BRPI0920891B1 - Mistura de alfa-amilase e método para produção de um açúcar fermentável - Google Patents

Abstract

MISTURAS DE ALFA-AMILASE, MÉTODOS PARA LIQUEFAÇÃO DE AMIDO, PARA OBTENÇÃO DE UM SUBSTRATO FERMENTÁVEL E PARA PRODUÇÃO DE UM AÇÚCAR FERMETÁVEL E DE GLICOSE. A presente invenção refere-se a uma mistura de alfa-amilase, incluindo uma alfa-amilase de B. stearothemophilus (AmyS) em que o amino-ácido na posição S242 é substituído e uma alfa-amilas de B. licheniformis. A invenção também se refere aos processos usando as misturas de alfa-amilase para liquefação de amido e sacarificação, produção de etanol, e produção de adoçante.

Description

REFERÊNCIA CRUZADA A PEDIDOS RELACIONADOS

[001] Este pedido reivindica prioridade ao Pedido Provisional U.S. No. de Série 61/100.092, depositado em 25 de setembro de 2008 e ao Pedido Provisional U.S. No. de Série 61/238.891, depositado em 1 de setembro de 2009, cada um dos quais é incorporado aqui em sua totalidade.

LISTAGEM DE SEQUÊNCIA

[002] Uma Listagem de Sequência, compreendendo SEQ ID NOS: 1 a 20 é anexada e é incorporada através de referência em sua totalidade.

CAMPO DA INVENÇÃO

[003] Descrito aqui é uma mistura de uma alfa-amilase de Geobacillus stearo’philus e uma alfa-amilase de Bacillus licheniformis. A mistura de alfa-amilase descrita aqui é adequada para numerosas aplicações tais como liquefação de amido e sacarificação, produção de etanol, e/ou produção de adoçante.

ANTECEDENTES

[004] As Alfa-Amilases (alfa-1,4-glucan-4-glucano-hidrolases, E.C. 3.2.1.1) constituem um grupo de enzimas, que catalisam hidrólise de amido e outros oligo- e polissacarídeos 1,4-glicosídicos lineares e ramificados.

[005] As amilases podem ser usadas comercialmente nos estágios iniciais (liquefação) de processamento de amido; em moagem de milho úmida; em produção de álcool; como agentes de limpeza em matrizes de detergente; na indústria têxtil para desengomagem de amido; em aplicações de cozimento; na indústria de bebida; na área de óleo nos processos de drenagem; em descoloração de papel reciclado e em alimentação de animais.

[006] As alfa-amilases são isoladas de uma ampla variedade de fontes bacterianas, fúngicas, vegetais, e animais. Muitas α-amilases industrialmente importantes são isoladas de Bacillus sp., em parte por causa da capacidade geralmente alta do Bacillus secretar amilases no meio de crescimento. Além disso, há uma necessidade de misturas de alfa-amilases, ou variantes destas, que podem capitalizar nas melhores propriedades de pelo menos duas alfa-amilases de pelo menos duas cepas bacterianas.

[007] Por exemplo, as alfa-amilases isoladas de B. stearothermophilus (AmyS) foram usadas em aplicações de etanol combustível por causa da propriedade de redução de viscosidade rápida. As plantas de etanol combustível possuem 20 a 30 min de tempo de pasta antes que pasta passe pela etapa de cozimento a jato e pelo fato de que viscosidade de 20 a 30 min deve ser rompida para fluxo do tubo sem problemas. No entanto, certas alfa-amilases ou variantes destas não são termoestáveis, então embora elas diminuam a viscosidade de uma pasta durante o tempo, elas sofrem de declive de inferior e redução de viscosidade inferior na liquefação secundária, onde a pasta pode ser mantida em 85 a 90°C durante até 90 a 120 min.

[008] Há por esse motivo uma necessidade na indústria pela identificação e otimização de amilases e suas misturas, útil em vários processos de produção, por exemplo, processos de liquefação de amido comerciais e processos de produção de etanol.

[009] Os liquefeitos de amido de viscosidade baixa são úteis no processo de produção de etanol atual. Se um modo pudesse ser encontrado para produzir tais liquefeitos de viscosidade baixa como matérias-primas de alimentação de fermentação usando uma mistura otimizada de alfa-amilases, ou variantes destas, isto representaria uma contribuição útil à técnica. Além disso, se um modo pode ser encontrado para tratar grãos moídos integrais com uma mistura de alfa-amilases, ou variantes destas, de duas diferentes espécies bacterianas para melhorar a liquefação de amido, isto também representaria uma contribuição útil à técnica.

[0010] Um desafio adicional na preparação de matérias-primas de alimentação de fermentação é que as alfa amilases de B. stearothermophilus, por exemplo, foram constatadas serem menos eficazes na hidrólise de amilase linear, resultando em um amido residual insolúvel retrógrado sob condições de fermentação de levedura. O alto nível de amido residual no caldo de fermentação de levedura foi considerado como um dos fatores principais influenciando a obstrução do evaporador afetar as operações de processamento a jusante nas produções de processo de etanol. Desta forma, se um modo pode ser constatado reduzir o amido insolúvel residual no caldo de fermentação usando uma mistura otimizada de alfa-amilases, ou variantes destas, isto também representaria uma contribuição útil à técnica.

SUMÁRIO

[0011] Um processo de liquefação para grãos moídos integrais no processo de fermentação é descrito. O processo compreende contato de uma pasta aquosa contendo grão moído integral com uma mistura de alfa-amilases liquidificadoras de amido de pelo menos duas diferentes espécies bacterianas.

[0012] Em uma modalidade, a presente invenção compreende uma mistura de alfa-amilase compreendendo: (i) uma alfa-amilase de B. stearothermophilus (AmyS) em que o aminoácido na posição S242 é substituído, usando o sistema de número de aminoácido mostrado na SEQ ID NO: 2; e (ii) uma alfa-amilase de B. licheniformis. A mistura pode também compreender uma fitase.

[0013] Em uma modalidade, uma relação de peso de cerca de 40% da AmyS com a substituição S242 e cerca de 60% da alfa-amilase de B. licheniformis pode ser usada. Desta maneira, as propriedades superiores de cada enzima, a rápida redução de viscosidade de liquefeitos de amido e a termoestabilidade, respectivamente, podem ser totalmente exploradas em um método de fermentação de álcool. Em outra modalidade preferida, a relação de peso de AmyS com a substituição S242 para alfa-amilase de B. licheniformis é 10:90 para explorar totalmente as propriedades das enzimas em um método de produção de um adoçante. Em outras modalidades, a relação de peso de AmyS com a substituição S242 para alfa-amilase de B. licheniformis pode ser 5:95, 15:85, 20:80, 25:75, 30:70, 50:50, 60:40, 70:30, 75:25, 80:20, 85:15, 90:10, ou valores intermediários destas.

[0014] Em outra modalidade, uma relação de atividade de cerca de 1.400 AAU/g a cerca de 14.000 AAU/g da AmyS com a substituição S242, e de cerca de 8.000 LU/g a cerca de 19.000 LU/g de alfa-amilase de B. licheniformis pode ser usada. A relação de AmyS com a substituição S242 para alfa-amilase de B. licheniformis pode ser 1.400 AAU/g:14.000 LU/g, 2.000 AAU/g:15.000 LU/g, 2.100 AAU/g:16.000 LU/g, 1.900 AAU/g:17.000 LU/g, ou valores intermediários destas. Em outras modalidades a relação de alfa-amilase de B. licheniformis para AmyS com a substituição S242 é de cerca de 5,5 LU/AAU a cerca de 9,5 LU/AAU. A relação de atividade de alfa-amilase de B. licheniformis para AmyS com a substituição S242 está na faixa de cerca de 0,1 LU/AAU a cerca de 9,5 LU/AAU. Por exemplo, a relação de atividade pode ser 0,1 LU/AAU, 0,2 LU/AAU, 0,3 LU/AAU, 0,4 LU/AAU, 0,5 LU/AAU, 1,0 LU/AAU, 1,5 LU/AAU, 2,0 LU/AAU, 2,5 LU/AAU, 3,0 LU/AAU, 4,0 LU/AAU, 5,0 LU/AAU, 5,5 LU/AAU, 6,0 LU/AAU, 6,5 LU/AAU, 7,0 LU/AAU, 7,5 LU/AAU, 8,0 LU/AAU, 8,5 LU/AAU, 9,0 LU/AAU, 9,5 LU/AAU ou valores intermediários destas.

[0015] A AmyS pode compreender a sequência de polipeptídeo da SEQ ID NO: 1 ou SEQ ID NO: 2, em que o resíduo S242 é substituído. Em uma modalidade preferida, a AmyS compreende uma sequência de aminoácido apresentada na SEQ ID NO: 4, que possui uma substituição S242Q comparada a SPEZYME® Xtra (SEQ ID NO: 2). Esta enzima é designada aqui como ou "AmyS S242Q" ou apenas "S242Q". Em outra modalidade, a AmyS pode ser selecionada de uma das enzimas AmyS compreendendo a sequência de polipeptídeo da SEQ ID NOS: 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 15 e 16, em que o resíduo S242 é substituído.

[0016] A substituição S242 pode ser uma substituição S242A, S242E, S242Q, S242F, S242H, ou S242N. Em uma modalidade, a substituição de aminoácido na posição S242 altera a termoestabilidade da AmyS. A AmyS com a substituição na posição S242 pode possuir um termoestabilidade elevada entre cerca de 80°C e cerca de 95°C comparada a uma AmyS sem a substituição S242.

[0017] Em uma modalidade, a AmyS compreende uma sequência de aminoácido possuindo pelo menos 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, ou 99% de identidade de sequência a AmyS da SEQ ID NO: 1, em que a AmyS possui atividade de alfa-amilase. A AmyS pode compreender uma substituição de uma cisteína nos aminoácidos 349 e 428, usando a SEQ ID NO: 1 para numeração. A AmyS também pode compreender uma substituição de N193 e/ou V416. A AmyS também pode compreender uma deleção dos aminoácidos 179 e 180, usando a SEQ ID NO: 1 para numeração.

[0018] As enzimas AmyS podem possuir uma sequência de aminoácido alterada comparada a uma AmyS do tipo selvagem que altera uma ou mais propriedades da enzima, por exemplo, especificidade de substrato, ligação de substrato, padrão de clivagem de substrato, estabilidade térmica, perfil de pH/atividade, perfil de pH/estabilidade, estabilidade para oxidação, dependência de Ca2+, e/ou atividade específica. Por exemplo, a alteração pode resultar em uma enzima que possui uma dependência de Ca2+ reduzida e/ou um perfil de pH/atividade alterado e/ou termoestabilidade, comparada a uma AmyS do tipo selvagem.

[0019] A alfa-amilase de B. licheniformis pode ser uma enzima do tipo selvagem purificada. A alfa-amilase de B. licheniformis pode possuir uma ou mais substituições de aminoácido da sequência do tipo selvagem selecionada do grupo consistindo em M15T, H133Y, N188S, e A209V. Em uma modalidade preferida, a alfa-amilase de B. licheniformis compreende a sequência de aminoácido mostrada na SEQ ID NO: 20, que é também conhecida como SPEZYME® FRED. Em uma modalidade, a alfa-amilase de B. licheniformis compreende uma sequência de aminoácido possuindo pelo menos 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97% 98%, ou 99% de identidade de sequência a SPEZYME® FRED (SEQ ID NO: 20).

[0020] A invenção também se refere aos construtos de DNA codificando as enzimas da invenção, aos métodos para preparo e purificação das enzimas, e ao uso das enzimas em vários processos industriais, por exemplo, liquefação de amido ou produção de adoçante.

[0021] Em um aspecto, a invenção refere-se à hidrólise de um substrato de amido solúvel usando atividade de alfa amilase (AA) e uma enzima de hidrólise de ácido fítico (FTU, ou fitase), em que a relação de AAU:FTU é de cerca de 1:15 a cerca de 15:1, de preferência de 1:10 a cerca de 10:1. Em uma modalidade, a relação de AAU:FTU é de 1:4 a 3:1. Em uma modalidade adicional, a relação de AAU:FTU é 1:1. A fitase pode ser uma enzima do tipo selvagem de qualquer fonte. A enzima de hidrólise de ácido fítico pode ser uma fitase bacteriana ou fúngica. A fitase fúngica pode ser uma fitase de Aspergillus ou uma fitase de Buttiauxella. Em algumas modalidades, a fitase bacteriana é de Escherichia coli. Em uma modalidade, a fitase pode compreender a sequência de aminoácido da SEQ ID NO: 19.

[0022] Um método para liquefação de amido é fornecido, que compreende adição de uma mistura de amilase descrita acima a uma solução compreendendo amido, e liquefação da solução compreendendo amido. Uma mistura de amilase preferida para esta aplicação possui uma relação de atividade de cerca de 40% (como AAU/g de DS) da AmyS com a substituição S242 e cerca de 60% (como LU/g de DS) da alfa-amilase de B. licheniformis. Outras relações podem ser usadas para esta aplicação, tal como 15:85, 20:80, 30:70, 50:50, 60:40, 70:30, 80:20 e 85:15.

[0023] O substrato de amido pode ser obtido de milho, milo, centeio, cevada, trigo, sorgo, ou aveias. Outras fontes de amido incluem outros grãos, capins, tubérculos e raízes e mais especificamente arroz, farelos, mandioca, milho miúdo, batata, batata doce, e tapioca. O substrato pode incluir material de planta, tal como amido granular de ou um processo de moagem a seco ou úmido. O método pode compreender uma etapa de liquefação primária e/ou secundária, incluindo adição de substrato adicional à pasta na etapa de liquefação primária e/ou secundária. O método pode compreender uso de uma mistura de amilase também compreendendo uma enzima de hidrólise de ácido fítico.

[0024] Um método para sacarificação do amido liquefeito para obter açúcares fermentáveis também é fornecido. Em algumas modalidades, o método também compreende a fermentação dos açúcares fermentáveis sob condições de fermentação adequadas para obter produtos finais tais como álcool. Alcoóis produzidos pelo presente método incluem, por exemplo, etanol e butanol.

[0025] Em um aspecto adicional, a invenção refere-se a um processo de conversão de amido e/ou um processo de fermentação de etanol que não requer adição de um ácido ou base para ajustar o pH. Uma modalidade refere-se a uma etapa de liquefação sem ajuste de pH, em que o pH da liquefação está na faixa de pH 4,5 a 5,4, e os produtos químicos neutralizantes de ácido não são adicionados à etapa de processo de liquefação. Em outra modalidade, o pH da liquefação está na faixa de pH 4,8 a 5,8, e os produtos químicos neutralizantes de ácido não são adicionados à etapa de processo de liquefação.

[0026] Em uma modalidade, o método compreende contato de uma pasta de grão moído contendo amido granular com tanto uma enzima de hidrólise de ácido fítico quanto uma mistura de alfa amilases descrita acima em uma temperatura de 0 a 30°C menor do que a temperatura de gelatinização de amido, aumento da temperatura acima da temperatura de gelatinização, hidrólise do amido gelatinado, e obtenção de um substrato fermentável.

[0027] Em outro aspecto, a invenção refere-se a um processo para produção de um açúcar fermentável compreendendo (a) misturação de material contendo amido moído com água e vinhaça fina, em que a vinhaça fina está na faixa de 10 a 70% em v/v, e obtenção de uma pasta compreendendo amido e possuindo um teor de sólidos secos (ds) de 20 a 50% em p/p, (b) tratamento da pasta com uma fitase antes de ou simultaneamente com liquefação do amido, (c) liquefação do amido, (d) adição de uma mistura de alfa amilase descrita acima ao amido ou durante a etapa (b) e/ou simultaneamente com a etapa de liquefação, e (e) sacarificação do amido liquefeito para obter açúcares fermentáveis, em que o pH não é ajustado durante quaisquer das etapas (a), (b), (c), (d) ou (e). Em algumas modalidades, o açúcar fermentável é recuperado e purificado ou isomerizado. Em outras modalidades, a fitase é adicionada antes da etapa de liquefação. Em modalidades adicionais, a mistura de alfa amilase é adicionada com a fitase. Ainda em outras modalidades, uma segunda dose da mistura de alfa amilase é adicionada durante a etapa de liquefação ou adicionada durante a etapa de sacarificação.

[0028] Em um aspecto adicional, a invenção refere-se a um processo de produção de álcool do material contendo amido, compreendendo liquefação e sacarificação de um substrato de amido tal como descrito acima para obter açúcares fermentáveis e também fermentação dos açúcares fermentáveis sob condições de fermentação adequadas para obter álcool. Em algumas modalidades, as etapas de sacarificação e fermentação são simultâneas. Em algumas modalidades, o álcool é etanol ou butanol.

[0029] Em uma modalidade adicional, a mistura de amilase descrita acima pode ser usada para converter um liquefeito de viscosidade baixa a um adoçante, tal como glicose, xarope de milho de frutose elevada, e outros mais. Uma mistura de amilase preferida para esta aplicação possui uma relação de atividade de cerca de 15% (como AAU/g de DS) da AmyS com a substituição S242 e cerca de 85% (como LU/g de DS) de alfa-amilase de B. licheniformis. Outras relações podem ser usadas para esta aplicação, tais como 5:95, 10:90, e 20:80 e valores intermediários destas.

[0030] Um método para produção de um adoçante pode compreender contato de um substrato de amido com uma mistura de amilase tal como descrito acima, liquefação do substrato de amido, e incubação do substrato em temperatura alta para produzir um produto compreendendo glicose. A etapa de incubação pode ser uma etapa de liquefação secundária. A etapa de incubação pode ser conduzida em uma temperatura de cerca de 90 a 100 °C, por exemplo, cerca de 95 °C. A incubação pode ser conduzida durante tempo suficiente para o produto compreender cerca de 2 a 14 DE de glicose. Em uma modalidade, o produto compreende cerca de 10 DE de glicose. O método para produção de um adoçante também pode compreender a sacarificação do produto para produzir uma solução rica em glicose. A solução rica em glicose pode compreender 80 a 99% de glicose. Em uma modalidade, a solução rica em glicose compreende cerca de 93 a 96% de glicose. A sacarificação pode compreender contato do produto de glicose com glicoamilase ou uma mistura de enzima, tal como OPTIMAX™ 4060-VHP, que compreende uma glicoamilase e uma pululanase.

BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS

[0031] As figuras 1A a 1D mostram posições correspondentes em outras alfa-amilases do tipo SPEZYME® Xtra origem que podem ser encontradas por alinhamento. Note que a SEQ ID NO: 4 é AmyS S242Q. AmyS S242A e AmyS S242E são apresentadas na SEQ ID NOS: 3 e 5, respectivamente.

[0032] A figura 2 mostra o plasmídeo pHPLT-AmyS.

[0033] A figura 3 mostra a atividade residual em porcentagem de variantes de biblioteca de S242 depois do estresse térmico em 95°C durante 30 minutos. As posições variantes P, S, W, e Y estão ausentes e são substituídas por AmyS ("wt") do tipo selvagem. Um controle de SPEZYME®® Xtra é rotulado "Z". Outro controle positivo, a AmyS com uma deleção de Δ179-180 e uma truncação terminal de C de 29 aminoácidos (SEQ ID NO: 16) é também mostrada ("$"). S242A e S242Q claramente mostram atividades residuais maiores do que o tipo selvagem.

[0034] A figura 4A a 4I mostram alinhamentos em pares para SEQ ID NOS: 1 e 14.

[0035] A figura 5 mostra as curvas de fusão térmica e os pontos de fusão para o tipo selvagem e variantes de amilase sem cálcio adicionado.

[0036] A figura 6 mostra as curvas de fusão térmica e os pontos de fusão para o tipo selvagem e variantes de amilase com cálcio.

[0037] A figura 7 mostra o perfil de atividade de SPEZYME® Xtra e duas variantes relativas a Liquozyme SC durante três pontos do tempo.

[0038] A figura 8 mostra a redução de viscosidade da farinha de milho devido à ação das alfa-amilases Liquozyme SC, SPEZYME® Ethyl ou SPEZYME® Xtra em uma dose de 30 ug.

[0039] A figura 9 mostra a redução de viscosidade de farinha de milho devido à ação das alfa-amilases Liquozyme SC ou SPEZYME® Xtra, ou uma de duas variantes (S242A e S242Q) em uma dose de 30 ug.

[0040] A figura 10 mostra a redução de viscosidade de farinha de milho devido à ação da alfa-amilase Liquozyme SC ou SPEZYME® Xtra, ou uma de duas variantes (S242A e S242Q) em uma dose de 20 ug.

[0041] A figura 11 mostra a progressão de DE de milho moído integral tratado com Liquozyme SC, SPEZYME® Xtra, ou uma de duas variantes (S242A e S242Q) durante o tempo (0, 30, 60 e 90 minutos).

[0042] A figura 12 mostra a viscosidade pós-jato de milho moído integral tratado com Liquozyme SC, SPEZYME® Xtra, ou uma de duas variantes (S242A e S242Q) durante o tempo (0, 30, 60 e 90 minutos).

[0043] A figura 13 mostra a progressão de DE de milho moído integral tratado com uma mistura de AmyS S242Q (SEQ ID NO: 4) e SPEZYME® FRED, e cada enzima individualmente, em um processo de liquefação em batelada em 85 a 90°C durante o tempo (30, 60, 90 e 120 minutos).

[0044] A figura 14 mostra a viscosidade de pasta de milho moído integral tratado com uma mistura de AmyS S242Q (SEQ ID NO: 4) e SPEZYME® FRED, e cada enzima individualmente, em um processo de liquefação em batelada em 85 a 90°C durante o tempo (30, 60, 90 e 120 minutos).

[0045] A figura 15 mostra a sequência de aminoácido de SPEZYME® FRED representada na SEQ ID NO: 20.

[0046] A figura 16 mostra o desenvolvimento de DE de um substrato de amido usando uma mistura de AmyS S242Q (SEQ ID NO: 4) e SPEZYME® FRED.

DESCRIÇÃO DETALHADA

[0047] Uma mistura de uma variante de uma alfa-amilase de B. stearothermophilus origem e uma alfa-amilase termoestável de B. licheniformis é fornecida. Em uma modalidade preferida, a mistura de alfa-amilase contém pelo menos cerca de 50% de atividade como AAU/g de DS da enzima variante alfa-amilase de B. stearothermophilus. Uma faixa preferida é de cerca de 10% a cerca de 90% de atividade como AAU/g de DS da enzima variante alfa-amilase de B. stearothermophilus. Em uma modalidade particularmente preferida, uma relação de atividade de cerca de 10% a cerca de 70% (como AAU/g de DS) de alfa-amilase de B. stearothermophilus e de cerca de 30% a cerca de 90% (como LU/g de DS) de alfa-amilase de B. licheniformis será usada a fim de que as propriedades superiores de cada cepa sejam exploradas, isto é, a rápida redução de viscosidade de liquefeitos de amido e termoestabilidade, respectivamente.

[0048] A mistura de uma variante de uma alfa-amilase de B. stearothermophilus origem e uma alfa-amilase termoestável de B. licheniformis possuirá outras propriedades vantajosas referentes ao processamento de um liquefeito de amido, exemplificadas por níveis de DS, pH, teor de cálcio, e temperaturas de liquefação e cozimento. Por exemplo, em certas modalidades, os níveis de DS podem variar de cerca de 32% a cerca de 40%, ou mais alto. Em outro aspecto, o pH em um liquefeito de amido pode variar de cerca de pH 5,5 a cerca de pH 6,0. Os níveis de cálcio podem variar até cerca de 10 ppm de cálcio adicionado. A Tjato pode variar de cerca de 100°C a cerca de 110°C, enquanto a Tmanutenção pode variar de cerca de 85°C a cerca de 95°C. Estes processos podem incluir a liquefação de amido para produzir adoçantes tais como xaropes de glicose, xarope de milho de frutose elevada, por exemplo. Ainda que estes processos apliquem-se mais particularmente à produção de adoçantes, em algumas modalidades, o processo pode ser aplicado à produção de matérias-primas de alimentação de fermentação. Os liquefeitos desta forma produzidos como matérias-primas de alimentação de fermentação podem ser usados nos processos de fermentação, tal como discutido abaixo em mais detalhe, para produzir produtos finais úteis, incluindo etanol ou butanol.

[0049] Em alguns aspectos, a presente invenção conta com técnicas e métodos de rotina usados no campo da engenharia genética e biologia molecular. Os seguintes recursos incluem descrições de metodologia geral útil de acordo com a invenção: Sambrook e outros, MOLECULAR CLONAGEM: A LABORATORY MANUAL (2nd Ed., 1989); Kreigler, GENE TRANSFER AND EXPRESSION; A LABORATORY MANUAL (1990) e Ausubel e outros, Eds. CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY (1994). Estas referências gerais fornecem definições e métodos conhecidos àqueles na técnica. No entanto, não pretende-se que a presente invenção seja limitada a quaisquer métodos, protocolos, e reagentes particulares descritos, quando estes podem variar.

[0050] A não ser que definido de outra forma aqui, todos os termos técnicos e científicos usados aqui possuem o mesmo significado como comumente entendido por aquele de ordinária versatilidade na técnica à qual esta invenção pertence. Singleton, e outros, DICTIONARY OF MICROBIOLOGY AND MOLECULAR BIOLOGY, 2D ED., John Wiley e Sons, New York (1994) e Hale & Markham, THE HARPER COLLINS DICTIONARY OF BIOLOGY, Harper Perennial, NY (1991) fornecem àquele de versatilidade com dicionários gerais de muitos dos termos usados nesta invenção.

[0051] Ainda que quaisquer métodos e materiais similares ou equivalentes àqueles descritos aqui possam ser usados na prática ou teste da presente invenção, os métodos e materiais preferidos são descritos.

[0052] A invenção agora será descrita em detalhe a título de referência apenas usando as seguintes definições e exemplos. Todas as patentes e publicações, incluindo todas as sequências descritas dentro de tais patentes e publicações, referidas aqui são expressamente incorporadas através de referência.

[0053] As faixas numéricas são inclusivas dos números definindo a faixa.

[0054] A não ser que de outra forma indicado, os ácidos nucleicos são escritos da esquerda para a direita na orientação 5‘ a 3‘; as sequências de aminoácido são escritas da esquerda para a direita em orientação de amino a carbóxi, respectivamente.

[0055] Os títulos fornecidos aqui não são limitações dos vários aspectos ou modalidades da invenção que podem ser tidos através de referência à especificação como um integrante.

A. Definições

[0056] Tal como usado aqui o termo "amido" refere-se a qualquer material compreendido dos carboidratos de polissacarídeo complexo de plantas, compreendido de amilose e amilopectina com a fórmula (C6H10O5)x, em que X pode ser qualquer número. Em particular, o termo refere-se à amilase e/ou amilopectina de qualquer material com base em planta incluindo, mas não limitado a grãos, capins, tubérculos e raízes e mais especificamente trigo, cevada, milho, centeio, aveias, sorgo, milo, arroz, sorgo, farelos, mandioca, milho miúdo, batata, batata doce, e tapioca.

[0057] O termo "alfa-amilase (por exemplo, E.C. classe 3.2.1.1)" refere-se às enzimas que catalisam a hidrólise de ligações alfa-1,4- glicosídicas. Estas enzimas foram também descritas como aquelas produzindo a exo ou endohidrólise de ligações 1,4-a-D-glicosídicas em polissacarídeos contendo unidades de D-glicose 1,4-α-ligada. Outro termo usado para descrever estas enzimas é "glicogenase". Enzimas exemplares incluem glucanohidrolase de 4-glucanohidrase de alfa-1,4- glucano.

[0058] O termo "recombinante" quando usado em referência a uma célula, ácido nucleico, proteína ou vetor, indica que a célula, ácido nucleico, proteína ou vetor, foi modificado pela introdução de um ácido nucleico ou proteína heteróloga ou pela alteração de um ácido nucleico ou proteína nativa, ou que a célula é derivada de uma célula assim modificada. Desta forma, por exemplo, células recombinantes expressam genes que não são encontrados dentro da forma nativa (não recombinante) da célula ou expressam genes nativos que são de outra forma anormalmente expressados, subexpressados ou não expressados na totalidade.

[0059] Os termos "proteína" e "polipeptídeo" são usados alternada mente aqui. O código de uma letra ou três letras convencionais para resíduos de aminoácido é usado aqui.

[0060] Uma "sequência de sinal" quer dizer uma sequência de aminoácidos ligada à porção de terminal de N de uma proteína, que facilita a secreção da forma madura da proteína fora da célula. A definição de uma sequência de sinal é uma sequência funcional. A forma madura da proteína extracelular precisa da sequência de sinal que é clivada durante o processo de secreção.

[0061] Um "gene" refere-se a um segmento de DNA que é envolvido na produção de um polipeptídeo e inclui regiões precedentes e seguintes às regiões de codificação assim como sequências intermediárias (íntrons) entre segmentos de codificação individuais (éxons).

[0062] O termo "ácido nucleico" abrange DNA, RNA, de filamento único ou de filamento duplo e modificações químicas deste. Os termos "ácido nucleico" e "polinucleotídeo" podem ser usados alternadamente aqui. Porque o código genético é degenerado, mais do que um códon pode ser usado para codificar um aminoácido particular, e a presente invenção abrange polinucleotídeos, que codificam uma sequência de aminoácido particular.

[0063] Um "vetor" refere-se a uma sequência de polinucleotídeo projetada para introduzir ácidos nucleicos em um ou mais tipos de célula. Os vetores incluem vetores de clonagem, vetores de expressão, vetores de transporte de ida e volta, plasmídeos, partículas de fago, cassetes e similares.

[0064] Um "vetor de expressão" tal como usado aqui quer dizer um construto de DNA compreendendo uma sequência de DNA que é operavelmente ligada a uma sequência de controle adequada capaz de produzir expressão do DNA em um hospedeiro adequado. Tais sequências de controle podem incluir um promotor para efetuar a transcrição, uma sequência operadora opcional para controlar a transcrição, uma sequência codificando sítios de ligação de ribossoma adequados no mRNA, realçadores e sequências que controlam a terminação de transcrição e translação.

[0065] Um "promotor" é uma sequência reguladora que é envolvida em ligação de RNA polimerase para iniciar a transcrição de um gene. O promotor pode ser um promotor induzível ou um promotor constitutivo. Um promotor preferido usado na invenção é cbh1 de Trichoderma reesei, que é um promotor induzível.

[0066] "Sob controle transcricional" é um termo bem entendido na técnica que indica que a transcrição de uma sequência de polinucleotídeo, geralmente uma sequência de DNA, depende de estar operavelmente ligada a um elemento que contribui para o início da, ou promove a transcrição.

[0067] "Sob controle translacional" é um termo bem entendido na técnica que indica um processo regulador que ocorre depois que o mRNA foi formado.

[0068] Tal como usado aqui quando descrevendo proteínas e genes que as codificam, o termo para o gene é escrito em itálico, (por exemplo, o gene que codifica amyL (AA de B. licheniformis) pode ser denotado como amyL). O termo para a proteína geralmente não é escrito em itálico e a primeira letra é geralmente capitalizada, (por exemplo, a proteína codificada pelo gene de amyL pode ser denotado como AmyL ou amyL).

[0069] O termo "derivado" abrange os termos "originado de", "obtido" ou "obtenível de", e "isolado de".

[0070] O termo "operavelmente ligado" refere-se à justaposição em que os elementos estão em uma disposição permitindo-os ser funcionalmente relacionados. Por exemplo, um promotor é operável- mente ligado a uma sequência de codificação se ele controlar a transcrição da sequência.

[0071] O termo "marcador seletivo" refere-se a um gene capaz de expressão em um hospedeiro que permite facilidade de seleção daqueles hospedeiros contendo um ácido nucleico ou vetor introduzido. Exemplos de marcadores selecionáveis incluem, mas não estão limitados a antimicrobianos (por exemplo, higromicina, bleomicina, ou cloranfenicol) e/ou genes que conferem uma vantagem metabólica, tal como uma vantagem nutricional na célula hospedeira.

[0072] Um polinucleotídeo ou um polipeptídeo possuindo uma certa porcentagem (por exemplo, 80%, 85%, 90%, 95%, ou 99%) de identidade de sequência com outra sequência quer dizer que, quando alinhado, aquela porcentagem de bases ou resíduos de aminoácido são as mesmas em comparação com as duas sequências. Este alinhamento e a homologia ou identidade em porcentagem podem ser determinados usando qualquer programa de software adequado conhecido na técnica, por exemplo, aqueles descritos em CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY (F. M. Ausubel e outros (eds) 1987, Supplement 30, section 7.7.18). Os programas preferidos incluem os programas Vector NTI Advance™ 9.0 (Invitrogen Corp. Carlsbad, CA), GCG Pileup, FASTA (Pearson e outros (1988) Proc. Natl, Acad. Sci USA 85:2444-2448), e BLAST (BLAST Manual, Altschul e outros, Natl Cent. Biotechnol. Inf., Natl Lib. Med. (NCIB NLM NIH), Bethesda, Md., e Altschul e outros, (1997) NAR 25:3389-3402). Outro programa de alinhamento preferido é ALIGN Plus (Scientific and Educational Software, PA), de preferência usando parâmetros básicos. Outro programa de software de sequência que encontra uso é o Programa de Pesquisa de Dados TFASTA disponível no Pacote de Software de Sequência Versão 6.0 (Genetics Computer Group, University of Wisconsin, Madison, WI).

[0073] Aquele versado na técnica reconhecerá que as sequências abrangidas pela invenção são também definidas pela capacidade de hibridizar sob condições de hibridização rigorosas com a sequência de amyS exemplificada (por exemplo, SEQ ID NO:5 de WO 06/002643). Um ácido nucleico é hibridizável a outra sequência de ácido nucleico quando uma forma de filamento único do ácido nucleico pode anelar-se ao outro ácido nucleico sob condições apropriadas de temperatura e força iônica de solução. As condições de hibridização e lavagem são bem conhecidas na técnica (Veja, por exemplo, Sambrook (1989) supra, particularmente os capítulos 9 e 11). Em algumas modalidades, as condições rigorosas correspondem a uma Tm de 65°C e 0,1 xSSC, 0,1 % SDS.

[0074] "Cepa hospedeira" ou "célula hospedeira" quer dizer um hospedeiro adequado para um vetor de expressão ou construto de DNA compreendendo um polinucleotídeo codificando uma enzima alfa- amilase variante de acordo com a invenção. Especificamente, as cepas hospedeiras são de preferência células bacterianas. Em uma modalidade preferida da invenção, "célula hospedeira" quer dizer ambas as células e protoplastos criados das células de uma cepa microbiana e particularmente um Bacillus sp.

[0075] O termo "cultura" refere-se ao desenvolvimento de uma população de células microbianas sob condições adequadas em um meio líquido ou sólido. Em uma modalidade, cultura refere-se à bioconversão fermentativa de um substrato de amido contendo amido granular a um produto final (tipicamente em um vaso ou reator). Fermentação é a decomposição enzimática e anaeróbica de substâncias orgânicas por micro-organismos para produzir compostos orgânicos simples. Embora a fermentação ocorra sob condições anaeróbicas, não pretende-se que o termo seja somente limitado às condições anaeróbicas estritas, quando a fermentação também ocorre na presença de oxigênio.

[0076] O termo "contato" refere-se à aplicação da(s) respectiva(s) enzima(s) em proximidade suficientemente próxima ao respectivo substrato para permitir a(s) enzima(s) converterem o substrato ao produto final. Aqueles versados na técnica reconhecerão que misturação de soluções da enzima com os respectivos substratos pode efetuar contato.

[0077] O termo "conversão enzimática" em geral refere-se à modificação de um substrato por ação de enzima. O termo tal como usado aqui também refere-se à modificação de um substrato de amido pela ação de uma enzima.

[0078] Tal como usado aqui o termo "sacarificação" refere-se à conversão enzimática de amido a glicose ou outros polissacarídeos de peso molecular baixo.

[0079] O termo "gelatinização" quer dizer solubilização de uma molécula de amido por cozimento para formar uma pasta viscosa.

[0080] O termo "liquefação" refere-se ao estágio na conversão de amido em que o amido gelatinado é hidrolisado para produzir dextrinas solúveis de peso molecular baixo.

[0081] O termo "grau de polimerização (DP)" refere-se ao número (n) de unidades de anidroglicopiranose em um dado sacarídeo. Exemplos de DP1 são os monossacarídeos, tais como glicose e frutose. Exemplos de DP2 são os dissacarídeos, tais como maltose e sacarose. Um DP>3 denota polímeros com um grau de polímeroization de mais do que 3.

[0082] Os termos "produto final" ou "produto final desejado" referem-se a qualquer produto de molécula derivado de fonte de carbono que é enzimaticamente convertido do substrato de amido.

[0083] Tal como usado aqui, o termo "unidade de enzima" refere-se à quantidade de enzima que produz uma dada quantidade de produto por dada quantidade de tempo sob condições de ensaio. Em algumas modalidades, uma unidade de enzima refere-se à quantidade de enzima que produz 1 micromole de produto por minuto sob as condições especificadas do ensaio. Por exemplo, em uma modalidade, o termo "unidade de atividade de glicoamilase" (GAU) é definido como a quantidade de enzima requerida para produzir 1 g de glicose por hora de substrato de amido solúvel (4% de ds) sob condições de ensaio de 60°C e pH 4,2.

[0084] A atividade de alfa amilase (AAU) foi determinada pela taxa de hidrólise de amido, como refletido na taxa de diminuição de capacidade de tingimento de iodo medida espectrofotometricamente. Uma AAU de atividade de alfa-amilase bacteriana é a quantidade de enzima requerida para hidrolisar 10 mg de amido por min sob condições padronizadas.

[0085] A atividade de alfa-amilase pode também ser determinada como unidade de amido solúvel (SSU) e é com base no grau de hidrólise de substrato de amido de batata solúvel (4% de DS) por uma alíquota da amostra de enzima em pH 4,5, 50°C. A redução de teor de açúcar é medida usando o método de DNS tal como descrito em Miller, G. L. (1959) Anal. Chem. 31:426 - 428.

[0086] A atividade de alfa amilase em Unidades de Liquefon (LU) foi medida de acordo com o método descrito em USP 5.958.739. Em suma, o método de ensaio usa malto-heptosídeo de p-nitrofenila como um substrato com o açúcar de terminal não redutor quimicamente bloqueado. A taxa de liberação de p-nitrofenila é proporcional à atividade de alfa amilase e a liberação é monitorada em 410 nm. A atividade é calculada contra um controle padrão.

[0087] Tal como usado aqui o termo "teor de sólidos secos (ds)" refere-se aos sólidos totais de uma pasta em % em uma base de peso seco. O termo "pasta" refere-se a uma mistura aquosa contendo sólidos insolúveis.

[0088] O termo "amido residual" refere-se ao amido restante (solúvel ou insolúvel) deixado em uma composição depois da fermentação de um substrato contendo amido.

[0089] Tal como usado aqui "uma etapa de reciclagem" refere-se à reciclagem de componentes de massa, que podem incluir amido residual, enzimas e/ou micro-organismos para fermentar substratos compreendendo amido.

[0090] O termo "massa" refere-se a uma mistura de uma fonte de carbono fermentável (carboidrato) em água usada para produzir um produto fermentado, tal como um álcool. Em algumas modalidades, o termo "cerveja" e "massa" são usados alternadamente.

[0091] O termo "vinhaça" quer dizer uma mistura de sólidos não fermentados e água, que é o resíduo depois da remoção de álcool de uma massa fermentada.

[0092] Os termos "grão secado por destiladores (DDG)" e "grão secado por destiladores com solúveis (DDGS)" referem-se a um subproduto útil da fermentação de grão.

[0093] Tal como usado aqui, "micro-organismo etanologênico" refere- se a um micro-organismo com a capacidade de converter um açúcar ou oligossacarídeo a etanol. Os micro-organismos etanologênicos são etanologênicos em virtude de sua capacidade de expressar uma ou mais enzimas que individualmente ou juntas convertem açúcar a etanol.

[0094] Tal como usado aqui, o termo "produtor de etanol" ou "micro organismo produtor de etanol" refere-se a qualquer organismo ou célula que seja capaz de produção de etanol de uma hexose ou pentose. Geralmente, as células produtoras de etanol contêm uma álcool desidrogenase e uma piruvato descarboxilase. Exemplos de microorganismos produtores de etanol incluem micro-organismos fúngicos tais como levedura. Uma levedura preferida inclui cepas de Saccharomyces, particularmente, S. cerevisiae.

[0095] O termo "heterólogo" com referência a um polinucleotídeo ou proteína refere-se a um polinucleotídeo ou proteína que não ocorre naturalmente em uma célula hospedeira. Em algumas modalidades, a proteína é uma proteína industrial comercialmente importante. Pretende-se que o termo inclua proteínas que são codificadas por genes de ocorrência natural, genes mutados, e/ou genes sintéticos.

[0096] O termo "endógeno" com referência a um polinucleotídeo ou proteína refere-se a um polinucleotídeo ou proteína que ocorre naturalmente na célula hospedeira.

[0097] Os termos "recuperado", "isolado", e "separado" tal como usados aqui referem-se a um composto, proteína, célula, ácido nucleico ou aminoácido que é removido de pelo menos um componente com o qual ele está naturalmente associado.

[0098] Tal como usado aqui, os termos "transformado", "estavelmente transformado" e "transgênico" usados em referência a uma célula quer dizer a célula que possui uma sequência de ácido nucleico não nativo (por exemplo, heterólogo) integrada em seu genoma ou como um plasmídeo epissômico que é mantido por múltiplas gerações.

[0099] Tal como usado aqui, o termo "expressão" refere-se ao processo pelo qual um polipeptídeo é produzido com base na sequência de ácido nucleico de um gene. O processo inclui tanto transcrição quanto translação.

[00100] O termo "introduzido" no contexto de inserção de uma sequência de ácido nucleico em uma célula, quer dizer "transfecção", ou "transformação" ou "transdução" e inclui referência à incorporação de uma sequência de ácido nucleico em uma célula eucariótica ou procariótica em que a sequência de ácido nucleico pode ser incorporada no genoma da célula (por exemplo, cromossoma, plasmídeo, plastídio, ou DNA mitocondrial), convertida em um réplicon autônomo, ou transitoriamente expressada (por exemplo, mRNA transfectado).

[00101] Tal como usado aqui, o termo "atividade específica" quer dizer uma unidade de enzima definida como o número de moles de substrato convertido ao produto por uma preparação de enzima por tempo de unidade sob condições específicas. A atividade específica é expressada como unidades (U)/mg de proteína.

[00102] O termo "rendimento" refere-se à quantidade de produto final ou produtos finais desejados produzidos usando os métodos da presente invenção. Em algumas modalidades preferidas, o rendimento é maior do que aquele produzido usando métodos conhecidos na técnica. Em algumas modalidades, o termo refere-se ao volume do produto final e, em outra modalidade, o termo refere-se à concentração do produto final.

[00103] "ATCC" refere-se à Coleção de Cultura do Tipo Americano localizada em Manassas, Va. 20108 (ATCC).

[00104] "NRRL" refere-se à Coleção de Cultura do Serviço de Pesquisa Agrícola, Centro Nacional para Pesquisa de Utilização Agrícola (e previamente conhecido como Laboratório de Pesquisa Regional do Norte USDA), Peoria, Ill.

[00105] "Um", "uma" e "o" incluem referências plurais a não ser que o contexto claramente dite de outra forma.

[00106] Tal como usado aqui, o termo "compreendendo" e seus cognatos são usados em seu sentido inclusivo; isto é, equivalente ao termo "incluindo" e seus correspondentes cognatos.

Nomenclatura

[00107] Na presente descrição e reivindicações, os códigos de uma letra e três letras convencionais para resíduos de aminoácido são usados. Para facilidade de referência, as variantes de alfa-amilase da invenção são descritas pelo uso da seguinte nomenclatura: Aminoácido(s) original(is): posição(ões): aminoácido(s) substituído(s)

[00108] De acordo com esta nomenclatura, por exemplo, a substituição de serina por uma alanina na posição 242 é mostrada como: Ser242Ala ou S242A uma deleção de alanina na posição 30 é mostrada como: Ala30* ou A30* ou ΔA30 e inserção de um resíduo de aminoácido adicional, tal como lisina, é mostrada como: Ala30AlaLys ou A30AK

[00109] Uma deleção de uma extensão consecutiva de resíduos de aminoácido, tais como resíduos de aminoácido 30-33, é indicado como (30-33)* ou Δ(A30-N33).

[00110] Onde uma alfa-amilase específica contém uma "deleção" em comparação com outras alfa-amilases e uma inserção é feita em uma tal posição isto é indicado como: *36Asp ou *36D para inserção de um ácido aspártico na posição 36.

[00111] Múltiplas mutações são separadas por sinais de mais, isto é: Ala30Asp+Glu34Ser ou A30N+E34S representando mutações nas posições 30 e 34 substituindo alanina e ácido glutâmico por asparagina e serina, respectivamente.

[00112] Quando um ou mais resíduos de aminoácido alternativos pode ser inserido em uma dada posição ele é indicado como A30N,E ou A30N ou A30E

[00113] Além disso, quando uma posição adequada para modificação é identificada aqui sem qualquer modificação específica sendo sugerida, deve ser entendido que qualquer resíduo de aminoácido pode ser substituído pelo resíduo de aminoácido presente na posição. Desta forma, por exemplo, quando uma modificação de uma alanina na posição 30 é mencionada, mas não especificada, deve ser entendido que a alanina pode ser deletada ou substituída por qualquer outro aminoácido, isto é, qualquer um de: R, N, D, A, C, Q, E, G, H, I, L, K, M, F, P, S, T, W, Y, V.

[00114] Além disso, "A30X" quer dizer quaisquer uma das seguintes substituições: A30R, A30N, A30D, A30C, A30Q, A30E, A30G, A30H, A30I, A30L, A30K, A30M, A30F, A30P, A30S, A30T, A30W, A30Y, ou A30 V; ou em suma: A30R,N,D,C,Q,E,G,H,I,L,K,M,F,P,S,T,W,Y,V.

[00115] Se a enzima de origem -- usada para a numeração -- já possui o resíduo de aminoácido em questão sugerido para substituição nesta posição, a seguinte nomenclatura é usada: "X30N" ou "X30N,V" no caso onde, por exemplo, um ou N ou V está presente no tipo selvagem.

[00116] Desta forma, significa que outras correspondentes enzimas de origem são substituídas a uma "Asn" ou "Val" na posição 30. Características dos Resíduos de Aminoácido

[00117] Aminoácidos carregados: Asp, Glu, Arg, Lys, His

[00118] Aminoácidos negativamente carregados (com o resíduo mais negativo primeiro): Asp, Glu

[00119] Aminoácidos positivamente carregados (com o resíduo mais positivo primeiro): Arg, Lys, His

[00120] Aminoácidos neutros: Gly, Ala, Val, Leu, Ile, Phe, Tyr, Trp, Met, Cys, Asn, Gln, Ser, Thr, Pro

[00121] Resíduos de aminoácido hidrofóbicos (com o resíduo mais hidrofóbico listado no final): Gly, Ala, Val, Pro, Met, Leu, Ile, Tyr, Phe, Trp,

[00122] Aminoácidos hidrofílicos (com o resíduo mais hidrofílico listado no final): Thr, Ser, Cys, Gln, Asn

Alfa-Amilases

[00123] As misturas de amilase compreendem uma alfa amilase AmyS e uma alfa amilase de B. licheniformis. A enzima AmyS pode compreender a sequência de polipeptídeo da SEQ ID NO: 1 ou SEQ ID NO: 2, em que o resíduo S242 é substituído. Em uma modalidade preferida, a AmyS compreende uma sequência de aminoácido apresentada na SEQ ID NO: 4, também conhecida como "AmyS S242Q" ou S242Q," que possui uma substituição S242Q comparada a SPEZYME® Xtra (SEQ ID NO: 2). Em outra modalidade, a AmyS pode ser selecionada de uma das enzimas AmyS compreendendo a sequência de polipeptídeo da SEQ ID NOS: 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 15 e 16, em que o resíduo S242 é substituído.

[00124] A substituição S242 pode ser uma substituição S242A, S242E, S242Q, S242F, S242H, ou S242N. Em uma modalidade, a substituição de aminoácido na posição S242 altera a termoestabilidade da AmyS. A AmyS com a substituição na posição S242 pode possuir um termoestabilidade elevada entre cerca de 80°C e cerca de 95°C comparada a uma AmyS sem a substituição S242.

[00125] Em uma modalidade, a AmyS compreende uma sequência de aminoácido possuindo pelo menos 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, ou 99% de identidade de sequência a AmyS da SEQ ID NO: 1, em que a AmyS possui atividade de alfa-amilase. A AmyS pode compreender uma substituição de uma cisteína nos aminoácidos 349 e 428, usando a SEQ ID NO: 1 para numeração. A AmyS também pode compreender uma substituição de N193 e/ou V416. A AmyS também pode compreender uma deleção de aminoácidos 179 e 180, usando a SEQ ID NO: 1 para numeração.

[00126] As enzimas AmyS podem possuir uma sequência de aminoácido alterada comparada a uma AmyS do tipo selvagem que altera uma ou mais propriedades da enzima, por exemplo, especificidade de substrato, ligação de substrato, padrão de clivagem de substrato, estabilidade térmica, perfil de pH/atividade, perfil de pH/estabilidade, estabilidade para oxidação, dependência de Ca2+, e/ou atividade específica. Por exemplo, a alteração pode resultar em uma enzima que possui uma dependência de Ca2+ reduzida e/ou um perfil de pH/atividade alterado e/ou termoestabilidade, comparada a uma AmyS do tipo selvagem.

[00127] Várias alfa-amilases produzidas por Bacillus spp. são altamente homólogas (idênticas) no nível de aminoácido.

[00128] A identidade de várias alfa-amilases de Bacillus conhecidas pode ser encontrada na Tabela 1 abaixo: TABELA 1 - Identidade em porcentagem

[00129] Por exemplo, a alfa-amilase de B. licheniformis (LAT) compreendendo a sequência de aminoácido mostrada na SEQ ID NO: 7 foi constatada ser cerca de 81% homóloga com a alfa-amilase de B. amyloliquefaciens compreendendo a sequência de aminoácido mostrada na SEQ ID NO: 9 e cerca de 65% homóloga com a alfa- amilase de G. stearothermophilus (BSG) compreendendo a sequência de aminoácido mostrada na SEQ ID NO: 1. Outras alfa-amilases homólogas incluem SP690 e SP722 descritas em WO 95/26397 e a alfa- amilase No.707 derivada de Bacillus sp., mostrada na SEQ ID NO: 6 e descrita por Tsukamoto e outros, Biochemical and Biophysical Research Communications, 151 (1988), pp. 25-31.

[00130] A alfa-amilase KSM AP1378 é descrita em WO 97/00324 (de KAO Corporation).

[00131] Ainda outras alfa-amilases homólogas incluem a alfa- amilase produzida pela cepa de B. lichenformis descrita em EP 0252666. (ATCC 27811), e as alfa-amilases identificadas em WO 91/00353 e WO 94/18314. Outras alfa-amilases do tipo SPEZYME® Xtra comerciais são compreendidas nos produtos vendidos sob os seguintes nomes comerciais: SPEZYME®® AA e Ultraphlow (disponível por Danisco US Inc, Genencor Division), e Keistase™ (disponível por Daiwa) e Liquezyme SC (disponível por Novozymes, Denmark).

[00132] Por causa da homologia substancial encontrada entre estas alfa-amilases, elas são consideradas pertencer à mesma classe de alfa- amilases, isto é, a classe de "alfa-amilases do tipo SPEZYME® Xtra".

[00133] Por conseguinte, no presente contexto, o termo "alfa-amilase do tipo SPEZYME®" pretende indicar uma alfa-amilase, em particular alfa-amilase de Bacillus, especialmente alfa-amilase de Geobacillus stearothermophilus, que, no nível de aminoácido, exibe uma identidade substancial à alfa-amilase possuindo a sequência de aminoácido mostrada na SEQ ID NO: 2, aqui. SPEZYME® Xtra (SEQ ID NO: 2) é comercialmente disponível por Danisco US Inc, Genencor Division. Geobacillus stearothermophilus foi referido como Bacillus stearothermophilus na literatura e as duas podem ser usadas alternadamente aqui.

[00134] Em outras palavras, todas as alfa-amilases seguintes, que possuem as sequências de aminoácido mostradas na SEQ ID NOS: 1, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 15 e 16 aqui são consideradas serem uma "alfa- amilase do tipo SPEZYME®". Outras alfa-amilases do tipo SPEZYME® Xtra são alfa-amilases i) que exibem pelo menos 60%, tal como pelo menos 70%, por exemplo, pelo menos 75%, ou pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99% de homologia (identidade) com pelo menos uma das referidas sequências de aminoácido mostradas na SEQ ID NOS: 1, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 15 e 16, e/ou são codificadas por uma sequência de DNA que hibridiza às sequências de DNA codificando as alfa-amilases acima especificadas que são evidentes da SEQ ID NOS: 9 (BAN), 5 (BSG), 3 (SP722), 1 (SP690), 7 (LAT), 11 (AA560) de WO 06/002643 e da presente especificação (cujas sequências de codificação codificam as sequências de aminoácido mostradas na SEQ ID NOS: 1, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 15 e 16 aqui, respectivamente).

[00135] Outra amilase alfa-amilase útil de Bacillus licheniformis é SPEZYME® FRED (SEQ ID NO: 20), comercialmente disponível por Danisco US Inc, Genencor Division. Esta alfa-amilase pode ser referida aqui como SPEZYME® FRED ou "Fred" (SEQ ID NO: 20).

Homologia (Identidade)

[00136] A homologia pode ser determinada como o grau de identidade entre as duas sequências indicando uma derivação da primeira sequência da segunda. A homologia pode adequadamente ser determinada por meio de programas de computador conhecidos na técnica tais como GAP fornecido no pacote de programa de GCG (descrito acima). Desta forma, Gap GCG v8 pode ser usado com a matriz de classificação básica para identidade e os seguintes parâmetros básicos: penalidade de criação de GAP de 5,0 e penalidade de extensão de GAP de 0,3, respectivamente para comparação de sequência acídica nucléica, e penalidade de criação de GAP de 3,0 e penalidade de extensão de GAP de 0,1, respectivamente, para comparação de sequência de proteína. GAP usa o método de Needleman e Wunsch, (1970), J.Mol. Biol. 48:443-453, para produzir alinhamentos e para calcular a identidade.

[00137] Um alinhamento estrutural entre SPEZYME® Xtra (SEQ ID NO: 2) e, por exemplo, outra alfa-amilase pode ser usado para identificar posições equivalentes/correspondentes em outras alfa-amilases do tipo SPEZYME® Xtra. Um método de obtenção do referido alinhamento estrutural é usar o programa Pile Up do pacote GCG usando valores básicos de penalidades de gap, isto é, uma penalidade de criação de gap de 3,0 e penalidade de extensão de gap de 0,1. Outros métodos de alinhamento estrutural incluem a análise de grupo hidrofóbico (Gaboriaud e outros, (1987), FEBS LETRAS 224, pp. 149-155) e encadeamento reverso (Huber, T; Torda, AE, PROTEIN SCIENCE Vol. 7, No. 1 pp. 142-149 (1998).

Hibridização

[00138] A sonda de oligonucleotídeo usada na caracterização da alfa-amilase do tipo SPEZYME® Xtra acima pode adequadamente ser preparada com base na sequência de nucleotídeo ou aminoácido total ou parcial da alfa-amilase em questão.

[00139] As condições adequadas para teste de hibridização envolvem pré-embebimento em SSC a 5X e pré-hibridização durante 1 hora em 40°C em uma solução de formamida a 20%, solução de Denhardt a 5X, fosfato de sódio a 50 mM, pH 6,8, e 50 mg de DNA de timo de bezerro sonicado desnaturado, seguido por hibridização na mesma solução suplementada com ATP a 100 mM durante 18 horas em 40°C, seguido por lavagem três vezes do filtro em SSC a 2X, SDS a 0,2% em 40°C durante 30 minutos (estringência baixa), preferido em 50°C (estringência média), mais preferivelmente em 65°C (estringência alta), até mais preferivelmente em 75°C (estringência muito alta). Mais detalhes a cerca do método de hibridização podem ser encontrados em Sambrook e outros, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd Ed., Cold Spring Harbor, 1989.

[00140] No presente contexto, "derivado de" pretende não apenas indicar uma alfa-amilase produzida ou produzível por uma cepa do organismo em questão, mas também uma alfa-amilase codificada por uma sequência de DNA isolada de tal cepa e produzida em um organismo hospedeiro transformado com a referida sequência de DNA. Finalmente, o termo pretende indicar uma alfa-amilase, que é codificada por uma sequência de DNA de origem sintética e/ou de cDNA e que possui as características de identificação da alfa-amilase em questão. O termo também pretende indicar que a alfa-amilase origem pode ser uma variante de uma alfa-amilase de ocorrência natural, isto é, uma variante, que é o resultado de uma modificação (inserção, substituição, deleção) de um ou mais resíduos de aminoácido da alfa-amilase de ocorrência natural.

Propriedades Alteradas

[00141] A seguinte seção descreve a relação entre mutações, que estão presentes em uma variante descrita aqui, e alterações desejáveis nas propriedades (relativa àquelas de uma alfa-amilase do tipo SPEZYME® Xtra origem), que podem resultar desta.

[00142] Tal como mencionado acima, a invenção refere-se a uma alfa-amilase do tipo SPEZYME® com propriedades alteradas.

[00143] As alfa-amilases do tipo SPEZYME® Xtra de origem especificamente consideradas em conexão com passagem pelas propriedades alteradas especificamente consideradas são a alfa- amilase do tipo SPEZYME® Xtra origem e alfa-amilases do tipo SPEZYME® Xtra híbridas de origem acima mencionadas.

[00144] A alfa-amilase de Geobacillus stearothermophilus (SEQ ID NO: 2) é usada como o ponto de partida, mas as posições correspondentes nas, por exemplo, alfa-amilases SP722, BLA, BAN, AA560, SP690, KSM AP1378, No.707 e outras de Bacillus deve ser entendida tal como descrito e especificamente considerada também.

[00145] Em um aspecto, a invenção refere-se à variante com propriedades alteradas tal como mencionado acima.

[00146] No primeiro aspecto, uma variante de uma alfa-amilase de G. stearothermophilus origem, compreendendo uma alteração em uma ou mais posições (usando a SEQ ID NO: 1 para a numeração de aminoácido) selecionada do grupo de:

[00147] P17, D19, T21, N28, S51, G72, V74, A82, Q86, Q89, A93, G95, Q97, W115, D117, P123, S124, D125, N127, I130,G132, Q135, P145, G146, G148, S153,Y159, W166, S169, K171, W187, P209, N224, S242, G256, D269, N271, T278, N281, G302, A304, R308, T321, Q358, P378, S382, K383, T398, H405, T417, E418, P420, G421, P432, W437, G446, G454, S457, T459, T461, S464, G474, R483.

[00148] em que (a) a(s) alteração(ões) é (são) independentemente (i) uma inserção de um aminoácido a jusante do aminoácido que ocupa a posição, (ii) uma deleção do aminoácido que ocupa a posição, ou (iii) uma substituição do aminoácido que ocupa a posição com um aminoácido diferente, (b) a variante possui atividade de alfa-amilase e (c) cada posição corresponde a uma posição da sequência de aminoácido da alfa-amilase de G. stearothermophilus origem possuindo a sequência de aminoácido mostrada na SEQ ID NO: 2.

[00149] Especificamente consideradas aqui são S242A, S242Q, S242N e S242E.

[00150] Adicionalmente, os resíduos R179, G180, I181, G182, K183 foram escolhidos explorar o efeito das mutações na região de ligação de cálcio-sódio, e P245 foi escolhido porque uma prolina no meio de uma hélice alfa é incomum.

[00151] As posições correspondentes em outras alfa-amilases do tipo SPEZYME® Xtra de origem podem ser encontradas por alinhamento tal como descrito acima e mostradas no alinhamento na figura 4. Desta forma, em um segundo aspecto, uma variante de uma alfa-amilase do tipo SPEZYME® Xtra origem, compreendendo uma alteração em uma ou mais das posições enumeradas acima (usando a SEQ ID NO: 1 para a numeração de aminoácido) é considerada aqui.

Estabilidade

[00152] No contexto das variantes descritas aqui, as mutações (incluindo substituições de aminoácido e deleção) de importância com respeito à obtenção de estabilidade alterada, em particular estabilidade melhorada (isto é, elevada ou inferior), em temperaturas especialmente altas (isto é, 70 a 120°C) e/ou pH extremo (isto é, pH baixo ou alto, isto é, pH 4 a 6 ou pH 8 a 11, respectivamente), em particular em concentrações de cálcio livre (isto é, não ligado, por esse motivo em solução) abaixo de 60 ppm, incluem quaisquer das mutações listadas na seção "Propriedades Alteradas". A estabilidade pode ser determinada tal como descrito na seção "Métodos" abaixo.

Estabilidade de Ca2+

[00153] A estabilidade de Ca2+ alterada quer dizer que a estabilidade da enzima sob depleção de Ca2+ foi melhorada, isto é, estabilidade elevada ou inferior. No contexto das variantes presentemente descritas, as mutações (incluindo substituições de aminoácido e deleções) de importância com respeito a obtenção de estabilidade de Ca2+ alterada, em particular estabilidade de Ca2+ melhorada, isto é, estabilidade elevada ou inferior, em pH especialmente alto (isto é, pH 8 a 10,5) incluem quaisquer das mutações listadas na seção "Propriedades Alteradas". Atividade Específica

[00154] Em um aspecto adicional, as mutações importantes (incluindo substituições de aminoácido e deleções) com respeito à obtenção de variantes exibindo atividade específica alterada, em particular atividade específica aumentada ou diminuída, especialmente em temperaturas de 10 a 60°C, de preferência 20 a 50°C, especialmente 30 a 40°C, incluem quaisquer das mutações listadas na seção "Propriedades alteradas". A atividade específica pode ser determinada tal como descrito na seção "Métodos" abaixo.

Estabilidade de Oxidação

[00155] As variantes descritas podem possuir estabilidade de oxidação alterada, em particular estabilidade de oxidação elevada, em comparação à alfa-amilase origem. A estabilidade de oxidação aumentada é vantajosa em, por exemplo, composições de detergente e a estabilidade de oxidação diminuída pode ser vantajosa em composição para liquefação de amido. A estabilidade de oxidação pode ser determinada tal como descrito na seção "Métodos" abaixo.

Perfil de pH Alterado

[00156] Importantes posições e mutações com respeito à obtenção de variantes com perfil de pH alterado, em particular atividade melhorada em pH especialmente alto (isto é, pH 8 a 10,5) ou pH baixo (isto é, pH 4-6) incluem mutações de resíduos de amino localizados próximos aos resíduos de sítio ativo.

[00157] As mutações/substituições específicas preferidas são aquelas listadas acima na seção "Propriedades Alteradas" para as posições em questão. Ensaios adequados são descritos na seção "Métodos" abaixo.

Desempenho de Lavagem

[00158] Posições e mutações importantes com respeito à obtenção de variantes com desempenho de lavagem melhorado em pH especialmente alto (isto é, pH 8,5 a 11) incluem as mutações/substituições específicas listadas acima na seção "Propriedades Alteradas" para as posições em questão. O desempenho de lavagem pode ser testado tal como descrito abaixo na seção "Métodos".

Mutações Gerais em Variantes da Invenção

[00159] Uma variante descrita aqui pode em uma modalidade compreender um ou mais modificações além daquelas delineadas acima. Desta forma, pode ser vantajoso que um ou mais resíduos de Prolina (Pro) presentes na parte da variante de alfa-amilase que é modificada seja/sejam substituídos com um resíduo de não Prolina que pode ser quaisquer dos resíduos de não Prolina de ocorrência natural possíveis, e que de preferência é uma Alanina, Glicina, Serina, Treonina, Valina ou Leucina.

[00160] Analogamente, em uma modalidade, um ou mais resíduos de Cisteína presentes na alfa-amilase de origem podem ser substituídos com um resíduo de não Cisteína tal como Serina, Alanina, Treonina, Glicina, Valina ou Leucina.

[00161] Deve ser entendido que a presente invenção abrange variantes incorporando duas ou mais das modificações delineadas acima.

[00162] Além disso, pode ser vantajoso introduzir mutações em uma ou mais das seguintes posições (usando a SEQ ID NO: 7 para a numeração):

[00163] M15, V128, A111, H133, W138, T149, M197, N188, A209, A210, H405, T412, em particular as seguintes mutações únicas, duplas ou triplas ou múltiplas: M15X, em particular M15T,L; V128X, em particular V128E; H133X, em particular H133Y; N188X, em particular N188S,T,P; M197X, em particular M197T,L; A209X, em particular A209V; M197T/W138F; M197T/138Y; M15T/H133Y/N188S; M15N128E/H133Y/N188S; E119C/S130C; D124C/R127C; H133Y/ T149I; G475R, H133Y/S187D; H133Y/A209V.

[00164] No caso da alfa-amilase de origem possuindo a sequência de aminoácido mostrada na SEQ ID NO. 7, os resíduos de aminoácido relevantes que podem ser deletados ou substituídos com a finalidade de melhora da estabilidade de oxidação incluem o resíduo de cisteína único (C363) e os resíduos de metionina localizados nas posições M8, M9, M96, M200, M206, M284, M307, M311, M316 e M438 na SEQ ID NO. 2.

[00165] Com respeito ao aumento da estabilidade térmica de uma variante de alfa-amilase relativa a sua alfa-amilase de origem, parece ser particularmente desejável deletar pelo menos um, e de preferência dois ou até três, dos seguintes resíduos de aminoácido na sequência de aminoácido mostrada na SEQ ID NO. 2 são F178, R179, G180, I181, G182 e K183.

[00166] As deleções em pares particularmente interessantes deste tipo são R179*+G180*; e I181*+G182* (SEQ ID NOs. 16 ou 15, respectivamente) (ou equivalentes destas deleções em pares em outra alfa-amilase satisfazendo os requisitos de uma alfa-amilase origem no contexto da presente descrição).

[00167] Outros resíduos de interesse incluem N193F e V416G na sequência de aminoácido mostrada na SEQ ID No. 2.

Métodos de Preparo das Variantes de α-amilase

[00168] Diversos métodos para introdução de mutações em genes são conhecidos na técnica. Depois de uma breve discussão da clonagem de sequências de DNA codificando α-amilase, os métodos para geração de mutações em sítios específicos dentro da sequência codificando α-amilase serão discutidos.

Clonagem de uma Sequência de DNA Codificando uma α-amilase

[00169] A sequência de DNA codificando uma α-amilase de origem pode ser isolada de qualquer célula ou micro-organismo produzindo a α-amilase em questão, usando vários métodos bem conhecidos na técnica. Primeiro, uma biblioteca de DNA e/ou cDNA genômica deve ser construída usando DNA cromossômico ou RNA mensageiro do organismo que produz a α-amilase a ser estudada. Então, se a sequência de aminoácido da α-amilase é conhecida, as sondas de oligonucleotídeo rotuladas homólogas podem ser sintetizadas e usadas para identificar os clones codificando α-amilase de uma biblioteca genômica preparada do organismo em questão. Alternativamente, uma sonda de oligonucleotídeo rotulada contendo sequências homólogas a um gene de α-amilase conhecido pode ser usada como uma sonda para identificar clones codificando α-amilase, usando condições de hibridização e lavagem de estringência inferior.

[00170] Ainda outro método para identificação de clones codificando α-amilase envolveria inserção de fragmentos de DNA genômico em um vetor de expressão, tal como um plasmídeo, transformação de bactérias negativas de α-amilase com a biblioteca de DNA genômica resultante, e em seguida plaqueamento das bactérias transformadas em ágar contendo um substrato para α-amilase, desse modo permitindo os clones expressando a α-amilase serem identificados.

[00171] Alternativamente, a sequência de DNA codificando a enzima pode ser preparada sinteticamente através de métodos-padrão estabelecidos, por exemplo, o método de fosfoamidita descrito por S. L. Beaucage e M. H. Caruthers (1981) ou o método descrito por Matthes e outros (1984). No método de fosfoamidita, os oligonucleotídeos são sintetizados, por exemplo, em um sintetizador de DNA automático, purificados, anelados, ligados e clonados em vetores apropriados.

[00172] Finalmente, a sequência de DNA pode ser de origem genômica e sintética mista, origem sintética e de cDNA mista ou origem genômica e de cDNA mista, preparada por ligação de fragmentos de origem sintética, genômica ou de cDNA (tal como apropriado, os fragmentos correspondentes a várias partes da sequência de DNA inteira), de acordo com técnicas-padrão. A sequência de DNA pode também ser preparada por reação de cadeia de polimerase (PCR) usando iniciadores específicos, por exemplo, tal como descrito na Patente U.S.. No. 4.683.202 ou R. K. Saiki e outros (1988).

Mutagênese direcionada a Sítio

[00173] Uma vez que uma sequência de DNA codificando α-amilase foi isolada, e sítios desejáveis para mutação identificados, as mutações podem ser introduzidas usando oligonucleotídeos sintéticos. Estes oligonucleotídeos contêm sequências de nucleotídeo flanqueando os sítios de mutação desejados; os nucleotídeos mutantes são inseridos durante a síntese de oligonucleotídeo. Em um método específico, um gap de filamento único de DNA, fazendo ponte com a sequência codificando α-amilase, é criado em um vetor transportando o gene de α- amilase. Em seguida, o nucleotídeo sintético, portando a mutação desejada, é anelado a uma porção homóloga do DNA de filamento único. O gap restante é em seguida carregado com DNA polimerase I (fragmento de Klenow) e o construto é ligado usando T4 ligase. Um exemplo específico deste método é descrito em Morinaga e outros (1984). A Patente U.S.. No. 4.760.025 descreve a introdução de oligonucleotídeos codificando múltiplas mutações por execução de alterações menores do cassete. No entanto, uma variedade até maior de mutações pode ser introduzida em qualquer momento pelo método de Morinaga, porque um grande número de oligonucleotídeos, de vários tamanhos, pode ser introduzido.

[00174] Outro método de introdução de mutações em sequências de DNA codificando α-amilase é descrito em Nelson and Long (1989). Ele envolve a geração em 3 etapas de um fragmento de PCR contendo a mutação desejada introduzida por uso de um filamento de DNA quimicamente sintetizado como um dos iniciadores nas reações de PCR. Do fragmento gerado por PCR, um fragmento de DNA transportando a mutação pode ser isolado por clivagem com endonucleases de restrição e reinserido em um plasmídeo de expressão.

[00175] Métodos alternativos para fornecimento de variantes da invenção incluem rearranjo de gene, por exemplo, tal como descrito em WO 95/22625 (de Affymax Technologies N.V.) ou em WO 96/00343 (de Novo Nordisk A/S), ou outras técnicas correspondentes resultando em uma enzima híbrida compreendendo a(s) mutação(ões), por exemplo, substituição(ões) e/ou deleção(ões), em questão.

Expressão de Variantes de Alfa-Amilase

[00176] De acordo com a invenção, uma sequência de DNA codificando a variante produzida através de métodos descritos acima, ou através de quaisquer métodos alternativos conhecidos na técnica, pode ser expressada, na forma de enzima, usando um vetor de expressão que tipicamente inclui sequências de controle codificando um promotor, operador, sítio de ligação de ribossoma, sinal de início de translação, e, opcionalmente, um gene repressor ou vários genes ativadores.

[00177] O vetor de expressão recombinante transportando a sequência de DNA codificando uma variante de alfa-amilase da invenção pode ser qualquer vetor, que pode convenientemente ser submetido aos procedimentos de DNA recombinantes, e a escolha de vetor frequentemente dependerá da célula hospedeira em que ele deve ser introduzido. Desta forma, o vetor pode ser um vetor autonomamente replicante, isto é, um vetor que existe como uma entidade extracromossômica, a replicação da qual é independente de replicação cromossômica, por exemplo, um plasmídeo, um bacteriófago ou um elemento extracromossômico, minicromossoma ou um cromossoma artificial. Alternativamente, o vetor pode ser aquele que, quando introduzido em uma célula hospedeira, é integrado no genoma de célula hospedeira e replicado junto com o(s) cromossoma(s) em que ele foi integrado.

[00178] No vetor, a sequência de DNA deve ser operavelmente conectada a uma sequência promotora adequada. O promotor pode ser qualquer sequência de DNA, que mostra atividade transcricional na célula hospedeira de escolha e pode ser derivado de genes codificando proteínas ou homólogo ou heterólogo à célula hospedeira. Exemplos de promotores adequados para controle da transcrição da sequência de DNA codificando uma variante de alfa-amilase da invenção, especialmente em um hospedeiro bacteriano, são o promotor do opéron de lac de E. coli, os promotores de gene dagA de agarase de Streptomyces coelicolor, os promotores do gene de alfa-amilase de Bacillus licheniformis (amyL), os promotores do gene de amilase maltogênica de Geobacillus stearothermophilus (amyM), os promotores da alfa-amilase de Bacillus amyloliquefaciens (amyQ), os promotores dos genes de xylA e xylB de Bacillus subtilis etc. Para transcrição em um hospedeiro fúngico, exemplos de promotores úteis são aqueles derivados do gene codificando TAKA amilase de A. oryzae, proteinase aspártica de Rhizomucor miehei, alfa-amilase neutra de A. niger, alfa- amilase estável em ácido de A. niger, glicoamilase de A. niger, lípase de Rhizomucor miehei, protease alcalina de A. oryzae, fosfato isomerase de triose de A. oryzae ou acetamidase de A. nidulans.

[00179] O vetor de expressão da invenção pode também compreender um terminador de transcrição adequado e, nos eucariotos, sequências de poli-adenilação operavelmente conectadas à sequência de DNA codificando a variante de alfa-amilase da invenção. Sequências de poliadenilação e terminação podem adequadamente ser derivadas das mesmas fontes como o promotor.

[00180] O vetor pode também compreender uma sequência de DNA permitindo o vetor replicar-se na célula hospedeira em questão. Exemplos de tais sequências são as origens de replicação de plasmídeos pUC19, pACYC177, pUB110, pE194, pAMB1 e pIJ702.

[00181] O vetor pode também compreender um marcador selecionável, por exemplo, um gene do produto de que complementa um defeito na célula hospedeira, tal como os genes de dal de B. subtilis ou B. licheniformis, ou aquele que confere resistência a antibiótico tal como resistência a ampicilina, canamicina, cloranfenicol ou tetraciclina. Além disso, o vetor pode compreender marcadores de seleção de Aspergillus tais como amdS, argB, niaD e sC, um marcador dando origem a resistência de higromicina, ou a seleção pode ser realizada por cotransformação, por exemplo, tal como descrito em WO 91/17243.

[00182] Embora a expressão intracelular possa ser vantajosa em alguns aspectos, por exemplo, quando usando certas bactérias como células hospedeiras, é geralmente preferido que a expressão seja extracelular. Em geral, as alfa-amilases de Bacillus mencionadas aqui compreendem uma secreção permitindo pré-região da protease expressada no meio de cultura. Se desejável, esta pré-região pode ser substituída por uma pré-região ou sequência de sinal diferente, convenientemente realizada por substituição das sequências de DNA codificando as respectivas pré-regiões.

[00183] Os procedimentos usados para ligar o construto de DNA da invenção codificando uma variante de alfa-amilase, o promotor, terminador e outros elementos, respectivamente, e para inseri-la em vetores adequados contendo a informação necessária para replicação, são bem conhecidos às pessoas versadas na técnica (conforme, por exemplo, Sambrook e outros, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd Ed., Cold Spring Harbor, 1989).

[00184] A célula da invenção, ou compreendendo um construto de DNA ou um vetor de expressão da invenção tal como definido acima, é vantajosamente usada como uma célula hospedeira na produção recombinante de uma variante de alfa-amilase da invenção. A célula pode ser transformada com o construto de DNA da invenção codificando a variante, convenientemente por integração do construto de DNA (em uma ou mais cópias) no cromossoma hospedeiro. Esta integração é geralmente considerada ser uma vantagem quando a sequência de DNA mais provavelmente deve ser estavelmente mantida na célula. A integração das construções de DNA no cromossoma hospedeiro pode ser desempenhada de acordo com métodos convencionais, por exemplo, por remistura homóloga ou heteróloga. Alternativamente, a célula pode ser transformada com um vetor de expressão tal como descrito acima em conexão com os diferentes tipos de células hospedeiras.

[00185] A célula da invenção pode ser uma célula de um organismo elevado tal como um mamífero ou um inseto, mas é de preferência uma célula microbiana, por exemplo, uma célula bacteriana ou uma fúngica (incluindo levedura).

[00186] Exemplos de bactérias adequadas são bactérias Gram- positivas tais como Bacillus subtilis, Bacillus licheniformis, Bacillus lentus, Bacillus brevis, Geobacillus stearothermophilus, Bacillus alkalophilus, Bacillus amyloliquefaciens, Bacillus coagulans, Bacillus circulans, Bacillus lautus, Bacillus megaterium, Bacillus thuringiensis, ou Streptomyces lividans ou Streptomyces murinus, ou bactérias gram- negativas tais como E. coli. A transformação das bactérias pode, por exemplo, ser efetuada por transformação de protoplasto ou por uso de células competentes de uma maneira conhecida por si.

[00187] O organismo de levedura pode favoravelmente ser selecionado de uma espécie de Saccharomyces ou Schizosaccharomyces, por exemplo, Saccharomyces cerevisiae. O fungo filamentoso pode vantajosamente pertencer a uma espécie de Aspergillus, por exemplo, Aspergillus oryzae ou Aspergillus niger. As células fúngicas podem ser transformadas por um processo envolvendo formação de protoplasto e transformação dos protoplastos seguida por regeração da parede celular de uma maneira conhecida por si. Um procedimento adequado para transformação de células hospedeiras de Aspergillus é descrito em EP 238 023.

[00188] Ainda em um outro aspecto, a presente invenção refere-se a um método de produção de uma variante de alfa-amilase da invenção, cujo método compreende cultura de uma célula hospedeira tal como descrito acima sob condições conducentes à produção da variante e recuperação da variante das células e/ou meio de cultura.

[00189] O meio usado para cultivar as células pode ser qualquer meio convencional adequado para desenvolvimento da célula hospedeira em questão e obtenção de expressão da variante de alfa- amilase da invenção. Os meios adequados estão disponíveis por fornecedores comerciais ou podem ser preparados de acordo com as receitas publicadas (por exemplo, tal como descrito nos catálogos da Coleção de Cultura do Tipo Americano).

[00190] A variante de alfa-amilase secretada das células hospedeiras pode convenientemente ser recuperada do meio de cultura por procedimentos bem conhecidos, incluindo separação das células do meio por centrifugação ou filtragem, e precipitação de componentes proteináceos do meio por meio de um sal tal como sulfato de amônio, seguido pelo uso de procedimentos cromatográficos tais como cromatografia de permuta de íons, cromatografia por afinidade, ou similares.

Fitases

[00191] As fitases úteis para a invenção incluem enzimas capazes de hidrólise de ácido fítico sob as condições definidas das etapas de incubação e liquefação. Em algumas modalidades, a fitase é capaz de liberação de pelo menos um fosfato inorgânico de um hexafosfato de inositol (ácido fítico). As fitases podem ser agrupadas de acordo com sua preferência para uma posição específica do grupo de éster de fosfato na molécula de fitato em que a hidrólise é iniciada, (por exemplo, como 3-fitases (EC 3.1.3.8) ou como 6-fitases (EC 3.1.3.26)). Um exemplo típico de fitase é mio-inositol-hexacifosfato-3-fosfo- hidrolase.

[00192] As fitases podem ser obtidas de micro-organismos tais como organismos fúngicos e bacterianos. Alguns destes microorganismos incluem, por exemplo, Aspergillus (por exemplo, A. niger, A. terreus, A. ficum e A. fumigatus), Myceliophthora (M. thermophila), Talaromyces (T. thermophilus) Trichoderma spp (T. reesei). e Thermomyces (WO 99/49740). As fitases também estão disponíveis pela espécie Penicillium, por exemplo, P. hordei (ATCC No. 22053), P. piceum (ATCC No. 10519), ou P. brevi-compactum (ATCC No. 48944). Veja, por exemplo, USP 6.475.762. Além disso, as fitases estão disponíveis por Bacillus (por exemplo, B. subtilis, Pseudomonas, Peniophora, E. coli, Citrobacter, Enterbacter e Buttiauxella (veja WO2006/ 043178).

[00193] As fitases comerciais estão disponíveis tais como NATUPHOS (BASF), RONOZYME P (Novozymes A/S), PHZYME (Danisco A/S, Diversa) e FINASE (AB Enzymes). O método para determinação de atividade de fitase microbiana e a definição de uma unidade de fitase foi publicada por Engelen e outros (1994) J. of AOAC International, 77: 760 - 764. A fitase pode ser uma fitase do tipo selvagem, uma variante ou fragmento desta.

[00194] Em uma modalidade, a fitase útil na presente invenção é aquela derivada da bactéria Buttiauxiella spp. A Buttiauxiella spp. inclui B. agrestis, B. brennerae, B. ferragutiase, B. gaviniae, B. izardii, B. noackiae, e B. warmboldiae. As cepas da espécie Buttiauxella estão disponíveis por DSMZ, o Centro de Recurso Nacional Alemão para Material Biológico (Inhoffenstrabe 7B, 38124 Braunschweig, Germany). A cepa P1-29 de Buttiauxella sp. depositada sob o número de acesso NCIMB 41248 é um exemplo de uma cepa particularmente útil da qual uma fitase pode ser obtida e usada de acordo com a invenção. Em algumas modalidades, a fitase é BP do tipo selvagem, uma variante desta (tal como BP-11) descrita em WO 06/043178 ou uma variante tal como descrito no pedido de patente U.S. 11/714.487, depositado em 6 de março de 2007. Por exemplo, um BP do tipo selvagem e variantes deste são descritos na Tabela 1 de WO 06/043178, em que a numeração é em referência a SEQ ID NO:3 do pedido de PCT publicado.

[00195] Em uma modalidade preferida, uma fitase útil na presente invenção é aquela possuindo pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 88%, pelo menos 90%, pelo menos 93%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98% e pelo menos 99% de identidade de sequência à sequência de aminoácido apresentada na SEQ ID NO:19 (BP-17) mostrada na Tabela 2 e variantes desta. Mais preferivelmente, a fitase possuirá pelo menos 95% a 99% de identidade de sequência à sequência de aminoácido apresentada na SEQ ID NO:19 ou variantes desta. Em algumas modalidades, a fitase compreende ou consiste na sequência de aminoácido da SEQ ID NO:19.

[00196] Em algumas modalidades, a quantidade (dosagem) de fitase usada nos processos de incubação e/ou liquefação está na faixa de cerca de 0,001 a 50 FTU/g de ds, (por exemplo, na faixa de cerca de 0,01 a 25 FTU/g de ds, cerca de 0,01 a 15 FTU/g de ds, cerca de 0,01 a 10 FTU/g de ds, cerca de 0,05 a 15 FTU/g de ds, e cerca de 0,05 a 5,0 FTU/g.

Aplicações Industriais

[00197] As misturas de alfa-amilase apresentadas aqui possuem propriedades valiosas permitindo uma variedade de aplicações industriais. Em particular, as misturas de amilase podem ser usadas para processos de amido, em particular conversão de amido, especialmente liquefação do amido (veja, por exemplo, Patente U.S.. No. 3.912.590, pedido de patente EP nos. 252 730 e 63 909, WO 99/19467, e WO 96/28567, todas as referências por meio deste incorporadas através de referência). Também consideradas são misturas de amilase que também compreendem uma glicoamilase, pululanase, e/ou outra alfa-amilase.

[00198] Além disso, as misturas de amilase são particularmente úteis na produção de adoçantes e alcoóis, tais como etanol ou butanol, de amido ou grãos integrais (veja, por exemplo, Patente U.S. No. 5.231.017, por meio deste incorporado através de referência).

[00199] As misturas de amilase também são úteis para desengomagem de produtos têxteis, tecidos e roupas (veja, por exemplo, WO 95/21247, Patente U.S.. No. 4.643.736, EP 119,920 por meio deste incorporado através de referência), produção ou fermentação de cerveja, na produção de polpa e papel.

Conversão de Amido

[00200] Os processos de conversão de amido convencionais, tais como processos de liquefação e sacarificação são descritos, por exemplo, na Patente U.S.. No. 3.912.590 e publicações de patente EP Nos. 252.730 e 63.909, por meio deste incorporado através de referência.

[00201] Em uma modalidade, o processo de conversão de amido degradando o amido aos componentes de carboidrato de peso molecular inferior tais como açúcares ou substitutos de gordura inclui uma etapa de desramificação.

Conversão de Amido a Açúcar

[00202] No caso de conversão do amido em um açúcar, o amido é despolimerizado. Um processo de despolimerização representativo compreende de uma etapa de pré-tratamento e duas ou três etapas de processo consecutivas, viz. um processo de liquefação, um processo de sacarificação e dependente do produto final desejado opcionalmente, um processo de isomerização.

Pré-Tratamento do Amido Nativo

[00203] O amido nativo consiste em grânulos microscópicos, que são insolúveis em água em temperatura ambiente. Quando uma pasta de amido aquosa é aquecida, os grânulos incham e eventualmente rompem, dispersando as moléculas de amido na solução. Durante este processo de "gelatinização", há um aumento dramático na viscosidade. Como o nível sólido é 30 a 40% em um processo industrial típico, o amido deve ser afinado ou "liquefeito" a fim de que ele possa ser manipulado. Esta redução na viscosidade é hoje na maioria das vezes obtida por degradação enzimática.

Liquefação

[00204] Durante a etapa de liquefação, o amido de cadeia longa é degradado em unidades mais curtas ramificadas e lineares por uma alfa-amilase. Os produtos podem incluir glicose (a/k/a DP1), assim como maltodextranas e outros oligossacarídeos de cadeia curta (DP2+). O processo de liquefação é realizado em 105 a 110°C durante 5 a 10 minutos seguido por 1 a 2 horas em 95°C. O pH situa-se entre 5,5 e 6,2. Para assegurar estabilidade de enzima ideal sob estas condições, 1 mM de cálcio é adicionado (40 ppm de ions de cálcio livre). Depois deste tratamento, o amido liquefeito possuirá um "equivalente de dextrose" (DE) de 10 a 15. S

acarificação

[00205] Depois do processo de liquefação, as dextrinas solúveis e oligossacarídeos de cadeia curta são convertidos em açúcares fermentáveis tais como glicose e maltose por adição de uma glicoamilase (por exemplo, OPTIDEX® L-400) e uma enzima de desramificação, tal como uma isoamilase (Patente U.S.. No. 4.335.208) ou uma pululanase. Antes desta etapa, o pH é reduzido a um valor abaixo de 4,5, mantendo a temperatura alta (acima de 95°C) para inativar a liquefação da alfa-amilase para reduzir a formação de oligossacarídeo curto chamado "precursores de panose" que não podem ser hidrolisados adequadamente pela enzima de desramificação.

[00206] A temperatura é reduzida a 60°C, e a glicoamilase e uma enzima de desramificação são adicionadas. O processo de sacarificação prossegue durante 24 a 72 horas.

[00207] Normalmente, quando desnaturando a α-amilase depois da etapa de liquefação, cerca de 0,2 a 0,5% do produto de sacarificação é o trisacarídeo ramificado Glc pα1-6Glc pα1-4Glc (panose) que não pode ser degradado por uma pululanase. Se a amilase ativa da etapa de liquefação está presente durante a sacarificação (isto é, sem desnaturação), este nível pode ser tão alto quanto 1 a 2%, que é altamente indesejável quando ela reduz o rendimento de sacarificação significantemente.

Isomerização

[00208] Quando o produto de açúcar final desejado é, por exemplo, xarope de frutose elevado, o xarope de dextrose pode ser convertido em frutose. Depois do processo de sacarificação, o pH é aumentadp a um valor na faixa de 6 a 8, de preferência pH 7,5, e o cálcio é removido por permuta de íons. O xarope de dextrose é em seguida convertido em xarope de frutose elevado usando, por exemplo, uma glicose isomerase imobilizada (tal como Gensweet® IGI-HF).

Produção de Etanol

[00209] Na produção de álcool (etanol) geral de grão integral pode ser separada em 4 etapas principais: Moagem Liquefação Sacarificação Fermentação

Moagem

[00210] O grão é moído a fim de abrir a estrutura e permitir processamento adicional. Dois processos usados são moagem úmida ou a seco. Na moagem a seco, a semente integral é moída e usada na parte restante do processo. A moagem úmida produz uma separação muito boa de germe e farinha (grânulos de amido e proteína) e é com algumas exceções aplicadas em locais onde há uma produção paralela de xaropes.

Preparo de uma pasta de material contendo amido

[00211] O material contendo amido moído será combinado com água e vinhaça fina reciclada resultando em uma pasta aquosa. A pasta compreenderá entre 15 a 55% em p/p de ds (por exemplo, 20 a 50%, 25 a 50%, 25 a 45%, 25 a 40%, e 20 a 35% de ds). Em algumas modalidades, a vinhaça fina reciclada será na faixa de 10 a 70% em v/v (por exemplo, 10 a 60%, 10 a 50%, 10 a 40%, 10 a 30%, 10 a 20%, 20 a 60%, 20 a 50%, 20 a 40% e também 20 a 30%).

[00212] Uma vez que o material contendo amido moído é combinado com água e vinhaça fina, o pH não é ajustado na pasta. Além disso, o pH não é ajustado depois da adição de fitase e opcionalmente alfa amilase à pasta. Em uma modalidade preferida, o pH da pasta será na faixa de pH 4,5 a menos do que 6,0 (por exemplo, pH 4,5 a 5,8, pH 4,5 a 5,6, pH 4,8 a 5,8, pH 5,0 a 5,8, pH 5,0 a 5,4 e pH 5,2 a 5,5). O pH da pasta pode ser entre pH 4,5 e 5,2 dependendo da quantidade de vinhaça fina adicionada à pasta e do tipo de material compreendendo a vinhaça fina. Por exemplo, o pH da vinhaça fina pode ser entre pH 3,8 e pH 4,5. Como um exemplo adicional, a Tabela 3 abaixo ilustra a mudança de pH que ocorre com a adição de quantidades crescentes de vinhaça fina a uma pasta de milho moído integral (32% de ds) depois de agitação durante 2 horas em 155F.

[00213] Deve ser mencionado que, durante a produção de etanol, os ácidos podem ser adicionados para reduzir o pH no cerveja corretamente para reduzir o risco de contaminação microbiana antes da destilação.

[00214] Em algumas modalidades, uma fitase será adicionada à pasta, além da mistura de alfa amilase. Em algumas modalidades, a fitase e a mistura de alfa amilase serão adicionadas à pasta sequencialmente e em outras modalidades a fitase e a mistura de alfa amilase serão adicionadas simultaneamente. Em algumas modalidades, a pasta compreendendo a mistura de alfa amilase e fitase opcional será incubada (pré-tratada) durante um período de 5 minutos a 8 horas (por exemplo, 5 minutos a 6 horas, 5 minutos a 4 horas, 5 minutos a 2 horas, e 15 minutos a 4 horas). Em outras modalidades, a pasta será incubada em uma temperatura na faixa de 40 a 115°C, (por exemplo, 45 a 80°C, 50 a 70°C, 50 a 75°C, 60 a 110°C, 60 a 95°C, 70 a 110°C, e 70 a 85°C).

[00215] Em outras modalidades, a pasta será incubada em uma temperatura de 0 a 30°C (por exemplo, 0 a 25°C, 0 a 20°C, 0 a 15°C, 0 a 10°C e 0 a 5°C) abaixo da temperatura de gelatinização de amido do material contendo amido. Em algumas modalidades, a temperatura será abaixo de 68°C, abaixo de 65°C, abaixo de 62°C, abaixo de 60°C e abaixo de 55°C. Em algumas modalidades, a temperatura será acima de 45°C, acima de 50°C, acima de 55°C e acima de 60°C. Em algumas modalidades, a incubação da pasta compreendendo uma mistura de alfa amilase e fitase opcional em uma temperatura abaixo da temperatura de gelatinização de amido é referida como uma liquefação primária (1°).

[00216] Em uma modalidade, o material contendo amido moído é milho ou milo. A pasta compreende 25 a 40% de ds, o pH está na faixa de 4,8 a 5,2, e a pasta é incubada com uma mistura de alfa amilase e opcionalmente uma fitase durante 5 minutos a 2 horas, em uma faixa de temperatura de 60 a 75°C.

[00217] Em uma etapa de liquefação adicional, o material contendo amido incubado ou pré-tratado será exposto a um aumento na temperatura tal como 0 a 45°C acima da temperatura de gelatinização de amido do material contendo amido. (por exemplo, 70°C a 120°C, 70°C a 110°C, e 70°C a 90°C) durante um período de tempo de 2 minutos a 6 horas (por exemplo, 2 minutos a 4 h) em um pH de cerca de 4,0 a 5,5 mais preferivelmente entre 1 hora a 2 horas. A temperatura pode ser aumentada por um sistema de convencional cozimento a jato de temperatura alta durante um curto período de tempo, por exemplo, durante 1 a 15 minutos. Em seguida o amido pode ser também hidrolisado em uma temperatura variando de 75°C a 95°C, (por exemplo, 80 °C a 90 °C e 80 °C a 85 °C) durante um período de 15 a 150 minutos (por exemplo, 30 a 120 minutos). Em uma modalidade preferida, o pH não é ajustado durante estas etapas de processo e o pH da massa liquefeita está na faixa de pH 4,0 a pH 5,8 (por exemplo, pH 4,5 a 5,8, pH 4,8 a 5,4, e pH 5,0 a 5,2). Em algumas modalidades, uma segunda dose de uma mistura de alfa amilase termoestável será adicionada à etapa de liquefação secundária, mas em outras modalidades, não haverá uma dosagem adicional de uma mistura de alfa amilase.

[00218] As etapas de incubação e liquefação de acordo com a invenção podem ser seguidas por etapas de sacarificação e fermentação bem conhecidas na técnica.

Liquefação

[00219] No processo de liquefação, os grânulos de amido são solubilizados por hidrólise a maltodextrinas na maioria das vezes de um DP maior do que 4. A hidrólise pode ser realizada por tratamento de ácido ou enzimaticamente por alfa-amilase. A hidrólise de ácido é usada em uma base limitada. A matéria-prima pode ser grão integral moído ou um fluxo lateral de processamento de amido.

[00220] A liquefação enzimática é tipicamente realizada como um processo de pasta a quente de três etapas. A pasta é aquecida a entre 60 a 95°C, de preferência 80 a 85°C, e a(s) enzima(s) é (são) adicionada(s). Em seguida a pasta é cozida a jato em entre 95 a 140°C, de preferência 105 a 125°C, resfriada a 60 a 95°C e mais enzima(s) é (são) adicionada(s) para obter a hidrólise final. O processo de liquefação é realizado em pH 4,5 a 6,5, tipicamente em um pH entre 5 e 6. O grão moído e liquefeito é também conhecido como massa.

Fermentação

[00221] Levedura tipicamente de Saccharomyces spp. é adicionada à massa e a fermentação é contínua durante 24 a 96 horas, tal como tipicamente 35 a 60 horas. A temperatura é entre 26 a 34°C, tipicamente em cerca de 32°C, e o pH é de pH 3 a 6, de preferência em torno de pH 4 a 5.

[00222] Note que o processo mais amplamente usado é um processo de sacarificação e fermentação simultâneas (SSF) onde não há nenhum estágio de manutenção para a sacarificação, significando que levedura e enzima são adicionadas juntas. Quando fazendo SSF, é comum introduzir uma etapa de pré-sacarificação em uma temperatura acima de 50°C, apenas antes da fermentação.

Sacarificação e Fermentação

[00223] O material contendo amido liquefeito é sacarificado na presença de enzimas de sacarificação, tais como glicoamilases. O processo de sacarificação pode permanecer durante 12 horas a 120 horas (por exemplo, 12 a 90 horas, 12 a 60 horas e 12 a 48 horas). No entanto, é comum desempenhar uma etapa de pré-sacarificação durante cerca de 30 minutos a 2 horas (por exemplo, 30 a 90 minutos) em uma faixa de temperatura de 30 a 65°C e tipicamente em torno de 60°C que é seguido por uma sacarificação completa durante a fermentação referida como sacarificação e fermentação simultâneas (SSF). O pH é geralmente entre 4,2 a 4,8, de preferência pH 4,5.

[00224] Açúcares fermentáveis obtidos de grãos, incluindo grãos moídos integrais, e amidos, incluindo amido de milho, (por exemplo, dextrinas, monossacarídeos, particularmente glicose) são produzidos de sacarificação enzimática. Estes açúcares fermentáveis podem ser também purificados e/ou convertidos a produtos de açúcar úteis. Além disso, os açúcares obtidos dos grãos moídos integrais podem ser usados como uma matéria-prima de alimentação em um processo de fermentação microbiano para produção de produtos finais, tais como álcool (por exemplo, etanol e butanol), ácidos orgânicos (por exemplo, ácido succínico, ácido cítrico e ácido lático), alcoóis de açúcar (por exemplo, glicerol), intermediários de ácido ascórbico (por exemplo, gliconato, 2-ceto-D-gliconato, 2,5-diceto-D-gliconato, ácido 2-ceto-L- gulônico), aminoácidos (por exemplo, lisina, ácido glutâmico e glutamatos tais como, por exemplo, glutamato monossódico), proteínas (por exemplo, anticorpos e fragmento destes).

[00225] Em uma modalidade preferida, os açúcares fermentáveis obtidos durante as etapas de processo de liquefação são usados para produzir álcool e particularmente etanol. Na produção de etanol, um processo de SSF é comumente usado em que as enzimas de sacarificação e organismos de fermentação (por exemplo, levedura) são adicionados e então executados em uma temperatura de 30°C a 40°C.

[00226] O organismo usado nas fermentações dependerá do produto final desejado. Tipicamente, se etanol é o produto final desejado, levedura será usada como o organismo de fermentação. Em algumas modalidades preferidas, o micro-organismo produtor de etanol é uma levedura e especificamente Saccharomyces tal como cepas de S. cerevisiae (Patente U.S. No. 4.316.956). Uma variedade de S. cerevisiae é comercialmente disponível e esta inclui, mas não está limitada a FALI (Fermento da Fleischmann), SUPERSTART (Alltech); FERMIOL (DSM Specialties), RED STAR (Lesaffre) e levedura de álcool da Angel (Angel Yeast Company, China). A quantidade de levedura iniciadora empregada nos métodos em uma quantidade eficaz para produzir uma quantidade comercialmente significante de etanol em uma quantidade adequada de tempo, (por exemplo, para produzir pelo menos etanol a 10% de um substrato possuindo entre 25 a 40% de DS em menos do que 72 horas). As células de levedura são geralmente fornecidas em quantidades de 104 a 1012, e de preferência de 107 a 1010 do total de levedura viável por ml de caldo de fermentação. A fermentação incluirá além de uma fermentação de micro-organismos (por exemplo, levedura), nutrientes, opcionalmente enzimas adicionais, incluindo ,mas não limitado às fitases. O uso de levedura na fermentação é bem conhecido e referência é feita a THE ALCOHOL TEXTBOOK, K. JACQUES ET AL., EDS. 1999, NOTTINGHAM UNIVERSITY PRESS, UK.

[00227] Em modalidades adicionais, por uso de micro-organismos de fermentação apropriados tal como conhecido na técnica, o produto final de fermentação pode incluir sem limitação glicerol, 1,3-propanodiol, gliconato, 2-ceto-D-gliconato, 2,5-diceto-D-gliconato, ácido 2-ceto-L- gulônico, ácido sucínico, ácido lático, aminoácidos e derivados destes. Mais especificamente, quando o ácido lático é o produto final desejado, um Lactobacillus sp. (L. casei ) pode ser usado; quando glicerol ou 1,3- propanodiol são os produtos finais desejados, E.coli pode ser usada; e quando 2-ceto-D-gliconato, 2,5-diceto-D-gliconato, e ácido 2-ceto-L- gulônico são os produtos finais desejados, Pantoea citrea pode ser usada como o micro-organismo de fermentação. A lista enumerada acima é apenas exemplos e aquele versado na técnica estará ciente de vários micro-organismos de fermentação que podem ser apropriadamente usados para obter um produto final desejado.

Destilação

[00228] Opcionalmente, em seguida à fermentação, álcool (por exemplo, etanol ou butanol) pode ser extraído através de, por exemplo, destilação e opcionalmente por uma ou mais etapas de processo.

[00229] Em algumas modalidades, o rendimento de etanol ou butanol produzido pelos métodos abrangidos pela invenção será pelo menos 8%, pelo menos 10%, pelo menos 12%, pelo menos 14%, pelo menos 15%, pelo menos 16%, pelo menos 17%, pelo menos 18% (v/v) e pelo menos 23% em v/v. O etanol obtido de acordo com o processo da invenção pode ser usado como, por exemplo, etanol combustível, etanol para beber, isto é, alcoóis neutros potáveis, ou etanol industrial.

Subprodutos

[00230] Subprodutos de grão da fermentação tipicamente são usados para alimentação de animais ou na forma líquida ou forma seca. Se o amido é moído úmido, subprodutos de não amido incluem proteína crua, óleo, e fibra, por exemplo, farinha de glúten de milho. Se o amido é moído a seco, os subprodutos podem incluir coprodutos de alimentação de animais, tais como grãos secos por destiladores (DDG) e grão seco por destiladores mais solúveis (DDGS). Quando o grão é moído a seco misturado em uma pasta antes da liquefação e sacarificação, no entanto, nenhum grão é deixado como um subproduto.

[00231] Detalhes adicionais de como realizar liquefação, sacarificação, fermentação, destilação, e recuperação de alcoóis são bem conhecidos à pessoa versada.

[00232] De acordo com o processo da invenção, a sacarificação e fermentação podem ser realizadas simultaneamente ou separadamente.

Glicoamilases e Pululanases

[00233] As glicoamilases úteis incluem aquelas purificadas de Aspergillus niger, por exemplo, a AMG de A. niger G1 ou G2 descrita em Boel e outros (1984), "Glucoamylases G1 and G2 from Aspergillus niger are synthesized from two different but closely related mRNAs", EMBO J. 3 (5), p. 1097-1102, ou uma variante destas, em particular uma variante descrita em WO 00/04136 ou WO 01/04273 ou a AMG de Talaromyces emersonii descrita em WO 99/28448 ou uma glicoamilase de Trichoderma reesei (veja WO 06/060062).

[00234] Em uma modalidade, a composição da invenção também compreende uma pululanase, por exemplo, uma pululanase de Bacillus. Veja, por exemplo, WO 99/45124.

Métodos Fermentação e Purificação de Variantes de Alfa-Amilase

[00235] Uma cepa de B. subtilis abrigando o plasmídeo de expressão relevante pode ser fermentada e purificada como segue: a cepa é estriada em uma placa de Ágar de LB com 10 micro g/ml de canamicina de matéria-prima a-80°C, e cultivada durante a noite em 37°C. As colônias são transferidas aos meios de PS-1 de 100 ml (abaixo) suplementados com 10 micro g/ml de cloranfenicol em um frasco de agitação de 500 ml. A cultura é agitada em 37°C em 270 rpm durante 5 dias. Composição de meio de PS-1 Açúcar de pérola 100 g/l Farinha de Soja 40 g/l Na2HPO4, 12 H2O 10 g/l Pluronic™ PE 6100 0,1 g/l CaCO3 5 g/l

[00236] As células e detritos celulares são removidos do caldo de fermentação por centrifugação em 4.500 rpm em 20 a 25 minutos. Mais tarde, o sobrenadante é filtrado para obter uma solução completamente clara. O filtrado é concentrado e lavado em um filtro de UF (membrana de corte de 10.000) e o tampão é alterado em Acetato a 20 mM, pH 5,5. O filtrado UF é aplicado em uma S-sefarose F.F. e eluição é realizada por eluição em etapa com NaCl a 0,2M no mesmo tampão. O eluído é dialisado contra Tris a 10 mM, pH 9,0 e aplicado em uma Q-Sefarose F.F. e eluído com um gradiente linear de NaCl a 0 até 0,3M em 6 volumes de coluna. As frações que contêm a atividade (medida pelo ensaio de Phadebas) são misturadas, o pH foi ajustado a pH 7,5 e a cor restante foi removida por um tratamento com carvão ativo a 0,5% em peso/vol em 5 minutos.

Determinação de Atividade Específica

[00237] A atividade específica é determinada usando o ensaio de Phadebas® (Pharmacia) como atividade/mg de enzima. As instruções dos fabricantes são seguidas (veja também abaixo sob "Ensaio para Atividade de Alfa-Amilase"). Determinação de Estabilidade

[00238] A estabilidade da amilase pode ser medida usando o método como segue:

[00239] A enzima é incubada sob as condições relevantes. As amostras são tiradas em vários pontos do tempo, por exemplo, depois de 0, 5, 10, 15 e 30 minutos e diluídas 25 vezes (a mesma diluição para todas as amostras tiradas) em tampão de ensaio (tampão de Britton a 50 mM, pH 7,3) e a atividade é medida usando o ensaio de Phadebas (Pharmacia) sob condições-padrão, pH 7,3, 37°C.

Ensaios para Atividade de Alfa-Amilase 1. Ensaio de Phadebas

[00240] A atividade de alfa-amilase é determinada por um método empregando comprimidos de Phadebas® como substrato. Os comprimidos de Phadebas (Teste de Amilase de Phadebas®, fornecido por Pharmacia Diagnostic) contêm um polímero de amido colorido de azul insolúvel reticulado, que foi misturado com albumina de soro bovino e uma substância de tampão e tabletado.

[00241] Para cada medição única, um comprimido é suspenso em um tubo contendo 5 ml de tampão de Britton-Robinson a 50 mM (ácido acético a 50 mM, ácido fosfórico a 50 mM, ácido bórico a 50 mM, CaCl2 a 0,1 mM, pH ajustado ao valor de interesse com NaOH). O teste é desempenhado em um banho de água na temperatura de interesse. A alfa-amilase a ser testada é diluída em x ml de tampão de Britton- Robinson a 50 mM. 1 ml desta solução de alfa-amilase é adicionado aos 5 ml de tampão de Britton-Robinson a 50 mM. O amido é hidrolisado pela alfa-amilase produzindo fragmentos azuis solúveis. A absorvência da solução azul resultante, medida espectrofotometricamente em 620 nm, é uma função da atividade de alfa-amilase.

[00242] É importante que a absorvência de 620 nm medida depois de 10 ou 15 minutos de incubação (tempo de teste) esteja na faixa de 0,2 a 2,0 unidades de absorvência em 620 nm. Nesta faixa de absorvência há linearidade entre atividade e absorvência (lei da Cerveja de Lambert). A diluição da enzima deve por esse motivo ser ajustada para adaptar este critério. Sob um conjunto especificado de condições (temp., pH, tempo de reação, condições de tampão), 1 mg de uma dada alfa-amilase hidrolisará uma certa quantidade de substrato e uma cor azul será produzida. A intensidade de cor é medida em 620 nm. A absorvência medida é diretamente proporcional à atividade específica (atividade/mg de proteína de alfa-amilase pura) da alfa-amilase em questão sob o dado conjunto de condições.

2. Método Alternativo

[00243] A atividade de alfa-amilase é determinada por um método empregando o substrato de PNP-G7. O PNP-G7 que é uma abreviação para p-nitrofenil-alfa,D-malto-heptosídeo é um oligossacarídeo bloqueado que pode ser clivado por uma endo-amilase. Seguinte à clivagem, a alfa-Glicosidase incluída no kit digere o substrato para liberar uma molécula de PNP livre que possui uma cor amarela e desta forma pode ser medida por espectrofotometria visível em À=405 nm (400 a 420 nm). Os kits contendo o substrato de PNP-G7 e alfa-Glicosidase são fabricados por Boehringer-Mannheim (cat. No.1054635).

[00244] Para preparar a solução de reagente, 10 ml de solução de substrato/tampão são adicionados a 50 ml de solução de enzima/tampão tal como recomendado pelo fabricante. O ensaio é desempenhado por transferência de amostra de 20 micro I a uma placa de microtítulo de 96 cavidades e incubação em 25°C. 200 microlitros de solução de reagente pré-equilibrados a 25°C são adicionados. A solução é misturada e pré-incubada por 1 minuto e absorção é medida cada 30 segundos durante 4 minutos em OD de 405 nm em uma leitora de ELISA.

[00245] O declive da curva de absorção dependente do tempo é diretamente proporcional à atividade da alfa-amilase em questão sob o dado conjunto de condições.

Determinação da Atividade de Fitase (FTU)

[00246] A Atividade de Fitase (FTU) é medida pela liberação de fosfato inorgânico. O fosfato inorgânico forma um complexo amarelo com reagente de molibdato/vanadato acídico e o complexo amarelo é medido em um comprimento de onda de 415 nm em um espectrofotômetro e o fosfato inorgânico liberado é quantificado com uma curva-padrão de fosfato. Uma unidade de fitase (FTU) é a quantidade de enzima que libera 1 micromole de fosfato inorgânico de fitato por minuto sob as condições de reação dadas no Padrão Europeu (CEN/TC 327,2005-TC327WI 003270XX).

Determinação de Teor de Ácido Fítico

[00247] Teor de ácido fítico: O ácido fítico foi extraído da amostra por ajuste do pH da pasta a 5% (se for amostra seca) a pH 10 e em seguida determinado através de um método de HPLC usando uma coluna de permuta de íons. O ácido fítico foi eluído da coluna usando um sistema de gradiente de NaOH. O teor de ácido fítico no líquido foi em seguida calculado por comparação a um padrão de ácido fítico.

[00248] A presente invenção é descrita em detalhe adicional nos seguintes exemplos que não pretendem de qualquer modo limitar o escopo da invenção tal como reivindicado. As figuras anexadas pretendem ser consideradas como partes integrais da especificação e descrição da invenção. Todas as referências citadas são aqui especificamente incorporadas através de referência para tudo o que é descrito neste. Os seguintes exemplos propõem ilustrar, mas não limitar a invenção reivindicada.

EXEMPLOS

[00249] Na seção de descrição e experimental que segue, as seguintes abreviações aplicam-se: % em p (porcentagem em peso); °C (graus Centígrados); H2O (água); dH2O (água desionizada); dIH2O (água desionizada, filtragem de Mili-Q); g ou gm (gramas); μg (microgramas); mg (miligramas); kg (quilogramas); μl (microlitros); mL e ml (mililitros); mm (milímetros); μm (micrômetro); M (molar); mM (milimolar); μM (micromolar); U (unidades); MW (peso molecular); sec (segundos); min(s) (minuto/minutos); hr(s) (hora/horas); DO (oxigênio dissolvido); P/V (peso para volume); P/P (peso para peso); V/V (volume para volume); IKA (IKA Works Inc. 2635 North Chase Parkway SE, Wilmington, NC; Ncm (centímetro de Newton) e ETOH (etanol). eq (equivalentes); N (Normal); ds ou DS (teor de sólidos secos), AAU (Unidade de Alfa Amilase), LU (Unidade de Liquefon), SAPU (unidade de protease de ácido espectrofotométrica, em que em 1 SAPU é a quantidade de atividade de enzima protease que libera um micromole de tirosina por minuto de um substrato de caseína sob condições do ensaio) e GAU (unidade de glicoamilase, que é definida como a quantidade de enzima que produzirá 1 g de açúcar redutor calculada como glicose por hora de um substrato de amido solúvel em pH 4,2 e 60°C).

Exemplo 1 - Construção de Variantes

[00250] As variantes na posição S242 da sequência madura de AmyS foram construídas usando um método direcionado a sítio.

[00251] O padrão para mutagênese foi pHPLT-AmyS metilado (veja figura 2) usando dam-Metilase de New England Biolabs (Massachusetts). Os iniciadores degenerados (S242D(ianteiro) e S242R(everso), dados abaixo) foram sintetizados e diluídos a 10uM em Opéron (Huntsville, AL) com sequências dianteiras e reversas complementares ambas contendo um 5’ fosfato para ligação na reação. A sequência da alfa-amilase origem é anexada até aqui como SEQ ID NO: 2. As bibliotecas foram criadas com o kit de Multi-sítio Stratagene Quik-ChangeTM (Stratagene, La Jolla CA) usando iniciadores de oligonucleotídeo aleatorizados com NN(G/C) na posição-alvo. O aminoácido selecionado (isto é, S242) foi aleatoriamente substituído com todas as 19 alternativas possíveis.

[00252] Iniciadores de S242 para mutagênese: S242 F: 5’ [Phos]GTCAAGCATATTAAGTTCNNSTTTTTTCCTGATTGGTTG 3’ SEQ ID NO: 17 S242 R: 5’[Phos]CAACCAATCAGGAAAAAASNNGAACTTAATATGCTTGAC 3’ SEQ ID NO: 18

[00253] A reação foi desempenhada como segue: Reação de Quik - Mudança:

[00254] A reação consistia em 18 μl de H2O destilada estéril, 2,5 μl de tampão a 10x do kit, 1uL de dNTPs do kit, 1,25 μl dos iniciadores dianteiros (de 10 uM de matéria-prima), 1,25 μl dos iniciadores reversos (de 10 μM de matéria-prima), 1 μl de DNA de plasmídeo pHPLT-AmyS como padrão (~70ng), e 1 μl da mistura de enzima do kit para um total de 26,5 μl. Condições em ciclo:

[00255] As condições em ciclo eram 95°C durante 1 min uma vez, em seguida 95°C durante 1 min, 55°C durante 1 min, 65°C durante 10 min para 25 ciclos.

[00256] Dpn I de um microlitro (10 U/μl) foi adicionado à mistura reacional Multi-site Quik-Change e incubado em 37°C durante 18 horas e em seguida outra 0,5 μl foi adicionado durante um adicional de 3 horas.

[00257] Um microlitro de reação digerida por DpnI foi usado como padrão para amplificação de círculo de rotação com o kit de amplificação de Templiphi (Amersham Biosciences, Piscataway, NJ) e a reação foi desempenhada de acordo com o protocolo de Amersham. Um microlitro de DNA de círculo de rotação foi transformado em 100ul de células competentes de Bacillus subtilis (2 cepas de B. subtilis deletada por protease (ΔaprE, ΔnprE, amyE::xylRPxylAcomK-phleo)) e agitado em 37°C durante 1 hora. A transformação inteira foi plaqueada logo depois em placas de LA + 10ppm de Neo + amido insolúvel a 1% (25ul em uma placa, 75 μl em outra placa) e incubada durante a noite em 37°C. Noventa e seis transformantes foram picados em 150ul de LB + 10ppm de Neo em uma placa de microtítulo e cultivados durante a noite em 37°C. A placa durante a noite foi estampada em uma placa de LA + 10ppm de Neo + amido insolúvel a 1% grande com um instrumento de replicação de 96 alfinetes e submetida a Quintara Biosciences (Berkeley, CA) para PCR de colônia e sequenciamento.

[00258] Depois que as sequências variantes foram determinadas, as variantes foram picadas em uma placa de microtítulo de 96 cavidades contendo 125ul de LB + 10ppm de Neo, dispondo as variantes em uma quad format com controles. A placa de microtítulo disposta foi cultivada durante 6 horas em 37°C e 250rpm. Usando um instrumento de replicação (Enzyscreen, Leiden, The Netherlands), a placa de cultura de microtítulo foi usada para inocular uma nova placa de microtítulo (placa de microtítulo e tampas de placa de Enzyscreen, Leiden, The Netherlands) contendo 150ul de meio de MBD para expressão de proteína (G. Vogtentanz e outros, A Bacillus subtilis fusion protein system to produce soybean Bowman-Birk protease inhibitor, Prot. Expr. & Purif.,55 (2007) 40-52 ) e suplementada com CaCl2 a 5 mM para expressão de proteína. As placas de expressão foram cultivadas durante 64 horas em 37°C, 250rpm, e 70% de umidade. As culturas de expressão foram filtradas logo depois através de uma placa de microfiltro (0,22um, Millipore, Billerica, MA) e analisadas quanto à termoestabilidade melhorada (veja Exemplo 3).

Exemplo 2 - Expressão, Purificação & Caracterização de Variantes

[00259] As colônias foram estriadas das placas de microtítulo do Exemplo 1 e colocadas em placas de amido com 10ppm de Neomicina. As placas foram incubadas durante a noite em 37°C e colônias únicas foram picadas e usadas para inocular frascos de agitação (250mL com meios de 25mL) contendo meios (veja abaixo) e 20ppm de Neomicina. Estas foram cultivadas em 37°C, 275rpm, durante cerca de 8 h (até um OD (600nm) de 2,0 foi alcançado). Depois do que os caldos de cultura foram misturados com glicerol a 50% em relação de 2:1, colocados em frascos de cultura individualmente rotulados e congelados em -80°C. Foi destas matérias-primas de glicerol que produção subsequente das amilases selecionadas foi feita.

[00260] Fermentações para amilases foram realizadas em frascos de agitação de 500 mL cultivados em 37 °C durante 60 horas em meio de cultura de MOPS mínimo (Neidhardt e outros, J. Bacteriol. (1974) 119(3):736-747) com Soytone a 1% (p/v). As enzimas foram purificadas do caldo de fermentação usando cromatografia de interação hidrofóbica. Em resumo, o caldo foi concentrado 10 vezes em seguida diluído novamente com MES a 50 mM, CaCl2a 2 mM, pH 6,8 com sulfato de amônio a 1M e filtrado estéril usando filtro de fibra de vidro. As amostras foram em seguida carregadas em coluna de densidade alta de sefarose FF de fenila (20 x 95mm; Amersham, GE Healthcare BioSciences, Sweden) pré-equilibrada com o mesmo tampão. As proteínas de não amilase foram lavadas com 10 volumes de coluna do mesmo tampão sem sulfato de amônio seguido por 5 volumes de coluna de água. Finalmente, as enzimas de interesse foram eluídas com MES a 50 mM, CaCl2 a 2 mM, pH 6,8 contendo propileno glicol a 40%.

[00261] As concentrações de proteína foram determinadas ou por um método de densitometria de gel de SDS page quantitativa padrão ou por um ensaio de atividade usando um kit de ensaio de amilase padrão de Megazyme (Wicklow, Ireland). Os ensaios foram convertidos usando uma curva-padrão gerada usando amilase purificada (Bacillus 707 amilase; SEQ ID NO: 6).

Exemplo 3 - Determinação de Propriedades Alteradas: Estresse térmico

[00262] Este exemplo mostra que as variantes descritas aqui podem possuir uma propriedade alterada relativa à alfa-amilase origem. Uma análise de estabilidade térmica de alta produtividade de variantes de alfa-amilase de G. stearothermophilus (AmyS) foi realizada.

[00263] As condições de estresse térmico foram investigadas e escolhidas de modo que depois do estresse térmico a enzima do tipo selvagem de partida mostrou aproximadamente 40% de sua atividade não estressada (isto é, atividade depois do estresse térmico/atividade antes do estresse térmico foi aproximadamente 0,4). As bibliotecas de mutantes foram analisadas em quadruplicata, e vencedores potenciais foram identificados como aqueles que mostraram atividade residual depois do estresse térmico que era pelo menos dois desvios-padrão maiores do que a atividade residual média da enzima do tipo selvagem de partida.

[00264] A expressão de amilase foi aproximadamente 100 ppm nos sobrenadantes de cultura das placas de expressão. Depois de 60 a 65 horas de desenvolvimento em 37°C em um agitador umidifcado (250 rpm e 70% de umidade relativa), os sobrenadantes de cultura foram clarificados para remover o material cellular usando placas de filtro. Os sobrenadantes clarificados foram diluídos 10 vezes em tampão contendo NaOAc a 50 mM / CaCl2 a 2,6 mM /Tween-20 a 0,002%, pH 5,8, a uma concentração final de aproximadamente 10 ppm. Uma alíquota do sobrenadante foi também diluída a 0,02 ppm, e atividade das variantes de enzima foram determinadas tal como descrito abaixo usando um substrato de amido de milho fluorescentemente rotulado. Uma segunda alíquota do sobrenadante foi submetida a um estresse térmico de 30 minutos em 95°C em um termogiratório antes de ser diluída a 0,02 ppm em NaOAc a 50 mM / CaCl2 a 2,6 mM /Tween-20 a 0,002%, pH 5,8 e analisada quanto à atividade residual usando o mesmo substrato fluorescente e ensaio descrito abaixo.

[00265] A atividade de amilase foi determinada usando o ensaio de amilase EnzCheck essencialmente tal como descrito pelo fabricante (Invitrogen, San Diego CA). A concentração final da amilase no ensaio foi aproximadamente 0,02 ppm. O tampão de ensaio era NaOAc a 50 mM / CaCl2 a 2,6 mM / Tween-20 a 0,002%, pH 5,8. O substrato era tintura de fluorescência BODIPY conjugada com 100 μg/mL de amido de milho DQ™ (Invitrogen - Eugene, OR). A fluorescência aumentada, indicando atividade de amilase, foi medida usando uma Spectomax M2 (Molecular Devices, Sunnyvale, CA). A reação foi monitorada em temperatura ambiente durante 5 minutos com o instrumento registrando em modo cinético. O comprimento de onda de excitação foi 485 nm; a emissão foi monitorada em 520 nm com um filtro de corte em 515 nm.

[00266] A AmyS do tipo selvagem (Xtra) mostrou 33 a 43% de atividade residual depois de ser submetida a estresse térmico durante 30 minutos em 95°C. As variantes de AmyS S242A e S242Q reteram 55 a 65% e 70 a 80% de atividades residuais, respectivamente, em seguida às mesmas condições de estresse térmico. Veja figura 3 e Tabela 4. Estas medições de atividade residual indicam que as duas variantes são mais termoestáveis do que a alfa amilase do tipo selvagem. Na Tabela 4, as atividades residuais em porcentagem de cada amostra variante são listadas. Algumas variantes estavam ausentes das bibliotecas, tal como indicado pela posição da letra sendo encontrada. Em vez das variantes, o tipo selvagem (SPEZYME® Xtra) foi usado, tal como mostrado pelo termo "WT." Cada placa inclui SPEZYME® Ethyl (rotulada "$") e SPEZYME® Xtra (rotulada "Z") como controles.

Exemplo 4 - Determinação de Propriedades Alteradas: DSC

[00267] SPEZYME® Xtra, S242A, e S242Q foram purificadas de caldo de fermentação de frasco de agitação (veja Exemplo 2) usando cromatografia de interação hidrofóbica. A proteína foi eluída da coluna na forma purificada usando MES a 50 mM, pH 6,8, contendo propileno glicol a 40% e CaCl2 a 2 mM.

[00268] As funções de capacidade térmica em excesso foram medidas usando um microcalorímetro de alta produtividade de varredura ultrasensível, VP-Cap DSC (MicroCal, Inc., Northampton, MA). O procedimento padrão para medições de DSC e a teoria da técnica é previamente publicada (Freire, E. (1995) Differential Scanning Calorimetry Methods. Mol. Biol. 41, 191-218). Aproximadamente 500 μL de α-amilase de Bacillus stearothermophilus do tipo selvagem a 0,5 mg/ml ou variante S242S e S242Q (na ausência e presença de cloreto de cálcio a 2 mM) foram avaliadas na faixa de temperatura de 30 a 120°C. A mesma amostra foi em seguida reavaliada para checar a reversibilidade do processo. Para α-amilase, o processo de desdobramento térmico era irreversível. O tampão usado foi acetato de sódio a 10 mM, pH 5,5. Uma taxa de varredura de 200oC/h foi usada para minimizar quaisquer artefatos que possam resultar da agregação. O ponto central térmico (Tm) das curvas de DSC foi usado como um indicador da estabilidade térmica. A Tabela 5 mostra os pontos de fusão térmicos para as proteínas de amilase testadas. As curvas de fusão térmica e os pontos de fusão para o tipo selvagem e variantes de amilase são mostrados na figura 5.

[00269] O desdobramento térmico para as variantes de amilase S242A e S242Q na ausência e na presença de cloreto de cálcio a 2 mM mostra considerável aumento nos pontos de fusão para as variantes quando comparado àquele para o tipo selvagem. Na ausência de cloreto de cálcio adicionado, a amilase do tipo selvagem possui um ponto de fusão térmico de 100,8°C embora os Tm’s para S242A e S242Q sejam 106,5°C e 110,1°C, respectivamente. Desta forma, a substituição de S242 com A resulta em um aumento no Tm de 5,7°C, e a substituição de S242 com Q resulta em um aumento no Tm de 9,3°C.

[00270] Na presença de cloreto de cálcio a 2 mM, a amilase do tipo selvagem caracterizada possui um ponto de fusão térmico de 106,8°C embora os Tm’s para S242A e S242Q sejam 111,8°C e 113,8°C, respectivamente. Desta forma, na presença de cloreto de cálcio a 2 mM, todas as três proteínas exibiram valores de Tm aumentados. O aumento no Tm para o tipo selvagem e as variantes S242A foi 6°C e 5,3°C, respectivamente. O aumento no Tm para as variantes S242Q foi 3,7°C. Isto sugere que as variantes S242Q sejam estabilizadas menos por cálcio ou sejam menos dependentes de cálcio para estabilidade. O aumento no Tm da S242A e S242Q relativa ao tipo selvagem na presença de cloreto de cálcio foi 5°C e 3°C, respectivamente. Isto sugere que as propriedades termodinâmicas das variantes diferem daquelas de SPEZYME® Xtra, e são consistentes com seu desempenho realçado em estudos de aplicação (veja Exemplo 5).

Exemplo 5 - Perfis de atividade

[00271] Este exemplo mostra que as variantes testadas possuem perfis de atividade alterados relativos não apenas à alfa-amilase de origem, mas também a um padrão de indústria. As determinações de proteína foram feitas em amostras purificadas ou de placa. Todas as variantes experimentais e alfa-amilases padrões foram dosadas concentrações de proteína iguais.

[00272] As variantes ou de placa ou purificadas foram diluídas abaixo de aproximadamente 20ppm usando tampão de ácido málico de pH 5,6. O substrato consistia em 15% de amido de milho no mesmo tampão de ácido Málico a 50mM, pH 5,6. Quatrocentos microlitros da pasta de amido foram equilibrados a 70°C durante 2,5 minutos. Em seguida, 7ul da enzima diluída foram rapidamente adicionados ao amido equilibrado (conc. de proteína final em torno de 0,36 ppm). A mistura reacional foi em seguida colocada em um bloco de aquecimento de agitação a 85°C preaquecida e misturada em 300rpm. Em intervalos de tempo predeterminados, as reações foram extinguidas com 50ul de NaOH a 125mM. Os tubos de reação foram em seguida centrifugados e o sobrenadante foi diluído 10 vezes em NaOH a 10mM, para serem analisados quanto a perfil de DP por HPAEC-PAD.

[00273] As reações foram reguladas durante 4, 10 e 20 minutos. A área total de DP2 ao término do ciclo de HPLC foi integrada e a área foi dividida pela proteína total e tempo de reação.

[00274] A reação de 4 min fornece uma indicação de como rapidamente a enzima começa a decompor o substrato; os 10 minutos fornecem uma indicação da atividade térmica da enzima, e os 20 minutos fornecem uma indicação da estabilidade térmica da enzima. Os resultados são fornecidos na figura 6 e na figura 7.

Exemplo 6 - Liquefação no Viscômetro

[00275] Este exemplo mostra que as variantes S242A e S242Q do Exemplo 3 que tinham a atividade residual alterada relativa à origem do tipo selvagem também possuem desempenho alterado relativo à alfa- amilase origem. As alfa-amilases variantes do Exemplo 2 foram purificadas e caracterizadas quanto à proteína total e atividade específica antes de seu teste na aplicação.

[00276] A redução de viscosidade da farinha de milho devido à ação da alfa-amilase foi monitorada usando um instrumento de HAAKE Viscotester 550. A pasta de substrato é preparada fresca diariamente no modo de batelada com sólidos secos de farinha de milho a 30%. O pH foi ajustado a 5,8 usando ácido sulfúrico. 50 g da pasta (15g de sólidos secos) são pesados e pré-incubados, com agitação, durante 10 minutos para aquecer até 70°C. Na adição de alfa amilase, a temperatura é imediatamente elevada de 70°C a 85°C com uma velocidade de rotação de 75. Uma vez que a temperatura da pasta e a mistura de enzima alcança 85°C, sua temperatura é mantida constante e a viscosidade é monitorada durante um adicional de 30 minutos. A viscosidade foi medida durante todo o ciclo e é relatada em uNm. AmyS, S242A, e S242Q do tipo selvagem foram todas dosadas em concentrações de proteína iguais (20 ou 30 ug/50 g de pasta de farinha de milho).

[00277] O teste de aplicação de viscômetro resultou em tanto variantes de AmyS, S242A quanto S242Q, possuindo melhor desempenho do que as alfa amilases de referência - Liquozyme SC, Ethyl, e Xtra. Ambas as variantes exibem a viscosidade de pico baixo característica de Xtra e viscosidade final baixa de Liquozyme SC e Ethyl. Quando carregadas na concentração inferior de 20ug de proteína total, as diferenças de viscosidades de pico inferiores das variantes comparadas àquelas de Liquozyme SC são também realçadas. Veja as figuras 8, 9 e 10.

Exemplo 7 - Liquefação em uma Panela a Jato

[00278] O milho moído integral foi suspenso a uma pasta a 32% (milho de sólidos secos) por uso de uma relação de 70:30 de água para vinhaça fina. O pH de pasta foi ajustado a pH 5,8 com NaOH a 10N. A pasta foi aquecida a 70°C (158°F) usando água e vapor em uma chaleira jaquetada. As enzimas de liquefação (SPEZYME® Xtra, LiquozymeSC, ou S242Q) foram adicionadas e a pasta foi aquecida a 85°C (185°F) durante aproximadamente 10 minutos. Depois de um adicional de 10 minutos de incubação em 85°C, a pasta foi passada por uma panela a jato mantida em 107°C (225°F) com um tempo de manutenção 3 minutos usando um jato de planta piloto grande (equipado com um hidro-aquecedor M103 de Hydro-thermal Corp., Waukesha, Wisconsin). O liquefeito foi coletado do jato e colocado em uma banho de água a 85°C. Uma segunda dose de enzima de liquefação foi adicionada pós- jato. O liquefeito foi continuamente agitado e mantido em 85°C durante 90 minutos. As amostras foram coletadas em 0, 30, 60 e 90 minutos. Todas as amostras foram testadas pós-jato quanto a DE (usando o método de Schoorls; método disponível em pedido), e quanto à viscosidade (viscômetro do tipo Brookfield (Lab-line Instruments Inc. de Melrose Park, Illinois) fuso 3 em 20 rpms). Dosagem de enzimas de liquefação pré- e pós-jato são indicadas nas seguintes figuras como "X + Y" onde X representa o número de unidades de enzima adicionadas antes do jato, e Y representa o número de unidades adicionadas ao liquefeito depois que passa pela panela a jato. Os resultados são mostrados nas figuras 11 e 12.

Exemplo 8 - Liquefação em batelada usando Mistura de Alfa- Amilases AmyS S242Q e SPEZYME® FRED

[00279] Milho moído integral de moinho de alimentação de Lader (Tiffany, Wisconsin) foi usado. Padrão de laboratório de SPEZYME® FRED (atividade 17,662 AAUs/g) e padrão de laboratório de AmyS S242Q (atividade 14,234 AAUs/g) foram usados.

[00280] Três suspensões idênticas de milho moído integral (700 g) foram preparadas com água contendo vinhaça fina a 30% v/v (obtido de United Etanol, Milton, Wisconsin) em 32% de DS. As amostras foram ajustadas a pH 5,8 usando NaOH a 6N. As suspensões foram mantidas em um banho de água a 85°C com misturação e AmyS S242Q (4 AAUs/g de ds de milho), Fred (20 LUs/g de ds de milho), e uma mistura de AmyS S242Q e Fred (2.8 AAUs/g de ds de milho e 6 LUs/g de ds de milho) foi adicionada a cada pasta, respectivamente. A cronometragem foi iniciada quando a temperatura de pasta alcançou 85°C. As amostras foram tiradas para testar quanto a DE (por Schoorls), °Brix, e viscosidade (por Brookfield) em 30, 60, 90 e 120 minutos. Os dados de progressão de DE e viscosidade são resumidos na figura 13 e na figura 14.

[00281] Tal como mostrado na figura 13 e na figura 14, a mistura AmyS S242Q /Fred satisfatoriamente reduziu a viscosidade de pasta a 1923 cP em 30 min. Em adição da amostra contendo a AmyS S242Q /Fred, a mistura manteve um alto declive de progressão de DE durante 120 min, o que indicou boa termoestablilidade. Quanto à redução de viscosidade, a figura 14 mostra que AmyS S242Q sozinho rapidamente reduziu a viscosidade a 1584 cP em 30 min, enquanto Fred sozinho resultou em uma viscosidade muito alta de 12.000 cP em 30 min de amostragem. Fred sozinha reduz a viscosidade a menos do que 2.000 cP por 90 minutos de tempo de liquefação, mas como notado acima, esta duração de tempo não seria útil em produção de etanol como correntemente praticado.

[00282] Em suma, a pasta de moído milho tratada com a mistura de AmyS S242Q /Fred demonstra as propriedades fundamentais necessárias para produção de etanol eficiente, isto é, uma rápida diminuição na viscosidade de pasta a abaixo de 2.000 cP (em cerca de 30 minutos), que é apropriada para plantas de etanol, e também um alto declive de progressão de DE durante todos os 120 min de tempo de liquefação, demonstrando termoestabilidade. Desta forma, a mistura AmyS S242Q e Fred nestes níveis de atividade resulta em propriedades acentuadamente melhores do que cada enzima separadamente.

Exemplo 9 - Produção de xarope de glicose usando Mistura de Alfa-Amilases AmyS S242Q e SPEZYME® FRED

[00283] Um xarope de glicose foi preparado de um substrato de amido. O substrato foi preparado como uma pasta contendo 38 % de ds de sólidos de amido de milho por pasta de amido de milho seco em água de osmose reversa (R.O.). O pH foi ajustado a 5,8, usando SO2 ou carbonato de sódio, tal como apropriado. A esta pasta, 5 LU de SPEZYME® FRED e 0,6 AAU de AmyS S242Q foram adicionados. A pasta foi liquefeito com uma panela a jato do tipo de injeção de vapor HydroHeater Brand em 108 °C com um tempo de manutenção de residência de 5 minutos. Em seguida a esta liquefação primária, a pasta liquefeita foi estimulado em pressão atmosférica e mantido em 95 °C durante 120 minutos ou até que 10 DE fossem obtidos. O desenvolvimento de DE é mostrado na figura 16. A atividade de alfa amilase foi terminada por ajuste do pH a 3,5 com HCl e manutenção em 95 °C durante 20 minutos.

[00284] O amido liquefeito foi resfriado a 60 °C, e o pH foi ajustado a 4,5 usando uma solução de carbonato de sódio a 20 %. A sacarificação foi feita por tratamento do amido liquefeito em pH 4,5 com mistura de enzima de sacarificação marca OPTIMAX™ 4060 em uma dose de 0,16 GAU/g de substância seca. A produção de glicose durante o tempo é mostrada na Tabela 6.

[00285] O xarope de glicose sacarificado final foi testado quanto à sedimento por centrifugação de 100 ml em 2.500 rpm durante 10 minutos. O xarope continha menos do que 1,5 % de sedimento. Duas gotas da pélete de centrífuga foram removidas e resuspensas em 5 ml com água RO. Esta solução foi resfriada em um banho de gelo a aproximadamente 10 °C, e 0,5 ml de uma solução de iodo a 0,02 N foi adicionado. A cor permaneceu não mudada e foi avaliada ser negativa a tingimento de iodo.

[00286] Todas as publicações e patentes mencionadas na especificação acima são aqui incorporadas através de referência. Várias modificações e variações dos métodos descritos e sistema da invenção serão evidentes àqueles versados na técnica sem afastamento do escopo e espírito da invenção. Ainda que a invenção fosse descrita em conexão com modalidades preferidas específicas, deve ser entendido que a invenção tal como reivindicado não deve ser desnecessariamente limitada a tais modalidades específicas. De fato, várias modificações dos modos descritos para execução da invenção que são óbvias àqueles versados na técnica pretendem estar dentro do escopo das seguintes reivindicações.

Claims (18)

1. Mistura de alfa-amilase, caracterizada pelo fato de que compreende: (i) uma alfa-amilase de B. stearothermophilus (AmyS) consistindo em uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 1 com uma substituição de aminoácidos selecionada do grupo que consiste em S242Q ou S242A, usando o sistema de número de aminoácido mostrado em SEQ ID NO: 2; e (ii) uma alfa-amilase de B. licheniformis consistindo na sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 20.

2. Mistura de alfa-amilase de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que compreende ainda uma fitase.

3. Mistura de alfa-amilase de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizada pelo fato de que compreende uma relação de peso de cerca de 40% da AmyS com a substituição S242 e cerca de 60% de alfa-amilase de B. licheniformis.

4. Mistura de alfa-amilase de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizada pelo fato de que a relação de peso de AmyS com a substituição S242 para alfa-amilase de B. licheniformis é 10:90.

5. Método de produção de um açúcar fermentável, caracterizado pelo fato de que compreende o tratamento de uma solução, substrato ou material compreendendo amido com uma mistura de alfa-amilase, conforme definido na reivindicação 1.

6. Método de acordo com a reivindicação 5, caracterizado pelo fato de que compreendeliquefação da solução compreendendo amido para formar uma pasta.

7. Método de acordo com a reivindicação 6, caracterizado pelo fato de que o amido é obtido a partir de material de planta, milho, milo, centeio, cevada, trigo, sorgo, aveias, arroz, farelos, mandioca, milho miúdo, batata, batata doce, ou tapioca, e opcionalmente em que o amido é amido granular de ou um processo de moagem a seco ou úmida.

8. Método de acordo com a reivindicação 6 ou 7, caracterizado pelo fato de que compreende ainda: (i) uma etapa de liquefação primária e/ou secundária, incluindo adição de substrato adicional à pasta na etapa de liquefação primária e/ou secundária; e/ou (ii) adição de uma enzima de hidrólise de ácido fítico; e/ou (iii) sacarificação do amido liquefeito para obter açúcares fermentáveis, e opcionalmente a fermentação dos açúcares fermentáveis sob condições de fermentação adequadas para obter produtos finais de álcool.

9. Método de acordo com a reivindicação 8 (iii), caracterizado pelo fato de que os produtos finais de álcool são etanol ou butanol.

10. Método de acordo com a reivindicação 6, caracterizado pelo fato de que: (i) o pH da liquefação está na faixa de pH 4,5 a 5,4, e produtos químicos neutralizantes de ácido não são adicionados à etapa de processo de liquefação; ou (ii) o pH da liquefação está na faixa de pH 4,8 a 5,8, e produtos químicos neutralizantes de ácido não são adicionados à etapa de processo de liquefação.

11. Método de acordo com a reivindicação 5, caracterizado pelo fato de que a solução, substrato ou material compreendendo amido é uma pasta de grãos moídos contendo amido granular, e o método compreende ainda: contato da referida pasta com uma enzima de hidrólise de ácido fítico em uma temperatura de 0 a 30°C inferior à temperatura de gelatinização de amido, aumento da temperatura acima da temperatura de gelatinização, hidrólise do amido gelatinado, e obtenção de um substrato fermentável.

12. Método de acordo com a reivindicação 5, caracterizado pelo fato de que compreende ainda: (a) mistura de material contendo amido moído com água e vinhaça fina, em que a vinhaça fina está na faixa de 10 a 70% em v/v, e obtenção de uma pasta compreendendo amido e possuindo um teor de sólidos secos (ds) de 20 a 50% em p/p, (b) tratamento da pasta com uma fitase antes de ou simultaneamente com a liquefação do amido, (c) liquefação do amido, (d) adição da mistura de alfa amilase, como definida na reivindicação 1, ao amido ou durante a etapa (b) e/ou simultaneamente com a etapa de liquefação, e (e) sacarificação do amido liquefeito para obter açúcares fermentáveis, em que o pH não é ajustado durante quaisquer etapas (a), (b), (c), (d) ou (e).

13. Método de acordo com a reivindicação 12, caracterizado pelo fato de que: (i) o açúcar fermentável é recuperado e purificado ou isomerizado; e/ou (ii) a fitase é adicionada antes da etapa de liquefação; e/ou (iii) a mistura de alfa amilase é adicionada com a fitase; e/ou (iv) uma segunda dose da mistura de alfa amilase é adicionada durante a etapa de liquefação ou adicionada durante a etapa de sacarificação.

14. Método de acordo com a reivindicação 5, caracterizado pelo fato de que compreende: liquefação do substrato de amido, e incubação do substrato em temperatura alta para produzir um produto compreendendo glicose.

15. Método de acordo com a reivindicação 14, caracterizado pelo fato de que: (i) a etapa de incubação é uma etapa de liquefação secundária; e/ou (ii) a etapa de incubação é conduzida em uma temperatura de cerca de 90 a 100 °C; e/ou (iii) a incubação é conduzida durante tempo suficiente para o produto compreender cerca de 2 a 14 DE de glicose, e opcionalmente, a incubação é conduzida durante tempo suficiente para o produto compreender cerca de 10 DE de glicose.

16. Método de acordo com a reivindicação 15, caracterizado pelo fato de que compreende ainda a sacarificação do produto para produzir uma solução rica em glicose.

17. Método de acordo com a reivindicação 16, caracterizado pelo fato de que a solução rica em glicose compreende 80 a 99% de glicose, e preferencialmente a solução rica em glicose compreende cerca de 93 a 96% de glicose.

18. Método de acordo com a reivindicação 16, caracterizado pelo fato de que a sacarificação compreende o contato do produto de glicose com glicoamilase ou uma mistura de enzima compreendendo uma glicoamilase e uma pululanase.

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