CN102341495A

CN102341495A - 巨大芽孢杆菌菌株DSM90相关的α-淀粉酶及其使用方法

Info

Publication number: CN102341495A
Application number: CN2010800109080A
Authority: CN
Inventors: B·E·琼斯; M·科尔克曼
Original assignee: Danisco USA Inc
Current assignee: Danisco USA Inc; Danisco US Inc
Priority date: 2009-03-10
Filing date: 2010-02-24
Publication date: 2012-02-01
Also published as: EP2406373B1; EP2406373A1; US20120172275A1; BRPI1009263A2; WO2010104675A1

Abstract

描述了涉及从巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)菌株DSM90获得的α-淀粉酶的和涉及结构上相关淀粉酶的组合物和方法。

Description

巨大芽孢杆菌菌株DSM90相关的α-淀粉酶及其使用方法

优先权

本申请要求2009年3月10日递交的美国临时专利申请系列号61/158,950的优先权，所述文献在此通过引用方式完整地并入作为参考。

技术领域

公开了涉及从巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)菌株DSM90获得的α-淀粉酶和涉及结构上相关淀粉酶的组合物和方法。

发明背景

淀粉由直链淀粉(15-30％w/w)和支链淀粉(70-85％w/w)的混合物组成。直链淀粉由α-1，4-连接的葡萄糖单元的直链组成，具有从约60,000至约800,000的分子量(MW)。支链淀粉是每隔24-30个葡萄糖单元含有α-1，6分支点的分支聚合物，其分子量可高达1亿。

来自淀粉的浓缩葡萄糖浆形式的糖目前通过酶催化方法产生，该方法包括(1)用α-淀粉酶将固体淀粉液化(或粘性降低)成具有约7-10平均聚合度的糊精，和(2)用淀粉葡糖苷酶(又称葡糖淀粉酶或GA)糖化所得的液化淀粉(即淀粉水解物)。所得的糖浆具有高的葡萄糖含量。商业产生的许多葡萄糖浆随后被酶促异构化成称作异糖浆(isosyrup)的葡萄糖/果糖混合物。

α-淀粉酶(EC 3.2.1.1)通过随机切割内部的α-1，4-糖苷键来水解淀粉、糖原和相关的多糖。α-淀粉酶，特别地来自芽孢杆菌属(Bacilli)的α-淀粉酶，已经用于多种不同目的，包括淀粉液化、织物退浆、造纸和纸浆工业中的淀粉改性，和用于酿造。这些酶也可以用来在餐具洗涤和衣物洗涤期间除去淀粉性污渍。对具有优异清洁性能的α-淀粉酶存在需求。

发明概述

本发明的组合物和方法涉及来自巨大芽孢杆菌菌株DSM90的α-淀粉酶和相关的α-淀粉酶，它们代表用于工业应用的独特淀粉酶家族。这些淀粉酶总体地称作AmyDSM90相关多肽或AmyDSM90相关淀粉酶。

在一个方面，提供了与AmyDSM90(SEQ ID NO：1)具有至少80％氨基酸序列同一性的分离多肽，其中该多肽相对于SEQ ID NO：1具有至少一个以下特征：

a)在第21位置处的天冬氨酸，

b)在第97位置处的天冬酰胺，和

c)在第128位置处的异亮氨酸。

在一些实施方案中，该多肽具有第21位置处的天冬氨酸和在第97位置处的天冬酰胺。在一些实施方案中，该多肽具有第21位置处的天冬氨酸和在第128位置处的异亮氨酸。在一些实施方案中，该多肽具有第97位置处的天冬酰胺和在第128位置处的异亮氨酸。在一些实施方案中，该多肽具有第21位置处的天冬氨酸、在第97位置处的天冬酰胺和在第128位置处的异亮氨酸。

在一些实施方案中，该多肽由异源细胞表达为分泌性多肽。

在一些实施方案中，该多肽具有α-淀粉酶活性。

在一些实施方案中，该多肽与SEQ ID NO：1的氨基酸序列具有至少90％同一性。在一些实施方案中，该多肽与SEQ ID NO：1的氨基酸序列具有至少95％同一性。在一些实施方案中，该多肽具有SEQ ID NO：1的氨基酸序列。在一些实施方案中，该多肽具有SEQ ID NO：28、SEQ ID NO：29或SEQ ID NO：30的氨基酸序列。

在一个相关的方面，提供了分离的多肽，其具有SEQ ID NO：23、SEQID NO：24、SEQ ID NO：25或SEQ ID NO：26的氨基酸序列。

在又一方面，提供了包含任一种前述多肽的组合物。

在一些实施方案中，该组合物是清洁组合物。在一些实施方案中，该组合物有效用于从衣物除去淀粉性污渍。在一些实施方案中，该组合物有效用于从餐具除去淀粉性污渍。在一些实施方案中，该组合物有效用于从织物除去淀粉性污渍。

在一个相关方面，提供了组合物，其包含具有SEQ ID NO：1、SEQ IDNO：3、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：23、SEQ ID NO：24、SEQ ID NO：25、SEQ ID NO：26、SEQ ID NO：28、SEQID NO：29或SEQ ID NO：30的氨基酸序列的多肽。

在另一个方面，提供了用于从表面除去淀粉性污渍的方法，该方法包括

在包含有效量的与AmyDSM90(SEQ ID NO：1)具有至少80％氨基酸序列同一性的α-淀粉酶的含水组合物存在下孵育该表面，其中该多肽相对于SEQ ID NO：1具有至少一个以下特征：

a)在第21位置处的天冬氨酸，

b)在第97位置处的天冬酰胺，和

c)在第128位置处的异亮氨酸；

允许该α-淀粉酶水解淀粉性污渍中存在的淀粉组分以产生淀粉衍生的溶解于含水组合物中的更小分子，

因而从表面除去淀粉性污渍。

在一些实施方案中，α-淀粉酶是AmyDSM90(SEQ ID NO：1)。在一些实施方案中，α-淀粉酶是具有第R179位及第G180位残基缺失的AmyDSM90变体(SEQ ID NO：28)。在一些实施方案中，α-淀粉酶是在M200处具有置换的AmyDSM90变体(SEQ ID NO：29)。在一些实施方案中，α-淀粉酶是具有第R179位及第G180位残基缺失和在M200处置换的AmyDSM90变体(SEQ ID NO：30)。

在含水组合物存在下孵育该表面，所述的含水组合物包含有效量的具有SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5、SEQ IDNO：6、SEQ ID NO：23、SEQ ID NO：24、SEQ ID NO：25、SEQ ID NO：26、SEQ ID NO：28、SEQ ID NO：29或SEQ ID NO：30的氨基酸序列的α-淀粉酶。

在一些实施方案中，该表面是织物表面。在一些实施方案中，该表面是在餐具上。在一些实施方案中，该表面是衣物表面。

在另一个方面，提供了用于表达α-淀粉酶的方法，该方法包括：

将包含多核苷酸的表达载体导入宿主细胞中，所述多核苷酸编码与AmyDSM90(SEQ ID NO：1)具有至少80％氨基酸序列同一性的α-淀粉酶，其中该多核苷酸符合读框地与信号序列融合；

表达α-淀粉酶为分泌性多肽至宿主细胞培养基中；和

从宿主细胞生长培养基回收分泌的α-淀粉酶；

因而分离作为分泌性多肽的α-淀粉酶。

在一些实施方案中，信号序列是天然信号序列。在一些实施方案中，信号序列来自芽孢杆菌属(Bacillus)AmyE或AprE或者链霉菌属(Streptomyces)CelA。

在一些实施方案中，α-淀粉酶具有SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：23、SEQ IDNO：24、SEQ ID NO：25、SEQ ID NO：26、SEQ ID NO：28、SEQ ID NO：29或SEQ ID NO：30的氨基酸序列。

在一些实施方案中，编码序列和编码α-淀粉酶的序列一起对SEQ IDNO：10的核苷酸序列具有至少80％同一性。

在一些实施方案中，该多肽相对于SEQ ID NO：1具有至少一个以下特征：

a)在第21位置处的天冬氨酸，

b)在第97位置处的天冬酰胺，和

c)在第128位置处的异亮氨酸。

在另一个方面，提供了编码前述多肽的多核苷酸，连同包括此类多核苷酸的表达载体。在又一方面，提供了包括这些表达载体的宿主细胞。

这些方面和其他方面以及组合物和方法的实施方案将从本发明描述和附图显而易见。

附图简述

图1.来自巨大芽孢杆菌DSM90(AmyDSM90，SEQ ID NO：1)和巨大芽孢杆菌AAK00598(SEQ ID NO：3)的蛋白质序列的比对。

图2.来自巨大芽孢杆菌DSM90(AmyDSM90，SEQ ID NO：1)、炭疽芽孢杆菌(B.anthracis)AAT32659(SEQ ID NO：4)、苏云金芽孢杆菌(B.thuringiensis)AAT60457(SEQ ID NO：5)、蜡状芽孢杆菌(B.cereus)AAP10417(SEQ ID NO：6)和巨大芽孢杆菌AAK00598(SEQ ID NO：3)的直向同源的淀粉酶序列的比对。

图3.质粒载体pHPLT的示意图，该质粒载体含有热稳定的淀粉酶LAT启动子(pLAT)和地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)LAT信号肽(pre LAT)，后接用于克隆的PstI和HpaI限制性位点。

图4.质粒pME602.13(也叫做pHPLT-B.meg DSM90Amy)的示意图，该质粒含有从菌株DSM90扩增的淀粉酶基因。

图5.用于AmyDSM90表达的基因构建体。

图6.地衣芽孢杆菌中作为带有地衣芽孢杆菌α-淀粉酶(LAT)信号肽的融合蛋白表达的AmyDSM90的核苷酸(SEQ ID NO：9)和相应氨基酸序列(SEQ ID NO：10)。

图7.含有LAT-DSM90淀粉酶基因的pICatH-B.meg DSM90amy质粒的示意图。

图8.使用CS-28稻淀粉玷污的织物样品，在25mM BTP pH 8缓冲液中于20℃1小时显示AmyDSM90的清洁性能的曲线图。

图9.使用CS-28稻淀粉玷污的织物样品，在25mM BTP pH 8缓冲液中于40℃1小时显示AmyDSM90的清洁性能的曲线图。

图10.使用CS-28稻淀粉玷污的织物样品，在25mM CAPS pH 10.3缓冲液中于20℃1小时显示AmyDSM90的清洁性能的曲线图。

图11.使用CS-28稻淀粉玷污的织物样品，在25mM CAPS pH 10.3缓冲液中于40℃1小时显示AmyDSM90的清洁性能的曲线图。

图12.显示在25mM HEPES缓冲液，pH 8中由AmyDSM90相关多肽清洁CS-28稻淀粉玷污的织物样品的曲线图。

图13.显示在25mM CAPS缓冲液，pH 10中由AmyDSM90相关多肽清洁CS-28稻淀粉玷污的织物样品的曲线图。

图14.在AATCC粉状洗涤剂，pH 10.5中使用CS-28稻淀粉玷污的织物样品情况下，显示巨大芽孢杆菌淀粉酶的衣物洗涤性能的曲线图。

图15.在AATCC液体洗涤剂，pH 7中使用CS-28稻淀粉玷污的织物样品情况下，显示巨大芽孢杆菌淀粉酶的衣物洗涤性能的曲线图。

图16显示在40℃于AATCC粉状洗涤剂，pH 10中使用CS-28稻淀粉玷污的织物样品情况下，Terg-o-tometer实验中作为剂量之函数的AmyDSM90清洁性能的曲线图。

图17.与商品淀粉酶相比，显示Amy DSM90在商品凝胶洗涤剂中洗涤性能的曲线图。

图18.与商品淀粉酶相比，显示Amy DSM90在标准洗涤剂中洗涤性能的曲线图。

图19.显示AmyDSM90相关淀粉酶在商品凝胶洗涤剂中洗涤性能的曲线图。

图20.显示AmyDSM90相关淀粉酶在含有漂白剂的标准洗涤剂中洗涤性能的曲线图。

图21.显示AmyDSM90相关淀粉酶在无漂白剂的标准洗涤剂中洗涤性能的曲线图。

图22.在本说明书中所提到的多肽序列和核苷酸序列。

序列简述

SEQ ID NO：1是巨大芽孢杆菌AmyDSM90成熟淀粉酶的氨基酸序列。

SEQ ID NO：2是克隆pME602的核苷酸序列。

SEQ ID NO：3是巨大芽孢杆菌AAK00598成熟淀粉酶的氨基酸序列。

SEQ ID NO：4是炭疽芽孢杆菌AAT32659成熟淀粉酶的氨基酸序列。

SEQ ID NO：5是苏云金芽孢杆菌AAT60457成熟淀粉酶的氨基酸序列。

SEQ ID NO：6是蜡状芽孢杆菌AAP10417成熟淀粉酶的氨基酸序列。

SEQ ID NO：7是地衣芽孢杆菌LAT信号肽的氨基酸序列。

SEQ ID NO：8是巨大芽孢杆菌DSM9016S rRNA的部分核苷酸序列。

SEQ ID NO：9是多核苷酸的核苷酸序列，所述多核苷酸编码在地衣芽孢杆菌中作为带有地衣芽孢杆菌α-淀粉酶(LAT)信号肽的融合蛋白表达的AmyDSM90。

SEQ ID NO：10是地衣芽孢杆菌中作为带有地衣芽孢杆菌α-淀粉酶(LAT)信号肽的融合蛋白表达的AmyDSM90多肽的氨基酸序列。

SEQ ID NOs：11和12是用来从巨大芽孢杆菌DSM90扩增amyDSM90基因的PCR引物的核苷酸序列。

SEQ ID NOs：13和14是用于菌落PCR以证实存在所需质粒DNA序列的PCR引物的核苷酸序列。

SEQ ID NOs：15和16是用来证实存在所需质粒DNA序列的测序引物的核苷酸序列。

SEQ ID NOs：17和18是用来扩增amyDSM90相关序列以制备地衣芽孢杆菌表达菌株的PCR引物的核苷酸序列。

SEQ ID NOs：19和20是使用QUIK-CHANGE方法，用来导入M200L置换的引物的核苷酸序列。

SEQ ID NOs：21和22是使用QUIK-CHANGE方法，用来导入ΔRG缺失的引物的核苷酸序列。

SEQ ID NO：23是编码来自炭疽芽孢杆菌AAT32659的淀粉酶的合成基因的核苷酸序列。

SEQ ID NO：24是编码来自蜡状芽孢杆菌AAP10417的淀粉酶的合成基因的核苷酸序列。

SEQ ID NO：25是编码来自苏云金芽孢杆菌AAT60457的淀粉酶的合成基因的核苷酸序列。

SEQ ID NO：26是编码来自巨大芽孢杆菌AAK00598的淀粉酶的合成基因的核苷酸序列。

SEQ ID NO：27是巨大芽孢杆菌AAK00598不成熟淀粉酶的氨基酸序列。信号肽序列以粗体显示。

SEQ ID NO：28是具有ΔRG缺失的AmyDSM90淀粉酶的氨基酸序列。

SEQ ID NO：29是具有M200L置换的AmyDSM90淀粉酶的氨基酸序列。

SEQ ID NO：30是具有ΔRG缺失和M200L置换的AmyDSM90淀粉酶的氨基酸序列。

发明详述

描述了涉及从巨大芽孢杆菌菌株DSM90分离的α-淀粉酶和涉及结构上相关淀粉酶的组合物和方法。这些淀粉酶总体地称作AmyDSM90相关淀粉酶或AmyDSM90相关多肽。AmyDSM90是迄今未描述的分泌性淀粉酶，该淀粉酶具有使其区别于相关淀粉酶的几个独特结构特征。另外，AmyDSM90相关多肽是分泌性多肽而非胞质多肽的发现使得能够为工业和商业用途大规模表达并纯化多种AmyDSM90相关多肽。这些淀粉酶的示例性用途是在制备用于衣物、餐具、织物和其他表面的清洁组合物如洗涤剂组合物方面。下文更详细地描述所述组合物和方法的这些方面和其他方面。

1.定义和缩写

根据这份详细的说明书，以下缩写和定义适用。应当指出，单数形式“一个”、“一种”和“该”包括复数指代，除非上下文清楚地说明并非如此。因此，例如，对“一种酶”的提及包括多种此类酶，并且对“该剂量”的提及包括对本领域技术人员已知的一个或多个剂量和其等同物的提及等。

除非另外定义，本文中所用的全部技术及科学术语具有与本领域普通技术人员通常所理解的相同意义。为清晰起见，定义以下缩写和/或术语。

1.1缩写/首字母缩写词

以下缩写/首字母缩写词具有以下含义，除非另外说明：

AE 脂肪醇乙氧基化物

AEO 脂肪醇乙氧基化物

AEOS 脂肪醇乙氧基化硫酸盐

AES 脂肪醇乙氧基化硫酸盐

AmyDSM90 来自巨大芽孢杆菌菌株DSM90的α-淀粉酶

AOS α-烯属磺酸酯

AS 烷基硫酸盐

CBD-25 糖结合结构域蛋白质家族25

cDNA 互补性DNA

CMC 羧甲基纤维素

DNA 脱氧核糖核酸

DTMPA 二乙三胺五乙酸

EC 酶学委员会

EDTA 乙二胺四乙酸

EMPA

Materialprüfungs-und Forschungs

Anstalt (瑞士联邦材料测试与研究实验室)

EO 环氧乙烷(聚合物片段)

F&HC 织物和家居用品护理

GA 葡糖淀粉酶

IPTG 异丙基β-D-硫代半乳糖苷

kDa 千道尔顿

LAS 线性烷基苯磺酸盐

LAT 地衣芽孢杆菌(B.licheniformis)淀粉酶

MW 分子量

MWU 改良Wohlgemuth单位；1.6x10^-5mg/MWU＝活性单位

NOBS 壬酰氧基苯磺酸盐

NTA 次氮基乙酸

OxAm Purastar HPAM 5000L(Genencor International，Inc.)

PEG 聚乙二醇

pI 等电点

PVA 聚(乙烯醇)

PVP 聚(乙烯吡咯烷酮)

RNA 核糖核酸

SAS 烷基磺酸盐

SDS-PAGE 十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳

sp. 物种

TAED 四乙酰乙二胺

w/v 重量/体积

w/w 重量/重量

v/v 体积/体积

wt％重量百分数

℃ 摄氏度

H₂O 水

dH₂O或DI 去离子水

dIH₂O Milli-Q过滤去离子水

g或gm 克

μg 微克

mg 毫克

kg 千克

μL和μl 微升

mL和ml 毫升

mm 毫米

μm 微米

M 摩尔

mM 毫摩尔

μm 微摩尔

U 单位

sec 秒

min 分钟

hr 小时

DO 溶解氧

Genencor Danisco US Inc，Genencor Division，Palo Alto，CA

Ncm 牛顿厘米

ETOH 乙醇

eq. 当量

N 正常

ds或DS 干固体含量

1.2定义

术语“淀粉酶”或“淀粉分解酶”指尤其能够催化淀粉降解的酶。淀粉酶是切割淀粉中α-D-(1→4)O-糖苷键的水解酶。通常，α-淀粉酶(EC 3.2.1.1；α-D-(1→4)-葡聚糖葡聚糖水解酶)定义为以随机方式切割淀粉分子内部α-D-(1→4)O-糖苷键的内切作用酶。相反，外切作用解淀粉酶，如β-淀粉酶(EC 3.2.1.2；α-D-(1→4)-葡聚糖麦芽糖水解酶)和一些产物特异性淀粉酶如生麦芽糖α-淀粉酶(EC 3.2.1.133)从底物的非还原性末端切割淀粉分子。β-淀粉酶、α-葡糖苷酶(EC 3.2.1.20；α-D-葡糖苷葡萄糖水解酶)、葡糖淀粉酶(EC 3.2.1.3；α-D-(1→4)-葡聚糖葡萄糖水解酶)和产物特异性淀粉酶可以从淀粉产生特定长度的麦芽糖寡糖。

如本文中所用，术语“淀粉”指包含植物的复杂多糖碳水化合物的任何物质，其包含具有式(C₆H₁₀O₅)_x的直链淀粉和支链淀粉，其中X可以是任意数字。该术语包括基于植物的物质，如谷物、牧草、块茎和根，并且更具体地包括从小麦、大麦、谷物、黑麦、稻、高粱、麸、木薯(cassava)、粟、马铃薯、甘薯和木薯粉(tapioca)获得的物质。

就多肽而言，术语“野生型”、“亲代”或“参照”指在一个或多个氨基酸位置不包括人造置换、***或缺失的天然存在多肽。类似地，就多核苷酸而言，术语“野生型”、“亲代”或“参照”指不包括人造核苷改变的天然存在多核苷酸。但是应当指出编码野生型、亲代或参照多肽的多核苷酸不限于天然存在的多核苷酸，而是包括编码野生型、亲代或参照多肽的任意多核苷酸。

就多肽而言，术语“变体”指下述多肽，该多肽不同于指定的野生型、亲代或参照多肽，因为该多肽在一个或多个氨基酸位置处包括人造置换、***或缺失。类似地，就多核苷酸而言，术语“变体”指在核苷酸序列方面不同于指定野生型、亲代或参照多核苷酸的多核苷酸。野生型、亲代或参照多肽或多核苷酸的身份将从上下文显而易见。

涉及主题细胞、核酸、蛋白质或载体使用时，术语“重组”表示该主题已经通过导入异源核酸或蛋白质或改变天然核酸或蛋白质被修饰，或者该细胞从如此修饰的细胞衍生。因而，例如，重组细胞表达在天然(非重组)形式的细胞内部找不到的基因，或以不同水平或在不同于自然界存在的条件下表达天然基因。

术语“回收”、“分离”和“分开”指从与其如自然界中存在那样天然结合的至少一种其他物质或组分中移出的化合物、蛋白质(多肽)、细胞、核酸、氨基酸或其他指定物质或组分。

如本文中所用，术语“纯化”意指处于相对纯的状态，例如，至少约90％纯，至少约95％纯、至少约98％纯或甚至至少约99％纯的物质(例如，分离的多肽或多核苷酸)。

就酶而言，术语“热稳定的”和“热稳定性”指酶在暴露于升高的温度后仍保留活性的能力。酶(如淀粉酶酶)的热稳定性由其以分钟、小时或日给出的半寿期(t_1/2)度量，在所述半寿期期间一半的酶活性在定义的条件丧失。可以通过暴露于(即遭受)升高的温度后测量残留α-淀粉酶活性计算半寿期。

就酶而言，“pH范围”意指pH值的范围，在所述范围下该酶显示催化活性。

如本文中所用，就酶而言，术语“pH稳定的”和“pH稳定性”涉及该酶在宽pH值范围内仍保留活性持续预定时间段(例如，15分钟、30分钟、1小时)的能力。

如本文中所用，“氨基酸序列”同义于术语“多肽”、“蛋白质“和“肽”，并且互换使用。在此类氨基酸序列显示活性的情况下，可以称它们为“酶”。使用氨基酸残基的常规单字母或三字母代码，同时氨基酸序列以标准的氨基至羧基端方向(即，N→C)表述。

术语“核酸”包括能够编码多肽的DNA、RNA、异双链体和合成的分子。核酸可以是单链或双链的，并且可以是化学修饰物。术语“核酸”和“多核苷酸”互换使用。因为遗传密码是简并的，故多于一种密码子可以用来编码特定氨基酸，并且本发明的组合物和方法包括编码特定氨基酸序列的核苷酸序列。除非另外说明，核酸序列以5′-至-3′方向表述。

“同源物”应当意指与主题氨基酸序列和主题核苷酸序列具有指定同一性程度的实体。同源序列理解为包括使用常规序列比对工具(例如，Clustal、BLAST等)，与主题序列至少75％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或甚至99％相同的氨基酸序列。一般而言，同源物将包括与主题氨基酸序列相同的活性部位残基，除非另外说明。

如本文中所用，术语“杂交”指核酸的一条链与互补链碱基配对的过程，在印迹杂交技术和PCR技术期间发生这一过程。严格杂交条件例举如下：50℃和0.2×SSC(1×SSC＝0.15M NaCl，0.015M柠檬酸三钠，pH 7.0)。高度严格杂交条件例举如下：65℃和0.1×SSC(1×SSC＝0.15M NaCl，0.015M柠檬酸三钠，pH 7.0)]。

如本文中所用，“合成的”分子是由体外化学合成或酶促合成而不由生物产生。

如本文中所用，谈到细胞时使用的术语“转化的”、“稳定转化的”和“转基因的”意指该细胞含有整合至其基因组内部或作为附加体携带的非天然(例如，异源)核酸序列，其中所述的附加体历经多个世代后仍维持。

在将核酸序列***细胞中的情况下，术语“导入”意指“转染”、“转化”或“转导”，如本领域已知。

“宿主菌株”或“宿主细胞”是已经导入包括编码目的多肽(例如，变体淀粉酶)的多核苷酸的表达载体、噬菌体、病毒或其他DNA构建体的生物。示例性宿主菌株是细菌细胞。术语“宿主细胞”包括从细胞(如芽孢杆菌属中的物种的那些细胞)产生的原生质体。

就多核苷酸或蛋白质而言，术语“异源的”指在宿主细胞中不天然存在的多核苷酸或蛋白质。

就多核苷酸或蛋白质而言，术语“内源的”指在宿主细胞中天然存在的多核苷酸或蛋白质。

如本文中所用，术语“表达”指基于核酸序列产生多肽的过程。该过程包括转录和翻译。

“选择标记”或“可选择标记”指基因，该基因能够在宿主中表达以促进选择携带此基因的宿主细胞。可选择标记的实例包括，但不限于抗微生物剂(例如潮霉素、博来霉素或氯霉素)和/或赋予宿主细胞代谢优势(如营养优势)的基因。

“载体”指设计用于将核酸导入一种或多种细胞类型的多核苷酸序列。载体包括克隆载体、表达载体、穿梭载体、质粒、噬菌体颗粒、盒等。

“表达载体”意指包含编码目的多肽的DNA序列的DNA构建体，其中所述的编码序列与能够实现该DNA在合适宿主表达的合适调控序列有效连接。此类调控序列可以包括实现转录的启动子、控制转录的任选操纵基因序列、编码mRNA上合适核糖体结合位点的序列、增强子和控制转录及翻译终止的序列。

术语“有效连接的”意指特定的多个组件处在允许它们以其预期方式发挥功能的关系(包括但不限于并列)中。例如，调节序列与编码序列有效连接，从而该编码序列的表达处在此调控序列的控制下。

“信号序列”是与蛋白质的氨基端部分连接的氨基酸序列，该序列促进该蛋白质分泌在细胞外。成熟形式的胞外蛋白缺少信号序列，该信号序列在分泌过程期间被切除。

如本文中所用，“生物活性的”指具有指定生物学活性(如酶活性)的序列。

“水硬度”是水中存在的矿物质(例如，钙和镁)的量度。

如本文中所用，“包含AmyDSM90相关多肽的培养细胞材料”或相似语言指包括AmyDSM90相关多肽作为组分的细胞裂解物或上清液(包括培养基)。该细胞材料优选地来自以培养方式培育旨在产生AmyDSM90相关多肽的异源宿主。

2.AmyDSM90相关多肽和核酸

本发明组合物和方法的一个方面是AmyDSM90相关多肽。该多肽可以对应于AmyDSM90、与AmyDSM90具有指定同一性程度的淀粉酶、AmyDSM90的包括人造置换、***或缺失的变体、或者其嵌合体。示例性AmyDSM90多肽具有SEQ ID NO：1的氨基酸序列。额外的多肽具有与AmyDSM90多肽至少75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或甚至99％的同源性/同一性。

在一些实施方案中，AmyDSM90多肽(相对于SEQ ID NO：1)具有至少一个以下特征：(a)在第21位置处的天冬氨酸，(b)在第97位置处的天冬酰胺，或(c)在第128位置处的异亮氨酸。在这些位置处的指定氨基酸残基使AmyDSM90多肽区别于来自炭疽芽孢杆菌AAT32659(SEQ ID NO：4)、苏云金芽孢杆菌AAT60457(SEQ ID NO：5)、蜡状芽孢杆菌AAP10417(SEQ ID NO：6)和巨大芽孢杆菌AAK00598(SEQ ID NO：3)的直向同源淀粉酶(见，例如，图2)。值得注意地，AmyDSM90多肽中天冬氨酸在第21位置处并且天冬酰胺在第97位置处的存在与所述直向同源淀粉酶中观察到的逆向布局(即，天冬酰胺在第21位置处存在并且天冬氨酸天在第97位置处存在)相反。不受限于理论，提出带正电荷的氨基酸残基在第21位置处的存在通常对于酶活性是重要，并且提出AmyDSM90多肽已经通过在第97位置处采用带正电荷的氨基酸残基克服了对第21位置处的这种电荷的需求。然而，该理论不排除以下可能性：使AmyDSM90多肽区别于直向同源淀粉酶的每个上文所确定特征是独立和非依赖性的。

因此，在一些实施方案中，AmyDSM90多肽仅具有一个上文所确定特征，即，第21位置处的天冬氨酸、在第97位置处的天冬酰胺或在第128位置处的异亮氨酸。在其他实施方案中，该α-淀粉酶具有二个上文所确定的特征，即，与第97位置处天冬酰胺组合的第21位置处天冬氨酸、与第128位置处异亮氨酸组合的第21位置处天冬氨酸或者与第128位置处异亮氨酸组合的第97位置处天冬酰胺。在具体的实施方案中，α-淀粉酶具有全部三个上文所确定特征，即，第21位置处的天冬氨酸、在第97位置处的天冬酰胺和在第128位置处的异亮氨酸。

所述多肽可以是包括信号序列的“不成熟”或“全长”AmyDSM90相关多肽，或缺少信号序列的成熟形式的AmyDSM90相关多肽。示例性不成熟形式的AmyDSM90多肽具有SEQ ID NO：2的氨基酸序列，而示例性成熟形式的AmyDSM90多肽具有SEQ ID NO：1的氨基酸序列。成熟形式的所述多肽大多用于清洁组合物中。所述多肽可以是截短形式的AmyDSM90相关多肽，其缺少成熟形式的N端或C端，或是AmyDSM90相关多肽的片段，其仍保留至少一部分作为亲代AmyDSM90相关多肽特征的α-淀粉酶活性。

如上文指出，所述多肽包括变体多肽，如包括人造缺失、***和置换的那些变体多肽。示例性缺失是残基R179和/或G180的缺失。示例性置换是残基M200，例如，M200L置换。R179-G180缺失和M200置换还可以在单一多肽中组合。其他示例性置换是保守性氨基酸置换，如下表中列出的那些氨基酸置换。

如所提及，优选的多肽仍保留α-淀粉酶活性，但是可以相对于天然存在的亲代多肽而言具有改变的生物化学特性。在一些实施方案中，亲代多肽是SEQ ID NO：1的亲代多肽。

所述多肽也可以是嵌合多肽，其包括AmyDSM90相关多肽的至少一部分和第二多肽的至少一部分。第二多肽可以例如是第二种淀粉酶、异源信号序列、允许追踪或纯化的表位等。示例性异源信号序列来自枯草芽孢杆菌淀粉酶(AmyE)或AprE和链霉菌属CelA。

本发明组合物和方法的另一个方面是编码AmyDSM90相关多肽的核酸。该核酸可以编码AmyDSM90、与AmyDSM90具有指定同一性程度的淀粉酶、AmyDSM90的包括人造置换、***或缺失的变体、或者其嵌合体。在一个实例中，核酸编码与AmyDSM90多肽(如SEQ ID NO：1的多肽)具有至少75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或甚至99％同源性/同一性的淀粉酶。该多肽可以包括上文所述的至少一个氨基酸序列特征。可以理解因遗传密码的简并性，多种核酸可以编码相同的多肽。

核酸也可以与编码AmyDSM90相关多肽的示例性多核苷酸如编码AmyDSM90的SEQ ID NO：7具有指定的同源性程度。在一个实例中，该核酸与示例性序列具有至少75％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或甚至99％同一性。在另一个实例中，该核酸在严格或非常严格条件下与示例性序列杂交。

核酸可以编码包括信号序列的“全长”(“fl”或“FL”)AmyDSM90相关多肽、缺少信号序列的仅成熟形式的AmyDSM90相关多肽、缺少成熟形式N端或C端的截短形式的AmyDSM90相关多肽，或其片段，它们仍保留至少一部分作为AmyDSM90相关多肽特征的α-淀粉酶活性。

编码AmyDSM90相关多肽的核酸可以与适用于宿主细胞中表达AmyDSM90相关多肽的载体中的多种启动子和调节基因有效连接。示例性启动子是枯草芽孢杆菌Amy E启动子和AprE启动子，以及链霉菌属CelA启动子。这种核酸也可以与其他编码序列连接，例如旨在编码嵌合多肽。

3.产生和纯化蛋白质的方法

本发明组合物和方法的一个方面是AmyDSM90相关多肽可以作为分泌性多肽表达。值得注意地，基于Genbank条目中的注释，迄今认为来自炭疽芽孢杆菌AAT32659(SEQ ID NO：4)、苏云金芽孢杆菌AAT60457(SEQ ID NO：5)和蜡状芽孢杆菌AAP10417(SEQ ID NO：6)的直向同源α-淀粉酶是细胞性多肽。就工业和商业过程而言，认为胞质淀粉酶具有较低价值，因为它们的生产和回收更复杂。因此，以下发现，即AmyDSM90相关多肽(包括这些直向同源α-淀粉酶)是分泌性的，大大促进了它们的分离和纯化，并且使它们能够在工业和商业过程中大规模使用。

产生和纯化从芽孢杆菌分泌到培养基中的蛋白质的方法是本领域已知的，而用于产生α-淀粉酶的合适宿主细胞也本领域已知的。下文公开了用于产生α-淀粉酶的示例性方法。

3.1用于产生α-淀粉酶的材料和方法

使用一般包括编码合适启动子、操纵基因、核糖体结合位点、翻译起始信号的调控序列和任选地包括阻抑基因或多种活化基因的表达载体，可以以酶形式表达AmyDSM90相关多肽。大量载体是商业上可获得的以重组DNA方法使用，并且载体的选择常常取决于载体待导入的宿主细胞。载体可以是自主复制型载体，即，作为其复制不依赖染色体复制的染色体外实体存在的载体，例如，质粒、噬菌体或染色体外元件、微型染色体或人工染色体。备选地，载体可以这样的载体，当导入分离的宿主细胞中时，所述载体整合到该宿主细胞基因组中并且随该载体已经整合至其中的染色体一起复制。通过利用受抗生素选择或其他选择压力驱动的扩增型构建体(如必需调节基因)或通过互补作用借助必需代谢途径基因的剂量效应也可以扩增整合的基因以在染色体中产生该基因的多个拷贝。

在载体中，所述DNA序列应当与合适的启动子序列有效连接。该启动子可以是在选择的宿主细胞中显示转录活性的任意DNA序列并且可以从编码与该宿主细胞同源或异源的蛋白质的基因衍生。用于指导编码AmyDSM90相关多肽的DNA序列转录、特别地在细菌宿主中转录的示例性启动子是大肠杆菌lac操纵子的启动子、天蓝色链霉菌(Streptomycescoelicolor)琼脂糖酶基因dagA或celA的启动子、地衣芽孢杆菌α-淀粉酶基因(amyL)的启动子、嗜热脂肪芽孢杆菌生麦芽糖淀粉酶基因(amyM)的启动子、解淀粉芽孢杆菌α-淀粉酶(amyQ)的启动子、枯草芽孢杆菌xylA和xylB基因的启动子等。对于真菌宿主中的转录，有用启动子的实例是从编码米曲霉(A.oryzae)TAKA淀粉酶、米黑根毛霉(Rhizomucor miehei)天冬氨酸蛋白酶、黑曲霉(A.niger)中性α-淀粉酶、黑曲霉酸稳定性α-淀粉酶、黑曲霉葡糖淀粉酶、米黑根毛霉脂肪酶、米曲霉碱性蛋白酶、米曲霉磷酸三糖异构酶或构巢曲霉(A.nidulans)乙酰胺酶的基因衍生的那些启动子。当编码AmyDSM90相关多肽的基因在细菌物种如大肠杆菌中表达时，可以例如从包括T7启动子和噬菌体λ启动子的噬菌体启动子中选择合适的启动子。用于酵母物种中表达的合适启动子的实例包括但不限于酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)Gal 1和Gal 10启动子和毕赤巴斯德酵母(Pichia pastoris)AOX1或AOX2启动子。对于在里氏木霉(Trichodermareesei)中表达，可以使用CBHII(纤维二糖水解酶II)启动子。

表达载体也可以包含适合的转录终止子和(在真核生物中)与编码AmyDSM90相关多肽的DNA序列有效连接的多腺苷酸化序列。终止序列和多腺苷酸化序列可以合适地与启动子源自相同来源。

载体还可以包含能够使该载体在宿主细胞中复制的DNA序列。此类序列的实例是质粒pUC19、pACYC177、pUB110、pE194、pAMB1和pIJ702的复制起点。

载体也可以包含选择标记，例如其产物补充分离的宿主细胞中某缺陷的基因，如来自枯草芽孢杆菌或地衣芽孢杆菌的dal基因，或者赋予抗生素抗性(例如青霉素、卡那霉素、氯霉素或四环素抗性)的基因。此外，载体可以包含产生潮霉素抗性的曲霉属选择标记如amdS、argB、niaD和xxsC，或者选择可以通过本领域已知的共转化法实现。见，例如，国际PCT申请WO 91/17243。

如上文指出，尽管胞内表达或固体发酵可能在一些方面中是有利的，例如，当使用某些细菌或真菌作为宿主细胞时，所述组合物和方法的一个方面构思了将AmyDSM90相关多肽向培养基中表达。

通常，全长或不成熟的AmyDSM90相关多肽在氢基端包括允许分泌至培养基中的信号序列。根据需要，该信号肽可以被不同的序列替换，所述替换便利地通过替换编码各个信号多肽的DNA序列来完成。

表达载体一般包括克隆载体的组分，例如，允许载体在所选择的宿主生物中自主复制的元件和一个或多个用于选择目的的表型上可检测的标记。表达载体通常包含调控核苷酸序列，如启动子、操纵基因、核糖体结合位点、翻译起始信号和任选地包含阻抑基因或者一个或更多活化基因。额外地，表达载体可以包含编码氨基酸序列的序列，其中所述的氨基酸序列能够靶向α-淀粉酶变体至宿主细胞的细胞器如过氧化物酶体或至特定宿主细胞区室。这种靶向序列包括但是不限于序列SKL。为在调控序列的指导下表达，α-淀粉酶变体的核酸序列以相对于表达而言恰当的方式与调控序列有效连接。示例性载体的一部分在图3中描述。

用来分别连接编码AmyDSM90相关多肽、启动子、终止子和其他元件的DNA构建体和用来将它们***含有复制所必需信息的合适载体中的方法是本领域技术人员熟知的(见，例如，Sambrook等人，MOLECULARCLONING：A LABORATORY MANUAL，第2版，Cold Spring Harbor，1989，和第3版，2001)。

包含DNA构建体或表达载体的分离细胞有利地作为重组产生AmyDSM90相关多肽中的宿主细胞使用。细胞可以用编码该酶的DNA构建体，便利地通过在宿主染色体中整合(一个或多个拷贝的)该DNA构建体进行转化。这种整合通常认为是有优势的，因为DNA序列更有可能稳定地维持在细胞中。DNA构建体整合到宿主染色体中可以根据常规方法进行，例如通过同源或异源重组。备选地，细胞可以用如上所述的与不同类型的宿主细胞有关的表达载体转化。

合适的细菌宿主生物的实例是***物种，例如芽孢杆菌科，包括枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、迟缓芽孢杆菌(Bacillus lentus)、短芽孢杆菌(Bacillus brevis)、嗜热脂肪土芽孢杆菌(其中土芽孢杆菌先前称为芽孢杆菌)(Geobacillus stearothermophilus)、嗜碱芽孢杆菌(Bacillusalkalophilus)、解淀粉芽孢杆菌(Bacillus coagulans)、凝固芽孢杆菌(Bacilluscoagulans)、灿烂芽孢杆菌(Bacillus lautus)、巨大芽孢杆菌和苏云金芽孢杆菌；链霉菌属物种，例如鼠灰链霉菌(Streptomyces murinus)；乳酸细菌物种，包括乳球菌属物种(Lactococcus sp.)，例如乳酸乳球菌(Lactococcuslactis)；乳杆菌属物种(Lactobacillus sp.)，包括路氏乳杆菌(Lactobacillusreuteri)；明串球菌属物种(Leuconostoc sp.)；片球菌属物种(Pediococcus sp.)和链球菌属物种(Streptococcus sp.)。备选地，可以选择属于肠细菌科(Enterobacteriaceae)(包括大肠杆菌)或属于假单胞菌科(Pseudomonadaceae)的革兰氏阴性细菌物种的菌株作为宿主生物。

合适的酵母宿主生物可以从生物技术相关酵母物种中选择，如但是不限于酵母属物种，如毕赤酵母属物种(Pichia sp.)、汉逊酵母属物种(Hansenula sp.)或克鲁维酵母属(Kluyveromyces)物种、亚罗酵母属(Yarrowinia)物种、裂殖酵母属(Schizosaccharomyces)物种或酵母属(Saccharomyces)的物种，包括酿酒酵母，或属于裂殖酵母属的物种，例如粟酒裂殖酵母(S.pombe)物种。甲基营养酵母物种毕赤巴斯德酵母的菌株可以作为宿主生物使用。备选地，宿主生物可以是汉逊酵母属物种。丝状真菌当中的合适宿主生物包括曲霉属(Aspergillu)的物种，例如黑曲霉(Aspergillus niger)、米曲霉(Aspergillus oryzae)、塔宾曲霉(Aspergillustubigensis)、泡盛曲霉(Aspergillus awamori)、或构巢曲霉(Aspergillusnidulan)。备选地，镰孢霉属(Fusarium)物种(例如，尖镰孢(Fusariumoxysporum))或根毛霉属物种(如米黑根毛霉)的菌株可以作为宿主生物使用。其他合适的菌株包括嗜热丝孢菌属(Thermomyces)和毛霉属(Mucor)物种。此外，里氏木霉可以作为宿主生物使用。用于转化曲霉属宿主细胞的合适方法包括例如在EP 238023中描述的方法。

在又一方面，提供了产生AmyDSM90相关多肽的方法，该方法包括在利于该酶产生的条件下培养如上文所述的宿主细胞并从细胞和/或培养基回收该酶。

用来培育细胞的培养基可以是适于培育所讨论的宿主细胞并且获得AmyDSM90相关多肽表达的任何常规培养基。合适的培养基和培养基组分是从商业供应商可获得的或可以根据公开的配方(例如，如美国典型培养物保藏中心的目录中所描述)制备。

在一个方面，从宿主细胞分泌的酶在完全培养液制备物中使用。在本发明的方法中，使用本领域已知的导致α-淀粉酶表达的任何培养方法，可以实现重组微生物已用过的完全发酵液的制备。因此，发酵可以理解为包括在实验室或工业发酵罐中在合适介质中并且在允许淀粉酶表达或分离的条件下进行的摇瓶培养、小规模或大规模发酵(包括连续、分批、补料-分批或固态发酵)。术语“已用过的完全发酵液(spent whole fermentationbroth)”在本文中定义为包括培养基、胞外蛋白(例如，酶)和细胞生物量的发酵物质的未分级内容物。应当理解术语“已用过的完全发酵液”也包括已经使用本领域熟知的方法予以裂解或透化的细胞生物量。

从宿主细胞分泌的酶可以便利地通过熟知方法从培养基中回收，所述的熟知方法包括通过离心或过滤从培养基中分离细胞，和借助盐(如硫酸铵)沉淀蛋白质性组分，随后是使用层析方法如离子交换层析、亲和层析等。

一个方面构思了载体中的多核苷酸与能够通过宿主细胞引起编码序列表达的调控序列有效连接，即该载体是表达载体。调控序列可以被修饰，例如通过添加其他转录调节元件以使由该调控序列指导的转录的水平更加应答于转录调节物。调控序列特别地可以包含启动子。

宿主细胞可在允许AmyDSM90相关多肽表达的合适条件下培养。所述酶的表达可以是组成型的，从而它们持续地产生，或者是诱导型的，需要刺激物以启动表达。在诱导型表达的情况下，当需要时，可以例如通过添加诱导物质如***、IPTG或Sopharose至培养基，启动蛋白质产生。多肽也可以在体外无细胞体系(例如TNT^TM(Promega)兔网织红细胞***)中重组地产生。

表达AmyDSM90相关多肽的宿主也可以在对宿主适宜的培养基中，在好氧条件下培养。可以提供振摇或者提供搅拌和通气的组合，同时生产在对宿主合适的温度(如从约25℃到约75℃(例如，30℃至45℃))进行，这取决于宿主和产生所需α-淀粉酶变体的需要。培养可以进行约12小时至约100小时或更长(和二者之间的任何小时值，例如从24小时至72小时。一般地，培养液的pH在约5.5至约8.0，这再次取决于宿主细胞产生AmyDSM90相关多肽所需要的培养条件。

3.2用于蛋白质纯化的材料和方法

发酵、分离和浓缩技术是本领域熟知的，并且可以使用常规的方法来制备含有浓缩AmyDSM90相关多肽的溶液。

发酵后，获得发酵液，通过常规分离技术除去微生物细胞以及各种悬浮的固体(包括残留的发酵原料)，旨在获得淀粉酶溶液。通常使用过滤、离心、微滤、旋转真空筒式过滤(rotary vacuum drum filtration)超滤、离心后超滤、提取或层析等。

期望浓缩含有AmyDSM90相关多肽的溶液以优化回收。非浓缩溶液的使用要求孵育时间增加，以收集纯化的酶沉淀物。

使用常规浓缩技术浓缩含酶溶液，直到获得想要的酶水平。含酶溶液的浓缩可以通过本文中讨论的任意技术实现。纯化的示例性方法包括但是不限于旋转真空过滤法和/或超滤法。

将酶溶液浓缩成浓缩的酶溶液，直至含有浓缩的AmyDSM90相关多肽的溶液的酶活性处于想要的水平。

浓缩可以使用例如沉淀剂如金属卤化物沉淀剂进行。金属卤化物沉淀剂包括但不限于碱金属氯化物、碱金属溴化物和这些金属卤化物中两种或更多种的掺合物。示例性金属卤化物包括氯化钠、氯化钾、溴化钠、溴化钾和这些金属卤化物中两种或更多种的掺合物。金属卤化物沉淀剂氯化钠也可以作为防腐剂使用，

金属卤化物沉淀剂以有效沉淀AmyDSM90相关多肽的量使用。在常规试验后，选择金属卤化物的有效引起该酶沉淀的至少有效量和最佳量，以及用于最大回收的沉淀条件(包括孵育时间、pH、温度和酶浓度等)对一名本领域普通技术人员而言会是轻易显而易见的。

一般来说，将至少约5％w/v(重量/体积)至约25％w/v的金属卤化物添加至浓缩的酶溶液，并且通常是至少8％w/v的金属卤化物。一般来说，将不多于约25％w/v的金属卤化物添加至浓缩的酶溶液，并且通常是不多于约20％w/v的金属卤化物。金属卤化物沉淀剂的最佳浓度尤其取决于特定AmyDSM90相关多肽的性质并且取决于其在浓缩酶溶液中的浓度。

实现酶沉淀的另一个备选方案是使用有机化合物。示例性有机化合物沉淀剂包括4-羟基苯甲酸、4-羟基苯甲酸的碱金属盐、4-羟基苯甲酸的烷基酯和这些有机化合物中两种或更多种的掺合物。所述的有机化合物沉淀剂的添加可以在添加金属卤化物沉淀剂之前、同时或之后进行，并且这两种沉淀剂(有机化合物和金属卤化物)的添加可以依次或同时实施。

一般来说，有机沉淀剂从由4-羟基苯甲酸的碱金属盐(如钠盐或钾盐)和直链或支链烷基4-羟基苯甲酸酯(其中烷基含有1至12个碳原子)及这些有机化合物中两种或更多种的掺合物组成的组中选择。有机化合物沉淀剂可以是例如直链或支链烷基4-羟基苯甲酸酯，其中烷基含有1至10个碳原子，和这些有机化合物中两种或更多种的掺合物。示例性有机化合物是4-羟基苯甲酸的直链烷基酯，其中烷基含有1至6个碳原子，和这些有机化合物中两种或更多种的掺合物。也可以使用4-羟基苯甲酸的甲基酯、4-羟基苯甲酸的丙基酯、4-羟基苯甲酸的丁基酯、4-羟基苯甲酸的乙基酯和这些有机化合物中两种或更多种的掺合物。额外的有机化合物也包括但不限于4-羟基苯甲酸甲酯(名称为尼泊金甲酯)、4-羟基苯甲酸丙酯(名称为尼泊金丙酯)，二者也均是淀粉酶防腐剂。对于进一步的描述，见例如，美国专利号5,281,526。

有机化合物沉淀剂的添加提供了沉淀条件在pH、温度、AmyDSM90相关多肽浓度、沉淀剂浓度和温育时间方面高度灵活性的优势。

有机化合物沉淀剂以通过金属卤化物沉淀剂有效改善酶沉淀作用的量使用。在常规试验后，在本公开的教导下，选择有机化合物沉淀剂的至少有效量和最佳量以及用于最大回收的沉淀条件(包括孵育时间、pH、温度和酶浓度等)对一名本领域普通技术人员而言会是轻易显而易见的。

一般来说，将至少约0.01％w/v的有机化合物沉淀剂添加至浓缩的酶溶液，并且通常是至少约0.02％w/v的有机化合物沉淀剂。一般来说，将不多于约0.3％w/v的有机化合物沉淀剂添加至浓缩的酶溶液，并且通常是不多于约0.2％w/v的有机化合物沉淀剂。

可以将含有金属卤化物沉淀剂和有机化合物沉淀剂的浓缩的AmyDSM90相关多肽溶液调节至必然会依赖于待纯化酶的pH。通常，将pH调节到该淀粉酶等电点附近的水平。例如，可以在低于等电点(pI)约2.5pH单位直至高于等电点约2.5pH单位的范围内调节pH。

获得纯化的酶沉淀物所需的孵育时间依赖于具体酶的性质、酶浓度、具体沉淀剂及其(它们的)浓度。通常，有效沉淀该酶的时间是在约1小时至约30小时之间；通常，它不超过约25小时。在有机化合物沉淀剂存在的情况下，孵育时间仍可以减少到少于约10小时，并且大多数情况下甚至少于约6个小时。

通常，孵育期间的温度是在约4℃与约50℃之间。通常，该方法在约10℃与约45℃之间(例如，在约20℃与约40℃之间)实施。用于诱导沉淀的最佳温度根据溶液条件和酶或所用的沉淀剂变化。

通过搅拌包含酶、所添加的金属卤化物和所添加的有机化合物的溶液，改善纯化的酶沉淀物的总回收率和实施该方法的效率。搅拌步骤在添加金属卤化物和有机化合物期间和在后续孵育时间期间均进行。合适的搅拌方法包括机械搅动或振摇、剧烈通气或任何的相似技术。

在孵育期后，将纯化的酶随后与解离的色素和其他杂质分离，并且通过常规分离技术(如过滤、离心、微滤、旋转真空过滤、超滤、加压过滤、跨膜微滤、交叉流动膜微滤等)收集。纯化的酶沉淀物的进一步纯化可以通过用水洗涤沉淀物获得。例如，纯化的酶沉淀物用含有金属卤化物沉淀剂的水或用含有金属卤化物和有机化合物沉淀剂的水洗涤。

在发酵期间，AmyDSM90相关多肽积累于培养液中。为分离和纯化想要的AmyDSM90相关多肽，将培养液离心或过滤以消除细胞，并且所得的无细胞液体用于酶纯化。在一个实施方案中，无细胞的培养液用饱和度约70％的硫酸铵进行盐析；70％饱和沉淀的级分随后溶解于缓冲液中并且施加至柱子例如Sephadex G-100柱上并且洗脱以回收有酶活性的级分。为进一步纯化，可以使用常规方法，如离子交换层析法等。

纯化的酶用于衣物和清洁应用中。例如，它们可以用于衣物洗涤剂和污点去除剂中。它们可以制成作为液体(溶液和浆液)或固体(颗粒和粉末)的终产品。

纯化的更具体实例在J.Sumitani等人，“新型淀粉结合结构域：芽孢杆菌属物种第195号α-淀粉酶C端区域中的直接重复基序对淀粉结合和粗淀粉降解有贡献(New type of starch-binding domain：the direct repeat motifin the C-terminal region of Bacillus sp.no.195α-amylase contributes tostarch binding and raw starch degrading)”，Biochem.J.350：477-484(2000)中描述并且在此简要总结。从4升变铅青链霉菌TK24培养上清液获得的酶用80％饱和度的(NH₄)₂SO₄处理。沉淀通过10,000x g(20分钟和4℃)离心回收并且重新溶解于含有5mM CaCl₂的20mM Tris/HCl缓冲液(pH 7.0)中。溶解的沉淀随后对相同的缓冲液透析。随后将透析的样品施加至Sephacryl S-200柱，该柱事先已经用20mM Tris/HCl缓冲液(pH 7.0)、5mM CaCl₂平衡并且用相同的缓冲液以线性流速7mL/小时洗脱。收集来自该柱的级分并且如通过酶测定法和SDS-PAGE那样评估其活性。该蛋白质如下进一步纯化。Toyopearl HW55柱(Tosoh Bioscience，Montgomeryville，PA；目录号19812)用含有5mM CaCl₂和1.5M(NH₄)₂SO₄的20mMTris/HCl缓冲液(pH 7.0)平衡。该酶用在含有5mM CaCl₂的20mMTris/HCL缓冲液，pH 7.0中的1.5至0M(NH₄)₂SO₄线性梯度洗脱。收集活性级分并且用80％饱和度的(NH₄)₂SO₄沉淀该酶。将沉淀物回收、重新溶解并且如上文所述透析。随后将透析的样品施加至Mono Q HR5/5柱(Amersham Pharmacia；目录号17-5167-01)，该柱事先用含有5mM CaCl₂的20mM Tris/HCl缓冲液(pH 7.0)以流速60mL/小时平衡。收集活性级分并且添加至1.5M(NH₄)₂SO₄。活性酶级分在Toyopearl HW55柱上如前再层析，以产生如SDS-PAGE所确定的均相酶。对于该方法和其变型的总体讨论，见J.Sumitani等人，“新型淀粉结合结构域：芽孢杆菌属物种第195号α-淀粉酶C端区域中的直接重复基序对淀粉结合和粗淀粉降解有贡献(New type of starch-binding domain：the direct repeat motif in theC-terminal region of Bacillus sp.no.195α-amylase contributes to starchbinding and raw starch degrading)”，Biochem.J.350：477-484(2000)。

对于生产规模的回收，AmyDSM90相关多肽可以通过用聚合物絮凝除去细胞如上文总体所述那样部分地纯化。备选地，使用可获得的膜及设备，该酶可以通过微滤纯化，随后通过超滤浓缩。然而，对于一些应用，无需纯化该酶，并且可以裂解和使用完全培养液培养物，无需进一步处理。酶可以随后加工，例如加工成颗粒。

4.清洁组合物

本发明组合物和方法的一个方面是包括AmyDSM90相关多肽作为组分的清洁组合物。AmyDSM90相关多肽可以作为组分在用于手洗涤、衣物洗涤、餐具洗涤和其他硬质表面清洁的洗涤剂组合物中使用。优选地，将AmyDSM90相关多肽以淀粉酶在洗涤剂中常规使用的浓度或接近该浓度掺入洗涤剂中。例如，AmyDSM90相关多肽可以按对应于每升洗涤/餐具洗涤液0.00001-1mg(计算为纯酶蛋白)α-淀粉酶的量添加。这里提供示例性制剂，如以下所例举：

4.1衣物洗涤剂组合物

作为仅有的酶或与其他酶(包括其他淀粉分解酶)一起，AmyDSM90相关多肽可以典型地是洗涤剂组合物的组分。像这样，它可以以非粉化颗粒、稳定化液体或受保护酶的形式包含在洗涤剂组合物中。非粉化颗粒剂例如可以如美国专利号4,106,991和4,661,452中所公开那样产生并且可以任选地通过本领域已知的方法包衣。蜡质包衣材料的实例是平均摩尔重量1,000至20,000的聚(环氧乙烷)产物(聚乙二醇，PEG)；具有16至50个环氧乙烷单位的乙氧基化壬基苯酚；其中醇含有12至20个碳原子并且其中存在15至80个环氧乙烷单位的乙氧基化脂肪醇；脂肪醇；脂肪酸；和脂肪酸单酰甘油和二酰甘油和三酰甘油。适用于流化床技术的成膜包衣材料的实例在英国专利号1483591中给出。液体酶制品可以根据建立的方法，例如通过添加多元醇如丙二醇、糖或糖醇、乳酸或硼酸稳定化。其他酶稳定剂是本领域已知的。可以根据例如EP 238,216中公开的方法制备受保护的酶。多元醇长久以来被视为蛋白质稳定剂，以及改善蛋白质溶解性。见J.K.Kaushik等人，“Why is trehalose an exceptional protein stabilizer？(为何海藻糖是出乎意料的蛋白质稳定剂？)”J.Biol.Chem.278：26458-65(2003)和其中引用的参考文献；和Monica.Conti等人，“Capillary isoelectricfocusing：the problem of protein solubility(毛细管等点聚焦作用：蛋白质溶解度的问题)，”J.Chromatography A757：237-245(1997)。

洗涤剂组合物可以处于任何有用形式，例如，作为粉剂、颗粒剂、糊剂或液体剂。液体洗涤剂可以是水性的，一般含有直至约70％的水和0至约30％有机溶剂。它也可以处于仅含有约30％水的致密凝胶类型的形式。

洗涤剂组合物包含一种或多种表面活性剂，所述每种表面活性剂可以是阴离子的、非离子的、阳离子的或兼性离子的。洗涤剂通常会含有0％至约50％阴离子表面活性剂，如线性烷基苯磺酸盐(LAS)；α-烯属磺酸酯(AOS)；烷基硫酸盐(脂肪醇硫酸盐)(AS)；醇乙氧基化硫酸盐(AEOS或AES)；仲烷基磺酸盐(SAS)；α-磺基脂肪酸甲酯；烷基或链烯基丁二酸；或皂。该组合物可含有0％至约40％非离子表面活性剂，如醇乙氧基化物(AEO或AE)、羧化醇乙氧基化物、壬基酚乙氧基化物、烷基多苷(alkylpolyglycoside)、烷基二甲基氧化胺(alkyldimethylamineoxide)、乙氧基化脂肪酸单乙醇酰胺、脂肪酸单乙醇酰胺或多羟基烷基脂肪酸酰胺(例如WO 92/06154中所描述)。

洗涤剂组合物可以额外包含一种或多种处于任意组合的其他酶，如脂肪酶、另一种淀粉分解酶、角质酶、蛋白酶、纤维素酶、过氧化物酶和/或漆酶。

洗涤剂可以含有约1％至约65％的洗涤剂助洗剂或络合剂，如沸石、二磷酸盐、三磷酸盐、膦酸盐、柠檬酸盐、次氮基三乙酸(NTA)、乙二胺四乙酸(EDTA)、二乙三胺五乙酸(DTMPA)、烷基或烯基丁二酸、可溶性硅酸盐或层状硅酸盐(例如，来自Hoechst的SKS-6)。洗涤剂也可以是非助洗的，即基本上不含洗涤剂助洗剂。酶可以在与酶稳定性相容的任意组合物中使用。通常可以通过已知的封装形式，例如通过粒化或水凝胶中隔离，来保护酶免遭有害组分影响。带有或不带有淀粉结合结构域的酶，并且特别地α-淀粉酶，如AmyDSM90分子，可以在包括衣物和餐具洗涤应用的多种组合物、表面清洁剂以及在从淀粉或生物量产生乙醇的组合物中使用。

洗涤剂可以包含一种或多种聚合物。实例包括羧甲基纤维素(CMC)、聚乙烯吡咯烷酮(PVP)、聚乙二醇(PEG)、聚(乙烯醇)(PVA)和聚羧酸酯，如聚丙烯酸酯、马来酸/丙烯酸共聚物和甲基丙烯酸十二烷基酯/丙烯酸共聚物。

洗涤剂可以含有漂白***，所述漂白***可以包含H₂O₂源，如过硼酸盐或过碳酸盐，其可以与形成过酸的漂白活化剂如四乙酰乙二胺(TAED)或壬酰氧基苯磺酸盐(NOBS)组合。备选地，该漂白***可以包含过氧酸(例如酰胺、酰亚胺或砜类型过氧酸)。该漂白***也可以是酶漂白***，例如，过水解酶，如国际PCT申请WO2005/056783中所述的那种过水解酶。

洗涤剂组合物的酶可以利用常规稳定剂稳定，例如多元醇，如丙二醇或甘油；糖或糖醇；乳酸；硼酸或硼酸衍生物，例如芳香硼酸酯；并且组合物可以如WO 92/19709和WO 92/19708中所述那样配制。

洗涤剂也可以含有其他常规洗涤剂成分，例如织物柔顺剂，包括粘土，起泡剂，抑泡剂、抗腐蚀剂、污物悬浮剂、抗污渍再沉积剂、染料、杀菌剂、晦暗抑制剂、荧光增白剂或香料。

pH(以使用浓度在水溶液中测量)通常是中性或碱性的，例如约7.0至约11.0的pH。

可以配制包含AmyDSM90相关多肽的洗涤剂组合物的具体形式以包括：

(1)洗涤剂组合物，其配制为具有至少600g/L堆积密度的颗粒剂，包含约7％至约12％的线性烷基苯磺酸盐(计算为酸)；约1％至约4％的醇乙氧基硫酸盐(例如，C_12-18醇，1-2环氧乙烷(EO))或烷基硫酸盐(例如，C_16-18)；约5％至约9％的醇乙氧基化物(例如，C_14-15醇，7EO)；约14至约20％的碳酸钠(例如，Na₂CO₃)；约2％至约6％的可溶性硅酸盐(例如，Na₂O，2SiO₂)；约15％至约22％的沸石(例如，NaAlSiO₄)；0％至约6％的硫酸钠(例如，Na₂SO₄)；约0％至约15％的柠檬酸钠/柠檬酸(如C₆H₅Na₃O₇/C₆H₈O₇)；约11％至约18％的过硼酸钠(例如，NaBO₃H₂O)；约2％至约6％的TAED；0％至约2％的羧甲基纤维素(CMC)；0-3％的聚合物(如马来酸/丙烯酸共聚物，PVP，PEG)；0.0001-0.1％蛋白质的酶(计算为纯酶)；和0％至约5％的次要成分(如抑泡剂、香料、明亮剂、光学漂白剂)。

(2)洗涤剂组合物，其配制为具有至少600g/L堆积密度的颗粒剂，包含约6％到约11％的线性烷基苯磺酸盐(计算为酸)；约1％至约3％的醇乙氧基硫酸盐(例如，C_12-18醇，1-2EO)或烷基硫酸盐(例如，C_16-18)；约5％至约9％的醇乙氧基化物(例如，C_14-15醇，7EO)；约15％至约21％的碳酸钠(例如，Na₂CO₃)；约1％至约4％的可溶性硅酸盐(例如，Na₂O，2SiO₂)；约24％至约34％的沸石(例如，NaAlSiO₄)；4％至约10％的硫酸钠(例如，Na₂SO₄)；0％至约15％的柠檬酸钠/柠檬酸(如C₆H₅Na₃O₇/C₆H₈O₇)；0％至约2％的羧甲基纤维素(CMC)；1-6％的聚合物(如马来酸/丙烯酸共聚物、PVP、PEG)；0.0001-0.1％的酶(计算为纯酶蛋白)；0-5％的次要成分(如抑泡剂、香料)。

(3)洗涤剂组合物，其配制为具有至少600g/L堆积密度的颗粒剂，包含约5％至约9％的线性烷基苯磺酸盐(计算为酸)；约7％至约14％的醇乙氧基化物(例如，C_12-15醇，7EO)；约1至约3％的作为脂肪酸的皂；约10％至约17％的碳酸钠(作为Na₂CO₃)；约3％至约9％的可溶性硅酸盐(例如，Na₂O，2SiO₂)；约23％至约33％的沸石(作为NaA1SiO₄)；0％至约4％的硫酸钠(例如，Na₂SO₄)；约8％至约16％的过硼酸钠(例如，NaBO₃H₂O)；约2％至约8％的TAED；0％至约1％的膦酸盐(例如，EDTMPA)；0％至约2％的羧甲基纤维素(CMC)；0-3％的聚合物(例如，马来酸/丙烯酸共聚物、PVP、PEG)；0.0001-0.1％的酶(计算为纯酶蛋白)；0-5％的次要成分(例如，抑泡剂、香料、荧光增白剂)。

4)洗涤剂组合物，其配制为具有至少600g/L堆积密度的颗粒剂，包含约8％至约12％的线性烷基苯磺酸盐(计算为酸)；约10％至约25％的醇乙氧基化物(例如，C_12-15醇，7EO)；约14％至约22％的碳酸钠(作为Na₂CO₃)；约1％至约5％的可溶性硅酸盐(例如，Na₂O、2SiO₂)；约25％至约35％的沸石(例如，NaA1SiO₄)；0％至约10％的硫酸钠(例如，Na₂SO₄)；0％至约2％的羧甲基纤维素(CMC)；1-3％的聚合物(例如，马来酸/丙烯酸共聚物、PVP、PEG)；0.0001-0.1％的酶(计算为纯酶蛋白)；和0-5％的次要成分(例如，抑泡剂、香料)。

水性液体洗涤剂组合物，包含约15％至约21％的线性烷基苯磺酸盐(计算为酸)；约12％至约18％的醇乙氧基化物(例如，C_12-15醇，7EO或C_12-15醇，5EO)；约3％至约13％的作为脂肪酸的皂(例如，油酸)；0％至约13％的烯基丁二酸(C_12-14)；约8％至约18％的氨基乙醇；约2％至约8％的柠檬酸；0％至约3％的膦酸盐；0％至约3％的聚合物(例如，PVP、PEG)；0％至约2％的硼酸盐(例如，B₄O₇)；0％至约3％的乙醇；约8％至约14％的丙二醇；0.0001-0.1％的酶(计算为纯酶蛋白)；和0-5％的次要成分(例如，分散剂、抑泡剂、香料、荧光增白剂)。

水性结构的液体洗涤剂组合物，包含约15％至约21％的线性烷基苯磺酸盐(计算为酸)；3-9％的醇乙氧基化物(例如，C_12-15醇，7EO或C_12-15醇，5EO)；约3％至约10％的作为脂肪酸的皂(例如，油酸)；约14％至约22％的沸石(作为NaA1SiO₄)；约9％至约18％的柠檬酸钾；0％至约2％的硼酸盐(例如，B₄O₇)；0％至约2％的羧甲基纤维素(CMC)；0％至约3％的聚合物(例如，PEG，PVP)；0％至约3％的锚定聚合物，例如，甲基丙烯酸十二烷基酯/丙烯酸共聚物；摩尔比25∶1，MW 3800)；0％至约5％的甘油；0.0001-0.1％的酶(计算为纯酶蛋白)；和0-5％的次要成分(例如，分散剂、抑泡剂、香料、荧光增白剂)。

7)洗涤剂组合物，其配制为具有至少600g/L堆积密度的颗粒剂，包含约5％至约10％的脂肪醇硫酸盐；约3％至约9％的乙氧基化脂肪酸单乙醇酰胺；0-3％的作为脂肪酸的皂；约5％至约10％的碳酸钠(例如，Na₂CO₃)；约1％至约4％的可溶性硅酸盐(例如，Na₂O，2SiO₂)；约20％至约40％的沸石(例如，NaA1SiO₄)；约2％至约8％的硫酸钠(例如，Na₂SO₄)；约12％至约18％的过硼酸钠(例如，NaBO₃H₂O)；约2％至约7％的TAED；约1％至约5％的聚合物(例如，马来酸/丙烯酸共聚物、PEG)；0.0001-0.1％的酶(计算为纯酶蛋白)；和0-5％的次要成分(例如，荧光增白剂、抑泡剂、香料)。

8)洗涤剂组合物，其配制为颗粒剂，包含约8％至约14％的线性烷基苯磺酸盐(计算为酸)；约5％至约11％的乙氧基化脂肪酸单乙醇酰胺；0％至约3％的作为脂肪酸的皂；约4％至约10％的碳酸钠(例如，Na₂CO₃)；约1％至约4％的可溶性硅酸盐(Na₂O，2SiO₂)；约30％至约50％的沸石(例如，NaA1SiO₄)；约3％至约11％的硫酸钠(例如，Na₂SO₄)；约5％至约12％的柠檬酸钠(例如，C₆H₅Na₃O₇)；约1％至约5％的聚合物(例如，PVP、马来酸/丙烯酸共聚物、PEG)；0.0001-0.1％的酶(计算为纯酶蛋白)；和0-5％的次要成分(例如，抑泡剂、香料)。

9)洗涤剂组合物，其配制为颗粒剂，包含约6％至约12％的线性烷基苯磺酸盐(计算为酸)；约1％至约4％的非离子表面活性剂；约2％至约6％的作为脂肪酸的皂；约14％至约22％的碳酸钠(例如，Na₂CO₃)；约18％至约32％的沸石(例如，NaA1SiO₄)；约5％至约20％的硫酸钠(例如，Na₂SO₄)；约3％至约8％的柠檬酸钠(例如，C₆H₅Na₃O₇)；约4％至约9％的过硼酸钠(例如，NaBO₃H₂O)；约1％至约5％的漂白活化剂(例如，NOBS或TAED)；0％至约2％的羧甲基纤维素(CMC)；约1％至约5％的聚合物(例如，聚羧酸酯或PEG)；0.0001-0.1％的酶(计算为纯酶蛋白)；和0-5％的次要成分(例如，荧光增白剂，香料)。

10)水性液体洗涤剂组合物，包含约15％至约23％的线性烷基苯磺酸盐(计算为酸)；约8％至约15％的醇乙氧基化硫酸盐(例如，C_12-15醇，2-3EO)；约3％至约9％的醇乙氧基化物(例如，C_12-15醇，7EO，或C_12-15醇，5EO)；0％至约3％的作为脂肪酸的皂(例如，月桂酸)；约1％至约5％的氨基乙醇；约5％至约10％的柠檬酸钠；约2％至约6％的水溶助长剂(例如，甲苯磺酸钠)；0％至约2％的硼酸盐(例如，B₄O₇)；0％至约1％的羧甲基纤维素；约1％至约3％的乙醇；约2％至约5％的丙二醇；0.0001-0.1％的酶(计算为纯酶蛋白)；和0-5％的次要成分(例如，聚合物、分散剂、香料、荧光增白剂)。

11)水性液体洗涤剂组合物，包含约20％至约32％的线性烷基苯磺酸盐(计算为酸)；6-12％的醇乙氧基化物(例如，C_12-15醇，7EO，或C_12-15醇，5EO)；约2％至约6％的氢基乙醇；约8％至约14％的柠檬酸；约1％至约3％的硼酸盐(例如，B₄O₇)；0％至约3％的聚合物(例如，马来酸/丙烯酸共聚物、锚定聚合物，例如，甲基丙烯酸十二烷基酯/丙烯酸共聚物)；约3％至约8％的甘油；0.0001-0.1％的酶(计算为纯酶蛋白)；和0-5％的次要成分(例如，水溶助长剂、分散剂、香料、荧光增白剂)。

12)洗涤剂组合物，其配制为具有至少600g/L堆积密度的颗粒剂，包含约25％至约40％的阴离子表面活性剂(线性烷基苯磺酸盐、烷基硫酸盐、α-烯属磺酸盐、α-磺基脂肪酸甲酯、烷基磺酸盐、皂)；约1％至约10％的非离子表面活性剂(例如，醇乙氧基化物)；约8％至约25％的碳酸钠(例如，Na₂CO₃)；约5％至约15％的可溶性硅酸盐(例如，Na₂O，2SiO₂)；0％至约5％的硫酸钠(例如，Na₂SO₄)；约15％至约28％的沸石(NaA1SiO₄)；0％至约20％的过硼酸钠(例如，NaBO₃·4H₂O)；约0％至约5％的漂白活化剂(TAED或NOBS)；0.0001-0.1％的酶(计算为纯酶蛋白)；0-3％的次要成分(例如，香料、荧光增白剂)。

13)洗涤剂组合物，其是如以上组合物1)-12)中所述的组合物，其中全部或部分的线性烷基苯磺酸盐被(C₁₂-C₁₈)烷基硫酸盐替换。

14)洗涤剂组合物，其配制为具有至少600g/L堆积密度的颗粒剂，包含约9％至约15％的(C₁₂-C₁₈)烷基硫酸盐；约3％至约6％的醇乙氧基化物；约1％至约5％的多羟基烷基脂肪酸酰胺；约10％至约20％的沸石(例如，NaA1SiO₄)；约10％至约20％的层状二硅酸盐(例如，来自Hoechst的SK56)；约3％至约12％的碳酸钠(例如，Na₂CO₃)；0％至约6％的可溶性硅酸盐(例如，Na₂O，2SiO₂)；约4％至约8％的柠檬酸钠；约13％至约22％的过硼酸钠；约3％至约8％的TAED；0％至约5％的聚合物(例如，聚羧酸酯和PVP)；0.0001-0.1％的酶(计算为纯酶蛋白)；和0-5％的次要成分(例如，荧光增白剂、光致漂白剂、香料、抑泡剂)。

15)洗涤剂组合物，其配制为具有至少600g/L堆积密度的颗粒剂，包含约4％至约8％的(C₁₂-C₁₈)烷基硫酸盐；约11％至约15％的醇乙氧基化物；约1％至约4％的皂；约35％至约45％的沸石MAP或沸石A；约2％至约8％的碳酸钠(作为Na₂CO₃)；0％至约4％的可溶性硅酸盐(例如，Na₂O，2SiO₂)；约13％至约22％的过硼酸钠；1-8％的TAED；0％至约3％的羧甲基纤维素(CMC)；0％至约3％的聚合物(例如，聚羧酸酯和PVP)；0.0001-0.1％的酶(计算为纯酶蛋白)；和0-3％的次要成分(例如，荧光增白剂、膦酸盐、香料)。

16)如以上1)-15)中所述的洗涤剂制剂，其含有稳定的或封装的过酸作为额外组分或者作为已指定漂白***的替代物。

17)如上文1)、3)、7)、9)和12)中所述的洗涤组合物，其中过硼酸盐被过碳酸盐替换。

18)如上文1)、3)、7)、9)、12)、14)和15)中所述的洗涤组合物，其额外地含有锰催化剂。这种锰催化剂例如是“用于低温漂白的高效锰催化剂(Efficient manganese catalysts for low-temperature bleaching)”，Nature369：637-39(1994)中所述的化合物之一。

19)配制为非水性洗涤剂液体的洗涤剂组合物，包含液态非离子表面活性剂(例如，线性烷氧基化伯醇)、助洗剂***(例如，磷酸盐)、酶和碱。该洗涤剂也可以包含阴离子表面活性剂和/或漂白***。

AmyDSM90相关多肽可以按洗涤剂中常规使用的浓度并入洗涤剂中。目前构思在洗涤剂组合物中，该酶可以按照与每升洗涤液0.00001-1.0mg(计算为纯酶蛋白)AmyDSM90相关多肽相对应的量添加。

在另一个实施方案中，其他酶，如2，6-β-D-果聚糖水解酶，可以并入包含AmyDSM90相关多肽的洗涤剂组合物，并且用于除去/清洁存在于家居和/或工业织物/衣物上的生物膜。

洗涤剂组合物可以例如配制为手工(手动)或机器(自动)衣物洗涤剂组合物，包括适用于预处理玷污织物的洗衣添加性组合物和漂洗添加的织物柔顺剂组合物，或配制为用于通常家居硬质表面清洁操作的洗涤剂组合物或配制用于手动或自动餐具洗涤操作。

在一个具体的方面，除AmyDSM90相关多肽外，洗涤剂组合物还可以包含2，6-β-D-果聚糖水解酶和一种或多种其他清洁用酶，例如蛋白酶、脂肪酶、角质酶、糖酶、纤维素酶、果胶酶、甘露聚糖酶、***糖酶、半乳聚糖酶、另一种淀粉裂解酶、木聚糖酶、氧化酶、漆酶和/或过氧化物酶和/或其组合。

通常，所选酶的特性应当与选择的洗涤剂(例如，最佳pH，与其他酶成分和非酶成分的相容性等)相容，并且所述酶应当以有效量存在。

蛋白酶：合适的蛋白酶包括动物、植物或微生物来源的那些蛋白酶。包括化学修饰或蛋白质工程化的突变体，以及天然加工的蛋白质。蛋白酶可以是丝氨酸蛋白酶或金属蛋白酶，如碱性微生物蛋白酶、胰蛋白酶样蛋白酶或胰凝乳蛋白酶样蛋白酶。碱性蛋白酶的实例是枯草蛋白酶，尤其从芽孢杆菌衍生的那些枯草蛋白酶，例如枯草蛋白酶Novo、枯草蛋白酶Carlsberg、枯草蛋白酶309、枯草蛋白酶147和枯草蛋白酶168(见，例如WO 89/06279)。胰蛋白酶样蛋白酶的实例是(例如猪或牛来源的)胰蛋白酶和镰刀菌蛋白酶(见，例如WO 89/06270与WO 94/25583)。有用蛋白酶的实例也包括但不限于在WO 92/19729、WO 98/20115、WO 98/20116和WO 98/34946中描述的变体。市售的蛋白酶包括但不限于：

PRIMASE^TM、DURALASE^TM、和KANNASE^TM(Novo Nordisk A/S)；MAXACAL^TM、MAXAPEM^TM、PURAFECT OXP^TM、FN2^TM和FN3^TM(Genencor International，Inc.)。

脂肪酶：合适的脂肪酶包括细菌或真菌来源的那些脂肪酶。包括化学修饰、蛋白酶解修饰或蛋白质工程化的突变体。有用脂肪酶的实例包括，但不限来自腐质霉属(Humicola)(同义词：嗜热真菌(Thermomyces))的脂肪酶，例如，来自柔毛腐质霉(H.lanuginosa)(T.lanuginosus)(见，例如，EP258068和EP 305216)和H.insolens(见，例如，WO 96/13580)；假单胞菌脂肪酶(例如，来自产碱假单胞菌(P.alcaligenes)或类产碱假单胞菌(P.pseudoalcaligenes)，见，例如，欧洲专利号218272)、洋葱假单胞菌(P.cepacia)(见，例如，欧洲专利号331376)、施氏假单胞菌(P.stutzeri)(见，例如，GB 1,372,034)、荧光假单胞菌(P.fluorescens)、假单胞菌属菌株SD705(见，例如，WO 95/06720和WO 96/27002)、威斯康星假单胞菌(P.wisconsinensis)(见，例如，WO 96/12012)；芽孢杆菌脂肪酶(例如，来自枯草芽孢杆菌；见，例如，Dartois等人，Biochemica et Biophysica Acta，1131：253-360(1993))、嗜热脂肪芽孢杆菌(见，例如，JP 64/744992)或短小芽孢杆菌(见，例如，WO 91/16422)。构思用于制剂中的额外脂肪酶变体包括例如在WO 92/05249、WO 94/01541、WO 95/35381、WO 96/00292、WO95/30744、WO 94/25578、WO 95/14783、WO 95/22615、WO 97/04079、WO 97/07202、EP 407225和EP 260105中描述的那些脂肪酶变体。一些市售的脂肪酶包括

和LIPOLASE ULTRA^TM(Novo NordiskA/S)。

聚酯酶：可以在组合物中包含合适的聚酯酶，如在例如WO 01/34899和WO 01/14629中所述的那些聚酯酶。

淀粉酶：组合物可以与其他淀粉酶(例如非生产增强的α-淀粉酶)组合。这些淀粉酶包括市售的淀粉酶，如但不限于

和BAN^TM(Novo Nordisk A/S)；

和

(来自Genencor International、Inc.)。

纤维素酶：纤维素酶可以添加至组合物。合适的纤维素酶包括细菌或真菌来源的那些纤维素酶。包括化学修饰的或蛋白质工程化的突变体。合适的纤维素酶包括来自芽孢杆菌属、假单胞菌属、腐质霉属、镰刀菌属、草根霉属(Thielavia)、枝顶孢霉属(Acremonium)的纤维素酶，例如美国专利号4,435,307；5,648,263；5,691,178；5,776,757；和WO 89/09259中公开的从Humicola insolens、嗜热毁丝霉(Myceliophthora thermophila)和尖孢镰刀菌(Fusarium oxysporum)产生的真菌纤维素酶。构思使用的示例性纤维素酶是对织物具有颜色护理益处的那些纤维素酶。此类纤维素酶的实例是在例如EP 0495257、EP 0531372、WO 96/11262、WO 96/29397和WO98/08940中描述的纤维素酶。其他的实例是纤维素酶变体，如在WO94/07998；WO 98/12307；WO 95/24471；PCT/DK98/00299；EP 531315；美国专利号5,457,046；5,686,593；和5,763,254中描述的那些纤维素酶变体。市售的纤维素酶包括

和

(Novo NordiskA/S)；

和

(Genencor International，Inc.)；和KAC-500(B)^TM(Kao Corporation)。

过氧物酶/氧化酶：构思用于组合物中的合适过氧物酶/氧化酶包括植物、细菌或真菌来源的那些过氧物酶/氧化酶。包括化学修饰的或蛋白质工程化的突变体。有用的过氧物酶的例子包括来自鬼伞属(Coprinus)，例如，来自灰盖鬼伞(C.cinereus)的过氧物酶及其变体，如在WO 93/24618、WO95/10602和WO 98/15257中描述的那些变体。市售的过氧物酶例如包括GUARDZYME^TM(Novo Nordisk A/S)。

可以通过添加含有一种或多种酶的单独添加物或通过添加包含全部这些酶的组合添加物，将洗涤剂酶包含在洗涤剂组合物中。洗涤剂添加物(即单独添加物或组合添加物)可以配制为例如颗粒剂、液体剂、浆液剂等。示例性的洗涤剂添加物制剂包括，但不限于颗粒剂，特别地非粉化颗粒剂、液体剂，特别地稳定化的液体剂或浆液剂。

非粉化颗粒剂例如可以如美国专利号4,106,991和4,661,452中所公开那样产生并且可以任选地通过本领域已知的方法包衣。蜡质包衣材料的实例是平均摩尔重量1,000至20,000的聚(环氧乙烷)产物(例如，聚乙二醇，PEG)；具有16至50个环氧乙烷单位的乙氧基化壬基苯酚；其中醇含有12至20个碳原子并且其中存在15至80个环氧乙烷单位的乙氧基化脂肪醇；脂肪醇；脂肪酸；和脂肪酸单酰甘油和二酰甘油和三酰甘油。适用于流化床技术应用的成膜包衣材料的实例在例如GB 1483591中给出。液体酶制品可以根据建立的方法，例如通过添加多元醇如丙二醇、糖或糖醇、乳酸或硼酸稳定化。受保护的酶可以根据EP 238,216中公开的方法制备。

洗涤剂组合物可以处于任何便利的形式，例如，棒、片剂、粉剂、颗粒剂、糊剂或液体剂。液体洗涤剂可以是水性的，一般含有直至约70％的水和0至约30％有机溶剂。也构思了含有约30％或更少水的致密洗涤剂凝胶。洗涤剂组合物可以任选地包含一种或多种表面活性剂，所述表面活性剂可以是非离子的(包括半极性)和/或阴离子和/或阳离子和/或兼性离子的。表面活性剂可以在约0.1％至约60％重量的宽大范围存在。

在包括于洗涤剂中时，洗涤剂一般会含有从约1％至约40％的阴离子表面活性剂如线性烷基苯磺酸盐、α-烯属磺酸酯、烷基硫酸盐(脂肪醇硫酸盐)、醇乙氧基化硫酸盐、仲烷基磺酸盐、α-磺基脂肪酸甲酯、烷基或链烯基丁二酸或皂。

在包括于洗涤剂中时，洗涤剂通常会含有从约0.2％至约40％的非离子表面活性剂如醇乙氧基化物、壬基苯酚乙氧基化物、烷基多糖苷、烷基二甲胺氧化物、乙氧基化脂肪酸单乙醇酰胺、脂肪酸单乙醇酰胺、多羟基烷基脂肪酸酰胺或葡糖胺的N-酰基N-烷基衍生物(“葡糖酰胺”)。

洗涤剂可以含有0至约65％的洗涤剂助洗剂或络合剂，如沸石、二磷酸盐、三磷酸盐、膦酸盐、碳酸盐、柠檬酸盐、次氮基三乙酸、乙二胺四乙酸(EDTA)、二乙三胺五乙酸、烷基或链烯基丁二酸、可溶性硅酸盐或层状硅酸盐(例如来自Hoechst的SKS-6)。

洗涤剂可以包含一种或多种聚合物。示例性聚合物包括羧甲基纤维素(CMC)、聚(乙烯吡咯烷酮)(PVP)、聚(乙二醇)(PEG)、聚(乙烯醇)(PVA)、聚(乙烯吡啶-N-氧化物)、聚(乙烯咪唑)、聚羧酸酯如聚丙烯酸酯、马来酸/丙烯酸共聚物和甲基丙烯酸月桂酯/丙烯酸共聚物。

使用常规稳定剂，例如，多元醇(如丙二醇或甘油)、糖或糖醇、乳酸、硼酸或硼酸衍生物(例如芳族硼酸酯)或苯基硼酸衍生物(如4-甲酰基苯硼酸)，洗涤剂组合物的酶可以稳定化。该组合物可以如WO 92/19709和WO92/19708中所述配制。

目前构思的是在洗涤剂组合物中，特别地酶变体可以按照与每升洗涤液约0.01至约100mg酶蛋白(例如，每升洗涤液约0.05至约5.0mg酶蛋白或每升洗涤液0.1至约1.0mg酶蛋白)相对应的量添加。

4.2清洁组合物

在洗涤剂应用中，AmyDSM90相关多肽通常在含有丙二醇的液体组合物中使用。该酶通过在含有10％氯化钙的25％体积/体积丙二醇溶液中混合来例如溶解于丙二醇中。

本文中讨论的myDSM90相关多肽可以配制在用于清洁餐具的洗涤剂组合物或其他清洁组合物中。这些组合物可以是粉剂、凝胶剂或液体剂。所述组合物可以包含单独的或与其他淀粉分解酶和/或与其他清洁用酶或漂白活化酶和清洁组合物常见的其他组分在一起的酶。

因此，餐具清洗洗涤剂组合物可以包含表面活性剂。该表面活性剂可以是阴离子的、非离子的、阳离子的、两性的或这些类型的混合物。该洗涤剂可以含有0％至约90％重量的非离子表面活性剂，如低发泡至无发泡的乙氧基化丙氧基化直链醇类。

该洗涤剂组合物可以含有无机和/或有机类型的洗涤剂助洗盐。洗涤剂助洗剂可以细分成含磷和不含磷的类型。洗涤剂组合物通常含有约1％至约90％的洗涤剂助洗剂。当存在时，含磷无机碱性洗涤剂助洗剂的实例包括水溶性盐，尤其是碱金属焦磷酸盐、正磷酸盐和聚磷酸盐。当存在时，含磷有机碱性洗涤剂助洗剂的实例包括水溶性膦酸盐。当存在时，不含磷的无机助洗剂的实例包括水溶性碱金属碳酸盐、硼酸盐和硅酸盐，以及各种类型的水不溶性晶状或无定形铝硅酸盐，其中沸石是其最知名的代表物。

合适的有机助洗剂的实例包括碱金属、铵和取代的铵；柠檬酸盐；琥珀酸盐；丙二酸盐；脂肪酸磺酸盐；羧基甲氧基琥珀酸盐；聚乙酸铵；羧酸盐；聚羧酸盐；氨基聚羧酸盐；聚乙酰羧酸盐和聚羟基磺酸盐。

其他合适的有机助洗剂包括已知具有助洗剂性质的高分子量聚合物和共聚物，例如，适宜的聚丙烯酸、聚马来酸和聚丙烯酸/聚马来酸共聚物，及它们的盐。

清洁组合物可以含有氯/溴型或氧型的漂白剂。无机氯/溴型的漂白剂的实例是锂、钠或钙的次氯酸盐和次溴酸盐，以及氯化的磷酸三钠。有机氯/溴型的漂白剂的实例是杂环N-溴和N-氯酰亚胺，例如三氯异氰脲酸、三溴异氰脲酸、二溴异氰脲酸和二氯异氰脲酸，及其带有水溶性阳离子(例如钾和钠)的盐。乙内酰脲化合物也是合适的。

清洁组合物可以含有氧漂白剂，例如以无机过盐酸的形式，任选地伴随漂白前体或作为过氧酸化合物。合适的过氧酸漂白化合物的常见实例是碱金属过硼酸盐的四水合物和一水合物、碱金属过碳酸盐、过硅酸盐和过磷酸盐。合适的活化剂物质包括四乙酰基亚乙基二胺(TAED)和甘油三乙酸酯。酶促漂白活化***也可以存在于制剂中，例如过硼酸盐或过碳酸盐，三乙酸甘油酯和过水解酶(见，例如，WO 2005/056783)。

使用酶的常规稳定剂，例如，多元醇(例如丙二醇)、糖或糖醇、乳酸、硼酸或硼酸衍生物(例如芳香硼酸酯)，清洁组合物可以稳定化。

清洁组合物也可含有其他常规的洗涤剂成分，例如，反絮凝剂、填料、抑泡剂、抗腐蚀剂、污物悬浮剂、掩蔽剂、抗污物再沉积剂、脱水剂、染料、杀菌剂、荧光剂、增稠剂和香料。

虽然本发明组合物和方法已经参考下文细节进行描述，但是应当理解可以作出多种改变。

4.3评估洗涤剂组合物中淀粉酶活性的方法

存在为数众多的α-淀粉酶清洁测定法。测试清洁作用的示例性描述包括以下内容。

“样品”是一块已经施加过污渍的材料，如织物。该材料可以例如是用棉、聚酯或天然纤维与合成纤维的混合物制造的织物。样品还可以是纸，例如滤纸或硝酸纤维素，或一块硬质材料，如陶瓷、金属或玻璃。对于淀粉酶而言，污渍是基于淀粉的，但是可以包括血、乳、墨、草、茶、酒、菠菜、肉汁、巧克力、蛋、乳酪、粘土、色素、油或这些化合物的混合物。

“较小的样品”是一片样品，该样品已经用单孔打孔装置切割过或者已经用定制的96孔打孔机切割过，其中多孔打孔机的样式与标准的96孔微量滴定平板匹配，或者该片样品已经从样品以别样方式取下。样品可以是织物、纸、金属或其他合适的材料。较小的样品可以在其置入24-孔、48-孔或96-孔微量滴定板的孔之前或之后附着有污渍。也可以通过施加污渍至一小片材料来制作“较小的样品”。例如，较小样品可以是带有直径5/8″或0.25″的一块玷污的织物。定制的打孔机以这样的方式设计，从而它同时送递96块样品至96孔平板的全部孔。该装置允许通过简单地装载相同的96孔平板多次而递送每孔多于一个样品。可构想多孔打孔装置以同时送递样品至任何形式的平板，包括但不限于24孔、48孔和96孔平板。在另一个可构想的方法中，弄脏的测试平台可以是以污物基质涂布的由金属、塑料、玻璃、陶瓷或其他合适材料制成的珠子。一颗或多颗涂布的珠子随后置入96-孔、48-孔或24-孔平板或更大形式平板的含有合适缓冲液和酶的孔中。在这种情况下，可以通过直接吸光度测量或在次级显色反应后对上清液检验释放的污物。对释放污物的分析也可以通过质谱分析进行。又一个微量筛选测定法可以是送递并固定样品(例如靛蓝染色的粗纹棉布)至多孔平板的孔，并且添加颗粒如砂或更大颗粒例如过筛以包括6至8或9号颗粒的石榴石，并且摇动该平板，从而造成样品被添加的颗粒摩擦。该测定法已经用于砂洗应用中纤维素酶的评估。可以通过至反应缓冲液的颜色释放(例如，释放的靛蓝溶解于二甲基亚砜中并且测量A₆₀₀nm处的吸光度)或通过磨损样品的反射度测量判断该酶的效果。

例如当未处理的BMI(血/乳/墨)样品在无漂白剂的洗涤剂中洗涤时，大部分的墨水甚至在无蛋白酶辅助的情况下释放。添加蛋白酶导致墨释放的少量增加，这可能在大背景上难以定量。本发明组的合物和方法提供了允许控制污渍固定程度的处理方案。结果，可能产生例如在所测试的酶不存在下洗涤时释放可变量污渍的样品。固定样品的使用导致洗涤测定法中信噪比的显著改善。此外，通过变动固定的程度，可以产生在多种清洗条件下给出最佳结果的污渍。

在多种类型材料上具有已知“强度”污渍的样品是商业上可获得的(EMPA，St.Gallen，瑞士；wfk-Testgewebe GmbH，德国克雷菲尔德；或荷兰弗拉尔丁恩实验材料中心(Center for Test Materials，Vlaardingen，The Netherlands)和/或可以由从业者制作(Morris和Prato，TextileResearch Journal 52(4)：280-286，(1982))。其他的试验样品包含但不限于在含棉织物上的血/乳/墨(BMI)污渍，在含棉织物上的菠菜污渍，或在含棉织物上的草，和在含棉织物上的巧克力/乳/烟灰。

BMI污渍可以用0.0003％至0.3％的过氧化氢固定到棉上。其他的组合包括用0.001％至1％戊二醛固定的草或菠菜、用0.001％至1％戊二醛固定的明胶和考马斯(Coomassie)污渍，或者用0.001％至1％戊二醛固定的巧克力、乳和烟灰。

也可以在随酶和/或洗涤剂制剂一起孵育期间搅动样品。清洗性能数据依赖于样品在孔中的朝向(水平对垂直)，特别是在96孔板中。这将表明孵育期间混合是不充足的。虽然存在保证孵育期间充分摇动的众多方式，但是可以构建一个平板固定器，其中微量滴定平板夹在两块铝板之间。这可以如下这样简单：例如在孔上安放一块粘性平板封盖，随后用任一类型的适当的市售夹子把两块铝板夹至96孔板上。平板随后可以安置在商业摇床上。设定振荡器至约400转/分钟产生极高效的混合，同时固定器有效防止泄露或交叉污染。

三硝基苯磺酸(TNBS)可以用来定量洗涤液中氨基的浓度。这可以充当从样品中除去的蛋白质的量的量度(如见Cayot和Tainturier，Anal.Biochem.249：184-200，1997)。然而，如果洗涤剂或酶样本导致非常小的肽片段形成(例如，因样本中存在肽酶)，则会得到更大的TNBS信号，即更多“噪音”。

测量血/乳/墨或其他污渍的清洗性能的另一种手段基于墨释放。样品上蛋白质的蛋白酶解导致墨颗粒的释放，这可以通过测量洗涤液吸光度进行定量。吸光度可以在350nm与800nm之间的任意波长处测量。吸光度在410nm或620nm处测量。也可以检测洗涤液以测定对含有草、菠菜、明胶或考马斯污渍的污渍的洗涤性能。用于这些污渍的示例性波长包括用于菠菜或草的670nm和用于明胶或考马斯的620nm。例如，将等分试样的洗涤液取出(一般，例如从96孔微量培养板中取出100-150μL)并且置于比色皿或多孔微量平板中。然后将其置于分光光度计中并且在适当的波长处读出吸光度。

例如使用在合适基质如布、塑料或陶瓷上的血/乳/墨污渍，该***也可以用来测定用于餐具洗涤的增强型酶和/或洗涤剂组合物。

在一个方面，通过在25℃施加0.3％过氧化氢至BMI/棉样品30分钟，或在60℃施加0.03％过氧化氢至BMI/棉样品30分钟，将BMI污渍固定至棉上。将大约0.25″的较小样品从BMI/棉样品切下并且置于96孔微量滴定平板的孔中。向每个孔置入洗涤剂组合物和酶(如变体蛋白)的已知混合物。在将粘性平板封盖安置在微量滴定平板的顶部后，将微量滴定平板夹到铝板上并且在有定轨摇床上以大约250转/分钟摇动约10至60分钟。这段时间结束时，将上清液转移到一块新微量滴定平板的孔中并且在620nm处测量墨的吸光度。这可以类似地用于测试菠菜污渍或草污渍，其中通过在25℃施加0.01％戊二醛30分钟至菠菜/棉样品或草/棉样品，将所述菠菜污渍或草污渍固定至棉上。可以用巧克力、乳和/或烟灰污渍进行相同的测试。

为易于阅读，将本发明文件组织成众多的段落；然而，读者会理解在一个段落做出的陈述可以适用于其他段落。以这种方式，本公开书不同段落所用的标题不应当解释为限制性的。

为进一步说明所述组合物和方法及其优势，给出以下具体实施例，同时应理解它们是说明性而非限制性的。

实施例

实施例1

amyDSM90基因的克隆和分离

巨大芽孢杆菌菌株DSM90从Deutsche Sammlung vonMikroorganismen und Zelkulturen GmbH(DSMZ)，Inhoffenstrasse 7B，38124布伦瑞克，德国获得。制备DNA并且使用基于巨大芽孢杆菌AAK00598淀粉酶序列(SEQ ID NO：3)设计的PCR引物组(SEQ ID NOs：11和12)，将DNA用于amyDSM90α-淀粉酶基因的分离。对克隆pME602的已测序核苷酸的翻译表明来自巨大芽孢杆菌DSM90的淀粉酶(SEQ IDNO：1)与来自巨大芽孢杆菌AAK00598的淀粉酶有8个氨基酸不同(同一性＝98.4％；图1)。

由于这个结果出乎意料，因而通过将几乎完整的16S rRNA基因测序来证实巨大芽孢杆菌菌株DSM90的身份。手工证实来自自动碱基读出(automated base calling)的序列结果以产生用于分析的最终1486nts序列(SEQ ID NO：8)。虽然巨大芽孢杆菌菌株DSM90的rRNA序列似乎是在公共数据库中不可获得的，但是使用SEQ ID NO：8作为查询所执行的BLAST搜索返回大量针对巨大芽孢杆菌菌株的“命中”(99-100％同一性)。基于可获得证据，得出结论：获得主题DNA的生物是巨大芽孢杆菌菌株。虽然菌株命名对于本发明组合物和方法是不重要，但是为了本公开的目的，这个菌株将称作DSM90。

使用BLASTp工具，在公共序列数据库中进行相似淀粉酶序列的搜索。出人意料地，该搜索揭示，最相似的淀粉酶(＞94％同一性)衍生自炭疽芽孢杆菌AAT32659(SEQ ID NO：4)、苏云金芽孢杆菌AAT60457(SEQ IDNO：5)、蜡状芽孢杆菌AAP10417(SEQ ID NO：6)，并且不衍生自其他巨大芽孢杆菌菌株，唯一例外是来自巨大芽孢杆菌AAK00598的淀粉酶(SEQID NO：3)。这些直向同源淀粉酶序列的比对在图2中显示并且它们的相关性(就同一性百分数而言)在(表1)中显示。

表1.直向同源淀粉酶序列的同一性百分数

在***发生上，蜡状芽孢杆菌、炭疽芽孢杆菌和苏云金芽孢杆菌形成高度相关物种和菌株的紧密聚类，与巨大芽孢杆菌仅远距离相关(Ash等人，Letters in Applied Microbiology 13：202-206，1991)。因而，尽管基于***发生相似性可以预期蜡状芽孢杆菌、炭疽芽孢杆菌和苏云金芽孢杆菌含有相似的淀粉酶，然而令人惊讶的是这些淀粉酶与巨大芽孢杆菌淀粉酶高度相似。这表明AmyDSM90是可鉴定淀粉酶亚组的成员，其中所述的亚组也包括来自蜡状芽孢杆菌、炭疽芽孢杆菌和苏云金芽孢杆菌的那些淀粉酶。值得注意的是数据库注释将这些蜡状芽孢杆菌、炭疽芽孢杆菌和苏云金芽孢杆菌淀粉酶描述为“胞质的”，即，不输出或不分泌于细胞外部，此观察结果与本发明的发现相矛盾。

实施例2

AmyDSM90在地衣芽孢杆菌中的表达

为在地衣芽孢杆菌中表达巨大芽孢杆菌DSM90淀粉酶(AmyDSM90)，通过使用pHPLT载体产生中间构建体。pHPLT(图3；Solingen等人，Extremophiles 5：333-41，2001)含有热稳定的淀粉酶LAT启动子(pLAT)和地衣芽孢杆菌LAT信号肽(pre LAT)，后接用于克隆的PstI和HpaI限制性位点。

使用来自Epicentre的MASTERPURE革兰氏阳性DNA纯化试剂盒，根据制造商的方案，从过夜培育的培养物(胰蛋白酶大豆培养液，在30℃)的1ml细胞沉淀制备巨大芽孢杆菌DSM90的基因组DNA。使用基于巨大芽孢杆菌AAK00598淀粉酶的前述引物(SEQ ID NOs：11和12)，根据制造商的说明(复性温度55℃)，在带有PURETAQ READY-TO-GO PCR珠的热循环仪(GE Healthcare)上通过PCR扩增amyDSM90基因。所得的PCR片段用限制性酶PstI和HpaI消化，并且根据供应商的说明(Roche AppliedScience，Indianapolis，IN，USA)，用T4DNA连接酶连接至消化的pHPLTpDNA(50ng/μl，用PstI和HpaI限制性酶消化)中。将连接混合物转化至枯草芽孢杆菌菌株WW120(也称作BG3934；amyE::xylRPxylAcomK-ermC)中。将转化反应物涂布在含有10ppm新霉素和1％w/v不溶性淀粉的LB琼脂平板上。获得约50-100个菌落。

使用菌落PCR和测序，对20个菌落评价***物的存在。对于菌落PCR，将每个枯草芽孢杆菌转化体悬浮在20μL无菌水中，其中2μL用于含有READY-TO-GO TAQ PCR珠(Amersham)、22μL无菌水、0.5μL 25μM pHPLT-F1引物(SEQ ID NO：13)和0.5μL 25μM pHPLT-R1引物(SEQ ID NO：14)的PCR反应中。循环条件是94℃4分钟一次，和总共30个循环的94℃1分钟、53℃1分钟和72℃2分钟，随后是在72℃7分钟的一个终末循环。5μL PCR产物用Exo-SapIT(Amersham)消化以在测序之前除去dNTP和引物。使用引物pHPLT-seq-F1(SEQ ID NO：15)和pHPLT-seq-R1(SEQ ID NO：16)进行测序以证实***物的序列。所得的质粒命名为pME602.13(也称作pHPLT-B.meg DSM90Amy，如图4中所示的质粒图上那样)。与AAK00598淀粉酶相比，克隆的淀粉酶基因具有8个氨基酸改变(图1)。该质粒可以直接用于表达AmyDSM90相关多肽，如实施例3中所述。

pHPLT-B.meg DSM90Amy质粒(DSM90-野生型)随后用来产生地衣芽孢杆菌AmyDSM90表达菌株，在该菌株中AmyDSM90被表达为带有地衣芽孢杆菌α-淀粉酶(LAT)信号肽的融合蛋白(图5和6，指SEQ ID NOs：9和10)。使用引物AmyPlatFW(SEQ ID NO：17)和AmyTlat_RV(SEQ IDNO：18)和质粒pHPLT-B.meg DSM90Amy作为模板，进行PCR扩增以产生XhoI片段，该片段含有在5′末端侧翼具有完整LAT启动子并且在3′末端侧翼具有LAT终止子的LAT-DSM90Amy前体(即，带有信号序列的不成熟蛋白)基因。在热循环仪上用PHUSION高保真DNA聚合酶(Finnzymes OY，Espoo，Finland)，根据制造商的说明(复性温度55℃)进行PCR。所得的PCR片段用限制性酶XhoI消化，并且根据供应商的说明(Invitrogen，Carlsbad，Calif.USA)，用T4DNA连接酶连接至XhoI消化的pICatH中。将连接混合物转化至如美国专利申请US20020182734(国际公开WO 02/14490)中所述的枯草芽孢杆菌菌株SC6.1中。通过DNA测序证实含有LAT-AmyDSM90前体基因的XhoI***物的序列(BaseClear，Leiden，The Netherlands)并且将正确的质粒克隆命名为pICatH-B.megDSM90amy(ori1)(图7)。

随后将pICatH-B.meg DSM90amy(ori1)质粒在许可温度(37℃)转化至地衣芽孢杆菌菌株BML612和BML780(分别是BRA7和BML612的衍生物；WO2005111203)中。从每个转化中选择一个新霉素抗性(neoR)和氯霉素抗性(CmR)转化体(分别命名为BML612(plCatH-AmyDSM90(ori1)和BML780(plCatH-AmyDSM90(ori1))。通过在非许可温度(50℃)在含有5μg/ml氯霉素的培养基中培育每种转化的菌株，将这些质粒整合至地衣芽孢杆菌基因组的catH区域中。选择每种菌株的一个氯霉素抗性克隆并将它在许可温度在具有氯霉素、但没有新霉素的情况下培育几个世代以环出(loop-out)载体序列，并且随后选择每种菌株的一个新霉素敏感(neoS)CmR克隆以进一步分析。在这些克隆中，切出了染色体上plCatH的载体序列(包括新霉素抗性基因)并且仅catH-LATAmyDSM90盒留下。

通过在氯霉素浓度增加的培养基中/上培育每种菌株扩增染色体上的catH-LATAmyDSM90盒。在几轮扩增后，选择抵抗75μg/ml氯霉素的每种菌株的一个克隆并且将其分别命名为BML612-DSM90amyCAP75和BML780-DSM90amyCAP75。为证实AmyDSM90表达，将菌株在37℃于具有1％淀粉天蓝(Starch Azure)(与雷马唑亮蓝R共价连接的马铃薯淀粉；Sigma-Aldrich，S7629)的心浸液(Bacto)琼脂平板上培育48小时。指示淀粉分解活性的清亮区带在菌落周围清晰可见，表明相当大量的有酶促活性的AmyDSM90在地衣芽孢杆菌菌株中表达。

实施例3

AmyDSM90在枯草芽孢杆菌中的表达

用(实施例2中描述的)质粒pME602.13转化的枯草芽孢杆菌菌株WW120分泌有酶促活性的AmyDSM90相关多肽，如碘染色之后淀粉平板上的晕圈形成所展示。为表达AmyDSM90相关多肽，该菌株的培养物一般在37℃伴以250转/分钟搅拌的情况下在以下培养基(每升)：10g大豆胨，75g葡萄糖，7.2g脲，40mM MOPS，4mM Tricine，3mM磷酸氢二钾，21.4mM KOH，50mM NaCl，276μM硫酸钾，528μM氯化镁，50μM二水合柠檬酸三钠，100μM二水合氯化钙，14μM七水合硫酸亚铁，5.9μM二水合硫酸锰，5.7μM一水合硫酸锌，2.9μM二水合氯化铜，4.2μM六水合钴，和4.5μM二水合钼酸钠中培育60至72小时。对于1L体积，将全部组分(除大豆胨之外)以500mL混合、无菌过滤并且添加至等份的已经通过高压灭菌法消毒的2X大豆胨。将痕量金属和柠檬酸盐制成100X或1000X母液。将缓冲剂、氢氧化钾、氯化钠、硫酸钾和氯化镁和痕量金属制作成10X母液。在混合全部组分后，调节pH至7.3。在使用之前，以20mM氯化钙和10mg/L新霉素三硫酸盐补充该培养基。此处所述的全部实验均使用枯草芽孢杆菌中表达的AmyDSM90。

实施例4

AmyDSM90的纯化

来自实施例3中所述摇瓶(500mL)的包括所表达AmyDSM90的生长培养基浓缩至25mL体积。随后添加含有2mM氯化钙的25ml 50mM MES缓冲液，pH 5.8至该浓缩物，接着添加6.6g硫酸铵以产生1M硫酸铵终浓度。在过滤后，将该样品施加至用5mL苯基琼脂糖凝胶(phenylsepharose)柱，该柱用含有50mM MES，pH 5.8，2mM氯化钙和1M硫酸铵的缓冲液平衡。在装载后，该柱用8个体积的与平衡所用相同的缓冲液洗涤。用始于平衡/洗涤缓冲液并止于50mM MES，pH 5.8，2mM氯化钙缓冲液(无硫酸铵)的梯度经12个柱体积从该柱洗脱AmyDMS90相关多肽。将50mM MES，pH 5.8，2mM氯化钙缓冲液(无硫酸铵)的条件延续7个柱体积，并且随后在该缓冲液中包含40％丙二醇持续5个柱体积。该柱用水以逆流方向洗涤5个柱体积并且以顺流方向洗涤10个柱体积。淀粉酶开始洗脱9个柱体积至梯度中并且继续洗脱历经2个柱体积。

使用Megazyme淀粉酶活性测定法测量α-淀粉酶活性，并且将全部活性级分汇集、浓缩(使用5K VIVASPIN 20mL离心浓缩机)并交换缓冲液三次至50mM MES，pH 5.8，2mM氯化钙缓冲液中以除去残留的硫酸铵。

实施例5

AmyDSM90相关多肽在地衣芽孢杆菌中的表达

使用QUICK CHANGE多位点诱变法(Stratagene，La Jolla，CA)，产生AmyDSM90的变体[例如，包括(a)R179-G180缺失(ΔRG)，(b)M200L置换和(c)这些突变的组合]。

使用QUIK-CHANGE多位点诱变试剂盒连同相应的引物对RGF(SEQ ID NO：21)/RG R(SEQ ID NO：22)和M200F(SEQ ID NO：19)/M200R(SEQ ID NO：20)，首先产生各个变体(即，分别包括R179和G180缺失和M200L置换)。ΔRG变体充当使用引物对M200F/M200R的第二QUIK-CHANGE多位点诱变反应的模板，旨在组合RG缺失和M200L置换。使用下文概述的方案产生全部3种变体：

在Quik-CHANGE诱变之前，使用dam甲基酶(NEB，Massachusetts，USA)甲基化pHPLT-B.meg DSM90Amy。除了在反应中使用赠送的引物替代单一正向引物之外，使用QUIK-CHANGE多位点诱变试剂盒，按照该试剂盒方案，pHPLT-B.meg DSM90Amy充当模板以产生头两个变体。使用GE Healthcare Illustra Templiphi试剂盒(GE Healthcare)，按照该试剂盒方案，1μL的QUICK-CHANGE反应物充当滚环扩增的模板。将滚环反应物稀释10倍，并且将1μL转化至100μL感受态枯草芽孢杆菌BG6006细胞(degUHy32，oppA，dspoII3501，amyE::xylRPxylAcomK-ermC，daprE，dnprE，depr，dispA，dbpr，dvpr，dwprA，dmpr-ybfJ，dnprB)(US20050202535A1)中。将转化物涂布在含有10ppm新霉素和1％w/v不溶性淀粉的LB琼脂平板上。获得约100个菌落。使用菌落PCR和测序，对4个菌落评价所需突变的存在。对于菌落PCR，将每个枯草芽孢杆菌转化体悬浮在20μL无菌水中，其中2μL用于含有来自Amersham的READY-TO-GO TAQ PCR珠、22μL无菌水、0.5μL 25μM pHPLT-F1引物(SEQ ID NO：13)(5′-TACATATGAGTTATGCAGTTTG-3′)和0.5μL25μM pHPLT-R1引物(SEQ ID NO：14)(5′-GTTATGAGTTAGTTCAAATTCG-3′)的PCR反应中。循环条件是94℃4分钟一次；总共30个循环的94℃1分钟、53℃1分钟，72℃2分钟，随后是在72℃7分钟的一个终末循环。5μL PCR产物用来自Amersham的Exo-SapIT消化以在测序之前除去dNTP和引物。使用引物pHPLT-seq-F1(SEQ ID NO：15)和pHPLT-seq-R1(SEQ ID NO：16)进行测序以证实存在所需的突变。

如实施例2中所述，pHPLT-B.meg DSM90Amy质粒(即，具有R179-G180缺失、M200L置换或这两者)充当模板以构建地衣芽孢杆菌AmyDSM90表达菌株。

实施例6

使用密码子修饰的基因表达AmyDSM90相关多肽

合成的、密码子优化的编码4种AmyDSM90相关多肽(即，天然存在的直向同源物)中每种多肽的DNA片段由GeneArt GmbH(Regensburg，Germany)产生并且用来构建额外的枯草芽孢杆菌菌株(表2)。

表2.含有修饰的密码子的合成的DNA片段

pHPLT载体(图3；实施例2)用于这些AmyDSM90相关多肽的表达。合成的基因(即，SEQ ID NO 23、SEQ ID NO 24、SEQ ID NO 25和SEQ IDNO 26)用限制性酶PstI和HpaI消化，并且根据供应商的说明(RocheApplied Science，Indianapolis，IN，USA)，用T4DNA连接酶连接至用PstI和HpaI限制性酶消化的pHPLT pDNA(50ng/μl)中。如实施例2中所述，将连接混合物转化至枯草芽孢杆菌菌株WW120中并进行序列分析。

为证实AmyDSM90相关多肽的表达，将每种转化的细菌在37℃于具有10mg/l新霉素和1％淀粉天蓝的心浸液(Bacto)琼脂平板上培育24小时。指示淀粉分解活性的清亮区带在所有菌落周围清晰可见。这些结果显示相当大量的AmyDSM90相关多肽在枯草芽孢杆菌中表达并且具有淀粉酶活性。

实施例7

α-淀粉酶活性的Megazyme测定法

测量α-淀粉酶活性的Megazyme测定法如下进行：

材料：

25mM Bis Tris丙烷缓冲液pH 6.9和2mM CaCl₂，

BPNPG7底物，5.45mg/mL(Amylase HR Reagent，(封闭的)对-硝基苯基a-D-麦芽庚糖苷，目录号：R-AMHR4Megazyme International)，

淀粉葡糖苷酶，10U/mL，和

α-葡糖苷酶，10U/mL。

方法：

1.通过添加10mL蒸馏水至含有BPNPG7连同淀粉葡糖苷酶/α-葡糖苷酶的小瓶制备底物。准备1mL等分试样并贮藏在-20℃。

2.将热混合仪设定至43℃。

3.调节平板读数仪至以下设置：40℃；405nm，动力学，45分钟，15秒间隔，预混合7秒。

4.用BTP pH 6.9和2mM CaCl₂缓冲液制备酶稀释直至1ppm，并贮藏在冰上。

5.添加10μL底物至150μL的BTP pH 6.9和2mM CaCl₂缓冲液。该底物溶液以大体积制备，并且将160μL溶液分配至预温至40℃至少10分钟的平板的每个微量滴定平板孔。

6.在该平板留在温暖平台上的同时，添加10μL酶至每个孔。

7.将平板立即转移至平板读数仪，并且监测酶反应的速率45分钟，或直至获得足够的线性数据。

8.通过用获得的速率(milliOD/min)除以测定法中所用的μg酶计算出比活性。

实施例8

AmyDSM90相关多肽在清洁作用筛选测定法中的性能

在96孔CS28-橙色着染的稻淀粉弄脏的织物样品微量施加清洁测定法中分析部分纯化的AmyDSM90相关多肽(实施例4)。使用织物打孔机，从CS28稻淀粉玷污的织物(试验织物目录号CS-28；Test Fabrics Inc)切下1/4英寸圆盘并且在平底96孔测试平板的每孔中安置两个圆盘。在进行淀粉酶测定法之前，通过添加200μL水至每孔，将测定平板置于热混合仪中并且25℃伴以750转/分钟振摇下孵育1小时，将样品预洗涤以除去结合不牢的任何染料。从每孔除去洗涤液并且将样品圆盘在200μL水中漂洗一次。立即抛弃漂洗水并且洗涤的样品圆盘在37℃于测试平板中晾干。

对于α-淀粉酶清洁测定法，添加预先选择的缓冲液至各孔并且平衡至预先选择的温度。在本发明的实验中，在25mM BTP(pH 8.0)中或在25mMCAPS(pH 10.3)中进行测定法，同时每种缓冲溶液额外地含有2mMCaCl₂。将200μL预先选择的缓冲液添加至每孔并且允许平衡至想要的温度(即，20℃或40℃)持续15分钟。添加10μL酶溶液至每孔，并且将平板在相同的温度伴以750转/分钟振摇下孵育1小时。在转移150μL分析溶液至新鲜微量滴定平板后，通过在488nm处分光光度方式所定量的酶依赖性颜色释放的量建立酶性能。关于该测定法的额外信息，见美国专利号7,122,334。

结果在图8-11中的曲线里显示。AmyDSM90在从织物样品除去淀粉性污渍方面在40℃于pH 8和pH 10.3均是高度有效的，同时它比对照酶(即，

Genencor International.Palo Alto，CA，USA)表现更好。令人惊讶地，该酶在较低温度即20℃在pH 8和pH 10.3也明显有效，同时它比对照酶

和

(二者均来自Genencor International.Palo Alto，CA，USA)显示更好的污渍除去作用。

该测定法的所述96孔形式适合高通量筛选。使用可以测量其反射度的更大样品，该测定法的24孔平板形式用来证实所述结果。两种量度(即，上清液吸光度和样品反射度)显示近乎完美的相关(决定系数(coefficient ofdetermination)r²具有值0.99)，因而证实该结果。

实施例9

AmyDSM90相关多肽在洗涤剂中的洗涤性能

使用指示染料与淀粉结合的CS28稻淀粉玷污织物样品(Test Fabrics目录号CS-28；Test Fabrics Inc.)，实施洗涤性能试验。在测定法之前，染色的试验织物用蒸馏水预洗涤1小时并晾干。试验织物的预洗涤在测定法之前除去任何不良结合的指示染料。备选地，样品在它们已经装入微量滴定平板的孔中之后(如实施例8中所述)预洗涤。

从预洗涤的织物切下1/4英寸圆盘并置于96孔平板中。添加190μL洗涤剂溶液至每孔中(例如，IEC-A^＊基础洗涤剂(目录号88010-1；WFKTestgewebe GmbH，德国)。带有样品和洗涤剂的平板在40℃预孵育15分钟。通过添加10μL体积中的0-1ppm来自实施例4的纯化AmyDSM90相关多肽或0至1ppm商业α-淀粉酶(例如，

)或

(作为对照)启动淀粉酶测定法。通过测量由分光光度法在488nm处所测量的指示染料进入溶液相中的颜色释放来确定洗涤性能。

实施例10

清洁作用筛选测定法中的多种AmyDSM90相关多肽

在枯草芽孢杆菌BG6006中表达AmyDSM90的天然存在变体，即炭疽芽孢杆菌AAT32659淀粉酶、蜡状芽孢杆菌AAP10417淀粉酶、苏云金芽孢杆菌AAT60457和巨大芽孢杆菌AAK00598淀粉酶，并且基本上如实施例8中所述测试它们的清洁效率。该测定法在25mM HEPES(pH 8.0)或25mM CAPS(pH 10.3)缓冲液中实施，每一缓冲液具有水硬度150ppmCa²⁺和Mg²⁺(2∶1Ca∶Mg)。将209μL缓冲液添加至96孔微量滴定平板的每孔并且允许平衡至想要的温度(即，40℃)15分钟。添加11μL纯化的酶溶液至每孔，并且将平板在相同的温度伴以750转/分钟振摇下孵育1小时。如前述，酶性能基于酶依赖性颜色释放的量，其中在转移150μL反应溶液至新鲜微量滴定平板后，通过在488nm处如分光光度方式定量所述的量。

图12和13中所示的结果显示直向同源淀粉酶与AmyDSM90和Amy707(Tsukamoto等人，Biochem.Biophys.Res.Comm.151：25-31，1988)相比较的相似清洁能力(即，淀粉清除作用)。

实施例11

AmyDSM90相关多肽的Terg-o-tometer测试

Terg-o-tometer为洗涤剂和酶提供中间的实验室规模测试测定法，其模拟北美洲常见的顶装、桨叶作用(paddle action)式洗衣机。下文描述用来进行该测定法的条件和流程：

样品：

棉布上EMPA161染色的玉米淀粉(EMPA Testmaterialien AG，St.Gallen，瑞士)和

棉布上CS-28染色的稻淀粉(Test fabrics，Inc.，Center for Testmaterials，荷兰弗拉尔丁恩)

洗涤剂：

AATCC液体剂，pH 7(1.5g/L)和

AATCC粉剂，pH 10。

淀粉酶：

巨大芽孢杆菌DSM90(AmyDSM90)，

巨大芽孢杆菌AAK00598，和

OxAm

作为对照。

条件：

1升Terg-o-tometer，

4份淀粉玷污的样品外加用于压载的4份白色漂白的棉布样品

6gPg(大约100ppm[3：1，Ca：Mg])水硬度，和

23℃洗涤温度。

方法：

在黑色背景上使用Minolta反射计，预读污物样品的中心两次。添加1L去离子水至terg-o-tometer，随后添加预先选择的洗涤剂剂量和盐以产生预先选择的水硬度。将溶液混合5分钟并且允许达到74°F洗涤温度。测量terg-o-tometer的pH并且添加受试淀粉酶。添加4份淀粉玷污的样品和4份白色漂白的棉布样品并且启动terg-o-tometer。样品在洗涤剂溶液中以100转/分钟混合15分钟。在孵育之后，将样品转移至一只4L塑料烧杯，在流动的自来水和流动的去离子水下(来自下文)漂洗3分钟并且安放在用于脱水循环(spin cycle)的前置式洗衣机中。多份样品通过平摊在一个清洁薄板上干燥过夜。在黑色背景的顶部将样品上污物的中心读取两次。结果记录为污物去除指数(％ΔSRI)。

结果：

结果在图14至16中显示并且与OXAM

相比，展现本发明淀粉酶在液体和粉状洗涤剂中的优异衣物洗涤性能。

实施例12

AmyDSM90相关多肽的Launder-o-meter测试

Launder-o-meter(LOM)为洗涤剂和酶提供中间的实验室规模测试测定法，其模拟欧洲常见的前置、筒式洗衣机。下文描述用来进行该测定法的条件和流程：

样品：

洗涤剂：

IEC A标准洗涤剂，pH10.7(6.16g/L)，

带漂白剂的IEC A，pH 10.4

市售的凝胶衣物洗涤剂。

淀粉酶：

巨大芽孢杆菌DSM90(AmyDSM90)，野生型

巨大芽孢杆菌DSM90突变体M200L，

巨大芽孢杆菌DSM90突变体ΔRG，

巨大芽孢杆菌DSM90突变体M200L和ΔRG，

OXAM

，作为对照，和

地衣芽孢杆菌淀粉酶(LAT，Genencor International)，作为对照。

条件：

每个试验4份淀粉沾染的样品，

12gPg(大约200ppm[3：1，Ca：Mg])，水硬度，和

40℃洗涤温度。

方法：

将LOM设定至适宜的温度。在室温启动洗涤循环并且允许LOM在45分钟洗涤循环中爬升至想要的温度。在黑色背景上使用50mm Minolta反射计，预读污物样品的中心两次。添加200mL的洗涤溶液。添加不锈钢球(6)和受试酶样本并且充分混合，随后添加所述洗涤样品。将试验烧杯盖好并用夹子固定并且置入LOM中。在45分钟孵育后，将样品从试验烧杯取出，挤出过多的水并转移至4L塑料烧杯。样品在流动的自来水下漂洗3分钟，安放在用于脱水循环(spin cycle)的前置式洗衣机中并且摊平晾干过夜。在黑色背景的顶部将样品上污物的中心读取两次。结果记录为污物去除指数(％ΔSRI)。结果在图17至21中显示。与商品酶(OXAM和LAT)相比，AmyDSM90在标准洗涤剂和市售洗涤剂中均具有改善的洗涤性能，例如变体M200L在含有漂白剂的洗涤剂中产生性能益处(图17和18)。

本文中提到的全部参考文献通过引用的方式完整并入本文用于参考。

Claims

1.与AmyDSM90(SEQ ID NO：1)具有至少80％氨基酸序列同一性的分离的多肽，其中该多肽相对于SEQ ID NO：1具有至少一个以下特征：

a)在第21位置处的天冬氨酸，

b)在第97位置处的天冬酰胺，和

c)在第128位置处的异亮氨酸。

2.权利要求1所述的多肽，其具有第21位置处的天冬氨酸和第97位置处的天冬酰胺。

3.权利要求1所述的多肽，其具有第21位置处的天冬氨酸和第128位置处的异亮氨酸。

4.权利要求1所述的多肽，其具有第97位置处的天冬酰胺和第128位置处的异亮氨酸。

5.权利要求1所述的多肽，其具有第21位置处的天冬氨酸、第97位置处的天冬酰胺和第128位置处的异亮氨酸。

6.权利要求1所述的多肽，其由异源细胞表达为分泌性多肽。

7.权利要求1所述的多肽，其具有α-淀粉酶活性。

8.权利要求1所述的多肽，其与SEQ ID NO：1的氨基酸序列具有至少90％同一性。

9.权利要求1所述的多肽，其与SEQ ID NO：1的氨基酸序列具有至少95％同一性。

10.权利要求1所述的多肽，其具有SEQ ID NO：1的氨基酸序列。

11.权利要求1所述的多肽，其具有SEQ ID NO：28、SEQ ID NO：29或SEQ ID NO：30的氨基酸序列。

12.分离的多肽，其具有SEQ ID NO：23、SEQ ID NO：24、SEQ IDNO：25或SEQ ID NO：26的氨基酸序列。

13.组合物，其包含权利要求1-12任一项所述的多肽。

14.权利要求13所述的组合物，其中该组合物是清洁组合物。

15.权利要求13所述的组合物，其中该组合物有效用于从衣物除去淀粉性污渍。

16.权利要求13所述的组合物，其中该组合物有效用于从餐具除去淀粉性污渍。

17.权利要求13所述的组合物，其中该组合物有效用于从织物除去淀粉性污渍。

18.组合物，其包含具有SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：23、SEQ ID NO：24、SEQID NO：25、SEQ ID NO：26、SEQ ID NO：28、SEQ ID NO：29或SEQ IDNO：30的氨基酸序列的多肽。

19.权利要求18所述的组合物，其中该组合物是清洁组合物。

20.权利要求18所述的组合物，其中该组合物有效用于从衣物除去淀粉性污渍。

21.权利要求18所述的组合物，其中该组合物有效用于从餐具除去淀粉性污渍。

22.权利要求18所述的组合物，其中该组合物有效用于从织物除去淀粉性污渍。

23.用于从表面除去淀粉性污渍的方法，包括

a)在第21位置处的天冬氨酸，

b)在第97位置处的天冬酰胺，和

c)在第128位置处的异亮氨酸；

因而从表面除去淀粉性污渍。

24.权利要求23所述的方法，其中α-淀粉酶是AmyDSM90(SEQ IDNO：1)。

25.权利要求23所述的方法，其中α-淀粉酶是具有第R179位及第G180位残基缺失的AmyDSM90变体(SEQ ID NO：28)。

26.权利要求23所述的方法，其中α-淀粉酶是在M200处具有置换的AmyDSM90变体(SEQ ID NO：29)。

27.权利要求23所述的方法，其中α-淀粉酶是具有第R179位及第G180位残基缺失和M200处置换的AmyDSM90变体(SEQ ID NO：30)。

28.用于从表面除去淀粉性污渍的方法，包括

在含水组合物存在下孵育该表面，所述的含水组合物包含有效量的具有SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5、SEQ ID

NO：6、SEQ ID NO：23、SEQ ID NO：24、SEQ ID NO：25、SEQ ID NO：26、SEQ ID NO：28、SEQ ID NO：29或SEQ ID NO：30的氨基酸序列的α-淀粉酶。

29.权利要求23-28任一项所述的方法，其中表面是织物表面。

30.权利要求23-28任一项所述的方法，其中表面是在餐具上。

31.权利要求23-28任一项所述的方法，其中表面是衣物表面。

32.用于表达α-淀粉酶的方法，包括：

表达α-淀粉酶为分泌性多肽至宿主细胞培养基中；和

从宿主细胞生长培养基回收分泌的α-淀粉酶；

因而分离作为分泌性多肽的α-淀粉酶。

33.权利要求32所述的方法，其中信号序列是天然信号序列。

34.权利要求32所述的方法，其中信号序列是来自芽孢杆菌属(Bacillus)AmyE或AprE或者链霉菌属(Streptomyces)CelA。