hidro-piran-2-il) -liJ-inda-zol-6-ilamino}-benzamida. ^-NMR (DMSO-cU δ 12,99 (1H, s), 11,21 (1H, s), 9,26 (1H, t, J= 5,3 Hz), 8,50 (1H, d, J=l,9 Hz), 8,41 (1H, dd, J=4,9, 1,9 Hz), 8,16 (1H, dd, J=8,3, 1,9

Hz), 8,04 (1H, d, J=9, 0 Hz), 7,85 (1H, d, J=16, 6 Hz), 7,42 (1H, d, J=16,6 Hz), 7,31 (1H, s ), 7,06 (1H, dd, J=8,7, 1,5

Hz), 6,96 (1H, s), 6,93 (1H, dd, J=7,5, 4,9 Hz), 5,14 (1H, t, J=5,6 Hz), 4,16 (2H, d, J=5, 6 Hz), 4,08 (2H, d, J=7,2 Hz), 2,46 (3H, s), 2,30 (3H, s) .

Exemplo 24 p-Toluenossulfonato do ácido 2-{3-[2-(4,6-dimetil--piridin-2-il)-vinil]-lJf-indazol-6-ilamino}-nicotínico

115 ΡΕ1585743

Preparado de uma maneira semelhante à descrita para o Exemplo 5, excepto usando o ácido 2—{3—[ (E)—2—(4,6— -dimetil-piridin-2-il)-vinil]-1-(tetra-hidro-piran-2-il)--lH-indazol-6-ilamino]-nicotínico em vez do ácido 2— {3— [2 — - (4, 6-dimetil-piridin-2-il)-vinil]-1-(tetra-hidro-piran-2--il)-l/í-indazol-6-ilamino}-benzóico . 1H-NMR (DMSO-de) δ 13,49 (1H, s), 10,80 (1H, s) , 8,63 (1H, d, J=l,5 Hz), 8,49 (1H, dd, J=4,8, 1,9 Hz), 8,31 (1H, dd, J=7,7, 1,9 Hz), 8,24-8,19 (2H, m) , 8,06 (1H, d, J=8,8 Hz), 7, 60-7,55 (2H, m), 7,46 (2H, d, J=8,l Hz), 7,22 (1H, dd, J=8,8, 1,7 Hz ), 7,09 (2H, d, J=7,9 Hz), 6,95 (1H, dd, J=7,7, 4,7 Hz), 2,66 (3H, s), 2,54 (3H, s), 2,27 (3H, s) .

Exemplo de Referência 25 N-(3-Ciclopropil-prop-2-inil)-2-{3-[(E)-2-(4,6-dimetil--piridin-2-il)-vinil]-lff-indazol-6-ilamino}-nicotinamida

Preparado de uma maneira semelhante à descrita para o Exemplo 6, excepto usando o p-toluenossulfonato do ácido 2—{3—[2—(4,6-dimetil-piridin-2-il)-vinil]-lH-indazol--6-ilamino}-nicotínico e 3-ciclopropil-prop-2-inilamina. 116 ΡΕ1585743 1H-NMR (DMSO-de) δ 13,01 (1H, s) , 11,20 (1H, s) , 9,19 (1H, bt), 8,51 (1H, s), 8,40 (1H, d, J=4,9 Hz), 8,15 (1H, d, J=7,5 Hz), 8,05 (1H, d, J=8,7 Hz), 7,83 (1H, d, J=16,4 Hz), 7,42 (1H, d, j=16,4 Hz), 7,31 (1H, s) , 7,05 (1H, d, J= 8,3

Hz), 6,96 (1H, s), 6,92 (1H, dd, J=7,5, 4,9 Hz), 4,06 (2H, d, J=4,14 Hz), 2,46 (3H, s), 2,29 (3H, s), 1,33-1,28 (1H, m) , 0,77-0,72 (2H, m) , 0, 60-0,55 (2H, m) .

Exemplo 26 4-Metil-2-vinil-piridina

Uma mistura amarela de 2-bromo-4-metil-piridina (Aldrich; 5,2 g; 30,5 mmol; 1,0 eq) , 2,6-di-terc-4-metil--fenol (Aldrich; 67 mg; 0,3 mmol); 1 mol%), tributil-vinil--estanano (Aldrich; 26,8 mL; 91,5 mmol; 3,0 eq) e tetra-quis (trifenilfosfina)paládio (0) (Strem; 1,8 g; 1,5 mmol; 5 mol%) em tolueno (100 mL) foi desgaseado e purgado com árgon. Uma solução âmbar foi obtida após a mistura ser aquecida até 100 °C. A mistura reaccional foi extinta após 18 horas pela adição de HC1 1,0 Μ. O extracto acidico foi lavado com éter, o pH ajustado a 9 com bicarbonato de sódio sólido e extraído com acetato de etilo. Os extractos orgânicos foram lavados com água salgada, secos sobre 117 ΡΕ1585743 sulfato de magnésio, filtrados e concentrados sob pressão reduzida. 0 produto cru (3,7 g de um óleo castanho) foi purificado por cromatografia flash (silica) e eluido com acetato de etilo 0-5%/diclorometano, o que deu um óleo limpido (1,9 g; 53%). 1H-NMR (DMSO-d6, 300 MHz) δ 8,39 (1H, d, J=4, 9 Hz), 7,33 (1H, s) , 7,10 (1H, dd, J=5,0, 0,8 Hz), 6,77 (1H, dd, 17,5, 10,8 Hz), 6,20 (1H, dd, J=17,5, 1,7 Hz), 5,44 (1H, dd, J=10,8, 1,8 Hz), 2,31 (3H, s). ESIMS m/z 120 (M+H) +.

Exemplo 27 3-[2-(4-Metil-piridin-2-il)-vinil]-6-nitro--1-(tetra-hidro-piran-2-il)-lH-indazole

Uma suspensão de 4-metil-2-vinil-piridina (Exemplo 23) (1,9 g; 15,97 mmol), 6-nitro-l-(tetra-hidro-piran- -2-il)-lfí-indazole (4,96 g; 13,3 mmol), Pd(OAc)2 (149 mg; 0,66 mmol), P(o-tolil)3 e DIEA (3,5 mL; 19,96 mmol) em DMF desgaseada (50 mL) foi aquecida sob árgon a 100 °C durante 18 h. A mistura reaccional foi arrefecida e os sólidos removidos por filtração lavando com EtOAc. O filtrado foi diluido com EtOAc e lavado com água salgada (2x), seco (MgS04) e concentrado sob pressão reduzida. O residuo foi 118 ΡΕ1585743 cromatografado sobre gel de sílica eluindo com hexanos:-EtOAc (3:1) para dar 3,40 g (70%) de um sólido amarelo brilhante. 1H-NMR (CDCl3-d) δ 8,56 (1H, s) , 8,50 (1H, d, J=5,0 Hz), 8,11 (2H, m), 7,89 (1H, d, J=16,3 Hz), 7,61 (1H, s), 7,03 (1H, d, J=4,3 Hz), 5,83 (1H, dd, J= 2,6, 9,0 Hz), 4,06 (1H, m), 3,82 (1H, m) , 2,58 (1H, m) , 2,39 (3H, s) , 2,18 (2H, m), 1,78 (3H, m) . Anál. calca para C20H20N4O3: C-65,92; H-5,53; N-15,38. Encontrado: C-65,80; H-5,52; N-15,15.

Exemplo 28 3- [2-(4-Metil-piridin-2-il)-vinil]--1-(tetra-hidro-piran-2-il)-lH-indazol-6-ilamina

Preparado de uma maneira semelhante à descrita para o Exemplo 2, excepto usando o [2-(4-metil-piridin-2--il)-vinil]-6-nitro-l-(tetra-hidro-piran-2-il)-lff-indazole (Exemplo 24) em vez do 3-[2-(4,6-dimetil-piridin-2-il)--vinil]-6-nitro-l-(tetra-hidro-piran-2-il)-lH-indazole. 1H-NMR (DMSO-de) δ 8,43 (1H, d, J=4,8 Hz), 7,79-7,73 (2H, m) , 7,50 (1H, s), 7,39 (1H, d, J=16,4 Hz), 7,09 (1H, d, J=4,8 Hz), 6, 64-6, 62 (2H, m) , 5,57 (1H, dd, J= 9,8, 2,5 Hz), 5,48 (2H, bs), 3, 92-3, 85 (1H, m), 3, 72-3, 64 (1H, m) , 2,43- 119 ΡΕ1585743 2,34 (1Η, m), 2,33 (3H, s) , 2,07-2,00 (1H, m) , 1,96-1,90 (1H, m) , 1,79-1, 66 (1H, m) , 1,60-1,53 (2H, m).

Exemplo 29 Éster de metilo do ácido 2-{3-[2-(4-metil-piridin-2-il)-vinil]--1-(tetra-hidro-piran-2-il)-lH-indazol-6-ilamino}-benzóico

Preparado de uma maneira semelhante à descrita para o Exemplo 3, excepto usando a 3-[2-(4-metil-piridin-2--il)-vinil]-1-(tetra-hidro-piran-2-il)-li7-indazol-6-ilamina em vez da 3-[2-(4,6-dimetil-piridin-2-il)-vinil]-1-(tetra--hidro-piran-2-il)-lH-indazol-6-ilamina. 1H-NMR (DMSO-dê) δ 9,48 (1H, s), 8,45 (1H, d, J=4,9 Hz), 8,13 (1H, d, J=8,7

Hz), 7,93 (1H, dd, J=8,3, 1,9 Hz), 7,86 (1H, d, J=16,2 Hz), 7,58 (1H, d, J= 1,9 Hz), 7,54-7,44 (3H, m) , 7,36 (1H, d, J=7,5 Hz), 7,18 (1H, dd, J=8,7, 1,9 Hz), 7,11 (1H, d, J=4,9 Hz), 6,87 (1H, t, J=8,3 Hz), 5,83 (1H, dd, J=9,4, 2,3 Hz), 3,87 (3H, 1H), 3, 93-3, 84 (1H, m) , 3, 77-3, 69 (1H, m), 2,46- 2,37 (1H, m) , 2,34 (3H, s) , 2,10-1,94 (2H, m) , 1,81-1,53 (3H, m) . 120 ΡΕ1585743

Exemplo 30 Ácido 2-{3-[2-(4-metil-piridin-2-il)-vinil]--1-(tetra-hidro-piran-2-il)-lH-indazol-6-ilamino}-benzóico

Preparado de uma maneira semelhante à descrita para o Exemplo 4 acima, excepto usando o éster de metilo do ácido 2-{3-[2-(4-metil-piridin-2-il)-vinil]-1-(tetra-hidro--piran-2-il)-lH-indazol-6-ilamino}-benzóico éster de metilo do ácido 2-{3-[2-(4,6-dimetil-piridin-2-il)-vinil]-1-(te-tra-hidro-piran-2-il) -lfí-indazol-6-ilamino} -benzóico. 1H-NMR (DMSO-d6) δ 13,17 (1H, s largo), 9,83 (1H, s) , 8,51 (1H, d, J= 5,2 Hz), 8,14 (1H, d, J= 8,7 Hz), 7,95 (1H, d, J=16,4 Hz), 7,94 (dd, 1H, J=l,5, 8,0 Hz), 7,73 (1H, s) , 7,60 (1H, d, J=l,5 Hz), 7,59 (1H, s) , 7,54 (1H, s) , 7,46 (1H, m), 7,37 (1H, d, J=7,6 Hz), 7,23 (2H, m) , 6,86 (1H, t, J= 6,9 Hz), 5,87 (1H, d, J=7,6 Hz), 3,90 (1H, m) , 3,76 (1H, m) , 2,45 (1H, m), 2,41 (3H, s) , 2,03 (2H, m), 1,77 (1H, m), 1,59 (2H, m) .

Exemplo 31 2-{3-[2-(4-Metil-piridin-2-il)-vinil]-1-(tetra-hidro--piran-2-il)-lií-indazol-6-ilamino}-N-prop-2-inil-benzamida 121 ΡΕ1585743

Preparado de uma maneira semelhante à descrita para o Exemplo 6 acima, excepto usando propargilamina e ácido 2-{3-[2-(4-metil-piridin-2-il)-vinil]-1-(tetra-hidro--piran-2-il)-l/í-indazol-6-ilamino}-benzóico. 1H-NMR (DMSO--d6) δ 9,87 (1H, s), 9,03 (1H, t, J=5,5 Hz), 8,46 (1H, d, J=4,9 Hz), 8,08 (1H, d, J=8,7 Hz), 7,86 (1H, d, J=16,4 Hz), 7,69 (1H, d, J= 7,3 Hz), 7,53 (1H, s) , 7,44 (4H, m) , 7,13 (2H, m) , 6,91 (1H, t, J=7,9 Hz), 5,81 (1H, dd, J= 2,2, 9,6 Hz), 4,07 (2H, dd, J= 2,5, 5,5 Hz), 3,89 (1H, m), 3,75 (1H, m), 3,12 (1H, t, J=2,5 Hz), 2,42 (1H, m) , 2,36 (3H, s) , 2,00 (2H, m), 1,75 (1H, m) , 1,58 (2H, m).

Exemplo de Referência 32 2 — {3—[(E)-2-(4-Metil-piridin-2-il)-vinil]-lH-indazol--6-ilamino}-N-prop-2-inil)-benzamida

Preparado de uma maneira semelhante à descrita para o Exemplo 7, excepto que 2-{3-[2-(4-metil-piridin-2- 122 ΡΕ1585743 -il) -vinil] -1- (tetra-hidro-piran-2-il) -lfí-indazol-6-ilami-no}-N-prop-2-inil-benzamida foi usada em vez da N-[4-(terc--butil-dimetil-silaniloxi)-but-2-inil-2-{3-[2-(4, 6-dimetil--piridin-2-il) -vinil] -1- (tetra-hidro-piran-2-il) -lfí-inda-zol-6-ilamino}-benzamida. 1H-NMR (DMSO-cU δ 12,93, s), 9,79 (1H, s), 9,02 (1H, t, J=5,4 Hz), 8,45 (1H, d, J=4,9

Hz), 8,08 (1H, d, J=8,7 Hz), 7,88 (1H, d, J=16,4 Hz), 7,69 (1H, d, J=7,7 Hz), 7,45 (4H, m), 7,27 (1H, s), ), 7,10 (1H, d, J=4,9 Hz), 7,03 (1H, d, J=8,8 Hz), 6,90 (1H, t, J=7,9

Hz), 4,06 (2H, dd, J=2,4, 5,4 Hz), 3,12 (1H, t, J=2,4 Hz), 2,35 (3H, s) . Anál. calca para C25H21N5OO, 35 CH2CI2O: C-69,64; H-5,00; N-16,02. Encontrado: C-69,65; H-5,15; N-15,80.

Exemplo 33 N-(2-Metil-alil)-2-{3-[2-(4-metil-piridin-2-il)-vinil]--1-(tetra-hidro-piran-2-il)-lfí-indazol-6-ilamino}-benzamida

Preparado de uma maneira semelhante à descrita para o Exemplo 6 acima, excepto usando 2-metil-alilamina e ácido 2-{3-[2-(4-metil-piridin-2-il)-vinil]-1-(tetra-hidro--piran-2-il)-lH-indazol-6-ilamino}-benzóico. 1H-NMR (DMSO- -de) δ 9,86 (1H, s) , 8,81 (1H, t, J= 5,5 Hz), 8,46 (1H, d,

123 ΡΕ1585743 7,75 (1Η, d, J=7,7 Hz), 7,54 (1H, s) , 7,50 (1H, d, J= 16,4

Hz), 7,43 (3H, m), 7,11 (2H, m) , 6,92 (1H, t, J=8,l Hz), 5,81 (1H, dd, J=2,5, 9,8 Hz), 4,83 (2H, d, J=ll,5 Hz), 3,81 (4H, m) , 2,41 (1H, m) , 2,35 (3H, s) , 2,00 (2H, m) , 1,76 (1H, m) , 1,73 (3H, s), 1,58 (2H, m) . Anál. calca para

CsiHssNsCVO, 80 TBME: C-72,71; H-7,43; N-12,11. Encontrado: C-72,43; H-7,57; N-12,02.

Exemplo de Referência 34 N-(2-Metil-alil)-2-{[(E)-2-(4-metil-piridin-2-il)-vinil]--lH-indazol-6-ilamino}-benzamida

Preparado de uma maneira semelhante à descrita para o Exemplo 7, excepto que N-(2-metil-alil)—2—{3—[2-(4--metil-piridin-2-il)-vinil]-1-(tetra-hidro-piran-2-il)-1H--indazol-6-ilamino}-benzamida foi usada em vez da N-[4- -(terc-butil-dimetil-silaniloxi)-but-2-inil-2-{3-[2-(4,6--dimetil-piridin-2-il)-vinil]-1-(tetra-hidro-piran-2-il)--líf-indazol-6-ilamino]-benzamida. 1H-NMR (DMSO-d6) δ 12,90 (1H, s), 9,76 (1H, s), 8,80 (1H, t, J=5,5 Hz), 8,45 (1H, d, J=5,l Hz), 8,07 (1H, d, J=8,9 Hz), 7,88 (1H, d, J=16,4 Hz), 7,75 (1H, d, J= 7,9 Hz), 7,51 (1H, s) , 7,48 (1H, d, J=16,4

Hz), 7,43 (2H, m), 7,24 (1H, s) , 7,10 (1H, d, J= 4,9 Hz), 7,00 (1H, dd, J= 1,9, 8,9 Hz), 6,91 (1H, t, J=8,l Hz), 4,82 124 ΡΕ1585743 (2Η, d, J=ll,3 Hz), 3,83 (2H, d, J= 5,8 Hz), 2,35 (3H, s) , 1,73 (3H, s) . Anál. calca para C26H25N5OO, 20 H20: C-73,11; H-5,99; N-16,40. Encontrado: C-73,13; H-6,03; N-16,13.

Exemplo 35 N-(3-Ciclopropil-prop-2-inil)--2-{3-[2-(4-metil-piridin-2-il)-vinil]--1- (tetra-hidro-piran-2-il) -lií-indazol-6-ilamino}-benzamida

Preparado de uma maneira semelhante à descrita para o Exemplo 6 acima, excepto usando o ácido 2 — {3— [2— (4 — -metil-piridin-2-il)-vinil]-1-(tetra-hidro-piran-2-il)-1H--indazol-6-ilamino}-benzóico e 3-ciclopropil-prop-2--inilamina. 1H-NMR (DMSO-de) δ 9,88 (1H, bs) , 8,93 (1H, bt) , 8,46 (1H, d, J= 4,9 Hz), 8,08 (1H, d, J=8,7 Hz), 7,85 (1H, d, J=16, 4 Hz), 7,69 (1H, d, J=7,6 Hz), 7,54-7,40 (5H, m) , 7,14-7,11 (2H, m), 6,90 (1H, t, J=6,l Hz), 5,81 (1H, d, J=7,5 Hz), 4,02 (2H, d, J=3,6 Hz), 3, 95-3, 85 (1H, m), 3,79-3,72 (1H, m) , 2,49-2,35 (1H, m) , 2,35 (3H, s) , 2,15-2,01 (2H, m) , 1,87-1,55 (3H, m) , 1,30-1,25 (1H, m) , 0,77 0,70 (2H, m), 0,59-0,54 (2H, m). 125 ΡΕ1585743

Exemplo de Referência 36 N-(3-Cicloprop-2-inil)-2-{3-[(E)-2-(4-metil-piridin-2-il)--vinil]-lH-indazol-6-ilamino}-benzamida

Preparado de uma maneira semelhante à descrita para o Exemplo 7, excepto usando N-(3-cicloprop-2-inil)-2--{3-[2-(4-metil-piridin-2-il)-vinil]-1-(tetra-hidro-piran--2-il)-lH-indazol-6-ilamino}-benzamida em vez da N-[4--(terc-butil-dimetil-silaniloxi)-but-2-inil-2-{3-[2-(4,6--dimetil-piridin-2-il)-vinil]-1-(tetra-hidro-piran-2-il)--líf-indazol-6-ilamino}-benzamida. 1H-NMR (DMSO-cU δ 12,91 (1H, s), 9,79 (1H, s), 8,91 (1H, t, J=5,6 Hz), 8,44 (1H, d, J=4,9 Hz), 8,06 (1H, d, J= 8,7 Hz), 7,87 (1H, d, J=16,6 Hz), 7,67 (1H, dd, J=7,9, 1,5 Hz), 7,50-7,35 (4H, m), 7,24 (1H, d, j=l,9 Hz), 7,09 (1H, d, j= 4,9 Hz), 7,00 (1H, dd, j=8,7, 1,5 Hz), 6,88 (1H, dt, J=4,l, 1,5 Hz), 4,00 (2H, dd, J=5,3, 1,9 Hz), 2,34 (3H, s) , 1,31-1,23 (1H, m) , 0,75-0, 69 (2H, m) , 0,56-0,52 (2H, m) .

Exemplo de Referência 37 2-{3-[2-(4-Metil-piridin-2-il)-vinil]--lH-indazol-6-ilamino}-N-piridin-2-ilmetil-benzamida 126 ΡΕ1585743

Preparado de uma maneira semelhante à descrita para o Exemplo 6 e Exemplo 7 acima, excepto usando ácido 2-{3-[2-(4-metil-piridin-2-il)-vinil]-1-(tetra-hidro-piran--2-il)-lfí-indazol-6-ilamino}-benzóico e C-piridin-2-il-me-tilamina. 1H-NMR (DMSO-d6, 300 MHz) δ 12,91 (1H, s) , 9,77 (1H, s), 9,19 (1H, t, J=5,8 Hz), 8,50 (1H, d, J= 4,1 Hz), 8,45 (1H, d, J=5,0 Hz), 8,06 (1H, d, J=8,8 Hz), 7,88 (1H, d, J=16,4 Hz), 7,82-7,70 (2H, m) , 7,51-7,25 (7H, m) , 7,10 (1H, d, J=4,6 Hz), 6,98 (1H, dd, J=8,8, 1,8 Hz), 6,96-6,91 (1H, m) , 4,58 (2H, d, J= 5,9 Hz), 2,35 (3H, s) . ESIMS m/z 461 (M+H)+. Anál. calca para C28H24N60· 0,3 MTBE: C-72,71; H-5,77; N-17,25. Encontrado: C-72,38; H-5,80; N-16,88.

Exemplo de Referência 38 2-{3-[2-(4-Metil-piridin-2-il)-vinil]--lH-indazol-6-ilamino}-N-piridin-4-ilmetil-benzamida

127 ΡΕ1585743

Preparado de uma maneira semelhante à descrita para o Exemplo 6 e Exemplo 7 acima, excepto usando ácido 2-{3-[2-(4-metil-piridin-2-il)-vinil]-1-(tetra-hidro-piran--2-il)-l/í-indazol-6-ilaminoJ-benzóico e C-piridin-4-il-me-tilamina. 1H-NMR (DMSO-d6, 300 MHz) δ 12,90 (1H, s), 9,73 (1H, s), 9,21 (1H, t, J= 5,9 Hz), 8,49-8,44 (3H, m) , 8,06 (1H, d, J=8,7 Hz), 7,88 (1H, d, J=16,4 Hz), 7,81 (1H, d, J=7,5 Hz), 7,51-7,40 (4H, m) , 7,31 (2H, d, J=5,9 Hz), 7,24 (1H, 5), 7,11 (1H, d, J=4,4 Hz), 7,00 (1H, dd, J=8,7, 1,7 Hz), 6, 97-6, 92 (1H, m) , 4,50 (2H, d, J=5,9 Hz), 2,35 (3H, s) . ES IMS m/z 461 (M+H)+. Anál. calca para C28H24N6O*0,4 H20: C-71,36; H-6,45; N-15,85. Encontrado: C-71,27; H-6,29; N-15,53.

Exemplo de Referência 39 N-(6-Metil-piridin-2-ilmetil)-2-{3-[2-(4-metil- -piridin-2-il)-vinil]-lfí-indazol-6-ilamino}-benzamida

Preparado de uma maneira semelhante à descrita para o Exemplo 6 e Exemplo 7 acima, excepto usando ácido 2-{3-[2-(4-metil-piridin-2-il)-vinil]-1-(tetra-hidro-piran--2-il)-lH-indazol-6-ilamino]-benzóico e C-(6-metil-piridin- 128 ΡΕ1585743 -2-il)-amina. -NMR (DMSO- d6, 300 MHz) δ 12,92 (1H, s) , 9,76 (1H, s) , 9, 20 (1H, t, J=5,8 Hz), 8, 44 (1H, d, J=4, 9 Hz), 8,05 (1H, d, , J=8, 6 Hz) , 7,86 (1H, d, J=16, 4 Hz) , 7,81 (1Η, d, J=7,7 Hz), 7,59 (1H, t, J=7,7 Hz), 7,49-7,37 (4H, m), 7,23 (1H, s), 7,11-7,08 (3H, m), 6,99 (1H, dd, J=8,7, 1,6 Hz), 6, 95-6, 90 (1H, m) , 4,51 (2H, d, J=5,9 Hz), 2,42 (3H, s), 2,33 (3H, s) . ESIMS m/z 475 (M+H) + . Anál. calca para C29H26N6O‘0,4 DCM: C-68, 98; H-5,29; N-16,39.

Encontrado: C-68,84; H-5,42; N-16,20.

Exemplo 40 N-(2,5-Dimetil-2H-pirazol-3-ilmetil)-2-{(E)-3-[2-(4-metil--piridin-2-il)-vinil]-1-(tetra-hidro-piran-2-il)--lfí-indazol-6-ilamino}-benzamida

Preparado de uma maneira semelhante à descrita para o Exemplo 6 acima, excepto usando ácido 2-{3-[2-(4-metil-piridin-2-il)-vinil]-1-(tetra-hidro-piran--2-il)-l£f-indazol-6-ilamino}-benzóico e C- (2,5-dimetil-2.fi- -pirazol-3-il)-metilamina. 1H-NMR (DMSO- -d6) δ 9,81 (1H r S) , 9,05 (1H, bt), 8,46 8,7 Hz), 7,85 (1H, d, J=16,4 Hz) , 7,71 (1H, d, J=7,5 Hz) , 7,54-7,40 (5H, m) , 7,11-7,09 (2H , m) , τ—] 05 (1H, t, J=6,9 Hz), 5,94 (1H, s), 5,80 (1H, d, J=7,3 129 ΡΕ1585743

Hz) , 4,45 (2H, d, J= 5,5 Hz) , 3,93- -3,85 (1H, m) , 3, 78- 3, 69 (1H, m) , 3,73 (3H, s), 2,45 -2,35 (1H, m) , 2,35 (3H, s), 2,07 (3H, s) , 2,06-1, 95 (2 H, m) , 1, τ—1 1 LO co 53 (m , 3H) ,

Exemplo de Referência 41 N-(2,5-Dimetil-2H-pirazol-3-ilmetil)—2—{3—[(E)-2-(4-metil--piridin-2-il)-vinil]-lH-indazol-6-ilamino}-benzamida

Preparado de uma maneira semelhante à descrita para o Exemplo 7, excepto usando N- (2,5-dimetil-2fí-pirazol--3-ilmetil)-2-{(E)-3-[2-(4-metil-piridin-2-il)-vinil]-1-- (tetra-hidro-piran-2-il) -li3-indazol-6-ilamino}-benzamida em vez de N-[4-(terc-butil-dimetil-silaniloxi)-but-2-inil-—2 —{3 —[2-(4, 6-dimetil-piridin-2-il)-vinil]-1-(tetra-hidro--piran-2-il) -lfí-indazol-6-ilamino} -benzamida. 1H-NMR (DMSO-d6) δ 12,90 (1H, s) , 9,70 (1H, s) , 9,03 (1H, t, J=6,0 Hz), 8,44 (1H, d, J=4,9 Hz), 8,06 (1H, d, J=9,0 Hz), 7,87 (1H, d, J=16,2 Hz), 7,70 (1H, d, J=7,5 Hz), 7,50-7,38 (4H, m), 7,22 (1H, s) , 7,1 (1H, d, J= 5,6 Hz), 6,99 (1H, dd, J=8,7, 1,5 Hz), 6,90 (1H, dt, J=7,9, 1,9 Hz), 5,91 (1H, s) , 4,43 (2H, d, J=5,6 Hz), 3,72 (3H, s) , 2,34 (3H, s) , 2,05 (3H, s) . ΡΕ1585743 130

Exemplo 42

Oxima de l-metil-lH-benzoimidazole-2-carbaldeído

N-OH \ A uma suspensão agitada de 1-metil-lH-benzoimida- zole-2-carbaldeído (980 mg; 6,61 mmol) em H2O (10 mL) foi adicionada uma solução de acetato de sódio (3,25 ; 39,68 mmol) e hidrocloreto de hidroxilamina (1,38 g; 19,84 mol) em 10 mL de H20. A reacção foi agitada à temperatura ambiente durante 2 h e o precipitado espesso foi recolhido por filtração, lavado com água e seco em vácuo para dar 1,02 g (94%) de um sólido branco. 1H-NMR (DMSO-de) δ 12,06 (1H, s) , 8,28 (1H, s) , 7,65 (1H, d, J=7,5 Hz), 7,60 (1H, d, J= 6,8 Hz), 7,32 (1H, t, J=7,2 Hz), 7,23 (1H, t, J=6,8 Hz), 4,00 (3H, s) . Anál. calca para C9H9N3O: C-61,70; H-5,18; N-23,99. Encontrado: C-61,80; H-5,23; N-23,98.

Exemplo 43

Di-hidrocloreto de C- (l-metil-lH-benzoimidazol-2-il)-metilamina

131 ΡΕ1585743

Uma garrafa de pressão de Parr foi carregada com oxima de l-metil-lH-benzoimidazole-2-carbaldeído M (267 mg; 1,6 mmol) , paládio 10% em carbono (75 mg), HC1 conc. (2 gotas) e EtOH (25 mL). A mistura reaccional foi agitada sob 45 psi de H2 durante 2 h antes do catalisador ser removido por filtração. O filtrado foi concentrado sob pressão reduzida e o resíduo foi triturado com Et20 para dar 340 mg (90%) de um sólido branco na forma de sal di-hidrocloreto e foi usado sem purificação posterior. 1H-NMR (DMSO-dg) δ 8,87 (2H, s largo), 7,72 (2H, m) , 7,38 (2H, m) , 4,50 (2H, s), 3,89 (3H, s) .

Exemplo 44 N-(l-Metil-lH-benzoimidazol-2-ilmetil)--2-{3-[2-(4-metil-piridin-2-il)-vinil]--1-(tetra-hidro-piran-2-il)-lH-indazol-6-ilamino}-benzamida

Preparado de uma maneira semelhante à descrita para o Exemplo 6, excepto usando hidrocloreto de C-(l-me-til-lH-benzoimidazol-2-il)-metilamina N e ácido 2—{3—[2—(4— -metil-piridin-2-il)-vinil]-1-(tetra-hidro-piran-2-il)-1H--indazol-6-ilamino}-benzóico. 1H-NMR (DMSO-de) δ 9,82 (1H, s), 9,20 (1H, t, J=5,3 Hz), 8,46 (1H, d, J=4,9 Hz), 8,07 132 ΡΕ1585743 (1H, d, J=8,9 Hz), 7,85 (1H, d, J=16,4 Hz) , 7, 74 (1H , d, J=n, 3 Hz: ), 7,58 (1H, d, J=7,2 Hz) , 7,50 (6H, m), 7,19 (4H, m) , 6, 92 (1H, t, J= 8,1 Hz) , 5 ,78 (1H, dd, J= =2,5 , 9,5 Hz) , 4,79 (2H , d, J=5,5 Hz) , 3, 89 (1H , m) , 3 ,83 (3H , s) , 3,71 (1H, m), 2,41 (1H, m), 2,35 (3H, s), 2 ,00 (2H, , m) , 1,74 (1H, m) , , 1,57 (2H, m). Anál. calca para C36H35N7O2·- 0, 65 hexanos: C-73 ,31; H-6 ,80; N-15 ,00. Encontrado: C-72 ,92; H-6,90; N-14,71

Exemplo de Referência 45 N-(l-Metil-lH-benzoimidazol-2-ilmetil)-2-{3-[(E)-2-(4-me-til-piridin-2-il)-vinil]-lH-indazol-6-ilamino}-benzamida

Preparado de uma maneira semelhante à descrita para o Exemplo 7, excepto que N-(1-metil-lH-benzoimidazol--2-ilmetil)—2—{3—[2-(4-metil-piridin-2-il)-vinil]-1-(tetra--hidro-piran-2-il)-lH-indazol-6-ilamino}-benzamida foi usada em vez de N-[4-(terc-butil-dimetil-silaniloxi)-but-2--inil-2-{3-[2-(4,6-dimetil-piridin-2-il)-vinil]-1-(tetra--hidro-piran-2-il) -lH-indazol-6-ilamino} -benzamida . 1H-NMR (DMSO-d6) δ 12,93 (1H, s), 9,73 (1H, s) , 9,19 (1H, t, J= 5,3 Hz), 8,45 (1H, d, J=4, 9 Hz), 8,06 (1H, d, J= 8,5 Hz), 7,88 (1H, d, J=16, 4 Hz), 7,74 (1H, d, J= 7,9 Hz), 7, 60-7,36 (6H, m) , 7,29-7,14 (3H, m) , 7,10 (1H, d, J= 4,7 Hz), 7,04 (1H, 133 ΡΕ1585743

J= 5,3 Hz), 3,83 (3H, s) , 2,35 (3H, s) . Anál. calca para C3iH27N701, 80 Η2Ο·0,40 CH2C12: C-65, 02; H-5,46; N-16,91.

Encontrado: C-64,97; H-5,82; N-17,09.

Exemplo 46

Oxima de l-metil-lH-imidazole-2-carbaldeído

HO

Preparado de uma maneira semelhante à descrita para o Exemplo 39, excepto que l-metil-lH-imidazole-2-car-baldeido foi usado em vez de l-metil-lH-benzoimidazole-2--carbaldeído. 1H-NMR (DMSO-d6) δ 11,50 (1H, s) , 8,05 (1H, s) , 7,28 (1H, s) , 6,95 (1H, s) , 3,80 (3H, s) . Anál. calca para C5H-7N3O: C-47, 99; H-5,64; N-33,58. Encontrado: C-48,22; H-5,58; N-33,45.

Exemplo 47

Di-hidrocloreto de C-(l-metil-lH-imidazol-2-il)-metilamina

Preparado de uma maneira semelhante à descrita 134 ΡΕ1585743 para o Exemplo 40, excepto que foi usada oxima de 1-metil--lH-imidazole-2-carbaldeído em vez de oxima de 1-metil-lH--benzoimidazole-2-carbaldeído. 1H-NMR (DMSO-de) δ 7,45 (1H, s), 7,29 (1H, s), 4,25 (21H, s), 3,79 (3H, s).

Exemplo 48 N-(l-Metil-lH-imidazol-2-ilmetil)--2-{3-[2-(4-metil-piridin-2-il)-vinil]--1-(tetra-hidro-piran-2-il)-lH-indazol-6-ilamino}-benzamida

Preparado de uma maneira semelhante à descrita para o Exemplo 6, excepto usando hidrocloreto de C-(l-me-til-lH-imidazol-2-il)-metilamina e ácido 2-{3-[2-(4-metil--piridin-2-il)-vinil]-1-(tetra-hidro-piran-2-il)-lH-inda-zol-6-ilamino}-benzóico. 1H-NMR (DMSO-d6) δ 9,83 (1H, s), 9,03 (1H, t, J= 5,5 Hz), 8,45 (1H, d, J=4,7 Hz), 8,09 (1H, d, J=8,5 Hz), 7,85 (1H, d , J=16,5 Hz), 8,67 (1H, d , J=7,3 Hz), 7,53-7,39 (4H, m) , 7,11 (3H, m) , 6,90 (1H, d, J=6,9

Hz), 6,86 (1H, s), 5,79 (1H, d , J=8,9 Hz), 5,75 (1H, s), 4,54 (1H, d , J=5,5 Hz), 3,85-3,70 (2H, m), 3,66 (3H, s), 2,35 (3H, s), 2,10 (2H, m) , 1,70 (2H, m) , 1,60 (3H, m) .

Anál. calca para C32H33N7C>2*0, 85 CH2CI2: C-63, 99; H-6, 672; N-15,93. Encontrado: C-63,95; H-5,72; N-16,01. 135 ΡΕ1585743

Exemplo de Referência 49 N-(l-Metil-lH-imidazol-2-ilmetil)-2-{3-[2-(4-metil--piridin-2-il)-vinil]-lH-indazol-6-ilamino}-benzamida

Preparado de uma maneira semelhante à descrita para o Exemplo 7, excepto que N-(l-metil-lH-imidazol-2-il-metil) —2 — {3—[2-(4-metil-piridin-2-il)-vinil]-1-(tetra-hi-dro-piran-2-il)-lH-indazol-6-ilamino}-benzamida foi usada em vez de N-[4-(terc-butil-dimetil-silaniloxi)-but-2-inil-—2—{3—[2- (4,6-dimetil-piridin-2-il)-vinil]-1-(tetra-hidro--piran-2-il) -lfí-indazol-6-ilamino} -benzamida. 1H-NMR (DMSO -de) δ 12, 89 (1H, 9,72 (1H, 8, 99 (1H, t , J= 5,6 Hz), OO 0^ (1H, d , J-- =4,9 Hz) , 8,05 (1H, d, J= :8, 7H) , 7,86 i (1H, d, J=16, 4 Hz ), 7, 66 (1H, d , J=6, 7 Hz) , 7,49- -7 ,36 (4H, m) , 7,24 (1H, m ) , 7, 09 (2 H , d, J=8,1 Hz) , 7,02 ( 1H, d, J= =8,8 Hz) , OO OO ^0 ( 1H, t, J= 6, 9 Hz) , 6,81 (1H, s) , 4 ,52 (2H, d , J= 5,5 Hz), 3,29 (3H, s) , 2,34 (3H, s) . Anál. calca para C27H25N7OO, 35 CH2C12: C-66, 59; H-5,25; N-19,88. Encontrado: C—66,48; H—5,65; N—19,56.

Exemplo 50 N- (4-Hidroxi-but-2-inil)--2-{3-[2-(4-metil-piridin-2-il)-vinil]--1-(tetra-hidro-piran-2-il)-lH-indazol-6-ilamino}-benzamida 136 ΡΕ1585743

Preparado de uma maneira semelhante à descrita para o Exemplo 6, excepto usando ácido 2-{3-[2-(4-metil-pi-ridin-2-il)-vinil]-1-(tetra-hidro-piran-2-il)-lfí-indazol-6--ilamino}-benzóico e 4-(terc-butil-dimetil-silaniloxi)-but--2-inilamina. 1H-NMR (CDC13) δ 9,48 (H, s), 8,46 (1H, d, J=5,3 Hz), 7,92 (1H, d, J=9,0 Hz), 7,83 (1H, d, J=16,2 Hz), 7,52 (1H, d, J=16, 6 Hz), 7,46-7,41 (2H, m) , 7,34-7,31 (3H, m) , 7,12 (1H, dd, J= 8,7, 1,9 Hz), 6,99 (1H, d, J=4,9 Hz), 6,81 (1H, t, J=6,8 Hz), 6,40 (1H, t, J=4,9 Hz), 5,62 (1H, dd, J= 9,4, 3,0 Hz), 4,28-4,23 (4H, m) , 4,08-4,01 (1H, m) , 3, 76-3,67 (1H, m) , 2, 63-2,49 (1H, m) , 2,38 (3H, s), 2,22-2,06 (2H, m), 1,80-1, 60 (3H, m) .

Exemplo de Referência 51 2—{3—[(E)-2-(4-Metil-piridin-2-il)-vinil]--lH-indazol-6-ilamino}-N-(4-hidroxi-but-2-inil)benzamida

137 ΡΕ1585743

Preparado de uma maneira semelhante à descrita para o Exemplo 7, excepto usando uma mistura de N-(4-hidroxi-but-2-inil)—2—{3—[2-(4-metil-piridin-2-il)-vinil] -1- (tetra-hidro-piran-2-il) -lfí-indazol-6-ilamino}-ben-zamida e 4-(terc-butil-dimetil-silaniloxi)-but-2-inil-2-{3--[2-(4-metil-piridin-2-il)-vinil]-1-(tetra-hidro-piran-2--il)-lH-indazol-6-ilamino}-benzamida em vez de 4-[(terc-butil-dimetil-silaniloxi) -but-2-inil]—2—{3—[2-(4,6-dimetil--piridin-2-il) -vinil] -1- (tetra-hidro-piran-2-il) -lH-inda-zol-6-ilamino}-benzamida. 1H-NMR (CDCI3) δ 12,92 (1H, s) , 9,83 (1H, s), 9,00 (1H, t, J=5,3 Hz), 8,44 (1H, d, J=4,9 Hz), 8,06 (1H, d, J=9,0 Hz), 7,87 (1H, d, J=16, 6 Hz), 7,68 (1H, d, J= 7,9 Hz), 7,50-7,38 (4H, m) , 7,26 (1H, s) , 7,09 (1H, d, J=5,3 Hz), 7,01 (1H, dd, J= 8,7, 1,5 Hz), 6,88 (1H, dt, J=6,8, 1,5 Hz), 5,11 (1H, t, J=3,0 Hz), 4,10-4,04 (4H, m) , 2,34 (3H, s) .

Exemplo 52 Éster de metilo do ácido 2-[3-(pirrol-l-iliminometil)-1-(2--trimetilsilanil-etoximetil)-lH-indazol-6-ilamino]-benzóico

Preparado de uma maneira semelhante à descrita para os Exemplos 2 e 3 acima, excepto partindo com 6-nitro- 138 ΡΕ1585743 -3-estiril-l- (2-trimetilsilanil-etoximetil) -lH-indazole em vez de 6-iodo-3-estiril-l-(2-trimetilsilanil-etoximetil)--lH-indazole. Este material foi tomado na forma de uma mistura crua de produto e éster de metilo do ácido 2-amino-benzóico no passo seguinte.

Exemplo 53 Ácido 2-[3-(pirrol-l-iliminometil)-1-(2-trimetilsilanil-etoximetil) -lH-indazol-6-ilamino]-benzóico

Isolado como um produto secundário da reacção de N-[4-(terc-butil-dimetil-silaniloxi)-but-2-inil]-2-[3-(pirrol-l-iliminometil) -1-(2-trimetilsilanil-etoximetil)-1H--indazol-6-ilamino]-benzamida e TBAF usando um procedimento semelhante ao do Exemplo 11 no Pedido de Patente dos E.U.A. com o N° de Série 09/609 335, apresentado em 30 de Junho de 2000, aqui incorporado na sua globalidade para todos os propósitos. 1H-NMR (DMSO-d6) δ 13,19 (1H, s largo), 10,00 (1H, s), 9,13 (1H, s), 8,37 (1H, d, J=8,7 Hz), 8,06 (1H, d, J=7,5 Hz), 7,75 (1H, s), 7,64 (2H, t, J=2,3 Hz), 7,54 (2H, m), 7,35 (1H, dd, J=l,9, 8,7 Hz), 6,99 (1H, m) , 6,33 (2H, t, J= 2,3 Hz), 5,89 (2H, s) , 3,68 (2H, t, J=8,l Hz), 0,94 (2H, t , J=8,l Hz), 0,00 (9H, s) . 139 ΡΕ1585743

Exemplo 54 N-(3-Ciclopropil-prop-2-inil)--2-[3-(pirrol-l-iliminometil)-1-(2-trimetilsilanil--etoximetil)-lH-indazol-6-ilamino]-benzamida

Preparado de uma maneira semelhante à descrita para o Exemplo 6 acima, excepto usando o ácido 2-[3-(pirrol-l-iliminometil) -1- (2-trimetilsilanil-etoximetil)-lH-in-dazol-6-ilamino]-benzóico e 3-ciclopropil-prop-2-inilamina. 1H-NMR (DMSO-d6) δ 9,93 (1H, 8,99 (1H, s) , 8,95 (1H, d, J=5,6 Hz), 8,20 (1H, d, J=8,9 Hz), 7,68 (1H, d , J=8,l Hz), 7,51 (4H, m), 7,37 (1H, t , J=6,8 Hz), 7,14 (1H, d, J=9,0

Hz), 6,91 (1H, t, J=7,5 Hz), 6,21 (2H, t, J= 2,3 Hz), 5,74 (2H, s), 4,00 (2H, dd, J=2,0, 5,6 Hz), 3,55 (2H, t, J=7,9

Hz), 1,26 (1H, m) , 0,82 (2H, t, J= 7,9 Hz), 0,72 (2H, m) 0,54 (2H, m), -0,12 (9H, s).

Exemplo de Referência 55 N-(3-Ciclopropil-prop-2-inil)-2-[3-(pirrol-l-iliminometil)--lH-indazol-6-ilamino]-benzamida

140 ΡΕ1585743

Preparado de uma maneira semelhante à descrita no Exemplo 11 no Pedido de Patente dos E.U.A. com o N° de Série 09/609 335, apresentado em 30 de Junho de 2000, excepto que N-(3-ciclopropil-prop-2-inil)-2-[3-(pirrol-1-iliminometil)-1-(2-trimetilsilanil-etoximetil)-lH-inda-zol-6-ilamino]-benzamida foi usada em vez de N-metil-N-{3-estiril-1-[2-trimetilsilanil)-etoximetil]-lH-indazol-6-il}-benzeno-1,3-diamina. 1H-NMR (DMSO-de) δ 13,29 (1H, s) , 9,83 (1H, 8,98 (1H, s), 8,95 (1H, t, J=5,5 Hz), 8,19 (1H, d, J= 8,9 Hz), 7,68 (1H, d, J= 7,5 Hz), 7,52 (2H, t, J= 2,3 Hz), 7,43 (2H, m) , 7,29 (1H, s) , 7,07 (1H, dd, J=l,9, 8,7 Hz), 6,91 (1H, t, J=7,4 Hz), 6,21 (2H, t, J= 2,3 Hz), 4,01 (2H, dd, J=l,7, 5,5 Hz), 1,27 (1H, m) , 0,73 (2H, m) , 0,55 (2H, m) . Anál. calca para C25H22N6O·0,05 Hexanos*0,30 H20: C-70,31; H-5,43; N-19,45. Encontrado: C-70,63; H-5,38; N-19,18.

Exemplo 56 N-[4-(terc-Butil-dimetil-silaniloxi)-but-2-inil]--2-[3-(pirrol-l-iliminometil)-1-(2-trimetilsilanil--etoximetil)-lH-indazol-6-ilamino]-benzamida

141 ΡΕ1585743

Preparado de uma maneira semelhante à descrita para o Exemplo 6 acima, excepto usando o ácido 2-[3-(pir-rol-l-iliminometil)-1-(2-trimetilsilanil-etoximetil)-lH-in-dazol-6-ilamino]-benzóico e 4-(terc-butil-dimetil-silanilo-xi)-but-2-inilamina. 1H-NMR (DMSO-cU δ 10,04 (1H, 9,16 (1H, t, J=5,3 Hz), 9,10 (1H, s) , 8,31 (1H, d, J= 8,7 Hz), 7,78 (1H, d, J= 7,9 Hz), 7,67 (4H, m) , 7,49 (1H, t , J=8,5

Hz), 7,24 (1H, dd, J=1,7, 8,7 Hz), 7,03 (1H, t, J=7,4 Hz), 6,33 (2H, t, J= 2,3 Hz), 5,85 (2H, s) , 4,83 (2H, s) , 4,19 (2H, d, J=5,5 Hz), 3,66 (2H, t, J= 7,9 Hz), 0,94 (2H, m) , 0,89 (9H, s), 0,13 (6H, s), 0,00 (9H, s).

Exemplo de Referência 57 N-(4-Hidroxi-but-2-inil)-2-[3-(pirrol-l-iliminometil)--lH-indazol-6-ilamino]-benzamida

Preparado de uma maneira semelhante à descrita no Exemplo 11 no Pedido de Patente dos E.U.A. com o N° de Série 09/609 335, apresentado em 30 de Junho de 2000, excepto que N-[4-(terc-butil-dimetil-silaniloxi)-but-2-inil]-2- [3- (pirrol-l-iliminometil)-1-(2-trimetilsilanil-etoximetil) -lH-indazol-6-ilamino]-benzamida foi usada em vez de N-metil-N-{3-estiril-l-[2-trimetilsilanil)-etoxi- 142 ΡΕ1585743 metil]-lH-indazol-6-il}-benzeno-l,3-diamina. 1H-NMR (DMSO-d6) δ 13,30 (1H, 5s), 9,87 (1H, 9,04 (1H, t, J= 5,3 Hz), 8,99 (1H, s), 8,19 (1H, d, J=8,5 Hz), 7,70 (1H, d , J=7,3

Hz), 7,46 (4H, m) , 7,31 (1H, s), 7,08 (1H, dd, J=l,7, 8,7

Hz), 6,91 (1H, t, J= 7,3 Hz), 6,21 (2H, t, J=2,l Hz), 5,14 (1H, t, J=5,8 Hz), 4,10 (2H, d , J=5,5 Hz), 4,06 (2H, d , J=5,8 Hz). Anál. calca para C23H20N6O2· 0,35 hexanos*0,20 H20: C-67,45; H-5,86; N-18,81. Encontrado: C-67,70; H-5,73; N-18,56.

Exemplo 58 2,5-Dimetil-2H-pirazole-3-carbonilo

2,5-Dimetil-2H-pirazole-3-carbonilo foi preparado a partir de 1,3-dimetilpirazole-5-carboxilato de etilo de acordo com procedimentos publicados para l-metil-pirazol-5--carbonitrilo por Maria Castellanos e Llinas Montserrat, JCS Perkins Trans I, (1985) 1209-1215. 1H-NMR (CDC13) δ 6,52 (1H, s), 3,96 (3H, s), 2,27 (3H, s) .

Exemplo 59

C- (2,5-Dimetil-2H-pirazol-3-il)-metilamina H2N 143 ΡΕ1585743

Uma suspensão de 2,5-dimetil-2H-pirazole-3-carbo-nilo (654 mg; 5,4 mmol) e paládio 10% sobre carbono (200 mg) em etanol (15 mL) foi agitada num aparelho de hidrogenação de Parr sob 45 psi de H2 durante 17 h. A mistura foi filtrada através de Celite e o filtrado foi concentrado sob pressão reduzida para dar 608 mg de um óleo que foi usado sem qualquer outra purificação. ^-NMR (CDCI3) δ 5,91 (1H, s), 3,81, 3,73 (2H, 2s) , 3,75 (3H, s) , 2,21 (3H, s).

Exemplo 60 N- (2,5-Dimetil-2H-pirazol-3-ilmetil)-2-[3-(pirrol--1-iliminometil)-1-(2-trimetilsilanil-etoximetil)--lH-indazol-6-ilamino]-benzamida

Preparado de uma maneira semelhante à descrita para o Exemplo 6 acima, excepto usando o ácido 2-[3-(pir-rol-l-iliminometil)-1-(2-trimetilsilanil-etoximetil)-lH-in-dazol-6-ilamino] -benzóico e C-(2,5-dimetil-2il-pirazol-3--il)-metilamina. 1H-NMR (CDC13) δ 9,56 (1H, s) , 8,68 (1H, s), 8,30 (1H, d, J= 8,7 Hz), 7,49 (1H, d, J= 8,3 Hz), 7,43 144 ΡΕ1585743 (1H, dd, J= 7, 9 , 1,5 Hz) , 7,36 -7,31 (2H , m), 7,23 (2H , t, J=2, í 5 Hz), 7,11 ' (1H, dd, <7=8,7, 1, 9 Hz), 6,83 (1H, t, J=1,2 Hz) , 6,32 (1H, bt), 6,29 (2H, t, J= 2,3 Hz) , 6,01 (1H, s), 5,67 (2H, s) , 4,61 (2H, d, J= 5,6 Hz) , 3,60 (3H, s) , 3,58 (2H, t, J= =8,3 Hz) , 2,22 (3H, s), 0,90 (2H, t, J= =8,7 Hz) , 0,06 (9H, s) .

Exemplo de Referência 61 N-(2,5-Dimetil-2H-pirazol-3-ilmetil)-2-[3-(pirrol--1-iliminometil)-lH-indazol-6-ilamino]-benzamida

Preparado de uma maneira semelhante à descrita no Exemplo 11 no Pedido de Patente dos E.U.A. com o N° de Série 09/609 335, apresentado em 30 de Junho de 2000, excepto que N- (2,5-dimetil-2H-pirazol-3-ilmetil)-2-[3-(pir-rol-l-iliminometil)-1-(2-trimetilsilanil-etoximetil)-1H-indazol-6-ilamino]-benzamida foi usada em vez de N-metil-N-{3-estiril-l-[2-trimetilsilanil)-etoximetil]-lH-indazol-6-il}-benzeno-l,3-diamina. 1H-NMR (DMSO-cy δ 13,27 (1H, s), 9,72 (1H, s), 9,05 (1H, t, J=5,3 Hz), 8,97 (1H, s) , 8,16 (1H, d, J=8,7 Hz), 7,68 (1H, dd, J=8,3, 1,9 Hz), 7,50 (2H, t, J= 2,6 Hz), 7,46-7,38 (2H, m) , 7,25 (1H, s) , 7,05 145 ΡΕ1585743 (1H, dd, J=8,7 , 1,9 Hz), 6,91 (1H, t, J=6,80 Hz), 6,20 (2H, t, J~- =2,3 Hz) , 5,91 (1H, s), 4,43 (2H, d, J= 5,6 Hz), 3,71 (3H, s), 2,04 (3H, s) .

Exemplo de Referência 62 Ácido 2-[3-(pirrol-l-iliminometil)--lH-indazol-6-ilamino]-benzóico

Preparado de uma maneira semelhante à descrita no Exemplo 11 no Pedido de Patente dos E.U.A. com o N° de Série 09/609 335, apresentado em 30 de Junho de 2000, excepto usando ácido 2-[3-(pirrol-l-iliminometil)-1-(2-tri-metilsilanil-etoximetil)-lH-indazol-6-ilamino]-benzóico em vez de N-metil-N-{3-estiril-l-[2-trimetilsilanil)-etoxime-til]-lH-indazol-6-il}-benzeno-l,3-diamina. 1H-NMR (DMSO-dô) δ 13,12 (1H, s), 12,70 (1H, s) , 8,94 (1H, s) , 8,10 (1H, d, J=8,7 Hz), 7,91 (1H , dd, J= 1, 7, 7,7 Hz), 7,50 (2H, t, J= 2,3 Hz) , 7,36 (1H, d, , J=7, 9 Hz) , 7,27 (1H, d, J=l, 5 Hz) , 7,16 (1H, t, J=7,5 Hz), 6,94 (1H, dd, J=l,7, 8,7 Hz), 6,68 (1H, t, J= 7,5 Hz) , 6,19 (2H, t, J= =2,3 Hz) .

Exemplo de Referência 63 N-Prop-2-inil-2-[3-(pirrol-l-iliminometil)--lH-indazol-6-ilamino]-benzamida 146 ΡΕ1585743

Preparado de uma maneira semelhante à descrita para o Exemplo 6 acima, excepto usando o ácido 2-[3-(pir-rol-l-iliminometil)-lH-indazol-6-ilamino]-benzóico e pro-pargilamina. 1H-NMR (DMSO-cy δ 13,30 (1H, s) , 9,82 (1H, s), 9,04 (1H, t, J=5,6 Hz), 8,98 (1H, s) , 8,19 (1H, d, J=8, 6 Hz), 7,69 (1H, d, J=7,9 Hz), 7,45 (4H, m) , 7,31 (1H, s), 7,08 (1H, d, J=8, 6 Hz), 6,91 (1H, t, J= 7,6 Hz), 6,21 (2H, s) , 4,05 (2H, s), 3,13 (1H, s) . Anál. calca para C22Hi8N6O-0,40 Η2Ο·0,05 hexanos: C-67, 97; H-5,01; N-21,33.

Encontrado: C-67,91; H-4,78; N-21,00.

Exemplo de Referência 64 N-(4-Hidroxi-but-2-inil)-2-[3-(2-piridin-2-il-vinil)- -lií-indazol-6-ilamino] -benzamida

147 ΡΕ1585743

Preparado de uma maneira semelhante à descrita para o Exemplo 6 acima, excepto usando 2-[3-(2-piridin-2--il-vinil)-lH-indazol-6-ilamino]-benzoato de tetrabutilamó-nio e 3-amino-but-2-in-l-ol. 1H-NMR (DMSO-dê) δ 12,95 (1H, s), 9,84 (1H, s), 9,02 (1H, t, J=5,6 Hz), 8,59 (1H, d, J=4,9 Hz), 8,08 (1H, d, J=8,7 Hz), 7,90 (1H, d, J=16,2 Hz), 7,80 (1H, t, J=7,2 Hz), 7,70-7, 64 (2H, m) , 7,51 (1H, d, J=16,2 Hz), 7,45-7,36 (2H, m), 7,27-7,24 (2H, m), 7,02 (1H, d, J=9,0 Hz), 6,88 (1H, t, J=7,2 Hz), 5,13 (1H, t, J=5,6 Hz), 4,10-4,04 (4H, m).

Exemplo de Referência 65 N- (2,5-Dimetil-2H-pirazol-3-ilmetil)-2-[3-(piridin--2-il-vinil)-lH-indazol-6-ilamino]-benzamida

Preparado de uma maneira semelhante à descrita para o Exemplo 6 acima, excepto usando 2-[3-(2-piridin-2--il-vinil)-lfí-indazol-6-ilamino]-benzoato de tetrabutilamó-nio e C- (2,5-dimetil-2fí-pirazol-3-ilmetilamina. 1H-NMR (DMSO-de) δ 12,93 (1H, s) , 9,70 (1H, s) , 9,04 (1H, bt) , 148 ΡΕ1585743 8,58 (1Η, d, J=4,0 Hz), 8,07 (1H, d, J=8,8 Hz), 7,88 (1H, d, J=16,4 Hz), 7,79 (1H, t, J=8,6 Hz), 7,71-7,64 (2H, m) , 7,50 (1H, d, J=16,4 Hz), 7,44-7,39 (2H, m) , 7,28-7,23 (2H, m), 7,00 (1H, d, J=8,8 Hz), 6,90 (1H, t, J=8,0 Hz), 5,91 (1H, s), 4,43 (2H, d, J=5,5 Hz), 3,71 (3H, s), 2,04 (3H, s).

Os compostos dos Exemplos acima descritos podem ser testados à sua actividade usando os testes descritos abaixo.

Testagem Biológica. Ensaios de Enzima A estimulação da proliferação celular por factores de crescimento tais como VEFG, FGF e outros depende da sua indução de autofosforilação de cada uma das suas tirosina-cinases do receptor respectivo. Por conseguinte, a capacidade de um inibidor de proteina-cinase bloquear a autofosforilação pode ser medida +ela inibição dos substratos de péptido. Para medir a actividade de inibição da proteina-cinase dos compostos, foram imaginados os seguintes construtos.

Construto de VEGF-R2 para Ensaio

Este construto determina a capacidade de um composto de teste inibir a actividade da tirosina-cinase. Um construto (VEGF-R2A50) do dominio citosólico do receptor 149 ΡΕ1585743 2 do factor de crescimento endotelial vascular (VEGF-R2) humano com falta dos 50 resíduos centrais dos 68 resíduos do domínio de inserção da cinase foi expresso num sistema celular baculovírus/insecto. Dos 1356 resíduos do VEGF-R2 de comprimento completo, VEGF-R2A50 contém os resíduos 806-939 e 990-1171, e também uma mutação pontual (E990V) no interior do domínio de inserção de cinase relativo ao VEGF-R2 de tipo selvagem. A autofosforilação do construto purificado foi realizada por incubação da enzima a uma concentração de 4 μΜ na presença de ATP 3 mM e MgCl2 40 mM em HEPES 100 mM, pH 7,5, contendo glicerol 5% e DTT 5 mM, a 4 °C durante 2 h. Após a autofosforilação, este construto mostrou possuir actividade catalítica essencialmente equivalente ao construto do domínio de cinase autofosforilada do tipo selvagem. Ver Parast et al., Biochemistry, 37 (1998) 16788-16801.

Construto de FGF-R1 para Ensaio O domínio de cinase intracelular de FGF-R1 humano foi expresso usando o sistema de expressão do vector baculovírus partindo do resíduo 456 de metionina até 766 de glutamato endógenos, de acordo com o sistema de numeração de resíduos de Mohammadi et al., Mol. Cell. Biol., 16 (1996) 977-989. Em aditamento, o construto também tem as 3 seguintes substituições de aminoácidos: L457V, C488A e C584S. 150 ΡΕ1585743

Construto de LCK para Ensaio A tirosina-cinase LCK foi expressa em células de insecto como uma deleção N-terminal partindo do resíduo 223 de aminoácido até ao fim da proteína no resíduo 509, com as duas seguintes substituições de aminoácido no terminal N: P233M e C224D.

Construto de CHK1 para Ensaio CHKl humana de comprimento completo (FL-CHKl) C-terminalmente marcada His foi expressa usando o sistema celular baculovírus/insecto. Contém 6 resíduos de histidina (6 x His-tag) no terminal C da CHKl humana do aminoácido 476. A proteína foi purificada por técnicas cromatográficas convencionais.

Construto de CDK2/Ciclina A para Ensaio CDK2 foi purificada usando metodologia publicada (Rosenblatt et al., J. Mol. Biol., 230 (1993) 1317-1319) a partir de células de insectos que tinham sido infectados com um vector de expressão de baculovírus. A ciclina A foi purificada a partir de células E. coli expressando ciclina A recombinante de comprimento completo e um construto de ciclina A truncado foi gerado por proteólise limitada e purificado conforme descrito previamente (Jeffrey et al., Nature, 376 (1995) 313-320). 151 ΡΕ1585743

Construto de CDK4/Ciclina D para Ensaio

Um complexo de CDK4 humana e ciclina D3B, ou um complexo de ciclina Dl e uma proteína de fusão de CDK4 humana e glutationa-S-transferase (GST-CDK4), foi purificado usando técnicas cromatográficas bioquímicas tradicionais de células de insectos que tinham sido co-infectados com os vectores de expressão de baculovírus correspondentes.

Construto de FAK para Ensaio 0 domínio catalítico de FAK humana (FAKcd409) foi expresso usando o sistema de expressão de vector de baculovírus. 0 domínio de aminoácido 280 expressado compreende resíduos de metionina 409 a glutamato 689. Uma substituição de aminoácido existe (P410T) relativamente ao número de determinação de sequência L13616 publicado por G. S. Whithey et al., DNA Cell Biol., 9 (1993) 823-30. A proteína foi purificada usando técnicas cromatográficas convencionais.

Construto de TIE-2 (TEK) para Ensaio O domínio de tirosina-cinase TIE-2 foi expresso em células de insecto como uma deleção N-terminal partindo do resíduo 774 de aminoácido até ao fim da proteína no resíduo 1124. Este construto também carrega uma mutação R774M, que serve como resíduo de metionina de iniciação na translação. ΡΕ1585743 152

Ensaio de VEGF-R2

Ensaio Espectrofotométrico (FLVK-P) Acoplado A produção de ADP a partir de ATP que acompanha a transferência de fosforilo foi acoplada à oxidação de NADH usando fosfoenolpiruvato (PEP) e um sistema tendo piruvato-cinase (PK) e láctico-desidrogenase (LDH). A oxidação de NADH foi monitorizada seguindo a diminuição da absorvância em 340 nm (e34o = 6,22 cm"1 mM"1) usando um espectrofotómetro Beckman DU 650. As condições de ensaio para VEGF-R2A50 fosforilado (indicado como FLVK-P nos quadros abaixo) foram as seguintes: PEP 1 mM; NADH 250 μΜ; 50 unidades de LDH/mL; 20 unidades de PK/mL; DTT 5 mM; poli(E4Yi) 5,1 mM; ATP 1 mM; e MgCl2 25 mM em HEPES 200 mM, pH 7,5. As condições de ensaio para VEGF-R2A50 não fosforilado (indicado como FLVK nos quadros) foram os seguintes: PEP 1 mM; NADH 250 μΜ; 50 unidades de LDH/mL; 20 unidades de PK/mL; DTT 5 mM; poli(E4Yi) 20 mM; ATP 3 mM; e MgCl2 60 mM e MnCl2 2 mM em HEPES 200 mM, pH 7,5. Os ensaios foram iniciados com enzima 5 a 40 nM. Os valores K4 foram determinados medindo a actividade da enzima em presença de concentrações variadas de compostos de teste.

Os dados foram analisados usando software Enzyme Kinetic e

Kaleidagraph.

Ensaio ELISA A formação de fosfogastrina foi monitorizada usando péptido gastrina biotinilada (1-17) como substrato. 153 ΡΕ1585743 A fosfogastrina biotinilada foi imobilizada usando placas de microtitulação de 96 cavidades revestidas com estreptavidina seguido por detecção usando anticorpo antifosfotirosina conjugado a rábano silvestre-peroxidase. A actividade de rábano silvestre-peroxidase foi monitorizada usando sal de diamónio de 2,2'-azino-di-[3--etilbenzatiazolina sulfonato(6)] (ABTS). Soluções de ensaio típicas continham: péptido gastrina biotinilada 2 μΜ, DTT 5 mM, ATP 20 μΜ, MgCL2 26 mM e MnCl2 2 mM em HEPES 200 mM, pH 7,5. O ensaio foi iniciado com 0,8 nM de VEGF-R2A50 fosforilado. A actividade de rábano silvestre--peroxidase foi avaliada usando ABTS 10 mM. A reacção de rábano silvestre-peroxidase foi extinta pela adição de ácido (H2SO4) seguido por leitura da absorvância em 405 nm. Os valores de Ki foram determinados medindo a actividade de enzima na presença de concentrações variadas de compostos de teste. Os dados foram analisados usando software Enzyme Kinetic e Kaleidagraph.

Ensaio de FGF-R O ensaio espectrofotométrico foi realizado conforme descrito acima para VEGF-R2, com excepção para as seguintes alterações nas concentrações: FGF-R = 50 nM, ATP = 2 mM e poli (E4Y1) = 15 mM.

Ensaio de LCK O ensaio espectrofotométrico foi realizado 154 ΡΕ1585743 conforme descrito acima para VEGF-R2, com excepção para as seguintes alterações nas concentrações: LCK = 60 nM,

MgCl2 = 0 mM, poli(E4Yi) = 20 mM.

Ensaio de CHK1 A produção de ADP a partir de ATP que acompanha a transferência de fosforilo para o substrato sintético péptido Syntide-2 (PLARTLSVAGLPGKK) foi acoplada à oxidação de NADH usando fosfoenolpiruvato (PEP) e um sistema tendo piruvato-cinase (PK) e láctico-desidrogenase (LDH) . A oxidação de NADH foi monitorizada seguindo a diminuição da absorvância em 340 nm (8340 = 6,22 cm’1 mM’1) usando um espectrofotómetro HP8452. As soluções de reacção típicas continham: PEP 4 mM; NADH 0,15 mM; 28 unidades de LDH/mL; 16 unidades de PK/mL; Syntide-2 0,125 mM; ATP 0,15 mM;

MgCl2 25 mM em TRIS 50 mM, pH 7,5; e NaCl 400 mM. Os ensaios foram iniciados 10 nM de FL-CHK1. Os valores Ki foram determinados medindo a actividade de enzima inicial na presença de concentrações variadas de compostos de teste. Os dados foram analisados usando software Enzyme Kinetic e Kaleidagraph.

Ensaios de CDK2/Ciclina A e CDK4/Ciclina D A actividade de cinase dependente de ciclina foi medido pela quantificação da incorporação dependente do tempo catalisada por enzima de fosfato radioactivo de 155 ΡΕ1585743 [32P]ATP num fragmento recombinante da proteína do retinoblastoma. A menos que indicado de maneira diferente, os ensaios foram realizados em placas de 96 cavidades num volume total de 50 pL, na presença de HEPES (N-[2-hidroxi-etil]piperazina-N[ácido 2-etanonossulfónico]) 10 mM (pH 7,4), MgCl2 10 mM, adenosina-trifosfato (ATP) 25 pM, ovalbumina 1 mg/mL, leupeptina 5 pg/mL, ditiotreitol 1 nM, β-glicerofosfato 10 mM, vanadato de sódio 0,1 mM, fluoreto de sódio 1 mM, etilenoglicol-ácido bis (éter β-aminoetili-co)-N,N,N',N'-tetraacético (EGTA) 2,5 mM, dimetilsulfóxido 2% (v/v) e [32P] ATP 0,03-0,2 pCi. O substrato (0,3-0,5 pg) foi fragmento de proteína de retinoblastoma recombinante purificado (Rb) (resíduos 386-928 da proteína de retinoblastoma nativo; 62,3 kDa, contendo a maioria dos sítios de fosforilação encontrados na proteína de 106 kDa nativa, assim como uma marca de seis resíduos de histidina para facilidade de purificação). As reacções foram iniciadas com CDK2 (complexo CDK2/ciclina A 150 nM) ou CDK4 (complexo CDK4/ciclina D3 50 nM), incubadas a 30 °C, e terminadas após 20 min (minutos) pela adição de ácido etilenodiaminatetraacético (EDTA) a 250 mM. O substrato fosforilado foi em seguida capturado numa membrana de nitrocelulose usando uma filtração múltipla de 96 cavidades e a radioactividade incorporada foi removida por lavagem repetida com ácido fosfórico 0,85%. A radioactividade foi quantificada expondo as membranas de nitrocelulose secas a um gerador de imagens de fósforo. Os valores Ki aparentes 156 ΡΕ1585743 foram medidos ensaiando a actividade de enzima na presença de diferentes concentrações de composto e subtraindo a radioactividade de fundo medida na ausência de enzima. Os parâmetros cinéticos (kcat, Km para ATP) foram medidos para cada enzima sob as condições de ensaio usuais pela determinação da dependência das proporções iniciais da concentração de ATP. Os dados foram ajustados a uma equação para a inibição da ligação firme competitiva usando o software KineTic (BioKin, Ltd.). Os valores Ki medidos para inibidores conhecidos contra CDK4 e CDK2 concordaram com os valores de IC5o publicados. A actividade especifica de CDK4 foi a mesma quer complexada com ciclina D3 de comprimento completo quer com o construto de Ciclina D3 truncada; ambos os complexos também produziram valores Ki muito semelhantes para inibidores seleccionados.

Ensaio de FAK FAK-HTS utilizou o ensaio de polarização de fluorescência proporcionado por LJL Biosystems. A reacção de cinase continha: Hepes 100 mM pH 7,5, MgCl2 1 mM, ATP 1 mM e poli-Glu-Tyr (4:1) 1 mg/mL. A reacção é iniciada pela adição de FAKcd409 5 nM. A reacção é terminada pela adição de EDTA seguido de péptido rotulado com flúor e anticorpo anti-fosfotirosina, ambos proporcionados por LJL Biosystems. Os resultados da inibição são lidos num detector Analyst (LJL). ΡΕ1585743 157

Ensaio Espectrofotométrico de TIE-2 A produção catalisada por cinase de ADP a partir de ATP que acompanha a transferência de fosforilo para o copolimero aleatorizado poli (Glu4Tyr) foi acoplada à oxidação de NADH através das actividades de piruvato-cinase (PK) e lactato-desidrogenase (LHD). A conversão de NADH a NAD+ foi monitorizada pela diminuição na absorvância em 340 nm (ε = 6,22 cm-1 mM-1) usando um espectrofotómetro Beckman DU650). As soluções de reacção tipicas continham fosfoenolpiruvato 1 mM, NADH 0,24 mM, MgCl2 40 mM, DTT 5 mM, poli (Clu4Tyr) 2,9 mg/mL, ATP 0,5 mM, 15 unidades de PK/mL, 15 unidades de LDH/mL em HEPES 100 mM; pH 7,5. Os ensaios foram iniciados com a adição de Tie-2 (aa 775-1122) fosforilado 4 a 12 nM. A percentagem de inibição foi determinada em triplicado a um nivel de inibidor de 1 pM.

Ensaio DELFIA de TIE-2 A formação de fosfotirosina foi monitorizada usando como substrato péptido p34cdc2 biotinilado (aa6-20 = KVEKIGEGTYGVVYK). O péptido biotinilado foi imobilizado usando NeutrAvidin™ em placas de 96 cavidades revestidas seguido pela detecção usando anticorpo anti-fosfotirosina (PY20) conjugado a quelato európio NI. As soluções de ensaio tipicas continham: péptido p34cdc2 biotinilado 1 pM, ATP 150 pM, MgCL2 5 mM, DTT 1 mM, BSA 0,01%, glicerol 5%, DMSO 2%, HEPES 25 mM pH 7,5. O ensaio foi iniciado na placa 158 ΡΕ1585743

NeutrAvidin com 50 nM de domínio intracelular TIE2. A reacção de cinase foi terminada com EDTA 50 mM. As placas foram em seguida lavadas e foi adicionado anticorpo európio. Após incubação, elas foram de novo lavadas e foi adicionada "Enhancement Solution" de DELFIA™. As placas foram lidas com regulações de tempo resolvido Európio estândar (Ex 340 nm, em 615 nm, pausa 400 ys, janela 400 ys). A percentagem de inibição foi calculada com referência a cavidades intraplaca a que foi adicionado DMSO em vez do composto em DMSO, com o fundo subtraído do experimental e do controlo com referência a uma cavidade de intraplaca que tinha EDTA adicionado antes da adição de enzima.

Ensaio de Proliferação de HUVEC

Este ensaio determina a capacidade de um composto de teste inibir a proliferação estimulada por factor de crescimento de células endoteliais da veia umbilical humana ("HUVEC"). As células HUVEC (passagem 3-4, Clonetics, Corp.) foram descongeladas em meio de cultura EGM2 (Clonetics Corp.) em frascos T75. Meio EGM2 fresco foi adicionado aos frascos 24 horas mais tarde. Quatro ou cinco dias mais tarde, as células foram expostas a um outro meio de cultura (meio F12K suplementado com soro bovino fetal (FBS) 10%, suplemento de crescimento celular endotelial (ECGS) 60 yg/mL e heparina 0,1 mg/mL). Células HUVEC crescendo exponencialmente foram depois disso usadas nos 159 ΡΕ1585743 experimentos. Dez a doze mil células HUVEC foram colocadas em placas de 96 cavidades em 100 μ]ΐ de meio de cultura rico (acima descrito). A células foram deixadas a agregar durante 24 horas neste meio. O meio foi em seguida removido por aspiração e 105 μΐι de meio de fome (F12K+FBS a 1%) foram adicionados a cada cavidade. Após 24 horas, 15 μΐ^ de agente de teste dissolvidos em DMSO 1% em meio de fome ou este veiculo isolado foram adicionados a cada cavidade de tratamento; a concentração de DMSO final foi 0,1%. Uma hora mais tarde, 30 μΐ, de VEGF (30 ng/mL) em meio de fome foram adicionados a todas as cavidades com excepção das que continham controlos não tratados; a concentração de VEGF final foi de 6 ng/mL. A proliferação celular foi quantificada 72 horas mais tarde por redução de cor de MTT, momento em que as células foram expostas durante 4 horas a MTT (Promega Corp.). A redução de cor foi parada pela adição de uma solução stop (Promega Corp.) e a absorvância em λ 595 foi determinada num leitor de placa de espectrofotómetro de 96 cavidades.

Os valores IC50 foram calculados por ajustamento à curva da resposta de A595 a várias concentrações do agente de teste; tipicamente, sete concentrações separadas por 0,5 log foram empregues, com cavidades triplicadas em cada concentração. Para placas de biblioteca de composto em rastreio, oram empregues uma ou duas concentrações (uma cavidade por concentração) e a % de inibição foi calculada pela seguinte fórmula: 160 ΡΕ1585743 inibição % = (controlo - teste) : (controlo - fome) onde controlo = A595 quando VEGF está presente sem agente de teste teste = A595 quando VEGF está presente com agente de teste fome = A595 quando VEGF e agente de teste estão ambos ausentes.

Ensaio de PK do Rato A farmacocinética (e.g., absorção e eliminação) de fármacos em ratos foi analisada usando o seguinte experimento. Os compostos de teste foram formulados na forma de uma solução ou suspensão num veiculo PEG 400:H20 acidificada (30:70) ou na forma de uma suspensão em CMC 0,5%. Isto foi administrado oralmente (p.o.) e intraperi-tonealmente (i.p.) em doses variáveis a dois grupos distintos (n=4) de ratos fêmeas B6. Foram recolhidas amostras de sangue via hemorragia orbital nos momentos: 0 horas (pré-dose) , 0,5 h, 1,0 h, 2,0 h e 4,0 h e 7,0 h pós-dose. O plasma foi obtido de cada amostra por centrifugação a 2500 rpm durante 5 min. O composto de teste foi extraído do plasma por um método de precipitação de proteína orgânica. Para cada momento da hemorragia, 50 μΕ de plasma foram combinados com 1,0 mL de acetonitrilo, turbilhonados durante 2 min e em seguida centrifugados a 4000 rpm durante 15 min para precipitar a proteína e extrair o composto de teste. A seguir, o sobrenadante de acetonitrilo (o extracto contendo o composto de teste) foi vertido em novos tubos de ensaio e evaporado numa placa 161 ΡΕ1585743 quente (25 °C) sob uma corrente de gás N2. A cada tubo contendo o extracto de composto de teste seco, 125 μΙ* de fase móvel (NH4H2PO4 0,025 Μ + TEA 2,5 mL/L:aceto-nitrilo, 60:40) foram adicionados. O composto de teste foi ressuspenso numa fase móvel por turbilhonamento e foi removida mais proteína por centrifugação a 4000 rpm durante 5 min. Cada amostra foi vertida num frasco de HPLC para análise do composto de teste num "Hewlett Packard 1100 series HPLC" com detecção UV. Para cada amostra, foram injectados 95 μΕ numa coluna Phenomenex-Prodigy de inversão de fases C-18, 150 x 3,2 mm e eluída com um gradiente de 45-50% de acetonitrilo ao longo de 10 min. As concentrações no plasma de composto de teste ^g/L) foram determinadas por uma comparação com a curva padrão (área de pico vs. conc. μρ/πΛ) usando concentrações conhecidas de composto de teste extraído de amostras de plasma da maneira acima descrita. Junto com os padrões e desconhecidos, três grupos (n=4) de controlos de qualidade (0,25 μς/ταΣ, 1,5 μς/κιΕ e 7,5 μρ/πΛ) foram corridos para assegurar a consistência da análise. A curva padrão tinha R2 >0,99 e os controlos de qualidade estavam todos dentro de 10% dos seus valores esperados. As amostras de teste quantificadas foram representadas em gráfico para visualização usando o software Kalidagraph e os seus parâmetros farmacocinéticos foram determinados usando software WIN NONLIN. O Exemplo l(a) produziu os resultados seguintes: 0,69 (pK de Rato, AUC, ip, yg-h/mL); 0,33 (pK de Rato, AUC, po, pg-h/mL). ΡΕ1585743 162

Fosforilação de KDR (VEGFR2) em Ensaio de Células PAE-KDR

Este ensaio determina a capacidade de um composto de teste para inibir a autofosforilação de KDR em células KDR endoteliais da aorta porcina (PAE). As células PAE que sobreexpressam KDR humano foram usadas neste ensaio. As células foram cultivadas em meio F12 de Ham suplementado com soro bovino fetal (FBS) 10% e G418 400 μς/ιηΕ. Trinta mil células foram semeadas em cada cavidade de uma placa de 96 cavidades em 75 pL de meio de crescimento e deixadas a fixarem-se durante 6 horas a 37 °C. As células foram em seguida expostas ao meio de fome (meio F12 de Ham suplementado com FBS 0,1%) durante 16 horas. Após o período de fome terminar, 10 μ]7 de agente de teste em DMSO 5% em meio de fome foram adicionados às cavidades de teste e 10 pL do veículo (DMSO 5% em meio de fome) foram adicionados às cavidades de controlo. A concentração de DMSO final em cada cavidade foi de 0,5%. As placas foram incubadas a 37 °C durante 1 hora e as células foram em seguida estimuladas com VEGF 500 ng/mL (comercialmente disponível em R & D System) na presença de Na3V04 2 mM durante 8 minutos. As células foram lavadas uma vez com Na3V04 1 mM em HBSS e lisadas pela adição de 50 μΕ por cavidade de tampão de lise. Cem μΐϋ de tampão de diluição foram em seguida adicionados a cada cavidade e o lisado celular diluído foi transferido para uma placa revestida de anticoelho de cabra de 96 cavidades (comercialmente 163 ΡΕ1585743 disponível em Pierce), que foi pré-revestida com anticorpo C-20 Anti-flk-1 anti-Humano de Coelho (comercialmente disponível em Santa Cruz). As placas foram incubadas à temperatura ambiente durante 2 horas e lavadas sete vezes com Tween 20 1% em PBS. HRP-PY20 (comercialmente disponível em Santa Cruz) foi diluído e adicionado à placa para uma incubação de 30 minutos. As placas foram em seguida lavadas outra vez e foi adicionado substrato de oxidase TMB (comercialmente disponível em Kirkegaard & Perry) para uma incubação de 10 minutos. Cem μΒ de H2S04 0, 09 N foram adicionados a cada cavidade da placa de 96 cavidades para parar a reacção. O estado de fosforilação foi avaliado por espectrofotómetro com leitura em 450 nm. Os valores IC50 foram calculados por ajustamento da curva usando uma análise de quatro parâmetros.

Fosforilação de PAE-PDGFR|J em Ensaio de Células PAE-PDGFRp

Este ensaio determina a capacidade de um composto de teste para inibir a autofosforilação de PDGFRp em células PDGFRp endoteliais da aorta porcina (PAE). As células PAE que sobreexpressam PDGFRp humano foram usadas neste ensaio. As células foram cultivadas em meio F12 de Ham suplementado com soro bovino fetal (FBS) 10% e G418 400 μρ/πιΕ. Vinte mil células foram semeadas em cada cavidade de uma placa de 96 cavidades em 50 μΕ de meio de crescimento e deixadas a fixarem-se durante 6 horas a 164 ΡΕ1585743 37 °C. As células foram em seguida expostas ao meio de fome (meio F12 de Ham suplementado com FBS 0,1%) durante 16 horas. Após o período de fome terminar, 10 μΐ de agente de teste em DMSO 5% em meio de fome foram adicionados às cavidades de teste e 10 μΙ. do veículo (DMSO 5% em meio de fome) foram adicionados às cavidades de controlo. A concentração de DMSO final em cada cavidade foi de 0,5%. As placas foram incubadas a 37 °C durante 1 hora e as células foram em seguida estimuladas com PDGF-BB 1 μg/mL (R & D System) na presença de Na3V04 2 mM durante 8 minutos. As células foram lavadas uma vez com Na3V04 1 mM em HBSS e lisadas pela adição de 50 pL por cavidade de tampão de lise. Cem pL de tampão de diluição foram em seguida adicionados a cada cavidade e o lisado celular diluído foi transferido para uma placa revestida de anticoelho de cabra de 96 cavidades (Pierce), que foi pré-revestida com anticorpo PDGFRP anti-Humano de Coelho (Santa Cruz) . As placas foram incubadas à temperatura ambiente durante 2 horas e lavadas sete vezes com Tween 20 1% em PBS. HRP-PY20 (Santa Cruz) foi diluído e adicionado à placa para uma incubação de 30 minutos. As placas foram em seguida lavadas outra vez e foi adicionado substrato de TMB-peroxidase (Kirkegaard & Perry) para uma incubação de 10 minutos. Cem μΒ de H2S04 0,09 N foram adicionados a cada cavidade da placa de 96 cavidades para parar a reacção. O estado de fosforilação foi avaliado por espectrofotómetro com leitura em 450 nm. Os valores IC50 foram calculados por ajustamento da curva usando uma análise de quatro parâmetros. 165 ΡΕ1585743

Ensaio de Microssoma de Fígado Humano (HLM)

0 metabolismo do composto nos microssomas de fígado humano foi medido por procedimentos de ensaio analítico de LC-MS, como segue. Primeiro, microssomas de fígado humano (HLM) foram descongelados e diluídos até 5 mg/mL com tampão de fosfato de potássio (KP04) 100 mM frio. Quantidades apropriadas de tampão de KP04, solução de regeneração de NADPH (contendo B-NADP, glucose-6-fosfato, glucose-6-fosfato-desidrogenase e MgCl2) e HLM foram pré-incubadas em tubos de vidro 13 x 100 mm a 37 °C durante 10 min (3 tubos por composto de teste - triplicado) . O composto de teste (5 μΜ final) foi adicionado a cada um dos tubos para iniciar a reacção e foi misturado com turbilhonamento suave, seguido por incubação a 37 °C. A t=0 e 2 h, uma amostra de 250 μL foi removida de cada tubo de incubação para tubos de vidro de 12 x 75 mm separados contendo 1 mL de acetonitrilo arrefecido em gelo com reserpina 0,05 μΜ. As amostras foram centrifugadas a 4000 rpm durante 20 min para precipitar proteínas e sal (Beckman Allegra 6KR, S/N ALK98D06, N° 634) . O sobrenadante foi transferido para novos tubos de vidro 12 x 75 mm e evaporado por evaporador a vácuo centrífugo Speed-Vac. As amostras foram reconstituídas em 200 μΒ de ácido fórmico 0,1%/acetonitrilo (90/10) e turbilhonadas vigorosamente até dissolverem. As amostras foram em seguida transferidas para tubos de microcentrífuga de polipropileno separados e 166 ΡΕ1585743 centrifugados a 14000 x g durante 10 min (Fisher Micro 14, S/N M00117580) . Para cada replicado (N° 1-3) em cada momento (0 e 2 h), uma amostra aliquota de cada composto de teste foi combinada numa inserção em frasco de HPLC único (total de 6 amostras) para análise LC-MS, o que é descrito abaixo.

As amostras de composto combinadas foram injectadas num sistema LC-MS composto por HPLC de arranjo ordenado de diodo Hewlett Packard 1100 e um espectrómetro de massa quádruplo Micromass Quattro II triplo operando em modo SIR de electrospray positivo (programado para examinar especificamente o ião molecular de cada composto de teste) . Cada pico de composto de teste foi integrado em cada momento. Para cada composto, da área do pico em cada momento (n=3) foi feita uma média e isto significa área de pico às 2 h dividida por uma área de pico em média no momento 0 horas para obter a percentagem de composto de teste restante às 2 h.

Os resultados da testagem dos compostos usando vários ensaios são sumariados no Quadro abaixo, onde uma notação de "% 0" indica a percentagem de inibição na concentração indicada, e valores representam Hi (nM) ou % de inibição a uma concentração de composto de 1 μΜ para * ou 50 nM para **, a menos que indicado de maneira diferente. "NT" indica nenhuma inibição significativa ou não testado. ΡΕ1585743 167

Quadro 1

Exem plo N° Ki % FLVK inib % a 50 nM FLVK- p -k LCK-P* inib % a 1 pM FGF-P inib % a 1 μΜ HUVEC IC5o (nM) HUVEC + albumina IC50 (nM) 0. restante (HTM) autofos PAE PDGFR IC50 (nM) PAE KDR IC50 (nM) MÉD bFGF Huvec IC50 (nM) MÉD 3 (a) 98 NT 30 99 12,7 NT NT NT NT NT 3 (b) 98 NT 27 96 5,7 NT 84@2H NT NT NT 3 (c) 91 NT 9 83 0,43 9,2 46@0,5H NT NT NT 3 (d) 89 NT 11 80 0,4 7,5 68Θ2Η 3,5 NT 147 3 (f) 95 NT 41 60 NT >100 NT NT NT NT 3 (g) 95 NT 28 72 1,1 NT 7200,5H NT NT NT 3 (h) 96 NT 37 85 1,6 NT 7500,5H 0,63 NT NT 3(1) 88 NT 22 45 0,2 NT NT 1,9 NT 1000 3 (j) 80 NT 17 43 1,7 NT 6500,5H 4,7 NT NT 3 (k) 74 NT 19 36 0,8 NT 7500,5H 5 NT 1000 3 (q) 47 NT 7 31 5 NT 8200,5H 5,2 NT NT 2 (h) 84 NT NT 75 1,6 NT 7400,5H 2,8 NT 70 1 (k) 27 NT NT 12 >10 NT NT NT NT NT 2 (g) 83 NT NT 79 0,71 NT 8500,5H 10,5 NT 173 64 94 NT NT 39 0,15 NT 6600,5H 5,5 NT 1250 65 3,1lnM NT NT NT 3,4 NT 8600,5H 5,8 NT NT 61 65 NT NT 14 6, 5 NT NT NT NT 662 41 45 NT NT 11 6,4 NT NT NT NT 3775 51 82 NT NT 52 NT NT NT NT NT NT 15 64 NT NT 29 1,5 NT NT 12,3 NT 1613 36 95 0,3nM NT 69 1,67 NT NT NT 1,62 935 13 80 NT NT 63 NT NT NT 6 NT NT 18 94 NT NT 59% NT NT NT NT NT 1882 20 91 NT NT 35% 0,084 NT NT NT NT NT 37 90 NT NT 45 NT NT NT NT 0,76 NT 38 75 NT NT NT NT 0, 68 NT 2 NT NT 39 96 NT NT 76% NT NT NT 4,7 NT NT 32 78 NT NT 70% 0, 61 NT 9700,5H 0,5 NT NT 55 97 NT NT 67% 0,2 NT NT 3,7 NT NT 57 91 NT NT 52% <1,8 NT NT 1,3 NT NT 63 85 NT NT 63% 0,1 NT NT 2,4 NT NT 34 72 NT NT NT NT NT NT 4,5 NT NT 10 76 6,07 NT 38, 197nM 0, 67 NT 8000,5H 21 NT NT 45 28 NT NT 24 NT NT NT NT NT NT 49 11 NT NT 36 NT NT NT NT NT NT 23 23 NT NT 56 NT NT NT 40 NT NT 25 64 NT NT 13 3 NT NT NT NT NT 168 ΡΕ1585743

Ensaio In Vivo do Desenvolvimento Vascular Retiniano em Ratazanas Recém-nascidas 0 desenvolvimento vascular retiniano em ratazanas ocorre a partir do dia 1 pós-nascimento até ao dia 14 pós-nascimento (P1-P14). Este processo depende da actividade de VEGF (J. Stone et al., J: Neurosci, 15 (1995) 4738). Trabalhos anteriores mostraram que VEGF também actua como factor de sobrevivência para os vasos da retina durante o desenvolvimento vascular inicial (Alon et al., Nat. Med., 1 (1995) 1024). Para avaliar a capacidade de compostos específicos inibirem a actividade de VEGF ín vivo, os compostos foram formulados num veiculo apropriado, usualmente 50% de polietilenoglicol, massa molecular média 400 daltons, e 50% de solução de sacarose 300 mM em água desionizada. Tipicamente, dois microlitros (2 yL) da solução de fármaco foram injectados no vítreo médio do olho de filhotes de ratazana no dia 8 ou 9 pós-nascimento. Seis dias depois da injecção intravítrea, os animais foram sacrificados e as retinas isoladas por dissecação do tecido ocular restante. As retinas isoladas foram em seguida sujeitas a um protocolo de coloração histoquímica que cora as células endoteliais especificamente (Lutty e McLeod, Arch. Ophtalmol., 110 (1992) 267), revelando a extensão da vascularização no interior da amostra de tecido. As retinas individuais são em seguida montadas em plano sobre lâminas de vidro e examinadas para determinar a extensão da vascularização. Os compostos eficazes inibem o posterior 169 ΡΕ1585743 desenvolvimento da vasculatura retiniana e induz a regressão da maior parte dos vasos no interior da retina. A quantidade de regressão de vasos foi usada para avaliar a potência relativa dos compostos depois de administração in vivo. A regressão de vasos é graduada numa escala subjectiva de um a três pulsos, sendo um a regressão mais detectável julgada ser aproximadamente 25 porcento ou menos, dois pulsos sendo julgado ser a regressão de aproximadamente 25-75% e três pulsos dá retinas com quase total regressão (aproximadamente 75% ou superior).

Para análise da regressão mais quantitativa, imagens de retinas montadas em plano coradas com ADPase foram captadas com uma câmara digital fixada a um microscópio de dissecação. As imagens retinianas foram em seguida importadas para um software de análise de imagem (Image Pro Plus 4.0, Media Cybernetics, Silver Spring, MD). O software foi empregue para determinar a percentagem da área da retina que continha vasos corados. Este valor para o olho experimental foi comparado ao medido para o olho contralateral injectado com veiculo do mesmo animal. A redução na área vascular vista no olho que recebeu composto quando comparada ao olho injectado com veiculo foi em seguida expressa como a "percentagem de regressão" para aquela amostra. Dos valores de percentagem de redução fez-se uma média para grupos de 5-8 animais.

Em amostras nas quais a observação através do microscópio indicou quase total regressão, um valor de 170 ΡΕ1585743 regressão em percentagem de 65-70% foi rotineiramente medido. Isto foi devido a depósitos de corante no interior de dobras da retina, dobras que foram induzidas pelo veiculo usado para a injecção do fármaco. O software de análise de imagem interpretou estas dobras contendo corante como vasos. Nenhuma tentativa foi feita para corrigir estas dobras uma vez que elas variaram de olho para olho. Por conseguinte, deverá ser notado que os valores da percentagem de regressão reportados resultam de uma medição conservadora que classifica precisamente os compostos por ordens, mas subestima a sua potência absoluta.

Ensaio In Vivo do Desenvolvimento Vascular Retiniano no Modelo de Ratazana Recém-nascida de Retinopatia de Prematuridade

Um segundo modelo de neovascularização retiniana dependente de VEGF foi empregue para avaliar as actividades desta série de compostos. Neste modelo (Penn et al., Invest. Ophtalmol. Vis. Sei., 36 (1995) 2063), filhotes de ratazanas (n=16) com a sua mãe são colocados numa câmara controlada por computador que regula a concentração de oxigénio. Os animais são expostos durante 24 horas a uma concentração de oxigénio 50% seguido por 24 horas numa concentração de oxigénio 10%. Este ciclo de alternância de hiperoxia seguida por hipoxia é repetido sete vezes após o que os animais são removidos para o ar ambiente (P14) . Os compostos são administrados via injecção intravitrea 171 ΡΕ1585743 aquando da remoção para o ar ambiente e os animais são sacrificados 6 dias depois (P20) . As retinas isoladas são em seguida isoladas, montadas, coradas e analisadas conforme detalhado acima no modelo de desenvolvimento. A eficácia foi também graduada conforme é descrito para o modelo de desenvolvimento.

Os compostos que servem de exemplos acima descritos podem ser formulados em composições farmacêuticas de acordo com os seguintes exemplos gerais.

Exemplo 1: Composição Parentérica

Para preparar uma composição farmacêutica parentérica adequada para administração por injecção, 100 mg de um sal solúvel em água de um composto de Fórmula I são dissolvidos em DMSO e em seguida misturados com 10 mL de salina estéril 0,9%. A mistura é incorporada numa forma unitária de dosagem adequada para administração por inj ecção.

Exemplo 2: Composição Oral

Para preparar uma composição farmacêutica para entrega oral, 100 mg de um composto de Fórmula I são misturados com 750 mg de lactose. A mistura é incorporada numa unidade de dosagem oral, tal como uma cápsula de gelatina dura, que é adequada para administração oral. 172 ΡΕ1585743

Exemplo 3: Composição Intra-ocular

Para preparar uma composição farmacêutica de libertação sustentada para entrega intra-ocular, um composto de Fórmula I é suspenso numa solução isotónica neutra de ácido hialurónico (conc. 1,5%) em tampão fosfato (pH 7,4) para formar uma suspensão 1%.

Deve ser entendido que a descrição precedente é de natureza exemplificadora e explanatória e tem a intenção de ilustrar a invenção e suas formas de realização preferidas. Através da experimentação de rotina, o perito reconhecerá modificações e variações evidentes que podem ser feitas sem afastamento do espirito da invenção. Por conseguinte, a invenção pretende ser definida não pela descrição acima, mas pelas seguintes reivindicações e seus equivalentes.

Lisboa, 2 de Julho de 2007

Claims (5)

1. ΡΕ1585743 1 REIVINDICAÇÕES 1. Um composto representado pela fórmula

   ou um seu sal farmaceuticamente aceitável. 2. 0 composto ou sal farmaceuticamente aceitável da reivindicação 1 para utilização como medicamento para o tratamento da degenerescência macular relacionada com a idade num mamífero. 3. 0 composto ou sal farmaceuticamente aceitável da reivindicação 1 para utilização como medicamento para o tratamento da neovascularização coroidiana num mamífero. 4. 0 composto ou sal farmaceuticamente aceitável da reivindicação 1 para utilização como medicamento para o tratamento da retinopatia num mamífero. 5. 0 composto ou sal farmaceuticamente aceitável da reivindicação 4, em que a retinipatia compreende retinopatia diabética, vitreorretinopatia ou retinopatia de prematuridade. 2 ΡΕ1585743 6. 0 composto ou sal farmaceuticamente aceitável da reivindicação 1 para utilização como medicamento para o tratamento da retinite num mamífero. 7. 0 composto ou sal farmaceuticamente aceitável da reivindicação 6, em que a retinite compreende retinite por citomegalovírus. 8. 0 composto ou sal farmaceuticamente aceitável da reivindicação 1 para utilização como medicamento para o tratamento do edema macular num mamífero. 9. 0 composto ou sal farmaceuticamente aceitável da reivindicação 1 para utilização como medicamento para o tratamento de uma doença oftálmica num mamífero.
2. 10. Uma composição farmacêutica compreendendo: (a) uma quantidade terapeuticamente eficaz de um composto ou sal farmaceuticamente aceitável da reivindicação; e (b) um agente de suporte, diluente ou veículo farmaceuticamente aceitáveis para esse fim.
3. 11. O composto ou sal farmaceuticamente aceitável da reivindicação 1 para utilização como medicamento para o tratamento de uma condição de doença de mamífero mediada por actividade de proteína-cinase. 3 ΡΕ1585743 12. 0 composto ou sal farmaceuticamente aceitável da reivindicação 11, em que a condição de doença de mamífero está associada com crescimento tumoral, proliferação celular ou angiogénese.
4. 13. Um método in vitro de modulação da activi-dade de um receptor de proteína-cinase, compreendendo o contacto do receptor de cinase com uma quantidade eficaz de um composto ou sal farmaceuticamente aceitável tal com o definido na reivindicação 1.
5. 14. Um método in vitro de acordo com a reivindicação 13, em que o receptor de proteína-cinase é um receptor de VEGF. Lisboa, 2 de Julho de 2007