MX2015002212A

MX2015002212A - Composiciones detergentes que comprenden metaloproteasas.

Info

Publication number: MX2015002212A
Application number: MX2015002212A
Authority: MX
Inventors: Morten Gjermansen; Martin Simon Borchert; Peter Rahbek Oestergaard; Astrid Benie
Original assignee: Novozymes As
Priority date: 2012-08-22
Filing date: 2013-08-21
Publication date: 2015-05-08
Also published as: US20160145540A1; WO2014029820A1; EP2888358A1; BR112015003726A2; CN104603265A

Abstract

La presente invención se refiere a composiciones que comprenden polipéptidos aislados que tienen actividad proteasa y polinucleótidos que codifican los polipéptidos y a su uso. La invención también se refiere a composiciones de limpieza y al uso de los polipéptidos en procesos de limpieza.

Description

COMPOSICIONES DETERGENTES QUE COMPRENDEN METALOPROTEASAS CAMPO DE LA INVENCIÓN La presente invención se refiere a composiciones detergentes y/o de limpieza que comprenden metaloproteasas (E.C 3.4.24). La invención trata además sobre el uso de metaloproteasas en los procesos de limpieza tales como el lavado de la vajilla y de la ropa. Además, la invención trata sobre métodos para realizar la limpieza tales como el lavado de vajilla y de la ropa.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN Durante más de 30 años, la industria de los detergentes ha añadido diferentes enzimas a las formulaciones detergentes, las enzimas utilizadas más comúnmente incluyen proteasas, amilasas y lipasas, cada una adaptada a la eliminación de diferentes tipos de manchas. Además de las enzimas, las composiciones detergentes incluyen normalmente una combinación compleja de ingredientes. Por ejemplo, la mayoría de los productos de limpieza incluyen un sistema surfactante, agentes de decoloración o adyuvantes. A pesar de la complejidad de los detergentes actuales, sigue siendo necesario desarrollar composiciones detergentes nuevas que comprendan enzimas y/o mezclas de enzimas nuevas.

Las metaloproteasas son enzimas proteolíticas que necesitan de manera absoluta el ión metálico para su actividad.

REF.:254483 La mayoría de las metaloproteasas son dependientes de zinc, aunque algunas utilizan otros metales de transición. Las metaloproteasas se han utilizado ampliamente en diferentes industrias como la industria alimentaria y cervecera. Uno de los grupos de metaloproteasas mejor caracterizados es el de las termolisinas. Las termolisinas pertenecen a la familia M4 de metaloproteasas y se han utilizado, p. ej., en los procesos de síntesis de péptidos. Para este tipo de aplicaciones, las termolisinas necesitan ser activas a temperaturas elevadas y el énfasis se ha puesto en incrementar su rendimiento a temperaturas elevadas. En el documento WO 2004/011619 (Stratagene) se describen las variantes termoestables de la proteasa similar a la termolisina con una especificidad de escisión alterada. Otra metaloproteasa M4 es la metaloproteasa de Bacillus amyloliquefaciens, también conocida como Neutrase®, que se ha utilizado durante muchos años como un aditivo en diversos productos de piensos y alimentos y, p. ej., en la elaboración de cerveza. Esta metaloproteasa también se ha descrito para su uso en procesos y composiciones de limpieza y detergentes tal como se describe, p. ej., en el documento WO 2007/044993, uso de metaloproteasas estables en el almacenamiento o documento WO 2009/058518, y EP 1 288 282 (Unilever), que describe una mezcla de una metaloproteasa y una serín proteasa para su uso en el lavado de la vajilla. El uso de las metaloproteasas similares a la termolisina en detergentes también se describe en el documento W020099058303 (Danisco US INC.).

Sin embargo, el uso de metaloproteasas en la industria de los detergentes ha sido muy limitado y el énfasis se ha puesto en el uso de las metaloproteasas Neutrase® y/o "NprE" tal como se expone en el documento WO 2007/044993. Generalmente, las metaloproteasas son muy inestables en las condiciones de lavado convencionales y en las composiciones detergentes convencionales. Por lo tanto, el uso de metaloproteasas en los procesos de limpieza y lavado y en los detergentes ha sido limitado.

El interés creciente en mejorar los procesos de lavado con el fin de hacerlos más ecológicos ha dado como resultado una tendencia global a reducir la temperatura, pH y tiempo de lavado y a disminuir la cantidad de componentes del detergente, los cuales pueden influir negativamente en el medio ambiente. La presente invención trata sobre estos y otros objetivos importantes.

SUMARIO DE LA INVENCIÓN Un aspecto de la invención se refiere a una composición que comprende un polipéptido que tiene actividad proteasa, donde el polipéptido que tiene actividad proteasa se selecciona entre: a) un polipéptido que tiene una identidad secuencial de al menos un 70%, tal como una identidad de al menos un 75%, tal como una identidad de al menos un 80%, tal como una identidad secuencial de al menos un 85%, tal como una identidad de al menos un 90%, tal como una identidad de al menos un 95%, tal como una identidad de al menos un 97%, tal como una identidad de al menos un 98%, tal como una identidad de al menos un 99% respecto al polipéptido maduro de la SEQ ID NO: 2 o la SEQ ID NO:4; b) un polipéptido codificado por un polinucleótido que tiene una identidad secuencial de al menos un 70%, tal como una identidad de al menos un 75%, tal como una identidad de al menos un 80%, tal como una identidad secuencial de al menos un 85%, tal como una identidad de al menos un 90%, tal como una identidad de al menos un 95%, tal como una identidad de al menos un 97%, tal como una identidad de al menos un 98% y tal como una identidad de al menos un 99% respecto a la secuencia que codifica el polipéptido maduro de la SEQ ID NO: 1 o la SEQ ID NO:3; (c) una variante que comprende una sustitución, supresión y/o inserción de uno o más (varios) aminoácidos del polipéptido maduro de la SEQ ID NO: 2 o la SEQ ID NO:3; y (d) un fragmento de un polipéptido de (a), (b) o (c) que tiene actividad proteasa.

En un aspecto particular de la invención, la composición es una composición de limpieza tal como una composición detergente o un aditivo para detergentes. Además, la invención se refiere al uso de una composición de conformidad con la invención en uñ proceso de limpieza tal como el lavado de la ropa, la limpieza de superficies duras, lavado de la vajilla o lavado de la vajilla de forma automática.

Otro aspecto de la invención se refiere al uso de un polipéptido que tiene actividad proteasa en un proceso de limpieza, donde el polipéptido que tiene actividad proteasa se selecciona entre: a) un polipéptido que tiene una identidad secuencial de al menos un 70%, tal como una identidad de al menos un 75%, tal como una identidad de al menos un 80%, tal como una identidad secuencial de al menos un 85%, tal como una identidad de al menos un 90%, tal como una identidad de al menos un 95%, tal como una identidad de al menos un 97%, tal como una identidad de al menos un 98% y tal como una identidad de al menos un 99% respecto al polipéptido maduro de la SEQ ID NO: 2 o la SEQ ID N0:4; b) un polipéptido codificado por un polinucleótido que tiene una identidad secuencial de al menos un 70%, tal como una identidad de al menos un 75%, tal como una identidad de al menos un 80%, tal como una identidad secuencial de al menos un 85%, tal como una identidad de al menos un 90%, tal como una identidad de al menos un 95%, tal como una identidad de al menos un 97%, tal como una identidad de al menos un 98% y más preferentemente todavía una identidad de al menos un 99% respecto a la secuencia que codifica el polipéptido maduro de la SEQ ID NO: 1 o la SEQ ID NO:3; (c) una variante que comprende una sustitución, supresión y/o inserción de uno o más (varios) aminoácidos del polipéptido maduro de la SEQ ID NO: 2 o la SEQ ID NO:4; y (d) un fragmento de un polipéptido de (a), (b) o (c) que tiene actividad proteasa.

El polipéptido aislado de la invención es una metaloproteasa que pertenece al grupo M4 de metaloproteasas. Preferentemente, el polipéptido aislado se deriva de Exíguobacterium .

La presente invención se refiere al uso de metaloproteasas, en particular una metaloproteasa del tipo M4 tal como metaloproteasas que tienen una identidad secuencial de al menos un 70% respecto a la SEQ ID NO 2 o la SEQ ID NO 4 en procesos de limpieza tales como el lavado de la ropa y de la vajilla y, en particular, al uso a baja temperatura. La invención también se refiere a composiciones detergentes y composiciones de limpieza que comprenden metaloproteasas.

Un aspecto particular de la invención se refiere a un método de limpieza, comprendiendo elmétodo los siguientes pasos: poner en contacto una superficie con una metaloproteasa de conformidad con la invención.

Otro aspecto particular de la invención se refiere a una composición tal como una composición detergente que comprende una metaloproteasa y un surfactante.

Otro aspecto particular más de la invención se refiere a un método para eliminar una mancha de una superficie que comprende poner en contacto la superficie con una composición de conformidad con la invención.

BREVE DESCRIPCIÓN DEL LISTADO DE SECUENCIAS SEQ ID NO 1: es la secuencia de ADN de Exiguobacterium sibiricum.

SEQ ID NO:2 es la secuencia de aminoácidos tal como se deduce a partir de la SEQ ID NO: 1 (SWISSPROT: B1YFR1).

SEQ ID NO 3: es la secuencia de ADN de Exiguobacterium sp . ATlb .

SEQ ID NO:4 es la secuencia de aminoácidos tal como se deduce a partir de la SEQ ID NO: 3 (SWISSPROT: C4L1B3).

SEQ ID NO 5: ADN que codifica la metaloproteasa de Exiguobacterium sibiricum con un codón de utilización optimizado para la expresión en una cepa de Bacillus .

SEQ ID NO 6: ADN que codifica la metaloproteasa de Exiguobacterium sp. ATlb con un codón de utilización optimizado para la expresión en una cepa de Bacillus .

SEQ ID NO 7: Secuencia del cebador directo.

SEQ ID NO 8: Secuencia del cebador inverso.

SEQ ID NO 9: Polipéptido maduro de Exiguobacterium sibiricum SEQ ID NO 10: Polipéptido maduro de Exiguobacterium sp.

ATlb SEQ ID NO 11: Secuencias del N-terminal de Exiguobacterium sibiricum SEQ ID NO 12: Secuencia del N-terminal de Exiguobacterium sp. ATlb SEQ ID NO 13: Proteasa de Bacillus amyloliquefaciens Uniprot: P06832 (Neutrase®) SEQ ID NO 14: Proteasa de Bacillus clausii (Savinase®) DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN Definiciones Los "polipéptidos que tienen actividad proteasa", polipéptidos que tienen actividad proteasa, o proteasas, también se denominan a veces peptidasas, proteinasas, peptido-hidrolasas o enzimas proteolíticas. Las proteasas pueden ser del tipo exo, que hidrolizan péptidos empezando en cualquiera de sus extremos, o bien de tipo endo, que actúan internamente en las cadenas polipeptídicas (endopeptidasas). Las endopeptidasas presentan actividad en sustratos peptídicos bloqueados en los extremos N y C que son relevantes para la especificidad de la proteasa en cuestión.

El término "proteasa" se define en la presente como una enzima que hidroliza enlaces peptídicos. La presente invención proporciona el uso de polipéptidos con actividad proteasa en composiciones detergentes. También proporciona polinucleótidos que codifican los polipéptidos. Las proteasas de la invención son metaloproteasas de la familia M4 de MEOPS. Los polipéptidos de la presente invención tienen al menos un 20%, p. ej., al menos un 40%, al menos un 50%, al menos un 60%, al menos un 70%, al menos un 80%, al menos un 90%, al menos un 95%, al menos un 96%, al menos un 97%, al menos un 98%, al menos un 99% y al menos un 100% de la actividad proteasa del polipéptido maduro de la SEQ ID NO: 2 o la SEQ ID NO: 4.

La "actividad proteasa" se puede medir utilizando cualquier ensayo, en el que se emplee un sustrato, que incluya enlaces peptídicos relevantes para la especificidad de la proteasa en cuestión. El pH del ensayo y la temperatura del ensayo también se han de adaptar a la proteasa en cuestión. Algunos ejemplos de los valores del pH del ensayo son pH 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 o 12. Algunos ejemplos de las temperaturas de ensayo son 15, 20, 25, 30, 35, 37, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 80, 90, o 95°C. Algunos ejemplos de sustratos generales de proteasa son el colágeno, la caseína, la albúmina de suero bovino y la hemoglobina. En el método clásico de Anson y Mirsky, se utiliza hemoglobina desnaturalizada como sustrato y, después de la incubación del ensayo con la proteasa en cuestión, se determina la cantidad de hemoglobina soluble en ácido tricloroacético como una medición de la actividad proteasa (Anson, M.L. y Mirsky, A.E., 1932, J. Gen. Physiol . 16: 59 y Anson, M.L., 1938, J. Gen . Physiol . 22: 79).

A los efectos de la presente invención, la actividad proteasa se determinó utilizando los ensayos que se describen en "Materiales y métodos", tales como el ensayo de Protazyme OL.

El término "metaloproteasa" tal como se utiliza en la presente se refiere a una proteasa que tiene uno o más iones metálicos en el sitio activo/de unión.

La expresión "familia M4 de metaloproteasas " o "metaloproteasa M4" o "M4" tal como se emplea en la presente se refiere a un polipéptido comprendido en la familia M4 de metaloproteasas de conformidad con Rawlings et al., Biochem. J. , 290, 205-218 (1993) y tal como se describe adicionalmente en MEROPS - (Rawlings et al., MEROPS: the peptidase database, Nucí Acids Res, publicación de la base de datos 34, D270-272, 2006). Las metaloproteasas M4 son metaloproteasas neutras que contienen principalmente endopeptidasas. Todas las peptidasas de la familia se unen a un único ion de zinc catalítico. Los miembros de la familia M4 de metaloproteasas incluyen el motivo común HEXXH, donde los residuos de histidina actúan como ligandos de zinc y el glutamato es un residuo del sitio activo. Las metaloproteasas M4 tienen un pH óptimo principalmente a pH neutro. La familia M4 de metaloproteasas incluye, p. ej., Neutrase® (clasificada como la subclase de MEROPS M04.014), termolisina, bacilolisina, vibriolisina, pseudolisina, peptidasa Msp, cocolisina, aureolisina, vimelisina, peptidasa B neutra de la toxina lambda, peptidasa PA (de tipo Aeromonas) , griselisina, estearolisina, MprIII ( Alteromonas sp., cepa 0-7), peptidasa pap6, peptidasa neutra (tipo Thermoactinomyces) , peptidasa ZmpA ( Burkholderia sp.), peptidasa zpx, peptidasa PrtS ( Photorhabdus luminescens) , protealisina, peptidasa ZmpB ( Burkholderia sp.). La familia de polipéptidos M4 de metaloproteasas se ha caracterizado en mayor grado y en la actualidad incluye, según MEROPS, al menos veintidós subclases, para las cuales se ha asignado un ID MEROPS distintivo (es decir, un identificador de fórmula M04.xxx), así como también homólogos que no son peptidasas y peptidasas no asignadas.

La expresión "polipéptido aislado" tal como se emplea en la presente se refiere a un polipéptido que se aísla a partir de una fuente. En un aspecto, la variante o polipéptido presenta una pureza de al menos un 20%, más preferentemente una pureza de al menos un 40%, más preferentemente una pureza de al menos un 60%, aún más preferentemente una pureza de al menos un 80%, más preferentemente todavía una pureza de al menos un 90%, y de la manera más preferida una pureza de al menos un 95%, según se determina mediante SDS-PAGE.

La expresión "polipéptido sustancialmente puro" se refiere en la presente a un preparado polipeptídico que contiene como máximo un 10%, preferentemente como máximo un 8%, más preferentemente como máximo un 6%, más preferentemente como máximo un 5%, más preferentemente como máximo un 4%, más preferentemente como máximo un 3%, aún más preferentemente como máximo un 2%, más preferentemente todavía como máximo un 1% y de la manera más preferida como máximo un 0.5% en peso de otro material polipeptídico con el cual está asociado de manera natural o recombinante. Por lo tanto, se prefiere que el polipéptido sustancialmente puro presente una pureza de al menos un 92%, preferentemente una pureza de al menos un 94%, más preferentemente una pureza de al menos un 95%, más preferentemente una pureza de al menos un 96%, más preferentemente una pureza de al menos un 97%, más preferentemente una pureza al menos un 98%, aún más preferentemente una pureza de al menos un 99%, más preferentemente todavía una pureza de al menos un 99.5% y de la manera más preferida una pureza de un 100% en peso respecto al material polipeptídico total presente en el preparado. Los polipéptidos de la presente invención se encuentran preferentemente en una forma sustancialmente pura. Esto se puede conseguir, por ejemplo, preparando la variante o polipéptido mediante métodos recombinantes de uso común o mediante métodos de purificación clásicos.

La expresión "secuencia que codifica el polipéptido maduro" se refiere a un polinucleótido que codifica un polipéptido maduro que tiene actividad proteasa.

El grado de correlación entre dos secuencias de aminoácidos o entre dos secuencias de nucleótidos se describe mediante el parámetro "identidad secuencial". A los efectos de la presente invención, el grado de identidad entre dos secuencias de aminoácidos se determina utilizando el algoritmo de Needleman-Wunsch (Needleman y Wunsch, 1970, J. Mol . Biol . 48: 443-453) según se implementa en el programa Needle del paquete EMBOSS (EMBOSS: The European Molecular Biology Open Software Suite, Rice et al., 2000, Trends in Genetics 16: 276-277; http://emboss.org), preferentemente la versión 3.0.0 o versiones posteriores. Los parámetros opcionales utilizados son una penalización por la apertura de un hueco de 10, una penalización por la extensión de un hueco de 0.5 y la matriz de sustitución EBLOSUM62 (versión EMBOSS de BLOSUM62). El resultado de Needle denominado "la identidad más larga" (que se obtiene utilizando la opción no resumida) se utiliza como la identidad porcentual y se calcula como se indica a continuación: (Residuos idénticos x 100)/(Longitud de la alineación -Número total de huecos en la alineación) A los efectos de la presente invención, el grado de identidad entre dos secuencias de desoxirribonucleótidos se determina utilizando el algoritmo de Needleman-Wunsch (Needleman y Wunsch, 1970, mencionado anteriormente) según se implementa en el programa Needle del paquete EMBOSS (EMBOSS: The European Molecular Biology Open Software Suite, Rice efc al., 2000, mencionado anteriormente; http://emboss.org), preferentemente la versión 3.0.0 o versiones posteriores. Los parámetros opcionales utilizados son una penalización por la apertura de un hueco de 10, una penalización por la extensión de un hueco de 0.5 y la matriz de sustitución EDNAFULL (versión EMBOSS de NCBI NUC4.4). El resultado de Needle denominado "la identidad más larga" (que se obtiene utilizando la opción no resumida) se utiliza como la identidad porcentual y se calcula como se indica a continuación: (Desoxirribonucleótidos idénticos x 100)/(Longitud de la alineación - Número total de huecos en la alineación) El término "fragmento" se refiere a un polipéptido en el que se han eliminado uno o más (varios) aminoácidos del extremo amino y/o carboxilo de un polipéptido maduro; donde el fragmento tiene actividad proteasa.

La expresión "fragmento funcional de un polipéptido" o "fragmento funcional de este" se utiliza para describir un polipéptido que se deriva de un polipéptido más largo, p. ej., un polipéptido maduro, y que se ha truncado ya sea en la región del N-terminal, en la región del C-terminal o en ambas regiones para generar un fragmento del polipéptido original. Para que un polipéptido sea funcional, el fragmento debe mantener al menos un 20%,preferentemente al menos un 40%, más preferentemente al menos un 50%, más preferentemente al menos un 60%, más preferentemente al menos un 70%, más preferentemente al menos un 80%, aún más preferentemente al menos un 90%, más preferentemente todavía al menos un 95% y de la manera más preferida al menos un 100% de la actividad proteasa del polipéptido completo/maduro. Una metaloproteasa M4 se puede truncar de manera que se elimine cierto dominio para generar un fragmento funcional, el cual puede estar constituido por polipéptidos donde se han eliminado de la metaloproteasa M4 madura menos de 200 aminoácidos, preferentemente se han eliminado del polipéptido maduro menos de 150 aminoácidos, más preferentemente menos de 120, 100, 80, 60, 40, 30 aminoácidos, aún más preferentemente menos de 20 aminoácidos y de la manera más preferida menos de 10 aminoácidos.

El término "subsecuencia" se refiere a un polinucleótido en el que se han eliminado uno o más (varios) nucleótidos del extremo 5' y/o 3' de la secuencia que codifica el polipéptido maduro; donde la subsecuencia codifica un fragmento que tiene actividad proteasa.

La expresión "variante alélica" se refiere a cualquiera de las dos o más formas alternativas de un gen que ocupan el mismo locus cromosómico. La variación alélica aparece de manera natural debido a una mutación y puede generar polimorfismo en las poblaciones. Las mutaciones génicas pueden ser silenciosas (sin cambios en el polipéptido codificado) o pueden codificar polipéptidos con secuencias de aminoácidos alteradas. Una variante alélica de un polipéptido es un polipéptido codificado por una variante alélica de un gen.

El término "variante" se refiere a un polipéptido que tiene actividad proteasa que comprende una alteración, es decir, una sustitución, inserción y/o supresión de uno o más (varios) residuos aminoacidicos en una o más (varias) posiciones. Una sustitución se refiere al Reemplazo de un aminoácido que ocupa una posición por un aminoácido diferente; una supresión se refiere a la eliminación de un aminoácido que ocupa una posición; y una inserción se refiere a una adición de 1-3 aminoácidos adyacéntes a un aminoácido que ocupa una posición.

Las expresiones "composiciones de limpieza" y "formulaciones de limpieza" se refieren a composiciones útiles para la eliminación de compuestos no deseados de los artículos que han de limpiarse, tales como telas, alfombras, vajilla incluida la cristalería, lentes de contacto, superficies duras tales como azulejos, objetos de zinc, suelos y superficies de mesas, pelo (champús), piel (jabones y cremas), dientes (colutorios, pastas de dientes), etc. Las expresiones abarcan cualesquiera materiales/compuestos seleccionados para el tipo concreto de composición de limpieza deseada y la forma del producto (p. ej., composiciones líquidas, en gel, gránulos o aerosol), siempre que la composición sea compatible con la metaloproteasa y la otra u otras enzimas utilizadas en la composición. La selección específica de los materiales de la composición de limpieza se hace fácilmente teniendo en cuenta la superficie, el artículo o la tela que se ha de limpiar y la forma deseada de la composición para las condiciones de limpieza durante su uso. Estas expresiones se refieren además a cualquier composición que sea adecuada para limpiar, decolorar, desinfectar y/o esterilizar cualquier objeto y/o superficie. Se pretende que las expresiones incluyan, sin carácter limitante, composiciones detergentes (p. ej., detergentes para lavar la ropa sólidos y/o líquidos, y detergentes para prendas delicadas; formulaciones de limpieza de superficies duras, por ejemplo, para vidrio, madera, encimeras metálicas y de cerámica, y ventanas; limpiadores de alfombras; limpiadores de hornos; aromatizantes para telas; suavizantes para telas; y quitamanchas para el tratamiento previo al lavado de ropa y artículos textiles, así como detergentes para la vajilla).

La expresión "composición detergente" incluye, a menos que se indique lo contrario, agentes de lavado de gran potencia o multiusos en forma de polvos o gránulos, especialmente detergentes de limpieza; agentes de lavado multiusos en forma de pasta, gel o líquido, especialmente los denominados de tipo líquido de gran potencia (HDL, por sus siglas en inglés); detergentes líquidos para prendas delicadas; agentes para lavar la vajilla a mano o agentes para lavar la vajilla poco potentes, especialmente aquellos del tipo que produce una gran cantidad de espuma; agentes para lavar la vajilla a máquina, incluidos los diferentes tipos de líquidos, granulados, comprimidos y abrillantadores para uso doméstico e institucional; agentes de desinfección y limpieza líquidos, incluidos los tipos de jabones para manos antibacterianos, barras de limpieza, colutorios, productos de higiene de prótesis dentales, champús para coches o alfombras, productos de limpieza para el baño; champús para el cabello y enjuagues para el cabello; geles de ducha, espumas de baño; productos de limpieza de metales; así como también auxiliares de limpieza tales como aditivos de decoloración y tipos de "quitamanchas en barra" o de pretratamientos.

Las expresiones "composición detergente" y "formulación detergente" se utilizan haciendo referencia a mezclas que están diseñadas para ser utilizadas en un medio de lavado para limpiar objetos sucios. En algunas modalidades, la expresión se utiliza haciendo referencia al lavado de telas y/o prendas (p. ej., "detergentes para lavar la ropa"). En modalidades alternativas, la expresión se refiere a otros detergentes, tales como los utilizados para lavar la vajilla, la cubertería, etc. (p. ej., "detergentes lavavajillas "). No se pretende que la presente invención se limite a ninguna composición o formulación detergente concreta. Se pretende que, además de las metaloproteasas de conformidad con la invención, la expresión englobe detergentes que contengan, p. ej., surfactantes, adyuvantes, quelantes o agentes quelantes, un sistema decolorante o componentes decolorantes, polímeros, acondicionadores de telas, potenciadores de la espuma, supresores de la espuma de jabones, tintes, perfume, inhibidores de la aparición de color parduzco, abrillantadores ópticos, bactericidas, fungicidas, agentes de suspensión de la suciedad, agentes anticorrosivos, inhibidores o estabilizantes de enzimas, activadores de enzimas, transferasa(s), enzimas hidrolíticas, óxido-reductasas, colorantes azules y tintes fluorescentes, antioxidantes y solubilizantes.

El término "tela" abarca cualquier material textil. Por lo tanto, se pretende que el término abarque prendas, así como telas, hilos, fibras, materiales no tejidos, materiales naturales, materiales sintéticos y cualquier otro material textil.

El término "textil" se refiere a las telas tejidas, así como también a filamentos y fibras cortados adecuados para la conversión o uso como hilos, tejidos, tejidos de punto y telas no tejidas. Por lo tanto, el término abarca hilos hechos a partir de fibras tanto naturales como sintéticas (p. ej., manufacturadas). La expresión "materiales textiles" es un término general para fibras, intermedios de hilos, hilos, telas y productos hechos a partir de telas (p. ej., prendas u otros artículos).

La expresión "composiciones detergentes para superficies que no son telas" incluye composiciones detergentes para superficies no textiles incluidas, sin carácter limitante, las composiciones detergentes lavavajillas , composiciones detergentes orales, composiciones detergentes dentales y composiciones de limpieza personal.

La expresión "cantidad eficaz de enzima" se refiere a la cantidad de enzima necesaria para lograr la actividad enzimática requerida en la aplicación específica, p. ej., en una composición detergente definida. Los expertos en la téenica pueden determinar fácilmente tales cantidades eficaces en función de varios factores tales como la enzima concreta utilizada, la aplicación de limpieza, la composición específica de la composición detergente y si se requiere una composición líquida o seca (p. ej., en gránulos o barra) y similares. La expresión "cantidad eficaz" de una metaloproteasa se refiere a la cantidad de metaloproteasas descrita anteriormente en la presente que logra el nivel deseado de actividad enzimática, p. ej., en una composición detergente definida.

La expresión "rendimiento del lavado" de una enzima se refiere a la contribución de una enzima al lavado que proporciona un rendimiento de limpieza adicional respecto al detergente sin la adición de la enzima a la composición. El rendimiento del lavado se compara en condiciones de lavado relevantes. El rendimiento de lavado de una enzima se determina convenientemente mediante su capacidad de eliminar ciertas manchas representativas en condiciones de ensayo apropiadas.

En estos sistemas de ensayo, se pueden controlar otros factores relevantes, tales como la composición detergente, la concentración del detergente, la dureza del agua, la mecánica del lavado, tiempo, pH y/o temperatura, de modo que se imiten las condiciones típicas de una aplicación doméstica en cierto segmento del mercado.

La expresión "dureza del agua" o "grado de dureza" o "dH" o "°dH" tal como se emplea en la presente se refiere a grados alemanes de dureza. Se define un grado como 10 miligramos de óxido de calcio por litro de agua.

La expresión "condiciones relevantes de lavado" se emplea en la presente para indicar las condiciones, en particular el tiempo, temperatura del lavado, mecánica del lavado, concentración de detergente, tipo de detergente y dureza del agua, utilizados de hecho a nivel doméstico en un segmento del mercado de detergentes.

La expresión "propiedad mejorada" se emplea para indicar que se obtiene un mejor resultado final en una propiedad en comparación con el mismo proceso llevado a cabo sin la enzima. Las propiedades ilustrativas que se mejoran preferentemente en los procesos de la presente invención incluyen el rendimiento del lavado, la estabilidad enzimática, la actividad enzimática y la especificidad del sustrato.

La expresión "rendimiento de lavado mejorado" se utiliza para indicar que se obtiene un mejor resultado final en la eliminación de manchas de los artículos lavados (p. ej., telas o vajilla y/o cubertería) en condiciones de lavado relevantes en comparación con la ausencia de enzima o respecto a una enzima de referencia, o que se necesita menos enzima, basándose en el peso, para obtener el mismo resultado final respecto a la ausencia de enzima o a una enzima de referencia. En este contexto, el rendimiento de lavado mejorado también podría significar que se obtiene el mismo efecto, p. ej., efecto de eliminación de la mancha, en un tiempo de lavado menor, p. ej., las enzimas proporcionan su efecto más rápidamente en las condiciones de ensayo.

La expresión "rendimiento de lavado conservada" se utiliza para indicar que el rendimiento de lavado de una enzima, basándose en el peso, es de al menos un 80% respecto a otra enzima en condiciones de lavado relevantes.

La expresión "detergencia enzimática" o "detergencia" o "efecto detergente" se define en la presente como el efecto beneficioso que puede añadir una enzima a un detergente en comparación con el mismo detergente sin la enzima. Algunos beneficios de la detergencia importantes que pueden proporcionar las enzimas son la eliminación de manchas sin o con muy poca suciedad visible después del lavado y/o la limpieza, la prevención o reducción de la redeposición de la suciedad liberada en el proceso de lavado, un efecto que también se denomina efecto contra la redeposición, restableciendo completa o parcialmente la blancura de los artículos textiles que eran originalmente blancos pero que después del uso y lavado reiterados han adquirido un aspecto grisáceo o amarillento, un efecto que también se denomina blanqueo. Los beneficios del cuidado de los artículos textiles, los cuales no están directamente relacionados con la eliminación catalítica de las manchas o la prevención de la redeposición de la suciedad, también son importantes para los beneficios de la detergencia enzimática. Algunos ejemplos de este tipo de beneficios en el cuidado de los artículos textiles son la prevención o reducción de la transferencia del tinte de una tela a otra tela o a otra parte de la misma tela, un efecto que también se denomina inhibición de la transferencia del tinte o anti-retinción, eliminación de fibras rotas o que sobresalen de la superficie de la tela para disminuir la tendencia al frisado o eliminar pelusa o bolitas que ya existen, un efecto que también se denomina anti-frisado, mejora de la suavidad de la tela, aclaramiento del color de la tela y eliminación de suciedad particulada la cual se queda atrapada en las fibras de la tela o prenda. El decoloramiento enzimático es un beneficio detergente enzimático adicional donde la actividad catalítica se utiliza generalmente para catalizar la formación de un componente de decoloración tal como el peróxido de hidrógeno u otros peróxidos.

La expresión "efecto contra la redeposición" tal como se utiliza en la presente describe la reducción o prevención de la redeposición de la suciedad disuelta o suspendida en la solución de lavado sobre los objetos limpiados. La redeposición se podrá apreciar tras uno o varios ciclos de lavado (p. ej., como la adquisición de una coloración amarillenta o grisácea u otras decoloraciones).

La expresión "materiales adjuntos" se refiere a cualquier material líquido, sólido o gaseoso seleccionado para el tipo particular de composición detergente deseada y la forma del producto (p. ej., una composición líquida, en gránulos, polvo, barra, pasta, aerosol, comprimidos, gel o espuma), cuyos materiales también son compatibles preferentemente con la enzima de tipo metaloproteasa utilizada en la composición. En algunas modalidades, las composiciones granuladas se presentan en una forma "compacta", mientras que en otras modalidades, las composiciones líquidas se presentan en una forma "concentrada".

La expresión "enzima para eliminar manchas", tal como se utiliza en la presente, describe una enzima que facilita la eliminación de una mancha o de la suciedad de un tela o superficie dura. Las enzimas para eliminar manchas actúan sobre sustratos específicos, p. ej., una proteasa sobre una proteína, una amilasa sobre el almidón, una lipasa y una cutinasa sobre lípidos (grasas y aceites), una pectinasa sobre la pectina y las hemicelulasas sobre la hemicelulosa. A menudo las manchas son depósitos de mezclas complejas de diferentes componentes los cuales o bien provocan por si mismos una decoloración local del material o bien dejan una superficie pegajosa sobre el objeto la cual puede atraer suciedad disuelta en la solución de lavado que, de este modo, provoca la decoloración del área manchada. Cuando una enzima actúa sobre su sustrato específico presente en una mancha, la enzima degrada o degrada parcialmente su sustrato y de este modo facilita la eliminación de componentes de la mancha y suciedad asociados con el sustrato durante el proceso de lavado. Por ejemplo, cuando una proteasa actúa sobre una mancha de césped, degrada los componentes proteicos del césped y permite que se pierda el color verde/marrón durante el lavado.

La expresión "cantidad reducida" se refiere en este contexto a que la cantidad del componente es menor que la cantidad que debería utilizarse en un proceso de referencia en condiciones idénticas. En una modalidad preferida, la cantidad se reduce en, p. ej., al menos un 5%, tal como al menos un 10%, al menos un 15%, al menos un 20% o si no, tal como se describe en la presente.

La expresión sistema con una "concentración de detergente baja" incluye detergentes donde en el agua de lavado están presentes menos de aproximadamente 800 ppm de componentes detergentes. Los detergentes asiáticos, p. ej., los japoneses, se consideran normalmente sistemas con una concentración de detergente baja.

La expresión sistema con una "concentración de detergente media" incluye detergentes donde en el agua de lavado están presentes entre aproximadamente 800 ppm y aproximadamente 2000 ppm de componentes detergentes . Los detergentes norteamericanos se consideran generalmente sistemas con una concentración de detergente media.

La expresión sistema con una "concentración de detergente elevada" incluye detergentes donde en el agua de lavado están presentes más de aproximadamente 2000 ppm de componentes detergentes. Los detergentes europeos se consideran generalmente sistemas con una concentración de detergente elevada.

Polipéptidos que tienen actividad proteasa En una modalidad, la presente invención se refiere a una composición tal como una composición de limpieza que comprende polipéptidos aislados que tienen una identidad secuencial respecto al polipéptido maduro de la SEQ ID NO: 2 o la SEQ ID NO: 4 de al menos un 70%, p. ej., al menos un 75%, al menos un 80%, al menos un 85%, al menos un 86%, al menos un 87%, al menos un 88%, al menos un 89%, al menos un 90%, al menos un 91%, al menos un 92%, al menos un 93%, al menos un 94%, al menos un 95%, al menos un 96%, al menos un 97%, al menos un 98%, al menos un 99% o un 100%, los cuales tienen actividad proteasa.

Por lo tanto, una modalidad de la invención se refiere a una composición que comprende un polipéptido que tiene actividad proteasa, donde el polipéptido que tiene actividad proteasa se selecciona entre: a) un polipéptido que tiene una identidad secuencial de al menos un 70%, tal como una identidad de al menos un 75%, tal como una identidad de al menos un 80%, tal como una identidad secuencial de al menos un 85%, tal como una identidad de al menos un 90%, tal como una identidad de al menos un 95%, tal como una identidad de al menos un 97%, tal como una identidad de al menos un 98%, tal como una identidad de al menos un 99% respecto al polipéptido maduro de la SEQ ID NO: 2 o la SEQ ID NO:4; b) un polipéptido codificado por un polinucleótido que tiene una identidad secuencial de al menos un 70%, tal como una identidad de al menos un 75%, tal como una identidad de al menos un 80%, tal como una identidad secuencial de al menos un 85%, tal como una identidad de al menos un 90%, tal como una identidad de al menos un 95%, tal como una identidad de al menos un 97%, tal como una identidad de al menos un 98% y tal como una identidad de al menos un 99% respecto a la secuencia que codifica el polipéptido maduro de la SEQ ID NO: 1 o la SEQ ID NO:3; (c) una variante que comprende una sustitución, supresión y/o inserción de uno o más (varios) aminoácidos del polipéptido maduro de la SEQ ID NO: 2 o la SEQ ID NO:4; y (d) un fragmento de un polipéptido de (a), (b) o (c) que tiene actividad proteasa.

En un aspecto particular de la invención, la composición es una composición de limpieza tal como una composición detergente o un aditivo para detergentes.

En otra modalidad, la presente invención se refiere al uso de polipéptidos aislados que tienen una identidad secuencial respecto al polipéptido maduro de la SEQ ID NO: 2o la SEQ ID NO: 4 de al menos un 70%, p. ej., al menos un 75%, al menos un 80%, al menos un 85%, al menos un 86%, al menos un 87%, al menos un 88%, al menos un 89%, al menos un 90%, al menos un 91%, al menos un 92%, al menos un 93%, al menos un 94%, al menos un 95%, al menos un 96%, al menos un 97%, al menos un 98%, al menos un 99% o un 100%, los cuales tienen actividad proteasa en un proceso de limpieza o en un detergente.

Por lo tanto, otro aspecto de la invención se refiere al uso de un polipéptido que tiene actividad proteasa en un proceso de limpieza, donde el polipéptido que tiene actividad proteasa se selecciona entre: a) un polipéptido que tiene una identidad secuencial de al menos un 70%, tal como una identidad de al menos un 75%, tal como una identidad de al menos un 80%, tal como una identidad secuencial de al menos un 85%, tal como una identidad de al menos un 90%, tal como una identidad de al menos un 95%, tal como una identidad de al menos un 97%, tal como una identidad de al menos un 98% y tal como una identidad de al menos un 99% respecto al polipéptido maduro de la SEQ ID NO: 2 o la SEQ ID NO:4; b) un polipéptido codificado por un polinucleótido que tiene una identidad secuencial de al menos un 70%, tal como una identidad de al menos un 75%, tal como una identidad de al menos un 80%, tal como una identidad secuencial de al menos un 85%, tal como una identidad de al menos un 90%, tal como una identidad de al menos un 95%, tal como una identidad de al menos un 97%, tal como una identidad de al menos un 98% y más preferentemente todavía una identidad de al menos un 99% respecto a la secuencia que codifica el polipéptido maduro de la SEQ ID NO: 1 o la SEQ ID NO:3; (c) una variante que comprende una sustitución, supresión y/o inserción de uno o más (varios) aminoácidos del polipéptido maduro de la SEQ ID NO: 2 o la SEQ ID NO:4; y (d) un fragmento de un polipéptido de (a), (b) o (c) que tiene actividad proteasa.

En un aspecto, los polipéptidos no difieren en más de 10 aminoácidos, p. ej., 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8o9, del polipéptido maduro de la SEQ ID NO: 2.

En un aspecto, los polipéptidos no difieren en más de 10 aminoácidos, p. ej.,1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8o9, del polipéptido maduro de la SEQ ID NO: 4.

En un aspecto, el polipéptido que se va a utilizar en la presente invención comprende o está constituido por la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 2 o una variante alélica de esta; o es un fragmento de este que tiene actividad proteasa. En otro aspecto, el polipéptido comprende o está constituido por el polipéptido maduro de la SEQ ID NO: 2. En otro aspecto, el polipéptido comprende o está constituido por los aminoácidos 1-317 de la SEQ ID NO: 2.

En un aspecto, el polipéptido que se va a utilizar en la presente invención comprende o está constituido por la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 4 o una variante alélica de esta; o es un fragmento de este que tiene actividad proteasa. En otro aspecto, el polipéptido comprende o está constituido por el polipéptido maduro de la SEQ ID NO: 4. En otro aspecto, el polipéptido comprende o está constituido por los aminoácidos 1-315 de la SEQ ID NO: 4.

En una modalidad preferida de la invención, el polipéptido aislado de la invención es una metaloproteasa que pertenece al grupo M4 de metaloproteasas. Preferentemente, el polipéptido aislado se deriva de Exiguobacterium. Más preferentemente, el polipéptido se deriva de Exiguobacterium sibiricum o Exiguobacterium sp. ATlb. Por lo tanto, la presente invención se refiere al uso de metaloproteasas, en particular una metaloproteasa del tipo M4 tal como una metaloproteasa que tiene una identidad de al menos un 70% respecto a la SEQ ID NO 2 o la SEQ ID NO 4 en procesos de limpieza tales como el lavado de la ropa o de la vajilla. La invención también se refiere a composiciones detergentes y composiciones de limpieza que comprenden metaloproteasas.

Las metaloproteasas del tipo M4 son metaloproteasas que pertenecen a la familia M4 de metaloproteasas, metaloproteasas M4 o simplemente M4 tal como se emplea en la presente se refiere a un polipéptido comprendido en la familia M4 de metaloproteasas de conformidad con Rawlings et al., Biochem. J. , 290, 205-218 (1993) y tal como se describe adicionalmente en MEROPS - (Rawlings et al., MEROPS: the peptidase database, Nucí Acids Res, publicación de la base de datos 34, D270-272, 2006). Las metaloproteasas M4 son metaloproteasas neutras que contienen principalmente endopeptidasas. Todas las peptidasas de la familia se unen a un único ion de zinc catalítico. Los miembros de la familia M4 de metaloproteasas incluyen el motivo común HEXXH, donde los residuos de histidina actúan como ligandos de zinc y el glutamato es un residuo del sitio activo. Las metaloproteasas M4 tienen un pH óptimo principalmente a pH neutro. La familia de polipéptidos M4 de metaloproteasas se ha caracterizado en mayor grado y en la actualidad incluye, según MEROPS, al menos veintidós subclases, para las cuales se ha asignado un ID MEROPS distintivo (es decir, un identificador de fórmula M04.xxx), así como también homólogos que no son peptidasas y peptidasas no asignadas.

En otra modalidad, la presente invención se relaciona con el uso de un polipéptido aislado que tiene actividad proteasa codificada por un polinucleótido que se híbrida en condiciones de rigurosidad muy baja, condiciones de rigurosidad baja, condiciones de rigurosidad media, condiciones de rigurosidad media-alta, condiciones de rigurosidad alta, o condiciones de rigurosidad muy alta con (i) la secuencia codificante del polipéptido maduro de la SEQ ID NO: 1 o la SEQ ID NO: 3, o (ii) la secuencia complementaria completa de (i) o (ii) (Sambrook et al . , 1989, Molecular Cloning, ? Laboratory Manual , 2.a edición, Coid Spring Harbor, Nueva York).

El polinucleótido de la SEQ ID NO: 1 o la SEQ ID NO: 3 o una subsecuencia de este, así como el polipéptido de la SEQ ID NO: 2 o la SEQ ID NO: 4 o un fragmento de este, se pueden utilizar para diseñar sondas de ácido nucleico con el fin de identificar y clonar polipéptidos que codifican ADN que tienen actividad proteasa de cepas de diferentes géneros o especies de conformidad con métodos muy conocidos en la téenica. En particular, este tipo de sondas se pueden utilizar para la hibridación con el ADN genómico o ADNc de una célula de interés, siguiendo procedimientos estándar de Southern blot, con el fin de identificar y aislar el gen correspondiente en este. Este tipo de sondas pueden ser considerablemente más cortas que la secuencia completa, pero deben tener una longitud de al menos 15, p. ej., al menos 25, al menos 35 o al menos 70 nucleótidos. Como tal, la sonda de ácido nucleico tiene una longitud de al menos 100 nucleótidos, p. ej., una longitud de al menos 200 nucleótidos, al menos 300 nucleótidos, al menos 400 · nucleótidos, al menos 500 nucleótidos, al menos 600 nucleótidos, al menos 700 nucleótidos, al menos 800 nucleótidos o al menos 900 nucleótidos. Se pueden utilizar sondas tanto de ADN como de ARN. Las sondas suelen marcarse para detectar el gen correspondiente (por ejemplo, con 32P, 3H, 35S, biotina o avidina). La presente invención abarca este tipo de sondas.

Se puede cribar una biblioteca de ADN genómico o ADNc preparada a partir de otras cepas de este tipo para detectar ADN que se hibride con las sondas descritas anteriormente y que codifique un polipéptido que tiene actividad proteasa. El ADN genómico o de otro tipo procedente de otras cepas de este tipo se puede separar mediante electroforesis en gel de poliacrilamida o agarosa, o mediante otras téenicas de separación. El ADN de las bibliotecas o el ADN separado se puede transferir a nitrocelulosa u otro material portador adecuado e inmovilizarlo sobre este. Con el fin de identificar un clon o ADN que se hibride con la SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3 o una subsecuencia de esta, el material portador se utiliza en una Southern blot.

A efectos de la presente invención, la hibridación indica que el polinucleótido se híbrida con una sonda de ácido nucleico marcada correspondiente a (i) la SEQ ID NO: 1 o la SEQ ID NO: 3; (ii) la secuencia que codifica el polipéptido maduro de la SEQ ID NO: 1 o la SEQ ID NO: 3; (iii) la secuencia complementaria completa de esta; o (iv) una subsecuencia de esta; en condiciones de rigurosidad de muy baja a muy alta. Las moléculas con las cuales se híbrida la sonda de ácido nucleico en estas condiciones se pueden detectar utilizando, por ejemplo, una película de rayos X o cualquier otro medio de detección conocido en la téenica.

En otra modalidad, la presente invención se refiere a un polipéptido aislado que tiene actividad proteasa codificado por un polinucleótido que tiene una identidad secuencial respecto a la secuencia codificante del polipéptido maduro de la SEQ ID NO: 1 o la SEQ ID NO 3 de al menos un 70%, p. ej., al menos un 75%, al menos un 80%, al menos un 85%, al menos un 86%, al menos un 87%, al menos un 88%, al menos un 89%, al menos un 90%,.al menos un 91%, al menos un 92%, al menos un 93%, al menos un 94%, al menos un 95%, al menos un 96%, al menos un 97%, al menos un 98%, al menos un 99% o un 100%.

En otra modalidad, la presente invención se relaciona con variantes del polipéptido maduro de SEQ ID NO: 2 o variantes del polipéptido maduro de la SEQ ID NO: 4 que comprenden una sustitución, supresión y/o inserción en una o más (p. ej., varias) posiciones. En una modalidad, el número de sustituciones, supresiones y/o inserciones de aminoácidos introducidas en el polipéptido maduro de la SEQ ID NO: 2 o la SEQ ID NO: 4 no es superior a 10, p. ej., 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 o 9. Los cambios de los aminoácidos pueden ser poco relevantes, es decir, inserciones o sustituciones conservadoras de aminoácidos que no afectan significativamente al plegamiento y/o la actividad de la proteína; supresiones pequeñas, normalmente de 1-30 aminoácidos; extensiones pequeñas en el extremo amino o en el C-terminalarboxilo, tales como un residuo de metionina en el extremo amino; un péptido conector pequeño de hasta 20-25 residuos; o una extensión pequeña que facilita la purificación al cambiar la carga neta u otra función, tal como una región de polihistidina, un epítopo antigénico o un dominio de unión.

Algunos ejemplos de sustituciones conservadoras son las sustituciones dentro de los grupos de aminoácidos básicos (arginina, lisina e histidina), aminoácidos ácidos (ácido glutámico y ácido aspártico), aminoácidos polares (glutamina y asparagina), aminoácidos hidrófobos (leucina, isoleucina y valina), aminoácidos aromáticos (fenilalanina, triptófano y tirosina) y aminoácidos de bajo peso molecular (glicina, alanina, serina, treonina y metionina). En la téenica existe constancia de sustituciones de aminoácidos que no alteran generalmente la actividad específica y han sido descritas, por ejemplo, por H. Neurath y R.L. Hill, 1979, en The Proteins, Academic Press, Nueva York. Algunas sustituciones comunes son Ala/Ser, Val/lle, Asp/Glu, Thr/Ser, Ala/Gly, Ala/Thr, Ser/Asn, Ala/Val, Ser/Gly, Tyr/Phe, Ala/Pro, Lys/Arg, Asp/Asn, Leu/lle, Leu/Val, Ala/Glu y Asp/Gly.

De forma alternativa, los cambios de los aminoácidos son de una naturaleza tal que las propiedades fisicoquímicas de los polipéptidos se alteran. Por ejemplo, los cambios de los aminoácidos pueden mejorar la estabilidad térmica del polipéptido, alterar la especificidad por el sustrato, cambiar el pH óptimo y similares. Ejemplos de posiciones en las metaloproteasas M4 que, preferentemente, podrían alterarse: 110, 114, 115, 116, 119, 133, 144, 150, 202, 211, 225, 227. En particular, las siguientes mutaciones específicas conllevan mayores probabilidades, p. ej., una mayor actividad en metaloproteasas M4: Y110W, F114A, N116D, Q119R,E,D,H,M,S,G,A, F133L, L144S, D150N,H,W, L202F,Y,G,A,V, Y211W, Q225R, N227H (numeración de conformidad con el péptido maduro de la proteasa M4 de Bacillus thermoproteolyticus, Número de acceso público: Uniprot: P00800, Handbook of proteolytic enzymes.2.a edición, editado por Barret A., Rawlings N., Woessner F, Elsevier Academic Press 2004).

Los aminoácidos esenciales de un polipéptido se pueden identificar de conformidad con procedimientos de uso común en la téenica tales como la mutagénesis dirigida o la mutagénesis de barrido de alanina (Cunningham y Wells, 1989, Science 244: 1081-1085). En esta última técnica, se introducen mutaciones de una única alanina en cada residuo de la molécula y las moléculas mutadas resultantes se evalúan para determinar su actividad proteasa con el fin de identificar los residuos aminoacídicos que son cruciales para la actividad de la molécula. Remítase también a Hilton et al . , 1996, J. Biol . Chem. 271: 4699-4708. El sitio activo de la enzima u otra interacción biológica también se puede determinar mediante el análisis físico de la estructura, que se determina mediante téenicas tales como la resonancia magnética nuclear, cristalografía, difracción de electrones o mareaje de fotoafinidad, junto con la mutación de posibles aminoácidos del sitio de contacto. Remítase, por ejemplo, a de Vos et al., 1992, Science 255: 306-312; Smith et al . , 1992, J. Mol . Biol . 224: 899-904; Wlodaver et al., 1992, FEBS Lett . 309: 59-64. La identidad de los aminoácidos esenciales también se puede deducir a partir de una alineación con un polipéptido relacionado. En la metaloproteasa de Exiguobacterium sibiricum los residuos del sitio activo son E144 y H232 (numeración de conformidad con la SEQ ID NO 2). En la metaloproteasa de Exiguobacterium sp. ATlb los residuos del sitio activo son E142 y H230 (numeración de conformidad con la SEQ ID NO 4).

Las sustituciones, supresiones y/o inserciones de un único aminoácido o de múltiples aminoácidos se pueden realizar y evaluar utilizando métodos conocidos de mutagénesis, recombinación y/o reordenamiento, seguidos de un procedimiento de cribado relevante, como los descritos por Reidhaar-Olson y Sauer, 1988, Science 241: 53-57; Bowie y Sauer, 1989, Proc. Nati . Acad. Sci . USA 86: 2152-2156; WO 95/17413 o WO 95/22625. Otros métodos que se pueden utilizar incluyen la PCR propensa a error, la presentación en fagos (p. ej., Lowman et al . , 1991, Biochemistry 30: 10832-10837; Patente de EE.UU. N.° 5.223.409; WO 92/06204), mutagénesis dirigida a una región (Derbyshire et al., 1986, Gene 46: 145; Ner et al., 1988, DNA 7: 127).

Los métodos de mutagénesis/reordenamiento se pueden combinar con métodos de cribado automáticos de alto rendimiento para detectar la actividad de polipéptidos mutados clonados expresados por las células hospedadoras (Ness et al . , 1999, Nature Biotechnology 17: 893-896). Las moléculas de ADN mutado que codifican polipéptidos activos se pueden recuperar a partir de las células hospedadoras y secuenciar rápidamente utilizando métodos estándar de la téenica. Estos métodos permiten determinar rápidamente la importancia de residuos aminoacídicos individuales en un polipép ido.

El número total de sustituciones, supresiones y/o inserciones de aminoácidos del polipéptido maduro de la SEQ ID NO: 2 o 4 no es superior a 10, p. ej., 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 o 9.

Además de los 20 aminoácidos estándar, los aminoácidos no estándar (tales como 4-hidroxiprolina, 6- -metillisina, ácido 2-aminoisobutírico, isovalina y alfa-metilserina) pueden ser sustituidos por residuos aminoacídicos de un polipéptido de tipo natural. Un número limitado de aminoácidos no conservadores, aminoácidos que no están codificados por el código genético, y aminoácidos no naturales pueden sustituirse por residuos aminoacídicos. Los "aminoácidos no naturales" se han modificado tras la síntesis proteica y/o tienen una estructura química en su cadena o cadenas laterales diferentes de la de los aminoácidos estándar. Los aminoácidos no naturales se pueden sintetizar químicamente y, preferentemente, están comercializados e incluyen el ácido pipecólico, ácido tiazolidinocarboxílico, deshidroprolina, 3- y 4-metilprolina y 3,3-dimetilprolina.

De forma alternativa, los cambios de los aminoácidos son de una naturaleza tal que las propiedades fisicoquímicas de los polipéptidos se alteran. Por ejemplo, los cambios de los aminoácidos pueden mejorar la estabilidad térmica del polipéptido, alterar la especificidad por el sustrato, cambiar el pH óptimo y similares.

El polipéptido puede ser un polipéptido híbrido en el cual una región de un polipéptido se fusiona con el N-terminal o el C-terminal de una región de otro polipéptido.

El polipéptido puede ser un polipéptido de fusión o un polipéptido de fusión escindible en donde otro polipéptido se fusiona en el N-terminal o C-terminal del polipéptido de la presente invención. Un polipéptido de fusión se produce fusionando un polinucleótido que codifica otro polipéptido con un polinucleótido de la presente invención. Las téenicas para producir polipéptidos de fusión son de uso común en la técnica e incluyen ligar las secuencias codificantes que codifican los polipéptidos de modo que estén en fase y que la expresión del polipéptido de fusión esté controlada por el mismo promotor o promotores y el mismo terminador. Los polipéptidos de fusión también se pueden construir utilizando la tecnología de inteínas en la cual los polipéptidos de fusión se crean después de la traducción (Cooper et al., 1993, EMBO J. 12: 2575-2583; Dawson et al . , 1994, Science 266: 776-779).

Un polipéptido de fusión puede comprender además un sitio de escisión entre los dos polipéptidos.Al secretar la proteína de fusión, el sitio se escinde y se liberan los dos polipéptidos. Los ejemplos de sitios de escisión incluyen, sin carácter limitante, los sitios descritos en Martin et al., 2003, J. Ind. Microbiol . Biotechnol .3: 568-576; Svetina et al., 2000,J. Biotechnol . 76: 245-251; Rasmussen-Wilson et al., 1997, Appl . Environ. Microbiol . 63: 3488-3493; Ward et al., 1995, Biotechnology 13: 498-503; Contreras et al., 1991, Biotechnology 9: 378-381; Eaton et al., 1986, Biochemistry 25: 505-512; Collins-Racie et al . , 1995, Biotechnology 13: 982-987; Cárter et al., 1989, Proteins: Structure, Function, and Genetics 6: 240-248; y Stevens, 2003, Drug Discovery World 4: 35-48.

Fuentes de metaloproteasas M4 Una metaloproteasa M4 útil en la presente invención se puede obtener a partir de microorganismos de cualquier género. A los efectos de la presente invención, la expresión "obtenido a partir de", tal como se utiliza en la presente en relación con una fuente determinada, significará que el polipéptido codificado por una secuencia de nucleótidos está producido por la fuente en la cual está presente de manera natural o por una cepa en la cual se ha insertado la secuencia de nucleótidos procedente de la fuente. En un aspecto preferido, el polipéptido obtenido a partir de una fuente determinada se secreta extracelularmente.

Un polipéptido de la presente invención puede ser un polipéptido bacteriano. Por ejemplo, el polipéptido puede ser un polipéptido de bacterias grampositivas tal como un polipéptido que tiene actividad proteasa de Exiguobacterium, Bacillus, Clostridium, Enterococcus , Geobacillus, Lactobacillus, Lactococcus, Oceanobacillus, Staphylococcus, Streptococcus o Streptomyces , o un polipéptido de bacterias gramnegativas tal como un polipéptido de Campylobacter, E. coli, Flavobacterium, Fusobacterium, Helicobacter, Ilyobacter, Neisseria, Pseudomonas, Salmonella y Ureaplasma .

En un aspecto, el polipéptido es un polipéptido de Exiguobacterium, tal como un polipéptido de Exiguobacterium sibiricum o un polipéptido de Exiguobacterium sp. ATlb.

En otro aspecto, el polipéptido es un polipéptido de Bacillus alkalophilus, Bacillus amyloliquefaciens, Bacillus brevis, Bacillus cereus, Bacillus circulans, Bacillus clausii, Bacillus coagulans, Bacillus firmus, Bacillus lautus, Bacillus lentus, Bacillus licheniformis, Bacillus megaterium, Bacillus pumilus, Bacillus stearothermophilus, Bacillus subtilis o Bacillus thuringiensis .

En otro aspecto, el polipéptido es un polipéptido de Geobacillus caldolyticus, Geobacillus stearothermophilus .

En otro aspecto, el polipéptido es un polipéptido de Streptococcus equisimilis, Streptococcus pyogenes, Streptococcus uberis o Streptococcus equi subesp. Zooepi demi cus .

En otro aspecto, el polipéptido es un polipéptido de Streptomyces achromogenes, Streptomyces avermitilis , Streptomyces coelicolor, Streptomyces griseus o Streptomyces lividans .

Un polipéptido de la presente invención también puede ser un polipéptido de un hongo y, más preferentemente, un polipéptido de levaduras tal como un polipéptido de Candida, Kluyveromyces, Pichia, Saccharomyces-, Schizosaccharomyces, o Yarrowia; o más preferentemente un polipéptido de un hongo filamentoso tal como un polipéptido de Acremonium, Aspergillus , Aureobasidium, Chaeto ium, Cryptococcus, Filibasidium, Fusarium, Humicola, Magnaporthe, Mucor, Myceliophthora, Neocallimastix, Neurospora, PPaaeecciilloommyycceess ,, Penicillium, Piromyces , Poronia, Schizophyllum, Talaromyces , Thermoascus, Thielavia, Tolypocladium, Trichoderma o Verticillium.

En un aspecto preferido, el polipéptido es un polipéptido de Saccharomyces carlsbergensis , Saccharomyces cerevisiae, Saccharomyces diastaticus , Saccharomyces douglasii , Saccharomyces kluyveri , Saccharomyces norhensis o Saccharomyces oviformis.

En otro aspecto preferido, el polipéptido es un polipéptido de Aspergillus aculeatus , Aspergillus awamori , Aspergillus fumigatus , Aspergillus foetidus , Aspergillus japonicus , Aspergillus nidulans , Aspergillus niger, Aspergillus oryzae, Aspergillus terreus, Chaetomium globosum, Coprinus cinereus , Diplodia gossyppina, Fusarium bactridioides , Fusarium cerealis , Fusarium crookwellen.se, Fusarium culmorum, Fusarium graminearum, Fusarium graminum, Fusarium heterosporum, Fusarium negundi , Fusarium oxysporum, Fusarium reticulatum, Fusarium roseum, Fusarium sambucinum, Fusarium sarcochroum, Fusarium sporotrichioides , Fusarium sulphureum, Fusarium torulosum, Fusarium tri chothecioides , Fusarium venenatum, Humicola insolens , Humicola lanuginosa, Magnaporthe grísea, Mucor iehei , Myceliophthora thermophila, Neurospora crassa, Penicillium purpurogenum , Phanerochaete chrysosporium, Poronia punctata, Pseudoplectania nigrella, Thermoascus aurantiacus , Thielavia terrestris , Trichoderma harzianum, Trichoderma koningii , Trichoderma longibrachiatum, Trichoderma reesei, Trichoderma viride, Trichophaea saccata o Vert icillium tenerum.

En un aspecto preferido, el polipéptido es un polipéptido de Exiguobacterium sp. ATlb tal como un polipéptido con la SEQ ID NO: 4 o un polipéptido que tiene una identidad de al menos un 70% respecto a esta. En otro aspecto preferido, el polipéptido es un polipéptido de Exiguobacterium, tal como un polipéptido de Exiguobacterium sibiricum, tal como un polipéptido con la SEQ ID NO: 2 o un polipéptido que tiene una identidad de al menos un 70% respecto a esta.

Se sobreentenderá que, para las especies mencionadas anteriormente, la invención abarca tanto los estados perfectos como los imperfectos y otros equivalentes taxonómicos, p. ej., anamorfos, independientemente del nombre de la especie con el cual se los conoce. Los expertos en la téenica reconocerán fácilmente la identidad de los equivalentes apropiados.

Las cepas de estas especies son de dominio público y se puede acceder a ellas fácilmente en una serie de bibliotecas de cultivos, tales como la American Type Culture Collection (ATCC), Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH (DSM), Centraalbureau Voor Schimmelcultures (CBS) y Agricultural Research Service Patent Culture Collection, Northern Regional Research Center (NRRL).

Además, estos polipéptidos se pueden identificar y obtener a partir de otras fuentes, incluidos los microorganismos aislados a partir de la naturaleza (p. ej., suelo, compost, agua, etc.), utilizando las sondas mencionadas anteriormente. Las téenicas para aislar microorganismos a partir de hábitats naturales son de uso común en la técnica. El polinucleótido se puede obtener entonces cribando de manera similar una biblioteca genómica o de ADNc de un microorganismo de este tipo. Una vez que se ha detectado la secuencia de polinucleótidos que codifica un polipéptido con la sonda o las sondas, el polinucleótido se puede aislar o clonar utilizando técnicas con las que estarán familiarizados los expertos en la técnica (remítase, p. ej., a Sambrook et al . , 1989, mencionado anteriormente).

Los polipéptidos de la presente invención también incluyen polipéptidos fusionados o polipéptidos de fusión escindibles en los cuales otro polipéptido se fusiona en el N-terminal o en el C-terminal del polipéptido o fragmento de este. Un polipéptido fusionado se produce fusionando una secuencia de nucleótidos (o una porción de esta) que codifica otro polipéptido con una secuencia de nucleótidos (o una porción de esta) de la presente invención. Las técnicas para producir polipéptidos de fusión son de uso común en la materia e incluyen ligar las secuencias codificantes que codifican los polipéptidos de modo que estén en fase y que la expresión del polipéptido fusionado esté controlada por el mismo promotor o promotores y por el mismo terminador.

Composiciones La presente invención también se refiere a composiciones que comprenden una metaloproteasa de la invención. Preferentemente, las composiciones están enriquecidas en una metaloproteasa de la invención. El término "enriquecido" indica que se ha incrementado la actividad proteasa de la composición.

En una modalidad, la presente invención se refiere a composiciones, en particular a composiciones de limpieza y/o composiciones detergentes, que comprenden una metaloproteasa de la invención y un portador y/o excipiente adecuado.

En una modalidad, la composición detergente se puede adaptar para usos específicos tales como el lavado de la ropa, en particular el lavado de la ropa doméstico, lavado de la vajilla o la limpieza de una superficie dura.

Las composiciones detergentes de la invención se pueden formular, por ejemplo, como una composición detergente para lavar la ropa a mano o a máquina que incluye una composición aditiva para lavar la ropa adecuada para el pretratamiento de telas manchadas y una composición suavizante de telas añadida en el enjuagado, o se puede formular como una composición detergente para su uso en operaciones de limpieza de superficies duras domésticas en general, o se puede formular para operaciones de lavado de la vajilla a mano o a máquina. Las composiciones detergentes de la invención pueden ser útiles en la limpieza de superficies duras, aplicaciones de lavado de la vajilla automático, así como también aplicaciones cosméticas tales como prótesis dentales, dientes, cabello y piel.

En una modalidad preferida, las composiciones detergentes comprenden uno o más portadores y/o uno o más excipientes convencionales tales como los ejemplificados posteriormente.

La composición detergente de la invención puede presentarse en cualquier forma conveniente, p. ej., una barra, un comprimido, un polvo, un gránulo, una pasta o un líquido. Un detergente líquido puede ser acuoso, normalmente con un contenido de hasta un 70% de agua y un 0-30% de disolvente orgánico o no acuoso.

A menos que se indique lo contrario, todos los niveles de la composición o componentes proporcionados en la presente se proporcionan haciendo referencia al nivel activo de ese componente o composición y son exclusivos de las impurezas, por ejemplo, disolventes residuales o productos secundarios, que pueden estar presentes en las fuentes comercializadas.

Las metaloproteasas de la invención se incorporan a la composición detergente normalmente con un nivel de entre un 0.000001% y un 2% de la proteína enzimática en peso de la composición, preferentemente con un nivel de entre un 0.00001% y un 1% de la proteína enzimática en peso de la composición, más preferentemente con un nivel de entre un 0.0001% y un 0.75% de la proteína enzimática en peso de la composición, aún más preferentemente con un nivel de entre un 0.001% y un 0.5% de proteína enzimática en peso de la composición.

Además, las metaloproteasas de la invención se incorporan a la composición detergente normalmente en cantidades tales que su concentración en el agua de lavado esté en un nivel comprendido entre un 0.0000001% y un 1% de proteína enzimática, preferentemente con un nivel comprendido entre un 0.000005% y un 0.01% de proteína enzimática, más preferentemente con un nivel de entre un 0.000001% y un 0.005% de proteína enzimática, aún más preferentemente con un nivel de entre un 0.00001% y un 0.001% de proteína enzimática en el agua de lavado.

Como es muy conocido, la cantidad de enzima también variará de conformidad con la aplicación particular y/o como resultado de otros componentes incluidos en las composiciones.

Una composición para su uso en un lavavajillas automático (ADW, por sus siglas en inglés) puede incluir, por ejemplo, un 0.001%-50%, tal como un 0.01%-25%, tal como un 0.02%-20%, tal como un 0.1%-15% de proteína enzimática en peso de la composición.

Una composición para su uso en un detergente granulado para lavar la ropa puede incluir, por ejemplo, un 0.0001%-50%, tal como un 0.001%-20%, tal como un 0.01%-15%, tal como un 0.05%-10% de proteína enzimática en peso de la composición.

Una composición para uso en un detergente líquido para lavar la ropa puede incluir por ejemplo, un 0.0001%-10%, tal como un 0.001%-7%, tal como un 0.1%-5% de proteína enzimática en peso de la composición.

En algunas modalidades preferidas, las composiciones detergentes proporcionadas en la presente se formulan normalmente de manera que, durante su uso en las operaciones de limpieza acuosa, el agua de lavado tenga un pH de entre aproximadamente 5.0 y aproximadamente 11.5 o, en modalidades alternativas, incluso de entre aproximadamente 6.0 y aproximadamente 10.5, tal como entre aproximadamente 5 y aproximadamente 11, entre aproximadamente 5 y aproximadamente 10, entre aproximadamente 5 y aproximadamente 9, de entre aproximadamente 5 y aproximadamente 8, de entre aproximadamente 5 y aproximadamente 7, entre aproximadamente 6 y aproximadamente 11, entre aproximadamente 6 y aproximadamente 10, entre aproximadamente 6 y aproximadamente 9, entre aproximadamente 6 y aproximadamente 8, entre aproximadamente 6 y aproximadamente 7, entre aproximadamente 7 y aproximadamente 11, entre aproximadamente 7 y aproximadamente 10, entre aproximadamente 7 y aproximadamente 9 o entre aproximadamente 7 y aproximadamente 8. En algunas modalidades preferidas, los productos para el lavado de la ropa líquidos o en gránulos se formulan de manera que el agua de lavado tenga un pH de entre aproximadamente 5.5 y aproximadamente 8. Las téenicas para controlar el pH en los niveles de utilización recomendados incluyen la utilización de amortiguadores, álcalis, ácidos. etc., y son de uso común para el experto en la téenica.

Los pesos de los componentes enzimáticos se basan en la proteína activa total. Todos los porcentajes y relaciones se calculan en peso a menos que se indique lo contrario. Todos los porcentajes y relaciones se calculan en función de la composición total a menos que se indique lo contrario. En la composición detergente ejemplificada, los niveles enzimáticos se expresan en enzima pura en peso de la composición total y a menos que se indique lo contrario, los ingredientes detergentes se expresan en peso de la composición total.

Las enzimas de la presente invención también se utilizan en productos que son aditivos para detergentes. Un producto que es un aditivo para detergentes que comprende una metaloproteasa de la invención es ideal para ser incluido en un proceso de lavado cuando, p. ej., la temperatura es baja, el pH está entre 6 y 8 y el tiempo de lavado es corto, p. ej., menos de 30 min.

El producto que es un aditivo para detergentes puede ser una metaloproteasa de la invención y preferentemente una enzima adicional. En una modalidad, el aditivo se empaqueta en una forma de dosificación para su adición al proceso de limpieza. La dosificación única puede comprender una pastilla, comprimido, cápsula de gel ( gelcap ) u otra dosificación unitaria única que incluya polvos y/o líquidos. En algunas modalidades, se incluyen material o materiales de relleno y/o portadores, los materiales de relleno o portadores adecuados incluyen, sin carácter limitante, diversas sales de sulfato, carbonato y silicato así como talco, arcilla y similares. En algunas modalidades los materiales de relleno y/o portadores para las composiciones líquidas incluyen agua y/o alcoholes primarios y secundarios con un peso molecular bajo que incluyen polioles y dioles. Los ejemplos de alcoholes de este tipo incluyen, sin carácter limitante, metanol, etanol, propanol e isopropanol.

En una modalidad particularmente preferida, las metaloproteasas de conformidad con la invención se emplean en una composición en gránulos o líquido, y la metaloproteasa puede estar en forma de una partícula encapsulada. En una modalidad, el material de encapsulación se selecciona a partir del grupo constituido por carbohidratos, gomas naturales o sintéticas, quitina y quitosano, celulosa y derivados de celulosa, silicatos, fosfatos, boratos, alcohol polivinílico, polietilenglicol, ceras de parafina y combinaciones de estos.

Las composiciones de conformidad con la invención comprenden normalmente uno o más ingredientes detergentes. La expresión composiciones detergentes incluye artículos y composiciones de limpieza y tratamiento. La expresión composición de limpieza incluye, a menos que se indique lo contrario, agentes de lavado multiusos o "de gran potencia" en forma de comprimidos, polvos o gránulos, especialmente detergentes para el lavado de la ropa; agentes de lavado multiusos en forma de líquido, gel o pasta, especialmente los denominados de tipo líquido de gran potencia; detergentes líquidos para prendas delicadas; agentes para lavar la vajilla a mano o agentes para lavar la vajilla poco potentes, especialmente aquellos del tipo que produce una gran cantidad de espuma; agentes para lavar la vajilla a máquina, incluidos los diferentes tipos de comprimidos, granulados, líquidos y abrillantadores para uso doméstico e institucional. La composición también puede presentarse en paquetes de dosis unitarios, incluidos aquellos conocidos en la téenica y que son hidrosolubles, insolubles en agua y/o permeables al agua.

En las modalidades en las que los componentes de limpieza y/o detergentes puede que no sean compatibles con la metaloproteasa de la presente invención, se pueden utilizar métodos adecuados para mantener los componentes de limpieza y/o detergentes y la metaloproteasa separados (es decir, que no estén en contacto unos con otros) hasta que la combinación de los dos componentes sea apropiada. Los métodos de separación de este tipo incluyen cualquier método adecuado conocido en la técnica (p. ej., cápsulas de gel, encapsulación, comprimidos y la separación física).

Tal como se ha mencionado, cuando se emplean las metaloproteasas de la invención como un componente de una composición detergente (p. ej., una composición detergente para lavar la ropa o una composición detergente para lavar la vajilla) se pueden incluir en la composición detergente, por ejemplo, en forma de un granulado que no genera polvo, un líquido estabilizado o una enzima protegida. Los granulados que no generan polvo se pueden producir, p. ej., tal como se describe en los documentos US 4.106.991 y 4.661.452 (ambos de Novo Industri A/S) y opcionalmente se pueden recubrir utilizando métodos conocidos en la téenica. Algunos ejemplos de materiales de recubrimiento céreos son los productos de tipo poli(óxido de etileno) (polietilenglicol, PEG) con pesos moleculares medios comprendidos entre 1000 y 20 000; nonilfenoles etoxilados que contienen entre 16 y 50 unidades de óxido de etileno; alcoholes grasos etoxilados en los cuales el alcohol contiene entre 12 y 20 átomos de carbono y los cuales contienen entre 15 y 80 unidades de óxido de etileno; alcoholes grasos; ácidos grasos; y mono-, di- y triglicéridos de ácidos grasos. En el documento GB 1483591 se proporcionan ejemplos de materiales de recubrimiento peliculígenos adecuados para la aplicación mediante técnicas de lecho fluido.

En algunas modalidades, las enzimas empleadas en la presente se estabilizan mediante la presencia de fuentes hidrosolubles de iones de zinc (II), calcio (II) y/o magnesio (II) en las composiciones acabadas que proporcionan iones de este tipo a las enzimas, así como también otros iones metálicos (p. ej., bario (II), escandio (II), hierro (II), manganeso (II), aluminio (III), estaño (II), cobalto (II), cobre (II), níquel (II) y oxovanadio (IV). Las enzimas de las composiciones detergentes de la invención también pueden estabilizarse utilizando agentes estabilizantes convencionales tales como poliol, p. ej., propilenglicol o glicerol, un azúcar o alditol, ácido láctico, y la composición se puede formular tal y como se describe, p. ej., en los documentos WO 92/19709 y WO 92/19708. Las enzimas de la invención también pueden estabilizarse añadiendo inhibidores enzimáticos reversibles, p. ej., del tipo proteico (tal y como se describe en el documento EP 0544 777 Bl) o del tipo ácido borónico. Otros estabilizantes enzimáticos son muy conocidos en la téenica, tales como aldehidos peptídicos e hidrolisados proteicos, p. ej., las metaloproteasas de conformidad con la invención se pueden estabilizar utilizando cetonas o aldehidos peptídicos tal como se describe en los documentos W02005/105826 y W02009/118375.

Las enzimas protegidas para su inclusión en una composición detergente de la invención pueden prepararse, tal como se ha mencionado anteriormente, de conformidad con el método descrito en el documento EP 238216.

Se puede aumentar la composición con uno o más agentes para prevenir o eliminar la formación de la biopelícula. Estos agentes pueden incluir, sin carácter limitante, dispersantes, surfactantes, detergentes, otras enzimas, antimicrobianos y biocidas.

Otras enzimas En una modalidad, una metaloproteasa de la invención se combina con una o más enzimas, tal como al menos dos enzimas, más preferentemente al menos tres, cuatro o cinco enzimas. Preferentemente, las enzimas tienen una especificidad de sustrato diferente, p. ej., actividad proteolítica, actividad amilolítica, actividad lipolítica, actividad hemicelulítica o actividad pectolítica.

El aditivo para detergentes así como la composición detergente puede comprender una o más enzimas tales como una proteasa, lipasa, cutinasa, una amilasa, carbohidrasa, celulasa, pectinasa, mananasa, arabinasa, galactanasa, xilanasa, oxidasa, p. ej., lacasa, y/o peroxidasa.

En general, las propiedades de la enzima o las enzimas seleccionadas deben ser compatibles con el detergente seleccionado (es decir, pH óptimo, compatibilidad con otros ingredientes enzimáticos y no enzimáticos, etc.) y la enzima o las enzimas deben estar presentes en cantidades eficaces.

Celulasas: Las celulasas adecuadas incluyen aquellas de origen animal, vegetal o microbiano. Las celulasas especialmente adecuadas incluyen aquellas de origen bacteriano o fúngico. Se incluyen los mutantes modificados químicamente o con proteínas manipuladas. Las celulasas adecuadas incluyen celulasas de los géneros Bacillus, Pseudomonas, Humicola, Fusarium, Thielavia, Acremonium, p. ej., las celulasas fúngicas producidas por Humicola insolens, Myceliophthora thermophila y Fusarium oxysporum que se describen en US 4,435,307, US 5,648,263, US 5,691,178, US 5,776,757 y WO 89/09259.

Las celulasas especialmente adecuadas son las celulasas alcalinas o neutras que presentan beneficios en cuanto al cuidado del color. Algunos ejemplos de tales celulasas son las celulasas que se describen en los documentos EP 0495 257, EP 0 531 372, WO 96/11262, WO 96/29397 y WO 98/08940. Otros ejemplos son las variantes de celulasas tales como las que se describen en los documentos WO 94/07998, EP 0 531 315, US 5,457,046, US 5,686,593, US 5,763,254, WO 95/24471, WO 98/12307 y WO 1999/001544.

Las celulasas comercializadas incluyen Celluzyme™ y Carezy e™ (Novozymes A/S), Clazinase™ y Puradax HA™ (Genencor International Inc.) y KAC-500(B)™ (Kao Corporation).

Proteasas Las proteasas adecuadas incluyen las de origen bacteriano, fúngico, vegetal, vírico o animal, p. ej., las de origen vegetal o microbiano. Se prefiere el origen microbiano. Se incluyen los mutantes modificados químicamente o con proteínas manipuladas. Puede ser una proteasa alcalina, tal como una serín proteasa o una metaloproteasa. Una serín proteasa puede ser, por ejemplo, de la familia SI, tal como la tripsina, o de la familia S8 tal como la subtilisina. Una proteasa de tipo metaloproteasa puede ser, por ejemplo, una termolisina de, p. ej., la familia M4 u otra metaloproteasa tal como las de las familias M5, M7 o M8.

El término "subtilasas" se refiere a un subgrupo de serín proteasas de conformidad con Siezen et al . , Protein Engng. 4 (1991) 719-737 y Siezen et al . , Protein Science 6 (1997) 501-523. Las serín proteasas son un subgrupo de proteasas caracterizadas por tener una serina en el sitio activo, que forma un aducto covalente con el sustrato. Las subtilasas se pueden dividir en 6 subdivisiones, es decir, la familia de la subtilisina, la familia de la termitasa, la familia de la proteinasa K, la familia de la lantibiótico-peptidasa, la familia de la kexina y la familia de la pirolisina.

Algunos ejemplos de subtilasas son aquellas derivadas de Bacillus tales como Bacillus lentus, B. alkalophilus , B. subtilis , B. amyloliquefaciens, Bacillus pumilus y Bacillus gibsonii descritas en los documentos US7262042 y W009/021867, y subtilisin lentus, subtilisin Novo, subtilisin Carlsberg, Bacillus licheniformis, subtilisin BPN' , subtilisin 309, subtilisin 147 and subtilisin 168 descritas en los documentos WO89/06279 y la proteasa PD138 descrita en el documento (W093/18140). Otras proteasas útiles pueden ser aquellas descritas en los documentos W092/175177, W001/016285, W002/026024 y W002/016547. Algunos ejemplos de proteasas similares a la tripsina son la tripsina (p. ej., de origen porcino o bovino) y la proteasa de Fusarium descrita en los documentos W089/06270, W094/25583 y W005/040372 y las proteasas de quimotripsina derivadas de Cellulomonas descritas en los documentos W005/052161 y W005/052146.

Otra proteasa preferida es la proteasa alcalina de Bacillus lentus DSM 5483, tal como se describe, por ejemplo, en el documento WO 95/23221, y variantes de estas, las cuales se describen en los documentos WO 92/21760, WO 95/23221, EP 1921147 y EP 1921148.

Algunos ejemplos de metaloproteasas son las metaloproteasas neutras tal como se describen en el documento WO07/044993 (Genencor Int.) tal como aquellas derivadas de Bacillus amyloliquefaciens.

Algunos ejemplos de proteasas útiles son las variantes descritas en: los documentos W092/19729, WO96/034946, WO98/20115, WO98/20116, WO99/011768, WOOl/44452, W003/006602, W004/03186, W004/041979, W007/006305, WOll/036263, W011/036264, especialmente las variantes con sustituciones en una o más de las siguientes posiciones: 3, 4, 9, 15, 27, 36, 57, 68, 76, 87, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 101, 102, 103, 104, 106, 118, 120, 123, 128, 129, 130, 160, 167, 170, 194, 195, 199, 205, 206, 217, 218, 222, 224, 232, 235, 236, 245, 248, 252 y 274 utilizando la numeración BRN'. De manera más preferida, las variantes de proteasa pueden comprender las siguientes mutaciones: S3T, V4I, S9R, A15T, K27R, *36D, V68A, N76D, N87S,R, *97E, A98S, S99G,D,A, S99AD, S101G,M,R S103A, V104I,Y,N, S106A, G118V,R, H120D,N, N123S, S128L, P129Q, S130A, G160D, Y167A, R170S, A194P, G195E, V199M, V205I, L217D, N218D, M222S, A232V, K235L, Q236H, Q245R, N252K, T274A (utilizando la numeración BPN').

Las enzimas proteasa comercializadas adecuadas incluyen aquellas que se venden con los nombres comerciales Alcalase®, DuralaseTm, DurazyrnTm, Relase®, Relase® Ultra, Savinase®, Savinase® Ultra, Primase®, Polarzyme®, Kannase®, Liquanase®, Liquanase® Ultra, Ovozyme®, Coronase®, Coronase® Ultra, Neutrase®, Everlase® y Esperase® (Novozymes A/S), aquellas que se venden con los nombres comerciales Maxatase®, Maxacal®, Maxapem®, Purafect®, Purafect Prime®, PreferenzTm, Purafect MA®, Purafect Ox®, Purafect OxP®, Puramax®, Properase®, EffectenzTra, FN2®, FN3® , FN4®, Excellase®, Opticlean® y Optimase® (Danisco/DuPont), Axapem™ (Gist-Brocases N.V.), BLAP (secuencia que se muestra en la Figura 29 del documento US5352604) y variantes de esta (Henkel AG) y KAP ( Bacillus alkalophilus subtilisin) de Kao.

Lipasas: Las 1ipasas adecuadas incluyen aquellas de origen animal, vegetal o microbiano. Las lipasas especialmente adecuadas incluyen aquellas de origen bacteriano o fúngico. Se incluyen los mutantes modificados químicamente o con proteínas manipuladas. Los ejemplos de lipasas útiles incluyen lipasas de Humicola (sinónimo de Thermomyces) , p. ej., de H. lanuginosa (T. lanuginosus) según se describe en EP 258068 y EP 305216 o de H. insolens según se describe en WO 96/13580, una lipasa de Pseudomonas, p. ej,, de P. alcaligenes o P. pseudoalcaligenes (EP 218272), P. cepacia (EP 331376), P. stutzeri (GB 1.372.034), P. fluorescens, Pseudomonas sp. cepa SD 705 (WO 95/06720 y WO 96/27002), P. wisconsinensis (WO 96/12012), una lipasa de Bacillus, p. ej., de B . subtilis (Dartois et al . , 1993, Biochemica et Biophysica Acta, 1131: 253-360), B. stearothermophilus (JP 64/744992) o B. pumilus (WO 91/16422).

Otros ejemplos son variantes de lipasas tales como las que se describen en WO 92/05249, WO 94/01541, EP 407225, EP 260 105, WO 95/35381, WO 96/00292, WO 95/30744, WO 94/25578, WO 95/14783, WO 95/22615, WO 97/04079, WO 97/07202, WO 00/060063.

Las enzimas de tipo lipasa comercializadas preferidas incluyen Lipolase™, Lipolase Ultra™ y Lipex™ (Novozymes A/S).

Amilasas: Las amilasas adecuadas incluyen aquellas de origen animal, vegetal o microbiano. Las amilasas (alfa y/o beta) particularmente adecuadas incluyen aquellas de origen bacteriano o fúngico. Se incluyen los mutantes modificados químicamente o con proteínas manipuladas. Las amilasas incluyen, por ejemplo, alfa-amilasas obtenidas de Bacillus , p. ej ., una cepa especial de Bacillus lichenifor is, descrita con más detalle en GB 1.296.839.

Algunos ejemplos de amilasas útiles son las variantes que se describen en WO 94/02597, WO 94/18314, WO 96/23873 y WO 97/43424, especialmente las variantes con sustituciones en una o más de las siguientes posiciones: 15, 23, 105, 106, 124, 128, 133, 154, 156, 181, 188, 190, 197, 202, 208, 209, 243, 264, 304, 305, 391, 408, y 444.

Algunas amilasas comercializadas son Stainzyme™, Natalase™, Duramyl™, Termamyl™, Fungamyl™ y BAN™ (Novozymes A/S), Rapidase™ y Purastar™ (de Genencor International Inc.).

Peroxidasas/oxidasas: Las peroxidasas/oxidasas adecuadas incluyen aquellas de origen vegetal, bacteriano o fúngico. Se incluyen los mutantes modificados químicamente o con proteínas manipuladas. Los ejemplos de peroxidasas útiles incluyen peroxidasas de CoprinuB, p. ej., de C. cinereus y variantes de estas tales como las que se describen en WO 93/24618, WO 95/10602 y WO 98/15257.

Las peroxidasas comercializadas incluyen Guardzyme™ (Novozymes A/S).

La enzima o las enzimas detergentes se pueden incluir en una composición detergente añadiendo aditivos independientes que contengan una o más enzimas, o añadiendo un aditivo combinado que comprenda todas estas enzimas. Un aditivo para detergentes de la invención, es decir, un aditivo independiente o un aditivo combinado, se puede formular, por ejemplo, como un granulado, líquido, suspensión espesa, etc. Las formulaciones de aditivos para detergentes preferidas son los granulados, en particular los granulados que no generan polvo, tal como se ha descrito anteriormente líquidos, en particular líquidos estabilizados, o suspensiones.

Surfactantes Normalmente, la composición detergente comprende (en peso de la composición) uno o más surfactantes comprendidos en el intervalo entre un 0% y un 50%, preferentemente entre un 2% y un 40%, más preferentemente entre un 5% y un 35%, más preferentemente entre un 7% y un 30%, más preferentemente todavía entre un 10% y un 25% y de la manera más preferida entre un 15% y un 20%. En una modalidad preferida, el detergente es un detergente líquido o en polvo que comprende menos de un 40%, preferentemente menos de un 30%, más preferentemente menos de un 25%, aún más preferentemente menos de un 20% en peso del surfactante. La composición puede comprender entre un 1% y un 15%, preferentemente entre un 2% y un 12%, entre un 3% y un 10%, más preferentemente todavía entre un 4% y un 8%, aún más preferentemente entre un 4% y un 6% de uno o más surfactantes. Los surfactantes preferidos son los surfactantes aniónicos, surfactantes no iónicos, surfactantes catiónicos, surfactantes zwitteriónicos, surfactantes anfoteros y mezclas de estos. Preferentemente, la mayor parte del surfactante es aniónico. Los surfactantes aniónicos adecuados son muy conocidos en la téenica y pueden comprender carboxilatos de ácidos grasos (jabón), alquilsulfatos de cadena ramificada, de cadena lineal y de cadena aleatoria o sulfatos de alcoholes grasos o sulfatos de alcoholes primarios o alquilbencenosulfonatos tales como LAS y LAB o fenilalcanosulfonatos o alquenilsulfonatos o alquenilbencenosulfonatos o alquiletoxisulfatos o sulfatos de éteres de alcoholes grasos o alfa-olefinsulfonato o ácido dodecenil/tetradecenilsuccínico. Los surfactantes aniónicos pueden estar alcoxilados. La composición detergente también puede comprender entre un 1% en peso y un 10% en peso del surfactante no iónico, preferentemente entre un 2% en peso y un 8% en peso, más preferentemente entre un 3% y un 7% en peso, aún más preferentemente menos de un 5% en peso del surfactante no iónico. Los surfactantes no iónicos adecuados son muy conocidos en la técnica y pueden comprender etoxilatos de alcoholes y/o etoxilatos de alquilo y/o etoxilatos de alquilfenol y/o glucamidas tales como las amidas N-glucosílicas o 27-metílicas de ácidos grasos y/o alquilpoliglucósidos y/o mono- o dietanolamidas o amidas de ácidos grasos. La composición detergente también puede comprender entre un 0% en peso y un 10% en peso del surfactante catiónico, preferentemente entre un 0.1% en peso y un 8% en peso, más preferentemente entre un 0.5% y un 7% en peso, aún más preferentemente menos de un 5% en peso del surfactante catiónico. Los surfactantes catiónicos adecuados son muy conocidos en la téenica y pueden comprender compuestos de alquilamonio cuaternario y/o compuestos de alquilpiridinio y/o compuestos de alquilfosfonio cuaternario y/o compuestos de alquilsulfonio terciario. La composición comprende preferentemente un surfactante en una cantidad que proporcione entre 100 ppm y 5000 ppm de surfactante en la solución de lavado durante el proceso de lavado. La composición tras el contacto con el agua forma normalmente una solución de lavado que comprende entre 0.5 g/L y 10 g/L de composición detergente. Se dispone de muchos compuestos con actividad superficial adecuados y estos están descritos en su totalidade en la bibliografía, por ejemplo, en "Surface- Active Agents and Detergents", volúmenes I y 11, de Schwartz, Perry y Berch.

Adyuvantes La función principal del adyuvante es secuestrar iones metálicos divalentes (tales como iones de calcio y de magnesio) en la solución de lavado que de lo contrario interaccionarían negativamente con el sistema surfactante. Los adyuvantes también son eficaces para eliminar iones metálicos y suciedad inorgánica de la superficie de la tela, lo que produce una eliminación mejor de las manchas de bebidas y particuladas. Los adyuvantes también son una fuente de alcalinidad y amortiguan el pH del agua de lavado hasta un nivel de 9.5 a 11. La capacidad amortiguadora también se denomina alcalinidad de reserva y, preferentemente, debería ser superior ¾ 4.

Las composiciones detergentes de la presente invención pueden comprender uno o más sistemas adyuvantes o adyuvantes para detergentes. En la bibliografía se describen muchos sistemas adyuvantes adecuados, por ejemplo, en Powdered Detergents, Surfactant Science series, volumen 71, Marcel Dekker, Inc. El adyuvante puede comprender entre un 0% y un 60%, preferentemente entre un 5% y un 45%, más preferentemente entre un 10% y un 40%, más preferentemente todavía entre un 15% y un 35%, aún más preferentemente entre un 20% y un 30% de adyuvante en peso de la composición en cuestión. La composición puede comprender entre un 0% y un 15%, preferentemente entre un 1% y un 12%, entre un 2% y un 10%, más preferentemente todavía entre un 3% y un 8%, aún más preferentemente entre un 4% y un 6% de adyuvante en peso de la composición en westión.

Los adyuvantes incluyen, sin carácter limitante, metales alcalinos, sales de amonio y alcanolamonio de polifosfatos (p. ej., tripolifosfato STPP), silicatos de metales alcalinos, carbonatos de metales alcalinos y alcalinotérreos, adyuvantes de aluminosilicatos (p. ej., zeolitas) y compuestos de policarboxilatos, éteres de hidroxipolicarboxilatos, copolímeros de anhídrido maleico con etileno o éter metil vinílico, ácido 1,3,5-trihidroxibenceno-2,4,6-trisulfónico y ácido carboximetiloxisuccínico, las diversas sales de metales alcalinos, amonio y de amonio sustituido de ácidos poliacéticos tales como ácido etilendiaminotetraacético y ácido nitrilotriacético, así como también policarboxilatos tales como ácido melítico, ácido succínico, ácido cítrico, ácido oxidisuccínico, ácido polimaleico, ácido benceno-1,3,5-tricarboxílico, ácido carboximetiloxisuccínico y sales solubles de estos. Las etanolaminas (MEA, DEA y TEA) también pueden contribuir a la capacidad amortiguadora en los detergentes líquidos.

Decolorantes Las composiciones detergentes de la presente invención pueden comprender uno o más agentes de decoloración. En particular, los detergentes en polvo pueden comprender uno o más agentes de decoloración. Los agentes de decoloración adecuados incluyen otros fotodecolorantes, perácidos preformados, fuentes de peróxido de hidrógeno, activadores de la decoloración, peróxido de hidrógeno, catalizadores de la decoloración y mezclas de estos. En general, cuando se utiliza un agente de decoloración, las composiciones de la presente invención pueden comprender entre aproximadamente un 0.1% y aproximadamente un 50% o incluso entre un 0.1% y aproximadamente un 25% de agente de decoloración en peso de la composición de limpieza en cuestión. Los ejemplos de agentes de decoloración adecuados incluyen: (1) otros fotodecolorantes, por ejemplo, vitamina K3; (2) perácidos preformados: Los perácidos preformados adecuados incluyen, sin carácter limitante, compuestos seleccionados a partir del grupo constituido por ácidos y sales percarboxílicos, ácidos y sales percarbónicos, ácidos y sales perimídicos, ácidos y sales peroximonosulfúricos, por ejemplo, Oxone y mezclas de estos. Los ácidos percarboxílicos adecuados incluyen perácidos hidrófobos e hidrófilos que tienen la fórmula R-(C=0)0-O-M donde R es un grupo alquilo, opcionalmente ramificado, que contiene, cuando el perácido es hidrófobo, de 6 a 14 átomos de carbono o de 8 a 12 átomos de carbono y, cuando el perácido es hidrófilo, menos de 6 átomos de carbono o incluso menos de 4 átomos de carbono; y M es un contraión, por ejemplo, sodio, potasio o hidrógeno; (3) fuentes de peróxido de hidrógeno, por ejemplo, sales perhidratadas inorgánicas, incluidas las sales de metales alcalinos tales como las sales sódicas de perborato (normalmente mono- o tetrahidratadas), percarbonato, persulfato, perfosfato, persilicato y mezclas de estas. En un aspecto de la invención, las sales perhidratadas inorgánicas se seleccionan a partir del grupo constituido por las sales sódicas de perborato, percarbonato y mezclas de estos. Cuando se emplean las sales perhidratadas inorgánicas, normalmente están presentes en cantidades comprendidas entre un 0.05 y un 40% en peso o entre un 1 y un 30% en peso del total de la composición, y normalmente se incorporan en tales composiciones como un sólido cristalino que puede estar recubierto. Los recubrimientos adecuados incluyen: sales inorgánicas tales como sales de tipo silicato, carbonato o borato de metales alcalinos o mezclas de estas, o materiales orgánicos tales como polímeros dispersables o hidrosolubles, ceras, aceites o jabones grasos. Las composiciones de decoloración útiles se describen en las patentes de los EE. UU. N.os 5,576,282 y 6,306,812; (4) activadores de la decoloración que contienen R-(C=0)-L donde R es un grupo alquilo, opcionalmente ramificado, que contiene, cuando el activador de la decoloración es hidrófobo, de 6 a 14 átomos de carbono o de 8 a 12 átomos de carbono y, cuando el activador de la decoloración es hidrófilo, menos de 6 átomos de carbono o incluso menos de 4 átomos de carbono; y L es un grupo saliente. Algunos ejemplos de grupos salientes adecuados son el ácido benzoico y sus derivados - especialmente el bencenosulfonato. Los activadores de la decoloración adecuados incluyen el dodecanoiloxibencenosulfonato, decanoiloxibencenosulfonato, ácido decanoiloxibenzoico o sales de este, 3 ,5,5-trimetilhexanoiloxibencenosulfonato, tetraacetiletilendiamina (TAED) y nonanoiloxibencenosulfonato (NOBS). En el documento W098/17767 también se describen activadores de la decoloración adecuados. Aunque se puede utilizar cualquier activador de la decoloración adecuado, en un aspecto de la invención, la composición de limpieza en cuestión puede comprender NOBS, TAED o mezclas de estos; y (5) catalizadores de la decoloración que son capaces de aceptar un átomo de oxígeno de un peroxiácido y transferir el átomo de oxígeno a un sustrato oxidable se describen en el documento WO 2008/007319. Los catalizadores de la decoloración adecuados incluyen, sin carácter limitante: cationes y poliiones imínicos; zwitteriones imínicos; aminas modificadas; óxidos de aminas modificadas; N-sulfoniliminas; N-fosfoniliminas; N-aci1iminas; dióxidos de tiadiazol; perfluoroiminas; cetonas de azúcares cíclicos y mezclas de estos. Normalmente, el catalizador de la decoloración estará presente en la composición detergente en un nivel comprendido entre un 0.0005% y un 0.2%, entre un 0.001% y un 0.1% o incluso de un 0.005% a uri 0.05% en peso·.

Cuando está presente, el perácido y/o el activador de la decoloración generalmente está presente en la composición en una cantidad comprendida entre aproximadamente un 0.1 y aproximadamente un 60% en peso, entre aproximadamente un 0.5 y aproximadamente un 40% en peso o incluso entre aproximadamente un 0.6 y aproximadamente un 10% en peso en función de la composición. Se pueden utilizar uno o más perácidos hidrófobos o precursores de estos combinados con uno o más perácidos hidrófilos o precursores de estos.

Las cantidades de la fuente de peróxido de hidrógeno y del perácido o activador de la decoloración se pueden seleccionar de modo que la proporción molar de oxígeno disponible (de la fuente de peróxido) respecto al perácido sea de 1:1 a 35:1 o incluso de 2:1 a 10:1.

Materiales adjuntos Dispersantes: Las composiciones detergentes de la presente invención también pueden contener dispersantes. En particular, los detergentes en polvo pueden comprender dispersantes. Los materiales orgánicos hidrosolubles adecuados incluyen los ácidos homo- o copoliméricos o sus sales, en los cuales el ácido policarboxílico comprende al menos dos radicales carboxilo separados entre sí por no más de dos átomos de carbono. Los dispersantes adecuados se describen, por ejemplo, en Powdered Detergents, Surfactant Science series, volumen 71, Marcel Dekker, Inc.

Agentes inhibidores de la transferencia de tintes: Las composiciones detergentes de la presente invención también pueden incluir uno o más agentes inhibidores de la transferencia de tintes. Los agentes inhibidores de la transferencia de tintes poliméricos adecuados incluyen, sin carácter limitante, polímeros de polivinilpirrolidona, polímeros de 27-óxido de poliamina, copolímeros de N-vinilpirrolidona y N-vinilimidazol, poliviniloxazolidonas y polivinilimidazoles o mezclas de estos. Cuando están presentes en una composición en cuestión, los agentes inhibidores de la transferencia de tintes pueden estar presentes en niveles comprendidos entre aproximadamente un 0.0001 % y aproximadamente un 10%, entre aproximadamente un 0.01% y aproximadamente un 5% o incluso entre aproximadamente un 0.1% y aproximadamente un 3% en peso de la composición.

Agentes blanqueadores fluorescentes - Las composiciones detergentes de la presente invención también contendrán preferentemente componentes adicionales que pueden dar color a los artículos que se están limpiando, tales como agentes blanqueadores fluorescentes o abrillantadores ópticos. En la composición de la presente invención se puede utilizar cualquier agente blanqueador fluorescente adecuado para su uso en una composición detergente para lavar la ropa. Los agentes blanqueadores fluorescentes utilizados más frecuentemente son los que pertenecen a las clases de derivados del ácido diaminoestilbenosulfónico, derivados de diarilpirazolina y derivados de bisfenildiestirilo. Los ejemplos de agentes blanqueadores fluorescentes de tipo derivados del ácido diaminoestilbenosulfónico incluyen las sales sódicas de: 4,4'-bis-(2-dietanolamino-4-anilino-s-triazin-6-ilamino)estilbeno-2,2'-disulfonato, 4,41-bis-(2,4-dianilino-s-triazin-6-ilamino)estilbeno-2.2'-disulfonato, 4,4'-bis-(2-anilino-4(W-metil-i\7-2-hidroxietilamino)-s-triazin-6-ilamino)estilbeno-2,21-disulfonato, 4,4'-bis-(4-fenil-2,1,3-triazol-2-il)estilbeno-2,2'-disulfonato, 4,4'-bis-(2-anilino-4(l-metil-2-hidroxietilamino)-s-triazin-6-ilamino)estilbeno-2,21-disulfonato y 2-(estilbil-4 "-nafto-1.,2':4,5)-1,2,3-trizol-2 "-sulfonato. Los agentes blanqueadores fluorescentes preferidos son Tinopal DMS y Tinopal CBS, que se pueden adquirir de Ciba-Geigy AG, Basilea, Suiza. Tinopal DMS es la sal disódica del 4,4'-bis(2-morfolino-4-anilino-s-triazin-6-ilamino)estilbenodisulfonato. Tinopal CBS es la sal disódica del 2,2'-bis(fenilestiril)disulfonato.

También es un agente blanqueador fluorescente preferido el producto comercializado Parawhite KX, suministrado por Paramount Minerals and Chemicals, Bombay, India.

Otros agentes fluorescentes adecuados para su uso en la invención incluyen las 1-3-diarilpirazolinas y las 7-alquilaminocumarinas.

Los niveles de abrillantadores fluorescentes adecuados incluyen niveles inferiores de aproximadamente un 0.01, de un 0.05, de aproximadamente un 0.1 o incluso de aproximadamente un 0.2% en peso y niveles superiores de un 0.5 o incluso un 0.75% en peso.

Agentes que modifican la tonalidad de las telas Las composiciones detergentes de la presente invención también pueden incluir agentes que modifican la tonalidad de la tela, tales como tintes o pigmentos, los cuales, cuando se formulan en las composiciones detergentes, se pueden depositar sobre una tela cuando la tela se pone en contacto con una solución de lavado que comprenda las composiciones detergentes y de este modo alterar el color de la tela mediante la absorción de la luz visible. Los agentes blanqueadores fluorescentes emiten al menos cierta cantidad de luz visible. En cambio, los agentes que modifican la tonalidad de las telas alteran el color de una superficie, ya que absorben al menos una porción del espectro de la luz visible. Los agentes que modifican la tonalidad de las telas adecuados incluyen tintes y conjugados de tinte-arcilla, y también pueden incluir pigmentos. Los tintes adecuados incluyen tintes que son moléculas de bajo peso molecular y tintes poliméricos. Los tintes que son moléculas de bajo peso molecular adecuados incluyen tintes que son moléculas de bajo peso molecular seleccionados a partir del grupo constituido por los tintes incluidos en las clasificaciones del índice de Color (C.I., por sus sigtas en inglés) de Azul directo, Rojo directo, Violeta directo, Azul ácido, Rojo ácido, Violeta ácido, Azul básico, Rojo básico y Violeta básico, o mezclas de estos, por ejemplo, según se describe en los documentos W02005/03274, W02005/03275, W02005/03276 y EP 1 876 226. La composición detergente comprende preferentemente entre aproximadamente un 0.00003% en peso y aproximadamente un 0.2% en peso, entre aproximadamente un 0.00008% en peso y aproximadamente un 0.05% en peso, o incluso entre aproximadamente un 0.0001% en peso y aproximadamente un 0.04% en peso del agente que modifica la tonalidad de las telas. La composición puede comprender entre un 0.0001% en peso y un 0.2% en peso de un agente que modifica la tonalidad de las telas, esto puede preferirse especialmente cuando la composición esté en forma de bolsitas de dosis unitaria.

Polímeros que liberan la suciedad - Las composiciones detergentes de la presente invención también pueden incluir uno o más polímeros que liberan la suciedad, los cuales facilitan la eliminación de la suciedad de telas tales como telas de base de algodón y poliestirénica, en particular la eliminación de suciedad hidrófoba de telas de base poliestirénica. Los polímeros que liberan la suciedad pueden ser, por ejemplo, polímeros de base tereftálica aniónicos o no iónicos, polivinilcaprolactama y copolímeros relacionados, copolímeros vinílicos de injerto, poliéster poliamidas, remítase, por ejemplo, al Capítulo 7 en Powdered Detergents, Surfactant Science series, volumen 71, Marcel Dekker, Inc. Otro tipo de polímeros para liberar la suciedad son los polímeros que limpian la grasa alcoxilados anfifílicos, los cuales comprenden una estructura central y una pluralidad de grupos alcoxilato unidos a esa estructura central. La estructura central puede comprender una estructura de tipo polialquilenimina o una estructura de tipo polialcanolamina, según se describe detalladamente en el documento WO 2009/087523. Además, los copolímeros de injerto aleatorio son polímeros para liberar la suciedad adecuados. En los documentos WO 2007/138054, WO 2006/108856 y WO 2006/113314 se describen detalladamente copolímeros de injerto adecuados. Otros polímeros para liberar la suciedad son estructuras de polisacáridos sustituidos, especialmente estructuras celulósicas sustituidas tales como derivados de celulosa modificados tales como los que se describen en los documentos EP 1 867 808 o WO 2003/040279. Los polímeros celulósicos adecuados incluyen celulosa, éteres de celulosa, ásteres de celulosa, amidas de celulosa y mezclas de estos. Los polímeros celulósicos adecuados incluyen celulosa modificada aniónicamente, celulosa modificada no iónicamente, celulosa modificada catiónicamente, celulosa modificada zwiteriónicamente y mezclas de estas. Los polímeros celulósicos adecuados incluyen metilcelulosa, carboximetilcelulosa, etilcelulosa, hidroxiletilcelulosa, hidroxilpropilmetilcelulosa, éster de carboximetilcelulosa y mezclas de estas.

Agentes contra la redeposición - Las composiciones detergentes de la presente invención también pueden incluir uno o más agentes contra la redeposición tales como carboximetilcelulosa (CMC), alcohol polivinílico (PVA), polivinilpirrolidona (PVP), polioxietileno y/o polietilenglicol (PEG), homopolímeros de ácido acrílico, copolímeros de ácido acrílico y ácido maleico, y polietileniminas etoxiladas. Los polímeros de base celulósica descritos en los polímeros para liberar la suciedad anteriores también pueden actuar como agentes contra la redeposición.

Otros materiales adjuntos adecuados incluyen, sin carácter limitante, agentes antiencogimiento, agentes antiarrugas, bactericidas, aglutinantes, portadores, tintes, estabilizantes enzimáticos, suavizantes para telas, materiales de relleno, reguladores de la espuma, hidrótropos, perfumes, pigmentos, supresores de la espuma de jabones, disolventes, estructurantes para detergentes líquidos y/o agentes que confieren elasticidad a la estructura.

En un aspecto, el detergente es una composición detergente para lavar la ropa fluida compacta que comprende: a) al menos aproximadamente un 10%, preferentemente entre un 20 y un 80% en peso de la composición, del surfactante seleccionado entre surfactantes aniónicos, surfactantes no iónicos, jabón y mezclas de estos; b) entre aproximadamente un 1% y aproximadamente un 30%, preferentemente entre un 5 y un 30% en peso de la composición de agua; c) entre aproximadamente un 1% y aproximadamente un 15%, preferentemente entre un 3 y un 10% en peso de la composición del disolvente que no tiene funcionalidad amino; y d) entre aproximadamente un 5% y aproximadamente un 20% en peso de la composición de un aditivo para el rendimiento seleccionado entre quelantes, polímeros para liberar la suciedad, enzimas y mezclas de estos; donde la composición detergente para lavar la ropa compacta fluida comprende al menos uno de los siguientes: (i) el surfactante tiene una relación ponderal del surfactante aniónico respecto al surfactante no iónico comprendida entre aproximadamente 1.5:1 y aproximadamente 5:1, el surfactante comprende entre aproximadamente un 15% y aproximadamente un 40% en peso de la composición del surfactante aniónico y comprende entre aproximadamente un 5% y aproximadamente un 40% en peso de la composición del jabón; (ii) entre aproximadamente un 0.1% y aproximadamente un 10% en peso de la composición del potenciador de la espuma de jabones seleccionado entre polímeros potenciadores de la espuma de jabones, surfactantes catiónicos, surfactantes zwitteriónicos, surfactantes de óxido de amina, surfactantes anfoteros y mezclas de estos; y (ii) tanto (i) como (ii). Todos los ingredientes se describen en el documento WO 2007/130562. En el documento WO 2007/149806 se describen más polímeros útiles en formulaciones detergentes.

En otro aspecto, el detergente es un detergente (en polvo) granulado compacto que comprende a) al menos aproximadamente un 10%, preferentemente entre un 15 y un 60% en peso de la composición, de un surfactante seleccionado entre surfactantes aniónicos, surfactantes no iónicos, jabón y mezclas de estos; b) entre aproximadamente un 10 y un 80% en peso de la composición de un adyuvante, preferentemente entre un 20% y un 60% donde el adyuvante puede ser una mezcla de adyuvantes seleccionados entre i) un adyuvante de fosfato, preferentemente menos de un 20%, más preferentemente menos de un 10%, aún más preferentemente menos de un 5% del adyuvante total es un adyuvante de fosfato; ii) un adyuvante de zeolita, preferen emente menos de un 20%, más preferentemente menos de un 10%, más preferentemente todavía menos de un 5% del adyuvante total es un adyuvante de zeolita; iii) citrato, preferentemente de un 0 a un 5% del adyuvante total es un adyuvante de citrato; iv) policarboxilato, preferentemente de un 0 a un 5% del adyuvante total es un adyuvante de policarboxilato v) carbonato, preferentemente de un 0 a un 30% del adyuvante total es un adyuvante de carbonato y vi) silicatos de sodio, preferentemente de un 0 a un 20% del adyuvante total es un adyuvante de silicato de sodio; c) entre aproximadamente un 0% y un 25% en peso de la composición, de materiales de relleno tales como sales de sulfato, preferentemente entre un 1% y un 15%, más preferentemente entre un 2% y un 10%, más preferentemente entre un 3% y un 5% en peso de la composición, de materiales de relleno; y d) entre aproximadamente un 0.1% y un 20% en peso de la composición de enzimas, preferentemente entre un 1% y un 15%, más preferentemente entre un 2% y un 10% en peso de la composición de enzimas.

Uso de metaloproteasas en detergentes La suciedad y las manchas que son importantes para los fabricantes de detergentes están compuestas de muchas sustancias diferentes, y se ha desarrollado una gama de diferentes enzimas, todas con especificidades de sustratos diferentes para su uso en detergentes tanto en relación con el lavado de la ropa como con lá limpieza de superficies duras, tal como el lavado de la vajilla. Se considera que estas enzimas proporcionan un beneficio de detergencia enzimática, ya que mejoran específicamente la eliminación de manchas en el proceso de limpieza en el que se aplican en comparación con el mismo proceso sin enzimas. Las enzimas que eliminan manchas conocidas en la téenica incluyen enzimas tales como carbohidrasas, amilasas, proteasas, lipasas, celulasas, hemicelulasas, xilanasas, cutinasas y pectinasas.

En un aspecto, la presente invención trata sobre el uso de metaloproteasas de la invención en las composiciones detergentes y procesos de limpieza, tales como lavado de ropa y limpieza de superficies duras. Por lo tanto, en un aspecto, la presente invención demuestra el efecto de detergencia de las metaloproteasas de la invención sobre diferentes manchas y en diferentes condiciones. En un aspecto particular de la invención, la composición detergente y el uso en procesos de limpieza tratan sobre el uso de una metaloproteasa de la invención junto con al menos una de las enzimas que eliminan manchas mencionadas anteriormente, tal como otra proteasa y, en particular, una serín proteasa.

En un aspecto preferido de la presente invención, las metaloproteasas de la invención útiles de conformidad con la invención se pueden combinar con al menos dos enzimas. Estas enzimas adicionales se describen en detalle en la sección "otras enzimas", más preferentemente al menos tres, cuatro o cinco enzimas. Preferentemente, las enzimas tienen una especificidad de sustrato diferente, p. ej., actividad carbolítica, actividad proteolítica, actividad amilolítica, actividad lipolítica, actividad hemicelulítica o actividad pectolítica. La combinación de enzimas puede ser, por ejemplo, una metaloproteasa de la invención con otra enzima que elimina manchas, p. ej., una metaloproteasa de la invención y una proteasa, una metaloproteasa de la invención y una amilasa, una metaloproteasa de la invención y una celulasa, una metaloproteasa de la invención y una hemicelulasa, una metaloproteasa de la invención y una lipasa, una metaloproteasa de la invención y una cutinasa, una metaloproteasa de la invención y una pectinasa o una metaloproteasa de la invención y una enzima contra la redeposición. Más preferentemente, la metaloproteasa de la invención se combina con al menos otras dos enzimas que eliminan manchas, p. ej., una metaloproteasa de la invención, una lipasa y una amilasa; o una metaloproteasa de la invención, una proteasa y una amilasa; o una metaloproteasa de la invención, una proteasa y una lipasa; o una metaloproteasa de la invención, una proteasa y una pectinasa; o una metaloproteasa de la invención, una proteasa y una celulasa; o una metaloproteasa de la invención una proteasa y una hemicelulasa; o una metaloproteasa de la invención, una proteasa y una cutinasa; o una metaloproteasa de la invención una amilasa y una pectinasa; o una metaloproteasa de la invención, una amilasa y una cutinasa; o una metaloproteasa de la invención, una amilasa y una celulasa; o una metaloproteasa de la invención, una amilasa y una hemicelulasa; o una metaloproteasa de la invención, una lipasa y una pectinasa; o una metaloproteasa de la invención, una lipasa y una cutinasa; o una metaloproteasa de la invención, una lipasa y una celulasa; o una metaloproteasa de la invención, una lipasa y una hemicelulasa. Aún más preferentemente, las metaloproteasas de la invención se pueden combinar con al menos otras tres enzimas que eliminan manchas, p. ej., una metaloproteasa de la invención, una proteasa una lipasa y una amilasa; o una metaloproteasa de la invención, una proteasa, una amilasa y una pectinasa; o una metaloproteasa de la invención, una proteasa, una amilasa y una cutinasa; o una metaloproteasa de la invención, una proteasa, una amilasa y una celulasa; o una metaloproteasa de la invención, una proteasa, una amilasa y una hemicelulasa; o una metaloproteasa de la invención, una amilasa, una lipasa y una pectinasa; o una metaloproteasa de la invención, una amilasa, una lipasa y una cutinasa; o una metaloproteasa de la invención, una amilasa, una lipasa y una celulasa; o una metaloproteasa de la invención, una amilasa, una lipasa y una hemicelulasa; o una metaloproteasa de la invención, una proteasa, una lipasa y una pectinasa; o una metaloproteasa de la invención, una proteasa, una lipasa y una cutinasa; o una metaloproteasa de la invención, una proteasa, una lipasa y una celulasa; o una metaloproteasa de la invención, una proteasa, una lipasa y una hemicelulasa. Una metaloproteasa de conformidad con la presente invención se puede combinar con cualquiera de las enzimas seleccionadas a partir de la lista no exhaustiva que comprende: carbohidrasas, tales como una amilasa, una hemicelulasa, una pectinasa, una celulasa, una xantanasa o una pululanasa, una peptidasa, una proteasa o una lipasa.

En una modalidad preferida, una metaloproteasa de la invención se combina con una serín proteasa, p. ej., una proteasa de la familia S8 tal como Savinase®.

En otra modalidad de la presente invención, una metaloproteasa de la invención útil de conformidad con al presente invención se puede combinar con una o más metaloproteasas diferentes, tales como otra metaloproteasa M4, incluidas la Neutrase® o termolisina. Tales combinaciones pueden comprender además combinaciones de otras enzimas detergentes según se ha expuesto anteriormente.

El proceso de limpieza o el proceso de cuidado de artículos textiles puede ser, por ejemplo, un proceso para lavar la ropa, un proceso para lavar la vajilla o para limpiar superficies duras tales como azulejos de baño, suelos, superficies de mesas, desagües, fregaderos o lavabos. Los procesos para lavar la ropa pueden ser, por ejemplo, de lavado doméstico pero pueden ser también de lavado industrial.Además, la invención se refiere a un proceso para lavar telas y/o prendas donde el proceso comprende tratar las telas con una solución de lavado que contiene una composición detergente y al menos una metaloproteasa de la invención. El proceso de limpieza o un proceso de cuidado de artículos textiles se puede llevar a cabo, por ejemplo, en un proceso de lavado a máquina o en un proceso de lavado a mano. La solución de lavado puede ser, por ejemplo, una solución de lavado acuosa que contiene una composición detergente.

Las telas y/o prendas sujetas a un proceso de lavado, de limpieza o de cuidado de artículos textiles de la presente invención pueden ser ropa que se pueda lavar de manera convencional, por ejemplo, ropa doméstica. Preferentemente, la mayor parte de la ropa está constituida por prendas y telas, que incluyen artículos de punto, tejidos, vaqueros, no tejidos, fieltros, hilos y toallas. Las telas pueden tener una base celulósica, tal como materiales celulósicos naturales, que incluyen algodón, fibra de lino, tejido de lino, yute, ramio. sisal o fibra de coco, o materiales celulósicos hechos por el hombre (p. ej., que se han originado a partir de pulpa de madera), que incluyen viscosa/rayón, ramio, fibras de acetato de celulosa (tricell), lyocell o mezclas de estos. Las telas también pueden tener una base no celulósica tal como poliamidas naturales, que incluyen lana, camello, cachemir, angora, conejo y seda, o un polímero sintético tal como nailon, aramida, poliéster, acrílico, polipropileno y espandex/elastano o mezclas de estos, así como también una mezcla de fibras de base celulósica y de base no celulósica. Algunos ejemplos de mezclas son mezclas de algodón y/o rayón/viscosa con uno o más materiales que los acompañan, tales como lana, fibras sintéticas (p. ej., fibras de poliamida, fibras acrílicas, fibras de poliéster, fibras de alcohol polivinílico, fibras de cloruro polivinílico, fibras de poliuretano, fibras de poliurea, fibras de aramida) y fibras que contienen celulosa (p. ej., rayón/viscosa, ramio, fibra de lino, tejido de lino, yute, fibras de acetato de celulosa, lyocell).

En los últimos años se ha generado un interés cada vez mayor por reemplazar componentes en los detergentes que derivan de productos petroquímicos con componentes biológicos renovables tales como enzimas y polipéptidos, sin que se comprometa el rendimiento de lavado. Cuando los componentes de las composiciones detergentes cambian, se necesitan nuevas actividades enzimáticas o nuevas enzimas que tengan propiedades alternativas y/o mejoradas en comparación con las enzimas detergentes utilizadas normalmente, tales como proteasas, lipasas y amilasas, para conseguir un rendimiento de lavado similar o mejorado en comparación con las composiciones detergentes tradicionales.

La invención además se refiere a la utilización de metaloproteasas de la invención en un proceso de eliminación de manchas proteináceas. Las manchas proteináceas pueden ser manchas tales como manchas de comida, p. ej., comida para bebés, sebo, cacao, huevo, sangre, leche, tinta, césped o una combinación de estos.

Las composiciones detergentes típicas incluyen varios componentes además de las enzimas, estos componentes tienen diferentes efectos, algunos componentes como los surfactantes disminuyen la tensión superficial en el detergente, lo cual permite que la mancha que se está limpiando se separe y disperse y a continuación sea eliminada, otros componentes como los sistemas de decoloración eliminan la coloración a menudo por oxidación y muchos decolorantes también tienen potentes propiedades bactericidas, y se utilizan para desinfectar y esterilizar. Sin embargo, otros componentes como los adyuvantes y quedantes ablandan el agua de lavado, p. ej., eliminando iones metálicos del líquido.

En una modalidad particular, la invención se refiere al uso de una composición que comprende una metaloproteasa de la invención, donde la composición enzimática comprende además al menos uno o más de los siguientes elementos: un surfactante, un adyuvante, un que1ante o un agente que1ante, un sistema de decoloración o componente de decoloración, para lavar la ropa o lavar la vajilla.

En una modalidad preferida de la invención, se reduce la cantidad del surfactante, adyuvante, quelante o agente quelante, sistema de decoloración y/o componente de decoloración en comparación con la cantidad de surfactante, adyuvante, quelante o agente quelante, sistema de decoloración y/o componente de decoloración utilizados sin la metaloproteasa añadida de la invención. Preferentemente, el componentes o los componente que son un surfactante, un adyuvante, un quelante o agente quelante, un sistema de decoloración y/o un componente de decoloración, están presentes en una cantidad que es un 1% inferior, tal como un 2% inferior, tal como un 3% inferior, tal como un 4% inferior, tal como un 5% inferior, tal como un 6% inferior, tal como un 7% inferior, tal como un 8% inferior, tal como un 9% inferior, tal como un 10% inferior, tal como un 15% inferior, tal como un 20% inferior, tal como un 25% inferior, tal como un 30% inferior, tal como un 35% inferior, tal como un 40% inferior, tal como un 45% inferior, tal como un 50% inferior a la cantidad del componente en el sistema sin la adición de la metaloproteasa de la invención, tal como una cantidad convencional de elcomponente. En un aspecto, la metaloproteasa de la invención se utiliza en composiciones detergentes donde la composición está exenta de al menos un componente, el cual es un surfactante, un adyuvante, un quelante o un agente guelante, un sistema de decoloración o un componente de decoloración y/o un polímero.

Método de lavado Las composiciones detergentes de la presente invención son ideales para su uso en aplicaciones para lavar la ropa. Por consiguiente, la presente invención incluye un método para lavar una tela. El método comprende los pasos de poner en contacto la tela que se ha de lavar con una solución de limpieza de la ropa que comprende la composición detergente de conformidad con la invención. La tela puede comprender cualquier tela que se pueda lavar en condiciones de uso normales para el usuario. La solución tiene preferentemente un pH de aproximadamente 5.5 a aproximadamente 8. Las composiciones se pueden emplear con concentraciones de aproximadamente 100 ppm, preferentemente de 500 ppm a aproximadamente 15000 ppm en solución. La temperatura del agua estará comprendida normalmente en el intervalo de aproximadamente 5 °C a aproximadamente 90 °C, incluidos aproximadamente 10 °C, aproximadamente 15 °C, aproximadamente 20 °C, aproximadamente 25 °C, aproximadamente 30 °C, aproximadamente 35 °C, aproximadamente 40 °C, aproximadamente 45 °C, aproximadamente 50 °C, aproximadamente 55 C, aproximadamente 60 °C, aproximadamente 65 °C, aproximadamente 70 °C, aproximadamente 75. °C, aproximadamente 80 °C, aproximadamente 85 °C y aproximadamente 90 °C. La relación del agua respecto a la tela está comprendida normalmente entre aproximadamente 1:1 y aproximadamente 30:1.

En modalidades particulares, el método de lavado se lleva a cabo a un pH de aproximadamente 5.0 a aproximadamente 11.5, o en modalidades alternativas incluso de aproximadamente 6 a aproximadamente 10.5, tal como de aproximadamente 5 a aproximadamente 11, de aproximadamente 5 a aproximadamente 10, de aproximadamente 5 a aproximadamente 9, de aproximadamente 5 a aproximadamente 8, de aproximadamente 5 a aproximadamente 7, de aproximadamente 5.5a aproximadamente 11, de aproximadamente 5.5 a aproximadamente 10, de aproximadamente 5.5 a aproximadamente 9, de aproximadamente 5.5 a aproximadamente 8, de aproximadamente 5.5 a aproximadamente 7, de aproximadamente 6 a aproximadamente 11, de aproximadamente 6 a aproximadamente 10, de aproximadamente 6 a aproximadamente 9, de aproximadamente 6 a aproximadamente 8, de aproximadamente 6 a aproximadamente 7, de aproximadamente 6.5 a aproximadamente 11, de aproximadamente 6.5 a aproximadamente 10, de aproximadamente 6.5 a aproximadamente 9, de aproximadamente 6.5 a aproximadamente 8, de aproximadamente 6.5 a aproximadamente 7, de aproximadamente 7 a aproximadamente 11, de aproximadamente 7 a aproximadamente 10, de aproximadamente 7 a aproximadamente 9 o de aproximadamente ' a aproximadamente 8, preferentemente de aproximadamente 5.5 a aproximadamente 9 y más preferentemente de aproximadamente 6 a aproximadamente En modalidades particulares, el método de lavado se lleva a cabo con un grado de dureza de aproximadamente 0 °dH a aproximadamente 30 °dH, tal como de aproximadamente 1 °dH, aproximadamente 2 °dH, aproximadamente 3 °dH, aproximadamente 4 °dH, aproximadamente 5 °dH, aproximadamente 6 °dH, aproximadamente 7 °dH, aproximadamente 8 °dH, aproximadamente 9 °dH, aproximadamente 10 °dH, aproximadamente 11 °dH, aproximadamente 12 °dH, aproximadamente 13 °dH, aproximadamente 14 °dH, aproximadamente 15 °dH, aproximadamente 16 °dH, aproximadamente 17 °dH, aproximadamente 18 °dH, aproximadamente 19 °dH, aproximadamente 20 °dH, aproximadamente 21 °dH, aproximadamente 22 °dH, aproximadamente 23 °dH, aproximadamente 24 °dH, aproximadamente 25 °dH, aproximadamente 26 °dH, aproximadamente 27 °dH, aproximadamente 28 °dH, aproximadamente 29 ’dH y aproximadamente 30 °dH. En condiciones de lavado europeas típicas, el grado de dureza es de aproximadamente 15 °dH, en condiciones de lavado de EE. UU. típicas, de aproximadamente 6 °dH y en condiciones de lavado asiáticas típicas, de aproximadamente 3 °dH.

La presente invención se refiere a un método para limpiar una tela, vajilla o una superficie dura con una composición detergente que comprende una metaloproteasa de la invención.

Una modalidad preferida trata sobre un método de limpieza, donde elmétodo comprende los siguientes pasos: poner en contacto un objeto con una composición de limpieza que comprende una metaloproteasa de la invención en condiciones adecuadas para limpiar elobjeto. En una modalidad preferida, la composición de limpieza es una composición detergente y el proceso es un proceso para lavar la ropa o lavar la vajilla.

Otra modalidad más se refiere a un método para eliminar manchas de una tela que comprende poner en contacto la tela con una composición que comprende una metaloproteasa de la invención en condiciones adecuadas para limpiar elobjeto.

En una modalidad preferida, las composiciones para su uso en los métodos anteriores comprenden además al menos una enzima adicional según se ha expuesto en la sección "otras enzimas" anteriormente, tal como una enzima seleccionada a partir del grupo constituido por carbohidrasas, peptidasas, proteasas, lipasas, celulasa, xilanasas o cutinasas o una combinación de estas. En otra modalidad preferida más, las composiciones comprenden una cantidad reducida de al menos uno o más de los siguientes componentes: un surfactante, un adyuvante, un quelante o agente quelante, un sistema de decoloración o componente de decoloración o un polímero.

También se contemplan composiciones y métodos para tratar telas (p. ej., para desaprestar un artículo textil) utilizando una o más metaloproteasas de la invención. Las metaloproteasas se puede utilizar en cualquier método de tratamiento de telas que sea de uso común en la téenica (remítase, p. ej., a la patente de los EE. UU. N.° 6,077,316). Por ejemplo, en un aspecto, el tacto y apariencia de una tela se mejoran mediante un método que comprende poner en contacto la tela con una metaloproteasa en una solución. En un aspecto, la tela se trata con la solución a presión.

Usos a temperatura baja Una modalidad de la invención trata sobre un método para lavar la ropa, lavar la vajilla o de limpieza industrial que comprende poner en contacto la superficie que se va a limpiar con las metaloproteasas de la invención, y donde ellavado de la ropa, lavado de la vajilla, limpieza institucional o industrial se lleva a cabo a una temperatura de aproximadamente 40 °C o inferior. Una modalidad de la invención se refiere al uso de una metaloproteasa en un proceso para lavar la ropa, lavar la vajilla o de limpieza, donde la temperatura al lavar la ropa, lavar la vajilla o la limpieza industrial es de aproximadamente 40 °C o inferior.

En otra modalidad, la invención trata sobre el uso de una metaloproteasa de conformidad con la invención en un proceso para eliminar proteínas, donde la temperatura en el proceso para eliminar proteínas es de aproximadamente 40 °C o inferior .

La presente invención también se refiere al uso en un proceso para lavar la ropa, lavar la vaj illa o realizar una limpieza industrial de una metaloproteasa que tiene al menos una propiedad mejorada en comparación con una metaloproteasa comercial tal como Neutrase® y donde la temperatura en el proceso para lavar la ropa, lavar la vajilla o realizar una limpieza es a una temperatura de aproximadamente 40 °C o inferior.

En cada uno de los métodos y usos identificados anteriormente, la temperatura de lavado es de aproximadamente 40 °C o inferior, tal como aproximadamente 39 °C o inferior, tal como aproximadamente 38 °C o inferior, tal co o aproximadamente 37 °C o inferior, tal como aproximadamente 36 °C o inferior, tal como aproximadamente 35 °C o inferior, tal como aproximadamente 34 °C o inferior, tal como aproximadamente 33 °C o inferior, tal como aproximadamente 32 °C o inferior, tal como aproximadamente 31 °C o inferior, tal como aproximadamente 30 °C o inferior, tal como aproximadamente 29 °C o inferior, tal como aproximadamente 28 °C o inferior, tal como aproximadamente 27 °C o inferior, tal como aproximadamente 26 °C o inferior, tal como aproximadamente 25 °C o inferior, tal como aproximadamente 24 °C o inferior, tal como aproximadamente 23 °C o inferior, tal como aproximadamente 22 °C o inferior, tal como aproximadamente 21 °C o inferior, tal como aproximadamente 20 °C o inferior, tal como aproximadamente 19 °C o inferior, tal como aproximadamente 18 °C o inferior, tal como aproximadamente 17 °C o inferior, tal como aproximadamente 16 °C o inferior, tal como aproximadamente 15 °C o inferior, tal como aproximadamente 14 °C o inferior, tal como aproximadamente 13 °C o inferior, tal como aproximadamente 12 °C o inferior, tal como aproximadamente 11 °C o inferior, tal como aproximadamente 10 °C o inferior, tal como aproximadamente 9 °C o inferior, tal como aproximadamente 8 “C o inferior, tal como aproximadamente 7 °C o inferior, tal como aproximadamente 6 °C o inferior, tal como aproximadamente 5 °C o inferior, tal como aproximadamente 4 °C o inferior, tal como aproximadamente 3 °C o inferior, tal como aproximadamente 2 °C o inferior o tal como aproximadamente 1 °C o inferior.

En otra modalidad preferida, la temperatura de lavado está comprendida en el intervalo de aproximadamente 5-40 °C, tal como aproximadamente 5-30 °C, aproximadamente 5-20 °C, aproximadamente 5-10 °C, aproximadamente 10-40 °C, aproximadamente 10-30 °C, aproximadamente 10-20 °C, aproximadamente 15-40 °C, aproximadamente 15-30 °C, aproximadamente 15-20 °C, aproximadamente 20-40 °C, aproximadamente 20-30 °C, aproximadamente 25-40 °C, aproximadamente 25-30 °C o aproximadamente 30-40 °C. En una modalidad particularmente preferida, la temperatura de lavado es de aproximadamente 30 °C.

En modalidades particulares, el método de lavado a baja temperatura se lleva a cabo a un pH de aproximadamente 5.0 a aproximadamente 11.5, o en modalidades alternativas incluso de aproximadamente 6 a aproximadamente 10.5, tal como de aproximadamente 5 a aproximadamente 11, de aproximadamente 5 a aproximadamente 10, de aproximadamente 5 a aproximadamente 9, de aproximadamente 5 a aproximadamente 8, de aproximadamente 5 a aproximadamente 7, de aproximadamente 5.5 a aproximadamente 11, de aproximadamente 5.5 a aproximadamente 10, de aproximadamente 5.5 a aproximadamente 9, de aproximadamente 5.5 a aproximadamente 8, de aproximadamente 5.5 a aproximadamente 7, de aproximadamente 6 a aproximadamente 11, de aproximadamente 6 a aproximadamente 10, de aproximadamente 6 a aproximadamente 9, de aproximadamente 6 a aproximadamente 8, de aproximadamente 6 a aproximadamente 7, de aproximadamente 6.5 a aproximadamente 11, de aproximadamente 6.5 a aproximadamente 10, de aproximadamente 6.5 a aproximadamente 9, de aproximadamente 6.5 a aproximadamente 8, de aproximadamente 6.5 a aproximadamente 7, de aproximadamente 7 a aproximadamente 11, de aproximadamente 7 a aproximadamente 10, de aproximadamente 7 a aproximadamente 9 o de aproximadamente 7 a aproximadamente 8, preferentemente de aproximadamente 5.5 a aproximadamente 9 y más preferentemente de aproximadamente 6 a aproximadamente 8.

En modalidades particulares, el método de lavado a baja temperatura se lleva a cabo con un grado de dureza de aproximadamente 0 °dH a aproximadamente 30 °dH, tal como de aproximadamente 1 °dH, aproximadamente 2 °dH, aproximadamente 3 °dH, aproximadamente 4 °dH, aproximadamente 5 °dH, aproximadamente 6 °dH, aproximadamente 7 °dH, aproximadamente 8 °dH, aproximadamente 9 °dH, aproximadamente 10 °dH, aproximadamente 11 °dH, aproximadamente 12 °dH, aproximadamente 13 °dH, aproximadamente 14 °dH, aproximadamente 15 °dH, aproximadamente 16 °dH, aproximadamente 17 °dH, aproximadamente 18 °dH, aproximadamente 19 °dH, aproximadamente 20 °dH, aproximadamente 21 °dH, aproximadamente 22 °dH, aproximadamente 23 °dH, aproximadamente 24 °dH, aproximadamente 25 0dH, aproximadamente 26 °dH, aproximadamente 27 °dH, aproximadamente 28 °dH, aproximadamente 29 °dH y aproximadamente 30 °dH. En condiciones de lavado europeas típicas, el grado de dureza es de aproximadamente 15 °dH, en condiciones de lavado de EE. UU. típicas, de aproximadamente 6 °dH y en condiciones de lavado asiáticas típicas, de aproximadamente 3 °dH.

Utilización para eliminar manchas de huevo Otra modalidad particular de la invención trata sobre la eliminación de manchas de huevo. Estos tipos de manchas a menudo son muy difíciles de eliminar completamente. Las manchas de huevo son especialmente problemáticas en la limpieza de superficies duras tales como el lavado de la vajilla donde a menudo las manchas permanecen en los platos y la cubertería tras el lavado. Las metaloproteasas de la invención son particularmente adecuadas para eliminar manchas de huevo.

Por lo tanto, la invención trata además sobre métodos para eliminar manchas de huevo de artículos textiles, telas y/o superficies duras tales como la vajilla y cubertería, en particular, de telas y artículos textiles. Un aspecto preferido de la invención trata sobre un método para eliminar manchas de huevo de artículos textiles y/o telas que comprende poner en contacto una superficie de la que es necesario eliminar una mancha de huevo con una metaloproteasa de la invención. En una modalidad, la invención comprende un método para eliminar manchas de huevo de artículos textiles y/o telas que comprende poner en contacto una superficie de la que es necesario eliminar una mancha de huevo con una composición detergente que comprende una metaloproteasa de la invención. La invención también trata sobre un método para eliminar manchas de huevo que comprende añadir una metaloproteasa de la invención a un proceso de lavado y/o de lavado de la ropa donde los artículos textiles y/o telas comprenden diversas manchas de huevo.

Una modalidad de la presente invención se refiere a un método para eliminar manchas de huevo de una superficie dura o de la ropa, donde el método comprende poner en contacto la superficie dura que contiene la mancha de huevo o la ropa que contiene la mancha de huevo con una composición detergente o de limpieza, preferentemente una composición para lavar la ropa o lavar la vajilla, que contiene una metaloproteasa de la invención.

Otra modalidad se refiere a un método para eliminar manchas de huevo de una tela o artículo textil que comprende poner en contacto la tela o artículo textil con una composición detergente o de limpieza, preferentemente una composición para lavar la ropa o lavar la vajilla, que comprende una metaloproteasa de la invención.

Una modalidad adicional más se refiere a un método para eliminar manchas de huevo de una tela o artículo textil que comprende poner en contacto la tela o artículo textil con una composición que comprende una metaloproteasa de la invención, donde la composición además comprende al menos una enzima adicional tal y como se expone en la sección anterior "otras enzimas", tal como una enzima seleccionada a partir del grupo constituido por una carbohidrasa, una peptidasa, una proteasa, una lipasa, una celulasa, una xilanasa, una cutinasa o una combinación de estas.

En modalidades particulares, el método para eliminar huevo se lleva a cabo a un pH de aproximadamente 5.0 a aproximadamente 11.5, o en modalidades alternativas incluso de aproximadamente 6 a aproximadamente 10.5, tal como de aproximadamente 5 a aproximadamente 11, de aproximadamente 5 a aproximadamente 10, de aproximadamente 5 a aproximadamente 9, de aproximadamente 5 a aproximadamente 8, de aproximadamente 5 a aproximadamente 7, de aproximadamente 5.5a aproximadamente 11, de aproximadamente 5.5 a aproximadamente 10, de aproximadamente 5.5 a aproximadamente 9, de aproximadamente 5.5a aproximadamente 8, de aproximadamente 5.5a aproximadamente 7, de aproximadamente 6 a aproximadamente 11, de aproximadamente 6 a aproximadamente 10, de aproximadamente 6 a aproximadamente 9, de aproximadamente 6 a aproximadamente 8, de aproximadamente 6 a aproximadamente 7, de aproximadamente 6.5 a aproximadamente 11, de aproximadamente 6.5 a aproximadamente 10, de aproximadamente 6.5 a aproximadamente 9, de aproximadamente 6.5 a aproximadamente 8, de aproximadamente 6.5 a aproximadamente 7, de aproximadamente 7 a aproximadamente 11, de aproximadamente 7 a aproximadamente 10, de aproximadamente 7 a aproximadamente 9 o de aproximadamente 7 a aproximadamente 8, preferentemente de aproximadamente 5.5 a aproximadamente 9 y más preferentemente de aproximadamente 6 a aproximadamente 8.

En modalidades particulares, el método para eliminar huevo se lleva a cabo con un grado de dureza de aproximadamente 0 °dH a aproximadamente 30 °dH, tal como de aproximadamente 1 °dH, aproximadamente 2 °dH, aproximadamente 3 °dH, aproximadamente 4 °dH, aproximadamente 5 °dH, aproximadamente 6 °dH, aproximadamente 7 °dH, aproximadamente 8 °dH, aproximadamente 9 °dH, aproximadamente 10 °dH, aproximadamente 11 °dH, aproximadamente 12 °dH, aproximadamente 13 °dH, aproximadamente 14 °dH, aproximadamente 15 °dH, aproximadamente 16 °dH, aproximadamente 17 °dH, aproximadamente 18 °dH, aproximadamente 19 °dH, aproximadamente 20 °dH, aproximadamente 21 °dH, aproximadamente 22 °dH, aproximadamente 23 °dH, aproximadamente 24 °dH, aproximadamente 25 °dH, aproximadamente 26 °dH, aproximadamente 27 °dH, aproximadamente 28 °dH, aproximadamente 29 °dH y aproximadamente 30 °dH. En condiciones de lavado europeas típicas, el grado de dureza es de aproximadamente 15 °dH, en condiciones de lavado de EE. UU. típicas de aproximadamente 6 °dH y en condiciones de lavado asiáticas típicas de aproximadamente 3 °dH.

Todos los documentos citados en la presente se incorporan por referencia en su totalidad.

La presente invención se describe adicionalmente mediante los siguientes ejemplos que no deben considerarse limitantes del alcance de la invención.

Ejemplos Materiales y métodos Ensayos de lavado Ensayo de estrés mecánico automático (AMSA, por sus siglas en inglés) para lavar la ropa Con el fin de evaluar el rendimiento de lavado en el lavado de la ropa, se llevaron a cabo experimentos utilizando el ensayo de estrés mecánico automático (AMSA). Con el AMSA, se puede examinar el rendimiento de lavado de una gran cantidad de soluciones detergentes enzimáticas de volumen pequeño. La placa AMSA tiene una serie de ranuras para las soluciones de ensayo y una tapa que aprieta con firmeza la muestra de ropa, el artículo textil que se ha de lavar, contra todos los orificios de las ranuras. Durante el tiempo de lavado, la placa, las soluciones de ensayo, el artículo textil y la tapa se agitan enérgicamente para que la solución de ensayo entre en contacto con el artículo textil y para aplicar un estrés mecánico de modo regular, periódico y oscilante. Para consultar una descripción más detallada, remítase al documento W002/42740, especialmente al párrafo "Special method embodiments" en las páginas 23-24.

El rendimiento de lavado se mide como el brillo del color del artículo textil lavado. El brillo también se puede expresar como la intensidad de la luz reflejada por la muestra cuando se ilumina con luz blanca. Cuando la muestra está manchada, la intensidad de la luz reflejada es menor que la de la muestra limpia. Por lo tanto, la intensidad de la luz reflejada se puede utilizar para medir el rendimiento de lavado.

Las mediciones del color se realizan con un escáner de superficie plana profesional (Kodak iQsmart, Kodak, Midtager 29, DK-2605 Brondby, Dinamarca), el cual se utiliza para capturar una imagen del artículo textil lavado.

Con el fin de extraer un valor para la intensidad de la luz a partir de las imágenes escaneadas, los valores en píxeles de 24 bits de la imagen se convierten en valores para rojo, verde y azul (RBG, por sus siglas en inglés). El valor de la intensidad (Int) se calcula sumando los valores RBG como vectores y tomando a continuación la longitud del vector resultante: Tabla 1: Composición de detergentes modelo y materiales de ensayo Los materiales de ensayo se obtienen a partir del Center For Testmaterials BV, P.O. Box 120, 3133 KT Vlaardingen, los Países Bajos y EMPA Testmaterials AG, Móvenstrasse 12, CH-9015 S. Gallen, Suiza.

Ensayos de proteasas Ensayo de actividad de purificación con Protazyme AK Sustrato: Comprimido de Protazyme AK (AZCL-caseína, Megazyme T-PRAK 1000).

Temperatura : 37 °C Amortiguador de ensayo : HEPES/NaOH 50 mM, pH 7. 0.

Se suspende un comprimido de Protazyme AK en 2.0 mL de Tritón X-100 al 0.01% mezclando suavemente . Se dispensan 500 |1L de esta suspensión y 500 fJL del amortiguador de ensayo en un tubo Eppendorf y se colocan en hielo. Se añaden 20 m? de solución de proteasa (diluida en Tritón X-100 al 0.01%) a la mezcla enfriada con hielo. El ensayo se inicia transfiriendo el tubo Eppendorf a un termomezclador Eppendorf, el cual se fija a la temperatura de ensayo . El tubo se incuba durante 15 minutos en el termomezclador Eppendorf a la mayor velocidad de agitación (1400 rpm) . La incubación se detiene transfiriendo el tubo de nuevo al baño de hielo . A continuación, el tubo se centrifuga en una centrífuga enfriada con hielo durante unos pocos minutos y se transfieren 200 mL del sobrenadante a una placa de microvaloración . Se lee la DO650 como una medición de la actividad proteasa . Se incluye un amortiguador como control negativo en el ensayo (en lugar de la enzima) .

Ensayos de actividad de caracterización: Ensayo de caracterización con Protazyme OL: Sustrato: Comprimido de Protazyme OL (AZCL-colágeno, Megazyme T-PROL 1000).

Temperatura: Controlada (temperatura de ensayo).

Amortiguadores de ensayo: ácido succínico 100 mM, HEPES 100 mM, CHES 100 mM, CABS 100 mM, CaCl21 mM, KC1150 mM, TritonX-100 al 0.01% ajustado a valores de pH de 2.0, 3.0, 4.0, 5.0, 6.0.7.0, 8.0, 9.0, 10.0 y 11.0 con HCl o NaOH.

Se suspende un comprimido de Protazyme OL en 2.0 mL de Tritón X-100 al 0.01% mezclando suavemente. Se dispensan 500 L de esta suspensión y 500 mL del amortiguador de ensayo en un tubo Eppendorf y se colocan en hielo. Se añaden 20 ml de solución de proteasa (diluida en Tritón X-100 al 0.01%) a la mezcla enfriada con hielo. El ensayo se inicia transfiriendo el tubo Eppendorf a un termomezclador Eppendorf, el cual se fija a la temperatura de ensayo. El tubo se incuba durante 15 minutos en el termomezclador Eppendorf a la mayor velocidad de agitación (1400 rpm). La incubación se detiene transfiriendo el tubo de nuevo al baño de hielo. A continuación, el tubo se centrifuga en una centrífuga enfriada con hielo durante unos pocos minutos y se transfieren 200 mL del sobrenadante a una placa de microvaloración. Se lee la DC>650 como una medición de la actividad proteasa. Se incluye un amortiguador como control negativo en el ensayo (en lugar de la enzima).

Ejemplo 1: Diseño de una secuencia de ADN optimizada Se identificó la secuencia de dos proteasas de la familia M4 derivadas de cepas que pertenecían al género Exiguobacterium en la base de datos de secuencias proteicas públicas SWISSPROT que tenían el número de acceso SWISSPROT:B1YFR1 ( Exiguobacterium sibiricum) (SEQ ID NO: 1) y SWISSPROT: C4L1B3 ( Exiguobacterium sp.ATlb) (SEQ ID NO: 3). Con el fin de expresar las metaloproteasas , se optimizaron genes que codificaban las metaloproteasas mediante el uso de codones para la expresión en una cepa hospedadora de Bacillus , lo que dio como resultado las secuencias que se muestran en la SEQ ID NO: 5 y SEQ ID NO:6.El proceso de optimización de codones es un método conocido en la téenica y también se describe en WO 2012025577.

Expresión de las metaloproteasas de Exiguobacterium sibiricum Un fragmento de ADN que tenía la secuencia de la SEQ ID NO: 1 ( Exiguobacterium sibiricum) se optimizó mediante codones y se sintetizó como se ha descrito anteriormente en este ejemplo y se clonó esencialmente como se describe en el documento WO 2010151787. El péptido señal de la proteasa alcalina de B. clausii (aprH) se fusionó mediante PCR tal como se describe en el documento WO 99/43835 en fase con el fragmento de ADN que codifica la metaloproteasa de Exiguobacterium sibiricum utilizando el fragmento de ADN sintético como molde y los oligos. cebador directo: GTTCATCGATCGCATCGGCTGAGGGCCTTCAAGCTGGC (SEQ ID NO 7) cebador inverso: GCGTTTTTTTATTGATTAACGCGTTTAGTATACGCCAACTGCG (SEQ ID NO 8) El fragmento de nucleótidos obtenido a partir de la PCR posterior se integró mediante recombinación homologa en el genoma de la célula hospedadora de Bacillus subtilis tal como se describe en el documento W02010/151787. La selección de los clones positivos en placas de agar con medio LB que contenía 6 ug/mL de cloranfenicol y un 1% de leche desnatada y el cultivo de los clones en medio líquido rico se realizó según se describe en el documento W02010/151787. El clon de expresión se cultivó durante 48 horas a 26 °C en un medio de crecimiento bacteriano rico en proteínas antes de la purificación proteica. El sobrenadante se separó de las células de B. subtilis por centrifugación a 10000 rpm durante 30 minutos y a continuación se filtró a través de un filtro de 0.45 pm. El sobrenadante se conservó a -20 °C hasta su uso posterior. Se detectó la expresión exitosa mediante análisis de SDS-PAGE que mostró una banda proteica de aproximadamente 33 kDa por encima del fondo del hospedador.

Expresión de las metaloproteasas de Exiguobacterium sp.

ATlb Se sintetizó un fragmento de ADN que tenía la secuencia de la SEQ ID NO: 3 ( Exiguobacterium sp. ATlb) (Geneart®, Life Technologies, Naerum, Dinamarca) y se clonó el gen sintético en el vector de expresión de Bacillus subtilis de conformidad con el procedimiento descrito esencialmente en los documentos WO 2012025577 y WO 2010151787. El constructo del vector de expresión denotado C362H codificó una proteína de fusión en la cual el péptido señal natural se había reemplazado por el péptido señal aprH de B. clausii tal como se describe en el documento WO 99/43835. Se transformaron células TOPIO de E. coli con el plásmido C362H y se seleccionó un clon correcto en medio que contenía ampicilina utilizando métodos conocidos en la téenica. El fragmento de nucleótidos que codificaba la secuencia que codificaba la metaloproteasa de fusión se integró por recombinación homologa en el genoma de la células hospedadora de Bacillus subtilis . El constructo del gen se expresó controlado por un sistema promotor triple (tal como se describe en el documento WO 99/43835). El gen que codificaba la cloranfenicol-acetiltransferasa se utilizó como marcador (como se describe en (Diderichsen et al., 1993, Plasmid 30: 312-315).

Se separaron diez clones de B. subtilis en placas de agar con medio LB que contenía 6 ug/mL .de cloranfenicol y un 1% de leche desnatada. Las placas de agar se incubaron durante toda la noche a 37 °C y los clones que expresaban el polipéptido que tenía actividad proteasa presentaron zonas de transparentes alrededor de las colonias, lo cual indica la presencia de actividad proteolítica.

Se cultivó un clon que expresaba la metaloproteasa en medio líquido rico a 37 °C y se agitó a 225 rpm durante 4-5 días. El sobrenadante se separó de las células de B. subtilis por centrifugación a 10 000 rpm durante 30 minutos y a continuación se filtró a través de un filtro de 0.45 pm. El sobrenadante se conservó a -20 °C hasta su uso posterior. Se añadieron 40 mL de muestra descongelada a 10 pL de ácido tricloroacético al 50% (TCA) y se incubaron sobre hielo durante 5 minutos antes de centrifugarlos a 40 000 rpm durante 5 minutos. Se retiró el sobrenadante y se añadieron 20 pL de amortiguador de muestra para SDS-PAGE (Nupage, Invitrogen) al sedimento, a continuación se pipetearon arriba y abajo hasta que el sedimento se disolvió completamente. Se detectó una banda proteica clara de aproximadamente 34 kDa por encima del fondo del hospedador, lo que indica una expresión recombinante con éxito de la metaloproteasa.

Ejemplo 2: Purificación de la proteasa M4 de Exiguobacterium sibiricum (La proteasa M4 se expresó en B. subtilis) .

Se centrifugó el caldo de cultivo (20000 x g, 20 min) y se decantó cuidadosamente el sobrenadante del precipitado. El sobrenadante se filtró a través de una unidad de filtración Nalgene de 0.2 mm para retirar el resto de las células hospedadoras de Bacillus . El filtrado de 0.2 mm se aplicó sobre una columna de bacitracina-agarosa (de Upfront chromatography) equilibrada con MES/NaOH 20 mM, CaCl25 mM, pH 6. Tras lavar exhaustivamente la columna con el amortiguador de equilibración, se eluyó la proteasa M4 con H3B03100 mM, MES 10 mM, CaCl22 mM, NaCl 1M, pH 6 con un 25%(v/v) de 2-propanol. Se analizaron las fracciones de la columna para determinar la actividad proteasa (utilizando el ensayo de actividad de purificación con Protazyme AK a pH 7) y las fracciones activas se analizaron adicionalmente mediante SDS-PAGE. Se combinaron las fracciones para las cuales se observó solamente una banda en el gel de la SDS-PAGE teñido con coomassie y se transfirieron a H3B03100 mM, MES 10 mM, CaCl22 mM, pH 6 en una columna Sephadex G25 como la preparación purificada y se utilizó para una caracterización adicional.

Purificación de la proteasa M4 de Exiguobacterium sp. ATlb (La proteasa M4 se expresó en B. subtilis) .

Se centrifugó el caldo de cultivo (20000 x g, 20 min) y se decantó cuidadosamente el sobrenadante del precipitado. El sobrenadante se filtró a través de una unidad de filtración Nalgene de 0.2 mih para retirar el resto de las células hospedadoras de Bacillus . El filtrado de 0.2 mm se diluyó 2.5 veces en agua desionizada y se aplicó sobre una columna de bacitracina-agarosa (de Upfront chromatography) equilibrada con MES/NaOH 20 mM, CaCl25 mM, pH 6. Tras lavar exhaustivamente la columna con el amortiguador de equilibración, se eluyó la proteasa M4 con H3BO3100 rnM, MES 10 mM, CaCl22 mM, NaCl 1M, pH 6 con un 25%(v/v) de 2-propanol. Se analizaron las fracciones de la columna para determinar la actividad proteasa (utilizando el ensayo de actividad de purificación con Protazyme AK a pH 7) y las fracciones activas se analizaron adicionalmente mediante SDS-PAGE. Se combinaron las fracciones para las cuales se observó solamente una banda en el gel de la SDS-PAGE teñido con coomassie y se transfirieron a H3BO3100 mM, MES 10 mM, CaCl22 mM, pH 6 en una columna Sephadex G25 como la preparación purificada y se utilizó para una caracterización adicional.

Ejemplo 3: Caracterización de las proteasas M4 de Exiguobacterium: pH-actividad, pH-estabilidad y temperatura-actividad Se utilizó el ensayo de caracterización con Protazyme OL para obtener el perfil de pH-actividad a 37 °C, el perfil de pH-estabilidad (actividad residual después de 2 horas para los valores de pH indicados) y el perfil de temperatura-actividad al pH óptimo. Para el perfil pH-estabilidad se diluyó la proteasa 7x en los distintos amortiguadores del ensayo de caracterización hasta alcanzar los valores de pH de estos amortiguadores y se incubó durante 2 horas a 37 °C. Tras la incubación, el pH de las incubaciones de la proteasa se ajustó al pH óptimo de la proteasa, antes del ensayo para determinar la actividad residual, mediante dilución en el amortiguador de ensayo a pH óptimo. Los resultados se muestran a continuación en las Tablas 2-4. En la Tabla 2, las actividades son relativas respecto al pH óptimo de la enzima. En la Tabla 3, las actividades son actividades residuales relativas a una muestra, la cual se mantuvo en condiciones estables (5 °C, pH 6). En la Tabla 4, las actividades son relativas respecto a la temperatura óptima de la enzima a su pH óptimo.

Tabla 2: perfil de pH-actividad a 37 °C Tabla 3: perfil de pH-estabilidad (actividad residual despues de 2 horas a 37 °C) Tabla 4: Perfil de temperatura-actividad a pH 6, pH 8 o ElLi Otras características de las proteasas M4 de Exiguobacterium Las proteasas M4 se inhiben con 1,10-fenantrolina y EDTA. Exiguobacterium sibiricum La determinación de la secuencia del N-terminal mediante la degradación de EDMAN fue: VTGTTSV (SEQ ID NO 11). El peso molecular relativo según se determina por SDS-PAGE fue de aproximadamente Mr = 36 kDa.

El peso molecular determinado por el análisis de peso molecular intacto fue de 33543.5 Da.

La secuencia madura (de los datos de espectrometría de masas y de los datos de la degradación de EDMAN y la secuencia del ADN): VTGTTSVGTGTTVLGTTATFNTVKSGSYYYLQDSTRGKGIYTYDAKKRNTLPGSLW ADLDNQFNTTYDRAAVSAQVNAVKTYDFYKNTYGRNSYDNAGAALNSSVHYSTSYNNAFWD GTKMVYGDGDGSTFTYLSGALDW AHELTHAVTEYTAGLVYQNESGAINEAVSDIMGTVAE YSVGSNFDWLVGEDIYTPGVSGDALRSMSNPAAYGDPDHYSKRYTGTQDNGGVHTNSGIVN KAAYLLGNGGTHTGVTVTGVGVPKLGAIYYRALSVYLTPNSNFSSLRAAW QSAKDLYGST SAEATAAAKSFDAVGVY (SEQ ID NO 9) Aminoácidos 1-317 de la SEQ ID NO: 2.

El peso molecular calculado de esta secuencia madura fue de 33543.5 Da.

Exiguobacterium sp.ATlb.

La determinación de la secuencia del N-terminal mediante la degradación de EDMAN fue: GTTYTGT (SEQ ID NO 12) El peso molecular relativo según se determina por SDS-PAGE fue de aproximadamente Mr = 36 kDa.

El peso molecular determinado por el análisis de peso molecular intacto fue de 33770.9 Da.

La secuencia madura (de los datos de espectrometría de masas y de los datos de la degradación de EDMAN y la secuencia del ADN): GTTYTGTGIDVLGYSQTFKTTKSGSYYYLQDSTRGKGIYTYDAKNRTTLPGSLWAD VDNVLNTTYDRAAVSAHVNATKTYDFYKNTYGRNSYDNAGAALNSTVHYSRSYNNAFWDGS KMVYGDGDGQTFTYLSGALDW AHELTHAITEYTAGLIYQNESGAINEAVSDILGTVAEYS VGTNFDWLVGEDIYTPGVAGDGLRSMANPAAYGDPDHYSKRYTGTQDNGGVHINSGIVNKA AYLLGNGGSHYGVSVQGVGVMAMGDIYYRALNVYLTPTSNFSSLRQAW QSAKDLYGATSP QAVSAAKSFDAVGIY (SEQ ID NO 10) Aminoácidos 1-315 de la SEQ ID NO: 4.

El peso molecular calculado de esta secuencia madura fue de 33769.8 Da.

Ejemplo 4: Rendimiento de lavado AMSA de las proteasas M4 de Exiguobacterium Se evaluó el rendimiento del lavado de las proteasas M4 de Exiguobacterium utilizando un detergente líquido modelo, un detergente comercial líquido y un detergente en polvo a 2 temperaturas de lavado diferentes en 3 manchas téenicas diferentes utilizando el Ensayo de Estrés Mecánico Automático.

Los experimentos se llevaron a cabo como se describe en el AMSA para un método de lavado de ropa donde se utiliza un procedimiento de lavado de un único ciclo descrito en la tabla 5, con la composición detergente, las muestras y las condiciones experimentales que se especifican a continuación en las tablas 6 y 7.

Tabla 5: Condiciones experimentales para el AMSA de las Tablas 6 y 7 Se ajustó la dureza del agua a 15 °dH añadiendo CaCl2, MgCl2 y NaHC03 (Ca2+:Mg2+:CO32 = 4:1:7.5) al sistema de prueba. Tras el lavado, los artículos textiles se enjuagaron con agua del grifo y se secaron.

Tabla 6: Incremento del valor de la intensidad del detergente que contiene proteasas M4 de Exiguobacterium en comparación con el detergente sin proteasa Tabla 6 Exiguobacterium sibiricu Tabla 7 Exiguobacterium sp. ATlb Los resultados muestran que tanto la metaloproteasa de Exiguobacterium sibiricum como la metaloproteasa de Exiguobacterium sp. ATlb muestran un buen rendimiento de lavado sobre manchas de sangre/leche/tinta (PC-05), chocolate leche/hollín (C-03) y huevo entero (CS-37).

Tablas 8 y 9 : Valor del rendimiento del lavado relativo del detergente que contiene proteasas M4 de Exiguobacterium en comparación con el detergente que contiene Neutrase® (SEQ ID NO 13) Tabla 8 Exiguobacterium sibiricum Los resultados muestran que la metaloproteasa de Exiguobacterium sibiricum supera el rendimiento de Neutrase® en la mancha de huevo CS-37 y a la vez muestra un rendimiento de lavado similar o ligeramente mejor que Neutrase® en las otras machas en las condiciones estudiadas.

Tabla 9 Exiguobacterium sp. ATlb Los resultados muestran que la metaloproteasa de Exiguobacterium sp. Ib supera el rendimiento de Neutrase® en la mancha de huevo CS-37 y a la vez muestra un rendimiento de lavado similar o ligeramente mejor que Neutrase® en las otras machas en las condiciones estudiadas.

Ejemplo 5 Rendimiento de lavado AMSA de la proteasa M4 de Exiguobacterium sibiricum en comparación con Savinase® Se evaluó el rendimiento del lavado de la proteasa M4 de Exiguobacterium sibiricum utilizando un detergente modelo líquido y un detergente líquido comercializado a 2 temperaturas de lavado diferentes en 2 manchas téenicas diferentes utilizando el ensayo de estrés mecánico automático.

Los experimentos se llevaron a cabo como se describe en el AMSA para un método de lavado de ropa donde se utiliza un procedimiento de lavado de un único ciclo descrito en la tabla 10, con la composición detergente, las muestras y las condiciones experimentales que se especifican a continuación en la tabla 11.

Tabla 10: Condiciones experimentales para el AMSA de la Tabla 11 Se ajustó la dureza del agua a 15 °dH añadiendo CaCl2, MgCl2 y NaHC03 (Ca2+:Mg2+:CO32 = 4:1:7.5) al sistema de prueba. Tras el lavado, los artículos textiles se enjuagaron con agua del grifo y se secaron.

Tabla 11: Valor del rendimiento del lavado relativo del detergente que contiene proteasas M4 de Exiguobacterium sibiricum en comparación con el detergente que contiene Savinase® (SEQ ID NO 14) Tabla 11 Exiguobacterium sibiricum La proteasa M4 de Exiguobacterium sibiricum tiene una actuación generalmente mejor que Savinase® en PC-05 y comparable con Savinase® en PC- 03 en las condiciones investigadas .

Se hace constar que con relación a esta fecha, el mejor método conocido por la solicitante para llevar a la práctica la citada invención, es el que resulta claro de la presente descripción de la invención.

Claims

REIVINDICACIONES Habiéndose descrito la invención como antecede, se reclama como propiedad lo contenido en las siguientes reivindicaciones:

1. Una composición caracterizada porque comprende un polipéptido que tiene actividad proteasa, donde el polipéptido que tiene actividad proteasa se selecciona entre: a) un polipéptido que tiene una identidad secuencial de al menos un 70%, tal como una identidad de al menos un 75%, tal como una identidad de al menos un 80%, tal como una identidad secuencial de al menos un 85%, tal como una identidad de al menos un 90%, tal como una identidad de al menos un 95%, tal como una identidad de al menos un 97%, tal como una identidad de al menos un 98%, tal como una identidad de al menos un 99% respecto al polipéptido maduro de la SEQ ID NO: 2 o la SEQ ID N0:4; b) un polipéptido codificado por un polinucleótido que tiene una identidad secuencial de al menos un 70%, tal como una identidad de al menos un 75%, tal como una identidad de al menos un 80%, tal como una identidad secuencial de al menos un 85%, tal como una identidad de al menos un 90%, tal como una identidad de al menos un 95%, tal como una identidad de al menos un 97%, tal como una identidad de al menos un 98% y tal como una identidad de al menos un 99% respecto a la secuencia que codifica el polipéptido maduro de la SEQ ID NO: 1 o la SEQ ID NO:3; (c) una variante que comprende una sustitución, supresión y/o inserción de uno o más (varios) aminoácidos del polipéptido maduro de la SEQ ID NO: 2 o la SEQ ID NO:3; y (d) un fragmento de un polipéptido de (a), (b) o (c) que tiene actividad proteasa.

2. La composición de la reivindicación 1, caracterizada porque es una composición detergente.

3. La composición detergente de la reivindicación 2, caracterizada porque comprende además una o más enzimas adicionales seleccionadas entre una proteasa, lipasa, cutinasa, amilasa, carbohidrasa, celulasa, pectinasa, mananasa, arabinasa, galactanasa, xilanasa, oxidasa, p. ej., una lacasa y/o peroxidasa.

4. La composición detergente de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 2-3, caracterizada porque está en forma de una barra, un comprimido homogéneo, un comprimido que tiene dos o más capas, una bolsita que tiene uno o más compartimentos, un polvo estándar o compacto, un gránulo, una pasta, un gel o un líquido estándar, compacto o concentrado.

5. El uso de una composición de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-4, en un proceso de limpieza tal como lavar la ropa, limpiar superficies duras, lavar la vajilla o lavar la vajilla de forma automática.

6. El uso de un polipéptido que tiene actividad proteasa en un proceso de limpieza, donde el polipéptido que tiene actividad proteasa se selecciona entre: a) un polipéptido que tiene una identidad secuencial de al menos un 70%, tal como una identidad de al menos un 75%, tal como una identidad de al menos un 80%, tal como una identidad secuencial de al menos un 85%, tal como una identidad de al menos un 90%, tal como una identidad de al menos un 95%, tal como una identidad de al menos un 97%, tal como una identidad de al menos un 98% y tal como una identidad de al menos un 99% respecto al polipéptido maduro de la SEQ ID NO: 2 O la SEQ ID NO:4; b) un polipéptido codificado por un polinucleótido que tiene una identidad secuencial de al menos un 70%, tal como una identidad de al menos un 75%, tal como una identidad de al menos un 80%, tal como una identidad secuencial de al menos un 85%, tal como una identidad de al menos un 90%, tal como una identidad de al menos un 95%, tal como una identidad de al menos un 97%, tal como una identidad de al menos un 98% y más preferentemente todavía una identidad de al menos un 99% respecto a la secuencia que codifica el polipéptido maduro de la SEQ ID NO: 1 o la SEQ ID NO:3; (c) una variante que comprende una sustitución, supresión y/o inserción de uno o más (varios) aminoácidos del polipéptido maduro de la SEQ ID NO: 2 o la SEQ ID NO:4; y (d) un fragmento de un polipéptido de (a), (b) o (c) que tiene actividad proteasa.

7. Un método para eliminar una mancha de una superficie caracterizado porque comprende poner en contacto la superficie con una composición de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-4.

8. La composición de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-4 o el uso de conformidad con la reivindicación 5 o 6, en donde el polipéptido se deriva de Exiguobacterium sp ATlb.

9. La composición de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-4 o el uso de conformidad con la reivindicación 5 o 6, en donde el polipéptido se deriva de Exiguobacterium sibiricum.