JPH0665316B2 - アスペルギルス オリザにおけるタンパク生成物の製造法 - Google Patents

アスペルギルス オリザにおけるタンパク生成物の製造法

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JPH0665316B2
JPH0665316B2 JP62060276A JP6027687A JPH0665316B2 JP H0665316 B2 JPH0665316 B2 JP H0665316B2 JP 62060276 A JP62060276 A JP 62060276A JP 6027687 A JP6027687 A JP 6027687A JP H0665316 B2 JPH0665316 B2 JP H0665316B2
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Description

【発明の詳細な説明】 〔発明の技術分野〕 本発明は、アスペルギルス・オリザ（Aspergillus oryz
ae）におけるタンパク生成物の発現方法に関する。
〔従来の技術〕
今日までに、組換えＤＮＡ技術によるポリペプチドまた
はタンパクを生産するため数多くの方法が開発されてき
た、主な興味は細菌および酵母に集中されてきたのであ
り、例えばE. coli 、Bacillus subtilisおよびSaccharom
yces cerevisiaeは例えば発現および選択系に関して詳
細に特微化されているものである。
上記の微生物のほかに、Aspergillus nigerのような糸
状菌は、詳細に特微化されている組換えＤＮＡベクター
用の宿主微生物として有望な候補であり、酵素を商業的
に生産するのに広範囲に用いられている微生物である。
形質転換された宿主微生物から形質転換細胞を選択でき
る選択マーカーが用いられる形質転換系の開発に、特に
努力が集中されてきた。
過去数年間にAspergillus nidulansの形質転換のための
各種選択マーカーが報告され、菌の細胞分化を制御する
遺伝学的および分子学的方法を研究する目的で糸状菌As
pergillus nidulansの組込み形質転換の手法が近年にな
り開発されてきた。A.nidulans の形質転換は、Neurospora crassapyr-４遺
伝子（Bsllance,D.J.ら、Biochem.Biophys.Res.Commu
n.、第112巻、（1983年）、284〜289頁）、A.nidulans
amdS遺伝子（Tilburn,J.G.ら、Gene、第２６巻、（1983
年）、205〜221頁）、A.nidulans trpC遺伝子（Yelton,
M.M.ら、Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.、第８１巻、（198
4年）、1470〜1474頁）およびA.nidulansargB遺伝子（J
ohn,M.A.およびPeberdy,J.、Microb.Technol.、第６巻、
（1984年）386〜389頁）を含むプラスミドを用いて説明
されてきた。形質転換するＤＮＡは、比較的低い頻度
（典型的には1000個未満の形質転換体／１μｇのＤＮ
Ａ）で宿主ゲノムに組込まれることが分かった。
ごく最近に、A.nidulansのamdS遺伝子を用いるAspergil
lus nigerの形質転換が報告され（Kelly,J.M.とHynes,
M.J.、EMBO Journal、第４巻、（1985年），475〜479
頁）、amdSは単一の窒素源としてのアセタミド上では強
力には成長できないAspergillus nigerの形質転換に使
用される有力な選択マーカーであることが示された。A.
nidulansのargB遺伝子を用いるAspergillus nigerの形
質転換も、最近報告された（Buxton,F.P.ら、Gene、第
３７巻、（1985年）、207〜214頁）。
〔発明が解決しようとする問題点〕
糸状菌Aspergillus oryzaeにおける異種タンパクの発現
のための系は、主として、この菌における遺伝子発現の
制御法が十分には知られておらず且つクローニングベク
ター上に好適な選択可能な遺伝子マーカーが欠如してい
ることにより、これまでは開発されなかった。
〔問題点を解決するための手段、発明の作用および効果〕
本発明によれば、上記の形質転換技法を用いて、異種タ
ンパクを高水準で発現させまたはAspergillus oryzaeに
おける同種タンパクの産生を増進させることができる。
本明細書において用いられる「異種タンパク」という表
現はA.oryzaeによっては産生されないタンパクを意味
し、一方「同種タンパク」という表現はA.oryzae自体に
よって産生されるタンパクを意味する。
更に具体的には、A.nigerおよびA.nidulansの形質転換
に用いたマーカー遺伝子を使用することによって、所望
なタンパク生成物を暗号化するＤＮＡで形質転換したA.
oryzae株の選択が可能である。これら前者の菌類とA.or
yzaeとの系統発生的距離（Raper,K.B.およびFennell,D.
I.、（1965年）The Genus Aspergillus）のために、こ
れはまったく予知されないものであった。
本発明の第一の見地によれば、 (a)アスペルギルス オリザ（Aspergillus oryzae）宿
主のゲノム中に１個以上のコピーを組込み可能であり且
つ遺伝子発現を促進する機能を暗号化するＤＮＡ配列
と、形質転換細胞の選択に好適なマーカーと、所望なタ
ンパク生成物を暗号化するＤＮＡ配列とを有する組換え
ＤＮＡクローニングベクター系を提供し、 (b)選定された選択マーカー用の機能遺伝子を有しないA
spergillus oryzaeを工程(a)からの組換えＤＮＡクロー
ニングベクター系で形質転換し、次いで (c)形質転換したAspergillus oryzae宿主を適当な培養
基中で培養する工程から成るAspergillus oryzaeにおい
てタンパク生成物の発現法が提供される。
本発明の第二の見地によれば、Aspergillus、具体的に
はAspergillus oryzaeおよびAspergillus nigerにおけ
るタンパク生成物の発現に極めて効果的なプロモータで
あって、TAKA−アミラーゼプロモーターまたは任意に上
流活性化配列が先行する上記プロモータの機能的部分と
して特徴化されるものが提供される。
本発明の第三の見地によれば、Aspergillus oryzaeにお
けるタンパク生成物の産生法であって、上記のように組
換えＤＮＡクローニングベクターを用いて形質転換した
Aspergillus oryzae株を適当な培養基中で培養し、生成
物を培養基から回収する方法が提供される。
使用した形質転換法は、A. nidulansの形質転換法の変
法（Ballance,D.J.ら、Biochem.Biophys.Res.Commun.、
第112巻、（1983年）、284〜289頁、Tilburn,J.G.ら、G
ene、第２６巻、（1983年）、205〜221頁）、Yelton,M.
M.ら、Proc.Natl.Acad.Sic.U.S.A.、第８１巻（1984
年）、1470〜1474頁）およびA.nigerの形質転換につい
てのBuxtonらの方法、（Gene、第３７巻、（1985年）．
207〜214頁）に類似の方法であった。本発明の方法で
は、Aspergillus oryzaeは、宿主株のゲノム中に組込む
ことができるが、形質転換前は宿主株に有しない選択マ
ーカーを含むベクター系で形質転換される。
好ましい選択マーカーはargB（A.nidulansまたはA.nige
r）、trpC（A.nidulans）、amdS（A.nidulans）またはp
yr4（Neurospora crassa遺伝子、またはDHFR（ジヒドロ
フォレートレダクターゼまたはその変異株）遺伝子であ
る。更に好ましい選択マーカーはargBまたはarmS遺伝子
である。野生型A. oryzae株は通常はargB+である（すな
わち、argB遺伝子がA. oryzaeにおいて機能的であ
る）。argBを選択マーカーとして選択する場合には、こ
のマーカーに対して遺伝子に欠損を有するA. oryzaeのa
rgB変異株を宿主株として用いなければならない。A. or
yzaeのargB変異株は、F.P.Buxtonらが報告したのと同様
にして調製することができる（Gene、第３７巻、（1985
年）、207〜214頁）。argB変異株はオルニチントランス
カルバミラーゼ遺伝子に欠損を有する変異株として定義
される。他方、amdS遺伝子は、野生型A. oryzae株がこ
の遺伝子を含まないので、この野性型の形質転換の選択
マーカーとして用いることができる。
遺伝子配列を促進する機能を暗号化するＤＮＡ配列は、
典型的にプロモーター、転写ターミネーターおよびポリ
アデニル化シグナルである。
当業界において周知のように上流活性化配列およびエン
ハンサー配列が先行することのあるプロモーターはAspe
rgillus oryzaeにおいて強力な転写活性を示すことがで
きる如何なるＤＮＡ配列であってもよく、アミラーゼ、
グルコアミラーゼ、プロテアーゼ、リパーゼ、セルラー
ゼおよび解糖酵素のような細胞外および細胞内タンパク
のいずれをも暗号化する遺伝子から誘導することができ
る。好適なプロモーターはA.oryzae TAKAアミラーゼ、R
hizomucormieheiアスパラギン酸プロテイナーゼ、A.nig
erグルコアミラーゼ、A. niger中性α−アミラーゼ、A.
niger酸安定α−アミラーゼおよびRhizomucormieheiリ
パーゼについての遺伝子から誘導することができる。解
糖酵素の遺伝子からのプロモーターの例は、ＴＰＩ、Ａ
ＤＨおよびＰＧＫである。
本発明による好ましいプロモーターは、A.oryzae TAKA
−アミラーゼプロモーターである。TAKAアミラーゼは周
知のα−アミラーゼ（Todaら、Proc.Japan Acad.、第５
８巻、シリーズＢ（1982年）、208〜212頁）である。プ
ロモーター領域を暗号化するＤＮＡは、TAKA−アミラー
ゼゲノム性クローンから誘導した。プロモーターおよび
プロモーターの上流の領域の配列を、プレ領域およびTA
KA−アミラーゼについての構造遺伝子の５′末端と共に
第１図に示す。
実施例２に更に詳細に説明されるように、プレ領域およ
びプロモーターおよび上流活性化配列を含むTAKA−アミ
ラーゼを暗号化するＤＮＡ配列は、A.oryzae mycelium
から誘導され、BamHIを消化したpBR322に挿入されて、
プラスミドpTAKA 17を生成した（第２図を参照された
い）。pTAKA 17A.oryzaeから誘導されたＤＮＡは5.5kb
BamHI/Sau 3AI-BamHI/Sau 3AIフラグメントとして示さ
れ、プロモーターおよび上流活性化配列は位置０で開始
する2.1kbフラグメントを表わす。BglII部位までのプロ
モーターおよび上流活性化配列の確立されたＤＮＡ配列
を、第１図に示す。プロモーターは、TAKA−アミラーゼ
プレ配列のMet(1)コドンに先行するヌクレオチド−１で
終了する。プレ配列を暗号化するヌクレオチド配列は６
３個のヌクレオチドから構成され、成熟TAKA−アミラー
ゼはヌクレオチド６４に対応する位置から開始する。
pTAKA 17から、プロモーターに対して上流の配列を含む
全プロモーター配列またはその機能的部分は、当業者に
公知の手段によって誘導することができる。プロモータ
ー配列は、プロモーター配列を、例えば所望なタンパク
生成物またはことなるプレ領域（シグナルペプチド）を
暗号化する遺伝子のような他のＤＮＡとの連結を促進す
る特異的な制限部位を導入するために、リンカーを備え
ていてもよい。
本発明による方法では、（SalI部位の開始を表わす）ヌ
クレオチド−1144（第１図を参照されたい）からヌクレ
オチド−１０の配列を、プロモーター領域の十分に機能
する部分の一例として使用した。本発明のもう一つの態
様では、ヌクレオチド−1176から−１までのヌクレオチ
ド配列は、pTAKA 17からの未だ配列されていない1.05kb
フラグメントが先行した。各種のフラグメントを使用で
きることは、当業者にとって明らかである。
本発明の一態様によれば、プロモーターおよび上流活性
化配列は、第１図におけるヌクレオチド−1144からヌク
レオチド−１０の配列を表わす下記の配列または機能的
に等価なヌクレオチド配列を有する。
もう一つの態様によれば、プロモーターおよび上流活性
化配列は、第１図におけるヌクレオチド−1176から−１
までの配列を表わす下記の配列または機能的に等価なヌ
クレオチド配列を有する。
本発明のもう一つの見地によれば、後者の配列では、pT
AKA 17からの1.05kb未配列の上流領域（第２図における
位置０〜1.05）が先行してもよい。
ターミネーターおよびポリアデニル化配列はプロモータ
ーと同じ源から誘導することができる。エンハンサー配
列を構造中に挿入してもよい。
発現した生成物は細胞の***を要する細胞内に蓄積させ
て、生成物を単離することができる。この付加的工程を
回避し且つ細胞内で発現した生成物の可能な分解量を最
小限にするには、生成物を細胞から分泌するのが好まし
い。この目的のため、所望な生成物の遺伝子は、発現し
た生成物を細胞の分泌経路内への効果的に向けるプレ領
域を有する。自然に起こるシグナルまたはリーダーペプ
チドまたはその機能的部分あるいは分泌を行う合成配列
であることができるこのプレ領域は、一般的には分泌の
際に所望な生成物から開裂して、培養液から単離する準
備のできた成熟生成物を残す。
このプレ領域は、如何なる有機物源からのものであって
も分泌されるタンパクの遺伝子から誘導することができ
る。
本発明によれば、プレ領域はAspergillus種からのグル
コアミラーゼまたはアミラーゼ遺伝子、Bacillus種から
のアミラーゼ遺伝子、Rhizomucormieheiからのリパーゼ
またはプロテイナーゼ遺伝子、S.cerevisiaeからのα−
因子の遺伝子または仔牛プロキシモシン遺伝子から誘導
することができる。更に好ましくは、プレ領域はA.oryz
aeTAKAアミラーゼ、A.niger中性α−アミラーゼ、A.nig
er酸安定α−アミラーゼ、B.lichniformisα−アミラー
ゼ、Bacillus NCIB 11837からのマルトース原性アミラ
ーゼ、B.stearothermophilusまたはB.lichniformissubt
ilisinから誘導される。有効なシグナル配列は、A.oryz
aeTAKA−アミラーゼシグナル、Rhizomucor mieheiアス
パラギン酸プロテイナーゼシグナルおよびRhizomucor m
ieheiリパーゼシグナルである。
TAKA−アミラーゼシグナルは下記の配列を有する。
プロモーターおよびターミネーター配列に機能的に連結
した所望な生成物の遺伝子は、選択マーカーを含むベク
ターに組込むことができ、または宿主株のゲノム中に組
込むことができる別個のベクターまたはプラスミド上に
置いてもよい。本明細書で用いる「ベクター系」という
表現は単一ベクターまたはプラスミドまたは宿主ゲノム
中に組込まれる全ＤＮＡ情報を含む２種類以上のベクタ
ーまたはプラスミドを包含する。ベクターまたはプラス
ミドは、線状または閉じた円形分子であってもよい。本
発明の好ましい態様によれば、A.oryzaeは２個のベクタ
ーであって、一つは選択マーカーを含み、もう一つは宿
主株に導入される残りの異種ＤＮＡから成り、プロモー
ター、所望な生成物および転写ターミネーターの遺伝子
およびポリアデニル化配列を含むもので共形質転換され
る。
通常は、A.oryzae形質転換体は安定であり、選択マーカ
ーの不在で培養することができる。形質転換体が不安定
になる場合には、選択マーカーを用いて培養の際に選択
してもよい。形質転換細胞を、次に問題のマーカーに対
応する選択圧で培養する。
本発明はA.oryzaeにおいて多種多様なポリペプチドまた
はタンパク生成物を高収率で製造する方法を提供する。
A.oryzaeは長年にわたり例えばTAKA−アミラーゼ酵素お
よびタンパク分解酵素の生産に商業的規模で用いられて
きており、従ってこの微生物の醗酵技術は十分に開発さ
れており、この微生物は食品工業において使用されるこ
とが証明されている。本発明は、原則として如何なるポ
リペプチドまたはタンパク生成物でも高収量での工業的
生産にA.oryzaeの使用可能性を提供する。かかる生成物
の例はキモシンまたはプロキモシンおよび他のレンネッ
ト、プロテアーゼ、アミログルコシダーゼ、Aspergillu
sからの酸安定アミラーゼ、菌のリパーゼまたは原生生
物のリパーゼおよび熱に安定な細菌または菌のアミラー
ゼである。
本発明をプロキモシン、Rhizomucormieheiアスパラギン
酸プロテイナーゼ，TAKA−アミラーゼ酵素およびRhizom
ucormieheiからのリパーゼの生産によって説明する。こ
れらの酵素の遺伝子は、下記に更に詳細に説明するよう
に、ｃＤＮＡライブラリーまたはゲノムライブラリーか
ら得た。
〔実施例〕
以下の実施例において出発物質として使用したプラスミ
ドは次の通りである。
p285 （ATCC No.20681） PCAMG91 Boelら、EMBO Journal、第３巻、 （1984年）、1581〜1585頁。
pIC19R Marshら、Gene、第３２巻、（1984年）、4
81〜485頁。
pSa143 Berseら、Gene、第２５巻、（1983年）、1
09〜117頁、John＆ Peberdy、Enzyme Microb. Technol.。
p3SR2 J.M.KellyおよびM.J.Hynes、EMBO Journa
l、第４巻（1985年）、475〜479頁。
pBR322 Bolivar,F.ら、Gene、第２巻 （1977年）、95〜113頁。
pBR327 Covarrubias,L.ら、Gene、第１３巻、（19
81年）、25〜35頁。
pUC9、pUC13 およびpUC19 Vieiraら、Gene、第１９巻、 （1982年）、259〜268頁。およびMessing,Meth.in Enzy
mology、第101巻、（1983年）、20〜27頁。
使用した菌株は次の通りである。A.niger ATCC 1055、ATCC 10582A.oryzae ATCC 20423、IFO 4177、ATCC 1011、ATCC 957
6、ATCC 14488〜11491、ATCC 11601およびATCC 12892。E.coli MC1000（Casabadan,M.J.およびCohen,S.
N.、J.Mol.BiOl.、第138巻、179〜207頁）（NCIB 1195
6）。Rhizomucor miehei CBS 370.65 実施例１ プロキモシン遺伝子を含むプラスミド285′proCの調製 プレプロキモシン遺伝子を仔牛の胃のｃＤＮＡライブラ
リーから単離し、Ｇ−ＣテイリングによってpBR322のPs
tI部位に挿入して（Chirgwinら、Biochemistry、第１８
巻、（1979年）、5294頁およびTruelsenら、Nucleic Ac
ids Res.、第６巻、（1979年）、3061頁）、pR26を得
た。pUC9をSalIで切断し、切断をクレノーポリメラーゼ
で満たし、Ｔ４リガーゼで連結した。生成するプラスミ
ドをBamHI−EcoRIで切断して、2.7kbの大きなフラグメ
ントをプロキモシン遺伝子のＮ末端を含むpR26からの0.
47kb BamHI−EcoRIフラグメントと連結し、pUC9′を作
った。pUC9′は、プロキモシン遺伝子のＮ末端にHindII
I部位を含む。pUC13をBamHI−NarIで切断して、NarI−X
amIと大きなそれぞれの小型フラグメントをプロキモシ
ン遺伝子のＣ末端を含むpR26の0.64kb XamI−BclIフラ
グメントと連結して、プラスミドpUC13′を得た。pUC1
3′は、プロキモシン遺伝子のＣ末端にXbaI部位を含
む。pUC13′の0.65kb XmaI-XbaIフラグメントを、pUC
9′の0.46kb HindIII-XmaIおよびp285の１１kb XbaI-Hi
ndIIIフラグメントと連結して、第３図に示されるよう
にプロキモシン遺伝子を含むプラスミドp285′proCを生
成させた。
実施例２ A.oryzae TAKA−アミラーゼＡ遺伝子のクローニング じゃがいも澱粉上で成長させたA.oryzae Hw325から、Ka
planらの方法（Biochem.J.、第183巻、（1979年）、（1
81〜184頁）によって、ｍＲＮＡを調製した。TAKA−ア
ミラーゼ遺伝子の1050bpを含む部分ｃＤＮＡクローン
を、ｍＲＮＡをTAKA−アミラーゼにおけるアミノ酸295
〜299についての暗号化配列に相補的な４−マー・オリ
ゴヌクレオチド混合物 で特異的に感作することによって得た（Todaら、Proc.J
apan Acad.第５８巻、シリーズＢ、（1982年）、208〜2
12頁）。クローニング法は、Gubler＆Hoffmann、Gene、第
２５巻、（1983年）、263〜269頁記載の方法に準じた。
ｃＤＮＡクローンの両端および中央手での配列は、TAKA
−アミラーゼのアミノ酸配列に対応する配列が存在する
ことを示した。
ゲノムクローンの単離A.oryzae Hw325からの菌糸を収穫して、Boelからの上記
文献に記載のA.nigerについて用いた方法に従ってＤＮ
Ａを調製するために加工した。Sau3Aで部分消化するこ
とによって生成した３〜１０kbの制限フラグメントを、
BamHIで消化して、脱リン酸化したpBR322と連結した（N
ew England Biolabs）。50,000個の組換体をオリゴヌク
レオチドプローブNOR-168（上記）でスクリーニングし
て、７個がTAKA−アミラーゼを暗号化するＤＮＡを含む
ことを見出した。一つのクローンをｍＲＮＡ開始2.1kb
上流を有するプロモーター領域を更に使用するのに選択
した。プラスミドpTAKA17についての制限マップを第２
図に示す。E.coli株に移したpTAKA17を1987年２月23日
にDeutscheSammlung von Mikroorganismen(DSM)、Gries
ebachstrasse 8,D-3400,Goettingenに寄託され、受託番
号DSM 4012を与えられた。ＤＳＭは1977年のブタペスト
条約で認定された国際寄託当局であり、上記の条約のそ
れぞれ第９規則および第１１規則に従って、公衆による
寄託および入手の永続性を付与している。
実施例３ Rhizomucor miehei ｃＤＮＡライブラリーの構成 真菌類Rhizomucor miehei（この菌種の形態学的および
系統学的説明については、Shipper,M.A.A.、On the gene
ra Rhizomucor and Parasitella、Studies in mycology、
Institute of the Royal Nethelands Academy of Scien
ce and Letters、第１７号（1978年）、53〜71頁を参照
されたい）はチーズ製造におけるミルクの凝固に広く用
いられている酸プロテイナーゼ（Rhizomucor mieheiプ
ロテイナーゼ、以下ＲＭＰと省略する）を分泌する。E.
coliにおいてこのタンパクのｃＤＮＡ組換えクローンを
得るために、全ＲＮＡをBoelら（EMBOJ.、第３巻、1097
〜1102頁、1984年）およびChirgwinら（Biochemistry(W
ash.)、第１８巻、5294〜5299、1979年）の方法によっ
てホモゲナイズしたR.mieheimyceliumから抽出した。ポ
リ（Ａ）含有ＲＮＡを、AvivとLeder(PNAS,USA,第６９
巻、1408〜1412頁、1972年）によって報告されたオリゴ
（ｄＴ）−セルロース上で親和クロマトグラフィーを２
サイクル行うことによって得た。オリゴ（ｄＴ）で感作
した相補性ＤＮＡを合成して、GublerとHoffman(Gene、
第２５巻、263〜269頁、1983年）が報告した方法に従っ
て二重鎖とした。二重鎖を、Roychoudhuryら（Nucleic
Acids Res、第３巻、101〜106頁、1976年）によって報
告された方法によって、ｄＣＴＰおよび末端デオキシヌ
クレオチジル・トランスフェラーゼと連結した。プラス
ミドpBR327をPstIで線形化して、ｄＧＴＰと連結した。
オリゴ（ｄＣ）を連結したdscＤＮＡを、Peacockらが記
載した方法（Biochim.Biophys.Acta、第655巻、243〜25
0頁、1981年）によってこのオリゴ（ｄＧ）を連結した
ブクターにアニーリングして、E.coliMC1000のhsdR-,M+
誘導体（CasadabanとCohen、J.Mol.Biol.、第138巻、179
〜207頁、1980年）を形質転換して組換えクローンを生
成させるのに用いた。
ＲＭＰ特異的なｃＤＮＡ組換体の同定 １６個のヘプタデカマー・オリゴデオキシリボヌクレオ
チド の混合物であって、その一つがTyr-Tyr-Phe-Trp-Asp-Al
aを暗号化する領域においてＲＭＰ ｍＲＮＡに相補的
であるもの（BechとFoltmann、Nethmilk Dairy J.、第３
５巻、275〜280頁、1981年）をApplied Biosystems,In
s.製ＤＮＡ合成装置上で合成し、ポリアクリルアミドゲ
ル電気泳動法によって精製した。RhizomucormieheiｃＤ
ＮＡライブラリーからの約10,000個のE.coli組換体をWh
atman 540紙に移した。コロニーを、Gergenらが記載
した方法によってリーシスして、固定した（Nucleic Ac
ids Res.、第７巻、2115〜2135頁、1979年）。フィルタ
ーを、Boelら（EMBO J.、第３巻、1097〜1102頁、1984
年）によって記載された方法によって３２Ｐ−標識した
ＲＭＰ特異的ヘプタデカマー混合物と交雑した。フィル
ターの交雑と洗浄は４０℃で行い、次いでインテンシフ
ァイヤー・スクリーンを用いて２４時間オートラジオグ
ラフィーを行った。ミニプレプ（Miniprep）プラスミド
ＤＮＡは、標準的な方法（BirnboimとDoly、Nucleic Aci
ds Res.、第７巻、1513〜1523頁、1979年）によって交
雑するコロニーから単離し、ｃＤＮＡインサートのＤＮ
Ａ配列をMaxamとGilbertの方法（Methods Enzymol.、第
６５巻、499〜560頁、1980年）によって確立した。
pRMP1016は、ｍＲＮＡの５′未翻訳末端の部分を含み、
次いで６９個の酸の長いプレプロ領域と300個のアミノ
酸をＰＭＲタンパクの成熟部分に暗号化する領域中に伸
びていることを示した。
pRMP1016はＲＭＰ ｍＲＮＡの完全な３′末端に対応す
るインサートを含まなかったので、ｃＤＮＡライブラリ
ーをクローンpRMP1016からの３２Ｐニックが翻訳された
３′特異的制限フラグメントで再度スクリーニングする
ことによって、クローンpRMP2931を単離した。このクロ
ーンは３′未翻訳領域の部分とＲＭＰタンパクのカルボ
キシル未端部分を暗号化する270個のトリプレットを有
する開放読み込み枠を含む。それ故、pRMP1016およびpR
MP2931は著しくオーバーラップしており、２個のクロー
ンの結合した配列は、R.mieheiプレプロＲＭＰ ｃＤＮ
Ａの配列を与える。1416個のヌクレオチドの総ては、ｃ
ＤＮＡクローニング法から生成するＧ：Ｃテイルの間に
配列した。確立したＤＮＡ配列を第４ａおよびｂ図に、
ＲＭＰへの前駆体の推定アミノ酸配列と共に示す。第４
ａおよびｂ図では、水平線はｃＤＮＡライブラリーのス
クリーニングに用いた合成オリゴ混合物の位置を示して
いる。矢印は、元のＲＭＰの成熟において加工が起こる
位置を示している。ヌクレオチドは開始Metコドンにお
ける第一の塩基から番号を付け、アミノ酸は成熟ＲＭＰ
における第一の残基から番号を付けている。このｃＤＮ
Ａ配列から、ＲＭＰは６９個のアミノ酸のプロペプチド
で430個のアミノ酸の長い前駆体として合成されると結
論することができる。この前駆体における推定上のシグ
ナルペプチダーゼ加工部位（von Heijne、Eur.J.Bioche
m.、第133巻、17〜21頁、（1983年）は、Ala(-48)およ
びArg(-47)の間にあると考えられ、成熟ＲＭＰはGlu-1
およびAla(+1)の間での自動タンパク分解性開裂によっ
て生成する。ＲＭＰのｃＤＮＡで推定したアミノ酸配列
は、以前報告された部分的アミノ酸配列（Bechとfoltma
nn、Neth-Milk Dairy J.、第３５巻、275〜280頁、1981
年）と良好に一致している。
ＲＭＰ ｃＤＮＡを用いて更に構成作業を促進するた
め、次のようにしてクローンpRMP2931において同定され
たＴＡＡ停止コドンに対して３′のBanI部位にHindIII
リンカーを挿入した。すなわち、２５μｇpRMP2931をPs
tIで消化してＲＭＰ ｃＤＮＡを得た。このインサート
を１％アガロースゲル電気泳動法で精製し、ゲルから電
気溶出し、フェノールおよびクロロホルム抽出によって
精製し、MaClおよびエタノールで沈澱させた。ＲＭＰの
３′半分を暗号化するこのフラグメントをBanIで消化
し、BanI付着制限部位末端を４個のｄＮＴＰとE.coliＤ
ＮＡポリメラーゼのKlenowフラグメントとの混合物で満
たした。これらの満たした末端にＴ４−ＤＮＡリガーゼ
反応においてHindIIIリンカーを加えた。連結反応混合
物をフェノールとクロロホルムで抽出して、ＤＮＡを４
Ｍ酢酸アンモニウム／エタノールで沈澱させた。精製し
たＤＮＡを過剰量のHindIII酵素で消化して、380bpフラ
グメントを６％ポリアクリルアミドゲル上で精製した。
ＲＭＰ開放読取り枠の３′末端とＴＡＡ停止コドンを含
むこのフラグメントを、HindIIIで消化してアルカリ性
ホスファターゼで処理したpIC19Rに連結した。この連結
混合物を用いて競合するE.coli細胞を形質転換し、形質
転換をアンピシリン含有観点プレート上で選択した。プ
ラスミドＤＮＡを形質転換体から精製し、正確な組換体
を制限エンドヌクレアーゼ消化とアガロースゲル電気泳
動法によって同定した。かかる正確な組換体、pRMP3′
から、210bp BglII/HindIIIフラグメントを６％ポリア
クリルアミドゲル電気泳動法によって単離した。このフ
ラグメントはアミノ酸297〜299でBglII部位からのＲＭ
Ｐ ｃＤＮＡの３′末端を含み、ＴＡＡ停止コドン中を
通って、挿入されたHindIIIリンカーまで伸びている。
ＲＭＰ ｃＤＮＡの５′部分は、１％アガロースゲル電
気泳動法によって997bp HindIII/BglIIとしてｐＲＭＰ
から単離した。HindIII部位は、プロセグメントにおい
て残基−36，−35に対応する位置においてＲＭＰ−ＤＮ
Ａ中に配置されている。997bp５′フラグメントをHindI
IIで消化してホスファターゼ処理したpIC19R中で210bp
３′フラグメントに連結した。この連結混合物を用い
て、組換体をE.coliから得て、３′部分に結合したＲＭ
Ｐの５′部分を有する正確なプラスミドｐＲＭＰは制限
酵素分析によって同定した。
ｐＲＭＰの構成を第５図に示す。ｐＲＭＰはＲＭＰプレ
領域およびプロセグメントの５′半分を暗号化しない。
実施例４ 活性ＲＭＰを分泌するように設計したAspergillus発現
ベクターの構成 この実施例では、プラスミドをグルコアミラーゼプロモ
ーター、シグナルおよびターミネーター配列の制御下に
ＲＭＰを発現するように設計して構成した。グルコアミ
ラーゼプロモーターおよびターミネーター配列をベクタ
ーpCAMG91でクローン化したグルコアミラーゼゲノム遺
伝子から誘導した。pCAMG91の構成はBoelら（EMBO Jour
nal、第３巻、1984年、1581〜1585頁）によって報告さ
れており、プラスミドpCAMG91のエンドヌクレアーゼ制
限マップは第６図に示す。
pCAMG91をSalIおよびPstI制限エンドヌクレアーゼで消
化した。上記消化物から、アガロースゲル上で698bpフ
ラグメントを単離した。このSalI-PstIフラグメントは
グルコアミラーゼｍＲＮＡの140bp３′未翻訳部分を暗
号化する領域を含む。この３′フラグメントはＴ４−Ｄ
ＮＡポリメラーゼで処理して、XbaIリンカーの添加およ
びXbaI制限酵素での消化の前に制限部位を「ブラント・
エンド」させた。このグルコアミラーゼ遺伝子の３′末
端をXbaIで線形化したpUC13に連結してグルコアミラー
ゼ遺伝子ポリ（Ａ）付加領域を含むプラスミドpAMG/Ter
mを生成させた。pAMG/Termの構成は、第７ａ図に示す。
A.nigerグルコアミラーゼ遺伝子の３′末端は、pAMG/Te
rmからの700bP XbaIフラグメントとして得た。このター
ミネーターフラグメントを、XbaIで消化してホスファタ
ーゼ処理したpIR19Rに連結した。この連結混合物を用い
て、E.coliから組換体が得られ、正確なプラスミドpICA
MG/TermであってpIC19Rの多重クローニング部位のHindI
II部位に面するターミネーターフラグメントの５′末端
を有するものは制限酵素分析によって同定した。pICAMG
/Termの構成を、第７ａ図に示す。pICAMG/Termから、グ
ルコアミラーゼターミネーター（ＡＭＧターミネータ
ー）領域を１％アガロースゲル電気泳動法によって750b
p HindIII/ClaI制限フラグメントとして単離した。
pCAMG91から、グルコアミラーゼプロモーター（ＡＭＧ
プロモーター）を、グルコアミラーゼシグナルペプチド
を暗号化する領域、ヘキサペプチド−プロセグメントお
よび3.5kb ClaI/BssHIIフラグメントとしてのpBR322ア
ンピシリン耐性遺伝子（Amp）と共に、１％アガロース
ゲル電気泳動法によって単離した。合成BssHII/HindIII
リンカーは、Applied Biosystems Inc.製ＤＮＡ合成装
置上で合成した２種類の合成３１マー・オリゴヌクレオ
チドから調製した。合成リンカーは下記の構造を有す
る。
このリンカーを、3.5kbグルコアミラーゼプロモーター
を含むフラグメントおよび750bpグルコアミラーゼター
ミネーターを含むフラグメントとの連結反応に用いた。
連結混合物を用いてE.coliを形質転換して、正確な組換
体、p673は制限エンドヌクレアーゼ消化によって同定し
た。単離したp673はHindIIIクローニングベクターであ
り、この中に適当なHindIII ｃＤＮＡフラグメントを
グルコアミラーゼヘキサペプチドプロセグメントおよび
グルコアミラーゼ転写ターミネーター領域の間に挿入す
ることができる。挿入したｃＤＮＡはグルコアミラーゼ
プロモーターによって転写制御され、翻訳された融合生
成物の分泌はグルコアミラーゼシグナルペプチドとグル
コアミラーゼヘキサペプチドプロセグメントとによって
指示される。p673をHindIIIで消化して、アルカリ性ホ
スファターゼで処理して、ｐＲＭＰの消化物から精製し
た1.2kbHindIIIと連結した。
連結混合物を用いてE.coliを形質転換し、ＲＭＰを発現
させるために正確な位置に挿入されたＲＭＰｃＤＮＡを
有する組換体p686は制限エンドヌクレアーゼ消化によっ
て単離されて特徴化された。p686は以下の構造：グルコ
アミラーゼシグナルペプチド、グルコアミラーゼヘキサ
プロペプチド、ＲＭＰからのプロペプチドのアミノ酸−
４５から−１、成熟ＲＭＰの361個のアミノ酸を有する
ＲＭＰ前駆体を暗号化する。p686の構成を、第７ｂ図に
示す。
実施例５ 本発明の好ましい態様では、プレプロＲＭＰの開放読取
り枠を、A.nigerからのグルコアミラーゼ遺伝子または
A.oryzaeからのTAKA−アミラーゼ遺伝子からのプロモー
ターの制御下において発現プラスミドに挿入すべきであ
る。これを行うために、BamHI制限エンドヌクレアーゼ
部位を、次の工程によってプレプロＲＭＰのシグナルペ
プチドの開始メチオニンコドンの５′に挿入した。pRMP
1016を、ｃＤＮＡにおいてアミノ酸残基Ser（−66）お
よびGln（−65）に対応する位置で切断するDdeIと、ｃ
ＤＮＡにおいてアミノ酸残基Lys（−36）およびLeu（−
35）に対応する位置で切断するHindIIIで消化した。精
製する８９bp DdeI/HindIIIフラグメントを８％ポリア
クリルアミドゲル上で精製し、フェノールおよびクロロ
ホルム抽出の後電気溶出し、エタノール沈澱した。以下
の配列を有する合成ＤＮＡフラグメントは、アプライド
バイオシステム社製製ＤＮＡ合成装置上で２個のオリゴ
ヌクレオチドとして合成した。
このフラグメントは、開始Met-コドンに対してBamHI付
着末端５′および３′末端にDdeI付着末端を有する。こ
れら２個のオリゴヌクレオチドは、ＡＴＰおよびＴ４ポ
リヌクレオチドキナーゼでキナーゼ化し、互いにアニー
リングして、次いでBamHI/HindIIIで消化したpUC13ベク
ター中でpRMP1016から精製した８９bp DdeI/HindIIIＲ
ＭＰフラグメントに連結した。連結混合物を用いて、E.
coli細胞を形質転換し、正確な組換え体をミニプレプ精
製プラスミド上で制限酵素消化によって同定した。正確
な組換えプラスミドを配列して、使用したオルゴヌクレ
オチドの配列を証明した。かかる正確なプラスミドpRMP
5′をBamHIおよびHindIIIで消化して、開始Metコドン、
ＲＭＰシグナルペプチドおよびＲＭＰプロセグメントの
部分を有する100bpBamHI/HindIIIフラグメント１０％ポ
リアクリルアミドゲル電気泳動法によって精製した。こ
のフラグメントを電気溶出し、フェノールおよびクロロ
ホルム抽出し、エタノールで沈澱した。ＲＭＰ開放読込
み枠の残りおよびＡＭＧターミネーター配列をEcoRIで
消化し、HindIIIで部分消化した後プラスミドp686から
得た。これによって、1.9kbフラグメントを放出し、こ
のフラグメントをアガロースゲル電気泳動法、電気溶出
フェノールおよびクロロホルム抽出の後、エタノールで
沈澱させた。この1.9kbフラグメントを、BamHIおよびEc
oRIで消化したpUC13ベクター中でpRMP5′からの110bp B
amHI/HindIIIに連結した。
この連結混合物を用いて、E.coli細胞を形質転換し、正
確な組換え体をミニプレプ精製プラスミド上で制限酵素
消化によって同定した。かかる正確な組換体は、pRMPAM
GTermであった。
pRMPAMGTermの構成を第８図に示す。
実施例６ Aspergillus nigerグルコアミラーゼプロモーターによ
ってA.oryzae中で活性ＲＭＰを分泌するように設計され
たAspergillus発現ベクターの構成 グルコアミラーゼプロモーターを以下のようにして単離
した。２５μｇのpCAMG91をEcoRIおよびBssHII制限エン
ドヌクレアーゼで消化した。この二重消化の後、270bp
ＤＮＡフラグメントをアガロースゲル電気泳動法によっ
て単離することができた。このフラグメントは、プロモ
ーター領域の一部分、５′未翻訳領域およびグルコアミ
ラーゼ遺伝子（ＡＭＧ遺伝子）のシグナルペプチドをカ
バーする。アガロースゲルからＤＮＡを電気溶出した
後、フラグメントをフェノールおよびクロロホルム抽出
し、次いでエタノール沈澱することによって精製した。
次いで、270bpの長いフラグメントをSfaNIで消化した。
この酵素は、グルコアミラーゼ遺伝子の開始ＡＴＧメチ
オニンコドンに対して５′に開裂部位を有する。完全に
消化した後、ＤＮＡをＤＮＡポリメラーゼＩの大きなフ
ラグメント（KIenow）および４個のｄＮＴＰ総てで処理
して、ＤＮＡ上にブラントエンドを生成させた。このＤ
ＮＡに、ＤＮＡリガーゼを有するBglIIリンカーを加え
て、ＤＮＡをBglII制限酵素の過剰量で消化した。１０
％ポリアクリルアミドゲル上でＤＮＡフラグメントを分
離した後、175bp BglIIフラグメントを電気溶出によっ
て単離することができた。このフラグメントは、開始メ
チオニンコドンに対して５′のSfaNI制限部位に対応す
る位置に挿入されたBglIIリンカーを有する。このＤＮ
Ａ切片をBglIIで消化したアルカリホスファターゼ処理
したpIC19Rベクターに連結して、この連結混合物を用い
てE.coli細胞を形質転換した。生成する形質転換の中
で、正確なプラスミドをミニプレププラスミド上で制限
酵素消化することによって同定した。かかる正確なプラ
スミドpB404.1をNsiIおよびBglIIで消化して、グルコア
ミラーゼ遺伝子の５′未翻訳領域をプロモーター領域の
３′部分の約100bpと共に含む0.16bpフラグメントを放
出した。このフラグメントを、ポリアクリルアミドゲル
電気泳動法、電気溶出、フェノールおよびクロロホルム
抽出およびエタノール沈澱によって精製した。このフラ
グメントをpCAMG91からのグルコアミラーゼプロモータ
ー領域の残りの部分に結合させるため、以下の工程を行
った。２５μｇのpCAMG91をBssHIIで消化した後、更にN
deIで部分的に消化した。フラグメント末端を４個総て
のｄＮＴＰおよびＤＮＡポリメラーゼのKIenowフラグメ
ントで満たした後、1.4kbＤＮＡフラグメントを１％ア
ガロースゲル上で単離した。このフラグメントは、総て
のプロモーター領域を５′未翻訳領域およびシグナルペ
プチド暗号化領域と共に含んでいた。このフラグメント
を電気溶出、フェノールおよびクロロホルム抽出および
エタノール沈澱によって、ＤＮＡを濃縮した。NsiIで消
化した後、ＤＮＡを１％アガロースゲル上で流して、1.
2kb NdeI-NsiIフラグメントを電気溶出によって単離し
た。このＤＮＡは上記反応でNdeI部位にフラントエンド
を生じ、これをNruI-BglIIで消化したpIC19Rベクター中
でのpB401.1からの0.16kbNsiI-BglIIフラグメントに連
結させた。連結混合物を用いて、E.coli細胞を形質転換
し、精製する形質転換体の中から、正確な組換体をミニ
プレププラスミドの制限酵素消化によって同定した。上
記の正確な組換体、pB408.3をHindIIIおよびBglIIで消
化して、グルコアミラーゼ（ＡＭＧ）プロモーターを１
％アガロースゲル上で1.4kbフラグメントとして単離し
た。このフラグメントを電気溶出、フェノールおよびク
ロロホルム抽出およびエタノール沈澱した。このグルコ
アミラーゼプロモーターフラグメントを次に、HindIII-
EcoRIで消化したpUC19ベクター中のpRMPAMGTermからの
2.OBamHI-EcoRIフラグメントに連結した。連結混合物を
用いて、E.coli細胞を形質転換し、精製する形質転換体
の中から、正確な組換体をミニプレププラスミドの制限
酵素消化によって同定した。上記の正確な組換体の一つ
p778を大規模に成長させて、組換えプラスミドを単離し
て、プラスミド調製物をCsCl／臭化エチジウム遠心分離
によって精製した。このプラスミドをグルコアミラーゼ
プロモーターおよびターミネーター配列の制御下におい
てＲＭＰの合成を指示する。p408.3の構成を第９ａ図に
示し、p778の構成を第９ｂ図に示す。
実施例７ Aspergillus oryzae TAKA−アミラーゼプロモーターに
よる活性ＲＭＰを分泌させるように設計されたAspergil
lus発現ベクターの構成 Aspergillus oryzae TAKA−アミラーゼゲノム遺伝子を
含むプラスミドpTAKA 17（実施例２を参照されたい）５
０μｇをSalIで消化した。この酵素は、成熟TAKA−アミ
ラーゼのアミノ酸残基２６に対応する位置においてゲノ
ムＤＮＡでの制限部位を有する。もう一つのSalI制限部
位はこの位置に対して約1300個のヌクレオチドだけ上流
の、上流プロモーター領域の５′末端に配設される。Sa
lI消化の後、この1300bpプロモーターを含むフラグメン
トをアガロースゲル電気泳動法によって精製し、ＤＮＡ
をフェノールおよびクロロホルム抽出およびエタノール
沈澱によって精製した。次いで、ＤＮＡをエクソヌクレ
アーゼIII緩衝液中に溶解して、Henikoff,S.（Gene、第
２８巻、351〜359頁、1984年）の方法に従ってエクソヌ
クレアーゼIIIで消化した。反応を停止して、それぞれ
のＤＮＡ末端において約130bpの欠失を得た。この方法
ではTAKA−アミラーゼ遺伝子の暗号か領域のSalI部位か
らの約130bpの欠失は、開始メチオニンコドンの上流に
多重クローニング部位リンカーを導入する機械を生じ
る。エクソヌクレアーゼIIIで処理したＤＮＡを、Henik
off,S.（Gene、第２８巻、351〜359頁、1984年）の方法
に従ってＳ１ヌクレアーゼIIIで消化し、フェノールお
よびクロロホルムで抽出した後エタノールで沈澱した。
Ｓ１ヌクレアーゼで処理したＤＮＡを補修して連結可能
なブラントエンドを得ることは、Henikoff,S.（Gene、
第２８巻、351〜359頁、1984年）の方法に従って、４個
のｄＮＴＰ総てとＤＮＡポリメラーゼＩのKIenowフラグ
メントを用いて行った。ＤＮＡをEcoRIで消化して、130
0bp SalIフラグメントで切断して、２群のフラグメント
を精製した。一つの群は約380bpの長さであり、蒸溜領
域を表わしたが、他の群は620bpの長さであり、プロモ
ーター領域を含んでいた。
EcoRI消化生成物のこれらの群をアガロースゲル上で分
離して、約620bpの長さのＤＮＡフラダメントを電気溶
出して、EcoRI/SmaIで消化したpUC19ベクターに連結し
た。連結混合物を用いて、競合するE.coli細胞を形質転
換し、組換体から、ミニプレププラスミドＤＮＡを単離
した。これらの欠失変異株を制限酵素消化によって特徴
化して、開始メチオニンコドンに対して５′の欠失末端
を有するプラスミドを同定した。所望な特徴を有する数
個の候補を配列させ、ＡＴＧ−メチオニンコドンにおけ
るＡに対して９bpを欠失した５′を有する変異株（ｐ
９）を選択して、更に構成した。ｐ９をEcoRIおよびHin
dIIIで消化して、フラグメントを含む645bp TAKA−アミ
ラーゼプロモーターをアガロースゲル電気泳動法、フェ
ノールおよびクロロホルム抽出およびエタノールでの沈
澱によって単離した。pTAKA 17をSalIおよびEcoRIで消
化して、TAKA−アミラーゼプロモーター上流領域を含む
510bpフラグメントを、アガロースゲル電気泳動法、フ
ェノールおよびクロロホルム抽出およびエタノールでの
沈澱によって単離した。これらの２個のプロモーター領
域を互いに連結させ、且つSalIおよびHindIIIpで消化し
たIC19Rベクターに連結させた。連結混合物を用いて、
E.coli細胞を形質転換し、正確な組換体を、ミニプレプ
として抽出されたプラスミドを制限酵素で消化すること
によって同定した。かかる組換体の一つp719では、Aspe
rgillus oryzaeからのTAKA−アミラーゼプロモーターフ
ラグメントは、多数の各種制限酵素消化液によって削除
することができる1.1kbの移動可能なフラグメントとし
て見出されている。p719の構成を第１０図に示す。
pRMPAMGTermから、プレブロＲＭＰ開放読取り枠および
グルコアミラーゼターミネーター領域（AMGTerm）を、B
amHIおよびEcoRIで消化した後２kbフラグメントとして
単離した。このフラグメントを、アガロースゲル電気泳
動法、次いでフェノールおよびクロロホルム抽出および
エタノールでの沈澱によって精製した。A.oryzaeからの
TAKA−アミラーゼからのプロモーターを、p719をSalIお
よびBamHIで消化した後に得られる1.1kbフラグメントと
して単離した。このフラグメントを、アガロースゲル電
気泳動法、フェノールおよびクロロホルム抽出、次いで
エタノールでの沈澱によって精製した。1.1kbプロモー
ターフラグメントをSalIおよびEcoRIで消化したpUC19ベ
クターにおいてpRMPAMGTermからの２kbBamHI/EcoRIフラ
グメントに連結した。連結混合物を用いて、E.coli細胞
を形質転換し、精製する組換体から、正確な組換体を、
ミニプレププラスミドを制限酵素で消化することによっ
て同定した。かかる正確な組換体の一つp777を大規模に
成長させて、組換えフラスミドを単離し、プラスミド調
製物をCsCl／臭化エチジウム遠心分離によって精製し
た。p777の構成を第１１図に示す。
実施例８ Aspergillus oryzae TAKA−アミラーゼプロモーターの
制御下によるRhizomucor mieheiリパーゼを分泌させる
ように設計されたAspergillus発現ベクターの構成 E.coliにおけるリパーゼｃＤＮＡクローンの構成および
同定 特異的オリゴヌクレオチドプローブを構成させることが
できる情報を得るため、精製したRhizomucor mieheiリ
パーゼ（Moskowitz,G.J.ら、J.Agric.Food Chem.、第２
５巻、1977年、1146〜1150頁）について部分配列を決定
した。以下の説明では、ＲＭＬという略号をRhizomucor
mieheiリパーゼについて用いた。菌糸体および低分子
量物質を除去したRhizomucor mieheiの培養液からの上
澄液を、陰イオン交換クロマトグラフィーに付した。カ
ラムからの主要な脂肪分解性分画を、凍結乾燥する前に
脱塩および限外過した。次いで、凍結乾燥した粉末
を、親和性クロマトグラフィーに付した。カラムからの
貯蔵したリパーゼ分画を脱塩して、限外過によって濃
縮した。次いで、この濃縮液を疎水性相互作用クロマト
グラフィー（ＨＩＣ）に付して、ＨＩＣ−精製からのリ
パーゼを用いてアミノ酸配列を決定した。配列の決定
は、元の酵素（Ｎ−末端配列）およびリパーゼをArmill
ariamelleaプロテアーゼを用いてタンパク分解性消化を
行った後に得られる選択されたフラグメントの両方につ
いて行った。配列の決定は、Thim,L.ら（FEBS Lett.198
7年、印刷中）によって報告されたのと同じ方法でGas P
hase Sequencer(Applied Biosystems Model 470A）で行
った。
ＲＭＬを、酵素の基質の対する比率を１：４０（モル：
モル）としたことを除いてMoodyら（FEBSLett.、第172
巻、1984年、142〜148頁）によって報告されたのと同じ
Armillariamelleaプロテアーゼを用いて消化した。得ら
れたフラグメントをHPLCによって分離して、ＵＶ吸収を
280nmおよび214nmで観察した。オリゴヌクレオチドプロ
ーブの構成のための好適なフラグメントを同定するに
は、これらのフラグメントはTryおよび／またはTryを含
むので、280nmおよび214nmの間で高い比率を示したペプ
チドのみを配列した。
以下のＮ−末端配列が、元のＲＭＬを使用することによ
って見出された。
タンパク分解性消化液から単離されたフラグメントの一
つは、配列Arg-Thr-Val-Ile-Pro-Gly-Ala-Thr-Try-Asp-
X-Ile-Hisを有し、このフラグメントを特異的オリゴヌ
クレオチドプローブの合成に用いた。
Rhizomucor mieheiからのアスパラギン酸プロテイナー
ゼ（ＲＭＰ）組換体を単離するために構成された実施例
３からの上記生物のｃＤＮＡライブラリーも用いてリパ
ーゼに特異的な組換体を同定した。オリゴヌクレオチド
の混合物を、Applied Biosystems Inc.製ＤＮＡ合成装
置で合成した。構造 を有する混合物は、アミノ酸Gly-Ala-Thr-Trp-Aspを暗
号化する領域においてＲＭＬ ｍＲＭＡに相補的であっ
た。このペンタペプチドは、精製したＲＭＬタンパクの
タンパク分解性フラグメントから得られるアミノ酸配列
のセグメントとして同定された（上記参照）。Rhizomucor miehei ｃＤＮＡライブラリーを、ＲＭＰ特
異的混合物でスクリーニングするのに記載した方法と同
様にして32Ｐ−キナーゼしたリパーゼオリゴヌクレオチ
ド混合物でスクリーニングした。交雑およびフィルター
の最初の洗浄は、４３℃で行った。オートラジオグラフ
ィーの後、フィルターを４７℃で洗浄した。強力な交雑
を示したコロニーを単離して、対応するプラスミドにお
いて挿入されたｃＤＮＡを配列してＲＭＬ特異的組換体
を同定した。かかる２個の組換体p353.7およびp353.16
は、約1.2kbのインサートを有した。これらの２種類の
組換体から得られるＤＮＡ配列は、シグナルペプチドの
中央で開始し、ポリＡテイルにまで伸びている。この領
域では、長い開放読取り枠を同定できた。２個の組換え
体は、開始メチオニンコドンを有するシグナルペプチド
の５′部分についての配列を含まないので、合成オリゴ
ヌクレオチド（584）５′CGAGAGGGGATGAGGGGTGG３′
584 を合成した。このオリゴヌクレオチド584は、ポリペプ
チド領域で見られるアミノ酸配列 Pro-Pro-Leu-Ile-Pro-Ser-Arg を暗号化する領域におけるＲＭＬ ｍＲＭＡに相補的で
ある。オリゴ584をＴ４ポリヌクレオチドキナーゼおよ
び32Ｐ−γ−ＡＴＰを用いて高い比活性にまでキナーゼ
処理した後、記載された方法（Boel,E.ら、PNAS、USA、第
８０巻、2866〜2869頁、1983年）によって、Rhizomucor
mieheiｍＲＭＡでのＡＭＶリバース・トランスクリプ
ターゼとのプライマー伸長反応に用いた。プライマー伸
長反応生成物を１０％ポリアクリルアミド／尿素ゲル上
で電気泳動して、２個のｃＤＮＡ生成物を分割した。こ
れらの２個のｃＤＮＡ、すなわち一つは150個のヌクレ
オチドの長さであり、もう一方は160個のヌクレオチド
長さのものを、両方とも電気溶出し、ＤＮＡ配列のため
の化学的分解法によって配列した。両者のｃＤＮＡはプ
ライマー領域から伸びており、開始メチオニンコドンに
対して位置９のヌクレオチド５′までの読取り可能な配
列を生じた。この配列は、リパーゼ組換えｃＤＮＡプラ
スミドから得られた配列であることを示した。２個のプ
ライマー伸長ｃＤＮＡ生成物の長さは、リパーゼｍＲＭ
Ａの５′末端（ＣＡＰ−部位）が第１２図に示した第一
のＡヌクレオチドに対して約５または１５ヌクレオチド
５′に配列される。菌類からのｍＲＮＡの５′末端の位
置におけるマイクロヘテロゲナイェティは、極めて一般
的である。２個のクローン化したp353.7およびp353.16
から得られる配列をプライマー伸長分析からの配列と結
合することにより、ＲＭＬ前駆体のアミノ酸配列を確立
することができる。ＤＮＡ配列およびＲＭＬ前駆体の対
応するアミノ酸配列を第１２図に示す。第１２図では、
水平線はｃＤＮＡ合成およびｃＤＮＡライブラリースク
リーニングに用いられた合成オリゴの位置を示してい
る。矢印は、元のＲＭＬの成熟において加工が起こる位
置を示す。ヌクレオチドは、開始Metコドンでの最初の
塩基から番号を付け、アミノ酸は成熟した元のＲＭＬに
おける最初の残基から番号を付ける。ＲＭＬを開始Met
コドンから伸びている開放読み込み枠によって暗号化
し、次いで停止コドンに達する前に363コドンを通る。
この前駆体では、最初のアミノ酸残基は、典型的な疎水
性シグナルペプチドから成る。von Heijne（Eur.J.Bioc
hem.、第113巻、17〜21頁、1983年）の生産則によれ
ば、シグナルペプチドは、それぞれ、位置−７１および
−７０でのAla−およびVal残基の間のシグナルペプチダ
ーゼ開裂によって以下のプロペプチドから開裂する。Rhiomucor miehei からの培養液の上澄みから得られる精
製ＲＭＬのＮ末端アミノ酸配列分析は活性ＲＭＬ酵素の
Ｎ末端としてSer-Ile-Asp-Gly-Gly-Ile-Arg同定したの
で、ＲＭＬ前駆体のプロペプチドは前駆体における次の
７０個のアミノ酸残基から成っていた。このＮ末端Ser
残基から始めて、成熟ＲＭＬは停止コドンに達するまで
に269個の残基を通って伸びる。この成熟29500ダルトン
酵素では、リパーゼ基質結合部位は、多数のリパーゼに
保存されている残基Ser(144)の付近に配置される。ＲＭ
Ｌ ｍＲＭＡの３′末端では、104個のヌクレオチドが
ＴＡＡ停止コドンとポリ（Ａ）テイルとの間の未翻訳領
域として配置された。このポリ（Ａ）テイルに対して２
３ヌクレオチド５′では、７ＡＴ塩基対から成る反復構
造が見出されたが、典型的な真核生物のポリアデニル化
シグナルは同定されなかった。
本発明の好ましい具体例では、ＲＭＬ ｃＤＮＡについ
て多くの変更を行った。これらの変更は、開放読み込み
枠に対して制限エンドヌクレアーゼ部位５′および３′
をクローニングおよび付加の際に、ｃＤＮＡに加えた
Ｇ：Ｃテイルの除去を含む。多くの好都合な制限部位
も、ｃＤＮＡのシグナルペプチドおよびプロペプチド領
域に導入された。
p353.16をFnuDIIで消化して、アガロースゲル電気泳動
によって880bpＤＮＡフラグメント（ＲＭＬ ｃＤＮＡ
の３′末端）を単離した。このフラグメントを電気溶出
し、フェノールおよびクロロホルムで抽出し、エタノー
ルで沈澱した。
ＲＭＬ ｃＤＮＡの３′末端を次いでSamIで消化し且つ
アルカリ性ホスファターゼで処理したpUC19ベクターに
連結した。連結反応を用いて、競合するE.coli細胞を形
質転換し、精製した形質転換体から正確な組換体をミニ
プレププラスミドの制限酵素消化によって同定した。一
つのかかる好適な組換体p435.2をBanIIおよびHindIIIで
消化し、0.69kbフラグメントをアガロースゲル電気泳動
法で単離した。このフラグメントを電気溶出し、フェノ
ールおよびクロロホルムで抽出し、エタノールで沈澱し
た。ＲＭＬ ｃＤＮＡのフラグメントは、３′未翻訳領
域に結合したpUC19多重クローニング部位の主要部分を
有していた。
ＲＭＬ ｃＤＮＡの５′末端を、合成オリゴヌクレオチ
ドを用いて再設計して、好都合な制限部位を導入した。
合成フラグメント（ＲＭＬ５′）のＤＮＡ配列を第１４
図に示す。導入した制限部位の位置および個々に合成し
たオリゴヌクレオチドの結合部位を水平線乃至垂直／水
平線によって示す。精製するフラグメント（ＲＭＬ
５′）を２％アガロースゲル上で150bpフラグメントと
して精製し、電気溶出し、フェノールおよびCHCl3で抽
出し、更に連結反応を行う前にエタノールで沈澱した。
p353.7をBanIおよびBanIIで消化して、387bpＲＭＬフラ
グメントを１０％ポリアミリルアミドゲル電気泳動法に
よって精製した。このフラグメントを電気溶出し、フェ
ノールおよびクロロホルムで抽出した後、エタノール沈
澱して、次いで合成ＲＭＬ５′フラグメントおよびBamH
I/HindIIIで消化したpUC13ベクターにおいてp435.2から
の0.69kb BanII/HindIIIフラグメントに連結した。連結
反応を用いて、競合するE.coliを形質転換して、精製す
る形質転換体から正確な組換体をミニプレププラスミド
上で制限酵素消化することによって同定した。一つのか
かる正確な組換体pB544では、合成部分を配列して予想
した構造を確認した。pB544の構成を第13a図に示す。pB
544からプレプロＲＭＬ ｃＤＮＡをアガロースゲル電
気泳動法によって、1.2kb BamHIフラグメントとして単
離した。Aspergillus oryzae TAKA−アミラーゼ遺伝子
からのプロモーターおよびAspergillus nigerグルコア
アミラーゼ遺伝子からのターミネーターに基づく発現ベ
クターを、以下のようにして調製した。p719（実施例７
参照）刃SalIおよびBamHIで消化した。生成する1.1kb T
AKA−アミラーゼプロモーターフラグメントをアガロー
スゲル電気泳動法によって精製した。pICAMG/Term（実
施例４参照）は、BamHIおよびEcoRIで消化した。生成す
る0.75kb TAKA−アミラーゼターミネーターフラグメン
トをアガロースゲル電気泳動法によって精製した。フェ
ノールおよびクロロホルム抽出の後、これらの２種類の
フラグメントをエタノールで沈澱し、SalI/EcoRIで消化
したpUC19ベクターに連結した。連結反応を用いて、E.c
oliを形質転換して、精製する形質転換体から正確な組
換体をミニプレププラスミド上で制限酵素消化すること
によって同定した。一つのかかる正確な組換体p775をBa
mHIで消化して、アルカリ性ホスファターゼで処理し
た。pB544からの1.2kb BamHI ＲＭＬプレプロｃＤＮＡ
フラグメントをこのp775ベクターに連結して、E.coli中
に形質転換した。プロモーターとターミネーターとの間
で正確な位置に挿入されたＲＭＬプレプロｃＤＮＡを有
する組換えp787を、E.coli形質転換体から抽出したミニ
プレププラスミド上で制限酵素による消化によって同定
した。p787プラスミドＤＮＡを大規模に成長させて、プ
ラスミド調整物をCsCl／臭化エチジウム遠心分離によっ
て精製した。p787の構成を第１３ｂ図に示す。
実施例９ Aspergillus oryzaeの形質転換（一般的処理法） 100mlのＹＰＤ（shermanら、Methods in Yeast Genetic
s、Cold Spring Harbor Laboratory、1987年）にA.oryza
e、IFO 4177またはそのargB変異株の胞子を接種して、振
盪しながら３７℃で約２日間培養した。ミラクロスを通
して過することによって菌糸を回収して、0.6ＭのMgS
O4200mlで洗浄した。菌糸を１５mlの1.2ＭのMgSO4、１
０ｍＭのNaH2PO4、pH＝5.8に懸濁させた。懸濁液を氷で
冷却し、NovozymR 234、バッチ1687を120ml含む緩衝液
１mlを加えた。５分後、１mlの１２mg／mlＢＳＡ（Sigm
a、Ｈ２５型）を加えて、緩やかに撹拌しながら1.5〜2.
5時間３７℃でインキュベーションし、顕微鏡下で検討
した試料中において多数の原形質体が観察されるように
なるまで継続した。
懸濁液をミラクロスを通して過し、液を無菌チュー
ブに移して、５mlの0.6Ｍソルビトール、100ｍＭトリス
−HCl、pH＝7.0を積層した。
1000ｇで１５分間遠心分離を行い、原形質体をMgSO4ク
ッションの上部から収集した。２容量のＳＴＣ（1.2Ｍ
のソルビトール、１０ｍＭのトリス−HCl、pH＝7.5、１
０ｍＭのCaCl2）を原形質体懸濁液に加えて、混合物を1
000gで５分間遠心分離した。原形質体ペレットを３mlの
ＳＴＣに再懸濁して、再度成型した。これを繰り返し
た。最後に、原形質体を0.2〜１mlのＳＴＣに再懸濁し
た。
100μの原形質体分散液を５〜２５μｇの適当なＤＮ
Ａを１０μのＳＴＣに懸濁したものと混合した。argB
株からの原形質体をpSa143ＤＮＡ（A.nidulansargB遺伝
子を担持するプラスミド）およびargB+株からの原形質
体をp3SR2（A.nidulansargB遺伝子を担持するプラスミ
ド）と混合した。混合物を室温で２５分間放置した。0.
2mlの６０％PEG4000(BDH29576)、１０ｍＭのCaCl2およ
び１０ｍＭのトリス−HCl、pH＝7.5を加えて、注意深く
混合し（２回）、最後に0.85mlの上記溶液を加えて、注
意深く混合した。混合物を室温で２５分間放置し、2500
ｇで１５分間遠心分離し、ペレットを再度２mlの1.2Ｍ
ソルビトールに懸濁した。もう一回沈降させてから、原
形質体を適当なプレートに塗布した。pSa143で形質転換
したargB株からの原形質体を炭素および窒素源として、
それぞれグルコースおよび尿素を有し且つ浸透圧安定の
ために1.2Ｍソルビトールを含む最小限のプレート（Cov
e、Biochem.Biophys.Acta、第113巻、1966年、51〜56
頁）に拡げた。p3SR2で形質転換したargB+株からの原形
質体を、1.0Ｍスクロース、pH＝0.7、窒素源として１０
ｍＭのアセタミド、およびバックグラウンド成長を抑制
する２０ｍＭのCsClを含む最小限のプレート（Cove、Bio
chem.Biophys.Acta、第113巻、1966年、51〜56頁）に塗
布した。３７℃で４〜７日間インキュベーションした
後、胞子を回収して、減菌水に懸濁し、塗布して単一コ
ロニーとした。この処理法を繰り返して、２回の再分離
の後、単一コロニーの胞子を定義した形質転換体として
保存した。
実施例１０ 野生型A. oryzaeにおけるTAKA−アミラーゼの発現 pTAKA 17を、実施例９に記載したようにA.nidulansから
のamdS遺伝子を含むp3SR2で共形質転換することによっ
て、A.oryzaeIFO 4177中に形質転換した。上記のように
調製した原形質体を等量のpTAKA 17およびp3SR2であっ
てそれぞれ約５μｇを用いた混合物とインキュベーショ
ンした。単一窒素源としてアセタミドを用いることがで
きる９個の形質転換体を、２回再度単離した。ＹＰＤ
（Shermanら、1981年）上で３日間成長させた後、培養
液上澄みをＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分析した。ゲル
を、コマージー・ブリリアント・ブルーＲで染色した。
最良の形質転換体は、形質転換していないIFO 4177の10
〜20倍のアミラーゼを生成した。一つの形質転換体を更
に研究するために選択して、２リットルKieler醗酵装置
中で４％大豆ミール上で成長させ、成長中にグルコース
を供給した。醗酵中に、培養液を激しく撹拌した。これ
らの条件下では、IFO 4177は約１ｇ／ｌを生じ、形質転
換体は酵素活性として測定したところ約１２ｇ／ｌのア
ミラーゼであった。酵素活性を澱粉を分解する能力とし
て測定した（Cereal Chemistry、第１６巻、1939年、71
2〜723頁）。使用した澱粉はMerck Amylum solubileerg
B.6であり、分析はpH4.7および３７℃で行った。外部
からβ−アミラーゼを加えなかった。
実施例１１ A.oryzaeにおけるＲＭＰの発現 実施例７からのp777または実施例６からのp778を、実施
例９に記載の処理法によってp3SR2と共に共形質転換す
ることによってIFO-4177中へ形質転換した。形質転換体
を選択して、実施例９に記載のように再度単離した。
形質転換体をＹＰＤ中で３日間成長させ、上澄みをＳＤ
Ｓ−ＰＡＧＥの後にWestern blottingおよびＥＬＩＳＡ
を行って分析した。p777およびp778からの形質転換体の
上澄液は、ＲＭＰ抗体と反応するタンパク50〜150mg／
ｌを生成したプロテイナーゼと比較して過剰にグリコシ
ル化した。２つの形状のうち、一方はプロ型であり、他
方は加工された成熟プロテイナーゼであると思われた。
p778の２種類の形質転換体およびp777の３種類の形質転
換体を、上記TAKA−アミラーゼ形質転換体と同様に醗酵
装置中で成長させた。p778の２種類の形質転換体は、Ku
niz法（Kuniz,M.、Jour.Gen.Physiol.、第１８巻、1935
年、459〜466頁）によるミルク凝固活性として測定した
ところ、約0.2ｇ／ｌおよび0.4ｇ／ｌのＲＭＰを生じ、
p777の３種類の形質転換体は約0.5ｇ／ｌ、2.4ｇ／ｌお
よび3.3ｇ／ｌのＲＭＰを生じ、組換えＲＭＰの特異的
活性はRhyzomucor mieheiの活性と同じであると考えら
れた（これについては、後で確認した）。ＳＤＳ−ＰＡ
ＧＥおよびＳＤＡ−ＰＡＧＥの後にWestern-blottingお
よびＥＬＩＳＡを行ったところ、大規模で培養する場合
には、１つの形状のＲＭＰのみが存在することが判っ
た。ＲＭＰはこれらの成長条件下でも、過剰にグリコシ
ル化した。ゲル上にみられるタンパクの量は、酵素活性
から予測された量とよく相関を有した。
ＲＭＰを親和性クロマトグラフィーおよび寸法排除クロ
マトグラフィーによって培養液の上澄みから精製した。
精製した組換えＲＭＰのＮ−末端配列を、Thimら（TEBS
Lett、1987年、印刷中）によって報告されたのと同様に
気相配列装置を用いて、測定した。
組換えＲＭＰの２つの形状はＮ−末端における加工が不
均一であることを示した。一つの形状はAla-Asp-Gly-Se
r-Val-Asp-Thr-Pro-Gly-Try-のＮ−末端配列を有し、も
う一方はGly-Ser-Val-Asp-Thr-Pro-Gly-Tyr-Tyr-Asp-の
Ｎ−末端配列を有したＮ−末端でのかかる不均一加工
も、Mucor miehieからの元のＲＭＰについて記載されて
いる（Paquet,D.ら、Neth.Milk Dairy J.、第３５巻、1
981年、358〜360頁）。組換えＲＭＰの不均一加工は元
のＲＭＰの不均一加工と良好な相関を有し、A.oryzaeは
本発明によれば正確な領域で組換えＲＭＰを加工するこ
とができることが判った。
実施例１２ A.oryzaeにおけるプロキモシンの産生に就いての発現単
位の構成 この構成は、A.oryzaeアミラーゼプロモーターの制御下
でA.oryzae TAKA−アミラーゼ遺伝子からのシグナルペ
プチド配列がすぐ先行するプロキモシン遺伝子を含む、
この構成は更に、A.nigerグルコアミラーゼ遺伝子とE.c
oli複製体からのからのターミネーターを含む。
p285′proC（実施例１参照）からの約430bp BamHI/XmaI
フラグメントおよび以下の配列 を有する合成オリゴマーをEcoRI-XmaI切断pUC19プラス
ミド中に挿入して、プラスミドpToC50aを生成した。
pToC50aをEcoRI-SacIIで切断し、pUC19を含む大きなフ
ラグメントとプロキモシン遺伝子（プロキモシン′）の
の５′部分を単離した。このフラグメントをpTAKA17か
らの0.6kb EcoRI-BanIフラグメントおよび以下の合成オ
リゴマーと連結した。
形質転換の後、A.oryzae TAKA−アミラーゼ遺伝子（プ
レTAKA）からのシグナル配列に融合し且つ約500bp上流
のTAKAアミラーゼ配列が先行するプロキモシン遺伝子
（プロキモシン′）のの５′部分を含むプラスミドpToC
51を単離した。pToC51の構成を第１５ａ図に示す。
pR26をHinfIで切断して、ＤＮＡポリメラーゼＩおよび
４個のｄＮＴＰの大きなフラグメント（Klenow）で処理
し、XmaIで切断した。プロキモシン遺伝子の３′末端を
含む750bpフラグメントを単離した。このフラグメント
の３′末端でのHindIIIを挿入するために、pUC9をXmaI/
HincIIで切断して、大きなフラグメントをプロキモシン
遺伝子の３′末端を含む750bpフラグメントに連結し
た。
pTAKA 17からの5.6kb EcoRI-ClaIフラグメントを単離し
て、同じプラスミド貸せの2.6kb ClaI-HindIIIフラグメ
ントおよびA.nigerグルコアミラーゼ遺伝子ターミネー
ターおよびポリＡ部位を含むpICAMG/Term（実施例４参
照）からの0.7kb EcoRI-HindIIIと連結した。生成する
プラスミド輪pToC52として第１５ｂ図に示す。
pToC52をHindIIIで切断し、EcoRIで部分的に切断し、6.
4kbフラグメントを単離した。これをpToC51からの0.9kb
EcoRI-XmaIフラグメントおよびプロキモシン遺伝
子（′プロキモシン）の３′部分を含むpUC9′PCからの
0.7kb XmaI-HindIIIフラグメントと連結した。生成する
プラスミドはpToC56と呼ばれ、第１５ｂ図に示す。
実施例１３ A.oryzaeにおけるプロキモシンの発現 p3SR2（amdS遺伝子）またはpSal43（argB遺伝子）と共
形質転換することによって、pToC56をA.oryzae IFO 417
7またはargB変異株に形質転換した。選択的培地で成長
する形質転換体を、実施例９と同様に２回再度単離し
た。
形質転換体をＹＰＤ中で３日間成長させ、上澄液のプロ
キモシン含量をＳＤＳ−ＰＡＧＥ後Westernブロット上
でＥＬＩＳＡによって分析した。形質転換体は、上澄液
中に１〜１０mg／ｌのプロキモシンの寸法免疫反応性タ
ンパクを産生した。他の免疫反応性タンパクは上澄液中
に検出されなかった。
実施例１４ A.oryzaeにおけるＲＭＬの発現 実施例８からのp787を、実施例９に記載の方法によって
p3SR2で共形質転換することによってIFO-4177中に形質
転換した。形質転換体を実施例９と同様に選択して、再
度単離した。
３日間成長させた形質転換体のＹＰＤ培養液からの上澄
液を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥの後にWesternブロットおよび
ＥＬＩＳＡを行って分析した。最良の形質転換体は、タ
ンパク１リットル当り２mgの成熟ＲＭＬの寸法を産生し
た。上澄液におけるリパーゼ活性を、トリブチリンを開
裂する能力として計測した（ＮＯＶＯ法AF 95.1／３−G
B）。
この測定によって上澄液に２mg／ｌの活性リパーゼが存
在することが判った。
【図面の簡単な説明】
第１図は、TAKA−アミラーゼプロモーターおよび上流プ
ロモーター領域のＤＮＡ−配列を示し、 第２図は、プラスミドpTAKA 17のエンドヌクレアーゼ制
限マップを示し、 第３図は、プラスミドp285′proCの構成を示し、 第４ａおよびｂ図は、３文字省略によって与えられる推
定アミノ酸配列を有するプレプロRhizomucor mieheiア
スパラギン酸プロテイナーゼのＤＮＡ配列を示し、 第５図は、プラスミドｐＲＭＰの構成を示す。 第６図は、プラスミドpCAMG91のエンドヌクレアーゼ制
限マップを示し、 第７ａ図はプラスミドpICAMG/Termの構成を示し、 第７ｂ図は、プラスミドp686の構成を示し、 第８図は、プラスミドpRMPAMGTermの構成を示し、 第９ａ図は、プラスミドpB408.3の構成を示し、 第９ｂ図は、プラスミドpB778の構成を示し、 第１０図は、プラスミドpB719の構成を示し、 第１１図は、プラスミドp777の構成を示し、 第１２図は、３文字省略によって与えられる推定アミノ
酸配列を有するプレプロRhizomucor mieheiリパーゼｃ
ＤＮＡの配列を示し、 第１３ａ図は、プラスミドpB544の構成を示し、 第１３ｂ図は、プラスミドp787の構成を示し、 第１４図は、合成フラグメントRML5′りＤＮＡ配列を示
し、 第１５ａ図は、プラスミドpToC51の構成を示し、 第１５ｂ図は、プラスミドpToC56の構成を示す。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.5 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ１２Ｒ 1:69） (Ｃ１２Ｎ 1/15 Ｃ１２Ｒ 1:69）

Claims (17)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】アスペルギルス・オリザ（Aspergillus or
    yzae）におけるタンパク生成物の発現方法であって、 （ａ）アスペルギルス・オリザ（Aspergillus oryzae）
    宿主のゲノム中に１個以上のコピーを組込み可能であ
    り、かつ、遺伝子発現を促進する機能を暗号化するDNA
    配列と形質転換細胞の選択に好適なマーカーと所望のタ
    ンパク生成物を暗号化するDNA配列とを含んで成る組換
    えDNAクローニングベクター系を用意し、 （ｂ）選定された選択マーカーについての機能的遺伝子
    を有しないアスペルギルス・オリザ（Aspergillus oryz
    ae）を工程（ａ）からの組換えDNAクローニングベクタ
    ー系で形質転換し、次いで （Ｃ）形質転換したアスペルギルス・オリザ（Aspergil
    lus oryzae）宿主を適当な培養基中で培養する工程を含
    んで成る方法。
  2. 【請求項２】遺伝子発現を促進する機能を暗号化するDN
    A配列が、プロモーター、転写開始部位、並びに転写タ
    ーミネーターおよびポリアデニル化機能を有する、特許
    請求の範囲第１項記載の方法。
  3. 【請求項３】プロモーターに対して、上流活性化配列が
    先行する、特許請求の範囲第２項記載の方法。
  4. 【請求項４】選択マーカーが、Ａ．ニドランス（A. nid
    ulans）またはＡ．ニガー（A. niger）argB、Ａ．ニド
    ランス（A. nidulans）trpC、Ａ．ニドランス（A. nidu
    lans）amdS、ニューロスポラ・クラザーエ（Neurospora
    crassae）Pyr4またはDHFRに由来する、特許請求の範囲
    第１項記載の方法。
  5. 【請求項５】選択マーカーがＡ．ニドランス（A. nidul
    ans）またはＡ．ニガー（A. niger）に由来するArgB遺
    伝子またはＡ．ニドランス（A. nidulans）に由来するa
    mdS遺伝子である、特許請求の範囲第４項記載の方法。
  6. 【請求項６】プロモーターおよび上流活性化配列がアミ
    ラーゼ、グルコアミラーゼ、プロテアーゼ、リパーゼ、
    セルラーゼまたは解糖酵素のような細胞外あるいは細胞
    内タンパクを暗号化する遺伝子に由来する、特許請求の
    範囲第３項記載の方法。
  7. 【請求項７】プロモーターおよび上流活性化配列が、
    Ａ．オリザ（A. oryzae）TAKAアミラーゼ、リゾムコー
    ル マイヘイ（Rhizomucor miehei）アスパラギン酸プ
    ロテイナーゼ、Ａ．ニガー（A. niger）中性α−アミラ
    ーゼ、Ａ．ニガー（A. niger）グルコアミラーゼまたは
    リゾムコール マイヘイ（Rhizomucor miehei）リパー
    ゼの遺伝子に由来する、特許請求の範囲第６項記載の方
    法。
  8. 【請求項８】プロモーターがA.oryzae TAKAアミラーゼ
    プロモーターまたはその機能性部分である、特許請求の
    範囲第７項記載の方法。
  9. 【請求項９】プロモーターおよび上流活性化配列が以下
    の配列 または機能的に等価なヌクレオチド配列を有する、特許
    請求の範囲第８項記載の方法。
  10. 【請求項１０】プロモーターおよび上流活性化配列が以
    下の配列 または機能的に等価なヌクレオチド配列を有する、特許
    請求の範囲第８項記載の方法。
  11. 【請求項１１】特許請求の範囲第10項記載の配列に対し
    て、プラスミドpTAKA 17における位置０〜1.05の1.05Kb
    無配列上流領域が先行する、特許請求の範囲第10項記載
    の方法。
  12. 【請求項１２】ベクター系が更に培養基への発現生成物
    の分泌を提供するためのプレ領域を有する、特許請求の
    範囲第１項記載の方法。
  13. 【請求項１３】プレ領域がアスペルギルス（Aspergillu
    s）の種からのグルコアミラーゼあるいはアミラーゼ遺
    伝子、バシラス（Bacillus）の種からのアミラーゼ遺伝
    子、リゾムコール マイヘイ（Rhizomucor miehei）か
    らのリパーゼもしくはプロテイナーゼ遺伝子、Ｓ．セレ
    ビゼ（S.cerevisiae）からのα−因子の遺伝子または仔
    牛のプロキモシン遺伝子に由来する、特許請求の範囲第
    12項記載の方法。
  14. 【請求項１４】プレ領域がＡ．オリザ（A.oryzae）TAKA
    アミラーゼ、Ａ．ニガー（A. niger）中性α−アミラー
    ゼ、Ａ．ニガー（A. niger）の酸に安定なα−アミラー
    ゼ、Ｂ．リケニフォルミス（B. licheniformis）、α−
    アミラーゼ、バシラス（Bacillus）NCIB 11837マルトー
    ス生成アミラーゼ、Ｂ．ステロサーフィラス（B.stearo
    thermophilus）α−アミラーゼまたはＢ．リケニホルミ
    ス・ズブチリシン（B. licheniformis subtilisin）の
    遺伝子に由来する、特許請求の範囲第13項記載の方法。
  15. 【請求項１５】プレ領域が以下の配列 を有するTAKA−アミラーゼプレ領域である、特許請求の
    範囲第14項記載の方法。
  16. 【請求項１６】ベクター系が２個のベクターを含んで成
    り、一方が選択マーカーを有し、他方は遺伝子発現を促
    進する機能を暗号化するDNA配列と所望のタンパク生成
    物を暗号化するDNA配列を有する、特許請求の範囲第１
    項記載の方法。
  17. 【請求項１７】アスペルギルス・オリザ（Aspergillus
    oryzae）によるタンパク生成物の製造方法であって、 （ａ）アスペルギルス・オリザ（Aspergillus oryzae）
    宿主のゲノム中に１個以上のコピーを組込み可能であ
    り、かつ、遺伝子発現を促進する機能を暗号化するDNA
    配列と形質転換細胞の選択に好適なマーカーと所望のタ
    ンパク生成物を暗号化するDNA配列とを含んで成る組換
    えDNAクローニングベクター系を用意し、 （ｂ）選定された選択マーカーについての機能的遺伝子
    を有しないアスペルギルス・オリザ（Aspergillus oryz
    ae）を工程（ａ）からの組換えDNAクローニングベクタ
    ー系で形質転換し、 （Ｃ）形質転換したアスペルギルス・オリザ（Aspergil
    lus oryzae）宿主を適当な培養基中で培養し、次いで （ｄ）培養物から生成物を回収する、 ことを特徴とする方法。
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