CN103068988A - 具有启动子活性的多核苷酸 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及具有启动子活性的分离的多核苷酸，和所述分离的多核苷酸用于产生多肽的用途。本发明亦涉及包含多核苷酸的核酸构建体、载体和宿主细胞，以及使用具有启动子活性的多肽产生所需多肽的方法。

Description

具有启动子活性的多核苷酸
涉及序列表
本申请包含计算机可读形式的序列表。该计算机可读形式通过提述并入本文。
发明背景
技术领域
本发明涉及具有启动子活性的多核苷酸。具体而言，本发明涉及在真菌宿主细胞中具有启动子活性的多核苷酸。本发明亦涉及包含所述多核苷酸的核酸构建体、载体和宿主细胞，以及使用本发明的多核苷酸产生多肽的方法。
背景技术
在真菌宿主细胞，特别是丝状真菌宿主细胞如曲霉属(Aspergillus)细胞中异源蛋白的重组产生，可对于以商业上重要的量产生所述蛋白提供更理想的媒介。
异源蛋白的重组产生一般通过下述实现：构建表达盒，其中编码所述蛋白的DNA置于启动子的表达调控下，所述启动子是从受调节的基因切出的，且适于宿主细胞。将所述表达盒导入宿主细胞。然后，通过在表达盒上所包含的启动子的正常功能所需的诱导条件下培养经转化的宿主细胞来实现异源蛋白的产生。
蛋白的重组表达的改善一般需要新的调节序列的可用性，所述调节序列适于在宿主细胞中调控所述蛋白的表达。所述调节序列可为合适的启动子序列，其能够直接转录可操作地连接于所述启动子序列的基因。前导序列可操作地连接于编码所述多肽的核苷酸序列的5’端。
用于丝状真菌宿主细胞的启动子序列可从来源于米曲霉(Aspergillusoryzae)TAKA淀粉酶和构巢曲霉(Aspergillus nidulans)丙糖磷酸异构酶的基因获得。
本发明的一个目的是提供用于在真菌宿主细胞中使用的新启动子，并进一步提供用于在真菌宿主细胞中使用所述新启动子产生多肽的改善的方法。
发明内容
在第一个方面，本发明涉及具有启动子活性的分离的多核苷酸，其选自下组：
(a)多核苷酸，其包含具有启动子活性的核苷酸序列，所述核苷酸序列与SEQ ID NO:1的核苷酸序列具有至少60%，更优选至少65%，更优选至少70%，更优选至少75%，更优选至少80%，更优选至少85%，甚至更优选至少90%，且最优选至少95%序列同一性；和
(b)多核苷酸，其具有启动子活性，其在至少低严格条件，更优选至少中等严格条件，甚至更优选至少中等-高严格条件，最优选至少高严格条件，且甚至最优选至少非常高严格条件下与SEQ ID NO:1的核苷酸序列或其全长互补链杂交。
在一个进一步的方面，本发明涉及核酸构建体，表达载体和/或宿主细胞，其包含本发明的核苷酸序列，所述核苷酸序列可操作地连接于编码序列，其中本发明的核苷酸序列在天然形式不与该编码序列连接。
最后，本发明涉及产生所需多肽的方法，其包括：(a)在有助于所述多肽产生的条件下培养包含核酸构建体的宿主细胞，所述核酸构建体包含本发明的核苷酸，所述核苷酸可操作地连接于编码所需多肽的编码序列；和(b)回收所述多肽。
定义
序列同一性：参数“序列同一性”描述两个核苷酸序列之间的相关性。
就本发明而言，两个脱氧核糖核苷酸序列之间的序列同一性程度使用如EMBOSS软件包(EMBOSS:The European Molecular Biology Open SoftwareSuite,Rice等,2000,见上文)，优选3.0.0版或更高版本的Needle程序中所执行的Needleman-Wunsch算法(Needleman和Wunsch,1970,见上文)来测定。使用的可选参数为缺口开放罚分10，缺口延伸罚分0.5和EDNAFULL(NCBINUC4.4的EMBOSS版)取代矩阵。使用Needle标记为“最高同一性”的输出结果(使用-nobrief选项获得)作为百分比同一性，并计算如下：
(同样的脱氧核糖核苷酸×100)/(比对长度－比对中缺口的总数)
比对的长度优选为至少10个核苷酸，优选至少25个核苷酸，更优选至少50个核苷酸，且最优选至少100个核苷酸。
亚序列：术语“亚序列(subsequence)”在本文中定义为意指从SEQ ID NO:1的核苷酸序列或其同源序列的5’和/或3’端缺失一个或多个(几个)核苷酸的核苷酸序列；其中所述亚序列具有启动子活性。在一个方面，亚序列含有SEQ IDNO:1的核苷酸序列或其同源序列的至少10个核苷酸，更优选至少25个核苷酸，更优选至少50个核苷酸，更优选至少100个核苷酸，甚至更优选至少200个核苷酸，且最优选至少个核苷酸。
等位变体(allelic variant)：术语“等位变体”在本文中表示占据相同染色体基因座的基因的任何两种或更多种可选形式。等位变异通过突变天然地发生，并且可导致种群内的多态性。基因突变可以是沉默的(多核苷酸的功能无变化)或其可对多核苷酸的功能具有影响。具有启动子活性的多核苷酸的等位变体是由基因的等位变体获得的多核苷酸。
分离的多核苷酸：术语“分离的多核苷酸”在本文中指从来源分离的多核苷酸。在一个方面，所述变体如通过琼脂糖凝胶电泳测定的，为至少1%纯，优选至少5%纯，更优选至少10%纯，更优选至少20%纯，更优选至少40%纯，更优选至少60%纯，更优选至少80%纯，且最优选至少90%纯。
编码序列：当用于本文中术语“编码序列”意指直接指定其蛋白产物氨基酸序列的核苷酸序列。编码序列的边界通常由开读框决定，所述开读框通常以ATG起始密码子或其他起始密码子例如GTG和TTG开始，并且以终止密码子例如TAA、TAG和TGA结束。编码序列可以是DNA、cDNA、合成的或重组的核苷酸序列。
核酸构建体：如用于本文中术语“核酸构建体”指单链或双链的核酸分子，其分离自天然存在的基因，或受修饰以本来不存在于(not otherwise exist)自然界中的方式含有核酸的区段，或是合成的。当所述核酸构建体含有表达本发明的编码序列所需的调控序列时，术语核酸构建体与术语“表达盒”同义。
调控序列(control sequence)：在本文中术语“调控序列”定义为包括对多核苷酸表达是必需的所有成分。各个调控序列对于编码待表达的多肽的核苷酸序列可以是天然的或异源的，或各个调控序列对于彼此可以是天然的或异源的。这些调控序列包括但不限于前导序列、聚腺苷酸化序列、前肽序列、信号肽序列和转录终止子。最少的情况，调控序列包括启动子和转录和翻译的终止信号。调控序列可以和用于引入特异性限制位点的接头一起提供，所述特异性限制位点促进调控序列与编码多肽的核苷酸序列编码区的连接。
可操作地连接：术语“可操作地连接”在本文中表示这样的构型，其中将调控序列置于相对于多核苷酸序列的编码序列的适当位置，使得调控序列指导该多肽的编码序列的表达。
表达：术语“表达”包括涉及产生多肽的任何步骤，其包括但不限于转录、转录后修饰、翻译、翻译后修饰和分泌。
表达载体：术语“表达载体”在本文中定义为线性的或环状的DNA分子，其包含具有本发明的启动子序列的多核苷酸和编码多肽的多核苷酸，并且所述多核苷酸与提供用于其表达的额外核苷酸可操作地连接。
宿主细胞：“宿主细胞”用于本文中包括任何细胞类型，所述细胞类型对于使用包含本发明多核苷酸的核酸构建体或表达载体的转化、转染、转导等是易感的(susceptible)。
发明详述
具有启动子活性的多核苷酸
对于本发明，具有启动子活性旨在意指由宿主细胞识别、用于可操作连接于所述具有启动子活性的多核苷酸的多核苷酸的表达的核苷酸序列。具有启动子序列的多核苷酸可为启动子可为在所选的宿主细胞中显示转录活性的任何核苷酸序列，包括突变的、截短的和杂合的启动子，并且可以从编码与宿主细胞同源或异源的胞外或胞内多肽的基因获得。
本发明的具有启动子活性的多核苷酸可获得自任何属的微生物。就本发明而言，用于本文与给定的来源有关的术语“获得自”，应意指所述具有启动子活性的多核苷酸可从所述来源分离，或可通过其中***了来自该来源的多核苷酸的菌株来分离。
本发明的具有启动子活性的多核苷酸包含或组成为(consist of)与SEQ IDNO:1具有至少60%序列同一性，优选至少70%序列同一性，更优选至少80%序列同一性，更优选至少90%序列同一性，甚至更优选至少95%序列同一性，仍更优选至少97%序列同一性，且最优选至少98%序列同一性的多核苷酸。
与SEQ ID NO:1具有序列同一性的多核苷酸和SEQ ID NO:1之间的比对长度为优选至少10个核苷酸，更优选至少25个核苷酸，甚至更优选至少50个核苷酸，且最优选至少100个核苷酸。
本发明的一个特别优选的启动子是具有SEQ ID NO:1的启动子及其等位变体。该启动子可从见于黑曲霉(Aspergillus niger)的推定的烷基硫酸酯酶基因分离。
本发明的具有启动子活性的多核苷酸可获得自真菌，如酵母如假丝酵母属(Candida)、克鲁维酵母属(Kluyveromyces)、毕赤酵母属(Pichia)、酵母属(Saccharomyces)、裂殖酵母属(Schizosaccharomyces)或西洋蓍霉属(Yarrowia)；或更优选获得自丝状真菌如枝顶孢霉属(Acremonium)、伞菌属(Agaricus)、链格孢属(Alternaria)、曲霉属(Aspergillus)、短梗霉属(Aureobasidium)、Botryospaeria、拟蜡菌属(Ceriporiopsis)、毛喙壳属(Chaetomidium)、金孢子菌属(Chrysosporium)、Claviceps、Cochliobolus、鬼伞属(Coprinopsis)、Coptotermes、棒囊壳属(Corynascus)、隐丛赤壳菌属(Cryphonectria)、隐球菌属(Cryptococcus)、色二孢属(Diplodia)、黑耳属(Exidia)、Filibasidium、镰孢属(Fusarium)、赤霉属(Gibberella)、全鞭毛虫属(Holomastigotoides)、腐质霉属(Humicola)、耙齿菌属(Irpex)、蘑菇属(Lentinula)、Leptospaeria、梨孢菌属(Magnaporthe)、Melanocarpus、多孔菌属(Meripilus)、毛霉属(Mucor)、毁丝霉属(Myceliophthora)、新考玛脂霉属(Neocallimastix)、脉孢菌属(Neurospora)、拟青霉属(Paecilomyces)、青霉属(Penicillium)、平革菌属(Phanerochaete)、瘤胃壶菌属(Piromyces)、Poitrasia、假黑盘菌属(Pseudoplectania)、Pseudotrichonympha、根毛霉属(Rhizomucor)、裂褶菌属(Schizophyllum)、柱顶孢属(Scytalidium)、踝节菌属(Talaromyces)、嗜热子囊菌属(Thermoascus)、梭孢壳属(Thielavia)、弯颈霉属(Tolypocladium)、木霉属(Trichoderma)、长毛盘菌属(Trichophaea)、轮枝孢属(Verticillium)、包脚菇属(Volvariella)或炭角菌属(Xylaria)。
在另一个优选的方面，本发明的具有启动子活性的多核苷酸获得自解纤维枝顶孢霉(Acremonium cellulolyticus)、棘孢曲霉(Aspergillus aculeatus)、泡盛曲霉(Aspergillus awamori)、烟曲霉(Aspergillus fumigatus)、臭曲霉(Aspergillusfoetidus)、日本曲霉(Aspergillus japonicus)、构巢曲霉(Aspergillus nidulans)、黑曲霉(Aspergillus niger)、米曲霉(Aspergillus oryzae)、嗜角质金孢子菌(Chrysosporiumkeratinophilum)、Chrysosporium lucknowense、热带金孢子菌(Chrysosporiumtropicum)、Chrysosporium merdarium、Chrysosporium inops、毡金孢子菌(Chrysosporium pannicola)、Chrysosporium queenslandicum、Chrysosporiumzonatum、杆孢状镰孢(Fusarium bactridioides)、禾谷镰孢(Fusarium cerealis)、库威镰孢(Fusarium crookwellense)、大刀镰孢(Fusarium culmorum)、禾本科镰孢(Fusarium graminearum)、禾赤镰孢(Fusarium graminum)、异孢镰孢(Fusariumheterosporum)、合欢木镰孢(Fusarium negundi)、尖镰孢(Fusarium oxysporum)、多枝镰孢(Fusarium reticulatum)、粉红镰孢(Fusarium roseum)、接骨木镰孢(Fusarium sambucinum)、肤色镰孢(Fusarium sarcochroum)、拟分枝孢镰孢(Fusarium sporotrichioides)、硫色镰孢(Fusarium sulphureum)、圆镰孢(Fusariumtorulosum)、拟丝孢镰孢(Fusarium trichothecioides)、镶片镰孢(Fusariumvenenatum)、灰腐质霉(Humicola grisea)、特异腐质霉(Humicola insolens)、疏棉状腐质霉(Humicola lanuginosa)、白耙齿菌(Irpex lacteus)、米黑毛霉(Mucormiehei)、嗜热毁丝霉(Myceliophthora thermophila)、粗糙脉孢菌(Neurosporacrassa)、绳状青霉(Penicillium funiculosum)、产紫青霉(Penicillium purpurogenum)、黄孢平革菌(Phanerochaete chrysosporium)、无色梭孢壳(Thielavia achromatica)、Thielavia albomyces、Thielavia albopilosa、澳洲梭孢壳(Thielavia australeinsis)、Thielavia fimeti、小孢梭孢壳(Thielavia microspora)、卵孢梭孢壳(Thielaviaovispora)、Thielavia peruviana、瘤孢梭孢壳(Thielavia spededonium)、毛梭孢壳(Thielavia setosa)、Thielavia subthermophila、土生梭孢霉(Thielavia terrestris)、哈茨木霉(Trichoderma harzianum)、康宁木霉(Trichoderma koningii)、长枝木霉(Trichoderma longibrachiatum)、里氏木霉(Trichoderma reesei)或绿色木霉(Trichoderma viride)。
在另一个优选的方面，所述具有启动子活性的多核苷酸获得自黑曲霉或米曲霉。
在一个最优选的方面，本发明具有启动子活性的多核苷酸获得自黑曲霉。
可理解的是对于前述的种，本发明包含完全和不完全阶段(perfect andimperfect states)，和其它分类学的等同物(equivalent)，例如无性型(anamorph)，而无论它们已知的种名。本领域技术人员会容易地识别适合的等同物的身份。
这些种的菌株在许多培养物保藏中心对于公众能够容易地取得，所述保藏中心诸如美国典型培养物保藏中心(the American Type Culture Collection)(ATCC)、德意志微生物和细胞培养物保藏中心(Deutsche Sammlung vonMikroorganismen und Zellkulturen GmbH)(DSM)、真菌菌种保藏中心(Centraalbureau Voor Schimmelcultures)(CBS)和农业研究机构专利培养物保藏中心北区研究中心(Agricultural Research Service Patent Culture Collection,Northern Regional Research Center)(NRRL)。
此外可以使用上述的探针从其它来源，包括从自然界(例如，土壤、堆肥、水等)分离的微生物鉴定和获得所述具有启动子活性的多核苷酸。用于从天然生境(habitat)分离微生物的技术是本领域内公知的。随后可通过相似地筛选此种微生物的基因组来得到所述多核苷酸。一旦检测到具有启动子活性的多核苷酸，就能够使用本领域普通技术人员公知的技术将所述多核苷酸分离或克隆(参见，例如，Sambrook等,1989,见上文)。
用于分离或克隆具有启动子活性的多核苷酸的技术是本领域内已知的，并包括但不限于从基因组DNA分离和多种启动子捕获技术。可例如通过使用熟知的聚合酶链式反应(PCR)来实现从这种基因组DNA克隆本发明的多核苷酸。参见，例如，Innis等,1990,PCR:A Guide to Methods and Application,Academic Press,New York。可以使用其它核酸扩增方法，如连接酶链式反应(LCR)、连接活化转录(ligated activated transcription；LAT)和基于核苷酸序列的扩增(NASBA)。可以从曲霉属菌株，或其它或相关生物体克隆多核苷酸，并且因此可为例如本发明的具有启动子活性的多核苷酸的等位基因变体或种变体(species variant)。
本发明亦涉及具有启动子活性的分离的多核苷酸，其包含或组成为与SEQ ID NO:1的序列具有优选至少60%，更优选至少65%，更优选至少70%，更优选至少75%，更优选至少80%，更优选至少85%，甚至更优选至少90%，最优选至少95%，和甚至最优选至少96%，至少97%，至少98%，或至少99%序列同一性程度的核苷酸序列。
本发明亦涉及本发明的具有启动子活性的分离的多核苷酸，其在非常低严格条件，优选低严格条件，更优选中等严格条件，更优选中等-高严格条件，甚至更优选高严格条件，且最优选非常高严格条件下与以下杂交：(1)SEQ IDNO:1的序列，(ii)(i)的全长互补链；或其等位变体和亚序列(Sambrook等，1989，见上文)，如本文中所定义。
本发明亦涉及具有启动子活性的分离的多核苷酸，其通过以下获得：(a)将DNA群体在非常低、低、中等、中等-高、高或非常高严格条件下与以下杂交：(i)SEQ ID NO:1的成熟多肽编码序列，(ii)(i)的全长互补链；和(b)分离具有启动子活性的杂交的多核苷酸。
核酸构建体
本发明还涉及包含本发明的分离的多核苷酸的核酸构建体，所述分离的多核苷酸与一个或多个(几个)调控序列可操作地连接，所述调控序列在合适的宿主细胞中在与该调控序列相容的条件下指导编码序列的表达。
可以用许多方式操作本发明的具有启动子活性的多核苷酸以提供多肽的表达。依赖于表达载体，在将多核苷酸的序列***载体之前对其进行操作可能是理想的或必需的。使用重组DNA方法修饰多核苷酸序列的技术是本领域熟知的。
调控序列也可以是合适的转录终止子序列，即由宿主细胞识别以终止转录的序列。所述终止子序列与编码所述多肽的核苷酸序列的3’末端可操作地连接。可以将在所选宿主细胞中有功能的任何终止子用在本发明中。
对于丝状真菌宿主细胞优选的终止子从如下酶的基因获得：米曲霉TAKA淀粉酶、黑曲霉葡糖淀粉酶、构巢曲霉邻氨基苯甲酸合酶、黑曲霉α-葡糖苷酶和尖镰孢胰蛋白酶样蛋白酶。
对于酵母宿主细胞优选的终止子从如下酶的基因获得：酿酒酵母烯醇化酶、酿酒酵母细胞色素C(CYC1)和酿酒酵母甘油醛-3-磷酸脱氢酶。对于酵母宿主细胞其它有用的终止子由Romanos等,1992,见上文描述。
调控序列还可以是合适的前导序列，即对于宿主细胞的翻译重要的mRNA非翻译区。前导序列可操作地连接于编码多肽的核苷酸序列的5’-末端。可以将在所选宿主细胞中有功能的任何前导序列用在本发明中。
对于丝状真菌宿主细胞优选的前导序列从如下酶的基因获得：米曲霉TAKA淀粉酶和构巢曲霉丙糖磷酸异构酶。
对于酵母宿主细胞合适的前导序列从如下酶的基因获得：酿酒酵母烯醇化酶(ENO-1)、酿酒酵母3-磷酸甘油酸激酶、酿酒酵母α因子和酿酒酵母醇脱氢酶/甘油醛-3-磷酸脱氢酶(ADH2/GAP)。
调控序列也可以是聚腺苷酸化序列，其是与核苷酸序列的3’末端可操作地连接的序列，并且在转录时，宿主细胞将其识别为将聚腺苷残基添加至转录的mRNA的信号。可以将在所选宿主细胞中有功能的任何聚腺苷酸化序列在本发明中使用。
对于丝状真菌宿主细胞优选的聚腺苷酸化序列从如下酶的基因获得：米曲霉TAKA淀粉酶、黑曲霉葡糖淀粉酶、构巢曲霉邻氨基苯甲酸合酶、尖镰孢胰蛋白酶样蛋白酶和黑曲霉α-葡糖苷酶。
对于酵母宿主细胞有用的聚腺苷酸化序列由Guo和Sherman,1995,Molecular Cellular Biology15:5983-5990描述。
调控序列还可以是信号肽编码序列，其编码与多肽的氨基末端相连的信号肽，并且指导编码的多肽进入细胞分泌途径。核苷酸序列的编码序列5’端可固有地包含信号肽编码序列，其与编码分泌多肽的编码序列片段一起天然地连接在翻译阅读框中。可供选择的是，编码序列5’端可含有对于所述编码序列外源的信号肽编码序列。外源信号肽编码序列在编码序列不天然地含有信号肽编码序列时可为必需的。或者，外源信号肽编码序列可以简单地取代天然信号肽编码序列以增强多肽的分泌。然而，指导表达的多肽进入所选宿主细胞的分泌途径(即，分泌至培养基中)的任何信号肽编码序列可在本发明中使用。
对于丝状真菌宿主细胞有效的信号肽编码序列是从如下酶的基因获得的信号肽编码序列：米曲霉TAKA淀粉酶、黑曲霉中性淀粉酶、黑曲霉葡糖淀粉酶、曼赫根毛霉天冬氨酸蛋白酶、特异腐质霉(Humicola insolens)纤维素酶、特异腐质霉内切葡聚糖酶V和疏棉状腐质霉(Humicola lanuginosa)脂肪酶。
对于酵母宿主细胞有用的信号肽从酿酒酵母α因子和酿酒酵母转化酶的基因获得。其它有用的信号肽编码序列由Romanos等,1992,见上文描述。
同样理想的是添加调节序列，其允许相对于宿主细胞的生长来调节多肽的表达。调节***的实例是引起基因表达响应化学或物理刺激物，包括调节化合物的存在而开启或关闭的那些***。原核***中的调节***包括lac、tac和trp操纵基因***。在酵母中，可以使用ADH2***或GAL1***。在丝状真菌中，可以使用TAKAα-淀粉酶启动子、黑曲霉葡糖淀粉酶启动子和米曲霉葡糖淀粉酶启动子作为调节序列。调节序列的其它实例是那些允许基因扩增的序列。在真核***中，这些调节序列包括在氨甲蝶呤(methotrexate)存在下扩增的二氢叶酸还原酶基因，和以重金属(with heavy metal)扩增的金属硫蛋白基因。在这些情况下，本发明的具有启动子的核苷酸序列将与调节序列可操作地连接。
表达载体
本发明还涉及重组表达载体，所述重组表达载体包含本发明的多核苷酸，所需多肽的编码序列和转录和翻译终止信号。本文所述的多种核酸和调控序列可以结合在一起以产生重组表达载体，所述表达载体可以包括一个或多个(几个)方便的限制位点以允许在这些位点***或取代核苷酸序列。可供选择的是，可以通过在适当的用于表达编码序列的载体中***包含所述序列的核苷酸序列或核酸构建体来使用本发明的多核苷酸序列。在制备表达载体的过程中，将编码序列置于载体中，从而将该编码序列与适当的表达调控序列以及本发明的具有启动子活性的多核苷酸可操作地连接。
重组表达载体可以是任何载体(例如，质粒或病毒)，其能够方便地进行重组DNA步骤，并且能够产生核苷酸序列的表达。载体的选择将通常依赖于载体与将引入该载体的宿主细胞的相容性。载体可以是线状或闭合环状质粒。
载体可以是自主复制载体，即，作为染色体外实体(entity)存在的载体，其复制独立于染色体复制，例如，质粒、染色体外元件、微型染色体(minichromosome)或人工染色体。载体可以含有任何用于确保自复制的手段(means)。或者，载体可以是一种当被引入宿主细胞中时，整合到基因组中并且与整合了该载体的染色体一起复制的载体。此外，可以使用单独的载体或质粒或两个或更多个载体或质粒，其共同含有待引入宿主细胞基因组的完整DNA(total DNA)，或可以使用转座子(transposon)。
本发明的载体优选地含有一个或多个(几个)选择性标记，其允许简单选择经转化、转染、转导等的细胞。选择性标记是基因，其产物提供杀生物剂或病毒抗性、对重金属的抗性、对营养缺陷型的原养性(prototrophy to auxotrophs)等。
用于酵母宿主细胞的合适标记为ADE2，HIS3，LEU2，LYS2，MET3，TRP1，和URA3。用于丝状真菌宿主细胞的选择性标记包括但不限于amdS(乙酰胺酶)、argB(鸟氨酸氨甲酰基转移酶)、bar(草铵膦(phosphinothricin)乙酰转移酶)、hph(潮霉素磷酸转移酶)、niaD(硝酸还原酶)(nitrate reductase)、pyrG(乳清酸核苷-5’-磷酸脱羧酶)(orotidine-5’-phosphate decarboxylase)、sC(硫酸腺苷酰转移酶)和trpC(邻氨基苯甲酸合酶(anthranilate synthase))以及它们的等同物。优选用在曲霉属细胞中的是构巢曲霉(Aspergillus nidulans)或米曲霉的amdS和pyrG基因和吸水链霉菌(Streptomyces hygroscopicus)的bar基因。
本发明的载体优选含有元件，其允许载体整合入宿主细胞基因组或允许载体在细胞中独立于基因组的自主复制。
为了整合入宿主细胞基因组，载体可依赖编码多肽的多核苷酸的序列或用于通过同源或非同源重组整合入基因组的任何其它载体元件。或者，载体可以含有额外的核苷酸序列，用于指导通过同源重组整合入宿主细胞基因组染色体中的精确位置。为了增加在精确位置整合的可能性，整合元件应优选含有足够数量的核酸，如100至10,000碱基对，优选400至10,000碱基对，并且最优选800至10,000碱基对，其与相应的目标序列具有高度序列同一性以增强同源重组的概率。整合元件可以是任何序列，其与宿主细胞基因组中的目标序列同源。此外，整合元件可以是非编码或编码的核苷酸序列。另一方面，可以将载体通过非同源重组整合到宿主细胞的基因组中。
为了自主复制，载体可以进一步包含复制起点，其使载体能够在所述的宿主细胞中自主地复制。复制起点可以是介导自主复制的任何质粒复制子(replicator)，其在细胞中发挥功能。术语“复制起点”或“质粒复制子”在本文定义为能够使质粒或载体体内复制的核苷酸序列。
在丝状真菌细胞中有用的复制起点的实例是AMA1和ANS1(Gems等,1991,Gene98:61-67；Cullen等,1987,Nucleic Acids Research15:9163-9175；WO00/24883)。分离AMA1基因和构建包含该基因的质粒或载体能够根据公开于WO00/24883中的方法完成。
可以将包含本发明的具有启动子活性的多核苷酸的多于一个拷贝的核酸构建体***宿主细胞以增加所需基因产物的产生。核酸构建体拷贝数的增加可通过如下方法获得：将至少一个额外拷贝的序列整合入宿主细胞基因组，或将可扩增的选择性标记基因包括于多核苷酸，其中可通过在合适的选择剂(selectable agent)存在下培养细胞来选择含有选择性标记基因的扩增拷贝，且由此含有本发明的具有启动子活性的多核苷酸的额外拷贝的细胞。
用于连接上述元件以构建本发明的重组表达载体的方法是本领域技术人员熟知的(参见，例如，Sambrook等,1989,见上文)。
宿主细胞
本发明还涉及重组宿主细胞，其包含本发明的分离的多核苷酸可操作地连接于一个或多个(几个)调控序列，所述调控序列指导所需多肽的产生。将包含本发明多核苷酸的构建体或载体导入宿主细胞，使构建体或载体如前所述作为染色体整合体或者作为自复制的染色体外载体维持。术语“宿主细胞”包括亲本细胞的任何后代，其由于复制过程中发生的突变而不同于亲本细胞。宿主细胞的选择将在很大程度上依赖于编码多肽的基因及其来源。
宿主细胞可以是在多肽的重组产生中有用的任何细胞，例如，真核生物，如哺乳动物、昆虫、植物或真菌细胞。
在一个优选的方面，宿主细胞是真菌细胞。“真菌”用在本文包括以下门：子囊菌门(Ascomycota)、担子菌门(Basidiomycota)、壶菌门(Chytridiomycota)和接合菌门(Zygomycota)(如由Hawksworth等,于Ainsworth and Bisby’sDictionary of The Fungi,第8版,1995,CAB International,University Press,Cambridge,UK中所定义)以及卵菌门(Oomycota)(如Hawksworth等,1995,见上,171页中所引用)，和所有有丝***孢子真菌(mitosporic fungi)(Hawksworth等,1995,见上文)。
在一个更优选的方面，真菌宿主细胞是酵母细胞。“酵母”用在本文包括产子囊酵母(ascosporogenous yeast)(内孢霉目(Endomycetales))、产担子酵母(basidiosporogenous yeast)和属于半知菌类(Fungi Imperfecti)(芽孢纲(Blastomycetes))的酵母。由于酵母的分类在未来可能改变，就本发明而言，将酵母定义为如Biology and Activities of Yeast(Skinner,F.A.,Passmore,S.M.,和Davenport,R.R.编,Soc.App.Bacteriol.Symposium Series No.9,1980)中所述。
在一个甚至更加优选的方面，酵母宿主细胞是假丝酵母属(Candida)、汉逊酵母属(Hansenula)、克鲁维酵母属(Kluyveromyces)、毕赤酵母属(Pichia)、酵母属(Saccharomyces)、裂殖酵母属(Schizosaccharomyces)或西洋蓍霉属(Yarrowia)细胞。
在最优选的方面，酵母宿主细胞是卡尔酵母(Saccharomycescarlsbergensis)、酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)、糖化酵母(Saccharomycesdiastaticus)、道格拉氏酵母(Saccharomyces douglasii)、克鲁弗酵母(Saccharomyces kluyveri)、诺地酵母(Saccharomyces norbensis)、卵形酵母(Saccharomyces oviformis)细胞。在另一个最优选的方面，酵母宿主细胞是乳酸克鲁维酵母(Kluyveromyces lactis)细胞。在另一个最优选的方面，酵母宿主细胞是解脂西洋蓍霉(Yarrowia lipolytica)细胞。
在另一个更优选的方面，真菌宿主细胞是丝状真菌细胞。“丝状真菌”包括真菌门(Eumycota)和卵菌门的亚门(如由Hawksworth等,1995,见上文，所定义)的所有丝状形式。丝状真菌通常的特征在于由壳多糖(chitin)、纤维素、葡聚糖、壳聚糖(chitosan)、甘露聚糖和其它复杂多糖组成的菌丝体壁。通过菌丝延伸进行营养生长，而碳分解代谢是专性需氧的。相反，酵母例如酿酒酵母的营养生长通过单细胞菌体的出芽生殖(budding)进行，而碳分解代谢可以是发酵的。
在一个甚至更优选的方面，丝状真菌宿主细胞是枝顶孢霉属(Acremonium)、曲霉属(Aspergillus)、短梗霉属(Aureobasidium)、烟管霉属(Bjerkandera)、拟蜡菌属(Ceriporiopsis)、金孢子菌属(Chrysosporium)、鬼伞属(Coprinus)、革盖菌属(Coriolus)、隐球菌属(Cryptococcus)、Filibasidium、镰孢属(Fusarium)、腐质霉属(Humicola)、梨孢菌属(Magnaporthe)、毛霉属(Mucor)、毁丝霉属(Myceliophthora)、新考玛脂霉属(Neocallimastix)、脉孢菌属(Neurospora)、拟青霉属(Paecilomyces)、青霉属(Penicillium)、平革菌属(Phanerochaete)、射脉菌属(Phlebia)、瘤胃壶菌属(Piromyces)、侧耳属(Pleurotus)、裂褶菌属(Schizophyllum)、踝节菌属(Talaromyces)、嗜热子囊菌属(Thermoascus)、梭孢壳属(Thielavia)、弯颈霉属(Tolypocladium)、栓菌属(Trametes)或木霉属(Trichoderma)细胞。
在最优选的方面，丝状真菌宿主细胞是泡盛曲霉(Aspergillus awamori)、烟曲霉(Aspergillus fumigatus)、臭曲霉(Aspergillus foetidus)、日本曲霉(Aspergillus japonicus)、构巢曲霉(Aspergillus nidulans)、黑曲霉(Aspergillusniger)或米曲霉(Aspergillus oryzae)细胞。在另一个最优选方面，丝状真菌宿主细胞是杆孢状镰孢(Fusarium bactridioides)、禾谷镰孢(Fusarium cerealis)、库威镰孢(Fusarium crookwellense)、大刀镰孢(Fusarium culmorum)、禾本科镰孢(Fusarium graminearum)、禾赤镰孢(Fusarium graminum)、异孢镰孢(Fusariumheterosporum)、合欢木镰孢(Fusarium negundi)、尖镰孢(Fusarium oxysporum)、多枝镰孢(Fusarium reticulatum)、粉红镰孢(Fusarium roseum)、接骨木镰孢(Fusarium sambucinum)、肤色镰孢(Fusarium sarcochroum)、拟分枝孢镰孢(Fusarium sporotrichioides)、硫色镰孢(Fusarium sulphureum)、圆镰孢(Fusariumtorulosum)、拟丝孢镰孢(Fusarium trichothecioides)或镶片镰孢(Fusariumvenenatum)细胞。在另一个最优选的方面，丝状真菌宿主细胞是黑刺烟管菌(Bjerkandera adusta)、干拟蜡菌(Ceriporiopsis aneirina)、干拟蜡菌、Ceriporiopsis caregiea、Ceriporiopsis gilvescens、Ceriporiopsis pannocinta、Ceriporiopsis rivulosa、Ceriporiopsis subrufa、虫拟蜡菌(Ceriporiopsissubvermispora)、嗜角质金孢子菌(Chrysosporium keratinophilum)、Chrysosporium lucknowense、热带金孢子菌(Chrysosporium tropicum)、Chrysosporium merdarium、Chrysosporium inops、毡金孢子菌(Chrysosporiumpannicola)、Chrysosporium queenslandicum、Chrysosporium zonatum、灰盖鬼伞(Coprinus cinereus)、毛革盖菌(Coriolus hirsutus)、特异腐质霉(Humicolainsolens)、疏棉状腐质霉(Humicola lanuginosa)、米黑毛霉(Mucor miehei)、嗜热毁丝霉(Myceliophthora thermophila)、粗糙脉孢菌(Neurospora crassa)、产紫青霉(Penicillium purpurogenum)、黄孢平革菌(Phanerochaete chrysosporium)、辐射射脉菌(Phlebia radiata)、刺芹侧耳(Pleurotus eryngii)、土生梭孢霉(Thielavia terrestris)、长绒毛栓菌(Trametes villosa)、变色栓菌(Trametesversicolor)、哈茨木霉(Trichoderma harzianum)、康宁木霉(Trichodermakoningii)、长枝木霉(Trichoderma longibrachiatum)、里氏木霉(Trichodermareesei)或绿色木霉(Trichoderma viride)细胞。
可以将真菌细胞通过涉及原生质体形成、原生质体转化和细胞壁再生的方法以本身公知的方式转化。用于转化曲霉属和木霉属宿主细胞的合适方法在EP238023和Yelton等,1984,Proceedings of the National Academy ofSciences USA 81:1470-1474中描述。用于转化镰孢属菌种的合适方法由Malardier等,1989,Gene78:147-156和WO96/00787描述。可以使用由如下文献描述的方法转化酵母：Becker和Guarente,于Abelson,J.N.和Simon,M.I.编,Guide to Yeast Genetics and Molecular Biology,Methods in Enzymology,Volume194,pp182-187,Academic Press,Inc.,New York；Ito等,1983,Journal ofBacteriology153:163；和Hinnen等,1978,Proceedings of the National Academyof Sciences USA75:1920。
产生方法
在本发明的产生方法中，在适合于从本发明的具有启动子活性的多核苷酸提供转录活性的营养培养基中培养细胞。例如，可以通过在合适培养基中和允许本发明的具有启动子活性的多核苷酸的转录活性的条件下进行的摇瓶培养，和实验室或工业发酵罐中的小规模或大规模发酵(包括连续、分批、补料分批或固态发酵)来培养细胞。使用本领域已知的方法在合适的营养培养基中进行培养，所述营养培养基包含碳源和氮源和无机盐。合适的培养基能够从商业供应商获得或可以根据公开的组成制备(例如，在美国典型培养物保藏中心的目录中)。如果包含本发明的具有启动子活性的多核苷酸的核酸构建体设计用于表达所需的多肽，且该多肽分泌到营养培养基中，该多肽能够从所述培养基中直接回收。此种多肽可使用本领域已知方法回收。例如，多肽可以通过常规方法从营养培养基中回收，所述常规方法包括但不限于离心、过滤、提取、喷雾干燥、蒸发或沉淀。
本发明进一步通过下述实施例描述，其不应视为对本发明的范围的限制。
实施例
用作缓冲液和底物的化学品为至少试剂级的商品。
材料和方法
方法
分子克隆技术描述于Sambrook,J.,Fritsch,E.F.,Maniatis,T.(1989)Molecular cloning:a laboratory manual(第2版)Cold Spring Harbor Laboratory,Cold Spring Harbor,New York。
酶
用于DNA操作的酶(例如限制性内切核酸酶，连接酶等)可从New EnglandBiolabs,Inc.获得，并可根据生产商的指示使用。
培养基和试剂
用作缓冲液和底物的化学品为分析级的商品。
Cove-N(tf)平板组成为342.3g的蔗糖，20ml的Cove盐溶液，3g的NaNO3，和30g的Noble Agar，加水至1升。
Cove-N平板组成为30g的蔗糖，20ml的Cove盐溶液，3g的NaNO3，和30g的Noble Agar，加水至1升。
COVE盐溶液组成为26g KCl，26g MgSO4·7H2O，76g KH2PO4和50mlCove痕量金属，加水至1升。
COVE的痕量金属溶液组成为0.04g NaB4O7·10H2O，0.4g的CuSO4·5H2O，1.2g的FeSO4·7H2O，1.0g的MnSO4·H2O，0.8g的中性淀粉酶II MoO2·2H2O，和10.0g的ZnSO4·7H2O，加水至1升。
Cove-N顶层琼脂糖(top agarose)组成为342.3g的蔗糖，20ml的COVE盐溶液，3g的NaNO3，和10g的低熔点琼脂糖，加水至1升。
淀粉葡糖苷酶痕量金属溶液组成为6.8g ZnCl2·7H2O，2.5g CuSO4·5H2O，0.24g NiCl2·6H2O，13.9g FeSO4·7H2O，13.5g MnSO4·H2O和3g柠檬酸，加水至1升。
YPG组成为4g的酵母提取物，1g的KH2PO4，0.5g的MgSO4·7H2O和15g的葡萄糖(pH6.0)，加水至1升。
STC缓冲液组成为0.8M的山梨糖醇，25mM的Tris(pH8)，和25mM的CaCl2，加水至1升。
STPC缓冲液组成为STC缓冲液中的40%PEG4000。
MLC组成为40g葡萄糖，50g大豆粉，4g/柠檬酸(pH5.0)，加水至1升。
MSS组成为70g蔗糖，100g大豆粉(pH6.0)，加水至1升。
MU-1组成为260g的麦芽糊精，3g的MgSO4·7H2O，5g的KH2PO4，6g的K2SO4，淀粉葡糖苷酶痕量金属溶液0.5ml和尿素2g(pH4.5)，加水至1升。
购买的材料(大肠杆菌，质粒和试剂盒)
将大肠杆菌DH5-alpha(Toyobo)用于质粒构建和扩增。将商业性质粒/载体TOPO Cloning Kit(Invitrogen)和pBlue script II SK-(Stratagene#212206)用于克隆PCR片段。扩增的质粒用Plasmid Kit(Qiagen)回收。连接用DNA Ligation Kit(Takara)或T4DNA连接酶(Boehringer Mannheim)进行。聚合酶链式反应(PCR)用ExpandTM PCR***(Boehringer Mannheim)进行。将QIAquickTM Gel Extraction Kit(Qiagen)用于从琼脂糖凝胶纯化PCR片段和提取DNA片段。
菌株
将构巢曲霉菌株NRRL1092用作硝酸还原酶基因终止子的供体。
表达宿主菌株黑曲霉QMJi016-14-1由Novozymes分离，且为从土壤分离的黑曲霉NN049184的衍生物。QMJi016-14-1经遗传修饰以破坏ku70、oah和pyrG的表达。
表达宿主菌株黑曲霉NN059180(pyrG–)由Novozymes分离并为从土壤分离的黑曲霉NN049184的衍生物。NN059180经遗传修饰以破坏淀粉葡糖苷酶活性的表达。黑曲霉NN059180中的中性蛋白酶I基因由大肠杆菌潮霉素B磷酸转移酶基因打断。
米曲霉Bech2描述于WO00/39322实施例1。
描述于WO2006/069289的米曲霉菌株#13-1由Novozymes分离。
描述于WO2006/069289的米曲霉IFO4177由Novozymes分离，并可从Institute for Fermentation,Osaka(IFO)Culture Collection of Microorganisms,17-85,Juso-honmachi,2-chome,Yodogawa-ku,Osaka532-8686,Japan获得。
质粒
表达盒质粒pJaL790(描述于专利公开WO2005070962)
表达盒质粒pHUda440(描述于专利公开WO2006/069289)
表达盒质粒pCBPhycutiprepro(描述于专利公开WO2008/017646)
pJaL574描述于WO07045248中的实施例9
黑曲霉的转化
曲霉属菌种的转化可使用一般的用于酵母转化的方法实现。对于本发明的优选步骤如下所述。
将黑曲霉宿主菌株接种至补充10mM尿苷的100ml的YPG培养基，并在32℃以80rpm温育16小时。收集沉淀，并用0.6M KCl洗涤，并重悬于含有20mg每ml的最终浓度的商业性β-葡聚糖酶产品(GLUCANEXTM,Novozymes A/S,
Figure BDA00002854686400173
Denmark)的20ml0.6M KCl。将悬液在32℃以80rpm温育直至形成原生质体，然后用STC缓冲液洗涤两次。将原生质体用血细胞计数器计数，并重悬，并调整于STC:STPC:DMSO为8:2:0.1溶液中至2.5x107个原生质体/ml的终浓度。将大约4μg的质粒DNA添加至100μl的原生质体悬液，轻柔的混合，并在冰上温育30分钟。添加一ml的SPTC，并将原生质体悬液在37℃温育30分钟。在添加10ml的50℃Cove-N顶层琼脂糖之后，将反应倾至Cove-N(tf)琼脂平板上，并将平板在32℃温育5日。
PCR扩增
Figure BDA00002854686400171
PCR条件
用于葡糖淀粉酶产生的SF培养
将选定的转化体的孢子接种于100ml的MLC培养基并在30℃培养2日。将10ml的MLC接种至100ml的MU-1培养基，并在30℃培养7日。上清通过离心获得。
用于肌醇六磷酸酶产生的SF培养
将选定的转化体的孢子接种于100ml的MSS培养基并在30℃培养2日。将10ml的MSS接种至100ml的MU-1培养基，并在32℃培养3日。上清通过离心获得。
Southern杂交
将选定的转化体的菌丝体从100ml YPG培养基中的过夜培养收获，用蒸馏水漂洗，干燥，并冻结于-80℃。将磨碎的菌丝体用蛋白酶K和RNaseA在65℃温育1小时。回收基因组DNA，即酚/CHCl3提取两次，接着进行EtOH沉淀，并重悬于蒸馏水。
非放射性探针使用PCR DIG探针合成试剂盒(Roche Applied Science,Indianapolis IN)遵循生产商的指示合成。将DIG标记的探针使用QIAquickTMGel Extraction Kit(QIAGEN Inc.,Valencia,CA)根据生产商的指示进行凝胶纯化。
将五微克的基因组DNA用合适的限制性酶完全消化16小时(40μl总体积，4U酶/μl DNA)，并在0.8%琼脂糖凝胶上运行。将DNA在凝胶中通过用0.2M HCl处理来片段化，变性(0.5M NaOH,1.5M NaCl)，和中和(1M Tris,pH7.5;1.5M NaCl)，以供后续在20X SSC中转移至Hybond N+膜(Amersham)。将DNA UV交联于膜，并在42℃在20ml DIG Easy Hyb(Roche DiagnosticsCorporation,Mannheim,Germany)中预杂交1小时。将变性的探针直接添加于DIG Easy Hyb缓冲液，并进行在42℃的过夜杂交。在后杂交洗涤(在2X SSC中在室温进行两次，每次5分钟，和在0.1X SSC中在68℃进行两次，每次15分钟)之后，遵循生产商的指示进行使用DIG检测***和CPD-Star(Roche)的化学发光检测。将DIG标记的DNA Molecular Weight Marker II(Roche)用作标准物标记。
葡糖淀粉酶活性
葡糖淀粉酶活性以淀粉葡糖苷酶单位(AGU)测量。AGU定义为在标准条件下每分钟水解1微摩尔麦芽糖的酶量，所述标准条件为：37℃，pH4.3，底物：23.2mM麦芽糖，缓冲液：0.1M乙酸，反应时间5分钟。
可使用自动分析仪***。将变旋酶添加至葡萄糖脱氢酶试剂使得任何存在的α-D-葡萄糖转化为β-D-葡萄糖。葡萄糖脱氢酶在上述反应中与β-D-葡萄糖起特异性反应，形成NADH，其使用光度计在340nm作为原始葡萄糖浓度的量度来确定。
淀粉葡糖苷酶温育：
底物：                           23.2mM麦芽糖
缓冲液：                         0.1M乙酸(盐)
pH：                             4.30±0.05
温育温度：                       37℃±1
反应时间：                       5分钟
酶工作范围：                     0.5-4.0AGU/mL
颜色反应：
GlucDH：                         430U/L
变旋酶：                         9U/L
NAD：                            0.21mM
缓冲液：                         0.12M磷酸盐；0.15MNaCl
pH：                             7.60±0.05
温育温度：                       37℃±1
反应时间：                       5分钟
波长：                           340nm
实施例1：在黑曲霉中通过推定的烷基硫酸酯酶启动子调控葡糖淀粉酶的表达
pIH142的构建
为了整合单个拷贝的酶表达盒，将pIH142构建为具有中性淀粉酶基因的5’和3’侧翼序列。
基于黑曲霉的基因组数据库中的核苷酸序列信息，设计引物组5NA1F和5NA1R，以及3NA1F和3NA1R来扩增中性淀粉酶I(NAI)基因的黑曲霉5’和3’侧翼区。
5NA1F：gtttaaacctatctgttccctccccccc(SEQ ID NO:2)
5NA1R：tttactagtgctagctgacttctatataaaaatgagta (SEQ ID NO:3)
3NA1F：tttctagagtatatgatggtactgctattc(SEQ ID NO:4)
3NA1R：gcggccgcgcattctcctagttactgatgact(SEQ ID NO:5)
用这些引物对组进行用黑曲霉NN059180的基因组DNA作为模板的PCR反应。将1.8kb和1.4kb产物条带在1.0%琼脂糖凝胶上纯化，并用于构建pIH142。
此外，质粒pIH142携带从米曲霉菌株#13-1(描述于WO2006069289由Novozymes分离)，使用引物对TCGA-F和TCGA-R扩增的葡糖淀粉酶基因的cDNA克隆。
TCGA-F：tgggggatccaccatgcgtttcacgctcct(SEQ ID NO:6)
TCGA-R：ctcgagttaattaactaccgccaggtgtcgttc(SEQ ID NO:7)
将扩增的葡糖淀粉酶基因融合于来自pJaL790的修饰的NA2启动子。
质粒pIH142亦含有来自构巢曲霉NRRL1092的pyrG基因作为选择性标志物基因。
pHiTe29的构建
通过PCR用引物对pHiTe29F和pHiTe29R使用黑曲霉NN059180的基因组DNA作为模板来扩增黑曲霉推定的烷基硫酸酯酶启动子的1.0kb区。
pHiTe29 F ctagctagcgccacccagattccaccgatatac(SEQ ID NO:8)
pHiTe29 R cgcggatcctaaatcctcaattctgaaggg(SEQ ID NO:9)
鉴定了推定的烷基硫酸酯酶基因的启动子序列，并基于由JGI(http://genome.jgi-psf.org/Aspni5/Aspni5.home.html)提供的基因组序列数据库设计引物。将获得的含有黑曲霉推定的硫酸酯酶基因启动子的1.0kb DNA片段从琼脂糖凝胶回收，并导入修饰型式的pIH142以替代启动子区。质粒制备在大肠杆菌DH5α中进行。将所得的质粒命名为pHiTe29。
pHiTe29包含表达盒，该表达盒含有由黑曲霉推定的烷基硫酸酯酶基因启动子和黑曲霉淀粉葡糖苷酶终止子(AMG终止子)调控的葡糖淀粉酶基因。此外，pHiTe29包含来自构巢曲霉的选择性标志物pyrG。
HUda1032的构建
通过PCR用引物对pPthiA F和pPthiA R使用米曲霉IFO4177的基因组DNA作为模板扩增米曲霉硫胺素可调节的thiA启动子的0.7kb区。
pPthiA F tcaggctagcaattgattacgggatcccat(SEQ ID NO:10)
pPthiA R gagtagatctgtttcaagttgcaatgacta(SEQ ID NO:11)
将获得的含有米曲霉thiA启动子的PCR片段从琼脂糖凝胶回收，并导入pIH142的修饰型式以替代启动子区。将连接混合物转化入大肠杆菌DH5α以构建表达质粒pHUda1032，其包含表达盒，所述表达盒含有由米曲霉thiA启动子和黑曲霉淀粉葡糖苷酶终止子(AMG终止子)调控的葡糖淀粉酶基因。此外，所述质粒包含来自构巢曲霉的选择性标志物pyrG。
将pHiTe29和pHUda1032导入黑曲霉NN059180。转化体从基本培养基Cove-N(tf)选择。
将随机选择的转化体接种在含有0.2g/l潮霉素B的Cove-N平板上，潮霉素B为杀灭不表达位于黑曲霉NN059180的NA1基因座的大肠杆菌潮霉素B磷酸转移酶基因的细胞的药剂。将无法在含有潮霉素B的Cove-N平板上生长的菌株纯化，并对其进行Southern印迹分析以确认pHiTe29和pHUda1032中的表达盒是否作为单个拷贝在限定的基因座正确整合。
在包含正确整合事件的菌株中，选择来自每个构建体的两个菌株，29-4,5和1032-4,5。确定了每个转化体上清的葡糖淀粉酶活性。
表1显示选择的转化体的平均葡糖淀粉酶活性，相对于pHUda1032的转化体的平均活性。
表1：表达结果
菌株 质粒 启动子 葡糖淀粉酶相对活性
29-4,5 pHiTe29 推定的烷基硫酸酯酶基因 1.19
1032-4,5 pHuda1032 ThiA 1.00
Figure IDA00002854686700011
Figure IDA00002854686700031

Claims (11)

1.一种有启动子活性的分离的多核苷酸，其选自下组：
(a)多核苷酸，其包含具有启动子活性的核苷酸序列，所述核苷酸序列与SEQ ID NO:1的核苷酸序列具有至少60%，更优选至少65%，更优选至少70%，更优选至少75%，更优选至少80%，更优选至少85%，甚至更优选至少90%，且最优选至少95%序列同一性；和
(b)多核苷酸，其具有启动子活性，其在至少低严格条件，更优选至少中等严格条件，甚至更优选至少中等-高严格条件，最优选至少高严格条件，且甚至最优选至少非常高严格条件下与SEQ ID NO:1的核苷酸序列或其全长互补链杂交。
2.权利要求1的多核苷酸，其包含或组成为SEQ ID NO:1的核苷酸序列，或其具有启动子活性的片段。
3.一种核酸构建体，其包含权利要求1的多核苷酸，所述多核苷酸可操作地连接于一个或多个(几个)调控序列，所述调控序列指导所需的多肽在表达宿主中的产生。
4.一种重组表达载体，其包含权利要求3的核酸构建体。
5.一种重组宿主细胞，其包含权利要求3的核酸构建体。
6.一种产生所需多肽的方法，其包括：(a)在有助于所述多肽产生的条件下培养包含权利要求3的核酸构建体的宿主细胞；和(b)回收所述多肽。
7.权利要求6的方法，其中所述宿主细胞是丝状真菌。
8.权利要求7的方法，其中所述丝状真菌选自下组：枝顶孢霉属(Acremonium)、曲霉属(Aspergillus)、短梗霉属(Aureobasidium)、烟管霉属(Bjerkandera)、拟蜡菌属(Ceriporiopsis)、金孢子菌属(Chrysosporium)、鬼伞属(Coprinus)、革盖菌属(Coriolus)、隐球菌属(Cryptococcus)、Filibasidium、镰孢属(Fusarium)、腐质霉属(Humicola)、梨孢菌属(Magnaporthe)、毛霉属(Mucor)、毁丝霉属(Myceliophthora)、新考玛脂霉属(Neocallimastix)、脉孢菌属(Neurospora)、拟青霉属(Paecilomyces)、青霉属(Penicillium)、平革菌属(Phanerochaete)、射脉菌属(Phlebia)、瘤胃壶菌属(Piromyces)、侧耳属(Pleurotus)、裂褶菌属(Schizophyllum)、踝节菌属(Talaromyces)、嗜热子囊菌属(Thermoascus)、梭孢壳属(Thielavia)、弯颈霉属(Tolypocladium)、栓菌属(Trametes)和木霉属(Trichoderma)。
9.权利要求7的方法，其中所述丝状真菌选自下组：泡盛曲霉(Aspergillusawamori)、烟曲霉(Aspergillus fumigatus)、臭曲霉(Aspergillus foetidus)、日本曲霉(Aspergillus japonicus)、构巢曲霉(Aspergillus nidulans)、黑曲霉(Aspergillusniger)、米曲霉(Aspergillus oryzae)、杆孢状镰孢(Fusarium bactridioides)、禾谷镰孢(Fusarium cerealis)、库威镰孢(Fusarium crookwellense)、大刀镰孢(Fusariumculmorum)、禾本科镰孢(Fusarium graminearum)、禾赤镰孢(Fusarium graminum)、异孢镰孢(Fusarium heterosporum)、合欢木镰孢(Fusarium negundi)、尖镰孢(Fusarium oxysporum)、多枝镰孢(Fusarium reticulatum)、粉红镰孢(Fusariumroseum)、接骨木镰孢(Fusarium sambucinum)、肤色镰孢(Fusarium sarcochroum)、拟分枝孢镰孢(Fusarium sporotrichioides)、硫色镰孢(Fusarium sulphureum)、圆镰孢(Fusarium torulosum)、拟丝孢镰孢(Fusarium trichothecioides)、镶片镰孢(Fusarium venenatum)、黑刺烟管霉(Bjerkandera adusta)、干拟蜡菌(Ceriporiopsisaneirina)、干拟蜡菌、Ceriporiopsis caregiea、Ceriporiopsis gilvescens、Ceriporiopsispannocinta、Ceriporiopsis rivulosa、Ceriporiopsis subrufa、虫拟蜡菌(Ceriporiopsissubvermispora)、嗜角质金孢子菌(Chrysosporium keratinophilum)、Chrysosporiumlucknowense、热带金孢子菌(Chrysosporium tropicum)、Chrysosporium merdarium、Chrysosporium inops、毡金孢子菌(Chrysosporium pannicola)、Chrysosporiumqueenslandicum、Chrysosporium zonatum、灰盖鬼伞(Coprinus cinereus)、毛革盖菌(Coriolus hirsutus)、特异腐质霉(Humicola insolens)、疏棉状腐质霉(Humicolalanuginosa)、米黑毛霉(Mucor miehei)、嗜热毁丝霉(Myceliophthora thermophila)、粗糙脉孢菌(Neurospora crassa)、产紫青霉(Penicillium purpurogenum)、黄孢平革菌(Phanerochaete chrysosporium)、辐射射脉菌(Phlebia radiata)、刺芹侧耳(Pleurotus eryngii)、土生梭孢霉(Thielavia terrestris)、长绒毛栓菌(Trametesvillosa)、变色栓菌(Trametes versicolor)、哈茨木霉(Trichoderma harzianum)、康宁木霉(Trichoderma koningii)、长枝木霉(Trichoderma longibrachiatum)、里氏木霉(Trichoderma reesei)和绿色木霉(Trichoderma viride)。
10.权利要求6-9任一项的方法，其中所述多肽是酶。
11.权利要求10的方法，其中所述酶选自下组：蛋白酶、淀粉酶、葡糖淀粉酶、脂肪酶、纤维素酶、肌醇六磷酸酶、氧化酶、氧还酶和果胶酶。
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