CN103492551A - 用于生产c4-二羧酸的微生物 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及具有碳酸氢根转运蛋白活性的分离的多肽,和编码所述多肽的分离的多核苷酸。本发明亦涉及包含所述多核苷酸的核酸构建体、载体和宿主细胞,以及产生和使用所述多肽的方法,和产生C4-二羧酸如苹果酸的方法。
Description
对相关申请的交叉引用
本申请要求2011年2月28日提交的美国临时申请号61/447,286的优先权,其通过全文提述并入本文。
涉及序列表
本申请包含计算机可读形式的序列表,其通过提述并入本文。
发明背景
技术领域
本发明涉及用于C4-二羧酸(例如苹果酸)的重组生产的方法。
背景技术
有机酸在多种工业中具有悠久历史的商业使用。举例而言,有机酸用于食品和饲料工业(柠檬酸、抗坏血酸、乳酸、乙酸和葡糖酸),作为用于产生多种聚合物的单体(己二酸、乳酸、丙烯酸和衣康酸),作为金属螯合剂(葡糖酸)和作为“绿色”溶剂(乙酸)(Sauer等,2008,Trends in Biotechnology26:100-108)。有机酸可以自身是商业产品,也可以是用于制造其他化学品的化学构件(building block)。除了专门用途之外,长久以来公认C4-二羧酸亦可充当构件化合物以供产生大量的工业化学品,如1,4-丁二醇,四氢呋喃和γ-丁内酯。由于石油衍生构件的高成本,通过传统石油化学途径产生这些大体积工业化学品的成本显著增加。
有机酸在产业上可通过从石油衍生原料的化学合成(例如,延胡索酸、苹果酸、丙烯酸和己二酸)或通过微生物发酵(例如柠檬酸、乳酸、葡糖酸和衣康酸)产生。一些有机酸如延胡索酸和苹果酸亦可通过微生物发酵来产生,但由于更低的生产成本,目前在商业上仍通过化学合成从石油化学原料产生。然而,石油衍生构件化学品的成本的日益升高,地缘政治的不稳定性对原油价格的影响,以及对实施利用来源于可再生资源的原料的制造工艺的期望,再次激发了人们通过微生物发酵产生有机酸和其他化学品的兴趣。
虽然现在C4-二羧酸如苹果酸通过化学合成从石油化学来源来工业生产,其亦可通过微生物发酵生产。苹果酸已在基因工程改造的酵母(酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae))(Zelle等,2008,Appl.Environ.Microbiol.74:2766-2777)和天然存在的丝状真菌如曲霉属菌种(Aspergillus spp.)(美国专利号3,063,910;Bercovitz等,1990,Appl.Environ.Microbiol.56:1594-1597)中获得了高水平生产。Abe等(美国专利号3,063,910)和Bercovitz等(1990,Appl.Environ.Microbiol.56:1594-1597)报道了在几种曲霉属菌种中高水平的苹果酸生产。而且,Battat等(1991,Biotechnol.Bioengineering,37:1108-1116)报道了在优化条件下在搅拌的发酵罐中由黄曲霉(Aspergillus flavus)产生了高至113g/L的苹果酸。在WO2010/003728中描述了在酵母中通过微生物发酵产生二羧酸。亦在WO2009/011974,WO2009/155382和WO2010/111344中描述了通过微生物发酵产生苹果酸。通过遗传工程C4-二羧酸如苹果酸的产生的改善可使得能够通过发酵经济地商业性生产苹果酸。
在宿主如曲霉属菌种(Aspergillus spp.)中的苹果酸过量产生在特定的培养条件(有氧条件和高C:N比;碳酸钙亦可作为中和剂和作为用于苹果酸生物合成的CO2源添加)下发生。在这些条件下,通过胞质溶胶中发生的还原性三羧酸(TCA)循环的溢出代谢(overflow metabolism)导致的苹果酸生物合成和培养基分泌量增加。已报道了酿酒酵母中通过使用遗传工程增加丙酮酸羧化酶(Bauer等,1999,FEMS Microbiol Lett.179:107-113)或苹果酸脱氢酶(Pines等,1997,Appl.Microbiol.Biotechnol.48:248-255)的水平和增加苹果酸转运蛋白的表达(Zelle等,2008,见上)可增加苹果酸产生。基于生物化学证据,提出了在黄曲霉菌株ATCC13697中,苹果酸脱氢酶活性限制苹果酸产生(Peleg等,1988,Appl.Microbiol.Biotechnol.28:69-75)。2010年8月27日提交、标题为“Methods for ImprovingMalic Acid Production in Filamentous Fungi”的美国申请第12/870,523号(其内容通过提述以其整体并入本文)和2010年6月21日提交、标题为“PolypeptidesHaving C4-dicarboxylic acid Transporter Activity and Polynucleotides EncodingSame”的美国临时申请第61/356,868号(其通过全文提述并入本文)描述了C4-二羧酸生产。
在本领域中,作为使用重组DNA技术的遗传工程改造的结果而改善C4-二羧酸产生如苹果酸产生会是有益的。本发明提供了用于改善C4-二羧酸产生(例如苹果酸产生)的方法等。
发明内容
本发明涉及包含碳酸氢根转运蛋白活性的重组宿主细胞,其中所述宿主细胞产生(或能够产生)增加量的C4-二羧酸(例如苹果酸)。在一个方面,所述重组宿主细胞包含编码碳酸氢根转运蛋白(例如硫酸根-碳酸氢根转运蛋白)的异源多核苷酸,其中所述宿主细胞与不含所述异源核苷酸的宿主细胞相比,当在相同条件下培养时,产生(或能够产生)和/或分泌(或能够分泌)更大量的C4-二羧酸(例如苹果酸)。在一些方面,所述宿主细胞还包含编码C4-二羧酸转运蛋白的异源多核苷酸,编码苹果酸脱氢酶的异源多核苷酸,和/或编码丙酮酸羧化酶的异源多核苷酸。在一些方面,所述宿主细胞是丝状真菌宿主细胞,如米曲霉(Aspergillus oryzae)宿主细胞。
本发明亦涉及使用重组宿主细胞用于产生C4-二羧酸的方法。在一个方面,本发明涉及产生C4-二羧酸(例如苹果酸)的方法,其包括:(a)在合适的条件下在培养基中培养具有碳酸氢根转运蛋白活性的重组宿主细胞(例如丝状真菌宿主细胞)以产生C4-二羧酸;和(b)回收所述C4-二羧酸。在一些方面,所述重组宿主细胞包含编码碳酸氢根转运蛋白(例如硫酸根-碳酸氢根转运蛋白)。在另一个方面,本发明涉及产生C4-二羧酸(例如苹果酸)的方法,其包括:(a)将本文中所述的编码碳酸氢根转运蛋白的异源多核苷酸转化入宿主细胞(例如丝状真菌宿主细胞);(b)在合适的条件下在培养基中培养转化的生物以产生C4-二羧酸;和(c)回收所述C4-二羧酸。在所述方法的一些方面,所述重组宿主细胞进一步包含编码C4-二羧酸转运蛋白的异源多核苷酸,编码苹果酸脱氢酶的异源多核苷酸,和/或编码丙酮酸羧化酶的异源多核苷酸。
附图说明
图1显示pShTh60的限制图谱。
图2显示pAmFs69的限制图谱。
图3A和3B显示米曲霉NRRL3488碳酸氢根转运蛋白基因(bt1)的基因组核苷酸构建体序列和推导的氨基酸序列(分别为SEQ ID NO:1和2)。
图4A和4B显示米曲霉NRRL3488碳酸氢根转运蛋白基因(bt2)的基因组核苷酸构建体序列和推导的氨基酸序列(分别为SEQ ID NO:3和4)。
图5显示pSaMF36的限制图谱。
图6显示棘孢曲霉(Aspergillus aculeatus)C4-二羧酸转运蛋白基因(c4t521)的基因组DNA序列和推导的氨基酸序列(分别为SEQ ID NO:5和6)。
图7显示米曲霉NRRL3488苹果酸脱氢酶基因(mdh3)的基因组DNA序列和推导的氨基酸序列(分别为SEQ ID NO:7和8)。
图8显示pSaMF21的限制图谱。
图9A和9B一同显示米曲霉NRRL3488丙酮酸羧化酶基因(pyc)的基因组DNA序列和推导的氨基酸序列(分别为SEQ ID NO:9和10)。
图10显示pRYAN1的限制图谱。
图11显示pShTh77的限制图谱。
图12显示pShTh147的限制图谱。
定义
碳酸氢根转运蛋白:术语“碳酸氢根转运蛋白”(bicarbonate tranporters)在本文中定义为能够协助HCO3 -跨生物膜(如细胞膜和/或细胞器的膜)进行转运的蛋白,如膜整合蛋白(membrane integrated protein)。碳酸氢根转运蛋白的非限定性类型包括阴离子交换蛋白(anion exchanger,AE)家族的Cl-/HCO3 -交换蛋白,NBC家族的Na+/HCO3 -共转运蛋白,和Na+-依存性Cl-/HCO3 -交换蛋白。在本文中所述的一些方面,所述碳酸氢根转运蛋白是硫酸根-碳酸氢根转运蛋白,其中所述转运蛋白能够协助HCO3 -和SO4 2-阴离子二者跨生物膜的转运。碳酸氢根交换活性可如本领域技术中所述来确定,例如如Sterling等,2002,Am J Physiol CellPhysiol283:C1522-1529中所述确定。
所述碳酸氢根转运蛋白具有SEQ ID NO:2或4的成熟多肽编码序列的碳酸氢根转运活性的至少20%,例如至少40%,至少50%,至少60%,至少70%,至少80%,至少85%,至少90%,至少91%,至少92%,至少93%,至少94%,至少95%,至少96%,至少97%,至少98%,至少99%,或至少100%。
C4-二羧酸转运蛋白:术语“C4-二羧酸转运蛋白”在本文中定义为可将苹果酸、琥珀酸、草酰乙酸、丙二酸和/或延胡索酸转运至细胞外的二羧酸通透酶(Grobler等,1995,Yeast11:1485-1491;Camarasa等,2001,Applied andEnvironmental Microbiology67:4144-4151)。用于预测线粒体输入的蛋白及其靶向序列的计算方法由Claros和Vincens,1996,Eur.J.Biochem.241:779-786描述。
所述C4-二羧酸转运蛋白具有SEQ ID NO:6的成熟多肽序列的C4-二羧酸转运蛋白活性(例如苹果酸转运蛋白活性)的至少20%,例如至少40%,至少50%,至少60%,至少70%,至少80%,至少85%,至少90%,至少91%,至少92%,至少93%,至少94%,至少95%,至少96%,至少97%,至少98%,至少99%,或至少100%。
苹果酸脱氢酶:术语“苹果酸脱氢酶”在本文中定义为在NADH+H+的存在下催化将草酰乙酸还原为苹果酸和NAD+的苹果酸:NAD+氧还酶(EC1.1.1.37)。就本发明而言,根据下述步骤确定苹果酸脱氢酶活性。测定溶液由1mM草酰乙酸,100mM Tris pH8.0,10mM NaHCO3,5mM MgCl2,和0.1mM NADH(Sigma Chemical Co.,St.Louis,MO,USA)组成。将不含草酰乙酸作为底物的测定溶液作为对照运行以测量背景NADH降解率。用双蒸水制备每种上清的1/100,1/500,1/2500和1/12500的稀释。将测定溶液的270μl的等分试样分配入96孔聚苯乙烯平底板。添加每种稀释的上清的30μl样品以起始测定。使用340PC读板器(Molecular Devices,Sunnyvale,CA,USA)以下述设定监测反应:340nm,动力学读取(kinetic reading)。使用NADH的浓度系列以构建标准曲线,并使用纯化的苹果酸脱氢酶(Sigma Chemical Co.,St.Louis,MO,USA)的稀释系列作为阳性对照。一个单位的苹果酸脱氢酶活性等于能够在pH8.0,25℃每分钟将1微摩尔草酰乙酸和NADH+H+转化为苹果酸和NAD+的酶量。
所述苹果酸脱氢酶具有SEQ ID NO:8的成熟多肽序列的苹果酸脱氢酶活性的至少20%,例如至少40%,至少50%,至少60%,至少70%,至少80%,至少85%,至少90%,至少91%,至少92%,至少93%,至少94%,至少95%,至少96%,至少97%,至少98%,至少99%,或至少100%。
丙酮酸羧化酶:术语“丙酮酸羧化酶”在本文中定义为在ATP和HCO3 -存在下催化将丙酮酸羧化为草酰乙酸、ADP和磷酸的丙酮酸:二氧化碳连接酶(形成ADP的)(EC6.4.1.1)。就本发明而言,根据针对丙酮酸羧化酶的质量控制测试方法(Sigma Chemical Co.,St.Louis,MO,USA)的步骤确定丙酮酸羧化酶活性,只是该测定使用pH8.0的Tris缓冲液。一个单位的丙酮酸羧化酶活性等于能够在pH7.8,30℃每分钟将1微摩尔的丙酮酸和CO2转化为草酰乙酸的酶量。
所述丙酮酸羧化酶具有SEQ ID NO:10的成熟多肽序列的丙酮酸羧化酶活性的至少20%,例如至少40%,至少50%,至少60%,至少70%,至少80%,至少85%,至少90%,至少91%,至少92%,至少93%,至少94%,至少95%,至少96%,至少97%,至少98%,至少99%,或至少100%。
异源多核苷酸:术语“异源多核苷酸”在本文中定义为对于宿主细胞并非天然的多核苷酸;其中已对编码区进行结构修饰的天然多核苷酸;作为通过重组DNA技术(例如,不同的(外源)启动子)操纵DNA的结果其表达定量改变的天然多核苷酸;或其表达通过将一个或多个(几个)额外拷贝的多核苷酸导入宿主细胞而定量改变的天然多核苷酸。
分离的/纯化的:术语“分离的”和“纯化的”意指从至少一种与其天然结合(associated)的成分分离的多肽或多核苷酸。举例而言,如通过SDS-PAGE确定的,该多肽可为至少1%纯,例如至少5%纯,至少10%纯,至少20%纯,至少40%纯,至少60%纯,至少80%纯,至少90%纯,至少93%纯,至少95%纯,至少97%纯,至少98%纯,或至少99%纯;且如通过琼脂糖电泳确定的,该多核苷酸可为至少1%纯,例如至少5%纯,至少10%纯,至少20%纯,至少40%纯,至少60%纯,至少80%纯,至少90%纯,至少93%纯,至少95%纯,至少97%纯,至少98%纯,或至少99%纯。
编码序列:术语“编码序列”的意思是指定其蛋白产物的氨基酸序列的多核苷酸序列。编码序列的边界通常由开读框确定,所述开读框通常以ATG起始密码子或可供选择的起始密码子如GTG和TTG开始,并且以终止密码子如TAA、TAG和TGA结束。编码序列可以是基因组DNA、cDNA、合成多核苷酸和/或重组多核苷酸。
cDNA序列:术语“cDNA序列”意指从得自真核细胞的成熟的、已剪接的mRNA分子在反转录之后所得的DNA。来自基因组DNA起始的(initial)、初级的RNA转录物是mRNA的前体,其通过一系列包括剪接的步骤加工然后作为成熟的已剪接的mRNA出现。cDNA序列缺乏可存在于相应基因组DNA序列中的***的内含子。相应地,短语“SEQ ID NO:X的cDNA序列”意指将SEQ IDNO:X中***的内含子序列(若存在)去除之后所得的序列。在一些情况下—当参照的基因组DNA序列缺乏***的内含子序列时—cDNA序列可与相应的基因组DNA序列完全相同。
基因组DNA序列:术语“基因组DNA序列”意指见于来源生物的基因组(例如真核或原核基因组)的DNA序列。在一些情况下,来自真核基因组的基因组DNA序列含有一个或多个***的内含子序列,其作为RNA剪接的结果从初级RNA转录物去除。相应地,短语“SEQ ID NO:Y的基因组DNA序列”意指来自来源生物的相应DNA序列,其含有在RNA剪接之前存在的***的内含子序列(若存在)。
成熟多肽序列:术语“成熟多肽序列”意指参照的多核苷酸序列在任何翻译后序列修饰(如N端加工和/或C端截短)之后的部分。在一些情况下,所述成熟多肽序列可以与整个参照的多肽序列完全相同。在一个方面,基于预测缺乏信号肽的SignalP程序(Nielsen等,1997,Protein Engineering10:1-6)和InterProScan程序(The European Bioinformatics Institute),所述成熟多肽编码序列是SEQ ID NO:2的核苷酸1至770。在另一个方面,基于预测缺乏信号肽的SignalP程序和InterProScan程序,所述成熟多肽编码序列是SEQ ID NO:4的核苷酸1至843。本领域中已知宿主细胞可产生由相同多核苷酸表达的两种或更多种不同成熟多肽序列(即具有不同的C末端和/或N末端氨基酸)的混合物。
成熟多肽编码序列:术语“成熟多肽编码序列”意指参照的多核苷酸序列(例如基因组或cDNA序列)编码成熟多肽序列的部分。在一些情况下,所述成熟多肽编码序列可以与整个参照的多核苷酸序列完全相同。在一个方面,基于预测缺乏信号肽的SignalP程序(Nielsen等,1997,见上)和InterProScan程序(见上),所述成熟多肽编码序列是SEQ ID NO:1的核苷酸1至2503。在另一个方面,基于预测缺乏信号肽的SignalP程序和InterProScan程序,所述成熟多肽编码序列是SEQ ID NO:3的核苷酸1至2657。
片段:术语“片段”意指从参照的多肽序列的氨基和/或羧基末端缺失了一个或多个(几个)氨基酸的多肽。在一个方面,所述片段具有碳酸氢根转运蛋白活性。在另一个方面,片段包含SEQ ID NO:2的至少650个氨基酸残基,例如至少690个氨基酸残基或至少730个氨基酸残基。在另一个方面,片段包含SEQ ID NO:4的至少720个氨基酸残基,例如至少760个氨基酸残基或至少800个氨基酸残基。
亚序列:术语“亚序列(subsequence)”意指从参照的核苷酸序列的5'和/或3'端缺失了一个或多个(几个)核苷酸的多核苷酸。在一个方面,所述亚序列编码具有碳酸氢根转运蛋白活性的片段。在另一个方面,亚序列包含SEQ ID NO:1的至少1950个核苷酸,例如至少2070个核苷酸或至少2190个核苷酸。在另一个方面,亚序列包含SEQ ID NO:3的至少2160个核苷酸,例如至少2280个核苷酸或至少2400个核苷酸。
等位变体(allelic variant):术语“等位变体”意指占据相同染色体基因座的基因的两种以上可选形式中的任何种。等位变异通过突变天然地发生,并且可导致种群内的多态性。基因突变可以是沉默的(在编码的多肽中无变化)或可以编码具有改变的氨基酸序列的多肽。多肽的等位变体是由基因的等位变体编码的多肽。
序列同一性:两个氨基酸序列间或两个核苷酸序列间的相关性由参数“序列同一性”所描述。
就本发明而言,两个氨基酸序列之间的序列同一性程度是使用如EMBOSS软件包(EMBOSS:欧洲分子生物学开放软件套组(The European MolecularBiology Open Software Suite),Rice等,2000,Trends Genet.16:276-277)的Needle程序(优选为3.0.0版或之后的版本)中执行的Needleman-Wunsch算法(Needleman和Wunsch,1970,J.Mol.Biol.48:443-453)确定的。所用的可选参数为缺口开放罚分(gap open penalty)10,缺口延伸罚分(gap extension penalty)0.5,和EBLOSUM62(BLOSUM62的EMBOSS版)取代矩阵。使用标记为“最长同一性”的Needle输出(使用“-nobrief”选项获得)作为百分比同一性并如下计算:
(相同的残基×100)/(比对长度-比对中缺口总数)
就本发明而言,两个脱氧核糖核苷酸序列之间的序列同一性程度是使用如EMBOSS软件包(EMBOSS:欧洲分子生物学开放软件套组(The EuropeanMolecular Biology Open Software Suite),Rice等,2000,见上)的Needle程序(优选为3.0.0版或之后的版本)中执行的Needleman-Wunsch算法(Needleman和Wunsch,1970,见上)确定的。所用的可选参数为缺口开放罚分10,缺口延伸罚分0.5,和EDNAFULL(NCBI NUC4.4的EMBOSS版)取代矩阵。使用标记为”最长同一性”的Needle输出(使用-nobrief选项获得)作为百分比同一性并如下计算:
(相同的脱氧核糖核苷酸×100)/(比对长度-比对中缺口总数)。
表达:术语“表达”包括涉及多肽产生的任何步骤,其包括但不限于转录、转录后修饰、翻译、翻译后修饰和分泌。
核酸构建体:术语“核酸构建体”意指单链或双链的核酸分子,其分离自天然存在的基因,或经修饰以本来不存在于(not otherwise exist)自然界中的方式含有核酸的区段,或为合成的,其中所述核酸分子包含一个或多个(几个)调控序列。
调控序列(control sequence):术语“调控序列”意指对于多肽表达必需的核酸序列。调控序列对于编码所述多肽的多核苷酸可以是天然的或外源的,以及对于彼此可以是天然的或外源的。这些调控序列包括但不限于前导序列、聚腺苷酸化序列、前肽序列、启动子序列、信号肽序列和转录终止子序列。调控序列可以和用于引入特异性限制位点的接头一起提供,所述特异性限制位点促进调控序列与编码多肽的多核苷酸编码区的连接。
可操作地连接:术语“可操作地连接”意指这样的构型,其中将调控序列置于相对于多核苷酸的编码序列的适当位置,使得调控序列指导编码序列的表达。
表达载体:术语“表达载体”意指线性的或环状的DNA分子,其包含编码多肽的多核苷酸,并与调控序列可操作地连接,其中所述调控序列提供编码所述多肽的多核苷酸的表达。最少的情况,所述表达载体包含启动子序列,和转录和翻译终止信号序列。
宿主细胞:术语“宿主细胞”意指任何对于用包含本发明的多核苷酸(例如编码碳酸氢根转运蛋白的多核苷酸)的核酸构建体或表达载体的转化、转染、转导等是易感(susceptible)的细胞类型。术语“宿主细胞”涵盖亲本细胞的任何由于在复制过程中发生的突变而不同于亲本细胞的后代。
变体:术语“变体”意指在一个或多个(几个)位置包含变化即取代、***和/或缺失一个或多个(几个)氨基酸残基的,具有活性例如碳酸氢根转运蛋白活性的多肽。取代意指将占据某位置的氨基酸用不同氨基酸替换;缺失意指去除占据某位置的氨基酸;而***意指在占据某位置的氨基酸的相邻处添加一个或多个(几个),例如1-3个氨基酸。
体积生产力(volumetric productivity):术语“体积生产力”指每单位时间每体积(例如,培养基及其中内含物的总体积)使用的***所产生的参照的产物的量(例如,产生的C4-二羧酸的量)。
发酵培养基:术语“发酵培养基”指包含一种或多种(几种)糖如葡萄糖、果糖、蔗糖、纤维二糖、木糖、木酮糖、***糖、甘露糖、半乳糖和/或可溶性寡糖的培养基,其中所述培养基能够部分地通过宿主细胞转化(发酵)为所需产物,如C4-二羧酸。在一些情况下,所述发酵培养基源自天然来源,如甘蔗,淀粉,或纤维素,并可为通过酶水解(糖化)而预处理所述来源的结果。
在本文中,提及“约”某值或参数包括了涉及该值或参数本身的方面。举例而言,提及“约X”的描述包括了“X”的方面。
如用于本文中和所附权利要求中,除非上下文明确地表示相反,单数形式“一(个/种...)(a)”或“所述/该(the)”包括了对复数的提及。应理解本文中所述的发明的各方面包括了“由...组成(consisting)”和/或“基本上由...组成(consisting essentially of)”的方面。
除非另行定义或上下文明确指出,本文中使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属领域的一般技术人员通常理解的相同的含意。
发明详述
本发明描述了特定基因在宿主细胞如丝状真菌(例如曲霉属(Aspergillus))中的过量表达以增强C4-二羧酸(例如苹果酸)的产生等。本发明涵盖使用异源基因以供表达碳酸氢根转运蛋白。所述碳酸氢根转运蛋白可为任何适于实践本发明的、描述的碳酸氢根转运蛋白。在一个方面,所述碳酸氢根转运蛋白是在培养条件下过表达,以高效价产生碳酸氢根的转运蛋白。在一个方面,所述碳酸氢根转运蛋白是硫酸根-碳酸氢根转运蛋白。所述重组宿主细胞可进一步包含编码C4-二羧酸的异源多核苷酸,编码苹果酸脱氢酶的异源多核苷酸和/或编码丙酮酸羧化酶的异源多核苷酸。
碳酸氢根转运蛋白和编码碳酸氢根转运蛋白的多核苷酸
在本文所述的重组宿主细胞和方法的一个方面,所述碳酸氢根转运蛋白选自下组:(a)碳酸氢根转运蛋白,其与SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:4或其成熟多肽序列具有至少60%序列同一性;(b)碳酸氢根转运蛋白,其由多核苷酸编码,所述多核苷酸在低严格条件下与以下杂交:(i)SEQ ID NO:1或3,或其成熟多肽编码序列,(ii)SEQ ID NO:1或3的cDNA序列,或其成熟多肽编码序列,(iii)(i)或(ii)的全长互补链;(c)碳酸氢根转运蛋白,其由多核苷酸编码,所述多核苷酸与(iv)SEQ ID NO:1或3,或其成熟多肽编码序列,(v)SEQID NO:1或3的cDNA序列,或其成熟多肽编码序列,(vi)(iv)或(v)的全长互补链具有至少60%序列同一性;(d)SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:4或其成熟多肽序列的包含一个或多个(几个)氨基酸的取代、缺失和/或***的碳酸氢根转运蛋白变体;和(e)(a)、(b)、(c)或(d)的多肽具有碳酸氢根转运蛋白活性的片段。
在一个方面,所述碳酸氢根转运蛋白包含或组成为氨基酸序列,所述氨基酸序列与SEQ ID NO:2或4,或其成熟多肽序列具有至少60%,例如至少65%,至少70%,至少75%,至少80%,至少85%,至少90%,至少91%,至少92%,至少93%,至少94%,至少95%,至少96%,至少97%,至少98%,至少99%,或100%序列同一性。在一个方面,所述碳酸氢根转运蛋白包含氨基酸序列,所述氨基酸序列与SEQ ID NO:2或4,或其成熟多肽序列相差不多于十个氨基酸,例如不多于五个氨基酸,不多于四个氨基酸,不多于三个氨基酸,不多于两个氨基酸,或一个氨基酸。
在一个方面,所述碳酸氢根转运蛋白包含或组成为这样的氨基酸序列,所述氨基酸序列与SEQ ID NO:2或其成熟多肽序列具有至少60%,例如至少65%,至少70%,至少75%,至少80%,至少85%,至少90%,至少91%,至少92%,至少93%,至少94%,至少95%,至少96%,至少97%,至少98%,至少99%,或100%序列同一性。在一个方面,所述碳酸氢根转运蛋白包含这样的氨基酸序列,所述氨基酸序列与SEQ ID NO:2或其成熟多肽序列相差不多于十个氨基酸,例如不多于五个氨基酸,不多于四个氨基酸,不多于三个氨基酸,不多于两个氨基酸,或一个氨基酸。在另一个方面,所述碳酸氢根转运蛋白包含氨基酸序列,所述氨基酸序列与SEQ ID NO:4或其成熟多肽序列具有至少60%,例如至少65%,至少70%,至少75%,至少80%,至少85%,至少90%,至少91%,至少92%,至少93%,至少94%,至少95%,至少96%,至少97%,至少98%,至少99%,或100%序列同一性。在另一个方面,所述碳酸氢根转运蛋白包含这样的氨基酸序列,所述氨基酸序列与SEQ ID NO:4或其成熟多肽序列相差不多于十个氨基酸,例如不多于五个氨基酸,不多于四个氨基酸,不多于三个氨基酸,不多于两个氨基酸,或一个氨基酸。
在一个方面,所述碳酸氢根转运蛋白包含或组成为SEQ ID NO:2的氨基酸序列,SEQ ID NO:2的成熟多肽序列,其等位变体,或前述序列的具有C4-二羧酸转运蛋白活性的序列。在另一个方面,所述碳酸氢根转运蛋白包含或组成为SEQ ID NO:2的氨基酸序列。在另一个方面,所述碳酸氢根转运蛋白包含或组成为SEQ ID NO:2的成熟多肽序列。在另一个方面,所述碳酸氢根转运蛋白包含或组成为SEQ ID NO:2的氨基酸1至770。
在一个方面,所述碳酸氢根转运蛋白包含或组成为SEQ ID NO:4的氨基酸序列,SEQ ID NO:4的成熟多肽序列,其等位变体,或前述序列的具有碳酸氢根转运蛋白活性的序列。在另一个方面,所述碳酸氢根转运蛋白包含或组成为SEQ ID NO:4的氨基酸序列。在另一个方面,所述碳酸氢根转运蛋白包含或组成为SEQ ID NO:4的成熟多肽序列。在另一个方面,所述碳酸氢根转运蛋白包含或组成为SEQ ID NO:4的氨基酸1至843。
在一个方面,所述碳酸氢根转运蛋白由多核苷酸编码,所述多核苷酸在至少低严格条件,例如中等严格条件,中等-高严格条件,高严格条件,或非常高严格条件与以下杂交:(i)SEQ ID NO:1或3,或其成熟多肽编码序列,(ii)SEQID NO:1或3的cDNA序列,或其成熟多肽编码序列,(iii)(i)或(ii)的全长互补链(参见,例如J.Sambrook,E.F.Fritsch和T.Maniatus,1989,Molecular Cloning,A Laboratory Manual,第2版,Cold Spring Harbor,New York)。
在一个方面,所述碳酸氢根转运蛋白由多核苷酸编码,所述多核苷酸在至少低严格条件,例如中等严格条件,中等-高严格条件,高严格条件,或非常高严格条件与以下杂交:(i)SEQ ID NO:1,或其成熟多肽编码序列,(ii)SEQID NO:1的cDNA序列,或其成熟多肽编码序列,(iii)(i)或(ii)的全长互补链。在另一个方面,所述碳酸氢根转运蛋白由多核苷酸编码,所述多核苷酸在至少低严格条件,例如中等严格条件,中等-高严格条件,高严格条件,或非常高严格条件与以下杂交:(i)SEQ ID NO:3,或其成熟多肽编码序列,(ii)SEQID NO:3的cDNA序列,或其成熟多肽编码序列,(iii)(i)或(ii)的全长互补链。
在一个方面,所述碳酸氢根转运蛋白由多核苷酸编码,所述多核苷酸与(iv)SEQ ID NO:1或3,或其成熟多肽编码序列,(v)SEQ ID NO:1或3的cDNA序列,或其成熟多肽编码序列,(vi)(iv)或(v)的全长互补链具有至少65%,例如至少70%,至少75%,至少80%,至少85%,至少85%,至少90%,至少91%,至少92%,至少93%,至少94%,至少95%,至少96%,至少97%,至少98%,至少99%,或100%序列同一性。
在一个方面,所述碳酸氢根转运蛋白由多核苷酸编码,所述多核苷酸与(iv)SEQ ID NO:1,或其成熟多肽编码序列,(v)SEQ ID NO:1的cDNA序列,或其成熟多肽编码序列,(vi)(iv)或(v)的全长互补链具有至少65%,例如至少70%,至少75%,至少80%,至少85%,至少85%,至少90%,至少91%,至少92%,至少93%,至少94%,至少95%,至少96%,至少97%,至少98%,至少99%,或100%序列同一性。
在一个方面,所述碳酸氢根转运蛋白由多核苷酸编码,所述多核苷酸与(iv)SEQ ID NO:3,或其成熟多肽编码序列,(v)SEQ ID NO:3的cDNA序列,或其成熟多肽编码序列,(vi)(iv)或(v)的全长互补链具有至少65%,例如至少70%,至少75%,至少80%,至少85%,至少85%,至少90%,至少91%,至少92%,至少93%,至少94%,至少95%,至少96%,至少97%,至少98%,至少99%,或100%序列同一性。
在一个方面,所述碳酸氢根转运蛋白由SEQ ID NO:1或3,或其成熟多肽编码序列编码。在一个方面,所述碳酸氢根转运蛋白由SEQ ID NO:1或其成熟多肽编码序列编码。在一个方面,所述碳酸氢根转运蛋白由SEQ ID NO:1编码。在一个方面,所述碳酸氢根转运蛋白由SEQ ID NO:3或其成熟多肽编码序列编码。在一个方面,所述碳酸氢根转运蛋白由SEQ ID NO:3编码。在一个方面,所述碳酸氢根转运蛋白由SEQ ID NO:1或3的亚序列编码,其中所述亚序列编码具有碳酸氢根转运蛋白活性的多肽。在一个方面,所述碳酸氢根转运蛋白由SEQ ID NO:1的亚序列编码,其中所述亚序列编码具有碳酸氢根转运蛋白活性的多肽。在一个方面,所述碳酸氢根转运蛋白由SEQ IDNO:3的亚序列编码,其中所述亚序列编码具有碳酸氢根转运蛋白活性的多肽。
在一个方面,所述碳酸氢根转运蛋白是SEQ ID NO:2或4或其成熟多肽编码序列的包含一个或多个(几个)氨基酸的取代、缺失和/或***的变体。在一个方面,所述碳酸氢根转运蛋白是SEQ ID NO:2的包含一个或多个(几个)氨基酸的取代、缺失和/或***的变体。在一个方面,所述碳酸氢根转运蛋白是SEQ ID NO:2的成熟多肽的包含一个或多个(几个)氨基酸的取代、缺失和/或***的变体。在一个方面,所述碳酸氢根转运蛋白是SEQ ID NO:4的包含一个或多个(几个)氨基酸的取代、缺失和/或***的变体。在一个方面,所述碳酸氢根转运蛋白是SEQ ID NO:4的成熟多肽的包含一个或多个(几个)氨基酸的取代、缺失和/或***的变体。
优选地,氨基酸改变的性质是较不重要的(of a minor nature),即保守的氨基酸取代或***,其不显著影响蛋白质的折叠和/或活性;通常为1至大约30个氨基酸的小缺失;小的氨基或羧基末端延伸,例如氨基末端甲硫氨酸残基;多至大约20-25个残基的小接头肽;或通过改变净电荷或其它功能来促进纯化的小延伸,如多组氨酸序列(poly histidine tract)、抗原表位(antigenic epitope)或结合域(binding domain)。
保守取代的实例是在以下组之内:碱性氨基酸组(精氨酸、赖氨酸和组氨酸)、酸性氨基酸组(谷氨酸和天冬氨酸)、极性氨基酸组(谷氨酰胺和天冬酰胺)、疏水氨基酸组(亮氨酸、异亮氨酸和缬氨酸)、芳族氨基酸组(苯丙氨酸、色氨酸和酪氨酸)和小氨基酸组(甘氨酸、丙氨酸、丝氨酸、苏氨酸和甲硫氨酸)。通常不改变比活性(specific activity)的氨基酸取代是本领域已知的,并且由例如H.Neurath和R.L.Hill,1979,于The Proteins,Academic Press,New York中描述。最普遍发生的交换是Ala/Ser、Val/Ile、Asp/Glu、Thr/Ser、Ala/Gly、Ala/Thr、Ser/Asn、Ala/Val、Ser/Gly、Tyr/Phe、Ala/Pro、Lys/Arg、Asp/Asn、Leu/Ile、Leu/Val、Ala/Glu和Asp/Gly。
或者,氨基酸改变具有这样的性质:使多肽的物理化学性质改变。例如,氨基酸改变可改善多肽的热稳定性,改变底物特异性,改变最适pH等。
能够根据本领域已知的方法,例如定位诱变或丙氨酸分区诱变法(Cunningham和Wells,1989,Science244:1081-1085)来鉴定亲本多肽中的必需氨基酸。在后一技术中,将单一丙氨酸突变引入到分子中的每个残基,并且测试所得突变分子的碳酸氢根转运蛋白活性以鉴定对于所述分子的活性关键的氨基酸残基。同样参见Hilton等,1996,J.Biol.Chem.271:4699-4708。酶的活性部位或其它的生物相互作用也能够通过结构的物理分析而测定,如通过以下这些技术:如核磁共振、晶体学、电子衍射或光亲和标记,连同推定的接触位点氨基酸的突变来确定。参见例如de Vos等,1992,Science255:306-312;Smith等,1992,J.Mol.Biol.224:899-904;Wlodaver等,1992,FEBSLett.309:59-64。必需氨基酸的身份(identity)也能够从与多肽的同一性分析来推断,所述多肽与参照的亲本多肽相关。
能够使用已知的诱变、重组和/或改组(shuffling)方法接着进行有关的筛选方法,例如那些由Reidhaar-Olson和Sauer,1988,Science241:53-57;Bowie和Sauer,1989,Proc.Natl.Acad.Sci.USA86:2152-2156;WO95/17413;或WO95/22625公开的那些方法来进行并测试单个或多个氨基酸取代、缺失和/或***。能够使用的其它方法包括易错PCR、噬菌体展示(例如,Lowman等,1991,Biochemistry30:10832-10837;美国专利No.5,223,409;WO92/06204)和区域定向的诱变(Derbyshire等,1986,Gene46:145;Ner等,1988,DNA7:127)。
诱变/改组方法能够与高通量、自动化的筛选方法组合以检测由宿主细胞表达的克隆的、诱变的多肽的活性(Ness等,1999,Nature Biotechnology17:893-896)。能够从宿主细胞回收编码活性多肽的诱变的DNA分子,并且使用本领域中的标准方法快速测序。这些方法允许快速确定多肽中单个氨基酸残基的重要性。
在一些方面,SEQ ID NO:2或4,或其成熟多肽序列的氨基酸取代、缺失和/或***的总数不多于10,例如不多于1,2,3,4,5,6,7,8或9。
在另一个方面,所述碳酸氢根转运蛋白是SEQ ID NO:2或4,或其成熟多肽序列的片段,其中所述片段具有碳酸氢根转运蛋白活性。在一个方面,所述碳酸氢根转运蛋白是SEQ ID NO:2或其成熟多肽序列的片段,其中所述片段具有碳酸氢根转运蛋白活性。在一个方面,所述片段含有SEQ ID NO:2的至少650个氨基酸残基,例如优选至少690个氨基酸残基,或至少730个氨基酸残基。在一个方面,所述片段含有碳酸氢根转运蛋白域,例如,SEQ IDNO:2的氨基酸280至556的推定的转运蛋白域。在另一个方面,所述碳酸氢根转运蛋白是SEQ ID NO:4或其成熟多肽序列的片段,其中所述片段具有碳酸氢根转运蛋白活性。在一个方面,所述片段含有SEQ ID NO:4的至少720个氨基酸残基,例如优选至少760个氨基酸残基,或至少800个氨基酸残基。在一个方面,所述片段含有碳酸氢根转运蛋白域,例如,SEQ ID NO:4的氨基酸192至480的推定的转运蛋白域。
所述碳酸氢根转运蛋白可为融合多肽或可切割的融合多肽,其中另一种多肽融合于本发明多肽的N端或C端。通过将编码另一个多肽的多核苷酸融合于本发明的多核苷酸来产生融合的多肽。产生融合多肽的技术是本领域已知的,并包括连接编码多肽的编码序列以使它们在阅读框中,并且使融合多肽的表达在相同启动子和终止子的调控下。融合蛋白亦可使用内蛋白(intein)技术构建,其中融合物在翻译后产生(Cooper等,1993,EMBO J.12:2575-2583;Dawson等,1994,Science266:776-779)。
融合多肽还可以包含在两个多肽之间的切割位点。一旦分泌了融合多肽,就切割所述位点,释放所述两个多肽。切割位点的实例包括,但不限于,公开于Martin等,2003,J.Ind.Microbiol.Biotechnol.3:568-76;Svetina等,2000,J.Biotechnol.76:245-251;Rasmussen-Wilson等,1997,Appl.Environ.Microbiol.63:3488-3493;Ward等,1995,Biotechnology13:498-503;和Contreras等,1991,Biotechnology9:378-381;Eaton等,1986,Biochem.25:505-512);Collins-Racie等,1995,Biotechnology13:982-987;Carter等,1989,Proteins:Structure,Function,andGenetics6:240-248;以及Stevens,2003,Drug Discovery World4:35-48中的位点。
用于分离或克隆编码用于本文中提及的任何方面的多核苷酸—例如编码碳酸氢根转运蛋白的多核苷酸—以及其它多核苷酸的技术是本领域内已知的,包括从基因组DNA分离,从cDNA制备,或其组合。可通过例如使用熟知的聚合酶链式反应(PCR)或表达文库的抗体筛选来检测具有共有结构特性的克隆DNA片段,从而实现从这种基因组DNA克隆多核苷酸。参见,例如,Innis等,1990,PCR:A Guide to Methods and Application,Academic Press,New York。可以使用其它核酸扩增方法,如连接酶链式反应(LCR)、连接活化转录(ligatedactivated transcription;LAT)和基于核苷酸序列的扩增(NASBA)。可以从曲霉属(Aspergillus)菌株,或其他或相关生物体克隆所述多核苷酸,并且因此可为例如核苷酸序列的多肽编码区的等位基因变体或种间变体(species variant)。
SEQ ID NO:1或3的多核苷酸,或亚序列,以及SEQ ID NO:2或4的氨基酸序列,或其片段,可用于设计核酸探针,以根据本领域内公知的方法从不同属或种的菌株鉴定和克隆编码碳酸氢根转运蛋白的DNA。具体而言,根据标准的Southern印迹方法,可将这些探针用于与感兴趣的属或种的基因组DNA或cDNA杂交,以鉴定和分离其中相应的基因。这些探针可明显短于完整序列,例如长度上为至少14个核苷酸,至少25个核苷酸,至少35个核苷酸,或至少70个核苷酸。所述核酸探针可以更长,例如至少100个核苷酸,至少200个核苷酸,至少300个核苷酸,至少400个核苷酸,或至少500个核苷酸的长度,可使用甚至更长的探针,如至少600个核苷酸,例如至少700个核苷酸,至少800个核苷酸,或至少900个核苷酸的长度。DNA和RNA探针二者均可使用。通常将探针标记以供检测相应的基因(例如,用32P、3H、35S、生物素或抗生物素蛋白(avidin)标记)。这些探针涵盖于本发明中。
可从由这些其它菌株制备的基因组DNA或cDNA文库中筛选与上述探针杂交并且编码具有碳酸氢根转运蛋白活性的多肽的DNA。可以通过琼脂糖或聚丙烯酰胺凝胶电泳,或通过其它分离技术分离来自这些其它株的基因组或其它DNA。可以将来自文库的DNA或分离的DNA转移至硝化纤维素(nitrocellulose)或其它合适的载体材料并且固定于其上。为了鉴定与SEQ ID NO:1或3的成熟多肽编码序列,或它们的亚序列同源的克隆或DNA,所述载体材料优选用于Sounthern印迹。
就本发明而言,杂交表示多核苷酸在非常低至非常高的严格条件下与标记的核酸探针杂交,所述核酸探针对应于SEQ ID NO:1或3,SEQ ID NO:1或3的成熟多肽编码序列,或其全长互补链;或前述序列的亚序列。可使用例如X射线片(X-ray film)检测在这些条件下与核酸探针杂交的分子。
在一个方面,核酸探针是SEQ ID NO:1或3。在另一个方面,核酸探针是SEQ ID NO:1或3的成熟多肽编码序列。在另一个方面,核酸探针是SEQID NO:1的成熟多肽编码序列。在另一个方面,核酸探针是SEQ ID NO:1。在另一个方面,核酸探针是SEQ ID NO:3的成熟多肽编码序列。在另一个方面,核酸探针是SEQ ID NO:3。在另一个方面,核酸探针是编码SEQ ID NO:2的多肽或其片段的多核苷酸。在另一个方面,核酸探针是编码SEQ ID NO:4的多肽或其片段的多核苷酸。
对于长度至少100个核苷酸的长探针,将非常低至非常高的严格条件定义为在42℃,在5X SSPE、0.3%SDS、200微克/ml已剪切并且变性的鲑精DNA中,并且对于非常低和低严格性为25%的甲酰胺、对于中和中-高严格性为35%的甲酰胺、或对于高和非常高严格性为50%的甲酰胺,根据标准的Southern印迹法进行预杂交和杂交最佳12至24小时。使用2X SSC、0.2%SDS在45℃(非常低严格性),在50℃(低严格性),在55℃(中严格性),在60℃(中-高严格性),在65℃(高严格性),和在70℃(非常高严格性)将载体材料最终洗涤三次,每次15分钟。
对于长度大约15个核苷酸至大约70个核苷酸的短探针,将严格条件定义为在比使用根据Bolton和McCarthy计算法(1962,Proc.Natl.Acad.Sci.USA48:1390)计算的Tm低大约5℃至大约10℃,在0.9M NaCl,0.09M Tris-HCl pH7.6,6mM EDTA,0.5%NP-40,1×Denhardt溶液,1mM焦磷酸钠(sodiumpyrophosphate),1mM磷酸二氢钠(sodium monobasic phosphate),0.1mM ATP和0.2mg每ml的酵母RNA中,根据标准的Southern印迹步骤进行预杂交和杂交最佳12至24小时。将所述载体材料在6×SSC加0.1%SDS中最终洗涤一次15分钟,并用6×SSC在比计算的Tm低5℃至10℃的温度洗涤两次,每次15分钟。
本发明碳酸氢根转运蛋白可以获得自任何属的微生物。如用于本文,与给定的来源有关的术语“获得自”,意思应为由多核苷酸编码的多肽由所述来源产生,或由其中***了来自所述来源的多核苷酸的细胞产生。
所述碳酸氢根转运蛋白可以是细菌碳酸氢根转运蛋白。例如,所述碳酸氢根转运蛋白可以是***多肽例如芽孢杆菌属(Bacillus)、链球菌属(Streptococcus)、链霉菌属(Streptomyces)、葡萄球菌属(Staphylococcus)、肠球菌属(Enterococcus)、乳杆菌属(Lactobacillus)、乳球菌属(Lactococcus)、梭菌属(Clostridium)、地芽孢杆菌属(Geobacillus)或海洋芽孢杆菌属(Oceanobacillus)碳酸氢根转运蛋白;或革兰氏阴性细菌多肽,如大肠杆菌(E.coli)、假单胞菌属(Pseudomonas)、沙门氏菌属(Salmonella)、弯曲杆菌属(Campylobacter)、螺杆菌属(Helicobacter)、黄杆菌属(Flavobacterium)、梭杆菌属(Fusobacterium)、泥杆菌属(Ilyobacter)、奈瑟氏菌属(Neisseria)或脲原体属(Ureaplasma)碳酸氢根转运蛋白。
在一个方面,所述碳酸氢根转运蛋白是嗜碱芽孢杆菌(Bacillus alkalophilus)、解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)、短芽孢杆菌(Bacillus brevis)、环状芽孢杆菌(Bacillus circulans)、克劳氏芽孢杆菌(Bacillus clausii)、凝结芽孢杆菌(Bacillus coagulans)、坚强芽孢杆菌(Bacillus firmus)、灿烂芽孢杆菌(Bacilluslautus)、迟缓芽孢杆菌(Bacillus lentus)、地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)、巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)、短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus)、嗜热脂肪芽孢杆菌(Bacillus stearothermophilus)、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)或苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis)碳酸氢根转运蛋白。
在另一个方面,所述碳酸氢根转运蛋白是似马链球菌(Streptococcusequisimilis)、酿脓链球菌(Streptococcus pyogenes)、***链球菌(Streptococcusuberis)或马链球菌兽瘟亚种(Streptococcus equi subsp.Zooepidemicus)碳酸氢根转运蛋白。
在另一个方面,所述碳酸氢根转运蛋白是不产色链霉菌(Streptomycesachromogenes)、除虫链霉菌(Streptomyces avermitilis)、天蓝链霉菌(Streptomycescoelicolor)、灰色链霉菌(Streptomyces griseus)或浅青紫链霉菌(Streptomyceslividans)碳酸氢根转运蛋白。
所述碳酸氢根转运蛋白可为真菌碳酸氢根转运蛋白。在一个方面,所述真菌碳酸氢根转运蛋白为酵母碳酸氢根转运蛋白,如假丝酵母属(Candida)、克鲁维酵母属(Kluyveromyces)、毕赤酵母属(Pichia)、酵母属(Saccharomyces)、裂殖酵母属(Schizosaccharomyces)或西洋蓍霉属(Yarrowia)碳酸氢根转运蛋白。
在另一个方面,所述碳酸氢根转运蛋白是丝状真菌碳酸氢根转运蛋白,如枝顶孢霉属(Acremonium)、伞菌属(Agaricus)、链格孢属(Alternaria)、曲霉属(Aspergillus)、短梗霉属(Aureobasidium)、Botryospaeria、拟蜡菌属(Ceriporiopsis)、毛喙壳属(Chaetomidium)、金孢子菌属(Chrysosporium)、Claviceps、Cochliobolus、鬼伞属(Coprinopsis)、Coptotermes、棒囊壳属(Corynascus)、隐丛赤壳菌属(Cryphonectria)、隐球菌属(Cryptococcus)、色二孢属(Diplodia)、黑耳属(Exidia)、Filibasidium、镰孢属(Fusarium)、赤霉属(Gibberella)、全鞭毛虫属(Holomastigotoides)、腐质霉属(Humicola)、耙齿菌属(Irpex)、蘑菇属(Lentinula)、Leptospaeria、梨孢菌属(Magnaporthe)、Melanocarpus、多孔菌属(Meripilus)、毛霉属(Mucor)、毁丝霉属(Myceliophthora)、新考玛脂霉属(Neocallimastix)、脉孢菌属(Neurospora)、拟青霉属(Paecilomyces)、青霉属(Penicillium)、平革菌属(Phanerochaete)、瘤胃壶菌属(Piromyces)、Poitrasia、假黑盘菌属(Pseudoplectania)、Pseudotrichonympha、根毛霉属(Rhizomucor)、裂褶菌属(Schizophyllum)、柱顶孢属(Scytalidium)、踝节菌属(Talaromyces)、嗜热子囊菌属(Thermoascus)、梭孢壳属(Thielavia)、弯颈霉属(Tolypocladium)、木霉属(Trichoderma)、长毛盘菌属(Trichophaea)、轮枝孢属(Verticillium)、包脚菇属(Volvariella)或炭角菌属(Xylaria)碳酸氢根转运蛋白。
在另一个方面,所述碳酸氢根转运蛋白是卡尔酵母(Saccharomycescarlsbergensis)、酿酒酵母、糖化酵母(Saccharomyces diastaticus)、道格拉氏酵母(Saccharomyces douglasii)、克鲁弗酵母(Saccharomyces kluyveri)、诺地酵母(Saccharomyces norbensis)或卵形酵母(Saccharomyces oviformis)碳酸氢根转运蛋白。
在另一个方面,所述碳酸氢根转运蛋白是解纤维枝顶孢霉(Acremoniumcellulolyticus)、棘孢曲霉(Aspergillus aculeatus)、泡盛曲霉(Aspergillus awamori)、黄曲霉、烟曲霉(Aspergillus fumigatus)、臭曲霉(Asperigullus foetidus)、日本曲霉(Aspergillus japonicus)、构巢曲霉(Aspergillus nidulans)、黑曲霉(Aspergillus niger)、米曲霉、酱油曲霉(Aspergillus sojae)、嗜角质金孢子菌(Chrysosporiumkeratinophilum)、Chrysosporium lucknowense、热带金孢子菌(Chrysosporiumtropicum)、Chrysosporium merdarium、Chrysosporium inops、毡金孢子菌(Chrysosporium pannicola)、Chrysosporium queenslandicum、Chrysosporiumzonatum、杆孢状镰孢(Fusarium bactridioides)、禾谷镰孢(Fusarium cerealis)、库威镰孢(Fusarium crookwellense)、大刀镰孢(Fusarium culmorum)、禾本科镰孢(Fusarium graminearum)、禾赤镰孢(Fusarium graminum)、异孢镰孢(Fusariumheterosporum)、合欢木镰孢(Fusarium negundi)、尖镰孢(Fusarium oxysporum)、多枝镰孢(Fusarium reticulatum)、粉红镰孢(Fusarium roseum)、接骨木镰孢(Fusarium sambucinum)、肤色镰孢(Fusarium sarcochroum)、拟分枝孢镰孢(Fusarium sporotrichioides)、硫色镰孢(Fusarium sulphureum)、圆镰孢(Fusariumtorulosum)、拟丝孢镰孢(Fusarium trichothecioides)、镶片镰孢(Fusariumvenenatum)、灰腐质霉(Humicola grisea)、特异腐质霉(Humicola insolens)、疏棉状腐质霉(Humicola lanuginosa)、白耙齿菌(Irpex lacteus)、米黑毛霉(Mucormiehei)、嗜热毁丝霉(Myceliophthora thermophila)、粗糙脉孢菌(Neurosporacrassa)、绳状青霉(Penicillium funiculosum)、产紫青霉(Penicillium purpurogenum)、黄孢平革菌(Phanerochaete chrysosporium)、无色梭孢壳(Thielavia achromatica)、Thielavia albomyces、Thielavia albopilosa、澳洲梭孢壳(Thielavia australeinsis)、Thielavia fimeti、小孢梭孢壳(Thielavia microspora)、卵孢梭孢壳(Thielaviaovispora)、Thielavia peruviana、瘤孢梭孢壳(Thielavia spededonium)、毛梭孢壳(Thielavia setosa)、Thielavia subthermophila、土生梭孢霉(Thielavia terrestris)、哈茨木霉(Trichoderma harzianum)、康宁木霉(Trichoderma koningii)、长枝木霉(Trichoderma longibrachiatum)、里氏木霉(Trichoderma reesei)或绿色木霉(Trichoderma viride)碳酸氢根转运蛋白。
在一个方面,所述碳酸氢根转运蛋白是曲霉属碳酸氢根转运蛋白,如米曲霉碳酸氢根转运蛋白。在一个方面,所述碳酸氢根转运蛋白是SEQ ID NO:2的米曲霉碳酸氢根转运蛋白。在另一个方面,所述碳酸氢根转运蛋白是SEQ ID NO:4的米曲霉碳酸氢根转运蛋白。
可理解的是对于前述的种,本发明包含完全和不完全阶段(perfect andimperfect states),和其它分类学的等同物(equivalent),例如无性型(anamorph),而无论它们已知的种名。本领域技术人员将容易地识别适合的等同物的身份。
这些种的菌株在许多培养物保藏中心对于公众能够容易地取得,所述保藏中心诸如美国典型培养物保藏中心(the American Type Culture Collection)(ATCC)、德意志微生物和细胞培养物保藏中心(Deutsche Sammlung vonMikroorganismen und Zellkulturen GmbH)(DSM)、真菌菌种保藏中心(Centraalbureau Voor Schimmelcultures)(CBS)和农业研究机构专利培养物保藏中心北区研究中心(Agricultural Research Service Patent Culture Collection,Northern Regional Research Center)(NRRL)。
亦可使用上述的探针从其它来源,包括从自然界(例如,土壤、堆肥、水等)分离的微生物,或直接从自然材料(例如,土壤、堆肥、水等)获得的DNA样品鉴定和获得所述碳酸氢根转运蛋白。用于从天然生境(habitat)分离微生物和DNA的技术是本领域内公知的。然后可通过相似地筛选另一种微生物的基因组DNA或cDNA文库或混合的DNA样品来获得编码碳酸氢根转运蛋白的多核苷酸。一旦用如本文中所述的合适探针检测到编码碳酸氢根转运蛋白的多核苷酸,就能够使用本领域普通技术人员已知的技术将所述序列分离或克隆(参见,例如,J.Sambrook,E.F.Fritsch和T.Maniatus,1989,Molecular Cloning,A Laboratory Manual,第2版,Cold Spring Harbor,New York)。
C4-二羧酸转运蛋白和编码C4-二羧酸转运蛋白的多核苷酸
在重组宿主细胞及其使用方法的一些方面,所述宿主细胞具有C4-二羧酸转运蛋白活性。在一些方面,所述宿主细胞包含编码C4-二羧酸转运蛋白的异源多核苷酸。所述C4-二羧酸转运蛋白可为任何适于实践本发明的C4-二羧酸转运蛋白。在一个方面,所述C4-二羧酸转运蛋白存在于宿主细胞胞质溶胶中。
在一个方面,所述C4-二羧酸转运蛋白是:(a)C4-二羧酸转运蛋白,其与SEQ ID NO:6或其成熟多肽序列具有至少60%序列同一性;(b)C4-二羧酸转运蛋白,其由多核苷酸编码,所述多核苷酸在低严格条件下与SEQ ID NO:5,其成熟多肽编码序列,或前述的全长互补链杂交;(c)C4-二羧酸转运蛋白,其由多核苷酸编码,所述多核苷酸与SEQ ID NO:5,其成熟多肽编码序列,或前述的全长互补链具有至少60%序列同一性;(d)SEQ ID NO:6或其成熟多肽序列的包含一个或多个氨基酸(例如两个、几个)的取代、缺失和/或***的C4-二羧酸转运蛋白变体;和(e)(a)、(b)、(c)或(d)的多肽具有C4-二羧酸转运蛋白活性的片段。
在一个方面,所述C4-二羧酸转运蛋白包含或组成为氨基酸序列,所述氨基酸序列与SEQ ID NO:6或其成熟多肽序列具有至少60%,例如至少65%,至少70%,至少75%,至少80%,至少85%,至少90%,至少91%,至少92%,至少93%,至少94%,至少95%,至少96%,至少97%,至少98%,或至少99%序列同一性。在一个方面,所述C4-二羧酸转运蛋白包含氨基酸序列,所述氨基酸序列与SEQ ID NO:6或其成熟多肽序列相差不多于十个氨基酸,例如不多于五个氨基酸,不多于四个氨基酸,不多于三个氨基酸,不多于两个氨基酸,或一个氨基酸。
在一个方面,所述C4-二羧酸转运蛋白包含或组成为SEQ ID NO:6的氨基酸序列,SEQ ID NO:6的成熟多肽序列,其等位变体,或前述的具有C4-二羧酸转运蛋白活性的序列。在另一个方面,所述C4-二羧酸转运蛋白包含或组成为SEQ ID NO:6的氨基酸序列。在另一个方面,所述C4-二羧酸转运蛋白包含或组成为SEQ ID NO:6的成熟多肽序列。在另一个方面,所述C4-二羧酸转运蛋白包含或组成为SEQ ID NO:6的氨基酸1至418。在另一个方面,所述C4-二羧酸转运蛋白包含或组成为SEQ ID NO:6的氨基酸18至418。
在一个方面,所述C4-二羧酸转运蛋白由多核苷酸编码,所述多核苷酸在至少低严格条件,例如中等严格条件,中等-高严格条件,高严格条件,或非常高严格条件与SEQ ID NO:5,其成熟多肽编码序列,或前述的全长互补链杂交(参见,例如J.Sambrook,E.F.Fritsch和T.Maniatus,1989,见上文)。
在一个方面,所述C4-二羧酸转运蛋白由多核苷酸编码,所述多核苷酸与SEQ ID NO:5,其成熟多肽编码序列,或前述的全长互补链具有至少65%,例如至少70%,至少75%,至少80%,至少85%,至少85%,至少90%,至少91%,至少92%,至少93%,至少94%,至少95%,至少96%,至少97%,至少98%,至少99%,或100%序列同一性。
在一个方面,所述C4-二羧酸转运蛋白由SEQ ID NO:5,或其成熟多肽编码序列编码。在一个方面,所述C4-二羧酸转运蛋白由SEQ ID NO:5编码。在一个方面,所述C4-二羧酸转运蛋白由SEQ ID NO:5的成熟多肽编码序列编码。在一个方面,所述成熟多肽编码序列是SEQ ID NO:5的核苷酸1至1257。在一个方面,所述成熟多肽编码序列是SEQ ID NO:5的核苷酸52至1257。在一个方面,所述C4-二羧酸转运蛋白由SEQ ID NO:5的亚序列编码,其中所述亚序列编码具有C4-二羧酸转运蛋白活性的多肽。在一个方面,所述亚序列含有SEQ ID NO:7的至少885个核苷酸,例如至少930个核苷酸或至少975个核苷酸。
在一个方面,所述C4-二羧酸转运蛋白为SEQ ID NO:6或其成熟多肽序列的包含一个或多个(几个)氨基酸的取代、缺失和/或***的变体,如上文所述。在一个方面,所述C4-二羧酸转运蛋白为SEQ ID NO:6的包含一个或多个(几个)氨基酸的取代、缺失和/或***的变体。在一个方面,所述C4-二羧酸转运蛋白为SEQ ID NO:6的成熟多肽序列的包含一个或多个(几个)氨基酸的取代、缺失和/或***的变体。在一些方面,SEQ ID NO:6或其成熟多肽序列的氨基酸取代、缺失和/或***的总数不多于10,例如不多于1,2,3,4,5,6,7,8或9。
在另一个方面,所述C4-二羧酸转运蛋白是SEQ ID NO:6或其成熟多肽序列的片段,其中所述片段具有C4-二羧酸转运蛋白活性。在一个方面,所述的片段含有SEQ ID NO:6的至少355个氨基酸残基,例如至少375个氨基酸残基,或至少395个氨基酸残基。
所述C4-二羧酸转运蛋白亦可为C4-二羧酸转运蛋白的等位变体或人工变体。
所述C4-二羧酸转运蛋白亦可包括融合多肽或可切割的融合多肽,如上文所述。
用于分离或克隆编码C4-二羧酸转运蛋白的多核苷酸的技术如上文中所述。
SEQ ID NO:5的多核苷酸;或其亚序列;以及SEQ ID NO:6的氨基酸序列;或其片段;可用于设计核酸探针以从不同属或种的菌株鉴定和克隆编码C4-二羧酸转运蛋白的DNA,如上文中所述。本发明涵盖此类探针。可对从此类其它生物制备的基因组DNA或cDNA筛选与如上所述的探针杂交并编码C4-二羧酸转运蛋白的DNA,如上文中所述。
在一个方面,所述核酸探针为SEQ ID NO:5。在另一个方面,所述核酸探针为SEQ ID NO:5的成熟多肽编码序列。在另一个方面,所述核酸探针是多核苷酸序列,其编码SEQ ID NO:6,其成熟多肽序列或前述序列的片段。
对于长度至少100个核苷酸的长探针,非常低至非常高的严格条件和洗涤条件如上文中所述定义。对于长度大约15个核苷酸至大约70个核苷酸的短探针,严格条件和洗涤条件如上文中所述定义。
所述C4-二羧酸转运蛋白可获得自任何属的微生物。在一个方面,所述C4-二羧酸转运蛋白可为从本文中所述的微生物获得的细菌、酵母或丝状真菌C4-二羧酸转运蛋白。在另一个方面,所述C4-二羧酸转运蛋白是曲霉属C4-二羧酸转运蛋白,如棘孢曲霉C4-二羧酸转运蛋白,例如SEQ ID NO:6的棘孢曲霉C4-二羧酸转运蛋白。
其它可与本发明中所述的宿主细胞和使用方法使用的C4-二羧酸转运蛋白包括但不限于,黄曲霉(Aspergillus flavus)C4-二羧酸转运蛋白(AFLA_107340),SEQ ID NO:27的米曲霉C4-二羧酸转运蛋白(由SEQ IDNO:26的多核苷酸序列编码;参见US2011/0053233),SEQ ID NO:29的土曲霉(Aspergillus terreus)C4-二羧酸转运蛋白(由SEQ ID NO:28的多核苷酸序列编码,参见US2011/0053233),SEQ ID NO:32的粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe)C4-二羧酸转运蛋白(由SEQ ID NO:30或31的多核苷酸序列编码,参见US2011/0053233),SEQ ID NO:34的棘孢曲霉(Aspergillus aculeatus)C4-二羧酸转运蛋白(由SEQ ID NO:33的多核苷酸序列编码,参见2011年6月21日提交的,标题为“Polypeptides HavingC4-dicarboxylic acid Transporter Activity and Polynucleotides Encoding Same”的美国申请号13/165,696),SEQ ID NO:36的棘孢曲霉C4-二羧酸转运蛋白(由SEQ ID NO:35的多核苷酸序列编码,参见美国申请号13/165,696,见上文),SEQ ID NO:39的日本裂殖酵母(Schizosaccharomyces japonicus)C4-二羧酸转运蛋白(由SEQ ID NO:37或38的多核苷酸序列编码,参见2011年6月2日提交的,标题为“C4-dicarboxylic acid Production in Filamentous Fungi”的PCT/US11/38881),SEQ ID NO:41的棒曲霉(Aspergillus clavatus)C4-二羧酸转运蛋白(由SEQ ID NO:40的多核苷酸序列编码;参见2011年6月21提交的,标题为“Methods for Improving C4-dicarboxylic acid Production in FilamentousFungi”的美国申请号13/165,719),SEQ ID NO:43的烟曲霉(Aspergillusfumigatus)C4-二羧酸转运蛋白(由SEQ ID NO:42的多核苷酸编码,参见美国申请号13/165,719,见上文),或任何相应的参考文献中所述的C4-二羧酸转运蛋白的任何方面。本文中所述的任何涉及其序列同一性,杂交,氨基酸修饰(例如取代、缺失和/或***),片段,或亚序列的方面也涵盖上述的C4-二羧酸转运蛋白。
本发明涵盖将本文中所述的序列同一性、杂交、变体和片段的任何方面适用于如上所述的C4-二羧酸转运蛋白多肽序列和多核苷酸序列。举例而言,在一个方面,所述C4-二羧酸转运蛋白是(a)C4-二羧酸转运蛋白,其与SEQ IDNO:27,29,32,34,36,39,41,或43或其成熟多肽序列具有至少60%,例如至少65%,至少70%,至少75%,至少80%,至少85%,至少85%,至少90%,至少91%,至少92%,至少93%,至少94%,至少95%,至少96%,至少97%,至少98%,至少99%,或100%序列同一性;(b)C4-二羧酸转运蛋白,其由多核苷酸编码,所述多核苷酸在低严格条件,例如中等严格条件,中等-高严格条件,高严格条件或非常高严格条件下与以下杂交:(i)SEQ IDNO:26,28,30,31,33,35,37,38,40,或42或其成熟多肽编码序列,(ii)SEQ ID NO:26,28,30,31,33,35,37,38,40,或42的cDNA序列或其成熟多肽编码序列,或(iii)(i)或(ii)的全长互补链;(c)C4-二羧酸转运蛋白,其由多核苷酸编码,所述多核苷酸与(iv)SEQ ID NO:26,28,30,31,33,35,37,38,40,或42或其成熟多肽编码序列,(v)SEQ ID NO:26,28,30,31,33,35,37,38,40,或42的cDNA序列或其成熟多肽编码序列,或(vi)(iv)或(v)的全长互补链具有至少60%,例如至少65%,至少70%,至少75%,至少80%,至少85%,至少85%,至少90%,至少91%,至少92%,至少93%,至少94%,至少95%,至少96%,至少97%,至少98%,至少99%,或100%序列同一性;(d)SEQ ID NO:27,29,32,34,36,39,41,或43或其成熟多肽序列的包含一个或多个氨基酸(几个)的取代、缺失和/或***的C4-二羧酸转运蛋白变体;和(e)(a)、(b)、(c)或(d)的多肽具有C4-二羧酸转运蛋白活性的片段。
所述C4-二羧酸转运蛋白亦可从其它来源鉴定和获取,所述来源包括从自然界(例如土壤、堆肥、水等)分离的微生物或直接从自然材料(例如土壤、堆肥、水等)获得的DNA样品,如上文中所述。
苹果酸脱氢酶和编码苹果酸脱氢酶的多核苷酸
在重组宿主细胞及其使用方法的一些方面,所述宿主细胞具有苹果酸脱氢酶活性。在一些方面,所述宿主细胞包含编码苹果酸脱氢酶的异源多核苷酸。所述苹果酸脱氢酶可为任何适于实践本发明的苹果酸脱氢酶。在一个方面,所述苹果酸脱氢酶是存在于宿主细胞胞质溶胶中的酶。
在本文所述的重组宿主细胞和方法的一个方面,所述苹果酸脱氢酶是:(a)苹果酸脱氢酶,其与SEQ ID NO:8或其成熟多肽序列具有至少60%序列同一性;(b)苹果酸脱氢酶,其由多核苷酸编码,所述多核苷酸在低严格条件下与以下杂交:(i)SEQ ID NO:7,或其成熟多肽编码序列,(ii)SEQ ID NO:7的cDNA序列或其成熟多肽编码序列,或(iii)(i)或(ii)的全长互补链;(c)苹果酸脱氢酶,其由多核苷酸编码,所述多核苷酸与以下具有至少60%序列同一性:(iv)SEQ ID NO:7,或其成熟多肽编码序列,(v)SEQ ID NO:7的cDNA序列或其成熟多肽编码序列,或(vi)(iv)或(v)的全长互补链;(d)SEQ ID NO:8或其成熟多肽序列的包含一个或多个(几个)氨基酸的取代、缺失和/或***的苹果酸脱氢酶变体;和(e)(a)、(b)、(c)或(d)的多肽具有苹果酸脱氢酶活性的片段。
在一个方面,所述苹果酸脱氢酶包含或组成为这样的氨基酸序列,所述氨基酸序列与SEQ ID NO:8或其成熟多肽序列具有至少60%,例如至少65%,至少70%,至少75%,至少80%,至少85%,至少90%,至少91%,至少92%,至少93%,至少94%,至少95%,至少96%,至少97%,至少98%,或至少99%序列同一性。在一个方面,所述苹果酸脱氢酶包含氨基酸序列,所述氨基酸序列与SEQ ID NO:8或其成熟多肽序列相差不多于十个氨基酸,例如不多于五个氨基酸,不多于四个氨基酸,不多于三个氨基酸,不多于两个氨基酸,或一个氨基酸。
在一个方面,所述苹果酸脱氢酶包含或组成为SEQ ID NO:8的氨基酸序列,SEQ ID NO:8的成熟多肽序列,其等位变体,或前述的具有苹果酸脱氢酶活性的序列。在另一个方面,所述苹果酸脱氢酶包含或组成为SEQ ID NO:8的氨基酸序列。在另一个方面,所述苹果酸脱氢酶包含或组成为SEQ ID NO:8的成熟多肽序列。在另一个方面,所述苹果酸脱氢酶包含或组成为SEQ IDNO:8的氨基酸1至330。
在一个方面,所述苹果酸脱氢酶由多核苷酸编码,所述多核苷酸在至少低严格条件,例如中等严格条件,中等-高严格条件,高严格条件,或非常高严格条件与以下杂交:(i)SEQ ID NO:7或其成熟多肽编码序列,(ii)SEQ IDNO:7的cDNA序列或其成熟多肽编码序列,或(iii)(i)或(ii)的全长互补链(参见,例如J.Sambrook,E.F.Fritsch和T.Maniatus,1989,见上文)。
在一个方面,所述苹果酸脱氢酶由多核苷酸编码,所述多核苷酸与(iv)SEQ ID NO:7或其成熟多肽编码序列,(v)SEQ ID NO:7的cDNA序列或其成熟多肽编码序列,或(vi)(iv)或(v)的全长互补链具有至少65%,例如至少70%,至少75%,至少80%,至少85%,至少85%,至少90%,至少91%,至少92%,至少93%,至少94%,至少95%,至少96%,至少97%,至少98%,至少99%,或100%序列同一性。
在一个方面,所述苹果酸脱氢酶由SEQ ID NO:7,或其成熟多肽编码序列编码。在一个方面,所述苹果酸脱氢酶由SEQ ID NO:7编码。在一个方面,所述苹果酸脱氢酶由SEQ ID NO:7的成熟多肽编码序列编码。在一个方面,所述苹果酸脱氢酶由SEQ ID NO:7的亚序列编码,其中所述亚序列编码具有苹果酸脱氢酶活性的多肽。在一个方面,所述亚序列含有SEQ ID NO:7的至少885个核苷酸,例如至少930个核苷酸或至少975个核苷酸。
在一个方面,所述苹果酸脱氢酶为SEQ ID NO:8或其成熟多肽序列的包含一个或多个(几个)氨基酸的取代、缺失和/或***的变体,如上文所述。在一个方面,所述苹果酸脱氢酶为SEQ ID NO:8的包含一个或多个(几个)氨基酸的取代、缺失和/或***的变体。在一个方面,所述苹果酸脱氢酶为SEQ ID NO:8的成熟多肽序列的包含一个或多个氨基酸的取代、缺失和/或***的变体。在一些方面,SEQ ID NO:8或其成熟多肽序列的氨基酸取代、缺失和/或***的总数不多于10,例如不多于1,2,3,4,5,6,7,8或9。
在另一个方面,所述苹果酸脱氢酶是SEQ ID NO:8或其成熟多肽序列的片段,其中所述片段具有苹果酸脱氢酶活性。在一个方面,所述的片段含有SEQ ID NO:8的至少295个氨基酸残基,例如至少310个氨基酸残基,或至少325个氨基酸残基。
所述苹果酸脱氢酶亦可为苹果酸脱氢酶的等位变体或人工变体。
所述苹果酸脱氢酶亦可包括融合多肽或可切割的融合多肽,如上文所述。
用于分离或克隆编码苹果酸脱氢酶的多核苷酸的技术如上文中所述。
SEQ ID NO:7的多核苷酸;或其亚序列;以及SEQ ID NO:8的氨基酸序列;或其片段;可用于设计核酸探针以从不同属或种的菌株鉴定和克隆编码苹果酸脱氢酶的DNA,如上文中所述。本发明涵盖此类探针。可对从此类其它生物制备的基因组DNA或cDNA筛选与如上所述的探针杂交并编码苹果酸脱氢酶的DNA,如上文中所述。
在一个方面,所述核酸探针为SEQ ID NO:7。在另一个方面,所述核酸探针为SEQ ID NO:7的成熟多肽编码序列。在另一个方面,所述核酸探针是多核苷酸序列,其编码SEQ ID NO:8,其成熟多肽序列或前述序列的片段。
对于长度至少100个核苷酸的长探针,非常低至非常高的严格条件和洗涤条件如上文中所述定义。对于长度大约15个核苷酸至大约70个核苷酸的短探针,严格条件和洗涤条件如上文中所述定义。
所述苹果酸脱氢酶可获得自任何属的微生物。在一个方面,所述苹果酸脱氢酶可为从本文中所述的微生物获得的细菌、酵母或丝状真菌苹果酸脱氢酶。在另一个方面,所述苹果酸脱氢酶是米曲霉苹果酸脱氢酶,例如SEQ IDNO:8的米曲霉苹果酸脱氢酶。
其它可用于实践本发明的苹果酸脱氢酶包括但不限于:构巢曲霉苹果酸脱氢酶(AN6717.1;SIMS等,2004,Mycol.Res.108:853-857);黑曲霉苹果酸脱氢酶(An16g00120;Pel等,2007,Nature Biotechnology25:221-231);Phytophthora infestans苹果酸脱氢酶(PITG13614.1;Calcagno等,2009,Mycological Research113:771-781);酿酒酵母苹果酸脱氢酶(YKL085W;McAlister-Henn和Thompson,1987,J Bacteriol.169:5157-5166);埃默森踝节菌苹果酸脱氢酶(AF439996,AF487682;Maloney等,2004,Eur.J.Biochem.271:3115-3126);以及玉蜀黍黑粉菌(Ustilago maydis)苹果酸脱氢酶(um00403,um11161;McCann和Snetselaar,2008,Fungal Genetics and Biology45:S77–S87),SEQ ID NO:45的米曲霉苹果酸脱氢酶(其由SEQ ID NO:44的核苷酸序列所编码;参见美国申请号12/870,523,标题为“Methods for ImprovingMalic Acid Production in Filamentous Fungi”,2010年8月27日提交),或任何相应的参考文献中所述的苹果酸脱氢酶的任何方面。本文中所述的任何涉及其序列同一性,杂交,氨基酸修饰(例如取代、缺失和/或***),片段,或亚序列的方面也涵盖上述的苹果酸脱氢酶。
本发明涵盖将本文中所述的序列同一性、杂交、变体和片段的任何方面适用于如上所述的苹果酸脱氢酶多肽序列和多核苷酸序列。举例而言,在一个方面,所述苹果酸脱氢酶是(a)苹果酸脱氢酶,其与SEQ ID NO:45或其成熟多肽序列具有至少60%,例如至少65%,至少70%,至少75%,至少80%,至少85%,至少85%,至少90%,至少91%,至少92%,至少93%,至少94%,至少95%,至少96%,至少97%,至少98%,至少99%,或100%序列同一性;(b)苹果酸脱氢酶,其由多核苷酸编码,所述多核苷酸在低严格条件,例如中等严格条件,中等-高严格条件,高严格条件或非常高严格条件下与以下杂交:(i)SEQ ID NO:44或其成熟多肽编码序列,(ii)SEQ ID NO:44的cDNA序列或其成熟多肽编码序列,或(iii)(i)或(ii)的全长互补链;(c)苹果酸脱氢酶,其由多核苷酸编码,所述多核苷酸与(iv)SEQ ID NO:44或其成熟多肽编码序列,(v)SEQ ID NO:44的cDNA序列或其成熟多肽编码序列,或(vi)(iv)或(v)的全长互补链具有至少60%,例如至少65%,至少70%,至少75%,至少80%,至少85%,至少85%,至少90%,至少91%,至少92%,至少93%,至少94%,至少95%,至少96%,至少97%,至少98%,至少99%,或100%序列同一性;(d)SEQ ID NO:45或其成熟多肽序列的包含一个或多个氨基酸(几个)的取代、缺失和/或***的苹果酸脱氢酶变体;和(e)(a)、(b)、(c)或(d)的多肽具有苹果酸脱氢酶活性的片段。
所述苹果酸脱氢酶亦可从其它来源鉴定和获取,所述来源包括从自然界(例如土壤、堆肥、水等)分离的微生物或直接从自然材料(例如土壤、堆肥、水等)获得的DNA样品,如上文中所述。
丙酮酸羧化酶和编码丙酮酸羧化酶的多核苷酸
在重组宿主细胞及其使用方法的一些方面,所述宿主细胞具有丙酮酸羧化酶活性。在一些方面,所述宿主细胞包含编码丙酮酸羧化酶的异源多肽。所述丙酮酸羧化酶可为任何适于实践本发明的丙酮酸羧化酶。在一个方面,所述丙酮酸羧化酶是存在于宿主细胞胞质溶胶中的酶。
在本文所述的重组宿主细胞和方法的一个方面,所述丙酮酸羧化酶是:(a)丙酮酸羧化酶,其与SEQ ID NO:10或其成熟多肽序列具有至少60%序列同一性;(b)丙酮酸羧化酶,其由多核苷酸编码,所述多核苷酸在低严格条件下与以下杂交:(i)SEQ ID NO:9,或其成熟多肽编码序列,(ii)SEQ ID NO:9的cDNA序列或其成熟多肽编码序列,或(iii)(i)或(ii)的全长互补链;(c)丙酮酸羧化酶,其由多核苷酸编码,所述多核苷酸与以下具有至少60%序列同一性:(iv)SEQ ID NO:9,或其成熟多肽编码序列,(v)SEQ ID NO:9的cDNA序列或其成熟多肽编码序列,或(vi)(iv)或(v)的全长互补链;(d)SEQ ID NO:10或其成熟多肽序列的包含一个或多个氨基酸(几个)的取代、缺失和/或***的丙酮酸羧化酶变体;和(e)(a)、(b)、(c)或(d)的多肽具有丙酮酸羧化酶活性的片段。
在一个方面,所述丙酮酸羧化酶包含或组成为这样的氨基酸序列,所述氨基酸序列与SEQ ID NO:10或其成熟多肽序列具有至少60%,例如至少65%,至少70%,至少75%,至少80%,至少85%,至少90%,至少91%,至少92%,至少93%,至少94%,至少95%,至少96%,至少97%,至少98%,或至少99%序列同一性。在一个方面,所述丙酮酸羧化酶包含这样的氨基酸序列,所述氨基酸序列与SEQ ID NO:10或其成熟多肽序列相差不多于十个氨基酸,例如不多于五个氨基酸,不多于四个氨基酸,不多于三个氨基酸,不多于两个氨基酸,或一个氨基酸。
在一个方面,所述丙酮酸羧化酶包含或组成为SEQ ID NO:10的氨基酸序列,SEQ ID NO:10的成熟多肽序列,其等位变体,或前述序列的具有丙酮酸羧化酶活性的序列。在另一个方面,所述丙酮酸羧化酶包含或组成为SEQID NO:10的氨基酸序列。在另一个方面,所述丙酮酸羧化酶包含或组成为SEQ ID NO:10的成熟多肽序列。在另一个方面,所述丙酮酸羧化酶包含或组成为SEQ ID NO:10的氨基酸1至1193。
在一个方面,所述丙酮酸羧化酶由多核苷酸编码,所述多核苷酸在至少低严格条件,例如中等严格条件,中等-高严格条件,高严格条件,或非常高严格条件与以下杂交:(i)SEQ ID NO:9或其成熟多肽编码序列,(ii)SEQ IDNO:9的cDNA序列或其成熟多肽编码序列,或(iii)(i)或(ii)的全长互补链(参见,例如J.Sambrook,E.F.Fritsch和T.Maniatus,1989,见上文)。
在一个方面,所述丙酮酸羧化酶由多核苷酸编码,所述多核苷酸与(iv)SEQ ID NO:9或其成熟多肽编码序列,(v)SEQ ID NO:9的cDNA序列或其成熟多肽编码序列,或(vi)(iv)或(v)的全长互补链具有至少65%,例如至少70%,至少75%,至少80%,至少85%,至少85%,至少90%,至少91%,至少92%,至少93%,至少94%,至少95%,至少96%,至少97%,至少98%,至少99%,或100%序列同一性。
在一个方面,所述丙酮酸羧化酶由SEQ ID NO:9,或其成熟多肽编码序列编码。在一个方面,所述丙酮酸羧化酶由SEQ ID NO:9编码。在一个方面,所述丙酮酸羧化酶由SEQ ID NO:9的成熟多肽编码序列编码。在一个方面,所述丙酮酸羧化酶由SEQ ID NO:9的亚序列编码,其中所述亚序列编码具有丙酮酸羧化酶活性的多肽。在一个方面,所述亚序列含有SEQ ID NO:9的至少3060个核苷酸,例如至少3240个核苷酸或至少3420个核苷酸。
在一个方面,所述丙酮酸羧化酶为SEQ ID NO:10或其成熟多肽序列的包含一个或多个(几个)氨基酸的取代、缺失和/或***的变体,如上文所述。在一个方面,所述丙酮酸羧化酶为SEQ ID NO:10的包含一个或多个(几个)氨基酸的取代、缺失和/或***的变体。在一个方面,所述丙酮酸羧化酶为SEQ ID NO:10的成熟多肽序列的包含一个或多个(几个)氨基酸的取代、缺失和/或***的变体。在一些方面,SEQ ID NO:10或其成熟多肽序列的氨基酸取代、缺失和/或***的总数不多于10,例如不多于1,2,3,4,5,6,7,8或9。
在另一个方面,所述丙酮酸羧化酶是SEQ ID NO:10或其成熟多肽序列的片段,其中所述片段具有丙酮酸羧化酶活性。在一个方面,所述的片段含有SEQ ID NO:10的至少1020个氨基酸残基,例如至少1080个氨基酸残基,或至少1140个氨基酸残基。
所述丙酮酸羧化酶亦可为丙酮酸羧化酶的等位变体或人工变体。
所述丙酮酸羧化酶亦可包括融合多肽或可切割的融合多肽,如上文所述。
所述丙酮酸羧化酶可为线粒体丙酮酸羧化酶的变体,使得体内输入线粒体减少,由此增加所述丙酮酸羧化酶在胞质溶胶中的水平。
用于分离或克隆编码丙酮酸羧化酶的多核苷酸的技术如上文中所述。
SEQ ID NO:9的多核苷酸;或其亚序列;以及SEQ ID NO:10的氨基酸序列;或其片段;可用于设计核酸探针以从不同属或种的菌株鉴定和克隆编码丙酮酸羧化酶的DNA,如上文中所述。本发明涵盖此类探针。可对从此类其它生物制备的基因组DNA或cDNA筛选与如上所述的探针杂交并编码丙酮酸羧化酶的DNA,如上文所述。
在一个方面,所述核酸探针为SEQ ID NO:9。在另一个方面,所述核酸探针为SEQ ID NO:9的成熟多肽编码序列。在另一个方面,所述核酸探针是多核苷酸序列,其编码SEQ ID NO:10,其成熟多肽序列或前述序列的片段。
对于长度至少100个核苷酸的长探针,非常低至非常高的严格条件和洗涤条件如上文中所述定义。对于长度大约15个核苷酸至大约70个核苷酸的短探针,严格条件和洗涤条件如上文中所述定义。
所述丙酮酸羧化酶可获得自任何属的微生物。在一个方面,所述丙酮酸羧化酶可为从本文中所述的微生物获得的细菌、酵母或丝状真菌丙酮酸羧化酶。在另一个方面,所述丙酮酸羧化酶是米曲霉丙酮酸羧化酶,例如SEQ IDNO:10的米曲霉丙酮酸羧化酶。
其它可用于实施本发明的丙酮酸羧化酶包括但不限于:棒曲霉(Aspergillusclavatus)NRRL1丙酮酸羧化酶(XP_001271664;Direct Submission,Submitted(26-OCT-2006),The Institute for Genomic Research,9712Medical Center Drive,Rockville,MD20850,USA);烟曲霉Af293丙酮酸羧化酶(XP_752054;Nierman等,2005,Nature438:1151-1156);构巢曲霉FGSC A4丙酮酸羧化酶(XP_662066;Galagan等,2005,Nature438:1105-1115);黑曲霉丙酮酸羧化酶(An15g02820;Pel等,2007,Nature Biotechnology25:221-231;ASPNG5061;Panneman等,(JUL-1998)提交至EMBL/GenBank/DDBJ数据库);土曲霉丙酮酸羧化酶(O93918;Direct Submission,Submitted(OCT-1998)The Institute for Genomic Research,9712Medical Center Drive,Rockville,MD20850,USA);Magnaporthe grisea70-15丙酮酸羧化酶(XP_367852;Direct Submission,Submitted(26-SEP-2005)Broad Instituteof MIT and Harvard,320Charles Street,Cambridge,MA02142,USA);粗糙脉孢菌OR74A丙酮酸羧化酶(XP_965636;Galagan等,2003,Nature422:859-868);米根霉(Rhizopus oryzae)丙酮酸羧化酶(RO3G_06931.1);酿酒酵母丙酮酸羧化酶(NP_009777;Gaffeau等,1996,Science274:546-547);粟酒裂殖酵母丙酮酸羧化酶(NP_595900;Direct Submission,Submitted(29-JUN-2007)EuropeanSchizosaccharomyces genome sequencing project,Sanger Institute,The WellcomeTrust Genome Campus,Hinxton,Cambridge CB101SA);和玉蜀黍黑粉菌丙酮酸羧化酶(um01054;McCann和Snetselaar,2008,Fungal Genetics and Biology45:S77-S87)。本文中所述的任何涉及其序列同一性,杂交,氨基酸修饰(例如取代、缺失和/或***),片段,或亚序列的方面也涵盖上述的丙酮酸羧化酶。
所述丙酮酸羧化酶亦可从其它来源鉴定和获取,所述来源包括从自然界(例如土壤、堆肥、水等)分离的微生物或直接从自然材料(例如土壤、堆肥、水等)获得的DNA样品,如上文中所述。
核酸构建体
本发明还涉及使用核酸构建体的重组宿主细胞和方法,所述核酸构建体包含编码碳酸氢根转运蛋白(和/或编码C4-二羧酸转运蛋白,苹果酸脱氢酶和/或丙酮酸羧化酶)的异源多核苷酸与一个或多个(几个)调控序列连接,所述调控序列指导在合适的宿主细胞中在与该调控序列相容的条件下表达。此类核酸构建体可用于本文中所述的任何宿主细胞和方法。本文中所述的多核苷酸可以通过多种方式加以操纵,来为所需多肽的表达提供条件。取决于表达载体,在将多核苷酸***载体之前对其进行操作可能是理想的或必需的。使用重组DNA方法修饰多核苷酸的技术是本领域熟知的。
调控序列可为启动子序列,启动子序列是一种多核苷酸,被用于表达本文中所述的任何多肽(例如碳酸氢根转运蛋白,C4-二羧酸转运蛋白,苹果酸脱氢酶,或丙酮酸羧化酶)的多核苷酸的宿主细胞所识别。启动子序列含有介导多肽的表达的转录调控序列。启动子可以是在所选的宿主细胞中显示转录活性的任何多核苷酸,包括突变的、截短的和杂合的启动子,并且可以从编码与宿主细胞同源或异源的胞外或胞内多肽的基因获得。
本文中所述的每个多核苷酸都可以可操作地连接于对于所述多核苷酸而言是外来的启动子。例如,在一个方面,所述编码碳酸氢根转运蛋白的异源多核苷酸可操作地连接于对于所述多核苷酸而言是外来的启动子。在另一个方面,编码C4-二羧酸的异源多核苷酸可操作地连接于对于所述多核苷酸而言是外来的启动子。在另一个方面,编码苹果酸脱氢酶的异源多核苷酸可操作地连接于对于所述多核苷酸而言是外来的启动子。在另一个方面,编码丙酮酸羧化酶的异源多核苷酸可操作地连接于对于所述多核苷酸而言是外来的启动子。
用于指导本发明的核酸构建体在细菌宿主细胞中转录的合适启动子的实例是从下述获得的启动子:解淀粉芽孢杆菌α-淀粉酶基因(amyQ)、地衣芽孢杆菌α-淀粉酶基因(amyL)、地衣芽孢杆菌青霉素酶基因(penP)、嗜热脂肪芽孢杆菌产麦芽糖淀粉酶基因(amyM)、枯草芽孢杆菌果聚糖蔗糖酶基因(sacB)、枯草芽孢杆菌xylA和xylB基因、大肠杆菌lac操纵子、大肠杆菌trc启动子(Egon等,1988,Gene69:301-315)、天蓝色链霉菌琼脂糖酶基因(dagA)和原核β-内酰胺酶基因(Villa-Kamaroff等,1978,Proceedings of the National Academy ofSciences USA75:3727-3731),以及tac启动子(DeBoer等,1983,Proc.Natl.Acad.Sci.USA80:21-25)。另外的启动子在"Useful proteins from recombinant bacteria"于Gilbert等,1980,Scientific American,242:74-94中;和在Sambrook等,1989,见上文描述。
用于指导本发明的核酸构建体在丝状真菌宿主细胞中转录的合适启动子的实例是从下列酶的基因获得的启动子:构巢曲霉乙酰胺酶、黑曲霉中性α-淀粉酶、黑曲霉酸稳定性α-淀粉酶、黑曲霉或泡盛曲霉葡糖淀粉酶(glaA)、米曲霉TAKA淀粉酶、米曲霉碱性蛋白酶、米曲霉丙糖磷酸异构酶、尖镰孢胰蛋白酶样蛋白酶(WO96/00787)、镶片镰孢淀粉葡糖苷酶(WO00/56900)、镶片镰孢Daria(WO00/56900)、镶片镰孢Quinn(WO00/56900)、曼赫根毛霉(Rhizomucor miehei)脂肪酶、曼赫根毛霉天冬氨酸蛋白酶、里氏木霉β-葡糖苷酶、里氏木霉纤维二糖水解酶I、里氏木霉纤维二糖水解酶II、里氏木霉内切葡聚糖酶I、里氏木霉内切葡聚糖酶II、里氏木霉内切葡聚糖酶III、里氏木霉内切葡聚糖酶IV、里氏木霉内切葡聚糖酶V、里氏木霉木聚糖酶I、里氏木霉木聚糖酶II、里氏木霉β-木糖苷酶,以及NA2-tpi启动子(一种修饰的启动子,其来自曲霉属中编码中性α-淀粉酶的基因,其中未翻译的前导序列已由曲霉属(Aspergilli)中编码丙糖磷酸异构酶的基因的未翻译的前导序列所替代;非限制性实例包括修饰的启动子,其来自黑曲霉中编码中性α-淀粉酶的基因,其中未翻译的前导序列已由构巢曲霉或米曲霉中编码丙糖磷酸异构酶的基因的未翻译的前导序列所替代);和它们的突变的、截短的和杂合的启动子。
在酵母宿主中,有用的启动子从如下酶的基因获得:酿酒酵母烯醇化酶(ENO-1)、酿酒酵母半乳糖激酶(GAL1)、酿酒酵母醇脱氢酶/甘油醛-3-磷酸脱氢酶(ADH1,ADH2/GAP)、酿酒酵母丙糖磷酸异构酶(TPI)、酿酒酵母金属硫蛋白(CUP1)和酿酒酵母3-磷酸甘油酸激酶。对于酵母宿主细胞其它有用的启动子由Romanos等,1992,Yeast8:423-488描述。
调控序列也可以是合适的转录终止子序列,其由宿主细胞识别以终止转录。所述终止子序列与编码所述多肽的多核苷酸的3’末端可操作地连接。可以将在所选宿主细胞中有功能的任何终止子用在本发明中。
对于丝状真菌宿主细胞优选的终止子从如下酶的基因获得:构巢曲霉邻氨基苯甲酸合酶、黑曲霉葡糖淀粉酶、黑曲霉α-葡糖苷酶、米曲霉TAKA淀粉酶和尖镰孢胰蛋白酶样蛋白酶。
对于酵母宿主细胞优选的终止子从如下酶的基因获得:酿酒酵母烯醇化酶、酿酒酵母细胞色素C(CYC1)和酿酒酵母甘油醛-3-磷酸脱氢酶(gpd)。对于酵母宿主细胞其它有用的终止子由Romanos等,1992,见上文描述。
调控序列还可以是合适的前导序列,当被转录时其为对于宿主细胞的翻译重要的mRNA非翻译区。前导序列可操作地连接于编码多肽的多核苷酸的5’-末端。可使用在所选宿主细胞中有功能的任何前导序列。
对于丝状真菌宿主细胞优选的前导序列从如下酶的基因获得:米曲霉TAKA淀粉酶和构巢曲霉丙糖磷酸异构酶。
对于酵母宿主细胞合适的前导序列从如下酶的基因获得:酿酒酵母烯醇化酶(ENO-1)、酿酒酵母3-磷酸甘油酸激酶、酿酒酵母α因子和酿酒酵母醇脱氢酶/甘油醛-3-磷酸脱氢酶(ADH2/GAP)。
调控序列也可以是聚腺苷酸化序列,其是与多核苷酸的3’末端可操作地连接的序列,并且在转录时,宿主细胞将其识别为将聚腺苷残基添加至转录的mRNA的信号。可使用在所选宿主细胞中有功能的任何聚腺苷酸化序列。
对于丝状真菌宿主细胞优选的聚腺苷酸化序列从如下酶的基因获得:米曲霉TAKA淀粉酶、黑曲霉葡糖淀粉酶、构巢曲霉邻氨基苯甲酸合酶、尖镰孢胰蛋白酶样蛋白酶和黑曲霉α-葡糖苷酶。
对于酵母宿主细胞有用的聚腺苷酸化序列由Guo和Sherman,1995,Mol.Cellular Biol.15:5983-5990描述。
调控序列还可以是信号肽编码区,其编码与多肽的N端相连的信号肽,并且指导多肽进入细胞的分泌途径。多核苷酸的编码序列5’端可固有地包含信号肽编码序列,其与编码所述多肽的编码序列的区段一起天然地连接在翻译阅读框中。可供选择的是,编码序列5’端可含有对于所述编码序列外源的信号肽编码序列。外源信号肽编码序列在编码序列不天然地含有信号肽编码序列时可为必需的。或者,外源信号肽编码序列可以简单地取代天然信号肽编码序列以增强多肽的分泌。然而,可使用指导表达的多肽进入所选宿主细胞的分泌途径的任何信号肽编码序列。
对于细菌宿主细胞有效的信号肽编码序列是从如下酶的基因获得的信号肽编码序列:芽孢杆菌属NCIB11837产麦芽糖淀粉酶、地衣芽孢杆菌枯草杆菌蛋白酶(subtilisin)、地衣芽孢杆菌β-内酰胺酶、嗜热脂肪芽孢杆菌α-淀粉酶、嗜热脂肪芽孢杆菌中性蛋白酶(nprT,nprS,nprM)和枯草芽孢杆菌prsA。另外的信号肽由Simonen和Palva,1993,Microbiological Reviews57:109-137描述。
对于丝状真菌宿主细胞有效的信号肽编码序列是从如下酶的基因获得的信号肽编码序列:黑曲霉中性淀粉酶、黑曲霉葡糖淀粉酶、米曲霉TAKA淀粉酶、特异腐质霉纤维素酶、特异腐质霉内切葡聚糖酶V、疏棉状腐质霉脂肪酶和曼赫根毛霉天冬氨酸蛋白酶。
对于酵母宿主细胞有用的信号肽从酿酒酵母α因子和酿酒酵母转化酶的基因获得。其它有用的信号肽编码序列由Romanos等,1992,见上文描述。
调控序列还可以是前肽编码序列,其编码位于多肽N端的前肽。所得多肽称为酶原(proenzyme)或前多肽(propolypeptide)(或在某些情况下称为酶原(zymogen))。前多肽通常是无活性的,并且能够通过前肽的催化或自催化切割从前多肽转化为活性多肽。可以从枯草芽孢杆菌碱性蛋白酶(aprE),枯草芽孢杆菌中性蛋白酶(nprT)、嗜热毁丝霉漆酶(WO95/33836)、曼赫根毛霉天冬氨酸蛋白酶和酿酒酵母α因子的基因获得前肽编码序列。
当信号肽和前肽序列二者均出现在多肽的N端时,将前肽序列置于紧接着(next to)多肽N端,并且将信号肽序列置于紧接着前肽序列的N端。
同样理想的是添加调节序列,其允许相对于宿主细胞的生长来调节多肽的表达。调节***的实例是引起基因表达响应化学或物理刺激物,包括调节化合物的存在而开启或关闭的那些***。原核***中的调节***包括lac、tac和trp操纵基因***。在酵母中,可使用ADH2***或GAL1***。在丝状真菌中,可以使用黑曲霉葡糖淀粉酶启动子、米曲霉TAKAα-淀粉酶启动子和米曲霉葡糖淀粉酶启动子。调节序列的其它实例是那些允许基因扩增的序列。在真核***中,这些调节序列包括在氨甲蝶呤(methotrexate)存在下扩增的二氢叶酸还原酶基因,和以重金属(with heavy metal)扩增的金属硫蛋白基因。在这些情况下,编码多肽的多核苷酸将与调节序列可操作地连接。
表达载体
本发明还涉及利用重组表达载体的重组宿主细胞和方法,所述重组表达载体包含编码碳酸氢根转运蛋白(和/或编码C4-二羧酸转运蛋白,编码苹果酸脱氢酶或丙酮酸羧化酶的多核苷酸)的异源多核苷酸,以及启动子;和转录和翻译终止信号。此类重组表达载体可用于任何本文中所述的重组细胞和方法。多种核苷酸和调控序列可以结合在一起以产生重组表达载体,所述表达载体可以包括一个或多个(几个)方便的限制位点以允许在这些位点***或取代编码多肽的多核苷酸。可供选择的是,可以通过在适当的用于表达的载体中***包含所述序列的多核苷酸或核酸构建体来表达所述多核苷酸。在制备表达载体的过程中,将编码序列置于载体中,从而将该编码序列与适当的表达调控序列可操作地连接。
重组表达载体可以是任何载体(例如,质粒或病毒),其能够方便地进行重组DNA步骤,并且能够产生多核苷酸的表达。载体的选择将通常依赖于载体与将引入该载体的宿主细胞的相容性。载体可以是线状或闭合环状质粒。
在一个方面,每个编码本文中所述的碳酸氢根转运蛋白,苹果酸脱氢酶,和/或丙酮酸羧化酶的多核苷酸包含于各自独立的载体上。在一个方面,至少两个所述多核苷酸包含于一个载体上。在一个方面,至少三个所述多核苷酸包含于一个载体上。在一个方面,所有编码碳酸氢根转运蛋白,C4-二羧酸转运蛋白,苹果酸脱氢酶,和/或丙酮酸羧化酶的多核苷酸包含于一个载体上。
载体可以是自主复制载体,即,作为染色体外实体(entity)存在的载体,其复制独立于染色体复制,例如,质粒、染色体外元件、微型染色体(minichromosome)或人工染色体。载体可以含有任何用于确保自复制的手段(means)。或者,载体可以是一种当被引入宿主细胞中时,整合到基因组中并且与整合了该载体的染色体一起复制的载体。此外,可以使用单独的载体或质粒或两个或更多个载体或质粒,其共同含有待引入宿主细胞基因组的完整DNA(total DNA),或可以使用转座子(transposon)。
载体优选含有一个或多个(几个)选择性标记,其允许简单选择经转化、转染、转导等的细胞。选择性标记是基因,其产物提供杀生物剂或病毒抗性、对重金属的抗性、对营养缺陷型的原养性(prototrophy to auxotrophs)等。
细菌选择性标记的实例是来自枯草芽孢杆菌或地衣芽孢杆菌的dal基因,或赋予抗生素抗性的标记,所述抗生素抗性如氨苄青霉素、氯霉素、卡那霉素或四环素抗性。对于酵母宿主细胞合适的标记是ADE2、HIS3、LEU2、LYS2、MET3、TRP1和URA3。用于丝状真菌宿主细胞的选择性标记包括但不限于amdS(乙酰胺酶)、argB(鸟氨酸氨甲酰基转移酶)、bar(草铵膦(phosphinothricin)乙酰转移酶)、hph(潮霉素磷酸转移酶)、niaD(硝酸还原酶)(nitrate reductase)、pyrG(乳清酸核苷-5’-磷酸脱羧酶)(orotidine-5’-phosphate decarboxylase)、sC(硫酸腺苷酰转移酶)和trpC(邻氨基苯甲酸合酶(anthranilate synthase))以及它们的等同物。优选用在曲霉属细胞中的是构巢曲霉或米曲霉的amdS和pyrG基因和吸水链霉菌(Streptomyces hygroscopicus)的bar基因。
载体优选含有允许载体整合入宿主细胞基因组或载体在细胞中独立于基因组的自主复制的元件。
为了整合入宿主细胞基因组,载体可依赖编码多肽的多核苷酸的序列、或任何其它载体元件,来通过同源或非同源重组整合入基因组。或者,载体可以含有额外的多核苷酸,用于指导通过同源重组整合入宿主细胞基因组染色体中的精确位置。为了增加在精确位置整合的可能性,整合元件应含有足够数量的与相应的目标序列具有高度序列同一性的核酸,如100至10,000个碱基对,400至10,000个碱基对,800至10,000个碱基对,以增强同源重组的概率。整合元件可以是任何,其宿主细胞基因组中的目标序列同源的序列。此外,整合元件可以是非编码或编码的多核苷酸。另一方面,可以将载体通过非同源重组整合到宿主细胞的基因组中。
为了自主复制,载体可以进一步包含复制起点。复制起点使载体能够在所述的宿主细胞中自主地复制。复制起点可以是在细胞中发挥功能,介导自主复制的任何质粒复制子(replicator)。术语“复制起点”或“质粒复制子”意指能够使质粒或载体发生体内复制的多核苷酸。
细菌复制起点的实例有:允许在大肠杆菌中复制的质粒pBR322、pUC19、pACYC177和pACYC184的复制起点,和允许在芽孢杆菌属中复制的质粒pUB110、pE194、pTA1060和pAMβ1的复制起点。
用于酵母宿主细胞中的复制起点的实例有2微米复制起点,ARS1,ARS4,ARS1和CEN3的组合,和ARS4和CEN6的组合。
在丝状真菌细胞中有用的复制起点的实例有AMA1和ANS1(Gems等,1991,Gene98:61-67;Cullen等,1987,Nucleic Acids Res.15:9163-9175;WO00/24883)。AMA1基因的分离和包含该基因的质粒或载体的构建可以根据公开于WO00/24883中的方法完成。
可以将多于一个拷贝的本文中所述的多核苷酸***宿主细胞以增加多肽的产生。多核苷酸拷贝数的增加可通过如下方法实现:使至少一个额外拷贝的序列整合入宿主细胞基因组,或使多核苷酸包含可扩增的选择性标记基因,其中可通过在合适的选择剂(selectable agent)存在下培养细胞来选出含有选择性标记基因的扩增拷贝,且由此选出含有多核苷酸的额外拷贝的细胞。
用于连接上述元件以构建本发明的重组表达载体的方法是本领域技术人员熟知的(参见,例如,Sambrook等,1989,见上文)。
宿主细胞
如本文中所述,本发明还涉及重组宿主细胞,其包含本文中所述的一种或几种多核苷酸,所述多核苷酸可以可操作地连接于一个或多个(几个)调控序列,所述调控序列指导一种或多种所述的多肽的表达,用于重组产生C4-二羧酸转运蛋白。本发明还涵盖使用此类宿主细胞产生C4-二羧酸的方法。所述宿主细胞可包含任何一种或多种本文中所述的多核苷酸的组合。举例而言,在一个方面,所述重组宿主细胞包含编码碳酸氢根转运蛋白的异源多肽,并任选地包含编码C4-二羧酸转运蛋白的异源多核苷酸,苹果酸脱氢酶的异源多核苷酸,和/或编码丙酮酸脱羧酶的异源多核苷酸;其中所述宿主细胞与不含有所述编码碳酸氢根转运蛋白的异源多核苷酸的宿主细胞相比,在相同条件下培养时,产生(或能够产生)更多量的C4-二羧酸。
在一个方面,所述重组宿主细胞包含:
(1)异源多核苷酸,其编码碳酸氢根转运蛋白,如选自下组的C4碳酸氢根转运蛋白:(a)碳酸氢根转运蛋白,其与SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:4或其成熟多肽序列具有至少60%序列同一性;(b)碳酸氢根转运蛋白,其由多核苷酸编码,所述多核苷酸在低严格条件下与以下杂交:(i)SEQ ID NO:1或3,或其成熟多肽编码序列,(ii)SEQ ID NO:1或3的cDNA序列,或其成熟多肽编码序列,(iii)(i)或(ii)的全长互补链;(c)碳酸氢根转运蛋白,其由多核苷酸编码,所述多核苷酸与(iv)SEQ ID NO:1或3,或其成熟多肽编码序列,(v)SEQID NO:1或3的cDNA序列,或其成熟多肽编码序列,(vi)(iv)或(v)的全长互补链具有至少60%序列同一性;(d)SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:4或其成熟多肽序列的包含一个或多个(几个)氨基酸的取代、缺失和/或***的碳酸氢根转运蛋白变体;和(e)(a)、(b)、(c)或(d)的多肽具有碳酸氢根转运蛋白活性的片段;
(2)任选的异源第二多核苷酸,其编码C4-二羧酸转运蛋白,如选自下组的C4-二羧酸转运蛋白:(a)C4-二羧酸转运蛋白,其与SEQ ID NO:6或其成熟多肽序列具有至少60%序列同一性;(b)C4-二羧酸转运蛋白,其由多核苷酸编码,所述多核苷酸在低严格条件下与SEQ ID NO:5,或其成熟多肽编码序列,或前述序列的全长互补链杂交;(c)C4-二羧酸转运蛋白,其由多核苷酸编码,所述多核苷酸与SEQ ID NO:5,其成熟多肽编码序列,或前述序列的全长互补链具有至少60%序列同一性;(d)SEQ ID NO:6或其成熟多肽序列的包含一个或多个氨基酸(例如两个、几个)的取代、缺失和/或***的C4-二羧酸转运蛋白变体;和(e)(a)、(b)、(c)或(d)的多肽具有C4-二羧酸转运蛋白活性的片段;
(3)任选的异源第三多核苷酸,其编码苹果酸脱氢酶,如选自下组的苹果酸脱氢酶:(a)苹果酸脱氢酶,其与SEQ ID NO:8或其成熟多肽序列具有至少60%序列同一性;(b)苹果酸脱氢酶,其由多核苷酸编码,所述多核苷酸在低严格条件下与以下杂交:(i)SEQ ID NO:7或其成熟多肽编码序列,(ii)SEQ ID NO:7的cDNA序列或其成熟多肽编码序列,或(iii)(i)或(ii)的全长互补链;(c)苹果酸脱氢酶,其由多核苷酸编码,所述多核苷酸与以下具有至少60%序列同一性:(iv)SEQ ID NO:7或其成熟多肽编码序列,(v)SEQ ID NO:7的cDNA序列或其成熟多肽编码序列,或(vi)(iv)或(v)的全长互补链;(d)SEQ ID NO:8或其成熟多肽序列的包含一个或多个氨基酸(几个)的取代、缺失和/或***的苹果酸脱氢酶变体;和(e)(a)、(b)、(c)或(d)的多肽具有苹果酸脱氢酶活性的片段;和
(4)任选的异源第四多核苷酸,其编码丙酮酸羧化酶,如选自下组的丙酮酸羧化酶:(a)丙酮酸羧化酶,其与SEQ ID NO:10或其成熟多肽序列具有至少60%序列同一性;(b)丙酮酸羧化酶,其由多核苷酸编码,所述多核苷酸在低严格条件下与以下杂交:(i)SEQ ID NO:9或其成熟多肽编码序列,(ii)SEQ IDNO:9的cDNA序列或其成熟多肽编码序列,或(iii)(i)或(ii)的全长互补链;(c)丙酮酸羧化酶,其由多核苷酸编码,所述多核苷酸与以下具有至少60%序列同一性:(iv)SEQ ID NO:9或其成熟多肽编码序列,(v)SEQ ID NO:9的cDNA序列或其成熟多肽编码序列,或(vi)(iv)或(v)的全长互补链;(d)SEQ ID NO:10或其成熟多肽序列的包含一个或多个氨基酸(几个)的取代、缺失和/或***的丙酮酸羧化酶变体;和(e)(a)、(b)、(c)或(d)的多肽具有丙酮酸羧化酶活性的片段;
其中所述宿主细胞与不含有所述一种或多种(几种)多核苷酸(例如不含有编码碳酸氢根转运蛋白的异源多核苷酸)的宿主细胞相比在相同条件下培养时产生(或能够产生)更多量的C4-二羧酸(例如苹果酸)。
将包含一种或多种(几种)多核苷酸的构建体或载体(或多个构建体或载体)导入宿主细胞,使所述构建体或载体如前所述作为染色体整合体或者作为自复制的染色体外载体维持。术语“宿主细胞”涵盖任何亲本细胞的后代,其由于在复制中发生的突变而与亲本细胞不同。在一些情况下,宿主细胞的选择会很大程度上依赖于编码多肽的基因及其来源。下文中所述的方面适用于宿主细胞本身,以及使用宿主细胞的方法。
所述宿主细胞可为任何能够重组产生本发明的多肽的细胞,例如原核细胞或真核细胞,和/或任何能够重组产生C4-二羧酸(例如苹果酸)的细胞。
原核宿主细胞可以是任何革兰氏阳性或革兰氏阴性细菌。***包括但不限于,芽孢杆菌属、梭菌属、肠球菌属、地芽孢杆菌属、乳杆菌属、乳球菌属、海洋芽孢杆菌属、葡萄球菌属、链球菌属和链霉菌属。革兰氏阴性细菌包括但不限于,弯曲杆菌属、大肠杆菌、黄杆菌属、梭杆菌属、螺杆菌属、泥杆菌属、奈瑟氏菌属、假单胞菌属、沙门氏菌属和脲原体属。
细菌宿主细胞可以是任何芽孢杆菌属细胞,包括但不限于嗜碱芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌、短芽孢杆菌、环状芽孢杆菌、克劳氏芽孢杆菌、凝结芽孢杆菌、坚强芽孢杆菌、灿烂芽孢杆菌、迟缓芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌、短小芽孢杆菌、嗜热脂肪芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌和苏云金芽孢杆菌细胞。
细菌宿主细胞还可以是任何链球菌属细胞,包括但不限于,似马链球菌、酿脓链球菌、***链球菌和马链球菌兽瘟亚种细胞。
细菌宿主细胞还可以是任何链霉菌属细胞,包括但不限于,不产色链霉菌、除虫链霉菌、天蓝链霉菌、灰色链霉菌和浅青紫链霉菌细胞。
可通过如下方法实现将DNA引入到芽孢杆菌属细胞:例如原生质体转化(参见,例如,Chang和Cohen,1979,Mol.Gen.Genet.168:111-115),使用感受态细胞(参见,例如,Young和Spizizen,1961,J.Bacteriol.81:823-829或Dubnau和Davidoff-Abelson,1971,J.Mol.Biol.56:209-221),电穿孔(参见,例如,Shigekawa和Dower,1988,Biotechniques6:742-751)或接合(参见,例如,Koehler和Thorne,1987,J.Bacteriol.169:5771-5278)。可通过如下方法实现将DNA引入到大肠杆菌细胞:例如原生质体转化(参见,例如,Hanahan,1983,J.Mol.Biol.166:557-580)或电穿孔(参见,例如,Dower等,1988,Nucleic Acids Res.16:6127-6145)。可通过如下方法实现将DNA引入到链霉菌属细胞:例如原生质体转化和电穿孔(参见,例如,Gong等,2004,Folia Microbiol.(Praha)49:399-405),接合(参见,例如,Mazodier等,1989,J.Bacteriol.171:3583-3585),或转导(参见,例如,Burke等,2001,Proc.Natl.Acad.Sci.USA98:6289-6294)。可通过如下方法实现将DNA引入到假单胞菌属细胞:例如电穿孔(参见,例如,Choi等,2006,J.Microbiol.Methods64:391-397)或接合(参见,例如,Pinedo和Smets,2005,Appl.Environ.Microbiol.71:51-57)。可通过如下方法实现将DNA引入到链球菌属细胞:例如天然感受态(natural competence)(参见,例如,Perry和Kuramitsu,1981,Infect.Immun.32:1295-1297),原生质体转化(参见,例如,Catt和Jollick,1991,Microbios.68:189-207),电穿孔(参见,例如,Buckley等,1999,Appl.Environ.Microbiol.65:3800-3804)或接合(参见,例如,Clewell,1981,Microbiol.Rev.45:409-436)。然而,可以使用本领域已知的将DNA引入宿主细胞的任何方法。
宿主细胞还可以是真核生物,如哺乳动物、昆虫、植物或真菌细胞。
所述宿主细胞可为真菌细胞。“真菌”用在本文包括以下门:子囊菌门(Ascomycota)、担子菌门(Basidiomycota)、壶菌门(Chytridiomycota)和接合菌门(Zygomycota)(如由Hawksworth等,于Ainsworth and Bisby’s Dictionary of TheFungi,第8版,1995,CAB International,University Press,Cambridge,UK中所定义)以及卵菌门(Oomycota)(如Hawksworth等,1995,见上,171页中所引用)和所有有丝***孢子真菌(mitosporic fungi)(Hawksworth等,1995,见上)。
所述真菌宿主细胞可为酵母细胞。“酵母”用在本文包括产子囊酵母(ascosporogenous yeast)(内孢霉目(Endomycetales))、产担子酵母(basidiosporogenous yeast)和属于半知菌类(Fungi Imperfecti)(芽孢纲(Blastomycetes))的酵母。由于酵母的分类在未来可能改变,就本发明而言,将酵母定义为如Biology and Activities of Yeast(Skinner,F.A.,Passmore,S.M.,和Davenport,R.R.编,Soc.App.Bacteriol.Symposium Series No.9,1980)中所述。
所述酵母宿主细胞可为假丝酵母属、汉逊酵母属(Hansenula)、克鲁维酵母属、毕赤酵母属、酵母属、裂殖酵母属或西洋蓍霉属细胞,如乳酸克鲁维酵母(Kluyveromyces lactis)、卡尔酵母、酿酒酵母、糖化酵母、道格拉氏酵母、克鲁弗酵母、诺地酵母、卵形酵母、或解脂西洋蓍霉(Yarrowia lipolytica)细胞。
所述真菌宿主细胞可为丝状真菌细胞。“丝状真菌”包括真菌门(Eumycota)和卵菌门的亚门(如由Hawksworth等,1995,见上文,所定义)的所有丝状形式。丝状真菌通常的特征在于由壳多糖(chitin)、纤维素、葡聚糖、壳聚糖(chitosan)、甘露聚糖和其它复杂多糖组成的菌丝体壁。通过菌丝延伸进行营养生长,而碳分解代谢是专性需氧的。相反,酵母例如酿酒酵母的营养生长通过单细胞菌体的出芽生殖(budding)进行,而碳分解代谢可以是发酵性的。
所述丝状真菌宿主细胞可为枝顶孢霉属、曲霉属、短梗霉属、烟管霉属(Bjerkandera)、拟蜡菌属、金孢子菌属、鬼伞属(Coprinus)、革盖菌属(Coriolus)、隐球菌属、Filibasidium、镰孢属、腐质霉属、梨孢菌属、毛霉属、毁丝霉属、新考玛脂霉属、脉孢菌属、拟青霉属、青霉属、平革菌属(Phanerochaete)、射脉菌属(Phlebia)、瘤胃壶菌属、侧耳属(Pleurotus)、裂褶菌属、踝节菌属、嗜热子囊菌属、梭孢壳属、弯颈霉属、栓菌属(Trametes)或木霉属细胞。
所述丝状真菌宿主细胞可为棘孢曲霉、泡盛曲霉、烟曲霉、臭曲霉、日本曲霉、构巢曲霉、黑曲霉、米曲霉、黑刺烟管菌(Bjerkandera adusta)、干拟蜡菌(Ceriporiopsis aneirina)、Ceriporiopsis caregiea、Ceriporiopsis gilvescens、Ceriporiopsis pannocinta、Ceriporiopsis rivulosa、Ceriporiopsis subrufa、虫拟蜡菌(Ceriporiopsis subvermispora)、Chrysosporium inops、嗜角质金孢子菌、Chrysosporium lucknowense、Chrysosporium merdarium、毡金孢子菌、Chrysosporiumqueenslandicum、热带金孢子菌、Chrysosporium zonatum、灰盖鬼伞(Coprinuscinereus)、毛革盖菌(Coriolus hirsutus)、杆孢状镰孢、禾谷镰孢、库威镰孢、大刀镰孢、禾本科镰孢、禾赤镰孢、异孢镰孢、合欢木镰孢、尖镰孢、多枝镰孢、粉红镰孢、接骨木镰孢、肤色镰孢、拟分枝孢镰孢、硫色镰孢、圆镰孢、拟丝孢镰孢、镶片镰孢、特异腐质霉、疏棉状腐质霉、米黑毛霉、嗜热毁丝霉、粗糙脉孢菌、产紫青霉、黄孢平革菌、辐射射脉菌(Phlebia radiata)、刺芹侧耳(Pleurotuseryngii)、土生梭孢霉、长绒毛栓菌(Trametes villosa)、变色栓菌(Trametes versicolor)、哈茨木霉、康宁木霉、长枝木霉、里氏木霉或绿色木霉细胞。
在一个方面,所述宿主细胞是曲霉属宿主细胞。在另一个方面,所述宿主细胞是米曲霉。
可以将真菌细胞通过涉及原生质体形成、原生质体转化和细胞壁再生的方法以本身公知的方式转化。用于转化曲霉属和木霉属宿主细胞的合适方法在EP238023和Yelton等,1984,Proc.Natl.Acad.Sci.USA81:1470-1474中描述。用于转化镰孢属菌种的合适方法由Malardier等,1989,Gene78:147-156和WO96/00787描述。可以使用由如下文献描述的方法转化酵母:Becker和Guarente,于Abelson,J.N.和Simon,M.I.编,Guide to Yeast Genetics and Molecular Biology,Methods inEnzymology,Volume194,pp182-187,Academic Press,Inc.,New York;Ito等,1983,J.Bacteriol.153:163;和Hinnen等,1978,Proc.Natl.Acad.Sci.USA75:1920。
在一些方面,所述宿主细胞包含一种或多种(几种)本文中所述的多核苷酸,其中所述宿主细胞与不含有所述一种或多种(几种)多核苷酸的宿主细胞相比在相同条件下培养时分泌(或能够分泌)增加水平的C4-二羧酸。在一些方面,所述宿主细胞与不含有所述一种或多种(几种)多核苷酸(例如不含有编码碳酸氢根转运蛋白的异源多核苷酸)的宿主细胞相比,在相同条件下培养时,分泌(或能够分泌)的C4-二羧酸(例如苹果酸)增加至少5%,例如至少10%,至少15%,至少20%,至少25%,至少50%,至少100%,至少150%,至少200%,至少300%,或500%水平。
在本文中所述的重组宿主细胞和方法的任何方面中,所述C4-二羧酸可为苹果酸、琥珀酸、草酰乙酸、丙二酸或延胡索酸,或其组合。在一些方面中,所述C4-二羧酸是苹果酸、琥珀酸或延胡索酸,或其组合。在一些方面中,所述C4-二羧酸是苹果酸或延胡索酸,或苹果酸和延胡索酸的组合。在一些方面中,所述C4-二羧酸是苹果酸。
在任何这些方面,所述宿主细胞产生(和/或能够产生)高于理论值至少10%,例如至少20%,至少30%,至少40%,至少50%,至少60%,至少70%,至少80%或至少90%的产率。
在任何这些方面,所述重组宿主具有大于约0.1g/L每小时,例如,大于约0.2g/L每小时,0.5g/L每小时,0.6g/L每小时,0.7g/L每小时,0.8g/L每小时,0.9g/L每小时,1.0g/L每小时,1.1g/L每小时,1.2g/L每小时,1.3g/L每小时,1.5g/L每小时,1.75g/L每小时,2.0g/L每小时,2.25g/L每小时,2.5g/L每小时,或3.0g/L每小时;或约0.1g/L每小时至约2.0g/L每小时,例如,约0.3g/L每小时至约1.7g/L每小时,约0.5g/L每小时至约1.5g/L每小时,约0.7g/L每小时至约1.3g/L每小时,约0.8g/L每小时至约1.2g/L每小时,或约0.9g/L每小时至约1.1g/L每小时的C4-二羧酸体积生产力(volumetric productivity)(例如苹果酸体积生产力)。
可将所述重组宿主细胞在适于产生碳酸氢根转运蛋白、C4-二羧酸转运蛋白、苹果酸脱氢酶或丙酮酸羧化酶的营养培养基中使用本领域中公知的方法进行培养。例如,可以通过在合适培养基中在允许表达和/或分离合意的多肽的条件下进行的摇瓶培养或实验室或工业发酵罐中的小规模或大规模发酵(包括连续、分批、补料分批或固态发酵)来培养细胞。使用本领域已知的方法在合适的营养培养基中进行培养,所述营养培养基包含碳源和氮源和无机盐。合适的培养基能够从商业供应商获得或可以根据公开的组成制备(例如,在美国典型培养物保藏中心的目录中),或可从商业上可获得的成分制备。
所述碳酸氢根转运蛋白、C4-二羧酸转运蛋白、苹果酸脱氢酶和丙酮酸羧化酶,及其活性,可使用本领域中公知的方法检测。这些检测方法可包括使用特异性抗体,酶产物的形成,或酶底物的消失。参见,例如Sambrook等,MolecularCloning:A Laboratory Manual,第3版,Cold Spring Harbor Laboratory,New York(2001);Ausubel等,Current Protocols in Molecular Biology,John Wiley and Sons,Baltimore,MD(1999);及Hanai等,Appl.Environ.Microbiol.73:7814-7818(2007))。
方法
本发明亦涉及使用本文中所述的重组宿主细胞产生C4-二羧酸的方法。在一个方面,本发明涵盖产生C4-二羧酸(例如苹果酸)的方法,其包括:(a)在合适的条件下在培养基中培养任一种本文中所述的重组宿主细胞(例如任何具有碳酸氢根转运蛋白活性,C4-二羧酸转运蛋白活性,苹果酸脱氢酶活性,和/或丙酮酸羧化酶活性的宿主细胞)以产生C4-二羧酸;和(b)回收所述C4-二羧酸。在一个方面,本发明涵盖产生C4-二羧酸(例如苹果酸)的方法,其包括:(a)在合适的条件下在培养基中培养任一种本文中所述的重组宿主细胞,其中所述宿主细胞包含编码碳酸氢根转运蛋白的异源多核苷酸,以及任选地,编码C4-二羧酸转运蛋白的异源多核苷酸,编码苹果酸脱氢酶的异源多核苷酸,和/或编码丙酮酸羧化酶的异源多核苷酸,以产生C4-二羧酸;和(b)回收所述C4-二羧酸。在一个方面,所述培养基是发酵培养基。
在所述方法的一个方面,以大于约10g/L,例如,大于约25g/L,50g/L,75g/L,100g/L,125g/L,150g/L,160g/L,170g/L,180g/L,190g/L,200g/L,210g/L,225g/L,250g/L,275g/L,300g/L,325g/L,350g/L,400g/L,或500g/L;或约10g/L至约500g/L,例如,约50g/L至约350g/L,约100g/L至约300g/L,约150g/L至约250g/L,约175g/L至约225g/L,或约190g/L至约210g/L的效价产生所述C4-二羧酸(例如苹果酸)。
在所述方法的一个方面,产生的C4-二羧酸(例如苹果酸)的量在相同条件下培养时与不含有编码所述碳酸氢根转运蛋白的多核苷酸的宿主细胞相比,高至少5%,例如至少10%,至少15%,至少20%,至少25%,至少30%,至少50%,或至少100%。
在所述方法的一个方面,所述C4-二羧酸选自下组:苹果酸、琥珀酸、草酰乙酸、丙二酸和延胡索酸。在一个方面,所述C4-二羧酸是苹果酸。
所述重组的C4-二羧酸可任选地从发酵培养基使用任何本领域中已知的方法回收(参见例如,WO1998/022611和U.S.7,601,865),所述方法包括但不限于层析(例如大小排阻层析,吸附层析,离子交换层析),电泳方法,差示溶解度,渗透,蒸馏,提取(例如液液萃取),渗透蒸发,萃取性过滤(extractivefiltration),膜过滤,膜分离,反相(reverse)或超滤。在一个实例中,所述C4-二羧酸从发酵培养基中的其它材料通过过滤来回收。
在所述方法的一些方面,在任选地纯化之前和/或之后的重组C4-二羧酸是基本上纯的。对于产生C4-二羧酸(或其具体C4-二羧酸,如苹果酸)的方法,“基本上纯的”意指含有不超过15%杂质的回收的C4-二羧酸制备物,其中杂质已知除了C4-二羧酸以外的化合物。在一种变化中,提供基本上纯的C4-二羧酸制备物,其中所述制备物含有不超过25%杂质,或不超过20%杂质,或不超过10%杂质,或不超过5%杂质,或不超过3%杂质,或不超过1%杂质,或不超过0.5%杂质。
可使用本领域中已知的方法进行对本文中所述的产生方法和宿主细胞合适的测试C4-二羧酸的产生的测定法。举例而言,最终C4-二羧酸产物(例如苹果酸)和其它有机化合物,可通过如HPLC(高效液相色谱),GG-MS(气相色谱-质谱),和LC-MS(液相色谱-质谱)的方法或其它合适的分析方法,用本领域中公知的常规步骤进行分析。发酵液中C4-二羧酸的释放亦可用培养上清进行测试。发酵培养基中的副产物和残余糖(例如葡萄糖)可通过HPLC,例如使用供葡萄糖和醇类用的折射率检测器,和供有机酸用的UV检测器(Lin等,Biotechnol.Bioeng.90:775-779(2005))的HPLC,或其它本领域中公知的合适的测定和检测方法来定量。
本发明进一步通过下述实施例描述,其不应视为对本发明范围的限制。
实施例
用作缓冲液和底物是至少试剂级的商品。
真菌菌株
使用米曲霉NRRL3488(或ATCC56747)作为碳酸氢根转运蛋白基因(bt1)丙酮酸羧化酶基因(pyc)、苹果酸脱氢酶基因(mdh3)的来源,并用于产生C4-二羧酸。棘孢曲霉用作C4-二羧酸转运蛋白基因(c4t521)的来源。
培养基
YEG培养基组成为:20g葡萄糖,5g酵母提取物,和去离子水加至1升。
COVE平板组成为:1M蔗糖,2%COVE盐溶液,10mM乙酰胺,15mMCsCl,和25g/l高贵级琼脂(Agar Noble)。
COVE盐溶液组成为:26g KCl,26g MgSO4·7H2O,76g KH2PO4,50mlCOVE痕量元素溶液,和去离子水加至1升。
COVE痕量元素溶液组成为:0.04g Na2B4O7·10H2O,0.04g CuSO4·5H2O,1.2g FeSO4·7H2O,0.7g MnSO4·H2O,0.8g Na2MoO2·2H2O,10g ZnSO4·7H2O和去离子水加至1升。
种子培养基组成为:40g葡萄糖,6g细菌蛋白胨(Bacto peptone),750mgKH2PO4,750mg K2HPO4,100mg MgSO4·7H2O,100mg CaCl2·H2O,5mgFeSO4·7H2O,5mg NaCl,和去离子水加至1升。
种子培养基B组成为:30g葡萄糖,3g细菌蛋白胨,560mg KH2PO4,560mg K2HPO4,925mg NaH2PO4·H2O,820mg Na2HPO4,75mg MgSO4·7H2O,75mgCaCl2·H2O,0.75ml的1000X微量营养物溶液(Micronutrient Solution),和去离子水加至1升。
产酸培养基C组成为:100g葡萄糖,80g CaCO3,6g细菌蛋白胨,150mg KH2PO4,150mg K2HPO4,100mg MgSO4·7H2O,100mg CaCl2·H2O,1ml1000X微量营养物溶液,和去离子水加至1升。
发酵罐分批培养基组成为:60g葡萄糖,120g CaCO3,9g Bacto-peptone,150mg KH2PO4,150mg K2HPO4,100mg MgSO·7H2O,100mg CaCl2-2H2O,5mg FeSO4·7H2O,5mg NaCl,5mL Pluronic L61,和去离子水加至1升。
1000X微量营养物溶液组成为:5g NaCl,5g FeSO4·7H2O,1g柠檬酸,和去离子水加至1升。
PDA平板组成为:39g/l马铃薯右旋糖琼脂。
2XYT+amp平板组成为16g胰蛋白胨,10g酵母提取物,5g NaCl,100mg氨苄青霉素,15g细菌琼脂(Bacto agar),和去离子水加至1升。
实施例1:米曲霉碳酸氢根转运蛋白基因(bt1)的克隆和表达载体pAmFs69的构建
通过PCR扩增从米曲霉NRRL3488基因组DNA克隆碳酸氢根转运蛋白基因bt1(AO090012000782),PCR扩增使用与在已公开的米曲霉ATCC42149基因组序列(Galagan等,2005,Nature438:1105-1115)中发现的预测的米曲霉碳酸氢根转运蛋白基因模型号AO090012000782同源的引物。
来自米曲霉NRRL3488的基因组DNA的分离通过下述进行:用2X106个孢子接种摇瓶中的100ml YEG培养基,并在37℃200rpm振荡下将烧瓶温育过夜。将菌丝体收集在衬有(Calbiochem,San Diego,CA,USA)的漏斗中,并将大约2克的组织冻结于液氮。在冷的杵和研钵中研磨来破坏菌丝体。使用植物大提试剂盒(Plant Maxi Kit)(QIAGEN Inc.,Valencia,CA,USA),根据生产商的指示从粉末化的菌丝体分离基因组DNA。使用下示的正向引物069824和反向引物069825扩增米曲霉bt1基因:
引物069824:
5’-GTGATAGAACATCGTCCATAATGGAATCCAGCGCTGTACA-3’(SEQ ID NO:11)
引物069825:
5’-GTGTCAGTCACCTCTAGTTAtcagatttcaatctcgtctt-3’(SEQ ID NO:12)
扩增反应使用Hot Start高保真DNA聚合酶(Hot StartHigh-Fidelity DNA Polymerase)(Finnzymes OY,Finland)根据生产商的指示进行。每个PCR反应体系包含47ng米曲霉NRRL3488基因组DNA,dNTPs各200μM,50pM正向引物,50pM反向引物,1XGC Buffer反应缓冲液(Finnzymes OY,Finland),和50个单位的热启动高保真DNA聚合酶,终体积为50μl。将扩增反应体系在 (Eppendorf Scientific Inc.,Westbury,NY,USA)中温育,其编程如下:1个循环,在98℃进行30秒;35个循环,每个在98℃进行10秒,66℃进行30秒,和72℃进行2.5分钟;和1个循环,在72℃进行10分钟。PCR产物通过50mM Tris碱-50mM乙酸-0.1mM EDTA二钠盐(TAE)中的1%琼脂糖凝胶电泳进行纯化。从凝胶切出大约2.5kb的片段,并使用凝胶提取试剂盒(QIAGEN Inc.,Valencia,CA,USA)从琼脂糖提取出来。
将质粒pShTh60(图1,亦参见2010年8月27日提交的PCR申请号PCT/US10/47002)用Sex AI和Pac I消化,通过在TBE缓冲液(10.8g/L Tris碱,5.5g/L硼酸,2mM EDTA,pH8.0)中的0.8%琼脂糖凝胶电泳分离,并使用凝胶提取试剂盒(QIAGEN Inc.,Valencia,CA,USA)纯化。然后使用In-FusionTM Advantage反应试剂盒(Clontech,Mountain View,CA,USA)根据生产商的指示将上述纯化的PCR产物***经消化的pShTh60片段,得到质粒pAmFs69(图2)。
对所得的转化体使用DNA序列分析以确认bt1编码序列的完整性。使用下示的引物610849,610851,610853,610855,610857,610859,和610861,以及ABI3130XL DNA分析仪(Applied Biosystems,Inc.,Foster City,CA,USA)和带染料终止物化学的引物步移技术(Giesecke等,1992,J.Virol.Methods38:47-60)。
引物610849:5’-GAACAGGAAGAAATCCAAAA-3'(SEQ ID NO:13)
引物610851:5’-GTCGGCATAGCCACTGCAAT-3'(SEQ ID NO:14)
引物610853:5’-TGTTGCCGCCAAGGGACTTA-3'(SEQ ID NO:15)
引物610855:5’-CCGAGAGCGTTGAGTTAATC-3'(SEQ ID NO:16)
引物610857:5’-AGCATTAGGGCTAGCTCCGT-3'(SEQ ID NO:17)
引物610859:5’-CCAAGATGCCATGTCAGGAC-3'(SEQ ID NO:18)
引物610861:5’-TCACAAAAGAGTAGAGGCCA-3'(SEQ ID NO:19)
米曲霉bt1基因的基因组DNA序列的核苷酸构建体(SEQ ID NO:1)和推导的氨基酸序列(SEQ ID NO:2)示于图3A和3B。2503bp的基因组编码序列(包含一个终止密码子)由三个78bp(465-542),51bp(1173-1223),和61bp(1747-1807)的内含子分隔。相应的cDNA序列(图3A和3B中所示的粗体核苷酸序列)为2313bp,包含一个终止密码子。预测的编码蛋白为770个氨基酸,具有83.9kDa的预测的分子量和6.9的等电点pH。
实施例2:米曲霉碳酸氢根转运蛋白基因AO090003000798的克隆和相应的表达载体的构建
通过PCR扩增从米曲霉NRRL3488基因组DNA克隆碳酸氢根转运蛋白基因bt2(AO090003000798),PCR扩增使用与在已公布的米曲霉ATCC42149基因组序列(Galagan等,2005,见上)中发现的米预测的曲霉碳酸氢根转运蛋白基因模型号AO090003000798同源的引物。
来自米曲霉NRRL3488的基因组DNA的分离和菌丝体的收获和处理如实施例1中所述。使用下示的正向引物0614058和反向引物0614057扩增米曲霉bt2基因:
引物0614058:
5'-gtgatagaacatcgtccataatgccgggcgatctcaaaacc-3'(SEQ ID NO:52)
引物0614057:
5'-gtgtcagtcacctctagttactatgcatcaaggacattc-3'(SEQ ID NO:53)
扩增反应使用Hot Start高保真DNA聚合酶(Finnzymes)根据生产商的指示进行。每个PCR反应体系包含47ng米曲霉NRRL3488基因组DNA,dNTPs各200μM,50pM正向引物,50pM反向引物,1XGCBuffer反应缓冲液(Finnzymes),和50个单位的Hot Start高保真DNA聚合酶,终体积为50μl。将扩增反应体系在 (Eppendorf Scientific Inc.)中温育,其编程如下:1个循环,在98℃进行2分钟;35个循环,每个在98℃进行15秒,65℃进行15秒,和74℃进行1分钟;和1个循环,在74℃进行1分钟。将PCR产物通过50mMTris碱-50mM乙酸-0.1mM EDTA二钠盐(TAE)中的1%琼脂糖凝胶电泳进行纯化。将大约2.7kb的片段从凝胶切出,并使用凝胶提取试剂盒(QIAGEN Inc.)从琼脂糖提取出来。
将质粒pShTh77(图11)用Sex AI和Pac I消化,通过在TBE缓冲液(10.8g/L Tris碱,5.5g/L硼酸,2mM EDTA,pH8.0)中的0.8%琼脂糖凝胶电泳分离,并使用凝胶提取试剂盒(QIAGEN Inc.,Valencia,CA,USA)纯化。然后将上述纯化的PCR产物使用In-FusionTM Advantage反应试剂盒(Clontech)根据生产商的指示***消化的pShTh77片段,得到质粒pShTh147(图12)。
对所得的转化体使用DNA序列分析以确认bt2编码序列的完整性。使用下示的引物0614313,0614314,996270,和0611428,以及ABI3130XL DNA分析仪(Applied Biosystems,Inc.,Foster City,CA,USA)和带染料终止子化学的引物步移技术(Giesecke等,1992,J.Virol.Methods38:47-60)。
引物0614313:5’-gattgagatcggcatttact-3'(SEQ ID NO:54)
引物0614314:5’-acgcggaacagcagaatggc-3'(SEQ ID NO:55)
引物996270:5’-CTATAGCGAAATGGATTGATTGTCT-3'(SEQ ID NO:56)
引物0611428:5’-TTCACCGTGAAACGTATTGA-3'(SEQ ID NO:57)
米曲霉bt1基因的基因组DNA序列的核苷酸构建体(SEQ ID NO:3)和推导的氨基酸序列(SEQ ID NO:4)示于图4A和4B。2657bp的基因组编码序列(包含终止密码子)由两个64bp(302-365)和61bp(512-572)的内含子分隔。相应的cDNA序列(图4A和4B中所示的粗体核苷酸序列)为2532bp,包含一个终止密码子。预测的编码蛋白为843个氨基酸,具有92.5kDa的预测的分子量和8.4的等电点pH。
实施例3:棘孢曲霉C4-二羧酸转运蛋白基因的克隆和载体pSaMF36的构建
通过用2X106个孢子接种摇瓶中的100ml YEG培养基,并在34℃在160rpm振荡下将烧瓶温育过夜来分离来自棘孢曲霉的基因组DNA。通过使用衬有(Calbiochem,San Diego,CA,USA)的漏斗过滤来收获菌丝体,并回收大约2克的菌丝体并冻结于液氮。在冻结的菌丝体包裹在内时,迅速用锤子敲碎来将其打断。然后将经打断的菌丝体转移至50ml聚丙烯锥形离心管中,离心管装有10ml的1X裂解缓冲液(100mMEDTA,10mM Tris pH8.0,1%X-100,0.5M盐酸胍,200mM NaCl)和3μl的RNase A(QIAGEN Inc.,Valencia,CA,USA,100mg/ml)。通过轻柔地涡旋试管来混合,然后在室温温育5分钟,接着添加150μl蛋白酶K(QIAGENInc.,Valencia,CA,USA;20mg/ml)。通过倒置试管来混合,并在50℃温育试管1小时。然后将试管在7240x g离心20分钟。然后将上清加到经预平衡的QIAGEN-tip100(QIAGEN Inc.,Valencia,CA,USA)上,根据生产商的指示来进行其余的DNA提取步骤。将DNA重悬于100μl TE缓冲液(10mM Tris碱,1mM EDTA,pH8.0)。
使用下示的引物069700和069701从分离的棘孢曲霉基因组DNA扩增了1257bp的C4-二羧酸转运蛋白基因c4t521。
引物069700:
5’-TGTGATAGAACATCGTCCATAATGCACGACCACAGC-3’(SEQ IDNO:20)
引物069701:
5’-GTGTCAGTCACCTCTAGTTATCATTCGAACAACTCGGACA-3’(SEQ ID NO:21)
PCR反应体系由10μl5X反应缓冲液,1μl棘孢曲霉基因组DNA模板(105ng/μl),1μl引物069700(100ng/μl),1μl引物069701(100ng/μl),1μldNTP混合物(10mM),35.5μl去离子水,和0.5μl PhusionTM Hot Start高保真聚合酶(Finnzymes,Inc,Massachusetts,USA)构成。将扩增反应体系在中温育,其编程如下:1个循环,在98℃进行30秒;30个循环,每个在98℃进行10秒,60℃进行30秒,72℃进行1分钟,和1个循环,在72℃进行10分钟。将PCR产物用Dpn I消化1小时以降解任何质粒DNA模板。
将质粒pShTh60(图1)用Sex AI和Pac I消化,通过在TBE缓冲液中的0.8%琼脂糖凝胶电泳分离,并使用凝胶提取试剂盒纯化。然后使用In-FusionTM Advantage反应试剂盒将上述纯化的PCR产物***该经消化的pShTh60片段,组成为:2μl5X缓冲液、3μl纯化的PCR产物(26ng/μl)、1.5μl凝胶纯化的Sex AI和Pac I消化的和凝胶纯化的pShTh60(132ng/μl)、1μl In-FusionTM酶和2.5μl去离子水。将反应体系在37℃温育15分钟,50℃温育15分钟,置于冰上5分钟,并用40μl TE缓冲液稀释,得到pSaMF36(图5)。
将2.5μl等份的连接反应体系根据生产商的指示转化至ONE TOP10化学感受态大肠杆菌细胞。将转化体铺板于2XYT+amp平板上并在37℃温育过夜。挑取所得的转化体对其进行DNA测序以确认mat521基因成功地整合入载体。
棘孢曲霉c4t521基因的基因组DNA序列的核苷酸构建体(SEQ ID NO:5)和推导的氨基酸序列(SEQ ID NO:6)示于图6。1257bp的基因组编码序列(包括终止密码子)不含内含子。预测的编码蛋白为418个氨基酸,具有46.8kDa的预测的分子量和6.36的等电点pH。使用SignalP程序(Nielsen等,1997,Protein Engineering10:1-6),预测了一条17个残基的信号肽。基于该程序,预测的成熟蛋白含有401个氨基酸,具有44.9kDa的预测的分子量和6.89的等电点pH。
实施例4:米曲霉苹果酸脱氢酶基因的克隆和表达载体pSaMF21的构建
构建了质粒pSaMF21,该质粒含有NAD依存性苹果酸脱氢酶(mdh3)基因序列(DOGAN:AO090701000013),其是来自米曲霉的一个1430bp片段,如2010年8月27日提交的PCT申请号PCT/US10/47002中所述。米曲霉NRRL3488苹果酸脱氢酶mdh3基因的基因组DNA序列的核苷酸构建体(SEQ IDNO:7)和推导的氨基酸序列(SEQ ID NO:8)示于图7。1430bp的基因组编码序列(包括终止密码子)被57bp(14-70bp),70bp(103-172bp),74bp(284-357bp),68bp(446-513bp),58bp(892-949bp),48bp(1035-1082bp),和62bp(1228-1289bp)的7个内含子分隔开来。mdh3基因的编码区的G+C含量为50.3%。对应的cDNA序列(图7中所示的粗体核苷酸序列)为993个bp,包含一个终止密码子。预测的编码蛋白为330个氨基酸,具有34.5kDa的预测的分子量,和6.79的等电点pH。
简言之,该质粒是通过用Sex AI和Pac I进行的限制性消化使pShTh60直链化(图1)而构建的。将经消化的载体通过TBE缓冲液中的0.8%琼脂糖凝胶电泳分离,并使用凝胶提取试剂盒纯化。使用引物067522和067525从pShTh71(2010年8月27日提交的PCT申请号PCT/US10/47002)扩增mdh3基因。
引物067522:
5’-AGAACATCGTCCATAATGGTCAAAGCTGGTGAGTTA-3’(SEQ IDNO:22)
引物067525:
5’-GTGTCAGTCACCTCTAGTTATTACTTTGGTGGTGGGTTCT-3’(SEQID NO:23)
PCR反应体系由5μl10X反应缓冲液,1μl pShTh71模板(87ng/μl),1μl引物067522(100ng/μl),1μl引物067525(100ng/μl),1μl dNTP混合物(10mM),45.5μl去离子水,和0.5μlHotStart DNA聚合酶(Stratagene,La Jolla,CA,USA)构成。将扩增反应体系在 中温育,其编程为:1个循环,在95℃进行2分钟;10个循环,每循环在95℃进行10秒,58℃进行30秒,和72℃进行1.5分钟;20个循环,每循环在95℃进行10秒,50℃进行30秒,和72℃进行1.5分钟且每个循环增加10秒。对PCR反应体系用Dpn I进行限制性消化1小时,以降解任何质粒DNA模板。然后使用PCR纯化试剂盒(QIAGEN Inc.,Valencia,CA,USA)纯化PCR产物。将纯化的PCR产物使用In-FusionTMAdvantage反应***载体,其中所述反应体系由2μl5X缓冲液,0.5μl纯化的PCR产物(110ng/μl),1.7μl凝胶纯化的经Sex AI和Pac I限制性消化的pShTh60(图1;78ng/μl),1μl In-FusionTM酶和4.8μl去离子水构成。将反应体系在37℃温育15分钟,接着在50℃温育15分钟,之后将其置于冰上5分钟,并用40μl TE缓冲液稀释,得到pSaMF21(图8)。将2μl等份的连接反应体系依照生产商的指示转化入ONETOP10化学感受态大肠杆菌细胞(Invitrogen,San Diego,CA,USA)。将转化体铺板于2XYT+amp平板上,并在37℃温育过夜。挑取所得的转化体,并对其进行DNA测序以确认mdh3基因成功地整合入载体。
实施例5:米曲霉丙酮酸羧化酶基因的克隆和表达载体pRyan1的构建
构建了质粒pRyan1,该质粒含有丙酮酸羧化酶(pyc)基因序列(DOGAN:AO090023000801),其是来自米曲霉的3646bp片段(包含两个终止密码子),如2010年8月27日提交的PCT申请号PCT/US10/47002中所述。米曲霉丙酮酸羧化酶基因的基因组DNA序列的核苷酸构建体(SEQ ID NO:9)和推导的氨基酸序列(SEQ ID NO:10)示于图9A和9B。米曲霉NRRL3488和ATCC56747丙酮酸羧化酶基因具有相同的核苷酸序列。基因编码区的G+C含量是57.1%。3643bp的基因组编码序列(包含一个终止密码子)被1个61bp(3475-3535bp)的内含子分隔。基因编码区的G+C含量是57.1%。相应的cDNA序列(图9A和9B中所示的粗体核苷酸序列)为3582bp,包含一个终止密码子。预测的编码蛋白为1193个氨基酸,具有131kDa的预测分子量。
简言之,该质粒是通过用Sex AI和Pac I进行的限制性消化使pShTh60直链化(图1)而构建的。消化的载体通过TBE缓冲液中的0.8%琼脂糖凝胶电泳分离,并使用凝胶提取试剂盒纯化。使用如下所示的引物066549和067388从米曲霉NRRL3488基因组DNA扩增pyc基因。
引物066549:
5’-TAGAACATCGTCCATAATGGCGGCTCCGTTTCGTCA-3’(SEQ IDNO:24)
引物067388:
5’-GTGTCAGTCACCTCTAGTTATTATTACGCTTTGACGATCT-3’(SEQID NO:25)
PCR反应体系由5μl10X反应缓冲液,1μl米曲霉NRRL3488基因组DNA(110ng/μl),1μl引物066549(100ng/μl),1μl引物067388(100ng/μl),1μldNTP混合物(10mM),45.5μl去离子水,和0.5μl HotStart DNA聚合酶构成。将扩增反应体系在中温育,其编程为:1个循环,在95℃进行2分钟;10个循环,每循环在95℃进行10秒,58℃进行30秒,和72℃进行3.5分钟;20个循环,每循环在95℃进行10秒,58℃进行30秒,和72℃进行3.5分钟且每个循环增加10秒。然后使用PCR纯化试剂盒纯化PCR产物。
使用In-FusionTM Advantage反应物将纯化的PCR产物***载体,其中反应体系由2μl5X缓冲液,1μl纯化的PCR产物(144ng/μl),2μl凝胶纯化的、Sex AI和Pac I限制性消化的pShTh60(图1;78ng/μl),1μl In-FusionTM酶和4μl去离子水构成。将反应体系在37℃温育15分钟,接着在50℃温育15分钟,之后将其置于冰上5分钟,并用40μl TE缓冲液稀释,得到pRYAN1(图10)。将2μl等份的连接反应体系依照生产商的指示转化入ONE TOP10化学感受态大肠杆菌细胞。将转化体铺板于2XYT+amp平板上,并在37℃温育过夜。挑取所得的转化体,并对其进行DNA测序以确认pyc基因成功地整合入载体。核苷酸1308从C变为T,但并不影响蛋白序列。
实施例6:将pAmFs69,pRyan1,pSaMf21,pSaMf36表达载体片段转化入米曲霉NRRL3488(ShTh6900)
米曲霉NRRL3488的原生质体制备和转化如下进行:将大约2x107个孢子接种入100ml的YEG培养基,并将烧瓶在27℃以140rpm温育16-18小时。将培养物倾倒通过衬有的经无菌漏斗,并用50ml的0.7M KCl漂洗,来收集菌丝体。将经洗涤的菌丝体重悬于含有20ml原生质体化溶液(protoplasting solution)的125ml烧瓶中,其中所述原生质体化溶液的组成为:5mg的GLUCANEXTM(Novozymes A/S,Denmark)和0.5mg的壳多糖酶(chitinase)(Sigma Chemical Co.,St.Louis,MO,USA)每毫升0.7M KCl(经过滤灭菌),然后在34℃以80rpm的混合进行温育30分钟。将所述原生质体化溶液倾倒经过衬有的无菌漏斗,并用50ml的STC缓冲液(由1M山梨醇-10mM Tris-HCl pH6.5-10mM CaCl2构成)漂洗。流过物收集在两个50ml聚丙烯管中。将管以1300x g在室温离心10分钟。弃去上清,并将原生质体离心沉淀重悬于20ml的STC缓冲液。通过将离心沉淀在20ml的STC缓冲液中重悬后以1300x g在室温离心10分钟两轮来洗涤原生质体。将最终的离心沉淀重悬于2ml的STC缓冲液。移出10μl样品并将其在血细胞计数器(VWR,West Chester,PA,USA)中计数来对原生质体进行计数。用STC缓冲液调整体积以获得2x107每ml的原生质体浓度。
通过用Pme I在37℃限制性消化4小时分别制备了质粒表达载体pAmFs69(实施例1),pSaMF36(实施例3),pSaMF21(实施例4)和pRyan1(实施例5)以供转化。通过TBE缓冲液中的0.8%琼脂糖凝胶电泳将来自每个转化体的大约5-6kb的表达盒与载体序列分离,并使用凝胶提取试剂盒根据生产商的指示纯化出来。
通过将上述100μl原生质体制备物添加至四个12ml聚丙烯管来制备四个转化反应体系。对于每个试管,将2微克的经消化的pRyan1pyc片段,和各1微克的经消化的pAmFs69bt1片段,经消化的pSaMF36C4T521片段,和经消化的pSaMF21mdh片段添加至250μl的聚乙二醇(PEG)溶液(60%w/v聚乙二醇(PEG),10mM Tris6.5,10mM CaCl),接着轻柔地混合并在37℃温育30分钟。用6ml的STC缓冲液稀释每个转化体系,接着将三个单独的等分试样铺板于COVE平板。然后将每个平板在34℃温育7-10日。将所得的转化体中的六十个转移至单独的COVE平板,并在34℃温育5日。通过制备每个培养物的甘油储备物(800μl孢子储液,200μl0.1%80)并冷冻于-80℃来储藏培养物。
将转化体在摇瓶中培育,并根据上述描述分离基因组DNA。用于测试四种表达载体片段中的每一个的存在的单独PCR反应由5μl10X反应缓冲液,0.5μl模板(80-300ng/μl);1.0μl正向引物(50pM,见下);1.0μl反向引物(50pM;见下);0.5μl dNTP混合物(10mM),16.75μl去离子水,和0.25μl DNA聚合酶。
正向引物065067(用于pRyan1pyc,pSaMf21mdh,和pSaMf36C4T521片段):
5’-tgaccttccacgctgaccac-3’(SEQ ID NO:46)
正向引物0610854(用于pAmFs69bt1片段):
5’-GGCTGAGAAAATATGTTGCA-3’(SEQ ID NO:47)
反向引物0611365(用于pSaMF36C4T521片段):
5’-gatagaccactaatcatggtggcgatggag-3’(SEQ ID NO:48)
反向引物061752(用于pRyan1pyc片段)
5’-TGCGGTCCTGAGTCAGGCCCAGTTGCTCGA-3’(SEQ ID NO:49)
反向引物062400(用于pSaMF21mdh片段)
5’-GGGATTTGAACAGCAGAAGG-3’(SEQ ID NO:50)
反向引物996270(用于pAmFs69bt1片段)
5’-tcacaaaagagtagaggcca-3’(SEQ ID NO:51)
扩增反应体系在中温育,其编程为:1个循环,在98℃进行30秒;35个循环,每循环在98℃进行10秒,66℃(对于pRyan1pyc片段)或58℃(对于pAmFs69bt1,pSaMf21mdh,和pSaMf36C4T521片段)进行10秒;72℃进行15秒;和1个循环,在72℃进行10分钟。使用米曲霉NRRL3488基因组DNA(110ng/μl)作为阴性对照模板,使用每种质粒(pRyan1,pAmFs69,pSaMf21,或pSaMf36,稀释至20ng/μl)作为阳性对照模板。扩增反应混合物通过凝胶电泳,使用2μl的每种反应混合物在0.8%琼脂糖凝胶上进行分析。然后对得到预期PCR片段大小,从而确认了整合的转化体,测试苹果酸的产生。
制备了含有pSaMF36,pSaMF21,和pRyan1但缺乏pAmFs69的表达载体片段的对照转化体(命名为SaMf3603转化体),并如上所述在类似的步骤中进行验证。
实施例7:在含有pAmFs69,pRyan1,pSaMf21,和pSaMf36的表达载体片段的米曲霉转化体(ShTh6900)的摇瓶培养中产生苹果酸
将来自实施例6中所述的ShTh6900转化体和作为对照的米曲霉NRRL3488的孢子铺板于单独的PDA平板上,并允许在34℃孢子形成5至7日。将孢子收集在0.1%80中,并使用血细胞计数器计数。在含有100ml种子培养基B的250ml烧瓶中制备种子培养物,并接种300μl孢子悬液。将种子培养物在30℃在200rpm振荡下培育大约17个小时。在含有50ml产酸培养基C和3ml的17小时种子培养物的250ml不带挡板的烧瓶中制备产酸培养物。将培养物在30℃在200rpm振荡下温育2至10日。
对于摇瓶培养物的苹果酸定量通过使用1200系列双元LC***(Binary LCSystem)和1200系列二极管阵列检测器(Diode Array Detector)(DAD)(AgilentTechnologies,Santa Clara,CA USA)的反相高效液相色谱进行。使用Aqua5μC18205x4.6mm ID柱和AQ C184x3.0mm预柱(Security Guard Cartridge)(Phenomenex,Inc.,Torrance,CA,USA)进行反相分离。流动相由10%甲醇(HPLC级)和90%145mM磷酸盐pH1.5缓冲液组成。
移出全培养物样品,并将其在HPLC运行缓冲液中以1:10稀释,所述HPLC运行缓冲液组成为850ml的64mM磷酸盐缓冲液和150ml的甲醇pH1.65。然后将样品通过25mm的0.45微米聚醚砜膜(Whatman,Florham Park,NJ,USA)过滤,并将1.5ml的滤过物置于HPLC小瓶中以供酸分析。将剩余量的摇瓶培养物通过三层粗滤布(cheese cloth)过滤,并用10体积的双蒸灭菌水漂洗三次以去除不溶性CaCO3。从粗滤布收获细胞沉淀,置于15ml培养管中,并储藏于-20℃。
RP-HPLC运行的使用的条件为:注入体积10μl,流速0.7ml/分钟(等度洗脱),柱温25℃,运行时间11分钟。检测设定为210nm,8nm带宽,参照为360nm,40nm带宽。空白时间(void time)确定为3.8分钟。通过进行浓度范围为49.2至3.93mM的系列稀释的苹果酸标样的重复注入,确定了该反相法对于苹果酸的定量能力。对于重复注入的相对标准偏差(RSD)为≤5%。苹果酸显示R2≥0.9999。
含有pAmFs69,pRyan1,pSaMf21,和pSaMf36的表达载体片段的米曲霉ShTh6900转化体与米曲霉NRRL3488对照株相比显示高两倍以上的苹果酸效价,且高于在单独实验中用各SaMf3603转化体(含有pSaMF36,pSaMF21,和pRyan1的表达载体片段,但缺乏pAmFs69的表达载体片段)中观察到的效价。
实施例8:含有pAmFs69,pRyan1,pSaMf21,和pSaMf36的表达载体片段的米曲霉转化体(ShTh6900)的发酵
将在实施例7中所述的米曲霉ShTh6900转化体和对照转化体SaMf3603(含有pSaMF36,pSaMF21,和pRyan1的表达载体片段,但缺乏pAmFs69的表达载体片段)在34℃在PDA平板上培育大约7日。将5-6ml体积的含有0.2%80的无菌的50mM磷酸钠缓冲液(50mM,pH6.8)添加至每个平板,并通过用接种环刮擦使孢子悬浮。通过移液将每个悬液转移至一个50ml锥形管中。对于每个管,将25ml的无菌的含0.2%80的磷酸钠缓冲液(50mM,pH6.8)添加至含有75ml的种子培养基的500ml不带挡板的烧瓶,然后将其用2ml的孢子悬液接种。然后将烧瓶在32℃和180rpm温育约24小时。合并各种子烧瓶以供应每罐所需的144ml接种物。
通过导入144ml(8%)的来自ShTh6900转化体或米曲霉SaMf3603转化体的三个合并的种子***种子培养液来分别接种含有1.8升的发酵罐分批培养基的三升发酵罐。将发酵罐平衡于32±0.1℃并以500rpm搅拌。输入空气流维持在1v/v/m。从发酵约20小时时开始,以大约7.3g/hr的速率施加25%葡萄糖流。在大约第5日时添加无菌的CaCO3(约100g)以保持发酵pH在6至7的范围。每日移出样品,并如实施例6中所述分析苹果酸产生。发酵在7或8日之后完成。
ShTh6900转化体与SaMF3603对照转化体相比显示更高的苹果酸效价,具有更快的产生速率(特别是在最初的72小时内),和更快的葡萄糖消耗。
实施例9:将pShTh147的表达载体片段转化入米曲霉M727(ShTh147)
通过将大约2x107个孢子接种入100ml的YEG培养基,并将烧瓶在27℃以140rpm温育16-18小时来制备和转化米曲霉M727(ShTh6900的突变株,其通过用NTG标准诱变并选择增加的C4酸产生而制成)的原生质体。通过将培养物倾倒通过衬有的无菌漏斗,并用50ml的0.7M KCl漂洗来收集菌丝体。将经洗涤的菌丝体重悬于含有20ml原生质体化溶液(protoplastingsolution)的125ml烧瓶中,其中所述溶液由5mg的GLUCANEXTM(NovozymesA/S,Denmark)和0.5mg的壳多糖酶(chitinase)(Sigma Chemical Co.,St.Louis,MO,USA)每毫升0.7M KCl(经过滤灭菌)构成,然后在34℃以80rpm的混合进行温育30分钟。将所述原生质体化溶液倾倒通过衬有的无菌漏斗,并用50ml的STC缓冲液(由1M山梨醇-10mM Tris-HCl pH6.5-10mMCaCl2构成)漂洗。将流过物收集在两个50ml聚丙烯管中。将管以1300x g在室温离心10分钟。弃去上清,并将原生质体离心沉淀重悬于20ml的STC缓冲液。通过将沉淀在20ml的STC缓冲液中重悬再以1300x g在室温离心10分钟两轮来洗涤原生质体。将最终的离心沉淀重悬于2ml的STC缓冲液中。通过移出10μl样品并将其在血细胞计数器中计数(VWR)来对原生质体进行计数。用STC缓冲液调整体积以获得2x107每ml的原生质体浓度。
通过用PmeI在37℃限制性消化4小时制备质粒表达载体pShTh147(实施例2)以供转化。通过在TBE缓冲液中的0.8%琼脂糖凝胶电泳将大约5.2kb表达盒与载体序列分离,并使用凝胶提取试剂盒根据生产商的指示纯化出来。
通过将上述100μl原生质体制备物添加至四个12ml聚丙烯管来制备四个转化反应体系。对于每个试管,将2微克消化的pShTh147bt2片段添加至250μl的聚乙二醇(PEG)溶液(60%w/v聚乙二醇(PEG),10mM Tris6.5,10mMCaCl),接着轻柔地混合并在37℃温育30分钟。用6ml的STC缓冲液稀释每个转化反应体系,接着将三个单独的等分试样铺板于COVE平板上。然后将每个平板在34℃温育7-10日。将所得的转化体中的四十个转移至单独的个COVE平板,并在34℃温育5日。通过制备每个培养物的甘油储液(800μl孢子储液,200μl0.1%80)并冷冻于-80℃来储藏培养物。
实施例10:在含有pAmFs69,pRyan1,pSaMf21,pSaMf36,和pShTh147的表达载体片段的米曲霉转化体(ShTh147)的摇瓶培养中产生苹果酸
将来自实施例9中所述的ShTh147转化体和作为对照的米曲霉NRRL3488的孢子铺板于单个PDA平板上,并允许在34℃孢子形成5至7日。将孢子在0.1%80中收集,并使用血细胞计数器计数。在含有100ml种子培养物B的250ml烧瓶中制备种子培养物,并接种1mL收获的孢子。将种子培养物在30℃在200rpm振荡下培育大约22个小时。在含有50ml产酸培养基C和3ml的22小时种子培养物的250ml不带挡板的烧瓶中制备产酸培养物。将培养物在30℃在200rpm振荡下温育3日。
对于摇瓶培养物的苹果酸定量通过使用1200系列双元LC***和1200系列二极管阵列检测器(DAD)(Agilent Technologies,Santa Clara,CA USA)的反相高效液相色谱(RP-HPLC)进行。使用Aqua5μC18205x4.6mm ID柱和AQ C184x3.0mm预柱(Security Guard Cartridge)(Phenomenex,Inc.,Torrance,CA,USA)进行反向分离。流动相由10%甲醇(HPLC级)和90%145mM磷酸盐pH1.5缓冲液组成。
移出全培养物样品,并将其在HPLC运行缓冲液中以1:20稀释,所述HPLC缓冲液由为900ml的145mM磷酸盐缓冲液和100ml的甲醇pH1.50构成。然后将样品通过96孔0.45微米Durapore PVDF膜过滤到96孔板中以供酸分析。
使用下述条件进行RP-HPLC:注入体积10μl,流速0.7ml/分钟(等度洗脱),柱温20℃。检测为210nm,8nm带宽,参照为360nm,40nm带宽。运行时间为13分钟。空白时间(void time)确定为3.8分钟。通过进行浓度范围为49.2至3.93mM的系列稀释的苹果酸标样的重复注入,对于苹果酸确定了反相方法的定量能力。对于重复注入的相对标准偏差(RSD)为≤5%。苹果酸显示R2≥0.9999。
在摇瓶测试之后,鉴定出了六个米曲霉ShTh147转化体,其以高于M727对照的水平产生苹果酸,包括两个改善了1.15x和1.14x的。
本发明可通过下述编号段落进一步描述:
[1]包含编码碳酸氢根转运蛋白的异源多核苷酸的重组宿主细胞,其中所述宿主细胞与不含所述异源核苷酸的宿主细胞相比,当在相同条件下培养时,能够产生更大量的C4-二羧酸。
[2]段[1]的重组宿主细胞,其中所述碳酸氢根转运蛋白是硫酸根-碳酸氢根转运蛋白。
[3]段[1]或[2]的重组宿主细胞,其中所述所述碳酸氢根转运蛋白选自下组:
(a)多肽,其与SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:4或其成熟多肽序列具有至少65%,例如至少70%,至少75%,至少80%,至少85%,至少90%,至少91%,至少92%,至少93%,至少94%,至少95%,至少96%,至少97%,至少98%,至少99%,或100%序列同一性;
(b)多肽,其由多核苷酸编码,所述多核苷酸在低严格条件,中等严格条件,中等-高严格条件,高严格条件,或非常高严格条件下,与以下杂交:(i)SEQ ID NO:1或3,或其成熟多肽编码序列,(ii)SEQ ID NO:1或3的cDNA序列,或其成熟多肽编码序列,(iii)(i)或(ii)的全长互补链;
(c)多肽,其由多核苷酸编码,所述多核苷酸与(iv)SEQ ID NO:1或3,或其成熟多肽编码序列,(v)SEQ ID NO:1或3的cDNA序列,或其成熟多肽编码序列,(vi)(iv)或(v)的全长互补链具有至少65%,例如至少70%,至少75%,至少80%,至少85%,至少85%,至少90%,至少91%,至少92%,至少93%,至少94%,至少95%,至少96%,至少97%,至少98%,至少99%,或100%序列同一性;
(d)SEQ ID NO:2或4或其成熟多肽序列的包含一个或多个(几个)氨基酸的取代、缺失和/或***的变体;和
(e)(a)、(b)、(c)或(d)的多肽具有碳酸氢根转运蛋白活性的片段。
[4]段[1]-[3]任一项的重组宿主细胞,其中所述碳酸氢根转运蛋白与SEQID NO:2或4或其成熟多肽序列具有至少65%,例如至少70%,至少75%,至少80%,至少85%,至少90%,至少91%,至少92%,至少93%,至少94%,至少95%,至少96%,至少97%,至少98%,至少99%,或100%序列同一性。
[5]段[1]-[4]任一项的重组宿主细胞,其中所述碳酸氢根转运蛋白由多核苷酸编码,所述多核苷酸在低严格条件,中等严格条件,中等-高严格条件,高严格条件,或非常高严格条件下,与以下杂交:(i)SEQ ID NO:1或3,或其成熟多肽编码序列,(ii)SEQ ID NO:1或3的cDNA序列,或其成熟多肽编码序列,(iii)(i)或(ii)的全长互补链;
[6]段[1]-[5]任一项的重组宿主细胞,其中所述碳酸氢根转运蛋白由多核苷酸编码,所述多核苷酸与(iv)SEQ ID NO:1或3,或其成熟多肽编码序列,(v)SEQ ID NO:1或3的cDNA序列,或其成熟多肽编码序列,或(vi)(iv)或(v)的全长互补链具有至少65%,例如至少70%,至少75%,至少80%,至少85%,至少85%,至少90%,至少91%,至少92%,至少93%,至少94%,至少95%,至少96%,至少97%,至少98%,至少99%,或100%序列同一性。
[7]段[1]-[6]任一项的重组宿主细胞,其中所述碳酸氢根转运蛋白包含或组成为SEQ ID NO:2或4,或其成熟多肽序列。
[8]段[1]-[6]任一项的重组宿主细胞,其中所述碳酸氢根转运蛋白包含或组成为SEQ ID NO:2或4。
[9]段[1]-[6]任一项的重组宿主细胞,其中所述碳酸氢根转运蛋白包含或组成为SEQ ID NO:2。
[10]段[1]-[6]任一项的重组宿主细胞,其中所述碳酸氢根转运蛋白包含或组成为SEQ ID NO:4。
[11]段[1]-[6]任一项的重组宿主细胞,其中所述碳酸氢根转运蛋白包含或组成为SEQ ID NO:2或4的成熟多肽序列。
[12]段[1]-[6]任一项的重组宿主细胞,其中所述碳酸氢根转运蛋白包含或组成为SEQ ID NO:2的成熟多肽序列。
[13]段[1]-[6]任一项的重组宿主细胞,其中所述碳酸氢根转运蛋白包含或组成为SEQ ID NO:4的成熟多肽序列。
[14]段[1]-[6]任一项的重组宿主细胞,其中所述碳酸氢根转运蛋白为SEQID NO:2或4或其成熟多肽序列的包含一个或多个(几个)氨基酸的取代、缺失和/或***的变体。
[15]段[1]-[6]任一项的重组宿主细胞,其中所述碳酸氢根转运蛋白为SEQID NO:2或4的包含一个或多个(几个)氨基酸的取代、缺失和/或***的变体。
[16]段[1]-[6]任一项的重组宿主细胞,其中所述碳酸氢根转运蛋白为SEQID NO:2的包含一个或多个(几个)氨基酸的取代、缺失和/或***的变体。
[17]段[1]-[6]任一项的重组宿主细胞,其中所述碳酸氢根转运蛋白为SEQID NO:4的包含一个或多个(几个)氨基酸的取代、缺失和/或***的变体。
[18]段[1]-[6]任一项的重组宿主细胞,其中所述碳酸氢根转运蛋白为SEQID NO:2或4的成熟多肽序列的包含一个或多个(几个)氨基酸的取代、缺失和/或***的变体。
[19]段[1]-[6]任一项的重组宿主细胞,其中所述碳酸氢根转运蛋白为SEQID NO:2的成熟多肽序列的包含一个或多个(几个)氨基酸的取代、缺失和/或***的变体。
[20]段[1]-[6]任一项的重组宿主细胞,其中所述碳酸氢根转运蛋白为SEQID NO:4的成熟多肽序列的包含一个或多个(几个)氨基酸的取代、缺失和/或***的变体。
[21]段[1]-[6]任一项的重组宿主细胞,其中所述碳酸氢根转运蛋白为SEQID NO:2或4的片段,其中所述片段具有碳酸氢根转运蛋白活性。
[22]段[1]-[6]任一项的重组宿主细胞,其中所述碳酸氢根转运蛋白为SEQID NO:2的片段,其中所述片段具有碳酸氢根转运蛋白活性。
[23]段[1]-[6]任一项的重组宿主细胞,其中所述碳酸氢根转运蛋白为SEQID NO:4的片段,其中所述片段具有碳酸氢根转运蛋白活性。
[24]段[1]-[23]任一项的重组宿主细胞,其中所述异源多核苷酸可操作地连接于对于所述多核苷酸而言是外来的启动子。
[25]段[1]-[24]任一项的重组宿主细胞,其还包含编码C4-二羧酸转运蛋白的异源第二多核苷酸(例如编码SEQ ID NO:6,27,29,32,34,36,39,41,或43或其任何相关方面的异源多核苷酸)。
[26]段[25]的重组宿主细胞,其中所述异源第二多核苷酸可操作地连接于对于所述多核苷酸而言是外来的启动子。
[27]段[1]-[26]任一项的重组宿主细胞,其还包含编码苹果酸脱氢酶的异源第三多核苷酸(例如编码SEQ ID NO:8或45,或其任何相关方面的异源多核苷酸)。
[28]段[27]的重组宿主细胞,其中所述异源第三多核苷酸可操作地连接于对于所述多核苷酸是外来的启动子。
[29]段[1]-[28]任一项的重组宿主细胞,其还包含编码丙酮酸羧化酶的异源第四多核苷酸(例如编码SEQ ID NO:10,或其任何相关方面的异源多核苷酸)。
[30]段[29]的重组宿主细胞,其中所述异源第四多核苷酸可操作地连接于对于所述多核苷酸是外来的启动子。
[31]段[1]-[24]任一项的重组宿主细胞,其还包含编码C4-二羧酸转运蛋白的异源第二多核苷酸,编码苹果酸脱氢酶的异源第三多核苷酸,和编码丙酮酸羧化酶的异源第四多核苷酸。
[32]段[1]-[31]任一项的重组宿主细胞,其中所述宿主细胞是真核宿主细胞。
[33]段[32]的重组宿主细胞,其中所述宿主细胞是丝状真菌宿主细胞。
[34]段[33]的重组宿主细胞,其中所述宿主细胞选自下组:枝顶孢霉属(Acremonium)、曲霉属(Aspergillus)、短梗霉属(Aureobasidium)、烟管霉属(Bjerkandera)、拟蜡菌属(Ceriporiopsis)、金孢子菌属(Chrysosporium)、鬼伞属(Coprinus)、革盖菌属(Coriolus)、隐球菌属(Cryptococcus)、Filibasidium、镰孢属(Fusarium)、腐质霉属(Humicola)、梨孢菌属(Magnaporthe)、毛霉属(Mucor)、毁丝霉属(Myceliophthora)、新考玛脂霉属(Neocallimastix)、脉孢菌属(Neurospora)、拟青霉属(Paecilomyces)、青霉属(Penicillium)、平革菌属(Phanerochaete)、射脉菌属(Phlebia)、瘤胃壶菌属(Piromyces)、侧耳属(Pleurotus)、根霉属(Rhizopus)、裂褶菌属(Schizophyllum)、踝节菌属(Talaromyces)、嗜热子囊菌属(Thermoascus)、梭孢壳属(Thielavia)、弯颈霉属(Tolypocladium)、栓菌属(Trametes)和木霉属(Trichoderma)细胞。
[35]段[34]的重组宿主细胞,其中所述宿主细胞是曲霉属宿主细胞。
[36]段[35]的重组宿主细胞,其中所述宿主细胞是米曲霉宿主细胞。
[37]段[35]的重组宿主细胞,其中所述宿主细胞是黑曲霉宿主细胞。
[38]段[1]-[37]任一项的重组宿主细胞,其中所述C4-二羧酸选自苹果酸、琥珀酸、草酰乙酸、丙二酸和延胡索酸。
[39]段[38]的重组宿主细胞,其中所述C4-二羧酸是苹果酸。
[40]段[1]-[39]任一项的重组宿主细胞,其中所述细胞能够具有大于约0.1g/L每小时,例如,大于约0.2g/L每小时,0.5g/L每小时,0.6g/L每小时,0.7g/L每小时,0.8g/L每小时,0.9g/L每小时,1.0g/L每小时,1.1g/L每小时,1.2g/L每小时,1.3g/L每小时,1.5g/L每小时,1.75g/L每小时,2.0g/L每小时,2.25g/L每小时,2.5g/L每小时,或3.0g/L每小时;或约0.1g/L每小时至约2.0g/L每小时,例如,约0.3g/L每小时至约1.7g/L每小时,约0.5g/L每小时至约1.5g/L每小时,约0.7g/L每小时至约1.3g/L每小时,约0.8g/L每小时至约1.2g/L每小时,或约0.9g/L每小时至约1.1g/L每小时的C4-二羧酸体积生产力。
[41]段[1]-[40]任一项的重组宿主细胞,其中所述宿主细胞与不含所述异源多核苷酸的宿主细胞相比,当在相同条件下培养时,能够产生多至少5%,例如至少10%,至少15%,至少20%,至少25%,至少30%,至少50%,或至少100%的量的C4-二羧酸。
[42]组合物,其包含段[1]-[41]任一项的重组宿主细胞。
[43]段[42]的组合物,其中所述培养基是可发酵培养基。
[44]段[42]或[43]的组合物,其还包含C4-二羧酸。
[45]段[44]的组合物,其中所述C4-二羧酸选自苹果酸、琥珀酸、草酰乙酸、丙二酸和延胡索酸。
[46]段[45]的组合物,其中所述C4-二羧酸是苹果酸。
[47]段[42]-[46]任一项的组合物,其中所述C4-二羧酸的效价大于约10g/L,例如,大于约25g/L,50g/L,75g/L,100g/L,125g/L,150g/L,160g/L,170g/L,180g/L,190g/L,200g/L,210g/L,225g/L,250g/L,275g/L,300g/L,325g/L,350g/L,400g/L,或500g/L;或约10g/L至约500g/L,例如,约50g/L至约350g/L,约100g/L至约300g/L,约150g/L至约250g/L,约175g/L至约225g/L,或约190g/L至约210g/L。
[48]产生C4-二羧酸的方法,其包括:
(a)在合适的条件下在培养基中培养段[1]-[41]任一项的重组宿主细胞以产生所述C4-二羧酸;和
(b)回收所述C4-二羧酸。
[49]段[48]的方法,其中所述培养基是可发酵的培养基。
[50]段[48]或[49]的方法,其中所述C4-二羧酸的效价大于约10g/L,例如,大于约25g/L,50g/L,75g/L,100g/L,125g/L,150g/L,160g/L,170g/L,180g/L,190g/L,200g/L,210g/L,225g/L,250g/L,275g/L,300g/L,325g/L,350g/L,400g/L,或500g/L;或约10g/L至约500g/L,例如,约50g/L至约350g/L,约100g/L至约300g/L,约150g/L至约250g/L,约175g/L至约225g/L,或约190g/L至约210g/L。
[51]段[48]-[50]任一项的方法,其中产生的C4-二羧酸的量与相同条件下培养没有编码碳酸氢根转运蛋白的多核苷酸的宿主细胞相比高至少5%,例如至少10%,至少15%,至少20%,至少25%,至少30%,至少50%,或至少100%。
[52]段[48]-[51]任一项的方法,其中所述C4-二羧酸选自苹果酸、琥珀酸、草酰乙酸、丙二酸和延胡索酸。
[53]段[52]的方法,其中所述C4-二羧酸是苹果酸。
本文描述和要求保护的本发明并不局限于本文公开的具体方面的范围内,因为这些方面旨在作为本发明几个方面的说明。旨在将任何等同的方面包含于本发明的范围内。实际上,从前面的说明中,除本文所显示和描述的之外,本发明的多种修改对于本领域的技术人员来说是显而易见的。这些修改也旨在落入所附的权利要求的范围内。在冲突的情况下,将以包括定义部分的本公开为准。
Claims (26)
1.包含编码碳酸氢根转运蛋白的异源多核苷酸的重组宿主细胞,其中所述所述异源多核苷酸:
(a)编码与SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:4具有至少65%,例如至少70%,至少75%,至少80%,至少85%,至少90%,至少91%,至少92%,至少93%,至少94%,至少95%,至少96%,至少97%,至少98%,至少99%,或100%序列同一性的碳酸氢根转运蛋白;
(b)在低严格条件,中等严格条件,中等-高严格条件,高严格条件,或非常高严格条件下,与SEQ ID NO:1,SEQ ID NO:3,或其cDNA序列的全长互补链杂交;或
(c)与SEQ ID NO:1,SEQ ID NO:3,或其cDNA序列具有至少65%,例如至少70%,至少75%,至少80%,至少85%,至少85%,至少90%,至少91%,至少92%,至少93%,至少94%,至少95%,至少96%,至少97%,至少98%,至少99%,或100%序列同一性,
其中所述宿主细胞与没有所述异源多核苷酸的宿主细胞相比,当在相同条件下培养时能够产生更多量的C4-二羧酸。
2.权利要求1的重组宿主细胞,其中所述异源多核苷酸编码与SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:4具有至少90%序列同一性的碳酸氢根转运蛋白。
3.权利要求1的重组宿主细胞,其中所述异源多核苷酸编码与SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:4具有至少95%序列同一性的碳酸氢根转运蛋白。
4.权利要求1-3任一项的重组宿主细胞,其中所述异源多肽在高严格条件下与SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:3、或其cDNA序列的全长互补链杂交。
5.权利要求1-3任一项的重组宿主细胞,其中所述异源多肽在非常高严格条件下与SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:3、或其cDNA序列的全长互补链杂交。
6.权利要求1-5任一项的重组宿主细胞,其中所述异源多核苷酸与SEQ IDNO:1、SEQ ID NO:3、或其cDNA序列具有至少90%序列同一性。
7.权利要求1-5任一项的重组宿主细胞,其中所述异源多核苷酸与SEQ IDNO:1,SEQ ID NO:3,或其cDNA序列具有至少95%序列同一性。
8.权利要求1-7任一项的重组宿主细胞,其中所述异源多核苷酸编码包含或组成为SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:4的多肽。
9.权利要求1-8任一项的重组宿主细胞,其中所述编码碳酸氢根转运蛋白的异源多核苷酸可操作地连接于对于该多核苷酸而言是外来的启动子。
10.权利要求1-9任一项的重组宿主细胞,其还包含编码C4-二羧酸转运蛋白的异源多核苷酸(例如编码SEQ ID NO:6,27,29,32,34,36,39,41,或43的C4-二羧酸转运蛋白的异源多核苷酸)。
11.权利要求10的重组宿主细胞,其中所述编码C4-二羧酸转运蛋白的异源多核苷酸可操作地连接于对于所述多核苷酸而言是外来的启动子。
12.权利要求1-26任一项的重组宿主细胞,其还包含编码苹果酸脱氢酶的异源多核苷酸(例如编码SEQ ID NO:8或45的苹果酸脱氢酶的异源多核苷酸)。
13.权利要求12的重组宿主细胞,其中所述编码苹果酸脱氢酶的异源多核苷酸可操作地连接于对于所述多核苷酸而言是外来的启动子。
14.权利要求1-13任一项的重组宿主细胞,其还包含编码丙酮酸羧化酶的异源多核苷酸(例如编码SEQ ID NO:10的丙酮酸羧化酶的异源多核苷酸)。
15.权利要求14的重组宿主细胞,其中所述编码丙酮酸羧化酶的异源多核苷酸可操作地连接于对于所述多核苷酸而言是外来的启动子。
16.权利要求1-15任一项的重组宿主细胞,其中所述宿主细胞是真核宿主细胞。
17.权利要求16的重组宿主细胞,其中所述宿主细胞是丝状真菌宿主细胞。
18.权利要求17的重组宿主细胞,其中所述宿主细胞选自下组:枝顶孢霉属(Acremonium)、曲霉属(Aspergillus)、短梗霉属(Aureobasidium)、烟管霉属(Bjerkandera)、拟蜡菌属(Ceriporiopsis)、金孢子菌属(Chrysosporium)、鬼伞属(Coprinus)、革盖菌属(Coriolus)、隐球菌属(Cryptococcus)、Filibasidium、镰孢属(Fusarium)、腐质霉属(Humicola)、梨孢菌属(Magnaporthe)、毛霉属(Mucor)、毁丝霉属(Myceliophthora)、新考玛脂霉属(Neocallimastix)、脉孢菌属(Neurospora)、拟青霉属(Paecilomyces)、青霉属(Penicillium)、平革菌属(Phanerochaete)、射脉菌属(Phlebia)、瘤胃壶菌属(Piromyces)、侧耳属(Pleurotus)、根霉属(Rhizopus)、裂褶菌属(Schizophyllum)、踝节菌属(Talaromyces)、嗜热子囊菌属(Thermoascus)、梭孢壳属(Thielavia)、弯颈霉属(Tolypocladium)、栓菌属(Trametes)和木霉属(Trichoderma)。
19.权利要求17的重组宿主细胞,其中所述宿主细胞是曲霉属宿主细胞。
20.权利要求19的重组宿主细胞,宿主细胞是米曲霉宿主细胞。
21.权利要求19的重组宿主细胞,宿主细胞是黑曲霉宿主细胞。
22.权利要求1-21任一项的重组宿主细胞,其中所述C4-二羧酸是苹果酸。
23.权利要求1-22任一项的重组宿主细胞,其中所述所述宿主细胞与没有所述编码碳酸氢根转运蛋白的多核苷酸的宿主细胞相比,当在相同条件下培养时,能够产生多至少25%的量的C4-二羧酸。
24.产生C4-二羧酸的方法,其包括:
(a)在合适的条件下在培养基中培养权利要求1-23任一项的重组宿主细胞以产生所述C4-二羧酸;和
(b)回收所述C4-二羧酸。
25.权利要求24的方法,其中所述C4-二羧酸是苹果酸。
26.重组宿主细胞,其包含异源多核苷酸,所述异源多核苷酸编码SEQ IDNO:2或4的包含一个或多个(几个)氨基酸的取代、缺失和/或***的碳酸氢根转运蛋白变体;
其中所述宿主细胞与没有所述异源多核苷酸的宿主细胞相比,当在相同条件下培养时,能够产生更多量的C4-二羧酸。
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