JP3330941B2 - ヘム・タンパク質の製造方法 - Google Patents

ヘム・タンパク質の製造方法

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Description

【発明の詳細な説明】 技術分野 本発明は、増加した収率においてヘム・タンパク質を
製造する方法に関する。
背景技術 バクテリア中の様々なヘム・タンパク質のクローニン
グ及び発現が、先に記載されている。このように、S.A.
Orlepp et al.,J.Biotechn.11,1989,pp.353−364は、大
腸菌（E.coli）におけるホースラディッシュ・ペルオキ
シダーゼＣの発現及び特徴について記載している。この
酵素は、不溶性凝集体として細胞内に発現されるので、
それは溶菌細胞から精製されなければならない。さら
に、その酵素は、活性形態において発現されず、そして
機能性となるためにはヘム及びCa2+の存在中で別々に折
り畳まれなければならない。同様に、A.T.Smith et a
l.,J.Biol.Chem.265（22）,1990,pp.13335−13343は、
大腸菌（E.coli）におけるホースラディッシュ・ペルオ
キシダーゼＣの発現について記載している。この組換え
酵素は、生来のホースラディッシュ・ペルオキシダーゼ
Ｃよりも低い活性をもち、そして（精製された活性酵素
の）２−３％の収率で生産される。S.Laprasert et a
l.,J.Bact.171（９）,1989,pp.4871−4875は、バチルス
・ステアロサーモフィルス（Bacillus stearothermophi
lus）からのペルオキシダーゼＡの大腸菌（E.coli）に
おけるクローニング及び発現にいついて報告している。
S.J.Hoffman et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 87,pp.85
21−8525は、大腸菌（E.coli）における機能性ヒト・ヘ
モグロビンの発現について記載している。Z.Wang et a
l.,J.Biotechn.13,1990,pp.131−144は、ストレプトミ
セス・リビダンス（Streptomyces lividans）における
ストレプトミセス・ビリドスポラス（Streptomyces vir
idosporus）からのリグニン・ペルオキシダーゼのクロ
ーニング及び発現について記載している。
酵母（Saccharomyces cerevisiae）におけるヒト・ヘ
モグロビンの発現は、M.Wagenbach et al,Bio/Technolo
gy ９,1991,pp.57−61により記載されている。酵母にお
いては、ヘモグロビンは、完全に組み立てられたヘム含
有テトラマーとして発現される。しかしながら、このタ
ンパク質は、酵母細胞から分泌されず、細胞形質空間内
に残り、そしてそれから精製されなけらばならない。
それ故、ヘム・タンパク質を生産するだけでなくその
細胞膜を通して活性形態においてそれを運び出すことが
できる糸状菌のような宿主生物を選択し、それにより精
製手順を簡略にすることが有利であろう。
近年、アスペルギルス・ニガー（Aspergillus nige
r）及びアスペルギルス・ニジュランス（Aspergillus n
idulans）を含む糸状菌の形質転換のための手順が開発
されてきた。US 4,885,249（Allelix）は、選択マーカ
ーをエンコードしている遺伝子を担持しているプラスミ
ドの導入により増幅されたアスペルギルス・ニガー（A.
niger）の形質転換のための一般的方法について記載し
ている。EP 215 594（Genencor）は、分泌を提供するた
めに異なるアスペルギルス（Aspergillus）タンパク質
のシグナル配列を使用したアスペルギルス・ニジュラス
（A.nidulans）における様々なタンパク質の発現及び分
泌について記載している。
これらの文献のいずれも、糸状菌内でのヘム・タンパ
ク質の製造の可能性について示していない。反対に、M.
Saloheimo et al.,Gene 85,1989,pp.343−351は、トリ
コデルマ・レエセイ（Trichoderma reesei）内のフレビ
ア・ラジアタ（Phlebia rediata）からのリニン・ペル
オキシダーゼのクローニング及び発現について記載して
いる。その著者は、リグニン・ペルオキシダーゼmRNAが
トリコデルマ・レエセイ（T.reesei）内で発現されるけ
れども、タンパク質は全く検出されることができなかっ
たと報告している。彼らは、これがヘムの非存在におけ
るタンパク質の不正確な折り畳み又はその翻訳を妨害す
る異なる構造のRNAを原因とするプロテアーゼによる細
胞内分解を帰することができるであろうと推測してい
る。
発明の要約 驚くべきことに、ヘム又はヘム・グループを含む他の
材料が、ヘム・タンパク質のアポタンパク質を過剰生産
する微生物を培養するための発酵培地に添加されたと
き、そのヘム・グループがそのタンパク質に結合し、そ
れによりそのアポタンパク質が活性化され、そしてタン
パク質分解性の分解に対してそれがより安定であるよう
なコンホメーションを獲得するということが発見され
た。ヘム・タンパク質の全体としての収率は、かなり増
加される。この方法において、宿主生物内での内発的な
ヘム合成であってヘム・タンパク質の発現においてしば
しばボトル−ネックであるものを克服することができ
る。
したがって、本発明は、増加した収率において細胞外
ヘム・タンパク質を製造するための方法であって、活性
な再結合ヘム・タンパク質の生産を許容する条件下でヘ
ム又はヘム含有材料を含む発酵培地中でヘム・アポタン
パク質生産微生物を培養し、そしてその培地から得られ
たヘム・タンパク質を回収することを含んで成る方法に
関する。
本文脈においては、用語“ヘム・タンパク質（heme p
rotein）”は、置換基としてヘムを含むタンパク質の群
の中のいずれかのメンバー（例えば、プロトポルフィリ
ンIX）を含むと意図される。用語“アポタンパク質（ap
oprotein）”は、置換基を欠いたヘム・タンパク質の形
態を示すと意図される。用語“細胞外ヘム・タンパク
質”は、バクテリア又は酵母内での生産により従来技術
において提供されたヘム・タンパク質とは異なり、ヘム
・タンパク質のアポタンパク質形態がその宿主細胞か
ら、それがその培地中へのヘム又はヘム含有材料の添加
により提供された置換ヘム基をもつ（ホロタンパク質
（holoprorein）に）再結合するような培養基中に、分
泌されるということを示すと理解される。
発明の詳細な開示 本発明の方法の好ましい態様においては、ヘム・タン
パク質生産微生物は、そのヘム・タンパク質をエンコー
ドしているDNAを含んで成る組換え発現ベクターにより
形質転換されたものである。
このDNA配列は、確立された標準的な方法、例えば、
S.L.Beaucage and M.H.Caruthers,Tetrahedron Letters
22,1981,pp.1859−1869により記載されたホスホアミジ
ット法、又はMatthes et al.,EMBO Journal ３,1984,p
p.801−805により記載された方法により合成的に調製さ
れることができる。このホスホアミジット法に従って、
オリゴヌクレオチドを、例えば、自動DNA合成装置内で
合成し、精製し、アニールし、連結し、そして好適なベ
クター内でクローン化する。
このDNA配列は、ゲノム又はcDNA起源であることもで
き、例えば、標準的な技術（Sambrook et al.,Molecula
r Cloning:A Laboratory Manual,2nd Ed.,Cold Spring
Harbor,1989を参照のこと。）に従って、ゲノム又はcDN
Aライブラリーを調製し、そして合成オリゴヌクレオチ
ド・プローブを使用したハイブリダイゼーションにより
そのヘム・タンパク質の全部又は一部をコーディングし
ているDNA配列をスクリーニングすることにより、得ら
れることもできる。この場合には、ヘム・タンパク質を
エンコードしているゲノム又はcDNA配列は、例えば、よ
く知られた手順に従って相同的組換えのための所望のア
ミノ酸配列をエンコードしている合成オリゴヌクレオチ
ドを使用した部位指定突然変異誘発により、アミノ酸置
換を導入することが望まれる部位に対応する部位におい
て修飾されることができる。
最終的に、このDNA配列は、（適切には）合成、ゲノ
ム又はcDNA起源の断片を連結することにより調製された
合成とゲノムの混合、合成とcDNAの混合又はゲノムとcD
NAの混合の起源の内にあることができ、その断片は標準
的な技術に従った完全なDNA配列の様々な部分に対応す
る。このDNA配列は、例えば、US 4,683,202又はR.K.Sai
ki et al.,Science 239,1988,pp.487−491中に記載され
ているような特異的プライマーを使用したポリメラーゼ
連鎖反応により調製されることもできる。
一旦構築されれば、ヘム・タンパク質をエンコードし
ているDNA配列は、組換え発現ベクター中に挿入され
る。これは、組換えDNA手順に便利に供されることがで
きるいずれのベクターであることができ、そしてベクタ
ーの選択は、しばしばそれが導入されるべき宿主細胞に
依存するであろう。したがって、ベクターは、自己複製
ベクター、すなわち染色体外存在物として存在するベク
ターであってその複製が染色体の複製から独立している
もの、例えば、プラスミドであることができる。あるい
は、そのベクターは、宿主細胞中に導入されるとき、宿
主細胞のゲノム内に組み込まれ、そしてそれが組み込ま
れた染色体と一緒に複製されるものであることができ
る。
ベクター内では、ヘム・タンパク質をエンコードして
いるDNA配列は好適なプロモーター及びターミネーター
配列に作用可能な状態で連結されなければならない。こ
のプロモーターは、選択された宿主細胞内で転写活性を
示すいずれかのDNA配列であることができ、そしてその
宿主細胞に同種又は異種のいずれかであるタンパク質を
エンコードしている遺伝子由来のものであることができ
る。宿主細胞が糸状菌であるとき、プロモーターは細胞
外又は細胞内タンパク質、例えば、アミラーゼ、グルコ
アミラーゼ、プロテアーゼ、リパーゼ、セルラーゼ又は
解糖酵素をエンコードシテイル遺伝子由来であることが
できる。好適なプロモーターの例は、アスペルギルス・
オリザエ（A.oryzae）TAKAアミラーゼ、リゾムコール・
メイヘイ（Rhizomucor meihei）アスパラギン・プロテ
イナーゼ、アスペルギルス・ニガー（A.niger）中性α
−アミラーゼ、アスペルギルス・ニガー（A.niger）酸
安定性α−アミラーゼ、アスペルギルス・ニガー（A.ni
ger）グルコアミラーゼ、リゾムコール、メイヘイ（Rhi
zomucor meihei）リパーゼ、アスペルギルス・オリザエ
（A.oryzae）アルカリ性プロテアーゼ又はアスペルギル
ス・オリザエ（A.oryzae）トリオース・リン酸イソメラ
ーゼをエンコードしている遺伝子由来のものである。タ
ーミネーター配列は、プロモーターと同じ源由来のもの
であることができる。
細胞外発現のために、ヘム・タンパク質をエンコード
しているDNA配列は、好ましくは、分泌タンパク質をコ
ードしている遺伝子から得ることができるシグナル配列
により先行される。したがって、このシグナル配列は、
便利には、アスペルギルス・オリザエTAKAアミラーゼ、
アスペルギルス・ニガー中性α−アミラーゼ、アスペル
ギルス・ニガー酸安定性α−アミラーゼ、アスペルギル
ス・ニガーグルコアミラーゼ、又はコプリナス・マクロ
リザス（Coprinus macrorhizus）又はコプリナス・シネ
レウス（Coprinus cinereus）のペルオキシダーゼをエ
ンコードしている遺伝子から得られることができる。
ヘム・タンパク質、プロモーター、ターミネーター及
び場合によりシグナル配列をコードしているDNA配列を
それぞれ連結するために、そしてそれらを好適なベクタ
ー内に挿入するために使用される手順は、当業者によく
知られている（例えば、Sambrook et al.,前記を参照の
こと。）。
組換え発現ベクターにより形質転換された微生物は、
そのヘム・タンパク質と同質（すなわち、その遺伝子が
それが起源として得られたところの生物に形質転換によ
り戻される）又は異質であることができる。それは、好
ましくは、菌、特に糸状菌、例えば、フィコミセート
（Phycomycetes）、ザイゴミセート（Zygomycetes）、
アスコミセート（Ascomycetes）、バシジオミセート（B
asidiomycetes）の群に属する菌又は不完全菌（fungi i
mparfecti）であってヒフォミセート（Hyphomycetes）
例えば、アスペルギルス（Aspergillus）、トリコデル
マ（Trichoderma）、ペニシリウム（Penicillium）、フ
サリウム（Fusarium）若しくはフミコーラ（Humicola）
の属を含むものである。
糸状菌宿主生物は、便利には、組換えタンパク質のた
めの宿主として先に使用されてきたもの、例えば、アス
ペルギルス種の株、例えば、アスペルギルス・ニガー、
アスペルギスル・ニジュランス又はアスペルギルス・オ
リザエであることができる。組換えタンパク質の生産に
おけるアスペルギルス・オリザエの使用は、例えば、EP
238 023中に広く記載されている。
本発明の方法により生産されたヘム・タンパク質は、
好ましくは、オキシドレダクターゼ、特にリグニン・ペ
ルオキシダーゼ又はMn−ペルオキシダーゼ、又はハロペ
ルオキシダーゼを含むペルオキシダーゼである。目下の
好ましい態様においては、ペルオキシダーゼをエンコー
ドしている配列は、コプリナス種、特にコプリナス・マ
クロリザス又はコプリナス・シネレウス、又はアルスロ
ミセス・ラモサス（Arthromyces ramosus）由来のもの
である。ヘム・タンパク質は、カタラーゼ、例えば、ア
スペルギルス・ニガー由来のカタラーゼであることもで
きる。
形質転換宿主細胞を培養するために使用される培地
は、問題の宿主生物を培養するのに好適ないずれかの慣
用の培地であることができる。ヘム・グループと分泌ア
ポタンパク質との再結合を得るために培地を添加される
ヘム又はヘム含有材料は、好適には、ヘミン（hemin）
又は好ましくはヘモグロビン又は赤血球細胞を添加する
ことにより供給されることができる。なぜならそのヘム
・グループが加熱の間に機能性を維持し、これらの物質
の中の１つを含む培地のオートクレーブを許容するから
である。それは、好適には、１−1000mg/lの、特に10−
100mg/lの量で存在することができる。ヘモグロビンが
培地に添加されるときは、それは、好適には、0.5−50g
/l、特に１−25g/lの量で存在することができる。赤血
球細胞が培地に添加されるときは、それらは、好適に
は、0.5−50g/l、特に１−25g/lの量で存在することが
できる。
発酵培地中の表面活性剤の存在がヘム・タンパク質の
増加した収率をもたらすことが発見され、最近、表面活
性剤がそのタンパク質を安定化する能力に帰せられた。
結果として、表面活性剤、例えば、Triton X−100、
（ポリオキシエチレン・ポリマー）、ポリエチレン・グ
リコール、又はGlanapon（脂肪酸の側鎖をもつポリエチ
レン・オキサイドのポリマー）を培地に、例えば、１−
100ml/lの量で添加することが好ましい。
本発明を以下の実施例中でさらに説明するが、これ
を、いかなる方法においても請求に係る発明の範囲を限
定するものと解釈してはならない。
実施例１ コプリナス・シネレウス（Coprinus cinereus）ペルオ
キシダーゼをエンコードしているcDNAのクローニング PCRによるプローブの構築 ペルオキシダーゼcDNA断片を、コプリナス・マクロリ
ザスのペルオキシダーゼのアミノ酸配列に基づいて構築
された特異的オリゴヌクレオチド・プライマー（R.K.Sa
iki et al.,Science 239,1988,pp.487−491）を使用し
てポリメラーゼ連鎖反応により調製した。PCRを製造者
の指示に従ってGene Ampキット及び装置（Perkin Elmer
Cetus,Norwalk,CT,USAから入手可能なもの）を使用し
て行った。但し、その反応を、（コプリナス・シネレウ
ス、IFO 8371から得られたmRNAから調製された）第一ス
トランドcDNAへの良好なハイブリダイゼーションを得る
ために最初の３サイクルの間28℃において、そしてその
後、30サイクルのPCRの間65℃において行った。
以下の特異的プライマーを、PCRのために使用した： “N"は、４の全てのヌクレオチドの混合を表す。
プライマーを以下のように組み合わせた:1と２、３と
４、５と７、６と７、１と４、１と７、及び３と７。PC
R断片を、このように、その５′末端におけるEcoR I部
位により、そしてその３′末端におけるBamH I部位によ
り延長した。予想されたサイズのバンドは１％アガロー
ス・ゲル上で分析された。そのバンドがペルオキシダー
ゼ特異的配列に一致することを確認するために、そのゲ
ルをサザン・ブロッティングに供し、そしてPCRプライ
マー３と４の間に位置する以下の配列： をもつオリゴヌクレオチド・プローブにハイブリダイズ
させた。このプローブは、約130塩基対、420塩基対、54
0塩基対及び240塩基対のバンドにハイブリダイズするこ
とが確認され、このように、観察されたDNAバンドがペ
ルオキシダーゼ配列に一致することを確認した。
様々なPCR反応からのDNAを、EcoR I及びBamH Iにより
消化し、そしてプラスミドpUC19（C.Yanisch−Perron e
t al.,Gene 33,1985,pp.103−119）中にクローン化し
た。正しいPCR断片を含むコロニーを先に特定したオリ
ゴヌクレオチド・プローブを使用したハイブリダイゼー
ションにより同定した。陽性コロニーからのDNAを、San
ger et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 74,1977,pp.5463
−5467により記載されている制限酵素マッピング及び部
分的DNA配列分析により分析した。プライマー１及び４
を使用して得られたコロニーの中の１つからの430塩基
対の断片を、以下に記載するようなコプリナス・シネレ
ウスのcDNAライブラリーをスクリーンするために使用し
た。
大腸菌（E.coli）内でのコプロナス・シネレウスcDNAラ
イブラリーの構築 全RNAを、Boel et al.（EMBO J.,３:1097−1102,198
4）及びChirgwin et al.（Biochemistry（Wash），18:5
294−5299,1979）により記載された方法によるペルオキ
シダーゼの最大活性のための時間において採取された均
質化されたコプリナス・シネレウス（IFO 8371）菌糸体
から抽出された。ポリ（Ａ）含有RNAは、Aviv and Lede
r（PNAS,USA 69:1408−1412,1972）により記載された
ようなオリゴ（dT）−セルロース上のアフィニティー・
クロマトグラフィーの２サイクルにより得られる。cDNA
は、製造者の指示に従ってInvitrogenからのcDNA合成キ
ットの手段により合成される。コプリナス・シネレウス
cDNAライブラリーからの約50,000の大腸菌（E.coli）組
換え体を、Whatman 540ペーパー・フィルターに移し
た。コロニーを溶菌し、そしてGergen et al.（Nucleic
Acids Res.７,2115−2135,1979）により記載されたよ
うに固定化した。このフィルターを、0.2 x SSC,0.1％S
DS中の32P−標識の430塩基対ペルオキシダーゼ特異的プ
ローブとハイブリダイズさせた。このフィルターのハイ
ブリダイゼーション及び洗浄を、65℃において行い、そ
の後増感スクリーンにより24時間のオートラジオグラフ
ィーを行った。オートラジオグラフィー後、そのフィル
ターを増加した温度において洗浄し、その後増感スクリ
ーンにより24時間のオートラジオグラフィーを行った。
この方法において、50以上の陽性コロニーを同定した。
ミニ調製プラスミドDNAを、標準的な手順（Birnboim an
d Doly Nucleic Acids Res.７,1513−1523,1979）によ
りハイブリダイジング・コロニーから単離し、そしてcD
NA挿入物のDNA配列をSangerのジデオキシ手順（Sanger
et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 74,1977,pp.5463−546
7）により測定した。ペルオキシダーゼcDNA断片をHind
III/Xho Iによる解裂によりベクターから切除し、そし
て連結反応の準備をした。cDNA断片をHind III/Xho I消
化pHD414に連結し、そのcDNAがアスペルギルス・オリザ
エからのTAKAプロモーター及びアスペルギルス・ニガー
からのANGターミネーターの転写制御下にあるところのp
Cipを作った。
アスペルギルス発現ベクターpHD414の構築 ベクターpHD414は、（EP 238 023中に記載された）プ
ラスミドp775の誘導体である。p775に反して、pHD414
は、そのプロモーターとターミネーターとの間にユニー
ク制限部位のストリングをもつ。
このプラスミドをそのターミネーターの3'末端におい
て（不所望の制限部位を含む）約200塩基対の長い断片
を除去し、そして次にそのプロモーターの5'末端におい
て、これもまた不所望の制限部位を含む約250塩基対の
長い断片を除去することにより構築した。この200塩基
対の領域は、（pUCベクター中にある）Nar I及び（その
ターミネーターのちょうど3'にある）Xba Iによる解裂
によりp775から除去し、次に生じた末端をクレノウDNA
ポリメラーゼ＋dNTPによりフィル・インし、ゲル上でそ
のベクター断片を精製し、そしてそのベクター断片を複
製した。このDNAを先に記載したように大腸菌（E.col
i）MC1061中に形質転換した。10クローン（pHD413−１
〜−10）を選択し、制限酵素分析により分析した。その
制限酵素分析において予想されたバンドのパターンを示
すコロニーの中の１つを、pHD414の構築において使用し
た。
pHD413を（そのプロモーターの5'末端内にある）Stu
I及び（そのpUCベクター内にある）Pvu IIにより切断
し、そしてゲル上で分画した。このベクター断片を精製
し、再連結し、そして大腸菌（E.coli）MC1061中に形質
転換した。12コロニーを選択し、そして制限酵素分析に
より分析した。12コロニーのすべてが予想されたバンド
のパターンを示した。プラスミドpHD414を図１中に示
す。
アスペルギリス・オリザエ又はアスペルギルス・ニガー
の形質転換（一般的な手順） 100mlのYPD培地（Sherman et al.,Methods in Yeast
Genetics,Cold Spring Harbor Laboratory,1981）に、
アスペルギルス・オリザエ又はアスペルギルス・ニガー
の胞子を接種し、そして約２日間37℃において振とうし
ながらインキュベートした。この菌糸体をミラクロス
（miracloth）を通しての濾過により収穫し、そして200
mlの0.6M MgSO4により洗浄した。この菌糸体を15mlの1.
2M MgSO4,10mM NaH2PO4,pH＝5.8中に懸濁させた。懸濁
液を氷上で冷却し、そして120mgのNovozym 234,バッチ
1687を含む1mlのバッファーを添加した。５分後、1mlの
12mg/ml BSA（sigma type H25）を添加し、穏やかな攪
拌を伴ったインキュベーションを、多数のプロトプラス
トが顕微鏡下で検査されるサンプル中に見えるようにな
るまで37℃において1.5−2.5時間続けた。
懸濁液をミラクロスを通して濾過し、その濾液を滅菌
チューブに移し、そして5mlの0.6Mソルビトール、100mM
Tris−HCl,pH＝7.0により重層した。遠心分離を100gに
おいて15分間行い、そしてプロトプラストをこのMgSO4
クッションの上から回収した。２容量のSTC（1.2Mソル
ビトール、10mM Tris−HCl,pH＝7.5、10mM CaCl2）をこ
のプロトプラスト懸濁液に加え、そしてその混合物を10
00 x gにおいて５分間遠心分離した。このプロトプラス
ト・ペレットを、3mlのSTC中に再懸濁した。この手順を
繰り返した。最後に、このプロトプラストを0.2−1mlの
STC中に再懸濁した。
100μｌのプロトプラスト懸濁液を５−25μｇの適当
なDNAと10μｌのSTC中で混合した。argB株からのプロト
プラストをpSal43 DNA（アスペルギルス・ニジュラス
（A.nidulans）argB遺伝子担持プラスミド）と混合し、
そしてargB+株からのロトプラストをp3SR2（アスペルギ
ルス・ニジュランス（A.nidulans）amds遺伝子担持プラ
スミド）と混合した。この混合物を室温において25分間
放置した。0.2mlの60％PEG 4000（BDH 29576）、10mM C
aCl2及び10mM Tris−HCl,pH＝7.5を添加し、そして注意
して（２回）混合し、そして最後に0.85mlの同一溶液を
添加し、そして注意して混合した。この混合物を室温に
おいて25分間放置し、そしてそのペレットを2mlの1.2M
ソルビトール中に再懸濁した。他の沈降後、プロトプラ
ストを適当なプレート上に広げた。pSal43により形質転
換されたargB株からのプロトプラストを、それぞれ炭素
及び窒素源としてグルコース及び尿素を含み、そして浸
透圧の安定化のための1.2Mソルビトールを含む最小プレ
ート（Cove Biochem.Biophys.Acta 113（1966）51−5
6）上に広げた。p3SR2により形質転換されたargB−株か
らのプロトプラストを、1.0Mシュクロース,pH＝7.0、窒
素源としての10mMアセトアミド及び背景増殖を阻害する
ための20mM CsClを含む最小プレート（Cove Biochem.Bi
ophys.Acta 113（1966）51−56）上に広げた。37℃に
おいて４−７日間のインキュベーション後、胞子を拾い
上げ、無菌水中に懸濁し、そして第二単離の後の単一コ
ロニーの胞子を所定の形質転換体として保存した。
実施例２ ヘミンを含む発酵培地中のアスペルギルス・オリザエ株
における組換え体コプリナス・シネレウスのペルオキシ
ダーゼの生産 pCipを、先に記載したようなアスペルギルス・ニジュ
ランスからのamdS遺伝子を含むp3SR2とpCip及びp3SR2の
等量混合物（それぞれ約５μｇ）との同時形質転換によ
りアスペルギルス・オリザエA1560（IFO 4177）中に形
質転換した。それらの全窒素源としてのアセトアミドを
使用することができる形質転換細胞を２回再単離した。
以下の組成： 酵母エキス 1 g/l 琥珀酸 10 g/l MgCl2・6H2O 0.82g/l KCl 1.83g/l NaH2PO4・2H2O 1.01g/l NaSO4 1.8 g/l 尿素 2 g/l クエン酸 2 g/l 微量金属溶液 0.5 ml/l Pluronic 0.1 ml/l 水 1000mlまで pHをNaOHにより6.00に調整する をもつ50ml ASP03培地を含む300mlプロピレン振とうフ
ラスコであって121℃において60分間コートクレーブに
かけ、その後0.01M NaOH中に溶解し、そして0.2μｍ膜
を通してそのフラスコ中に無菌濾過した（pH12）20g/l
のマルトデキストリン及び変動量のヘミン（Sigma H−2
250）を添加したものを、アスペルギルス・オリザエ形
質転換体の1mlの胞子懸濁液（約106胞子/ml）により接
種し、そして300rpmにおいて72時間34℃においてインキ
ュベートした。
結果を以下の表中に示す。ペルオキシダーゼ活性をPO
DU/mlにおいて測定した。（1PODU（ペルオキシダーゼ・
ユニット））は、2,2'−アジノbis［３−エチルベンゾ
チアゾリン−６−スルホネート］が25℃の温度において
1mM H2O2の存在中で酸化されるところの系において１分
間当たり１μモルのH2O2の変換を触媒する酵素の量とし
て定義される。
上記の表から明らかなように、培養基へのヘミンの添
加は、ペルオキシダーゼの収率をかなり増加させる。
実施例３ ヘミン及び表面活性剤を含む発酵培地中のアスペルギル
ス・オリザエ株における組換え体コプリナス・シネレウ
スのペルオキシダーゼの生産 先に記載したように得られたアスペルギルス・オリザ
エ形質転換体を実施例２中に記載したように、オートク
レーブ前に表面活性剤として（Bussettiから入手可能
な）Glanapon DG 160を添加された培地中で培養した。
結果を以下の表に表す。
表から明らかなように、添加されたGlanaponは、ペル
オキシダーゼの収率に対してヘミンとの優れたシナジー
効果をもっている。
実施例４ ヘミン、ヘモグロビン又は赤血球細胞を含む発酵培地中
のアスペルギルス・オリザエにおける組換え体コプリナ
ス・シネレウスのペルオキシダーゼの生産 先に記載したように得られたアスペルギルス・オリザ
エ形質転換体を、ヘミン、ヘモグロビン（Merck Art 43
00）又は赤血球細胞（スプレー・ドライ混合ブタ及びウ
シ赤血球細胞、食品グレード）を（オートクレーブの前
又は後に）添加された培地中で実施例２中に記載したよ
うに培養した。ヘモグロビン及び赤血球細胞をオートク
レーブ前にpH10.5（NaOH）において溶解し、そして滅菌
濾過した、結果を以下の表に表す。
表から明らかなように、ヘム基がグロビンに結合する
場合に、ヘム源がペルオキシダーゼの収率にかなりの増
加をもたらす。さらなる利点は、それらを非常に安価に
得ることができるということ、及びそのヘム基が加熱滅
菌の間に破壊から保護されるということである。
実施例５ ヘモグロビンを含む発酵培地中の２リッター発酵槽内の
アスペルギルス・オリザエにおける組換え体コプリナス
・シネレウスのペルオキシダーゼの生産 先に記載したように得られたアスペルギルス・オリザ
エを以下のような供給バッチ工程において２リッター実
験室発酵槽内で発酵させた： タンク培地:NaSO4・7H2O ２ g/l KH2PO4 ２ g/l K2SO4 ３ g/l クエン酸 ４ g/l 微量金属 酵母エキス １ g/l Pluronic 0.2ml/l 供給培地：マルトース250 g/l 酵母エキス ７ g/l FeSO4・7H2O １ g/l 尿素 20 g/l Pluronic ２ ml/l 発酵条件:2.0l発酵槽 温度34℃ pH＝7.8 pO2＞20％（増加攪拌速度による） 通気:1VVM 供給特性:3g/lxh 0−24時間 6g/lxh 24−144時間 50mlの24時間後のASPO3振とうフラスコ培養
物により接種。
滅菌の間、pHを、タンク培地及び／又は供給培地（ヘ
モグロビンを供給する場合）にために10.5に増加させ
た。ヘモグロビンをpH10.5において40分間121℃におい
てオートクレーブにかけた。発酵前、pHを7.8に調整し
た。
結果を以下の表に示す。
表から明らかなように、ペルオキシダーゼの収率を、
発酵培地へのヘモグロビンの添加によりかなり増加させ
ることができる。ヘミンによる収率の増加と同程度のも
のを得ることはできなかった。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ Ｃ１２Ｒ 1:66） Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ (Ｃ１２Ｎ 15/09 ＺＮＡ Ｃ１２Ｒ 1:01） (58)調査した分野(Int.Cl.7，ＤＢ名) C12P 21/02 C12N 9/02 C12N 15/00 - 15/90 ＭＥＤＬＩＮＥ（ＳＴＮ)

Claims (20)

    (57)【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】増加した収量における細胞外ヘム・タンパ
    ク質の製造方法であって、アポ・タンパク質生産微生物
    をヘム又はヘム含有材料を含む発酵培地中で活性な再結
    合ヘム・タンパク質の生産を許容する条件下で培養し、
    そしてその培地から得られたヘム・タンパク質を回収す
    ることを含んで成る方法。
  2. 【請求項２】前記微生物がヘム・タンパク質をコードし
    ているDNA配列を含んで成る組換え発現ベクターにより
    形質転換されたものである、請求項１に記載の方法。
  3. 【請求項３】前記DNA配列が異種ヘム・タンパク質をコ
    ードしている、請求項２に記載の方法。
  4. 【請求項４】前記微生物が菌類（fungus）である、請求
    項１〜３のいずれかに記載の方法。
  5. 【請求項５】前記菌類が糸状菌である、請求項４に記載
    の方法。
  6. 【請求項６】前記糸状菌がアスペルギルス（Aspergillu
    s）属の微生物である、請求項５に記載の方法。
  7. 【請求項７】前記アスペルギルス（Aspergillus）属の
    微生物がアスペルギルス・オリザエ（Aspergillus oryz
    ae）又はアスペルギルス・ニガー（Aspergillus nige
    r）である、請求項６に記載の方法。
  8. 【請求項８】前記ヘム・タンパク質がオキシドレダクタ
    ーゼ又はカタラーゼである、請求項１〜７のいずれかに
    記載の方法。
  9. 【請求項９】前記オキシドレダクターゼがペルオキシダ
    ーゼ又はハロペルオキシダーゼである、請求項８に記載
    の方法。
  10. 【請求項１０】前記ペルオキシダーゼがコプリナス（Co
    prinus）属又はアルスロミセス（Arthromyces）属由来
    のものである、請求項９に記載の方法。
  11. 【請求項１１】前記コプリナス（Coprinus）属微生物が
    コプリナス・マクロリザス（Coprinus macrorhizus）又
    はコプリナス・シネレウス（Coprinus cinereus）であ
    り、前記アルスロミセス（Arthromyces）属微生物がア
    ルスロミセス・ラモサス（Arthromyces ramosus）であ
    る、請求項10に記載の方法。
  12. 【請求項１２】ヘム含量材料がヘモグロビン又は赤血球
    細胞である、請求項１〜11のいずれかに記載の方法。
  13. 【請求項１３】発酵培地が１〜1000mg/lの量でヘミンを
    含む、請求項１〜13のいずれか１項に記載の方法。
  14. 【請求項１４】発酵培地が10〜100mg/lの量でヘミンを
    含む、請求項13に記載の方法。
  15. 【請求項１５】発酵培地が0.5〜50g/lの量でヘモグロビ
    ンを含む、請求項12に記載の方法。
  16. 【請求項１６】発酵培地が１〜25g/lの量でヘモグロビ
    ンを含む、請求項15に記載の方法。
  17. 【請求項１７】発酵培地が0.5〜50g/lの量で赤血球細胞
    を含む、請求項12に記載の方法。
  18. 【請求項１８】発酵培地が１〜25g/lの量で赤血球細胞
    を含む、請求項17に記載の方法。
  19. 【請求項１９】発酵培地が表面活性剤をさらに含む、請
    求項１〜18のいずれかに記載の方法。
  20. 【請求項２０】発酵培地が１〜100ml/lの量で表面活性
    剤を含む、請求項19に記載の方法。
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