CN103890169A - 烟曲霉纤维素分解酶组合物及其用途 - Google Patents

烟曲霉纤维素分解酶组合物及其用途 Download PDF

Info

Publication number
CN103890169A
CN103890169A CN201280052444.9A CN201280052444A CN103890169A CN 103890169 A CN103890169 A CN 103890169A CN 201280052444 A CN201280052444 A CN 201280052444A CN 103890169 A CN103890169 A CN 103890169A
Authority
CN
China
Prior art keywords
seq
sequence
mature polypeptide
trichoderma
polynucleotide
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN201280052444.9A
Other languages
English (en)
Inventor
J.沙斯基
B.麦克布雷尔
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Novozymes Inc
Original Assignee
Novozymes Biotech Inc
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Novozymes Biotech Inc filed Critical Novozymes Biotech Inc
Publication of CN103890169A publication Critical patent/CN103890169A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/52—Genes encoding for enzymes or proenzymes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/24—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2)
    • C12N9/2402—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2) hydrolysing O- and S- glycosyl compounds (3.2.1)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/37—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from fungi
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
    • C12N1/14—Fungi; Culture media therefor
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/80—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for fungi
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/24—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2)
    • C12N9/2402—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2) hydrolysing O- and S- glycosyl compounds (3.2.1)
    • C12N9/2405—Glucanases
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/24—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2)
    • C12N9/2402—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2) hydrolysing O- and S- glycosyl compounds (3.2.1)
    • C12N9/2405—Glucanases
    • C12N9/2434—Glucanases acting on beta-1,4-glucosidic bonds
    • C12N9/2437—Cellulases (3.2.1.4; 3.2.1.74; 3.2.1.91; 3.2.1.150)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/24—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2)
    • C12N9/2402—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2) hydrolysing O- and S- glycosyl compounds (3.2.1)
    • C12N9/2405—Glucanases
    • C12N9/2434—Glucanases acting on beta-1,4-glucosidic bonds
    • C12N9/2445—Beta-glucosidase (3.2.1.21)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/24—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2)
    • C12N9/2402—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2) hydrolysing O- and S- glycosyl compounds (3.2.1)
    • C12N9/2468—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2) hydrolysing O- and S- glycosyl compounds (3.2.1) acting on beta-galactose-glycoside bonds, e.g. carrageenases (3.2.1.83; 3.2.1.157); beta-agarase (3.2.1.81)
    • C12N9/2471—Beta-galactosidase (3.2.1.23), i.e. exo-(1-->4)-beta-D-galactanase
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/24—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2)
    • C12N9/2402—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2) hydrolysing O- and S- glycosyl compounds (3.2.1)
    • C12N9/2477—Hemicellulases not provided in a preceding group
    • C12N9/248—Xylanases
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/24—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2)
    • C12N9/2402—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2) hydrolysing O- and S- glycosyl compounds (3.2.1)
    • C12N9/2477—Hemicellulases not provided in a preceding group
    • C12N9/248—Xylanases
    • C12N9/2485—Xylan endo-1,3-beta-xylosidase (3.2.1.32), i.e. endo-1,3-beta-xylanase
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P19/00—Preparation of compounds containing saccharide radicals
    • C12P19/02—Monosaccharides
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P19/00—Preparation of compounds containing saccharide radicals
    • C12P19/14—Preparation of compounds containing saccharide radicals produced by the action of a carbohydrase (EC 3.2.x), e.g. by alpha-amylase, e.g. by cellulase, hemicellulase
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P9/00—Preparation of organic compounds containing a metal or atom other than H, N, C, O, S or halogen
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y302/00—Hydrolases acting on glycosyl compounds, i.e. glycosylases (3.2)
    • C12Y302/01—Glycosidases, i.e. enzymes hydrolysing O- and S-glycosyl compounds (3.2.1)
    • C12Y302/01021—Beta-glucosidase (3.2.1.21)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y302/00—Hydrolases acting on glycosyl compounds, i.e. glycosylases (3.2)
    • C12Y302/01—Glycosidases, i.e. enzymes hydrolysing O- and S-glycosyl compounds (3.2.1)
    • C12Y302/01091—Cellulose 1,4-beta-cellobiosidase (3.2.1.91)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y302/00—Hydrolases acting on glycosyl compounds, i.e. glycosylases (3.2)
    • C12Y302/01—Glycosidases, i.e. enzymes hydrolysing O- and S-glycosyl compounds (3.2.1)
    • C12Y302/01176—Cellulose 1,4-beta-cellobiosidase (reducing end)(3.2.1.176)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P2203/00—Fermentation products obtained from optionally pretreated or hydrolyzed cellulosic or lignocellulosic material as the carbon source

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Botany (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Enzymes And Modification Thereof (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)

Abstract

本发明涉及产生烟曲霉纤维素分解酶组合物的重组木霉属宿主细胞，以及产生和使用所述组合物的方法。

Description

烟曲霉纤维素分解酶组合物及其用途
对于在联邦资助的研究和开发下完成的发明的权利的声明
该发明是在由能源部授予的合作协议(Cooperative Agreement)DE-FC36-08GO18080下以政府支持完成的。政府在该发明中具有一定权利。
涉及序列表
本申请包含计算机可读形式的序列表，其通过提述并入本文。
发明背景
技术领域
本发明涉及产生烟曲霉纤维素分解酶组合物的木霉属宿主细胞，以及产生和使用所述组合物的方法。
相关技术的描述
纤维素是葡萄糖通过β-1,4-键连接的聚合物。许多微生物产生水解β-连接的葡聚糖的酶。这些酶包括内切葡聚糖酶、纤维二糖水解酶和β-葡糖苷酶。内切葡聚糖酶在随机位置消化纤维素聚合物，使其暴露于纤维二糖水解酶攻击(attack)。纤维二糖水解酶从纤维素聚合物的末端顺序地释放纤维二糖的分子。纤维二糖是水溶性的β-1,4-连接的葡萄糖二聚体。β-葡糖苷酶将纤维二糖水解成葡萄糖。
将含木素纤维素原料(lignocellulosic feedstock)转化为乙醇具有以下优势：大量原料现成可用，可以理想地避免燃烧或填埋材料，以及乙醇燃料的清洁性。木材、农业残余物、草本作物和城市固体废物被认为是用于乙醇生产的原料。这些材料主要由纤维素、半纤维素和木质素组成。一旦将纤维素转化成葡萄糖，葡萄糖容易地由酵母发酵成乙醇。
一种最常商业上使用的纤维素分解酶***来自里氏木霉(有性型红褐肉座菌(Hypocrea jecorina))，其分泌在内部切割纤维素链的内切葡聚糖酶，持续从末端降解纤维素链释放纤维二糖的外切纤维二糖酶，和将纤维二糖水解为葡萄糖的β-葡糖苷酶。作为纤维素分解产生***，里氏木霉具有数种优点，如分泌蛋白的高产率，在大规模发酵下具生产性，非常具活性且理解良好的基础纤维素分解酶***，和经测序且充分注释的基因组。然而，里氏木霉纤维素分解酶***的缺点是：其它生物产生个体而言更优越的纤维素分解酶；对于富含半纤维素的底物而言，半纤维素降解酶不足；和在高固形物水解下，β-葡糖苷酶是限制性的。
据报道，烟曲霉产生数种纤维素酶(Nierman等,2005,Nature438:1151-1156)。WO2011/057140公开了一种烟曲霉纤维二糖水解酶I及其基因。WO2011/057140公开了一种烟曲霉纤维二糖水解酶II及其基因。WO2005/047499公开了一种烟曲霉β-葡糖苷酶及其基因。2010/138754公开了一种具有纤维素分解增强活性的烟曲霉GH61多肽及其基因。WO2011/057140公开了一种烟曲霉内切葡聚糖酶II及其基因。WO2006/078256公开了烟曲霉GH10木聚糖酶。WO2011/057140公开了一种烟曲霉β-木糖苷酶及其基因。
在本领域中，需要新的纤维素分解酶***，其可以商业量生产，且可更有效地分解纤维素材料。
本发明提供了编码烟曲霉纤维素分解酶组合物的木霉属宿主细胞，和产生和使用所述组合物的方法。
发明内容
本发明涉及重组木霉属宿主细胞，其包含多核苷酸，所述多核苷酸编码(i)烟曲霉纤维二糖水解酶I；(ii)烟曲霉纤维二糖水解酶II；(iii)烟曲霉β-葡糖苷酶；和(iv)具有纤维素分解增强活性的烟曲霉GH61多肽；或其同源物。
本发明亦涉及产生酶组合物的方法，其包括：(a)在有助于产生所述酶组合物的条件下培养本发明的木霉属宿主细胞；和任选地(b)回收所述酶组合物。
本发明亦涉及酶组合物，其包含本发明的重组木霉属宿主细胞的回收的发酵液。
本发明亦涉及用于降解纤维素材料的工艺，其包括用酶组合物处理所述纤维素材料，所述酶组合物包含本发明的回收的发酵液。
本发明亦涉及用于产生发酵产物的方法，其包括：(a)用酶组合物糖化纤维素材料，所述酶组合物包含本发明的回收的发酵液；(b)用一种或多种(例如几种)发酵微生物发酵经糖化的纤维素材料以产生发酵产物；和(c)从发酵回收发酵产物。
本发明进一步涉及发酵纤维素材料的工艺，其包括用一种或多种(例如几种)发酵微生物发酵纤维素材料，其中所述纤维素材料是用酶组合物糖化的，所述酶组合物包含本发明的回收的发酵液。
附图说明
图1显示质粒pJfyS139的限制性酶切图。
图2显示质粒pJfyS142的限制性酶切图。
图3显示质粒pJfyS144的限制性酶切图。
图4显示质粒pAG43的限制性酶切图。
图5显示质粒pSMai214的限制性酶切图。
图6显示质粒pDM287的限制性酶切图。
图7显示表达烟曲霉纤维二糖水解酶I、烟曲霉纤维二糖水解酶II、烟曲霉β-葡糖苷酶和烟曲霉GH61B多肽的里氏木霉菌株的酶组合物与基于里氏木霉的纤维素酶组合物或烟曲霉酶组合物在水解经预处理的玉米秸秆方面的比较。
图8显示烟曲霉野生型酶组合物与基于里氏木霉的纤维素酶组合物在水解经预处理的玉米秸秆方面的比较。
定义
乙酰木聚糖酯酶：术语“乙酰木聚糖酯酶”意指羧基酯酶(EC3.1.1.72)，其催化乙酰基从聚合木聚糖、乙酰化木糖、乙酰化葡萄糖、乙酸α-萘酯(alpha-napthyl acetate)和乙酸对硝基苯酯(p-nitrophenyl acetate)的水解。就本发明而言，乙酰木聚糖酯酶活性是使用含有0.01％TWEENTM20(聚氧乙烯山梨坦单月桂酸酯)的50mM乙酸钠pH5.0中的0.5mM乙酸对硝基苯酯作为底物确定的。一个单位的乙酰木聚糖酯酶定义为能够在pH5，25℃每分钟释放1微摩尔对硝基苯酚阴离子(p-nitrophenolate anion)的酶量。
等位变体(allelic variant)：术语“等位变体”意指占据相同染色体基因座的基因的任何两种或更多种(例如几种)可选形式。等位变异通过突变天然地发生，并且可导致种群内的多态性。基因突变可以是沉默的(在编码的多肽中无变化)或可以编码具有改变的氨基酸序列的多肽。多肽的等位变体是由基因的等位变体编码的多肽。
α-L-***呋喃糖苷酶：术语“α-L-***呋喃糖苷酶”意指α-L-***呋喃糖苷***呋喃水解酶(EC3.2.1.55)，其催化对α-L-***糖苷中的末端非还原性α-L-***呋喃糖苷残基的水解。该酶对α-L-***呋喃糖苷、含有(1,3)-和/或(1,5)-键的α-L-***聚糖、***木聚糖和***半乳聚糖起作用。α-L-***呋喃糖苷酶也称为***糖苷酶、α-***糖苷酶、α-L-***糖苷酶、α-***呋喃糖苷酶、多糖α-L-***呋喃糖苷酶、α-L-***呋喃糖苷水解酶、L-***糖苷酶或α-L-***聚糖酶。就本发明而言，α-L-***呋喃糖苷酶活性是使用总体积200μl中的每ml的100mM乙酸钠pH5中5mg的中等粘度小麦***木聚糖(Megazyme International Ireland,Ltd.,Bray,Co.Wicklow,Ireland)在40℃进行30分钟，接着通过
Figure BDA0000496198300000041
HPX-87H柱层析(Bio-RadLaboratories,Inc.,Hercules,CA,USA)的***糖分析来确定的。
α-葡糖醛酸糖苷酶：术语“α-葡糖醛酸糖苷酶”意指α-D-葡糖苷酸葡糖醛酸水解酶(alpha-D-glucosiduronate glucuronohydrolase)(EC3.2.1.139)，其催化α-D-葡糖醛酸糖苷水解为D-葡糖醛酸和醇。就本发明而言，α-葡糖醛酸糖苷酶活性是根据de Vries,1998,J.Bacteriol.180:243-249确定的。一个单位的α-葡糖醛酸糖苷酶等于能够在pH5，40℃每分钟释放1微摩尔葡糖醛酸或4-O-甲基葡糖醛酸的酶量。
天冬氨酸蛋白酶：术语“天冬氨酸蛋白酶”意指使用天冬氨酸残基催化肽和蛋白中肽键的水解的蛋白酶。天冬氨酸蛋白酶是一个蛋白酶家族，其使用天冬氨酸残基来催化水解其肽底物。一般而言，其在活性位点具有两个高度保守的天冬氨酸，并在酸性pH具有最适活性(Szecsi,1992,Scand.J.Clin.Lab.In vest.Suppl.210:5-22)。就本发明而言，天冬氨酸蛋白酶活性根据由Aikawa等,2001,J.Biochem.129:791-794描述的方法确定。
β-葡糖苷酶：术语“β-葡糖苷酶”意指β-D-葡糖苷葡糖水解酶(beta-D-glucosideglucohydrolase)(E.C.No.3.2.1.21)，其催化末端非还原β-D-葡萄糖残基的水解，并释放β-D-葡萄糖。就本发明而言，β-葡糖苷酶根据Venturi等,2002,Extracellularbeta-D-glucosidase from Chaetomium thermophilum var.coprophilum:production,purification and some biochemical properties,J.Basic Microbiol.42:55-66的方法使用对硝基苯基-β-D-葡糖吡喃糖苷作为底物确定。一个单位的β-葡糖苷酶定义为在25℃,pH4.8，在含有0.01％
Figure BDA0000496198300000042
20(聚氧乙烯山梨坦单月桂酸酯)的50mM柠檬酸钠中从作为底物的1mM对硝基苯基-β-D-葡糖吡喃糖苷每分钟产生1.0微摩尔对硝基苯酚阴离子。
β-木糖苷酶：术语“β-木糖苷酶”意指β-D木糖苷木糖水解酶(β-D-xylosidexylohydrolase)(E.C.3.2.1.37)，其催化短β(1→4)木寡糖(xylooligosaccharide)的外水解以从非还原端去除连续的D-木糖残基。就本发明而言，一个单位的β-木糖苷酶定义为在40℃，pH5在含有0.01％
Figure BDA0000496198300000051
20的100mM柠檬酸钠中从作为底物的1mM对硝基苯基-β-D-木糖苷每分钟产生1.0微摩尔对硝基苯酚阴离子。
cDNA：术语“cDNA”意指能够通过反转录从得自真核或原核细胞的成熟的、已剪接的mRNA分子制备的DNA分子。cDNA缺少可存在于相应基因组DNA中的内含子序列。起始的(initial)、初级的RNA转录物是mRNA的前体，其通过一系列的步骤包括剪接进行加工，然后作为成熟的已剪接的mRNA出现。
纤维二糖水解酶：术语“纤维二糖水解酶”意指1,4-β-D-葡聚糖纤维二糖水解酶(1,4-beta-D-glucan cellobiohydrolase)(E.C.3.2.1.91和E.C.3.2.1.176)，其催化纤维素、纤维寡糖，或任何包含β-1,4-连接的葡萄糖的聚合物中的1,4-β-D-糖苷键的水解，从链的还原或非还原末端释放纤维二糖(Teeri,1997,Crystalline cellulose degradation:New insight into the function ofcellobiohydrolases,Trends in Biotechnology15:160-167；Teeri等,1998,Trichoderma reesei cellobiohydrolases:why so efficient on crystalline cellulose？,Biochem.Soc.Trans.26:173-178)。根据Lever等,1972,Anal.Biochem.47:273-279；van Tilbeurgh等,1982,FEBS Letters149:152-156；van Tilbeurgh和Claeyssens,1985,FEBS Letters187:283-288；以及Tomme等,1988,Eur.J.Biochem.170:575-581描述的方法确定纤维二糖水解酶活性。在本发明中，
Tomme等的方法可用于确定纤维二糖水解酶活性。
纤维素分解酶或纤维素酶：术语“纤维素分解酶”或“纤维素酶”意指一种或多种(例如几种)水解纤维素材料的酶。此类酶包括内切葡聚糖酶，纤维二糖水解酶，β-葡糖苷酶，或其组合。测量纤维素分解活性的两种基本方法包括：(1)测量总纤维素分解活性，和(2)测量单独的纤维素分解活性(内切葡聚糖酶、纤维二糖水解酶和β-葡糖苷酶)，如Zhang等,Outlook for cellulase improvement:Screening and selection strategies,2006,Biotechnology Advances24:452-481所综述的。总纤维素分解活性通常是使用不溶性底物来测定的，所述底物包括Whatman1号滤纸、微晶纤维素、细菌纤维素、藻类纤维素、棉花、经预处理的木素纤维素等。最常见的总纤维素分解活性测定法是使用Whatman1号滤纸作为底物的滤纸测定法。该测定法是由International Union of Pure andApplied Chemistry(IUPAC)(Ghose,1987,Measurement of cellulase activities,Pure Appl.Chem.59:257-68)确立的。
就本发明而言，纤维素分解酶活性通过测量在下述条件下由纤维素分解酶进行的纤维素材料水解相比于未添加纤维素分解酶蛋白的对照水解的增加来确定：1-50mg的纤维素分解酶蛋白/g的PCS中纤维素(或其它经预处理的纤维素材料)在合适的温度，例如50℃、55℃或60℃进行3-7日。通常条件为：1ml反应液，经洗涤或未洗涤的PCS，5％不溶性固形物，50mM乙酸钠pH5，1mM MnSO4，50℃、55℃或60℃，72小时，通过
Figure BDA0000496198300000061
HPX-87H柱(Bio-Rad Laboratories,Inc.,Hercules,CA,USA)进行糖分析。
纤维素材料：术语“纤维素材料”意指包含纤维素的任何材料。生物质的初生细胞壁(primary cell wall)中的主要多糖是纤维素，其次最丰富的是半纤维素，而第三是果胶。次生细胞壁(secondary cell wall)在细胞停止生长后产生，其同样含有多糖并通过共价交联至半纤维素的聚合木质素而加强。纤维素是脱水纤维二糖的均聚物，因此是直链β-(1-4)-D-葡聚糖，而半纤维素包括多种化合物，例如木聚糖、木葡聚糖(xyloglucan)、***木聚糖和甘露聚糖，形成具有多种多样的取代基的复杂分支结构。尽管纤维素通常是多形的，但存在于植物组织中的纤维素主要是平行葡聚糖链的不溶晶体基质。半纤维素通常与纤维素以及其它半纤维素以氢键相连，其帮助稳定细胞壁基质。
纤维素通常见于例如植物的茎、叶、壳、皮和穗轴，或树的叶、枝和木材。纤维素材料可以是，但不限于，农业残余物、草本材料(包括能源作物)、城市固体废物、纸浆与造纸厂残余物、废纸和木材(包括林业残余物)(参见，例如，Wiselogel等,1995,于Handbook on Bioethanol(Charles E.Wyman编),pp.105-118,Taylor&Francis,Washington D.C.；Wyman,1994,Bioresource Technology50:3-16；Lynd,1990,Applied Biochemistry and Biotechnology24/25:695-719；Mosier等,1999,Recent Progress in Bioconversion of Lignocellulosics,于Advances in BiochemicalEngineering/Biotechnology,T.Scheper主编,Volume65,pp.23-40,Springer-Verlag,New York)。在本文中应理解的是，纤维素可以是任何形式的木素纤维素，木素纤维素是一种在混合基质中包含木质素、纤维素和半纤维素的植物细胞壁材料。在一个优选的方面，纤维素材料是任何生物质材料。在另一个优选的方面，所述纤维素材料是木素纤维素，其包含纤维素、半纤维素和木质素。
在一个方面，纤维素材料是农业残余物。在另一个方面，纤维素材料是草本材料(包括能源作物)。在另一个方面，纤维素材料是城市固体废物。在另一个方面，纤维素材料是纸浆和造纸厂残余物。在另一个方面，纤维素材料是废纸。在另一个方面，纤维素材料是木材(包括林业残余物)。
在另一个方面，纤维素材料是芦竹(arundo)。在另一个方面，纤维素材料是蔗渣。在另一个方面，纤维素材料是竹子。在另一个方面，纤维素材料是玉米穗轴。在另一个方面，纤维素材料是玉米纤维。在另一个方面，纤维素材料是玉米秸秆。在另一个方面，纤维素材料是芒草属。在另一个方面，纤维素材料是橙皮。在另一个方面，纤维素材料是稻杆。在另一个方面，纤维素材料是柳枝稷(switch grass)。在另一个方面，纤维素材料是麦杆。
在另一个方面，纤维素材料是白杨。在另一个方面，纤维素材料是桉树。在另一个方面，纤维素材料是枞树。在另一个方面，纤维素材料是松树。在另一个方面，纤维素材料是杨树。在另一个方面，纤维素材料是云杉。在另一个方面，纤维素材料是柳树。
在另一个方面，纤维素材料是藻类纤维素。在另一个方面，纤维素材料是细菌纤维素。在另一个方面，纤维素材料是棉线头(cotton linter)。在另一个方面，纤维素材料是滤纸。在另一个方面，纤维素材料是微晶纤维素。在另一个方面，纤维素材料是磷酸处理的纤维素。
在另一个方面，纤维素材料是水生生物质。如用于本文中，“水生生物质”意指在水生环境中由光合作用过程产生的生物质。水生生物质可为藻类、挺水植物(emergent plant)、浮叶植物(floating-leaf plant)或沉水植物(submerged plant)。
纤维素材料可以按原样(as is)使用或进行预处理，预处理使用本领域已知的常规方法，如本文所述。在一个优选的方面，预处理纤维素材料。
编码序列：术语“编码序列”意指直接指定多肽的氨基酸序列的多核苷酸。编码序列的边界通常由开读框决定，所述开读框以起始密码子如ATG、GTG或TTG开始，并且以终止密码子如TAA、TAG或TGA结束。编码序列可以是基因组DNA、cDNA、合成DNA或其组合。
调控序列(control sequence)：术语“调控序列”意指对编码多肽的多核苷酸表达是必需的核酸序列。各个调控序列对于编码所述多肽的多核苷酸可以是天然的(即，来自同一基因)或外来的(即，来自不同基因)，或各个调控序列对于彼此可以是天然的或外来的。这些调控序列包括但不限于前导序列、聚腺苷酸化序列、前肽序列、启动子、信号肽序列和转录终止子。最少的情况下，调控序列包括启动子和转录和翻译的终止信号。调控序列可以配备用于引入特异性限制位点的接头，所述特异性限制位点促进调控序列与编码多肽的多核苷酸编码区的连接。
内切葡聚糖酶：术语“内切葡聚糖酶”意指内切-1,4-(1,3；1,4)-β-D-葡聚糖4-葡聚糖水解酶(endo-1,4-β-D-glucan4-glucanohydrolase)(E.C.3.2.1.4)，其催化纤维素、纤维素衍生物(例如羧甲基纤维素和羟乙基纤维素)、地衣淀粉(lichenin)中的1,4-β-D-糖苷键、混合的β-1,3葡聚糖例如谷类β-D-葡聚糖或木葡聚糖和含有纤维素组分的其它植物材料中的β-1,4键的内水解(endohydrolysis)。内切葡聚糖酶活性可通过测量底物粘度的减少或由还原糖测定法(Zhang等,2006,Biotechnology Advances24:452-481)确定的还原端增加来确定。就本发明而言，根据Ghose,1987,Pure and Appl.Chem.59:257-268的方法，在pH5，40℃使用羧甲基纤维素(CMC)作为底物来确定内切葡聚糖酶活性。
表达：术语“表达”包括涉及多肽产生的任何步骤，其包括但不限于转录、转录后修饰、翻译、翻译后修饰和分泌。
表达载体：术语“表达载体”意指线性的或环状的DNA分子，其包含编码多肽的多核苷酸，并且所述多核苷酸与提供用于其表达的调控序列可操作地连接。
家族61糖苷水解酶：术语“家族61糖苷水解酶”或“家族GH61”或“GH61”在本文中定义为根据Henrissat B.,1991,A classification of glycosyl hydrolasesbased on amino-acid sequence similarities,Biochem.J.280:309-316,及Henrissat B.和Bairoch A.,1996,Updating the sequence-based classification of glycosylhydrolases,Biochem.J.316:695-696属于糖苷水解酶家族61的多肽。该家族中的酶原先基于在一个家族成员测量到的非常弱的内切-1,4-β-D葡聚糖酶活性而归类为糖苷水解酶家族。这些酶的结构和作用模式是非经典的，且它们无法视为真正的(bona fide)糖苷酶。然而，基于当与纤维素酶或纤维素酶的混合物一同使用时，其增强木素纤维素分解的能力，它们被保留在CAZy分类中。
阿魏酸酯酶：术语“阿魏酸酯酶(feruloyl esterase)”意指4-羟基-3-甲氧基肉桂酰-糖水解酶(EC3.1.1.73)，其催化4-羟基-3-甲氧基肉桂酰(阿魏酰)基团从酯化的糖(其在天然生物质底物中通常为***糖)的水解，以产生阿魏酸(4-羟基-3-甲氧基肉桂酸)。阿魏酸酯酶也称作阿魏酸酯酶(ferulic acid esterase)、羟基肉桂酰基酯酶、FAE-III、肉桂酸酯水解酶、FAEA、cinnAE、FAE-I或FAE-II。就本发明而言，阿魏酸酯酶活性是使用50mM乙酸钠pH5.0中的0.5mM阿魏酸对硝基苯酯作为底物确定的。一个单位的阿魏酸酯酶等于能够在pH5，25℃每分钟释放1微摩尔对硝基苯酚阴离子的酶量。
侧翼：术语“侧翼”意指在特定DNA序列、基因座或基因任一侧延伸的DNA序列。侧翼DNA紧密邻接着另一个DNA序列、基因座或基因，其即将整合入丝状真菌细胞的基因组。
片段：术语“片段”意指从成熟多肽主体的氨基和/或羧基末端缺失一个或多个(例如几个)氨基酸的多肽；其中所述片段具有酶活性。在一个方面，片段含有酶的成熟多肽的至少85％，例如至少90％或至少95％的氨基酸残基。
半纤维素分解酶或半纤维素酶：术语“半纤维素分解酶”或“半纤维素酶”意指一种或多种(例如几种)水解半纤维素材料的酶。参见，例如Shallom,D.和Shoham,Y.Microbial hemicellulases.Current Opinion In Microbiology,2003,6(3):219-228)。半纤维素酶是植物生物质降解中的关键成分。半纤维素酶的实例包括但不限于乙酰甘露聚糖酯酶、乙酰木聚糖酯酶、***聚糖酶、***呋喃糖苷酶、香豆酸酯酶、阿魏酸酯酶、半乳糖苷酶、葡糖醛酸糖苷酶、葡糖醛酸酯酶、甘露聚糖酶、甘露糖苷酶、木聚糖酶和木糖苷酶。这些酶的底物，半纤维素，是支化和直链多糖的混杂集团，这些多糖通过氢键键合于植物细胞壁中的纤维素微纤维，将其交联为鲁棒(robust)的网络。半纤维素亦共价地附于木质素，与纤维素一同形成高度复杂的结构。半纤维素的多变的结构和组织形式需要许多酶的协同作用使其完全降解。半纤维素酶的催化模块为水解糖苷键的糖苷水解酶(GH)，或水解乙酸或阿魏酸侧基的酯连接的糖酯酶(CE)。这些催化模块，基于其一级结构的同源性，可指派为GH和CE家族。一些家族，具有总体上类似的折叠，可进一步归类为宗族(clan)，以字母标记(例如，GH-A)。最具信息性和最新的这些和其他糖活性酶的分类可在Carbohydrate-Active Enzymes(CAZy)数据库获得。半纤维素分解酶活性可根据Ghose和Bisaria,1987,Pure&Appl.Chem.59:1739-1752在合适的温度，例如50℃、55℃或60℃，或合适的pH，例如5.0或5.5进行测量。
高严格条件：术语“高严格条件”意指对于长度至少100个核苷酸的探针，在42℃，在5X SSPE、0.3％SDS、200微克/ml已剪切并且变性的鲑精DNA和50％的甲酰胺中，根据标准的Southern印迹法进行预杂交和杂交12至24小时。使用2X SSC、0.2％SDS在65℃将载体材料最终洗涤三次，每次15分钟。
同源3’或5’区：术语“同源3’区”意指DNA片段，其与基因组中的区具有相同序列或具有至少70％，例如至少75％，至少80％，至少81％，至少82％，至少83％，至少84％，至少85％，至少86％，至少87％，至少88％，至少89％，至少90％，至少91％，至少92％，至少93％，至少94％，至少95％，至少96％，至少97％，至少98％，或至少99％的序列同一性，且当与同源5’区组合时，可通过同源重组靶向整合一片DNA至基因组中的特定位点。术语“同源5’区”指DNA片段，其与基因组中的区具有相同序列，且当与同源3’区组合时，可通过同源重组靶向整合一片DNA至基因组中的特定位点。同源5’和3’区必须在基因组中相连，这意味着它们在同一染色体上，并彼此相距在200kb以内(within atleast200kb of one another)。
同源侧翼区：术语“同源侧翼区”意指DNA片段，其与基因组中的区相同或具有至少70％，例如至少75％，至少80％，至少81％，至少82％，至少83％，至少84％，至少85％，至少86％，至少87％，至少88％，至少89％，至少90％，至少91％，至少92％，至少93％，至少94％，至少95％，至少96％，至少97％，至少98％，或至少99％的序列同一性，且位于紧接着胞外DNA靶向整合入的基因组中特定位点的上游或下游。
同源重复：术语“同源重复”意指在引入宿主细胞的重组DNA中重复至少两次的DNA片段，且其可通过同源重组协助DNA的丧失，即，将选择标志物***两个同源重复之间。同源重复亦称为直接重复。
宿主细胞：术语“宿主细胞”意指任何适合于使用包含编码多肽的多核苷酸的核酸构建体或表达载体进行转化、转染、转导等的细胞类型。术语“宿主细胞”涵盖亲本细胞的由于在复制中发生的突变而不同于亲本细胞的任何后代。
分离的：术语“分离的”意指以不在自然界出现的形式或环境存在的物质。分离的物质的非限定性实例包括(1)任何非天然存在的物质，(2)任何至少部分地与一种或多种或全部与其天然伴随的天然存在的成分脱离的物质，包括但不限于任何酶、变体、核酸、蛋白质、肽或辅因子；(3)任何相对于自然界中所见的该物质而言经过了人工修饰的物质；或(4)任何通过相对于与其天然伴随的其他组分增加该物质的量(例如，在宿主细胞中重组产生；编码该物质的基因的多拷贝；使用比与编码该物质的基因天然伴随的启动子更强的启动子)而修饰的物质。
低严格条件：术语“低严格条件”意指对于长度至少100个核苷酸的探针，在42℃，在5X SSPE、0.3％SDS、200微克/ml已剪切并且变性的鲑精DNA和25％的甲酰胺中，根据标准的Southern印迹法进行预杂交和杂交12至24小时。使用2X SSC、0.2％SDS在50℃将载体材料最终洗涤三次，每次15分钟。
成熟多肽：术语“成熟多肽”意指以其在翻译和任何翻译后修饰之后的最终形式存在的多肽，所述修饰例如N-末端加工、C-末端截短、糖基化、磷酸化等。在一个方面，根据预测SEQ ID NO:2的氨基酸1至26是信号肽的SignalP程序(Nielsen等,1997,Protein Engineering10:1-6)，烟曲霉纤维二糖水解酶I的成熟多肽是SEQ ID NO:2的氨基酸27至532。在另一个方面，根据预测SEQ ID NO:4的氨基酸1至19是信号肽的SignalP程序，烟曲霉纤维二糖水解酶II的成熟多肽是SEQ ID NO:4的氨基酸20至454。在另一个方面，根据预测SEQ ID NO:6的氨基酸1至19是信号肽的SignalP程序，烟曲霉β-葡糖苷酶的成熟多肽是SEQ ID NO:6的氨基酸20至863。在另一个方面，根据预测SEQ ID NO:8的氨基酸1至21是信号肽的SignalP程序，烟曲霉GH61多肽的成熟多肽是SEQID NO:8的氨基酸22至250。在另一个方面，根据预测SEQ ID NO:10的氨基酸1至18是信号肽的SignalP程序，烟曲霉内切葡聚糖酶I的成熟多肽是SEQ IDNO:10的氨基酸19至407。在另一个方面，根据预测SEQ ID NO:12的氨基酸1至18是信号肽的SignalP程序，烟曲霉内切葡聚糖酶II的成熟多肽是SEQ IDNO:12的氨基酸19至329。在另一个方面，根据预测SEQ ID NO:14的氨基酸1至17是信号肽的SignalP程序，烟曲霉木聚糖酶I的成熟多肽是SEQ ID NO:14的氨基酸18至364。在另一个方面，根据预测SEQ ID NO:16的氨基酸1至19是信号肽的SignalP程序，烟曲霉木聚糖酶II的成熟多肽是SEQ ID NO:16的氨基酸20至323。在另一个方面，根据预测SEQ ID NO:18的氨基酸1至19是信号肽的SignalP程序，烟曲霉木聚糖酶III的成熟多肽是SEQ ID NO:18的氨基酸20至397。在另一个方面，根据预测SEQ ID NO:20的氨基酸1至20是信号肽的SignalP程序，烟曲霉β-木糖苷酶的成熟多肽是SEQ ID NO:20的氨基酸21至792。在另一个方面，根据预测SEQ ID NO:22的氨基酸1至17是信号肽的SignalP程序，烟曲霉膨胀素的成熟多肽是SEQ ID NO:22的氨基酸18至470。
在另一个方面，根据预测SEQ ID NO:24的氨基酸1至17是信号肽的SignalP程序，里氏木霉纤维二糖水解酶I的成熟多肽是SEQ ID NO:24的氨基酸18至514。在另一个方面，根据预测SEQ ID NO:26的氨基酸1至18是信号肽的SignalP程序，里氏木霉纤维二糖水解酶II的成熟多肽是SEQ ID NO:26的氨基酸19至471。在另一个方面，根据预测SEQ ID NO:28的氨基酸1至19是信号肽的SignalP程序，里氏木霉β-葡糖苷酶的成熟多肽是SEQ ID NO:28的氨基酸20至744。在另一个方面，根据预测SEQ ID NO:30的氨基酸1至22是信号肽的SignalP程序，里氏木霉内切葡聚糖酶I的成熟多肽是SEQ ID NO:30的氨基酸23至459。在另一个方面，根据预测SEQ ID NO:32的氨基酸1至21是信号肽的SignalP程序，里氏木霉内切葡聚糖酶II的成熟多肽是SEQ ID NO:32的氨基酸22至418。在另一个方面，根据预测SEQ ID NO:34的氨基酸1至19是信号肽的SignalP程序，里氏木霉木聚糖酶I的成熟多肽是SEQ ID NO:34的氨基酸20至229。在另一个方面，根据预测SEQ ID NO:36的氨基酸1至19是信号肽的SignalP程序，里氏木霉木聚糖酶II的成熟多肽是SEQ ID NO:36的氨基酸20至223。在另一个方面，根据预测SEQ ID NO:38的氨基酸1至16是信号肽的SignalP程序，里氏木霉木聚糖酶III的成熟多肽是SEQ ID NO:38的氨基酸17至347。在另一个方面，根据预测SEQ ID NO:40的氨基酸1至20是信号肽的SignalP程序，里氏木霉β-木糖苷酶的成熟多肽是SEQ ID NO:40的氨基酸21至797。在另一个方面，根据预测SEQ ID NO:42的氨基酸1至18是信号肽的SignalP程序，里氏木霉膨胀素的成熟多肽是SEQ ID NO:42的氨基酸19至493。在本领域中已知宿主细胞可产生由相同多核苷酸表达的两种或更多种成熟多肽(即具有不同的C端和/或N端氨基酸)的混合物。
成熟多肽编码序列：术语“成熟多肽编码序列”意指编码具有酶活性的成熟多肽的多核苷酸。在一个方面，根据预测SEQ ID NO:1的核苷酸1至78编码信号肽的SignalP程序(Nielsen等,1997,见上)，烟曲霉纤维二糖水解酶I的成熟多肽编码序列是SEQ ID NO:1的核苷酸79至1956或其cDNA序列。在另一个方面，根据预测SEQ ID NO:3的核苷酸1至57编码信号肽的SignalP程序，烟曲霉纤维二糖水解酶II的成熟多肽编码序列是SEQ ID NO:3的核苷酸58至1700或其cDNA序列。在另一个方面，根据预测SEQ ID NO:5的核苷酸1至57编码信号肽的SignalP程序，烟曲霉β-葡糖苷酶的成熟多肽编码序列是SEQID NO:5的核苷酸58至2580或其cDNA序列。在另一个方面，根据预测SEQID NO:7的核苷酸1至63编码信号肽的SignalP程序，烟曲霉GH61多肽的成熟多肽编码序列是SEQ ID NO:7的核苷酸64至859或其cDNA序列。在另一个方面，根据预测SEQ ID NO:9的核苷酸1至54编码信号肽的SignalP程序，烟曲霉内切葡聚糖酶I的成熟多肽编码序列是SEQ ID NO:9的核苷酸55至1221或其cDNA序列。在另一个方面，根据预测SEQ ID NO:11的核苷酸1至54编码信号肽的SignalP程序，烟曲霉内切葡聚糖酶II的成熟多肽编码序列是SEQID NO:11的核苷酸55至1248或其cDNA序列。在另一个方面，根据预测SEQID NO:13的核苷酸1至51编码信号肽的SignalP程序，烟曲霉木聚糖酶I的成熟多肽编码序列是SEQ ID NO:13的核苷酸52至1145或其cDNA序列。在另一个方面，根据预测SEQ ID NO:15的核苷酸1至57编码信号肽的SignalP程序，烟曲霉木聚糖酶II的成熟多肽编码序列是SEQ ID NO:15的核苷酸58至1400或其cDNA序列。在另一个方面，根据预测SEQ ID NO:17的核苷酸1至106编码信号肽的SignalP程序，烟曲霉木聚糖酶III的成熟多肽编码序列是SEQID NO:17的核苷酸107至1415或其cDNA序列。在另一个方面，根据预测SEQID NO:19的核苷酸1至60编码信号肽的SignalP程序，烟曲霉β-木糖苷酶的成熟多肽编码序列是SEQ ID NO:19的核苷酸61至2373或其cDNA序列。在另一个方面，根据预测SEQ ID NO:21的核苷酸1至51编码信号肽的SignalP程序，烟曲霉膨胀素的成熟多肽编码序列是SEQ ID NO:21的核苷酸52至1657或其cDNA序列。
在另一个方面，根据预测SEQ ID NO:23的核苷酸1至51编码信号肽的SignalP程序，里氏木霉纤维二糖水解酶I的成熟多肽编码序列是SEQ ID NO:23的核苷酸52至1545或其cDNA序列。在另一个方面，根据预测SEQ ID NO:25的核苷酸1至54编码信号肽的SignalP程序，里氏木霉纤维二糖水解酶II的成熟多肽编码序列是SEQ ID NO:25的核苷酸55至1608或其cDNA序列。在另一个方面，根据预测SEQ ID NO:27的核苷酸1至57编码信号肽的SignalP程序，里氏木霉β-葡糖苷酶的成熟多肽编码序列是SEQ ID NO:27的核苷酸58至2612或其cDNA序列。在另一个方面，根据预测SEQ ID NO:29的核苷酸1至66编码信号肽的SignalP程序，里氏木霉内切葡聚糖酶I的成熟多肽编码序列是SEQ ID NO:29的核苷酸67至1374或其cDNA序列。在另一个方面，根据预测SEQ ID NO:31的核苷酸1至63编码信号肽的SignalP程序，里氏木霉内切葡聚糖酶II的成熟多肽编码序列是SEQ ID NO:31的核苷酸64至1254或其cDNA序列。在另一个方面，根据预测SEQ ID NO:33的核苷酸1至57编码信号肽的SignalP程序，里氏木霉木聚糖酶I的成熟多肽编码序列是SEQ ID NO:33的核苷酸58至749或其cDNA序列。在另一个方面，根据预测SEQ ID NO:35的核苷酸1至57编码信号肽的SignalP程序，里氏木霉木聚糖酶II的成熟多肽编码序列是SEQ ID NO:35的核苷酸58至778或其cDNA序列。在另一个方面，根据预测SEQ ID NO:37的核苷酸1至48编码信号肽的SignalP程序，里氏木霉木聚糖酶III的成熟多肽编码序列是SEQ ID NO:37的核苷酸49至1349或其cDNA序列。在另一个方面，根据预测SEQ ID NO:39的核苷酸1至60编码信号肽的SignalP程序，里氏木霉β-木糖苷酶的成熟多肽编码序列是SEQ IDNO:39的核苷酸61至2391或其cDNA序列。在另一个方面，根据预测SEQ IDNO:41的核苷酸1至54编码信号肽的SignalP程序，里氏木霉膨胀素的成熟多肽编码序列是SEQ ID NO:41的核苷酸55至2776或其cDNA序列。
中等严格条件：术语“中等严格条件”意指对于长度至少100个核苷酸的探针，在42℃，在5X SSPE、0.3％SDS、200微克/ml已剪切并且变性的鲑精DNA和35％的甲酰胺中，根据标准的Southern印迹法进行预杂交和杂交12至24小时。使用2X SSC、0.2％SDS在55℃将载体材料最终洗涤三次，每次15分钟。
中等-高严格条件：术语“中等-高严格条件”意指对于长度至少100个核苷酸的探针，在42℃，在5X SSPE、0.3％SDS、200微克/ml已剪切并且变性的鲑精DNA和35％的甲酰胺中，根据标准的Southern印迹法进行预杂交和杂交12至24小时。使用2X SSC、0.2％SDS在60℃将载体材料最终洗涤三次，每次15分钟。
核酸构建体：术语“核酸构建体”意指单链或双链的核酸分子，其分离自天然存在的基因，或其经修饰以本来不会存在于自然界中的方式含有核酸的区段，或其为合成的，其包含一个或多个(例如几个)调控序列。
可操作地连接：术语“可操作地连接”意指这样的构型，其中将调控序列置于相对于多核苷酸的编码序列的适当位置，使得调控序列指导编码序列的表达。
具有纤维素分解增强活性的多肽：术语“具有纤维素分解增强的多肽”意指催化具有纤维素分解活性的酶对纤维素材料的水解的增强的GH61多肽。就本发明而言，通过测量来自由纤维素分解酶在下述条件下与对照水解相比较水解纤维素材料的还原糖增加或纤维二糖与葡萄糖的总量增加来确定纤维素分解增强活性：1-50mg总蛋白/g PCS中纤维素，其中总蛋白包含50-99.5％w/w的纤维素分解酶蛋白，及0.5-50％w/w的具有纤维素分解增强活性的GH61多肽的蛋白质，在合适的温度，例如50℃、55℃或60℃，和pH，例如5.0或5.5历时1-7天，所述对照水解用等量的总蛋白加载量而无纤维素分解增强活性(1-50mg纤维素分解蛋白/g PCS中纤维素)进行。在一个优选的方面，使用在总蛋白重量的2-3％的米曲霉β-葡糖苷酶(根据WO02/095014在米曲霉中重组产生)或者总蛋白质量的2-3％的烟曲霉β-葡糖苷酶(如WO2002/095014所述在米曲霉中重组产生)的纤维素酶蛋白加载量存在下的
Figure BDA0000496198300000151
1.5L(Novozymes A/S,
Figure BDA0000496198300000152
Denmark)的混合物作为纤维素分解活性的来源。
具有纤维素分解增强活性的GH61多肽通过降低达到相同水解水平所需的纤维素分解酶的量而增强由具有纤维素分解活性的酶催化的纤维素材料的水解，优选降低至少1.01倍，例如至少1.05倍，至少1.10倍，至少1.25倍，至少1.5倍，至少2倍，至少3倍，至少4倍，至少5倍，至少10倍，或至少20倍。
预处理的玉米秸秆：术语“PCS”或“预处理的玉米秸秆”意指通过用热和稀硫酸处理、碱预处理或中性预处理的源自玉米秸秆的纤维素材料。
序列同一性：参数“序列同一性”描述两个氨基酸序列之间或两个核苷酸序列之间的相关性。
就本发明而言，两个氨基酸序列之间的序列同一性程度使用如EMBOSS软件包(EMBOSS:The European Molecular Biology Open Software Suite,Rice等,2000,Trends Genet.16:276-277)，优选5.0.0版或更新版本的Needle程序中所执行的Needleman-Wunsch算法(Needleman和Wunsch,1970,J.Mol.Biol.48:443-453)来测定。使用的参数为缺口罚分(gap penalty)10，缺口延伸罚分(gap extension penalty)0.5和EBLOSUM62(BLOSUM62的EMBOSS版)取代矩阵。使用Needle标记为“最高同一性(longest identity)”的输出结果(使用-nobrief选项获得)作为同一性百分比，并计算如下：
(同样的残基×100)/(比对长度－比对中缺口的总数)
就本发明而言，两个核苷酸序列之间的序列同一性程度使用如EMBOSS软件包(EMBOSS:The European Molecular Biology Open Software Suite,Rice等,2000,见上文)，优选5.0.0版或更新版本的Needle程序中所执行的Needleman-Wunsch算法(Needleman和Wunsch,1970,见上文)来测定。使用的参数为缺口罚分10，缺口延伸罚分0.5和EDNAFULL(NCBI NUC4.4的EMBOSS版)取代矩阵。使用Needle标记为“最高同一性”的输出结果(使用-nobrief选项获得)作为同一性百分比，并计算如下：
(同样的脱氧核糖核苷酸×100)/(比对长度－比对中缺口的总数)
亚序列：术语“亚序列(subsequence)”意指从成熟多肽编码序列的5’和/或3’端缺失一个或多个(例如几个)核苷酸的多核苷酸；其中所述亚序列编码具有酶活性的片段。在一个方面，亚序列含有酶的成熟多肽编码序列的至少85％，例如至少90％，或至少95％的核苷酸。
枯草杆菌蛋白酶样丝氨酸蛋白酶：术语“枯草杆菌蛋白酶样丝氨酸蛋白酶”意指与枯草杆菌蛋白酶具有类似的底物特异性的蛋白酶，其使用丝氨酸残基催化肽和蛋白中的肽键水解。枯草杆菌蛋白酶样蛋白酶(枯草蛋白酶)是丝氨酸蛋白酶，其表征为三个氨基酸天冬氨酸、组氨酸和丝氨酸的催化三联体(triad)。这些催化性残基的排列与来自地衣芽孢杆菌的原型枯草杆菌蛋白酶相同(Siezen和Leunissen,1997,Protein Science6:501-523)。枯草杆菌蛋白酶样丝氨酸蛋白酶活性可使用100mM NaCl-100mM MOPS pH7.0中的合成底物N-琥珀酰-L-Ala-L-Ala-L-Pro-L-Phe-对硝基苯胺(N-succinyl-L-Ala-L-Ala-L-Pro-L-Phe-p-nitroanilide，AAPF)(Bachem AG,Bubendorf,Switzerland)在50℃进行3小时然后测量405nm处的吸光度来确定。
靶向整合：术语“靶向整合”意指胞外DNA在限定的基因组基因座的稳定整合。
转化体：术语“转化体”意指摄取胞外DNA(外源、人工或修饰的)并表达其中含有的基因的细胞。
转化：术语“转化”意指将胞外DNA引入细胞，即，由通过细胞膜摄取并从其周围直接摄取，组入和表达外源遗传材料(外源DNA)导致的细胞的遗传改变。
转化效率：术语“转化效率”意指细胞可摄取胞外DNA并表达其中含有的基因的效率，其计算如下：将表达基因的阳性转化体的数量除以在转化步骤中使用的DNA的量。
胰蛋白酶样丝氨酸蛋白酶：术语“胰蛋白酶样丝氨酸蛋白酶”意指具有与胰蛋白酶类似的底物特异性的蛋白酶，其使用丝氨酸残基催化肽和蛋白中的肽键水解。就本发明而言，胰蛋白酶样丝氨酸蛋白酶活性根据Dienes等,2007,Enzymeand Microbial Technology40:1087-1094所述的步骤来确定。
变体：术语“变体”意指在一个或多个(例如几个)位置包含改变，即取代、***和/或缺失的具有酶活性的多肽。取代意指将占据某位置的氨基酸用不同的氨基酸替代；缺失意指去除占据某位置的氨基酸；而***意指在邻接并紧接着占据某位置的氨基酸之后添加氨基酸。
非常高严格条件：术语“非常高严格条件”意指对于长度至少100个核苷酸的探针，在42℃，在5X SSPE、0.3％SDS、200微克/ml已剪切并且变性的鲑精DNA和50％的甲酰胺中，根据标准的Southern印迹法进行预杂交和杂交12至24小时。使用2X SSC、0.2％SDS在70℃将载体材料最终洗涤三次，每次15分钟。
非常低严格条件：术语“非常低严格条件”意指对于长度至少100个核苷酸的探针，在42℃，在5X SSPE、0.3％SDS、200微克/ml已剪切并且变性的鲑精DNA和25％的甲酰胺中，根据标准的Southern印迹法进行预杂交和杂交12至24小时。使用2X SSC、0.2％SDS在45℃将载体材料最终洗涤三次，每次15分钟。
含木聚糖材料：术语“含木聚糖材料”意指任何包含含有β-(1-4)连接的木糖残基骨架的植物细胞壁多糖的材料。陆生植物的木聚糖是具有β-(1-4)-吡喃木糖骨架的杂聚物，其由短的糖链分支。它们包括D-葡糖醛酸或其4-O-甲基醚，L-***糖和/或多种包含D-木糖、L-***糖、D-或L-半乳糖和D-葡萄糖的寡糖。木聚糖类型的多糖可分为均木聚糖(homoxylan)和杂木聚糖(heteroxylan)，后者包括葡糖醛酸木聚糖，(***)葡糖醛酸木聚糖，(葡糖醛酸)***木聚糖，***木聚糖和复合杂木聚糖。参见，例如Ebringerova等,2005,Adv.Polym.Sci.186:1-67。
在本发明的工艺中，可使用任何含有木聚糖的材料。在一个优选的方面，所述含木聚糖材料是木素纤维素。
木聚糖降解活性或木聚糖分解活性：术语“木聚糖降解活性”或“木聚糖分解活性”意指水解含木聚糖材料的生物学活性。两种测定木聚糖分解活性的基础方法包括：(1)测定总木聚糖分解活性，和(2)测定单独的木聚糖分解活性(例如内切木聚糖酶、β-木糖苷酶、***呋喃糖苷酶、α-葡糖醛酸糖苷酶、乙酰木聚糖酯酶、阿魏酸酯酶和α-葡糖醛酸酯酶(α-glucuronyl esterase))。最近在木聚糖分解酶测定法的进展总结于几个公开文献中，包括Biely和Puchard,Recent progress in the assays of xylanolytic enzymes,2006,Journal of theScience of Food和Agriculture86(11):1636-1647；Spanikova和Biely,2006,Glucuronoyl esterase-Novel carbohydrate esterase produced by Schizophyllumcommune,FEBS Letters580(19):4597-4601；Herrmann,Vrsanska,Jurickova,Hirsch,Biely和Kubicek,1997,The beta-D-xylosidase of Trichoderma reesei is amultifunctional beta-D-xylan xylohydrolase,Biochemical Journal321:375-381。
总木聚糖降解活性可通过确定从多种类型的木聚糖形成的还原糖来测量，所述木聚糖包括例如燕麦小麦(oat spelt)、山毛榉木(beechwood)和落叶松木(larchwood)木聚糖，或者可通过光度法确定从多种共价染色的木聚糖释放出的染色的木聚糖片段来测量。最常见的总木聚糖分解活性测定法基于从多聚的4-O-甲基葡糖醛酸木聚糖产生还原糖，如Bailey,Biely,Poutanen,1992,Interlaboratory testing of methods for assay of xylanase activity,Journal ofBiotechnology23(3):257-270中所述。木聚糖酶活性亦可用0.2％AZCL-***木聚糖作为底物在37℃在0.01％
Figure BDA0000496198300000181
X-100(4-(1,1,3,3-四甲基丁基)苯基-聚乙二醇)和200mM磷酸钠缓冲液pH6中来确定。一个单位的木聚糖酶活性定义为在37℃，pH6在200mM磷酸钠pH6缓冲液中从作为底物的0.2％AZCL-***木聚糖每分钟产生1.0微摩尔天青精。
就本发明而言，木聚糖降解活性是通过测量由木聚糖降解酶在下述通常条件下造成的桦木木聚糖(Sigma Chemical Co.,Inc.,St.Louis,MO,USA)水解的增加来确定的：1ml反应，5mg/ml底物(总固形物)，5mg木聚糖分解蛋白质/g底物，50mM乙酸钠，pH5，50℃，24小时，如Lever,1972,A new reactionfor colorimetric determination of carbohydrates,Anal.Biochem47:273-279所述使用对羟基苯甲酸酰肼(PHBAH)测定法进行糖分析。
木聚糖酶：术语“木聚糖酶”意指1,4-β-D-木聚糖-木糖水解酶(1,4-β-D-xylan-xylohydrolase)(E.C.3.2.1.8)，其催化木聚糖中1,4-β-D-木糖苷键的内水解。就本发明而言，木聚糖酶活性是使用0.2％AZCL-***木聚糖作为底物在0.01％
Figure BDA0000496198300000182
X-100和200mM磷酸钠pH6缓冲液中在37℃确定的。一个单位的木聚糖酶活性定义为在37℃，pH6在200mM磷酸钠pH6缓冲液中从作为底物的0.2％AZCL-***木聚糖每分钟产生1.0微摩尔天青精。
发明详述
本发明涉及重组木霉属宿主细胞，其包含多核苷酸，所述多核苷酸编码(i)烟曲霉纤维二糖水解酶I；(ii)烟曲霉纤维二糖水解酶II；(iii)烟曲霉β-葡糖苷酶；和(iv)具有纤维素分解增强活性的烟曲霉GH61多肽；或其同源物。在一个方面，所述重组木霉属宿主细胞进一步包含一种或多种(例如几种)多核苷酸，所述多核苷酸编码一种或多种(例如几种)选自下组的酶：(i)烟曲霉内切葡聚糖酶I；(ii)烟曲霉内切葡聚糖酶II；(iii)烟曲霉木聚糖酶；(iv)烟曲霉β-木糖苷酶；和(v)烟曲霉膨胀素；或其同源物。
本发明的重组木霉属宿主细胞产生的烟曲霉纤维素分解酶的酶组合物令人意想不到地在分解纤维素材料方面比由里氏木霉或烟曲霉产生的天然纤维素分解酶组合物更加有效。
烟曲霉纤维素酶和半纤维素酶
在本发明中可使用任何烟曲霉纤维二糖水解酶I，烟曲霉纤维二糖水解酶II，烟曲霉β-葡糖苷酶；具有纤维素分解增强活性的烟曲霉GH61多肽，烟曲霉内切葡聚糖酶I，烟曲霉内切葡聚糖酶II，烟曲霉木聚糖酶，烟曲霉β-木糖苷酶，和烟曲霉膨胀素，或其同源物。
在一个方面，所述烟曲霉纤维二糖水解酶I或其同源物选自下组：(i)纤维二糖水解酶I，其包含或组成为SEQ ID NO:2的成熟多肽；(ii)纤维二糖水解酶I，其包含或组成为氨基酸序列，所述氨基酸序列与SEQ ID NO:2的成熟多肽具有至少70％，例如至少75％，至少80％，至少81％，至少82％，至少83％，至少84％，至少85％，至少86％，至少87％，至少88％，至少89％，至少90％，至少91％，至少92％，至少93％，至少94％，至少95％，至少96％，至少97％，至少98％，或至少99％序列同一性；(iii)纤维二糖水解酶I，其由多核苷酸编码，所述多核苷酸包含或组成为核苷酸序列，所述核苷酸序列与SEQ ID NO:1的成熟多肽编码序列具有至少70％，例如至少75％，至少80％，至少81％，至少82％，至少83％，至少84％，至少85％，至少86％，至少87％，至少88％，至少89％，至少90％，至少91％，至少92％，至少93％，至少94％，至少95％，至少96％，至少97％，至少98％，或至少99％序列同一性；和(iv)纤维二糖水解酶I，其由多核苷酸编码，所述多核苷酸在至少高严格条件，例如非常高严格条件下，与SEQ ID NO:1的成熟多肽编码序列或其全长互补链杂交。
在另一个方面，所述烟曲霉纤维二糖水解酶II或其同源物选自下组：(i)纤维二糖水解酶II，其包含或组成为SEQ ID NO:4的成熟多肽；(ii)纤维二糖水解酶II，其包含或组成为氨基酸序列，所述氨基酸序列与SEQ ID NO:4的成熟多肽具有至少70％，例如至少75％，至少80％，至少81％，至少82％，至少83％，至少84％，至少85％，至少86％，至少87％，至少88％，至少89％，至少90％，至少91％，至少92％，至少93％，至少94％，至少95％，至少96％，至少97％，至少98％，或至少99％序列同一性；(iii)纤维二糖水解酶II，其由多核苷酸编码，所述多核苷酸包含或组成为核苷酸序列，所述核苷酸序列与SEQ ID NO:3的成熟多肽编码序列具有至少70％，例如至少75％，至少80％，至少81％，至少82％，至少83％，至少84％，至少85％，至少86％，至少87％，至少88％，至少89％，至少90％，至少91％，至少92％，至少93％，至少94％，至少95％，至少96％，至少97％，至少98％，或至少99％序列同一性；和(iv)纤维二糖水解酶II，其由多核苷酸编码，所述多核苷酸在至少高严格条件，例如非常高严格条件下，与SEQ ID NO:3的成熟多肽编码序列或其全长互补链杂交。
在另一个方面，所述烟曲霉β-葡糖苷酶或其同源物选自下组：(i)β-葡糖苷酶，其包含或组成为SEQ ID NO:6的成熟多肽；(ii)β-葡糖苷酶，其包含或组成为氨基酸序列，所述氨基酸序列与SEQ ID NO:6的成熟多肽具有至少70％，例如至少75％，至少80％，至少81％，至少82％，至少83％，至少84％，至少85％，至少86％，至少87％，至少88％，至少89％，至少90％，至少91％，至少92％，至少93％，至少94％，至少95％，至少96％，至少97％，至少98％，或至少99％序列同一性；(iii)β-葡糖苷酶，其由多核苷酸编码，所述多核苷酸包含或组成为核苷酸序列，所述核苷酸序列与SEQ ID NO:5的成熟多肽编码序列具有至少70％，例如至少75％，至少80％，至少81％，至少82％，至少83％，至少84％，至少85％，至少86％，至少87％，至少88％，至少89％，至少90％，至少91％，至少92％，至少93％，至少94％，至少95％，至少96％，至少97％，至少98％，或至少99％序列同一性；和(iv)β-葡糖苷酶，其由多核苷酸编码，所述多核苷酸在至少高严格条件，例如非常高严格条件下，与SEQ ID NO:5的成熟多肽编码序列或其全长互补链杂交。
在另一个方面，所述具有纤维素分解增强活性的烟曲霉GH61多肽或其同源物选自下组：(i)具有纤维素分解增强活性的GH61多肽，其包含或组成为SEQ ID NO:8的成熟多肽；(ii)具有纤维素分解增强活性的GH61多肽，其包含或组成为氨基酸序列，所述氨基酸序列与SEQ ID NO:8的成熟多肽具有至少70％，例如至少75％，至少80％，至少81％，至少82％，至少83％，至少84％，至少85％，至少86％，至少87％，至少88％，至少89％，至少90％，至少91％，至少92％，至少93％，至少94％，至少95％，至少96％，至少97％，至少98％，或至少99％序列同一性；(iii)具有纤维素分解增强活性的GH61多肽，其由多核苷酸编码，所述多核苷酸包含或组成为核苷酸序列，所述核苷酸序列与SEQ ID NO:7的成熟多肽编码序列具有至少70％，例如至少75％，至少80％，至少81％，至少82％，至少83％，至少84％，至少85％，至少86％，至少87％，至少88％，至少89％，至少90％，至少91％，至少92％，至少93％，至少94％，至少95％，至少96％，至少97％，至少98％，或至少99％序列同一性；和(iv)具有纤维素分解增强活性的GH61多肽，其由多核苷酸编码，所述多核苷酸在至少高严格条件，例如非常高严格条件下，与SEQ ID NO:7的成熟多肽编码序列或其全长互补链杂交。
在另一个方面，所述烟曲霉内切葡聚糖酶I或其同源物选自下组：(i)内切葡聚糖酶I，其包含或组成为SEQ ID NO:10的成熟多肽；(ii)内切葡聚糖酶I，其包含或组成为氨基酸序列，所述氨基酸序列与SEQ ID NO:10的成熟多肽具有至少70％，例如至少75％，至少80％，至少81％，至少82％，至少83％，至少84％，至少85％，至少86％，至少87％，至少88％，至少89％，至少90％，至少91％，至少92％，至少93％，至少94％，至少95％，至少96％，至少97％，至少98％，或至少99％序列同一性；(iii)内切葡聚糖酶I，其由多核苷酸编码，所述多核苷酸包含或组成为核苷酸序列，所述核苷酸序列与SEQ ID NO:9的成熟多肽编码序列具有至少70％，例如至少75％，至少80％，至少81％，至少82％，至少83％，至少84％，至少85％，至少86％，至少87％，至少88％，至少89％，至少90％，至少91％，至少92％，至少93％，至少94％，至少95％，至少96％，至少97％，至少98％，或至少99％序列同一性；和(iv)内切葡聚糖酶I，其由多核苷酸编码，所述多核苷酸在至少高严格条件，例如非常高严格条件下，与SEQ ID NO:9的成熟多肽编码序列或其全长互补链杂交。
在另一个方面，所述烟曲霉内切葡聚糖酶II或其同源物选自下组：(i)内切葡聚糖酶II，其包含或组成为SEQ ID NO:12的成熟多肽；(ii)内切葡聚糖酶II，其包含或组成为氨基酸序列，所述氨基酸序列与SEQ ID NO:12的成熟多肽具有至少70％，例如至少75％，至少80％，至少81％，至少82％，至少83％，至少84％，至少85％，至少86％，至少87％，至少88％，至少89％，至少90％，至少91％，至少92％，至少93％，至少94％，至少95％，至少96％，至少97％，至少98％，或至少99％序列同一性；(iii)内切葡聚糖酶II，其由多核苷酸编码，所述多核苷酸包含或组成为核苷酸序列，所述核苷酸序列与SEQ ID NO:11的成熟多肽编码序列具有至少70％，例如至少75％，至少80％，至少81％，至少82％，至少83％，至少84％，至少85％，至少86％，至少87％，至少88％，至少89％，至少90％，至少91％，至少92％，至少93％，至少94％，至少95％，至少96％，至少97％，至少98％，或至少99％序列同一性；和(iv)内切葡聚糖酶II，其由多核苷酸编码，所述多核苷酸在至少高严格条件，例如非常高严格条件下，与SEQ ID NO:11的成熟多肽编码序列或其全长互补链杂交。
在另一个方面，所述烟曲霉木聚糖酶或其同源物选自下组：(i)木聚糖酶，其包含或组成为SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:16或SEQ ID NO:18的成熟多肽；(ii)木聚糖酶，其包含或组成为氨基酸序列，所述氨基酸序列与SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:16或SEQ ID NO:18的成熟多肽具有至少70％，例如至少75％，至少80％，至少81％，至少82％，至少83％，至少84％，至少85％，至少86％，至少87％，至少88％，至少89％，至少90％，至少91％，至少92％，至少93％，至少94％，至少95％，至少96％，至少97％，至少98％，或至少99％序列同一性；(iii)木聚糖酶，其由多核苷酸编码，所述多核苷酸包含或组成为核苷酸序列，所述核苷酸序列与SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:15或SEQ ID NO:17的成熟多肽编码序列具有至少70％，例如至少75％，至少80％，至少81％，至少82％，至少83％，至少84％，至少85％，至少86％，至少87％，至少88％，至少89％，至少90％，至少91％，至少92％，至少93％，至少94％，至少95％，至少96％，至少97％，至少98％，或至少99％序列同一性；和(iv)木聚糖酶，其由多核苷酸编码，所述多核苷酸在至少高严格条件，例如非常高严格条件下，与SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:15或SEQID NO:17的成熟多肽编码序列或其全长互补链杂交。
在另一个方面，所述烟曲霉β-木糖苷酶或其同源物选自下组：(i)β-木糖苷酶，其包含或组成为SEQ ID NO:20的成熟多肽；(ii)β-木糖苷酶，其包含或组成为氨基酸序列，所述氨基酸序列与SEQ ID NO:20的成熟多肽具有至少70％，例如至少75％，至少80％，至少81％，至少82％，至少83％，至少84％，至少85％，至少86％，至少87％，至少88％，至少89％，至少90％，至少91％，至少92％，至少93％，至少94％，至少95％，至少96％，至少97％，至少98％，或至少99％序列同一性；(iii)β-木糖苷酶，其由多核苷酸编码，所述多核苷酸包含或组成为核苷酸序列，所述核苷酸序列与SEQ ID NO:19的成熟多肽编码序列具有至少70％，例如至少75％，至少80％，至少81％，至少82％，至少83％，至少84％，至少85％，至少86％，至少87％，至少88％，至少89％，至少90％，至少91％，至少92％，至少93％，至少94％，至少95％，至少96％，至少97％，至少98％，或至少99％序列同一性；和(iv)β-木糖苷酶，其由多核苷酸编码，所述多核苷酸在至少高严格条件，例如非常高严格条件下，与SEQ ID NO:19的成熟多肽编码序列或其全长互补链杂交。
在另一个方面，所述烟曲霉膨胀素或其同源物选自下组：(i)膨胀素，其包含或组成为SEQ ID NO:22的成熟多肽；(ii)膨胀素，其包含或组成为氨基酸序列，所述氨基酸序列与SEQ ID NO:22的成熟多肽具有至少70％，例如至少75％，至少80％，至少81％，至少82％，至少83％，至少84％，至少85％，至少86％，至少87％，至少88％，至少89％，至少90％，至少91％，至少92％，至少93％，至少94％，至少95％，至少96％，至少97％，至少98％，或至少99％序列同一性；(iii)膨胀素，其由多核苷酸编码，所述多核苷酸包含或组成为核苷酸序列，所述核苷酸序列与SEQ ID NO:21的成熟多肽编码序列具有至少70％，例如至少75％，至少80％，至少81％，至少82％，至少83％，至少84％，至少85％，至少86％，至少87％，至少88％，至少89％，至少90％，至少91％，至少92％，至少93％，至少94％，至少95％，至少96％，至少97％，至少98％，或至少99％序列同一性；和(iv)膨胀素，其由多核苷酸编码，所述多核苷酸在至少高严格条件，例如非常高严格条件下，与SEQ ID NO:21的成熟多肽编码序列或其全长互补链杂交。
可利用SEQ ID NO:1、3、5、7、9、11、13、15、17、19或21的多核苷酸或其亚序列，以及SEQ ID NO:2、4、6、8、10、12、14、16、18、20或22的多肽或其片段设计核酸探针，以根据本领域内公知的方法从不同属或种的菌株鉴定和克隆编码酶的DNA。具体而言，根据标准的Southern印迹方法，可将这些探针用于与感兴趣的细胞的基因组DNA或cDNA杂交，以鉴定和从其中分离相应的基因。这些探针可明显短于完整序列，但长度上应为至少15，例如至少25，至少35，或至少70个核苷酸。优选地，所述核酸探针是至少100个核苷酸的长度，例如，至少200个核苷酸，至少300个核苷酸，至少400个核苷酸，至少500个核苷酸，至少600个核苷酸，至少700个核苷酸，至少800个核苷酸，或至少900个核苷酸的长度。DNA和RNA探针二者均可使用。通常将探针标记以探测相应的基因(例如，用32P、3H、35S、生物素或抗生物素蛋白(avidin)标记)。这些探针涵盖于本发明中。
可从基因组DNA或cDNA文库中筛选与上述探针杂交并且编码酶的DNA。可以通过琼脂糖或聚丙烯酰胺凝胶电泳，或通过其它分离技术分离基因组或其它DNA。可以将来自文库的DNA或分离的DNA转移至硝化纤维素(nitrocellulose)或其它合适的载体材料并且固定于其上。为了鉴定与SEQ IDNO:1、3、5、7、9、11、13、15、17、19或21或其亚序列杂交的克隆或DNA，将所述载体材料用在Sounthern印迹中。
就本发明而言，杂交表示多核苷酸在非常低至非常高的严格条件下与标记的核酸探针杂交，所述核酸探针对应于：(i)SEQ ID NO:1、3、5、7、9、11、13、15、17、19或21；(ii)SEQ ID NO:1、3、5、7、9、11、13、15、17、19或21的成熟多肽编码序列；(iii)其cDNA序列；(iv)它们的全长互补链；或(iv)它们的亚序列。可使用例如X射线胶片(X-ray film)或其他任何本领域中已知的检测手段检测在这些条件下与核酸探针杂交的分子。
在一个方面，所述核酸探针是SEQ ID NO:1、3、5、7、9、11、13、15、17、19或21，或其成熟多肽编码序列。在另一个方面，所述核酸探针是编码SEQ ID NO:2、4、6、8、10、12、14、16、18、20或22的多肽，其成熟多肽，或其片段的多核苷酸。
用于分离或克隆多核苷酸的技术在本领域中是已知的，并包括从基因组分离DNA或cDNA，或其组合。可通过例如使用熟知的聚合酶链式反应(PCR)或表达文库的抗体筛选来检测具有共有结构特性的克隆DNA片段，从而实现从这种基因组DNA克隆多核苷酸。参见，例如，Innis等,1990,PCR:A Guide toMethods and Application,Academic Press,New York。可以使用其它核酸扩增方法，如连接酶链式反应(LCR)、连接活化转录(ligated activated transcription；LAT)和基于多核苷酸的扩增(NASBA)。可以从烟曲霉的菌株克隆所述多核苷酸，因此，例如可为所述多核苷酸的多肽编码区的等位变体或种变体(species variant)。
可使用上述烟曲霉酶(或蛋白)的化学修饰的或蛋白质工程改造的突变体。
烟曲霉酶亦可为杂合多肽，其中烟曲霉酶的区域融合于另一个酶的区域的N端或C端。
所述烟曲霉酶亦可为融合多肽或可切割的融合多肽，其中另一个酶融合于烟曲霉酶的N端或C端。通过将编码另一个酶的多核苷酸融合于编码所述烟曲霉酶的多核苷酸来产生融合多肽。产生融合多肽的技术是本领域已知的，并包括连接编码多肽的编码序列以使它们符合读框(in frame)，并且使融合多肽的表达在相同启动子和终止子的调控下。融合蛋白亦可使用内蛋白(intein)技术构建，其中融合物在翻译后产生(Cooper等,1993,EMBO J.12:2575-2583；Dawson等,1994,Science266:776-779)。
融合多肽还可以在两个多肽之间包含切割位点。融合多肽一旦分泌，所述位点就被切割开，释放所述两个多肽。切割位点的实例包括，但不限于，公开于Martin等,2003,J.Ind.Microbiol.Biotechnol.3:568-76；Svetina等,2000,J.Biotechnol.76:245-251；Rasmussen-Wilson等,1997,Appl.Environ.Microbiol.63:3488-3493；Ward等,1995,Biotechnology13:498-503；和Contreras等,1991,Biotechnology9:378-381；Eaton等,1986,Biochem.25:505-512)；Collins-Racie等,1995,Biotechnology13:982-987；Carter等,1989,Proteins:Structure,Function,and Genetics6:240-248；以及Stevens,2003,Drug Discovery World4:35-48中的位点。
所述烟曲霉酶还可为一个或多个(例如几个)选自下组的烟曲霉酶：乙酰甘露聚糖酯酶，乙酰木聚糖酯酶，***聚糖酶，***呋喃糖苷酶，香豆酸酯酶，阿魏酸酯酶，半乳糖苷酶，葡糖醛酸糖苷酶，葡糖醛酸酯酶，甘露聚糖酶，和甘露糖苷酶。
所述烟曲霉酶甚至还可为一个或多个(例如几个)选自下组的烟曲霉酶：酯酶，棒曲霉素，漆酶，木质素分解酶，果胶酶，过氧化物酶，和蛋白酶。
木霉属宿主细胞
所述木霉属宿主细胞可为任何可用于酶或蛋白的重组产生的木霉属细胞。例如，所述木霉属细胞可为哈茨木霉(Trichoderma harzianum)、康宁木霉(Trichoderma koningii)、长枝木霉(Trichoderma longibrachiatum)、里氏木霉(Trichoderma reesei)或绿色木霉(Trichoderma viride)细胞。在一个方面，所述木霉属细胞是哈茨木霉细胞。在另一个方面，所述木霉属细胞是康宁木霉细胞。在另一个方面，所述木霉属细胞是长枝木霉细胞。在另一个方面，所述木霉属细胞是里氏木霉细胞。在另一个方面，所述木霉属细胞是绿色木霉细胞。
在另一个方面，所述里氏木霉细胞是里氏木霉RutC30。在另一个方面，所述里氏木霉细胞是里氏木霉TV10。在另一个方面，所述绿色木霉细胞是里氏木霉RutC30的突变体。在另一个方面，所述里氏木霉细胞是里氏木霉TV10的突变体。在另一个方面，所述绿色木霉细胞是里氏木霉的形态学突变体。参见例如WO97/26330，其通过全文提述并入本文。
可以将木霉属细胞通过涉及原生质体形成、原生质体转化和细胞壁再生的工艺以本身已知的方式转化。用于转化木霉属宿主细胞的合适方法在EP238023和Yelton等,1984,Proc.Natl.Acad.Sci.USA81:1470-1474以及Christensen等,1988,Bio/Technology6:1419-1422中描述。
在木霉属宿主细胞中，可通过破坏或缺失一个或多个(例如几个)天然纤维素酶和/或半纤维素酶基因或其一部分来使所述基因失活，这导致突变细胞与亲本细胞相比，当在相同条件下培养时，产生较少或不产生所述纤维素酶和/或半纤维素酶。在一个方面，所述一种或多种(例如几种)纤维素酶基因编码选自下组的酶：纤维二糖水解酶I，纤维二糖水解酶II，内切葡聚糖酶I，内切葡聚糖酶II，β-葡糖苷酶，和膨胀素。在另一个方面，所述一种或多种(例如几种)半纤维素酶基因编码选自下组的酶：木聚糖酶I，木聚糖酶II，木聚糖酶III，和β-木糖苷酶。在另一个方面，所述一种或多种(例如几种)半纤维素酶基因编码选自下组的酶：乙酰甘露聚糖酯酶，乙酰木聚糖酯酶，***聚糖酶，***呋喃糖苷酶，香豆酸酯酶，阿魏酸酯酶，半乳糖苷酶，葡糖醛酸糖苷酶，葡糖醛酸酯酶，甘露聚糖酶，和甘露糖苷酶。
所述突变细胞可通过使用本领域公知的方法，例如***、破坏、替代或缺失，来减少或消除编码木霉属纤维素酶或半纤维素酶的多核苷酸的表达。在一个优选的方面，所述多核苷酸经失活。待修饰或失活的多核苷酸可为，例如编码区或其对于活性必需的部分，或编码区表达所需的调节元件。此种调节或调控序列的实例可为启动子序列或其功能部分，即，足以影响多核苷酸表达的部分。其它可供修饰的调控序列包括但不限于：前导序列，聚腺苷酸化序列，前肽序列，信号肽序列，转录终止子，和转录激活子。
可以通过向亲本细胞施以诱变，并且选择其中已将多核苷酸的表达减少或消除的突变细胞来进行多核苷酸的修饰或失活。诱变可能是特异性的或随机的，可以通过例如使用合适的物理或化学诱变剂进行，通过使用合适的寡核苷酸进行，或通过将所述DNA序列进行PCR产生的诱变。此外，可以通过使用这些诱变剂的任何组合来进行诱变。
适合于本发明目的的物理或化学诱变剂的实例包括紫外线(UV)照射、羟胺、N-甲基-N'-硝基-N-亚硝基胍(MNNG)、O-甲基羟胺、亚硝酸、乙基甲磺酸酯(ethyl methane sulphonate)(EMS)、亚硫酸氢钠、甲酸和核苷酸类似物。
当使用这些试剂时，通常通过如下方法来进行所述诱变：在合适条件下存在所述诱变剂时温育待诱变的亲本细胞，并筛选和/或选择显示基因表达减少的或无基因表达的突变细胞。
亦可通过***、取代或缺失基因或其转录或翻译所需的调控元件中的一个或多个(例如几个)核苷酸实现多核苷酸的修饰或失活。例如，可以***或去除核苷酸从而导致引入终止密码子，去除起始密码子，或改变开读框。按照本领域已知的方法通过定位诱变或PCR产生的诱变可以实现这种修饰或失活。尽管在理论上所述修饰可以在体内进行，即，直接在表达待修饰的多核苷酸的细胞上进行，但优选如下面所示例的那样在体外进行所述修饰。
消除或减少多核苷酸表达的便利方式的实例是基于基因替代，基因缺失，或基因破坏的技术。例如，在基因破坏方法中，将对应于内源多核苷酸的核酸序列在体外进行诱变以产生缺陷性的核酸序列，然后将其转化入亲本细胞中以产生缺陷基因。通过同源重组，所述缺陷性核酸序列替代了内源多核苷酸。理想的是所述缺陷性多核苷酸还编码标志物，其可用于选择其中多核苷酸被修饰或破坏的转化子。在一个方面，用选择性标志物(如本文所述的那些)来破坏所述多核苷酸。
亦可通过在细胞中抑制由所述多核苷酸编码的酶的表达来实现对于多核苷酸的修饰或失活，即向细胞施用或在细胞中表达双链RNA(dsRNA)分子，其中所述dsRNA包含编码所述酶的多核苷酸的亚序列。在一个优选的方面，所述dsRNA长度为约15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25或更多个双链体核苷酸。
所述dsRNA优选为小干扰RNA(siRNA)或微RNA(miRNA)。在一个优选的方面，所述dsRNA是用于抑制转录的小干扰RNA。在另一个优选的方面，所述dsRNA是用于抑制翻译的微RNA。在另一个方面，所述双链RNA(dsRNA)分子包含SEQ ID NO:23，SEQ ID NO:25，SEQ ID NO:27，SEQ IDNO:29，SEQ ID NO:31，SEQ ID NO:33，SEQ ID NO:35，SEQ ID NO:37，SEQ ID NO:39，和/或SEQ ID NO:41的成熟多肽编码序列的一部分，以供在细胞中抑制所述多肽的表达。尽管本发明并不限于任何具体作用机制，但所述dsRNA可进入细胞并导致类似或相同序列的单链RNA(ssRNA)，包括内源mRNA的降解。当细胞暴露于dsRNA时，来自同源基因的mRNA通过称为RNA干扰(RNAi)的过程受选择性降解。
所述dsRNA可用于基因沉默以使用本发明的dsRNAi选择性降解RNA。该工艺可在体外、离体或体内实践。在一个方面，所述dsRNA分子可用于在细胞、器官或动物中生成功能丧失的突变。用于制备和使用dsRNA分子以选择性降解RNA的方法是本领域中公知的，参见，例如美国专利号6,489,127；6,506,559；6,511,824；和6,515,109。
在一个方面，所述木霉属纤维二糖水解酶I或其同源物选自下组：(i)纤维二糖水解酶I，其包含或组成为SEQ ID NO:24的成熟多肽；(ii)纤维二糖水解酶I，其包含或组成为氨基酸序列，所述氨基酸序列与SEQ ID NO:24的成熟多肽具有至少70％，例如至少75％，至少80％，至少81％，至少82％，至少83％，至少84％，至少85％，至少86％，至少87％，至少88％，至少89％，至少90％，至少91％，至少92％，至少93％，至少94％，至少95％，至少96％，至少97％，至少98％，或至少99％序列同一性；(iii)纤维二糖水解酶I，其由多核苷酸编码，所述多核苷酸包含或组成为核苷酸序列，所述核苷酸序列与SEQ ID NO:23的成熟多肽编码序列具有至少70％，例如至少75％，至少80％，至少81％，至少82％，至少83％，至少84％，至少85％，至少86％，至少87％，至少88％，至少89％，至少90％，至少91％，至少92％，至少93％，至少94％，至少95％，至少96％，至少97％，至少98％，或至少99％序列同一性；和(iv)纤维二糖水解酶I，其由多核苷酸编码，所述多核苷酸在至少高严格条件，例如非常高严格条件下，与SEQ ID NO:23的成熟多肽编码序列或其全长互补链杂交。
在另一个方面，所述木霉属纤维二糖水解酶II或其同源物选自下组：(i)纤维二糖水解酶II，其包含或组成为SEQ ID NO:26的成熟多肽；(ii)纤维二糖水解酶II，其包含或组成为氨基酸序列，所述氨基酸序列与SEQ ID NO:26的成熟多肽具有至少70％，例如至少75％，至少80％，至少81％，至少82％，至少83％，至少84％，至少85％，至少86％，至少87％，至少88％，至少89％，至少90％，至少91％，至少92％，至少93％，至少94％，至少95％，至少96％，至少97％，至少98％，或至少99％序列同一性；(iii)纤维二糖水解酶II，其由多核苷酸编码，所述多核苷酸包含或组成为核苷酸序列，所述核苷酸序列与SEQ ID NO:25的成熟多肽编码序列具有至少70％，例如至少75％，至少80％，至少81％，至少82％，至少83％，至少84％，至少85％，至少86％，至少87％，至少88％，至少89％，至少90％，至少91％，至少92％，至少93％，至少94％，至少95％，至少96％，至少97％，至少98％，或至少99％序列同一性；和(iv)纤维二糖水解酶II，其由多核苷酸编码，所述多核苷酸在至少高严格条件，例如非常高严格条件下，与SEQ ID NO:25的成熟多肽编码序列或其全长互补链杂交。
在另一个方面，所述木霉属β-葡糖苷酶或其同源物选自下组：(i)β-葡糖苷酶，其包含或组成为SEQ ID NO:28的成熟多肽；(ii)β-葡糖苷酶，其包含或组成为氨基酸序列，所述氨基酸序列与SEQ ID NO:28的成熟多肽具有至少70％，例如至少75％，至少80％，至少81％，至少82％，至少83％，至少84％，至少85％，至少86％，至少87％，至少88％，至少89％，至少90％，至少91％，至少92％，至少93％，至少94％，至少95％，至少96％，至少97％，至少98％，或至少99％序列同一性；(iii)β-葡糖苷酶，其由多核苷酸编码，所述多核苷酸包含或组成为核苷酸序列，所述核苷酸序列与SEQ ID NO:27的成熟多肽编码序列具有至少70％，例如至少75％，至少80％，至少81％，至少82％，至少83％，至少84％，至少85％，至少86％，至少87％，至少88％，至少89％，至少90％，至少91％，至少92％，至少93％，至少94％，至少95％，至少96％，至少97％，至少98％，或至少99％序列同一性；和(iv)β-葡糖苷酶，其由多核苷酸编码，所述多核苷酸在至少高严格条件，例如非常高严格条件下，与SEQ ID NO:27的成熟多肽编码序列或其全长互补链杂交。
在另一个方面，所述木霉属内切葡聚糖酶I或其同源物选自下组：(i)内切葡聚糖酶I，其包含或组成为SEQ ID NO:30的成熟多肽；(ii)内切葡聚糖酶I，其包含或组成为氨基酸序列，所述氨基酸序列与SEQ ID NO:30的成熟多肽具有至少70％，例如至少75％，至少80％，至少81％，至少82％，至少83％，至少84％，至少85％，至少86％，至少87％，至少88％，至少89％，至少90％，至少91％，至少92％，至少93％，至少94％，至少95％，至少96％，至少97％，至少98％，或至少99％序列同一性；(iii)内切葡聚糖酶I，其由多核苷酸编码，所述多核苷酸包含或组成为核苷酸序列，所述核苷酸序列与SEQ ID NO:29的成熟多肽编码序列具有至少70％，例如至少75％，至少80％，至少81％，至少82％，至少83％，至少84％，至少85％，至少86％，至少87％，至少88％，至少89％，至少90％，至少91％，至少92％，至少93％，至少94％，至少95％，至少96％，至少97％，至少98％，或至少99％序列同一性；和(iv)内切葡聚糖酶I，其由多核苷酸编码，所述多核苷酸在至少高严格条件，例如非常高严格条件下，与SEQ ID NO:29的成熟多肽编码序列或其全长互补链杂交。
在另一个方面，所述木霉属内切葡聚糖酶II或其同源物选自下组：(i)内切葡聚糖酶II，其包含或组成为SEQ ID NO:32的成熟多肽；(ii)内切葡聚糖酶II，其包含或组成为氨基酸序列，所述氨基酸序列与SEQ ID NO:32的成熟多肽具有至少70％，例如至少75％，至少80％，至少81％，至少82％，至少83％，至少84％，至少85％，至少86％，至少87％，至少88％，至少89％，至少90％，至少91％，至少92％，至少93％，至少94％，至少95％，至少96％，至少97％，至少98％，或至少99％序列同一性；(iii)内切葡聚糖酶II，其由多核苷酸编码，所述多核苷酸包含或组成为核苷酸序列，所述核苷酸序列与SEQ ID NO:31的成熟多肽编码序列具有至少70％，例如至少75％，至少80％，至少81％，至少82％，至少83％，至少84％，至少85％，至少86％，至少87％，至少88％，至少89％，至少90％，至少91％，至少92％，至少93％，至少94％，至少95％，至少96％，至少97％，至少98％，或至少99％序列同一性；和(iv)内切葡聚糖酶II，其由多核苷酸编码，所述多核苷酸在至少高严格条件，例如非常高严格条件下，与SEQ ID NO:31的成熟多肽编码序列或其全长互补链杂交。
在另一个方面，所述木霉属木聚糖酶或其同源物选自下组：(i)木聚糖酶，其包含或组成为SEQ ID NO:34的成熟多肽；(ii)木聚糖酶，其包含或组成为氨基酸序列，所述氨基酸序列与SEQ ID NO:34的成熟多肽具有至少70％，例如至少75％，至少80％，至少81％，至少82％，至少83％，至少84％，至少85％，至少86％，至少87％，至少88％，至少89％，至少90％，至少91％，至少92％，至少93％，至少94％，至少95％，至少96％，至少97％，至少98％，或至少99％序列同一性；(iii)木聚糖酶，其由多核苷酸编码，所述多核苷酸包含或组成为核苷酸序列，所述核苷酸序列与SEQ ID NO:33的成熟多肽编码序列具有至少70％，例如至少75％，至少80％，至少81％，至少82％，至少83％，至少84％，至少85％，至少86％，至少87％，至少88％，至少89％，至少90％，至少91％，至少92％，至少93％，至少94％，至少95％，至少96％，至少97％，至少98％，或至少99％序列同一性；和(iv)木聚糖酶，其由多核苷酸编码，所述多核苷酸在至少高严格条件，例如非常高严格条件下，与SEQ ID NO:33的成熟多肽编码序列或其全长互补链杂交。
在另一个方面，所述木霉属木聚糖酶或其同源物选自下组：(i)木聚糖酶，其包含或组成为SEQ ID NO:36的成熟多肽；(ii)木聚糖酶，其包含或组成为氨基酸序列，所述氨基酸序列与SEQ ID NO:36的成熟多肽具有至少70％，例如至少75％，至少80％，至少81％，至少82％，至少83％，至少84％，至少85％，至少86％，至少87％，至少88％，至少89％，至少90％，至少91％，至少92％，至少93％，至少94％，至少95％，至少96％，至少97％，至少98％，或至少99％序列同一性；(iii)木聚糖酶，其由多核苷酸编码，所述多核苷酸包含或组成为核苷酸序列，所述核苷酸序列与SEQ ID NO:35的成熟多肽编码序列具有至少70％，例如至少75％，至少80％，至少81％，至少82％，至少83％，至少84％，至少85％，至少86％，至少87％，至少88％，至少89％，至少90％，至少91％，至少92％，至少93％，至少94％，至少95％，至少96％，至少97％，至少98％，或至少99％序列同一性；和(iv)木聚糖酶，其由多核苷酸编码，所述多核苷酸在至少高严格条件，例如非常高严格条件下，与SEQ ID NO:35的成熟多肽编码序列或其全长互补链杂交。
在另一个方面，所述木霉属木聚糖酶或其同源物选自下组：(i)木聚糖酶，其包含或组成为SEQ ID NO:38的成熟多肽；(ii)木聚糖酶，其包含或组成为氨基酸序列，所述氨基酸序列与SEQ ID NO:38的成熟多肽具有至少70％，例如至少75％，至少80％，至少81％，至少82％，至少83％，至少84％，至少85％，至少86％，至少87％，至少88％，至少89％，至少90％，至少91％，至少92％，至少93％，至少94％，至少95％，至少96％，至少97％，至少98％，或至少99％序列同一性；(iii)木聚糖酶，其由多核苷酸编码，所述多核苷酸包含或组成为核苷酸序列，所述核苷酸序列与SEQ ID NO:37的成熟多肽编码序列具有至少70％，例如至少75％，至少80％，至少81％，至少82％，至少83％，至少84％，至少85％，至少86％，至少87％，至少88％，至少89％，至少90％，至少91％，至少92％，至少93％，至少94％，至少95％，至少96％，至少97％，至少98％，或至少99％序列同一性；和(iv)木聚糖酶，其由多核苷酸编码，所述多核苷酸在至少高严格条件，例如非常高严格条件下，与SEQ ID NO:37的成熟多肽编码序列或其全长互补链杂交。
在另一个方面，所述木霉属β-木糖苷酶或其同源物选自下组：(i)β-木糖苷酶，其包含或组成为SEQ ID NO:40的成熟多肽；(ii)β-木糖苷酶，其包含或组成为氨基酸序列，所述氨基酸序列与SEQ ID NO:40的成熟多肽具有至少70％，例如至少75％，至少80％，至少81％，至少82％，至少83％，至少84％，至少85％，至少86％，至少87％，至少88％，至少89％，至少90％，至少91％，至少92％，至少93％，至少94％，至少95％，至少96％，至少97％，至少98％，或至少99％序列同一性；(iii)β-木糖苷酶，其由多核苷酸编码，所述多核苷酸包含或组成为核苷酸序列，所述核苷酸序列与SEQ ID NO:39的成熟多肽编码序列具有至少70％，例如至少75％，至少80％，至少81％，至少82％，至少83％，至少84％，至少85％，至少86％，至少87％，至少88％，至少89％，至少90％，至少91％，至少92％，至少93％，至少94％，至少95％，至少96％，至少97％，至少98％，或至少99％序列同一性；和(iv)β-木糖苷酶，其由多核苷酸编码，所述多核苷酸在至少高严格条件，例如非常高严格条件下，与SEQ ID NO:39的成熟多肽编码序列或其全长互补链杂交。
在另一个方面，所述木霉属膨胀素或其同源物选自下组：(i)膨胀素，其包含或组成为SEQ ID NO:42的成熟多肽；(ii)膨胀素，其包含或组成为氨基酸序列，所述氨基酸序列与SEQ ID NO:42的成熟多肽具有至少70％，例如至少75％，至少80％，至少81％，至少82％，至少83％，至少84％，至少85％，至少86％，至少87％，至少88％，至少89％，至少90％，至少91％，至少92％，至少93％，至少94％，至少95％，至少96％，至少97％，至少98％，或至少99％序列同一性；(iii)膨胀素，其由多核苷酸编码，所述多核苷酸包含或组成为核苷酸序列，所述核苷酸序列与SEQ ID NO:41的成熟多肽编码序列具有至少70％，例如至少75％，至少80％，至少81％，至少82％，至少83％，至少84％，至少85％，至少86％，至少87％，至少88％，至少89％，至少90％，至少91％，至少92％，至少93％，至少94％，至少95％，至少96％，至少97％，至少98％，或至少99％序列同一性；和(iv)膨胀素，其由多核苷酸编码，所述多核苷酸在至少高严格条件，例如非常高严格条件下，与SEQ ID NO:41的成熟多肽编码序列或其全长互补链杂交。
在一个方面，木霉属纤维二糖水解酶I基因失活。在另一个方面，木霉属纤维二糖水解酶II基因失活。在另一个方面，木霉属内切葡聚糖酶I基因失活。在另一个方面，木霉属内切葡聚糖酶II基因失活。在另一个方面，木霉属β-葡糖苷酶基因失活。在另一个方面，木霉属木聚糖酶基因失活。在另一个方面，木霉属β-木糖苷酶基因失活。在另一个方面，木霉属膨胀素基因失活。
在另一个方面，木霉属纤维二糖水解酶I基因和木霉属纤维二糖水解酶II基因失活。
在另一个方面，两个或更多个(例如几个)选自下组的基因失活：纤维二糖水解酶I，纤维二糖水解酶II，内切葡聚糖酶I，内切葡聚糖酶II，β-葡糖苷酶，木聚糖酶I，木聚糖酶II，木聚糖酶III，β-木糖苷酶，和膨胀素基因。在另一个方面，三个或更多个(例如几个)选自下组的基因失活：纤维二糖水解酶I，纤维二糖水解酶II，内切葡聚糖酶I，内切葡聚糖酶II，β-葡糖苷酶，木聚糖酶I，木聚糖酶II，木聚糖酶III，β-木糖苷酶，和膨胀素基因。在另一个方面，四个或更多个(例如几个)选自下组的基因失活：纤维二糖水解酶I，纤维二糖水解酶II，内切葡聚糖酶I，内切葡聚糖酶II，β-葡糖苷酶，木聚糖酶I，木聚糖酶II，木聚糖酶III，β-木糖苷酶，和膨胀素基因。在另一个方面，五个或更多个(例如几个)选自下组的基因失活：纤维二糖水解酶I，纤维二糖水解酶II，内切葡聚糖酶I，内切葡聚糖酶II，β-葡糖苷酶，木聚糖酶I，木聚糖酶II，木聚糖酶III，β-木糖苷酶，和膨胀素基因。在另一个方面，六个或更多个(例如几个)选自下组的基因失活：纤维二糖水解酶I，纤维二糖水解酶II，内切葡聚糖酶I，内切葡聚糖酶II，β-葡糖苷酶，木聚糖酶I，木聚糖酶II，木聚糖酶III，β-木糖苷酶，和膨胀素基因。在另一个方面，七个或更多个(例如几个)选自下组的基因失活：纤维二糖水解酶I，纤维二糖水解酶II，内切葡聚糖酶I，内切葡聚糖酶II，β-葡糖苷酶，木聚糖酶I，木聚糖酶II，木聚糖酶III，β-木糖苷酶，和膨胀素基因。在另一个方面，八个或更多个(例如几个)选自下组的基因失活：纤维二糖水解酶I，纤维二糖水解酶II，内切葡聚糖酶I，内切葡聚糖酶II，β-葡糖苷酶，木聚糖酶I，木聚糖酶II，木聚糖酶III，β-木糖苷酶，和膨胀素基因。在另一个方面，九个或更多个(例如几个)选自下组的基因失活：纤维二糖水解酶I，纤维二糖水解酶II，内切葡聚糖酶I，内切葡聚糖酶II，β-葡糖苷酶，木聚糖酶I，木聚糖酶II，木聚糖酶III，β-木糖苷酶，和膨胀素基因。
在另一个方面，所述纤维二糖水解酶I，纤维二糖水解酶II，内切葡聚糖酶I，内切葡聚糖酶II，β-葡糖苷酶，和β-木糖苷酶基因失活。在另一个方面，所述纤维二糖水解酶I，纤维二糖水解酶II，内切葡聚糖酶I，内切葡聚糖酶II，β-葡糖苷酶，木聚糖酶I，木聚糖酶II，木聚糖酶III，β-木糖苷酶，和膨胀素基因失活。
在另一个方面，一个或多个(例如几个)蛋白酶基因失活。在另一个方面，所述一个或多个(例如几个)蛋白酶基因是如WO2011/075677(其通过全文提述并入本文)中所述的枯草杆菌蛋白酶样丝氨酸蛋白酶，天冬氨酸蛋白酶，和胰蛋白酶样丝氨酸蛋白酶基因。
在上述每个方面中，所述木霉属酶是哈茨木霉(Trichoderma harzianum)、康宁木霉(Trichoderma koningii)、长枝木霉(Trichoderma longibrachiatum)、里氏木霉(Trichoderma reesei)或绿色木霉(Trichoderma viride)酶。在另一个方面，所述木霉属酶是哈茨木霉酶。在另一个方面，所述木霉属酶是康宁木霉酶。在另一个方面，所述木霉属酶是长枝木霉酶。在另一个方面，所述木霉属酶是里氏木霉酶。在另一个方面，所述木霉属酶是绿色木霉酶。
核酸构建体
包含编码烟曲霉酶或蛋白的核酸构建体可通过将一个或多个(例如几个)调控序列可操作地连接于所述多核苷酸以在与所述调控序列相容的条件下指导所述编码序列在木霉属宿主细胞中表达。取决于于表达载体，在将多核苷酸***载体之前对其进行操作可能是理想的或必需的。使用重组DNA方法修饰多核苷酸的技术是本领域熟知的。
调控序列可为启动子，其由用于表达编码酶或蛋白的多核苷酸的木霉属宿主细胞所识别。启动子含有介导多肽的表达的转录调控序列。启动子可以是在宿主细胞中显示转录活性的任何多核苷酸，包括突变的、截短的和杂合的启动子，并且可以从编码与宿主细胞同源或异源的胞外或胞内多肽的基因获得。
用于指导核酸构建体在木霉属宿主细胞中转录的合适启动子的实例是从下列酶的基因获得的启动子：构巢曲霉(Aspergillus nidulans)乙酰胺酶、黑曲霉(Aspergillus niger)中性α-淀粉酶、黑曲霉酸稳定性α-淀粉酶、黑曲霉或泡盛曲霉(Aspergillus awamori)葡糖淀粉酶(glaA)、米曲霉(Aspergillus oryzae)TAKA淀粉酶、米曲霉碱性蛋白酶、米曲霉丙糖磷酸异构酶、尖镰孢(Fusarium oxysporum)胰蛋白酶样蛋白酶(WO96/00787)、镶片镰孢(Fusarium venenatum)淀粉葡糖苷酶(WO00/56900)、镶片镰孢Daria(WO00/56900)、镶片镰孢Quinn(WO00/56900)、曼赫根毛霉(Rhizomucor miehei)脂肪酶、曼赫根毛霉天冬氨酸蛋白酶、里氏木霉(Trichoderma reesei)β-葡糖苷酶、里氏木霉纤维二糖水解酶I、里氏木霉纤维二糖水解酶II、里氏木霉内切葡聚糖酶I、里氏木霉内切葡聚糖酶II、里氏木霉内切葡聚糖酶III、里氏木霉内切葡聚糖酶V、里氏木霉木聚糖酶I、里氏木霉木聚糖酶II、里氏木霉木聚糖酶III、里氏木霉β-木糖苷酶、里氏木霉翻译延伸因子，以及NA2-tpi启动子(一种修饰的启动子，其来自在曲霉属中性α-淀粉酶基因，其中未翻译的前导序列由曲霉属丙糖磷酸异构酶的基因的未翻译的前导序列所替代；非限制性实例包括修饰的启动子，其来自黑曲霉中性α-淀粉酶的基因，其中未翻译的前导序列由构巢曲霉或米曲霉丙糖磷酸异构酶的基因的未翻译的前导序列所替代)；和它们的突变的、截短的和杂合的启动子。其它启动子描述于美国专利号6,011,147，其通过全文提述并入本文。
调控序列也可以是转录终止子，其由木霉属宿主细胞识别以终止转录。所述终止子与编码所述多肽的多核苷酸的3’末端可操作地连接。在本发明中可使用在宿主细胞中有功能的任何终止子。
对于木霉属宿主细胞优选的终止子从如下酶的基因获得：构巢曲霉邻氨基苯甲酸合酶、黑曲霉葡糖淀粉酶、黑曲霉α-葡糖苷酶、米曲霉TAKA淀粉酶、尖镰孢胰蛋白酶样蛋白酶、里氏木霉β-葡糖苷酶、里氏木霉纤维二糖水解酶I、里氏木霉纤维二糖水解酶II、里氏木霉内切葡聚糖酶I、里氏木霉内切葡聚糖酶II、里氏木霉内切葡聚糖酶III、里氏木霉内切葡聚糖酶V、里氏木霉木聚糖酶I、里氏木霉木聚糖酶II、里氏木霉木聚糖酶III、里氏木霉β-木糖苷酶和里氏木霉翻译延伸因子。
调控序列还可以是合适的前导序列，其为对于木霉属宿主细胞的翻译重要的mRNA非翻译区。前导序列可操作地连接于编码多肽的多核苷酸的5’-末端。可使用在宿主细胞中有功能的任何前导序列。
对于木霉属宿主细胞优选的前导序列从如下酶的基因获得：米曲霉TAKA淀粉酶和构巢曲霉丙糖磷酸异构酶。
调控序列也可以是聚腺苷酸化序列，其是与多核苷酸的3’末端可操作地连接的序列，并且在转录时，木霉属宿主细胞将其识别为将聚腺苷残基添加至转录的mRNA的信号。可使用在宿主细胞中有功能的任何聚腺苷酸化序列。
对于木霉属宿主细胞优选的聚腺苷酸化序列从如下酶的基因获得：构巢曲霉邻氨基苯甲酸合酶、黑曲霉葡糖淀粉酶、黑曲霉α-葡糖苷酶、米曲霉TAKA淀粉酶、尖镰孢胰蛋白酶样蛋白酶、里氏木霉纤维二糖水解酶I、里氏木霉纤维二糖水解酶II和里氏木霉内切葡聚糖酶V。
调控序列还可以是信号肽编码区，其编码与多肽的N端相连的信号肽，并且指导所述多肽进入细胞分泌途径。多核苷酸的编码序列5’端可固有地包含信号肽编码序列，其与编码所述多肽的编码序列的区段一起天然地连接在翻译阅读框中。或者，编码序列5’端可含有对于所述编码序列外源的信号肽编码序列。当编码序列不天然地含有信号肽编码序列时，外源信号肽编码序列可能是必需的。或者，可以直接用外源信号肽编码序列取代天然信号肽编码序列以增强多肽的分泌。然而，可使用指导表达的多肽进入宿主细胞的分泌途径的任何信号肽编码序列。
对于里氏木霉宿主细胞有效的信号肽编码序列是从如下酶的基因获得的信号肽编码序列：黑曲霉中性淀粉酶、黑曲霉葡糖淀粉酶、米曲霉TAKA淀粉酶、特异腐质霉纤维素酶、特异腐质霉内切葡聚糖酶V、疏棉状腐质霉脂肪酶、曼赫根毛霉天冬氨酸蛋白酶、里氏木霉纤维二糖水解酶I、里氏木霉纤维二糖水解酶II、里氏木霉内切葡聚糖酶I、里氏木霉内切葡聚糖酶II、里氏木霉内切葡聚糖酶III和里氏木霉内切葡聚糖酶V。
调控序列还可以是前肽编码序列，其编码位于多肽的N端的前肽。所得多肽称为酶原(proenzyme)或前多肽(propolypeptide)(或在某些情况下称为酶原(zymogen))。前多肽通常是无活性的，并且能够通过前肽的催化或自催化切割从前多肽转化为活性多肽。可以从嗜热毁丝霉漆酶(WO95/33836)和曼赫根毛霉天冬氨酸蛋白酶的基因获得前肽编码序列。
当信号肽和前肽序列二者均存在时，将前肽序列置于紧接着(next to)多肽N端，并且将信号肽序列置于紧接着前肽序列的N端。
同样理想的是添加调节序列，其相对于木霉属宿主细胞的生长来调节多肽的表达。调节序列的实例是引起基因表达响应化学或物理刺激物，包括调节化合物的存在而开启或关闭的那些***。调节序列包括黑曲霉葡糖淀粉酶启动子、米曲霉TAKAα-淀粉酶启动子和米曲霉葡糖淀粉酶启动子、里氏木霉纤维二糖水解酶I启动子和里氏木霉纤维二糖水解酶II启动子。调节序列的其它实例是那些允许基因扩增的序列。在真核***中，这些调节序列包括在氨甲蝶呤(methotrexate)存在下扩增的二氢叶酸还原酶基因，和以重金属(with heavy metal)扩增的金属硫蛋白基因。在这些情况下，编码多肽的多核苷酸将与调节序列可操作地连接。
表达载体
重组表达载体可构建为包含编码烟曲霉酶或蛋白的多核苷酸，启动子，终止子，和转录和翻译终止信号。多种核苷酸和调控序列可以结合在一起以产生重组表达载体，所述表达载体可以包括一个或多个(例如几个)方便的限制位点以允许在这些位点***或取代编码所述多肽多核苷酸。或者，可以通过在适当的用于表达的载体中***包含所述多核苷酸的核酸构建体或多核苷酸来表达所述多核苷酸。在制备表达载体的过程中，将编码序列置于载体中，从而将该编码序列与适当的调控序列可操作地连接以供表达。
重组表达载体可以是任何能够方便地进行重组DNA步骤，并且能够产生多核苷酸的表达的载体(例如，质粒或病毒)。载体的选择将通常依赖于载体与将引入该载体的宿主细胞的相容性。载体可以是线状或闭合环状质粒。
载体可以是自主复制载体，即，作为染色体外实体(entity)存在的载体，其复制独立于染色体复制，例如，质粒、染色体外元件、微型染色体(minichromosome)或人工染色体。载体可以含有任何用于确保自我复制的手段(means)。或者，载体可以是一种当被引入宿主细胞中时，整合到基因组中并且与整合了该载体的染色体一起复制的载体。此外，可以使用单独的载体或质粒或两个或更多个载体或质粒，其共同含有待引入宿主细胞基因组的完整DNA(total DNA)，或可以使用转座子(transposon)。
所述载体优选地含有一个或多个(例如几个)选择性标志物，以便于容易地选择经转化、转染、转导等的细胞。选择性标志物是这样的基因，其产物提供杀生物剂或病毒抗性、对重金属的抗性、对营养缺陷型的原养性(prototrophy toauxotrophs)等。
用于木霉属宿主细胞的选择性标志物的实例包括但不限于adeA(磷酸核糖氨基咪唑琥珀羧酰胺合酶，phosphoribosylaminoimidazole-succinocarboxamidesynthase)、adeB(磷酸核糖氨基咪唑合酶，phosphoribosyl-aminoimidazolesynthase)、amdS(乙酰胺酶)、argB(鸟氨酸氨甲酰基转移酶)、bar(草铵膦(phosphinothricin)乙酰转移酶)、hph(潮霉素磷酸转移酶)、niaD(硝酸还原酶)(nitrate reductase)、pyrG(乳清酸核苷-5’-磷酸脱羧酶)(orotidine-5’-phosphatedecarboxylase)、sC(硫酸腺苷酰转移酶)和trpC(邻氨基苯甲酸合酶(anthranilatesynthase))以及它们的等同物。优选用在曲霉属细胞中的是构巢曲霉或米曲霉amdS和pyrG基因和吸水链霉菌(Streptomyces hygroscopicus)bar基因。优选用于木霉属细胞的是adeA、adeB、amdS、hph和pyrG基因。细菌选择性标志物的实例是赋予抗生素抗性的标志物，所述抗生素抗性例如氨苄青霉素、氯霉素、卡那霉素、新霉素、壮观霉素或四环素抗性。
所述选择性标志物可为WO2010/039889A2(其通过全文提述并入本文)中所述的双重选择性标志物***。在一个方面，所述选择性标志物是hph-tk双重选择性标志物***。
所述载体优选含有允许载体整合入宿主细胞基因组或载体在细胞中独立于基因组的自主复制的元件。
为了整合入宿主细胞基因组，载体可依赖编码多肽的多核苷酸的序列或用于通过同源或非同源重组整合入基因组的任何其它载体元件。或者，载体可以含有用于指导通过同源重组整合入宿主细胞基因组染色体中的精确位置的额外的多核苷酸。为了增加在精确位置整合的可能性，整合元件应含有足够数量的与相应的目标序列具有高度序列同一性的核酸，如100至10,000碱基对，400至10,000碱基对，和800至10,000碱基对，以提高同源重组的概率。整合元件可以是任何与宿主细胞基因组中的目标序列同源的序列。此外，整合元件可以是非编码或编码的多核苷酸。另一方面，可以将载体通过非同源重组整合到宿主细胞的基因组中。
为了自主复制，载体可以还包含复制起点，其使载体能够在所述的宿主细胞中自主地复制。复制起点可以是在细胞中发挥功能的介导自主复制的任何质粒复制子(replicator)。术语“复制起点”或“质粒复制子”意指能够使质粒或载体体内复制的多核苷酸。
在木霉属宿主细胞中有用的复制起点的实例是AMA1和ANS1(Gems等,1991,Gene98:61-67；Cullen等,1987,Nucleic Acids Res.15:9163-9175；WO00/24883)。分离AMA1基因和构建包含该基因的质粒或载体能够根据公开于WO00/24883中的方法完成。
可以将多于一个拷贝的多核苷酸***木霉属宿主细胞以增加多肽的产生。多核苷酸拷贝数的增加可通过如下方法获得：将至少一个额外拷贝的序列整合入宿主细胞基因组，或将可扩增的选择性标志物基因包括于多核苷酸，其中可通过在合适的选择剂(selectable agent)存在下培养细胞来选择含有选择性标志物基因的扩增拷贝，且由此含有多核苷酸的额外拷贝的细胞。
用于连接上述元件以构建本发明的重组表达载体的方法是本领域技术人员熟知的(参见，例如，Sambrook等,1989,见上文)。
产生方法
本发明亦涉及产生包含烟曲霉纤维素酶和/或半纤维素酶的酶组合物的方法，其包括：(a)在有助于产生所述酶组合物的条件下培养本发明的木霉属重组宿主细胞；和(b)回收所述酶组合物。
使用本领域已知的方法在适合于产生所述酶组合物的营养培养基中培养木霉属宿主细胞。例如，可以通过在合适培养基中和允许表达和/或分离所述酶的条件下进行的摇瓶培养，或实验室或工业发酵罐中的小规模或大规模发酵(包括连续、分批、补料分批或固态发酵)来培养细胞。使用本领域已知的方法在合适的营养培养基中进行培养，所述营养培养基包含碳源和氮源和无机盐。合适的培养基能够从商业供应商获得或可以根据公开的组成制备(例如，在美国典型培养物保藏中心的目录中)。
可以使用本领域已知的对于酶为特异性的方法来检测所述烟曲霉纤维素酶和/或半纤维素酶。这些检测方法包括但不限于特异性抗体的使用、酶产物的形成或酶底物的消失。例如，酶测定法(enzyme assay)可用于确定活性。
所述烟曲霉纤维素酶和/或半纤维素酶可以使用本领域已知的方法回收。例如，所述多肽可以通过常规方法从营养培养基中回收，所述常规方法包括但不限于收集、离心、过滤、提取、喷雾干燥、蒸发或沉淀。在一个方面，回收了全部发酵液。
多肽可以使用多种本领域已知的方法纯化以获得基本上纯的多肽，所述方法包括但不限于层析(例如，离子交换、亲和、疏水、层析聚焦和大小排阻)、电泳方法(例如，制备型(preparative)等电聚焦)、差示溶解度(例如，硫酸铵沉淀)、SDS-PAGE或提取(参见，例如，Protein Purification,Janson和Ryden编,VCH Publishers,New York,1989)。
酶组合物
本发明亦涉及酶组合物，其包含本发明的重组木霉属宿主细胞的回收的发酵液。在一个方面，所述酶组合物可具有移出的发酵液的一个或多个成分。在另一个方面，所述酶组合物可不具有移出的发酵液的任何成分。
所述酶组合物包含：(i)烟曲霉纤维二糖水解酶I；(ii)烟曲霉纤维二糖水解酶II；(iii)烟曲霉β-葡糖苷酶；和(iv)具有纤维素分解增强活性的烟曲霉GH61多肽；或其同源物，如本文中所述。在一个方面，所述酶组合物进一步包含一种或多种(例如几种)选自下组的酶：(i)烟曲霉内切葡聚糖酶I；(ii)烟曲霉内切葡聚糖酶II；(iii)烟曲霉木聚糖酶；(iv)烟曲霉β-木糖苷酶；和(v)烟曲霉膨胀素；或(vi)其组合；或其同源物，如本文中所述。在另一个方面，所述酶组合物进一步包含烟曲霉内切葡聚糖酶I。在另一个方面，所述酶组合物进一步包含烟曲霉内切葡聚糖酶II。在另一个方面，所述酶组合物进一步包含烟曲霉木聚糖酶。在另一个方面，所述酶组合物进一步包含烟曲霉β-木糖苷酶。在另一个方面，所述酶组合物进一步包含烟曲霉膨胀素。
在另一个方面，所述酶组合物进一步包含木霉属内切葡聚糖酶I。在另一个方面，所述酶组合物进一步包含里氏木霉内切葡聚糖酶I。在另一个方面，所述酶组合物进一步包含了里氏木霉Cel7B内切葡聚糖酶I(GENBANKTM登录号M15665)。在另一个方面，所述里氏木霉内切葡聚糖酶I对于宿主细胞是天然的。在另一个方面，所述里氏木霉内切葡聚糖酶I是SEQ ID NO:30的成熟多肽。
在另一个方面，所述酶组合物进一步包含木霉属内切葡聚糖酶II。在另一个方面，所述酶组合物进一步包含里氏木霉内切葡聚糖酶II。在另一个方面，所述酶组合物进一步包含了里氏木霉Cel5A内切葡聚糖酶II(GENBANKTM登录号M19373)。在另一个方面，所述里氏木霉内切葡聚糖酶II对于宿主细胞是天然的。在另一个方面，所述里氏木霉内切葡聚糖酶II是SEQ ID NO:32的成熟多肽。
所述酶组合物可进一步包含一种或多种(例如几种)选自下组的酶：纤维素酶，具有纤维素分解增强活性的GH61多肽，半纤维素酶，酯酶，棒曲霉素，漆酶，木质素分解酶，果胶酶，过氧化物酶，蛋白酶，和膨胀素。在另一个方面，所述纤维素酶优选为一种或多种(例如几种)选自下组的酶：内切葡聚糖酶，纤维二糖水解酶，和β-葡糖苷酶。在另一个方面，所述半纤维素酶优选为一种或多种(例如几种)选自下组的酶：乙酰甘露聚糖酯酶、乙酰木聚糖酯酶、***聚糖酶、***呋喃糖苷酶、香豆酸酯酶、阿魏酸酯酶、半乳糖苷酶、葡糖醛酸糖苷酶、葡糖醛酸酯酶、甘露聚糖酶、甘露糖苷酶、木聚糖酶和木糖苷酶。所述酶对于所述木霉属宿主细胞可为天然的或外来的。
术语“发酵液”用于本文中指由细胞发酵产生、不经历或仅经历最低限的回收和/或纯化的制备物。举例而言，当将微生物培养物生长至饱和，在限制碳的条件下温育以允许蛋白合成(例如由宿主细胞表达酶)，并分泌入细胞培养基时，产生发酵液。所述发酵液可含有在发酵终止时得到的发酵材料的未分级或分级的内容物。通常而言，发酵液是未分级的，并包含去除(例如通过离心)微生物细胞(例如丝状真菌细胞)之后存在的用过的培养基以及细胞碎片。在一些实施方案中，所述发酵液含有用过的细胞培养基，胞外酶，和能成活的和/或不能成活的(viable and/or nonviable)微生物细胞。
在一个实施方案中，所述发酵液配制物和细胞组合物包含第一有机酸组分和第二有机酸组分，所述第一有机酸组分包含至少一种1-5碳的有机酸和/或其盐，而所述第二有机酸组分包含至少一种6个或更多个碳的有机酸和/或其盐。在一个具体实施方案中，所述第一有机酸组分是乙酸、甲酸、丙酸、它们的盐，或前述两种或更多种的混合物，而所述第二有机酸组分是苯甲酸、环己烷羧酸、4-甲基戊酸、苯乙酸、它们的盐，或前述两种或更多种的混合物。
在一个方面，所述组合物含有有机酸，并任选地进一步含有已被杀灭的细胞和/或细胞碎片。在一个实施方案中，从已杀灭细胞的全培养液中移出所述已被杀灭的细胞和/或细胞碎片以提供不含这些组分的组合物。
所述发酵液配制物或细胞组合物可进一步包含防腐剂和/或抗微生物(例如抑菌)剂，包括但不限于山梨醇、氯化钠、山梨酸钾和其它本领域中已知者。
所述已杀灭细胞的全培养液或组合物可含有在发酵终止时得到的发酵材料的未分级内容物。通常而言，所述已杀灭细胞的全培养液或组合物含有在将微生物细胞(例如丝状真菌细胞)生长至饱和，并在限制碳的条件下温育以允许蛋白合成之后存在的用过的培养基以及细胞碎片。在一些实施方案中，所述已杀灭细胞的全培养液或组合物含有用过的细胞培养基，胞外酶，和已被杀灭的丝状真菌细胞。在一些实施方案中，在已杀灭细胞的全培养液或组合物中存在的微生物细胞可使用本领域中已知的方法渗透和/或裂解。
如本文中所述的全培养液或细胞组合物通常为液体，但可含有不溶性组分，如已被杀灭的细胞、细胞碎片、培养基组分和/或不溶性酶。在一些实施方案中，可去除不溶性组分以提供澄清的液体组合物。
本发明的全培养液配制物和细胞组合物可通过WO90/15861或WO2010/096673中描述的方法来产生。
用途
本发明还涉及下述使用包含本发明的回收的发酵液的酶组合物的工艺。
本发明还涉及降解或转化纤维素材料的工艺，其包括：用包含本发明的回收的发酵液的酶组合物处理纤维素材料。在一个方面，所述方法进一步包括回收已降解或转化的纤维素材料。所述纤维素材料的降解或转化的可溶性产物可从不溶性纤维素材料使用本领域已知的方法分离，如例如离心、过滤或重力沉降。
本发明还涉及产生发酵产物的工艺，其包括：(a)用包含本发明的回收的发酵液的酶组合物糖化纤维素材料；(b)用一种或多种(例如几种)发酵微生物发酵经糖化的纤维素材料以产生发酵产物；和(c)从发酵回收发酵产物。
本发明还涉及发酵纤维素材料的工艺，其包括：用一种或多种(例如几种)发酵微生物发酵纤维素材料，其中所述纤维素材料是用包含本发明的回收的发酵液的酶组合物糖化的。在一个方面，纤维素材料的发酵产生发酵产物。在另一个方面，所述工艺进一步包括从发酵回收发酵产物。
本发明的工艺可以用于将纤维素材料糖化成可发酵糖，并且将可发酵糖转化成很多有用的发酵产物，例如燃料、饮用乙醇和/或平台化学品(platformchemical)(例如酸、醇、酮、气体等)。从纤维素材料产生期望的发酵产物通常涉及预处理、酶水解(糖化)和发酵。
根据本发明的纤维素材料的处理可使用本领域的常规方法完成。此外，本发明的工艺能使用经配置以依照本发明操作的任何常规生物质加工设备进行。
水解(糖化)和发酵，分别的或同时的，包括但不限于，分离的水解和发酵(SHF)、同时糖化和发酵(SSF)、同时糖化和共发酵(SSCF)、混合的水解和发酵(HHF)、分离的水解和共发酵(SHCF)、混合的水解和共发酵(HHCF)，和直接微生物转化(DMC)，有时也称为联合生物加工(consolidated bioprocessing，CBP)。SHF使用分离的处理步骤以首先将纤维素材料酶水解为可发酵糖，例如，葡萄糖，纤维二糖和戊糖单体，然后将可发酵糖发酵成为乙醇。在SSF中，纤维素材料的酶水解和糖变为乙醇的发酵组合在一个步骤中(Philippidis,G.P.,1996,Cellulosebioconversion technology,于Handbook on Bioethanol:Production and Utilization,Wyman,C.E编,Taylor&Francis,Washington,DC,179-212)。SSCF包括多种糖的共发酵(Sheehan,J.,和Himmel,M.,1999,Enzymes,energy and the environment:Astrategic perspective on the U.S.Department of Energy’s research and developmentactivities for bioethanol,Biotechnol.Prog.15:817-827)。HHF在同时糖化和水解步骤之外，还包括单独的水解步骤，所述各步骤可以在同一个反应器中进行。HHF过程中的步骤可以在不同的温度进行，即，高温酶法糖化，然后在发酵菌株能够耐受的较低温度进行SSF。DMC在一个或多个(例如几个)步骤中组合了所有三个过程(酶产生、水解和发酵)，其中使用相同的生物体产生用于将纤维素转化成可发酵糖并将可发酵糖转化成终产物的酶(Lynd,L.R.,Weimer,P.J.,van Zyl,W.H.,和Pretorius,I.S.,2002,Microbial cellulose utilization:Fundamentals andbiotechnology,Microbiol.Mol.Biol.Reviews66:506-577)。在本文可以理解的是，本领域中已知的任何方法，包括预处理、酶水解(糖化)、发酵，或它们的组合，均可用于实施本发明的工艺。
常规设备可包括补料分批式搅拌反应器、分批式搅拌反应器、具有超滤的连续流搅拌反应器和/或连续活塞流柱式反应器(Fernanda de CastilhosCorazza,Flávio Faria de Moraes,Gisella Maria Zanin和Ivo Neitzel,2003,Optimal control in fed-batch reactor for the cellobiose hydrolysis,ActaScientiarum.Technology25:33-38；Gusakov,A.V.,和Sinitsyn,A.P.,1985,Kinetics of the enzymatic hydrolysis of cellulose:1.A mathematical model for abatch reactor process,Enz.Microb.Technol.7:346-352)、研磨反应器(Ryu,S.K.,和Lee,J.M.,1983,Bioconversion of waste cellulose by using an attritionbioreactor,Biotechnol.Bioeng.25:53-65)，或者具有由电磁场引起的强烈搅拌的反应器(Gusakov,A.V.,Sinitsyn,A.P.,Davydkin,I.Y.,Davydkin,V.Y.,Protas,O.V.,1996,Enhancement of enzymatic cellulose hydrolysis using a novel type ofbioreactor with intensive stirring induced by electromagnetic field,Appl.Biochem.Biotechnol.56:141-153)。其它反应器类型包括：流化床、升流层(upflowblanket)、固定化和用于水解和/或发酵的挤出机型的反应器。
预处理。在本发明的工艺的实施中，可以使用本领域已知的任何预处理过程破坏植物细胞壁的纤维素材料组分(Chandra等,2007,Substrate pretreatment:The key to effective enzymatic hydrolysis of lignocellulosics？Adv.Biochem.Engin./Biotechnol.108:67-93；Galbe和Zacchi,2007,Pretreatment of lignocellulosicmaterials for efficient bioethanol production,Adv.Biochem.Engin./Biotechnol.108:41-65；Hendriks和Zeeman,2009,Pretreatments to enhance the digestibility oflignocellulosic biomass,Bioresource Technol.100:10-18；Mosier等,2005,Featuresof promising technologies for pretreatment of lignocellulosic biomass,BioresourceTechnol.96:673-686；Taherzadeh和Karimi,2008,Pretreatment of lignocellulosicwastes to improve ethanol and biogas production:A review,Int.J.of Mol.Sci.9:1621-1651；Yang和Wyman,2008,Pretreatment:the key to unlocking low-costcellulosic ethanol,Biofuels Bioproducts and Biorefining-Biofpr.2:26-40)。
纤维素材料也可以在预处理之前使用本领域中已知的方法进行粒度减小、筛分、预浸泡、润湿、洗涤和/或调理(conditioning)。
常规的预处理包括但不限于，蒸汽预处理(伴随或不伴随***)、稀酸预处理、热水预处理、碱预处理、石灰预处理、湿氧化、湿***、氨纤维***、有机溶剂预处理和生物预处理。其它预处理包括氨渗滤、超声、电穿孔、微波、超临界CO2、超临界H2O、臭氧、离子性液体和γ辐射预处理。
可以在水解和/或发酵之前预处理纤维素材料。预处理优选在水解前进行。或者，预处理可以与酶水解同时进行以释放可发酵糖，如葡萄糖、木糖和/或纤维二糖。在大多数情况下，预处理步骤本身使一些生物质转化成可发酵糖(甚至在不存在酶的情况下)。
蒸汽预处理。在蒸汽预处理中，加热纤维素材料以破坏植物细胞壁成分，包括木质素、半纤维素和纤维素，使纤维素和其它级分，例如，半纤维素能够被酶触及。将纤维素材料经过或通过反应容器，其中注入蒸汽以增加温度至需要的温度和压力，并且在其中保持期望的反应时间。蒸汽预处理优选在140-250℃，例如160-200℃，或170-190℃进行，其中最优的温度范围依赖于化学催化剂的添加。蒸汽预处理的停留时间优选1-60分钟，例如1-30分钟，1-20分钟，3-12分钟，或4-10分钟，其中最优的停留时间依赖于温度范围和化学催化剂的添加。蒸汽预处理允许相对较高的固形物加载量，以致于纤维素材料在预处理过程中通常仅仅变得潮湿。蒸汽预处理经常与预处理后的物质的***放料(explosive discharge)组合，这称为蒸汽***，即，快速闪变至大气压和物质的湍流，以通过破碎增加可接触的表面积(Duff和Murray,1996,Bioresource Technology855:1-33；Galbe和Zacchi,2002,Appl.Microbiol.Biotechnol.59:618-628；美国专利申请No.20020164730)。在蒸汽预处理过程中，半纤维素乙酰基团被切开，并且得到的酸自催化半纤维素部分水解成为单糖和寡糖。木质素仅以有限的程度被去除。
化学预处理：术语“化学处理”指能促进纤维素、半纤维素和/或木质素分离和/或释放的任何化学处理。此种预处理可将晶体纤维素转化为无定形纤维素。合适的化学预处理工艺的实例包括例如稀酸预处理、石灰预处理、湿氧化、氨纤维/冷冻***(AFEX)、氨渗滤(APR)、离子性液体和有机溶剂预处理。
经常在蒸汽预处理之前加入催化剂如H2SO4或SO2(通常0.3至5％w/w)，其可减少时间，降低温度，增加回收率，并改进酶水解(Ballesteros等,2006,Appl.Biochem.Biotechnol.129-132:496-508；Varga等,2004,Appl.Biochem.Biotechnol.113-116:509-523；Sassner等.,2006,Enzyme Microb.Technol.39:756-762)。在稀酸预处理中，将纤维素材料与稀酸(通常是H2SO4)和水混合以形成浆料，由蒸汽加热至期望的温度，并在一段停留时间后闪变至大气压。可以用很多反应器设计进行稀酸预处理，例如，活塞流反应器、逆流反应器或连续逆流收缩床反应器(Duff和Murray,1996,见上文；Schell等,2004,Bioresource Technol.91:179-188；Lee等,1999,Adv.Biochem.Eng.Biotechnol.65:93-115)。
还可以使用碱性条件下的几种预处理方法。这些碱预处理包括，但不限于，氢氧化钠、石灰、湿氧化、氨渗滤(APR)和氨纤维/冷冻***(AFEX)。
用氧化钙或氢氧化钙，在85-150℃的温度进行石灰预处理，停留时间从1小时到几天(Wyman等,2005,Bioresource Technol.96:1959-1966；Mosier等,2005,Bioresource Technol.96:673-686)。WO2006/110891、WO2006/110899、WO2006/110900和WO2006/110901公开了使用氨的预处理方法。
湿氧化是一种热预处理，通常在180-200℃进行5-15分钟，加入氧化剂如过氧化氢或过压氧(Schmidt和Thomsen,1998,Bioresource Technol.64:139-151；Palonen等,2004,Appl.Biochem.Biotechnol.117:1-17；Varga等,2004,Biotechnol.Bioeng.88:567-574；Martin等,2006,J.Chem.Technol.Biotechnol.81:1669-1677)。预处理优选以1-40％干物质，例如2-30％干物质，或5-20％干物质进行，并且经常通过加入碱如碳酸钠来增加初始pH。
湿氧化预处理方法的修改方法，称为湿***(湿氧化和蒸汽***的组合)，能够处理高达30％的干物质。在湿***中，在预处理过程中，在一定的停留时间后引入氧化剂。然后通过闪变至大气压而结束预处理(WO2006/032282)。
氨纤维***(AFEX)涉及在温和温度如90-150℃和高压如17-20bar，用液氨或氨气将纤维素材料处理5-10分钟，其中干物质含量可以高达60％(Gollapalli等,2002,Appl.Biochem.Biotechnol.98:23-35；Chundawat等,2007,Biotechnol.Bioeng.96:219-231；Alizadeh等,2005,Appl.Biochem.Biotechnol.121:1133-1141；Teymouri等,2005,Bioresource Technol.96:2014-2018)。在AFEX预处理过程中，纤维素和半纤维素保持相对完整。木质素-糖复合物被切开。
有机溶剂预处理通过用含水乙醇(40-60％乙醇)在160-200℃提取30-60分钟而将纤维素材料去木质素化(Pan等,2005,Biotechnol.Bioeng.90:473-481；Pan等,2006,Biotechnol.Bioeng.94:851-861；Kurabi等,2005,Appl.Biochem.Biotechnol.121:219-230)。经常加入硫酸作为催化剂。在有机溶剂预处理中，大部分半纤维素和木质素得以去除。
合适的预处理方法的其他实例如Schell等,2003,Appl.Biochem andBiotechn.Vol.105-108:69-85,和Mosier等,2005,Bioresource Technology96:673-686,和美国专利公开申请2002/0164730所述。
在一个方面，化学预处理优选作为稀酸处理，并且更优选作为连续稀酸处理进行。酸通常是硫酸，但也可以使用其它酸，如乙酸、柠檬酸、硝酸、磷酸、酒石酸、琥珀酸、氯化氢或其混合物。弱酸处理在优选1-5，例如1-4，或1-2.5的pH范围内进行。在一个方面，酸浓度在优选0.01至10wt％酸，例如0.05至5wt％酸或0.1至2wt％酸的范围内。将酸与纤维素材料接触，并在优选140-200℃，例如165-190℃范围内的温度保持1至60分钟的时间。
在另一个方面，预处理发生在含水浆料中。在优选的方面，在预处理过程中纤维素材料以优选10-80wt％，例如20-70wt％或30-60wt％，如约40wt％的量存在。预处理的纤维素材料可以不洗涤或者使用本领域任何已知的方法洗涤，例如，用水洗涤。
机械预处理或物理预处理：术语“机械预处理”或“物理预处理”指任何促进颗粒大小减少的预处理。举例而言，此种预处理可涉及各种类型的研磨(grinding)或磨制(milling)(例如，干磨、湿磨或振动球磨)。
纤维素材料可经物理(机械)和化学预处理。机械或物理预处理可与下述结合：汽蒸/蒸汽***、水热解(hydrothermolysis)、稀酸或弱酸处理、高温、高压处理、辐射(例如微波辐射)，或其组合。在一个方面，高压指优选约100至约400psi，例如约150至约250psi的范围的压力。在另一个方面，高温指约100至约300℃，例如约140至约200℃范围的温度。在一个优选的方面，机械或物理预处理在使用如上所定义的高温和高压的分批过程、使用蒸***水解器***，例如来自Sunds Defibrator AB,Sweden的Sunds Hydrolyzer中进行。所述物理和化学预处理可视需要顺序进行或同时进行。
因此，在一个优选的方面，对纤维素材料进行物理(机械)或化学预处理，或者它们的任何组合，以促进纤维素、半纤维素和/或木质素的分离和/或释放。
生物预处理：术语“生物预处理”指可以促进纤维素、半纤维素和/或木质素从纤维素材料分离和/或释放的任何生物预处理。生物预处理技术可以包括应用溶解木质素的微生物和/或酶(参见，例如，Hsu,T.-A.,1996,Pretreatment of biomass,于Handbook on Bioethanol:Production and Utilization,Wyman,C.E编,Taylor&Francis,Washington,DC,179-212；Ghosh和Singh,1993,Physicochemical andbiological treatments for enzymatic/microbial conversion of lignocellulosic biomass,Adv.Appl.Microbiol.39:295-333；McMillan,J.D.,1994,Pretreating lignocellulosicbiomass:a review,于Enzymatic Conversion of Biomass for Fuels Production,Himmel,M.E.,Baker,J.O.,和Overend,R.P.,编,ACS Symposium Series566,American Chemical Society,Washington,DC,第15章；Gong,C.S.,Cao,N.J.,Du,J.,和Tsao,G.T.,1999,Ethanol production from renewable resources,于Advances inBiochemical Engineering/Biotechnology,Scheper,T.,编,Springer-Verlag BerlinHeidelberg,Germany,65:207-241；Olsson和Hahn-Hagerdal,1996,Fermentation oflignocellulosic hydrolysates for ethanol production,Enz.Microb.Tech.18:312-331；和Vallander和Eriksson,1990,Production of ethanol from lignocellulosic materials:State of the art,Adv.Biochem.Eng./Biotechnol.42:63-95)。
糖化。在水解步骤中，将纤维素材料，例如经预处理的纤维素材料水解以将纤维素和半纤维素分解成可发酵糖，如葡萄糖、纤维二糖、木糖、木酮糖、***糖、甘露糖、半乳糖和/或可溶的寡糖。水解通过包含本发明的回收的发酵液的酶组合物酶促进行。
酶水解优选在易于由本领域技术人员确定的条件下，在合适的含水环境中进行。在一个方面，水解在适于酶的活性，即对于酶最佳的条件下进行。水解可以以补料分批或连续的过程进行，在连续过程中将纤维素材料逐渐补入，例如，补入含酶的水解溶液中。
糖化通常在搅拌釜反应器或发酵罐中，在受控的pH、温度和混合条件下进行。合适的处理时间、温度和pH条件可以由本领域技术人员容易地确定。例如，糖化可以持续长达200小时，但是通常优选进行约12至约120小时，例如约16至约72小时，或约24至约48小时。温度为优选约25℃至约70℃的范围，例如约30℃至约65℃，约40℃至约60℃，或约50℃至约55℃。pH优选约3至约8，例如约3.5至约7，约4至约6，或约5.0至约5.5的范围。干固形物含量优选约5至约50wt％，例如约10至约40wt％，或20至约30wt％。
在本发明的工艺中，所述包含本发明的回收的发酵液的酶组合物可在发酵之前或之中添加，例如在糖化之中或在发酵微生物繁殖过程中或之后添加。
包含本发明的回收的发酵液的酶组合物可为任何适用的形式，例如移除或不移除细胞的粗发酵液，含或不含细胞碎片的细胞裂解液，半纯化或纯化的酶制备物，或作为酶的来源的木霉属宿主细胞。所述酶组合物可为干粉或颗粒，无粉尘的颗粒，液体，稳定化液体或稳定化受保护的酶。液体酶制备物可根据确立的工艺，例如通过添加稳定剂如糖、糖醇或其他多元醇，和/或乳酸或其他有机酸来稳定化。
烟曲霉纤维素酶或半纤维素酶的最适量取决于几个因素，其包括但不限于，组分纤维素分解酶和/或半纤维素分解酶的混合物、纤维素材料、纤维素材料的浓度、纤维素材料的预处理、温度、时间、pH和包括发酵生物体(例如，同时糖化和发酵的酵母)。
在一个方面，纤维素分解酶或半纤维素分解酶对于纤维素材料的有效量是约0.01至约50.0mg，例如约0.01至约40mg，约0.01至约30mg，约0.01至约20mg，约0.01至约10mg，约0.01至约5mg，约0.025至约1.5mg，约0.05至约1.25mg，约0.075至约1.25mg，约0.1至约1.25mg，约0.15至约1.25mg，或约0.25至约1.0mg每g纤维素材料。
在另一个方面，具有纤维素分解增强活性的GH61多肽在WO2008/151043中所述的可溶性活化二价金属阳离子，例如硫酸锰的存在下使用。
在另一个方面，所述具有纤维素分解增强活性的GH61多肽在二氧化合物、二环化合物、杂环化合物、含氮化合物、醌化合物、含硫化合物或从经预处理的纤维素材料(如经预处理的玉米秸秆(PCS))获得的液体的存在下使用。
所述二氧化合物可包括任何含有两个或更多氧原子的合适化合物。在一些方面，所述二氧化合物含有如本文中所述的取代的芳基模块(moiety)。所述二氧化合物可包括一个或多个(例如几个)羟基和/或羟基衍生物，但亦包括缺乏羟基和羟基衍生物的取代的芳基模块。二氧化合物的非限定性实例包括邻苯二酚或儿茶酚；咖啡酸；3,4-二羟基苯甲酸；4-叔丁基-5-甲氧基-1,2-苯二酚；连苯三酚；没食子酸；甲基-3,4,5-三羟基苯甲酸；2,3,4-三羟基二苯甲酮；2,6-二甲氧基苯酚；芥子酸；3,5-二羟基苯甲酸；4-氯-1,2-苯二酚；4-硝基-1,2-苯二酚；鞣酸；没食子酸乙酯；羟乙酸甲酯；二羟基延胡索酸；2-丁炔-1,4-二醇；克酮酸；1,3-丙二醇；酒石酸；2,4-戊二醇；3-乙氧基-1,2-丙二醇；2,4,4’-三羟基二苯甲酮；顺-2-丁烯-1,4-二醇；3,4-二羟基-3-环丁烯-1,2-二酮；二羟基丙酮；乙酰丙烯醛(acrolein acetal)；甲基-4-羟基苯甲酸；4-羟基苯甲酸；和甲基-3,5-二甲氧基-4-羟基苯甲酸；或它们的盐或溶剂合物(solvate)。
所述二环化合物可包括任何如本文中所述的合适的取代稠环***。所述化合物可包含一个或多个(例如几个)另外的环，且除非另行说明，不限于具体的环数。在一个方面，所述二环化合物是类黄酮。在另一个方面，所述二环化合物是任选取代的异类黄酮(isoflavonoid)。在另一个方面，所述二环化合物是任选取代的花色
Figure BDA0000496198300000481
离子(flavylium ion)，如任选取代的花色素或任选取代的花色苷，或其衍生物。二环化合物的非限定性实例包括表儿茶素(epicatechin)；槲皮素(quercetin)；杨梅黄酮(myricetin)；黄杉素(taxifolin)；山奈酚(kaempferol)；桑素(morin)；金合欢素(acacetin)；柚皮素(naringenin)；异鼠李黄素(isorhamnetin)；芹菜苷配基(apigenin)；花青素(cyanidin)；花色素苷(cyanin)；kuromanin；花青素鼠李葡糖苷(keracyanin)；或它们的盐或溶剂合物。
所述杂环化合物可为任何合适的化合物，如本文中所述的任选取代的包含杂原子的芳环或非芳环。在一个方面，所述杂环是包含任选取代的杂环烷基模块或任选取代的杂芳基模块的化合物。在另一个方面，所述任选取代的杂环烷基模块或任选取代的杂芳基模块是任选取代的五元杂环烷基或任选取代的五元杂芳基模块。在另一个方面，任选取代的杂环烷基或任选取代的杂芳基模块是选自如下的任选取代的模块：吡唑基、呋喃基、咪唑基、异噁唑基、噁二唑基、噁唑基、吡咯基、吡啶基、嘧啶基、哒嗪基、噻唑基、***基、噻吩基(thienyl)、二氢噻吩-吡唑基(dihydrothieno-pyrazolyl)、硫茚基、咔唑基、苯并咪唑基、苯并噻吩基(benzothienyl)、苯并呋喃基、吲哚基、喹啉基、苯并***基、苯并噻唑基、苯并噁唑基(benzooxazolyl)、苯并咪唑基、异喹啉基、异吲哚基、吖啶基、苯并异噁唑基(benzoisazolyl)、二甲基乙内酰脲、吡嗪基、四氢呋喃基、吡咯啉基、吡咯烷基、吗啉基、吲哚基、二氮杂环庚三烯基(diazepinyl)、氮杂环庚三烯基(azepinyl)、硫杂环庚三烯基(thiepinyl)、哌啶基和氧杂环庚三烯基(oxepinyl)。在另一个方面所述任选取代的杂环烷基模块或任选取代的杂芳基模块是任选取代的呋喃基。杂环化合物的非限定性实例包括(1,2-二羟乙基)-3,4-二氢呋喃-2(5H)-酮；4-羟基-5-甲基-3-呋喃酮；5-羟基-2(5H)-呋喃酮；[1,2-二羟乙基]呋喃-2,3,4(5H)-三酮；α-羟基-γ-丁内酯；核糖酸γ-内酯；己醛糖酸γ-内酯(aldohexuronicaldohexuronic acidγ-lactone)；葡糖酸δ-内酯；4-羟基香豆素；二氢苯并呋喃；5-(羟甲基)糠醛；糠偶姻(furoin)；2(5H)-呋喃酮；5,6-二氢-2H-吡喃-2-酮；和5,6-二氢-4-羟基-6-甲基-2H-吡喃-2-酮；或它们的盐或溶剂合物。
所述含氮化合物可为任何具有一个或多个(例如几个)氮原子的合适化合物。在一个方面，所述含氮化合物包含胺、亚胺、羟胺或氧化亚氮(nitroxide)模块。含氮化合物的非限定性实例包括丙酮肟；紫尿酸；吡啶-2-醛肟；2-氨基苯酚；1,2-苯二胺；2,2,6,6-四甲基-1-哌啶基氧(piperidinyloxy)；5,6,7,8-四氢生物蝶呤；6,7-二甲基-5,6,7,8-四氢蝶呤；和马来酰胺酸；或它们的盐或溶剂合物。
所述醌化合物可为任何本文中所述的包含醌模块的合适的化合物。醌化合物的非限定性实例包括1,4-苯醌；1,4-萘醌；2-羟基-1,4-萘醌；2,3-二甲氧基-5-甲基-1,4-苯醌或辅酶Q0；2,3,5,6-四甲基-1,4-苯醌或四甲基对苯醌；1,4-二羟基蒽醌；3-羟基-1-甲基-5,6-二氢吲哚二酮或肾上腺色素；4-叔丁基-5-甲氧基-1,2-苯醌；吡咯并喹啉醌(pyrroloquinoline quinone)；或它们的盐或溶剂合物。
所述含硫化合物可为任何包含一个或多个(例如几个)硫原子的合适的化合物。在一个方面，所述含硫化合物包含选自如下的模块：亚硫酰，硫醚，亚磺酰，磺酰，硫酰胺(sulfamide)，磺酰胺(sulfonamide)，磺酸和磺酸酯。含硫化合物的非限定性实例包括乙硫醇；2-丙硫醇；2-丙烯-1-硫醇；2-巯基乙磺酸；苯硫醇；苯-1,2-二硫醇；半胱氨酸；甲硫氨酸；谷胱甘肽；胱氨酸；或它们的盐或溶剂合物。
在一个方面，此种如上所述的化合物对纤维素材料的有效量，以对纤维素糖单元的摩尔比例计为约10-6至约10，例如约10-6至约7.5，约10-6至约5，约10-6至约2.5，约10-6至约1，约10-5至约1，约10-5至约10-1，约10-4至约10-1，约10-3至约10-1，或约10-3至约10-2。在另一个方面，如上所述的化合物的有效量为约0.1μM至约1M，例如约0.5μM至约0.75M，约0.75μM至约0.5M，约1μM至约0.25M，约1μM至约0.1M，约5μM至约50mM，约10μM至约25mM，约50μM至约25mM，约10μM至约10mM，约5μM至约5mM，或约0.1mM至约1mM。
术语“液剂(liquor)”意指在本文中所述的条件下，通过处理浆料中的木素纤维素和/或半纤维素材料，或其单糖例如木糖、***糖、甘露糖等，所产生的溶液相，即水相、有机相或其组合，及其可溶性内容物。用于GH61多肽的纤维素分解增强的液剂可通过，任选在催化剂例如酸的存在下，任选在有机溶剂的存在下，且任选与对所述材料的物理破坏相组合来藉由施加热和/或压力来处理纤维素材料或半纤维素材料(或原料)，然后将溶液与残余固体分离来产生。此类条件决定了在借助纤维素酶制备物水解纤维素材料的过程中通过液剂和GH61多肽的组合可获得的纤维素分解增强的程度。所述液剂可使用本领域中的标准方法如过滤、沉积或离心从经处理的材料分离。
在一个方面，所述液剂对纤维素的有效量为约10-6至约10g每g纤维素，例如约10-6至约7.5g，约10-6至约5，约10-6至约2.5g，约10-6至约1g，约10-5至约1g，约10-5至约10-1g，约10-4至约10-1g，约10-3至约10-1g，或约10-3至约10-2g每g纤维素。
发酵。可通过一种或多种(例如几种)能将糖直接或间接发酵成所需发酵产物的发酵微生物发酵自经水解的纤维素材料获得的可发酵糖。“发酵”或“发酵方法”指任何发酵方法或包含发酵步骤的任何方法。发酵方法还包括用于消费品醇工业(例如，啤酒和葡萄酒)、乳品业(例如，发酵乳产品)、皮革业和烟草业的发酵方法。发酵条件依赖于期望的发酵产物和发酵生物体，并且能由本领域的技术人员容易地确定。
在发酵步骤中，作为预处理和酶水解步骤的结果从纤维素材料释放的糖，通过发酵生物体(如酵母)发酵成为产物，例如，乙醇。如上所述，水解(糖化)和发酵可以是单独或同时的。
在实施本发明的发酵步骤中可以使用任何合适的经水解的纤维素材料。通常根据所需发酵产品(即，要从发酵获得的物质)和使用的方法来选择所述材料，如本领域中所公知的。
术语“发酵培养基”在本文中可理解为指加入发酵微生物之前的培养基，如，由糖化过程产生的培养基，以及同时糖化和发酵方法(SSF)中使用的培养基。
“发酵微生物”指适用于理想的发酵方法产生发酵产物的任何微生物，包括细菌和真菌生物体。发酵生物体可以是己糖和/或戊糖发酵生物体，或它们的组合。己糖和戊糖发酵生物体在本领域均是公知的。合适的发酵微生物能将糖(如葡萄糖、木糖、木酮糖、***糖、麦芽糖、甘露糖、半乳糖和/或寡糖)直接或间接地发酵(即，转化)成所需的发酵产品。可产生乙醇的细菌和真菌发酵生物体的实例如Lin等，2006，Appl.Microbiol.Biotechnol.69:627-642所述。
能发酵己糖的发酵微生物的实例包括细菌和真菌生物体，如酵母。优选的酵母包括假丝酵母属、克鲁维酵母属和酵母属，例如Candida sonorensis、马克斯克鲁维酵母和酿酒酵母的菌株。
以其天然状态能发酵戊糖的发酵生物体的实例包括细菌和真菌生物体，如一些酵母。优选的木糖发酵酵母包括假丝酵母属，优选休哈塔假丝酵母(Candida sheatae)或Candida sonorensis；和毕赤酵母属，优选树干毕赤酵母(Pichia stipitis)的菌株，如树干毕赤酵母CBS5773的菌株。优选的戊糖发酵酵母包括管囊酵母属(Pachysolen)，优选嗜鞣管囊酵母(Pachysolen tannophilus)的菌株。不能够发酵戊糖如木糖和***糖的生物可通过本领域已知方法遗传修饰而发酵戊糖。
能有效地将己糖和戊糖发酵成乙醇的细菌的实例包括，例如，凝结芽孢杆菌、丙酮丁醇梭菌(Clostridium acetobutylicum)、热纤维梭菌(Clostridiumthermocellum)、Clostridium phytofermentans、地芽孢杆菌属菌种、解糖热厌氧杆菌(Thermoanaerobacter saccharolyticum)和运动发酵单胞菌(Philippidis，1996，见上文)。
其它发酵生物包括芽孢杆菌属，如凝结芽孢杆菌；假丝酵母属，如Candidasonorensis、C.methanosorbosa、迪丹斯假丝酵母(Candida diddensii)、***滑假丝酵母(Candida parapsilosis)、C.naedodendra、C.blankii、C.entomophilia、芸薹假丝酵母(C.brassicae)、假热带假丝酵母(Candida pseudotropicalis)、博伊丁假丝酵母(Candida boidinii)、产朊假丝酵母(Candida utilis)和休哈塔假丝酵母(C.scehatae)；梭菌属，如丙酮丁醇梭菌、热纤维梭菌和C.phytofermentans；大肠杆菌，特别是经遗传修饰促进乙醇产率(yield)的大肠杆菌菌株；地芽孢杆菌属菌种；汉逊酵母属，如异常汉逊酵母(Hansenula anomala)；克雷伯氏菌属(Klebsiella)，如产酸克雷伯氏菌(Klebsiella oxytoca)；克鲁维酵母属，如马克斯克鲁维酵母、乳酸克鲁维酵母(K.latic)、K.thermotolerans和脆壁克鲁维酵母；裂殖酵母属，如粟酒裂殖酵母(S.pombe)；热厌氧杆菌属(Thermoanaerobacter)，如解糖热厌氧杆菌，和发酵单胞菌属，如运动发酵单胞菌的菌株。
在一个优选的方面，酵母是酒香酵母属(Bretannomyces)。在一个更优选的方面，酵母是克劳森酒香酵母(Bretannomyces clausenii)。在另一个更优选的方面，酵母是假丝酵母。在另一个更优选的方面，酵母是Candida sonorensis。在另一个更优选的方面，酵母是博伊丁假丝酵母。在另一个更优选的方面，酵母是Candida blankii。在另一个更优选的方面，酵母是芸薹假丝酵母。在另一个更优选的方面，酵母是迪丹斯假丝酵母。在另一个更优选的方面，酵母是Candida entomophiliia。在另一个更优选的方面，酵母是假热带假丝酵母。在另一个更优选的方面，酵母是休哈塔假丝酵母。在另一个更优选的方面，酵母是产朊假丝酵母。在另一个优选的方面，酵母是棒孢酵母属(Clavispora)。在另一个更优选的方面，酵母是葡萄牙棒孢酵母(Clavispora lusitaniae)。在另一个更优选的方面，酵母是仙人掌棒孢酵母(Clavispora opuntiae)。在另一个优选的方面，酵母是克鲁维酵母。在另一个更优选的方面，酵母是脆壁克鲁维酵母。在另一个更优选的方面，酵母是马克斯克鲁维酵母。在另一个更优选的方面，酵母是Kluyveromyces thermotolerans。在另一个优选的方面，酵母是管囊酵母属。在另一个更优选的方面，酵母是嗜鞣管囊酵母。在另一个优选的方面，酵母是毕赤酵母。在另一个更优选的方面，酵母是树干毕赤酵母。在另一个优选的方面，酵母是酵母属菌种。在另一个优选的方面，酵母是酿酒酵母。在另一个更优选的方面，酵母是糖化酵母(Saccharomyces distaticus)。在另一个更优选的方面，酵母是葡萄汁酵母(Saccharomyces uvarum)。
在一个优选的方面，细菌是芽孢杆菌属。在一个更优选的方面，细菌是凝结芽孢杆菌。在另一个更优选的方面，细菌是梭菌属。在另一个更优选的方面，细菌是丙酮丁醇梭菌。在另一个更优选的方面，细菌是Clostridiumphytofermentans。在另一个更优选的方面，细菌是热纤维梭菌。在另一个更优选的方面，细菌是地芽孢杆菌属菌种。在另一个更优选的方面，细菌是热厌氧杆菌属。在另一个更优选的方面，细菌是解糖热厌氧杆菌。在另一个更优选的方面，细菌是发酵单胞菌属。在另一个更优选的方面，细菌是运动发酵单胞菌。
商业上可得到的适合乙醇产生的酵母包括，例如BIOFERMTMAFT和XR(NABC-North American Bioproducts Corporation，GA，USA)，ETHANOLREDTM酵母(Red Star/Lesaffre，USA)、FALITM(Fleischmann’s Yeast，Burns PhilpFood Inc.，USA)，FERMIOLTM(DSM Specialties)，GERT STRANDTM(GertStrand AB，Sweden)以及SUPERSTARTTM和THERMOSACCTM新鲜酵母(Ethanol Technology，WI，USA)。
在一个优选的方面，发酵微生物已经经过遗传修饰，以提供发酵戊糖的能力，如利用木糖、利用***糖和共同利用木糖和***糖的微生物。
已经通过将异源基因克隆入多种发酵微生物构建了能将己糖和戊糖转化成乙醇(共发酵)的生物体(Chen和Ho，1993，Cloning and improving the expression ofPichia stipitis xylose reductase gene in Saccharomyces cerevisiae，Appl.Biochem.Biotechnol.39-40:135-147；Ho等，1998，Genetically engineered Saccharomycesyeast capable of effectively cofermenting glucose and xylose，Appl.Environ.Microbiol.64:1852-1859；Kotter和Ciriacy，1993，Xylose fermentation bySaccharomyces cerevisiae，Appl.Microbiol.Biotechnol.38:776-783；Walfridsson等，1995，Xylose-metabolizing Saccharomyces cerevisiae strains overexpressing theTKL1and TAL1genes encoding the pentose phosphate pathway enzymestransketolase and transaldolase，Appl.Environ.Microbiol.61:4184-4190；Kuyper等，2004，Minimal metabolic engineering of Saccharomyces cerevisiae for efficientanaerobic xylose fermentation:a proof of principle，FEMS Yeast Research4:655-664；Beall等，1991，Parametric studies of ethanol production from xylose and other sugarsby recombinant Escherichia coli，Biotech.Bioeng.38:296-303；Ingram等，1998，Metabolic engineering of bacteria for ethanol production，Biotechnol.Bioeng.58:204-214；Zhang等，1995，Metabolic engineering of a pentose metabolism pathwayin ethanologenic Zymomonas mobilis，Science267:240-243；Deanda等，1996，Development of an arabinose-fermenting Zymomonas mobilis strain by metabolicpathway engineering，Appl.Environ.Microbiol.62:4465-4470；WO2003/062430，Xylose Isomerase)。
在一个优选的方面，经过遗传修饰的发酵微生物是Candida sonorensis。在另一个优选的方面，经过遗传修饰的发酵微生物是大肠杆菌。在另一个优选的方面，经过遗传修饰的发酵微生物是产酸克雷伯氏菌(Klebsiella oxytoca)。在另一个优选的方面，所述经遗传修饰的发酵微生物是马克斯克鲁维酵母。在另一个优选的方面，所述经遗传修饰的发酵微生物是酿酒酵母。在另一个优选的方面，经过遗传修饰的发酵微生物是运动发酵单胞菌。
本领域中公知的是，上述生物体还能用于产生其它物质，如本文所述。
通常向降解的纤维素材料或水解物加入发酵微生物，并进行约8至约96小时，例如约24至约60小时发酵。温度通常为约26℃至约60℃，例如约32℃或50℃，并且在约pH3至约pH8，例如约pH4-5、6或7。
在一个方面，对降解的纤维素材料施用酵母和/或另一种微生物，并进行约12至约96小时，如通常为24-60小时发酵。在另一个方面，温度优选为约20℃至约60℃，例如约25℃至约50℃，并且约32℃至约50℃，约32℃至约50℃，并且pH通常为约pH3至约pH7，例如约pH4至约pH7。然而，一些发酵生物体例如细菌，具有更高的最适发酵温度。酵母或另一种微生物优选以约105-1012，优选约107-1010，特别是约2x108活细胞计数每ml发酵液的量施用。关于使用酵母进行发酵的进一步指导可以在例如“The AlcoholTextbook”(K.Jacques，T.P.Lyons和D.R.Kelsall编，Nottingham UniversityPress，United Kingdom1999)中找到，其通过提述并入本文。
发酵刺激剂可以与本文所述的任何工艺组合使用，以进一步改进发酵方法，而且特定地，改进发酵微生物的性能，如，速率增加和乙醇得率。“发酵刺激剂”指用于发酵微生物(特别是酵母)生长的刺激剂。优选的用于生长的发酵刺激剂包括维生素和矿物质。维生素的实例包括多种维生素、生物素、泛酸(盐)、烟酸、内消旋肌醇(meso-inositol)、硫胺素、吡哆醇(pyridoxine)、对氨基苯甲酸、叶酸、核黄素和维生素A、B、C、D和E。参见，例如，Alfenore等，Improving ethanol production and viability of Saccharomyces cerevisiae by avitamin feeding strategy during fed-batch process，Springer-Verlag(2002)，其通过提述并入本文。矿物质的实例包括能够提供营养物的矿物质和矿物质盐，所述营养物包括P、K、Mg、S、Ca、Fe、Zn、Mn和Cu。
发酵产物：发酵产物可以是源自发酵的任何物质。发酵产物可以是，不限于，醇(例如，***醇、正丁醇、异丁醇、乙醇、甘油、甲醇、乙二醇、1,3-丙二醇(丙二醇)、丁二醇、丙三醇、山梨醇和木糖醇)；烷烃(例如戊烷、己烷、庚烷、辛烷、壬烷、癸烷、十一烷和十二烷)；环烷烃(例如环戊烷、环己烷、环庚烷、和环辛烷)；烯烃(例如戊烯、己烯、庚烯和辛烯)；氨基酸(例如，天冬氨酸、谷氨酸、甘氨酸、赖氨酸、丝氨酸和苏氨酸)；气体(例如，甲烷、氢气(H2)、二氧化碳(CO2)和一氧化碳(CO))；异戊二烯；酮(例如，丙酮)；有机酸(例如，乙酸、醋酮酸、己二酸、抗坏血酸、柠檬酸、2,5-二酮-D-葡糖酸、甲酸、反丁烯二酸、葡糖二酸、葡糖酸、葡糖醛酸、戊二酸、3-羟基丙酸、衣康酸、乳酸、苹果酸、丙二酸、草酸、草酰乙酸、丙酸、琥珀酸和木糖酸)；和聚酮化合物。发酵产物还可以是作为高价值产品的蛋白质。
在一个优选的方面，发酵产物是醇。可理解的是，术语“醇”包括包含一个或多个(例如几个)羟基基团的物质。在更优选的方面，所述醇是正丁醇。在另一个更优选的方面，所述醇是异丁醇。在另一个更优选的方面，所述醇是乙醇。在另一个更优选的方面，所述醇是甲醇。在另一个更优选的方面，所述醇是***醇。在另一个更优选的方面，所述醇是丁二醇。在另一个更优选的方面，所述醇是乙二醇。在另一个更优选的方面，所述醇是甘油(glycerin)。在另一个更优选的方面，所述醇是甘油(glycerol)。在另一个更优选的方面，所述醇是1,3-丙二醇。在另一个更优选的方面，所述醇是山梨醇。在另一个更优选的方面，所述醇是木糖醇。参见，例如，Gong，C.S.，Cao，N.J.，Du，J.,和Tsao，G.T.，1999，Ethanol production from renewable resources，于Advances in Biochemical Engineering/Biotechnology，Scheper，T.编，Springer-Verlag Berlin Heidelberg，Germany，65:207-241；Silveira，M.M.,和Jonas，R.，2002，The biotechnological production of sorbitol，Appl.Microbiol.Biotechnol.59:400-408；Nigam，P.,和Singh，D.，1995，Processes for fermentativeproduction of xylitol–a sugar substitute，Process Biochemistry30(2):117-124；Ezeji，T.C.，Qureshi，N.和Blaschek，H.P.，2003，Production of acetone，butanol and ethanol by Clostridium beijerinckii BA101and in situ recovery by gasstripping，World Journal of Microbiology and Biotechnology19(6):595-603。
在另一个优选的方面，所述发酵产物是烷烃。所述烷烃是未支化或支化的烷烃。在另一个更优选的方面，所述烷烃是戊烷。在另一个更优选的方面，所述烷烃是己烷。在另一个更优选的方面，所述烷烃是庚烷。在另一个更优选的方面，所述烷烃是辛烷。在另一个更优选的方面，所述烷烃是壬烷。在另一个更优选的方面，所述烷烃是癸烷。在另一个更优选的方面，所述烷烃是十一烷。在另一个更优选的方面，所述烷烃是十二烷。
在另一个优选的方面，所述发酵产物是环烷烃。在另一个更优选的方面，所述环烷烃是环戊烷。在另一个更优选的方面，所述环烷烃是环己烷。在另一个更优选的方面，所述环烷烃是环庚烷。在另一个更优选的方面，所述环烷烃是环辛烷。
在另一个优选的方面，所述发酵产物是烯烃。所述烯烃可为未支化或支化的烯烃。在另一个更优选的方面，所述烯烃是戊烯。在另一个更优选的方面，所述烯烃是己烯。在另一个更优选的方面，所述烯烃是庚烯。在另一个更优选的方面，所述烯烃是辛烯。
在另一个优选的方面，所述发酵产物是氨基酸。在另一个更优选的方面，所述有机酸是天冬氨酸。在另一个更优选的方面，所述氨基酸是谷氨酸。在另一个更优选的方面，所述氨基酸是甘氨酸。在另一个更优选的方面，所述氨基酸是赖氨酸。在另一个更优选的方面，所述氨基酸是丝氨酸。在另一个更优选的方面，所述氨基酸是苏氨酸。参见，例如，Richard，A.,和Margaritis，A.，2004，Empiricalmodeling of batch fermentation kinetics for poly(glutamic acid)production and othermicrobial biopolymers，Biotechnology and Bioengineering87(4):501-515。
在另一个优选的方面，所述物质是气体。在另一个更优选的方面，所述气体是甲烷。在另一个更优选的方面，所述气体是H2。在另一个更优选的方面，所述气体是CO2。在另一个更优选的方面，所述气体是CO。参见，例如，Kataoka，N.，A.Miya,和K.Kiriyama，1997，Studies on hydrogen production bycontinuous culture system of hydrogen-producing anaerobic bacteria，WaterScience and Technology36(6-7):41-47；和Gunaseelan V.N.于Biomass andBioenergy，Vol.13(1-2)，pp.83-114，1997，Anaerobic digestion of biomass formethane production:A review。
在另一个优选的方面，所述发酵产物是异戊二烯。
在另一个优选的方面，所述发酵产物是酮。应理解的是，术语“酮”涵盖了含有一个或多个(例如几个)酮模块的酮。在另一个更优选的方面，所述酮是丙酮。参见，例如Qureshi和Blaschek，2003，见上文。
在另一个优选的方面，所述发酵产物是有机酸。在另一个更优选的方面，所述有机酸是乙酸。在另一个更优选的方面，所述有机酸是醋酮酸。在另一个更优选的方面，所述有机酸是己二酸。在另一个更优选的方面，所述有机酸是抗坏血酸。在另一个更优选的方面，所述有机酸是柠檬酸。在另一个更优选的方面，所述有机酸是2,5-二酮-D-葡糖酸。在另一个更优选的方面，所述有机酸是甲酸。在另一个更优选的方面，所述有机酸是反丁烯二酸。在另一个更优选的方面，所述有机酸是葡糖二酸。在另一个更优选的方面，所述有机酸是葡糖酸。在另一个更优选的方面，所述有机酸是葡糖醛酸。在另一个更优选的方面，所述有机酸是戊二酸。在另一个优选的方面，所述有机酸是3-羟基丙酸。在另一个更优选的方面，所述有机酸是衣康酸。在另一个更优选的方面，所述有机酸是乳酸。在另一个更优选的方面，所述有机酸是苹果酸。在另一个更优选的方面，所述有机酸是丙二酸。在另一个更优选的方面，所述有机酸是草酸。在另一个更优选的方面，所述有机酸是丙酸。在另一个更优选的方面，所述有机酸是琥珀酸。在另一个更优选的方面，所述有机酸是木糖酸。参见，例如，Chen，R.,和Lee，Y.Y.，1997，Membrane-mediated extractive fermentation for lactic acidproduction from cellulosic biomass，Appl.Biochem.Biotechnol.63-65:435-448。
在另一个优选的方面，所述物质是聚酮化合物(polyketide)。
回收可以使用本领域已知的任何方法，任选地从发酵培养基回收发酵产物，所述方法包括，但不限于，层析、电泳方法、差示溶解度、蒸馏或提取。例如，通过常规蒸馏方法从发酵的纤维素材料分离并纯化醇。可以获得纯度高达约96vol％的乙醇，其能用作，例如，燃料乙醇、饮用乙醇，即，中性饮料酒，或工业乙醇。
通过以下实施例进一步对本发明进行描述，但不应将其理解为对本发明范围的限制。
实施例
菌株
里氏木霉菌株981-O-8(D4)是里氏木霉RutC30的诱变株(ATCC56765；Montenecourt和Eveleigh,1979,Adv.Chem.Ser.181:289-301)。
里氏木霉菌株AgJg115-104-7B1(PCT/US2010/061105,WO2011/075677)是里氏木霉菌株981-O-8(D4)的ku70衍生物。
培养基和缓冲溶液
2XYT加氨苄青霉素平板由16g的胰蛋白胨，10g的酵母提取物，5g的氯化钠，15g的Bacto琼脂，和去离子水加至1升构成。在经蒸汽灭菌的培养基冷却至55℃之后添加一ml的100mg/ml氨苄青霉素溶液。
SOC培养基由20g的Bacto-胰蛋白胨，5g的Bacto酵母提取物，0.5g的NaCl，2.5ml的1M KCl，和去离子水加至1升构成。在蒸汽灭菌之前，将pH用10N NaOH调整至7.0。然后在即将使用前添加20ml的灭菌1M葡萄糖。
LB平板由10g的胰蛋白胨，5g的酵母提取物，5g的NaCl，15g的Bacto琼脂，和去离子水加至1升构成。
COVE盐溶液由26g的KCl，26g的MgSO4·7H2O，76g的KH2PO4，50ml的COVE痕量金属溶液，和去离子水加至1升构成。
COVE痕量金属溶液由0.04g的NaB4O7·10H2O，0.4g的CuSO4·5H2O，1.2g的FeSO4·7H2O，0.7g的MnSO4·H2O，0.8g的Na2MoO2·2H2O，10g的ZnSO4·7H2O，和去离子水加至1升构成。
COVE平板由342.3g的蔗糖，20ml的COVE盐溶液，10ml的1M乙酰胺，10ml的1.5M CsCl，25g的Noble琼脂(Difco)，和去离子水加至1升构成。
COVE2平板由30g的蔗糖，20ml的COVE盐溶液，10ml的1M乙酰胺，25g的Noble琼脂(Difco)，和去离子水加至1升构成。
木霉属痕量金属溶液由216g的FeCl3·6H2O，58g的ZnSO4·7H2O，27g的MnSO4·H2O，10g的CuSO4·5H2O，2.4g的H3BO3，336g的柠檬酸，和去离子水加至1升构成。
CIM培养基由20g的纤维素，10g的玉米浆固形物(corn steep solids)，1.45g的(NH4)2SO4，2.08g的KH2PO4，0.28g的CaCl2，0.42g的MgSO4·7H2O，0.42ml的木霉属痕量金属溶液，1-2滴抑泡剂，和去离子水加至1升构成；pH调整至6.0。
YP培养基由10g的酵母提取物，20g的Bacto蛋白胨，和去离子水加至1升构成。
YPG培养基由4g的酵母提取物，1g的K2HPO4，0.5g的MgSO4，15.0g的葡萄糖，和去离子水加至1升(pH6.0)构成。
PEG缓冲液由500g的聚乙二醇4000(PEG4000)，10mM CaCl2，10mMTris-HCl pH7.5，和去离子水加至1升构成；过滤灭菌。
PDA平板由39g的Potato Dextrose琼脂(Difco)和去离子水加至1升构成。
PDA覆盖培养基由39g的Potato Dextrose琼脂(Difco)，2.44g的尿苷，和去离子水加至1升构成。将之前蒸汽灭菌的培养基在微波炉中熔融，然后在使用前冷却至55℃。
STC由1M山梨醇，10mM mM CaCl2，和10mM Tris-HCl，pH7.5构成；过滤灭菌。
TE缓冲液由1M Tris pH8.0和0.5M EDTA pH8.0构成。
20X SSC由175.3g的NaCl，88.2g的柠檬酸钠，和去离子水加至1升构成。
TrMM-G培养基由20ml的COVE盐溶液，6g的(NH4)2SO4，0.6g的CaCl2，25g的Nobel琼脂(Difco)，20g的葡萄糖，和去离子水加至1升构成。
NZY+培养基由5g的NaCl，3g的MgSO4·7H2O，5g的酵母提取物，10g的NZ胺，1.2g的MgCl2，4g的葡萄糖，和去离子水加至1升构成。
NNCYP07-PCS培养基由5.0g的NaNO3，3.0g的NH4Cl，2.0g的MES(游离酸)，2.5g的柠檬酸，0.2g的CaCl22H2O，1.0g的Bacto蛋白胨，5.0g的酵母提取物，0.2g的MgSO47H2O，4.0g的K2HPO4，1.0ml的COVE痕量金属溶液，80.0g的经预处理的玉米秸秆(PCS)，和去离子水加至1升构成。
实施例1：里氏木霉cbhI-烟曲霉cbhI替代构建体pJfyS139的构建
将烟曲霉纤维二糖水解酶(cbhI)编码序列(SEQ ID NO:1[DNA序列]和SEQ ID NO:2[推导的氨基酸序列])从pEJG93(WO2011/057140)使用下示的基因特异性正向和反向引物进行扩增。斜体区域代表与
Figure BDA0000496198300000591
反应的***位点同源的载体，而下划线部分为引入的Pac I位点
正向引物：
5’-cgcggactgcgcaccATGCTGGCCTCCACCTTCTCCTACC-3’(SEQ ID NO:43)
反向引物：
5’-ctttcgccacggagcttaattaaCTACAGGCACTGAGAGTAATAATCA-3’(SEQ ID NO:44)
扩增反应物由20ng的pEJG93，各200μM的dNTP，0.4μM引物，1X
Figure BDA0000496198300000601
Reaction Buffer(Stratagene，La Jolla，CA，USA)，和1.875单位的
Figure BDA0000496198300000602
Hot Start High-Fidelity DNA Polymerase(Stratagene，LaJolla，CA，USA)构成，最终体积为50μl。将扩增反应物在
Figure BDA0000496198300000604
5333epgradient S(Eppendorf Scientific，Inc.，Westbury，NY，USA)中温育，其程序如下：1个循环，在95℃进行2分钟；30个循环，每循环在95℃进行30秒，55℃进行30秒，和72℃进行1分钟；和1个循环，在72℃进行7分钟。PCR产物通过使用40mM Tris碱，20mM柠檬酸钠，1mM EDTA二钠盐(TAE)缓冲液的1％琼脂糖凝胶电泳分离，其中1.6kb片段从凝胶切出和使用
Figure BDA0000496198300000605
Gel Extraction Kit(QIAGEN Inc.，Valencia，CA，USA)依照生产商的实验方案提取。
将1.6kb PCR产物使用Advantage PCR Cloning Kit(Clontech，Palo Alto，CA，USA)依照生产商的实验方案***Nco I/Pac I-消化的pSMai155(WO05/074647)。所述
Figure BDA0000496198300000607
反应由1X
Figure BDA0000496198300000608
Reaction Buffer(Clontech，Palo Alto，CA，USA)，125ng的Nco I/Pac I-消化的pSMai155，100ng的所述1.6kb PCR产物，和1μl的
Figure BDA0000496198300000609
Enzyme(Clontech，Palo Alto，CA，USA)构成，反应体积为10μl。将所述反应在37℃温育15分钟，接着在50℃温育15分钟。在温育期之后，将40μl的TE缓冲液添加至反应，使用2μl等分试样依照生产商的实验方案转化ONETOP10感受态细胞(Invitrogen，Carlsbad，CA，USA)。将细胞在42℃热休克30秒并添加250μl的SOC培养基。将管在37℃，200rpm温育1小时，并将250μl铺板于150mm直径2XYT加氨苄青霉素平板，并在37℃温育过夜。将所得的转化体通过测序筛选，并鉴定出一个含有不具有PCR错误的***物的克隆，将其命名为pJfyS139-A。将pJfyS139-A用于***单纯疱疹病毒胸腺嘧啶激酶(tk)基因。
将单纯疱疹病毒tk编码序列(SEQ ID NO:45[DNA序列]和SEQ ID NO:46[推导的氨基酸序列])从pJfyS1579-8-6(WO2010/039840)通过用Bgl II和Bam HI消化该质粒而释放出。对消化物进行使用TAE缓冲液的1％琼脂糖凝胶电泳，其中2.3kb条带从凝胶切出并使用Gel Extraction Kit提取。将tk基因使用QUICK LIGATIONTMKit(New England Biolabs，Inc.，Ipswich，MA USA)依照生产商的实验方案***Bam HI-消化的、小牛肠磷酸酶处理的pJfyS139-A。连接反应由50ng的所述Bam HI-消化的、小牛肠磷酸酶处理的pJfyS139-A，50ng的2.3kb tk基因***物，1X QUICK LIGATIONTM缓冲液(New England Biolabs，Inc.，Ipswich，MA USA)，和5单位的QUICKLIGASETM(New England Biolabs，Inc.，Ipswich，MA USA)构成，最终体积为20μl。将反应在室温温育5分钟，并使用2μl的反应物依照生产商的实验方案转化ONE
Figure BDA0000496198300000611
TOP10感受态细胞。将细胞在42℃热休克30秒，并添加250μl的SOC培养基。将管在37℃，200rpm温育1小时，并将250μl铺板于150mm直径2XYT加氨苄青霉素平板，并在37℃温育过夜。将所得的转化体通过用Xma I的限制性消化分析来筛选，以确定***物的存在和取向，并鉴定出一个含有所述***物的克隆，将其命名为pJfyS139-B。将pJfyS139-B用于***里氏木霉3’cbhI基因侧翼序列。
3’cbhI基因侧翼序列从里氏木霉RutC30基因组DNA使用下述正向和反向引物扩增。下划线部分代表用于克隆的引入的Not I位点。
正向引物：
5’-ttagactgcggccgcGTGGCGAAAGCCTGACGCACCGGTAGAT-3’(SEQ ID NO:47)
反向引物：
5’-agtagttagcggccgcACGGCACGGTTAAGCAGGGTCTTGC-3’(SEQ ID NO:48)
将里氏木霉RutC30在250ml带挡板的摇瓶中50ml的补充2％葡萄糖(w/v)的YP培养基中在28℃在200rpm搅拌下生长2日。菌丝体通过使用
Figure BDA0000496198300000612
(Calbiochem，La Jolla，CA，USA)的过滤收获，在去离子水中洗涤两次，并在液氮下冻结。将冻结的菌丝体通过杵和研钵磨碎至精细粉末。总DNA使用
Figure BDA0000496198300000613
Plant Maxi Kit(QIAGEN Inc.，Valencia，CA，USA)分离，其中裂解温育延长至2小时。
扩增反应物由150ng的里氏木霉RutC30基因组DNA，各200μM的dNTP，0.4μM引物，1XReaction Buffer，和1.875单位的
Figure BDA0000496198300000615
Hot Start High-Fidelity DNA Polymerase构成，最终体积为50μl。扩增反应物在
Figure BDA0000496198300000616
5333epgradient S中温育，其程序如下：1个循环，在95℃进行2分钟；30个循环，每循环在95℃进行30秒，60℃进行30秒，和72℃进行1分钟30秒；和1个循环，在72℃进行7分钟。
对PCR反应物依照生产商的实验方案施以
Figure BDA0000496198300000617
NucleotideRemoval Kit(QIAGEN Inc.，Valencia，CA，USA)。将所得的PCR混合物用Not I消化，并将消化的PCR产物通过使用TAE缓冲液的1％琼脂糖凝胶电泳分离。将含有3’cbhI基因侧翼序列的1.3kb片段从凝胶切出，并使用
Figure BDA0000496198300000621
Gel Extraction Kit提取。将所述1.3kb片段使用QUICKLIGATIONTMKit***Not I-直链化、小牛肠磷酸酶处理的pJfyS139-B。所述QUICK LIGATIONTM反应由100ng的所述Not I-直链化、小牛肠磷酸酶处理的pJfyS139-B，20ng的所述1.3kb片段，1X QUICK LIGATIONTMBuffer，和5单位的QUICK LIGASETM构成，最终体积为20μl。将所述反应物在室温温育5分钟，并将2μl的的所述反应物用于依照生产商的实验方案转化ONE
Figure BDA0000496198300000622
TOP10感受态细胞。将细胞在42℃热休克30秒，并添加250μl的SOC培养基。将管在37℃，200rpm温育1小时，并将250μl铺板于150mm直径2XYT加氨苄青霉素平板，并在37℃温育过夜。将所得的转化体通过用Xma I的限制性消化分析来筛选，以确定***物的存在和取向，并对阳性克隆测序。将一个含有不具有PCR错误的3’cbhI基因侧翼序列的克隆命名为pJfyS139(图1)。将pJfyS139用作载体以替代里氏木霉cbhI基因。
实施例2：里氏木霉原生质体生成和转化
原生质体制备和转化使用Penttila等，1987，Gene61：155-164的修饰的实验方案进行。简言之，将里氏木霉菌株AgJg115-104-7B1(PCT/US2010/061105，WO2011/075677)在补充2％(w/v)葡萄糖和10mM尿苷的25ml的YP培养基在27℃在90rpm的轻柔搅拌下培养17小时。菌丝体通过使用Vacuum Driven Disposable Filtration System(Millipore，Bedford，MA，USA)过滤来收集，并用去离子水洗涤两次，并用1.2M山梨醇洗涤两次。原生质体通过将经洗涤的菌丝体在34℃在90rpm的轻柔振荡下悬于20ml的含有15mg每ml的
Figure BDA0000496198300000623
200G(Novozymes A/S，Bagsvaerd，Denmark)和0.36单位每ml的壳多糖酶(Sigma Chemical Co.，St.Louis，MO，USA)的1.2M山梨醇中15-25分钟来生成。将原生质体通过在400x g离心7分钟并用冷1.2M山梨醇洗涤两次来收集。将原生质体使用血细胞计数器计数，并在STC中重悬至1x108原生质体每ml的最终浓度。将过量的原生质体在-80℃储藏于Cryo1℃ Freezing Container(Nalgene，Rochester，NY，USA)。
下述实施例中所述的将大约100μg的转化质粒用Pme I消化。将消化反应通过使用TAE缓冲液的1％琼脂糖凝胶电泳来纯化。将DNA条带从凝胶切出，并使用Gel Extraction Kit(QIAGEN Inc.，Valencia，CA，USA)提取。将所得的纯化的DNA添加至100μl的原生质体溶液并轻柔地混合。添加PEG缓冲液(250μl)，混合，并在34℃温育30分钟。然后添加STC(3ml)，混合，并铺板于补充1M蔗糖的PDA平板。在28℃温育16小时之后，将20ml的补充35μg每ml的潮霉素B的覆盖PDA培养基添加至每个平板。将平板在28℃温育4-7日。
实施例3：用烟曲霉cbhI编码序列替代天然的里氏木霉cbhI基因
为了用烟曲霉cbhI编码序列(SEQ ID NO:1[DNA序列]和SEQ ID NO:2[推导的氨基酸序列])替代里氏木霉天然cbhI基因(SEQ ID NO:23[DNA序列]和SEQ ID NO:24[推导的氨基酸序列])，将里氏木霉ku70-菌株AgJg115-104-7B1(PCT/US2010/061105，WO2011/075677)用4x2μg的Pme I直链化的pJfyS139(实施例1)依照实施例2中所述的步骤来转化。获得了七个转化体，并将每一个挑取并转移至PDA平板，并在28℃温育7日。将基因组DNA从转化体根据实施例1中所述的步骤分离，并对每个转化体施以Southern分析。
对于Southern分析，将2μg的基因组DNA用33单位的Bgl II在50μl反应体积中消化，并对其进行TAE缓冲液中的1％琼脂糖电泳。将凝胶中的DNA用一次在0.25N HCl中的10分钟洗涤来去嘌呤，用两次在0.5NNaOH-1.5M NaCl中的15分钟洗涤来变性，用一次在1M Tris pH8-1.5MNaCl中的30分钟洗涤来中和，并在20X SSC中温育5分钟。将DNA使用TURBOBLOTTERTMSystem(Whatman，Inc.，Florham Park，NJ，USA)依照生产商的实验方案转移至
Figure BDA0000496198300000632
Supercharge膜(Whatman，Inc.，FlorhamPark，NJ，USA。将DNA使用STRATALINKERTMUV Crosslinker(Stratagene，La Jolla，CA，USA)UV交联至膜，并在42℃在20ml的DIG Easy Hyb(RocheDiagnostics Corporation，Indianapolis，IN，USA)中预杂交1小时。
杂交于3’cbhI基因侧翼序列的探针使用Dig Probe Synthesis Kit(RocheDiagnostics Corporation，Indianapolis，IN，USA)依照生产商的指示用下示的正向和反向引物来生成。PCR反应由1X
Figure BDA0000496198300000633
Reaction Buffer，各400nM的引物，200μM DIG-标记的含dUTP-的dNTP，20ng的pJfyS139，和1.5单位的
Figure BDA0000496198300000634
Hot Start High-Fidelity DNA Polymerase构成。扩增反应物在
Figure BDA0000496198300000635
5333epgradient S中温育，其程序如下：1个循环，在95℃进行2分钟；25个循环，每循环在95℃进行30秒，55℃进行30秒，和72℃进行40秒；和1个循环，在72℃进行7分钟。
正向引物：
5’-AAAAAACAAACATCCCGTTCATAAC-3’(SEQ ID NO:49)
反向引物：
5’-AACAAGGTTTACCGGTTTCGAAAAG-3’(SEQ ID NO:50)
将探针通过使用TAE缓冲液的1％琼脂糖凝胶电泳纯化，其中对应于探针的0.5kb条带从凝胶切出并使用
Figure BDA0000496198300000641
Gel Extraction Kit提取。将探针煮沸5分钟，在冰上冷却2分钟，并添加至10ml的DIG Easy Hyb以产生杂交溶液。杂交在42℃进行15-17小时。然后将膜在低严格条件下在2X SSC加0.1％SDS中在室温洗涤5分钟，接着进行在0.5X SSC加0.1％SDS中在65℃的两次高严格性洗涤，每次15分钟。探针-靶杂交通过化学发光测定(Roche Diagnostics，Indianapolis，IN，USA)依照生产商的指示来检测。Southern分析指示7个转化体中的3个含有在cbhI基因座的替代盒，且选择一个转化体里氏木霉JfyS139-8用于消除(cure)hpt和tk标志物。
生成孢子的新鲜平板，即，将在28℃生长7日龄PDA平板的孢子转移至PDA平板，并在28℃温育7日。将孢子在10ml的0.01％
Figure BDA0000496198300000642
20中使用灭菌的涂布器收集。孢子的浓度使用血细胞计数器确定，并将105个孢子铺板于含有补充1μM5-氟-2'-脱氧尿苷(FdU)的TrMM-G培养基的150mm平板上。
获得了三百个FdU抗性的孢子分离株，并从上述孢子分离株中的2个提取了DNA。将分离株通过Southern分析如上所述进行分析，且结果指示两个孢子分离株均切出了替代盒的同源重复之间的hpt/tk区。选择一个称作里氏木霉JfyS139-8A的菌株用于替代cbhII基因。
实施例4：空里氏木霉cbhII替代构建体pJfyS142的构建
为了生成构建体以用烟曲霉cbhII编码序列(SEQ ID NO:3[DNA序列]和SEQ ID NO:4[推导的氨基酸序列])替代里氏木霉cbhII基因(SEQ ID NO:25[DNA序列]和SEQ ID NO:26[推导的氨基酸序列])，首先从里氏木霉RutC30基因组DNA使用下示的基因特异性正向和反向引物扩增里氏木霉cbhII启动子。里氏木霉RutC30基因组DNA根据实施例1中所述的步骤制备。
正向引物：
5’-acgaattgtttaaacgtcgacCCAAGTATCCAGAGGTGTATGGAAATATCAGAT-3’(SEQ ID NO:51)
反向引物：
5’-cgcgtagatctgcggccatGGTGCAATACACAGAGGGTGATCTT-3’(SEQ ID NO:52)
扩增反应物由20ng的里氏木霉RutC30基因组DNA，各200μM的dNTP，0.4μM引物，1X
Figure BDA0000496198300000651
Reaction Buffer，和1.875单位的
Figure BDA0000496198300000652
Hot Start High-Fidelity DNA Polymerase构成，最终体积为50μl。扩增反应物在中温育，其程序如下：1个循环，在95℃进行2分钟；25个循环，每循环在95℃进行30秒，55℃进行30秒，和72℃进行1分钟30秒；和1个循环，在72℃进行7分钟。PCR产物通过使用TAE缓冲液的1％琼脂糖凝胶电泳分离，其中1.6kb片段从凝胶切出并使用
Figure BDA0000496198300000654
Gel Extraction Kit提取。
将1.6kb PCR产物使用
Figure BDA0000496198300000655
Advantage PCR Cloning Kit依照生产商的实验方案***Nco I/Sal I-消化的pSMai155(WO05/074647)。所述
Figure BDA0000496198300000656
反应由1X
Figure BDA0000496198300000657
Reaction Buffer，125ng的Nco I/Sal I-消化的pSMai155，100ng的所述1.6kb PCR产物，和1μl的
Figure BDA0000496198300000658
Enzyme构成，反应体积为10μl。将所述反应在37℃温育15分钟和在50℃温育15分钟。在温育期之后将40μl的TE添加至反应。将2μl等分试样用于依照生产商的实验方案转化ONE
Figure BDA0000496198300000659
TOP10感受态细胞。将细胞在42℃热休克30秒并添加250μl的SOC培养基。将管在37℃，200rpm温育1小时并将250μl铺板于150mm直径2XYT加氨苄青霉素平板并在37℃温育过夜。将所得的转化体通过用Pci I的限制性消化来筛选并对正向克隆测序以确保不存在PCR错误。鉴定出了一个含有不具有PCR错误的***物的克隆，并将其命名为pJfyS142-A。将质粒pJfyS142-A用于***里氏木霉cbhII终止子。
所述cbhII终止子从里氏木霉RutC30基因组DNA使用下示的基因特异性正向和反向引物扩增。斜体区域代表与
Figure BDA00004961983000006510
反应中的***位点同源的载体。
正向引物：
5’-atctacgcgtactagttaattaaGGCTTTCGTGACCGGGCTTCAAACA-3’(SEQ ID NO:53)
反向引物：
5’-gcggccgttactagtggatccACTCGGAGTTGTTATACGCTACTCG-3’(SEQ ID NO:54)
扩增反应物由150ng的里氏木霉RutC30基因组DNA，各200μM的dNTP，0.4μM引物，1X
Figure BDA0000496198300000661
Reaction Buffer，和1.875单位的
Figure BDA0000496198300000662
Hot Start High-Fidelity DNA Polymerase构成，最终体积为50μl。扩增反应物在中温育，其程序如下：1个循环，在95℃进行2分钟；25个循环，每循环在95℃进行30秒，54℃进行30秒，和72℃进行50秒；和1个循环，在72℃进行7分钟。将PCR产物通过使用TAE缓冲液的1％琼脂糖凝胶电泳来分离，其中将0.3kb片段从凝胶切出并使用
Figure BDA0000496198300000664
Gel Extraction Kit提取。
将所述0.3kb PCR产物使用
Figure BDA0000496198300000665
Advantage PCR Cloning Kit依照生产商的实验方案***Pac I/Bam HI-消化的pJfyS142-A。所述反应由1XReaction Buffer，150ng的PacI/Bam HI-消化的pJfyS142-A，50ng的0.3kb PCR产物，和1μl的Enzyme构成，反应体积为10μl。将所述反应在37℃温育15分钟和在50℃温育15分钟。在温育期之后将40μl的TE添加至反应。将2μl等分试样用于依照生产商的实验方案转化ONE
Figure BDA0000496198300000669
TOP10感受态细胞。将细胞在42℃热休克30秒并添加250μl的SOC培养基。将管在37℃，200rpm温育1小时并将250μl铺板于150mm直径2XYT加氨苄青霉素平板并在37℃温育过夜。通过序列分析筛选转化体来鉴定阳性克隆和确保不存在PCR错误。鉴定出了一个含有不具有PCR错误的***物的克隆，并将其命名为pJfyS142-B。将质粒pJfyS142-B用于***单纯疱疹tk基因。
将单纯疱疹病毒tk基因从pJfyS1579-8-6(WO2010/039840)通过用Bgl II和Bam HI消化所述质粒来释放出。对消化物施以使用TAE缓冲液的1％琼脂糖凝胶电泳，其中2.3kb条带从凝胶切出并使用
Figure BDA00004961983000006610
Gel Extraction Kit提取。将tk盒使用QUICK LIGATIONTMKit依照生产商的实验方案***Bam HI-消化的、小牛肠磷酸酯酶去磷酸的pJfyS142-B。所述连接反应由50ng的所述Bam HI-消化的、小牛肠磷酸酯酶去磷酸的pJfyS142-B，50ng的2.3kb tk基因***物，1X QUICK LIGATIONTMBuffer，和5单位的QUICK LIGASETM构成，连接体积为20μl。将反应物在室温温育5分钟并将2μl的所述反应物用于依照生产商的实验方案转化ONE
Figure BDA00004961983000006611
TOP10感受态细胞。将细胞在42℃热休克30秒并添加250μl的SOC培养基。将管在37℃，200rpm温育1小时并将250μl铺板于150mm直径2XYT加氨苄青霉素平板并在37℃温育过夜。将所得的转化体通过用Xma I和Bam HI的限制性消化来筛选来确定***物的存在和取向，并鉴定了含有***物的克隆，并将其命名为pJfyS142-C。将质粒pJfyS142-C用于***里氏木霉3’cbhII基因侧翼序列。
所述3’cbhII基因侧翼序列使用下示的正向和反向引物从里氏木霉RutC30基因组DNA扩增。斜体区域代表与
Figure BDA0000496198300000671
反应中的***位点同源的载体。
正向引物：
5’-atccatcacactggcggccgcGCTTCAAACAATGATGTGCGATGGT-3’(SEQ ID NO:55)
反向引物：
5’-gatgcatgctcgagcggccgcCTACCTTGGCAGCCCTACGAGAGAG-3’(SEQ ID NO:56)
扩增反应物由150ng的里氏木霉RutC30基因组DNA，各200μM的dNTP，0.4μM引物，1X
Figure BDA0000496198300000672
Reaction Buffer，和1.875单位的
Figure BDA0000496198300000673
Hot Start High-Fidelity DNA Polymerase构成，最终体积为50μl。扩增反应物在
Figure BDA0000496198300000674
中温育，其程序如下：1个循环，在95℃进行2分钟；30个循环，每循环在95℃进行30秒，56℃进行30秒，和72℃进行1分钟50秒；和1个循环，在72℃进行7分钟。对PCR反应进行使用TAE缓冲液的1％琼脂糖凝胶电泳，其中1.5kb条带从凝胶切出并使用
Figure BDA0000496198300000675
Gel Extraction Kit提取。将所述3’cbhII基因侧翼序列使用Advantage PCR Cloning Kit依照生产商的实验方案***Not I-线性化的pJfyS142-C。所述
Figure BDA0000496198300000677
反应由1XReaction Buffer，150ng的pJfyS142-C，80ng的所述1.5kb PCR产物，和1μl的
Figure BDA0000496198300000679
Enzyme构成，反应体积为10μl。将所述反应在37℃温育15分钟和在50℃温育15分钟。在温育期之后将40μl的TE添加至反应。将2μl等分试样用于依照生产商的实验方案转化ONE
Figure BDA00004961983000006710
TOP10感受态细胞。将细胞在42℃热休克30秒并添加250μl的SOC培养基。将管在37℃，200rpm温育1小时并将250μl铺板于150mm直径2XYT加氨苄青霉素平板并在37℃温育过夜。将所得的转化体通过用Bgl II的限制性消化来筛选，并将阳性克隆测序以确保不存在PCR错误。鉴定出了一个含有不具有PCR错误的***物的克隆，并命名为pJfyS142(图2)。使用质粒pJfyS142***烟曲霉cbhII编码序列。
实施例5：里氏木霉cbhII-烟曲霉cbhII替代构建体pJfyS144的构建
所述烟曲霉cbhII编码序列(SEQ ID NO:3[DNA序列]和SEQ ID NO:4[推导的氨基酸序列])从pAlLo33(WO2011/057140)使用下示的正向和反向引物扩增。斜体区域代表与
Figure BDA0000496198300000681
反应的***位点同源的载体。
正向引物：
5’-ctctgtgtattgcaccATGAAGCACCTTGCATCTTCCATCG-3’(SEQ ID NO:57)
反向引物：
5’-ccggtcacgaaagccTTAATTAAAAGGACGGGTTAGCGTT-3’(SEQ ID NO:58)
扩增反应物由20ng的pAlLo33，各200μM的dNTP，0.4μM引物，1mM
Figure BDA0000496198300000682
Reaction Buffer，和1.875单位的
Figure BDA0000496198300000683
Hot StartHigh-Fidelity DNA Polymerase构成，最终体积为50μl。扩增反应物在
Figure BDA0000496198300000684
中温育，其程序如下：1个循环，在95℃进行2分钟；30个循环，每循环在95℃进行30秒，55℃进行30秒，和72℃进行2分钟；和1个循环，在72℃进行7分钟。
对PCR反应进行使用TAE缓冲液的1％琼脂糖凝胶电泳，其中1.7kb条带从凝胶切出并使用
Figure BDA0000496198300000685
Gel Extraction Kit提取。将所述1.7kb PCR产物使用
Figure BDA0000496198300000686
Advantage PCR Cloning Kit依照生产商的实验方案***Nco I/Pac I-消化的pJfyS142(实施例4)。所述
Figure BDA0000496198300000687
反应由1X
Figure BDA0000496198300000688
Reaction Buffer，120ng的Nco I/Pac I-消化的pJfyS142，70ng的1.7kb PCR产物，和1μl的
Figure BDA0000496198300000689
Enzyme构成，反应体积为10μl。将所述反应在37℃温育15分钟和在50℃温育15分钟。在温育期之后将40μl的TE添加至反应。将2μl等分试样用于依照生产商的实验方案转化ONE
Figure BDA00004961983000006810
TOP10感受态细胞。将细胞在42℃热休克30秒并添加250μl的SOC培养基。将管在37℃，200rpm温育1小时并将250μl铺板于150mm直径2XYT加氨苄青霉素平板并在37℃温育过夜。对所得的转化体测序以确保不存在PCR错误和确定***物的存在。鉴定出了一个具有不含错误的序列的克隆并命名为pJfyS144(图3)。使用质粒pJfyS144以用来自烟曲霉的cbhII编码序列替代天然cbhII基因。
实施例6：用烟曲霉cbhII编码序列替代天然里氏木霉cbhII基因
为了用烟曲霉cbhII编码序列(SEQ ID NO:3[DNA序列]和SEQ ID NO:4[推导的氨基酸序列])替代天然里氏木霉cbhII基因(SEQ ID NO:25[DNA序列]和SEQ ID NO:26[推导的氨基酸序列])，将里氏木霉JfyS139-8A(实施例3)根据实施例2中所述的步骤用2μg的Pme I-直链化和凝胶纯化的pJfyS144(实施例5)转化。获得了七个转化体，挑取每一个，并转移至PDA平板并在28℃温育7日。使用下述的真菌孢子PCR方法以筛选携带基因替代的转化体，其中使用了下示的退火于5’cbhII基因侧翼序列上游超过整合区域的区域的正向引物，和下示的退火于烟曲霉cbhII编码序列的反向引物。
正向引物：
5’-AGCCACATGCCGCATATTGACAAAG-3’(SEQ ID NO:59)
反向引物：
5’-AGGGATTCAGTGTGCTACAGGCTGC-3’(SEQ ID NO:60)
仅在cbhII基因座处发生准确的基因替代时会生成1.8kb PCR产物。若盒整合至基因组的别处，不会导致扩增。
将来自每个转化体的少量孢子悬于25μl的TE缓冲液中，并在微波炉以“高”档加热1分钟。将每个经微波加热的孢子悬液用作PCR反应中的模板。所述反应由1μl的所述微波加热的孢子悬液，各1μl的10mM dNTP，12.5μl的2X
Figure BDA0000496198300000691
GC-Melt LA缓冲液(Clontech，Mountain View，CA，USA)，25pmol的正向引物，25pmol的反向引物，1.25单位的
Figure BDA0000496198300000692
GC Genome LA Polymerase Mix(Clontech，Mountain View，CA，USA)，和9.25μl的水构成。反应在
Figure BDA0000496198300000693
5333epgradientS中温育，其程序如下：1个循环，在95℃进行10分钟；35个循环，每循环在95℃进行30秒，56℃进行30秒，和72℃进行1分钟40秒；1个循环，在72℃进行7分钟；和4℃维持。对PCR反应进行使用TAE缓冲液的1％琼脂糖凝胶电泳。孢子PCR指示七个转化体中的四个在靶向的基因座含有所述替代盒，且对其中三个进行Southern分析以确认替代盒为单拷贝。
将基因组DNA从三个转化体根据实施例1中所述的步骤分离，并对每个转化体施以Southern分析。对于Southern分析，将2μg的基因组DNA用50μl反应体积中的50单位的Dra I消化，并对其进行TAE缓冲液中的1％琼脂糖电泳。将凝胶中的DNA用一次在0.25N HCl中的10分钟洗涤来去嘌呤，用两次在0.5N NaOH-1.5M NaCl中的15分钟洗涤来变性，用一次在1M Tris pH8-1.5M NaCl中的30分钟洗涤来中和，并在20X SSC中温育5分钟。将DNA转移至
Figure BDA0000496198300000694
Supercharge膜。将DNA使用STRATALINKERTMUV CrosslinkerUV交联至膜，并在42℃在20ml的DIG Easy Hyb中预杂交1小时。
杂交于3’cbhII基因侧翼序列的探针使用Dig Probe Synthesis Kit依照生产商的指示用下示的正向和反向引物来生成。PCR反应由1XReaction Buffer，各400nM的引物，200μM DIG-标记的含dUTP-的dNTP，150ng的里氏木霉RutC30基因组DNA，和1.5单位的Hot StartHigh-Fidelity DNA Polymerase。扩增反应物在
Figure BDA0000496198300000703
5333epgradient S中温育，其程序如下：1个循环，在95℃进行2分钟；30个循环，每循环在95℃进行30秒，51℃进行30秒，和72℃进行40秒；和1个循环，在72℃进行7分钟。
正向引物：
5’-AAAAAACAAACATCCCGTTCATAAC-3’(SEQ ID NO:61)
反向引物：
5’-AACAAGGTTTACCGGTTTCGAAAAG-3’(SEQ ID NO:62)
将探针通过使用TAE缓冲液的1％琼脂糖凝胶电泳纯化，其中对应于探针的0.5kb条带从凝胶切出并使用Gel Extraction Kit提取。将探针煮沸5分钟，在冰上冷却2分钟，并添加至10ml的DIG Easy Hyb以产生杂交溶液。杂交在42℃进行大约17小时。然后将膜在低严格条件下在2XSSC加0.1％SDS中在室温洗涤5分钟，接着进行在0.5X SSC加0.1％SDS中在65℃的两次高严格性洗涤，每次15分钟。探针-靶杂交通过化学发光测定(Roche Diagnostics，Indianapolis，IN，USA)依照生产商的指示来检测。Southern分析指示三个转化体在cbhII基因座含有替代盒，且选择所有三个(命名为JfyS139/144-5，-6，和-10)用于消除hpt和tk标志物。
生成孢子的新鲜平板，即，将在28℃生长7日龄PDA平板的孢子转移至新鲜PDA平板，并在28℃温育7日。将孢子在10ml的0.01％
Figure BDA0000496198300000706
20中使用灭菌的涂布器收集。孢子的浓度使用血细胞计数器确定，并将105和104个孢子铺板于含有补充1μM FdU的TrMM-G培养基的150mm平板上。
从含有105个孢子的平板对于每个转化体获得了大约500个FdU抗性的孢子分离株，而从含有104个孢子的平板对于每个转化体获得了大约100个FdU抗性的孢子分离株。对于菌株JfyS139/144-5和-6挑取了八个孢子分离株，而对于菌株JfyS139/144-10挑取了四个。来自初级转化体5的每个分离株1至8命名为JfyS139/144-5A至-5H。来自初级转化体6的每个分离株1至8命名为JfyS139/144-6A至-6H。来自初级转化体10的分离株对于分离株1至4命名为JfyS139/144-10A至10D。孢子PCR如上所述进行，使用下示的正向和反向引物，以确认hpt和tk标志物已正确地切出。
正向引物：
5’-GTTAAGCATACAATTGAACGAGAATGG-3’(SEQ ID NO:63)
反向引物：
5’-GATGATATAATGGAGCAAATAAGGG-3’(SEQ ID NO:64)
PCR反应如上所述以下述循环参数进行：1个循环，在95℃进行2分钟；30个循环，每循环在95℃进行30秒，55℃进行30秒，和72℃进行6分钟秒；和1个循环，在72℃进行7分钟。
使用退火于5’(正向)和3’(反向)侧翼序列的引物进行cbhII基因替代。正确地切出htp/tk盒的菌株会显示3.5kb片段，而具有完好的标志物的那些菌株会显示8kb片段。PCR筛选指示所有的孢子分离株正确地切出了htp/tk盒。
对于每个初级转化体，从A和B孢子分离株提取了DNA，并对其进行了如上所述的Southern分析。Southern分析确认每个孢子分离株正确地切除了htp/tk盒。选择孢子分离株里氏木霉JfyS139/144-10B以代表含有里氏木霉cbhI和cbhII基因二者均用来自烟曲霉的相应同源物替代的菌株。
实施例7：里氏木霉ku70基因修复质粒pTH239的生成
将四个DNA区段使用
Figure BDA0000496198300000711
Advantage PCR Cloning Kit合并以生成构建体，其用天然里氏木霉ku70编码序列(SEQ ID NO:65[DNA序列]和SEQ ID NO:66[推导的氨基酸序列])替代了破坏的里氏木霉ku70编码序列。含有原核复制起点的氨苄青霉素抗性标志物区从pJfyS139-B(实施例1)使用下示的序列特异性正向和反向引物(SEQ ID NO:67和68)扩增。里氏木霉ku70基因上游序列(由来自ku70编码序列上游的989bp和ku70编码序列的最初1010bp组成)从里氏木霉981-O-8基因组DNA使用下示的序列特异性正向和反向引物(SEQ ID NO:69和70)扩增。里氏木霉ku70基因下游序列(由从上游PCR产物中扩增的ku70编码序列的1010bp区段的3’端重复的500bp的区段，和含有剩余ku70编码序列的1067bp区段，和来自ku70编码序列的下游的461bp组成)从里氏木霉981-O-8基因组DNA使用下示的序列特异性正向和反向引物(SEQ ID NO:71和72)扩增。里氏木霉981-O-8基因组DNA根据实施例1中所述的步骤制备。
正向引物：
5’-GTGTGCGGCCGCTCGAGCATGCATGTTTAAACAGCTTGGCACTGGCCGTCGTTTT-3’(SEQID NO:67)
反向引物：
5’-ATCAGCCCCGAGACGGCGCCGCGTTTAAACAATTCGTAATCATGGTCATAGCTGT-3’(SEQID NO:68)
正向引物：
5’-CATGATTACGAATTGTTTAAACGCGGCGCCGTCTCGGGGCTGATCTTGTCGAGGA-3’(SEQID NO:69)
反向引物：
5’-GGCGGCCGTTACTAGTGGATCCAGCCCTTGACAGTGATCTTGAGTCCAGGTGCAA-3’(SEQID NO:70)
正向引物：
5’-TGCAGATATCCATCACACTGGCGGCCGCAGTTTCCATGTCCAACGTGTTGTTTTGCGC-3’(SEQID NO:71)
反向引物：
5’-GCCAGTGCCAAGCTGTTTAAACATGCATGCTCGAGCGGCCGCACACGCCCTCTCCTCG-3’(SEQID NO:72)
为了扩增氨苄青霉素抗性标志物和原核复制起点区，所述反应由100ng的里氏木霉981-O-8基因组DNA，200μM dNTPs，1μM的每种引物(SEQ IDNO:67和70)，1X
Figure BDA0000496198300000721
High-Fidelity Hot Start DNA Polymerase缓冲液(New England Biolabs，Inc.，Ipswich，MA，USA)，和1.0单位的
Figure BDA0000496198300000722
High-Fidelity Hot Start DNA Polymerase(New England Biolabs，Inc.，Ipswich，MA，USA)构成，最终体积为50μl。扩增反应物在
Figure BDA0000496198300000723
5333epgradient S中温育，其程序如下：1个循环，在98℃进行30秒；30个循环，每循环在98℃进行10秒，55℃进行30秒，和72℃进行1分钟30秒；和1个循环，在72℃进行7分钟。所述PCR产物通过使用TAE缓冲液的1％琼脂糖凝胶电泳分离，其中2.692kb片段从凝胶切出并使用Gel Extraction Kit提取。
为了扩增ku70基因上游序列或下游序列，所述反应由100ng的pJfyS139-B，200μM dNTPs，1μM的每种引物(分别为SEQ ID NO:69和70，或者71和72)，1X
Figure BDA0000496198300000731
High-Fidelity Hot Start DNA Polymerase Buffer，和1.0单位的
Figure BDA0000496198300000732
High-Fidelity Hot Start DNA Polymerase构成，最终体积为50μl。所述扩增反应在
Figure BDA0000496198300000733
5333epgradient S中温育，其程序如下：1个循环，在98℃进行30秒；30个循环，每循环在98℃进行10秒，55℃进行30秒，和72℃进行1分钟30秒；和1个循环，在72℃进行7分钟。PCR产物通过使用TAE缓冲液的1％琼脂糖凝胶电泳分离，其中1.999kb和2.028kb片段分别从凝胶切出并使用
Figure BDA0000496198300000734
Gel Extraction Kit提取。
第四DNA区段从用Not I和Bam HI对pJfyS139-B的限制性酶消化来生成。反应由5μg的pJfyS139-B，10单位的Not I，20单位的Bam HI，和20μl的Restriction Enzyme Buffer2(New England Biolabs，Inc.，Ipswich，MA，USA)构成，总体积为50μl。将所述反应在37℃温育1小时，然后通过使用TAE缓冲液的1％琼脂糖凝胶电泳分离，其中4.400kb片段从凝胶切出并使用Gel Extraction Kit提取。
将2,028bp，1,999bp和2,692bp的三种PCR产物使用
Figure BDA0000496198300000736
Advantage PCR Cloning Kit依照生产商的实验方案***Not I和Bam HI-消化的pJfyS139-B。所述
Figure BDA0000496198300000737
反应由1X
Figure BDA0000496198300000738
Reaction Buffer，50ng的Not I/Bam HI-消化的pJfyS139-B，50ng的1.999kb ku70基因上游PCR产物，50ng的2.028kb ku70基因下游PCR产物，50ng的2.692kb氨苄青霉素抗性标志物和原核复制起点PCR产物，和1μl的Enzyme构成，反应体积为10μl。所述反应在37℃温育15分钟，接着在50℃温育15分钟。在温育期之后将40μl的TE添加至反应。将3μl等分试样用于依照生产商的实验方案转化大肠杆菌XL10
Figure BDA00004961983000007310
感受态细胞(Stratagene，La Jolla，CA，USA)。将细胞在42℃热休克30秒，然后添加预加热至42℃的500μl的NZY+培养基。将管在37℃在200rpm振荡下温育40分钟，然后铺板于150mm直径2XYT加氨苄青霉素平板并在37℃温育过夜。将所得的转化体通过用Hind III和Xba I的限制性消化来筛选并对正向克隆测序以确保不存在PCR错误。鉴定了一个含有不具有PCR错误的***物的克隆并命名为pTH239。
实施例8：烟曲霉cbh1和cbh2替代菌株JfyS139/144-10B中ku70基因的修复
将天然里氏木霉ku70基因在菌株里氏木霉JfyS139/144-10B(实施例6)中修复，以协助菌株操作，需要ku70基因在非同源末端连接中的功能。将里氏木霉JfyS129/144-10B用23x2μg的Pme I-直链化的pTH239(实施例7)根据实施例2中所述的步骤转化。获得了十九个转化体，并将每一个分别转移至PDA平板，并在28℃温育7日。
将所有十九个转化体通过PCR筛选以确认pTH239Pme I片段在破坏的ku70基因基因座的同源整合。对于每个转化体，使用灭菌的接种环来从7日龄PDA平板收集孢子。将孢子转移至含有25μl的1mM EDTA-10mM Tris缓冲液的管，并在“高”档微波处理1分钟。将经微波处理的孢子混合物的1μl等分试样直接添加至PCR反应作为模板DNA。设计了下示的一组PCR引物以扩增整个ku70编码序列的破坏的区域以区分具有ku70编码序列(848bp)中的破坏的宿主基因组和感兴趣的pTH239靶向的菌株(606bp)。所述PCR反应由1X
Figure BDA0000496198300000741
基因组LA Polymerase Reaction Buffer(Clontech，Mountain View，CA，USA)，各400nM的引物，各200μM的dNTP，1μl的经微波处理的TE-孢子混合物(如上所述)，和1.0单位的
Figure BDA0000496198300000742
基因组LA Polymerase(Clontech，Mountain View，CA，USA)构成。扩增反应物在
Figure BDA0000496198300000743
5333epgradient S中温育，其程序如下：1个循环，在95℃进行10分钟；30个循环，每循环在95℃进行30秒，55℃进行30秒，和72℃进行60秒；和1个循环，在72℃进行7分钟。
正向引物：
5’-CAATGACGATCCGCACGCGT-3’(SEQ ID NO:73)
反向引物：
5’-CAATGACGATCCGCACGCGT-3’(SEQ ID NO:74)
十九个转化体中仅有一个(#19)对于606bp PCR产物是阳性的且对于848bp PCR产物是阴性的，指示含有在ku70基因座同源整合的pTH239PmeI片段的菌株。
将来自转化体#19的7日龄PDA平板的孢子在10ml的0.01％
Figure BDA0000496198300000744
20中使用灭菌的涂布器收集。孢子的浓度使用血细胞计数器确认，并将106个孢子铺板于含有补充1μM5-氟-2'-脱氧尿苷(FdU)的TrMM-G培养基的150mm平板，并在28℃培养5日。获得了二十二个FdU-抗性孢子分离株，并将其转化至PDA平板，并在28℃培养5日。
将所有二十二个孢子分离株(#19A-V)通过PCR筛选在修复盒内ku70编码序列的同源重复之间存在的hpt/tk标志物区的切出。对于每个孢子分离株，使用灭菌接种环从7日龄PDA平板收集孢子。将孢子转移至含有25μl的1mM EDTA-10mM Tris缓冲液的管，并在“高”档微波处理1分钟。将孢子混合物的1μl等分试样直接添加至PCR反应作为模板基因组DNA。设计了下示的一组PCR引物以扩增整个hpt/tk区域以区分hpt/tk区域的存在(6kb)或不存在(1.1kb)。所述PCR反应由1X
Figure BDA0000496198300000751
基因组LA PolymeraseReaction Buffer，各400nM的引物(见下)，各200μM的dNTP，1μl的微波处理的TE-孢子混合物(如上所述)，和1.0单位的
Figure BDA0000496198300000752
基因组LAPolymerase构成。扩增反应物在
Figure BDA0000496198300000753
5333epgradient S中温育，其程序如下：1个循环，在95℃进行10分钟；30个循环，每循环在95℃进行30秒，50℃进行30秒，和72℃进行6分钟；和1个循环，在72℃进行7分钟。
正向引物：
5’-GACACTCTTTTCTCCCATCT-3’(SEQ ID NO:75)
反向引物：
5’-GAGGAGCAGAAGAAGCTCCG-3’(SEQ ID NO:76)
所有二十二个孢子分离株对于对应于hpt/tk标志物区的6kb PCR产物是阴性的。
将来自分离株#19A和#19L的7日龄PDA平板的孢子使用灭菌的涂布器在10ml的0.01％
Figure BDA0000496198300000754
20中收集。孢子的浓度使用血细胞计数器确定，并将103，102，和101个孢子铺板于含有1M蔗糖的150mm PDA平板上，并在28℃培养3日。对于菌株#19A和#19L两者从PDA平板选择了十个孢子分离株，并将其转移至新鲜PDA平板并置于28℃。
根据实施例中所述的步骤从#19L和#19A两者的6个孢子分离株提取基因组DNA，并对其施以Southern分析。
对于Southern分析，将2μg的基因组DNA在50μl反应体积中用下述消化：(1)分别为5单位和10单位的Asc I和Xho I或(2)分别为5单位和25单位的Asc I和Apa I，并对其进行使用TAE缓冲液的1％琼脂糖凝胶电泳。将凝胶中的DNA用一次在0.25N HCl中的10分钟洗涤来去嘌呤，用两次在0.5NNaOH-1.5M NaCl中的15分钟洗涤来变性，用一次在1M Tris pH8-1.5MNaCl中的30分钟洗涤来中和，并在20X SSC中温育5分钟。将DNA使用TURBOBLOTTERTMSystem依照生产商的实验方案转移至
Figure BDA0000496198300000766
Supercharge膜。将DNA使用STRATALINKERTMUV Crosslinker UV交联至膜，并在42℃在20ml的DIG Easy Hyb中预杂交1小时。
杂交于ku70编码序列的3’端的探针使用PCR Dig Probe Synthesis Kit(Roche Diagnostics Corporation，Indianapolis，IN，USA)根据生产商的指示用下示的正向和反向引物来生成。为了生成纯模板以供探针PCR反应，将ku70编码序列的3’端从里氏木霉981-O-8基因组DNA扩增。所述PCR反应由1X
Figure BDA0000496198300000761
High-Fidelity Hot Start DNA Polymerase Buffer，各1μM的引物，各200μM的dNTP，165ng的里氏木霉981-O-8基因组DNA，和1.0单位的
Figure BDA0000496198300000762
High-Fidelity Hot Start DNA Polymerase构成。扩增反应物在
Figure BDA0000496198300000763
5333epgradient S中温育，其程序如下：1个循环，在98℃进行30秒；35个循环，每循环在98℃进行10秒，60℃进行30秒，和72℃进行15秒；和1个循环，在72℃进行10分钟。
正向引物：
5’-gcatatataacccactcaagta-3’(SEQ ID NO:77)
反向引物：
5’-attatcttggaccggccgcagg-3’(SEQ ID NO:78)
将0.5kb探针木板通过使用TAE缓冲液的1％琼脂糖凝胶电泳纯化并从凝胶切出，并使用
Figure BDA0000496198300000764
Gel Extraction Kit提取。将纯化的PCR产物用于使用如上所指示的引物和扩增条件如生产商的指示生成DIG标记的探针。将0.5kb DIG标记的探针通过使用TAE缓冲液的1％琼脂糖凝胶电泳纯化并从凝胶切出，并使用
Figure BDA0000496198300000765
Gel Extraction Kit提取。将探针煮沸5分钟，在冰上冷却2分钟，并添加至10ml的DIG Easy Hyb以产生杂交溶液。杂交在42℃进行15至17小时。然后将膜在低严格条件下在2X SSC加0.1％SDS中在室温洗涤5分钟，接着进行在0.5X SSC加0.1％SDS中在65℃的两次高严格性洗涤，每次15分钟。探针-靶杂交通过化学发光测定(RocheDiagnostics，Indianapolis，IN，USA)依照生产商的指示来检测。Southern分析指示所有孢子分离株在ku70基因座含有修复/替代盒，并消除了hpt和tk标志物。选择了一个命名为里氏木霉981-O-8.5#10B+Ku70#19L3的菌株进行进一步转化。
实施例9：烟曲霉GH61B多肽基因的克隆
使用几种已知的GH61多肽，包括桔橙嗜热子囊菌(Thermoascusaurantiacus)GH61A多肽(GeneSeqP登录号AEC05922)作为查询项(query)进行了对烟曲霉部分基因座序列的tblastn检索(Altschul等，1997，Nucleic Acids Res.25：3389-3402)(The Institute for Genomic Research，Rockville，MD，USA)。基于在氨基酸水平与查询序列的高度相似性，将几个基因鉴定为推定的GH61家族同源物。选择一个与桔橙嗜热子囊菌GH61A多肽序列在氨基酸水平具有大于70％序列同一性的大约850bp的基因组区进行进一步研究。
将烟曲霉NN051616如美国专利号7,244,605中所述生长和收获。将冻结的菌丝体通过杵和研钵磨碎至细微粉末，且基因组DNA使用PlantMaxi Kit根据生产商的指示来分离。
设计了两个下示的合成寡核苷酸引物以从基因组DNA PCR扩增烟曲霉家族GH61B多肽编码序列。使用
Figure BDA0000496198300000772
Cloning Kit(Clontech，PaloAlto，CA，USA)将片段直接克隆入表达载体pAlLo2(WO2004/099228)，而无需限制性消化和连接。
正向引物：
5’-ACTGGATTTACCATGACTTTGTCCAAGATCACTTCCA-3'(SEQ ID NO:79)
反向引物：
5’-TCACCTCTAGTTAATTAAGCGTTGAACAGTGCAGGACCAG-3’(SEQ ID NO:80)
粗体字母代表编码序列。剩余序列与pAlLo2的***位点同源。
将五十皮摩尔的每种上述引物用于PCR反应，所述反应由204ng的烟曲霉基因组DNA，1X Pfx Amplification Buffer(Invitrogen，Carlsbad，CA，USA)，1.5μl的10mM dATP、dTTP、dGTP和dCTP共混物，2.5单位的
Figure BDA0000496198300000773
Pfx DNA Polymerase(Invitrogen Corp.，Carlsbad，CA，USA)，和1μl的50mMMgSO4构成，最终体积为50μl。扩增使用
Figure BDA0000496198300000774
5333epgradient S进行，其程序如下：1个循环，在94℃进行3分钟；和30个循环，每循环在94℃进行30秒，56℃进行30秒，和72℃进行1分钟。加热块然后在72℃维持15分钟，接着进行4℃浸泡循环。将反应产物通过使用TAE缓冲液的1.0％琼脂糖凝胶电泳分离，其中将大约850bp的产物条带从凝胶切出，并使用
Figure BDA0000496198300000775
Gel Extraction Kit根据生产商的指示纯化。
然后将850bp片段使用
Figure BDA0000496198300000781
Cloning Kit克隆入pAlLo2。将质粒pAlLo2用Nco I和Pac I消化。质粒片段通过如上所述的凝胶电泳和
Figure BDA0000496198300000782
Gel Purification Kit纯化。将基因片段和消化的载体在如下所述的反应中合并在一起，得到表达质粒pAG43(图4)，其中烟曲霉GH61B多肽编码序列的转录处于NA2-tpi启动子的调控下。NA2-tpi启动子是来自黑曲霉中性α-淀粉酶基因的修饰的启动子，其中未翻译的前导序列被来自构巢曲霉丙糖磷酸异构酶基因的未翻译的前导序列所替代。重组反应(20μl)由1X
Figure BDA0000496198300000783
Reaction Buffer，1X BSA(Clontech，Palo Alto，CA，USA)，1μl的
Figure BDA0000496198300000784
Enzyme(1:10稀释)，166ng的用Nco I和Pac I消化的pAlLo2，和110ng的所述烟曲霉GH61B多肽纯化的PCR产物构成。将反应在37℃进行15分钟，接着在50℃进行15分钟。将反应物用40μl的10mM Tris-0.1MEDTA缓冲液稀释，并将2.5μl的稀释的反应物用于转化大肠杆菌XL10
Figure BDA0000496198300000785
Gold感受态细胞(Stratagene，La Jolla，CA，USA)。通过限制性酶消化鉴定出了含有pAG43(GH61B多肽编码序列)的大肠杆菌转化体，并使用
Figure BDA0000496198300000786
9600(QIAGEN Inc.，Valencia，CA，USA)制备质粒DNA。
所述862bp PCR片段的DNA测序用Applied Biosystems Model377XLAutomated DNA Sequencer(Applied Biosystems，Carlsbad，CA，USA)使用染料终止子化学(Giesecke等，1992，Journal of Virology Methods38：47-60)和引物步移策略进行。使用下述载体特异性引物进行测序：
pAllo25Seq：
5'-TGTCCCTTGTCGATGCG3'(SEQ ID NO:81)
pAllo23Seq：
5'-CACATGACTTGGCTTCC3'(SEQ ID NO:82)
就品质审视了核苷酸序列数据，并将所有序列在PHRED/PHRAP软件(University of Washington，Seattle，WA，USA)的协助下相互比较。
基于编码的蛋白与桔橙嗜热子囊菌GH61A蛋白(GeneSeqP登录号AEC05922)的相似性构建了针对烟曲霉序列的基因模型。烟曲霉GH61B多肽编码序列的核苷酸序列和推导的氨基酸序列分别示于SEQ ID NO:7和SEQID NO:8。基因组片段编码250个氨基酸的多肽，由53和56bp的2个内含子中断。编码序列和成熟编码序列的％G+C含量分别为53.9％和57％。使用SignalP软件程序(Nielsen等，1997，Protein Engineering10：1-6)，预测了21个残基的信号肽。预期的成熟蛋白含有221个氨基酸，具有23.39kDa的预期的分子量。
实施例10：用于表达烟曲霉GH61B多肽的pSMai214的构建
所述烟曲霉GH61B多肽编码序列从质粒pAG43(实施例9)使用下示的基因特异性正向和反向引物扩增。斜体区域代表与反应的***位点同源的载体。
正向引物：
5'-GGACTGCGCACCATGACTTTGTCCAAGATCACTTCCA-3'(SEQ ID NO:83)
反向引物：
5'-GCCACGGAGCTTAATTAATTAAGCGTTGAACAGTGCAG-3'(SEQ ID NO:84)
将五十皮摩尔的每种上述引物用于PCR反应，所述反应由10ng的pAG43DNA，1X Pfx Amplification Buffer，1.5μl的10mM dATP、dTTP、dGTP和dCTP共混物，2.5单位的
Figure BDA0000496198300000792
Pfx DNA Polymerase，和1μl的50mMMgSO4构成，最终体积为50μl。扩增使用
Figure BDA0000496198300000793
5333epgradient S进行，其程序如下：1个循环，在98℃进行3分钟；和30个循环，每循环在98℃进行30秒，56℃进行30秒，和72℃进行1分钟。加热块然后在72℃维持15分钟。PCR产物通过使用TAE缓冲液的1％琼脂糖凝胶电泳分离，其中大约0.9kb片段从凝胶切出并使用
Figure BDA0000496198300000794
GelExtraction Kit依照生产商的实验方案提取。
将质粒pMJ09(WO2005/047499)用Nco I和Pac I消化，通过1mM EDTA二钠盐-50mM Tris碱-50mM硼酸(TBE)缓冲液中的1.0％琼脂糖凝胶电泳分离，从凝胶切出，并使用
Figure BDA0000496198300000795
Gel Extraction Kit根据生产商的指示提取。
将所述0.9kb PCR产物使用
Figure BDA0000496198300000796
PCR Cloning Kit(Clontech，Palo Alto，CA，USA)依照生产商的实验方案***经凝胶纯化、Nco I/Pac I消化的pMJ09。所述
Figure BDA0000496198300000797
反应由1X
Figure BDA0000496198300000798
Reaction Buffer，100ng的经凝胶纯化、Nco I/Pac I消化的pMJ09，37ng的0.9kb PCR产物，2μl的500μg/ml BSA，和1μl的Enzyme构成，反应体积为20μl。将所述反应在37℃温育15分钟和在50℃温育15分钟。在温育期之后，将30μl的TE缓冲液添加至反应。将2.5μl等分试样用于依照生产商的实验方案转化
Figure BDA00004961983000007910
Gold Supercompetent Cells。转化体通过测序筛选，并鉴定了一个含有不具有PCR错误的***物的克隆，并命名为pSMai214(图5)。质粒pSMai214可用Pme I消化以生成大约5.4kb片段以供里氏木霉转化。所述5.4kb片段含有由里氏木霉Cel7A纤维二糖水解酶I基因启动子，烟曲霉GH61B多肽编码序列，里氏木霉Cel7A纤维二糖水解酶I基因终止子，和构巢曲霉乙酰胺酶(amdS)基因构成的表达盒。
实施例11：用于表达烟曲霉CEL3Aβ-葡糖苷酶和烟曲霉GH61Ｂ多肽的串联构建体pDM287的构建
烟曲霉GH61B多肽表达盒从质粒pSMai214使用下示的基因特异性正向和反向引物扩增。斜体区域代表与
Figure BDA0000496198300000801
反应的***位点同源的载体。
正向引物：
5’-CGCGGTAGTGGCGCGGTCGACCGAATGTAGGATTGTT-3'(SEQ ID NO:85)
反向引物：
5'-TTACCAATTGGCGCGCCACTACCGCGTTCGAGAAGA-3'(SEQ ID NO:86)
将五十皮摩尔的每种上述引物用于PCR反应，所述反应由25ng的pSMai214DNA，1X PHUSIONTMHigh-Fidelity Hot Start DNA PolymeraseBuffer，1μl的10mM dATP、dTTP、dGTP和dCTP共混物，和1单位的PHUSIONTMHigh-Fidelity Hot Start DNA Polymerase构成，最终体积为50μl扩增使用
Figure BDA0000496198300000802
5333epgradient S进行，其程序如下：1个循环，在98℃进行30秒；35个循环，每循环在98℃进行10秒，60℃进行30秒，和72℃进行1分钟30秒；和1个循环，在72℃进行10分钟。PCR产物通过使用TAE缓冲液的0.8％琼脂糖凝胶电泳分离，其中大约2.33kb片段从凝胶切出并使用
Figure BDA0000496198300000803
Extract II Kit(Macherey-Nagel，Inc.，Bethlehem，PA，USA)依照生产商的实验方案提取。
将大约2.3kb PCR产物使用
Figure BDA0000496198300000804
Advantage PCR Cloning Kit依照生产商的实验方案***Asc I-消化的pEJG107(WO2005/047499)。质粒pEJG107包含烟曲霉CEL3Aβ-葡糖苷酶编码序列(SEQ ID NO:5[DNA序列]和SEQ ID NO:6[推导的氨基酸序列])。所述
Figure BDA0000496198300000805
反应由1X
Figure BDA0000496198300000806
ReactionBuffer，125ng的Asc I-消化的pEJG107，90ng的2.33kb PCR产物，和1μl的
Figure BDA0000496198300000807
Enzyme构成，反应体积为10μl。将反应在37℃温育15分钟，接着在50℃温育15分钟。在温育期之后将40μl的TE添加至反应。将2μl等分试样用于依照生产商的实验方案转化ONETOP10感受态细胞。将大肠杆菌转化反应物铺板于2XYT加氨苄青霉素平板上。通过测序筛选转化体，并鉴定出了一个含有不具有PCR错误的***物的克隆，并命名为pDM287(图6)。质粒pDM287可用Pme I消化以生成大约9.9kb片段以供里氏木霉转化。所述9.9kb片段含有两个表达盒，所述表达盒由下述构成：(1)里氏木霉Cel7A纤维二糖水解酶I基因启动子，烟曲霉CEL3Aβ-葡糖苷酶编码序列，和里氏木霉Cel7A纤维二糖水解酶I基因终止子；和(2)里氏木霉Cel7A纤维二糖水解酶I基因启动子，烟曲霉GH61B多肽编码序列，和里氏木霉Cel7A纤维二糖水解酶I基因终止子。所述9.9kb片段亦含有构巢曲霉乙酰胺酶(amdS)基因。
实施例12：烟曲霉β-葡糖苷酶和GH61B多肽在ku70+烟曲霉cbh1和cbh2替代菌株里氏木霉981-O-8.5#10B+Ku70#19L3中的表达
为了表达烟曲霉β-葡糖苷酶和烟曲霉GH61B多肽，将里氏木霉菌株981-O-8.5#10B+Ku70#19L3(描述于实施例8)的原生质体如实施例2中所述生成，并用2μg的Pme I直链化的pDM287转化。为了转化，将100μl的原生质体转移至14ml聚丙烯管，并向其添加2μg的经Pme I直链化、凝胶纯化的pDM287。添加二百五十μl的PEG缓冲液，并通过将管通过倒置6次轻柔地混合。将管在34℃温育30分钟，之后添加了3ml的STC。将管的内容物分开并铺板于两个不同的150mm直径COVE平板，并在28℃温育11日。转化体使用灭菌的1μl接种环挑取，并转移至新鲜的75mm直径COVE2+10mM尿苷平板，并在28℃温育6日。
将转化体各自在摇瓶中生长，即用使用10μl接种环收集的孢子接种125ml聚碳酸酯不带挡板的摇瓶中的25ml的CIM培养基。将瓶在28℃在200rpm振荡下温育5日。通过将整个培养物倾入50ml锥底管并在
Figure BDA0000496198300000812
LegendRT+浮桶离心机(swing-bucket centrifuge)(Thermo Fisher Scientific，Waltham，MA，USA)中以2500rpm将样品离心15分钟来收获摇瓶。将十ml的每份上清转移至15ml的锥底管。将五μl的上清与5μl含5％β-巯基乙醇(SigmaAldrich，St.Louis，MO，USA)的Laemelli样品缓冲液(Bio-Rad Laboratories，Hercules，CA，USA)在0.2ml微离心管中合并，并在
Figure BDA0000496198300000813
Figure BDA0000496198300000814
5333epgradient S中在95℃煮沸5分钟。样品通过使用
Figure BDA0000496198300000815
8-16％Tris-HCl Gel(Bio-Rad Laboratories，Hercules，CA，USA)的SDS-PAGE根据生产商的指示使用10μl的PRECISION PLUSTMAll BlueProtein Standards(Bio-Rad Laboratories，Hercules，CA，USA)进行分析。凝胶使用BIO-SAFETMCoomassie(Bio-Rad Laboratories，Hercules，CA，USA)染色和脱色。基于烟曲霉β-葡糖苷酶和烟曲霉GH61B多肽的高表达选择了一个菌株(里氏木霉JfyS-DM287-23)。将十ml的里氏木霉JfyS-DM287-23摇瓶培养液使用灭菌的30ml注射器和
Figure BDA0000496198300000821
GP0.22μm注射器式滤器(Millipore，Bedford，MA，USA)灭菌，转移至新的15ml锥形管，并储藏于-20℃。蛋白浓度使用Microplate BCATMProtein Assay Kit(Thermo Fischer Scientific，Waltham，MA，USA)确定，其中使用牛血清白蛋白作为蛋白标样。
实施例13：经预处理的玉米秸秆水解测定
将玉米秸秆在U.S.Department of Energy National Renewable EnergyLaboratory(美国能源部国家可再生能源实验室)(NREL)使用1.4wt％硫酸在165℃和107psi预处理8分钟。预处理的玉米秸秆(PCS)中的不溶于水的固形物含有56.5％纤维素，4.6％半纤维素和28.4％木质素。通过两阶段硫酸水解，接着通过使用NREL标准分析程序(Standard Analytical Procedure)#002的高效液相色谱分析糖来测定纤维素和半纤维素。木质素在用硫酸水解纤维素和半纤维素级分之后使用NREL标准分析程序#003以重量分析法确定。
经磨制、未经洗涤的PCS(干重量32.35％)通过在Cosmos ICMG40湿式多用途研磨机(EssEmm Corporation,Tamil Nadu，India)中磨制全浆料PCS来制备。
PCS的水解使用2.2ml深孔板(Axygen，Union City，CA，USA)在1.0ml的总反应体积中进行。水解用50mg的不溶性PCS固体每ml的含有1mM硫酸锰的50mM乙酸钠pH5.0缓冲液和多种蛋白加载量的多种酶组合物(表示为mg蛋白每克纤维素)进行。制备酶组合物，然后以50μl至200μl范围的体积同时添加至所有孔，至每个反应中1ml的终体积。然后使用ALPS-300TM平板热密封器(Abgene，Epsom,United Kingdom)密封平板，充分混合，并在特定温度温育72小时。所有报道的反应重复三次进行。
在水解之后，使用0.45μm96孔过滤板(Millipore，Bedford，MA，USA)过滤样品，然后如后文所述分析滤过物的糖含量。当不立即使用时，将过滤的等分试样冷冻于-20℃。如下测量稀释于0.005M H2SO4的样品的糖浓度：使用4.6x250mm
Figure BDA0000496198300000823
HPX-87H柱(Bio-RadLaboratories，Inc.，Hercules，CA，USA)通过在65℃用0.05％w/w苯甲酸-0.005M H2SO4以0.6ml每分钟的流速洗脱，并通过从由纯糖样品校正的折光率检测(
Figure BDA0000496198300000831
1100HPLC，Agilent Technologies，SantaClara，CA，USA)对所得的葡萄糖、纤维二糖和木糖信号的积分来进行定量。使用所得的葡萄糖和纤维二糖当量对于每个反应计算纤维素转化的百分比。
分别测量葡萄糖、纤维二糖和木糖。根据合适的稀释因子调整测得的糖浓度。在未洗涤的PCS的情况下，酶法产生的糖的净浓度通过就在零时点未洗涤的PCS中相应的背景糖浓度调整测得的糖浓度来确定。所有HPLC数据处理均使用MICROSOFT EXCELTM软件(Microsoft，Richland，WA，USA)进行。
使用下式计算纤维素转化为葡萄糖的程度：％转化＝(葡萄糖浓度/限制消化中的葡萄糖浓度)x100。为了计算％转化，基于纤维素酶对照(100mg的里氏木霉纤维素酶每克纤维素)设定100％转化点，并将所有值除以该数值并接着乘以100。将三次重复数据点取平均值，并计算标准偏差。
实施例14：米曲霉β-葡糖苷酶的制备
米曲霉β-葡糖苷酶(SEQ ID NO:87[DNA序列]和SEQ ID NO:88[推导的氨基酸序列])根据WO02/095014使用米曲霉作为宿主重组制备。
将米曲霉β-葡糖苷酶的过滤的培养液使用配置有10kDa聚醚砜膜(PallFiltron，Northborough，MA，USA)的切线流浓缩器(Pall Filtron，Northborough，MA，USA)浓缩用20mM Tris-HCl pH8.0缓冲液交换。将经缓冲液交换的样品加载于用20mM Tris-HCl pH8.0平衡的
Figure BDA0000496198300000832
柱(GE Healthcare，Piscataway，NJ，USA)上，并将结合的蛋白用0至1000mM氯化钠的线性梯度洗脱。将蛋白级分汇集并使用10kDa MW-CO Amicon Ultra离心浓缩器(Millipore，Bedford，MA，USA)浓缩入20mM Tris-HCl pH8.0。蛋白浓度使用BCATMProtein Assay Kit确定，以牛血清白蛋白作为蛋白标样。
实施例15：烟曲霉酶组合物的制备
烟曲霉Cel7A纤维二糖水解酶I的制备。烟曲霉Cel7A纤维二糖水解酶I(SEQ ID NO:1[DNA序列]和SEQ ID NO:2[推导的氨基酸序列])如WO2011/057140中所述在米曲霉中重组制备。烟曲霉Cel7A纤维二糖水解酶I根据WO2011/057140纯化。
烟曲霉纤维二糖水解酶II的制备。烟曲霉GH6A纤维二糖水解酶II(SEQID NO:3[DNA序列]和SEQ ID NO:4[推导的氨基酸序列])如WO2011/057140中所述在米曲霉中重组制备。将烟曲霉GH6A纤维二糖水解酶II的经过滤的培养液使用400ml SEPHADEXTMG-25柱(GE Healthcare，UnitedKingdom)根据生产商的指示缓冲液交换入20mM Tris pH8.0。将级分收集、汇集，并调整至1.2M硫酸铵-20mM Tris pH8.0。将经平衡的蛋白加载于平衡于含1.2M硫酸铵的20mM Tris pH8.0中的PHENYL SEPHAROSETM6Fast Flow柱(高端(high sub))(GE Healthcare，Piscataway，NJ，USA)之上，且结合的蛋白用不含硫酸铵的20mM Tris pH8.0洗脱。将级分汇集。
烟曲霉菌株GH5内切葡聚糖酶II的制备。烟曲霉GH5内切葡聚糖酶II(SEQ ID NO:11[DNA序列]和SEQ ID NO:12[推导的氨基酸序列])如WO2011/057140中所述在米曲霉中重组制备。烟曲霉GH5内切葡聚糖酶II根据WO2011/057140纯化。
具有纤维素分解增强活性的烟曲霉GH61B多肽的制备。具有纤维素分解增强活性的烟曲霉GH61B多肽(SEQ ID NO:7[DNA序列]和SEQ ID NO:8[推导的氨基酸序列])如WO2011/057140中所述在米曲霉中重组制备。具有纤维素分解增强活性的烟曲霉GH61B多肽根据WO2011/057140纯化。
烟曲霉GH10木聚糖酶的制备。烟曲霉GH10木聚糖酶(xyn3)(SEQ ID NO:17[DNA序列]和SEQ ID NO:18[推导的氨基酸序列])根据WO2006/078256使用米曲霉BECh2(WO2000/39322)作为宿主重组制备。将烟曲霉NN055679GH10木聚糖酶(xyn3)的经过滤的培养液使用
Figure BDA0000496198300000841
26/10DesaltingColumn根据生产商的指示脱盐和缓冲液交换入50mM乙酸钠pH5.0。
烟曲霉Cel3Aβ-葡糖苷酶的制备。烟曲霉Cel3Aβ-葡糖苷酶(SEQ ID NO:5[DNA序列]和SEQ ID NO:6[推导的氨基酸序列])根据WO2005/047499使用米曲霉作为宿主重组制备。将烟曲霉Cel3Aβ-葡糖苷酶的经过滤的培养液使用配置有10kDa聚醚砜膜的切线流浓缩器浓缩并用20mM Tris-HCl pH8.5缓冲液交换。将样品加载于平衡于20mM Tris pH8.5中的Q
Figure BDA0000496198300000842
HighPerformance柱(GE Healthcare，Piscataway，NJ，USA)上，且结合的蛋白用0至600mM氯化钠的线性梯度洗脱。将级分浓缩并加载于用20mM Tris-150mM氯化钠pH8.5平衡的
Figure BDA0000496198300000843
75HR26/60柱上。或者，将经过滤的培养液用20％乙酸钠调整至pH8.0，这使得溶液浑浊。为了去除浑浊，将溶液在20,000x g离心20分钟，并将上清经过0.2μm过滤单元(Nalgene，Rochester，NY，USA)过滤。将滤过物用去离子水稀释以达到与50mM Tris/HCl，pH8.0相同的电导率。将经调整的酶溶液施于在50mM Tris-HCl，pH8.0中平衡的Q
Figure BDA0000496198300000851
Fast Flow柱(GE Healthcare，Piscataway，NJ，USA)，并用0至500mM氯化钠的线性梯度洗脱。将级分汇集，并用1％(w/v)活性炭处理以从β-葡糖苷酶汇集物去除颜色。所述炭通过将悬液经过0.2μm过滤单元(Nalgene，Rochester，NY，USA)过滤来去除。将滤过物用20％乙酸调整至pH5.0，并用去离子水稀释10倍。将经调整的滤过物施于在10mM琥珀酸pH5.0中平衡的SP
Figure BDA0000496198300000852
Fast Flow柱(GE Healthcare，Piscataway，NJ，USA)，并用0至500mM氯化钠的线性梯度洗脱。级分通过SDS-PAGE分析。将其中在考马斯染色的SDS-PAGE凝胶上仅发现一个条带的级分汇集作为纯化产物，并用于进一步实验。
烟曲霉菌株GH3β-木糖苷酶的制备。烟曲霉菌株GH3β-木糖苷酶(SEQID NO:19[DNA序列]和SEQ ID NO:20[推导的氨基酸序列])如WO2011/057140中所述在米曲霉中重组制备。烟曲霉菌株GH3β-木糖苷酶根据WO2011/057140纯化。
对于上述的每个单组分的蛋白浓度使用Microplate BCATMProtein AssayKit确定，其中将牛血清白蛋白用作蛋白标样。烟曲霉酶组合物由如上所述制备的每个单组分如下所述构成：37％烟曲霉Cel7A纤维二糖水解酶I，25％烟曲霉Cel6A纤维二糖水解酶II，10％烟曲霉Cel5A内切葡聚糖酶II，15％具有纤维素分解增强活性的烟曲霉GH61B多肽，5％烟曲霉GH10木聚糖酶(xyn3)，5％烟曲霉β-葡糖苷酶，和3％烟曲霉β-木糖苷酶。所述烟曲霉酶组合物在本文中命名为“烟曲霉酶组合物(单组分混合物)”。
实施例16：烟曲霉野生型组合物的表达
将烟曲霉菌株NN051616(EXT2007-00107)接种在PDA平板上，并在45℃避光温育4日。将数个菌丝体-PDA栓接种入含有100ml的NNCYP07-PCS培养基的500ml摇瓶中。将瓶在45℃在160rpm振荡下温育5日。将培养液使用0.45μm
Figure BDA0000496198300000853
Membrane(Millipore，Bedford，MA，USA)过滤。
将3ml体积的滤过物使用
Figure BDA0000496198300000854
10-DG脱盐柱(Bio-RadLaboratories，Inc.，Hercules，CA，USA)根据生产商的指示脱盐和缓冲液交换入50mM乙酸钠pH5.0。蛋白浓度通过SDS-PAGE光密度分析法使用
Figure BDA0000496198300000861
8-16％Tris-HCl Gel，用GELCODETMBlue Stain Reagent(Pierce，Rockford，IL，USA)染色，和通过ImageJ(National Institutes of Health，Bethesda，Maryland，USA)进行软件分析来确定。
所述烟曲霉酶组合物在本文中命名为“烟曲霉野生型酶组合物”。
实施例17：将表达烟曲霉酶的里氏木霉菌株的酶组合物与基于里氏木霉的纤维素酶组合物和烟曲霉酶组合物比较的PCS水解测定
将表达烟曲霉纤维二糖水解酶I，烟曲霉纤维二糖水解酶II，烟曲霉β-葡糖苷酶，和烟曲霉GH61B多肽的里氏木霉JfyS-DM287-23的酶组合物相对于基于里氏木霉的纤维素酶组合物(CELLUCLASTTM1.5L FG；NovozymesA/S，
Figure BDA0000496198300000863
Denmark，用5％米曲霉β-葡糖苷酶替代)，和烟曲霉酶组合物(单组分混合物)(实施例15)使用经磨制、未经洗涤的PCS在50℃进行评估。将结果与针对基于里氏木霉的纤维素酶组合物和烟曲霉酶组合物(单组分混合物)相比较。所有的组合物在2.0，4.0，和6.0mg蛋白g纤维素下使用。
测定如实施例13中所述进行。用5％经磨制、未经洗涤的PCS的1ml反应在含有1mM硫酸锰的50mM柠檬酸钠pH5.0缓冲液中进行72小时。所有反应进行一式三次，并设计在水解开始时的单次混合。
图7中所示的结果表明表达烟曲霉纤维二糖水解酶I，烟曲霉纤维二糖水解酶II，烟曲霉β-葡糖苷酶，和烟曲霉GH61B多肽的里氏木霉JfyS-DM287-23的酶组合物和烟曲霉酶组合物(单组分混合物)与基于里氏木霉的纤维素酶组合物相比，在所有三种加载情况下均产生显著较高的水解。此外，表达烟曲霉纤维二糖水解酶I，烟曲霉纤维二糖水解酶II，烟曲霉β-葡糖苷酶，和烟曲霉GH61B多肽的里氏木霉JfyS-DM287-23的酶组合物与烟曲霉酶组合物(单组分混合物)相比产生更高的水解。
实施例18：将烟曲霉野生型酶组合物与基于里氏木霉的纤维素酶组合物相比较的PCS水解测定
将烟曲霉野生型酶组合物(实施例16)与基于里氏木霉的纤维素酶组合物(CELLUCLASTTM1.5L FG；Novozymes A/S，
Figure BDA0000496198300000862
Denmark，用5％米曲霉β-葡糖苷酶替代)在50℃使用经磨制、未经洗涤的PCS进行比较。此外，将烟曲霉野生型酶组合物用5％烟曲霉β-葡糖苷酶替代。所述烟曲霉野生型酶组合物和基于里氏木霉的纤维素酶组合物在2.0，4.0，和6.0mg蛋白每g纤维素下使用，且用5％烟曲霉β-葡糖苷酶替代的烟曲霉野生型酶组合物在2.0和4.0mg蛋白每g纤维素下使用。
测定如实施例13中所述进行。用5％经磨制、未经洗涤的PCS的1ml反应在含有1mM硫酸锰的50mM柠檬酸钠pH5.0缓冲液中进行72小时。所有反应进行一式三次，并设计在水解开始时的单次混合。
图8中所示的结果表明基于里氏木霉的纤维素酶组合物与烟曲霉野生型酶组合物和用5％烟曲霉β-葡糖苷酶替代的烟曲霉野生型酶组合物相比，具有显著更高的水解。用烟曲霉β-葡糖苷酶对烟曲霉野生型组合物的替代显著增加纤维素水解至高于烟曲霉野生型组合物本身，但两种混合物与基于里氏木霉的纤维素酶组合物相比，均产生显著较少的水解。
本发明进一步通过下述编号段落描述。
[1]一种重组木霉属宿主细胞，其包含多核苷酸，所述多核苷酸编码(i)烟曲霉纤维二糖水解酶I；(ii)烟曲霉纤维二糖水解酶II；(iii)烟曲霉β-葡糖苷酶；和(iv)具有纤维素分解增强活性的烟曲霉GH61多肽；或其同源物。
[2]段1的重组木霉属宿主细胞，其中所述烟曲霉纤维二糖水解酶I或其同源物选自下组：(i)纤维二糖水解酶I，其包含或组成为SEQ ID NO:2的成熟多肽；(ii)纤维二糖水解酶I，其包含或组成为氨基酸序列，所述氨基酸序列与SEQ ID NO:2的成熟多肽具有至少70％，例如至少75％，至少80％，至少81％，至少82％，至少83％，至少84％，至少85％，至少86％，至少87％，至少88％，至少89％，至少90％，至少91％，至少92％，至少93％，至少94％，至少95％，至少96％，至少97％，至少98％，或至少99％序列同一性；(iii)纤维二糖水解酶I，其由多核苷酸编码，所述多核苷酸包含或组成为核苷酸序列，所述核苷酸序列与SEQ IDNO:1的成熟多肽编码序列具有至少70％，例如至少75％，至少80％，至少81％，至少82％，至少83％，至少84％，至少85％，至少86％，至少87％，至少88％，至少89％，至少90％，至少91％，至少92％，至少93％，至少94％，至少95％，至少96％，至少97％，至少98％，或至少99％序列同一性；和(iv)纤维二糖水解酶I，其由多核苷酸编码，所述多核苷酸在至少高严格条件，例如至少非常高严格条件下，与SEQ ID NO:1的成熟多肽编码序列或其全长互补链杂交。
[3]段1或2的重组木霉属宿主细胞，其中所述烟曲霉纤维二糖水解酶II或其同源物选自下组：(i)纤维二糖水解酶II，其包含或组成为SEQ ID NO:4的成熟多肽；(ii)纤维二糖水解酶II，其包含或组成为氨基酸序列，所述氨基酸序列与SEQ ID NO:4的成熟多肽具有至少70％，例如至少75％，至少80％，至少81％，至少82％，至少83％，至少84％，至少85％，至少86％，至少87％，至少88％，至少89％，至少90％，至少91％，至少92％，至少93％，至少94％，至少95％，至少96％，至少97％，至少98％，或至少99％序列同一性；(iii)纤维二糖水解酶II，其由多核苷酸编码，所述多核苷酸包含或组成为核苷酸序列，所述核苷酸序列与SEQ ID NO:3的成熟多肽编码序列具有至少70％，例如至少75％，至少80％，至少81％，至少82％，至少83％，至少84％，至少85％，至少86％，至少87％，至少88％，至少89％，至少90％，至少91％，至少92％，至少93％，至少94％，至少95％，至少96％，至少97％，至少98％，或至少99％序列同一性；和(iv)纤维二糖水解酶II，其由多核苷酸编码，所述多核苷酸在至少高严格条件，例如至少非常高严格条件下，与SEQ ID NO:3的成熟多肽编码序列或其全长互补链杂交。
[4]段1-3任一项的重组木霉属宿主细胞，其中所述烟曲霉β-葡糖苷酶或其同源物选自下组：(i)β-葡糖苷酶，其包含或组成为SEQ ID NO:6的成熟多肽；(ii)β-葡糖苷酶，其包含或组成为氨基酸序列，所述氨基酸序列与SEQ IDNO:6的成熟多肽具有至少70％，例如至少75％，至少80％，至少81％，至少82％，至少83％，至少84％，至少85％，至少86％，至少87％，至少88％，至少89％，至少90％，至少91％，至少92％，至少93％，至少94％，至少95％，至少96％，至少97％，至少98％，或至少99％序列同一性；(iii)β-葡糖苷酶，其由多核苷酸编码，所述多核苷酸包含或组成为核苷酸序列，所述核苷酸序列与SEQ ID NO:5的成熟多肽编码序列具有至少70％，例如至少75％，至少80％，至少81％，至少82％，至少83％，至少84％，至少85％，至少86％，至少87％，至少88％，至少89％，至少90％，至少91％，至少92％，至少93％，至少94％，至少95％，至少96％，至少97％，至少98％，或至少99％序列同一性；和(iv)β-葡糖苷酶，其由多核苷酸编码，所述多核苷酸在至少高严格条件，例如至少非常高严格条件下，与SEQ ID NO:5的成熟多肽编码序列或其全长互补链杂交。
[5]段1-4任一项的重组木霉属宿主细胞，其中所述具有纤维素分解增强活性的烟曲霉GH61多肽或其同源物选自下组：(i)具有纤维素分解增强活性的GH61多肽，其包含或组成为SEQ ID NO:8的成熟多肽；(ii)具有纤维素分解增强活性的GH61多肽，其包含或组成为氨基酸序列，所述氨基酸序列与SEQ ID NO:8的成熟多肽具有至少70％，例如至少75％，至少80％，至少81％，至少82％，至少83％，至少84％，至少85％，至少86％，至少87％，至少88％，至少89％，至少90％，至少91％，至少92％，至少93％，至少94％，至少95％，至少96％，至少97％序列同一性；(iii)具有纤维素分解增强活性的GH61多肽，其由多核苷酸编码，所述多核苷酸包含或组成为核苷酸序列，所述核苷酸序列与SEQ ID NO:7的成熟多肽编码序列具有至少70％，例如至少75％，至少80％，至少81％，至少82％，至少83％，至少84％，至少85％，至少86％，至少87％，至少88％，至少89％，至少90％，至少91％，至少92％，至少93％，至少94％，至少95％，至少96％，至少97％，至少98％，或至少99％序列同一性；和(iv)具有纤维素分解增强活性的GH61多肽，其由多核苷酸编码，所述多核苷酸在至少高严格条件，例如至少非常高严格条件下，与SEQ ID NO:7的成熟多肽编码序列或其全长互补链杂交。
[6]段1-5任一项的重组木霉属宿主细胞，其进一步包含一种或多种多核苷酸，所述多核苷酸编码一种或多种选自下组的酶：(i)烟曲霉内切葡聚糖酶I；(ii)烟曲霉内切葡聚糖酶II；(iii)烟曲霉木聚糖酶；(iv)烟曲霉β-木糖苷酶；和(v)烟曲霉膨胀素。
[7]段的重组木霉属宿主细胞6，其中所述烟曲霉内切葡聚糖酶I或其同源物选自下组：(i)内切葡聚糖酶I，其包含或组成为SEQ ID NO:10的成熟多肽；(ii)内切葡聚糖酶I，其包含或组成为氨基酸序列，所述氨基酸序列与SEQID NO:10的成熟多肽具有至少70％，例如至少75％，至少80％，至少81％，至少82％，至少83％，至少84％，至少85％，至少86％，至少87％，至少88％，至少89％，至少90％，至少91％，至少92％，至少93％，至少94％，至少95％，至少96％，至少97％，至少98％，或至少99％序列同一性；(iii)内切葡聚糖酶I，其由多核苷酸编码，所述多核苷酸包含或组成为核苷酸序列，所述核苷酸序列与SEQ ID NO:9的成熟多肽编码序列具有至少70％，例如至少75％，至少80％，至少81％，至少82％，至少83％，至少84％，至少85％，至少86％，至少87％，至少88％，至少89％，至少90％，至少91％，至少92％，至少93％，至少94％，至少95％，至少96％，至少97％，至少98％，或至少99％序列同一性；和(iv)内切葡聚糖酶I，其由多核苷酸编码，所述多核苷酸在至少高严格条件，例如至少非常高严格条件下，与SEQ ID NO:9的成熟多肽编码序列或其全长互补链杂交。
[8]段6或7的重组木霉属宿主细胞，其中所述烟曲霉内切葡聚糖酶II或其同源物选自下组：(i)烟曲霉内切葡聚糖酶II，其包含或组成为SEQ ID NO:12的成熟多肽；(ii)内切葡聚糖酶II，其包含或组成为氨基酸序列，所述氨基酸序列与SEQ ID NO:12的成熟多肽具有至少70％，例如至少75％，至少80％，至少81％，至少82％，至少83％，至少84％，至少85％，至少86％，至少87％，至少88％，至少89％，至少90％，至少91％，至少92％，至少93％，至少94％，至少95％，至少96％，至少97％，至少98％，或至少99％序列同一性；(iii)内切葡聚糖酶II，其由多核苷酸编码，所述多核苷酸包含或组成为核苷酸序列，所述核苷酸序列与SEQ ID NO:11的成熟多肽编码序列具有至少70％，例如至少75％，至少80％，至少81％，至少82％，至少83％，至少84％，至少85％，至少86％，至少87％，至少88％，至少89％，至少90％，至少91％，至少92％，至少93％，至少94％，至少95％，至少96％，至少97％，至少98％，或至少99％序列同一性；和(iv)内切葡聚糖酶II，其由多核苷酸编码，所述多核苷酸在至少高严格条件，例如至少非常高严格条件下，与SEQ ID NO:11的成熟多肽编码序列或其全长互补链杂交。
[9]段6-8任一项的重组木霉属宿主细胞，其中所述烟曲霉木聚糖酶或其同源物选自下组：(i)烟曲霉木聚糖酶，其包含或组成为SEQ ID NO:14，SEQID NO:16，或SEQ ID NO:18的成熟多肽；(ii)木聚糖酶，其包含或组成为氨基酸序列，所述氨基酸序列与SEQ ID NO:14，SEQ ID NO:16，或SEQ ID NO:18的成熟多肽具有至少70％，例如至少75％，至少80％，至少81％，至少82％，至少83％，至少84％，至少85％，至少86％，至少87％，至少88％，至少89％，至少90％，至少91％，至少92％，至少93％，至少94％，至少95％，至少96％，至少97％，至少98％，或至少99％序列同一性；(iii)木聚糖酶，其由多核苷酸编码，所述多核苷酸包含或组成为核苷酸序列，所述核苷酸序列与SEQ ID NO:13，SEQ ID NO:15，或SEQ ID NO:17的成熟多肽编码序列具有至少70％，例如至少75％，至少80％，至少81％，至少82％，至少83％，至少84％，至少85％，至少86％，至少87％，至少88％，至少89％，至少90％，至少91％，至少92％，至少93％，至少94％，至少95％，至少96％，至少97％，至少98％，或至少99％序列同一性；和(iv)木聚糖酶，其由多核苷酸编码，所述多核苷酸在至少高严格条件，例如至少非常高严格条件下，与SEQ ID NO:13，SEQ ID NO:15，或SEQ ID NO:17的成熟多肽编码序列；或其全长互补链杂交。
[10]段6-9任一项的重组木霉属宿主细胞，其中所述烟曲霉β-木糖苷酶或其同源物选自下组：(i)β-木糖苷酶，其包含或组成为SEQ ID NO:20的成熟多肽；(ii)β-木糖苷酶，其包含或组成为氨基酸序列，所述氨基酸序列与SEQID NO:20的成熟多肽具有至少70％，例如至少75％，至少80％，至少81％，至少82％，至少83％，至少84％，至少85％，至少86％，至少87％，至少88％，至少89％，至少90％，至少91％，至少92％，至少93％，至少94％，至少95％，至少96％，至少97％，至少98％，或至少99％序列同一性；(iii)β-木糖苷酶，其由多核苷酸编码，所述多核苷酸包含或组成为核苷酸序列，所述核苷酸序列与SEQ ID NO:19的成熟多肽编码序列具有至少70％，例如至少75％，至少80％，至少81％，至少82％，至少83％，至少84％，至少85％，至少86％，至少87％，至少88％，至少89％，至少90％，至少91％，至少92％，至少93％，至少94％，至少95％，至少96％，至少97％，至少98％，或至少99％序列同一性；和(iv)β-木糖苷酶，其由多核苷酸编码，所述多核苷酸在至少高严格条件，例如至少非常高严格条件下，与SEQ ID NO:19的成熟多肽编码序列或其全长互补链杂交。
[11]段6-10任一项的重组木霉属宿主细胞，其中所述烟曲霉膨胀素或其同源物选自下组：(i)膨胀素，其包含或组成为SEQ ID NO:22的成熟多肽；(ii)膨胀素，其包含或组成为氨基酸序列，所述氨基酸序列与SEQ ID NO:22的成熟多肽具有至少70％，例如至少75％，至少80％，至少81％，至少82％，至少83％，至少84％，至少85％，至少86％，至少87％，至少88％，至少89％，至少90％，至少91％，至少92％，至少93％，至少94％，至少95％，至少96％，至少97％，至少98％，或至少99％序列同一性；(iii)膨胀素，其由多核苷酸编码，所述多核苷酸包含或组成为核苷酸序列，所述核苷酸序列与SEQ ID NO:21的成熟多肽编码序列具有至少70％，例如至少75％，至少80％，至少81％，至少82％，至少83％，至少84％，至少85％，至少86％，至少87％，至少88％，至少89％，至少90％，至少91％，至少92％，至少93％，至少94％，至少95％，至少96％，至少97％，至少98％，或至少99％序列同一性；和(iv)膨胀素，其由多核苷酸编码，所述多核苷酸在至少高严格条件，例如至少非常高严格条件下，与SEQ ID NO:21的成熟多肽编码序列或其全长互补链杂交。
[12]段1-11任一项的重组木霉属宿主细胞，其选自下组：哈茨木霉(Trichoderma harzianum)、康宁木霉(Trichoderma koningii)、长枝木霉(Trichoderma longibrachiatum)、里氏木霉(Trichoderma reesei)和绿色木霉(Trichoderma viride)。
[13]段1-11任一项的重组木霉属宿主细胞，其为里氏木霉。
[14]段1-13任一项的重组木霉属宿主细胞，其中对于所述木霉属宿主为内源的一种或多种纤维素酶基因，一种或多种半纤维素酶基因，或其组合已失活。
[15]段14的重组木霉属宿主细胞，其中木霉属纤维二糖水解酶I基因或其同源物已失活。
[16]段15的重组木霉属宿主细胞，其中所述木霉属纤维二糖水解酶I基因编码SEQ ID NO:24的成熟多肽或其同源物。
[17]段16的重组木霉属宿主细胞，其中所述木霉属纤维二糖水解酶I基因同源物选自下组：(i)纤维二糖水解酶I，其包含或组成为氨基酸序列，所述氨基酸序列与SEQ ID NO:24的成熟多肽具有至少70％，例如至少75％，至少80％，至少81％，至少82％，至少83％，至少84％，至少85％，至少86％，至少87％，至少88％，至少89％，至少90％，至少91％，至少92％，至少93％，至少94％，至少95％，至少96％，至少97％，至少98％，或至少99％序列同一性；(ii)纤维二糖水解酶I，其由多核苷酸编码，所述多核苷酸包含或组成为核苷酸序列，所述核苷酸序列与SEQ ID NO:23的成熟多肽编码序列具有至少70％，例如至少75％，至少80％，至少81％，至少82％，至少83％，至少84％，至少85％，至少86％，至少87％，至少88％，至少89％，至少90％，至少91％，至少92％，至少93％，至少94％，至少95％，至少96％，至少97％，至少98％，或至少99％序列同一性；和(iii)纤维二糖水解酶I，其由多核苷酸编码，所述多核苷酸在至少高严格条件，例如至少非常高严格条件下，与SEQ ID NO:23的成熟多肽编码序列或其全长互补链杂交。
[18]段14-17任一项的重组木霉属宿主细胞，其中木霉属纤维二糖水解酶II基因或其同源物已失活。
[19]段18的重组木霉属宿主细胞，其中所述木霉属纤维二糖水解酶II基因编码SEQ ID NO:26的成熟多肽或其同源物。
[20]段19的重组木霉属宿主细胞，其中所述木霉属纤维二糖水解酶II基因同源物选自下组：(i)纤维二糖水解酶II，其包含或组成为氨基酸序列，所述氨基酸序列与SEQ ID NO:26的成熟多肽具有至少70％，例如至少75％，至少80％，至少81％，至少82％，至少83％，至少84％，至少85％，至少86％，至少87％，至少88％，至少89％，至少90％，至少91％，至少92％，至少93％，至少94％，至少95％，至少96％，至少97％，至少98％，或至少99％序列同一性；(ii)纤维二糖水解酶II，其由多核苷酸编码，所述多核苷酸包含或组成为核苷酸序列，所述核苷酸序列与SEQ ID NO:25的成熟多肽编码序列具有至少70％，例如至少75％，至少80％，至少81％，至少82％，至少83％，至少84％，至少85％，至少86％，至少87％，至少88％，至少89％，至少90％，至少91％，至少92％，至少93％，至少94％，至少95％，至少96％，至少97％，至少98％，或至少99％序列同一性；和(iii)纤维二糖水解酶II，其由多核苷酸编码，所述多核苷酸在至少高严格条件，例如至少非常高严格条件下，与SEQ ID NO:25的成熟多肽编码序列或其全长互补链杂交。
[21]段14-20任一项的重组木霉属宿主细胞，其中木霉属β-葡糖苷酶基因或其同源物已失活。
[22]段21的重组木霉属宿主细胞，其中所述木霉属β-葡糖苷酶基因编码SEQ ID NO:28的成熟多肽或其同源物。
[23]段22的重组木霉属宿主细胞，其中所述木霉属β-葡糖苷酶基因同源物选自下组：(i)β-葡糖苷酶，其包含或组成为氨基酸序列，所述氨基酸序列与SEQID NO:28的成熟多肽具有至少70％，例如至少75％，至少80％，至少81％，至少82％，至少83％，至少84％，至少85％，至少86％，至少87％，至少88％，至少89％，至少90％，至少91％，至少92％，至少93％，至少94％，至少95％，至少96％，至少97％，至少98％，或至少99％序列同一性；(ii)β-葡糖苷酶，其由多核苷酸编码，所述多核苷酸包含或组成为核苷酸序列，所述核苷酸序列与SEQ ID NO:27的成熟多肽编码序列具有至少70％，例如至少75％，至少80％，至少81％，至少82％，至少83％，至少84％，至少85％，至少86％，至少87％，至少88％，至少89％，至少90％，至少91％，至少92％，至少93％，至少94％，至少95％，至少96％，至少97％，至少98％，或至少99％序列同一性；和(iii)β-葡糖苷酶，其由多核苷酸编码，所述多核苷酸在至少高严格条件，例如至少非常高严格条件下，与SEQ ID NO:27的成熟多肽编码序列或其全长互补链杂交。
[24]段14-23任一项的重组木霉属宿主细胞，其中木霉属内切葡聚糖酶I基因或其同源物已失活。
[25]段24的重组木霉属宿主细胞，其中所述木霉属内切葡聚糖酶I基因编码的成熟多肽SEQ ID NO:30或其同源物。
[26]段25的重组木霉属宿主细胞，其中所述木霉属内切葡聚糖酶I基因同源物选自下组：(i)内切葡聚糖酶I，其包含或组成为氨基酸序列，所述氨基酸序列与SEQ ID NO:30的成熟多肽具有至少70％，例如至少75％，至少80％，至少81％，至少82％，至少83％，至少84％，至少85％，至少86％，至少87％，至少88％，至少89％，至少90％，至少91％，至少92％，至少93％，至少94％，至少95％，至少96％，至少97％，至少98％，或至少99％序列同一性；(ii)内切葡聚糖酶I，其由多核苷酸编码，所述多核苷酸包含或组成为核苷酸序列，所述核苷酸序列与SEQ ID NO:29的成熟多肽编码序列具有至少70％，例如至少75％，至少80％，至少81％，至少82％，至少83％，至少84％，至少85％，至少86％，至少87％，至少88％，至少89％，至少90％，至少91％，至少92％，至少93％，至少94％，至少95％，至少96％，至少97％，至少98％，或至少99％序列同一性；和(iii)内切葡聚糖酶I，其由多核苷酸编码，所述多核苷酸在至少高严格条件，例如至少非常高严格条件下，与SEQ ID NO:29的成熟多肽编码序列或其全长互补链杂交。
[27]段14-26任一项的重组木霉属宿主细胞，其中木霉属内切葡聚糖酶II基因或其同源物已失活。
[28]段27的重组木霉属宿主细胞，其中所述木霉属内切葡聚糖酶II基因编码SEQ ID NO:32的成熟多肽或其同源物。
[29]段28的重组木霉属宿主细胞，其中所述木霉属内切葡聚糖酶II基因同源物选自下组：(i)内切葡聚糖酶II，其包含或组成为氨基酸序列，所述氨基酸序列与SEQ ID NO:32的成熟多肽具有至少70％，例如至少75％，至少80％，至少81％，至少82％，至少83％，至少84％，至少85％，至少86％，至少87％，至少88％，至少89％，至少90％，至少91％，至少92％，至少93％，至少94％，至少95％，至少96％，至少97％，至少98％，或至少99％序列同一性；(ii)内切葡聚糖酶II，其由多核苷酸编码，所述多核苷酸包含或组成为核苷酸序列，所述核苷酸序列与SEQ ID NO:31的成熟多肽编码序列具有至少70％，例如至少75％，至少80％，至少81％，至少82％，至少83％，至少84％，至少85％，至少86％，至少87％，至少88％，至少89％，至少90％，至少91％，至少92％，至少93％，至少94％，至少95％，至少96％，至少97％，至少98％，或至少99％序列同一性；和(iii)内切葡聚糖酶II，其由多核苷酸编码，所述多核苷酸在至少高严格条件，例如至少非常高严格条件下，与SEQ ID NO:31的成熟多肽编码序列或其全长互补链杂交。
[30]段14-29任一项的重组木霉属宿主细胞，其中木霉属木聚糖酶I基因或其同源物已失活。
[31]段30的重组木霉属宿主细胞，其中所述木霉属木聚糖酶I基因编码SEQ ID NO:34的成熟多肽或其同源物。
[32]段31的重组木霉属宿主细胞，其中所述木霉属β-木聚糖酶I基因同源物选自下组：(i)木聚糖酶I，其包含或组成为氨基酸序列，所述氨基酸序列与SEQ ID NO:34的成熟多肽具有至少70％，例如至少75％，至少80％，至少81％，至少82％，至少83％，至少84％，至少85％，至少86％，至少87％，至少88％，至少89％，至少90％，至少91％，至少92％，至少93％，至少94％，至少95％，至少96％，至少97％，至少98％，或至少99％序列同一性；(ii)木聚糖酶I，其由多核苷酸编码，所述多核苷酸包含或组成为核苷酸序列，所述核苷酸序列与SEQ ID NO:33的成熟多肽编码序列具有至少70％，例如至少75％，至少80％，至少81％，至少82％，至少83％，至少84％，至少85％，至少86％，至少87％，至少88％，至少89％，至少90％，至少91％，至少92％，至少93％，至少94％，至少95％，至少96％，至少97％，至少98％，或至少99％序列同一性；和(iii)木聚糖酶I，其由多核苷酸编码，所述多核苷酸在至少高严格条件，例如至少非常高严格条件下，与SEQ ID NO:33的成熟多肽编码序列或其全长互补链杂交。
[33]段14-32任一项的重组木霉属宿主细胞，其中木霉属木聚糖酶II基因或其同源物已失活。
[34]段33的重组木霉属宿主细胞，其中所述木霉属木聚糖酶II基因编码SEQ ID NO:36的成熟多肽或其同源物。
[35]段34的重组木霉属宿主细胞，其中所述木霉属木聚糖酶II基因同源物选自下组：(i)木聚糖酶II，其包含或组成为氨基酸序列，所述氨基酸序列与SEQ ID NO:36的成熟多肽具有至少70％，例如至少75％，至少80％，至少81％，至少82％，至少83％，至少84％，至少85％，至少86％，至少87％，至少88％，至少89％，至少90％，至少91％，至少92％，至少93％，至少94％，至少95％，至少96％，至少97％，至少98％，或至少99％序列同一性；(ii)木聚糖酶II，其由多核苷酸编码，所述多核苷酸包含或组成为核苷酸序列，所述核苷酸序列与SEQ ID NO:35的成熟多肽编码序列具有至少70％，例如至少75％，至少80％，至少81％，至少82％，至少83％，至少84％，至少85％，至少86％，至少87％，至少88％，至少89％，至少90％，至少91％，至少92％，至少93％，至少94％，至少95％，至少96％，至少97％，至少98％，或至少99％序列同一性；和(iii)木聚糖酶II，其由多核苷酸编码，所述多核苷酸在至少高严格条件，例如至少非常高严格条件下，与SEQ ID NO:35的成熟多肽编码序列或其全长互补链杂交。
[36]段14-35任一项的重组木霉属宿主细胞，其中木霉属木聚糖酶III基因或其同源物已失活。
[37]段36的重组木霉属宿主细胞，其中所述木霉属木聚糖酶III基因编码SEQ ID NO:38的成熟多肽或其同源物。
[38]段37的重组木霉属宿主细胞，其中所述木霉属木聚糖酶III基因同源物选自下组：(i)木聚糖酶III，其包含或组成为氨基酸序列，所述氨基酸序列与SEQID NO:38的成熟多肽具有至少70％，例如至少75％，至少80％，至少81％，至少82％，至少83％，至少84％，至少85％，至少86％，至少87％，至少88％，至少89％，至少90％，至少91％，至少92％，至少93％，至少94％，至少95％，至少96％，至少97％，至少98％，或至少99％序列同一性；(ii)木聚糖酶III，其由多核苷酸编码，所述多核苷酸包含或组成为核苷酸序列，所述核苷酸序列与SEQ ID NO:37的成熟多肽编码序列具有至少70％，例如至少75％，至少80％，至少81％，至少82％，至少83％，至少84％，至少85％，至少86％，至少87％，至少88％，至少89％，至少90％，至少91％，至少92％，至少93％，至少94％，至少95％，至少96％，至少97％，至少98％，或至少99％序列同一性；和(iii)木聚糖酶III，其由多核苷酸编码，所述多核苷酸在至少高严格条件，例如至少非常高严格条件下，与SEQ ID NO:37的成熟多肽编码序列或其全长互补链杂交。
[39]段14-38任一项的重组木霉属宿主细胞，其中木霉属β-木糖苷酶基因或其同源物已失活。
[40]段39的重组木霉属宿主细胞，其中所述木霉属β-木糖苷酶基因编码SEQ ID NO:40的成熟多肽或其同源物。
[41]段40的重组木霉属宿主细胞，其中所述木霉属β-木糖苷酶基因同源物选自下组：(i)β-木糖苷酶，其包含或组成为氨基酸序列，所述氨基酸序列与SEQ ID NO:40的成熟多肽具有至少70％，例如至少75％，至少80％，至少81％，至少82％，至少83％，至少84％，至少85％，至少86％，至少87％，至少88％，至少89％，至少90％，至少91％，至少92％，至少93％，至少94％，至少95％，至少96％，至少97％，至少98％，或至少99％序列同一性；(ii)β-木糖苷酶，其由多核苷酸编码，所述多核苷酸包含或组成为核苷酸序列，所述核苷酸序列与SEQ ID NO:39的成熟多肽编码序列具有至少70％，例如至少75％，至少80％，至少81％，至少82％，至少83％，至少84％，至少85％，至少86％，至少87％，至少88％，至少89％，至少90％，至少91％，至少92％，至少93％，至少94％，至少95％，至少96％，至少97％，至少98％，或至少99％序列同一性；和(iii)β-木糖苷酶，其由多核苷酸编码，所述多核苷酸在至少高严格条件，例如至少非常高严格条件下，与SEQ ID NO:39的成熟多肽编码序列或其全长互补链杂交。
[42]段14-41任一项的重组木霉属宿主细胞，其中木霉属膨胀素基因或其同源物已失活。
[43]段42的重组木霉属宿主细胞，其中所述木霉属膨胀素基因编码SEQID NO:42的成熟多肽或其同源物。
[44]段43的重组木霉属宿主细胞，其中所述木霉属膨胀素基因同源物选自下组：(i)膨胀素，其包含或组成为氨基酸序列，所述氨基酸序列与SEQ ID NO:42的成熟多肽具有至少70％，例如至少75％，至少80％，至少81％，至少82％，至少83％，至少84％，至少85％，至少86％，至少87％，至少88％，至少89％，至少90％，至少91％，至少92％，至少93％，至少94％，至少95％，至少96％，至少97％，至少98％，或至少99％序列同一性；(ii)膨胀素，其由多核苷酸编码，所述多核苷酸包含或组成为核苷酸序列，所述核苷酸序列与SEQ ID NO:41的成熟多肽编码序列具有至少70％，例如至少75％，至少80％，至少81％，至少82％，至少83％，至少84％，至少85％，至少86％，至少87％，至少88％，至少89％，至少90％，至少91％，至少92％，至少93％，至少94％，至少95％，至少96％，至少97％，至少98％，或至少99％序列同一性；和(iii)膨胀素，其由多核苷酸编码，所述多核苷酸在至少高严格条件，例如至少非常高严格条件下，与SEQ ID NO:41的成熟多肽编码序列或其全长互补链杂交。
[45]一种产生酶组合物的方法，其包括：在有助于所述酶组合物产生的条件下培养段1-44任一项的宿主细胞。
[46]段45的方法，进一步包括回收所述酶组合物。
[47]一种酶组合物，其包含段1-44任一项的重组木霉属宿主细胞的回收的发酵液。
[48]段47的酶组合物，其具有移出的发酵液的一个或多个成分。
[49]段47的酶组合物，其不具有移出的发酵液的任何成分。
[50]一种降解纤维素材料的工艺，其包括用段47-49任一项所述酶组合物处理所述纤维素材料。
[51]段50的工艺，其中所述纤维素材料经预处理。
[52]段50或51的工艺，进一步包括回收降解的纤维素材料。
[53]段52的工艺，其中所述降解的纤维素材料是糖。
[54]段53的工艺，其中所述糖选自下组：葡萄糖，木糖，甘露糖，半乳糖，和***糖。
[55]一种用于产生发酵产物的工艺，其包括：(a)用段46-48任一项的酶组合物糖化纤维素材料；(b)用一种或多种发酵微生物发酵经糖化的纤维素材料以产生发酵产物；和(c)从发酵回收发酵产物。
[56]段55的工艺，其中所述纤维素材料经预处理。
[57]段55或56的工艺，其中步骤(a)和(b)在同步糖化和发酵中同时进行。
[58]段55-57任一项的工艺，其中所述发酵产物是醇、烷烃、环烷烃、烯烃、氨基酸、气体、异戊二烯、酮、有机酸或聚酮化合物。
[59]一种发酵纤维素材料的方法，其包括：用一种或多种发酵微生物发酵所述纤维素材料，其中所述纤维素材料事用段47-49任一项的酶组合物糖化的。
[60]段59的工艺，其中所述纤维素材料的发酵产生发酵产物。
[61]段60的工艺，进一步包括从发酵回收发酵产物。
[62]段60或61的工艺，其中所述发酵产物是醇、烷烃、环烷烃、烯烃、氨基酸、气体、异戊二烯、酮、有机酸或聚酮化合物。
[63]段59-62任一项的工艺，其中所述纤维素材料在糖化之前经预处理。
[64]段47-49的酶组合物，进一步包含木霉属内切葡聚糖酶I，木霉属内切葡聚糖酶II，或木霉属内切葡聚糖酶I和木霉属内切葡聚糖酶II。
[65]段64的酶组合物，其中所述木霉属木霉属内切葡聚糖酶I是里氏木霉内切葡聚糖酶I。
[66]段64的酶组合物，其中所述木霉属内切葡聚糖酶II是里氏木霉内切葡聚糖酶II。
本文描述和要求保护的本发明并不局限于本文公开的具体方面的范围内，因为这些方面旨在作为本发明几个方面的说明。旨在将任何等同的方面包含于本发明的范围内。实际上，从前面的说明中，除本文所显示和描述的之外，本发明的多种修改对于本领域的技术人员来说是显而易见的。这些修改也旨在落入所附的权利要求的范围内。在冲突的情况下，将以包括定义部分的本公开为准。
Figure IDA0000496198360000021
Figure IDA0000496198360000031
Figure IDA0000496198360000041
Figure IDA0000496198360000051
Figure IDA0000496198360000071
Figure IDA0000496198360000101
Figure IDA0000496198360000111
Figure IDA0000496198360000121
Figure IDA0000496198360000131
Figure IDA0000496198360000141
Figure IDA0000496198360000151
Figure IDA0000496198360000161
Figure IDA0000496198360000171
Figure IDA0000496198360000181
Figure IDA0000496198360000201
Figure IDA0000496198360000211
Figure IDA0000496198360000221
Figure IDA0000496198360000231
Figure IDA0000496198360000241
Figure IDA0000496198360000251
Figure IDA0000496198360000261
Figure IDA0000496198360000271
Figure IDA0000496198360000281
Figure IDA0000496198360000291
Figure IDA0000496198360000301
Figure IDA0000496198360000311
Figure IDA0000496198360000331
Figure IDA0000496198360000341
Figure IDA0000496198360000351
Figure IDA0000496198360000361
Figure IDA0000496198360000371
Figure IDA0000496198360000381
Figure IDA0000496198360000391
Figure IDA0000496198360000401
Figure IDA0000496198360000411
Figure IDA0000496198360000431
Figure IDA0000496198360000441
Figure IDA0000496198360000451
Figure IDA0000496198360000461
Figure IDA0000496198360000471
Figure IDA0000496198360000481
Figure IDA0000496198360000491
Figure IDA0000496198360000501
Figure IDA0000496198360000511
Figure IDA0000496198360000521
Figure IDA0000496198360000531
Figure IDA0000496198360000541
Figure IDA0000496198360000551

Claims (21)

1.一种重组木霉属宿主细胞，其包含多核苷酸，所述多核苷酸编码(i)烟曲霉纤维二糖水解酶I；(ii)烟曲霉纤维二糖水解酶II；(iii)烟曲霉β-葡糖苷酶；和(iv)具有纤维素分解增强活性的烟曲霉GH61多肽；或其同源物。
2.权利要求1的重组木霉属宿主细胞，其中所述烟曲霉纤维二糖水解酶I或其同源物选自下组：
(i)纤维二糖水解酶I，其包含或组成为SEQ ID NO:2的成熟多肽；
(ii)纤维二糖水解酶I，其包含或组成为氨基酸序列，所述氨基酸序列与SEQ ID NO:2的成熟多肽具有至少70％，至少75％，至少80％，至少81％，至少82％，至少83％，至少84％，至少85％，至少86％，至少87％，至少88％，至少89％，至少90％，至少91％，至少92％，至少93％，至少94％，至少95％，至少96％，至少97％，至少98％，或至少99％序列同一性；
(iii)纤维二糖水解酶I，其由多核苷酸编码，所述多核苷酸包含或组成为核苷酸序列，所述核苷酸序列与SEQ ID NO:1的成熟多肽编码序列具有至少70％，至少75％，至少80％，至少81％，至少82％，至少83％，至少84％，至少85％，至少86％，至少87％，至少88％，至少89％，至少90％，至少91％，至少92％，至少93％，至少94％，至少95％，至少96％，至少97％，至少98％，或至少99％序列同一性；和
(iv)纤维二糖水解酶I，其由多核苷酸编码，所述多核苷酸在至少高严格条件或至少非常高严格条件下，与SEQ ID NO:1的成熟多肽编码序列或其全长互补链杂交；
其中所述烟曲霉纤维二糖水解酶II或其同源物选自下组：
(i)纤维二糖水解酶II，其包含或组成为SEQ ID NO:4的成熟多肽；
(ii)纤维二糖水解酶II，其包含或组成为氨基酸序列，所述氨基酸序列与SEQ ID NO:4的成熟多肽具有至少70％，至少75％，至少80％，至少81％，至少82％，至少83％，至少84％，至少85％，至少86％，至少87％，至少88％，至少89％，至少90％，至少91％，至少92％，至少93％，至少94％，至少95％，至少96％，至少97％，至少98％，或至少99％序列同一性；
(iii)纤维二糖水解酶II，其由多核苷酸编码，所述多核苷酸包含或组成为核苷酸序列，所述核苷酸序列与SEQ ID NO:3的成熟多肽编码序列具有至少70％，至少75％，至少80％，至少81％，至少82％，至少83％，至少84％，至少85％，至少86％，至少87％，至少88％，至少89％，至少90％，至少91％，至少92％，至少93％，至少94％，至少95％，至少96％，至少97％，至少98％，或至少99％序列同一性；和
(iv)纤维二糖水解酶II，其由多核苷酸编码，所述多核苷酸在至少高严格条件或至少非常高严格条件下，与SEQ ID NO:3的成熟多肽编码序列或其全长互补链杂交；
其中所述烟曲霉β-葡糖苷酶或其同源物选自下组：
(i)β-葡糖苷酶，其包含或组成为SEQ ID NO:6的成熟多肽；
(ii)β-葡糖苷酶，其包含或组成为氨基酸序列，所述氨基酸序列与SEQ IDNO:6的成熟多肽具有至少70％，至少75％，至少80％，至少81％，至少82％，至少83％，至少84％，至少85％，至少86％，至少87％，至少88％，至少89％，至少90％，至少91％，至少92％，至少93％，至少94％，至少95％，至少96％，至少97％，至少98％，或至少99％序列同一性；
(iii)β-葡糖苷酶，其由多核苷酸编码，所述多核苷酸包含或组成为核苷酸序列，所述核苷酸序列与SEQ ID NO:5的成熟多肽编码序列具有至少70％，至少75％，至少80％，至少81％，至少82％，至少83％，至少84％，至少85％，至少86％，至少87％，至少88％，至少89％，至少90％，至少91％，至少92％，至少93％，至少94％，至少95％，至少96％，至少97％，至少98％，或至少99％序列同一性；和
(iv)β-葡糖苷酶，其由多核苷酸编码，所述多核苷酸在至少高严格条件或至少非常高严格条件下与SEQ ID NO:5的成熟多肽编码序列或其全长互补链杂交；和
其中所述烟曲霉具有纤维素分解增强活性的GH61多肽或其同源物选自下组：
(i)具有纤维素分解增强活性的GH61多肽，其包含或组成为SEQ ID NO:8的成熟多肽；
(ii)具有纤维素分解增强活性的GH61多肽，其包含或组成为氨基酸序列，所述氨基酸序列与SEQ ID NO:8的成熟多肽具有至少70％，至少75％，至少80％，至少81％，至少82％，至少83％，至少84％，至少85％，至少86％，至少87％，至少88％，至少89％，至少90％，至少91％，至少92％，至少93％，至少94％，至少95％，至少96％，至少97％序列同一性；
(iii)具有纤维素分解增强活性的GH61多肽，其由多核苷酸编码，所述多核苷酸包含或组成为核苷酸序列，所述核苷酸序列与SEQ ID NO:7的成熟多肽编码序列具有至少70％，至少75％，至少80％，至少81％，至少82％，至少83％，至少84％，至少85％，至少86％，至少87％，至少88％，至少89％，至少90％，至少91％，至少92％，至少93％，至少94％，至少95％，至少96％，至少97％，至少98％，或至少99％序列同一性；和
(iv)具有纤维素分解增强活性的GH61多肽，其由多核苷酸编码，所述多核苷酸在至少高严格条件或至少非常高严格条件下与SEQ ID NO:7的成熟多肽编码序列或其全长互补链杂交。
3.权利要求1或2的重组木霉属宿主细胞，其进一步包含一种或多种多核苷酸，所述多核苷酸编码一种或多种选自下组的酶：(i)烟曲霉内切葡聚糖酶I；(ii)烟曲霉内切葡聚糖酶II；(iii)烟曲霉木聚糖酶；(iv)烟曲霉β-木糖苷酶；和(v)烟曲霉膨胀素。
4.权利要求3的重组木霉属宿主细胞，其中所述烟曲霉内切葡聚糖酶I或其同源物选自下组：
(i)内切葡聚糖酶I，其包含或组成为SEQ ID NO:10的成熟多肽；
(ii)内切葡聚糖酶I，其包含或组成为氨基酸序列，所述氨基酸序列与SEQID NO:10的成熟多肽具有至少70％，至少75％，至少80％，至少81％，至少82％，至少83％，至少84％，至少85％，至少86％，至少87％，至少88％，至少89％，至少90％，至少91％，至少92％，至少93％，至少94％，至少95％，至少96％，至少97％，至少98％，或至少99％序列同一性；
(iii)内切葡聚糖酶I，其由多核苷酸编码，所述多核苷酸包含或组成为核苷酸序列，所述核苷酸序列与SEQ ID NO:9的成熟多肽编码序列具有至少70％，至少75％，至少80％，至少81％，至少82％，至少83％，至少84％，至少85％，至少86％，至少87％，至少88％，至少89％，至少90％，至少91％，至少92％，至少93％，至少94％，至少95％，至少96％，至少97％，至少98％，或至少99％序列同一性；和
(iv)内切葡聚糖酶I，其由多核苷酸编码，所述多核苷酸在至少高严格条件或至少非常高严格条件下与SEQ ID NO:9的成熟多肽编码序列或其全长互补链杂交；
其中所述烟曲霉内切葡聚糖酶II或其同源物选自下组：
(i)烟曲霉内切葡聚糖酶II，其包含或组成为SEQ ID NO:12的成熟多肽；
(ii)内切葡聚糖酶II，其包含或组成为氨基酸序列，所述氨基酸序列与SEQ ID NO:12的成熟多肽具有至少70％，至少75％，至少80％，至少81％，至少82％，至少83％，至少84％，至少85％，至少86％，至少87％，至少88％，至少89％，至少90％，至少91％，至少92％，至少93％，至少94％，至少95％，至少96％，至少97％，至少98％，或至少99％序列同一性；
(iii)内切葡聚糖酶II，其由多核苷酸编码，所述多核苷酸包含或组成为核苷酸序列，所述核苷酸序列与SEQ ID NO:11的成熟多肽编码序列具有至少70％，至少75％，至少80％，至少81％，至少82％，至少83％，至少84％，至少85％，至少86％，至少87％，至少88％，至少89％，至少90％，至少91％，至少92％，至少93％，至少94％，至少95％，至少96％，至少97％，至少98％，或至少99％序列同一性；和
(iv)内切葡聚糖酶II，其由多核苷酸编码，所述多核苷酸在至少高严格条件或至少非常高严格条件下与SEQ ID NO:11的成熟多肽编码序列或其全长互补链杂交；
其中所述烟曲霉木聚糖酶或其同源物选自下组：
(i)烟曲霉木聚糖酶，其包含或组成为SEQ ID NO:14，SEQ ID NO:16，或SEQ ID NO:18的成熟多肽；
(ii)木聚糖酶，其包含或组成为氨基酸序列，所述氨基酸序列与SEQ IDNO:14，SEQ ID NO:16，或SEQ ID NO:18的成熟多肽具有至少70％，至少75％，至少80％，至少81％，至少82％，至少83％，至少84％，至少85％，至少86％，至少87％，至少88％，至少89％，至少90％，至少91％，至少92％，至少93％，至少94％，至少95％，至少96％，至少97％，至少98％，或至少99％序列同一性；
(iii)木聚糖酶，其由多核苷酸编码，其包含或组成为核苷酸序列，所述核苷酸序列与SEQ ID NO:13，SEQ ID NO:15，或SEQ ID NO:17的成熟多肽编码序列具有至少70％，至少75％，至少80％，至少81％，至少82％，至少83％，至少84％，至少85％，至少86％，至少87％，至少88％，至少89％，至少90％，至少91％，至少92％，至少93％，至少94％，至少95％，至少96％，至少97％，至少98％，或至少99％序列同一性；和
(iv)木聚糖酶，其由多核苷酸编码，所述多核苷酸在至少高严格条件或至少非常高严格条件下与SEQ ID NO:13，SEQ ID NO:15，或SEQ ID NO:17的成熟多肽编码序列；或其全长互补链杂交；
其中所述烟曲霉β-木糖苷酶或其同源物选自下组：
(i)β-木糖苷酶，其包含或组成为SEQ ID NO:20的成熟多肽；
(ii)β-木糖苷酶，其包含或组成为氨基酸序列，所述氨基酸序列与SEQ IDNO:20的成熟多肽具有至少70％，至少75％，至少80％，至少81％，至少82％，至少83％，至少84％，至少85％，至少86％，至少87％，至少88％，至少89％，至少90％，至少91％，至少92％，至少93％，至少94％，至少95％，至少96％，至少97％，至少98％，或至少99％序列同一性；
(iii)β-木糖苷酶，其由多核苷酸编码，所述多核苷酸包含或组成为核苷酸序列，所述核苷酸序列与SEQ ID NO:19的成熟多肽编码序列具有至少70％，至少75％，至少80％，至少81％，至少82％，至少83％，至少84％，至少85％，至少86％，至少87％，至少88％，至少89％，至少90％，至少91％，至少92％，至少93％，至少94％，至少95％，至少96％，至少97％，至少98％，或至少99％序列同一性；和
(iv)β-木糖苷酶，其由多核苷酸编码，所述多核苷酸在至少高严格条件或至少非常高严格条件下与SEQ ID NO:19的成熟多肽编码序列或其全长互补链杂交；和
其中所述烟曲霉膨胀素或其同源物选自下组：
(i)膨胀素，其包含或组成为SEQ ID NO:22的成熟多肽；
(ii)膨胀素，其包含或组成为氨基酸序列，所述氨基酸序列与SEQ ID NO:22的成熟多肽具有至少70％，至少75％，至少80％，至少81％，至少82％，至少83％，至少84％，至少85％，至少86％，至少87％，至少88％，至少89％，至少90％，至少91％，至少92％，至少93％，至少94％，至少95％，至少96％，至少97％，至少98％，或至少99％序列同一性；
(iii)膨胀素，其由多核苷酸编码，所述多核苷酸包含或组成为核苷酸序列，所述核苷酸序列与SEQ ID NO:21的成熟多肽编码序列具有至少70％，至少75％，至少80％，至少81％，至少82％，至少83％，至少84％，至少85％，至少86％，至少87％，至少88％，至少89％，至少90％，至少91％，至少92％，至少93％，至少94％，至少95％，至少96％，至少97％，至少98％，或至少99％序列同一性；和
(iv)膨胀素，其由多核苷酸编码，所述多核苷酸在至少高严格条件或至少非常高严格条件下与SEQ ID NO:21的成熟多肽编码序列或其全长互补链杂交。
5.权利要求1-4任一项的重组木霉属宿主细胞，其选自下组：哈茨木霉(Trichoderma harzianum)、康宁木霉(Trichoderma koningii)、长枝木霉(Trichoderma longibrachiatum)、里氏木霉(Trichoderma reesei)和绿色木霉(Trichoderma viride)。
6.权利要求1-4任一项的重组木霉属宿主细胞，其为里氏木霉。
7.权利要求1-6任一项的重组木霉属宿主细胞，其中对于所述木霉属宿主为内源的一种或多种纤维素酶基因、一种或多种半纤维素酶基因，或其组合已失活。
8.权利要求7的重组木霉属宿主细胞，其中木霉属纤维二糖水解酶I基因或其同源物已失活；其中所述木霉属纤维二糖水解酶I基因或同源物编码选自下组的纤维二糖水解酶I：
(i)纤维二糖水解酶I，其包含或组成为SEQ ID NO:24的成熟多肽；
(ii)纤维二糖水解酶I，其包含或组成为氨基酸序列，所述氨基酸序列与SEQ ID NO:24的成熟多肽具有至少70％，至少75％，至少80％，至少81％，至少82％，至少83％，至少84％，至少85％，至少86％，至少87％，至少88％，至少89％，至少90％，至少91％，至少92％，至少93％，至少94％，至少95％，至少96％，至少97％，至少98％，或至少99％序列同一性；
(iii)纤维二糖水解酶I，其由多核苷酸编码，所述多核苷酸包含或组成为核苷酸序列，所述核苷酸序列与SEQ ID NO:23的成熟多肽编码序列具有至少70％，至少75％，至少80％，至少81％，至少82％，至少83％，至少84％，至少85％，至少86％，至少87％，至少88％，至少89％，至少90％，至少91％，至少92％，至少93％，至少94％，至少95％，至少96％，至少97％，至少98％，或至少99％序列同一性；和
(iv)纤维二糖水解酶I，其由多核苷酸编码，所述多核苷酸在至少高严格条件或至少非常高严格条件下与SEQ ID NO:23的成熟多肽编码序列或其全长互补链杂交。
9.权利要求7或8的重组木霉属宿主细胞，其中木霉属纤维二糖水解酶II基因或其同源物已失活；其中所述木霉属纤维二糖水解酶I基因或同源物编码选自下组的纤维二糖水解酶II：
(i)纤维二糖水解酶II，其包含或组成为SEQ ID NO:26的成熟多肽；
(ii)纤维二糖水解酶II，其包含或组成为氨基酸序列，所述氨基酸序列与SEQ ID NO:26的成熟多肽具有至少70％，至少75％，至少80％，至少81％，至少82％，至少83％，至少84％，至少85％，至少86％，至少87％，至少88％，至少89％，至少90％，至少91％，至少92％，至少93％，至少94％，至少95％，至少96％，至少97％，至少98％，或至少99％序列同一性；
(iii)纤维二糖水解酶II，其由多核苷酸编码，所述多核苷酸包含或组成为核苷酸序列，所述核苷酸序列与SEQ ID NO:25的成熟多肽编码序列具有至少70％，至少75％，至少80％，至少81％，至少82％，至少83％，至少84％，至少85％，至少86％，至少87％，至少88％，至少89％，至少90％，至少91％，至少92％，至少93％，至少94％，至少95％，至少96％，至少97％，至少98％，或至少99％序列同一性；和
(iv)纤维二糖水解酶II，其由多核苷酸编码，所述多核苷酸在至少高严格条件或至少非常高严格条件下与SEQ ID NO:25的成熟多肽编码序列或其全长互补链杂交。
10.权利要求7-9任一项的重组木霉属宿主细胞，其中木霉属β-葡糖苷酶基因或其同源物已失活；其中所述木霉属β-葡糖苷酶基因或同源物编码选自下组的β-葡糖苷酶：
(i)β-葡糖苷酶，其包含或组成为SEQ ID NO:28的成熟多肽；
(ii)β-葡糖苷酶，其包含或组成为氨基酸序列，所述氨基酸序列与SEQ IDNO:28的成熟多肽具有至少70％，至少75％，至少80％，至少81％，至少82％，至少83％，至少84％，至少85％，至少86％，至少87％，至少88％，至少89％，至少90％，至少91％，至少92％，至少93％，至少94％，至少95％，至少96％，至少97％，至少98％，或至少99％序列同一性；
(iii)β-葡糖苷酶，其由多核苷酸编码，所述多核苷酸包含或组成为核苷酸序列，所述核苷酸序列与SEQ ID NO:27的成熟多肽编码序列具有至少70％，至少75％，至少80％，至少81％，至少82％，至少83％，至少84％，至少85％，至少86％，至少87％，至少88％，至少89％，至少90％，至少91％，至少92％，至少93％，至少94％，至少95％，至少96％，至少97％，至少98％，或至少99％序列同一性；和
(iv)β-葡糖苷酶，其由多核苷酸编码，所述多核苷酸在至少高严格条件或至少非常高严格条件下与SEQ ID NO:27的成熟多肽编码序列或其全长互补链杂交。
11.权利要求7-10任一项的重组木霉属宿主细胞，其中木霉属内切葡聚糖酶I基因或其同源物已失活；其中所述木霉属内切葡聚糖酶I基因或同源物编码选自下组的内切葡聚糖酶I：
(i)内切葡聚糖酶I，其包含或组成为SEQ ID NO:30的成熟多肽；
(ii)内切葡聚糖酶I，其包含或组成为氨基酸序列，所述氨基酸序列与SEQID NO:30的成熟多肽具有至少70％，至少75％，至少80％，至少81％，至少82％，至少83％，至少84％，至少85％，至少86％，至少87％，至少88％，至少89％，至少90％，至少91％，至少92％，至少93％，至少94％，至少95％，至少96％，至少97％，至少98％，或至少99％序列同一性；
(iii)内切葡聚糖酶I，其由多核苷酸编码，所述多核苷酸包含或组成为核苷酸序列，所述核苷酸序列与SEQ ID NO:29的成熟多肽编码序列具有至少70％，至少75％，至少80％，至少81％，至少82％，至少83％，至少84％，至少85％，至少86％，至少87％，至少88％，至少89％，至少90％，至少91％，至少92％，至少93％，至少94％，至少95％，至少96％，至少97％，至少98％，或至少99％序列同一性；和
(iv)内切葡聚糖酶I，其由多核苷酸编码，所述多核苷酸在至少高严格条件或至少非常高严格条件下与SEQ ID NO:29的成熟多肽编码序列或其全长互补链杂交。
12.权利要求7-11任一项的重组木霉属宿主细胞，其中木霉属内切葡聚糖酶II基因或其同源物已失活；其中所述木霉属内切葡聚糖酶II基因或同源物编码选自下组的内切葡聚糖酶II：
(i)内切葡聚糖酶II，其包含或组成为SEQ ID NO:32的成熟多肽；
(ii)内切葡聚糖酶II，其包含或组成为氨基酸序列，所述氨基酸序列与SEQ ID NO:32的成熟多肽具有至少70％，至少75％，至少80％，至少81％，至少82％，至少83％，至少84％，至少85％，至少86％，至少87％，至少88％，至少89％，至少90％，至少91％，至少92％，至少93％，至少94％，至少95％，至少96％，至少97％，至少98％，或至少99％序列同一性；
(ii)内切葡聚糖酶II，其由多核苷酸编码，所述多核苷酸包含或组成为核苷酸序列，所述核苷酸序列与SEQ ID NO:31的成熟多肽编码序列具有至少70％，至少75％，至少80％，至少81％，至少82％，至少83％，至少84％，至少85％，至少86％，至少87％，至少88％，至少89％，至少90％，至少91％，至少92％，至少93％，至少94％，至少95％，至少96％，至少97％，至少98％，或至少99％序列同一性；和
(iv)内切葡聚糖酶II，其由多核苷酸编码，所述多核苷酸在至少高严格条件或至少非常高严格条件下与SEQ ID NO:31的成熟多肽编码序列或其全长互补链杂交。
13.权利要求7-12任一项的重组木霉属宿主细胞，其中木霉属木聚糖酶基因或其同源物已失活；其中所述木霉属木聚糖酶基因或同源物编码选自下组的木聚糖酶I：
(i)木聚糖酶，其包含或组成为SEQ ID NO:34，SEQ ID NO:36，或SEQID NO:38的成熟多肽；
(ii)木聚糖酶，其包含或组成为氨基酸序列，所述氨基酸序列与SEQ IDNO:34，SEQ ID NO:36，或SEQ ID NO:38的成熟多肽具有至少70％，至少75％，至少80％，至少81％，至少82％，至少83％，至少84％，至少85％，至少86％，至少87％，至少88％，至少89％，至少90％，至少91％，至少92％，至少93％，至少94％，至少95％，至少96％，至少97％，至少98％，或至少99％序列同一性；
(iii)木聚糖酶，其由多核苷酸编码，其包含或组成为核苷酸序列，所述核苷酸序列与SEQ ID NO:33，SEQ ID NO:35，或SEQ ID NO:37的成熟多肽编码序列具有至少70％，至少75％，至少80％，至少81％，至少82％，至少83％，至少84％，至少85％，至少86％，至少87％，至少88％，至少89％，至少90％，至少91％，至少92％，至少93％，至少94％，至少95％，至少96％，至少97％，至少98％，或至少99％序列同一性；和
(iv)木聚糖酶，其由多核苷酸编码，所述多核苷酸在至少高严格条件或至少非常高严格条件下与SEQ ID NO:33，SEQ ID NO:35，或SEQ ID NO:37的成熟多肽编码序列或其全长互补链杂交。
14.权利要求7-13任一项的重组木霉属宿主细胞，其中木霉属β-木糖苷酶基因或其同源物已失活。其中所述木霉属β-木糖苷酶基因或同源物编码选自下组的β-木糖苷酶：
(i)β-木糖苷酶，其包含或组成为SEQ ID NO:40的成熟多肽；
(ii)β-木糖苷酶，其包含或组成为氨基酸序列，所述氨基酸序列与SEQ IDNO:40的成熟多肽具有至少70％，至少75％，至少80％，至少81％，至少82％，至少83％，至少84％，至少85％，至少86％，至少87％，至少88％，至少89％，至少90％，至少91％，至少92％，至少93％，至少94％，至少95％，至少96％，至少97％，至少98％，或至少99％序列同一性；
(iii)β-木糖苷酶，其由多核苷酸编码，所述多核苷酸包含或组成为核苷酸序列，所述核苷酸序列与SEQ ID NO:39的成熟多肽编码序列具有至少70％，至少75％，至少80％，至少81％，至少82％，至少83％，至少84％，至少85％，至少86％，至少87％，至少88％，至少89％，至少90％，至少91％，至少92％，至少93％，至少94％，至少95％，至少96％，至少97％，至少98％，或至少99％序列同一性；和
(iv)β-木糖苷酶，其由多核苷酸编码，所述多核苷酸在至少高严格条件或至少非常高严格条件下与SEQ ID NO:39的成熟多肽编码序列或其全长互补链杂交。
15.权利要求7-14任一项的重组木霉属宿主细胞，其中木霉属膨胀素基因或其同源物已失活；其中所述木霉属膨胀素基因编码选自下组的膨胀素：
(i)膨胀素，其包含或组成为SEQ ID NO:42的成熟多肽；
(ii)膨胀素，其包含或组成为氨基酸序列，所述氨基酸序列与SEQ ID NO:42的成熟多肽具有至少70％，至少75％，至少80％，至少81％，至少82％，至少83％，至少84％，至少85％，至少86％，至少87％，至少88％，至少89％，至少90％，至少91％，至少92％，至少93％，至少94％，至少95％，至少96％，至少97％，至少98％，或至少99％序列同一性；
(iii)膨胀素，其由多核苷酸编码，所述多核苷酸包含或组成为核苷酸序列，所述核苷酸序列与SEQ ID NO:41的成熟多肽编码序列具有至少70％，至少75％，至少80％，至少81％，至少82％，至少83％，至少84％，至少85％，至少86％，至少87％，至少88％，至少89％，至少90％，至少91％，至少92％，至少93％，至少94％，至少95％，至少96％，至少97％，至少98％，或至少99％序列同一性；和
(iv)膨胀素，其由多核苷酸编码，所述多核苷酸在至少高严格条件或至少非常高严格条件下与SEQ ID NO:41的成熟多肽编码序列或其全长互补链杂交。
16.一种产生酶组合物的方法，其包括：在有助于所述酶组合物产生的条件下培养权利要求1-15任一项的宿主细胞。
17.权利要求16的方法，进一步包括回收所述酶组合物。
18.一种酶组合物，其包含权利要求1-15任一项的重组木霉属宿主细胞的回收的发酵液。
19.一种降解纤维素材料的方法，其包括用权利要求18的酶组合物处理所述纤维素材料。
20.一种用于产生发酵产物的方法，其包括：
(a)用权利要求18的酶组合物糖化纤维素材料；
(b)用一种或多种发酵微生物发酵经糖化的纤维素材料以产生发酵产物；和
(c)从发酵回收发酵产物。
21.一种发酵纤维素材料的方法，其包括：用一种或多种发酵微生物发酵所述纤维素材料，其中所述纤维素材料是用权利要求18的酶组合物糖化的。
CN201280052444.9A 2011-08-24 2012-08-23 烟曲霉纤维素分解酶组合物及其用途 Pending CN103890169A (zh)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US201161526805P 2011-08-24 2011-08-24
US61/526,805 2011-08-24
PCT/US2012/052161 WO2013028927A1 (en) 2011-08-24 2012-08-23 Aspergillus fumigatus cellulolytic enzyme compositions and uses thereof

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN103890169A true CN103890169A (zh) 2014-06-25

Family

ID=46826908

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201280052444.9A Pending CN103890169A (zh) 2011-08-24 2012-08-23 烟曲霉纤维素分解酶组合物及其用途

Country Status (7)

Country Link
US (2) US9663772B2 (zh)
EP (1) EP2748314B1 (zh)
CN (1) CN103890169A (zh)
BR (1) BR112014004193A2 (zh)
CA (1) CA2846391A1 (zh)
DK (1) DK2748314T3 (zh)
WO (1) WO2013028927A1 (zh)

Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN108570510A (zh) * 2017-03-14 2018-09-25 河南科技大学 用于检测副猪嗜血杆菌的lamp引物、试剂盒及检测方法
CN108795781A (zh) * 2017-05-03 2018-11-13 中国科学院微生物研究所 一种高产哈茨木霉α-1,3-葡聚糖酶的重组菌及其应用
CN114561303A (zh) * 2022-02-14 2022-05-31 大连理工大学 一株分泌高性能纤维素酶的里氏木霉工程菌株及其应用

Families Citing this family (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US10059932B2 (en) 2013-03-15 2018-08-28 Nagaoka University Of Technology Mutant of cellulase-producing microorganism, production method of cellulase and production method of cello-oligosaccharide
WO2015017256A1 (en) 2013-07-29 2015-02-05 Danisco Us Inc. Variant enzymes
WO2015187935A1 (en) 2014-06-06 2015-12-10 Novozymes A/S Enzyme compositions and uses thereof
DK3268482T3 (da) 2015-03-09 2020-03-09 Novozymes As Fremgangsmåder til indføring af en flerhed af ekspressionskonstruktioner i en eukaryot celle
JP6774494B2 (ja) 2016-02-19 2020-10-21 インターコンチネンタル グレート ブランズ エルエルシー バイオマス源から複数の有用なストリームを形成するためのプロセス
JP7007645B2 (ja) * 2016-03-31 2022-02-10 東レ株式会社 変異型ｂｘｌ１遺伝子を有するトリコデルマ属真菌及びそれを使用したキシロオリゴ糖とグルコースの製造方法
WO2019046703A1 (en) 2017-09-01 2019-03-07 Novozymes A/S METHODS OF ENHANCING GENOME EDITION IN FUNGI

Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2011050037A1 (en) * 2009-10-23 2011-04-28 Novozymes, Inc. Cellobiohydrolase variants and polynucleotides encoding same
WO2011057140A1 (en) * 2009-11-06 2011-05-12 Novozymes, Inc. Compositions for saccharification of cellulosic material
WO2011059740A1 (en) * 2009-10-29 2011-05-19 Novozymes, Inc. Polypeptides having cellobiohydrolase activity and polynucleotides encoding same
WO2012061517A1 (en) * 2010-11-02 2012-05-10 Novozymes, Inc. Methods of pretreating cellulosic material with a gh61 polypeptide
WO2012103322A1 (en) * 2011-01-26 2012-08-02 Novozymes A/S Polypeptides having endoglucanase activity and polynucleotides encoding same

Family Cites Families (30)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DK122686D0 (da) 1986-03-17 1986-03-17 Novo Industri As Fremstilling af proteiner
US5989870A (en) 1986-04-30 1999-11-23 Rohm Enzyme Finland Oy Method for cloning active promoters
EP0477280B1 (en) 1989-06-13 1996-09-11 Genencor International, Inc. A method for killing cells without cell lysis
MX9606013A (es) 1994-06-03 1997-12-31 Novo Nordisk Biotech Inc Lacasas purificadas de myceliophthora y acidos nucleicos que codifican para las mismas.
EP0777737B1 (en) 1994-06-30 2005-05-04 Novozymes Biotech, Inc. Non-toxic, non-toxigenic, non-pathogenic fusarium expression system and promoters and terminators for use therein
EP0877801B1 (en) 1996-01-19 2005-04-27 Novozymes Biotech, Inc. Morphological mutants of filamentous fungi
US6506559B1 (en) 1997-12-23 2003-01-14 Carnegie Institute Of Washington Genetic inhibition by double-stranded RNA
ATE332968T1 (de) 1998-10-26 2006-08-15 Novozymes As Erstellung und durchmusterung von interessierenden dna-banken in zellen von filamentösen pilzen
DE69939947D1 (de) 1998-12-23 2009-01-02 Novozymes As Verfahren zur herstellung von polypeptiden in mutierten aspergillus zellen
US6511824B1 (en) 1999-03-17 2003-01-28 Exelixis, Inc. Nucleic acids and polypeptides of invertebrate TWIK channels and methods of use
EP2278016B1 (en) 1999-03-22 2012-09-26 Novozymes Inc. Promoter sequences derived from Fusarium Venenatum and uses thereof
US6531644B1 (en) 2000-01-14 2003-03-11 Exelixis, Inc. Methods for identifying anti-cancer drug targets
ES2166316B1 (es) 2000-02-24 2003-02-16 Ct Investig Energeticas Ciemat Procedimiento de produccion de etanol a partir de biomasa lignocelulosica utilizando una nueva levadura termotolerante.
AU1166502A (en) 2000-10-12 2002-04-22 Exelixis Inc Human ect2 and methods of use
WO2002095014A2 (en) 2001-05-18 2002-11-28 Novozymes A/S Polypeptides having cellobiase activity and polynucleotides encoding same
BRPI0306740B1 (pt) 2002-01-23 2019-08-27 C5 Yeast Company B V célula hospedeira transformada com um construto de ácido nucléico e processo para a produção de etanol
EP1622921B1 (en) 2003-05-02 2010-06-16 Novozymes Inc. Variants of beta-glucosidases
DK1682656T3 (da) 2003-10-28 2013-11-18 Novozymes Inc Polypeptider med beta-glucosidaseaktivitet og polynukleotider, der koder for dem
US7361495B2 (en) 2004-01-30 2008-04-22 Novozymes, Inc. Polypeptide from a cellulolytic fungus having cellulolytic enhancing activity
EP1715736A4 (en) 2004-02-12 2008-09-03 Novozymes Inc POLYPEPTIDES HAVING XYLANASE ACTIVITY AND POLYNUCLEOTIDES ENCODING SAME
DK176540B1 (da) 2004-09-24 2008-07-21 Cambi Bioethanol Aps Fremgangsmåde til behandling af biomasse og organisk affald med henblik på at udvinde önskede biologisk baserede produkter
EP1869197A2 (en) 2005-04-12 2007-12-26 E.I. Dupont De Nemours And Company Treatment of biomass to obtain ethanol
KR101507402B1 (ko) 2007-05-31 2015-04-02 노보자임스 인코포레이티드 폴리펩티드의 셀룰로오스 가수분해 증진 활성을 증가시키는 방법
EP2352831B1 (en) 2008-09-30 2015-03-25 Novozymes Inc. Methods for producing polypeptides in enzyme-deficient mutants of fusarium venenatum
WO2010039889A2 (en) 2008-09-30 2010-04-08 Novozymes, Inc. Methods for using positively and negatively selectable genes in a filamentous fungal cell
EP2358872A2 (en) * 2008-11-18 2011-08-24 Novozymes Inc. Methods and compositions for degrading cellulosic material
DK2398889T3 (en) 2009-02-20 2018-07-30 Danisco Us Inc FERMENTATION BOUILLON FORMULATIONS
AU2010253848C1 (en) 2009-05-29 2015-02-19 Novozymes, Inc. Methods for enhancing the degradation or conversion of cellulosic material
MX350399B (es) 2009-12-18 2017-09-06 Novozymes Inc Metodos para producir polipeptidos en mutantes de trichoderma deficientes en proteasa.
IN2014CN02100A (zh) * 2011-08-24 2015-05-29 Novozymes Inc

Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2011050037A1 (en) * 2009-10-23 2011-04-28 Novozymes, Inc. Cellobiohydrolase variants and polynucleotides encoding same
WO2011059740A1 (en) * 2009-10-29 2011-05-19 Novozymes, Inc. Polypeptides having cellobiohydrolase activity and polynucleotides encoding same
WO2011057140A1 (en) * 2009-11-06 2011-05-12 Novozymes, Inc. Compositions for saccharification of cellulosic material
WO2012061517A1 (en) * 2010-11-02 2012-05-10 Novozymes, Inc. Methods of pretreating cellulosic material with a gh61 polypeptide
WO2012103322A1 (en) * 2011-01-26 2012-08-02 Novozymes A/S Polypeptides having endoglucanase activity and polynucleotides encoding same

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
FEDOROVA N.D.，等: "Probale endo-bata-1,4-glucanase celB", 《UNIPROT SP:CELB_ASPFC》 *
NIERMAN, W.C., 等: "cellobiohydrolase [Aspergillus fumigatus Af293]", 《NCBI REFERENCE SEQUENCE: XP_748511.1》 *
NIERMAN, W.C.: "cellobiohydrolase, putative [Neosartorya fischeri NRRL 181]", 《NCBI REFERENCE SEQUENCE: XP_0012588431.1》 *

Cited By (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN108570510A (zh) * 2017-03-14 2018-09-25 河南科技大学 用于检测副猪嗜血杆菌的lamp引物、试剂盒及检测方法
CN108570510B (zh) * 2017-03-14 2021-07-09 河南科技大学 用于检测副猪嗜血杆菌的lamp引物、试剂盒及检测方法
CN108795781A (zh) * 2017-05-03 2018-11-13 中国科学院微生物研究所 一种高产哈茨木霉α-1,3-葡聚糖酶的重组菌及其应用
CN108795781B (zh) * 2017-05-03 2020-06-02 中国科学院微生物研究所 一种高产哈茨木霉α-1,3-葡聚糖酶的重组菌及其应用
CN114561303A (zh) * 2022-02-14 2022-05-31 大连理工大学 一株分泌高性能纤维素酶的里氏木霉工程菌株及其应用
CN114561303B (zh) * 2022-02-14 2023-11-17 大连理工大学 一株分泌高性能纤维素酶的里氏木霉工程菌株及其应用

Also Published As

Publication number Publication date
US9970015B2 (en) 2018-05-15
DK2748314T3 (en) 2017-03-20
US20140234914A1 (en) 2014-08-21
US20170218377A1 (en) 2017-08-03
WO2013028927A1 (en) 2013-02-28
US9663772B2 (en) 2017-05-30
BR112014004193A2 (pt) 2017-03-28
CA2846391A1 (en) 2013-02-28
EP2748314B1 (en) 2016-12-28
EP2748314A1 (en) 2014-07-02

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US11230723B2 (en) Cellulolytic enzyme compositions and uses thereof
CN103517986B (zh) 具有纤维二糖水解酶活性的多肽及编码该多肽的多核苷酸
CN103958674B (zh) 具有木聚糖酶活性的多肽及其编码多核苷酸
CN103517985B (zh) 具有纤维二糖水解酶活性的多肽及编码该多肽的多核苷酸
US9970015B2 (en) Aspergillus fumigatus cellulolytic enzyme compositions and uses thereof
CN103797126A (zh) 用于增强纤维素材料的降解或转化的方法
CN103608461A (zh) 增加多肽的纤维素分解增强活性的方法
CN103703125B (zh) 具有内切葡聚糖酶活性的多肽及其编码多核苷酸
CN106488982A (zh) 酶组合物及其用途
CN105492601A (zh) 增加对纤维素材料的酶法水解的方法
CN103958675A (zh) 具有木聚糖酶活性的多肽以及编码它们的多核苷酸
CN103649308A (zh) 具有内切葡聚糖酶活性的多肽和编码该多肽的多核苷酸
CN105861469A (zh) 具有纤维素分解增强活性的多肽以及编码它们的多核苷酸
CN104039834A (zh) 具有纤维二糖水解酶活性的杂合多肽和编码它们的多核苷酸
CN104053666A (zh) 具有内切葡聚糖酶活性的多肽和编码该多肽的多核苷酸
CN104136608A (zh) 具有内切葡聚糖酶活性的多肽和编码该多肽的多核苷酸
CN104039959A (zh) 具有木聚糖酶活性的多肽和编码该多肽的多核苷酸
CN104160022A (zh) 具有β-葡糖苷酶活性的多肽和编码该多肽的多核苷酸
US20220098631A1 (en) Cellulolytic enzyme compositions and uses thereof
CN104350148A (zh) 具有纤维二糖水解酶活性的多肽和编码该多肽的多核苷酸

Legal Events

Date Code Title Description
C06 Publication
PB01 Publication
C10 Entry into substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
AD01 Patent right deemed abandoned
AD01 Patent right deemed abandoned

Effective date of abandoning: 20170714