CN115066495A

CN115066495A - 甘露聚糖酶变体

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Publication number: CN115066495A
Application number: CN202180013337.4A
Authority: CN
Inventors: K·克兰; A·R·洛格; A·夸雷谢; C·霍昂; J·尼尔森; M·米勒; T·李
Original assignee: BASF SE
Current assignee: BASF SE
Priority date: 2020-02-14
Filing date: 2021-02-12
Publication date: 2022-09-16
Also published as: WO2021160818A1; EP4103707A1; JP2023513377A; BR112022015985A2; MX2022009968A; US20230081929A1

Abstract

一种与SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:4至少75％相同的甘露聚糖酶，编码该甘露聚糖酶的多核苷酸，包含该多核苷酸的表达构建体，以及包含该多核苷酸或该表达构建体的宿主细胞。

Description

甘露聚糖酶变体

技术领域

本发明涉及甘露聚糖酶的变体。这些变体可用于其中需要甘露聚糖降解或改性的工业应用，例如洗衣和清洁应用、饲料、食品、纸浆和造纸以及石油工业。本发明还提供有用的甘露聚糖酶、编码这些酶的多核苷酸、酶组合物以及它们的生产和使用方法。

背景技术

半纤维素和半乳甘露聚糖的主要作用是作为结构多糖和/或作为储备能量。除作为植物中最广泛的储备多糖的直链淀粉和支链淀粉之外，各种植物的种子、根、鳞茎和块茎中存在多样的基于甘露聚糖的多糖类群。这些类群包括甘露聚糖、半乳甘露聚糖和葡甘露聚糖。

甘露聚糖是具有β-1,4-连接的D-吡喃甘露糖残基骨架的多糖。在大多数情况下，甘露聚糖极不溶于水，但具有很高的水结合能力。与未取代的甘露聚糖相反，半乳甘露聚糖为水溶性。归因于植物细胞壁的复杂结构性组成，依赖分解植物材料兴起的微生物必须拥有众多不同的能够水解这些高度聚合且大多不溶性物质的酶。两类参与半纤维素降解的主要内切作用酶是β-甘露聚糖酶和β-木聚糖酶。另外，需要外切作用酶β-甘露糖苷酶、α-半乳糖苷酶和β-葡糖苷酶以完全降解半乳葡甘露聚糖。

参与甘露聚糖主链降解的主要酶类型是水解甘露聚糖主链中内部糖苷键的内切-1,4-β-甘露聚糖酶(EC 3.2.1.78)。内切-1,4-β-甘露聚糖酶(EC 3.2.1.78)是本文中可称为内切-β-1,4-D-甘露聚糖酶、β-甘露聚糖酶或甘露聚糖酶的甘露聚糖降解酶。由于内切-1,4-β-甘露聚糖酶(EC 3.2.1.78)降解甘露聚糖主链，故甘露聚糖降解包括降解甘露聚糖、半乳甘露聚糖和/或葡甘露聚糖。

甘露聚糖酶广泛用于食品和饲料应用、洗涤剂以及纸浆和造纸工业：

·使用甘露聚糖酶作为饲料添加剂已显示提供多种有益效果，因为甘露聚糖是影响肠道内容物粘度的一个因素，因此会对饲料消化率和动物生长速度产生不利影响。

·在食品工业中，甘露聚糖酶被描述用于生产速溶咖啡，其中酶由于咖啡甘露聚糖的水解而降低了咖啡提取物的粘度。此外，甘露聚糖酶用于生产特定的目的甘露寡聚体，这些甘露寡聚体可作为功能性食品成分，例如具有益生元功能的甘露寡聚体。在此类应用中，植物来源的甘露寡聚体经受甘露聚糖酶的水解。

·甘露聚糖酶在加工和制造果汁中很常见，因为它可以降低粘度并提高过滤速度、稳定性并有助于提取水果成分。

·洗涤剂用途：甘露聚糖酶促进移除食物衍生和化妆品衍生的污渍/污垢，后者经常包括含有甘露聚糖的添加物如稳定剂、乳化剂和增稠剂。在更特殊的清洁应用中，应用甘露聚糖酶从需要无微生物的表面或管件如制药设备移除生物膜。在这样的应用中，甘露聚糖酶经常与洗涤剂和其他酶如糖酶和蛋白酶组合使用。

·纸浆和造纸：甘露聚糖酶用于纸浆的酶助漂白中。甘露聚糖酶据称弥补木聚糖酶的作用。

·甘露聚糖酶应用于借助水力压裂的石油和天然气井增产过程中。甘露聚糖酶降低用于该过程中的瓜尔豆溶液的粘度。

·甘露聚糖酶用于从交联型半乳甘露聚糖组成的基质中控释药物或其他材料。

应用条件下的活性是许多工业应用酶的关键参数，因为这些酶在应用条件下往往趋向于活性不足。因此，本发明的一个目的是寻找具有改进性能，尤其是在将其储存一段时间之后具有改进性能的甘露聚糖酶变体。

本发明的甘露聚糖酶变体有利于具有良好的稳定性和甘露聚糖酶活性。此外，本发明的甘露聚糖酶变体可以提供提高的生产产量和更好的使用性能。

持续需要在洗涤剂制剂苛刻的环境下发挥作用的酶。甘露聚糖酶是洗涤制剂和/或清洁制剂的有用组分，原因是甘露聚糖酶移除部分包含半纤维素的污渍。

本文的包含甘露聚糖的污渍或含甘露聚糖的污渍包含至少一种甘露聚糖、至少一种半乳甘露聚糖和/或至少一种葡甘露聚糖并且在一个实施方案中，包含其他组分如纤维素和/或半纤维素。进一步地，这类污渍可以包含蛋白质材料、淀粉和/或糖。半乳甘露聚糖通常由带半乳糖侧基团的甘露糖主链组成。本文中，半乳甘露聚糖包括具有以下甘露糖/半乳糖比率的半乳甘露聚糖：约1:1的葫芦巴胶、约2:1的瓜耳胶、约3:1的刺云实胶、约4:1的刺槐豆胶或角豆胶、约5:1的决明子胶，其中比率是甘露糖:半乳糖。半乳甘露聚糖经常用于食品和化妆品中增加液体产品的粘度。

这些类型的污渍的去除不充分可例如导致织物变灰。因此，本发明的另一个目的是找到在pH处于5-12范围内、优选6-11范围内、更优选选自6-10、7-9和7.5-8.5范围内的pH的洗涤剂制剂中具有催化活性的甘露聚糖降解酶。

本发明提供在洗涤剂中和在使用甘露聚糖降解的洗涤和清洁应用如洗衣洗涤剂中通常使用的温度下特别稳定的甘露聚糖酶变体。

在一个方面，本发明提供了一种甘露聚糖酶，其在5-12或6-11范围内的pH，更优选6-10或7-9范围内的pH，最优选在7.5-8.5范围内的pH中具有甘露聚糖降解活性。甘露聚糖酶与SEQ ID NO:2至少75％相同，优选与根据SEQ ID NO:2的第31-490位的序列至少75％相同。根据SEQ ID NO:2的第31-490位的序列等于SEQ ID NO:3。甘露聚糖酶可以与根据SEQID NO:2的第31-327位的序列至少75％相同。根据SEQ ID NO:2的第31-327位的序列等于SEQ ID NO:4。

在一个方面，本发明提供编码根据本发明的甘露聚糖酶变体的多核苷酸序列。

在一个方面，本发明提供包含本发明的多核苷酸序列的载体。

在一个方面，本发明提供包含本发明的多核苷酸的重组宿主细胞，其使宿主细胞能够表达至少一种根据本发明的重组甘露聚糖酶变体。

在一个方面，本发明提供一种表达多核苷酸的方法，包括以下步骤

(a)通过将包含编码根据本发明的甘露聚糖酶变体的多核苷酸的核酸构建体引入宿主细胞，提供包含异源核酸构建体的宿主细胞，所述异源核酸构建体包含编码根据本发明的甘露聚糖酶变体的多核苷酸；

(b)在有利于多核苷酸表达的条件下培养步骤(a)的重组宿主细胞；和

(c)任选地，回收由多核苷酸编码的目的蛋白质。

在本发明的一个方面，根据本发明的甘露聚糖酶变体在酶制剂中提供，该酶制剂允许灵活地配制成液体制剂，例如具有一种酶或酶的混合物的液体洗涤剂制剂。酶制剂还可包含选自由以下组成的组的其他酶(一种或多种)：蛋白酶、淀粉酶、纤维素酶、脂肪酶、木聚糖酶、甘露聚糖酶、角质酶、酯酶、植酸酶、DNA酶、果胶酶、果胶裂解酶、果胶分解酶、糖酶、***糖酶、半乳聚糖酶、黄原胶酶、木葡聚糖酶、漆酶、过氧化物酶和氧化酶，以及选自由稳定所含酶的化合物如酶稳定剂和稳定制剂的化合物如防腐剂组成的组的合适添加剂。

在一个方面，本发明提供了一种包含根据本发明的甘露聚糖酶变体的制剂，其pH优选在5-12范围内，优选在6-11范围内，更优选在选自6-10、7-9和7.5-8.5的范围内。优选地，制剂是包含至少一种选自表面活性剂、助洗剂和水溶助长剂的组分的液体制剂，其以有效保持液体制剂的物理特性和/或清洁的量存在。在一个实施方案中，该制剂是洗涤剂制剂。

包含至少一种根据本发明的甘露聚糖酶变体的洗涤剂制剂是有利的，因为它可以去除含甘露聚糖的污渍。

序列

本文使用的序列如下：

编码根据SEQ ID NO:2的亲本甘露聚糖酶的SEQ ID NO:1多核苷酸序列：

以其单字母代码表示的SEQ ID NO:2亲本甘露聚糖酶(包括信号序列的490AA)：

以其单字母代码表示的包括接头和CBD(碳水化合物结构域)的SEQ ID NO:3成熟亲本甘露聚糖酶：

不具有接头和CBD(碳水化合物结构域)的SEQ ID NO:4成熟亲本甘露聚糖酶，以其单字母代码表示：

发明详述：

应理解，如在说明书和权利要求书中使用的，“一个”或“一种”可意指一个或多个(在“至少一个”的意义上)，这取决于其使用的上下文。

此外，应理解，术语“至少”是指该术语所指的项目或参数在一个方向上受到限制，但在一个或多个其他方向上是开放式的。

如在下文中使用的，术语“具有”、“包含”、“含有”或“包括”或其任何任意语法变体以非排他的方式使用。因此，这些术语既可以指代其中除了由这些术语引入的特征之外，在该上下文中描述的实体中不存在另外的特征的情况，又可以指代其中存在一个或多个另外的特征的情况。

通过“在一个实施方案中”或类似表述引入的特征旨在作为附加或替代特征，对本发明的替代实施方案没有任何限制，对本发明的范围没有任何限制，并且对将以这种方式引入的特征与本发明的其它附加或替代或非附加或非替代的特征组合的可能性没有任何限制。术语“可以”在本文中优选地涵盖实施方案。

如本文所用，术语“约”意指关于在所述术语之后列举的任何数字，存在在其中可以实现技术效果的区间精度。因此，如本文所提及的约优选是指精确数值或所述精确数值附近的±15％、优选±10％、更优选±5％或甚至更优选±3％的范围。

通常，“酶”是作用于底物并将其转化为产物的催化活性蛋白质或多肽。该反应在本文中可称为酶促转化，其通常发生在酶的“活性位点”处。发挥酶促转化作用的酶是酶促活性的或具有酶促活性。本文中称为“酶”的任何多肽意指具有催化活性的多肽。

根据本发明的甘露聚糖酶变体具有甘露聚糖降解活性并且属于酶类别EC3.2.1.78。在一个实施方案中，甘露聚糖降解活性涉及至少一种半乳甘露聚糖的降解。优选地，至少一种半乳甘露聚糖的特征在于甘露糖:半乳糖的比例为约1:1、约2:1、约3:1、约4:1和/或5:1。

甘露聚糖降解活性或甘露聚糖酶活性可以根据本领域已知的标准测试程序来测试。例如：可以将待测试的甘露聚糖酶应用于在包含0.2％AZCL半乳甘露聚糖(角豆(carob))的琼脂平板中冲出的4mm直径的孔中，即用于测定内切-1,4-β-D-甘露聚糖酶的底物可从公司Megazyme以I-AZ形式获得(Megazyme的互联网地址：http://www.megazyme.com/Purchase/index.html)。如McCleary,B.V.(1978).Carbohydrate Re-search,67(1),213-221中所述，甘露聚糖降解活性可以在液体测定中使用用雷马亮蓝(Remazol Brilliant Blue)染色的角豆半乳甘露聚糖进行测试。用于测试甘露聚糖降解活性的另一种方法是在与如瓜尔豆胶或刺槐豆胶等底物孵育时还原糖的检测–参考文献参见Miller,G.L.Use of Dinitrosalicylic Acid Reagent for Determination of ReducingSugars.Analytical Chemistry 1959；31:426–428。

酶是通常由多肽序列(本文也称为氨基酸序列)鉴定的多肽。多肽序列通常由根据世界知识产权局(WIPO)标准ST.25(1998)的SEQ ID NO:鉴定，本文的氨基酸使用其中第一个字母为大写的三字母代码或相应的一个字母表示。

多肽通常由多核苷酸编码。多核苷酸通常由多核苷酸序列和由根据世界知识产权局(WIPO)标准ST.25(1998)在本公开所附序列表中提供的SEQ ID NO:来鉴定。

“亲本”多肽氨基酸序列是用于向该序列引入突变(例如通过引入一个或多个氨基酸取代、***、缺失或其组合)的起始序列，导致亲本多肽氨基酸序列的“变体”。亲本包括：用作引入(进一步)变化的起始序列的野生型多肽氨基酸序列或合成产生的多肽氨基酸序列。

本发明的甘露聚糖酶变体的亲本多肽可以具有根据SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:4的多肽序列。在本发明的一个方面，亲本多肽具有根据SEQ ID NO:2的第31-490位的序列。根据SEQ ID NO:2的第31-490位的序列等于SEQ ID NO:3。在本发明的另一个方面，亲本多肽具有根据SEQ ID NO:2的第31-327位的序列。根据SEQ ID NO:2的第31-327位的序列等于SEQ ID NO:4。

“变体多肽”是指在氨基酸序列上与其亲本不同的酶。“与SEQ ID NO:X至少x％相同”的酶或多肽意指酶或多肽具有与根据SEQ ID NO:X的多肽序列相比具有x％相同的多肽序列，其中SEQ ID NO:X意指根据本发明的序列。在一个实施方案中，SEQ ID NO:X选自SEQID NO:2、SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4。

“与SEQ ID NO:Y至少y％相同”的多核苷酸意指与根据SEQ ID NO:Y的多核苷酸序列相比时具有y％相同的多核苷酸序列的多核苷酸，其对应于本文的SEQ ID NO:1。

当与亲本序列相比时，变体多肽序列可以通过它们的“序列同一性”来限定。序列同一性通常以“％序列同一性”或“％同一性”提供。为了计算序列同一性，在第一步中必须进行序列比对。

根据本发明，通过使用Needleman和Wunsch的算法(J.Mol.Biol.(1979)48,p.443-453)产生比对。优选地，程序“NEEDLE”(欧洲分子生物学开放软件套件(EMBOSS))用于本发明的目的，使用程序默认参数(多核苷酸：空位开放＝10.0，空位延伸＝0.5和矩阵＝EDNAFULL；多肽：空位开放＝10.0，空位延伸＝0.5，矩阵＝EBLOSUM62)。

在比对两个序列后，在第二步中，从产生的比对中确定同一性值。

在优选的实施方案中，通过将相同残基数除以显示两个比对序列的完整长度的比对区域的长度乘以100来计算％同一性：％同一性＝(相同残基/显示两个比对序列的完整长度的比对区域的长度)*100。

根据本发明的多肽

本发明的多肽与SEQ ID NO:2至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％相同，并且其中该多肽具有甘露聚糖降解活性。在本发明的一个方面，根据本发明的甘露聚糖酶变体与根据SEQ ID NO:2的第31-490位的序列或根据SEQ ID NO:3的序列至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％相同，其中所述多肽具有甘露聚糖降解活性。

在一个实施方案中，根据本发明的甘露聚糖酶变体与根据SEQ ID NO:2的第31-327位的序列或根据SEQ ID NO:4的序列至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％相同，其中所述多肽具有甘露聚糖降解活性。

甘露聚糖酶变体可以进一步包含一个或多个保守取代，这表示一个氨基酸由相似的氨基酸取代。根据本发明的相似氨基酸定义如下：

氨基酸A相似于氨基酸S；氨基酸D相似于氨基酸E和N；氨基酸E相似于氨基酸D、K和Q；氨基酸F相似于氨基酸W和Y；氨基酸H相似于氨基酸N和Y；氨基酸I相似于氨基酸L、M和V；氨基酸K相似于氨基酸E、Q和R；氨基酸L相似于氨基酸I、M和V；氨基酸M相似于氨基酸I、L和V；氨基酸N相似于氨基酸D、H和S；氨基酸Q相似于氨基酸E、K和R；氨基酸R相似于氨基酸K和Q；氨基酸S相似于氨基酸A、N和T；氨基酸T相似于氨基酸S；氨基酸V相似于氨基酸I、L和M；氨基酸W相似于氨基酸F和Y；氨基酸Y相似于氨基酸F、H和W。

根据本发明的甘露聚糖酶变体是“成熟多肽”，意指处于其最终形式的酶，包括任何翻译后修饰、糖基化、磷酸化、截短、N末端修饰、C末端修饰、信号序列缺失。成熟多肽可以根据表达***、载体、启动子和/或生产过程而变化。根据本发明的成熟甘露聚糖酶变体可以与根据SEQ ID NO:2的第31-490位的序列至少75％相同，或者可以与根据SEQ ID NO:3的序列至少75％相同。根据本发明的成熟甘露聚糖酶变体可以与根据SEQ ID NO:2的第31-327位的序列至少75％相同，或者与根据SEQ ID NO:4的序列至少75％相同。

本发明提供与根据SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:3的序列至少75％相同的多肽，其包含两个或更多个选自A31、Q89、N96、A119、E264、W289、N312、T348、E349、S352和D379的氨基酸取代，其中编号根据SEQ ID NO:2，并且其中所述多肽具有甘露聚糖降解活性。在一个实施方案中，多肽与一个或多个选自D86、L101、S103、K107、N108、N109、A112、N122、A124、S126、S127、N129、S231、I233、S235、D244、H254、K255、S270、Q272、K273、N274、S281、G286、S290、N296、D301、T309、A314、L317、A319、D328I、G329、G330、D331、N341、Y344、F346、G356、M359、Y374、L416和W432的氨基酸取代组合，其中编号根据SEQ ID NO:2。

在一个实施方案中，与根据SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:3的序列至少75％相同的多肽包含两个或更多个选自A31V、Q89V、N96D、A119Y/H/T、E264Q/V、W289F/M/H、N312F/Y、T348S/R/N/M/G、E349T/S/D/G、S352N/G和D379V的氨基酸取代，其中编号根据SEQ ID NO:2，其中该多肽具有甘露聚糖降解活性。

在一个实施方案中，甘露聚糖酶变体包含氨基酸取代Q89V和N96D和一个或多个选自A31V、A119Y/H/T、E264Q/V、W289F/M/H、N312F/Y、T348S/R/N/M/G、E349T/S/D/G、S352N/G和D379V的氨基酸取代。在一个实施方案中，甘露聚糖酶变体包含氨基酸取代Q89V和N96D和A119Y/H/T以及一个或多个选自A31V、E264Q/V、W289F/M/H、N312F/Y、T348S/R/N/M/G、E349T/S/D/G、S352N/G和D379V的氨基酸取代。在一个实施方案中，甘露聚糖酶至少包含氨基酸取代Q89V、N96D和A119H，优选与一个或多个选自A31V、E264Q/V、W289F/M/H、N312F/Y、T348S/R/N/M/G、E349T/S/D/G、S352N/G和D379V的氨基酸取代组合。在一个实施方案中，甘露聚糖酶至少包含氨基酸取代Q89V、N96D、和A119H和N312F/Y，优选与一个或多个选自A31V、E264Q/V、W289F/M/H、T348S/R/N/M/G、E349T/S/D/G、S352N/G和D379V的氨基酸取代组合。在一个实施方案中，甘露聚糖酶至少包含氨基酸取代Q89V、N96D、A119H、W289F/M/H和N312F/Y，优选与一个或多个选自A31V、E264Q/V、T348S/R/N/M/G、E349T/S/D/G、S352N/G和D379V的氨基酸取代组合。在一个实施方案中，甘露聚糖酶至少包含氨基酸取代Q89V、N96D、A119H、E264Q/V、W289F/M/H和N312F/Y，优选与一个或多个选自A31V、T348S/R/N/M/G、E349T/S/D/G、S352N/G和D379V的氨基酸取代组合。在一个实施方案中，甘露聚糖酶至少包含氨基酸取代Q89V、N96D、A119H、E264Q/V、W289F/M/H、N312F/Y和T348S/R/N/M/G，优选与一个或多个选自A31V、E349T/S/D/G、S352N/G和D379V的氨基酸取代组合。在一个实施方案中，甘露聚糖酶至少包含氨基酸取代Q89V、N96D、A119H、E264Q/V、W289F/M/H、N312F/Y、T348S/R/N/M/G和E349T/S/D/G，优选与一个或多个选自A31V、S352N/G和D379V的氨基酸取代组合。在一个实施方案中，甘露聚糖酶至少包含氨基酸取代Q89V、N96D、A119H、E264Q/V、W289F/M/H、N312F/Y、T348S/R/N/M/G、E349T/S/D/G和S352N/G，优选与一个或多个选自A31V和D379V的氨基酸取代组合。在所有提及的实施方案中，编号根据SEQ ID NO:2。优选地，第119位的A由H取代，第264位的E由Q取代，第289位的W由M取代，第312位的N由Y取代，第348位的T由N取代，第349位的E由G取代，第352位的S由G取代。

在一个实施方案中，该多肽与一个或多个选自D86N、L101T/V、S103Y/E/A、K107N、N108G、N109Q/A、A112N、N122S、124E/C/D、S126E、S127A、N129M/L/F、S231Q/K/L/P/Y、I233V、S235H/R/L/Q/N/Y、D244I/V/N、H254W、K255Y/H/R、S270T、Q272I、K273T、N274E/C/Q、S281L、G286E/L/Q/A、S290A、N296H/F/Y、D301E/C/T、T309L、A314P、L317T、A319D/E、D328I/Q/V、G329L/S/V/T、G330P/D/T、D331A/Q、N341F、Y344Q/F/T、F346T、G356Y/V/T/Q/H/C、M359R/Y/C/Q、Y374G/V/A/R/N/P、L416W和W432P/N/L/R/S/T/G/H/I氨基酸取代组合，其中编号根据SEQ ID NO:2。

本发明提供与根据SEQ ID NO:4的序列至少75％相同的多肽，其包含两个或更多个选自A31、Q89、N96、A119、E264、W289和N312的氨基酸取代，其中编号根据SEQ ID NO:2，其中所述多肽具有甘露聚糖降解活性。在一个实施方案中，多肽与一个或多个选自D86、L101、S103、K107、N108、N109、A112、N122、A124、S126、S127、N129、S231、I233、S235、D244、H254、K255、S270、Q272、K273、N274、S281、G286、S290、N296、D301、T309、A314、L317和A319的氨基酸取代组合，其中编号根据SEQ ID NO:2。

在一个实施方案中，与根据SEQ ID NO:4的序列至少75％相同的多肽包含两个或更多个选自A31V、Q89V、N96D、A119Y/H/T、E264Q/V和W289F/M/H、N312F/Y的氨基酸取代，其中编号根据SEQ ID NO:2，并且其中多肽具有甘露聚糖降解活性。在一个实施方案中，该多肽与一个或多个选自D86N、L101T/V、S103Y/E/A、K107N、N108G、N109Q/A、A112N、N122S、124E/C/D、S126E、S127A、N129M/L/F、S231Q/K/L/P/Y、I233V、S235H/R/L/Q/N/Y、D244I/V/N、H254W、K255Y/H/R、S270T、Q272I、K273T、N274E/C/Q、S281L、G286E/L/Q/A、S290A、N296H/F/Y、D301E/C/T、T309L、A314P、L317T和A319D/E的氨基酸取代组合，其中编号根据SEQ ID NO:2。

包含如上所述的取代的与根据SEQ ID NO:2的第31-490位或第31-327位(分别为SEQ ID NO 3和SEQ ID NO:4)的序列至少75％相同的成熟多肽分子称为“根据本发明的甘露聚糖酶变体”。编号高于327的所有取代仅在与SEQ ID NO:3相关的多肽中是可能的。因此对于与SEQ ID NO:4相关的多肽，以下适用：

在一个实施方案中，根据本发明的甘露聚糖酶变体包含氨基酸取代Q89V和N96D以及一个或多个选自A31V、A119Y/H/T、E264Q/V、W289F/M/H和N312F/Y的氨基酸取代。在本发明的一个实施方案中，根据本发明的甘露聚糖酶变体包含至少一个选自Q89V和N96D的氨基酸取代和两个或更多个选自A31V、A119Y/H/T、E264Q/V、W289F/M/H和N312F/Y的氨基酸取代。在一个实施方案中，根据本发明的甘露聚糖酶变体包含氨基酸取代Q89V、N96D和A119Y/H/T，以及一个或多个选自A31V、E264Q/V、W289F/M/H和N312F/Y的氨基酸取代。在一个实施方案中，甘露聚糖酶至少包含氨基酸取代Q89V、N96D和A119H，优选与一个或多个选自A31V、E264Q/V、W289F/M/H和N312F/Y的氨基酸取代组合。在一个实施方案中，甘露聚糖酶至少包含氨基酸取代Q89V、N96D、A119H和N312F/Y，优选与一个或多个选自A31V、E264Q/V和W289F/M/H的氨基酸取代组合。在一个实施方案中，甘露聚糖酶至少包含氨基酸取代Q89V、N96D、A119H、W289F/M/H和N312F/Y，优选与A31V和E264Q/V组合。在一个实施方案中，甘露聚糖酶至少包含氨基酸取代Q89V、N96D、A119H、E264Q/V、W289F/M/H和N312F/Y。在所有提及的实施方案中，编号根据SEQ ID NO:2。优选地，第119位的A由H取代，第264位的E由Q取代，第289位的W由M取代，第312位的N由Y取代，第348位的T由N取代，第349位的E由G取代，第352位的S由G取代。

本发明具体涉及具有与SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:4至少75％相同的氨基酸序列的甘露聚糖酶变体，包含如下表Ex4a、Ex4b和Ex4c中公开的氨基酸取代。

在本发明的一个方面，根据本发明的甘露聚糖酶变体在以下位置包含一个或多个保守氨基酸取代：T32S、N37S、F61Y、I80V、Y90W、T91S、K99R、S100N、V125I、L150I、D179N、S183N、Y196F、D206E、D229N、N258D、I323L、N345D、V358I、S370A、N383S、N384S、Q423K、F435Y、D459N、N461S、I463V、V482L，其中甘露聚糖酶变体与根据SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:4的序列至少75％相同，并且其中编号根据SEQ ID NO:2。根据本发明的甘露聚糖酶变体可以包含选自T32S、T91S、K99R、S100N、V125I、D179N、S183N、Y196F、D206E、N258D、V358I、S370A、Q423K、D459N、N461S和V482L的氨基酸取代的组合。根据本发明的甘露聚糖酶变体可以包含选自T32S、N37S、F61Y、I80V、Y90W、K99R、S100N、V125I、L150I、D179N、S183N、Y196F、D206E、D229N和I323L的氨基酸取代的组合。优选地，根据本发明的甘露聚糖酶变体包含一个或多个选自N37S、F61Y、I80V、Y90W、T91S、L150I、D229N、N258D、I323L、N345D、V358I、S370A、N383S、N384S、Q423K、F435Y、D459N、N461S、I463V和V482L的保守氨基酸取代，其中甘露聚糖酶变体与根据SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:4的序列至少75％相同，并且其中编号根据SEQ ID NO:2。

在一个实施方案中，根据本发明的甘露聚糖酶变体在以下位置包含一个或多个氨基酸取代：N39T、T45N、D64Q、S133D、E140S、S168D、A173V、Q202N、S305D、H332D、G335D、A360G、A365V、D372G、Q381N、S391Y、F398L、K433T、E438G、I449T和K475N，其中甘露聚糖酶变体与根据SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:4的序列至少75％相同，并且其中编号根据SEQ ID NO:2。根据本发明的甘露聚糖酶变体可以包含选自S133D、S168D、A173V、Q202N、S305D、H332D、G335D、A365V、D372G、Q381N、S391Y、E438G和K475N的氨基酸取代的组合。根据本发明的甘露聚糖酶变体可以包含选自N39T、T45N、D64Q、S133D、E140S和S168D的氨基酸取代的组合。优选地，根据本发明的甘露聚糖酶变体包含一个或多个选自A360G和I449T的氨基酸取代，其中甘露聚糖酶变体与根据SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:3的序列至少75％相同，并且其中编号根据SEQ ID NO:2。

在一个实施方案中，根据本发明的甘露聚糖酶变体在其多肽序列内包含一个或多个“保守氨基酸区”。本文的“保守氨基酸区”的特征在于多个未突变的连续氨基酸，其中连续氨基酸的个数为3-10、4-10、5至10、6、7、8、9或10个。一个或多个保守氨基酸区可以选自G76-A77-N78-T79、R81-V83-L84、E115-V116-H117-D118、Y134-W135-I136、A154-N155-E156-W157、A191-G192-W193-G194-Q195、F218-S219-I220-H221-M222-Y223-E224-Y225-A226-G227、N236-I237-D238、I249-G250-E251-F252-G253、G259-D260-V261-D262-E263和G276-W277-L278-A279-W280，其中编号根据SEQ ID NO:2。

根据本发明的甘露聚糖酶变体在5-12的范围内、优选在6-11的范围内、更优选选自6-10、7-9和7.5-8.5的范围内的pH中可以具有甘露聚糖降解活性。在一个实施方案中，根据本发明的甘露聚糖酶变体在具有5-12的范围内、优选在6-11的范围内、更优选选自6-10、7-9和7.5-8.5的范围内的pH的制剂内具有甘露聚糖降解活性。

与亲本酶相比，本发明的甘露聚糖酶变体具有改进的表面活性剂内稳定性。

改进的表面活性剂内稳定性意指与亲本酶相比，在特定温度下一段时间后剩余的甘露聚糖降解活性增加。“一段时间”可意指1天或多天，优选1至15天，更优选最多6天。“特定温度”可指37℃或42℃。在一个实施方案中，储存意指在37℃下15天。在另一个实施方案中，储存意指在42℃下1或4天。

可在至少一种阴离子和/或至少一种非离子表面活性剂存在下测定表面活性剂内稳定性。至少一种阴离子表面活性剂可选自如本文公开的根据通式(I)的化合物和选自如本文公开的根据通式(II)的化合物。至少一种非离子表面活性剂可以选自如本文所公开的根据通式(III)的化合物。

在一个实施方案中，增加的表面活性剂内稳定性在本文中意指洗涤剂内稳定性。

在一个实施方案中，与亲本酶相比，具有改善的表面活性剂内稳定性的甘露聚糖酶变体的发酵稳定性得到改善。

根据本发明的发酵稳定性是由催化结构域、接头和由发酵产生的CBD组成的甘露聚糖酶与已被内源性截短的甘露聚糖酶的比例。

本文改进的发酵稳定性意指根据本发明的甘露聚糖酶变体的发酵稳定性与亲本酶相比时至少1.5倍、至少1.6倍、至少2倍。

在一个实施方案中，发酵稳定性意指当在细菌宿主细胞，优选芽孢杆菌宿主细胞，更优选在枯草芽孢杆菌宿主细胞中表达时的发酵稳定性。

在一个实施方案中，发酵稳定性意指在35℃至45℃范围内的发酵温度，优选在37℃的温度下的发酵稳定性。

在一个实施方案中，根据本发明的具有改善的发酵稳定性的甘露聚糖酶变体的特征在于具有两个或更多个选自N341F、F346T、T348S/R/N/M/G、E349T/S/G/D、S352N/G、G356Y/V/T/Q/H/C和D379V的位置，其中编号根据SEQ ID NO:2。在一个实施方案中，具有改善的发酵稳定性的甘露聚糖酶包含

(a)在选自T348N/G、S352N和D379V的位置上的一个或多个氨基酸取代，优选与

(b)一个或多个选自N341F、F346T、T348S/R/M、E349T/S/G/D、S352G和G356Y/V/T/Q/H/C的氨基酸取代组合，

其中当在(a)中定义的对应位置存在取代时，不存在(b)中定义的氨基酸取代，并且其中编号根据SEQ ID NO:2，并且其中所述多肽具有甘露聚糖降解活性。

多核苷酸

本发明涉及编码根据本发明的甘露聚糖酶变体的多核苷酸。多核苷酸与SEQ IDNO:2至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％相同。在本发明的一个方面，多核苷酸编码与根据SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:4的序列至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％相同的多肽。本发明的多核苷酸可具有与SEQ ID NO:1至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％相同的序列。

根据本发明的多核苷酸编码根据本发明的甘露聚糖酶变体，其与根据SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:3的序列至少75％相同，包含两个或更多个选自A31、Q89、N96、A119、E264、W289、N312、T348、E349、S352和D379的氨基酸取代，其中编号根据SEQ ID NO:2并且其中多肽具有甘露聚糖降解活性。在一个实施方案中，该多核苷酸还编码一个或多个选自D86、L101、S103、K107、N108、N109、A112、N122、A124、S126、S127、N129、S231、I233、S235、D244、H254、K255、S270、Q272、K273、N274、S281、G286、S290、N296、D301、T309、A314、L317、A319、D328I、G329、G330、D331、N341、Y344、F346、G356、M359、Y374、L416和W432的氨基酸取代，其中编号根据SEQ ID NO:2。

在一个实施方案中，多核苷酸编码根据本发明的甘露聚糖酶变体，其与根据SEQID NO:2或SEQ ID NO:3的序列至少75％相同，包含两个或更多个选自A31V、Q89V、N96D、A119Y/H/T、E264Q/V、W289F/M/H、N312F/Y、T348S/R/N/M/G、E349T/S/D/G、S352N/G和D379V的氨基酸取代，其中编号根据SEQ ID NO:2并且其中所述多肽具有甘露聚糖降解活性。

在一个实施方案中，多核苷酸编码根据本发明的甘露聚糖酶变体，其与根据SEQID NO:2或SEQ ID NO:3的序列至少75％相同，包含氨基酸取代Q89V和N96D以及一个或多个选自A31V、A119Y/H/T、E264Q/V、W289F/M/H、N312F/Y、T348S/R/N/M/G、E349T/S/D/G、S352N/G和D379V的氨基酸取代，其中编号根据SEQ ID NO:2。

在一个实施方案中，多核苷酸编码根据本发明的甘露聚糖酶变体，其与根据SEQID NO:2或SEQ ID NO:3的序列至少75％相同，包含氨基酸取代Q89V和N96D和A119Y/H/T和一个或多个选自A31V、E264Q/V、W289F/M/H、N312F/Y、T348S/R/N/M/G、E349T/S/D/G、S352N/G和D379V的氨基酸取代，其中编号根据SEQ ID NO:2。

在一个实施方案中，多核苷酸编码根据本发明的甘露聚糖酶变体，其与根据SEQID NO:2或SEQ ID NO:3的序列至少75％相同，包含氨基酸取代Q89V、N96D和A119Y/H/T，以及一个或多个选自A31V、E264Q/V、W289F/M/H和N312F/Y的氨基酸取代。

在一个实施方案中，多核苷酸还编码一个或多个选自D86N、L101T/V、S103Y/E/A、K107N、N108G、N109Q/A、A112N、N122S、124E/C/D、S126E、S127A、N129M/L/F、S231Q/K/L/P/Y、I233V、S235H/R/L/Q/N/Y、D244I/V/N、H254W、K255Y/H/R、S270T、Q272I、K273T、N274E/C/Q、S281L、G286E/L/Q/A、S290A、N296H/F/Y、D301E/C/T、T309L、A314P、L317T、A319D/E、D328I/Q/V、G329L/S/V/T、G330P/D/T、D331A/Q、N341F、Y344Q/F/T、F346T、G356Y/V/T/Q/H/C、M359R/Y/C/Q、Y374G/V/A/R/N/P、L416W和W432P/N/L/R/S/T/G/H/I的氨基酸取代，其中编号根据SEQ ID NO:2。

本发明的多核苷酸编码与根据SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:3的序列至少75％相同的任何特定变体，包含具有如本文所公开的氨基酸取代。

根据本发明的多核苷酸编码根据本发明的甘露聚糖酶变体，其与根据SEQ ID NO:4的序列至少75％相同，包含两个或更多个选自A31、Q89、N96、A119、E264、W289和N312的氨基酸取代，其中编号根据SEQ ID NO:2并且其中所述多肽具有甘露聚糖降解活性。在一个实施方案中，多核苷酸还编码一个或多个选自D86、L101、S103、K107、N108、N109、A112、N122、A124、S126、S127、N129、S231、I233、S235、D244、H254、K255、S270、Q272、K273、N274、S281、G286、S290、N296、D301、T309、A314、L317和A319的氨基酸取代，其中编号根据SEQ ID NO:2。

在一个实施方案中，多核苷酸编码根据本发明的甘露聚糖酶变体，其与根据SEQID NO:4的序列至少75％相同，包含两个或更多个选自A31V、Q89V、N96D、A119Y/H/T、E264Q/V、W289F/M/H和N312F/Y的氨基酸取代，其中编号根据SEQ ID NO:2并且其中多肽具有甘露聚糖降解活性。在一个实施方案中，多核苷酸还编码一个或多个选自D86N、L101T/V、S103Y/E/A、K107N、N108G、N109Q/A、A112N、N122S、124E/C/D、S126E、S127A、N129M/L/F、S231Q/K/L/P/Y、I233V、S235H/R/L/Q/N/Y、D244I/V/N、H254W、K255Y/H/R、S270T、Q272I、K273T、N274E/C/Q、S281L、G286E/L/Q/A、S290A、N296H/F/Y、D301E/C/T、T309L、A314P、L317T和A319D/E的氨基酸取代，其中编号根据SEQ ID NO:2。

在本发明的一个实施方案中，编码根据本发明的甘露聚糖酶变体的多核苷酸编码至少一个选自Q89V和N96D的氨基酸取代和两个或更多个选自A31V、A119Y/H/T、E264Q/V、W289F/M/H和N312F/Y的氨基酸取代。

在本发明的一个实施方案中，编码根据本发明的甘露聚糖酶变体的多核苷酸编码氨基酸取代Q89V和N96D以及一个或多个选自A31V、A119Y/H/T、E264Q/V、W289F/M/H和N312F/Y的氨基酸取代。

在本发明的一个实施方案中，编码根据本发明的甘露聚糖酶变体的多核苷酸编码氨基酸取代Q89V、N96D和A119Y/H/T，以及一个或多个选自A31V、E264Q/V、W289F/M/H和N312F/Y的氨基酸取代。

本发明的多核苷酸编码与根据SEQ ID NO:4的序列至少75％相同的任何特定变体，包含具有如本文所公开的氨基酸取代。

在本发明的一个方面，编码根据本发明的甘露聚糖酶变体的多核苷酸在以下位置编码一个或多个保守氨基酸氨基酸取代：T32S、N37S、F61Y、I80V、Y90W、T91S、K99R、S100N、V125I、L150I、D179N、S183N、Y196F、D206E、D229N、N258D、I323L、N345D、V358I、S370A、N383S、N384S、Q423K、F435Y、D459N、N461S、I463V、V482L，其中甘露聚糖酶变体与根据SEQID NO:2或SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:4的序列至少75％相同，并且其中编号根据SEQ IDNO:2。编码根据本发明的甘露聚糖酶变体的多核苷酸可以编码选自T32S、T91S、K99R、S100N、V125I、D179N、S183N、Y196F、D206E、N258D、V358I、S370A、Q423K、D459N、N461S、V482L的氨基酸取代的组合。编码根据本发明的甘露聚糖酶变体的多核苷酸可以包含选自T32S、N37S、F61Y、I80V、Y90W、K99R、S100N、V125I、L150I、D179N、S183N、Y196F、D206E、D229N和I323L的氨基酸取代的组合。优选地，编码根据本发明的甘露聚糖酶变体的多核苷酸编码一个或多个选自N37S、F61Y、I80V、Y90W、T91S、L150I、D229N、N258D、I323L、N345D、V358I、S370A、N383S、N384S、Q423K、F435Y、D459N、N461S、I463V和V482L的保守氨基酸取代，其中甘露聚糖酶变体与根据SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:4的序列至少75％相同，并且其中编号根据SEQ ID NO:2。

在一个实施方案中，编码根据本发明的甘露聚糖酶变体的多核苷酸在以下位置编码一个或多个氨基酸取代：N39T、T45N、D64Q、S133D、E140S、S168D、A173V、Q202N、S305D、H332D、G335D、A360G、A365V、D372G、Q381N、S391Y、F398L、K433T、E438G、I449T和K475N，其中甘露聚糖酶变体与根据SEQ ID NO:2、或SEQ ID NO:3、或SEQ ID NO:4的序列至少75％相同，并且其中编号根据SEQ ID NO:2。编码根据本发明的甘露聚糖酶变体的多核苷酸可以编码选自S133D、S168D、A173V、Q202N、S305D、H332D、G335D、A365V、D372G、Q381N、S391Y、E438G和K475N的氨基酸取代的组合。编码根据本发明的甘露聚糖酶变体的多核苷酸可以编码选自N39T、T45N、D64Q、S133D、E140S和S168D的氨基酸取代的组合。优选地，编码根据本发明的甘露聚糖酶变体的多核苷酸编码一个或多个选自A360G和I449T的氨基酸取代，其中甘露聚糖酶变体与根据SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:3的序列至少75％相同，并且其中编号根据SEQID NO:2。

在一个实施方案中，编码根据本发明的甘露聚糖酶变体的多核苷酸编码其多肽序列内的一个或多个保守氨基酸区。本文的保守氨基酸区的特征在于多个连续氨基酸未突变，其中连续氨基酸的个数为3-10、4-10、5至10、6、7、8、9或10个。一个或多个保守氨基酸区可以选自G76-A77-N78-T79、R81-V83-L84、E115-V116-H117-D118、Y134-W135-I136、A154-N155-E156-W157、A191-G192-W193-G194-Q195、F218-S219-I220-H221-M222-Y223-E224-Y225-A226-G227、N236-I237-D238、I249-G250-E251-F252-G253、G259-D260-V261-D262-E263和G276-W277-L278-A279-W280，其中编号根据SEQ ID NO:2。

改进表面活性剂内稳定性的方法

在一个方面，本发明涉及一种通过以下步骤增加与SEQ ID NO:2、或SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:4至少75％相同的甘露聚糖酶的表面活性剂内稳定性的方法，所述步骤在选自A31V、D86N、N96D、A119Y/H/T、E264Q/V、W289F/M/H和N312F/Y及其组合的氨基酸位置引入两个或更多个氨基酸取代，其中编号根据SEQ ID NO:2。

改进的表面活性剂内稳定性涉及在特定温度下储存一段时间后剩余的甘露聚糖降解活性，所述剩余的甘露聚糖降解活性与亲本酶相比增加。“一段时间”可以指1天或多天，优选1至15天，更优选最多6天。“特定温度”可指37℃或42℃。在一个实施方案中，储存是指在37℃下15天。在另一个实施方案中，储存是指在42℃下1或4天。在一个实施方案中，储存是指在37℃下最多6天。

在本发明的一个方面，表面活性剂内稳定性意指洗涤剂内稳定性或保质期稳定性。然而，在洗涤剂内的稳定性意味着该洗涤剂包含如本文所定义的表面活性剂。优选地，洗涤剂包含至少一种如下文公开的阴离子表面活性剂。在一个实施方案中，洗涤剂包含至少一种如下文公开的阴离子表面活性剂和至少一种如下文公开的非离子表面活性剂。在一个实施方案中，洗涤剂另外包含至少一种如本文所公开的蛋白酶。

在一个实施方案中，该方法的特征在于如下步骤：引入氨基酸取代Q89V和N96D以及一个或多个选自A31V、A119Y/H/T、E264Q/V、W289F/M/H、N312F/Y、T348S/R/N/M/G、E349T/S/D/G、S352N/G和D379V的氨基酸取代，其中编号根据SEQ ID NO:2。

在一个实施方案中，该方法的特征在于如下步骤：引入氨基酸取代Q89V和N96D和A119Y/H/T以及一个或多个选自A31V、E264Q/V、W289F/M/H、N312F/Y、T348S/R/N/M/G、E349T/S/D/G、S352N/G和D379V的氨基酸取代，其中编号根据SEQ ID NO:2。

在一个实施方案中，该方法的特征在于如下步骤：引入氨基酸取代Q89V、N96D和A119Y/H/T以及一个或多个选自A31V、E264Q/V、W289F/M/H和N312F/Y的氨基酸取代。

在一个方面，本发明的甘露聚糖酶变体的表面活性剂内稳定性在至少一种本文公开的蛋白酶存在下得到改进。

甘露聚糖酶的生产

本发明涉及生产根据本发明的甘露聚糖酶变体的方法，包括以下步骤

(c)任选地，回收由多核苷酸编码的目的蛋白质。

本发明还涉及表达根据本发明的甘露聚糖酶变体的方法，包括以下步骤

(c)任选地，回收由多核苷酸编码的目的蛋白质。

可以“表达”编码多肽的多核苷酸。术语“表达”或“基因表达”意指一个特定基因或多个特定基因或特定核酸构建体的转录。术语“表达”或“基因表达”尤其意指将一个基因或多个基因或基因构建体转录为结构性RNA(例如，rRNA、tRNA)或mRNA，所述mRNA随后翻译成蛋白质或不翻译成蛋白质。该过程包括DNA的转录和所得mRNA产物的加工。

本文的核酸构建体意指单链或双链的核酸分子，所述核酸分子从天然存在的基因分离或经修饰以包含天然不存在的或合成的核酸区段(segments)，其包含一个或多个控制序列。术语“控制序列”意指编码本发明的甘露聚糖酶的多核苷酸的表达所必需的核酸序列。每个控制序列对于编码变体的多核苷酸可以是天然的或外来的，或者彼此是天然的或外来的。此类控制序列包括但不限于前导序列、聚腺苷酸化序列、前肽序列、启动子、信号肽序列和转录终止子。最少地，控制序列包括启动子、转录和翻译终止信号。控制序列可以配有接头，以便引入促进控制序列与编码变体的多核苷酸的编码区连接的特定限制性位点。

酶的工业生产通常通过使用表达***来完成。“表达***”可以指宿主微生物、表达宿主、宿主细胞、生产生物或生产菌株，并且这些术语各自可以互换使用。在一个实施方案中，表达宿主选自由以下组成的组：细菌表达***、酵母表达***、真菌表达***和合成表达***。表达宿主可以是野生型细胞或重组细胞，优选是重组细胞。本文中的“野生型细胞”意指经过某种修饰之前的细胞。术语“重组细胞”(在本文中也称为“遗传修饰细胞”)是指已被遗传改变、修饰或工程化的细胞，使得所述细胞与其所源自的野生型细胞相比，表现出改变、修饰或不同的基因型。“重组细胞”可以包含编码某种蛋白质或酶的外源多核苷酸，因此可以表达所述蛋白质或酶。

在一个实施方案中，本发明涉及包含编码如本文所述甘露聚糖酶的多核苷酸的重组宿主细胞。

表达宿主的实例包括但不限于：黑曲霉(Aspergillus niger)、米曲霉(Aspergillus oryzae)、多形汉逊酵母(Hansenula polymorpha)、疏棉状嗜热丝孢菌(Thermomyces lanuginosus)、尖孢镰刀菌(Fusarium oxysporum)、异孢镰刀菌(Fusariumheterosporum)、大肠杆菌(Escherichia coli)、芽孢杆菌属(Bacillus)，优选地选自枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)、短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus)和地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)、假单胞菌属(Pseudomonas)，优选地荧光假单胞菌(Pseudomonas fluorescens)、巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)(也称为法夫驹形氏酵母(Komagataella phaffii))、嗜热毁丝霉(Myceliopthora thermophila)(c1)、喜热梭孢壳(Themothelomyces thermophilus)、粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe)、木霉属(Trichoderma)，优选地里氏木霉(Trichoderma reesei)和酵母属(Saccharomyces)，优选地酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)。可以使用源自上文所列微生物的宿主细胞生产根据本发明的甘露聚糖酶。

在一个实施方案中，细菌表达***选自大肠杆菌(E.coli)、芽孢杆菌属(Bacillus)、假单胞菌属(Pseudomonas)和链霉菌属(Streptomyces)。在一个实施方案中，酵母表达***选自假丝酵母属(Candida)、毕赤酵母属(Pichia)、酵母属(Saccharomyces)、裂殖酵母属(Schizosaccharomyces)。在一个实施方案中，真菌表达***选自青霉属(Penicillium)、曲霉属(Aspergillus)、镰刀菌属(Fusarium)、毁丝霉属(Myceliopthora)、根毛霉属(Rhizomucor)、根霉属(Rhizopus)、嗜热真菌属(Thermomyces)和木霉属(Trichoderma)。

优选地，本发明的重组宿主细胞是包括但不限于以下属的革兰氏阳性菌：芽孢杆菌属(Bacillus)、梭菌属(Clostridium)、肠球菌属(Enterococcus)、地芽孢杆菌属(Geobacillus)、乳杆菌属(Lactobacillus)、乳球菌属(Lactococcus)、海洋芽孢杆菌属(Oceanobacillus)、葡萄球菌属(Staphylococcus)、链球菌属(Streptococcus)和链霉菌属(Streptomyces)。更优选地，宿主细胞是芽孢杆菌细胞，更优选地选自嗜碱芽孢杆菌(Bacillus alkalophius)、解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefacins)、短芽孢杆菌(bacillus brevis)、环状芽孢杆菌(Bacillus circulans)、克劳氏芽孢杆菌(Bacillusclausii)、凝固芽孢杆菌(Bacillus coagulans)、坚强芽孢杆菌(Bacillus firmus)、bacillus jautus、迟缓芽孢杆菌(Bacillus lentus)、地衣芽孢杆菌(Bacilluslicheniformis)、巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)、短小芽孢杆菌(bacilluspumilus)、嗜热脂肪芽孢杆菌(Bacillus stearothermophilus)、枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)和苏云金芽孢杆菌(Baccillus thuringiensis)的组。最优选地，芽孢杆菌细胞选自枯草芽孢杆菌、短小芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌和迟缓芽孢杆菌。在一个实施方案中，芽孢杆菌细胞是枯草芽孢杆菌细胞。

本发明提供了一种生产发酵产物的发酵方法，其包括以下步骤

a)提供根据本发明的重组宿主细胞，和

b)在允许表达编码本发明甘露聚糖酶的多核苷酸的条件下培养重组宿主细胞。

在多核苷酸和多肽的上下文中，术语“异源的”(或外源的或外来的或重组的)在本文中定义为：

(a)不是宿主细胞天然的；或

(b)是宿主细胞天然的，但结构修饰，例如缺失、取代和/或***，是通过重组DNA技术对宿主细胞的DNA进行操作以改变天然序列的结果；或

(c)是宿主细胞天然的，但表达被定量改变或表达是从不同于天然宿主细胞的基因组位置定向的，这是通过重组DNA技术例如更强的启动子对宿主细胞的DNA进行操作的结果。

优选地，本文中的“异源的”意指“不是宿主细胞天然的”。

本发明一方面涉及宿主细胞，优选芽孢杆菌属宿主细胞，其表达编码与SEQ IDNO:2、或SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:4至少75％相同的多肽的多核苷酸，包含如上所述的氨基酸取代。

在一个实施方案中，宿主细胞表达编码与SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:3至少75％相同的甘露聚糖酶变体的多核苷酸，该多核苷酸在选自N341F、F346T、T348S/R/N/M/G、E349T/S/G/D、S352N/G、G356Y/V/T/Q/H/C和D379V的一个或多个位置具有氨基酸取代，其中编号根据SEQ ID NO:2。

在一个实施方案中，本发明涉及包含编码本发明甘露聚糖酶的多核苷酸的基因构建体。如本文所用，“基因构建体”或“表达盒”或“表达构建体”是一种DNA分子，其由至少一个待表达的与一个或多个如本文所述的控制序列(至少与启动子)有效连接的本发明多核苷酸序列组成。一般地，表达盒包含三种元件：启动子序列、开放阅读框和3'非翻译区，所述3'非翻译区在真核生物中通常含有聚腺苷酸化位点。

用于指导本发明的核酸构建体在细菌宿主细胞中转录的合适启动子的实例是从解淀粉芽孢杆菌α-淀粉酶基因(amyQ)、地衣芽孢杆菌α-淀粉酶基因(amyl)、地衣芽孢杆菌青霉素酶基因(penP)、嗜热脂肪芽孢杆菌生麦芽糖淀粉酶基因(amyM)、枯草芽孢杆菌果聚糖蔗糖酶基因(sacB)、枯草芽孢杆菌xylA和xylB基因、苏云金芽胞杆菌(Bacillusthurigiensis)cryIIIA基因(Agaisse和Lereclus，1994，Molecular Biology13:97-107)、大肠杆菌lac操纵子、大肠杆菌trc启动子(Egon等人，1988，Gene 69:301-315)、天蓝色链霉菌琼脂糖基因(dagA)和原核β-内酰胺酶基因中获得的启动子(Villa-Kamaroff等人，1978，Proc.Natl.Acad.Sci USA 75:3727-3731)，以及tac启动子(DaBoer等人，1983，Proc.Natl.Acad.Sci USA 80:21-25)获得的启动子。其他有用的启动子在Gilbert等人，1980，Scientific American 242:74-94的“Useful proteins fromrecombinant bacteria”中以及在Sambrook，J.等人，1989，Molecular Cloning:ALaboratory Manual，第2版，Cold Spring Harbor Laboratory Press，ColdSpringHarbor，NY中描述。

额外的调控元件可包括转录和翻译增强子。还可以将内含子序列添加到5'非翻译区(UTR)或编码序列中，以增加在胞质溶胶中积累的成熟信息的量。表达盒可以是载体的一部分或可以整合到宿主细胞的基因组中并与其宿主细胞的基因组一起复制。表达盒通常能够增加或减少表达。

如本文所用，术语“载体”包含任何种类适合于携带外来多核苷酸序列用于转移至另一个细胞或用于在给定细胞中稳定表达或瞬时表达的构建体。如本文所用，术语“载体”涵盖任何种类的克隆载体，如但不限于质粒、噬菌粒、病毒载体(例如，噬菌体)、噬菌体、杆状病毒、粘粒、福斯质粒(fosmid)、人工染色体、或和任何其他对具体目的宿主特异的载体。还包括低拷贝数载体或高拷贝数载体。外来多核苷酸序列通常包含在本文中称作“目的基因”的编码序列。取决于宿主细胞的来源或目的的种类，目的基因可以包含内含子和外显子。

如本文所用的载体可以提供用于在转化到宿主细胞或宿主细胞细胞器中后外来多核苷酸的转录和翻译的区段。此类额外的区段可包括调节核苷酸序列、一个或多个其在特定细胞类型中保持和/或复制所需的复制起点、一种或多种可选择标记、聚腺苷酸化信号、用于***外来编码序列的合适位点例如多克隆位点等。一个实例是当需要将载体作为附加体遗传元件(例如质粒或粘粒分子)保持在细菌细胞中时。合适的复制起点的非限制性实例包括f1-ori和colE1。载体可以复制而不整合到宿主细胞的基因组中，例如作为细菌宿主细胞中的质粒，或者它可以将其部分或全部DNA整合到宿主细胞的基因组中，从而导致其DNA的复制和表达。

可以通过克隆将外来核酸引入载体。克隆可意指通过合适的手段和方法(例如限制酶)切割载体(例如在多克隆位点内)和外来多核苷酸，可以在单个核酸内产生能够控制所述外来核酸与载体融合的合适的结构。一旦引入载体，则将包含编码序列的外来核酸合适的引入(转化、转导、转染等)到宿主细胞或宿主细胞细胞器中。可以选择适合于在宿主细胞或宿主细胞细胞器中表达外来多核苷酸序列的克隆载体。

如本文所提及的术语“引入”或“转化”包括将外源多核苷酸转移到宿主细胞中，而与用于转移的方法无关。即，如本文所用的术语“转化”独立于载体、穿梭***或宿主细胞，并且它不仅涉及本领域已知的转化的多核苷酸转移方法(参见，例如，Sambrook,J.等人(1989)Molecular Cloning:A Laboratory Manual,第2版,Cold Spring HarborLaboratory Press,Cold Spring Harbor,NY)，而且它包括任何其他种类的多核苷酸转移方法，例如但不限于转导或转染。能够随后通过器官发生或胚胎发生进行克隆繁殖的植物组织可以用基因构建体转化，并由此再生整株植物。选择的特定组织将根据可用于和最适合被转化的特定物种的克隆繁殖***而有所不同。在本发明的一个实施方案中，载体用于转化宿主细胞。

本发明的多核苷酸可以瞬时或稳定地引入宿主细胞，优选芽孢杆菌属宿主细胞，并且可以非整合的保持例如作为质粒。“稳定转化”意指转化的细胞或细胞器将包含外来编码序列的核酸传递给细胞或细胞细胞器的下一代。通常稳定的转化是由于包含外来编码序列的核酸整合到染色体中或作为附加体(核DNA的单独片段)。“瞬时转化”是指一旦转化的细胞或细胞细胞器在一定时间内表达外来核酸序列——大多在一代之内。通常瞬时转化是由于包含外来核酸序列的核酸没有整合到染色体中或作为附加体引起的。或者，它整合到宿主基因组中。

酶通常以液体浓缩物的形式生产，通常来自发酵液。“液体酶浓缩物”在本文中意指包含至少一种酶的任何液体含酶产品。酶浓缩物中的“液体”与20℃和101.3kPa时的物理外观有关。

液体酶浓缩物可以因溶剂中溶解固体酶而产生。溶剂可以选自水和有机溶剂。由固体酶溶解在溶剂中产生的液体酶浓缩物可包含高达饱和浓度的酶量。

本文中溶解意指固态化合物通过与至少一种溶剂接触而液化。溶解意指固态化合物在特定溶剂中完全溶解直至实现饱和浓度，其中无相分离发生。

在本发明的一个方面，酶浓缩物可以基本不含水，这意味着无明显量的水存在。本文中无明显量的水意指酶浓缩物包含按重量计少于25％、少于20％、少于15％、少于10％、少于7％、少于5％、少于4％、少于3％、少于2％的水，前述百分数均相对于酶浓缩物的总重量而言，或不含水。在一个实施方案中，不含水的酶浓缩物意指酶浓缩物不包含明显量的水，但以按重量计30％-80％量包含有机溶剂，前述百分数相对于酶浓缩物的总重量而言。

包含水的液体酶浓缩物可称为“含水酶浓缩物”。

在一个实施方案中，“含水酶浓缩物”是含酶溶液，其中固体酶产物已溶解在水中。在一个实施方案中，“含水酶浓缩物”意指由发酵产生的酶产生的含酶产品。

发酵意指在允许重组宿主细胞生长并表达所需蛋白质的合适营养培养基中培养表达所需酶的重组细胞的过程。在发酵结束时，通常收集并进一步加工发酵液，其中发酵液包含液体级分和固体级分。取决于酶是否已经分泌到液体级分，从发酵液的液体级分或从细胞裂解物回收所需的蛋白质或酶。使用本领域技术人员已知的方法回收所需的酶。从发酵液回收蛋白质或酶的适合方法包括但不限于收集、离心、过滤、提取和沉淀。

发酵产生的含水酶浓缩物可包含按重量计0.1％至40％、或按重量计0.5％至30％、或按重量计1％至25％、或按重量计3％至25％、或按重量计5％至25％范围内的酶量，前述百分数均相对于酶浓缩物的总重量而言。

发酵产生的含水酶浓缩物可包含按重量计多于约50％、按重量计多于约60％、按重量计多于约70％或按重量计多于约80％的量的水，前述百分数均相对于酶浓缩物的总重量而言。发酵产生的含水酶浓缩物可包含残余组分，例如源自发酵培养基的盐、源自生产宿主细胞的细胞碎片、生产宿主细胞在发酵过程中产生的代谢物。在一个实施方案中，残余组分以按重量计少于30％、按重量计少于20％、按重量计少于10％或按重量计少于5％的量包含于液体酶浓缩物中，前述百分数均相对于含水酶浓缩物的总重量而言。

如果保留在水性环境中，酶趋向于失去酶活性，因此将其转化为无水形式是常规做法：水性浓缩物可以例如在载体材料存在下冻干或喷雾干燥以形成聚集体。通常，固体酶产物需要在使用前“溶解”。为了稳定液体产物中的酶，通常使用酶抑制剂，优选可逆酶抑制剂，以暂时抑制酶活性直到释放酶抑制剂。

酶制剂

本发明的酶制剂优选为液体。酶制剂中的“液体”与20℃和101.3kPa时的物理外观有关。

本发明的酶制剂包含含有至少一种根据本发明的甘露聚糖酶变体的液体酶浓缩物。本发明的酶制剂仅包含有效稳定酶制剂或其中包含的酶的组分，例如选自至少一种酶稳定剂、至少一种稳定液体酶制剂本身的化合物和至少一种溶剂。

本发明的液体酶制剂优选不含表面活性剂。在一个实施方案中，不含表面活性剂意指本发明的酶制剂中不包含主动添加的表面活性剂。这意味着本发明的酶制剂可以包含表面活性剂，该表面活性剂源自酶浓缩物所源自的发酵过程(作为副产物)。

本发明的液体酶制剂优选不含络合剂。在一个实施方案中，不含络合剂意指本发明的酶制剂中不包含主动添加的络合剂。这意味着本发明的酶制剂可以包含络合剂，该络合剂源自酶浓缩物所源自的发酵过程(作为副产物)。

在一个实施方案中，本发明的液体酶制剂不含表面活性剂和络合剂。

一方面，本发明提供了一种液体酶制剂，其包含根据本发明的甘露聚糖酶变体，其与SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:4至少75％相同，以及至少一种选自由以下组成的组的其他酶：蛋白酶、淀粉酶、纤维素酶、脂肪酶、木聚糖酶、不同于根据本发明的甘露聚糖酶变体的甘露聚糖酶、角质酶、酯酶、植酸酶、DNA酶、果胶酶、果胶裂解酶、果胶分解酶、糖酶、***糖酶、半乳聚糖酶、黄原胶酶、木葡聚糖酶、漆酶、过氧化物酶和氧化酶。

在一个实施方案中，酶制剂除了包含至少一种根据本发明的甘露聚糖酶变体之外，还包含至少一种枯草杆菌蛋白酶。本文中枯草杆菌蛋白酶是指具有枯草杆菌蛋白酶相关蛋白酶的催化三联体的丝氨酸蛋白酶。实例包括如在WO 89/06276和EP 0283075、WO 89/06279、WO 89/09830、WO 89/09819、WO 91/06637和WO 91/02792中描述的枯草杆菌蛋白酶。

为了本发明的目的，至少一种蛋白酶可以选自以下：来自解淀粉芽孢杆菌BPN'的枯草杆菌蛋白酶(由Vasantha等人(1984)J.Bacteriol.第159卷,第811-819页和JA Wells等人(1983)in Nucleic Acids Research,第11卷,第7911-7925页描述)；来自地衣芽孢杆菌的枯草杆菌蛋白酶(枯草杆菌蛋白酶Carlsberg；在EL Smith等人(1968)in J.BiolChem,第243卷,第2184-2191页和Jacobs等人(1985)in Nucl.Acids Res,第13卷,第8913-8926页中公开)；枯草杆菌蛋白酶PB92(碱性蛋白酶PB92的原始序列描述于EP 283075A2)；如WO 89/06279中所公开的枯草杆菌蛋白酶147和/或309(分别为

)；来自如WO 91/02792中公开的迟缓芽孢杆菌的枯草杆菌蛋白酶，例如来自迟缓芽孢杆菌DSM 5483或如WO 95/23221中描述的迟缓芽孢杆菌DSM 5483的变体；来自DE 10064983中公开的嗜碱芽孢杆菌(DSM 11233)的枯草杆菌蛋白酶；来自WO 2003/054184中公开的吉氏芽孢杆菌(Bacillus gibsonii)的枯草杆菌蛋白酶(DSM 14391)；来自WO 2003/056017中公开的芽孢杆菌属(DSM 14390)的枯草杆菌蛋白酶；来自WO 2003/055974中公开的芽孢杆菌属(DSM 14392)的枯草杆菌蛋白酶；来自WO 2003/054184中公开的吉氏芽孢杆菌(DSM 14393)的枯草杆菌蛋白酶；具有如WO 2005/063974中所述的SEQ ID NO:4的枯草杆菌蛋白酶；具有如WO 2005/103244中所述的SEQ ID NO:4的枯草杆菌蛋白酶；具有如WO 2005/103244中所述的SEQ ID NO:7的枯草杆菌蛋白酶；和具有如申请DE 102005028295.4中所述的SEQ IDNO:2的枯草杆菌蛋白酶。

根据本发明的有用蛋白酶的实例包括描述于以下的变体：WO 92/19729、WO 95/23221、WO 96/34946、WO 98/20115、WO 98/20116、WO 99/11768、WO 01/44452、WO 02/088340、WO 03/006602、WO 2004/03186、WO 2004/041979、WO 2007/006305、WO 2011/036263、WO 2011/036264和WO 2011/072099。合适的实例尤其包括源自如EP 1921147中所述的SEQ ID NO:22(其是来自迟缓芽孢杆菌DSM 5483的成熟碱性蛋白酶的序列)的枯草杆菌蛋白酶的蛋白酶变体，在以下位置的一个或多个处具有氨基酸取代：3、4、9、15、24、27、33、36、57、68、76、77、87、95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、106、118、120、123、128、129、130、131、154、160、167、170、194、195、199、205、206、217、218、222、224、232、235、236、245、248、252和274(根据BPN'编号)，具有蛋白质水解活性。在一个实施方案中，这样的枯草杆菌蛋白酶在位置Asp32、His64和Ser221(根据BPN'编号)没有突变。

至少一种枯草杆菌蛋白酶可具有如EP 1921147中所述的SEQ ID NO:22(其在本文中可称为BLAP WT)，或者是其变体，其与如EP1921147中所述的SEQ ID NO:22至少80％相同并且具有蛋白质水解活性。在一个实施方案中，枯草杆菌蛋白酶与如EP 1921147中所述的SEQ ID NO:22至少80％相同，并且其特征在于在第101位(根据BPN'编号)具有氨基酸谷氨酸(E)、或天冬氨酸(D)、或天冬酰胺(N)、或谷氨酰胺(Q)、或丙氨酸(A)、或甘氨酸(G)、或丝氨酸(S)并具有蛋白质水解活性。在一个实施方案中，枯草杆菌蛋白酶与如EP 1921147中所述的SEQ ID NO:22至少80％相同，其特征在于在第101位(根据BPN'编号)具有氨基酸谷氨酸(E)或天冬氨酸(D)并具有蛋白质水解活性。此类枯草杆菌蛋白酶变体可单独或与在以下位置的一个或多个取代组合在第101位包含氨基酸取代，例如R101E或R101D：3、4、9、15、24、27、33、36、57、68、76、77、87、95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、106、118、120、123、128、129、130、131、154、160、167、170、194、195、199、205、206、217、218、222、224、232、235、236、245、248、252和/或274(根据BPN'编号)并具有蛋白质水解活性。在一个实施方案中，所述蛋白酶包含一个或多个另外的取代：(a)第3位的苏氨酸(3T)，(b)第4位的异亮氨酸(4I)，(c)第63位的丙氨酸、苏氨酸或精氨酸(63A、63T或63R)，(d)第156位的天冬氨酸或谷氨酸(156D或156E)，(e)第194位的脯氨酸(194P)，(f)第199位的甲硫氨酸(199M，(g)第205位的异亮氨酸(205I)，(h)第217位的天冬氨酸、谷氨酸或甘氨酸(217D、217E或217G)，(i)根据(a)至(h)的两种或更多种氨基酸的组合。

合适的蛋白酶还包括那些具有蛋白质水解活性的上述蛋白酶的变体。在一个实施方案中，蛋白酶变体包括与上文公开的亲本酶的全长多肽序列具有至少40至100％同一性的变体。在一个实施方案中，具有蛋白质水解活性的蛋白酶变体与上文公开的亲本酶的全长多肽序列至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％相同。

在另一个实施方案中，本发明涉及包含不属于相应蛋白酶的功能域的保守突变的蛋白酶变体。该实施方案的具有蛋白质水解活性的蛋白酶变体可以与亲本酶的全长多肽序列至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％相似。

在一个实施方案中，当所述蛋白酶变体与亲本蛋白酶相比表现出增加的蛋白质水解活性时，蛋白酶变体具有根据本发明的蛋白质水解活性。

在一个实施方案中，当所述蛋白酶变体表现出相应的亲本蛋白酶的蛋白质水解活性的至少20％、至少25％、至少30％、至少35％、至少40％、至少45％、至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％，或100％时，蛋白酶变体具有根据本发明的蛋白质水解活性。

合适的枯草杆菌蛋白酶可以与如EP 1921147中描述的SEQ ID NO:22至少80％相同，并且其特征在于包含一个氨基酸(根据(a)-(h))或根据(i)与氨基酸101E、101D、101N、101Q、101A、101G或101S(根据BPN'编号)的组合并具有蛋白质水解活性。

在一个实施方案中，枯草杆菌蛋白酶与如EP 1921147中所述的SEQ ID NO:22至少80％相同，并且其特征在于包含突变(根据BPN'编号)R101E，或S3T+V4I+V205I，或S3T+V4I+R101E+V205I或S3T+V4I+V199M+V205I+L217D，并具有蛋白质水解活性。

在另一个实施方案中，枯草杆菌蛋白酶包含具有与如EP 1921147中所述的SEQ IDNO:22至少80％同一性的氨基酸序列，并进一步表征为包含S3T+V4I+S9R+A15T+V68A+D99S+R101S+A103S+I104V+N218D(根据BPN'编号)并具有蛋白质水解活性。

枯草杆菌蛋白酶可以具有与如EP 1921147中所述的SEQ ID NO:22至少80％相同的氨基酸序列，并进一步表征为包含R101E，和一个或多个选自由以下组成的组的取代：S156D、L262E、Q137H、S3T、R45E,D,Q、P55N、T58W,Y,L、Q59D,M,N,T、G61 D,R、S87E、G97S、A98D,E,R、S106A,W、N117E、H120V,D,K,N、S125M、P129D、E136Q、S144W、S161T、S163A,G、Y171L、A172S、N185Q、V199M、Y209W、M222Q、N238H、V244T、N261T,D和L262N,Q,D(如WO 2016/096711中所述和根据BPN'编号)，并具有蛋白质水解活性。

在一个方面，本发明提供了一种液体酶制剂，其包含根据本发明的甘露聚糖酶变体，其与SEQ ID NO:2至少75％相同，优选与根据SEQ ID NO:3的序列至少75％相同的甘露聚糖酶，至少一种稳定液体酶制剂本身的化合物、至少一种溶剂和任选的至少一种酶稳定剂。

稳定液体酶制剂本身的化合物

稳定液体酶制剂本身的化合物意指除酶稳定剂以外的以有效确保储存稳定性的量建立液体制剂的储存稳定性所需的任何化合物。

对于本领域技术人员而言，在液体制剂的背景下，储存稳定性通常包括产品外观和剂量均匀性方面。

产品的外观受产品的pH值以及防腐剂、抗氧化剂、粘度调节剂、乳化剂等化合物的存在影响。

剂量的均匀性通常与产品的同质性有关。

本发明的酶制剂可以是碱性的或表现出中性或微酸性的pH值。酶制剂的pH可以在5-12的范围内，优选在6-11的范围内，更优选在选自6-10、7-9和7.5-8.5的范围内。

本发明的液体酶制剂可以包含至少一种防腐剂。防腐剂以有效防止液体酶制剂，优选水性酶制剂的微生物污染的量添加。

本领域技术人员已知的一种或多种防腐剂可以相对于酶制剂的总重量以0.0001至10％的浓度添加到酶制剂中。

本发明在一个方面涉及保护根据本发明的水性酶制剂免受微生物污染或生长的方法，该方法包括添加选自由以下组成的组的抗微生物剂：相对于包含根据本发明的甘露聚糖酶变体的水性酶浓缩物浓度为0.01％至5％，更优选0.1％至2％的2-苯氧乙醇、浓度为2ppm至5000ppm，更优选10ppm至2000ppm的戊二醛、浓度为5ppm至5000ppm，更优选20ppm至1000ppm的2-溴-2-硝基丙烷-1,3-二醇、浓度为0.01％至3％，更优选0.05％至0.5％的酸形式的甲酸或其盐和浓度为0.001％至1％，更优选0.002％至0.6％的4,4'-二氯2-羟基二苯醚。

在一个实施方案中，本发明的液体酶制剂不含防腐剂，这意味着包含的防腐剂的量少于1ppm。在一个实施方案中，“不含防腐剂”意指本发明的酶制剂中不包含主动添加的防腐剂。这意味着酶制剂可包含源自酶浓缩物所源自的发酵过程的防腐剂(作为副产物)。

溶剂

在一个实施方案中，本发明的酶制剂是水性的，包含按重量计5％至95％的范围内、按重量计5％至30％的范围内、按重量计5％至25％的范围内或按重量计20％至70％的范围内的量的水，前述百分数均相对于酶制剂的总重量而言。

在一个实施方案中，本发明的酶制剂包含至少一种选自乙醇、正丙醇、异丙醇、正丁醇、异丁醇、仲丁醇、乙二醇、丙二醇、1,3-丙二醇、丁二醇、甘油、二甘醇、丙基二甘醇、丁基二甘醇、己二醇、乙二醇甲醚、乙二醇***、乙二醇丙醚和苯氧乙醇，优选乙醇、异丙醇或丙二醇的有机溶剂。另外，本发明的酶制剂可以含有至少一种选自如2-丁氧基乙醇、异丙醇、d-柠檬烯等化合物中的有机溶剂。

在优选的实施方案中，本发明的酶制剂包含至少一种水混溶性有机溶剂。本文中的水混溶性意指有机溶剂在水中以所有比例混合，形成均匀溶液的性质。优选地，至少一种水混溶性溶剂选自乙醇、异丙醇或1,2-丙二醇。

在一个实施方案中，本发明的酶制剂包含

(a)在约20％至50％的范围内的量的水，和

(b)至少一种有机溶剂，其量按重量计为30％至60％的范围内，或按重量计为45％至55％的范围内，前述百分数均相对于酶制剂的总重量而言。

在一个实施方案中，本发明的酶制剂包含相对于酶制剂的总重量按重量计为0％至20％范围内的量的有机溶剂。优选地，本发明的酶制剂包含按重量计为约30％至80％范围内的的量的水和至少一种按重量计少于10％、按重量计少于5％或按重量计少于1％的有机溶剂，前述百分数均相对于酶制剂的总重量而言。

在一个实施方案中，酶制剂包含按重量计为5％至15％的范围内的量的水并且没有明显量的有机溶剂，例如按重量计1％或更少，前述百分数均相对于酶制剂的总重量而言。

酶稳定剂

酶的稳定性涉及时间过程中的稳定性(例如储存稳定性)、热稳定性、pH稳定性和化学稳定性。本文中的术语“酶稳定性”优选地涉及作为时间例如在储存或操作期间的函数的酶活性的保留。酶稳定剂使酶稳定在液体，优选水环境中，这意味着它减少或避免了酶活性随着时间的推移而丧失。

在一个实施方案中，至少一种酶，优选至少一种根据本发明的甘露聚糖酶变体，通过酶制剂中钙和/或镁离子的水溶性源的存在而稳定。在一个实施方案中，至少一种酶稳定剂选自多元醇或水溶性盐。

多元醇可选自含有2至6个羟基的多元醇。合适的实例包括二醇、1,2-丙二醇、1,3-丙二醇、1,2-丁二醇、1,4-丁二醇、1,2-戊二醇、1,6-己二醇、乙二醇、己二醇、甘油、山梨糖醇、甘露糖醇、赤藓糖醇、葡萄糖、果糖和乳糖。

水溶性盐可以选自如NaCl或KCl的盐，以及乳酸和甲酸的碱金属盐。

在本发明的一个实施方案中，水溶性盐可以选自最终组合物中的锌(II)、钙(II)和/或镁(II)离子的水溶性来源，所述最终组合物为酶提供这样的离子，以及其他金属离子(例如钡(II)、钪(II)、铁(II)、锰(II)、铝(III)、锡(II)、钴(II)、铜(II)、镍(II)和氧钒(IV))。优选地，水溶性盐选自CaCl₂和MgCl₂。

在一个实施方案中，酶制剂包含蛋白酶，优选丝氨酸蛋白酶(EC3.4.21)，更优选枯草杆菌蛋白酶EC 3.4.21.62；和/或脂肪酶，优选三酰基甘油脂肪酶(EC 3.1.1.3)，更优选疏棉状嗜热丝孢菌脂肪酶。在本文中，酶稳定剂可以选自含硼化合物、多元醇、肽醛、其他稳定剂及其混合物。

含硼化合物可以选自硼酸或其衍生物和亚硼酸或其衍生物如芳基亚硼酸或其衍生物、其盐以及其混合物。本文中的硼酸可称为原硼酸。

在一个实施方案中，含硼化合物选自由芳基亚硼酸及其衍生物组成的组。在一个实施方案中，含硼化合物选自由苯亚硼酸(BBA)(其也称为苯基亚硼酸(PBA))其衍生物以及其混合物组成的组。

在一个实施方案中，苯基-亚硼酸衍生物选自由以下组成的组：4-甲酰基苯基亚硼酸(4-FPBA)、4-羧基苯基亚硼酸(4-CPBA)、4-(羟甲基)苯基亚硼酸(4-HMPBA)和对甲苯基亚硼酸(p-TBA)。

在一个实施方案中，酶制剂，优选另外包含枯草杆菌蛋白酶的那些，包含相对于酶制剂的总重量按重量计为约0.1-2％的至少一种含硼化合物。优选地，酶制剂包含相对于酶制剂的总重量按重量计为约0.15-1％、或0.2-0.5％、或约0.3％的至少一种含硼化合物。更优选地，酶制剂包含相对于酶制剂的总重量按重量计为约0.3％的4-FPBA。

在一个实施方案中，至少一种酶稳定剂选自肽稳定剂。至少一种肽稳定剂可以选自式(D)的化合物：

式(D)中的R¹、R²、R³、R⁴、R⁵和Z定义如下：

R¹、R²和R³各自独立地选自由以下组成的组：氢、任选取代的C_1-8烷基、任选取代的C_2-6烯基、任选取代的C_1-8烷氧基，任选取代的3-至12-元环烷基和任选取代的6-至10-元芳基；或其中R¹、R²和R³各自独立地选择为–(CH₂)₃-，其也连接至–NH-C(H)-的氮原子，使得–N-C(H)R^1,2或3-形成一个5-元杂环；

R⁴和R⁵各自独立地选自由以下组成的组：氢、任选取代的C_1-8烷基、任选取代的C_2-6烯基、任选取代的C_1-8烷氧基、任选取代的C_1-4酰基、任选取代的C_1-8烷基苯基(例如苄基)和任选取代的6-至10-元芳基；或其中R⁴和R⁵连接形成任选取代的5-或6-元环；

Z选自氢、N末端保护基团和一个或多个任选地包含N末端保护基团的氨基酸残基。

在优选的实施方案中，肽稳定剂选自根据式(D)的化合物，其中

·R¹和R²是这样的基团，使得NH-CHR¹-CO和NH-CHR²-CO各自是选自Ala、Cys、Gly、Pro、Ser、Thr、Val、Nva或Nle的L或D-氨基酸残基，并且R³是这样的基团，使得NH-CHR³-CO是选自Tyr、间-酪氨酸、3,4-二羟基苯丙氨酸、Phe、Val、Ala、Met、Nva、Leu、Ile或Nle的L或D-氨基酸残基；优选R¹为Val，R²为Ala且R³为Leu

和

·N末端保护基团Z选自苄氧基羰基(Cbz)、对甲氧基苄基羰基(MOZ)、苄基(Bn)、苯甲酰基(Bz)、对甲氧基苄基(PMB)、对甲氧基苯基(PMP)、甲酰基、乙酰基(Ac)、甲氧基、烷氧基羰基、甲氧基羰基、芴基甲氧羰基(Fmoc)或叔丁氧羰基(Boc)；优选Z是苄氧羰基(Cbz)。

本发明的酶制剂，优选另外包含枯草杆菌蛋白酶的那些，可包含按重量计为约0.05％至2％的范围内、按重量计为约0.08％至1％的范围内或按重量计为0.1至0.5％的范围内的肽稳定剂的总量，前述百分数均相对于酶制剂的总重量而言。优选地，相对于酶制剂的总重量，酶制剂包含按重量计为约0.3％的如上所公开的肽稳定剂。

甘露聚糖酶应用

一方面，本发明涉及优选具有5-12范围内的pH的制剂，其包含至少一种根据本发明的甘露聚糖酶变体。

一方面，本发明涉及根据本发明的甘露聚糖酶变体被配制成用于洗衣和硬表面清洁的洗涤剂制剂如I&I和家庭护理制剂中的用途，其中至少根据本发明的甘露聚糖酶变体和至少一种洗涤剂组分在一个或多个步骤中以无特定顺序与一种或多种洗涤剂组分混合。因此，本发明的洗涤剂制剂包含至少一种本发明的甘露聚糖酶变体。在一个实施方案中，根据本发明的甘露聚糖酶变体包含在液体酶制剂中。

在一个实施方案中，至少一种本发明的甘露聚糖酶以按重量计为约0.0005％至0.005％，或按重量计0.0005％至0.002％的量包含在本发明的洗涤剂制剂中，前述百分数均相对于洗涤剂制剂的总重量而言，并且其中该量涉及酶的100％活性含量。

在一个实施方案中，制剂具有6-11范围内的pH，更优选选自6-10、7-9和7.5-8.5的范围内的pH。在一个实施方案中，制剂是洗涤剂制剂，优选液体洗涤剂制剂。

根据本发明的洗涤剂制剂包含一种或多种洗涤剂组分。选择的组分(一种或多种)取决于所需的洗涤或清洁应用和/或洗涤剂制剂的物理形式。

术语“洗涤剂组分”在本文中定义为意指适用于洗涤剂制剂的任何类型的成分，例如表面活性剂、助洗剂、聚合物、漂白体系。任何本领域已知的承认其已知特性的组分(一种或多种)都是根据本发明的合适的洗涤剂组分(一种或多种)。洗涤剂组分在一个实施方案中意指当以有效量存在时提供洗涤或清洁性能或有效帮助加工(在加工、储存和使用期间保持物理特性；例如流变改性剂、水溶助长剂、干燥剂)的组分。

通常，洗涤剂制剂是多于两种洗涤剂组分的复合制剂。

洗涤剂组分在洗涤剂制剂的最终应用中可以具有多于一种功能，因此在本文特定功能的上下文中提及的任何洗涤剂组分也可以在洗涤剂制剂的最终应用中具有另一种功能。特定洗涤剂组分在洗涤剂制剂的最终应用中的功能通常取决于其在洗涤剂制剂中的量，即洗涤剂组分的有效量。

术语“有效量”包括提供有效去除污渍和有效清洁条件(例如pH、起泡量)的单个组分的量、有效提供光学益处(例如荧光增白、染料转移抑制)的某些组分的量和有效帮助加工(在加工、储存和使用过程中保持物理特性；例如流变改性剂、水溶助长剂、干燥剂)的某些组分的量。

在一个实施方案中，根据本发明的洗涤剂制剂是多于两种洗涤剂组分的制剂，其中至少一种组分可有效去除污渍，至少一种组分可有效提供最佳清洁条件，以及至少一种组分可有效保持洗涤剂的物理特性。

单独的洗涤剂组分和在洗涤剂制剂中的用途是本领域技术人员已知的。合适的洗涤剂组分尤其包含表面活性剂、助洗剂、聚合物、碱、漂白体系、荧光增白剂、抑泡剂和稳定剂、水溶助长剂和腐蚀抑制剂。进一步的实例描述在例如“complete Technology Book onDetergents with Formulations(Detergent Cake,Dishwashing Detergents,Liquid&Paste Detergents,Enzyme Detergents,Cleaning Powder&Spray Dried WashingPowder)”,Engineers India Research Institute(EIRI),第6版(2015)。本领域技术人员的另一本参考书可以是“Detergent Formulations Encyclopedia”,SolverchemPublications,2016。

洗涤剂制剂中的洗涤剂成分的类型和/或量取决于所需的应用例如洗涤白色纺织品、有色纺织品和羊毛而有所不同。选择的组分(一种或多种)进一步取决于洗涤剂制剂的物理形式(液体、固体、凝胶、以小袋或片剂形式提供等)。例如用于洗涤制剂选择的组分进一步取决于区域惯例(regional conventions)，这些惯例本身与如使用的洗涤温度、洗衣机的机械(垂直轴与水平轴机器)、每个洗涤周期的耗水量等以及地理特征如水的平均硬度等方面有关。

例如：低洗涤剂浓度***包括洗衣制剂，其中在洗涤水中存在少于约800ppm的洗涤剂组分。中等洗涤剂浓度包括洗涤制剂，其中在洗涤水中存在约800ppm和约2,000ppm之间的洗涤剂组分。高洗涤剂浓度包括洗衣制剂，其中洗涤水中存在多于约2,000ppm的洗涤剂组分。

列举的各个洗涤剂组分的数值范围提供了洗涤剂制剂中包含的量。这样的范围必须被理解为包括定义范围的数字并且包括定义范围内的每个整数。

如果没有另外描述，“％按重量计”或“％w/w”意指与总洗涤剂制剂有关。在这种情况下，“％按重量计”或“％w/w”的计算方法如下：物质的浓度为该物质的重量除以制剂的总重量，再乘以100。

在一个实施方案中，根据本发明的洗涤剂制剂包含一种或多种表面活性剂。“表面活性剂”(在本文中与“表面活性试剂”同义使用)意指有机化学物质，当添加到液体中时，它会改变该液体在界面处的特性。根据其离子电荷，表面活性剂称为非离子的、阴离子的、阳离子的或两性的表面活性剂。

表面活性剂的非限制性实例公开于McCutcheon's 2016Detergents andEmulsifiers,and McCutcheon's 2016Functional Materials,北美和国际版,MCPublishing Co,2016年版。在本领域技术人员已知的相同出版物的早期版本中公开了更多有用的实例。

在一个实施方案中，根据本发明的洗涤剂制剂包含按重量计为1％至30％的范围内、按重量计为3％至25％的范围内、按重量计为5％至20％的范围内或按重量计为8％至15％的范围内的阴离子表面活性剂的总量，前述百分数均相对于洗涤剂制剂的总重量而言。在一个实施方案中，本发明的洗涤剂制剂包含相对于洗涤剂制剂总重量按重量计为约11％的阴离子表面活性剂的总量。

在一个实施方案中，根据本发明的洗涤剂制剂包含至少一种选自通式(I)化合物的阴离子表面活性剂：

通式(I)中的变量定义如下：

R¹选自C₁-C₂₃-烷基(例如1-、2-、3-、4-C₁-C₂₃-烷基)和C₂-C₂₃-烯基，其中烷基和/或烯基为直链或支链，其中2-、3-或4-烷基；实例是n-C₇H₁₅、n-C₉H₁₉、n-C₁₁H₂₃、n-C₁₃H₂₇、n-C₁₅H₃₁、n-C₁₇H₃₅、i-C₉H₁₉、i-C₁₂H₂₅。

R²选自H、C₁-C₂₀-烷基和C₂-C₂₀-烯基，其中烷基和/或烯基为直链或支链。

R³和R⁴，各自独立地选自C₁-C₁₆-烷基，其中烷基为直链或支链；实例是甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、异丁基、仲丁基、叔丁基、正戊基、异戊基、仲戊基、新戊基、1,2-二甲基丙基、异戊基、正己基、异己基、仲己基、正庚基、正辛基、2-乙基己基、正壬基、正癸基、异癸基。

A^-选自–RCOO^-、-SO₃ ^-和RSO₃ ^-，其中R选自直链或支链C₁-C₈-烷基和C₁-C₄羟烷基，其中烷基是。当A^-是SO₃ ^-时，化合物可称为(脂肪)醇/烷基(乙氧基/醚)硫酸盐[(F)A(E)S]，当A^-是–RCOO^-时，化合物可称为(脂肪)醇/烷基(乙氧基/醚)羧酸盐[(F)A(E)C]。

M⁺选自H和成盐阳离子。成盐阳离子可以是单价或多价的；因此M⁺等于1/v M^v+。实例包括但不限于钠、钾、镁、钙、铵以及单-、二和三乙醇胺的铵盐。

通式(I)的整数定义如下：

m在0至200的范围内，优选1-80的范围内，更优选3-20的范围内；n和o，各自独立地在0到100的范围内；n优选在1至10的范围内，更优选1至6的范围内；o优选在1至50的范围内，更优选在4至25的范围内。m、n和o的总和至少为1，优选m、n和o的总和在5至100的范围内，更优选在9至50的范围内。

通式(I)的阴离子表面活性剂可以是任何结构、嵌段共聚物或无规共聚物。

其他合适的阴离子表面活性剂包括C₁₂-C₁₈磺基脂肪酸烷基酯(例如C₁₂-C₁₈磺基脂肪酸甲酯)、C₁₀-C₁₈-烷基芳基磺酸(例如nC₁₀-C₁₈-烷基苯磺酸)的盐(M⁺)和C₁₀-C₁₈烷基烷氧基羧酸盐。

M⁺在所有情况下均选自成盐阳离子。成盐阳离子可以是单价或多价的；因此M⁺等于1/v M^v+。实例包括但不限于钠、钾、镁、钙、铵以及单-、二和三乙醇胺的铵盐。

洗涤剂制剂可包含至少两种选自通式(I)化合物的阴离子表面活性剂，其中所述阴离子表面活性剂之一的特征在于R¹为C₁₁，R²为H，m为2，n和o＝0，A^-为SO₃ ^-，M⁺为Na⁺，和另一种表面活性剂，其特征在于R¹为C₁₃，R²为H，m为2，n和o＝0，A^-为SO₃ ^-，M⁺为Na⁺。

在一个实施方案中，洗涤剂制剂包含至少一种选自通式(II)化合物的阴离子表面活性剂：

其中式(II)中的R¹为C₁₀-C₁₃烷基。

洗涤剂制剂可以包含至少两种选自通式(II)的化合物的阴离子表面活性剂，其中所述阴离子表面活性剂之一的特征在于R¹为C₁₀，而另一种表面活性剂的特征在于R¹为C₁₃。像这样的化合物在本文中可以称为LAS(直链烷基苯磺酸盐)。

本发明的洗涤剂制剂可包含按重量计为约1％至约15％的范围内、按重量计为约3％至约12％的范围内或按重量计为约4％至约8％的范围内的非离子表面活性剂的总量，前述百分数均相对于洗涤剂制剂的总重量而言。在一个实施方案中，相对于洗涤剂制剂的总重量本发明的洗涤剂制剂包含按重量计为约5.5％的非离子表面活性剂的总量。

在一个实施方案中，根据本发明的洗涤剂制剂包含至少一种根据通式(III)的非离子表面活性剂：

通式(III)的变量定义如下：

R¹选自C₁-C₂₃烷基和C₂-C₂₃烯基，其中烷基和/或烯基为直链或支链；实例是n-C₇H₁₅、n-C₉H₁₉、n-C₁₁H₂₃、n-C₁₃H₂₇、n-C₁₅H₃₁、n-C₁₇H₃₅、i-C₉H₁₉、i-C₁₂H₂₅。

R²选自H、C₁-C₂₀烷基和C₂-C₂₀烯基，其中烷基和/或烯基为直链或支链。

R³和R⁴各自独立地选自C₁-C₁₆烷基，其中烷基为直链或支链；实例是甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、异丁基、仲丁基、叔丁基、正戊基、异戊基、仲戊基、新戊基、1,2-二甲基丙基、异戊基、正己基、异己基、仲己基、正庚基、正辛基、2-乙基己基、正壬基、正癸基、异癸基。

R⁵选自H和C₁-C₁₈烷基，其中烷基为直链或支链。

通式(III)的整数定义如下：

m在0至200的范围内，优选1-80的范围内，更优选3-20的范围内；n和o，各自独立地在0至100的范围内；n优选在1至10的范围内，更优选1至6的范围内；o优选在1至50的范围内，更优选在4至25的范围内。m、n和o的总和至少为1，优选m、n和o的总和在5至100的范围内，更优选在9至50的范围内。

通式(III)的非离子表面活性剂可以是任何结构，可以是嵌段结构或无规结构，不限于式(III)所示的顺序。

根据式(III)的化合物在本文中可称为烷基聚乙二醇醚(AEO)。

在一个实施方案中，洗涤剂制剂包含至少一种选自通式(III)的非离子表面活性剂，其中m在3至11的范围内，优选不多于7；n和o是0，R¹是C₁₂-C₁₄，R⁵是H。洗涤剂制剂可以包含至少两种选自通式(III)的化合物的非离子表面活性剂，其中所述非离子表面活性剂之一的特征在于R¹为C₁₂，R⁵为H，m为7，n和o＝0，另一种表面活性剂的特征在于R¹为C₁₄，R⁵为H，m为7，n和o＝0。

根据本发明的洗涤剂制剂可以包含一种或多种选自络合剂(螯合剂、多价螯合剂)、沉淀剂和离子交换化合物的化合物，它们可以与钙和镁形成水溶性络合物。此类化合物在本文中可称为“助洗剂”或“助洗试剂”，但无意将此类化合物限制为在洗涤剂制剂的最终应用中的此功能。在一个实施方案中，本发明的洗涤剂制剂包含至少一种选自非磷酸盐基助洗剂如葡萄糖酸钠、柠檬酸盐(一种或多种)、硅酸盐(一种或多种)、碳酸盐(一种或多种)、膦酸盐(一种或多种)、氨基羧酸盐(一种或多种)、聚羧酸盐(一种或多种)、聚磺酸盐(一种或多种)和聚膦酸盐(一种或多种)的助洗剂。

在一个实施方案中，本发明的洗涤剂制剂包含至少一种“柠檬酸盐”，该“柠檬酸盐”选自单碱金属盐和二碱金属盐，特别是柠檬酸的单钠盐和优选柠檬酸的三钠盐、柠檬酸的铵盐或取代的铵盐以及柠檬酸本身。柠檬酸盐可用作无水化合物或水合物，例如柠檬酸钠二水合物。柠檬酸盐可以以按重量计0％至约20％的范围内、按重量计约0.5％至约10％的范围内或按重量计1-5％的范围内的总量包含，前述百分数均相对于洗涤剂制剂的总重量而言。在一个实施方案中，本发明的洗涤剂制剂包含相对于洗涤剂制剂的总重量在约1-3％范围内的柠檬酸盐的总量。

本发明的洗涤剂制剂可包含一种或多种水溶助长剂。一种或多种水溶助长剂可选自有机溶剂如乙醇、异丙醇、乙二醇、1,2-丙二醇，以及本领域已知的在正常条件下与水混溶的其他有机溶剂，但不限于此。在一个实施方案中，本发明的洗涤剂制剂以按重量计为5-10％的范围内，优选按重量计为约6％的总量包含1,2-丙二醇，前述百分数均相对于洗涤剂制剂的总重量而言。

在一个实施方案中，本发明的洗涤剂制剂不包含除根据本发明的甘露聚糖酶之外的任何其他酶。

洗涤剂制剂可以包含除根据本发明的甘露聚糖酶变体之外的一种或多种其他酶，其选自由以下组成的组：蛋白酶、淀粉酶、纤维素酶、脂肪酶、木聚糖酶、不同于根据本发明的甘露聚糖酶变体甘露聚糖酶、角质酶、酯酶、植酸酶、DNA酶、果胶酶、果胶裂解酶、果胶分解酶、糖酶、***糖酶、半乳聚糖酶、黄原胶酶、木葡聚糖酶、漆酶、过氧化物酶和氧化酶。优选地，洗涤剂制剂至少包含本文公开的蛋白酶。

蛋白酶可以以按重量计为约0.004-0.4％、按重量计为0.008-0.3％、按重量计为0.04-0.25％的量包含在本发明的洗涤剂制剂中，前述百分数均相对于洗涤剂制剂的总重量而言，并且其中所述量与酶的100％活性含量有关。

洗涤剂制剂可包含钙和/或镁离子的水溶性来源。在一个实施方案中，洗涤剂制剂包含至少一种选自以上公开的多元醇和水溶性盐的酶稳定剂。

洗涤剂制剂可以包含至少一种选自如上文公开的含硼化合物和肽稳定剂的酶稳定剂。

根据本发明的甘露聚糖酶变体可优选在选自≤60℃、≤40℃和≤25℃的温度下发挥其甘露聚糖降解活性。优选地，温度是洗涤或清洁温度。本文洗涤或清洁背景下的甘露聚糖降解活性涉及其去除含甘露聚糖污渍的能力。

在一个实施方案中，本发明的洗涤剂制剂是洗衣洗涤剂。

术语“洗衣”涉及家用洗衣和工业洗衣两者，并且意指用包含本发明的洗涤剂制剂的溶液处理纺织品的过程。洗衣过程可以通过使用技术装置如家用或工业洗衣机来进行。或者，洗涤过程可以手工完成。

术语“纺织品”意指任何纺织材料，包括纱线(由用于针织或编织的天然或合成纤维制成的线)、纱线中间体、纤维、无纺材料、天然材料、合成材料，以及由这些材料制成的织物(由编织、针织或毡合纤维制成的纺织品)，例如服装(由纺织品制成的任何服装物品)、布料和其他物品。

术语“纤维”包括天然纤维、合成纤维及其混合物。天然纤维的实例是植物(例如亚麻、黄麻和棉花)或动物来源的，包括蛋白质如胶原蛋白、角蛋白和丝心蛋白(例如丝绸、羊毛、安哥拉羊毛(angora)、马海毛、羊绒)。合成来源的纤维的实例是聚氨酯纤维，例如

或

聚酯纤维，聚烯烃如弹性纤维(elastofin)，或聚酰胺纤维如尼龙。纤维可以是单纤维或纺织品一部分，例如针织品、织造物或非织造物。

本发明涉及提供包含液体甘露聚糖酶的制剂，优选液体洗涤剂制剂，更优选液体洗衣洗涤剂制剂的方法，包括在以下一个或多个步骤中混合的步骤

(a)至少一种根据本发明的甘露聚糖酶变体，优选其中甘露聚糖酶在本发明的酶制剂中提供

和

(b)至少一种选自表面活性剂、助洗剂和水溶助长剂的洗涤剂组分，以有效清洁性能或有效保持洗涤剂物理特性的量存在。

在一个实施方案中，制剂具有在5-12或6-11范围内的pH，更优选在选自6-10、7-9和7.5-8.5的范围内的pH。在一个实施方案中，该制剂是洗涤剂制剂，优选液体洗涤剂制剂，更优选液体洗衣洗涤剂制剂。

本发明的洗衣洗涤剂制剂在相关洗涤条件下发挥洗涤性能。本文中的术语“相关洗涤/清洁条件”是指实际用于洗衣机或手动洗涤过程中的条件，特别是温度、时间、清洁机制、泡沫浓度、洗涤剂类型和水硬度。在一个实施方案中，本文的洗涤性能与去除含甘露聚糖的污渍有关；优选地，含甘露聚糖的污渍选自那些含半乳甘露聚糖和葡甘露聚糖的污渍。在一个实施方案中，洗涤性能涉及去除含刺槐豆胶和/或瓜尔豆胶的污渍。

在一个方面，本发明提供通过使至少一种含甘露聚糖的污渍与本发明的甘露聚糖酶接触的步骤来去除含甘露聚糖的污渍的方法。甘露聚糖酶在5-12或6-11范围内的pH下，更优选在6-10或7-9或7-12或8-12或8-10范围内的pH下，和最优选在7.5-8.5范围内的pH下具有甘露聚糖降解活性。在所述pH下，甘露聚糖酶对含甘露聚糖的污渍表现出洗涤性能。优选地，该方法是在≤60℃，优选在约5-60℃的范围内，优选在约5-40℃的范围内，更优选在约10-40℃的范围内的温度下去除含甘露聚糖的污渍。

在一个方面，本发明涉及在≤60℃、优选在约5-60℃的范围内、优选在约5-40℃的范围内、更优选在约10-40℃的范围内，通过以下步骤去除含甘露聚糖的污渍的方法

(a)提供包含至少一种根据本发明的甘露聚糖酶的液体制剂，

(b)将含甘露聚糖的污渍与(a)的液体制剂接触

(c)让酶在污渍上发挥其催化活性约10-90分钟的范围内，优选20-80分钟，更优选30-70分钟，甚至更优选40-60分钟范围内的时间。

在一个实施方案中，去除含甘露聚糖的污渍的方法的特征在于是优选在洗衣机中在机械搅拌下进行的洗涤方法。液体制剂优选是液体洗涤剂制剂。

本发明涉及至少一种根据本发明的甘露聚糖酶变体在提高洗涤剂制剂对含甘露聚糖污渍、优选含刺槐豆胶和/或瓜尔豆胶的污渍的洗涤或清洁性能中的用途。

在一个实施方案中，洗涤剂制剂的pH在5-12或6-11的范围内，更优选在选自6-10、7-9和7.5-8.5的范围内。在一个实施方案中，该制剂是液体洗涤剂制剂，优选液体洗衣洗涤剂制剂。

在一个实施方案中，洗涤或清洁性能在洗涤或清洁温度≤60℃，优选在约5-60℃的范围内，优选在约5-40℃的范围内，更优选在约10-40℃的范围内增加。

在一个方面，本发明涉及洗涤或清洁方法，包括以下步骤

(a)提供至少一种含甘露聚糖的污渍；

(b)提供根据本发明的洗涤剂制剂

(c)使含甘露聚糖的污渍与(b)的洗涤剂接触。

在一个实施方案中，将步骤(a)中的含甘露聚糖污渍提供在纺织品上。

在一个实施方案中，将包含在根据本发明的洗涤剂中的甘露聚糖酶通过(c)使含甘露聚糖污渍与(b)的洗涤剂接触，优选在机械搅拌下在洗涤机器中从纺织品去除含甘露聚糖的污渍。

实施例

实施例1：甘露聚糖酶变体的表达和纯化

由GenScript(New Jersey,USA)合成基因并克隆到芽孢杆菌表达载体中。将从GenScript获得的构建体作为序列确认的质粒DNA，并转化到枯草芽孢杆菌中。将5μL 20-200ng/μL的质粒DNA添加到500μL新鲜制备的枯草芽孢杆菌感受态细胞中，并在37℃下生长过夜。随后将细胞铺板到LB+50ug/mL卡那霉素琼脂板上，并在37℃下生长过夜。为了确认枯草芽孢杆菌中甘露聚糖酶的表达，通过菌落PCR和测序筛选得到的菌落。在PCR之前，每个菌落在含有20mM DTT和0.5mg/mL蛋白酶K的缓冲液中在55℃下裂解5分钟，然后在95℃下裂解6分钟。使用1μL裂解细胞和TaKara Ex Taq(TaKaRa目录号RR001)聚合酶进行20μL PCR反应如下：在98℃初始变性3分钟、30个循环的变性、退火和分别在95℃下延伸10秒、55℃下延伸30秒和72℃下延伸2.5分钟。最后在72℃下延伸5分钟完成PCR反应。甘露聚糖酶的表达例如以微量滴定板形式进行。在30℃和1000rpm搅拌下进行发酵约48小时。最终的发酵液在4℃下以2500xg离心15分钟以获得无细胞上清液。使用自动毛细管凝胶电泳装置；带有HTProteinExpress

和HT Protein Express Reagent试剂盒的

GXII(PerkinElmer,USA)评估蛋白质定量。使用Regular Sensitivity HT Protein Express200测定法确定蛋白质纯度和定量，并使用

GX Reviewer 5.3软件进行分析。分子量确定是通过使用蛋白质标准品的包围梯(作为HT Protein Express试剂盒的一部分)来指定峰的MW和定量的LabChip软件或使用已知的蛋白质标准品和仪器分析软件内的“滴度”功能，或使用源自LabChip的一组已知浓度的蛋白质标准品的峰面积，生成标准曲线和目的蛋白质的定量结果进行的。

实施例2：甘露聚糖酶表达的表达

甘露聚糖酶的表达在384孔深孔板中完成。在37℃和1000rpm搅拌下进行发酵约48小时。最终的发酵液在4℃下以2500xg离心15分钟以获得无细胞上清液。

使用自动毛细管凝胶电泳装置；带有HT ProteinExpress

和HTProtein Express Reagent试剂盒的

GX II(PerkinElmer,USA)评估蛋白质定量。使用Regular Sensitivity HT Protein Express 200测定法确定蛋白质纯度和定量，并使用

甘露聚糖酶变体的降解稳定性通过计算全长酶的量以及全长甘露聚糖酶的百分比(全长的量除以全长甘露聚糖酶和观察到的降解产物(一种或多种)的总和乘以100)来确定。

表Ex2：与亲本酶相比，具有如表中所示的单点氨基酸取代的甘露聚糖酶变体的发酵过程中的降解稳定性

实施例3：储存后的甘露聚糖酶活性

在37℃下调整至pH 8 6天的ES1制剂中测定保质期稳定性。ES1洗涤剂制剂：

组分	类型	A浓度[％]
			Lutensit A-LBS<sup>1</sup>	LAS	5,5
Edenor可可脂肪酸	C<sub>12</sub>-C<sub>18</sub>可可脂肪酸	2,4
			Lutensol AO7<sup>2</sup>	AEO	5,5
Texapon N70<sup>3</sup>	FAEO	5,5
				1,2丙二醇	6,0
	乙醇	2,0
				KOH	2,2
酶		根据示例
			水		填充至100％

¹两种阴离子表面活性剂，选自根据通式(II)的化合物，其中所述阴离子表面活性剂之一的特征在于R¹为C₁₀，而另一种表面活性剂的特征在于R¹为C₁₃。

²通式(III)的化合物，其中所述非离子表面活性剂之一的特征在于R¹为n-C₁₂H₂₅，R²和R⁵为H，m为3-30，优选7，n和o＝0，另一种表面活性剂的特征在于R¹为n-C₁₄H₂₉，R²和R⁵为H，m为3-30，优选7，n和o＝0。

³两种选自通式(I)化合物的阴离子表面活性剂，其中所述阴离子表面活性剂之一的特征在于R¹为C₁₁，R²为H，m为2，n和o＝0，A^-为SO₃ ^-，M⁺为Na⁺，另一种表面活性剂的特征在于R¹为C₁₃，R²为H，m为2，n和o＝0，A^-为SO₃ ^-，M⁺为Na⁺。

900μl缓冲液/洗涤剂制剂中添加了15.2mg/mL甘露聚糖酶。探针在37℃下储存数天。在某个时间点从原始探针中取出50μl样品，并在800μl HEPES缓冲液中稀释。将样品在37℃下孵育5分钟。将200μl该样品与200μl底物(1％偶氮角豆半乳甘露聚糖)混合，再孵育60分钟。然后将200μl反应混合物加入到冰上的350μl 95％乙醇中并孵育10分钟。之后，将反应混合物以4000xg离心10分钟。在590nm处测定250μl所得上清液的吸收。在下表中所示的时间点储存后测量的甘露聚糖酶活性以相对于设定为1.0的亲本酶的改进因子提供。

表Ex3：与亲本酶相比，具有如表中所示单点氨基酸取代的甘露聚糖酶变体在含有表面活性剂的制剂中具有改进的稳定性

实施例4：洗涤剂中的保质期稳定性

保质期稳定性在

(a)市售不含酶的洗涤剂Persil non-bio

(b)可商购的Tide热处理灭活酶

(c)如上所述的ES1制剂

中在42℃下1或4天，或在37℃下15天。

此外，洗涤剂添加了按重量计0.2％的蛋白酶，该蛋白酶具有根据SEQ ID NO:22的氨基酸序列，具有如下表所示的取代R101E。

表Ex4a：保质期稳定性；在42℃下储存1天后的甘露聚糖酶活性；表中提供的数字被标准化为不含突变的亲本酶(相对于亲本的改进因子)

表Ex4b：保质期稳定性；在37℃下储存15天后的甘露聚糖酶活性；将表中提供的数字标准化为不含突变的亲本酶(相对于亲本的改进因子)

表Ex4c：在具有取代R101E的包含具有根据SEQ ID NO:22的氨基酸序列的蛋白酶的洗涤剂中的洗涤剂内稳定性——42℃下4天的加速保质期

序列表

<110> 巴斯夫欧洲公司(BASF SE)

<120> 甘露聚糖酶变体

<130> 201903WO01

<150> 62/976815

<151> 14/02/2020

<160> 4

<170> According Wipo Std 25

<210> 1

<211> 1473

<212> DNA

<213> 未知

<220>

<223> 从环境样品中获得序列。

<400> 1

atgtcaatta ttaagaaagt tccattaata tttctatgtc tcctaatgtt tgctacttct 60

ctatttattt ttaagcctga ggtaaaagca gcaactggct tttatgtaaa cggaaacact 120

ctgtacgatg caacaggtag cccgtttgtt atgaggggaa ttaaccatgc tcattcttgg 180

tttaaagatg attcttctac agcaatccct gctatagcga agacaggggc taatactatt 240

agaatcgtcc tatctgatgg aagccagtat acaaaagatg atattaatac agtaaaaagt 300

cttatatcct tagctgagaa gaataacctt attgctattt tagaggtgca tgatgccaca 360

ggaaacgatg ctgttagctc gttaaacgat gctgttagct attggattag tattaaagag 420

gctcttattg gaaaagaaga tagggtctta attaatattg ccaatgaatg gtatggtact 480

tgggatggtg caagttgggc aagtggctat aaacaggcta ttccaaagtt aagagatgct 540

ggactcagcc atacattaat tgtagattcc gcaggttggg gacaatatcc agagtctatc 600

catcaatatg gtaaagatgt atttaatgct gatccactaa aaaatacaat gttttctatt 660

catatgtatg aatatgctgg gggggatgct tccactatta aatcaaatat tgacggagta 720

ctgaatcagg atcttgcatt aattattggt gaatttggac ataaacatac gaatggagat 780

gttgatgagg aaacaattat gagttactca cagcagaaga atgttggttg gttagcttgg 840

tcttggaaag gtaatggccc cgagtggagt tatttagact tatcaaatga ttgggctgga 900

gataatttaa cctcgtgggg taatacaatt gtaaatggag ctaatggttt aaaagctact 960

tctaaaataa gtccagtatt tgatggagga gatcatcctg gtggttcagg tggaactgaa 1020

aatactttgt ataatttcga aaccgaaaca caaagctgga gtggtggaaa tgtaatggct 1080

ggaccctggt caacgaatga gtgggcatca aaagacaact attctttaaa agctgatgtt 1140

caattaaaca ataattccca gcattattta tctttaactc aaaaccaaaa tttcagtggg 1200

aaatctcaac taaaggcaac tgtaaagcac gctgattggg gaaatctagg gaatggaatt 1260

aatgcacagt tatatgtgaa aacagggtca gattggaaat ggtttgatgg tgagagtgta 1320

gaaattaatt cctccaatgg aactatttta actttagatt tatcatccat ctccgattta 1380

aatgacatta aagagattgg cgtgcagttt atgggctctt cgaaaagcag tggtcaaaca 1440

gctgtatacg ttgacaacgt aacaattcaa taa 1473

<210> 2

<211> 490

<212> PRT

<213> 未知

<220>

<223> 亲本蛋白（包括信号肽），由Seq-ID 1编码。信号肽是第1至30位。

<220>

<221> misc_feature

<222> (1)..(30)

<223> 信号肽

<400> 2

Met Ser Ile Ile Lys Lys Val Pro Leu Ile Phe Leu Cys Leu Leu Met

1 5 10 15

Phe Ala Thr Ser Leu Phe Ile Phe Lys Pro Glu Val Lys Ala Ala Thr

20 25 30

Gly Phe Tyr Val Asn Gly Asn Thr Leu Tyr Asp Ala Thr Gly Ser Pro

35 40 45

Phe Val Met Arg Gly Ile Asn His Ala His Ser Trp Phe Lys Asp Asp

50 55 60

Ser Ser Thr Ala Ile Pro Ala Ile Ala Lys Thr Gly Ala Asn Thr Ile

65 70 75 80

Arg Ile Val Leu Ser Asp Gly Ser Gln Tyr Thr Lys Asp Asp Ile Asn

85 90 95

Thr Val Lys Ser Leu Ile Ser Leu Ala Glu Lys Asn Asn Leu Ile Ala

100 105 110

Ile Leu Glu Val His Asp Ala Thr Gly Asn Asp Ala Val Ser Ser Leu

115 120 125

Asn Asp Ala Val Ser Tyr Trp Ile Ser Ile Lys Glu Ala Leu Ile Gly

130 135 140

Lys Glu Asp Arg Val Leu Ile Asn Ile Ala Asn Glu Trp Tyr Gly Thr

145 150 155 160

Trp Asp Gly Ala Ser Trp Ala Ser Gly Tyr Lys Gln Ala Ile Pro Lys

165 170 175

Leu Arg Asp Ala Gly Leu Ser His Thr Leu Ile Val Asp Ser Ala Gly

180 185 190

Trp Gly Gln Tyr Pro Glu Ser Ile His Gln Tyr Gly Lys Asp Val Phe

195 200 205

Asn Ala Asp Pro Leu Lys Asn Thr Met Phe Ser Ile His Met Tyr Glu

210 215 220

Tyr Ala Gly Gly Asp Ala Ser Thr Ile Lys Ser Asn Ile Asp Gly Val

225 230 235 240

Leu Asn Gln Asp Leu Ala Leu Ile Ile Gly Glu Phe Gly His Lys His

245 250 255

Thr Asn Gly Asp Val Asp Glu Glu Thr Ile Met Ser Tyr Ser Gln Gln

260 265 270

Lys Asn Val Gly Trp Leu Ala Trp Ser Trp Lys Gly Asn Gly Pro Glu

275 280 285

Trp Ser Tyr Leu Asp Leu Ser Asn Asp Trp Ala Gly Asp Asn Leu Thr

290 295 300

Ser Trp Gly Asn Thr Ile Val Asn Gly Ala Asn Gly Leu Lys Ala Thr

305 310 315 320

Ser Lys Ile Ser Pro Val Phe Asp Gly Gly Asp His Pro Gly Gly Ser

325 330 335

Gly Gly Thr Glu Asn Thr Leu Tyr Asn Phe Glu Thr Glu Thr Gln Ser

340 345 350

Trp Ser Gly Gly Asn Val Met Ala Gly Pro Trp Ser Thr Asn Glu Trp

355 360 365

Ala Ser Lys Asp Asn Tyr Ser Leu Lys Ala Asp Val Gln Leu Asn Asn

370 375 380

Asn Ser Gln His Tyr Leu Ser Leu Thr Gln Asn Gln Asn Phe Ser Gly

385 390 395 400

Lys Ser Gln Leu Lys Ala Thr Val Lys His Ala Asp Trp Gly Asn Leu

405 410 415

Gly Asn Gly Ile Asn Ala Gln Leu Tyr Val Lys Thr Gly Ser Asp Trp

420 425 430

Lys Trp Phe Asp Gly Glu Ser Val Glu Ile Asn Ser Ser Asn Gly Thr

435 440 445

Ile Leu Thr Leu Asp Leu Ser Ser Ile Ser Asp Leu Asn Asp Ile Lys

450 455 460

Glu Ile Gly Val Gln Phe Met Gly Ser Ser Lys Ser Ser Gly Gln Thr

465 470 475 480

Ala Val Tyr Val Asp Asn Val Thr Ile Gln

485 490

<210> 3

<211> 460

<212> PRT

<213> 未知

<220>

<223> 成熟亲本蛋白 (无信号肽)，由Seq-ID 1编码第91至1470位。

<400> 3

Ala Thr Gly Phe Tyr Val Asn Gly Asn Thr Leu Tyr Asp Ala Thr Gly

1 5 10 15

Ser Pro Phe Val Met Arg Gly Ile Asn His Ala His Ser Trp Phe Lys

20 25 30

Asp Asp Ser Ser Thr Ala Ile Pro Ala Ile Ala Lys Thr Gly Ala Asn

35 40 45

Thr Ile Arg Ile Val Leu Ser Asp Gly Ser Gln Tyr Thr Lys Asp Asp

50 55 60

Ile Asn Thr Val Lys Ser Leu Ile Ser Leu Ala Glu Lys Asn Asn Leu

65 70 75 80

Ile Ala Ile Leu Glu Val His Asp Ala Thr Gly Asn Asp Ala Val Ser

85 90 95

Ser Leu Asn Asp Ala Val Ser Tyr Trp Ile Ser Ile Lys Glu Ala Leu

100 105 110

Ile Gly Lys Glu Asp Arg Val Leu Ile Asn Ile Ala Asn Glu Trp Tyr

115 120 125

Gly Thr Trp Asp Gly Ala Ser Trp Ala Ser Gly Tyr Lys Gln Ala Ile

130 135 140

Pro Lys Leu Arg Asp Ala Gly Leu Ser His Thr Leu Ile Val Asp Ser

145 150 155 160

Ala Gly Trp Gly Gln Tyr Pro Glu Ser Ile His Gln Tyr Gly Lys Asp

165 170 175

Val Phe Asn Ala Asp Pro Leu Lys Asn Thr Met Phe Ser Ile His Met

180 185 190

Tyr Glu Tyr Ala Gly Gly Asp Ala Ser Thr Ile Lys Ser Asn Ile Asp

195 200 205

Gly Val Leu Asn Gln Asp Leu Ala Leu Ile Ile Gly Glu Phe Gly His

210 215 220

Lys His Thr Asn Gly Asp Val Asp Glu Glu Thr Ile Met Ser Tyr Ser

225 230 235 240

Gln Gln Lys Asn Val Gly Trp Leu Ala Trp Ser Trp Lys Gly Asn Gly

245 250 255

Pro Glu Trp Ser Tyr Leu Asp Leu Ser Asn Asp Trp Ala Gly Asp Asn

260 265 270

Leu Thr Ser Trp Gly Asn Thr Ile Val Asn Gly Ala Asn Gly Leu Lys

275 280 285

Ala Thr Ser Lys Ile Ser Pro Val Phe Asp Gly Gly Asp His Pro Gly

290 295 300

Gly Ser Gly Gly Thr Glu Asn Thr Leu Tyr Asn Phe Glu Thr Glu Thr

305 310 315 320

Gln Ser Trp Ser Gly Gly Asn Val Met Ala Gly Pro Trp Ser Thr Asn

325 330 335

Glu Trp Ala Ser Lys Asp Asn Tyr Ser Leu Lys Ala Asp Val Gln Leu

340 345 350

Asn Asn Asn Ser Gln His Tyr Leu Ser Leu Thr Gln Asn Gln Asn Phe

355 360 365

Ser Gly Lys Ser Gln Leu Lys Ala Thr Val Lys His Ala Asp Trp Gly

370 375 380

Asn Leu Gly Asn Gly Ile Asn Ala Gln Leu Tyr Val Lys Thr Gly Ser

385 390 395 400

Asp Trp Lys Trp Phe Asp Gly Glu Ser Val Glu Ile Asn Ser Ser Asn

405 410 415

Gly Thr Ile Leu Thr Leu Asp Leu Ser Ser Ile Ser Asp Leu Asn Asp

420 425 430

Ile Lys Glu Ile Gly Val Gln Phe Met Gly Ser Ser Lys Ser Ser Gly

435 440 445

Gln Thr Ala Val Tyr Val Asp Asn Val Thr Ile Gln

450 455 460

<210> 4

<211> 297

<212> PRT

<213> 未知

<220>

<223> 亲本蛋白的催化结构域，由Seq-ID 1编码第91至981位。

<400> 4

Ala Thr Gly Phe Tyr Val Asn Gly Asn Thr Leu Tyr Asp Ala Thr Gly

1 5 10 15

Ser Pro Phe Val Met Arg Gly Ile Asn His Ala His Ser Trp Phe Lys

20 25 30

Asp Asp Ser Ser Thr Ala Ile Pro Ala Ile Ala Lys Thr Gly Ala Asn

35 40 45

Thr Ile Arg Ile Val Leu Ser Asp Gly Ser Gln Tyr Thr Lys Asp Asp

50 55 60

Ile Asn Thr Val Lys Ser Leu Ile Ser Leu Ala Glu Lys Asn Asn Leu

65 70 75 80

Ile Ala Ile Leu Glu Val His Asp Ala Thr Gly Asn Asp Ala Val Ser

85 90 95

Ser Leu Asn Asp Ala Val Ser Tyr Trp Ile Ser Ile Lys Glu Ala Leu

100 105 110

Ile Gly Lys Glu Asp Arg Val Leu Ile Asn Ile Ala Asn Glu Trp Tyr

115 120 125

Gly Thr Trp Asp Gly Ala Ser Trp Ala Ser Gly Tyr Lys Gln Ala Ile

130 135 140

Pro Lys Leu Arg Asp Ala Gly Leu Ser His Thr Leu Ile Val Asp Ser

145 150 155 160

Ala Gly Trp Gly Gln Tyr Pro Glu Ser Ile His Gln Tyr Gly Lys Asp

165 170 175

Val Phe Asn Ala Asp Pro Leu Lys Asn Thr Met Phe Ser Ile His Met

180 185 190

Tyr Glu Tyr Ala Gly Gly Asp Ala Ser Thr Ile Lys Ser Asn Ile Asp

195 200 205

Gly Val Leu Asn Gln Asp Leu Ala Leu Ile Ile Gly Glu Phe Gly His

210 215 220

Lys His Thr Asn Gly Asp Val Asp Glu Glu Thr Ile Met Ser Tyr Ser

225 230 235 240

Gln Gln Lys Asn Val Gly Trp Leu Ala Trp Ser Trp Lys Gly Asn Gly

245 250 255

Pro Glu Trp Ser Tyr Leu Asp Leu Ser Asn Asp Trp Ala Gly Asp Asn

260 265 270

Leu Thr Ser Trp Gly Asn Thr Ile Val Asn Gly Ala Asn Gly Leu Lys

275 280 285

Ala Thr Ser Lys Ile Ser Pro Val Phe

290 295

Claims

1.一种甘露聚糖酶变体，其与SEQ ID NO:2或SEQ ID NO 3或SEQ ID NO:4至少75％相同，包含两个或更多个选自A31V、Q89V、N96D、A119Y/H/T、E264Q/V、W289F/M/H、N312F/Y、T348S/R/N/M/G、E349T/S/D/G、S352N/G、D379V的氨基酸取代，其中编号根据SEQ ID NO:2，并且其中所述多肽具有甘露聚糖降解活性。

2.根据权利要求1所述的甘露聚糖酶变体，其包含氨基酸取代Q89V和N96D以及选自A31V、A119Y/H/T、E264Q/V、W289F/M/H和N312F/Y的一个或多个氨基酸取代。

3.根据权利要求1和2所述的编码甘露聚糖酶的多核苷酸，其中所述多核苷酸与SEQ IDNO:1至少75％相同。

4.表达构建体，其包含根据权利要求3所述的多核苷酸。

5.宿主细胞，其包含根据权利要求3所述的多核苷酸或根据权利要求4所述的表达构建体。

6.一种表达根据权利要求1和2所述的甘露聚糖酶变体的方法，包括以下步骤

(b)在有利于多核苷酸表达的条件下培养步骤(a)的所述重组宿主细胞；和

(c)任选地，回收由所述多核苷酸编码的目的蛋白质。

7.液体酶制剂，其包含根据权利要求1和2所述的甘露聚糖酶、至少一种稳定液体酶制剂本身的化合物如防腐剂、至少一种溶剂如甘油和任选的至少一种酶稳定剂。

8.通过在选自A31V、D86N、N96D、A119Y/H/T、E264Q/V、W289F/M/H和N312F/Y的氨基酸位置引入两个或更多个氨基酸取代的步骤，增加与SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:4至少75％相同的甘露聚糖酶的表面活性剂内稳定性的方法，其中编号根据SEQ ID NO:2。

9.制剂，优选液体制剂，其包含根据权利要求1和2所述的甘露聚糖酶，其中所述制剂优选具有5-12范围内的pH。

10.一种提供洗涤剂制剂的方法，包括在一个或多个步骤中混合以下的步骤

(a)至少一种根据权利要求1和2所述的甘露聚糖酶，任选地其中所述甘露聚糖酶在根据权利要求7所述的酶制剂中提供

和

(b)至少一种选自表面活性剂、助洗剂和水溶助长剂的组分；全部以有效清洁性能或有效保持洗涤剂的物理特性的量存在。

11.一种洗涤或清洁方法，包括以下步骤

(a)提供至少一种含甘露聚糖的污渍；

(b)提供根据权利要求9所述的制剂

(c)使含甘露聚糖的污渍(a)与(b)的制剂接触，优选在5-60℃范围内的洗涤或清洁温度下。

12.根据权利要求11所述的方法，其中在纺织品(a)上提供含甘露聚糖的污渍；并且其中包含在洗涤剂(b)中的多肽从纺织品(a)中去除含甘露聚糖的污渍。

13.至少一种根据权利要求1和2所述的甘露聚糖酶在提高洗涤剂制剂对含甘露聚糖的污渍的洗涤性能中的用途，优选在5-60℃范围内的洗涤或清洁温度下。

14.根据权利要求13所述的用途，其中至少一种含甘露聚糖的污渍包含刺槐豆胶和/或瓜尔豆胶。