CN107148472A

CN107148472A - 芽孢杆菌属物种的丝氨酸蛋白酶

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Publication number: CN107148472A
Application number: CN201580058592.5A
Authority: CN
Inventors: M·科尔克曼; A·H·凯利特-史密斯; R·梅耶达尔; L·M·巴别
Original assignee: Danisco USA Inc
Current assignee: Danisco USA Inc; Danisco US Inc
Priority date: 2014-10-27
Filing date: 2015-10-27
Publication date: 2017-09-08
Also published as: US20180010074A1; EP3224357A1; WO2016069557A1; US20200239814A1

Abstract

本公开涉及从芽孢杆菌属物种克隆的丝氨酸蛋白酶及其变体。含有丝氨酸蛋白酶的组合物适合用于清洁织物和硬表面，以及用于各种工业应用。

Description

芽孢杆菌属物种的丝氨酸蛋白酶

本公开涉及从芽孢杆菌属的物种(Bacillus spp.)克隆的丝氨酸蛋白酶及其变体。含有丝氨酸蛋白酶的组合物适合用于清洁织物和硬表面，以及用于各种工业应用。

丝氨酸蛋白酶是具有启动蛋白质肽键水解的活性位点丝氨酸的酶(EC编号3.4.21)。基于它们的结构，存在两大类丝氨酸蛋白酶：胰凝乳蛋白酶样(胰蛋白酶样)和枯草杆菌蛋白酶样。原型枯草杆菌蛋白酶(EC编号3.4.21.62)最初从枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)获得。枯草杆菌蛋白酶及其同源物是MEROPS分类方案的S8肽酶家族的成员。家族S8的成员在其氨基酸序列中具有顺序为Asp、His和Ser的催化三联体。

尽管在工业酶领域很久以来就已经知道丝氨酸蛋白酶，但是仍然需要适合于特定条件和用途的另外的丝氨酸蛋白酶。

本发明的组合物和方法涉及从芽孢杆菌属的物种克隆的重组丝氨酸蛋白酶及其变体。含有丝氨酸蛋白酶的组合物适合用于清洁织物和硬表面，以及用于各种工业应用。

在一些实施例中，本发明是枯草杆菌蛋白酶的BspE04637进化枝。在一些实施例中，本发明是BspE04637进化枝枯草杆菌蛋白酶的重组多肽或其活性片段。在一些实施例中，枯草杆菌蛋白酶的BspE04637进化枝包括含有DTGIXXXHXDLXXXGGXSVFXXXXXXXXXXDXXGH(SEQ ID NO:31)基序的枯草杆菌蛋白酶或重组多肽或其活性片段，其中初始D是活性位点天冬氨酸，末端H是活性位点组氨酸，并且X是任何氨基酸(“基序1”)。在其他实施例中，枯草杆菌蛋白酶的BspE04637进化枝包括含有DTGIXXXHXDLXXXGGXSVFXXXXXXDPXXDXXGH(SEQ ID NO:32)基序的枯草杆菌蛋白酶或重组多肽或其活性片段，其中初始D是活性位点天冬氨酸，末端H是活性位点组氨酸，并且X是任何氨基酸(“基序2”)。在又进一步的实施例中，枯草杆菌蛋白酶的BspE04637进化枝包括含有DTGIXXXHXDLNVXGGXSVFXXXXXXXXXXDXXGH(SEQ ID NO:33)基序的枯草杆菌蛋白酶或重组多肽或其活性片段，其中初始D是活性位点天冬氨酸，末端H是活性位点组氨酸，并且X是任何氨基酸(“基序3”)。在又另一个实施例中，枯草杆菌蛋白酶的BspE04637进化枝包括含有DTGIXXXHXDLNVXGGXSVFXXXXXXDPXXDXXGH(SEQ ID NO:34)基序的枯草杆菌蛋白酶或重组多肽或其活性片段，其中初始D是活性位点天冬氨酸，末端H是活性位点组氨酸，并且X是任何氨基酸(“基序4”)。在一些实施例中，枯草杆菌蛋白酶的BspE04637进化枝包括含有DTGIDXXHXDLNVXGGXS VFXXXXXXXXXXDXXGH(SEQ ID NO:35)基序的枯草杆菌蛋白酶或重组多肽或其活性片段，其中初始D是活性位点天冬氨酸且末端H是活性位点组氨酸，并且X是任何氨基酸(“基序5”)。在一些实施例中，枯草杆菌蛋白酶的BspE04637进化枝包括含有DTGIDXNHXDL NVRGGXSVFTXXXXX DPXXDXXGH(SEQ ID NO:36)基序的枯草杆菌蛋白酶或重组多肽或其活性片段，其中初始D是活性位点天冬氨酸，末端H是活性位点组氨酸，并且X是任何氨基酸(“基序6”)。在一些实施例中，枯草杆菌蛋白酶的BspE04637进化枝包括含有DTGIDXNHXDLNVRGGXSVFTXXXXX DPYYDXXGH(SEQ ID NO:37)基序的枯草杆菌蛋白酶或重组多肽或其活性片段，其中初始D是活性位点天冬氨酸且末端H是活性位点组氨酸，并且X是任何氨基酸(“基序7”)。

在一些实施例中，本发明是包含与SEQ ID NO:3、6或9的氨基酸序列具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少99％氨基酸序列同一性的氨基酸序列的重组多肽或其活性片段。在一些实施例中，重组多肽或其活性片段包含与SEQID NO:3、6或9的氨基酸序列具有至少80％氨基酸序列同一性的氨基酸序列。在一些实施例中，重组多肽或其活性片段包含与SEQ ID NO:3、6或9的氨基酸序列具有至少80％氨基酸序列同一性的氨基酸序列，条件是所述多肽或其活性片段不包括BAD02409或JP2003325186-0001。

在一些实施例中，重组多肽具有蛋白酶活性或枯草杆菌蛋白酶活性，特别是酪蛋白水解活性。在一些实施例中，重组多肽在6至12的pH范围内保留其最大蛋白酶活性的至少50％。在一些实施例中，重组多肽在60℃至80℃的温度范围内保留其最大蛋白酶活性的至少50％。在一些实施例中，重组多肽在洗涤剂组合物(包括自动餐具洗涤剂和衣物洗涤剂)中具有清洁活性。

在一些实施例中，本发明是包含表面活性剂和上述重组多肽的组合物。在一些实施例中，表面活性剂选自：非离子表面活性剂、阴离子表面活性剂、阳离子表面活性剂、兼性离子表面活性剂、两性表面活性剂、半极性非离子表面活性剂及其组合。在一些实施例中，组合物是洗涤剂组合物，例如衣物洗涤剂、织物软化洗涤剂、餐具洗涤剂和硬表面清洁洗涤剂。在一些实施例中，组合物进一步包含至少一种钙离子和/或锌离子、至少一种稳定剂、至少一种漂白剂、磷酸盐或硼酸盐。在一些实施例中，组合物不含磷酸盐和/或不含硼酸盐。在一些实施例中，组合物是颗粒、粉末、固体、棒状、液体、片剂、凝胶、糊状或单位剂量组合物。在一些实施例中，组合物进一步包含选自以下的一种或多种另外的酶或酶衍生物：酰基转移酶、α-淀粉酶、β-淀粉酶、α-半乳糖苷酶、***糖苷酶、芳基酯酶、β-半乳糖苷酶、角叉菜胶酶、过氧化氢酶、纤维二糖水解酶、纤维素酶、软骨素酶、角质酶、内切β-1,4-葡聚糖酶、内切β-甘露聚糖酶、酯酶、外切甘露聚糖酶、半乳聚糖酶、葡糖淀粉酶、半纤维素酶、透明质酸酶、角蛋白酶、漆酶、乳糖酶、木质素酶、脂肪酶、脂肪氧合酶、甘露聚糖酶、氧化酶、果胶裂解酶、果胶乙酰酯酶、果胶酶、戊聚糖酶、过氧化物酶、酚氧化酶、磷酸酶、磷脂酶、植酸酶、聚半乳糖醛酸酶、蛋白酶、支链淀粉酶、还原酶、鼠李糖半乳糖醛酸酶、β-葡聚糖酶、鞣酸酶、转谷氨酰胺酶、木聚糖乙酰酯酶、木聚糖酶、木葡聚糖酶、木糖苷酶、金属蛋白酶、另外的丝氨酸蛋白酶及其组合。

在一些实施例中，本发明是一种清洁的方法，该方法包括使表面或物品与上文所列组合物接触。在一些实施例中，本发明是用于生产重组多肽的方法，该方法包括用包含编码上述重组多肽的多核苷酸的表达载体稳定转化宿主细胞。

附图简述

图1提供了用于表达BspE04637蛋白酶的质粒图。

图2提供了BspE04637蛋白酶对DMC底物的蛋白酶活性的图。

图3A至3F提供了包含BspE04637和SWT183_1430046的枯草杆菌蛋白酶的MUSCLE多重序列比对。

图4提供了包括BspE04637和SWT183_1430046蛋白酶的枯草杆菌蛋白酶的***发生树。

图5示出了在枯草杆菌蛋白酶的BspE04637进化枝中发现的序列基序变化的潜在结构后果。

描述了与来自芽孢杆菌属物种的重组丝氨酸蛋白酶有关的组合物和方法。组合物和方法部分地基于如下观察：在碱性反应条件和升高的温度下重组BspE04637和SWT_1430046等在表面活性剂存在下具有蛋白酶活性。BspE04637和SWT_1430046的这些特性使这些蛋白酶非常适合用于清洁织物和硬表面，以及用于纺织品、皮革和羽毛处理。新的蛋白酶也非常适合包含在用于蛋白质降解的组合物中，包括但不限于衣物和餐具洗涤剂。

在详细地描述本发明的组合物和方法之前，为了清楚起见定义以下术语。未定义的术语和缩写应当符合本领域中所使用的常规含义。除非本文另有定义，否则本文所使用的全部科技术语都具有如本领域普通技术人员通常理解的相同含义。除非另有说明，本公开的实践涉及通常用于分子生物学、蛋白质工程和微生物学的常规技术。尽管与本文所述方法和材料类似或等同的任何方法和材料可用于本公开的实践，但是本文描述了一些合适的方法和材料。通过参考作为一个整体的说明书，更全面地描述下面即将定义的术语。

除非上下文另有明确指示，如本文所使用的，单数“一个/一种”(a/an)和“该/所述”(the)包括复数。除非另有说明，否则核酸序列从左至右以5'至3'取向写出；并且氨基酸序列从左至右以氨基至羧基取向写出。应当理解的是，在没有相反的指示的情况下，本公开不限于本文所述的具体方法、方案和试剂。

在本说明书全文中给出的每一最大数值限度旨在包括每一较低数值限度，如同此类较低数值限度在本文中明确写出一样。在本说明书全文中给出的每一最小数值限度将包括每一较高数值限度，如同此类较高数值限度在本文中明确写出一样。在本说明书全文中给出的每一数值范围将包括落入此类较宽数值范围内的每一较窄数值范围，如同此类较窄数值范围在本文中全部明确写出一样。

如本文使用的，关于数值，术语“约”是指数值的+/-0.5的范围，除非术语在上下文中另有具体定义。例如，短语“约6的pH值”是指pH值为从5.5至6.5，除非pH值另有具体定义。

如本文使用的，术语“蛋白酶”(protease和proteinase)是指具有分解蛋白质和肽的能力的酶。蛋白酶具有通过在形成蛋白质的肽或多肽链中将氨基酸连接在一起的肽键的水解进行“蛋白水解”的能力。蛋白酶作为蛋白质消化酶的这种活性被称为“蛋白水解活性”。存在许多熟知的程序用于测量蛋白水解活性。例如，蛋白水解活性可以通过分析各自蛋白酶水解合适底物的能力的比较试验来确定。可用于分析蛋白酶或蛋白水解活性的示例性底物包括但不限于二甲基酪蛋白(西格玛公司(Sigma)C-9801)、牛胶原(西格玛公司(Sigma)C-9879)、牛弹性蛋白(西格玛公司(Sigma)E-1625)和牛角蛋白(ICN生物医学公司902111)。使用这些底物的比色测定是本领域熟知的(参见例如WO 99/34011和美国专利号6,376,450)。pNA肽基测定(参见例如，德尔玛(Del Mar)等人，分析生物化学(AnalBiochem)，99:316-320，1979)还可用于确定活性酶浓度。该测定测量当酶水解可溶性合成底物例如琥珀酰-丙氨酸-丙氨酸-脯氨酸-苯丙氨酸-对硝基苯胺(suc-AAPF-pNA)时释放对硝基苯胺的速率。在分光光度计上在410nm下测量来自水解反应的黄色的生成速率并且该速率与活性酶浓度成正比。另外，在280纳米(nm)处的吸光度测量可以用于确定纯化蛋白质样品中的总蛋白质浓度。底物/蛋白质浓度的活性给出了酶比活性。

关于多肽的术语“变体”是指与指定的野生型、亲本或参比多肽不同的多肽，因为它包括一种或多种天然存在的或人造的氨基酸取代、***或缺失。类似地，关于多核苷酸，术语“变体”是指在核苷酸序列中与指定的野生型、亲本或参比多核苷酸不同的多核苷酸。野生型、亲本或参比多肽或多核苷酸的身份将从上下文中显而易见。

如本文使用的，“芽孢杆菌属”包括如本领域技术人员已知的“芽孢杆菌”属内的所有物种，包括但不限于：枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、迟缓芽胞杆菌、短芽孢杆菌、嗜热脂肪芽胞杆菌、嗜碱芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌、克劳氏芽孢杆菌、耐盐芽孢杆菌(B.halodurans)、巨大芽孢杆菌、凝结芽孢杆菌、环状芽孢杆菌、吉氏芽孢杆菌和苏云金芽孢杆菌。据认识，芽孢杆菌属继续经历分类学重组。因此，该属旨在包括已重新分类的物种，包括但不限于：例如嗜热脂肪芽孢杆菌(B.stearothermophilus)(现在称为“嗜热脂肪土芽孢杆菌(Geobacillus stearothermophilus)”)或多粘芽孢杆菌(B.polymyxa)(现在是“多粘类芽孢杆菌(Paenibacillus polymyxa)”)的此类生物体。在胁迫环境条件下的抗性内生孢子的产生被认为是芽孢杆菌属的定义性特性，尽管这个特征也适用于最近命名的脂环酸芽孢杆菌属、双芽孢杆菌属(Amphibacillus)、硫胺素芽孢杆菌属(Aneurinibacillus)、厌氧芽孢杆菌属(Anoxybacillus)、短芽孢杆菌属、线性杆菌属(Filobacillus)、薄壁芽孢杆菌属(Gracilibacillus)、喜盐芽孢杆菌属(Halobacillus)、类芽孢杆菌属、需盐芽孢杆菌属(Salibacillus)、耐热芽孢杆菌属(Thermobacillus)、脲芽胞杆菌属(Ureibacillus)和枝芽孢杆菌属(Virgibacillus)。

如本文使用的，术语“突变”是指对参比氨基酸或核酸序列进行的改变。该术语旨在涵盖取代、***和缺失。

如本文使用的，术语“载体”是指用于将一个或多个核酸引入或转移到靶细胞或组织中的核酸构建体。典型地，载体用于将外源DNA引入细胞或组织中。载体包括质粒、克隆载体、噬菌体、病毒(例如病毒载体)、粘粒、表达载体、穿梭载体等。典型地，载体包括复制起点、多克隆位点和可选择标记。典型地，将载体***靶细胞的过程被称为转化。在一些实施例中，本发明包括：包含可操作地连接到合适的前序列(例如分泌、信号肽序列等)的编码丝氨酸蛋白酶多肽(例如，前体或成熟丝氨酸蛋白酶多肽)的DNA序列的载体，该载体能够在合适的宿主中实现DNA序列的表达，以及重组多肽链的折叠和易位。

如本文使用的，在将核酸序列引入细胞中的上下文中，术语“引入”是指适合于将核酸序列转移到细胞中的任何方法。这种引入方法包括但不限于：原生质体融合、转染、转化、电穿孔、缀合和转导。转化是指由摄取、任选的基因组掺入和遗传物质(例如DNA)的表达引起的细胞的遗传改变。

如本文使用的，当核酸与另一个核酸序列一起置于功能关系时，该核酸与另一个核酸序列“可操作地连接”。例如，如果启动子影响编码序列的转录，启动子或增强子可操作地连接到核苷酸编码序列。如果核糖体结合位点被定位以便促进编码序列的翻译，该核糖体结合位点可以可操作地连接到编码序列。典型地，“可操作地连接的”DNA序列是连续的。然而，增强子不需要是连续的。通过在方便的限制位点处连接来实现连接。如果这样的位点不存在，则可以按照常规实践使用合成的寡核苷酸衔接子或接头。

如本文使用的，术语“基因”是指编码多肽并且包括编码区之前和之后的区域的多核苷酸(例如，DNA区段)。在一些情况下，基因包括个体编码区段(外显子)之间的间隔序列(内含子)。

如本文使用的，“重组体”当关于细胞使用时，典型地表明细胞已经通过引入外源核酸序列而被修饰，或者细胞衍生自如此修饰的细胞。例如，重组细胞可以包含在天然(非重组)形式的细胞中不以相同形式存在的基因，或者重组细胞可以包含已经被修饰并且重新引入细胞中的天然基因(发现于细胞的天然形式中)。重组细胞可以包含细胞内源的核酸，该核酸已经被修饰而不从细胞中除去该核酸；此类修饰包括通过基因替换、位点特异性突变以及本领域普通技术人员已知的相关技术获得的那些。重组DNA技术包括用于在体外生产重组DNA并且将该重组DNA转移到其可以被表达或传播的细胞中从而生产重组多肽的技术。多核苷酸或核酸的“重组”(recombination和recombining)通常是指装配或组合两个或更多个核酸或多核苷酸链或片段以产生新的多核苷酸或核酸。

如果在其天然状态下或当通过本领域技术人员已知的方法操纵时，核酸或多核苷酸可以被转录和/或翻译以生产多肽或其片段，那么将该核酸或多核苷酸称为“编码”该多肽。这样的核酸的反义链也被称为编码该序列。

术语“宿主菌株”和“宿主细胞”是指对于包含感兴趣的DNA序列的表达载体而言合适的宿主。

“蛋白质”或“多肽”包含氨基酸残基的聚合序列。术语“蛋白质”和“多肽”在本文中可互换地使用。在本公开全文中使用了符合IUPAC-IUB生物化学术语联合委员会(JointCommission on Biochemical Nomenclature，JCBN)而定义的氨基酸的单字母和3字母代码。单字母X是指二十个氨基酸中的任一个。还应当理解，由于遗传密码的简并性，多肽可以由多于一种核苷酸序列编码。突变可以由亲本氨基酸的单个字母代码命名，随后是位置编号，然后是变体氨基酸的单个字母代码。例如，将在位置87处的甘氨酸(G)突变为丝氨酸(S)表示为“G087S”或“G87S”。当描述修饰时，位置后面在括号中列出的氨基酸表示由任何列出的氨基酸在该位置处的取代清单。例如，6(L,I)意指位置6可以被亮氨酸或异亮氨酸取代。有时，在序列中，将斜线(/)用于定义取代，例如，F/V表示特定位置，在该位置处可以具有苯丙氨酸或缬氨酸。

“前序列”或“前肽序列”是指在信号肽序列与成熟蛋白酶序列之间的、蛋白酶的正确折叠和分泌所必需的氨基酸序列；它们有时被称为分子内伴侣。前序列或前肽序列的切割导致成熟的活性蛋白酶。细菌丝氨酸蛋白酶通常表达为前酶。

术语“信号序列”和“信号肽”是指可以参与蛋白质的成熟或前体形式的分泌或定向转运的氨基酸残基序列。典型地，信号序列位于前体或成熟蛋白序列的N-末端。信号序列可以是内源的或外源的。成熟蛋白质中一般不存在信号序列。典型地，在蛋白质转运后，信号序列通过信号肽酶从蛋白质切割。

术语“成熟”形式的蛋白质、多肽或肽是指没有信号肽序列和前肽序列的蛋白质、多肽或肽的功能形式。

术语“前体”形式的蛋白质或肽是指具有可操作地连接到该蛋白质的氨基或羰基末端的原序列的成熟形式的蛋白质。前体还可以具有可操作地连接到原序列的氨基末端的“信号”序列。前体还可以具有涉及翻译后活性的另外的多肽(例如，从其切割的多肽以留下成熟形式的蛋白质或肽)。

关于氨基酸序列或核酸序列，术语“野生型”表示氨基酸序列或核酸序列是天然的或天然存在的序列。如本文使用的，术语“天然存在的”是指在自然界中发现的任何物质(例如蛋白质、氨基酸或核酸序列)。相反，术语“非天然存在”是指在自然界中没有发现的任何物质(例如，在实验室中生产的重组核酸和蛋白质序列、或野生型序列的修饰)。

如本文使用的，关于氨基酸残基位置，“对应于”(corresponding to或corresponds to)或“对应”是指在蛋白质或肽中所列举位置处的氨基酸残基，或类似于、同源于或等同于蛋白质或肽中所列举残基的氨基酸残基。如本文使用的，“对应区域”通常是指相关蛋白质或参比蛋白质中的类似位置。

术语“衍生自”和“获自”不仅是指由所讨论的生物体的菌株生产或可以由其生产的蛋白质，而且是指由从此类菌株分离的DNA序列编码并且在含有此类DNA序列的宿主生物体中生产的蛋白质。另外，该术语是指由合成的和/或cDNA来源的DNA序列编码并且具有所讨论的蛋白质的鉴定特征的蛋白质。举例来说，“来源于芽孢杆菌属的蛋白酶”是指具有由芽孢杆菌属天然生产的蛋白水解活性的那些酶，以及丝氨酸蛋白酶，如由芽孢杆菌属来源生产但是通过使用遗传工程技术由用编码丝氨酸蛋白酶的核酸转化的其他宿主细胞生产的那些。

在两个多核苷酸或多肽序列的上下文中，术语“同一性”是指在两个序列中的核酸或氨基酸在比对最大对应关系时相同，如使用以下描述的或本领域已知的序列比较或分析算法测量的。

如本文使用的，“％同一性”或“百分比同一性”或“PID”是指蛋白质序列同一性。百分比同一性可以使用本领域已知的标准技术来确定。有用的算法包括BLAST算法(参见阿特休尔(Altschul)等人，分子生物学杂志(J Mol Biol)，215:403-410，1990；以及卡林(Karlin)和阿特休尔(Altschul)，美国国家科学院院刊(Proc Natl Acad Sci USA)，90:5873-5787，1993)。BLAST程序使用多个搜索参数，其中大部分设置为默认值。NCBI BLAST算法按照生物相似性找到最相关的序列，但是不推荐用于少于20个残基的查询序列(阿特休尔(Altschul)等人，核酸研究(Nucleic Acids Res)，25:3389-3402，1997；以及谢弗(Schaffer)等人，核酸研究(Nucleic Acids Res.)29:2994-3005，2001)。核酸序列搜索的示例性默认BLAST参数包括：相邻字长阈值＝11；E值截止值(cutoff)＝10；打分矩阵(Scoring Matrix)＝NUC.3.1(匹配＝1，错配＝-3)；空位开放(Gap Opening)＝5；以及空位延伸＝2。氨基酸序列搜索的示例性默认BLAST参数包括：字长大小＝3；E值截止值＝10；打分矩阵＝BLOSUM62；空位开放＝11；以及空位延伸＝1。百分比(％)氨基酸序列同一性值由匹配相同残基的数值除以“参比”序列的残基总数(包括由程序为最佳/最大比对创建的任何空位)来确定。BLAST算法将“参比”序列称为“查询”序列。

如本文使用的，“同源蛋白质”或“同源蛋白酶”是指在一级、二级和/或三级结构中具有不同相似性的蛋白质。当比对蛋白质时，蛋白质同源性可以是指线性氨基酸序列的相似性。蛋白质序列的同源搜索可以使用来自NCBI BLAST的BLASTP和PSI-BLAST使用阈值(E值截止值)0.001进行。(阿特休尔(Altschul SF)、迈德(Madde TL)、谢弗(Shaffer AA)、张(Zhang J)、张(Zhang Z)、米勒(Miller W)、李普曼(Lipman DJ)，空位BLAST和PSI BLAST：新一代蛋白质数据库搜索程序(Gapped BLAST and PSI BLAST a new generation ofprotein database search programs)，核酸研究(Nucleic Acids Res)1997年第1组；25(17):3389-402)。使用该信息，可以将蛋白质序列分组。可以使用氨基酸序列构建***发生树。可以在例如Vector NTI Advance套件的程序中输入氨基酸序列，并且可以使用邻接(Neighbor Joining，(NJ))法创建引导树(斎藤(Saitou)和内伊(Nei)，分子生物学与进化(Mol Biol Evol)，4:406-425，1987)。可以使用针对序列距离的木村(Kimura)校正并且忽略具有空位的位置来计算树结构。程序例如AlignX可以在***发生树上显示的分子名称之后的括号内显示计算的距离值。

了解分子之间的同源性可以揭示分子的进化历史以及它们的功能信息；如果新测序的蛋白质与已经表征的蛋白质同源，则存在新蛋白质的生物化学功能的强烈指示。两个实体之间最基本的关系是同源性；如果两个分子来源于共同的祖先，则它们被称为是同源的。同源分子或同系物可以分为两类，旁系同源物和直系同源物。旁系同源物是存在于一个物种内的同系物。旁系同源物在它们的详细生物化学功能上往往不同。直系同源物是存在于不同物种内并且具有非常相似或完全相同功能的同系物。蛋白质超家族是可以推断出共同祖先的蛋白质的最大分组(进化枝)。通常这个共同祖先是基于序列比对和机械相似性。典型地，超家族包含几个在该家族内显示序列相似性的蛋白质家族。基于MEROPS蛋白酶分类***，术语“蛋白质宗族”通常用于蛋白酶超家族。

CLUSTAL W算法是序列比对算法的另一个实施例(参见汤普森(Thompson)等人，核酸研究(Nucleic Acids Res)，22:4673-4680，1994)。CLUSTAL W算法的默认参数包括：空位开放罚分＝10.0；空位延伸罚分＝0.05；蛋白质重量矩阵＝BLOSUM系列；DNA重量矩阵＝IUB；延迟发散序列％＝40；空位分隔距离＝8；DNA转换重量＝0.50；列表亲水残基＝GPSNDQEKR；使用负性矩阵＝关；切换特殊残基罚分＝开；切换亲水罚分＝开；以及切换结束空位分隔罚分＝关。在CLUSTAL算法中，包括在任一末端发生的缺失。例如，500个氨基酸的多肽的任一末端(或多肽内)具有5个氨基酸缺失的变体相对于“参比”多肽具有99％(495/500个相同残基×100)的百分比序列同一性。这样的变体将被与该多肽具有“至少99％的序列同一性”的变体所涵盖。

当核酸或多核苷酸至少部分或完全地与其他组分(包括但不限于例如其他蛋白质、核酸、细胞等)分离时，该核酸或多核苷酸是“分离的”。类似地，当多肽、蛋白质或肽至少部分或完全地与其他组分(包括但不限于例如其他蛋白质、核酸、细胞等)分离时，该多肽、蛋白质或肽是“分离的”。以摩尔计，在组合物中分离的种类比其他种类更丰富。例如，分离的种类可以包含存在的所有大分子种类的至少约60％、约65％、约70％、约75％、约80％、约85％、约90％、约91％、约92％、约93％、约94％、约95％、约96％、约97％、约98％、约99％、或约100％(以摩尔计)。优选地，将感兴趣的种类纯化至基本均一性(即，通过常规检测方法不能在组合物中检测到污染物种类)。可以分别使用本领域熟知的许多技术例如核酸或蛋白质样品的琼脂糖或聚丙烯酰胺凝胶电泳，接着通过染色后可视化来确定纯度和均一性。如果需要，可以使用高分辨率技术例如高效液相色谱法(HPLC)或类似方法来纯化物质。

术语“纯化的”如应用于核酸或多肽时通常表示基本上不含其他组分的核酸或多肽，如通过本领域熟知的分析技术确定的(例如，纯化的多肽或多核苷酸在电泳凝胶、色谱洗脱液和/或经历密度梯度离心的介质中形成离散的带)。例如，在电泳凝胶中产生基本上一条带的核酸或多肽是“纯化的”。纯化的核酸或多肽是至少约50％纯的，通常是至少约约60％、约65％、约70％、约75％、约80％、约85％、约90％、约91％、约92％、约93％、约94％、约95％、约96％、约97％、约98％、约99％、约99.5％、约99.6％、约99.7％、约99.8％或更加纯的(例如，以摩尔计的重量百分比)。在相关意义上，当在应用纯化或富集技术之后存在一种分子的浓度的大幅度增加时，对于该分子而言组合物被富集了。术语“富集”是指化合物、多肽、细胞、核酸、氨基酸或其他特定物质或组分以高于起始组合物的相对或绝对浓度存在于组合物中。

如本文使用的，术语“功能测定”是指提供蛋白质活性指示的测定法。在一些实施例中，该术语是指其中针对以其通常的能力发挥功能的能力来分析蛋白质的测定***。例如，在蛋白酶的情况下，功能测定涉及确定蛋白酶水解蛋白质底物的有效性。

术语“清洁活性”是指在本公开的蛋白水解、水解、清洁或其他过程期间主要的条件下由丝氨酸蛋白酶多肽或参比蛋白酶实现的清洁性能。在一些实施例中，丝氨酸蛋白酶多肽或参比蛋白酶的清洁性能可以通过使用用于清洁在物品或表面上的一种或多种不同酶敏感性污渍(例如，由食物、草地、血液、墨汁、奶、油和/或卵蛋白引起的污渍)的各种测定来确定。变体或参比蛋白酶的清洁性能可以通过使在物品或表面上的污渍经受一个或多个标准洗涤条件并且通过使用各种色谱、分光光度计或其他定量方法来评估污渍除去的程度来确定。示例性清洁测定和方法是本领域已知的，并且包括但不限于在WO 99/34011和US6,605,458(两者通过引用结合在此)中描述的那些，以及包括在下面所提供的实施例中的那些清洁测定和方法。

术语丝氨酸蛋白酶多肽或参比蛋白酶的“清洁有效量”是指在特定清洁组合物中达到希望的酶活性水平的蛋白酶的量。此类有效量可以由本领域普通技术人员容易地确定，并且基于许多因素，例如所使用的特定蛋白酶、清洁应用、清洁组合物的具体组成、以及是否需要液体或干燥(例如，颗粒、片剂、棒状)组合物等。

术语“清洁辅助材料”是指除了本公开的丝氨酸蛋白酶多肽之外在清洁组合物中包含的任何液体、固体或气体物质。在一些实施例中，本公开的清洁组合物包括一种或多种清洁辅助材料。典型地，取决于清洁组合物的具体类型和形式(例如液体、颗粒、粉末、棒状、糊状、喷雾、片剂、凝胶、泡沫或其他组合物)来选择每种清洁辅助材料。优选地，每种清洁辅助材料与在组合物中使用的蛋白酶相容。

清洁组合物和清洁配制品包括适合于清洁、漂白、消毒和/或灭菌任何物体、物品和/或表面的任何组合物。此类组合物和配制品包括但不限于例如液体和/或固体组合物，包括清洁或洗涤剂组合物(例如液体、片剂、凝胶、棒状、颗粒和/或固体衣物清洁剂或洗涤剂组合物)和精细织物洗涤剂组合物；硬表面清洁组合物和配制品，例如用于玻璃、木材、陶瓷和金属台面和窗户；地毯清洁剂；炉灶清洁剂；织物清新剂；织物软化剂；以及纺织品、衣物增效清洁或洗涤剂组合物，衣物添加剂清洁组合物和洗衣预去污(pre-spotter)清洁组合物；餐具洗涤组合物，包括手洗或手动餐具洗涤组合物(例如“手洗”或“手动”餐具洗涤剂)和自动餐具洗涤组合物(例如“自动餐具洗涤剂”)。本发明还可使用单一剂量单位形式，包括但不限于丸剂、片剂、囊形片(gelca)或其他单一剂量单位例如预先测量的粉末或液体。

除非另有说明，否则如本文使用的清洁组合物或清洁配制品包括颗粒或粉末形式的通用的或重垢洗涤剂，特别是清洁洗涤剂；液体、颗粒、凝胶、固体、片剂、糊剂或单位剂量形式的通用洗涤剂，特别是所谓的重垢液体(HDL)洗涤剂或重垢干燥(HDD)洗涤剂类型；液体精细织物洗涤剂；手洗或手动餐具洗涤剂，包括高泡型的那些；手洗或手动餐具洗涤剂、自动餐具洗涤剂、或餐具或桌面器具洗涤剂，包括用于家庭和机构使用的各种片剂、粉末、固体、颗粒、液体、凝胶和冲洗助剂类型；液体清洁和消毒剂，包括抗菌手洗类型，清洁棒、漱口水、假牙清洁剂、洗车香波、地毯香波、浴室清洁剂；用于人类和其他动物的毛发香波和/或毛发染发剂；沐浴露和泡沫浴和金属清洁剂；以及清洁助剂，例如漂白添加剂和“去污棒(stain-stick)”或预处理类型。在一些实施例中，颗粒组合物是处于“紧密”形式；在一些实施例中，液体组合物是处于“浓缩”形式。

如本文使用的，“织物清洁组合物”包括手洗和机洗衣物洗涤剂组合物，其包括衣物添加剂组合物和适合用于带有污渍的织物(例如衣服、亚麻制品和其他纺织材料)的浸泡和/或预处理的组合物。

如本文使用的，“非织物清洁组合物”包括非纺织品(即非织物)表面清洁组合物，包括但不限于例如手洗或手动或自动餐具洗涤剂组合物、口腔清洁组合物、假牙清洁组合物、隐形眼镜清洁组合物、伤口清创组合物和个人清洁组合物。

如本文使用的，关于旨在用于清洁污染或肮脏物体(包括特定织物和/或非织物物体或物品)的洗涤介质中的组合物，使用术语“洗涤剂组合物”或“洗涤剂配制品”。本公开的此类组合物不限于任何特定的洗涤剂组合物或配制品。实际上，在一些实施例中，本公开的洗涤剂包含本公开的至少一种丝氨酸蛋白酶多肽，另外还包含一种或多种表面活性剂、一种或多种转移酶、水解酶、氧化还原酶、助洗剂(例如助洗剂盐)、漂白剂、漂白活化剂、上蓝剂、荧光染料、结块抑制剂、掩蔽剂、酶活化剂、抗氧化剂和/或增溶剂。在一些情况下，助洗剂盐是硅酸盐和磷酸盐的混合物，优选具有比磷酸盐(例如三聚磷酸钠)更多的硅酸盐(例如偏硅酸钠)。本公开的一些组合物，例如但不限于清洁组合物或洗涤剂组合物，不包含任何磷酸盐(例如磷酸盐或磷酸盐助洗剂)。

如本文使用的，术语“漂白”是指处理材料(例如织物、衣物、纸浆等)或表面持续足够长的时间和/或在适当的pH和/或温度条件下处理材料(例如织物、衣物、纸浆等)或表面以实现该材料的增白(即变白)和/或清洁。适合于漂白的化学品的实施例包括但不限于例如ClO₂、H₂O₂、过酸、NO₂等。

如本文使用的，蛋白酶(例如，本公开的丝氨酸蛋白酶多肽)的“洗涤性能”是指与不添加丝氨酸蛋白酶多肽至组合物的洗涤剂相比，丝氨酸蛋白酶多肽对洗涤提供另外的清洁性能的贡献。在相关洗涤条件下比较洗涤性能。在一些测试***中，其他相关因素，例如洗涤剂组合物、泡沫浓度(sud concentration)、水硬度、洗涤力学、时间、pH和/或温度能按以下这样的方式进行控制：模仿在某些细分市场(例如手洗或手动餐具洗涤、自动餐具洗涤、餐具清洁、桌面器具清洁、织物清洁等)中对于家庭应用典型的一种或多种条件。

本文中使用的术语“相关洗涤条件”表示在手洗餐具洗涤、自动餐具洗涤或衣物洗涤剂细分市场中实际用于家庭中的条件，特别是洗涤温度、时间、洗涤力学、泡沫浓度、洗涤剂类型和水硬度。

如本文使用的，术语“消毒”是指从表面除去污染物，以及在物品表面上抑制或杀死微生物。本公开并不旨在限于任何特定表面、物品或待除去的一种或多种污染物或微生物。

本文清洁组合物的“紧密”形式最好通过密度来反映，并且就组合物而言通过无机填料盐的量来反映。无机填料盐是处于粉末形式的洗涤剂组合物的常规成分。在常规洗涤剂组合物中，填料盐以相当大的量存在，典型地为总组合物的约17％至约35％(以重量计)。相比之下，在紧密的组合物中，填料盐以不超过总组合物的约15％的量存在。在一些实施例中，填料盐以不超过组合物(以重量计)的约10％、或更优选地约5％的量存在。在一些实施例中，无机填料盐选自硫酸盐和氯化物的碱盐和碱土金属盐。在一些实施例中，填料盐是硫酸钠。

本公开提供了新的丝氨酸蛋白酶。本公开的丝氨酸蛋白酶多肽包括分离的、重组的、基本上纯的、或非天然存在的多肽。在一些实施例中，多肽可用于清洁应用中，并且可以并入可用于清洁对其有需要的物品或表面的方法中的清洁组合物中。

枯草杆菌蛋白酶的BspE04637进化枝的特征在于在位置N56之后的2个氨基酸残基***，其中所述氨基酸位置通过与枯草杆菌蛋白酶BPN'的氨基酸序列相对应来编号。该***发生在连接形成特征催化三联体的一部分的催化性天冬氨酸(D32)和催化性组氨酸(H66)的残基的跨度中，其中所述氨基酸位置通过与枯草杆菌蛋白酶BspE04637的氨基酸序列相对应来编号。

在一些实施例中，本发明是枯草杆菌蛋白酶的BspE04637进化枝，条件是枯草杆菌蛋白酶的BspE04637进化枝不包含BAD02409或JP2003325186-0001枯草杆菌蛋白酶。在一些实施例中，本发明是BspE04637进化枝枯草杆菌蛋白酶的重组多肽或其活性片段，条件是所述重组多肽或其活性片段不包含BAD02409或JP2003325186-0001。在一些实施例中，枯草杆菌蛋白酶的BspE04637进化枝包括含有DTGIXXXHXDLXXXGGXSVFXXXXXX XXXXDXXGH(SEQ IDNO:31)基序的枯草杆菌蛋白酶或重组多肽或其活性片段，其中初始D是活性位点天冬氨酸，末端H是活性位点组氨酸，并且X是任何氨基酸，条件是所述枯草杆菌蛋白酶和/或重组多肽或其活性片段不包含BAD02409或JP2003325186-0001。在其他实施例中，枯草杆菌蛋白酶的BspE04637进化枝包括含有DTGIXXXHXDL XXXGGXSVFXXXXXXDPXXDXXGH(SEQ ID NO:32)基序的枯草杆菌蛋白酶或重组多肽或其活性片段，其中初始D是活性位点天冬氨酸，末端H是活性位点组氨酸，并且X是任何氨基酸，条件是所述枯草杆菌蛋白酶和/或重组多肽或其活性片段不包含BAD02409或JP2003325186-0001。在又进一步的实施例中，枯草杆菌蛋白酶的BspE04637进化枝包括含有DTGIXXXHXDLNVXGGXSVFXXXXXX XXXXDXXGH(SEQ ID NO:33)基序的枯草杆菌蛋白酶或重组多肽或其活性片段，其中初始D是活性位点天冬氨酸，末端H是活性位点组氨酸，并且X是任何氨基酸，条件是所述枯草杆菌蛋白酶和/或重组多肽或其活性片段不包含BAD02409或JP2003325186-0001。在又另一个实施例中，枯草杆菌蛋白酶的BspE04637进化枝包括含有DTGIXXXHXDLNVXGGXS VFXXXXXXDPXXDXXGH(SEQ ID NO:34)基序的枯草杆菌蛋白酶或重组多肽或其活性片段，其中初始D是活性位点天冬氨酸，末端H是活性位点组氨酸，并且X是任何氨基酸，条件是所述枯草杆菌蛋白酶和/或重组多肽或其活性片段不包含BAD02409或JP2003325186-0001。在一些实施例中，枯草杆菌蛋白酶的BspE04637进化枝包括含有DTGIDXXHXDLNVXGGXSVFXXXXXX XXXXDXXGH(SEQ ID NO:35)基序的枯草杆菌蛋白酶或重组多肽或其活性片段，其中初始D是活性位点天冬氨酸且末端H是活性位点组氨酸，并且X是任何氨基酸，条件是所述枯草杆菌蛋白酶和/或重组多肽或其活性片段不包含BAD02409或JP2003325186-0001。在一些实施例中，枯草杆菌蛋白酶的BspE04637进化枝包括含有DTGI DXNHXDLNVRGGXSVFTXXXXX DPXXDXXGH(SEQ ID NO:36)基序的枯草杆菌蛋白酶或重组多肽或其活性片段，其中初始D是活性位点天冬氨酸，末端H是活性位点组氨酸，并且X是任何氨基酸，条件是所述枯草杆菌蛋白酶和/或重组多肽或其活性片段不包含BAD02409或JP2003325186-0001。在一些实施例中，枯草杆菌蛋白酶的BspE04637进化枝包括含有DTGIDXNHXDLNVRGGXSVFTXXXXXDPYYDXXGH(SEQ ID NO:37)基序的枯草杆菌蛋白酶或重组多肽或其活性片段，其中初始D是活性位点天冬氨酸且末端H是活性位点组氨酸，并且X是任何氨基酸，条件是所述枯草杆菌蛋白酶和/或重组多肽或其活性片段不包含BAD02409或JP2003325186-0001。

在一些实施例中，本发明的多肽是与示例的多肽具有特定程度的氨基酸序列同源性的多肽，例如与选自由SEQ ID NO:3、6和9组成的组的氨基酸序列具有70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％氨基酸序列同一性的多肽。在一些实施例中，重组多肽或其活性片段包含与SEQ ID NO:3、6或9的氨基酸序列具有至少70％氨基酸序列同一性的氨基酸序列。在一些实施例中，重组多肽或其活性片段包含与SEQ ID NO:3、6或9的氨基酸序列具有至少70％氨基酸序列同一性的氨基酸序列，条件是所述多肽或其活性片段不包括BAD02409、WP_026690432、ADC50469、ERN55058、WP_022626565、WP_026475840、WP_027963976、WP_012957833或JP2003325186-0001。在一些实施例中，重组多肽或其活性片段包含与SEQ ID NO:3、6或9的氨基酸序列具有至少70％氨基酸序列同一性的氨基酸序列，条件是所述多肽或其活性片段不包括BAD02409、WP_026690432、ADC50469、ERN55058、WP_022626565、WP_026475840、WP_027963976、WP_012957833、WP_035661169、WP_047973355或JP2003325186-0001。在一些实施例中，重组多肽或其活性片段包含与SEQ ID NO:3、6或9的氨基酸序列具有至少75％氨基酸序列同一性的氨基酸序列。在一些实施例中，重组多肽或其活性片段包含与SEQ ID NO:3、6或9的氨基酸序列具有至少75％氨基酸序列同一性的氨基酸序列，条件是所述多肽或其活性片段不包括BAD02409、WP_026690432、ADC50469、ERN55058、WP_022626565或JP2003325186-0001。在一些实施例中，重组多肽或其活性片段包含与SEQ ID NO:3、6或9的氨基酸序列具有至少75％氨基酸序列同一性的氨基酸序列，条件是所述多肽或其活性片段不包括BAD02409、WP_026690432、ADC50469、ERN55058、WP_022626565、WP_035661169、WP_047973355或JP2003325186-0001。在一些实施例中，重组多肽或其活性片段包含与SEQ ID NO:3、6或9的氨基酸序列具有至少80％、90％或95％氨基酸序列同一性的氨基酸序列。在一些实施例中，重组多肽或其活性片段包含与SEQ ID NO:3、6或9的氨基酸序列具有至少80％、90％或95％氨基酸序列同一性的氨基酸序列，条件是所述多肽或其活性片段不包括BAD02409或JP2003325186-0001。如本文所述，同源性可以通过氨基酸序列比对例如，使用程序例如BLAST、ALIGN、或CLUSTAL来确定。在一些实施例中，该多肽是分离的、重组的、基本上纯的或非天然存在的酶，该酶具有蛋白酶活性，例如枯草杆菌蛋白酶活性或酪蛋白水解活性(例如，二甲基酪蛋白水解活性)。

还提供了本发明的多肽酶，该多肽酶具有蛋白酶活性，例如碱性蛋白酶活性，所述酶包括与SEQ ID NO:3、6或9的氨基酸序列相差不超过50个、不超过40个、不超过30个、不超过25个、不超过20个、不超过15个、不超过10个、不超过9个、不超过8个、不超过7个、不超过6个、不超过5个、不超过4个、不超过3个、不超过2个、或不超过1个氨基酸残基的氨基酸序列(当使用任何先前描述的比对方法进行比对时)。

如上文所述，本发明的变体酶多肽具有酶活性(例如，蛋白酶活性)并且因此可用于清洁应用中，该清洁应用包括但不限于用于清洁餐具物品、桌面器具物品、织物和具有硬表面的物品(例如，桌子、桌面、墙、家具物品、地板、天花板等的硬表面)的方法。以下描述了包括本发明的一种或多种变体丝氨酸蛋白酶多肽的示例性清洁组合物。本发明的酶多肽的酶活性(例如，蛋白酶活性)可以容易地用本领域普通技术人员熟知的程序来确定。下面提供的实施例描述用于评估酶的活性和清洁性能的方法。可以容易地使用本领域中熟知的程序和/或通过使用在实施例中列出的程序来确定本发明的多肽酶在除去污渍(例如，蛋白质污渍例如血液/奶/墨汁或蛋黄)、清洁硬表面或清洁衣物、餐具或一种或多种桌面器具物品方面的性能。

本发明的丝氨酸蛋白酶多肽可以在宽范围的pH条件内具有蛋白酶活性。在一些实施例中，丝氨酸蛋白酶多肽对作为底物的二甲基酪蛋白具有蛋白酶活性，如在下面的实施例中显示的。在一些实施例中，丝氨酸蛋白酶多肽在从约4.0至约12.0的pH处具有蛋白酶活性。在一些实施例中，丝氨酸蛋白酶多肽在从约6.0至约12.0的pH处具有蛋白酶活性。在一些实施例中，丝氨酸蛋白酶多肽在从约6.0至约12.0或从约7.0至约12.0的pH处具有至少50％、60％、70％、80％或90％的最大蛋白酶活性。在一些实施例中，丝氨酸蛋白酶多肽在高于6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5、9.0、9.5、10.0、10.5、11.0或11.5的pH处具有蛋白酶活性。在一些实施例中，丝氨酸蛋白酶多肽在低于12.0、11.5、11.0、10.5、10.0、9.5、9.0、8.5、8.0、7.5、7.0、或6.5的pH处具有蛋白酶活性。

在一些实施例中，本发明的丝氨酸蛋白酶多肽在从约10℃至约90℃或从约30℃至约80℃的温度范围内具有蛋白酶活性。在一些实施例中，本发明的丝氨酸蛋白酶多肽在从约55℃至约75℃的温度范围内具有蛋白酶活性。在一些实施例中，丝氨酸蛋白酶多肽在从约55℃至约75℃的温度下具有至少50％、60％、70％、80％或90％的最大蛋白酶活性。在一些实施例中，丝氨酸蛋白酶在高于50℃、55℃、60℃、65℃或70℃的温度下具有活性。在一些实施例中，丝氨酸蛋白酶在低于75℃、80℃、70℃、65℃、60℃或55℃的温度下具有活性。

在一些实施例中，本发明的丝氨酸蛋白酶多肽在胁迫条件下在50℃20分钟后具有至少60％的活性。在一些实施例中，本发明的丝氨酸蛋白酶多肽在胁迫条件下在60℃下20分钟后具有至少20％的活性。在一些实施例中，本发明的丝氨酸蛋白酶多肽在胁迫条件下在75℃下20分钟后具有至少15％的活性。胁迫条件可以是例如在实施例中所示的那些条件。在一些实施例中，胁迫条件为LAS/EDTA测定、Tris/EDTA测定或OMO HDL测定。

在一些实施例中，本发明的丝氨酸蛋白酶多肽在清洁组合物中显示清洁性能。清洁组合物通常包括对酶的稳定性和性能有害的成分，这些有害的成分使清洁组合物成为酶例如丝氨酸蛋白酶保留功能的恶劣环境。因此，将酶置于清洁组合物中并且期望酶功能(例如丝氨酸蛋白酶活性，例如通过清洁性能显示)不是微不足道的。在一些实施例中，本发明的丝氨酸蛋白酶多肽在自动餐具洗涤(ADW)洗涤剂组合物中显示清洁性能。在一些实施例中，ADW洗涤剂组合物中的清洁性能包括清洁蛋黄污渍。在一些实施例中，本发明的丝氨酸蛋白酶多肽在衣物洗涤剂组合物中显示清洁性能。在一些实施例中，在衣物洗涤剂组合物中的清洁性能包括清洁血液/奶/墨汁污渍。在每种清洁组合物中，本发明的丝氨酸蛋白酶多肽显示具有或不具有漂白组分的清洁性能。

可以使本发明的多肽经历各种改变，例如一个或多个氨基酸***、缺失和/或取代(保守或非保守的)，包括此类改变基本上不改变多肽的酶活性的情况。类似地，本发明的核酸也可以经历各种变化，例如在一个或多个密码子中的一个或多个核苷酸的一个或多个取代，这样使得特定的密码子编码相同或不同的氨基酸，导致沉默变异(例如，当编码的氨基酸不被核苷酸突变改变时)或非沉默变异、序列中一个或多个核酸(或密码子)的一个或多个缺失、序列中一个或多个核酸(或密码子)的一个或多个添加或***、和/或序列中一个或多个核酸(或密码子)的一个或多个截短的切割。与由原始核酸序列编码的多肽酶相比，核酸序列中的许多这样的变化本质上可能不会改变所得的编码的多肽酶的酶活性。还可以对本发明的核酸序列进行修饰以便包括一个或多个密码子，这种或这些密码子在一个表达***(例如，细菌表达***)中提供了最佳表达，同时，若希望，所述一个或多个密码子仍编码一个或多个相同的氨基酸。

本发明提供分离的、非天然存在的或重组的核酸，其可统称为编码本发明多肽的“本发明的核酸”或“本发明的多核苷酸”。本发明的核酸，包括下面描述的全部，可用于本发明多肽的重组生产(例如，表达)，典型地通过包含编码感兴趣的多肽或其片段的序列的质粒表达载体进行表达。如上所讨论，多肽包括具有酶活性(例如，蛋白水解活性)的丝氨酸蛋白酶多肽，该多肽可用于清洁应用和用于清洁需要清洁的物品或表面(例如物品的表面)的清洁组合物中。

在一些实施例中，本发明的多核苷酸是与所示例的多核苷酸具有特定程度的核酸同源性的多核苷酸。在一些实施例中，多核苷酸具有与SEQ ID NO:1、4或7具有至少50％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％核酸同一性的核酸序列。在一些实施例中，多核苷酸包含选自由SEQ ID NO:1、4和7组成的组的核酸序列。在一些实施例中，多核苷酸具有编码如下多肽或其活性片段的核酸序列，该多肽或其活性片段与选自由SEQ ID NO:3、6和9组成的组的氨基酸序列具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％、或100％氨基酸序列同一性。在一些实施例中，多核苷酸具有编码具有SEQ ID NO:3、6或9的多肽或其活性片段的核酸序列。在其他实施例中，多核苷酸还可以具有与选自由SEQ ID NO:1、4和7组成的组的核酸序列互补的核酸序列。如本文所述，同源性可以通过氨基酸序列比对例如，使用程序例如BLAST、ALIGN、或CLUSTAL来确定。

在一些实施例中，本发明提供分离的、重组的、基本上纯的、合成衍生的或非天然存在的核酸，该核酸包含编码在上文标题为“本发明的多肽”的部分和本文的其他地方中描述的本发明的任何多肽(包括任何融合蛋白等)的核苷酸序列。本发明还提供了分离的、重组的、基本上纯的、合成衍生的或非天然存在的核酸，该核酸包含编码上文和本文其他地方所描述的本发明的任何多肽中的两个或更多个的组合的核苷酸序列。本发明提供编码本发明的丝氨酸蛋白酶多肽的核酸，其中所述丝氨酸蛋白酶多肽是具有蛋白水解活性的成熟形式。在一些实施例中，丝氨酸蛋白酶用同源前肽序列重组表达。在其他实施例中，丝氨酸蛋白酶用异源前肽序列(例如GG36前肽序列)重组表达。

本发明的核酸可以通过使用任何合适的合成、操作和/或分离技术或其组合来产生。例如，本发明的多核苷酸可以使用本领域技术人员熟知的标准核酸合成技术，例如固相合成技术来生产。在这样的技术中，典型地合成高达50个或更多个核苷酸碱基的片段，然后连接(例如通过酶或化学连接方法)以基本上形成任何希望的连续核酸序列。本发明的核酸的合成还可以通过本领域已知的任何合适的方法来促进，包括但不限于使用经典的亚磷酰胺方法的化学合成(参见例如博卡吉(Beaucage)等人，四面体快报(Tetrahedron Letters)22:1859-69[1981])；或马瑟斯(Matthes)等人描述的方法(参见马瑟斯(Matthes)等人，欧洲分子生物学学会杂志(EMBO J.)3:801-805[1984])，如典型地在自动合成方法中所实践的。本发明的核酸还可以通过使用自动DNA合成仪来产生。可以从各种商业来源订购定制的核酸(例如，米德兰认证试剂公司(The Midland Certified Reagent Company)、大美国基因公司(Great American Gene Company)、操纵子技术公司(Operon Technologies Inc.)和DNA2.0)。用于合成核酸和相关原理的其他技术是本领域已知的(参见例如，板仓(Itakura)等人，生物化学年鉴(Ann.Rev.Biochem.)53:323[1984]；和板仓(Itakura)等人，科学(Science)198:1056[1984])。

如上所述，可用于核酸修饰的重组DNA技术是本领域熟知的。例如，技术例如限制性内切核酸酶消化、连接、逆转录和cDNA生产以及聚合酶链反应(例如PCR)是本领域技术人员已知和容易使用的。本发明的核苷酸还可以通过使用一个或多个可以与其杂交的寡核苷酸探针或编码本发明的一个或多个丝氨酸蛋白酶多肽的PCR-扩增多核苷酸来筛选cDNA文库而获得。用于筛选和分离cDNA克隆和PCR扩增程序的方法是本领域技术人员熟知的并且描述于本领域技术人员已知的标准参考文献中。本发明的一些核酸可以通过例如已知的诱变程序(例如，定点诱变、位点饱和诱变和体外重组)改变天然存在的多核苷酸主链(例如，编码酶或亲本蛋白酶的多核苷酸主链)来获得。适合于产生编码本发明的丝氨酸蛋白酶多肽的本发明的修饰多核苷酸的多种方法是本领域已知的，这些方法包括但不限于例如位点饱和诱变、扫描诱变、***诱变、缺失诱变、随机诱变、定点诱变和定向进化、以及各种其他重组方法。

本发明提供了包含本文所述的本发明的至少一种丝氨酸蛋白酶多核苷酸的载体(例如，编码本文所述的本发明的丝氨酸蛋白酶多肽的多核苷酸)，包含本发明的至少一种核酸或多核苷酸的表达载体或表达盒，包含本发明的至少一种核酸或多核苷酸的分离的、基本上纯的或重组的DNA构建体，包含本发明的至少一种多核苷酸的分离的或重组的细胞，以及包含一种或多种这样的载体、核酸、表达载体、表达盒、DNA构建体、细胞、细胞培养物或其任何组合或混合物的组合物。

在一些实施例中，本发明提供包含具有本发明的至少一个核酸或多核苷酸的本发明的至少一种载体(例如表达载体或DNA构建体)的重组细胞。一些这样的重组细胞使用这样的至少一种载体转化或转染，尽管其他方法在本领域中是可获得且已知的。这样的细胞典型地称为宿主细胞。一些这样的细胞包含细菌细胞，包括但不限于芽孢杆菌属细胞，例如枯草芽孢杆菌细胞。本发明还提供包含本发明的至少一种丝氨酸蛋白酶多肽的重组细胞(例如，重组宿主细胞)。

在一些实施例中，本发明提供了包含本发明的核酸或多核苷酸的载体。在一些实施例中，载体是一种表达载体或表达盒，其中编码本发明的丝氨酸蛋白酶多肽的本发明的多核苷酸序列可操作地连接到有效基因表达所需的一个或另外的核酸区段(例如与编码本发明的丝氨酸蛋白酶多肽的本发明的多核苷酸可操作地连接的启动子)。载体可以包括转录终止子和/或能够通过在含有抗菌剂的培养基中生长来实现质粒感染的宿主细胞的连续培养维持的选择基因，例如抗生素抗性基因。

表达载体可以衍生自质粒或病毒DNA，或在可替代实施例中，含有两者的元件。示例性载体包括但不限于pC194、pJH101、pE194、pHP13(参见哈伍德(Harwood)和卡廷(Cutting)[编辑]，第3章，用于芽孢杆菌的分子生物学方法(Molecular BiologicalMethods for Bacillus)，约翰威利父子公司(John Wiley&Sons)[1990]；枯草芽孢杆菌的适合的复制质粒包括第92页列出的那些)。还参见，佩雷戈(Perego)，在枯草芽孢杆菌中用于遗传操作的整合载体(Integrational Vectors for Genetic Manipulations inBacillus subtilis)，在：Sonenshein等人，[编辑]枯草芽孢杆菌和其他***：生物化学、生理学和分子遗传学，美国微生物学会(American Society forMicrobiology)，华盛顿特区[1993]，pp.615-624)和p2JM103BBI中。

为了在细胞中表达和生产感兴趣的蛋白质(例如，丝氨酸蛋白酶多肽)，包含编码丝氨酸蛋白酶多肽的多核苷酸的至少一个拷贝(并且在一些情况下包含多个拷贝)的至少一种表达载体在适合于丝氨酸蛋白酶表达的条件下被转化到细胞中。在本发明的一些实施例中，将编码丝氨酸蛋白酶多肽的多核苷酸序列(以及在载体中包含的其他序列)整合到宿主细胞的基因组中，然而在其他实施例中，包含编码丝氨酸蛋白酶多肽的多核苷酸序列的质粒载体在细胞内保持为自主的染色体外元件。本发明提供染色体外核酸元件以及整合到宿主细胞基因组中的进入的核苷酸序列。本文描述的载体可用于生产本发明的丝氨酸蛋白酶多肽。在一些实施例中，编码丝氨酸蛋白酶多肽的多核苷酸构建体存在于能够将编码丝氨酸蛋白酶多肽的多核苷酸整合并且任选地扩增入宿主染色体中的整合载体上。整合位点的实施例是本领域技术人员熟知的。在一些实施例中，编码本发明的丝氨酸蛋白酶多肽的多核苷酸的转录通过启动子来实现，该启动子是所选前体蛋白酶的野生型启动子。在一些其他实施例中，启动子与前体蛋白酶是异源的，但是在宿主细胞中发挥功能。具体地，用于细菌宿主细胞的合适的启动子的实施例包括但不限于例如amyE、amyQ、amyL、pstS、sacB、pSPAC、pAprE、pVeg、pHpaII启动子，嗜热脂肪芽孢杆菌麦芽糖淀粉酶基因的启动子、解淀粉芽孢杆菌(BAN)淀粉酶基因的启动子、枯草芽孢杆菌碱性蛋白酶基因的启动子、克劳氏芽孢杆菌碱性蛋白酶基因的启动子、短小芽孢杆菌木糖苷酶基因的启动子、苏云金芽孢杆菌cryIIIA的启动子、和地衣芽孢杆菌α-淀粉酶基因的启动子。另外的启动子包括但不限于A4启动子，以及噬菌体λPR或PL启动子，以及大肠杆菌lac、trp或tac启动子。

本发明的丝氨酸蛋白酶多肽可以在任何合适的微生物(包括细菌和真菌)的宿主细胞中生产。在一些实施例中，本发明的丝氨酸蛋白酶多肽可以在***中生产。在一些实施例中，宿主细胞是芽孢杆菌属的物种(Bacillus spp.)、链霉菌属的物种(Streptomyces spp.)、埃希氏菌属的物种(Escherichia spp.)、曲霉属的物种(Aspergillus spp.)、木霉属的物种(Trichoderma spp.)、假单胞菌属的物种(Pseudomonas spp.)、棒状杆菌属的物种(Corynebacterium spp.)、酵母属的物种(Saccharomyces spp.)和毕赤酵母属的物种(Pichia spp.)。在一些实施例中，丝氨酸蛋白酶多肽由芽孢杆菌属宿主细胞生产。可用于本发明的丝氨酸蛋白酶多肽的生产的芽孢杆菌属宿主细胞的实施例包括但不限于：地衣芽孢杆菌、迟缓芽胞杆菌、枯草芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌、迟缓芽胞杆菌、短芽孢杆菌、嗜热脂肪芽孢杆菌、嗜碱芽孢杆菌、凝结芽胞杆菌、环状芽胞杆菌、短小芽孢杆菌、苏云金芽孢杆菌、克劳氏芽孢杆菌和巨大芽孢杆菌，以及芽孢杆菌属内的其他生物体。在一些实施例中，枯草芽孢杆菌宿主细胞被用于生产丝氨酸蛋白酶多肽。US 5,264,366和4,760,025(RE 34,606)描述了可以用于生产本发明的丝氨酸蛋白酶多肽的各种芽孢杆菌属宿主菌株，尽管可以使用其他合适的菌株。

可以用于生产本发明丝氨酸蛋白酶多肽的几种细菌菌株包括非重组(即野生型)芽孢杆菌属菌株，以及天然存在的菌株和/或重组菌株的变体。在一些实施例中，宿主菌株是重组菌株，其中编码感兴趣的多肽的多核苷酸已经被引入宿主中。在一些实施例中，宿主菌株是枯草芽孢杆菌宿主菌株，特别是重组枯草芽孢杆菌宿主菌株。许多枯草芽孢杆菌菌株是已知的，包括但不限于例如1A6(ATCC 39085)、168(1A01)、SB19、W23、Ts85、B637、PB1753至PB1758、PB3360、JH642、1A243(ATCC 39,087)、ATCC 21332、ATCC 6051、MI113、DE100(ATCC 39,094)、GX4931、PBT 110、和PEP 211菌株(参见例如霍克(Hoch)等人，遗传学(Genetics)73:215-228[1973]；还参见美国专利号4,450,235和4,302,544，以及EP0134048，其各自通过引用以其整体结合)。使用枯草芽孢杆菌作为表达宿主细胞是本领域熟知的(参见例如，Palva等人，基因(Gene)19:81-87[1982]；法恩斯托克(Fahnestock)和费希尔(Fischer)，细菌学杂志(J.Bacteriol.)，165:796-804[1986]；和王(Wang)等人，基因(Gene)69:39-47[1988])。

在一些实施例中，芽孢杆菌属宿主细胞是包含以下基因中的至少一个的突变或缺失的芽孢杆菌属物种：degU、degS、degR和degQ。在一些实施例中，突变是在degU基因中，并且在一些实施例中，突变为degU(Hy)32(参见例如，Msadek等人，细菌学杂志(J.Bacteriol.)172:824-834[1990]；以及奥尔莫斯(Olmos)等人，分子遗传学和基因组学(Mol.Gen.Gene)253:562-567[1997])。在一些实施例中，芽孢杆菌属宿主在scoC4(参见例如考德威尔(Caldwell)等人，细菌学杂志(J.Bacteriol.)183:7329-7340[2001])；spoIIE(参见例如Arigoni等人，分子微生物学(Mol.Microbiol.)31:1407-1415[1999])；和/或oppA或opp操纵子的其他基因(参见例如，佩雷戈(Perego)等人，分子微生物学(Mol.Microbiol.)5:173-185[1991])中包含突变或缺失。实际上，预期引起与oppA基因突变相同的表型的opp操纵子中的任何突变将可用于本发明的经改变的芽孢杆菌属菌株的一些实施例中。在一些实施例中，这些突变单独发生，而在其他实施例中，存在突变的组合。在一些实施例中，可以用于生产本发明的丝氨酸蛋白酶多肽的改经变的芽孢杆菌属宿主细胞株是已经包含上述基因中的一个或多个的突变的芽孢杆菌属宿主菌株。另外，可使用包含内源蛋白酶基因的一个或多个突变和/或缺失的芽孢杆菌属宿主细胞。在一些实施例中，芽孢杆菌属宿主细胞包含aprE和nprE基因的缺失。在其他实施例中，芽孢杆菌属宿主细胞包含5个蛋白酶基因的缺失，而在其他实施例中，芽孢杆菌属宿主细胞包含9个蛋白酶基因的缺失(参见例如，US 2005/0202535，通过引用结合在此)。

使用本领域已知的任何合适的方法，用编码本发明的至少一种丝氨酸蛋白酶多肽的至少一种核酸转化宿主细胞。利用质粒DNA构建体或载体将核酸(例如DNA)引入芽孢杆菌属细胞或大肠杆菌细胞并且将这样的质粒DNA构建体或载体转化到这样的细胞中的方法是熟知的。在一些实施例中，质粒随后从大肠杆菌细胞中分离并且转化到芽孢杆菌属细胞中。然而，没有必要使用介入微生物例如大肠杆菌，并且在一些实施例中，将DNA构建体或载体直接引入芽孢杆菌属宿主中。

本领域技术人员非常了解将本发明的核酸序列引入芽孢杆菌属细胞的合适方法(参见例如，费拉里等人，“遗传学”，在：哈伍德(Harwood)等人，[编辑]，芽孢杆菌(Bacillus)，Plenum出版公司[1989]，pp.57-72；桑德斯(Saunders)等人，细菌学杂志(J.Bacteriol.)157:718-726[1984]；霍克(Hoch)等人，细菌学杂志(J.Bacteriol.)93:1925-1937[1967]；曼(Mann)等人，现代微生物学(Current Microbiol.)13:131-135[1986]；Holubova，微生物学大观(Folia Microbiol.)30:97[1985]；常(Chang)等人，分子遗传学和基因组学(Mol.Gen.Genet.)168:11-115[1979]；Vorobjeva等人，FEMS微生物学快报(FEMS Microbiol.Lett.)7:261-263[1980]；史密斯(Smith)等人，应用与环境微生物学(Appl.Env.Microbiol.)51:634[1986]；费希尔(Fisher)等人，微生物学文献集(Arch.Microbiol.)139:213-217[1981]；以及麦克唐纳(McDonald)，普通微生物学杂志(J.Gen.Microbiol.)130:203[1984])。实际上，包括原生质体转化和转染、转导和原生质体融合在内的转化方法是熟知的并且适合用于本发明。本领域已知的用于转化芽孢杆菌属细胞的方法包括例如质粒标记物拯救转化的方法，其涉及通过携带部分同源的驻留质粒的感受态细胞摄取供体质粒(参见，孔滕特(Contente)等人，质粒(Plasmid)2:555-571[1979]；海马(Haima)等人，分子遗传学和基因组学(Mol.Gen.Genet.)223:185-191[1990]；魏因劳奇(Weinrauch)等人，细菌学杂志(J.Bacteriol.)154:1077-1087[1983]；以及魏因劳奇(Weinrauch)等人，细菌学杂志(J.Bacteriol.)169:1205-1211[1987])。在该方法中，进入的供体质粒在模拟染色体转化的过程中与驻留的“辅助”质粒的同源区重组。

除了通常使用的方法之外，在一些实施例中，用包含编码本发明的丝氨酸蛋白酶多肽的核酸的DNA构建体或载体直接转化宿主细胞(即，在引入宿主细胞之前，中间细胞不用于扩增或以其他方式处理DNA构建体或载体)。将本发明的DNA构建体或载体引入宿主细胞包括本领域已知的将核酸序列(例如DNA序列)引入宿主细胞而不***宿主基因组的那些物理和化学方法。此类方法包括但不限于氯化钙沉淀、电穿孔、裸DNA、脂质体等。在另外的实施例中，DNA构建体或载体与质粒一起共转化而不***质粒。在进一步的实施例中，通过本领域已知的方法从经改变的芽孢杆菌属菌株中缺失选择标记(参见斯特尔(Stahl)等人，细菌学杂志(J.Bacteriol.)158:411-418[1984]；以及Palmeros等人，基因(Gene)247:255-264[2000])。

在一些实施例中，将本发明的转化细胞在常规营养培养基中培养。合适的特定培养条件，例如温度、pH等是本领域技术人员已知的，并且详细描述于科学文献中。在一些实施例中，本发明提供包含本发明的至少一种丝氨酸蛋白酶多肽或至少一种核酸的培养物(例如细胞培养物)。

在一些实施例中，用编码本发明的至少一种丝氨酸蛋白酶多肽的至少一个多核苷酸序列转化的宿主细胞在允许本发明的蛋白酶表达的条件下在合适的营养培养基中培养，之后从培养物中回收得到的蛋白酶。在一些实施例中，通过常规程序从培养基中回收由细胞生产的蛋白酶，该常规程序包括但不限于例如通过离心或过滤从培养基中分离宿主细胞、借助于盐(例如硫酸铵)沉淀上清液或滤液的蛋白质组分、层析法纯化(例如离子交换、凝胶过滤、亲和等)。

在一些实施例中，由重组宿主细胞生产的丝氨酸蛋白酶多肽被分泌到培养基中。编码纯化促进结构域的核酸序列可以用于促进蛋白质的纯化。包含编码丝氨酸蛋白酶多肽的多核苷酸序列的载体或DNA构建体可以进一步包含编码促进丝氨酸蛋白酶多肽纯化的纯化促进结构域的核酸序列(参见例如，克罗尔(Kroll)等人，DNA细胞生物学(DNA CellBiol.)12:441-53[1993])。此类纯化促进结构域包括但不限于例如金属螯合肽，例如允许在固定化金属上纯化的组氨酸-色氨酸模块(参见波拉特(Porath)，蛋白表达与纯化(Protein Expr.Purif.)3:263-281[1992])；允许在固定化免疫球蛋白上纯化的蛋白质A结构域；以及在FLAGS延伸/亲和纯化***中使用的结构域。在纯化结构域和异源蛋白之间包含可切割的接头序列例如因子XA或肠激酶(例如，可获自加利福尼亚州圣地亚哥市英杰公司(Invitrogen)的序列)还可用于促进纯化。

用于检测和测量酶的酶活性的测定法，例如本发明的丝氨酸蛋白酶多肽是熟知的。用于检测和测量蛋白酶(例如本发明的丝氨酸蛋白酶多肽)的活性的各种测定法也是本领域普通技术人员已知的。具体地，测定可用于测量基于酪蛋白或血红蛋白的酸可溶性肽的释放的蛋白酶活性，其作为280nm下的吸光度测量或使用Folin方法进行比色测定。其他示例性测定涉及显色底物的溶解(参见例如，沃德(Ward)，“蛋白酶(Proteinases)”，在：福格蒂(Fogarty)(编辑)，微生物酶与生物技术(Microbial Enzymes and Biotechnology)，应用科学出版社(Applied Science)，伦敦[1983]，pp.251-317)。其他示例性测定包括但不限于琥珀酰-Ala-Ala-Pro-Phe-对硝基苯胺测定(suc-AAPF-pNA)和2,4,6-三硝基苯磺酸钠盐测定(TNBS测定)。本领域技术人员已知的许多另外的参考文献提供了合适的方法(参见例如，威尔斯(Wells)等人，核酸研究(Nucleic Acids Res.)11:7911-7925[1983]：克里斯蒂安松(Christianson)等人，分析生物化学(Anal.Biochem.)223:119-129[1994]；以及Hsia等人，分析生物化学(Anal.Biochem.)242:221-227[1999])。

可以使用各种方法来确定宿主细胞中成熟蛋白酶(例如，本发明的成熟丝氨酸蛋白酶多肽)的生产水平。此类方法包括但不限于例如利用对蛋白酶特异的多克隆或单克隆抗体的方法。示例性方法包括但不限于酶联免疫吸附测定(ELISA)、放射免疫测定(RIA)、荧光免疫测定(FIA)和荧光激活细胞分选(FACS)。这些和其他测定法是本领域熟知的(参见例如，马多克斯(Maddox)等人，实验医学杂志(J.Exp.Med.)158:1211[1983])。

在一些其他实施例中，本发明提供了制备或生产本发明的成熟丝氨酸蛋白酶多肽的方法。成熟的丝氨酸蛋白酶多肽不包括信号肽或前肽序列。一些方法包括在重组细菌宿主细胞(例如像芽孢杆菌属细胞(例如，枯草芽孢杆菌细胞))中制备或生产本发明的丝氨酸蛋白酶多肽。在一些实施例中，本发明提供了生产本发明的丝氨酸蛋白酶多肽的方法，该方法包括在有利于生产丝氨酸蛋白酶多肽的条件下培养包含重组表达载体的重组宿主细胞，该重组表达载体包含编码本发明的丝氨酸蛋白酶多肽的核酸。一些这样的方法进一步包括从培养物中回收丝氨酸蛋白酶多肽。

在一些实施例中，本发明提供了生产本发明的丝氨酸蛋白酶多肽的方法，该方法包括：(a)将包含编码本发明的丝氨酸蛋白酶多肽的核酸的重组表达载体引入细胞群体(例如细菌细胞，例如枯草芽孢杆菌细胞)中；并且(b)在有助于生产由表达载体编码的丝氨酸蛋白酶多肽的条件下在培养基中培养细胞。一些这样的方法进一步包括：(c)从细胞或培养基中分离丝氨酸蛋白酶多肽。

除非另外指出，在此提供的所有组分或组合物水平参照该组分或组合物的活性水平给出，并且不包括可能存在于可商购来源中的杂质，例如残余溶剂或副产品。酶组分重量是基于总的活性蛋白。除非另外指明，所有百分比和比率均按重量计算。除非另外指明，所有百分比和比率均基于总组合物计算。本发明的组合物包括清洁组合物，例如洗涤剂组合物。在例示洗涤剂组合物中，通过按总组合物的重量计的纯酶表示酶水平并且除非另外说明，按总组合物的重量计表示洗涤剂成分。

虽然对于本发明的目的不是必需的，但是下文所示的辅助剂的非限制性列表适合用于即时清洁组合物。在一些实施例中，掺入这些辅助剂例如以便辅助或增强清洁性能，用于处理待清洁的基材，或者以便改变清洁组合物的美观性，如香料、色素、染料等的情况。应当理解，此类辅助剂是本发明的丝氨酸蛋白酶多肽的补充。这些另外的组分的精确性质及其掺入水平将取决于组合物的物理形式和将在使用组合物的清洁操作的性质。合适的辅助材料包括但不限于漂白催化剂、其他酶、酶稳定***、螯合剂、荧光增白剂、去污聚合物、染料转移剂、分散剂、泡沫抑制剂、染料、香料、色素、填料盐、光活化剂、荧光剂、织物调理剂、可水解表面活性剂、防腐剂、抗氧化剂、抗收缩剂、抗皱剂、杀菌剂、杀真菌剂、颜色斑点、银护理、抗晦暗和/或抗腐蚀剂、碱源、增溶剂、载体、加工助剂、颜料、和pH控制剂、表面活性剂、助洗剂、螯合剂、染料转移抑制剂、沉积助剂、分散剂、附加的酶和酶稳定剂、催化材料、漂白活化剂、漂白增效剂、过氧化氢、过氧化氢源、预成型过酸、聚合物分散剂、粘土去除/抗再沉积剂、增白剂、泡沫抑制剂、染料、香料、结构弹性剂、织物软化剂、载体、助水溶物、加工助剂和/或颜料。除了以下公开，此类其他辅助剂的适合实施例以及使用水平发现于US 5,576,282；6,306,812；6,326,348；6,610,642；6,605,458；5,705,464；5,710,115；5,698,504；5,695,679；5,686,014和5,646,101中，其全部通过引用结合在此。在清洁辅助材料与本发明的丝氨酸蛋白酶多肽在清洁组合物中不相容的实施例中，那么使用合适的方法保持清洁辅助材料和一种或多种蛋白酶分离(即彼此不接触)直到两个组分的组合适当时。此类分离方法包括本领域已知的任何合适的方法(例如，囊形片、包封、片剂化、物理分离等)。上述辅助成分可以构成余量的本发明的清洁组合物。

本发明的清洁组合物有利地用于例如洗衣应用、硬表面清洁应用、餐具洗涤应用(包括自动餐具洗涤和手洗餐具洗涤)、以及装饰品应用(例如假牙、牙齿、头发和皮肤清洁)。本发明的酶还适合用于隐形眼镜清洁和伤口清创应用。另外，由于在较低温度溶液中增加有效性的独特优点，本发明的酶理想地适合于洗衣应用。此外，本发明的酶可用于颗粒和液体组合物。

本发明的丝氨酸蛋白酶多肽还可用于清洁添加剂产品。在一些实施例中，可使用低温溶液清洁应用。在一些实施例中，本发明提供了包括本发明的至少一种酶的清洁添加剂产品，当希望另外的漂白效果时，该酶理想地适合于包含在洗涤过程中。此类实施例包括但不限于低温溶液清洁应用。在一些实施例中，添加剂产品处于其最简单的形式，一种或多种蛋白酶。在一个实施例中，该添加剂被包封于剂型中用于添加至清洁过程中。在一些实施例中，该添加剂被包封于剂型中用于添加至清洁过程中，其中使用过氧源并且希望得到增加的漂白效果。本发明可使用任何适合的单一剂量单位形式，包括但不限于丸剂、片剂、囊形片或其他单一剂量单位例如预先测量的粉末或液体。在一些实施例中，包括一种或多种填料或一种或多种载体材料以增加此类组合物的体积。适合的填料或载体材料包括但不限于：硫酸盐、碳酸盐和硅酸盐的各种盐以及滑石、粘土等。用于液体组合物的适合的填料或载体材料包括但不限于水或低分子量伯醇和仲醇(包括多元醇和二元醇)。此类醇的实施例包括但不限于：甲醇、乙醇、丙醇和异丙醇。在一些实施例中，组合物包含从约5％至约90％的此类材料。酸性填料可用于降低pH值。可替代地，在一些实施例中，清洁添加剂包括辅助成分，如下面更全面地描述的。

本发明的清洁组合物和清洁添加剂需要有效量的本文提供的至少一种丝氨酸蛋白酶多肽，该丝氨酸蛋白酶多肽是单独的或与其他蛋白酶和/或另外的酶组合。所需的酶水平通过添加本发明的一种或多种丝氨酸蛋白酶多肽来实现。典型地本发明的清洁组合物包含至少约0.0001重量百分比、从约0.0001至约10重量百分比、从约0.001至约1重量百分比、或从约0.01至约0.1重量百分比的至少一种本发明的丝氨酸蛋白酶多肽。

典型地本文的清洁组合物被配制使得在水性清洁操作中使用期间，洗涤水将具有的pH为从约4.0至约11.5、或甚至从约5.0至约11.5、或甚至从约5.0至约8.0、或甚至从约7.5至约10.5。液体产品配制品典型地被配制成具有从约3.0至约9.0或甚至从约3至约5的pH。颗粒状洗衣产品典型地被配制成具有从约9至约11的pH。在一些实施例中，本发明的清洁组合物可以被配制成在洗涤条件下具有碱性pH，例如从约8.0至约12.0、或从约8.5至约11.0、或从约9.0至约11.0的pH。在一些实施例中，本发明的清洁组合物可以被配制成在洗涤条件下具有中性pH，例如从约5.0至约8.0、或从约5.5至约8.0、或从约6.0至约8.0、或从约6.0至约7.5的pH。在一些实施例中，当清洁组合物在20℃下以1:100(wt:wt)溶解于去离子水中时，可以测量中性pH条件，使用常规pH计进行测量。用于将pH控制在推荐的使用水平的技术包括使用缓冲液、碱、酸等，并且是本领域的普通技术人员熟知的。

在一些实施例中，当一种或多种丝氨酸蛋白酶多肽应用于颗粒组合物或液体中时，希望丝氨酸蛋白酶多肽将处于包封的颗粒的形式以保护丝氨酸蛋白酶多肽免受储存期间的颗粒组合物的其他组分之害。另外，包封还是在清洁过程中控制丝氨酸蛋白酶多肽的可用性的手段。在一些实施例中，包封增强了一种或多种丝氨酸蛋白酶多肽和/或另外的酶的性能。就这一点而言，本发明的丝氨酸蛋白酶多肽使用本领域已知的任何合适的包封材料进行包封。在一些实施例中，包封材料典型地包封本发明的一种或多种丝氨酸蛋白酶多肽的至少一部分。典型地，包封材料是水溶性和/或水分散性的。在一些实施例中，包封材料具有0℃或更高的玻璃化转变温度(Tg)。玻璃化转变温度在WO 97/11151中有更详细的描述。包封材料典型地选自：碳水化合物、天然或合成胶、甲壳素、壳聚糖、纤维素和纤维素衍生物、硅酸盐、磷酸盐、硼酸盐、聚乙烯醇、聚乙二醇、石蜡及其组合。当包封材料是碳水化合物时，其典型地选自单糖、寡糖、多糖及其组合。在一些典型的实施例中，包封材料是淀粉(参见例如EP 0922499；US 4,977,252；5,354,559；和5,935,826)。在一些实施例中，包封材料是由塑料(例如热塑性塑料、丙烯腈、甲基丙烯腈、聚丙烯腈、聚甲基丙烯腈及其混合物)制成的微球；可使用的可商购的微球包括但不限于由(Stockviksverken，瑞典)、PM 6545、PM 6550、PM 7220、PM 7228、和(PQ公司，宾夕法尼亚州福吉谷市(Valley Forge,PA))供应的那些。

存在各种洗涤条件，包括涉及洗涤的蛋白酶所暴露的不同的洗涤剂配制品、洗涤水体积、洗涤水温度、和洗涤时间的长短。低洗涤剂浓度体系包含以下洗涤剂，其中洗涤水中存在少于约800ppm的洗涤剂组分。中洗涤剂浓度体系包含以下洗涤剂，其中在洗涤水中存在约800ppm和约2000ppm之间的洗涤剂组分。高洗涤剂浓度体系包含以下洗涤剂，其中在洗涤水中存在多于约2000ppm的洗涤剂组分。在一些实施例中，本发明的“冷水洗涤”使用适合于在从约10℃至约40℃、或从约20℃至约30℃、或从约15℃至约25℃、以及在约15℃至约35℃范围内并且在10℃至40℃之间所有范围的所有其他组合的温度下洗涤的“冷水洗涤剂”。

典型地，不同的地理位置具有不同的水硬度。通常按照每加仑颗粒数混合的Ca²⁺/Mg²⁺来描述水硬度。硬度是水中钙(Ca²⁺)和镁(Mg²⁺)的量的量度。美国大部分水都是硬水，但是硬度却不同。中等硬(60-120ppm)至硬(121-181ppm)水具有60至181份/百万份。

表I.水硬度

水	每加仑颗粒数	百万分率
			软	小于1.0	小于17
略硬	1.0至3.5	17至60
			中等硬	3.5至7.0	60至120
硬	7.0至10.5	120至180
			非常硬	大于10.5	大于180

因此，在一些实施例中，本发明提供在至少一组洗涤条件(例如水温、水硬度和/或洗涤剂浓度)中显示令人惊讶的洗涤性能的丝氨酸蛋白酶多肽。在一些实施例中，本发明的丝氨酸蛋白酶多肽与其他丝氨酸蛋白酶多肽蛋白酶的洗涤性能相当。在本发明的一些实施例中，本文提供的丝氨酸蛋白酶多肽显示增强的氧化稳定性、增强的热稳定性、在各种条件下增强的清洁能力、和/或增强的螯合剂稳定性。另外，本发明的丝氨酸蛋白酶多肽也可单独地或与助洗剂和稳定剂组合地用于不含洗涤剂的清洁组合物。

在本发明的一些实施例中，清洁组合物包含至少一种本发明的丝氨酸蛋白酶多肽(水平为以组合物重量计从约0.00001％至约10％)和包括以组合物重量计的余量的清洁辅助材料(例如，约99.999％至约90.0％)。在本发明的一些其他实施例中，本发明的清洁组合物包含至少一种丝氨酸蛋白酶多肽(水平为以组合物重量计约0.0001％至约10％、约0.001％至约5％、约0.001％至约2％、约0.005％至约0.5％)并且余量的清洁组合物包含清洁辅助材料(例如，以重量计约99.9999％至约90.0％、约99.999％至约98％、约99.995％至约99.5％)。

在一些实施例中，本发明的清洁组合物包含一种或多种另外的洗涤剂酶，该洗涤剂酶提供清洁性能和/或织物护理和/或餐具洗涤益处。适合的酶的实施例包含但不限于：酰基转移酶、α-淀粉酶、β-淀粉酶、α-半乳糖苷酶、***糖苷酶、芳基酯酶、β-半乳糖苷酶、角叉菜胶酶、过氧化氢酶、纤维二糖水解酶、纤维素酶、软骨素酶、角质酶、内切β-1,4-葡聚糖酶、内切β-甘露聚糖酶、酯酶、外切甘露聚糖酶、半乳聚糖酶、葡糖淀粉酶、半纤维素酶、透明质酸酶、角蛋白酶、漆酶、乳糖酶、木质素酶、脂肪酶、脂肪氧合酶、甘露聚糖酶、氧化酶、果胶裂解酶、果胶乙酰酯酶、果胶酶、戊聚糖酶、过氧化物酶、酚氧化酶、磷酸酶、磷脂酶、植酸酶、聚半乳糖醛酸酶、蛋白酶、支链淀粉酶、还原酶、鼠李糖半乳糖醛酸酶、β-葡聚糖酶、鞣酸酶、转谷氨酰胺酶、木聚糖乙酰酯酶、木聚糖酶、木葡聚糖酶、和木糖苷酶、或其任意组合或混合物。在一些实施例中，使用酶的组合(即，“混合物”)，该酶包含常规可适用的酶如蛋白酶、脂肪酶、角质酶和/或纤维素酶，与淀粉酶结合。

除了本文提供的丝氨酸蛋白酶多肽之外，任何其他合适的蛋白酶都可用于本发明的组合物中。合适的蛋白酶包括动物、植物或微生物来源的蛋白酶。在一些实施例中，使用微生物蛋白酶。在一些实施例中，包括化学或遗传修饰的突变体。在一些实施例中，蛋白酶是丝氨酸蛋白酶，优选碱性微生物蛋白酶或胰蛋白酶样蛋白酶。碱性蛋白酶的实施例包括枯草杆菌蛋白酶，特别是衍生自芽孢杆菌的那些(例如，枯草杆菌蛋白酶迟缓、枯草杆菌蛋白酶解淀粉、枯草杆菌蛋白酶嘉士伯(Carlsberg)、枯草杆菌蛋白酶309、枯草杆菌蛋白酶147和枯草杆菌蛋白酶168)。另外的实施例包括在以下各项中描述的那些突变型蛋白酶：US RE 34,606；5,955,340；5,700,676；6,312,936；和6,482,628，其全部通过引用结合在此。另外的蛋白酶实施例包括但不限于胰蛋白酶(例如猪或牛起源的)和在WO 89/06270中描述镰孢菌属(Fusarium)蛋白酶。在一些实施例中，可用于本发明的可商购的蛋白酶包括但不限于：MAXACAL^TM、MAXAPEM^TM、OXP、PURAMAX^TM、EXCELLASE^TM、PREFERENZ^TM蛋白酶(例如P100、P110、P280)、EFFECTENZ^TM蛋白酶(例如P1000、P1050、P2000)、EXCELLENZ^TM蛋白酶(例如P1000)、和PURAFAST^TM(杰能科公司(Genencor))；赛威蛋白酶引发酶DURAZYM^TM、波力酶液体蛋白酶中性蛋白酶和益瑞蛋白酶(诺维信公司(Novozymes))；BLAP^TM和BLAP^TM变体(德国杜塞尔多夫市汉高股份有限公司(Henkel Kommanditgesellschaft auf Aktien，Duesseldorf，Germany))、以及KAP(嗜碱芽孢杆菌(B.Alkalophilus)枯草杆菌蛋白酶；日本东京市花王公司(KaoCorp.,Tokyo,Japan))。各种蛋白酶描述于WO 95/23221、WO 92/21760、WO 09/149200、WO09/149144、WO 09/149145、WO 11/072099、WO 10/056640、WO 10/056653、WO 11/140364、WO12/151534、US 2008/0090747、和US 5,801,039；5,340,735；5,500,364；5,855,625；RE 34,606；5,955,340；5,700,676；6,312,936；6,482,628；8,530,219；以及各种其他专利中。在一些进一步的实施例中，中性金属蛋白酶可用于本发明，包括但不限于在WO 1999014341、WO1999033960、WO 1999014342、WO 1999034003、WO 2007044993、WO 2009058303、WO2009058661、WO 2014/071410、WO 2014/194032、WO 2014/194034、WO 2014/194054、和WO2014/194117中描述的中性金属蛋白酶。示例性金属蛋白酶包括在枯草芽孢杆菌中表达的重组形式的中性金属蛋白酶nprE(参见例如WO 07/044993)和来自解淀粉芽孢杆菌的纯化的中性金属蛋白酶PMN。

另外，任何合适的脂肪酶都可用于本发明。适合的脂肪酶包括但不限于细菌或真菌起源的脂肪酶。化学或遗传修饰的突变体涵盖在本发明中。有用的脂肪酶的实施例包括绵毛状腐质菌(H.lanuginosa)脂肪酶(参见例如EP 258068和EP 305216)；米黑根毛霉(Rhizomucor miehei)脂肪酶(参见例如EP 238023)；假丝酵母属脂肪酶，例如南极洲假丝酵母(C.antarctica)脂肪酶(例如南极洲假丝酵母脂肪酶A或B；参见例如，EP214761)；假单胞菌脂肪酶，例如产碱假单胞菌(P.alcaligenes)脂肪酶和假产碱假单胞菌(P.pseudoalcaligenes)脂肪酶(参见例如，EP 218272)；洋葱假单胞菌(P.cepacia)脂肪酶(参见例如，EP 331376)；施氏假单胞菌(P.stutzeri)脂肪酶(参见例如，GB 1,372,034)；萤光假单胞菌脂肪酶；芽孢杆菌属脂肪酶(例如枯草芽孢杆菌脂肪酶[Dartois等人，生物化学与生物物理学报(Biochem.Biophys.Acta)1131:253-260[1993])；嗜热脂肪芽杆菌脂肪酶[参见例如，JP 64/744992]；以及短小芽胞杆菌脂肪酶[参见例如，WO 91/16422])。

此外，许多克隆的脂肪酶可用于本发明的一些实施例中，包括但不限于沙门柏干酪青霉(Penicillium camembertii)脂肪酶(参见Yamaguchi等人，基因(Gene)103:61-67[1991])；白地霉(Geotricum candidum)脂肪酶(参见Schimada等人，生物化学杂志(J.Biochem.)，106:383-388[1989])；以及各种根霉属脂肪酶例如德氏根霉(R.Delemar)脂肪酶(参见哈斯(Hass)等人，基因(Gene)109:117-113[1991])；雪白根霉脂肪酶(Kugimiya等人，生物科学、生物技术与生物化学(Biosci.Biotech.Biochem.)56:716-719[1992])和米根霉(R.oryzae)脂肪酶。

其他类型的脂肪酶多肽酶例如角质酶还可用于本发明的一些实施例中，包括但不限于源自门多萨假单胞菌(Pseudomonas mendocina)(参见WO 88/09367)的角质酶和源自豌豆根腐镰孢菌(Fusarium solani pisi)的角质酶(参见，WO 90/09446)。

另外适合的脂肪酶包括脂肪酶例如M1LIPASE^TM、LUMA FAST^TM、和LIPOMAX^TM(杰能科公司)；和ULTRA(诺维信公司)；和LIPASE P^TM“Amano”(日本天野药业有限公司(Amano Pharmaceutical Co.Ltd.))。

在本发明的一些实施例中，本发明的清洁组合物进一步包含以组合物重量计的另外的脂肪酶的从约0.00001％至约10％的水平的脂肪酶，以及以组合物重量计的余量的清洁辅助材料。在本发明的一些其他实施例中，本发明的清洁组合物还包含以组合物重量计在约0.0001％至约10％、约0.001％至约5％、约0.001％至约2％、约0.005％至约0.5％脂肪酶水平的脂肪酶。

在本发明的一些实施例中，任何合适的淀粉酶可用于本发明。在一些实施例中，还可使用适合用于碱性溶液的任何淀粉酶(例如α和/或β)。适合的淀粉酶包括但不限于细菌或真菌起源的那些。化学或遗传修饰的突变体包括在一些实施例中。可用于本发明的淀粉酶包括但不限于从地衣芽孢杆菌获得的α-淀粉酶(参见例如GB 1,296,839)。另外的适合的淀粉酶包括在W09510603、WO 9526397、WO 9623874、WO 9623873、WO 9741213、WO 9919467、WO 0060060、WO 0029560、WO 9923211、WO 9946399、WO 0060058、WO 0060059、WO 9942567、WO 0114532、WO 02092797、WO 0166712、WO 0188107、WO 0196537、WO 0210355、WO9402597、WO 0231124、WO 9943793、WO 9943794、WO 2004113551、WO 2005001064、WO2005003311、WO 0164852、WO 2006063594、WO 2006066594、WO 2006066596、WO2006012899、WO 2008092919、WO 2008000825、WO 2005018336、WO 2005066338、WO2009140504、WO 2005019443、WO 2010091221、WO 2010088447、WO 0134784、WO2006012902、WO 2006031554、WO 2006136161、WO 2008101894、WO 2010059413、WO2011098531、WO 2011080352、WO 2011080353、WO 2011080354、WO 2011082425、WO2011082429、WO 2011076123、WO 2011087836、WO 2011076897、WO 94183314、WO 9535382、WO 9909183、WO 9826078、WO 9902702、WO 9743424、WO 9929876、WO 9100353、WO 9605295、WO 9630481、WO 9710342、WO 2008088493、WO 2009149419、WO 2009061381、WO2009100102、WO 2010104675、WO 2010117511、和WO 2010115021中发现的那些。可用于本发明的可商购的淀粉酶包括但不限于拖麦米尔真菌淀粉酶污渍酶污渍酶加超级污渍酶和BAN^TM(诺维信公司)、以及强力酶(POWERASE)^TM、快速酶和P(杰能科公司)。

在本发明的一些实施例中，本发明的清洁组合物进一步包含以组合物重量计的另外的淀粉酶的从约0.00001％至约10％的水平的淀粉酶，以及以组合物重量计的余量的清洁辅助材料。在本发明的一些其他实施例中，本发明的清洁组合物还包含以组合物重量计在约0.0001％至约10％、约0.001％至约5％、约0.001％至约2％、约0.005％至约0.5％淀粉酶水平的淀粉酶。

在一些另外的实施例中，在本发明的清洁组合物中可使用任何适合的纤维素酶。适合的纤维素酶包括但不限于细菌或真菌起源的那些。化学或遗传修饰的突变体包括在一些实施例中。适合的纤维素酶包括但不限于腐质霉(Humicola insolens)纤维素酶(参见例如US 4,435,307)。尤其适合的纤维素酶是具有颜色护理益处的纤维素酶(参见例如EP0495257)。在本发明中可使用的可商购的纤维素酶包括但不限于纤维素酶护理酶(诺维信公司)、REVITALENZ^TM100(美国丹尼斯科公司(Danisco US Inc))和KAC-500(B)^TM(花王公司)。在一些实施例中，纤维素酶作为成熟野生型或变体纤维素酶的部分或片段掺入，其中N末端的一部分缺失(参见例如US 5,874,276)。另外的适合的纤维素酶包括在WO2005054475、WO 2005056787、US 7,449,318和7,833,773中发现的那些。在一些实施例中，本发明的清洁组合物进一步包含以组合物重量计的另外的纤维素酶的从约0.00001％至约10％的水平的纤维素酶，以及以组合物重量计的余量的清洁辅助材料。在本发明的一些其他实施例中，本发明的清洁组合物还包含以组合物重量计在约0.0001％至约10％、约0.001％至约5％、约0.001％至约2％、约0.005％至约0.5％纤维素酶水平的纤维素酶。

适合用于洗涤剂组合物的任何甘露聚糖酶也可用于本发明。适合的甘露聚糖酶包括但不限于细菌或真菌起源的那些。化学或遗传修饰的突变体包括在一些实施例中。已知各种甘露聚糖酶可用于本发明(参见例如US6,566,114；6,602,842；和6,440,991中，其全部通过引用结合在此)。可用于本发明的可商购的甘露聚糖酶包括但不限于PURABRITE^TM、和在一些实施例中，本发明的清洁组合物进一步包含以组合物重量计的另外的甘露聚糖酶的从约0.00001％至约10％的水平的甘露聚糖酶，以及以组合物重量计的余量的清洁辅助材料。在本发明的一些实施例中，本发明的清洁组合物还包含以组合物重量计在约0.0001％至约10％、约0.001％至约5％、约0.001％至约2％、约0.005％至约0.5％甘露聚糖酶水平的甘露聚糖酶。

在一些实施例中，过氧化物酶与过氧化氢或其来源(例如过碳酸盐、过硼酸盐或过硫酸盐)组合用于本发明的组合物中。在一些可替代的实施例中，氧化酶与氧组合使用。两种类型的酶都用于“溶液漂白”，即当织物在洗涤液中一起洗涤时防止纺织染料从一种染色的织物转移到另一种织物上)，优选与增效剂一起使用(参见例如WO 94/12621和WO 95/01426)。适合的过氧化物酶/氧化酶包括但不限于植物、细菌或真菌起源的那些。化学或遗传修饰的突变体包括在一些实施例中。在一些实施例中，本发明的清洁组合物进一步包含以组合物重量计的另外的过氧化物酶和/或氧化酶的从约0.00001％至约10％的水平的过氧化物酶和/或氧化酶，以及以组合物重量计的余量的清洁辅助材料。在本发明的一些其他实施例中，本发明的清洁组合物还包含以组合物重量计在约0.0001％至约10％、约0.001％至约5％、约0.001％至约2％、约0.005％至约0.5％过氧化物酶和/或氧化酶水平的过氧化物酶和/或氧化酶。

在一些实施例中，可使用的另外的酶，包括但不限于过水解酶(perhydrolase)(参见例如WO 2005056782、WO 2007106293、WO2008063400、WO 2008106214、和WO2008106215)。另外，在一些实施例中，上述酶的混合物涵盖在本文中，特别是一种或多种另外的蛋白酶、淀粉酶、脂肪酶、甘露聚糖酶和/或至少一种纤维素酶。实际上，预期这些酶的各种混合物将用于本发明。还预期一种或多种丝氨酸蛋白酶多肽和一种或多种另外的酶的不同水平可以独立地变动至约10％，清洁组合物的余量为清洁辅助材料。通过考虑有待清洁的表面、物品或织物，以及针对使用过程中(例如在整个清洁洗涤剂使用中)的清洁条件的组合物的所希望的形式而容易地具体选择清洁辅助材料。

在一些实施例中，本文提供的有效量的一种或多种丝氨酸蛋白酶多肽包含在用于清洁需要蛋白质去污的各种表面的组合物中。此类清洁组合物包括用于清洁硬表面、织物和餐具等应用的清洁组合物。实际上，在一些实施例中，本发明提供织物清洁组合物，而在其他实施例中，本发明提供非织物清洁组合物。值得注意的是，本发明还提供适用于个人护理的清洁组合物，包括口腔护理(包括牙粉、牙膏、漱口水等，以及假牙清洁组合物)、皮肤和毛发清洁组合物。本发明旨在涵盖处于任何形式的洗涤剂组合物(即，液体、颗粒、棒状、半固体、凝胶、乳剂、片剂、胶囊等)。

举例来说，下面将更详细地描述其中可使用本发明的丝氨酸蛋白酶多肽的几种清洁组合物。在将本发明的清洁组合物配制成适合用于一种或多种洗衣机洗涤方法中的组合物的一些实施例中，本发明的组合物优选含有至少一种表面活性剂和至少一种助洗剂化合物，以及一种或多种优选地选自有机聚合化合物、漂白剂、另外的酶、泡沫抑制剂、分散剂、钙皂分散剂、污垢悬浮液和抗再沉积剂以及腐蚀抑制剂的清洁辅助材料。在一些实施例中，洗衣组合物还含有软化剂(即，作为另外的清洁辅助材料)。本发明的组合物还可用于处于固体或液体形式的洗涤剂添加剂产品中。此类添加剂产品旨在补充和/或提高常规洗涤剂组合物的性能，并且可以在清洁过程的任何阶段添加。在一些实施例中，本文的衣物洗涤剂组合物的密度范围为从约400g/升至约1200g/升，而在其他实施例中，其范围为在20℃下测量的组合物的500g/升至约950g/升。

在配制为用于在手动餐具洗涤方法中使用的组合物的实施例中，本发明的组合物优选含有至少一种表面活性剂以及优选至少一种另外的清洁辅助材料，该清洁辅助材料选自有机聚合化合物、增泡剂、II族金属离子、溶剂、助水溶物和另外的酶。

在一些实施例中，各种清洁组合物(例如在US 6,605,458中提供的那些)可与本发明的丝氨酸蛋白酶多肽一起使用。因此，在一些实施例中，包含本发明的至少一种丝氨酸蛋白酶多肽的组合物是紧密的颗粒状织物清洁组合物，而在其他实施例中，组合物是用于有色织物洗涤的颗粒状织物清洁组合物，在进一步的实施例中，组合物是通过洗涤能力提供软化的颗粒状织物清洁组合物，在另外的实施例中，组合物是重垢液体织物清洁组合物。在一些实施例中，包含本发明的至少一种丝氨酸蛋白酶多肽的组合物是织物清洁组合物，例如在US 6,610,642和6,376,450中描述的那些。另外，本发明的丝氨酸蛋白酶多肽可用于在欧洲或日本洗涤条件下特别实用的颗粒状衣物洗涤剂组合物中(参见例如US 6,610,642)。

在一些可替代的实施例中，本发明提供了包含本文提供的至少一种丝氨酸蛋白酶多肽的硬表面清洁组合物。因此，在一些实施例中，包含本发明的至少一种丝氨酸蛋白酶多肽的组合物是硬表面清洁组合物，例如在US6,610,642；6,376,450；和6,376,450中描述的那些。

在又进一步的实施例中，本发明提供了包含本文提供的至少一种丝氨酸蛋白酶多肽的餐具洗涤组合物。因此，在一些实施例中，包含本发明的至少一种丝氨酸蛋白酶多肽的组合物是硬表面清洁组合物，例如在US6,610,642和6,376,450中的那些。在一些又进一步的实施例中，本发明提供了包含本文提供的至少一种丝氨酸蛋白酶多肽的餐具洗涤组合物。在一些进一步的实施例中，包含本发明的至少一种丝氨酸蛋白酶多肽的组合物包括口腔护理组合物，例如在US 6,376,450和6,376,450中描述的那些。在上述US6,376,450；6,605,458；6,605,458；和6,610,642中包含的化合物和清洁辅助材料的配制品和描述可用于本文提供的丝氨酸蛋白酶多肽。

将本发明的清洁组合物配制成任何合适的形式并且通过由配方设计师选择的任何方法来制备，其非限制性实施例描述于US 5,879,584；5,691,297；5,574,005；5,569,645；5,565,422；5,516,448；5,489,392；和5,486,303，其所有通过引用结合在此。当希望低pH清洁组合物时，此类组合物的pH经由添加例如单乙醇胺或酸性物质例如HCl的物质来调节。

在一些实施例中，根据本发明的清洁组合物包含酸化颗粒或氨基羧酸助洗剂。氨基羧酸助洗剂的实施例包括氨基羧酸、其盐和衍生物。在一些实施例中，氨基羧酸助洗剂是氨基多羧酸助洗剂，例如甘氨酸-N,N-二乙酸或具有通式MOOC-CHR-N(CH₂COOM)₂(其中R是C_1-12烷基并且M是碱金属)的衍生物。在一些实施例中，氨基羧酸助洗剂可以是甲基甘氨酸二乙酸(MGDA)、GLDA(谷氨酸-N,N-二乙酸)、亚氨基二琥珀酸(IDS)、羧基甲基菊粉及其盐及其衍生物、天冬氨酸-N-单乙酸(ASMA)、天冬氨酸-N,N-二乙酸(ASDA)、天冬氨酸-N-单丙酸(ASMP)、亚氨基二琥珀酸(IDA)、N-(2-磺基甲基)天冬氨酸(SMAS)、N-(2-磺基乙基)天冬氨酸(SEAS)、N-(2-磺基甲基)谷氨酸(SMGL)、N-(2-磺基乙基)谷氨酸(SEGL)、IDS(亚氨基二乙酸)及其盐及其衍生物例如N-甲基亚氨基二乙酸(MIDA)、α-丙氨酸-N,N-二乙酸(α-ALDA)、丝氨酸-N,N-二乙酸(SEDA)、异丝氨酸-N,N-二乙酸(ISDA)、苯丙氨酸-N,N-二乙酸(PHDA)、邻氨基苯甲酸-N,N-二乙酸(ANDA)、磺胺酸-N,N-二乙酸(SLDA)、牛磺酸-N,N-二乙酸(TUDA)和磺基甲基-N,N-二乙酸(SMDA)、以及碱金属盐及其衍生物。在一些实施例中，酸化颗粒的重量几何平均粒度为从约400μ至约1200μ，并且体积密度为至少550g/L。在一些实施例中，酸化颗粒包含至少约5％的助洗剂。

在一些实施例中，酸化颗粒可以包含任何酸，包括有机酸和无机酸。有机酸可以具有一个或两个羧基，并且在一些情况下可以具有多达15个碳，特别是多达10个碳，如甲酸、乙酸、丙酸、癸酸、草酸、琥珀酸、己二酸、马来酸、富马酸、癸二酸、苹果酸、乳酸、乙醇酸、酒石酸和水合乙醛酸。在一些实施例中，该酸是柠檬酸。无机酸包括盐酸和硫酸。在一些情况下，本发明的酸化颗粒是包含高水平氨基羧酸助洗剂的高活性颗粒。已经发现硫酸进一步有助于最终颗粒的稳定性。

在一些实施例中，根据本发明的清洁组合物包括至少一种表面活性剂和/或表面活性剂***，其中所述表面活性剂选自非离子表面活性剂、阴离子表面活性剂、阳离子表面活性剂、两性表面活性剂、兼性离子表面活性剂、半极性非离子表面活性剂及其混合物。在一些实施例中，表面活性剂以从约0.1％至约60％的水平存在，而在可替代的实施例中，该水平为从约1％至约50％，而在又进一步的实施例中，该水平为从约5％至约40％，以清洁组合物的重量计。

在一些实施例中，本发明的清洁组合物包含一种或多种洗涤剂助洗剂或助洗剂***。在掺入至少一种助洗剂的一些实施例中，清洁组合物包含以清洁组合物的重量计至少约1％、从约3％至约60％、或甚至从约5％至约40％的助洗剂。助洗剂包括但不限于多磷酸盐的碱金属盐、铵盐和烷醇铵盐；碱金属硅酸盐；碱土金属和碱金属碳酸盐、铝硅酸盐；醚羟基多羧酸盐；马来酸酐与乙烯或乙烯基甲基醚的共聚物；1,3,5-三羟基苯-2,4,6-三磺酸；聚乙酸的铵盐和取代的铵盐，例如乙二胺四乙酸和次氮基三乙酸；多羧酸盐，例如苯六甲酸、琥珀酸、柠檬酸、氧基二琥珀酸、聚马来酸、苯1,3,5-三羧酸、羧基甲基氧基琥珀酸；及其可溶性盐。实际上，预期任何适合的助洗剂将用于本发明的各种实施例中。

在一些实施例中，助洗剂形成水溶性硬度离子络合物(例如螯合助洗剂)，例如柠檬酸盐和多磷酸盐(例如三聚磷酸钠和三聚磷酸钠六水合物、三聚磷酸钾、以及混合的三聚磷酸钠和钾等)。预期任何适合的助洗剂将用于本发明，包括本领域已知的那些(参见例如EP 2100949)。

在一些实施例中，本文使用的助洗剂包括磷酸盐助洗剂和非磷酸盐助洗剂。在一些实施例中，助洗剂是磷酸盐助洗剂。在一些实施例中，助洗剂是非磷酸盐助洗剂。如果存在，助洗剂以按组合物的重量计从0.1％至80％、或从5％至60％、或从10％至50％的水平使用。在一些实施例中，产品包括磷酸盐和非磷酸盐助洗剂的混合物。适合的磷酸盐助洗剂包括单磷酸盐、二磷酸盐、三聚磷酸盐或低聚多磷酸盐，包括这些化合物的碱金属盐，包括钠盐。在一些实施例中，助洗剂可以是三聚磷酸钠(STPP)。另外，组合物可以包含有助于实现本发明的中性pH组合物的碳酸盐和/或柠檬酸盐，优选柠檬酸盐。其他适合的非磷酸盐助洗剂包括多羧酸及其部分或完全中和盐、单体型多羧酸和羟基羧酸及其盐的均聚物和共聚物。在一些实施例中，上述化合物的盐包括铵盐和/或碱金属盐，即锂盐、钠盐和钾盐，包括钠盐。适合的多元羧酸包括无环的、脂环族的、杂环的和芳香族的羧酸，其中在一些实施例中，它们可以包含至少两个羧基基团，这些羧基基团在每种情况下彼此分离，在某些情况下被不超过两个碳原子分离。

在一些实施例中，本发明的清洁组合物含有至少一种螯合剂。适合的螯合剂包括但不限于铜、铁和/或锰螯合剂及其混合物。在使用至少一种螯合剂的实施例中，本发明的清洁组合物包含以主题清洁组合物重量计从约0.1％至约15％或甚至从约3.0％至约10％的螯合剂。

在一些又进一步的实施例中，本文提供的清洁组合物包含至少一种沉积助剂。适合的沉积助剂包括但不限于聚乙二醇；聚丙二醇；聚羧酸盐；去污聚合物，例如聚对苯二甲酸；粘土，例如高岭石、蒙脱石、硅镁土、伊利石、膨润土和多水高岭土；以及它们的混合物。

如本文所示，在一些实施例中，抗再沉积剂可用于本发明的一些实施例中。在一些实施例中，可使用非离子表面活性剂。例如，在自动餐具洗涤实施例中，非离子表面活性剂可用于表面改性目的(特别是用于薄片)以避免成膜和沾上污渍并且改善光泽。这些非离子表面活性剂还可用于防止土壤的再沉积。在一些实施例中，抗再沉积剂是本领域已知的非离子表面活性剂(参见例如EP 2100949)。在一些实施例中，非离子表面活性剂可以是乙氧基化非离子表面活性剂，环氧树脂封端的聚(烷氧基化)醇和氧化胺表面活性剂。

在一些实施例中，本发明的清洁组合物包括一种或多种染料转移抑制剂。适合的聚合物染料转移抑制剂包括但不限于聚乙烯吡咯烷酮聚合物、多胺N-氧化物聚合物、N-乙烯吡咯烷酮与N-乙烯基咪唑的共聚物、聚乙烯噁唑烷酮以及聚乙烯咪唑或其混合物。在使用至少一种染料转移抑制剂的实施例中，本发明的清洁组合物包含以清洁组合物的重量计的从约0.0001％至约10％、从约0.01％至约5％、或甚至从约0.1％至约3％的该至少一种染料转移抑制剂。

在一些实施例中，硅酸盐包括在本发明的组合物内。在一些这样的实施例中，可使用硅酸钠(例如，二硅酸钠、偏硅酸钠和结晶页硅酸盐)。在一些实施例中，硅酸盐以从约1％至约20％的水平存在。在一些实施例中，硅酸盐以按组合物的重量计的从约5％至约15％的水平存在。

在一些又另外的实施例中，本发明的清洁组合物还含有分散剂。适合的水溶性有机材料包括但不限于均聚合或共聚合的酸或其盐，其中聚羧酸包括至少两个被不超过两个碳原子彼此分开的羧基自由基。

在一些进一步的实施例中，用于清洁组合物中的酶通过任何适合的技术来稳定。在一些实施例中，本文使用的酶通过在向这些酶提供钙和/或镁离子的成品组合物中钙和/或镁离子的水溶性来源的存在来稳定。在一些实施例中，酶稳定剂包括寡糖、多糖和无机二价金属盐，包括碱土金属，例如钙盐，例如甲酸钙。预想用于酶稳定化的各种技术将在本发明中使用。例如，在一些实施例中，本文使用的这些酶通过存在于为这些酶提供以下这样的离子的成品组合物中的锌(II)、钙(II)和/或镁(II)离子的水溶性来源，连同其他金属离子(例如，钡(II)、钪(II)、铁(II)、锰(II)、铝(III)、锡(II)、钴(II)、铜(II)、镍(II)以及氧钒(IV))来稳定。氯化物和硫酸盐也可用于本发明的一些实施例中。适合的寡糖和多糖(例如糊精)的实施例是本领域已知的(参见例如WO 07/145964)。在一些实施例中，根据需要还可使用可逆的蛋白酶抑制剂，例如含硼化合物(例如硼酸盐、4-甲酰基苯基硼酸)和/或三肽醛来进一步改善稳定性。

在一些实施例中，漂白剂、漂白活化剂和/或漂白催化剂存在于本发明的组合物中。在一些实施例中，本发明的清洁组合物包含一种或多种无机和/或有机漂白化合物。无机漂白剂包括但不限于过氧化氢合物盐(例如过硼酸盐、过碳酸盐、过磷酸盐、过硫酸盐和过硅酸盐)。在一些实施例中，无机过氧化氢合物盐是碱金属盐。在一些实施例中，包括的无机过氧化氢合物盐为结晶固体，没有另外的保护，尽管在一些其他实施例中，该盐被包被。本领域已知的任何适合的盐可用于本发明(参见例如EP 2100949)。

在一些实施例中，漂白活化剂用于本发明的组合物中。漂白活化剂通常为有机过酸前体，其在60℃及以下的温度下在清洁过程中增强漂白作用。适合本文使用的漂白活化剂包括在过水解条件下给出优选具有从约1至约10个碳原子，尤其是从约2至约4个碳原子的脂肪族过氧羧酸的化合物，和/或任选地取代的过氧苯甲酸。其他漂白活化剂是本领域已知的，并且可用于本发明(参见例如EP 2100949)。

另外，在一些实施例中并且如本文进一步描述的，本发明的清洁组合物进一步包含至少一种漂白催化剂。在一些实施例中，可使用锰三氮杂环壬烷和相关络合物，以及钴、铜、锰和铁络合物。另外的漂白催化剂可用于本发明(参见例如US 4,246,612；5,227,084；4,810410；WO 99/06521；和EP2100949)。

在一些实施例中，本发明的清洁组合物包含一种或多种催化性金属络合物。在一些实施例中，可使用含金属的漂白催化剂。在一些实施例中，金属漂白催化剂包含一种催化体系，该催化体系包括：具有限定的漂白催化活性的过渡金属阳离子(例如铜、铁、钛、钌、钨、钼或锰阳离子)，具有很少或不具有漂白催化活性的辅助金属阳离子(例如锌或铝阳离子)，以及对于催化性和辅助性金属阳离子具有限定的稳定性常数的螯合物，特别是乙二胺四乙酸、乙二胺四(亚甲基膦酸)及其水溶性盐(参见例如US4,430,243)。在一些实施例中，本发明的清洁组合物用锰化合物来催化。此类化合物和使用水平是本领域熟知的(参见例如US 5,576,282)。在另外的实施例中，钴漂白催化剂可用于本发明的清洁组合物中。各种钴漂白催化剂是本领域已知的(参见例如US 5,597,936和5,595,967)，并且通过已知的程序容易地制备。

在一些另外的实施例中，本发明的清洁组合物包含大多环刚性配体(macropolycyclic rigid ligand，MRL)的过渡金属络合物。作为实际问题而不当作限制，在一些实施例中，对本发明提供的组合物和清洁方法进行调节以在水性洗涤介质中提供至少一亿分之一数量级的活性MRL种类，并且在一些实施例中，在洗涤液中提供从约0.005ppm至约25ppm、更优选地从约0.05ppm至约10ppm、以及最优选地从约0.1ppm至约5ppm的MRL。

在一些实施例中，在瞬时过渡金属漂白催化剂中的过渡金属包括但不限于锰、铁和铬。MRL还包括但不限于形成交联桥接的特殊超刚性配体(例如5,12-二乙基-1,5,8,12-四氮杂双环[6.6.2]十六烷)。适合的过渡金属MRL通过已知的程序容易地制备(参见例如WO2000/32601和US6,225,464)。

在一些实施例中，本发明的清洁组合物包含金属护理剂。金属护理剂可用于预防和/或减少金属的锈蚀、腐蚀和/或氧化，该金属包括铝、不锈钢和非铁金属(例如银和铜)。适合的金属护理剂包括描述于EP 2100949、WO 9426860和WO 94/26859中的那些)。在一些实施例中，金属护理剂是锌盐。在一些进一步的实施例中，本发明的清洁组合物包含以重量计从约0.1％至约5％的一种或多种金属护理剂。

在一些实施例中，清洁组合物是具有变体丝氨酸蛋白酶多肽蛋白酶的高密度液体(HDL)组合物。HDL液体衣物洗涤剂可以包含清洁表面活性剂(10％-40％)，该清洁表面活性剂包含：阴离子清洁表面活性剂，其选自以下：直链或支链或无规链，取代的或未取代的烷基硫酸盐、烷基磺酸盐、烷基烷氧基化硫酸盐、烷基磷酸盐、烷基膦酸盐、烷基羧酸盐、和/或其混合物；以及任选地非离子表面活性剂，其选自以下：直链或支链或无规链，取代的或未取代的烷基烷氧基化醇，例如C₈-C₁₈烷基乙氧基化醇和/或C₆-C₁₂烷基苯酚烷氧基化物，任选地其中阴离子清洁表面活性剂(亲水指数(HIc)为从6.0至9)与非离子清洁表面活性剂的重量比大于1:1。

该组合物可以任选地包含由两亲烷氧基化油脂清洁聚合物组成的表面活性增强聚合物，该两亲烷氧基化油脂清洁聚合物选自以下：具有支链亲水和疏水特性的烷氧基化聚合物，例如烷氧基化聚亚烷基亚胺(在0.05wt％-10wt％范围内)和/或典型地包含含有选自以下的单体的亲水主链的无规接枝聚合物：不饱和的C₁-C₆羧酸、醚、醇、醛、酮、酯、糖单元、烷氧基单元、马来酸酐、饱和的多元醇(例如甘油)及其混合物；以及一个或多个疏水侧链，该疏水侧链选自：C₄-C₂₅烷基基团、聚丙烯、聚丁烯、饱和的C₂-C₆单羧酸的乙烯酯、丙烯酸或甲基丙烯酸的C₁-C₆烷基酯及其混合物。

该组合物可以包含另外的聚合物，例如去污聚合物，该去污聚合物包含例如阴离子封端的聚酯，例如SRP1；处于无规或嵌段构型的、含有至少一种单体单元的聚合物，该单体单元选自糖、二羧酸、多元醇及其组合；处于无规或嵌段构型的、基于对苯二甲酸乙二醇酯的聚合物及其共聚物，例如Repel-o-tex SF、SF-2和SRP6；Texcare SRA100、SRA300、SRN100、SRN170、SRN240、SRN300和SRN325；Marloquest SL；抗再沉积聚合物(0.1wt％至10wt％，包括例如羧酸盐聚合物，例如包含至少一种选自以下单体的聚合物：丙烯酸、马来酸(或马来酸酐)、富马酸、衣康酸、乌头酸、中康酸、柠康酸、亚甲基丙二酸及其任何混合物；乙烯基吡咯烷酮均聚物；和/或具有在500至100,000Da范围的分子量的聚乙二醇)；纤维素聚合物(包括例如烷基纤维素；烷基烷氧基烷基纤维素；羧基烷基纤维素；烷基羧基烷基纤维素，其实施例包括羧基甲基纤维素、甲基纤维素、甲基羟基乙基纤维素、甲基羧基甲基纤维素；及其混合物)；以及聚合羧酸酯(例如，像马来酸酯/丙烯酸酯无规共聚物或聚丙烯酸酯均聚物)。

该组合物可以进一步包含饱和或不饱和脂肪酸，优选饱和或不饱和的C₁₂-C₂₄脂肪酸(0wt％至10wt％)；处于无规或嵌段构型的沉积助剂(包括例如多糖、纤维素聚合物、聚二烯丙基二甲基卤化铵(DADMAC))、以及DADMAC与乙烯基吡咯烷酮的共聚物、丙烯酰胺、咪唑、卤化咪唑啉及其混合物；阳离子瓜尔胶；阳离子纤维素，例如阳离子羟基乙基纤维素；阳离子淀粉；阳离子聚丙烯酰胺；以及它们的混合物。

该组合物可以进一步包含染料转移抑制剂，其实施例包括锰酞菁、过氧化物酶、聚乙烯基吡咯烷酮聚合物、聚胺N-氧化物聚合物、N-乙烯基吡咯烷酮和N-乙烯基咪唑的共聚物、聚乙烯基噁唑烷酮和聚乙烯基咪唑和/或其混合物；螯合剂，其实施例包括乙二胺四乙酸(EDTA)；二亚乙基三胺五亚甲基膦酸(DTPMP)；羟基-乙烷二膦酸(HEDP)；乙二胺N,N'-二琥珀酸(EDDS)；甲基甘氨酸二乙酸(MGDA)；二亚乙基三胺五乙酸(DTPA)；丙二胺四乙酸(PDTA)；2-羟基吡啶-N-氧化物(HPNO)；或甲基甘氨酸二乙酸(MGDA)；谷氨酸N,N-二乙酸(N,N-二羧基甲基谷氨酸四钠盐(GLDA)；次氮基三乙酸(NTA)；4,5-二羟基间苯二磺酸；柠檬酸及其任何盐；N-羟基乙基乙二胺三乙酸(HEDTA)、三亚乙基四胺六乙酸(TTHA)、N-羟基乙基亚氨基二乙酸(HEIDA)、二羟基乙基甘氨酸(DHEG)、乙二胺四丙酸(EDTP)及其衍生物。

组合物可以包含酶稳定剂(其实施例包括多元醇，例如丙二醇或甘油；糖或糖醇；乳酸；可逆蛋白酶抑制剂；硼酸或硼酸衍生物，例如芳香族硼酸酯；或苯基硼酸衍生物例如4-甲酰基苯基硼酸)。

该组合物可以进一步包含硅树脂或基于脂肪酸的泡沫抑制剂；调色染料、钙和镁阳离子、视觉信号传导成分、抗泡沫剂(0.001wt％至约4.0wt％)和/或结构剂/增稠剂(0.01wt％至5wt％，选自：甘油二酸酯、甘油三酸酯、乙烯乙二醇二硬脂酸酯、微晶纤维素、基于纤维素的材料、超细纤维素、生物聚合物、黄原胶、结冷胶、及其混合物)。

适合的清洁表面活性剂还包括阳离子清洁表面活性剂(选自以下：烷基吡啶化合物、烷基季铵化合物、烷基季鏻化合物、烷基三元锍化合物和/或其混合物)；兼性离子和/或两性清洁表面活性剂(选自一组链烷醇胺磺基甜菜碱)；两性表面活性剂；半极性非离子表面活性剂；及其混合物。

该组合物可以是任何液体形式，例如液体或凝胶形式，或其任何组合。该组合物可以处于任何单位剂量形式，例如小袋。

在一些实施例中，该清洁组合物是具有变体丝氨酸蛋白酶多肽蛋白酶的高密度粉末(HDD)组合物。该HDD粉末衣物洗涤剂可以包括清洁表面活性剂，其包括阴离子清洁表面活性剂(选自以下：直链或支链或无规链、取代或未取代的烷基硫酸盐、烷基磺酸盐、烷基烷氧基化硫酸盐、烷基磷酸盐、烷基膦酸盐、烷基羧酸盐和/或其混合物)；非离子清洁表面活性剂(选自以下：直链或支链或无规链、取代或未取代的C₈-C₁₈烷基乙氧基化物和/或C₆-C₁₂烷基苯酚烷氧基化物)；阳离子清洁表面活性剂(选自以下：烷基吡啶化合物、烷基季铵化合物、烷基季鏻化合物，烷基三元锍化合物及其混合物)；兼性离子和/或两性清洁表面活性剂(选自以下：链烷醇胺磺基甜菜碱)；两性表面活性剂；半极性非离子表面活性剂及其混合物；助洗剂(无磷酸盐助洗剂[例如沸石助洗剂，其实施例包括在0wt％至小于10wt％范围内的沸石A、沸石X、沸石P和沸石MAP]；磷酸盐助洗剂[其实施例包括在0wt％至小于10wt％范围内的三聚磷酸钠]；在小于15wt％范围内的柠檬酸、柠檬酸盐和次氮基三乙酸或其盐)；硅酸盐(在0wt％至小于10wt％范围内的硅酸钠或硅酸钾或偏硅酸钠)或层状硅酸盐(SKS-6))；碳酸盐(在0wt％至小于10wt％范围内的碳酸钠和/或碳酸氢钠)；以及漂白剂(光漂白剂，其实施例包括磺化锌酞菁、磺化铝酞菁、呫吨染料及其混合物；疏水或亲水漂白活化剂(其实施例包括十二烷酰基氧基苯磺酸盐、癸酰基氧基苯磺酸盐、癸酰基氧基苯甲酸或其盐、3,5,5-三甲基己酰基氧基苯磺酸盐、四乙酰基乙二胺-TAED、和壬酰基氧基苯磺酸盐-NOBS、腈季铵盐(nitrile quats)、及其混合物；过氧化氢；过氧化氢源(无机过氧化氢合物盐，其实施例包括过硼酸盐、过碳酸盐、过硫酸盐、过磷酸盐或过硅酸盐的单或四水合钠盐)；预先形成的亲水和/或疏水性过酸(选自：过羧酸和盐，过碳酸和盐，过亚胺酸和盐，过氧单硫酸和盐)及其混合物和/或漂白催化剂(例如亚胺漂白增效剂，其实施例包括亚胺阳离子和聚离子；亚胺兼性离子；改性胺；改性氧化胺；N-磺酰亚胺；N-膦酰基亚胺；N-酰基亚胺；噻二唑二氧化物；全氟亚胺；环状糖酮及其混合物；含金属的漂白催化剂，例如铜、铁、钛、钌、钨、钼或锰阳离子以及辅助金属阳离子(例如锌或铝)以及螯合剂例如乙二胺四乙酸、乙二胺四(亚甲基膦酸)及其水溶性盐)。

该组合物可以进一步包含另外的洗涤剂成分，包括香料微囊剂、淀粉包封的香料协调剂、调色剂、包括织物完整性的另外的聚合物和阳离子聚合物、染料锁定成分、织物软化剂、增白剂(例如C.I.荧光增白剂)、絮凝剂、螯合剂、烷氧基化多胺、织物沉积助剂和/或环糊精。

在一些实施例中，该清洁组合物是具有本发明的丝氨酸蛋白酶的ADW洗涤剂组合物。该ADW洗涤剂组合物可以包含两种或多种选自下组的非离子表面活性剂：乙氧基化非离子表面活性剂、醇烷氧基化表面活性剂、环氧封端的聚(氧基烷基化)醇或胺氧化物表面活性剂，它们以0％至10％(以重量计)的量存在；在5％-60％的范围内的助洗剂，该助洗剂包括：磷酸盐助洗剂(单磷酸盐、二磷酸盐、三聚磷酸盐或低聚磷酸盐)，优选三聚磷酸钠-STPP，或无磷酸盐助洗剂[基于氨基酸的化合物，其实施例包括MGDA(甲基-甘氨酸-二乙酸)及其盐和衍生物、GLDA(谷氨酸-N,N-二乙酸)及其盐和衍生物、IDS(亚氨基二琥珀酸)及其盐和衍生物、羧基甲基菊粉及其盐和衍生物及其混合物、次氮基三乙酸(NTA)、二亚乙基三胺五乙酸(DTPA)、B-丙氨酸二乙酸(B-ADA)及其盐]，多元羧酸及其部分或完全中和盐的均聚物和共聚物，单体多元羧酸和羟基羧酸及其盐，它们在0.5重量％至50重量％的范围内；磺化/羧化聚合物(为产品提供尺寸稳定性)，其在约0.1％至约50％(以重量计)的范围内；在约0.1％至约10％(以重量计)的范围内的干燥助剂(选自聚酯，特别是任选地与有助于缩聚作用的具有3至6个官能团(特别是酸、醇或酯官能团)的另外的单体一起的阴离子聚酯，聚碳酸酯-、聚氨酯-和/或聚脲-聚有机硅氧烷化合物或其反应性环状碳酸酯和尿素型的前体化合物)；在从约1％至约20％(以重量计)的范围内的硅酸盐(硅酸钠或硅酸钾，例如二硅酸钠、偏硅酸钠和结晶页硅酸盐)；无机漂白剂(例如过氧化氢合物盐例如过硼酸盐、过碳酸盐、过磷酸盐、过硫酸盐和过硅酸盐)和有机漂白剂(例如有机过氧酸，包括二酰基和四酰基过氧化物，特别是二过氧十二烷二酸、二过氧十四烷二酸和二过氧十六烷二酸)。漂白活化剂-有机过酸前体，其在约0.1％至约10％(以重量计)范围内；漂白催化剂(选自锰三氮环壬烷及相关络合物，Co、Cu、Mn和Fe双吡啶胺及相关络合物，以及五胺乙酸钴(III)及相关络合物)；在从约0.1％至5％(以重量计)的范围内的金属护理剂(选自苯并三氮唑、金属盐和络合物、和/或硅酸盐)；每克自动餐具洗涤剂组合物的从约0.01mg至5.0mg范围内的活性酶的酶(酰基转移酶、α-淀粉酶、β-淀粉酶、α-半乳糖苷酶、***糖苷酶、芳基酯酶、β-半乳糖苷酶、角叉菜胶酶、过氧化氢酶、纤维二糖水解酶、纤维素酶、软骨素酶、角质酶、内切β-1,4-葡聚糖酶、内切β-甘露聚糖酶、酯酶、外切甘露聚糖酶、半乳聚糖酶、葡糖淀粉酶、半纤维素酶、透明质酸酶、角蛋白酶、漆酶、乳糖酶、木质素酶、脂肪酶、脂肪氧合酶、甘露聚糖酶、氧化酶、果胶裂解酶、果胶乙酰酯酶、果胶酶、戊聚糖酶、过氧化物酶、酚氧化酶、磷酸酶、磷脂酶、植酸酶、聚半乳糖醛酸酶、蛋白酶、支链淀粉酶、还原酶、鼠李糖半乳糖醛酸酶、β-葡聚糖酶、鞣酸酶、转谷氨酰胺酶、木聚糖乙酰酯酶、木聚糖酶、木葡聚糖酶、和木糖苷酶、及其任何混合物)；以及酶稳定剂组分(选自寡糖、多糖和无机二价金属盐)。

在一些实施例中，该清洁组合物不含硼酸盐。在一些实施例中，该清洁组合物不含磷酸盐。

有益地包含本发明的丝氨酸蛋白酶多肽的代表性洗涤剂配制品包括在WO2013063460，第78-152页中找到的洗涤剂配制品，并且特别是将第94至152页的表格通过引用特此结合。丝氨酸蛋白酶通常以按组合物重量计的从0.00001％至10％的酶蛋白的水平掺入洗涤剂组合物中。在一些实施例中，洗涤剂组合物包含以组合物重量计超过0.0001％、0.001％、0.01％、或0.1％的丝氨酸蛋白酶。在一些实施例中，洗涤剂组合物包含以组合物重量计少于1％、0.1％、0.01％、或0.001％的丝氨酸蛋白酶。

还提供了使用本发明的丝氨酸蛋白酶多肽处理织物(例如，使纺织品脱浆)的组合物和方法。织物处理方法是本领域中熟知的(参见例如，US6,077,316)。例如，可以通过包括使织物与溶液中的丝氨酸蛋白酶接触的方法来改善织物的手感和外观。织物可以在压力下用溶液进行处理。

可以在纺织品的编织期间或之后或在脱浆阶段期间或一个或多个另外的织物加工步骤中应用本发明的丝氨酸蛋白酶。在纺织品的编织中，使线暴露于可观的机械应变。在机械织机上编织之前，常常用上浆淀粉或淀粉衍生物涂覆经纱以增加其抗张强度并防止断开。可以在编织期间或之后应用本发明的丝氨酸蛋白酶以除去上浆淀粉或淀粉衍生物。编织之后，可以在进一步处理织物之前使用丝氨酸蛋白酶来除去浆涂层以确保均一和耐洗的结果。

本发明的丝氨酸蛋白酶可以单独使用或与其他脱浆化学试剂和/或脱浆酶一起使用，以作为清洁添加剂(例如在水性组合物中)使织物(包括含棉的织物)脱浆。淀粉酶还可以用于在靛蓝染色的牛仔织物和服装上产生石磨的外观的组合物和方法中使用。对于服装生产而言，所述织物可被裁剪和缝制成为服装或衣服，其随后被精整(finish)。特别地，对于牛仔布的生产，开发了不同的酶促精整方法。牛仔衣服的精整加工通常是以酶促脱浆步骤开始的，其中使衣服经受淀粉水解酶的作用以为织物提供柔软性，并且使棉更易于进行随后的酶促精整加工步骤。丝氨酸蛋白酶可以用于下列方法中：精整加工牛仔服装(例如“生物磨砂方法”)、酶促脱浆并为织物提供柔软性和/或精整加工方法。

本文所述的丝氨酸蛋白酶多肽可进一步用于酶辅助去除蛋白质，该蛋白质来自动物及其随后的降解或处理，例如羽毛、皮肤、毛发、兽皮等。在一些情况下，与在滚烫的水或去毛工艺中的传统浸泡相比，将动物尸体浸泡在包含本发明的丝氨酸蛋白酶多肽的溶液中可以起到保护皮肤免受损伤的作用。在一个实施例中，羽毛可以在适合于消化或引发羽化退化的条件下用本发明的分离的丝氨酸蛋白酶多肽进行喷雾。在一些实施例中，如上所述，本发明的丝氨酸蛋白酶可以与氧化剂组合使用。

在一些实施例中，通过使用本发明的丝氨酸蛋白酶多肽来辅助与未加工的羽毛相关的油或脂肪的去除。在一些实施例中，将丝氨酸蛋白酶多肽在用于清洁羽毛的组合物中使用，并且用来对纤维进行消毒和部分脱水。在又其他实施例中，所公开的丝氨酸蛋白酶多肽可用于从羽毛中回收蛋白质。在一些其他实施例中，在具有或没有约0.5％(v/v)的表面活性剂的情况下，将丝氨酸蛋白酶多肽与95％乙醇或其他极性有机溶剂组合应用于洗涤溶液中。

在本发明的进一步方面，本发明的丝氨酸蛋白酶多肽可用作包含丝氨酸蛋白酶及其变体的动物饲料组合物、动物饲料添加剂和/或宠物食品的组分。本发明进一步涉及制备这样一种动物饲料组合物、动物饲料添加剂组合物和/或宠物食品的方法，该方法包括将丝氨酸蛋白酶多肽与一种或多种动物饲料成分和/或动物饲料添加剂成分和/或宠物食品成分进行混合。此外，本发明涉及丝氨酸蛋白酶多肽在制备动物饲料组合物和/或动物饲料添加剂组合物和/或宠物食品中的用途。

术语“动物”包括所有非反刍动物和反刍动物。在一个具体实施例中，该动物是非反刍动物，例如马和单胃动物。单胃动物的实施例包括但不限于：猪(pig和swine)例如仔猪、生长猪、母猪；家禽例如火鸡、鸭子、小鸡、肉仔鸡、产卵鸡；鱼类例如鲑鱼，鳟鱼，罗非鱼，鲶鱼和鲤鱼；以及甲壳类例如小虾米和大虾。在进一步的实施例中，动物是反刍动物，包括但不限于牛、小牛、山羊、绵羊、长颈鹿、北美野牛、驼鹿、麋鹿、牦牛、水牛、鹿、骆驼、羊驼、骆驼、羊驼、美洲驼、羚羊、叉角羚和鹿牛羚。

在当下语境中，术语“宠物食品”旨在被理解为意指用于以下各项的食物：家庭动物，例如但不限于狗、猫、沙鼠、仓鼠、南美栗鼠、褐鼠、豚鼠；鸟类宠物，例如金丝雀、长尾小鹦鹉和鹦鹉；爬行动物宠物，例如海龟、蜥蜴和蛇；以及水生宠物，例如热带鱼和青蛙。

术语“动物饲料组合物”、“饲料”(feedstuff和fodder)可互换地使用，并且包含选自以下的一种或多种饲料原料，该组包括：a)谷类，例如小粒谷物(例如小麦、大麦、黑麦、燕麦及其组合)和/或大粒谷物，例如玉米或高粱；b)来自谷类的副产品，例如玉米谷蛋白粉、干酒糟谷物可溶物(Distillers DriedGrain Solubles)(DDGS)(特别是基于玉米的干酒糟谷物可溶物(cDDGS))、小麦麸、粗小麦粉、次麦粉、米糠、稻壳、燕麦壳、棕榈仁和柑橘洛；c)获自以下来源的蛋白质：例如大豆、向日葵、花生、羽扇豆、豌豆、蚕豆、棉花、卡诺拉、鱼粉、干血浆蛋白质、肉和骨粉、马铃薯蛋白、乳清、干椰子肉、芝麻；d)获自植物和动物来源的油和脂肪；以及e)矿物质和维生素。

本文所述的蛋白酶多肽可进一步用于纸浆(例如化学纸浆、半化学纸浆、牛皮纸浆、机械纸浆或通过亚硫酸盐法制备的纸浆)的酶辅助漂白。一般来说，将纸浆与本发明的蛋白酶多肽在适合于漂白纸浆的条件下一起孵育。

在一些实施例中，纸浆是不含氯的纸浆，该纸浆经氧、臭氧、过氧化氢或过氧酸进行漂白。在一些实施例中，蛋白酶多肽用于展示出低木质素含量的纸浆的酶辅助漂白，该纸浆是通过经改良的制浆方法或连续制浆方法生产的。在一些其他实施例中，蛋白酶多肽单独地应用或优选地与木聚糖酶和/或内切葡聚糖酶和/或α-半乳糖苷酶和/或纤维二糖水解酶组合应用。

本文所述的蛋白酶多肽可进一步用于酶辅助去除蛋白质，该蛋白质来自动物及其随后的降解或处理，例如羽毛、皮肤、毛发、兽皮等。在一些情况下，与在滚烫的水或去毛工艺中的传统浸泡相比，将动物尸体浸泡在包含本发明的蛋白酶多肽的溶液中可以起到保护皮肤免受损伤的作用。在一个实施例中，羽毛可以在适合于消化或引发羽化退化的条件下用本发明的分离的蛋白酶多肽进行喷雾。在一些实施例中，如上所述，本发明的蛋白酶可以与氧化剂组合使用。

在一些实施例中，通过使用本发明的蛋白酶多肽来辅助与未加工的羽毛相关的油或脂肪的去除。在一些实施例中，将蛋白酶多肽在用于清洁羽毛的组合物中使用，并且用来对纤维进行消毒和部分脱水。在一些其他实施例中，在具有或没有约0.5％(v/v)的表面活性剂的情况下，将蛋白酶多肽与95％乙醇或其他极性有机溶剂组合应用于洗涤溶液中。在又其他实施例中，所公开的蛋白酶多肽可用于从羽毛中回收蛋白质。所公开的蛋白酶多肽可以单独使用或与合适的羽毛加工和蛋白水解方法(例如在PCT/EP2013/065362、PCT/EP2013/065363、和PCT/EP 2013/065364中公开的那些，其通过引用特此结合)组合使用。在一些实施例中，回收的蛋白质随后可以用于动物或鱼类饲料中。

实施例

提供以下实施例以证明和说明本公开的某些优选实施例和方面，并且不应被解释为限制性的。在下面的实验公开中，应用以下缩写：ADW(自动餐具洗涤)；BMI(血液/奶/墨汁)；BSA(牛血清白蛋白)；CAPS(N-环己基-3-氨基丙磺酸)；CHES(N-环己基-2-氨基乙磺酸)；DMC(二甲基酪蛋白)；HDD(重垢干型/粉型)；HDL(重垢液体)；HEPES(4-(2-羟基乙基)-1-哌嗪乙磺酸)；MTP(微量滴定板)；ND(未完成)；OD(光密度)；PCR(聚合酶链反应)；ppm(百万分率)；QS(数量足够)；rpm(每分钟转动次数)；AAPF(琥珀酰-Ala-Ala-Pro-Phe-对硝基苯胺)；TNBSA(2,4,6-三硝基苯磺酸)；v/v(体积比体积)；以及w/v(重量比体积)。

实施例1

蛋白质测定方法

通过标准无污渍成像仪(Stain Free Imager Criterion)进行蛋白质测定

蛋白质通过标准无污渍成像仪法进行定量。该方法基于无污渍预制PAGE凝胶的应用，其中每个条带的强度将取决于在感兴趣的蛋白质中呈现的色氨酸残基的量。用于PAGE的Criterion^TMTGX(Tris-甘氨酸延伸型)无污渍(Stain-Free)^TM预制凝胶包括独特的三卤代化合物。这允许使用Gel Doc^TMEZ成像***进行蛋白质的快速荧光检测。三卤代化合物与UV诱导反应中的色氨酸残基反应产生荧光，该荧光可以很容易地通过Gel Doc EZ成像仪在凝胶内检测到。测定中使用的试剂：浓缩的(10x)Laemmli样品缓冲液(Kem-En-Tec公司，目录#42556)；18或26孔标准TGX无污渍预制凝胶(伯乐公司(Bio-Rad)，分别为目录#567-8124和567-8125)；和蛋白质标记“精密加蛋白质标准(Precision Plus Protein Standards)”(伯乐公司(Bio-Rad)，目录#161-0363)。如下进行测定：将25μl蛋白质样品和25μl0.5M HCL添加到96孔PCR板上，该PCR板在冰上持续10分钟以灭活蛋白酶并防止自水解。在96孔PCR板中将50μl酸性蛋白质混合物添加到含有0.385mg DTT的50μL样品缓冲液中。之后，通过运行缓冲液填充腔室，并设置凝胶盒。然后将每个样品的10μL与标记物一起加载到每个口袋中，并在200V下开始电泳持续35min。电泳后，将凝胶转移到成像仪中。使用成像实验室(ImageLab)软件来计算每个条带的强度。通过已知标准样品的蛋白的量和色氨酸含量，可以制作校准曲线。实验样品的量可以通过将条带强度和色氨酸数量外推到蛋白质浓度来确定。使用蛋白质定量方法来制备用于随后实施例中所示的测定的BspE04637蛋白酶的样品。

N-末端和C-末端氨基酸测定

在准备序列确认时，将分离的蛋白质样品在10kDa旋转过滤器中经受一系列化学处理。通过尿素和DTT处理将样品变性和减少。进行了胍基化步骤将赖氨酸转化为高精氨酸以保护赖氨酸侧链免于乙酰化。然后使用碘乙酰胺进行乙酰化反应仅修饰蛋白质的N-末端残基。然后将样品与含有¹⁸O水的缓冲液混合，并且添加胰蛋白酶和胰凝乳蛋白酶用于消化。除了将保留天然¹⁶O的羧基末端之外，得到的肽将含有¹⁸O和¹⁶O的混合物。使用普罗克松(Proxeon)纳米LC***，然后使用LTQ轨道阱(Orbitrap)(赛默飞世尔公司(Thermo Fisher)高分辨率质谱仪分离和分析消化产物，并且从肽的MS/MS片段谱和肽的同位素模式推导出氨基酸序列。

实施例2

丝氨酸蛋白酶BspE04637的发现和鉴定

芽孢杆菌属物种GX6638(ATCC 53278)被选为可用于工业应用的酶的潜在来源。为了鉴定由芽孢杆菌属物种GX6638产生的酶和编码这些酶的基因，使用依诺米那测序通过合成(SBS)技术对芽孢杆菌属物种GX6638的整个基因组进行测序。基因组测序和序列数据的集合由碱基清理(BaseClear)(荷兰莱顿市(Leiden，TheNetherlands))进行。重叠群通过BioXpr(比利时那慕尔(NamurNamur，Belgium))进行注释。在芽孢杆菌属物种GX6638菌株中以这种方式鉴定的基因中的一种编码与各种其他细菌的丝氨酸蛋白酶显示同源性的蛋白质。该基因(BspE04637.n)的序列描绘在SEQ ID NO:1中：ATGAGAAAACTACTA ACCTTGTTAACGTTAAGCATTCTTGTATTTTCGATGGTAGTACCAATGTCGATTAGTGCTCAATCACAGGCAGAAAAACAGGAGTACCTTGTTCAATTTAATGACAAGGTAAATAAGGGGATATTAAACGCATTTGGTGTAGATAACAGTGATGTTCTTCATACTTACAATCTACTACCTGTTAATCTAGTAAAAATGACAGAGCAGCAAGCGAAAGCATTACAAAATAATCCGCATATTAAAGCGGTGGAACCTAACTTTGAGGCGCAAGCATTCGCTCAAACAGTACCGTGGGGAGTTCCTCATGTTCAAGGTACTGATGCTCATGCAGCGGGGCATACTGGAAGTGGTGTAAAAGTAGCTATACTCGATACGGGAATTGATCGAAATCATGAAGATTTAAATGTAAGAGGAGGGCACTCTGTATTCACAGACAGTGCAAACAGGGATCCTTATTACGATGGTAGTGGTCATGGCACGCACGTTGCTGGAACAGTAGCGGCCTTAAATAATAGTGTAGGTGTGTTAGGTGTAGCCTACAACGCGGAGCTATATGCGGTAAAAGTATTAAATAACAGTGGAAGTGGTTCTTATGCGGGAATCGCTGAAGGAATTGAATGGGCAGTACAAAACAATATGGACATTATAAATATGAGTTTAGGAGGTTCGATGAGTTCTTCTATTTTAGAAGAGTGGTGTAATATTGCCTACAATTCTGGTGTGCTTGTAGTGGCGGCAGCTGGAAATAGTGGACGTACGAATGGCCGAGGGGATACTGTTGGTTATCCAGCAAAATATGATTCTGTTATCGCAGTAGCAGCAGTTGATTCTAGCAACAATCGTGCAAGTTTCTCTAGTACAGGACCTGCAGTGGAAATTGCTGCACCAGGTGTAAACATTCTTAGTACGACTCCTGGAAACAGCTATGCATCTTACAACGGAACTTCGATGGCATCTCCACATGTAGCTGGTGTGGCAGCGCTTGTCTTGGCAGCGAATCCGAACCTTTCAAACGTGGAGCTTCGTAATCGATTAAACGATACAGCGCAAAACTTAGGAGATGCAAACCACTTTGGAAACGGCCTAGTGCGTGCAGTTGATGCCATTAACGGCACTAGCTCCGGTGATAACGGTGGCGGAAGCGAACCAACAAAACCAGGTAACGGCAAAGGAAACGGAAGAAAC。

由BspE04637.n基因编码的前酶原描绘在SEQ ID NO:2中。在N-末端，蛋白质具有如通过SignalP-NN(埃马努埃尔松(Emanuelsson)等人，自然试验方案(Nature Protocols)(2007)2：953-971)预测的长度为25个氨基酸的信号肽。该信号肽序列在SEQ ID NO:2中加下划线并以粗体显示。信号肽的存在表明该丝氨酸蛋白酶是分泌的酶。该酶具有预测为72个氨基酸的前序列(以斜体显示)。预测的完全加工的成熟链的序列(BspE04637，303个氨基酸)描绘在SEQ ID NO:3中。

SEQ ID NO:2列出了丝氨酸蛋白酶前体BspE04637的氨基酸序列(信号肽序列加下划线并以粗体显示，前序列以斜体显示)：

AQTVPWGVPHVQGTDAHAAGHTGSGVKVAILDTGIDRNHEDLNVRGGHSVFTDSANRDPYYDGSGHGTHVAGTVAALNNSVGVLGVAYNAELYAVKVLNNSGSGSYAGIAEGIEWAVQNNMDIINMSLGGSMSSSILEEWCNIAYNSGVLVVAAAGNSGRTNGRGDTVGYPAKYDSVIAVAAVDSSNNRASFSSTGPAVEIAAPGVNILSTTPGNSYASYNGTSMASPHVAGVAALVLAANPNLSNVELRNRLNDTAQNLGDANHFGNGLVRAVDAINGTSSGDNGGGSEPTKPGNGKGNGRN。

SEQ ID NO:3列出了成熟蛋白酶BspE04637的预测氨基酸序列：AQTVPWGVPHVQGTDAHAAGHTGSGVKVAILDTGIDRNHEDLNVRGGHSVFTDSANRDPYYDGSGHGTHVAGTVAALNNSVGVLGVAYNAELYAVKVLNNSGSGSYAGIAEGIEWAVQNNMDIINMSLGGSMSSSILEEWCNIAYNSGVLVVAAAGNSGRTNGRGDTVGYPAKYDSVIAVAAVDSSNNRASFSSTGPAVEIAAPGVNILSTTPGNSYASYNGTSMASPHVAGVAALVLAANPNLSNVELRNRLNDTAQNLGDANHFGNGLVRAVDAINGTSSGDNGGGSEPTKPGNGKGNGRN。

实施例3

丝氨酸蛋白酶SWT183_1430046的发现和鉴定

芽孢杆菌属物种SWT183(杜邦培养物保藏中心)也被选为可用于工业应用的酶的潜在来源。为了鉴定由芽孢杆菌属物种SWT183产生的酶和编码这些酶的基因，使用依诺米那测序通过合成(SBS)技术对芽孢杆菌属物种SWT183的整个基因组进行测序。基因组测序、序列数据的集合以及重叠群的注释由碱基清理(BaseClear)(荷兰莱顿市(Leiden，The Netherlands))进行。在芽孢杆菌属物种SWT183菌株中以这种方式鉴定的基因中的一种编码与BspE04637显示同源性的蛋白质。该基因SWT183_1430046.n的序列描绘在SEQ ID NO:4中。

SEQ ID NO:4列出了SWT183_1430046.n基因的核苷酸序列：ATGAGAAAACTACTAACCTTGTTAACGTTAAGCATCCTTGTATTTTCGATGTTAGTACCAATGTCGATTAGTGCACAATCACAGGCAGAAAAACAGGAGTACCTTGTTCAATTTAATGATCAGGTGAATAATGGAATATTAAATGCATTTGGTGTAAAAGACAGTGATGTTCTTCATACTTACAATCTACTACCTGTCAATCTAGTAAAAATGACAGAGCAGCAAGCGAAAGCATTACAAAATAATCCACATATTAAAGCGGTGGAACCTAACTTTGAGGCGCAAGCATTCGCTCAAACCGTACCGTGGGGAGTTCCTCATGTTCAAGGTACCGATGCTCACGCAGCGGGGCATACTGGAAGTGGTGTAAAAGTAGCTATACTTGATACGGGAATTGATCGAAATCATGAAGATTTAAACGTAAGAGGAGGGCATTCTGTATTTACGGACAGTGCAAACAGCGATCCTTATTACGATGGTAGTGGTCATGGCACGCACGTTGCTGGAACAGTAGCGGCGTTAAATAATAGTGTAGGTGTGTTAGGTGTAGCCTACAATGCGGAACTGTATGCGGTAAAAGTATTAAATAACAGTGGAAGTGGTTCTTACGCAGGAATTGCACAAGGGATTGAATGGGCAGTTCAAAACAATATGGACATTATTAATATGAGCTTAGGAGGTTCGATGAGTTCTTCTATTTTAGAAGAATGGTGTAACATTGCTTACAATTCTGGTGTACTAGTAGTGGCAGCAGCTGGAAACAGTGGACGTACGAACGGTCGAGGAGATACTGTCGGTTATCCAGCAAAATATGATTCTGTTATCGCAGTAGCAGCAGTCGATTCTAGCAATAACCGTGCAAGCTTCTCTAGTACAGGATCTGCAGTGGAGATTGCTGCACCAGGTGTAAACATTCTTAGCACAACTCCTGGAAACAGTTACGCATCTTACAACGGAACTTCGATGGCATCTCCACATGTAGCTGGTGTAGCAGCACTTGTATGGGCAGCAAATCCGAACCTTTCAAACGTGGAGCTCCGTAATCGATTAAACGATACAGCGCAAAACTTAGGTGATGCAAACCACTTCGGACACGGCCTAGTCCGTGCAGTCGATGCCATTAACGGCACTAGCTCCGGTGATAACGGTGGCGGTGACGATGGTGGAAGCGGACCAACAAAACCAGGTAACGGCAAAGGAAACGGAAAAAACTAA。

由SWT183_1430046.n基因编码的前酶原描绘在SEQ ID NO:5中。在N-末端，蛋白质具有如通过SignalP-NN(埃马努埃尔松(Emanuelsson)等人，自然试验方案(NatureProtocols)(2007)2：953-971)预测的长度为25个氨基酸的信号肽。该信号肽序列在SEQ IDNO:5中加下划线并以粗体显示。信号肽的存在表明该丝氨酸蛋白酶是分泌的酶。该酶具有预测为72个氨基酸的前序列(以斜体显示)。预测的完全加工的成熟链的序列(SWT183_1430046，307个氨基酸)描绘在SEQ ID NO:6中。

SEQ ID NO:5列出了丝氨酸蛋白酶前体SWT183_1430046的氨基酸序列(信号肽序列加下划线并以粗体显示，前序列以斜体显示)：

AQTVPWGVPHVQGTDAHAAGHTGSGVKVAILDTGIDRNHEDLNVRGGHSVFTDSANSDPYYDGSGHGTHVAGTVAALNNSVGVLGVAYNAELYAVKVLNNSGSGSYAGIAQGIEWAVQNNMDIINMSLGGSMSSSILEEWCNIAYNSGVLVVAAAGNSGRTNGRGDTVGYPAKYDSVIAVAAVDSSNNRASFSSTGSAVEIAAPGVNILSTTPGNSYASYNGTSMASPHVAGVAALVWAANPNLSNVELRNRLNDTAQNLGDANHFGHGLVRAVDAINGTSSGDNGGGDDGGSGPTKPGNGKGNGKN。

SEQ ID NO:6列出了成熟蛋白酶SWT183_1430046的预测氨基酸序列：AQTVPWGVPHVQGTDAHAAGHTGSGVKVAILDTGIDRNHEDLNVRGGHSVFTDSANSDPYYDGSGHGTHVAGTVAALNNSVGVLGVAYNAELYAVKVLNNSGSGSYAGIAQGIEWAVQNNMDIINMSLGGSMSSSILEEWCNIAYNSGVLVVAAAGNSGRTNGRGDTVGYPAKYDSVIAVAAVDSSNNRASFSSTGSAVEIAAPGVNILSTTPGNSYASYNGTSMASPHVAGVAALVWAANPNLSNVELRNRLNDTAQNLGDANHFGHGLVRAVDAINGTSSGDNGGGDDGGSGPTKPGNGKGNGKN。

实施例4

BspE04637的异源表达

使用由枯草芽孢杆菌aprE启动子、枯草芽孢杆菌aprE信号肽序列、天然BspE04637蛋白酶原肽、成熟BspE04637蛋白酶和BPN'终止子组成的表达盒，在枯草芽孢杆菌中生产BspE04637蛋白酶。将该盒克隆到基于pBN的复制穿梭载体(巴贝(Babe)等人(1998)，生物技术与应用生物化学(Biotechnol.Appl.Biochem.)27：117-124)中，并转化到枯草芽孢杆菌菌株BG3594中。含有BspE04637基因(pBN-BspE04637)的pBN载体的图显示于图1中。

为了生产BspE04637，将含有pBN-BspE04637的枯草芽孢杆菌转化体在15ml福尔肯(Falcon)管子中在具有10ppm新霉素的TSB(肉汤)中培养16小时，并且将300μl该预培养物添加到500mL烧瓶中，该烧瓶装有补充有10ppm新霉素的30mL培养基(如下所述)。随着在180rpm下的持续转动混合，将这些烧瓶在32℃下孵育48小时。通过在锥形管中以14500rpm离心20分钟来收获培养物。将培养上清液用于测定。培养基是基于MOP缓冲液的富集的半定义培养基，以尿素为主要氮源，以葡萄糖为主要碳源，并补充有1％大豆蛋白胨用于稳健的细胞生长。在质粒pBN-BspE04637中BspE04637基因的核苷酸前成熟(prop-mature)序列描绘于SEQ ID NO:7中：CAATCACAGGCAGAAAAACAGGAGTACCTTGTTCAATTTAATGACAAGGTAAATAAGGGGATATTAAACGCATTTGGTGTAGATAACAGTGATGTTCTTCATACTTACAATCTACTACCTGTTAATCTAGTAAAAATGACAGAGCAGCAAGCGAAAGCATTACAAAATAATCCGCATATTAAAGCGGTGGAACCTAACTTTGAGGCGCAAGCATTCGCTCAAACAGTACCGTGGGGAGTTCCTCATGTTCAAGGTACTGATGCTCATGCAGCGGGGCATACTGGAAGTGGTGTAAAAGTAGCTATACTCGATACGGGAATTGATCGAAATCATGAAGATTTAAATGTAAGAGGAGGGCACTCTGTATTCACAGACAGTGCAAACAGGGACCCTTATTACGATGGTAGTGGTCATGGCACGCACGTTGCTGGAACAGTAGCGGCCTTAAATAATAGTGTAGGTGTGTTAGGTGTAGCCTACAACGCGGAGCTATATGCGGTAAAAGTATTAAATAACAGTGGAAGTGGTTCTTATGCGGGAATCGCTGAAGGAATTGAATGGGCAGTACAAAACAATATGGACATTATAAATATGAGTTTAGGAGGTTCGATGAGTTCTTCTATTTTAGAAGAGTGGTGTAATATTGCCTACAATTCTGGTGTGCTTGTAGTGGCGGCAGCTGGAAATAGTGGACGTACGAATGGCCGAGGGGATACTGTTGGTTATCCAGCAAAATATGATTCTGTTATCGCAGTAGCAGCAGTTGATTCTAGCAACAATCGTGCAAGTTTCTCTAGTACAGGACCTGCAGTGGAAATTGCTGCACCAGGTGTAAACATTCTTAGTACGACTCCTGGAAACAGCTATGCATCTTACAACGGAACTTCGATGGCATCTCCACATGTAGCTGGTGTGGCAGCGCTTGTCTTGGCAGCGAATCCGAACCTTTCAAACGTGGAGCTTCGTAATCGATTAAACGATACAGCGCAAAACTTAGGAGATGCAAACCACTTTGGAAACGGCCTAGTGCGTGCAGTTGATGCCATTAACGGCACTAGCTCCGGTGATAACGGTGGCGGAAGCGAACCAACAAAACCAGGTAACGGCAAAGGAAACGGAAGAAAC。

从质粒pBN-BspE04637表达的BspE04637前体蛋白的氨基酸序列描绘于SEQ IDNO:8中(预测的前肽以加下划线的文本显示)：QSQAEKQEYLVQFNDKVNKGILNAFGVDNSDVLHTYNL LPVNLVKMTEQQAKALQNNPHIKAVEPNFEAQAFAQTVPWGVPHVQGTDAHAAGHTGSGVKVAILDTGIDRNHEDLNVRGGHSVFTDSANRDPYYDGSGHGTHVAGTVAALNNSVGVLGVAYNAELYAVKVLNNSGSGSYAGIAEGIEWAVQNNMDIINMSLGGSMSSSILEEWCNIAYNSGVLVVAAAGNSGRTNGRGDTVGYPAKYDSVIAVAAVDSSNNRASFSSTGPAVEIAAPGVNILSTTPGNSYASYNGTSMASPHVAGVAALVLAANPNLSNVELRNRLNDTAQNLGDANHFGNGLVRAVDAINGTSSGDNGGGSEPTKPGNGKGNGRN。

如实施例1所述的N-末端和C-末端分析揭示从质粒pBN-BspE04637表达的分离的BspE04637蛋白是截短型(280个氨基酸)，理论平均质量为28.5kDa)。BspE04637蛋白的截短形式的序列显示于SEQ ID NO:9中：AQTVPWGVPHVQGTDAHAAGHTGSGVKVAILDTGIDRNHEDLNVRGGHSVFTDSANRDPYYDGSGHGTHVAGTVAALNNSVGVLGVAYNAELYAVKVLNNSGSGSYAGIAEGIEWAVQNNMDIINMSLGGSMSSSILEEWCNIAYNSGVLVVAAAGNSGRTNGRGDTVGYPAKYDSVIAVAAVDSSNNRASFSSTGPAVEIAAPGVNILSTTPGNSYASYNGTSMASPHVAGVAALVLAANPNLSNVELRNRLNDTAQNLGDANHFGNGLVRAVDAINGT。

实施例5

BspE04637的蛋白酶活性

通过测量二甲基酪蛋白(DMC)底物的水解来测试BspE04637蛋白酶(SEQ ID NO:9)的蛋白酶活性。用于DMC测定的试剂溶液是：在100mM碳酸钠(pH 9.5)中的2.5％DMC(西格玛公司(Sigma))、在试剂A中的0.075％TNBSA(2,4,6-三硝基苯磺酸，赛默科技公司(ThermoScientific))。试剂A：在15mL 4N NaOH中的45.4g Na₂B₄O₇.10H₂O(默克公司(Merck))在MQ水中达到1000mL的终体积，稀释溶液：10mM NaCl、0.1mM CaCl₂和0.005％吐温(Tween)-80。将蛋白酶上清液在稀释溶液中稀释至对于测定而言适当的浓度。向96孔微量滴定板(MTP)装填95μl DMC底物，随后添加5μl稀释的蛋白酶上清液。然后添加100μL在试剂A中的TNBSA，缓慢混合。使用SpectraMax板读数器以动力学方式在室温下经5min在405nm下测量活性。从值中减去不含蛋白酶的空白的吸光度。活性表达为mOD/min。BspE04637的蛋白酶活性曲线显示于图2中。使用DMC测定，发现BspE04637蛋白酶的比活性为32mOD/min/ppm。在相同的测定条件下，发现GG36和BPN’蛋白酶的比活性分别为54和23mOD/min/ppm。

实施例6

BspE04637蛋白酶的pH曲线

在含有50mM CaCl₂的50mM乙酸盐/Bis-Tris/HEPES/CHES缓冲液中，使用偶氮酪蛋白作为底物研究BspE04637蛋白酶(SEQ ID NO:9)的蛋白水解活性的pH依赖性。在4至12之间的pH处，以1个pH单位增量测量活性。将一个普罗塔克森(Protaxyme)AK片剂(梅格泽姆公司(Megazyme)，爱尔兰)与1.9mL适当的缓冲液和磁体一起添加到玻璃测试管中，随后在装有磁力搅拌器的温度受控的水浴中在40℃下持续5min进行温和的水合作用。将新鲜制备的蛋白酶(在去离子水中稀释至对于测定而言适当的浓度)的100μL样品添加到预水合的底物中，并在40℃下持续10min进行反应。为了终止反应，添加10mL的2％w/v Tris缓冲液(pH12)，混合溶液，并将样品立即通过沃特曼(Whatman)1号过滤器过滤。收集上清液，并且测量上清液在590nm处的吸光度以定量反应的产物。减去来自仅有缓冲液的对照的吸光度，通过将在最佳pH处的活性定义为100％，将得到的值转化为相对活性百分率。在本测定的条件下，确定BspE04637在6-12的pH范围内维持≥50％的活性。

实施例7

BspE04637蛋白酶的温度曲线

在含有50mM CaCl₂的50mM乙酸盐/Bis-Tris/HEPES/CHES缓冲液(pH 10)中，使用偶氮酪蛋白作为底物研究BspE04637蛋白酶(SEQ ID NO:9)的蛋白水解活性的温度依赖性。在30℃和80℃之间的温度下以10℃增量测量活性。将一个普罗塔克森(Protaxyme)AK片剂(梅格泽姆公司(Megazyme)，爱尔兰)与1.9mL适当的缓冲液和磁体搅拌器一起添加到玻璃测试管中，随后在装有磁力搅拌器的温度受控的水浴中在设定温度下持续5min进行温和的水合作用。将新鲜制备的蛋白酶(在去离子水中稀释至对于测定而言适当的浓度)的100μl样品添加到预水合的底物中，并在30℃和80℃之间的温度下持续10min进行反应。为了终止反应，添加10mL的2％w/v Tris缓冲液(pH 12)且混合溶液，并且立即通过沃特曼(Whatman)1号过滤器过滤。收集上清液，并且测量上清液在590nm处的吸光度以定量反应的产物。从每个样品读数中减去来自仅有缓冲液的对照的吸光度，通过将在最佳温度下的活性定义为100％，将得到的值转化为相对活性百分率。在本测定条件下，确定BspE04637在60℃-80℃的范围内保持≥50％的活性。

实施例8

蛋白酶的稳定性评估

在各种条件下确定BspE04637(SEQ ID NO:9)和FNA(SEQ ID NO:10)蛋白酶的稳定性。

SEQ ID NO:10列出了FNA蛋白酶的序列：AQSVPYGVSQIKAPALHSQGYTGSNVKVAVIDSGIDSSHPDLKVAGGASMVPSETNPFQDNNSHGTHVAGTVAALNNSIGVLGVAPSASLYAVKVLGADGSGQYSWIINGIEWAIANNMDVINMSLGGPSGSAALKAAVDKAVASGVVVVAAAGNEGTSGSSSTVGYPGKYPSVIAVGAVDSSNQRASFSSVGPELDVMAPGVSIQSTLPGNKYGALNGTSMASPHVAGAAALILSKHPNWTNTQVRSSLENTTTKLGDSFYYGKGLINVQAAAQ。

在设置温度下孵育后通过测量残留的蛋白水解活性，在以下显示的四个胁迫条件下测试稳定性。

LAS/EDTA：0.02％LAS，2.1mM EDTA在50mM HEPES(pH 8)中，0.005％吐温80

OMO HDL：10％OMO克莱因(Klein)与克拉克蒂格(Krachtig)(洗涤剂中存在的蛋白酶在使用前灭活)

对于胁迫条件，将稀释的酶样品在96孔PCR板中的胁迫缓冲液/洗涤剂中混合，并使用Tetrad2热循环仪，在30℃、40℃、50℃、60℃和75℃下孵育20min。对于非胁迫条件，在与胁迫培养基混合后立即测定酶以建立基线(初始活性)。在胁迫和非胁迫条件下的蛋白酶活性通过先前描述的AAPF-pNA或DMC底物测定的水解来测量。百分比残留活性是通过取每个温度下的胁迫与非胁迫活性的比例并将其乘以100来计算的。对于在各种温度下运行的每种条件，每种蛋白酶的百分比剩余活性显示于表1-2中。

实施例9

BspE04637蛋白酶与相关分子的比较

鉴定同源蛋白酶

针对NCBI非冗余蛋白质数据库，使用BspE04637蛋白酶(SEQ ID NO:9)和SWT183_1430046蛋白酶(SEQ ID NO:6)的成熟蛋白质氨基酸序列通过BLAST搜索(阿特休尔(Altschul)等人，核酸研究(Nucleic Acids Res)，25：3389-402，1997)鉴定相关蛋白质，并且子集分别显示于表3A和4A中。针对基因组查询专利(Genome Quest Patent)数据库，使用BspE04637蛋白酶(SEQ ID NO:9)和SWT183_1430046蛋白酶(SEQ ID NO:6)的成熟蛋白质氨基酸序列作为查询序列，将搜索参数设置为默认值进行类似的搜索，并且子集分别显示于表3B和4B中。将两个搜索集的百分比同一性(PID)定义为相同残基的数量除以成对比对中经比对残基的数量。表上标有“序列长度”的值对应于以所列出的登录号提及的蛋白质的长度(以氨基酸计)，而“比对长度”是针对用于比对和PID计算的序列。

同源序列的比对

成熟BspE04637蛋白酶(SEQ ID NO:9)和成熟SWT183_1430046蛋白酶(SEQ ID NO:6)的氨基酸序列与来自表3A和4A的所选枯草杆菌蛋白酶的成熟形式的序列的比对显示于图3中。使用来自Geneious软件(生物物质有限公司(Biomatters Ltd.))(罗伯特(Robert)C.埃德加(Edgar)，MUSCLE：具有高精确度和高通量的多序列比对(MUSCLE:Multi sequencealignment with high accuracy and high throughput)，核酸研究(Nucleic AcidsRes.)(2004)32(5)：1792-1797)的MUSCLE程序使用默认参数来比对这些序列。

使用Geneious树构建程序构建了图5中枯草杆菌蛋白酶的成熟形式的氨基酸序列的***发生树，并且在图3中列出。

实施例10

枯草杆菌蛋白酶的BspE04637进化枝的独特特征

针对枯草杆菌蛋白酶的BspE04637进化枝内的独特序列相似性，对图3的比对进行了综述。枯草杆菌蛋白酶的BspE04637进化枝的特征在于根据BspE04637编号以丝氨酸蛋白酶三联体的催化性天冬氨酸(D32)开始并且以催化三联体的催化性组氨酸(H66)结束的序列的共有基序。当与BPN'的氨基酸序列相比时，该基序包括2个氨基酸残基的一个***。该基序可以由以下基序进行表征：基序1：DTGIXXXHXDLXXXGGXSVFXXXXXXXXXXDXXGH(SEQ IDNO:31)，其中初始D是活性位点天冬氨酸，末端H是活性位点组氨酸，并且X是任何氨基酸；基序2：DTGIXXXHXDLXXXGGXSVFXXXXXXDPXXDXXGH(SEQ ID NO:32)，其中初始D是活性位点天冬氨酸，末端H是活性位点组氨酸，并且X是任何氨基酸；基序3：DTGIXXXHXDLNVXGGXSVFXXXXXXXXXXDXXGH(SEQ ID NO:33)，其中初始D是活性位点天冬氨酸，末端H是活性位点组氨酸，并且X是任何氨基酸；基序4：DTGIXXXHXDLNVXGGXSVFXXXXXXDPXX DXXGH(SEQ ID NO:34)，其中初始D是活性位点天冬氨酸，末端H是活性位点组氨酸，并且X是任何氨基酸；基序5：DTGIDXXHXDLNVX GGXSVFXX XXXXXXXXDXXGH(SEQ ID NO:35)，其中初始D是活性位点天冬氨酸且末端H是活性位点组氨酸，并且X是任何氨基酸；基序6：DTGIDXNHX DLNVRGGXSVFTXXXXXDPXXDXXGH(SEQ ID NO:36)，其中初始D是活性位点天冬氨酸，末端H是活性位点组氨酸，并且X是任何氨基酸；或基序7：DTGIDXNHXDLNVRGGXSVFTXXXXXDPYYDXXGH(SEQ ID NO:37)，其中初始D是活性位点天冬氨酸且末端H是活性位点组氨酸，并且X是任何氨基酸。图3包括围绕基序的框。

预期***发生在枯草杆菌蛋白酶的总体三级折叠共同的环中。使用枯草杆菌蛋白酶BPN'的已知结构作为参考，在图5中示出了***的位置。使用BPN'枯草杆菌蛋白酶结构作为参照(浅灰色)，以黑色突出显示基序区段。所有丝氨酸蛋白酶共有的催化三联体的催化性天冬氨酸和组氨酸残基侧链显示为棒。连接枯草杆菌蛋白酶催化三联体的催化性天冬氨酸(D32)和组氨酸(H66)(基于BspE04637编号)的片段包含两个环和中央β片层的最外链。该链包含BspE04637进化枝基序的GGXS部分，并在图5中由箭头指示。提出***发生在由箭头指示的环中，其中***放大的第二环。含有***的环在GGXS链后并引入催化性组氨酸。

基于上文列出的共享序列基序已经被鉴定为枯草杆菌蛋白酶的BspE04637进化枝的BspE04637、SWT183_1430046、和BAD02409枯草杆菌蛋白酶也在使用各种细菌枯草杆菌蛋白酶构建的并在图4中列出的***发育树中聚集在一起。

虽然已经显示并在本文描述了本发明的优选实施例，仅通过举例的方式来提供这样的实施例对本领域技术人员将是显而易见的。在不偏离本发明的情况下，许多变化、改变和替换将是本领域的技术人员能想到的。应当理解，在实施本发明时可以采用本文所述的本发明的实施例的各种替代方案。以下权利要求旨在限定本发明的范围，并且在这些权利要求及其等同物的范围内的方法和结构涵盖在其中。

Claims

1.一种枯草杆菌蛋白酶的BspE04637进化枝，所述枯草杆菌蛋白酶的BspE04637进化枝包含含有一个或多个选自以下基序的枯草杆菌蛋白酶或重组多肽或其活性片段：

i.DTGIXXXHXDLXXXGGXSVFXXXXXXXXXXDXXGH(SEQ ID NO:31)基序，其中初始D是活性位点天冬氨酸，末端H是活性位点组氨酸，并且X是任何氨基酸；

ii.DTGIXXXHXDLXXXGGXSVFXXXXXXDPXXDXXGH(SEQ ID NO:32)基序，其中初始D是活性位点天冬氨酸，末端H是活性位点组氨酸，并且X是任何氨基酸；

iii.DTGIXXXHXDLNVXGGXSVFXXXXXXXXXXDXXGH(SEQ ID NO:33)基序，其中初始D是活性位点天冬氨酸，末端H是活性位点组氨酸，并且X是任何氨基酸；

iv.DTGIXXXHXDLNVXGGXSVFXXXXXXDPXXDXXGH(SEQ ID NO:34)基序，其中初始D是活性位点天冬氨酸，末端H是活性位点组氨酸，并且X是任何氨基酸；

v.DTGIDXXHXDLNVXGGXS VFXXXXXXXXXXDXXGH(SEQ ID NO:35)基序，其中初始D是活性位点天冬氨酸且末端H是活性位点组氨酸，并且X是任何氨基酸；

vi.DTGIDXNHXDL NVRGGXSVFTXXXXX DPXXDXXGH(SEQ ID NO:36)基序，其中初始D是活性位点天冬氨酸，末端H是活性位点组氨酸，并且X是任何氨基酸；以及

vii.DTGIDXNHXDLNVRGGXSVFTXXXXX DPYYDXXGH(SEQ ID NO:37)基序，其中初始D是活性位点天冬氨酸且末端H是活性位点组氨酸，并且X是任何氨基酸。

2.根据权利要求1所述的枯草杆菌蛋白酶的BspE04637进化枝，其中所述枯草杆菌蛋白酶或重组多肽或其活性片段进一步包含与选自由SEQ ID NO:3、6和9组成的组的氨基酸序列具有至少70％氨基酸序列同一性的氨基酸序列。

3.根据权利要求1或2所述的枯草杆菌蛋白酶的BspE04637进化枝，条件是所述枯草杆菌蛋白酶和/或重组多肽或其活性片段不包含BAD02409或JP2003325186-0001。

4.如上述权利要求中任一项所述的枯草杆菌蛋白酶的BspE04637进化枝，其中所述枯草杆菌蛋白酶和/或重组多肽或活性片段具有蛋白酶活性。

5.一种重组多肽或其活性片段，包含与选自由SEQ ID NO:3、6和9组成的组的氨基酸序列具有至少80％氨基酸序列同一性的氨基酸序列。

6.BspE04637进化枝的一种重组多肽或其活性片段。

7.权利要求6所述的重组多肽或其活性片段，其中所述重组多肽或活性片段包含一个或多个选自以下的基序：

v.DTGIDXXHXDLNVXGGXSVFXXXXXXXXXXDXXGH(SEQ ID NO:35)基序，其中初始D是活性位点天冬氨酸且末端H是活性位点组氨酸，并且X是任何氨基酸；

vi.DTGIDXNHXDL NVRGGXSVFTXXXXXDPXXDXXGH(SEQ ID NO:36)基序，其中初始D是活性位点天冬氨酸，末端H是活性位点组氨酸，并且X是任何氨基酸；以及

vii.DTGIDXNHXDLNVRGGXSVFTXXXXXDPYYDXXGH(SEQ ID NO:37)基序，其中初始D是活性位点天冬氨酸且末端H是活性位点组氨酸，并且X是任何氨基酸。

8.权利要求6或7所述的重组多肽或其活性片段，其中所述重组多肽或其活性片段进一步包含与选自由SEQ ID NO:3、6和9组成的组的氨基酸序列具有至少70％氨基酸序列同一性的氨基酸序列。

9.权利要求5-8中任一项所述的重组多肽或其活性片段，条件是所述枯草杆菌蛋白酶和/或重组多肽或其活性片段不包含BAD02409或JP2003325186-0001。

10.权利要求5-9中任一项所述的重组多肽或其活性片段，其中所述多肽具有蛋白酶活性。

11.权利要求10所述的重组多肽或其活性片段，其中所述蛋白酶活性包括酪蛋白水解活性或二甲基酪蛋白水解活性。

12.权利要求5-11中任一项所述的重组多肽或其活性片段，其中所述多肽在6至12的pH范围内和/或在55℃至80℃的温度范围内保留其最大蛋白酶活性的至少50％。

13.权利要求5-12中任一项所述的重组多肽或其活性片段，其中所述多肽在胁迫条件下在50℃ 20分钟后保留至少60％的活性。

14.权利要求13所述的重组多肽或其活性片段，其中所述胁迫条件是在LAS/EDTA或OMOHDL测定中。

15.权利要求5-14中任一项所述的重组多肽或其活性片段，其中所述多肽在洗涤剂组合物中具有清洁活性。

16.权利要求15所述的重组多肽或其活性片段，其中所述洗涤剂组合物是自动餐具洗涤剂和/或所述清洁活性包括蛋黄底物的水解。

17.权利要求15所述的重组多肽或其活性片段，其中所述洗涤剂组合物是衣物洗涤剂和/或所述清洁活性包括选自以下的底物的水解：血液、奶、墨汁及其组合。

18.权利要求17所述的重组多肽或其活性片段，其中所述衣物洗涤剂是液体衣物洗涤剂或粉末衣物洗涤剂。

19.一种组合物，包含表面活性剂和权利要求1-4中任一项所述的枯草杆菌蛋白酶或重组多肽或其活性片段或权利要求5-18中任一项所述的重组多肽或其活性片段。

20.权利要求19所述的组合物，其中所述表面活性剂选自：阴离子表面活性剂、阳离子表面活性剂、兼性离子表面活性剂、两性表面活性剂、半极性非离子表面活性剂及其组合。

21.权利要求19或20所述的组合物，其中所述组合物是洗涤剂组合物。

22.权利要求21所述的组合物，其中所述洗涤剂组合物选自：衣物洗涤剂、织物软化洗涤剂、餐具洗涤剂和硬表面清洁洗涤剂。

23.权利要求19-22中任一项所述的组合物，其中所述组合物进一步包含至少一种钙离子和/或锌离子；至少一种稳定剂；从约0.001％至约1.0重量％的所述重组多肽；至少一种漂白剂；至少一种辅助成分；和/或一种或多种选自以下的另外的酶或酶衍生物：酰基转移酶、α-淀粉酶、β-淀粉酶、α-半乳糖苷酶、***糖苷酶、芳基酯酶、β-半乳糖苷酶、角叉菜胶酶、过氧化氢酶、纤维二糖水解酶、纤维素酶、软骨素酶、角质酶、内切β-1,4-葡聚糖酶、内切β-甘露聚糖酶、酯酶、外切甘露聚糖酶、半乳聚糖酶、葡糖淀粉酶、半纤维素酶、透明质酸酶、角蛋白酶、漆酶、乳糖酶、木质素酶、脂肪酶、脂肪氧合酶、甘露聚糖酶、氧化酶、果胶裂解酶、果胶乙酰酯酶、果胶酶、戊聚糖酶、过氧化物酶、酚氧化酶、磷酸酶、磷脂酶、植酸酶、聚半乳糖醛酸酶、蛋白酶、支链淀粉酶、还原酶、鼠李糖半乳糖醛酸酶、β-葡聚糖酶、鞣酸酶、转谷氨酰胺酶、木聚糖乙酰酯酶、木聚糖酶、木葡聚糖酶、木糖苷酶、金属蛋白酶、另外的丝氨酸蛋白酶及其组合。

24.权利要求19-23中任一项所述的组合物，其中所述组合物包含磷酸盐或不含磷酸盐和/或包含硼酸盐或不含硼酸盐。

25.权利要求19-24中任一项所述的组合物，其中所述组合物是颗粒、粉末、固体、棒状、液体、片剂、凝胶、糊状或单位剂量组合物。

26.权利要求19-25中任一项所述的组合物，其中所述组合物在从约8至约12的pH处配制。

27.一种清洁方法，所述方法包括将需要清洁的表面或物品与权利要求1-4中任一项所述的枯草杆菌蛋白酶或重组多肽或其活性片段；权利要求5-18中任一项所述的重组多肽或其活性片段；或权利要求19-26中任一项所述的组合物接触；和任选地进一步包括在所述表面或物品与所述重组多肽或组合物接触之后漂洗所述表面或物品的步骤。

28.权利要求27所述的方法，其中所述物品是餐具或织物。

29.一种多核苷酸，其包含对以下进行编码的核酸序列：权利要求1-4中任一项所述的枯草杆菌蛋白酶或重组多肽或其活性片段；或权利要求5-18中任一项所述的重组多肽或其活性片段。

30.权利要求29所述的多核苷酸，其中所述多核苷酸包含与SEQ ID NO:1、4或7具有至少70％核酸同一性的核酸序列。

31.一种包含权利要求29或30所述的多核苷酸的表达载体。

32.一种包含权利要求31所述的载体的宿主细胞。

33.权利要求32所述的宿主细胞，其中所述宿主细胞是选自以下的物种：芽孢杆菌属的物种(Bacillus spp.)、链霉菌属的物种(Streptomyces spp.)、埃希氏菌属的物种(Escherichia spp.)、曲霉属的物种(Aspergillus spp.)、木霉属的物种(Trichodermaspp.)、假单胞菌属的物种(Pseudomonas spp.)、棒状杆菌属的物种(Corynebacteriumspp.)、酵母属的物种(Saccharomyces spp.)和毕赤酵母属的物种(Pichia spp.)。

34.权利要求33所述的宿主细胞，其中所述芽孢杆菌属的物种是枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)。

35.用于生产权利要求1-4中任一项所述的枯草杆菌蛋白酶或重组多肽或其活性片段；或权利要求5-18中任一项所述的重组多肽或其活性片段的方法，所述方法包括：

(a)用权利要求31所述的表达载体稳定地转化权利要求32-34中任一项所述的宿主细胞；

(b)在适合于所述宿主细胞的条件下培养所述转化的宿主细胞以生产所述枯草杆菌蛋白酶或多肽；和

(c)回收所述枯草杆菌蛋白酶或多肽。

36.权利要求35所述的方法，其中所述表达载体包含编码异源前肽的异源多核苷酸序列。

37.权利要求35或36所述的方法，其中所述表达载体包含异源启动子和编码异源信号肽的多核苷酸序列之一或两者。

38.一种组合物，包含权利要求1-4中任一项所述的枯草杆菌蛋白酶或重组多肽或其活性片段；或权利要求5-18中任一项所述的重组多肽或其活性片段，其中所述组合物是动物饲料，隐形眼镜清洁组合物，伤口清洁组合物或纺织品、皮革或羽毛加工组合物。