JP2018198606A - 新規なイムノコンジュゲート - Google Patents

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amino acid
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Ast Oliver
オリバー アスト，
ペーター ブルエンカー，
Bruenker Peter
ペーター ブルエンカー，
トーマス ウー． ホーファー，
U Hofer Thomas
トーマス ウー． ホーファー，
ラルフ ホッセ，
Hosse Ralf
ラルフ ホッセ，
クリスティアン クライン，
Klein Christian
クリスティアン クライン，
エッケハルト メスナー，
Ekkehard Moessner
エッケハルト メスナー，
パブロ ウマーニャ，
Umana Pablo
パブロ ウマーニャ，
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Abstract

【課題】細胞活性に影響を与えるエフェクター部分を選択的に送達するための抗原特異的なイムノコンジュゲートの提供。【解決手段】特定のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域、特定のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域配列、及びヒトＩｇＧ１のＦｃドメインを含む、ＩｇＧクラス１の免疫グロブリン分子、及び免疫グロブリン分子とエフェクター部分を含み、エフェクター部分がサイトカインであるイムノコンジュゲート、並びにイムノコンジュゲートをコードするポリヌクレオチド。【選択図】なし

Description

発明の分野
本発明は、一般に、細胞活性に影響を与えるエフェクター部分を選択的に送達するための抗原特異的なイムノコンジュゲートに関する。また、本発明は、そのようなイムノコンジュゲートをコードするポリヌクレオチド、そのようなポリヌクレオチドを含むベクター及び宿主細胞に関する。本発明はさらに、本発明のイムノコンジュゲートを生成するため方法、及び疾患の治療においてこれらのイムノコンジュゲートを使用する方法に関する。
発明の背景
個々の細胞又は特定の細胞型の選択的破壊は、様々な臨床設定において望ましい場合が多い。例えば、健常細胞及び組織を完全なままで損傷を受けない状態にしつつ、腫瘍細胞を特異的に破壊することは癌治療の主要な目標である。細胞内における数多くのシグナル伝達経路は、細胞の生存及び／又は死と連結されている。従って、細胞生存又は死に関与する経路因子の直接送達は、細胞の維持又は破壊に寄与するために使用することができる。同様に、腫瘍細胞を攻撃し破壊するために、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞または細胞毒性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）のような、腫瘍の微小環境において免疫エフェクター細胞を刺激する特定の因子を送達することができる。
サイトカインは、免疫系の調節に関与する細胞シグナル伝達分子である。癌治療において使用されるとき、サイトカインは、抗腫瘍効果を有する免疫調節剤として作用することができ、そしてそれは幾つかのタイプの腫瘍の免疫原性を高めることができる。しかしながら、急速な血中クリアランス及び腫瘍特異性の欠如は、免疫応答を活性化し又は抗腫瘍効果を有するのに十分な、腫瘍部位でのサイトカインの濃度を達成するために、サイトカインの高用量の全身投与を必要とする。全身性サイトカインのこれらの高レベルは重度の毒性や副作用につながる可能性がある。
治療における使用のため、インビボで特定の部位（例えば癌治療の場合、腫瘍または腫瘍の微小環境）へ、サイトカインなどシグナル伝達経路因子を特異的に送達することが望まれる。これは、その因子を標的化部分、例えば部位特異的な抗体又は抗体断片に対して、結合させることによって達成することができる。サイトカインなどのシグナル伝達経路因子をインビボで特異的部位へ送達することを目的とていた初期の戦略は、リンホトキシン、腫瘍壊死因子−α（ＴＮＦ−α）、インターロイキン−２（ＩＬ−２）、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）を含む様々なサイトカインにコンジュゲートした免疫グロブリン重鎖を含んでいた（Lode et al., Pharmacol Ther 80, 277-292 (1998)に総説される）。
研究者らは、それらがインビボで特定の部位に対してサイトカインを標的にすることができるだけでなく、それらはまたモノクローナル抗体がほとんどの他のタンパク質よりも長い血清半減期を有するという事実を利用することができることを観察した。特定の非結合型サイトカイン、例えばＩＬ−２の高用量と関連付けられた全身毒性を考えると、低用量では全身性の副作用を最小限に抑えつつ、所望の部位で、例えば腫瘍において治療上有益な生物学的活性を最大にする、免疫グロブリン−サイトカイン融合タンパク質の能力は、免疫グロブリン−サイトカインイムノコンジュゲートが最適な治療薬であることを信じるように研究者らを導いた。
それにもかかわらず、当技術分野で公知の免疫グロブリン−サイトカインイムノコンジュゲートに関連した特定の欠点がある。例えば、これらのイムノコンジュゲートは、２つの免疫グロブリン重鎖の各々に結合された少なくとも一のサイトカインを有し、二価標的結合部分及び二つ以上のサイトカイン部分を持つイムノコンジュゲートを生じる（Chang et al., Expert Opin Drug Discovery 4, 181-194 (2009)、又はOrtiz-Sanchez et al., Expert Opin Biol Ther 8, 609-632 (2008)に総説される）。図１は、当技術分野で知られている従来の免疫グロブリン、サイトカインイムノコンジュゲートを示し、ここでサイトカインは、２本の抗体重鎖の各々のＣ末端に融合される。二以上のサイトカイン部分の存在のため、このようなイムノコンジュゲートは、各々のサイトカイン受容体に対して高い親和性を有し（例えば、ＩＬ−２の場合にはピコモル親和性）、従ってサイトカインが連結されている免疫グロブリンの標的抗原（ｎＭの親和性）に対するよりも、サイトカイン受容体を発現する免疫エフェクター細胞にむしろ標的化される。更に、従来のイムノコンジュゲートは、イムノコンジュゲートのサイトカイン部分による末梢血中の免疫エフェクター細胞上のサイトカイン受容体の活性化から少なくとも部分的に生じる注入反応と関連することが知られている（例えば、King et al., J Clin Oncol 22, 4463-4473 (2004)を参照）。
更に、それらのＦｃドメインを介して、免疫グロブリン−サイトカインイムノコンジュゲートは補体を活性化し、Ｆｃ受容体と相互作用することができる。治療用イムノコンジュゲートは、所望の抗原を有する細胞よりもむしろＦｃ受容体を発現する細胞を標的とすることができるので、この固有の免疫グロブリンの機能は不利に見られている。さらに、サイトカイン受容体及びサイトカイン放出をもたらすＦｃ受容体シグナル伝達経路の同時活性化は、特に免疫グロブリン融合タンパク質の長い半減期と組み合わせると、全身毒性に起因して治療設定における適用を困難にする。
この問題を克服する１つのアプローチは、イムノコンジュゲートにおけるｓｃＦｖ又はＦａｂ断片のようなＦｃドメインを欠く免疫グロブリン断片の使用である。免疫グロブリン断片−サイトカインイムノコンジュゲートの例には、ＰＣＴ公開公報ＷＯ２００１／０６２２９８に記載のｓｃＦｖ−ＩＬ−２イムノコンジュゲート、ＰＣＴ公開公報ＷＯ２００６／１１９８９７に記載のｓｃＦｖ−ＩＬ−１２−ｓｃＦｖイムノコンジュゲート（ここで２つのｓｃＦｖ断片の各々は、ジスルフィド結合（単数又は複数）によって一緒に保持されているＩＬ−１２ヘテロ二量体のサブユニットに連結されている）又はＰＣＴ公開公報２０１１／０２０７８３に記載のＦａｂ−ＩＬ−２−Ｆａｂイムノコンジュゲートを含む。免疫グロブリン親分子の腫瘍結合反応およびサイトカインの機能的活性の両方が、これらのタイプのイムノコンジュゲートのほとんどで維持されているが、しかし、このような構築物の半減期は、免疫グロブリン融合タンパク質よりもかなり短い。
従って、これらの製品の大きな治療有効性及び副作用の数と重症度の低減（例えば、毒性、非腫瘍細胞の破壊など）のために、改善された特性を有するイムノコンジュゲートの必要性が依然として存在する。
本発明は、既知のイムノコンジュゲートに比較して、有効性の改善、活性の高い特異性、毒性の減少、及び血中半減期と安定性の改善を示す免疫グロブリン様イムノコンジュゲートを提供する。
本発明は、例えばサイトカインなど複数のエフェクター部分を含むイムノコンジュゲートは、イムノコンジュゲートの抗原結合部分の標的抗原よりもむしろそれぞれのエフェクター部分の受容体を標的とすることができるという発明者の認識に一部基づいている。従って、一態様において本発明は、第一の抗原結合部分、２つのサブユニットからなるＦｃドメイン、及びエフェクター部分を含み、１以下のエフェクター部分が存在するイムノコンジュゲートを提供する。一実施態様において、エフェクター部分はＦｃドメインの２つのサブユニットの一方のアミノ末端又はカルボキシ末端のアミノ酸に、任意でリンカーペプチドを介して融合している。一実施態様において、第一の抗原結合部位は、Ｆｃドメインの２つのサブユニットの一方のアミノ末端のアミノ酸に、任意でリンカーペプチド又は免疫グロブリンのヒンジ領域を介して融合している。
一実施態様において、第一の抗原結合部分は、抗体の抗原結合ドメインを含む。特定の実施態様において、第一の抗原結合部分は、Ｆａｂ分子である。特定の実施態様において、Ｆｃドメインは、２つの非同一ポリペプチド鎖のヘテロ二量体化を促進する修飾を含む。特定の実施態様において、前記修飾は、Ｆｃドメインのサブユニットの一つにおけるノブ修飾及びＦｃドメインの２つのサブユニットの他方におけるホール修飾を含む、ノブ・イントゥ・ホール（knob into hole）修飾である。特定の一実施態様において、エフェクター部分は、ノブ修飾を含むＦｃドメインのサブユニットのアミノ末端又はカルボキシ末端のアミノ酸に融合している。
一実施態様において、ＦｃドメインはＩｇＧのＦｃドメインであり、特にＩｇＧ１のＦｃドメインである。特定の実施態様において、Ｆｃドメインはヒトである。
本発明の特定の実施態様において、Ｆｃドメインは、Ｆｃ受容体への結合を改変されるように、具体的には、Ｆｃγ受容体への結合を改変されるように、及び／又はエフェクター機能を改変されるように、具体的には抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）を改変されるように操作される。
Ｆｃドメインの存在は、イムノコンジュゲートの半減期を延長させるために不可欠であるが、発明者らは、幾つかの状況において、ＦｃドメインによるＦｃ受容体との係合に関連付けられたエフェクター機能を排除することは有益であろうと理解している。従って、特定の実施態様において、Ｆｃ受容体に対する結合及び／又はエフェクター機能の改変は、結合及び／又はエフェクター機能を減少される。具体的なその実施態様において、Ｆｃドメインは、Ｆｃ受容体、特にＦｃγ受容体に対するＦｃドメインの結合を減少させる一以上のアミノ酸変異を含む。好ましくは、そのようなアミノ酸変異は、ＦｃＲｎ受容体への結合を減少させない。一実施態様において、Ｆｃドメインは位置Ｐ３２９でのアミノ酸置換を含む。特定の実施態様において、Ｆｃドメインはそのサブユニットの各々において、アミノ酸置換のＬ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ及びＰ３２９Ｇを含む。
一方で、イムノコンジュゲートのエフェクター機能を拡張させることが望ましい状況があり得る。従って、特定の実施態様において、本発明のイムノコンジュゲートのＦｃドメインは、Ｆｃ受容体、特にＦｃγ受容体、より具体的にはＦｃγＩＩＩａ受容体への結合が改変されるように、および／またはエフェクター機能を改変されるように操作され、ここで改変された結合及び／又はエフェクター機能は、結合及び／又はエフェクター機能を増加される。一つのそのような実施態様において、Ｆｃドメインは、非操作型Ｆｃドメインと比較して、改変されたオリゴ糖構造を有する。一つのそのような実施態様において、Ｆｃドメインは、非操作型Ｆｃドメインと比較して、非フコシル化オリゴ糖の増加した割合を含む。より具体的な実施態様において、Ｆｃドメインは少なくとも２０％、具体的には少なくとも５０％、より具体的には少なくとも７０％の非フコシル化オリゴ糖を含む。別の具体的な実施態様において、Ｆｃドメインは、非操作型Ｆｃドメインと比較して、二分されたオリゴ糖の減少した割合を含む。さらに別の具体的な実施態様において、Ｆｃドメインは、非操作型Ｆｃドメインと比較して、二分された非フコシル化オリゴ糖の増加した割合を含む。幾つかの実施態様において、前記改変されたオリゴ糖構造は、イムノコンジュゲートの発現に用いられる宿主細胞において、β（１，４）−Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＩＩＩ（ＧｎＴＩＩＩ）の活性の増加から生じる。
特定の態様において、本発明は、第一及び第二の抗原結合部分、２つのサブユニットからなるＦｃドメイン、及びエフェクター部分を含み、１以下のエフェクター部分が存在するイムノコンジュゲートを提供する。一実施態様において、第一及び第二の抗原結合部分及びＦｃドメインは免疫グロブリン分子の一部である。特定の実施態様において、イムノコンジュゲートは、本質的に、免疫グロブリン分子及びエフェクター部分及び場合により一以上のリンカー配列からなる。特定の実施態様において、免疫グロブリン分子は、ＩｇＧクラスの免疫グロブリンである。さらにより特定の実施態様において、免疫グロブリンは、ＩｇＧ１サブクラスの免疫グロブリンである。一実施態様において、エフェクター部分は、免疫グロブリン重鎖の一方のカルボキシ末端のアミノ酸に、任意でリンカーペプチドを介して融合している。
特定の実施態様において、本発明のイムノコンジュゲートは、２つの抗原結合部分及びＦｃドメイン、及び免疫グロブリン重鎖の一方のカルボキシ末端アミノ酸に融合したエフェクター部分を含む免疫グロブリン分子を含み、１以下のエフェクター部分が存在し、前記Ｆｃドメインは、Ｆｃ受容体への結合を減少されるように、具体的にはＦｃγ受容体への結合を減少させるように、及び／又はエフェクター機能を減少させるように操作されている。
特定の実施態様において、前記第一の抗原結合部分、又は前記第一及び前記第二の抗原結合部分は、例えば炎症部位、又はウイルス感染細胞上で、腫瘍細胞上又は腫瘍細胞環境において提示された抗原など病状と関連した抗原を指向する。より具体的な実施態様において、前記抗原は、線維芽細胞活性化タンパク質（ＦＡＰ）、テネイシンＣのＡ１ドメイン（ＴＮＣ Ａ１）、テネイシン−ＣのＡ２ドメイン（ＴＮＣ Ａ２）、フィブロネクチンのエキストラドメインＢ（ＥＤＢ）、癌胎児性抗原（ＣＥＡ）、及びメラノーマ関連コンドロイチン硫酸プロテオグリカン（ＭＣＳＰ）からなる群から選択される。
特定の実施態様において、エフェクター部分は、単鎖エフェクター部分である。特定の実施態様において、エフェクター部分はサイトカインである。一実施態様において、前記サイトカインは、ＩＬ−２、ＩＬ−７、ＩＬ−１０、ＩＬ−１２、ＩＬ−１５、ＩＦＮ−α及びＩＦＮ−γの群から選択される。特定の実施態様において、サイトカインはＩＬ−２である。更により特定の実施態様において、前記サイトカインは、ＩＬ−２受容体のαサブユニットへの結合親和性が減少した変異体ＩＬ−２ポリペプチドである。特定の実施態様において、前記変異体ＩＬ−２ポリペプチドは、ヒトＩＬ−２の残基４２、４５及び７２に対応する位置から選択される一以上の位置でアミノ酸置換を含む。別の特定の実施態様において、サイトカインはＩＬ−１０である。更に別の実施態様において、サイトカインは、ＩＬ−１５、特にＩＬ−１５受容体のαサブユニットへの結合親和性が減少した変異体ＩＬ−１５ポリペプチドである。別の特定の実施態様において、サイトカインはＩＦＮ−αである。
本発明の別の態様によれば、本発明のイムノコンジュゲート又はその断片をコードする単離されたポリヌクレオチドが提供される。本発明はさらに、本発明の単離されたポリヌクレオチドを含む発現ベクター及び本発明の単離されたポリヌクレオチド又は発現ベクターを含む宿主細胞を提供する。幾つかの実施態様において、宿主細胞は真核細胞、特に哺乳動物細胞である。幾つかの実施態様において、宿主細胞は、β（１，４）−Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＩＩＩ（ＧｎＴＩＩＩ）活性を有する一以上のポリペプチドの増加したレベルを発現するように操作されている。一つのそのような実施態様において、宿主細胞は、α−マンノシダーゼＩＩ（ＭａｎＩＩ）活性を有する一以上のポリペプチドの増加したレベルを発現するように更に操作されている。
別の態様において、ａ）本発明の宿主細胞をイムノコンジュゲートの発現に適した条件下で培養し、ｂ）イムノコンジュゲートを回収する工程を含む、本発明のイムノコンジュゲートを産生する方法が提供される。本発明はまた、本発明の方法により製造されたイムノコンジュゲートを包含する。
本発明はさらに、本発明のイムノコンジュゲートおよび薬学的に許容される担体を含む薬学的組成物を提供する。
また、本発明に包含されるのは、本発明のイムノコンジュゲート及び薬学的組成物を使用する方法である。一態様において、本発明は、医薬として使用するための本発明のイムノコンジュゲート又は薬学的組成物を提供する。一態様では、それを必要とする個体における疾患の治療における使用のための本発明に係るイムノコンジュゲート又は薬学的組成物が提供される。特定の実施態様において、疾患は癌である。他の実施態様において、疾患は炎症性疾患である。特定のこのような実施態様では、イムノコンジュゲートはＩＬ−１０エフェクター部分を含む。
また、それを必要とする個体における疾患を治療するための医薬の製造のための本発明のイムノコンジュゲートの使用、並びに薬学的に許容される形態の本発明によるイムノコンジュゲートを含む組成物の治療上有効な量を該個体に投与することを含む個体における疾患を治療する方法が提供される。特定の実施態様において、疾患は癌である。他の実施態様において、疾患は炎症性疾患である。特定のこのような実施態様では、イムノコンジュゲートはＩＬ−１０エフェクター部分を含む。
上記実施態様の何れかにおいて、個体は好ましくは哺乳動物、特にヒトである。
更なる態様において、本発明は、特異的には任意の抗原に結合しない第一のＦａｂ分子、２つのサブユニットからなるＦｃドメイン、及びエフェクター部分を含み、１以下のエフェクター部分が存在するコンジュゲートを提供する。特定の実施態様において、第一のＦａｂ分子は、配列番号２９９の重鎖可変領域配列、及び配列番号２９７の軽鎖可変領域配列を含む。一実施態様において、コンジュゲートは、（ｉ）特異的には任意の抗原に結合しない第一のＦａｂ分子、及び（ｉｉ）エフェクター部分を含み、１以下のエフェクター部分が存在する。一実施態様では、免疫グロブリン分子は、ＩｇＧクラスの免疫グロブリン、特にＩｇＧ１サブクラスの免疫グロブリンである。特定の実施態様において、免疫グロブリン分子は、配列番号２９９の重鎖可変領域配列、及び配列番号２９７の軽鎖可変領域配列を含む。具体的には、配列番号２９９の重鎖可変領域配列及び配列番号２９７の軽鎖可変領域配列は、免疫グロブリン分子の第一および第二のＦａｂ分子に含まれている。一実施態様において、エフェクター部分は、免疫グロブリン重鎖の一方のカルボキシ末端のアミノ酸に、任意でリンカーペプチドを介して融合している。幾つかの実施態様において、コンジュゲートのＦｃドメインは、Ｆｃ受容体への結合が低減されるように、具体的には、Ｆｃγ受容体への結合が低減されるように、及び／又はエフェクター機能が低減されるように、具体的にはＡＤＣＣを低減されるように操作される。特定の実施態様において、コンジュゲートのＦｃドメインはそのサブユニットの各々において、アミノ酸置換のＬ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ及びＰ３２９Ｇを含む。特定の実施態様において、コンジュゲートのＦｃドメインは、非同一ポリペプチド鎖のヘテロ二量体化を促進する修飾を含む。特定の実施態様において、前記修飾は、Ｆｃドメインのサブユニットの一つにおけるノブ修飾及びＦｃドメインの２つのサブユニットの他方におけるホール修飾を含む、ノブ・イントゥ・ホール（knob into hole）修飾である。特定の一実施態様において、エフェクター部分は、ノブ修飾を含むＦｃドメインのサブユニットのアミノ末端又はカルボキシ末端のアミノ酸に融合している。特定の実施態様において、エフェクター部分はサイトカイン、特にＩＬ−２である。さらに、コンジュゲートは、本発明のイムノコンジュゲートのフォーマット、Ｆｃドメイン又はエフェクター部分に関連して、本明細書に記載の特徴の何れかを単独または組み合わせて組み込むことができる。
本発明はまた、本発明のコンジュゲートをコードする単離されたポリヌクレオチドを提供する。特定の実施態様において、単離されたポリヌクレオチドは、配列番号２９８又は配列番号３００の配列に対して少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一である配列を含む。本発明はさらに、単離されたポリヌクレオチドを含む発現ベクター及び本発明の単離されたポリヌクレオチド又は発現ベクターを含む宿主細胞を提供する。別の態様において、ａ）本発明の宿主細胞をコンジュゲートの発現に適した条件下で培養し、ｂ）コンジュゲートを回収する工程を含む、本発明のコンジュゲートを産生する方法が提供される。本発明はまた、本発明の方法により製造されたコンジュゲートを包含する。
本発明はさらに、本発明のコンジュゲートおよび薬学的に許容される担体を含む薬学的組成物を提供する。更に、コンジュゲートは、本発明のイムノコンジュゲートのために本明細書に記載の使用方法で使用することができる。
当技術分野で知られている典型的な免疫グロブリン−サイトカインイムノコンジュゲートの略図。ここでサイトカイン（点線）は、２本の免疫グロブリン重鎖の各々のＣ末端に融合される。 １以下のエフェクター部分（点線）を含む、本発明による新規なイムノコンジュゲートの略図。エフェクター部分は、必要に応じてリンカーペプチドを介して（グレーのボックス）Ｆｃドメインのカルボキシ末端（フォーマットＡ及びＢ）又はアミノ末端アミノ酸（フォーマットＣ）に融合している。イムノコンジュゲートは、１つ（フォーマットＢ及びＣ）又は複数（典型的には２つ、フォーマットＡ）の抗原結合部分を含み、それは抗体重鎖及び軽鎖可変ドメイン（斜線）を含むＦａｂ断片であってもよい。Ｆｃドメインは、２つの非同一のポリペプチド鎖のヘテロダイマー化を促進する修飾（黒丸）、及び／又はＦｃ受容体結合及び／又はエフェクター機能を改変する修飾（黒星）を含み得る。 ＦＡＰを標的とした４Ｇ８ベースのＩｇＧ−ＩＬ−２四重変異体（ｑｍ）イムノコンジュゲートの精製。Ａ）プロテインＡアフィニティークロマトグラフィー工程の溶出プロファイル。Ｂ）サイズ排除クロマトグラフィー工程の溶出プロファイル。Ｃ）最終生成物の分析的ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（NuPAGE Novex Bis-Tris Mini Gel, インビトロジェン、ＭＯＰＳランニングバッファー）。Ｄ）Ｓｕｐｅｒｄｅｘ２００カラム上での最終生成物の分析的サイズ排除クロマトグラフィー（９７％単量体含有量） ＦＡＰを標的とした２８Ｈ１ベースのＩｇＧ−ＩＬ−２ ｑｍイムノコンジュゲートの精製。Ａ）プロテインＡアフィニティークロマトグラフィー工程の溶出プロファイル。Ｂ）サイズ排除クロマトグラフィー工程の溶出プロファイル。Ｃ）最終生成物の分析的ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（還元：ＮｕＰＡＧＥ Ｎｏｖｅｘ ビス−トリスミニゲル、インビトロジェン、ＭＯＰＳランニングバッファー；非還元：ＮｕＰＡＧＥ トリス酢酸、インビトロジェン、トリス酢酸ランニングバッファー）。Ｄ）Ｓｕｐｅｒｄｅｘ２００カラム上での最終生成物の分析的サイズ排除クロマトグラフィー（１００％単量体含有量）。 ＦＡＰを標的とした２８Ｈ１ベースのＩｇＧ−ＩＬ−２ ｑｍイムノコンジュゲートのＣＨＯ細胞からの精製。Ａ）プロテインＡアフィニティークロマトグラフィー工程の溶出プロファイル。Ｂ）サイズ排除クロマトグラフィー工程の溶出プロファイル。Ｃ）最終生成物の分析的ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（NuPAGE Novex Bis-Tris Mini Gel, インビトロジェン、ＭＯＰＳランニングバッファー）。Ｄ）Ｓｕｐｅｒｄｅｘ２００カラム上での最終生成物の分析的サイズ排除クロマトグラフィー（１００％単量体含有量）。 ＦＡＰを標的とした４Ｂ９ベースのＩｇＧ−ＩＬ−２ ｑｍイムノコンジュゲートの精製。Ａ）プロテインＡアフィニティークロマトグラフィー工程の溶出プロファイル。Ｂ）サイズ排除クロマトグラフィー工程の溶出プロファイル。Ｃ）最終生成物の分析的ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（NuPAGE Novex Bis-Tris Mini Gel, インビトロジェン、ＭＯＰＳランニングバッファー）。Ｄ）Ｓｕｐｅｒｄｅｘ２００カラム上での最終生成物の分析的サイズ排除クロマトグラフィー（１００％単量体含有量）。 ＣＥＡを標的としたＣＨ１Ａ１Ａ ９８／９９ ２Ｆ１−ベースのＩｇＧ−ＩＬ−２ｑｍイムノコンジュゲートの精製。Ａ）プロテインＡアフィニティークロマトグラフィー工程の溶出プロファイル。Ｂ）サイズ排除クロマトグラフィー工程の溶出プロファイル。Ｃ）最終生成物の分析的キャピラリー電気泳動ＳＤＳ（キャリパー）。Ｄ）ＴＳＫｇｅｌ Ｇ３０００ ＳＷ ＸＬカラム上での最終生成物の分析的サイズ排除クロマトグラフィー（９８．８％単量体含有量）。 ＴＮＣ Ａ２を標的とした２Ｂ１０ベースのＩｇＧ−ＩＬ−２ ｑｍイムノコンジュゲートの精製。Ａ）プロテインＡアフィニティークロマトグラフィー工程の溶出プロファイル。Ｂ）サイズ排除クロマトグラフィー工程の溶出プロファイル。Ｃ）最終生成物の分析的キャピラリー電気泳動ＳＤＳ（キャリパー）。Ｄ）ＴＳＫｇｅｌ Ｇ３０００ ＳＷ ＸＬカラム上での最終生成物の分析的サイズ排除クロマトグラフィー（１００％単量体含有量）。 非標的化ＤＰ４７ＧＳベースＩｇＧ−ＩＬ−２ ｑｍイムノコンジュゲートの精製。Ａ）プロテインＡアフィニティークロマトグラフィー工程の溶出プロファイル。Ｂ）サイズ排除クロマトグラフィー工程の溶出プロファイル。Ｃ）最終生成物の分析的ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（NuPAGE Novex Bis-Tris Mini Gel, インビトロジェン、ＭＯＰＳランニングバッファー）。Ｄ）Ｓｕｐｅｒｄｅｘ２００カラム上での最終生成物の分析的サイズ排除クロマトグラフィー（１００％単量体含有量）。 安定的にトランスフェクトされたＨＥＫ２９３細胞に発現されるヒトＦＡＰに対するＦＡＰを標的とした４Ｇ８ベースのＩｇＧ−ＩＬ−２ ｑｍイムノコンジュゲートの結合。ＦＡＣＳにより測定され、対応するＦａｂ−ＩＬ−２ ｑｍ−Ｆａｂコンストラクトに対して比較される。 ２８Ｈ１ベースのＦａｂ−ＩＬ−２ ｑｍ−Ｆａｂコンストラクトに対して比較される、溶液中でＦＡＰを標的とした４Ｇ８ベースのＩｇＧ−ＩＬ−２ ｑｍイムノコンジュゲートにより誘導されるＮＫ９２細胞上でのインターフェロン（ＩＦＮ）−γの放出。 溶液中でＦＡＰを標的とした４Ｇ８ベースのＩｇＧ−ＩＬ−２ ｑｍイムノコンジュゲートで２０分間刺激後において、異なる細胞型におけるＦＡＣＳによるリン酸化ＳＴＡＴ５の検出、２８Ｈ１ベースのＦａｂ−ＩＬ−２ ｑｍ−Ｆａｂコンストラクト並びにプロロイキンと比較される。Ａ）ＮＫ細胞（ＣＤ３−ＣＤ５６＋）；Ｂ）ＣＤ８＋ Ｔ細胞（ＣＤ３＋ＣＤ８＋）；Ｃ）ＣＤ４＋ Ｔ細胞（ＣＤ３＋ＣＤ４＋ＣＤ２５−ＣＤ１２７＋）；Ｄ）制御性Ｔ細胞（ＣＤ４＋ＣＤ２５＋ＦＯＸＰ３＋）。 ＦＡＣＳにより測定される、ＴＮＣ Ａ２を標的とした２Ｂ１０ ＩｇＧ−ＩＬ−２ ｑｍと対応するｒ非結合型ＩｇＧのＴＮＣ Ａ２発現Ｕ８７ＭＧ細胞への結合。 ＴＮＣ Ａ２を標的とした２Ｂ１０ ＩｇＧ−ＩＬ−２ ｑｍ、ＣＥＡを標的としたＣＨ１Ａ１Ａ ９８／９９ ２Ｆ１ ＩｇＧ−ＩＬ−２ ｑｍ及びＣＨ１Ａ１Ａ ９８／９９ ２Ｆ１ ＩｇＧ−ＩＬ−２ ｗｔイムノコンジュゲートによるＮＫ９２細胞増殖の誘導。 ＦＡＰを標的とした４Ｂ９ ＩｇＧ−ＩＬ−２ ｑｍ及び４Ｂ９ ＩｇＧ−ＩＬ−２ ｗｔイムノコンジュゲートによるＮＫ９２細胞増殖の誘導。 コンジュゲートしていない糖鎖操作型ＣＨ１Ａ１Ａ ＩｇＧと比較した、糖鎖操作型（ｇｅ）及び野生型（ｗｔ）ＣＨ１Ａ１Ａ ＩｇＧ−ＩＬ−２ ｑｍイムノコンジュゲートにより媒介されるＡＤＣＣを介したＰＢＭＣによるＣＥＡを過剰発現するＡ５４９腫瘍細胞の死滅（ＬＤＨ放出により測定される）。 非標的化ＤＰ４７ＧＳ ＩｇＧ−ＩＬ−２ ｗｔイムノコンジュゲートの精製。Ａ）プロテインＡアフィニティークロマトグラフィー工程の溶出プロファイル。Ｂ）サイズ排除クロマトグラフィー工程の溶出プロファイル。Ｃ）最終生成物の分析的ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（NuPAGE Novex Bis-Tris Mini Gel, インビトロジェン、ＭＯＰＳランニングバッファー）。Ｄ）Ｓｕｐｅｒｄｅｘ２００カラム上での最終生成物の分析的サイズ排除クロマトグラフィー（９９．６％単量体含有量）。 ２８Ｈ１ベースのＦＡＰを標的とした２８Ｈ１ ＩｇＧ−ＩＬ−２ ｗｔイムノコンジュゲートの精製。Ａ）プロテインＡアフィニティークロマトグラフィー工程の溶出プロファイル。Ｂ）サイズ排除クロマトグラフィー工程の溶出プロファイル。Ｃ）最終生成物の分析的ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（NuPAGE Novex Bis-Tris Mini Gel, インビトロジェン、ＭＯＰＳランニングバッファー）。Ｄ）Ｓｕｐｅｒｄｅｘ２００カラム上での最終生成物の分析的サイズ排除クロマトグラフィー（９９．６％単量体含有量）。 ＣＥＡを標的としたＣＨ１Ａ１Ａ ９８／９９ ２Ｆ１−ベースのＩｇＧ−ＩＬ−２ｗｔイムノコンジュゲートの精製。Ａ）プロテインＡアフィニティークロマトグラフィー工程の溶出プロファイル。Ｂ）サイズ排除クロマトグラフィー工程の溶出プロファイル。Ｃ）最終生成物の分析的キャピラリー電気泳動ＳＤＳ（キャリパー）。Ｄ）ＴＳＫｇｅｌ Ｇ３０００ ＳＷ ＸＬカラム上での最終生成物の分析的サイズ排除クロマトグラフィー（１００％単量体含有量）。 ＦＡＰを標的とした４Ｂ９ベースＩｇＧ−ＩＬ−２ ｗｔイムノコンジュゲートの精製。Ａ）プロテインＡ親和性およびサイズ排除の混合クロマトグラフィーの溶出プロファイル。Ｂ）Ａにおけるサイズ排除クロマトグラフィーの溶出プロファイルの拡大。Ｃ）最終産物の分析的ＳＤＳ−ＰＡＧＥＥ（NuPAGE Novex Bis-Tris Mini Gel, インビトロジェン、ＭＯＰＳランニングバッファー）。Ｄ）ＴＳＫｇｅｌ Ｇ３０００ ＳＷ ＸＬカラム上での最終生成物の分析的サイズ排除クロマトグラフィー（９８．５％単量体含有量）。 Ａ）分析的ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（NuPAGE Novex Bis-Tris Mini Gel, インビトロジェン）、ＮｕＰＡＧＥ ＬＤＳサンプルバッファー（４ｘ）、１０分間７０℃で加熱、ＭＯＰＳバッファー、１６０Ｖ、６０分、ＭＷマーカーＭａｒｋ１２、還元（１）及び非還元（２）２Ｂ１０ ＩｇＧ−ＩＬ−１０Ｍ１の無染色標準物質（インビトロジェン、Ｍ）。Ｂ）１：１相互作用モデルに対して全体的に近似される、２Ｂ１０ ＩｇＧ−ＩＬ−１０Ｍ１のヒト ＴＮＣ Ａ２に対するＳＰＲにもとづく親和性決定（ProteOn XPR36）。（チップ：ＮＬＣ；リガンド：ＴＮＣＡ２（２５０ＲＵ）；分析物：ＴＮＣＡ２ ２Ｂ１０ ＩｇＧ−ＩＬ−１０Ｍ１ １６４ｋＤａ；分析物の濃度の範囲：５０、１０、２、０．４、０．０８、０ｎＭ；会合時間：１８０ｓ；解離時間：６００ｓ；流速：５０μｌ／分；ｋｏｎ １．８０ｘ１０６ １／Ｍｓ；ｋｏｆｆ：９．３５ｘ１０−５ １／ｓ；ＫＤ：５２ｐＭ）。Ｃ）１：１相互作用モデルに対して全体的に近似される、２Ｂ１０ ＩｇＧ−ＩＬ−１０Ｍ１のヒトＩＬ−１０Ｒ１に対するＳＰＲにもとづく親和性決定（ProteOn XPR36）（チップ：ＮＬＣ；リガンド：ＩＬ−１０Ｒ１（１６００ＲＵ）；分析物：ＴＮＣＡ２ ２Ｂ１０ ＩｇＧ−ＩＬ−１０Ｍ１ １６４ｋＤａ；分析物の濃度の範囲：５０、１０、２、０．４、０．０８、０ｎＭ；会合時間：１８０ｓ；解離時間：６００ｓ；流速：５０μｌ／分；ｋｏｎ ５．５６ｘ１０５ １／Ｍｓ；ｋｏｆｆ：２．８９ｘ１０−４ １／ｓ；ＫＤ：５２０ｐＭ）。 Ａ）分析的ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（NuPAGE Novex Bis-Tris Mini Gel, インビトロジェン）、ＮｕＰＡＧＥ ＬＤＳサンプルバッファー（４ｘ）、１０分間７０℃で加熱、ＭＯＰＳバッファー、１６０Ｖ、６０分、ＭＷマーカーＭａｒｋ１２、還元（１）及び非還元（２）４Ｇ８ ＩｇＧ−ＩＬ−１０Ｍ１の無染色標準物質（インビトロジェン、Ｍ）。Ｂ）１：１相互作用モデルに対して全体的に近似される、４Ｇ８ ＩｇＧ−ＩＬ−１０Ｍ１のヒトＦＡＰに対するＳＰＲにもとづく親和性決定（ProteOn XPR36）（チップ：ＧＬＭ；リガンド：ｈｕＦＡＰ（５００ＲＵ）；分析物：ＦＡＰ ４Ｇ８ ＩｇＧ−ＩＬ−１０Ｍ１ １６４ｋＤａ；分析物の濃度の範囲：１０、２、０．４、０．０８、０ｎＭ；会合時間：１８０ｓ；解離時間：６００ｓ；流速：５０μｌ／分；ｋｏｎ ６．６８ｘ１０５ １／Ｍｓ；ｋｏｆｆ：１．７５ｘ１０−５ １／ｓ；ＫＤ：２６ｐＭ）。Ｃ）１：１相互作用モデルに対して全体的に近似される、４Ｇ８ ＩｇＧ−ＩＬ−１０Ｍ１のヒトＩＬ−１０Ｒ１に対するＳＰＲにもとづく親和性決定（ProteOn XPR36）（チップ：ＮＬＣ；リガンド：ＩＬ １０Ｒ１（１６００ＲＵ）；分析物：ＦＡＰ ４Ｇ８ ＩｇＧ−ＩＬ−１０Ｍ１ １６４ｋＤａ；分析物の濃度の範囲：５０、１０、２、０．４、０．０８、０ｎＭ；会合時間：１８０ｓ；解離時間：６００ｓ；流速：５０μｌ／分；ｋｏｎ：３．６４ｘ１０５ １／Ｍｓ；ｋｏｆｆ：２．９６ｘ１０−４ １／ｓ；ＫＤ：８１５ｐＭ）。 ＦＡＰを標的とした４Ｂ９にもとづく「１＋１」ＩｇＧ−ＩＬ−２ ｑｍイムノコンジュゲートの精製。Ａ）プロテインＡ親和性およびサイズ排除の混合クロマトグラフィーの溶出プロファイル。Ｂ）最終生成物の分析的ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（NuPAGE Novex Bis-Tris Mini Gel, インビトロジェン、ＭＯＰＳランニングバッファー）。Ｃ）ＴＳＫｇｅｌ Ｇ３０００ ＳＷ ＸＬカラム上での最終生成物の分析的サイズ排除クロマトグラフィー（９９．２％単量体含有量）。 ＦＡＰを標的とした２８Ｈ１にもとづく「１＋１」ＩｇＧ−ＩＬ−２ ｑｍイムノコンジュゲートの精製。Ａ）プロテインＡ親和性およびサイズ排除の混合クロマトグラフィーの溶出プロファイル。Ｂ）最終生成物の分析的ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（NuPAGE Novex Bis-Tris Mini Gel, インビトロジェン、ＭＯＰＳランニングバッファー）。Ｃ）ＴＳＫｇｅｌ Ｇ３０００ ＳＷ ＸＬカラム上での最終生成物の分析的サイズ排除クロマトグラフィー（１００％単量体含有量）。 ＦＡＰを標的とした４Ｂ９にもとづく「１＋１」ＩｇＧ−ＩＬ−７イムノコンジュゲートの精製。Ａ）プロテインＡ親和性およびサイズ排除の混合クロマトグラフィーの溶出プロファイル。Ｂ）最終生成物の分析的キャピラリー電気泳動ＳＤＳ（キャリパー）。Ｃ）ＴＳＫｇｅｌ Ｇ３０００ ＳＷ ＸＬカラム上での最終生成物の分析的サイズ排除クロマトグラフィー（９８．６％単量体含有量）。 ＦＡＰを標的とした４Ｂ９にもとづく「１＋１」ＩｇＧ−ＩＦＮ−αイムノコンジュゲートの精製。Ａ）プロテインＡアフィニティークロマトグラフィー工程の溶出プロファイル。Ｂ）サイズ排除クロマトグラフィー工程の溶出プロファイル。Ｃ）最終生成物の分析的キャピラリー電気泳動ＳＤＳ（キャリパー）。Ｄ）ＴＳＫｇｅｌ Ｇ３０００ ＳＷ ＸＬカラム上での最終生成物の分析的サイズ排除クロマトグラフィー（９２．８％単量体含有量）。 ＦＡＰを標的とした４Ｂ９「１＋１」ＩｇＧ−ＩＬ−２ ｑｍ及び２８Ｈ１「１＋１」ＩｇＧ−ＩＬ−２ ｗｔイムノコンジュゲートによるＮＫ９２細胞増殖の誘導。対応するＩｇＧ−ＩＬ−２コンストラクトに対して比較される。 ＩｇＧ−ＩＬ−２ ｑｍ及びＩｇＧ−ＩＬ−２ ｗｔコンストラクトと比較した、４Ｂ９「１＋１」ＩｇＧ−ＩＬ−７及び４Ｂ９「１＋１」ＩｇＧ−ＩＬ−２ ｑｍイムノコンジュゲートにより誘導されたＰＨＡ活性化（Ａ）ＣＤ４及び（Ｂ）ＣＤ８Ｔ細胞の増殖。 ロフェロンＡと比較した、４Ｂ９「１＋１」ＩｇＧ−ＩＦＮ−αによるダウディ細胞増殖の誘導。 野生型（ｗｔ）又は四重変異体（ｑｍ）ＩＬ−２の何れかを含む、ＦＡＰ標的化（Ａ）及び非標的化（Ｂ）ＩｇＧ−ＩＬ−２コンストラクトの単回静脈注射投与後のＩＬ−２イムノコンジュゲートの血清濃度。 静脈注射後２４時間での、非結合型のＦＡＰを標的とした８Ｈ１ ＩｇＧ及び４Ｂ９ ＩｇＧ、並びに非標的化ＤＰ４７ＧＳ ＩｇＧと比較される、ＦＡＰを標的とした２８Ｈ１ ＩｇＧ−ＩＬｑｍの組織分布。 ＦＡＣＳにより測定される、２８Ｈ１ ＩｇＧ−ＩＬ−２ ｑｍ及び２８Ｈ１ ＩｇＧ−（ＩＬ−２ ｑｍ）２イムノコンジュゲートのＮＫ９２細胞に対する結合。 ＦＡＰを標的とした異なる２８Ｈ１ ＩＬ−２イムノコンジュゲート又はプロロイキンによる４日間（Ａ）、５日間（Ｂ）又は６日間（Ｃ）のインキュベーションによるＮＫ細胞の増殖。 ＦＡＰを標的とした異なる２８Ｈ１ ＩＬ−２イムノコンジュゲート又はプロロイキンによる４日間（Ａ）、５日間（Ｂ）又は６日間のインキュベーションによるＣＤ４ Ｔ細胞の増殖。 ＦＡＰを標的とした異なる２８Ｈ１ ＩＬ−２イムノコンジュゲート又はプロロイキンによる４日間（Ａ）、５日間（Ｂ）又は６日間のインキュベーションによるＣＤ８ Ｔ細胞の増殖。 異なるＩＬ−２イムノコンジュゲートによる６日間のインキュベーション後における、予め活性化されたＣＤ８（Ａ）及びＣＤ４（Ｂ）Ｔ細胞の増殖。 異なるＩＬ−２イムノコンジュゲートによる６日間のインキュベーション及び抗Ｆａｓ抗体による一晩の処理後における、ＣＤ３＋ Ｔ細胞の活性化誘導細胞死。 野生型（Ａ）又は四重変異体ＩＬ−２（Ｂ９の何れかを含む、非標的化ＤＰ４７ＧＳ ＩｇＧ−ＩＬ−２コンストラクトの単回静脈注射投与後のＩＬ−２イムノコンジュゲートの血清濃度。 異なる抗原にＤＰ４７ＧＳのＩｇＧの結合。結合は、プレート上に捕獲された抗原によるＥＬＩＳＡにもとづくアッセイで検出された。ほとんど全ての捕獲抗原に対して非特異的結合を示すヒトＩｇＧ１抗体が陽性対照として用いられ、空のサンプルは任意の抗体を含まなかった。 ＦＡＣＳ解析により測定された、ＦｃドメインにＬＡＬＡ Ｐ３２９Ｇ変異を含む又は含まないＤＰ４７ＧＳ ＩｇＧの、新鮮な（Ａ）、ＰＨＡ−Ｌ活性型（Ｂ）及び再刺激型（Ｃ）ヒトＰＢＭＣのサブセットに対する結合。上の左のパネル：Ｂ細胞（Ａ、Ｂにおける）又はＣＤ４＋ Ｔ細胞（Ｃにおける）；上の右のパネル：ＣＤ８＋ Ｔ細胞；下の左のパネル：ＮＫ細胞；下の右のパネル：ＣＤ１４＋細胞（単球／好中球）。
発明の詳細な記述
定義
本明細書において、用語は、以下に定義されていない限り、当技術分野で一般的に使用されるように使用される。
本明細書で使用する用語「コンジュゲート」は、一つのエフェクター部分および更なるペプチド分子、特に免疫グロブリン分子を含む融合ポリペプチド分子を指す。
本明細書で使用しているように、用語「イムノコンジュゲート」は、１つ以下のエフェクター部分が存在することを条件として、１つのエフェクター部分、少なくとも一つの抗原結合部分及びＦｃドメインを含む融合ポリペプチド分子を指す。特定の実施態様では、イムノコンジュゲートは、１つのエフェクター部分、２つの抗原結合部分、及びＦｃドメインを含む。本発明による特定のイムノコンジュゲートは、一以上のリンカー配列により連結される、エフェクター部分、２つの抗原結合部分、及びＦｃドメインから本質的になる。抗原結合部分およびエフェクター部分は、様々な相互作用によって、本明細書に記載されるように様々な立体配置でＦｃドメインに結合することができる。特定の実施態様において、２つの抗原結合部分とＦｃドメインは、完全な免疫グロブリン分子を形成するような立体配置でお互いに連結される。本明細書で言及されるイムノコンジュゲートは、融合タンパク質であり、すなわち、イムノコンジュゲートの成分はペプチド結合により、直接又はリンカーペプチドを介して相互に連結されている。
本明細書で使用しているように、用語「抗原結合部分」は、抗原決定基に特異的に結合するポリペプチド分子を指す。一実施態様では、抗原結合部分は、標的部位、例えば特定のタイプの腫瘍細胞又は抗原決定基をもつ腫瘍間質に付着される実体（例えばエフェクター部分又は第二抗原結合部分）を指向することが可能である。さらに本願明細書において定められるように、抗原結合部分には抗体およびその断片が含まれる。特定の抗原結合部分は、抗体の重鎖可変領域および抗体軽鎖可変領域を含む抗体の抗原結合ドメインを含む。特定の実施態様において、抗原結合部分は、本明細書でさらに定義され、当技術分野で公知の抗体定常領域を含むことができる。有用な重鎖定常領域は、５のアイソタイプ：α、δ、ε、γ又はμを含む。有用な軽鎖定常領域は、２のアイソタイプ：κおよびλを含む。 有用な軽鎖定常領域は、２つのアイソタイプ：κ及びλの何れかを含む。
本明細書で使用しているように、用語「抗原決定基」は「抗原」および「エピトープ」と同義で、抗原結合部分が結合するポリペプチド高分子上の部位（例えばアミノ酸の隣接するストレッチ又は非連続アミノ酸の異なる領域から成り立つ立体配置的配位）を指し、抗原結合部分−抗原複合体を形成する。有用な抗原決定基は、例えば、腫瘍細胞の表面上で、ウイルス感染細胞の表面上で、他の疾患細胞の表面上で、血清中に遊離して、および／または細胞外マトリックス（ＥＣＭ）中に見つけることができる。特定の実施態様において、抗原決定基は、ヒト抗原である。
「特異的に結合する」とは、結合が抗原について選択的であり、不必要な又は非特異的相互作用と区別されうることを意味する。特定の抗原決定基に結合する抗原結合部分の能力は、酵素結合免疫吸着測定法（ＥＬＩＳＡ）または当業者によく知られている他の技術、例えば表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）技術（ＢＩＡｃｏｒｅ機器で解析される）（Liljeblad,et al.,Glyco.J.17:323-329(2000））および伝統的な結合アッセイ（Heeley,R.P.,Endocr.Res.28:217-229(2002)）のいずれかによって測定することができる。一実施態様では、無関係のタンパク質への抗原結合部分の結合の程度は、例えばＳＰＲにより測定される場合、抗原に対する抗原結合部分の結合の約１０％未満である。ある実施態様において、抗原へ結合する抗原結合部分、又はその抗原結合部分を含むイムノコンジュゲートは、解離定数（ＫＤ）が、≦１μＭ、≦１００ｎＭ、≦１０ｎＭ、≦１ｎＭ，、≦０．１ｎＭ、≦０．０１ｎＭ、又は≦０．００１ｎＭ（例えば、１０−８Ｍ未満、例えば、１０−８Ｍから１０−１３Ｍ、例えば、１０−９Ｍから１０−１３Ｍ）である。
「親和性」とは、分子（例えば、受容体）の単一結合部位とその結合パートナー（例えば、リガンド）との間の非共有結合相互作用の総和の強度を指す。本明細書で使用する場合、特に断らない限り、「結合親和性」は、結合対（例えば、受容体とリガンド）のメンバー間の１：１の相互作用を反映している本質的な結合親和性を指す。分子ＸのそのパートナーＹに対する親和性は、一般的に、解離の比率である解離定数（ＫＤ）および会合速度定数（ぞれぞれｋｏｆｆとｋｏｎ）で表すことができる。従って、同等の親和性は、速度定数の比が同じままである限り、別の速度定数を含み得る。親和性は、本明細書に記載したものを含む、当技術分野で良く確立される方法によって測定することができる。親和性を測定するための特別な方法は、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）である。
「結合の減少」とは、例えばＦｃ受容体又はＣＤ２５に対する結合の減少であり、例えばＳＰＲにより測定される場合、それぞれの相互作用の親和性の減少を指す。明確にするために、この用語はまた、親和性がゼロへの低下（又は分析法の検出限界以下）、即ち、相互作用の完全な撤廃をも含む。逆に、「結合の増加」は、それぞれの相互作用に対する結合親和性の増加を指す。
本明細書で使用しているように、抗原結合部分などに関して用語「第一」及び「第二」は、一より多くのタイプの部分がある場合に、便宜上区別するために用いる。これらの用語の使用は、特記しない限り、イムノコンジュゲートの特別な順番又は方向を指すためのものではない。
本明細書で使用しているように、用語「エフェクター部分」は、例えば、シグナル伝達または他の細胞経路を介して細胞活性に影響を与えるポリペプチド、例えばタンパク質又は糖タンパク質を指す。従って、本発明のエフェクター部分は、エフェクター部分のための一つ以上の受容体をもつ細胞の応答を調整するために細胞膜の外側からシグナルを伝えるレセプター媒介性シグナル伝達と関係していてもよい。一実施態様では、エフェクター部分は、エフェクター部分のための一つ以上のレセプターをもつ細胞の細胞障害反応を誘発してもよい。他の実施態様では、エフェクター部分は、エフェクター部分のための一つ以上のレセプターをもつ細胞の増殖反応を誘発してもよい。他の実施態様では、エフェクター部分は、エフェクター部分のためのレセプターをもつ細胞の分化を誘発してもよい。他の実施態様では、エフェクター部分は、エフェクター部分のためのレセプターをもつ細胞の内在性細胞性タンパク質の発現（すなわち上方制御又はダウンレギュレート）を変えてもよい。エフェクター部分の非限定的な例には、サイトカイン、増殖因子、ホルモン類、酵素、基質、補助因子を含む。エフェクター部分は、イムノコンジュゲートを形成するために、様々な立体配置で抗原結合部分と関係していてもよい。
本明細書で使用しているように、用語「サイトカイン」は、生物学的又は細胞性機能又はプロセス（例えば免疫、炎症および造血）を媒介および／または制御する分子を指す。本願明細書において使用する用語「サイトカイン」には、「リンホカイン」、「ケモカイン」、「モノカイン」及び「インターロイキン」が含まれる。有用なサイトカインの例には、ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＬ−１α、ＩＬ−１β、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−８、ＩＬ−１０、ＩＬ−１２、ＩＦＮ−α、ＩＦＮ−β、ＩＦＮ−γ、ＭＩＰ−１α、ＭＩＰ−１β、ＴＧＦ−β、ＴＮＦ−αおよびＴＮＦ−βが含まれるが、これに限定されるものではない。特定のサイトカインは、ＩＬ−２、ＩＬ−７、ＩＬ−１０、ＩＬ−１２、ＩＬ−１５、ＩＦＮ−α及びＩＦＮ−γである。特定の実施態様において、サイトカインは、ヒトサイトカインである。本明細書で使用される用語「サイトカイン」はまた、Sauve et al., Proc Natl Acad Sci USA 88, 4636-40 (1991); Hu et al., Blood 101, 4853-4861 (2003) 及び米国特許出願公開第２００３／０１２４６７８号； Shanafelt et al., Nature Biotechnol 18, 1197-1202 (2000); Heaton et al., Cancer Res 53, 2597-602 (1993) 及び米国特許第５，２２９，１０９号；米国特許出願公開第２００７／００３６７５２号；国際公開第２００８／００３４４７３号；国際公開第２００９／０６１８５３号；ＰＣＴ特許出願ＰＣＴ／ＥＰ２０１２／０５１９９１に記述される、ＩＬ−２変異体などの野生型サイトカインに対応するアミノ酸配列における一以上のアミノ酸変異を含むサイトカイン変異体を含む。更に、サイトカイン変異体、例えばＩＬ−１５変異体が本明細書に記載されている。特定の実施態様において、サイトカインは、グリコシル化を排除するために変異されている。
本明細書で使用しているように、用語「単鎖」は、ペプチド結合によって線形に結合されるアミノ酸モノマーを含んでなる分子を指す。一実施態様では、エフェクター部分は、単鎖エフェクター部分である。単鎖エフェクター部分の非限定的な例には、サイトカイン、増殖因子、ホルモン類、酵素、基質、補助因子が含まれる。エフェクター部分がサイトカインであり、対象とするサイトカインが天然で多量体として通常見いだされるときに、多量体のサイトカインの各サブユニットはエフェクター部分の単鎖によって逐次にコードされる。したがって、有用な単鎖エフェクタ部分の非限定的な例には、ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＬ−１α、ＩＬ−１β、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−８、ＩＬ−１０、ＩＬ−１２、ＩＦＮ−α、ＩＦＮ−β、ＩＦＮ−γ、ＭＩＰ−１α、ＭＩＰ−１β、ＴＧＦ−β、ＴＮＦ−αおよびＴＮＦ−βが含まれる。
本明細書で使用しているように、用語「コントロールエフェクター部分」は、コンジュゲートしていないエフェクター部分を指す。例えば、本明細書に記載されるＩＬ−２イムノコンジュゲートをコントロールエフェクター部分と比較した場合、コントロールエフェクター部分はフリーな、コンジュゲートしていないＩＬ−２である。同様に、例えば、ＩＬ−１２イムノコンジュゲートをコントロールエフェクター部分と比較した場合、コントロールエフェクター部分はフリーな、コンジュゲートしていないＩＬ−１２（例えば、ｐ４０およびｐ３５サブユニットがジスルフィド結合（一又は複数）だけを共有するヘテロ二量体タンパク質として存在する）である。
本明細書で使用しているように、用語「エフェクター部分受容体」は、エフェクター部分に特異的に結合が可能なポリペプチド分子を指す。例えば、ＩＬ−２がエフェクター部分であるとき、ＩＬ−２分子（例えばＩＬ−２を含むイムノコンジュゲート）と結合するエフェクター部分受容体はＩＬ−２受容体である。同様に、例えば、ＩＬ−１２がイムノコンジュゲートのエフェクター部分であるとき、エフェクター部分受容体はＩＬ−１２受容体である。エフェクター部分が特異的に複数のレセプターと結合するとき、エフェクター部分と特異的に結合するすべての受容体はそのエフェクター部分のための「エフェクター部分受容体」である。
用語「免疫グロブリン分子」は、天然に存在する抗体の構造を有するタンパク質を指す。例えば、ＩｇＧクラスの免疫グロブリンは、ジスルフィド結合している２つの同一の軽鎖と２つの同一の重鎖から成る約１５０，０００ダルトンのヘテロ四量体糖タンパク質である。Ｎ末端からＣ末端に、各重鎖は、可変重鎖ドメイン又は重鎖可変ドメインとも呼ばれる可変領域（ＶＨ）を有し、続いて重鎖定常領域とも呼ばれる３つの定常ドメイン（ＣＨ１、ＣＨ２およびＣＨ３）がある。同様に、Ｎ末端からＣ末端に、各軽鎖は、可変軽鎖ドメイン又は軽鎖可変ドメインとも呼ばれる可変領域（ＶＬ）を有し、続いて軽鎖定常領域とも呼ばれる定常軽鎖（ＣＬ）ドメインがある。免疫グロブリンの重鎖は、α（ＩｇＡ）、δ（ＩｇＤ）、ε（ＩｇＥ）、γ（ＩｇＧ），又はμ（ＩｇＭ）と呼ばれる５つのタイプの１つに割り当てることができ、そのうち幾つかは更にγ１（ＩｇＧ１）、γ２（ＩｇＧ２）、γ３（ＩｇＧ３）、γ４（ＩｇＧ４）、α１（ＩｇＡ１）及びα２（ＩｇＡ２）などのサブタイプに分割され得る。免疫グロブリンの軽鎖は、その定常ドメインのアミノ酸配列に基づいて、カッパ（κ）とラムダ（λ）と呼ばれる、２つのタイプのいずれかに割り当てることができる。免疫グロブリンは、免疫グロブリンのヒンジ領域を介して連結された２つのＦａｂ分子およびＦｃドメインから本質的になる。
用語「抗体」は最も広い意味で用いられ、様々な抗体構造を包含し、限定されないが、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、及び、所望の抗原結合活性を示す限り、抗体断片を含む。
「抗体断片」は、インタクトな抗体が結合する抗原を結合するインタクトな抗体の一部を含むインタクトな抗体以外の分子を指す。抗体断片の例としては、限定されないが、Ｆｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆａｂ’−ＳＨは、Ｆ（ａｂ’）２、ダイアボディ、直鎖状抗体、単鎖抗体分子（例えばｓｃＦｖ）、及び単一ドメイン抗体を含む。所定の抗体断片の総説については、Hudson et al., Nat Med 9, 129-134 (2003)を参照。ｓｃＦｖ断片の総説については、例えば、Pluckthun, in The Pharmacology of Monoclonal Antibodies,第113巻, Rosenburg and Moore eds., (Springer-Verlag, New York), 頁269-315(1994)を参照；また、国際公開第９３／１６１８５号；及び米国特許第５，５７１，８９４号及び第５，５８７，４５８号も参照。サルベージ受容体結合エピトープ残基を含み、かつインビボ半減期を増加させたＦａｂ及びＦ（ａｂ’）２断片の議論については、米国特許第５８６９０４６号を参照のこと。ダイアボディは２価または二重特異性であり得る２つの抗原結合部位を有する抗体断片である。例えば、欧州特許第４０４，０９７号；国際公開第１９９３／０１１６１号； Hudson et al., Nat Med 9, 129-134 (2003); 及びHollinger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 6444-6448 (1993)を参照。トリアボディ及びテトラボディもまた Hudson et al., Nat. Med. 9:129-134 (2003)に記載されている。単一ドメイン抗体は、抗体の重鎖可変ドメインの全て又は一部、又は軽鎖可変ドメインの全て又は一部を含む抗体断片である。ある実施態様において、単一ドメイン抗体は、ヒト単一ドメイン抗体である（Domantis, Inc., Waltham, MA; 例えば、米国特許第６，２４８，５１６ Ｂ１号を参照）。抗体断片は様々な技術で作成することができ、限定されないが、本明細書に記載するように、インタクトな抗体のタンパク質分解、並びに組換え宿主細胞（例えば、大腸菌又はファージ）による生産を含む。
「抗原結合ドメイン」は、抗原の一部又は全体に相補的であり特異的に結合する領域を含む抗体の一部を指す。抗原結合ドメインは、例えば、一以上の抗体可変ドメイン（抗体可変領域とも呼ばれる）により与えられうる。特に、抗原結合ドメインは、抗体軽鎖可変領域（ＶＬ）と抗体重鎖可変領域（ＶＨ）を含む。
用語「可変領域」又は「可変ドメイン」は、抗体の抗原への結合に関与する抗体の重鎖または軽鎖のドメインを指す。天然型抗体の重鎖及び軽鎖の可変ドメイン（それぞれＶＨおよびＶＬ）は、４つの保存されたフレームワーク領域（ＦＲ）と３つの超可変領域（ＨＶＲ）を含む各ドメインを持ち、一般的に似たような構造を有する。（例えば、Kindt et al. Kuby Immunology, 6th ed., W.H. Freeman and Co., ９１頁(2007)を参照）。単一のＶＨ又はＶＬドメインは、抗原結合特異性を付与するのに十分であり得る。
本明細書で使用される用語「超可変領域」又は「ＨＶＲ」は、配列が超可変であるか、及び／又は構造的に定義されたループ（「超可変ループ」）を形成する抗体可変ドメインの各領域を指す。一般的に、天然型４鎖抗体は、ＶＨ（Ｈ１、Ｈ２、Ｈ３）に３つ、及びＶＬ（Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３）に３つの６つのＨＶＲを含む。ＨＶＲは一般的に、超可変ループ由来及び／又は「相補性決定領域」（ＣＤＲ）由来のアミノ酸残基を含み、後者は、最高の配列可変性であり、及び／又は抗原認識に関与している。ＶＨのＣＤＲ１の例外を除いて、ＣＤＲは一般的に超可変ループを形成するアミノ酸残基を含む。超可変領域（ＨＶＲ）は、相補性決定領域（ＣＤＲ）とも呼ばれ、これらの用語は、抗原結合領域を形成する可変領域の部分への参照において本明細書で互換的に使用される。この特定の領域は、Kabat et al., U.S. Dept. of Health and Human Services, "Sequences of Proteins of Immunological Interest" (1983)及びChothia et al., J. Mol. Biol. 196:901-917 (1987)に記述されており、そこで本定義は、相互に対して比較するときにアミノ酸残基の重複又はサブセットを含む。にも関わらず、抗体又はその変異体のＣＤＲを参照するために、何れかの定義の適用は、本明細書において定義され使用される用語の範囲内であることを意図されている。上記の引用文献の各々によって定義されるように、ＣＤＲを包含する適切なアミノ酸残基が、比較として以下の表１に記載されている。特定のＣＤＲを包含する正確な残基番号は、ＣＤＲの配列や大きさによって異なる。当業者は、抗体の可変領域アミノ酸配列を考慮して、どの残基が特定のＣＤＲを含むかを日常的に決定することができる。
Ｋａｂａｔらはまた、任意の抗体に適用可能である可変領域配列の番号付けシステムを定義した。当業者は、配列それ自体を超えた任意の実験データに頼ることなく、任意の可変領域配列に対してこのＫａｂａｔの番号付けシステムを一義的に割り当てることができる。本明細書で用いる場合、「Ｋａｂａｔ番号付け」とは、Kabat et al., U.S. Dept. of Health and Human Services, "Sequence of Proteins of Immunological Interest" (1983)で明記されている番号付けシステムを指す。特記されない限り、抗体可変領域内の特定のアミノ酸残基の位置の番号付けへの参照は、Ｋａｂａｔ番号付けシステムに従う。
配列表のポリペプチド配列（即ち、配列番号２３、２５、２７、２９、３１など）はＫａｂａｔの番号付けシステムに従って番号付けされてはいない。しかし、Ｋａｂａｔの番号付けを配列表の配列の番号に変換することは当業者の通常の技術の範囲内である。
「フレームワーク」又は「ＦＲ」は、超可変領域（ＨＶＲ）残基以外の可変ドメイン残基を指す。可変ドメインのＦＲは、一般的に４つのＦＲのドメインで構成される：ＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３、及びＦＲ４。従って、ＨＶＲ及びＦＲ配列は一般にＶＨ（又はＶＬ）の以下の配列に現れる：ＦＲ１−Ｈ１（Ｌ１）−ＦＲ２−Ｈ２（Ｌ２）−ＦＲ３−Ｈ３（Ｌ３）−ＦＲ４。
抗体又はイムノコンジュゲートの「クラス」は、その重鎖が保有する定常ドメイン又は定常領域のタイプを指す。抗体の５つの主要なクラス：ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ及びＩｇＭがあり、これらの幾つかは、更にサブクラス（アイソタイプ）、例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２に、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩＧＡ１、及びＩｇＡ２に分けることができる。免疫グロブリンの異なるクラスに対応する重鎖定常ドメインは、それぞれα、δ、ε、γ、及びμと呼ばれる。
用語「Ｆｃドメイン」又は「Ｆｃ領域」は、定常領域の少なくとも一部を含む、免疫グロブリン重鎖のＣ末端領域を定義するために使用される。その用語は、天然配列Ｆｃ領域と変異体Ｆｃ領域を含む。ＩｇＧ重鎖のＦｃ領域の境界は、若干異なる場合があるものの、ヒトＩｇＧ重鎖のＦｃ領域は通常、Ｃｙｓ２２６から又はＰｒｏ２３０から重鎖のカルボキシル末端へ伸展するように定義されている。しかし、Ｆｃ領域のＣ末端リジン（Ｌｙｓ４４７）は存在しているか、又は存在していない場合がある。本明細書に明記されていない限り、Ｆｃ領域又は定常領域内のアミノ酸残基の番号付けは、Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD, 1991に記載されるように、ＥＵインデックスとも呼ばれるＥＵ番号付けシステムに従う。本明細書で使用されるＦｃドメインの「サブユニット」は、二量体Ｆｃドメインを形成する２つのポリペプチドの一つ、即ち、安定に自己会合可能な免疫グロブリン重鎖のＣ末端定常領域を含むポリペプチドを指す。例えば、ＩｇＧのＦｃドメインのサブユニットは、ＩｇＧのＨＣ２及びＩｇＧのＣＨ３定常ドメインを含む。
「ヘテロ二量体化促進修飾」は、ホモ二量体を形成する同一なポリペプチドとポリペプチドとの会合を低減するか防止する、ペプチド骨格の操作又はポリペプチドの翻訳後修飾である。ヘテロ二量体化促進修飾は、本明細書で使用される場合、二量体を形成することが所望される２つのポリペプチドの各々に為される別々の修飾を特に含み、その修飾は２つのポリペプチドの会合を促進するために互いに相補的である。例えば、ヘテロ二量体化促進修飾は、その会合をそれぞれ立体的又は静電気的に好ましくするために、二量体を形成することが所望されるポリペプチドの一方又は双方の構造又は電荷を改変しうる。ヘテロ二量体化は、サブユニットの各々に融合された更なるイムノコンジュゲート要素（例えば抗原結合部分、エフェクター部分）が同じではない、Ｆｃドメインの２つのサブユニットなど、２つの非同一ポリペプチド間で生じる。本発明によるイムノコンジュゲートでは、ヘテロ二量体化促進修飾はＦｃドメインにある。幾つかの実施態様では、ヘテロ二量体化促進修飾は、アミノ酸変異、特にアミノ酸置換を含む。特定の実施態様では、ヘテロ二量体化促進修飾は、Ｆｃドメインの２つのサブユニットの各々における別々のアミノ酸変異、特にアミノ酸置換を含む。
「エフェクター機能」なる用語は、抗体に言及して使用される場合、抗体のＦｃ領域に起因するそれらの生物学的活性を指し、抗体アイソタイプによって異なる。抗体エフェクター機能の例は：Ｃ１ｑ結合及び補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）、Ｆｃ受容体結合、抗体依存細胞媒介細胞傷害（ＡＤＣＣ）、抗体依存細胞食作用（ＡＤＣＰ）、サイトカイン分泌、細胞表面受容体（例えばＢ細胞受容体）の下方制御、及びＢ細胞活性化を含む。
本明細書で使用される場合、「操作（engineer、engineered、engineering）」なる用語は、天然に生じるか又は組換えのポリペプチド又はその断片のペプチド骨格の何れかの修飾又は翻訳後修飾を含むと考えられる。操作は、アミノ酸配列の、糖鎖付加パターンの、又は個々のアミノ酸の側鎖基の修飾、並びにこれらのアプローチの組合せを含む。特に接頭語「糖」を持つ「操作」、並びに用語「グリコシル化操作」には、細胞中で発現される糖タンパク質のグリコシル化の改変を達成するためのオリゴ糖合成経路の遺伝子操作を含む、細胞のグリコシル化機構の代謝的操作を含む。さらに、グリコシル化操作は、グリコシル化における変異及び細胞環境の影響を含む。一実施態様において、グリコシル化操作は、糖転移酵素活性の変化である。特定の実施態様では、操作が変更されたグルコサミニル転移酵素活性及び／又はフコース転移酵素活性をもたらす。グリコシル化操作は、「ＧｎＴＩＩＩ活性が増加した宿主細胞」、「ＭａｎＩＩ活性が増加した宿主細胞」、又は「α（１，６）フコシルトランスフェラーゼ活性が低下した宿主細胞」を得るために用いることができる。
「アミノ酸変異」なる用語は、本明細書で使用される場合、アミノ酸置換、欠失、挿入、及び修飾を包含することを意味する。最終コンストラクトが所望の特徴、例えばＦｃ受容体への結合の減少又はＣＤ２５への結合の減少を有することを条件として、置換、欠失、挿入、及び修飾の何れかの組合せが最終コンストラクトに到達するために成されても良い。アミノ酸配列欠失及び挿入は、アミノ酸のアミノ−及び／又はカルボキシル−末端欠失及び挿入を含む。特定のアミノ酸変異はアミノ酸置換である。例えば、Ｆｃ受容体又はＩＬ−２などのサイトカインの結合特性を変更する目的のために、非保存的アミノ酸置換、即ち一のアミノ酸を、異なる構造的及び／又は化学的特性を有する別のアミノ酸と置換することが特に所望される。アミノ酸置換は、２０の標準的アミノ酸の非天然に生じるアミノ酸又は天然に生じるアミノ酸誘導体による置換を含む（例えば４−ヒドロキシプロリン、３−メチルヒスチジン、オルニチン、ホモセリン、５−ヒドロキシリジン）。アミノ酸変異は、当分野でよく知られた遺伝学的又は化学的方法を使用して生成されうる。遺伝学的方法は、部位特異的変異誘発、ＰＣＲ、遺伝子合成等を含みうる。化学的修飾など、遺伝子工学以外の方法によるアミノ酸の側鎖基の改変方法がまた有用でありうることが意図される。本明細書において同一のアミノ酸変異を示すために様々な名称が使用されてもよい。例えば、Ｆｃドメインの位置３２９のプロリンからグリシンへの置換は、３２９Ｇ、Ｇ３２９、Ｇ３２９、Ｐ３２９Ｇ、又はＰｒｏ３２９Ｇｌｙとして示すことができる。
本明細書で使用される場合、用語「ポリペプチド」はアミド結合（ペプチド結合としても知られる）によって線形に結合される単量体（アミノ酸）から成る分子を指す。「ポリペプチド」なる用語は、２以上のアミノ酸の何れかの鎖を指し、特定長の産物を指すものではない。このように、ペプチド、ジペプチド、トリペプチド、オリゴペプチド、「タンパク質」、「アミノ酸鎖」、又は２以上アミノ酸の鎖を指すために使用される何れかの他の用語が、「ポリペプチド」の定義内に含まれ、「ポリペプチド」なる用語はこれらの何れかの用語の代わりに又は互換的に使用されうる。「ポリペプチド」なる用語は、限定するものではないが、グリコシル化、アセチル化、リン酸化、アミド化、知られている保護／ブロッキング基による誘導体化、タンパク質切断、又は非天然に生じるアミノ酸による修飾を含む、ポリペプチドの発現後修飾の産物を指す。ポリペプチドは、天然の生物学的供給源に由来するか又は組換え技術によって生産され得るが、必ずしも指定の核酸配列から翻訳される必要はない。それは化学合成を含む何れかの方法において生成されうる。本発明のポリペプチドは、約３以上、５以上、１０以上、２０以上、２５以上、５０以上、７５以上、１００以上、２００以上、５００以上、１，０００以上、又は２，０００以上のアミノ酸のサイズでありうる。ポリペプチドは定められた三次元構造を有しうるが、それらは必ずしもこのような構造を有する必要はない。定められた三次元構造を有するポリペプチドはフォールドしたと言及され、定められた三次元構造を持たないが多数の異なるコンホメーションをとりうるポリペプチドはアンフォールドとして言及される。
「単離された」ポリペプチド又は変異体、又はその誘導体は、その天然環境中にはないポリペプチドを意図する。特定レベルの精製は必要とされない。例えば、単離されたポリペプチドは、その天然又は自然環境から除去することができる。何れかの好適な技術によって分離、分画化、又は部分的又は実質的に精製される天然又は組換えポリペプチドのように、宿主細胞において発現された組換え生産されたポリペプチド及びタンパク質は、本発明の目的のために単離されることが考えられる。
参照ポリペプチド配列に関する「パーセント（％）アミノ酸配列同一性」は、配列を整列させ、最大のパーセント配列同一性を得るために必要ならば間隙を導入した後、如何なる保存的置換も配列同一性の一部と考えないとした、参照ポリペプチドのアミノ酸残基と同一である候補配列中のアミノ酸残基のパーセントとして定義される。パーセントアミノ酸配列同一性を決定する目的のためのアラインメントは、当業者の技量の範囲にある種々の方法、例えばＢＬＡＳＴ、ＢＬＡＳＴ−２、ＡＬＩＧＮ、又はＭｅｇａｌｉｇｎ（ＤＮＡＳＴＡＲ）ソフトウェアのような公に入手可能なコンピュータソフトウェアを使用することにより達成可能である。当業者であれば、比較される配列の完全長に対して最大のアラインメントを達成するために必要な任意のアルゴリズムを含む、配列をアラインするための適切なパラメータを決定することができる。しかし、ここでの目的のためには、％アミノ酸配列同一性の値は、配列比較コンピュータプログラムＡＬＩＧＮ−２を使用することによって生成される。ＡＬＩＧＮ−２配列比較コンピュータプログラムはジェネンテック社によって作製され、ソースコードは米国著作権庁、ワシントンＤ．Ｃ．，２０５５９に使用者用書類とともに提出され、米国著作権登録番号ＴＸＵ５１００８７の下で登録されている。ＡＬＩＧＮ−２もまた、ジェネンテック社、サウスサンフランシスコ、カリフォルニアから公的に入手可能であり、又はそのソースコードからコンパイルすることができる。ＡＬＩＧＮ−２プログラムは、デジタルＵＮＩＸのＶ４．０Ｄを含む、ＵＮＩＸオペレーティングシステム上での使用のためにコンパイルされるべきである。全ての配列比較パラメータは、ＡＬＩＧＮ−２プログラムによって設定され変動しない。アミノ酸配列比較にＡＬＩＧＮ−２が用いられる状況では、与えられたアミノ酸配列Ａの、与えられたアミノ酸配列Ｂとの、又はそれに対する％アミノ酸配列同一性（或いは、与えられたアミノ酸配列Ｂと、又はそれに対して所定の％アミノ酸配列同一性を持つ又は含む与えられたアミノ酸配列Ａと言うこともできる）は次のように計算される：
分率Ｘ／Ｙの１００倍
ここで、Ｘは配列アラインメントプログラムＡＬＩＧＮ−２により、ＡとＢのそのプログラムのアラインメントにおいて同一と一致したスコアのアミノ酸残基の数であり、ＹはＢの全アミノ酸残基数である。アミノ酸配列Ａの長さがアミノ酸配列Ｂの長さと異なる場合、ＡのＢに対する％アミノ酸配列同一性は、ＢのＡに対する％アミノ酸配列同一性とは異なることは理解されるであろう。特に断らない限り、本明細書で使用されるすべての％アミノ酸配列同一性値が、ＡＬＩＧＮ−２コンピュータプログラムを使用し、直前の段落で説明したように、得られる。
「ポリヌクレオチド」なる用語は、単離された核酸分子又はコンストラクト、例えばメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）、ウィルス由来ＲＮＡ、又はプラスミドＤＮＡ（ｐＤＮＡ）を指す。ポリヌクレオチドは、通常のホスホジエステル結合又は非一般的な結合（例えば、ペプチド核酸（ＰＮＡ）に見られるようなアミド結合）を含みうる。「核酸分子」なる用語は、ポリヌクレオチドに存在する何れかの一又は複数の核酸セグメント、例えばＤＮＡ又はＲＮＡ断片を指す。
「単離された」核酸分子又はポリヌクレオチドとは、それの天然環境から採られた核酸分子、ＤＮＡ又はＲＮＡを意図する。例えば、ベクターに含まれる治療用ポリペプチドをコードする組換えポリヌクレオチドは、本発明の目的のために単離されていると考えられる。単離されたポリヌクレオチドの更なる例は、異種性宿主細胞に維持された組換えポリヌクレオチド又は溶液中における（部分的又は実質的に）精製されたポリヌクレオチドを含む。単離されたポリヌクレオチドは、ポリヌクレオチド分子を通常含有する細胞に含有されるポリヌクレオチド分子を含むが、ポリヌクレオチド分子は染色体外に、又はそれの染色体上の位置と異なる染色体上の位置に存在する。単離されたＲＮＡ分子は、本発明のインビボ又はインビトロＲＮＡ転写物、並びにプラス及びマイナス鎖形態、及び二本鎖形態を含む。本発明による単離されたポリヌクレオチド又は核酸は、合成的に生産されたこのような分子を更に含む。加えて、ポリヌクレオチド又は核酸は、プロモーター、リボソーム結合部位、又は転写ターミネーター等の調節要素であるか又はそれを含みうる。
本発明の参照ヌクレオチド配列と少なくとも例えば９５％「同一」であるヌクレオチド配列を有する核酸又はポリヌクレオチドにより、ポリヌクレオチドのヌクレオチド配列が、ポリヌクレオチド配列が参照ヌクレオチド配列のそれぞれ１００ヌクレオチドにつき最大で５つの点変異を含みうることを除けば、ポリヌクレオチドのヌクレオチド配列が参照配列と同一であることを意図している。言い換えれば、参照ヌクレオチド配列に対して少なくとも９５％同一であるヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドを得るために、参照配列中のヌクレオチドの５％までが欠失されたり、又は別のヌクレオチド置換され得、または参照配列中の全ヌクレオチドの最大５％までの多数のヌクレオチドが参照配列に挿入され得る。参照配列のこれらの変化は参照ヌクレオチド配列の５’又は３’末端位置又はそれらの位置の間のどこでも起こり得、参照配列中の残基中に個別に散在するか又は参照配列内における一以上の隣接グループ中に散在している。実際問題として、任意の特定のポリヌクレオチド配列が、本発明のヌクレオチド配列に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％同一であるかどうかは、従来法により、上記のものような既知のコンピュータプログラムを用いて決定することができる。
「発現カセット」なる用語は、標的細胞において特定の核酸の転写を可能にする一連の特定の核酸要素を伴う、組換え又は合成によって生成されるポリヌクレオチドを指す。組換え発現カセットは、プラスミド、染色体、ミトコンドリアＤＮＡ、色素体ＤＮＡ、ウイルス、又は核酸断片に組み込まれうる。典型的には、発現ベクターの組換え発現カセット部分は、他の配列の中でもとりわけ、転写される核酸配列及びプロモーターを含む。ある実施態様では、本発明の発現カセットは、本発明のイムノコンジュゲートをコードするポリヌクレオチド配列又はその断片を含む。
「ベクター」又は「発現ベクター」なる用語は、「発現コンストラクト」と同義であり、標的細胞において作動的に関連した特定の遺伝子の発現を導入する及び指向するために使用されるＤＮＡ分子を指す。
この用語は、自己複製核酸構造としてのベクター、並びにそれが導入された宿主細胞のゲノムに組み込まれたベクターを含む。本発明の発現ベクターは、発現カセットを含む。発現ベクターは、多量の安定なｍＲＮＡの転写を可能にする。一旦発現ベクターが標的細胞内に入ると、遺伝子にコードされたリボ核酸分子又はタンパク質が、細胞の転写及び／又は翻訳機構によって生産される。一実施態様では、本発明の発現ベクターは、本発明のイムノコンジュゲートをコードするポリヌクレオチド配列又はその断片を含む発現カセットを含む。
「人工的」なる用語は、合成の又は非宿主細胞由来の組成物、例えば化学的に合成されたオリゴヌクレオチドを指す。
用語「宿主細胞」、「宿主細胞株」及び「宿主細胞培養」は互換的に使用され、外因性の核酸が導入された細胞を指し、そのような細胞の子孫を含める。宿主細胞は、「形質転換体」及び「形質転換された細胞」を含み、継代の数に関係なく、それに由来する一次形質転換細胞及び子孫が含まれる。子孫は親細胞と核酸含量が完全に同一ではないかもしれないが、突然変異が含まれる場合がある。最初に形質転換された細胞においてスクリーニングまたは選択されたものと同じ機能又は生物活性を有する変異型子孫が本明細書において含まれる。宿主細胞は、本発明で使用されるイムノコンジュゲートを産生するために使用することができる任意のタイプの細胞システムである。一実施態様において、宿主細胞は、修飾されたオリゴ糖をそのＦｃ領域に持つイムノコンジュゲートの産生を可能にするように操作されている。特定の実施態様において、宿主細胞は、β（１，４）−Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＩＩＩ（ＧｎＴＩＩＩ）活性を有する一以上のポリペプチドの増加したレベルを発現するように操作されている。特定の実施態様において、宿主細胞は、α−マンノシダーゼＩＩ（ＭａｎＩＩ）活性を有する一以上のポリペプチドの増加したレベルを発現するように更に操作されている。宿主細胞は、培養細胞、例えば、ＣＨＯ細胞、ＢＨＫ細胞、ＮＳ０細胞、ＳＰ２／０細胞、ＹＯの骨髄腫細胞、Ｐ３Ｘ６３マウス骨髄腫細胞、ＰＥＲ細胞、ＰＥＲ．Ｃ６細胞又はハイブリドーマ細胞などの哺乳類培養細胞、酵母細胞、昆虫細胞、植物細胞、わずかな例を挙げると、しかしまた、トランスジェニック動物、トランスジェニック植物又は培養植物又は動物組織の中に含まれる細胞も含む。
本明細書において使用される場合、「ＧｎＴＩＩＩ活性を有するポリペプチド」とは、Ｎ−結合型オリゴ糖のトリマンノシルコアのβ結合型マンノシドへのβ１−４結合でのＮ−アセチルグルコサミン（ＧｌｃＮＡｃ）残基の付加を触媒できるポリペプチドを指す。これは、用量依存性を伴うか又は伴わない特定の生物学的アッセイで測定した場合に、生化学と分子生物学の国際連合命名委員会（ＮＣ−ＩＵＢＭＢ）に従って、β−１，４−マンノシル−糖タンパク質の４−β−Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼ（ＥＣ２．４．１．１４４）としても知られているβ（１，４）−Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＩＩＩの活性に、必ずしも同一ではないが、類似した酵素活性を示す融合ポリペプチドを含む。用量依存性が存在する場合、それは、ＧｎＴＩＩＩのものと同一である必要はなく、むしろＧｎＴＩＩＩに比べた場合、特定の活性における用量依存性に対して実質的に類似している（すなわち、候補のポリペプチドは、ＧｎＴＩＩＩに比べて、より大きい活性を示すか又は最高で約２５倍以下の活性、好ましくは最高で約１０倍以下の活性、及びより最も好ましくは最高で約３倍以下の活性を示し得る）。特定の実施態様において、ＧｎＴＩＩＩ活性を有するポリペプチドは、異種性ゴルジ常駐性ポリペプチドのゴルジ局在化ドメイン及びＧｎＴＩＩＩの触媒ドメインを含む融合ポリペプチドである。特に、ゴルジ局在化ドメインは、マンノシダーゼＩＩ又はＧｎＴＩの局在化ドメインであり、最も具体的にはマンノシダーゼＩＩの局在化ドメインである。あるいは、ゴルジ局在化ドメインは、マンノシダーゼＩの局在化ドメイン、ＧｎＴＩＩの局在化ドメイン、及びα１，６コアフコシルトランスフェラーゼの局在化ドメインからなる群から選択される。このような融合ポリペプチドを生成し、増加したエフェクター機能を有する抗体を産生するためにそれらを使用するための方法は、国際公開第２００４／０６５５４０号、米国仮特許出願第６０／４９５，１４２号及び米国特許出願公開第２００４／０２４１８１７号に開示され、その内容全体が参照により本明細書に援用される。
本明細書において用いられる場合、用語「ゴルジ局在化ドメイン」は、ゴルジ複合体内の位置にポリペプチドを固定するためのに関与するゴルジ常在性ポリペプチドのアミノ酸配列を指す。一般的に、局在化ドメインは酵素のアミノ末端「尾部」を含む。
本明細書で使用される場合、用語「ＭａｎＩＩ活性を有するポリペプチド」は、Ｎ結合型オリゴ糖の分岐したＧｌｃＮＡｃＭａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２マンノース中間体における末端１，３−及び１，６−結合α−Ｄ−マンノース残基の加水分解を触媒することができるポリペプチドを指す。これは、生化学と分子生物学の国際連合の命名委員会（ＮＣ−ＩＵＢＭＢ）による、マンノシルオリゴ糖１，３−１，６−α−マンノシダーゼＩＩ（ＥＣ３．２．１．１１４）としても知られる、ゴルジα−マンノシダーゼＩＩの活性に必ずしも同一ではないが類似の酵素活性を示すポリペプチドを含む。
「活性化Ｆｃ受容体」は、抗体のＦｃ領域による結合後に、エフェクター機能を遂行させるために受容体−担持細胞を刺激するシグナル伝達イベントを誘発させるＦｃ受容体である。活性化Ｆｃ受容体はＦｃγＲＩＩＩａ（ＣＤ１６ａ）、ＦｃγＲＩ（ＣＤ６４）、ＦｃγＲＩＩａ（ＣＤ３２）、及びＦｃαＲＩ（ＣＤ８９）を含む。
抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）は、免疫エフェクター細胞による抗体被覆標的細胞の溶解をもたらす免疫機構である。標的細胞は、Ｆｃ領域を含む抗体、イムノコンジュゲート又はその断片が、Ｎ末端にあるタンパク質部分を一般に介してＦｃ領域に特異的に結合する細胞である。本明細書で使用される場合、用語、「ＡＤＣＣの増加」は、標的細胞を取り囲む培地中で、上に定義されたＡＤＣＣのメカニズムによって、所定の時間内に、イムノコンジュゲートの所定の濃度で溶解される標的細胞の数の増加、及び／又はＡＤＣＣのメカニズムによって、所定の時間内に、所定の数の標的細胞の溶解を達成するために必要とされる、標的細胞を取り囲む培地中のイムノコンジュゲートの濃度の減少のいずれかとして定義される。ＡＤＣＣの増加は、同じ標準的な産生、精製、製剤、及び保存の方法（当業者に公知である）を使用して、同じ型の宿主細胞によって産生されるが、操作されていない、同じイムノコンジュゲートによって媒介されるＡＤＣＣに関連している。例えば、本明細書に記載の方法によりグリコシル化のパターンを改変されるように（例えば、グリコシルトランスフェラーゼ、ＧｎＴＩＩＩ、または他のグリコシルトランスフェラーゼを発現させるために）操作された宿主細胞により産生されるイムノコンジュゲートにより媒介されるＡＤＣＣの増加は、同じタイプの非操作型宿主細胞により産生される同じイムノコンジュゲートにより媒介されるＡＤＣＣに関連する。
「抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）を有するイムノコンジュゲート」によって、当業者に公知である任意の適切な方法によって決定されるＡＤＣＣの増加を有するイムノコンジュゲートが意味される。１つの受容されるインビトロＡＤＣＣアッセイは以下の通りである。
１）このアッセイは、イムノコンジュゲートの抗原結合領域によって認識される標的抗原を発現することが知られている標的細胞を使用する；
２）このアッセイは、エフェクター細胞として、ランダムに選択された健常ドナーの血液から単離されたヒト末梢血単球細胞（ＰＢＭＣ）を使用する；
３）このアッセイは以下のプロトコールに従って使用される。
ｉ）ＰＢＭＣを、標準的な密度遠心分離手順を使用して単離し、ＲＰＭＩ細胞培養培地中、５×１０６細胞／ｍｌで懸濁する；
ｉｉ）標的細胞を、標準的な培養方法によって増殖させ、９０％よりも高い生存度を有する指数増殖期から収集し、ＲＰＭＩ細胞培養培地中で洗浄し、１００マイクロキュリーの５１Ｃｒで標識し、細胞培養培地で２回洗浄し、そして１０５細胞／ｍｌの密度で細胞培養培地中に再懸濁する；
ｉｉｉ）１００マイクロリットルの上記の最終的な標的細胞懸濁物を、９６ウェルマイクロタイタープレートの各ウェルに移す；
ｉｖ）イムノコンジュゲートを、細胞培養培地中で４０００ｎｇ／ｍｌから０．０４ｎｇ／ｍｌまで段階希釈し、得られるイムノコンジュゲート溶液の５０マイクロリットルを９６ウェルマイクロタイタープレート中の標的細胞に加えて、上記の全体の濃度範囲を網羅する種々なイムノコンジュゲートの濃度を３通りで試験する；
ｖ）最大放出（ＭＲ）コントロールのために、標識された標的細胞を含む、プレート中の３つのさらなるウェルは、イムノコンジュゲート溶液（上記の要点ｉｖ）の代わりに、５０マイクロリットルの２％（Ｖ／Ｖ）非イオン性界面活性剤（Ｎｏｎｉｄｅｔ，Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ）の水溶液を受容する；
ｖｉ）自発性放出（ＳＲ）コントロールのために、標識された標的細胞を含む、プレート中の３つのさらなるウェルに、イムノコンジュゲート溶液（上記の要点ｉｖ）の代わりに、５０マイクロリットルのＲＰＭＩ細胞培養培地を受容する；
ｖｉｉ）次いで、９６ウェルマイクロタイタープレートを、５０×ｇで１分間遠心分離し、そして１時間４℃でインキュベートする；
ｖｉｉｉ）５０マイクロリットルのＰＢＭＣ懸濁液（上記の要点ｉ）を各ウェルに加えて２５：１のエフェクター：標的細胞比を生じ、そしてプレートをインキュベーター中、５％ＣＯ２大気、３７℃下に４時間配置する；
ｉｘ）各ウェルからの無細胞上清を収集し、実験的に放出された放射能（ＥＲ）をガンマカウンターを使用して定量する；
ｘ）特異的溶解のパーセンテージを、計算式（ＥＲ−ＭＲ）／（ＭＲ−ＳＲ）×１００に従って各イムノコンジュゲート濃度について計算し、ここで、ＥＲはイムノコンジュゲート濃度について定量された平均放射能（上記の要点ｉｘを参照のこと）であり、ＭＲはＭＲコントロール（上記の要点ｖを参照のこと）についての定量された平均放射能（上記の要点ｉｘを参照のこと）であり、そしてＳＲはＳＲコントロール（上記の要点ｖｉを参照のこと）についての定量された平均放射能（上記の要点ｉｘを参照のこと）である；
４）「ＡＤＣＣの増加」は、上記の試験されたイムノコンジュゲート濃度範囲内で観察される特異的溶解の最大パーセンテージの増加、及び／又は上記の試験されたイムノコンジュゲート濃度範囲内で観察される特異的溶解の最大パーセンテージの半分を達成するために必要とされるイムノコンジュゲートの濃度の減少のいずれかとして定義される。ＡＤＣＣの増加は、同じ標準的な産生、精製、製剤、及び保存の方法（当業者に公知である）を使用して、同じ型の宿主細胞によって産生されるが、操作されていない、同じイムノコンジュゲートによって媒介され、上のアッセイにより測定される、ＡＤＣＣに関連している。
「有効な量」の薬剤とは、投与される細胞又は組織において生理学的変化をもたらすために必要な量を指す。
薬剤、例えば、薬学的組成物の「治療的有効量」とは、所望の治療的又予防的結果を達成するために必要な用量及び期間での、有効な量を指す。治療的に有効な量の薬剤は例えば、疾患の有害作用を除去、低下、遅延、最小化又は防止させる。
「個体」又は「被検体」は、哺乳動物である。哺乳動物は、限定されないが、家畜動物（例えば、ウシ、ヒツジ、ネコ、イヌ、ウマ）、霊長類（例えば、ヒト、サルなどの非ヒト霊長類）、ウサギ、げっ歯類（例えば、マウス及びラット）を含む。特に、個体又は被検体はヒトである。
用語「薬学的組成物」は、その中に有効で含有される活性成分の生物学的活性を許容するような形態であって、製剤を投与する被検体にとって許容できない毒性である他の成分を含まない調製物を指す。
「薬学的に許容される担体」は、被検体に非毒性であり、有効成分以外の薬学的組成物中の成分を指す。薬学的に許容される担体は、限定されないが、緩衝剤、賦形剤、安定剤、又は保存剤を含む。
本明細書で用いられるように、「治療」（及び「治療する（treat）」または「治療している（treating）」など文法上の変形）は、治療されている個体における疾患の自然経過を変えようと試みる臨床的介入を指し、予防のために、または臨床病理の過程においてのいずれかで実行できる。治療の望ましい効果は、限定されないが、疾患の発症又は再発を予防すること、症状の緩和、疾患の直接的または間接的な病理学的帰結の縮小、転移を予防すること、疾患の進行の速度を遅らせること、疾患状態の改善又は緩和、及び寛解又は予後の改善を含む。幾つかの実施態様において、本発明のイムノコンジュゲートは、疾患の発症を遅延させるか又は疾患の進行を遅くするために使用される。
用語「パッケージ挿入物」は、効能、用法、用量、投与、併用療法、禁忌についての情報、及び／又はそのような治療用製品の使用に関する警告を含む、治療用製品の商用パッケージに慣習的に含まれている説明書を指すために使用される。
実施態様の詳細な説明
第一の態様において、本発明は、第一の抗原結合部分、２つのサブユニットからなるＦｃドメイン、及びエフェクター部分を含み、１以下のエフェクター部分が存在するイムノコンジュゲートを提供する。更なるエフェクター部分の欠如は、それぞれのエフェクター部分の受容体が提示される部位へのイムノコンジュゲートの標的化を減らし、それによって抗原結合部分により認識されるイムノコンジュゲートの実際の標的抗原が提示される部位への標的化及び蓄積を改善する場合がある。また、各エフェクター部分の受容体に対する親和性効果の欠如は、イムノコンジュゲートの静脈内投与時の末梢血中のエフェクター部分の受容体陽性細胞の活性化を低減することができる。さらに、単一のエフェクター部分のみを含むイムノコンジュゲートの血清半減期は、二つ以上のエフェクター部分を含むイムノコンジュゲートに比べて長くなると思われる。
イムノコンジュゲートのフォーマット
イムノコンジュゲートの構成要素は、様々な立体配置で相互に融合することができる。例示的な立体配置を図２に示す。一実施態様において、エフェクター部分はＦｃドメインの２つのサブユニットの一方のアミノ末端又はカルボキシ末端のアミノ酸に融合している。一実施態様において、エフェクター部分はＦｃドメインの２つのサブユニットの一方のカルボキシ末端のアミノ酸に融合している。エフェクター部分は、直接又は一つ以上のアミノ酸、典型的には約２〜２０個のアミノ酸を含むリンカーペプチドを介して、Ｆｃドメインに融合され得る。リンカーペプチドは、当技術分野で知られているか、または本明細書に記載されている。適切な、非免疫原性リンカーペプチドは、例えば、（Ｇ４Ｓ）ｎは、（ＳＧ４）ｎ又はＧ４（ＳＧ４）ｎはリンカーペプチドが挙げられる。「ｎ」は一般には１と１０の間、典型的には２から４の間の数である。代わりに、エフェクター部分がＦｃドメインのサブユニットのＮ末端に連結される場合、それは、免疫グロブリンのヒンジ領域またはその一部（追加のリンカーペプチドの有無にかかわらず）を介して連結されてもよい。
同様に、第一の抗原結合部分は、Ｆｃドメインの２つのサブユニットの一方のアミノ末端又はカルボキシ末端のアミノ酸に融合することができる。一実施態様において、抗原結合部分はＦｃドメインの２つのサブユニットの一方のアミノ末端のアミノ酸に融合している。第一の抗原結合部分は、Ｆｃドメインに直接またはリンカーペプチドを介して融合させることができる。特定の実施態様において、第一の抗原結合部分は、免疫グロブリンのヒンジ領域を介してＦｃドメインに融合される。具体的な実施形態において、免疫グロブリンのヒンジ領域は、ヒトＩｇＧ１ヒンジ領域である。
一実施態様において、第一の抗原結合部分は、抗体の重鎖可変領域および抗体軽鎖可変領域を含む抗体の抗原結合ドメインを含む。特定の実施態様において、第一の抗原結合部分は、Ｆａｂ分子である。一実施態様において、Ｆａｂ部分はＦｃドメインの２つのサブユニットの片方のアミノ末端のアミノ酸に対して、その重鎖又は軽鎖のカルボキシ末端で融合している。特定の実施態様において、Ｆａｂ部分はＦｃドメインの２つのサブユニットの片方のアミノ末端のアミノ酸に対して、その重鎖のカルボキシ末端で融合している。更に特定の実施態様において、Ｆａｂ部分は、免疫グロブリンのヒンジ領域を介してＦｃドメインに融合される。具体的な実施形態において、免疫グロブリンのヒンジ領域は、ヒトＩｇＧ１ヒンジ領域である。
一実施態様では、イムノコンジュゲートは、本質的には、抗原結合部分、２つのサブユニットからなるＦｃドメイン、エフェクター部分、及び必要に応じて１つ又は複数のリンカーペプチドからなり、ここで、前記抗原結合ドメインがＦａｂ分子であり、そして、その重鎖のカルボキシ末端でＦｃドメインの２つのサブユニットの一方のアミノ末端アミノ酸に融合され、前記エフェクター部分が、（ｉ）Ｆｃドメインの２つのサブユニットのうちの他方のアミノ末端アミノ酸、又は（ｉｉ）Ｆｃドメインの２つのサブユニットの一方のカルボキシ末端アミノ酸の何れかに対して融合される。後者の場合、エフェクター部分及び第一の抗原結合部分は、両方ともＦｃドメインの同じサブユニットに融合してもよいし、各々がＦｃドメインの２つのサブユニットの異なる１つに融合させてもよい。
単一抗原結合部位を持つイムノコンジュゲートフォーマット（例えば図２Ｂ及び２Ｃに示される）は、特に、高親和性の抗原結合部分の結合後に標的抗原の内在化が予想される場合、有用である。そのような場合、イムノコンジュゲートごとに一以上の抗原結合部分の存在は、内在化を高めることができ、それによって標的抗原の使用可能性が低減する。
しかし、他の多くのケースにおいては、エフェクター部分受容体と対比して標的抗原への標的化、及びイムノコンジュゲートの医薬用量の範囲を最適化するために、複数の抗原結合部分及び単一のエフェクター部分を含むイムノコンジュゲートを有することが有利であろう。
従って、特定の実施態様では、本発明のイムノコンジュゲートは、第一および第二の抗原結合部分を含む。一実施態様において、前記第一及び第二の抗原結合部分はＦｃドメインの２つのサブユニットの一方のアミノ末端のアミノ酸に融合している。第一及び第二の抗原結合部分は、Ｆｃドメインに直接またはリンカーペプチドを介して融合させることができる。特定の実施態様において、前記第一及び第二の抗原結合部分は、免疫グロブリンのヒンジ領域を介してＦｃドメインのサブユニットに融合される。具体的な実施形態において、免疫グロブリンのヒンジ領域は、ヒトＩｇＧ１ヒンジ領域である。
一実施態様において、前記第一及び第二の抗原結合部分は、抗体の重鎖可変領域および抗体軽鎖可変領域を含む抗体の抗原結合ドメインを含む。特定の実施態様において、前記第一及び第二の抗原結合部分は、Ｆａｂ分子である。一実施態様において、前記Ｆａｂ分子の各々は、その重鎖又は軽鎖のカルボキシ末端でＦｃドメインの２つのサブユニットの片方のアミノ末端のアミノ酸に対して融合している。特定の実施態様において、前記Ｆａｂ分子の各々は、その重鎖のカルボキシ末端でＦｃドメインの２つのサブユニットの片方のアミノ末端のアミノ酸に対して融合している。特定の実施態様において、前記Ｆａｂ分子の各々は、免疫グロブリンのヒンジ領域を介してＦｃドメインのサブユニットに融合される。具体的な実施形態において、免疫グロブリンのヒンジ領域は、ヒトＩｇＧ１ヒンジ領域である。
一実施態様において、第一及び第二の抗原結合部分及びＦｃドメインは免疫グロブリン分子の一部である。特定の実施態様において、免疫グロブリン分子は、ＩｇＧクラスの免疫グロブリンである。さらにより特定の実施態様において、免疫グロブリンは、ＩｇＧ１サブクラスの免疫グロブリンである。別の特定の実施態様において、免疫グロブリンは、ヒト免疫グロブリンである。別の実施態様において、免疫グロブリンは、キメラ免疫グロブリン又はヒト化免疫グロブリンである。一実施態様において、エフェクター部分は、免疫グロブリン重鎖の一方のカルボキシ末端のアミノ酸に融合している。エフェクター部分は、免疫グロブリン重鎖に直接またはリンカーペプチドを介して融合させることができる。特定の実施態様において、イムノコンジュゲートは、本質的に、免疫グロブリン分子、免疫グロブリン重鎖の一方のカルボキシ末端アミノ酸に融合したエフェクター部分、および任意で１つまたは複数のリンカーペプチドからなる。
一実施態様において、イムノコンジュゲートは、Ｆａｂ重鎖がＦｃドメインサブユニットとカルボキシ末端のペプチド結合を共有するポリペプチド、及びＦｃドメインサブユニットがエフェクター部分ポリペプチドとカルボキシ末端ペプチド結合を共有するポリペプチドを含む。別の実施態様において、イムノコンジュゲートは、第一のＦａｂ重鎖がＦｃドメインサブユニットとカルボキシ末端のペプチド結合を共有するポリペプチド、及び第二のＦａｂ重鎖がＦｃドメインサブユニットとカルボキシ末端ペプチド結合を共有し、これは次いでエフェクター部分ポリペプチドとカルボキシ末端ペプチド結合を共有するポリペプチドを含む。更なる実施態様において、イムノコンジュゲートは、Ｆａｂ重鎖がＦｃドメインサブユニットとカルボキシ末端のペプチド結合を共有するポリペプチド、及びエフェクター部分ポリペプチドがＦｃドメインサブユニットとカルボキシ末端ペプチド結合を共有するポリペプチドを含む。幾つかの実施態様においてイムノコンジュゲートは、更にＦａｂ軽鎖ポリペプチドを含む。特定の実施態様において、ポリペプチドは、共有結合、例えばジスルフィド結合により連結されている。
上記実施態様の何れかによれば、イムノコンジュゲートの構成要素（例えば、エフェクター部分、抗原結合部分、Ｆｃドメイン）は、直接または様々なリンカー、特に、一以上のアミノ酸を含み、典型的には、本明細書に記載されているか、又は当技術分野で知られている約２〜２０個のアミノ酸を含むペプチドリンカーによって連結されていてもよい。適切な非免疫原性リンカーペプチドは、例えば、（Ｇ４Ｓ）ｎ、（ＳＧ４）ｎ又はＧ４（ＳＧ４）ｎリンカーペプチドを含み、ｎは一般に、１と１０の間、典型的には２と４の数である。
Ｆｃドメイン
イムノコンジュゲートのＦｃドメインは、免疫グロブリン分子の重鎖ドメインを含むポリペプチド鎖の対からなる。例えば、免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）分子のＦｃドメインは、二量体であり、その各サブユニットは、ＣＨ２及びＣＨ３ ＩｇＧ重鎖定常ドメインを含む。Ｆｃドメインの２つのサブユニットは、互いに安定な会合が可能である。一実施態様において、本発明のイムノコンジュゲートは、一又は複数のＦｃドメインを含む。
本発明に係る一実施態様において、イムノコンジュゲートのＦｃドメインは、ＩｇＧのＦｃドメインである。特定の実施態様において、ＦｃドメインはＩｇＧ１のＦｃドメインである。別の実施態様において、ＦｃドメインはＩｇＧ４のＦｃドメインである。更なる特定の実施態様において、Ｆｃドメインはヒトである。ヒトＩｇＧ１のＦｃドメインの例示的な配列は配列番号１に与えられる。
Ｆｃドメインは、Ｆｃドメインを欠くイムノコンジュゲートフォーマットと比較して大幅に延長された血清半減期を付与する。特に、イムノコンジュゲートがかなり弱い活性の（しかし、例えば毒性が減少した）エフェクター部分を含む場合には、長い半減期はインビボで最適な効果を達成するために不可欠であるかもしれない。また、更に後述するように、Ｆｃドメインはエフェクター機能を媒介することができる。
ヘテロ二量体化を促進するＦｃドメインの修飾
本発明に係るイムノコンジュゲートは、Ｆｃドメインの２つのサブユニットの片方に融合した単一エフェクター部分を一つだけ含み、従ってそれらは２つの非同一ポリペプチド鎖を含む。これらのポリペプチドの組換え共発現及び続く二量体化は、２つのポリペプチドの幾つかの可能な組み合わせをもたらし、それらのうちの２つの非同一ポリペプチドのヘテロダイマーのみが本発明に従って有用である。組換え産生におけるイムノコンジュゲートの収率および純度を向上させるために、２つの同一ポリペプチド（すなわち、エフェクター部分を含む２つのポリペプチド、又はエフェクター部分を欠く２つのポリペプチド）のホモ二量体の形成を妨げ、および／またはエフェクター部分を含むポリペプチドとエフェクター部分を欠くポリペプチドとのヘテロ二量体の形成を促進する修飾をイムノコンジュゲートのＦｃドメインに導入することは有利であり得る。
したがって、本発明の特定の実施態様において、コンジュゲートのＦｃドメインは、非同一ポリペプチド鎖のヘテロ二量体化を促進する修飾を含む。ヒトＩｇＧのＦｃドメインの２つのポリペプチド鎖間の最も広範なタンパク質−タンパク質相互作用の部位は、ＦｃドメインのＣＨ３ドメインにある。従って、一実施態様では、前記修飾は、ＦｃドメインのＣＨ３ドメインにある。
特定の実施態様において、前記修飾は、Ｆｃドメインの２つのサブユニットの一つにおけるノブ修飾及びＦｃドメインの２つのサブユニットの他方におけるホール修飾を含む、ノブ・イントゥ・ホール（knob into hole）修飾である。
ノブ・イントゥ・ホール技術は、例えば米国特許第５，７３１，１６８号；米国特許第７，６９５，９３６号； Ridgway et al., Prot Eng 9, 617-621 (1996)及びCarter, J Immunol Meth 248, 7-15 (2001)に記載される。一般に、本方法は、ヘテロ二量体形成を促進し、ホモ二量体形成を妨げるように、突起が空洞内に配置することができるように、第一のポリペプチドの界面での突起（「ノブ」）及び第二ポリペプチドの界面における対応する空洞（「穴」）を導入することを含む。突起は、第一のポリペプチドの界面からの小さなアミノ酸側鎖をより大きな側鎖（例えばチロシン又はトリプトファン）と置換することによって構築される。突起と同一又はより小さい大きさの相補的な空洞が、大きなアミノ酸側鎖を小さいもの（例えばアラニン又はスレオニン）と置換することによって第二ポリペプチドの界面に作成される。突起及び空洞は、ポリペプチドをコードする核酸を改変することにより、例えば部位特異的突然変異誘発により、またはペプチド合成により作製することができる。特定の実施態様において、ノブ修飾は、Ｆｃドメインの２つのサブユニットの片方でアミノ酸置換Ｔ３６６Ｗを含み、そしてホール修飾は、Ｆｃドメインの２つのサブユニットの他方でアミノ酸置換Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ及びＹ４０７Ｖを含む。更なる特定の実施態様において、ノブ修飾を含むＦｃドメインのサブユニットは、アミノ酸置換Ｓ３５４Ｃを更に含み、ホール修飾を含むＦｃドメインのサブユニットは、アミノ酸置換Ｙ３４９Ｃを更に含む。これらの２つのシステイン残基の導入は、Ｆｃ領域の２つのサブユニット間のジスルフィド架橋の形成をもたらし、更に二量体を安定化させる (Carter, J Immunol Methods 248, 7-15 (2001))。
代わりの実施態様において、２つの非同一ポリペプチド鎖のヘテロ二量体化を促進する修飾は、ＰＣＴ出願公開ＷＯ２００９／０８９００４に記載されるように、静電的ステアリング効果を媒介する修飾を含む。一般に、この方法は、ホモ二量体形成は静電的に不利になるが、ヘテロ二量体は静電的に有利になるように、２つのポリペプチド鎖の界面で、荷電したアミノ酸残基による一又は複数のアミノ酸残基の置換を含む。
特定の一実施態様において、エフェクター部分は、ノブ修飾を含むＦｃドメインのサブユニットのアミノ末端又はカルボキシ末端のアミノ酸に融合している。理論に縛られることを望むものではないが、Ｆｃドメインのノブを含むサブユニットに対するエフェクター部分の融合は、さらに、２つのエフェクター部分（二つのノブを含有するポリペプチドの立体的な衝突）を含むホモ二量体イムノコンジュゲートの生成を最小限にするであろう。
Ｆｃ受容体結合を改変するＦｃドメインの修飾
本発明の特定の実施態様において、イムノコンジュゲートのＦｃドメインは、Ｆｃ受容体に対する結合親和性が改変されるように、具体的には非操作型Ｆｃドメインに比べて、Ｆｃγ受容体に対する結合親和性を改変されるように操作される。
Ｆｃ受容体への結合は、例えば、ＢＩＡｃｏｒｅ装置（ＧＥヘルスケア）など標準的な計測機器を使用してＥＬＩＳＡによって又は表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）によって容易に決定することができ、そのようなＦｃ受容体は、組換え発現によって得ることができる。適切なこのような結合アッセイが本明細書に記載されている。代わりに、ＦｃドメインまたはＦｃ受容体に対するＦｃドメインを含むイムノコンジュゲートの結合親和性は、特定のＦｃ受容体を発現することが知られている細胞株、例えばＦｃγＩＩＩａ受容体を発現するＮＫ細胞などを使用して評価することができる。
幾つかの実施態様において、イムノコンジュゲートのＦｃドメインは、非操作型Ｆｃドメインと比較して、改変されたエフェクター機能を有するように、とりわけＡＤＣＣを改変されるように操作される。
Ｆｃドメイン又はＦｃドメインを含むイムノコンジュゲートのエフェクター機能は、当技術分野で公知の方法によって測定することができる。ＡＤＣＣを測定するのに適したアッセイが本明細書に記載されている。対象とする分子のＡＤＣＣ活性を評価するためのインビトロアッセイの他の例は、米国特許第５，５００，３６２号：Hellstrom et al. Proc Natl Acad Sci USA 83, 7059-7063 (1986)及びHellstrom et al., Proc Natl Acad Sci USA 82, 1499-1502 (1985); 米国特許第５，８２１，３３７号; Bruggemann et al., J Exp Med 166, 1351-1361 (1987)に記述されている。あるいは、非放射性アッセイ法（例えば、フローサイトメトリーのためのＡＣＴＩＴＭ非放射性細胞毒性アッセイ（CellTechnology, Inc. Mountain View, CA）及びＣｙｔｏＴｏｘ９６（登録商標）非放射性細胞毒性アッセイ（Promega, Madison, WI）を参照）を用いることができる。このようなアッセイに有用なエフェクター細胞は、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）及びナチュラルキラー（ＮＫ）細胞が含まれる。あるいは、又は更に、目的の分子のＡＤＣＣ活性は、例えばClynes et al., Proc Natl Acad Sci USA 95, 652-656 (1998)に開示される動物モデルにおいてインビボで評価することができる。
幾つかの実施態様において、補体成分に対する、具体的にはＣ１ｑに対するＦｃドメインの結合が改変される。従って、Ｆｃドメインがエフェクター機能を改変されるように操作される幾つかの実施態様において、前記改変されたエフェクター機能は改変されたＣＤＣを含む。イムノコンジュゲートがＣ１ｑに結合することができそれ故にＣＤＣ活性を有するかを決定するためにＣ１ｑ結合アッセイを実施することができる。例えば、国際公開第２００６／０２９８７９号及び国際公開第２００５／１００４０２号のＣ１ｑ及びＣ３ｃ結合ＥＬＩＳＡを参照。補体活性化を評価するために、ＣＤＣアッセイを行ってもよい（例えば、Gazzano-Santoro et al., J Immunol Methods 202, 163 (1996); Cragg et al., Blood 101, 1045-1052 (2003)；及び Cragg and Glennie, Blood 103, 2738-2743 (2004))。
ａ）Ｆｃ受容体結合及び／又はエフェクター機能の低下
Ｆｃドメインは、その標的組織における良好な蓄積及び好ましい組織−血液分配比率に寄与する長い血清半減期を含む好ましい薬物動態学的特性をイムノコンジュゲートに付与する。しかし、同時期に、好適な抗原保有細胞に対するよりもむしろＦｃ受容体を発現する細胞に対するイムノコンジュゲートの所望されない標的化を導く。更に、Ｆｃ受容体シグナル伝達経路の同時活性化はサイトカイン放出につながる可能性があり、イムノコンジュゲートのエフェクター部分と長い半減期が長いと組み合わさって、サイトカイン受容体の過剰な活性化及び全身投与の際に重篤な副作用をもたらす。これに伴い、従来のＩｇＧ−ＩＬ−２イムノコンジュゲートは注入反応に関連することが説明されている（例えばKing et al., J Clin Oncol 22, 4463-4473 (2004))。
従って、本発明に係る特定の実施態様では、イムノコンジュゲートのＦｃドメインは、Ｆｃ受容体に対する結合親和性を低下させるいるように操作される。一つのそうした実施態様において、Ｆｃドメインは、Ｆｃ受容体に対するＦｃドメインの結合親和性を減少させる一以上のアミノ酸変異を含む。典型的には、同一の一以上のアミノ酸置換がＦｃドメインの２つのサブユニットの各々に存在する。一実施態様において、前記アミノ酸置換は、ＦｃドメインのＦｃ受容体に対する結合親和性を少なくとも２倍、少なくとも５倍、又は少なくとも１０倍減少させる。Ｆｃ受容体に対するＦｃドメインの結合親和性を減少させる複数のアミノ酸変異が存在する実施態様において、これらのアミノ酸変異は、ＦｃドメインのＦｃ受容体に対する結合親和性を少なくとも１０倍、少なくとも２０倍、又は更に少なくとも５０倍減少させ得る。
一実施態様において、操作されたＦｃドメインを含むイムノコンジュゲートは、非操作型Ｆｃドメインを含んでなるイムノコンジュゲートと比較した場合、Ｆｃ受容体に対する結合親和性の２０％未満、具体的には１０％未満、より具体的には５％未満の結合親和性を示す。一実施態様において、Ｆｃ受容体は活性化Ｆｃ受容体である。特定の実施態様において、Ｆｃ受容体は、Ｆｃγ受容体であり、より具体的にはＦｃγＲＩＩＩａ、ＦｃγＲＩ又はＦｃγＲＩＩａ受容体である。好ましくは、これらの受容体の各々に対する結合が減少する。幾つかの実施態様において、補体成分に対する結合親和性、具体的にはＣ１ｑに対する結合親和性もまた減少する。一実施態様において、新生児Ｆｃ受容体（ＦｃＲｎ）への結合親和性は低下しない。ＦｃＲｎへの実質的に類似な結合、すなわち、前記受容体への免疫グロブリンの結合親和性の保存は、Ｆｃドメイン（又は前記Ｆｃドメインを含んでなるイムノコンジュゲート）が、ＦｃＲｎに対し、非操作型形態のＦｃドメイン（又は前記非操作型形態のＦｃドメインを含んでなるイムノコンジュゲート）の約７０％より大きな結合親和性を呈する場合に達成される。Ｆｃドメイン又は前記Ｆｃドメインを含む本発明のイムノコンジュゲートは、約８０％を越える、又は更に約９０％を越えるそのような活性を示す場合がある。一実施態様では、アミノ酸変異はアミノ酸置換である。一実施態様において、Ｆｃドメインは位置Ｐ３２９でのアミノ酸置換を含む。より特異的な実施態様では、アミノ酸置換は、Ｐ３２９Ａ又はＰ３２９Ｇ、特にＰ３２９Ｇである。一実施態様では、Ｆｃドメインは、Ｓ２２８、Ｅ２３３、Ｌ２３４、Ｌ２３５、Ｎ２９７及びＰ３３１から選択される位置に更なるアミノ酸置換を含む。より特異的な実施態様では、更なるアミノ酸置換は、Ｓ２２８Ｐ、Ｅ２３３Ｐ、Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ、Ｌ２３５Ｅ、Ｎ２９７Ａ、Ｎ２９７Ｄ又はＰ３３１Ｓである。特定の実施態様では、Ｆｃドメインは、位置Ｐ３２９、Ｌ２３４及びＬ２３５にアミノ酸置換を含む。更に特定の実施態様では、Ｆｃドメインはアミノ酸変異Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ及びＰ３２９Ｇ（ＬＡＬＡ Ｐ３２９Ｇ）を含む。欧州特許出願番号ＥＰ１１１６０２５１．２に記載され、その全体が参照により本明細書に援用されるように、アミノ酸置換のこの組み合わせは、ＩｇＧのＦｃドメインのＦｃγ受容体結合をほとんど完全に消滅させる。ＥＰ １１１６０２５１．２はまた、このような変異体Ｆｃドメインを調製する方法、及びＦｃ受容体結合またはエフェクター機能などその特性を決定するための方法を記載する。
変異型Ｆｃドメインは、当技術分野で知られている遺伝子的又は化学的方法を用いて、アミノ酸の欠失、置換、挿入又は修飾によって調製することができる。遺伝的方法は、コードするＤＮＡ配列、ＰＣＲ、遺伝子合成等の部位特異的変異誘発を含むことができる。正しいヌクレオチド変化は、例えば配列決定によって検証することができる。
一つの実施態様において、Ｆｃドメインは、非操作型Ｆｃドメインと比較して、エフェクター機能が減少するように操作される。エフェクター機能の減少は、限定されないが、以下の一つ又は複数を含み得る：抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）の減少、抗体依存性細胞貪食（ＡＤＣＰ）の減少、サイトカイン分泌の減少、抗原提示細胞による免疫複合体媒介性の抗原取り込みの減少、ＮＫ細胞への結合の減少、マクロファージへの結合の減少、単球への結合の減少、多形核細胞への結合の減少、直接的シグナル伝達誘導性アポトーシスの減少、標的結合抗体の架橋の減少、樹状細胞成熟の減少、又はＴ細胞プライミングの減少。
一実施態様において、エフェクター機能の低下は、ＣＤＣの減少、ＡＤＣＣの減少、ＡＤＣＰの減少、及びサイトカイン分泌の減少から選択される一又は複数である。特定の実施態様において、エフェクター機能の低下はＡＤＣＣの減少である。一実施態様において、ＡＤＣＣの減少は、非操作型Ｆｃドメイン（又は非操作型Ｆｃドメインを含むイムノコンジュゲート）により誘導されるＡＤＣＣの２０％未満である。
本明細書中に上述され、及び欧州特許出願番号ＥＰ１１１６０２５１．２Ｆｃドメインに加えて、Ｆｃ受容体結合及び／又はエフェクター機能の減少を伴うＦｃドメインはまた、一以上のＦｃドメイン残基２３８、２６５、２６９、２７０、２９７、３２７及び３２９の置換を持つものを含む（米国特許第６７３７０５６）。そのようなＦｃ変異体は、残基２６５と２９７のアラニンへの置換を持ついわゆる「ＮＡＮＡ」Ｆｃ変異体を含む、二以上のアミノ酸位置２６５、２６９、２７０、２９７及び３２７で置換を持つＦｃ変異体を含む（米国特許第７３３２５８１）。
ＩｇＧ４抗体は、ＩｇＧ１抗体と比較して、Ｆｃ受容体への結合親和性の低下及びエフェクター機能の減少を呈示する。従って、いくつかの実施態様において、本発明のＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子のＦｃドメインは、ＩｇＧ４のＦｃドメイン、特にヒトＩｇＧ４のＦｃドメインである。一実施態様において、ＩｇＧ４のＦｃドメインは、位置Ｓ２２８でアミノ酸置換、具体的にはアミノ酸置換Ｓ２２８Ｐを含む。Ｆｃ受容体に対する結合親和性及び／又はそのエフェクター機能を更に低下させるために、一実施態様において、ＩｇＧ４のＦｃドメインは、位置Ｌ２３５でアミノ酸置換、具体的にはアミノ酸置換Ｌ２３５Ｅを含む。その他の実施態様において、ＩｇＧ４のＦｃドメインは、位置Ｐ２３９でアミノ酸置換、具体的にはアミノ酸置換Ｐ３２９Ｇを含む。特定の実施態様において、ＩｇＧ４のＦｃドメインは、位置Ｓ２２８、Ｌ２３５及びＰ３２９でアミノ酸置換、具体的にはアミノ酸置換Ｓ２２８Ｐ、Ｌ２３５Ｅ及びＰ３２９Ｇを含む。このようなＩｇＧ４のＦｃドメイン変異体とそのＦｃγ受容体結合特性は欧州特許出願ＥＰ１１１６０２５１．２に記載され、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
ｂ）Ｆｃ受容体結合及び／又はエフェクター機能の増加
逆に、例えば、イムノコンジュゲートが高度に特異的な腫瘍抗原を標的としているときなど、イムノコンジュゲートのＦｃ受容体結合及び／又はエフェクター機能を維持あるいは向上させることが望ましい状況があり得る。従って、特定の実施態様において、本発明のイムノコンジュゲートのＦｃドメインは、Ｆｃ受容体に対する結合親和性が増加しているように操作される。増加する結合親和性は、Ｆｃ受容体へのＦｃドメインの結合親和性の少なくとも２倍、少なくとも５倍、または少なくとも１０倍の増加であってもよい。一実施態様において、Ｆｃ受容体は活性化Ｆｃ受容体である。特異的な実施態様において、Ｆｃ受容体は活性化Ｆｃγ受容体である。一実施態様において、Ｆｃ受容体は、ＦｃγＲＩＩＩａ、ＦｃγＲＩおよびＦｃγＲＩＩａの群から選択される。特定の実施態様において、Ｆｃ受容体はＦｃγＲＩＩＩａである。
一つのこのような実施態様において、Ｆｃドメインは、非操作型Ｆｃドメインと比較して改変されたオリゴ糖構造を有するように設計される。特定のこのような実施態様において、Ｆｃドメインは、非操作型Ｆｃドメインと比較して非フコシル化オリゴ糖の増加した割合を含む。より具体的な実施態様において、イムノコンジュゲートのＦｃドメインにおけるＮ−結合型糖鎖の少なくとも約２０％、約２５％、約３０％、約３５％、約４０％、約４５％、約５０％、約５５％、約６０％、約６５％、約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９５％、または約１００％、特に少なくとも約５０％、より具体的には少なくとも約７０％は非フコシル化型である。非フコシル化オリゴ糖は、ハイブリッドまたは複合タイプのものであってもよい。別の特定の実施態様において、Ｆｃドメインは、非操作型Ｆｃドメインと比較して二分オリゴ糖の増加した割合を含む。より具体的な実施態様において、イムノコンジュゲートのＦｃドメインにおけるＮ−結合型糖鎖の少なくとも約１０％、約１５％、約２０％、約２５％、約３０％、約３５％、約４０％、約４５％、約５０％、約５５％、約６０％、約６５％、約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９５％、または約１００％、特に少なくとも約５０％、より具体的には少なくとも約７０％は二分型である。二分型オリゴ糖は、ハイブリッドまたは複合タイプのものであってもよい。さらに別の具体的な実施態様において、Ｆｃドメインは、非操作型Ｆｃドメインと比較して、二分された非フコシル化オリゴ糖の増加した割合を含む。より具体的な実施態様において、イムノコンジュゲートのＦｃドメインにおけるＮ−結合型糖鎖の少なくとも約１０％、約１５％、約２０％、約２５％、約３０％、約３５％、約４０％、約４５％、約５０％、約５５％、約６０％、約６５％、約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９５％、または約１００％、特に少なくとも約１５％、より具体的には少なくとも約２５％、少なくとも約３５％、少なくとも約５０％は非フコシル化型である。二分型、非フコシル化型オリゴ糖は、ハイブリッドまたは複合タイプのものであってもよい。
イムノコンジュゲートのＦｃドメイン中のオリゴ糖構造は、当該分野で周知の方法によって、例えばUmana et al., Nat Biotechnol 17, 176-180 (1999)又はFerrara et al., Biotechn Bioeng 93, 851-861 (2006)で説明したように、ＭＡＬＤＩ ＴＯＦ質量分析法により分析することができる。非フコシル化型オリゴ糖の割合は、Ａｓｎ２９７（例えば、複合、ハイブリッド、高マンノース構造）に付着し、ＭＡＬＤＩ ＴＯＦ ＭＳにより、Ｎ−グリコシダーゼＦ処理したサンプルで特定される全オリゴ糖に対するフコース残基が欠損したオリゴ糖の量である。ＡＳＮ２９７は、Ｆｃドメインの位置２９７（Ｆｃ領域残基のＥＵ番号）付近で位置するアスパラギン残基を意味するが、しかし、Ａｓｎ２９７はまた、位置２９７の約±３個上流または下流に、すなわち、免疫グロブリンのわずかな配列の変化に起因して位置２９４と３００の間に位置することができる。二分型、又は二分された非フコシル化型、オリゴ糖は同様に決定される。
イムノコンジュゲートのＦｃドメインにおけるグリコシル化の修飾は、グリコシルトランスフェラーゼ活性を有する１以上のポリペプチドの改変されたレベルを発現するように操作されている宿主細胞におけるイムノコンジュゲートの産生から生じ得る。
一実施態様において、非操作型Ｆｃドメインと比較して、イムノコンジュゲートのＦｃドメインは、１つ又はそれ以上のグリコシルトランスフェラーゼの改変された活性を有する宿主細胞においてイムノコンジュゲートを生成することによって、改変されたオリゴ糖構造を有するように操作される。グリコシルトランスフェラーゼには、例えば、β（１，４）−Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＩＩＩ（ＧｎＴＩＩＩ）、β（１，４）−ガラクトシルトランスフェラーゼ（ＧａｌＴ）、β（１，２）−Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＩ（ＧｎＴＩ）、β（１，２）−Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＩＩ（ＧｎＴＩＩ）及びα（１，６）−フコシルトランスフェラーゼを含む。特定の実施態様において、非操作型Ｆｃドメインと比較して、イムノコンジュゲートのＦｃドメインは、β（１，４）−Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＩＩＩ（ＧｎＴ ＩＩＩ）の増加した活性を有する宿主細胞においてイムノコンジュゲートを生成することによって、非フコシル化型オリゴ糖の増加した割合を含むように操作される。さらにより具体的な実施態様において、宿主細胞はさらに、増加したα−マンノシダーゼＩＩ（ＭａｎＩＩ）活性を有している。本発明のイムノコンジュゲートを糖鎖操作のために使用することができる糖鎖工学の方法論は、Umana et al., Nat Biotechnol 17, 176-180 (1999); Ferrara et al., Biotechn Bioeng 93, 851-861 (2006)；国際公開第９９／５４３４２号（米国特許第６，６０２，６８４号；欧州特許第１０７１７００号）；国際公開第２００４／０６５５４０（米国特許出願公開第２００４／０２４１８１７号；欧州特許第１５８７９２１号）、国際公開第０３／０１１８７８号（米国特許出願公開第２００３／０１７５８８４号）に詳細に記載されており、その各々の内容はその全体が参照により本明細書に組み込まれる。
一般に、本明細書で議論された細胞株を含む培養細胞株の任意のタイプが、変更されたグリコシル化パターンを有するイムノコンジュゲートの産生のための細胞株を生成するために使用できる。特定の細胞株は、ＣＨＯ細胞、ＢＨＫ細胞、ＮＳ０細胞、ＳＰ２／０細胞、ＹＯ骨髄腫細胞、Ｐ３Ｘ６３マウス骨髄腫細胞、ＰＥＲ細胞、ＰＥＲ．Ｃ６細胞又はハイブリドーマ細胞、及び他の哺乳動物細胞が挙げられる。特定の実施態様において、宿主細胞は、β（１，４）−Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＩＩＩ（ＧｎＴＩＩＩ）活性を有する一以上のポリペプチドの増加したレベルを発現するように操作されている。特定の実施態様において、宿主細胞は、α−マンノシダーゼＩＩ（ＭａｎＩＩ）活性を有する一以上のポリペプチドの増加したレベルを発現するように更に操作されている。特定の実施態様において、ＧｎＴＩＩＩ活性を有するポリペプチドは、異種性ゴルジ常駐性ポリペプチドのゴルジ局在化ドメイン及びＧｎＴＩＩＩの触媒ドメインを含む融合ポリペプチドである。特に、前記ゴルジ局在化ドメインは、マンノシダーゼＩＩのゴルジ局在化ドメインである。このような融合ポリペプチドを生成し、増加したエフェクター機能を有する抗体を産生するためにそれらを使用するための方法は Ferrara et al., Biotechn Bioeng 93, 851-861 (2006)及び国際公開第２００４／０６５５４０号に開示され、その内容全体が参照により本明細書に援用される。
本発明のイムノコンジュゲートのコード配列および／またはグリコシルトランスフェラーゼ活性を有するポリペプチドのコード配列を含有し、生物学的に活性な遺伝子産物を発現する宿主細胞は、例えば、ＤＮＡ−ＤＮＡ又はＤＮＡ−ＲＮＡハイブリダイゼーション；「マーカー」遺伝子機能の有無；宿主細胞内でのそれぞれのｍＲＮＡ転写物の発現により測定される転写のレベルを評価すること；又はイムノアッセイによって、又はその生物学的活性−当技術分野でよく知られている方法によって測定されるような遺伝子産物の検出により同定され得る。ＧｎＴＩＩＩ又はＭａｎ ＩＩ活性は、例えば、ＧｎＴＩＩＩ又はＭａｎＩＩの生合成産物に結合するレクチンを用いることによって検出することができる。そのようなレクチンの例は二分するＧｌｃＮＡｃを含むオリゴ糖に優先的に結合するＥ４−ＰＨＡレクチンである。ＧｎＴＩＩＩ又はＭａｎＩＩ活性を有するポリペプチドの生合成産物（すなわち、特定のオリゴ糖構造）はまた、前記ポリペプチドを発現する細胞により生産される糖タンパク質から遊離されたオリゴ糖の質量分析によって検出することができる。あるいは、ＧｎＴＩＩＩ又はＭａｎＩＩ活性を有するポリペプチドで操作された細胞によって産生されるイムノコンジュゲートによって媒介される、エフェクター機能の増加および／またはＦｃ受容体の結合の増加を測定する機能アッセイを使用してもよい。
別の実施態様において、非操作型Ｆｃドメインと比較して、Ｆｃドメインは、β（１，６）−Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＩＩＩ（ＧｎＴ ＩＩＩ）の増加した活性を有する宿主細胞においてイムノコンジュゲートを生成することによって、非フコシル化型オリゴ糖の増加した割合を含むように操作される。低下したα（１，６）フコシルトランスフェラーゼ活性を有する宿主細胞は、α（１，６）−フコシルトランスフェラーゼ遺伝子が破壊されたか又は別の方法で失活された、例えばノックアウトされた細胞であってもよい（Yamane-Ohnuki et al., Biotech Bioeng 87, 614 (2004); Kanda et al., Biotechnol Bioeng 94(4), 680-688 (2006); Niwa et al., J Immunol Methods 306, 151-160 (2006)を参照）。
脱フコシル化されたイムノコンジュゲートを産生することができる細胞株の他の例には、タンパク質フコース化が欠失したＬｅｃ１３ ＣＨＯ細胞が含まれる（Ripka et al., Arch Biochem Biophys 249, 533-545 (1986)；米国特許出願番号ＵＳ２００３／０１５７１０８；及び国際公開第２００４／０５６３１２号、具体的には実施例１１）。本発明のイムノコンジュゲートは、欧州特許第１ １７６ １９５ Ａ１号、国際公開第０３／０８４５７０号、国際公開第０３／０８５１１９号及び米国特許出願公開第２００３／０１１５６１４号、第２００４／０９３６２１号、第２００４／１１０２８２号、第２００４／１１０７０４号、第２００４／１３２１４０号、米国特許第６，９４６，２９２号（Ｋｙｏｗａ）に開示された技術に従って、例えばイムノコンジュゲートの産生に使用される宿主細胞におけるＧＤＰ−フコーストランスポータータンパク質の活性を低下または消滅させることにより、Ｆｃドメイン内のフコース残基を減少させるように代替的に糖鎖操作をすることができる。
本発明の糖鎖操作型イムノコンジュゲートはまた、国際公開第２００３／０５６９１４号（GlycoFi, Inc.）又は国際公開第２００４／０５７００２号及び国際公開第２００４／０２４９２７号（Greenovation）に教授されるものなど、修飾された糖タンパク質を産生する発現系において生産することができる。
一つの実施態様において、イムノコンジュゲートのＦｃドメインは、非操作型Ｆｃドメインと比較して増加したエフェクター機能を有するように操作される。エフェクター機能の増加は、限定されないが、以下の一つ又は複数を含み得る：補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）の増加、抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）の増加、抗体依存性細胞食作用（ＡＤＣＰ）の増加、サイトカイン分泌の増加、抗原提示細胞による免疫複合体媒介性の抗原取り込みの増加、ＮＫ細胞への結合の増加、マクロファージへの結合の増加、単球への結合の増加、多形核細胞への結合の増加、直接的シグナル伝達誘導性アポトーシスの増加、標的結合抗体の架橋の増加、樹状細胞成熟の増加、又はＴ細胞プライミングの増加。
一実施態様において、エフェクター機能の増加は、ＣＤＣの増加、ＡＤＣＣの増加、ＡＤＣＰの増加、及びサイトカイン分泌の増加から選択される一又は複数である。特定の実施態様において、エフェクター機能の増加とはＡＤＣＣの増加である。一実施態様において、操作型Ｆｃドメイン（又は操作型Ｆｃドメインを含むイムノコンジュゲート）により誘導されるＡＤＣＣは、非操作型Ｆｃドメイン（又は非操作型Ｆｃドメインを含むイムノコンジュゲート）により誘導されるＡＤＣＣと比べて少なくとも２倍増加している。
エフェクター部分
本発明における使用のためのエフェクター部分は、一般に、例えばシグナル伝達経路を介して細胞活性に影響を与えるポリペプチドである。従って、本発明において有用なイムノコンジュゲートのエフェクター部分は、細胞内応答を調節する細胞膜の外側からシグナルを伝達する受容体媒介性シグナル伝達と関連することができる。例えば、イムノコンジュゲートのエフェクター部分は、サイトカインとすることができる。特定の実施態様において、エフェクター部分はヒトである。
特定の実施態様において、エフェクター部分は、単鎖エフェクター部分である。特定の実施態様において、エフェクター部分はサイトカインである。有用なサイトカインの例としては、限定されないが、ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＬ−１α、ＩＬ−１β、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−８、ＩＬ−１０、ＩＬ−１２、ＩＬ−２１、ＩＦＮ−α、ＩＦＮ−β、ＩＦＮ−γ、ＭＩＰ−１α、ＭＩＰ−１β、ＴＧＦ−β、ＴＮＦ−α、及びＴＮＦ−βを含む。一実施態様において、イムノコンジュゲートのエフェクター部分は、ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＬ−２、ＩＬ−７、ＩＬ−８、ＩＬ−１０、ＩＬ−１２、ＩＬ−１５、ＩＬ−２１、ＩＦＮ−α、ＩＦＮ−γ、ＭＩＰ−１α、ＭＩＰ−１β及びＴＧＦ−βの群から選択されるサイトカインである。一実施態様において、イムノコンジュゲートのエフェクター部分は、ＩＬ−２、ＩＬ−７、ＩＬ−１０、ＩＬ−１２、ＩＬ−１５、ＩＦＮ−α及びＩＦＮ−γの群から選択されるサイトカインである。特定の実施態様において、サイトカインのエフェクター部分は、Ｎ−および／またはＯ−グリコシル化部位を除去するために変異される。グリコシル化の排除は、組換え生産で得られる生成物の均質性を向上させる。
特定の実施態様において、イムノコンジュゲートのエフェクター部分はＩＬ−２である。
特定の実施態様において、ＩＬ−２のエフェクター部分は、活性化Ｔリンパ球細胞における増殖、活性化Ｔリンパ球細胞における分化、細胞傷害性Ｔ細胞（ＣＴＬ）活性、活性化Ｂ細胞における増殖、活性化Ｂ細胞における分化、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞内の増殖、ＮＫ細胞における分化、活性化Ｔ細胞またはＮＫ細胞によるサイトカイン分泌、及びＮＫ／リンパ球活性化キラー（ＬＡＫ）抗腫瘍細胞毒性からなる群から選択される一又は複数の細胞応答を誘発することができる。別の特定の実施態様において、ＩＬ−２エフェクター部分は、ＩＬ−２受容体のαサブユニットへの結合親和性が低下した変異体ＩＬ−２エフェクター部分である。β−およびγ−サブユニット（それぞれＣＤ１２２及びＣＤ１３２としても知られている）と一緒に、α−サブユニット（ＣＤ２５とも呼ばれる）は、ヘテロ三量体高親和性ＩＬ−２受容体を形成し、一方β−およびγ−サブユニットのみからなる二量体受容体は、中間体親和性ＩＬ−２受容体と呼ばれている。その全体が参照により本明細書に組み込まれるＰＣＴ特許出願番号ＰＣＴ／ＥＰ２０１２／０５１９９１に記載されるように、ＩＬ−２受容体のαサブユニットへの結合が減少した変異体ＩＬ−２ポリペプチドは、野生型ＩＬ−２ポリペプチドと比較して、調節性Ｔ細胞におけるＩＬ−２シグナル伝達を誘導する能力の低下を有し、Ｔ細胞においてより少ない活性化誘導細胞死（ＡＩＣＤ）を誘導し、そしてインビボで減少した毒性プロファイルを有する。毒性が低下したそのようなエフェクター部分の使用は、Ｆｃドメインの存在に起因して長い血清半減期を有する、本発明によるイムノコンジュゲートに特に有利である。一実施態様において、本発明によるイムノコンジュゲートの変異体ＩＬ−２エフェクター部分は、非変異型ＩＬ−２エフェクター部分に比べて、ＩＬ−２受容体のαサブユニット（ＣＤ２５）に対する変異体ＩＬ−２エフェクター部分の親和性を低減又は消失させるが、（ＩＬ−２受容体のβ−及びγ−サブユニットからなる）中間体親和性ＩＬ−２受容体への変異体ＩＬ−２エフェクター部分の親和性を保持した少なくとも１つのアミノ酸変異を含む。一実施態様において、一又は複数のアミノ酸変異はアミノ酸置換である。特定の実施態様において、変異体ＩＬ−２エフェクター部分は、ヒトＩＬ−２の残基４２、４５、及び７２に対応する位置から選択される一つ、二つ、または三つの位置で、一つ、二つ又は三つのアミノ酸置換を含む。より特定の実施態様において、変異体ＩＬ−２エフェクター部分は、ヒトＩＬ−２の残基４２、４５、及び７２に対応する位置で三つのアミノ酸置換を含む。更により具体的な実施態様において、変異体ＩＬ−２エフェクター部分は、アミノ酸置換のＦ４２Ａ、Ｙ４５Ａ及びＬ７２Ｇを含むヒトＩＬ−２である。一実施態様において、変異体ＩＬ−２エフェクター部分はさらに、ヒトＩＬ−２の位置３に相当する位置でアミノ酸変異を含み、これはＩＬ−２のＯ−グリコシル化部位を除去する。特に、前記の付加的アミノ酸変異は、アラニン残基によってトレオニン残基を置換するアミノ酸置換である。本発明において有用な特定の変異体ＩＬ−２エフェクター部分は、ヒトＩＬ−２の残基、３、４２、４５および７２に対応する位置に４個のアミノ酸置換を含む。具体的なアミノ酸置換はＴ３Ａ、Ｆ４２Ａ、Ｙ４５Ａ及びＬ７２Ｇである。ＰＣＴ特許出願番号ＰＣＴ／ＥＰ２０１２／０５１９９１及びその添付の実施例に示すように、四重変異体ＩＬ−２ポリペプチド（ＩＬ−２ ｑｍ）は、ＣＤ２５への検出可能な結合、Ｔ細胞においてアポトーシスを誘導する能力の低下、Ｔｒｅｇ細胞においてＩＬ−２シグナル伝達を誘導する能力の低下、及びインビボでの毒性プロファイルの減少を呈示しない。しかし、それはエフェクター細胞においてＩＬ−２シグナル伝達を活性化する能力を保持しており、エフェクター細胞の増殖を誘導し、ＮＫ細胞による二次的サイトカインとしてＩＦＮ−γを生成する。
上記実施態様のいずれかに記載のＩＬ−２又は変異体ＩＬ−２エフェクター部分は、発現の増加又は安定性などのさらなる利点を提供する付加的な変異を含み得る。例えば、位置１２５のシステインは、ジスルフィド架橋ＩＬ−２二量体の形成を回避するためにアラニンなどの中性アミノ酸で置換されてもよい。従って、特定の実施態様において、本発明によるイムノコンジュゲートのＩＬ−２又は変異体ＩＬ−２エフェクター部分は、ヒトＩＬ−２の残基１２５に対応する位置で付加的なアミノ酸変異を含む。一実施態様において、前記付加的アミノ酸変異はアミノ酸置換Ｃ１２５Ａである。
特定の実施態様において、イムノコンジュゲートのＩＬ−２エフェクター部分は、配列番号２のポリペプチド配列を含む。別の特定の実施態様において、イムノコンジュゲートのＩＬ−２エフェクター部分は、配列番号３のポリペプチド配列を含む。
別の実施態様において、イムノコンジュゲートのエフェクター部分はＩＬ−１２である。特定の実施態様において、前記ＩＬ−１２のエフェクター部分は、単鎖ＩＬ−１２のエフェクター部分である。更により具体的な実施態様において、単鎖ＩＬ−１２のエフェクター部分は、配列番号４のポリペプチド配列を含む。一実施態様において、ＩＬ−１２のエフェクター部分は、ＮＫ細胞における増殖、ＮＫ細胞における分化、Ｔ細胞における増殖、及びＴ細胞分化からなる群から選択される細胞応答の一つ以上を誘発することができる。
別の実施態様において、イムノコンジュゲートのエフェクター部分はＩＬ−１０である。特定の実施態様において、前記ＩＬ−１０のエフェクター部分は、単鎖ＩＬ−１０のエフェクター部分である。更により具体的な実施態様において、単鎖ＩＬ−１０のエフェクター部分は、配列番号５のポリペプチド配列を含む。特定の実施態様において、前記ＩＬ−１０のエフェクター部分は、単鎖ＩＬ−１０のエフェクター部分である。更により具体的な実施態様において、単鎖ＩＬ−１０のエフェクター部分は、配列番号６のポリペプチド配列を含む。一実施態様において、ＩＬ−１０のエフェクター部分は、サイトカイン分泌の阻害、抗原提示細胞による抗原提示の阻害、酸素ラジカルの放出の減少、及びＴ細胞増殖の阻害からなる群から選択される細胞応答の一つ以上を誘発することができる。エフェクター部分はＩＬ−１０であることを特徴とする本発明によるイムノコンジュゲートは、炎症の下方制御のため、例えば炎症性疾患の治療において特に有用である。
別の実施態様において、イムノコンジュゲートのエフェクター部分はＩＬ−１５である。特定の実施態様において、前記ＩＬ−１５エフェクター部分は、ＩＬ−１５受容体のαサブユニットへの結合親和性が低下した変異体ＩＬ−１５エフェクター部分である。理論に縛られることを望むものではないが、ＩＬ−１５受容体のαサブユニットへのへの結合が減少した変異体ＩＬ−１５ポリペプチドは、身体全体の線維芽細胞に特異的に結合する能力が低下しており、野生型ＩＬ−１５ポリペプチドと比較して、改善された薬物動態及び毒性プロファイルをもたらす。毒性が低下したエフェクター部分、例えば説明され変異体ＩＬ−２及び変異体ＩＬ−１５エフェクター部分の使用は、Ｆｃドメインの存在に起因して長い血清半減期を有する、本発明によるイムノコンジュゲートに特に有利である。一実施態様において、本発明によるイムノコンジュゲートの変異体ＩＬ−２エフェクター部分は、非変異型ＩＬ−１５エフェクター部分に比べて、ＩＬ−１５受容体のαサブユニットに対する変異体ＩＬ−１５エフェクター部分の親和性を低減又は消失させるが、（ＩＬ−１５／ＩＬ−２受容体のβ−及びγ−サブユニットからなる）中間体親和性ＩＬ−１５／ＩＬ−２受容体への変異体ＩＬ−１５エフェクター部分の親和性を保持した少なくとも１つのアミノ酸変異を含む。一実施態様では、アミノ酸変異はアミノ酸置換である。特定の実施態様において、変異体ＩＬ−１５エフェクター部分は、ヒトＩＬ−１５の残基５３に対応する位置でアミノ酸置換を含む。より具体的な実施態様において、変異体ＩＬ−１５エフェクター部分は、アミノ酸置換のＥ５３Ａを含むヒトＩＬ−１５である。一実施態様において、変異体ＩＬ−１５エフェクター部分はさらに、ヒトＩＬ−１５の位置７９に相当する位置でアミノ酸変異を含み、これはＩＬ−１５のＮ−グリコシル化部位を除去する。特に、前記の付加的アミノ酸変異は、アラニン残基によってアスパラギン残基を置換するアミノ酸置換である。更により具体的な実施態様において、ＩＬ−１５のエフェクター部分は、配列番号７のポリペプチド配列を含む。一実施態様において、ＩＬ−１５のエフェクター部分は、活性化Ｔリンパ球細胞における増殖、活性化Ｔリンパ球細胞における分化、細胞傷害性Ｔ細胞（ＣＴＬ）活性、活性化Ｂ細胞における増殖、活性化Ｂ細胞における分化、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞内の増殖、ＮＫ細胞における分化、活性化Ｔ細胞またはＮＫ細胞によるサイトカイン分泌、及びＮＫ／リンパ球活性化キラー（ＬＡＫ）抗腫瘍細胞毒性からなる群から選択される一又は複数の細胞応答を誘発することができる。
イムノコンジュゲートにおけるエフェクター部分として有用な変異型サイトカイン分子は、当技術分野で公知の遺伝的または化学的方法を用いて、欠失、置換、挿入または修飾によって調製することができる。遺伝的方法は、コードするＤＮＡ配列、ＰＣＲ、遺伝子合成等の部位特異的変異誘発を含むことができる。正しいヌクレオチド変化は、例えば配列決定によって検証することができる。置換又は挿入は、天然ならびに非天然のアミノ酸残基を含むことができる。アミノ酸修飾は、グリコシル化部位の付加又は除去又は炭水化物連結など化学修飾の周知の方法を含む。
一実施態様において、イムノコンジュゲートのエフェクター部分、特に一本鎖のエフェクター部分はＧＭ−ＣＳＦである。特定の実施態様において、ＧＭ−ＣＳＦのエフェクター部分は、顆粒球、単球又は樹状細胞において増殖及び／又は分化を誘発することができる。一実施態様において、イムノコンジュゲートのエフェクター部分、特に一本鎖のエフェクター部分はＩＦＮ−αである。特定の実施態様において、ＩＦＮ−αのエフェクター部分は、ウイルス感染細胞におけるウイルス複製の阻害、及び主要組織適合性複合体Ｉ（ＭＨＣ Ｉ）の発現の上方制御からなる群から選択される細胞応答の一以上を誘発することができる。別の特定の実施態様では、ＩＦＮ−αのエフェクター部分は、腫瘍細胞において増殖を阻害することができる。一実施態様において、イムノコンジュゲートのエフェクター部分、特に一本鎖のエフェクター部分はＩＦＮ−γである。特定の実施態様において、ＩＦＮ−γのエフェクター部分は、マクロファージ活性の増加、ＭＨＣ分子の発現の増加、及びＮＫ細胞活性の増加の群から選択される細胞応答の一以上を誘発することができる。一実施態様において、イムノコンジュゲートのエフェクター部分、特に一本鎖のエフェクター部分はＩＬ−７である。特定の実施態様において、ＩＬ−７エフェクター部分は、Ｔ及び／又はＢリンパ球の増殖を誘発することができる。一実施態様において、イムノコンジュゲートのエフェクター部分、特に一本鎖のエフェクター部分はＩＬ−８である。特定の実施態様において、ＩＬ−８のエフェクター部分は、好中球において走化性を誘発することができる。一実施態様において、イムノコンジュゲートのエフェクター部分、特に一本鎖のエフェクター部分はＭＩＰ−１αである。特定の実施態様において、ＭＩＰ−１αのエフェクター部分は、単球およびＴリンパ球細胞において走化性を誘発することができる。一実施態様において、イムノコンジュゲートのエフェクター部分、特に一本鎖のエフェクター部分はＭＩＰ−１βである。特定の実施態様において、ＭＩＰ−１βのエフェクター部分は、単球およびＴリンパ球細胞において走化性を誘発することができる。一実施態様において、イムノコンジュゲートのエフェクター部分、特に一本鎖のエフェクター部分はＴＧＦ−βである。特定の実施態様において、ＴＧＦ−βのエフェクター部分は、単球における走化性、マクロファージにおける走化性、活性化マクロファージにおけるＩＬ−１発現の上方制御、及び活性化Ｂ細胞におけるＩｇＡ発現の上方制御からなる群から選択される細胞応答の一以上を誘発することができる。
一実施態様において、本発明のイムノコンジュゲートは、対照エフェクター部分のそれよりも少なくとも約１、１．５、２、２．５、３、３．５、４、４．５、５、５．５、６、６．５、７、７．５、８、８．５、９、９．５又は１０倍以上大きい解離定数（ＫＤ）で、エフェクター部分の受容体に結合する。別の実施態様において、イムノコンジュゲートは、二つ以上のエフェクター部分を含むイムノコンジュゲート分子に対応するものよりも少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、または１０倍大きいＫＤでエフェクター部分の受容体に結合する。別の実施態様において、イムノコンジュゲートは、二つ以上のエフェクター部分を含むイムノコンジュゲートに対応するものよりも約１０倍大きい解離定数ＫＤでエフェクター部分の受容体に結合する。
抗原結合部分
本発明のイムノコンジュゲートは、少なくとも一の抗原結合部分を含む。特定の実施態様において、イムノコンジュゲートは、二つの抗原結合部分、すなわち第一及び第二の抗原結合部分を含む。一実施態様において、イムノコンジュゲートは二以下の抗原結合部分を含む。
本発明のイムノコンジュゲートの抗原結合部分は、一般に、特定の抗原決定基に結合し、かつ標的部位、例えば抗原決定基を担う特定のタイプの腫瘍細胞又は腫瘍間質に結合する実体（例えば、エフェクター部分及びＦｃドメイン）を指向することができるポリペプチド分子である。イムノコンジュゲートは、例えば、腫瘍細胞の表面上で、ウイルス感染細胞の表面上で、他の疾患細胞の表面上で、血清中に遊離して、および／または細胞外マトリックス（ＥＣＭ）中に見つけることができる抗原決定基に結合することができる。
特定の実施態様において、抗原結合部分は、炎症部位、又はウイルス感染細胞上で、腫瘍細胞上又は腫瘍細胞環境において提示された抗原など病状と関連した抗原を指向する。
腫瘍抗原の非限定の例は、ＭＡＧＥ、ＭＡＲＴ−１／Ｍｅｌａｎ−Ａ、ｇｐ１００、ジペプチジルペプチダーゼＩＶ（ＤＰＰＩＶ）、アデノシンデアミナーゼ−結合タンパク質（ＡＤＡｂｐ）、シクロフィリンｂ、結腸直腸関連抗原（ＣＲＣ）−Ｃ０１７−１Ａ／ＧＡ７３３、癌胎児抗原（ＣＥＡ）及びその免疫原性エピトープＣＡＰ−１及びＣＡＰ−２、ｅｔｖ６、ａｍｌ１、前立腺特異的抗原（ＰＳＡ）及びその免疫原性エピトープＰＳＡ−１、ＰＳＡ−２、及びＰＳＡ−３、前立腺−特異的膜抗原（ＰＳＭＡ）、Ｔ−細胞受容体／ＣＤ３−ゼータ鎖、腫瘍抗原のＭＡＧＥ−ファミリー（例えばＭＡＧＥ−Ａ１、ＭＡＧＥ−Ａ２、ＭＡＧＥ−Ａ３、ＭＡＧＥ−Ａ４、ＭＡＧＥ−Ａ５、ＭＡＧＥ−Ａ６、ＭＡＧＥ−Ａ７、ＭＡＧＥ−Ａ８、ＭＡＧＥ−Ａ９、ＭＡＧＥ−Ａ１０、ＭＡＧＥ−Ａ１１、ＭＡＧＥ−Ａ１２、ＭＡＧＥ−Ｘｐ２（ＭＡＧＥ−Ｂ２）、ＭＡＧＥ−Ｘｐ３（ＭＡＧＥ−Ｂ３）、ＭＡＧＥ−Ｘｐ４（ＭＡＧＥ−Ｂ４）、ＭＡＧＥ−Ｃ１、ＭＡＧＥ−Ｃ２、ＭＡＧＥ−Ｃ３、ＭＡＧＥ−Ｃ４、ＭＡＧＥ−Ｃ５）、腫瘍抗原のＧＡＧＥ−ファミリー（例えばＧＡＧＥ−１、ＧＡＧＥ−２、ＧＡＧＥ−３、ＧＡＧＥ−４、ＧＡＧＥ−５、ＧＡＧＥ−６、ＧＡＧＥ−７、ＧＡＧＥ−８、ＧＡＧＥ−９）、ＢＡＧＥ、ＲＡＧＥ、ＬＡＧＥ−１、ＮＡＧ、ＧｎＴ−Ｖ、ＭＵＭ−１、ＣＤＫ４、チロシナーゼ、ｐ５３、ＭＵＣファミリー、ＨＥＲ２／ｎｅｕ、ｐ２１ｒａｓ、ＲＣＡＳ１、α−フェトプロテイン、Ｅ−カドヘリン、α−カテニン、β−カテニン及びγ−カテニン、ｐ１２０ｃｔｎ、ｇｐ１００ Ｐｍｅｌ１１７、ＰＲＡＭＥ、ＮＹ−ＥＳＯ−１、ｃｄｃ２７、大腸腺腫症タンパク質（ＡＰＣ）、フォドリン、コネキシン３７、Ｉｇ−イディオタイプ、ｐ１５、ｇｐ７５、ＧＭ２及びＧＤ２ガングリオシド、ウイルス産物、例えばヒトパピローマウイルスタンパク質、腫瘍抗原のＳｍａｄファミリー、ｌｍｐ−１、Ｐ１Ａ、ＥＢＶ−コード核内抗原（ＥＢＮＡ）−１、脳グリコーゲンホスホリラーゼ、ＳＳＸ−１、ＳＳＸ−２（ＨＯＭ−ＭＥＬ−４０）、ＳＳＸ−１、ＳＳＸ−４、ＳＳＸ−５、ＳＣＰ−１及びＣＴ−７、及びｃ−ｅｒｂＢ−２を含む。
ウィルス性抗原の非限定例は、インフルエンザウイルス血球凝集素、エプスタイン・バーウイルスＬＭＰ−１、Ｃ型肝炎ウイルスＥ２糖タンパク質、ＨＩＶ ｇｐ１６０、及びＨＩＶ ｇｐ１２０を含む。
ＥＣＭ抗原の非限定例は、シンデカン、ヘパラナーゼ、インテグリン、オステオポンチン、リンク、カドヘリン、ラミニン、ラミニンタイプＥＧＦ、レクチン、フィブロネクチン、ノッチ、テネイシン、及びマトリキシン（matrixin）を含む。
本発明のイムノコンジュゲートは、細胞表面抗原の以下の具体的な非限定例に結合できる：ＦＡＰ、Ｈｅｒ２、ＥＧＦＲ、ＩＧＦ−１Ｒ、ＣＤ２２（Ｂ−細胞受容体）、ＣＤ２３（低親和性のＩｇＥ受容体）、ＣＤ３０（サイトカイン受容体）、ＣＤ３３（骨髄系細胞表面抗原）、ＣＤ４０（腫瘍壊死因子受容体）、ＩＬ−６Ｒ（ＩＬ６受容体）、ＣＤ２０、ＭＣＳＰ、及びＰＤＧＦβＲ（β血小板由来増殖因子受容体）。特定の実施態様において、抗原はヒト抗原である。
特定の実施態様において、抗原結合部分は、腫瘍細胞上または腫瘍細胞環境において提示される抗原を指向する。他の実施態様において、抗原結合部分は、炎症部位で提示される抗原を指向する。より具体的な実施態様において、抗原結合部分は、線維芽細胞活性化タンパク質（ＦＡＰ）、テネイシンＣのＡ１ドメイン（ＴＮＣ Ａ１）、テネイシン−ＣのＡ２ドメイン（ＴＮＣ Ａ２）、フィブロネクチンのエキストラドメインＢ（ＥＤＢ）、癌胎児性抗原（ＣＥＡ）、及びメラノーマ関連コンドロイチン硫酸プロテオグリカン（ＭＣＳＰ）からなる群から選択される抗原を指向する。
一実施態様において、本発明のイムノコンジュゲートは、２つ又はそれ以上の抗原結合部分を含み、これらの抗原結合部分のそれぞれは、特に、同じ抗原決定基に結合することを特徴とする。
抗原結合部分は、抗原決定基に特異的に結合することを保持する抗体またはその断片の任意のタイプとすることができる。抗体断片は、限定するものではないが、ＶＨ断片、ＶＬ断片、Ｆａｂ断片、Ｆ（ａｂ’）２断片、ｓｃＦｖ断片、Ｆｖ断片、ミニボディ、ダイアボディ、トリアボディ、及びテトラボディ（例えばHudson and Souriau、Nature Med 9、129-134 (2003)を参照）を含む。特定の実施態様において、抗原結合部分は、Ｆａｂ分子である。一実施態様において、前記Ｆａｂ分子はヒトである。別の実施態様において、前記Ｆａｂ分子はヒト化されている。また別の実施態様では、Ｆａｂ分子は、ヒト重鎖及び軽鎖定常領域を含む。
一実施態様において、イムノコンジュゲートは、フィブロネクチンのエキストラドメインＢ（ＥＤＢ）に特異的である少なくとも一、典型的には二以上の抗原結合部分を含む。別の実施態様において、イムノコンジュゲートは、ＥＤＢのエピトープに対する結合をモノクローナル抗体Ｌ１９と競合することができる、少なくとも一、典型的には二以上の抗原結合部分を含む。例えば、ＰＣＴ公開ＷＯ２００７／１２８５６３ Ａ１（参照によりその全体が援用される）を参照。
さらに別の実施態様において、イムノコンジュゲートは、Ｌ１９モノクローナル抗体に由来するＦａｂ重鎖が、ノブ修飾を含むＦｃドメインサブユニットとカルボキシ末端のペプチド結合を共有し、同様にＩＬ−２ポリペプチドとカルボキシ末端ペプチド結合を共有するポリペプチド配列を含む。更により具体的な実施態様において、イムノコンジュゲートは配列番号２１５のポリペプチド配列、または機能性を保持したその変異体を含む。一実施態様において、イムノコンジュゲートは、Ｌ１９モノクローナル抗体に由来するＦａｂ重鎖が、ホール修飾を含むＦｃドメインサブユニットとカルボキシ末端のペプチド結合を共有するポリペプチド配列を含む。更により具体的な実施態様において、イムノコンジュゲートは配列番号２１３のポリペプチド配列、または機能性を保持したその変異体を含む。別の実施態様において、イムノコンジュゲートはＬ１９モノクローナル抗体由来のＦａｂ軽鎖を含む。更により具体的な実施態様において、イムノコンジュゲートは配列番号２１７のポリペプチド配列、または機能性を保持したその変異体を含む。更に別の実施態様において、イムノコンジュゲートは配列番号２１３、配列番号２１５及び配列番号２１７のポリペプチド配列、または機能性を保持したその変異体を含む。別の特定の実施態様において、ポリペプチドは、共有結合、例えばジスルフィド結合により連結されている。幾つかの実施態様において、Ｆｃドメインサブユニットの各々は、アミノ酸置換のＬ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ及びＰ３２９Ｇを含む。
特定の実施態様において、イムノコンジュゲートは、配列番号２１６の配列に対して少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は９９％同一であるポリヌクレオチド配列によりコードされるポリペプチド配列を含む。別の特定の実施態様において、イムノコンジュゲートは、配列番号２１６のポリヌクレオチド配列によりコードされるポリペプチド配列を含む。別の特定の実施態様において、ポリヌクレオチド配列は、配列番号２１４の配列に対して少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は９９％同一であるポリヌクレオチド配列によりコードされるポリペプチド配列を含む。更に別の特定の実施態様において、イムノコンジュゲートは、配列番号２１４のポリヌクレオチド配列によりコードされるポリペプチド配列を含む。別の特定の実施態様において、ポリヌクレオチド配列は、配列番号２１８の配列に対して少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は９９％同一であるポリヌクレオチド配列によりコードされるポリペプチド配列を含む。更に別の特定の実施態様において、イムノコンジュゲートは、配列番号２１８のポリヌクレオチド配列によりコードされるポリペプチド配列を含む。
一実施態様において、本発明のイムノコンジュゲートは、テネイシンＣのＡ１ドメイン（ＴＮＣ−Ａ１）に特異的である少なくとも一、典型的には二以上の抗原結合部分を含む。別の実施態様において、イムノコンジュゲートは、ＴＮＣ−Ａ１のエピトープに対する結合をモノクローナル抗体Ｆ１９と競合することができる、少なくとも一、典型的には二以上の抗原結合部分を含む。例えば、ＰＣＴ公開ＷＯ２００７／１２８５６３ Ａ１（参照によりその全体が援用される）を参照。一実施態様において、イムノコンジュゲートは、テネイシンＣのＡ１及び／又はＡ４ドメイン（ＴＮＣ−Ａ１又はＴＮＣ−Ａ４又はＴＮＣ−Ａ１／Ａ４）に特異的である少なくとも一、典型的には二以上の抗原結合部分を含む。
特定の実施態様において、イムノコンジュゲートの抗原結合部分は、配列番号３３又は配列番号３５の何れかに対して少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一である重鎖可変領域、又は機能性を保持したその変異体を含む。別の特定の実施態様において、イムノコンジュゲートの抗原結合部分は、配列番号２９又は配列番号３１の何れかに対して少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一である軽鎖可変領域、又は機能性を保持したその変異体を含む。更に具体的な実施態様において、イムノコンジュゲートの抗原結合部分は、配列番号３３又は配列番号３５の何れかに対して少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一である重鎖可変領域、又は機能性を保持したその変異体、及び配列番号２９又は配列番号３１の何れかに対して少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一である軽鎖可変領域、又は機能性を保持したその変異体を含む。
別の特定の実施態様において、イムノコンジュゲートの抗原結合部分の重鎖可変領域配列は、配列番号３４又は配列番号３６の何れかに対して少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％同一であるポリヌクレオチド配列によってコードされる。更に別の特定の実施態様では、イムノコンジュゲートの抗原結合部分の重鎖可変領域配列は、配列番号３４又は配列番号３６の何れかのポリヌクレオチド配列によりコードされる。別の特定の実施態様において、イムノコンジュゲートの抗原結合部分の軽鎖可変領域配列は、配列番号３０又は配列番号３２の何れかに対して少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％同一であるポリヌクレオチド配列によってコードされる。更に別の特定の実施態様では、イムノコンジュゲートの抗原結合部分の軽鎖可変領域配列は、配列番号３０又は配列番号３４の何れかのポリヌクレオチド配列によりコードされる。
一実施態様において、イムノコンジュゲートは、テネイシンＣのＡ１ドメインに特異的なＦａｂ重鎖が、ノブ修飾を含むＦｃドメインサブユニットとカルボキシ末端のペプチド結合を共有し、同様にＩＬ−２ポリペプチドとカルボキシ末端ペプチド結合を共有するポリペプチド配列を含む。別の実施態様において、イムノコンジュゲートは、テネイシンＣのＡ１ドメインに特異的なＦａｂ重鎖が、ホール修飾を含むＦｃドメインサブユニットとカルボキシ末端のペプチド結合を共有するポリペプチド配列を含む。より特定の実施態様において、イムノコンジュゲートは、これらのポリペプチド配列の両方を含む。別の実施態様において、イムノコンジュゲートは、テネイシンＣのＡ１ドメインに特異的なＦａｂ軽鎖を更に含む。別の特定の実施態様において、ポリペプチドは共有結合性、例えばジスルフィド結合により連結されている。幾つかの実施態様において、Ｆｃドメインサブユニットの各々は、アミノ酸置換のＬ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ及びＰ３２９Ｇを含む。
特定の実施態様において、イムノコンジュゲートは、テネイシンＣのＡ２ドメイン（ＴＮＣ−Ａ２）に特異的である少なくとも一、典型的には二以上の抗原結合部分を含む。特定の実施態様において、イムノコンジュゲートの抗原結合部分は、配列番号２７、配列番号１５９、配列番号１６３、配列番号１６７、配列番号１７１，配列番号１７５、配列番号１７９、配列番号１８３及び配列番号１８７の群から選択される配列に対して少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％同一である重鎖可変領域、又は機能性を保持したその変異体を含む。別の特定の実施態様において、イムノコンジュゲートの抗原結合部分は、配列番号２３、配列番号２５；配列番号１５７、配列番号１６１、配列番号１６５、配列番号１６９、配列番号１７３、配列番号１７７、配列番号１８１及び配列番号１８５の群から選択される配列に対して少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％同一である軽鎖可変領域、又は機能性を保持したその変異体を含む。より特定の実施態様において、イムノコンジュゲートの抗原結合部分は、配列番号２７、配列番号１５９、配列番号１６３、配列番号１６７、配列番号１７１、配列番号１７５、配列番号１７９、配列番号１８３及び配列番号１８７の群から選択される配列に対して少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％同一である重鎖可変領域、又は機能性を保持したその変異体、及び配列番号２３、配列番号２５；配列番号１５７、配列番号１６１、配列番号１６５、配列番号１６９、配列番号１７３、配列番号１７７、配列番号１８１及び配列番号１８５の群から選択される配列に対して少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％同一である軽鎖可変領域、又は機能性を保持したその変異体を含む。特定の実施態様において、イムノコンジュゲートの抗原結合部分は、配列番号２７の重鎖可変領域配列、及び配列番号２５の軽鎖可変領域配列を含む。
別の特定の実施態様において、イムノコンジュゲートの抗原結合部分の重鎖可変領域配列は、配列番号２８、配列番号１６０、配列番号１６４、配列番号１６８、配列番号１７２、配列番号１７６、配列番号１８０、配列番号１８４及び配列番号１８８の群から選択される配列に対して少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％同一であるポリヌクレオチド配列によってコードされる。別の特定の実施態様において、イムノコンジュゲートの抗原結合部分の重鎖可変領域配列は、配列番号２８、配列番号１６０、配列番号１６４、配列番号１６８、配列番号１７２、配列番号１７６、配列番号１８０、配列番号１８４及び配列番号１８８の群から選択されるポリヌクレオチド配列によってコードされる。別の特定の実施態様において、イムノコンジュゲートの抗原結合部分の軽鎖可変領域配列は、配列番号２４、配列番号２６、配列番号１５８、配列番号１６２、配列番号１６６、配列番号１７０、配列番号１７４、配列番号１７８、配列番号１８２及び配列番号１８６の群から選択される配列に対して少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％同一であるポリヌクレオチド配列によってコードされる。別の特定の実施態様において、イムノコンジュゲートの抗原結合部分の軽鎖可変領域配列は、配列番号２４、配列番号２６、配列番号１５８、配列番号１６２、配列番号１６６、配列番号１７０、配列番号１７４、配列番号１７８、配列番号１８２及び配列番号１８６．の群から選択されるポリヌクレオチド配列によってコードされる。
更に別の実施態様において、イムノコンジュゲートは、テネイシンＣのＡ２ドメインに特異的なＦａｂ重鎖が、ホール修飾を含むＦｃドメインサブユニットとカルボキシ末端のペプチド結合を共有し、同様にＩＬ−１０ポリペプチドとカルボキシ末端ペプチド結合を共有するポリペプチド配列を含む。更により具体的な実施態様において、イムノコンジュゲートは配列番号２３５又は配列番号２３７のポリペプチド配列、または機能性を保持したその変異体を含む。一実施態様において、イムノコンジュゲートは、テネイシンＣのＡ２ドメインに特異的なＦａｂ重鎖が、ノブ修飾を含むＦｃドメインサブユニットとカルボキシ末端のペプチド結合を共有するポリペプチド配列を含む。更により具体的な実施態様において、イムノコンジュゲートは配列番号２３３のポリペプチド配列、または機能性を保持したその変異体を含む。別の実施態様において、イムノコンジュゲートは、テネイシンＣのＡ２ドメインに特異的なＦａｂ軽鎖を含む。別の特定の実施態様において、イムノコンジュゲートは配列番号２３９のポリペプチド配列又は機能性を保持したその変異体を含む。別の実施態様において、イムノコンジュゲートは配列番号２３３、配列番号２３５及び配列番号２３９のポリペプチド配列、または機能性を保持したその変異体を含む。更に別の実施態様において、イムノコンジュゲートは配列番号２３３、配列番号２３７及び配列番号２３９のポリペプチド配列、または機能性を保持したその変異体を含む。別の特定の実施態様において、ポリペプチドは、共有結合、例えばジスルフィド結合により連結されている。幾つかの実施態様において、Ｆｃドメインサブユニットの各々は、アミノ酸置換のＬ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ及びＰ３２９Ｇを含む。
特定の実施態様において、イムノコンジュゲートは、配列番号２３６又は配列番号２３８の配列に対して少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は９９％同一であるポリヌクレオチド配列によりコードされるポリペプチド配列を含む。別の特定の実施態様において、イムノコンジュゲートは、配列番号２３６又は配列番号２３８のポリヌクレオチド配列によりコードされるポリペプチド配列を含む。別の特定の実施態様において、ポリヌクレオチド配列は、配列番号２３４の配列に対して少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は９９％同一であるポリヌクレオチド配列によりコードされるポリペプチド配列を含む。更に別の特定の実施態様において、イムノコンジュゲートは、配列番号２３４のポリヌクレオチド配列によりコードされるポリペプチド配列を含む。別の特定の実施態様において、ポリヌクレオチド配列は、配列番号２４０の配列に対して少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は９９％同一であるポリヌクレオチド配列によりコードされるポリペプチド配列を含む。更に別の特定の実施態様において、イムノコンジュゲートは、配列番号２４０のポリヌクレオチド配列によりコードされるポリペプチド配列を含む。
更に別の実施態様において、イムノコンジュゲートは、テネイシンＣのＡ２ドメインに特異的なＦａｂ重鎖が、ノブ修飾を含むＦｃドメインサブユニットとカルボキシ末端のペプチド結合を共有し、同様にＩＬ−２ポリペプチドとカルボキシ末端ペプチド結合を共有するポリペプチド配列を含む。更により具体的な実施態様において、イムノコンジュゲートは配列番号２８５のポリペプチド配列、または機能性を保持したその変異体を含む。一実施態様において、イムノコンジュゲートは、テネイシンＣのＡ２ドメインに特異的なＦａｂ重鎖が、ホール修飾を含むＦｃドメインサブユニットとカルボキシ末端のペプチド結合を共有するポリペプチド配列を含む。更により具体的な実施態様において、イムノコンジュゲートは配列番号２８７のポリペプチド配列、または機能性を保持したその変異体を含む。別の実施態様において、イムノコンジュゲートは、テネイシンＣのＡ２ドメインに特異的なＦａｂ軽鎖を含む。別の特定の実施態様において、イムノコンジュゲートは配列番号２３９のポリペプチド配列又は機能性を保持したその変異体を含む。別の実施態様において、イムノコンジュゲートは配列番号２８５、配列番号２８７及び配列番号２３９のポリペプチド配列、または機能性を保持したその変異体を含む。別の特定の実施態様において、ポリペプチドは、共有結合、例えばジスルフィド結合により連結されている。幾つかの実施態様において、Ｆｃドメインサブユニットの各々は、アミノ酸置換のＬ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ及びＰ３２９Ｇを含む。
特定の実施態様において、イムノコンジュゲートは、配列番号２８６の配列に対して少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は９９％同一であるポリヌクレオチド配列によりコードされるポリペプチド配列を含む。別の特定の実施態様において、イムノコンジュゲートは、配列番号２８６のポリヌクレオチド配列によりコードされるポリペプチド配列を含む。別の特定の実施態様において、ポリヌクレオチド配列は、配列番号２８８の配列に対して少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は９９％同一であるポリヌクレオチド配列によりコードされるポリペプチド配列を含む。更に別の特定の実施態様において、イムノコンジュゲートは、配列番号２８８のポリヌクレオチド配列によりコードされるポリペプチド配列を含む。別の特定の実施態様において、ポリヌクレオチド配列は、配列番号２４０の配列に対して少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は９９％同一であるポリヌクレオチド配列によりコードされるポリペプチド配列を含む。更に別の特定の実施態様において、イムノコンジュゲートは、配列番号２４０のポリヌクレオチド配列によりコードされるポリペプチド配列を含む。
特定の実施態様において、イムノコンジュゲートは、線維芽細胞活性化タンパク質（ＦＡＰ）に特異的である少なくとも一、典型的には二以上の抗原結合部分を含む。具体的な実施態様において、イムノコンジュゲートの抗原結合部分は、配列番号４１、配列番号４５、配列番号４７、配列番号５１、配列番号５５、配列番号５９、配列番号６３、配列番号６７、配列番号７１、配列番号７５、配列番号７９、配列番号８３、配列番号８７、配列番号９１、配列番号９５、配列番号９９、配列番号１０３、配列番号１０７、配列番号１１１、配列番号１１５、配列番号１１９、配列番号１２３、配列番号１２７、配列番号１３１、配列番号１３５、配列番号１３９、配列番号１４３、配列番号１４７、配列番号１５１及び配列番号１５５からなる群から選択される配列に対して、少なくともおよそ８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一である重鎖可変領域配列、又は機能性を保持したその変異体を含む。別の具体的な実施態様において、イムノコンジュゲートの抗原結合部分は、配列番号３７、配列番号３９、配列番号４３、配列番号４９、配列番号５３、配列番号５７、配列番号６１、配列番号６５、配列番号６９、配列番号７３、配列番号７７、配列番号８１、配列番号８５、配列番号８９、配列番号９３、配列番号９７、配列番号１０１、配列番号１０５、配列番号１０９、配列番号１１３、配列番号１１７、配列番号１２１、配列番号１２５、配列番号１２９、配列番号１３３、配列番号１３７、配列番号１４１、配列番号１４５、配列番号１４９及び配列番号１５３，からなる群から選択される配列に対して、少なくともおよそ８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一である軽鎖可変領域配列、又は機能性を保持したその変異体を含む。より具体的な実施態様において、イムノコンジュゲートの抗原結合部分は、配列番号４１、配列番号４５、配列番号４７、配列番号５１、配列番号５５、配列番号５９、配列番号６３、配列番号６７、配列番号７１、配列番号７５、配列番号７９、配列番号８３、配列番号８７、配列番号９１、配列番号９５、配列番号９９、配列番号１０３、配列番号１０７、配列番号１１１、配列番号１１５、配列番号１１９、配列番号１２３、配列番号１２７、配列番号１３１、配列番号１３５、配列番号１３９、配列番号１４３、配列番号１４７、配列番号１５１及び配列番号１５５からなる群から選択される配列に対して、少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一である重鎖可変領域配列又は機能性を保持したその変異体、及び配列番号３７、配列番号３９、配列番号４３、配列番号４９、配列番号５３、配列番号５７、配列番号６１、配列番号６５、配列番号６９、配列番号７３、配列番号７７、配列番号８１、配列番号８５、配列番号８９、配列番号９３、配列番号９７、配列番号１０１、配列番号１０５、配列番号１０９、配列番号１１３、配列番号１１７、配列番号１２１、配列番号１２５、配列番号１２９、配列番号１３３、配列番号１３７、配列番号１４１、配列番号１４５、配列番号１４９及び配列番号１５３からなる群から選択される配列に対して、少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一である軽鎖可変領域配列又は機能性を保持したその変異体を含む。特定の実施態様において、イムノコンジュゲートの抗原結合部分は、配列番号１１１の重鎖可変領域配列、及び配列番号１０９の軽鎖可変領域配列を含む。更なる特定の実施態様において、イムノコンジュゲートの抗原結合部分は、配列番号１４３の重鎖可変領域配列、及び配列番号１４１の軽鎖可変領域配列を含む。特定の実施態様において、イムノコンジュゲートの抗原結合部分は、配列番号５１の重鎖可変領域配列、及び配列番号４９の軽鎖可変領域配列を含む。
別の具体的な実施態様において、イムノコンジュゲートの抗原結合部分の重鎖可変領域配列は、配列番号４２、配列番号４６、配列番号４８、配列番号５２、配列番号５６、配列番号６０、配列番号６４、配列番号６８、配列番号７２、配列番号７６、配列番号８０、配列番号８４、配列番号８８、配列番号９２、配列番号９６、配列番号１００、配列番号１０４、配列番号１０８、配列番号１１２、配列番号１１６、配列番号１２０、配列番号１２４、配列番号１２８、配列番号１３２、配列番号１３６、配列番号１４０、配列番号１４４、配列番号１４８、配列番号１５２、及び配列番号１５６からなる群から選択される配列に対して、少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％，又は９９％同一であるポリヌクレオチド配列によりコードされる。更に別の具体的な実施態様において、イムノコンジュゲートの抗原結合部分の重鎖可変領域配列は、配列番号４２、配列番号４６、配列番号４８、配列番号５２、配列番号５６、配列番号６０、配列番号６４、配列番号６８、配列番号７２、配列番号７６、配列番号８０、配列番号８４、配列番号８８、配列番号９２、配列番号９６、配列番号１００、配列番号１０４、配列番号１０８、配列番号１１２、配列番号１１６、配列番号１２０、配列番号１２４、配列番号１２８、配列番号１３２、配列番号１３６、配列番号１４０、配列番号１４４、配列番号１４８、配列番号１５２、及び配列番号１５６からなる群から選択されるポリヌクレオチド配列によりコードされる。別の具体的な実施態様において、イムノコンジュゲートの抗原結合部分の軽鎖可変領域配列は、配列番号３８、配列番号４０、配列番号４４、配列番号５０、配列番号５４、配列番号５８、配列番号６２、配列番号６６、配列番号７０、配列番号７４、配列番号７８、配列番号８２、配列番号８６、配列番号９０、配列番号９４、配列番号９８、配列番号１０２、配列番号１０６、配列番号１１０、配列番号１１４、配列番号１１８、配列番号１２２、配列番号１２６、配列番号１３０、配列番号１３４、配列番号１３８、配列番号１４２、配列番号１４６、配列番号１５０，及び配列番号１５４からなる群から選択される配列に対して、少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％，又は９９％同一であるポリヌクレオチド配列によりコードされる。更に別の具体的な実施態様において、イムノコンジュゲートの抗原結合部分の軽鎖可変領域配列は、配列番号３８、配列番号４０、配列番号４４、配列番号５０、配列番号５４、配列番号５８、配列番号６２、配列番号６６、配列番号７０、配列番号７４、配列番号７８、配列番号８２、配列番号８６、配列番号９０、配列番号９４、配列番号９８、配列番号１０２、配列番号１０６、配列番号１１０、配列番号１１４、配列番号１１８、配列番号１２２、配列番号１２６、配列番号１３０、配列番号１３４、配列番号１３８、配列番号１４２、配列番号１４６、配列番号１５０、及び配列番号１５４からなる群から選択されるポリヌクレオチド配列によりコードされる。
一実施態様において、イムノコンジュゲートは、ＦＡＰに特異的なＦａｂ重鎖が、ノブ修飾を含むＦｃドメインサブユニットとカルボキシ末端のペプチド結合を共有し、同様にＩＬ−２ポリペプチドとカルボキシ末端ペプチド結合を共有するポリペプチド配列を含む。より具体的な実施態様において、イムノコンジュゲートは、配列番号１９５、配列番号１９７、配列番号２０３、配列番号２０９、配列番号２６９、配列番号２７１及び配列番号２７３、又は機能性を保持したその変異体を含む。一実施態様において、イムノコンジュゲートは、ＦＡＰに特異的なＦａｂ重鎖が、ノブ修飾を含むＦｃドメインサブユニットとカルボキシ末端のペプチド結合を共有し、同様にＩＬ−１５ポリペプチドとカルボキシ末端ペプチド結合を共有するポリペプチド配列を含む。更により具体的な実施態様において、イムノコンジュゲートは配列番号１９９のポリペプチド配列、または機能性を保持したその変異体を含む。一実施態様において、イムノコンジュゲートは、ＦＡＰに特異的なＦａｂ重鎖が、ホール修飾を含むＦｃドメインサブユニットとカルボキシ末端のペプチド結合を共有するポリペプチド配列を含む。更に具体的な実施態様において、イムノコンジュゲートは配列番号１９３、配列番号２０１及び配列番号２０７からなる群から選択されるポリペプチド配列、または機能性を保持したその変異体を含む。別の実施態様において、イムノコンジュゲートはＦＡＰに特異的なＦａｂ軽鎖を含む。より具体的な実施態様において、イムノコンジュゲートは配列番号２０５又は配列番号２１１のポリペプチド配列、または機能性を保持したその変異体を含む。別の実施態様において、イムノコンジュゲートは、配列番号２０５のポリペプチド配列、配列番号１９３のポリペプチド配列、及び配列番号１９５、配列番号１９７、配列番号１９９及び配列番号２６９の群から選択されるポリペプチド配列、又は機能性を保持したその変異体を含む。更に別の実施態様において、イムノコンジュゲートは配列番号２０１、配列番号２０３及び配列番号２０５のポリペプチド配列、または機能性を保持したその変異体を含む。更に別の実施態様において、イムノコンジュゲートは配列番号２０７、配列番号２０９及び配列番号２１１のポリペプチド配列、または機能性を保持したその変異体を含む。更に別の実施態様において、イムノコンジュゲートは配列番号２０５、配列番号１９３及び配列番号２６９のポリペプチド配列、または機能性を保持したその変異体を含む。更に別の実施態様において、イムノコンジュゲートは配列番号２１１、配列番号２０７及び配列番号２７１のポリペプチド配列、または機能性を保持したその変異体を含む。更に別の実施態様において、イムノコンジュゲートは配列番号２１１、配列番号２０７及び配列番号２７３のポリペプチド配列、または機能性を保持したその変異体を含む。別の特定の実施態様において、ポリペプチドは、共有結合、例えばジスルフィド結合により連結されている。幾つかの実施態様において、Ｆｃドメインサブユニットの各々は、アミノ酸置換のＬ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ及びＰ３２９Ｇを含む。
更に別の実施態様において、イムノコンジュゲートは、ＦＡＰに特異的なＦａｂ重鎖が、ホール修飾を含むＦｃドメインサブユニットとカルボキシ末端のペプチド結合を共有し、同様にＩＬ−１０ポリペプチドとカルボキシ末端ペプチド結合を共有するポリペプチド配列を含む。より具体的な実施態様において、イムノコンジュゲートは配列番号２４３又は配列番号２４５のポリペプチド配列、または機能性を保持したその変異体を含む。一実施態様において、イムノコンジュゲートは、ＦＡＰに特異的なＦａｂ重鎖が、ノブ修飾を含むＦｃドメインサブユニットとカルボキシ末端のペプチド結合を共有するポリペプチド配列を含む。更により具体的な実施態様において、イムノコンジュゲートは配列番号２４１のポリペプチド配列、または機能性を保持したその変異体を含む。別の実施態様において、イムノコンジュゲートはＦＡＰに特異的なＦａｂ軽鎖を含む。更により具体的な実施態様において、イムノコンジュゲートは配列番号２０５のポリペプチド配列、または機能性を保持したその変異体を含む。別の実施態様において、イムノコンジュゲートは配列番号２０５、配列番号２４１及び配列番号２４３のポリペプチド配列、または機能性を保持したその変異体を含む。更に別の実施態様において、イムノコンジュゲートは配列番号２０５、配列番号２４１及び配列番号２４５のポリペプチド配列、または機能性を保持したその変異体を含む。別の特定の実施態様において、ポリペプチドは、共有結合、例えばジスルフィド結合により連結されている。幾つかの実施態様において、Ｆｃドメインサブユニットの各々は、アミノ酸置換のＬ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ及びＰ３２９Ｇを含む。
特定の実施態様において、イムノコンジュゲートは、配列番号１９６、配列番号１９８、配列番号２００、配列番号２０４、配列番号２１０、配列番号２４４、配列番号２４６、配列番号２７０、配列番号２７２及び配列番号２７４の群から選択される配列に対して少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％同一であるポリヌクレオチド配列によってコードされるポリペプチド配列を含む。別の具体的な実施態様において、イムノコンジュゲートは、配列番号１９６、配列番号１９８、配列番号２００、配列番号２０４、配列番号２１０、配列番号２４４、配列番号２４６、配列番号２７０、配列番号２７２及び配列番号２７４の群から選択されるポリヌクレオチド配列によってコードされるポリペプチド配列を含む。特定の実施態様において、イムノコンジュゲートは、配列番号１９４、配列番号２０２、配列番号２０８及び配列番号２４２の群から選択される配列に対して少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は９９％同一であるポリヌクレオチド配列によりコードされるポリペプチド配列を含む。更に別の具体的な実施態様において、イムノコンジュゲートは配列番号１９４、配列番号２０２、配列番号２０８及び配列番号２４２からなる群から選択されるポリヌクレオチド配列によりコードされるポリペプチド配列を含む。別の特定の実施態様において、イムノコンジュゲートは、配列番号２０６又は配列番号２１２の配列に対して少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は９９％同一であるポリヌクレオチド配列によりコードされるポリペプチド配列を含む。更に別の特定の実施態様において、イムノコンジュゲートは、配列番号２０６又は配列番号２１２のポリヌクレオチド配列によりコードされるポリペプチド配列を含む。
一実施態様において、イムノコンジュゲートは、癌胎児性抗原（ＣＥＡ）に特異的である少なくとも一、典型的には二以上の抗原結合部分を含む。特定の実施態様において、イムノコンジュゲートの抗原結合部分は、配列番号１９１又は配列番号２９５に対して少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一である重鎖可変領域配列、又は機能性を保持したその変異体を含む。別の特定の実施態様において、イムノコンジュゲートの抗原結合部分は、配列番号１８９又は配列番号２９３に対して少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一である軽鎖可変領域配列、又は機能性を保持したその変異体を含む。より具体的な実施態様において、イムノコンジュゲートの抗原結合部分は、配列番号１９１の配列に対して少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一である重鎖可変領域配列、又は機能性を保持したその変異体、及び配列番号１８９の配列に対して少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一である軽鎖可変領域配列、又は機能性を保持したその変異体を含む。更に具体的な実施態様において、イムノコンジュゲートの抗原結合部分は、配列番号２９５の配列に対して少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一である重鎖可変領域配列、又は機能性を保持したその変異体、及び配列番号２９３の配列に対して少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一である軽鎖可変領域配列、又は機能性を保持したその変異体を含む。
別の具体的な実施態様において、イムノコンジュゲートの抗原結合部分の重鎖可変領域配列は、配列番号１９２又は配列番号２９６の配列に対して少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％同一であるポリヌクレオチド配列によってコードされる。更に別の特定の実施態様では、イムノコンジュゲートの抗原結合部分の重鎖可変領域配列は、配列番号１９２又は配列番号２９６のポリヌクレオチド配列によりコードされる。別の具体的な実施態様において、イムノコンジュゲートの抗原結合部分の軽鎖可変領域配列は、配列番号１９０又は配列番号２９４の配列に対して少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％同一であるポリヌクレオチド配列によってコードされる。更に別の特定の実施態様では、イムノコンジュゲートの抗原結合部分の軽鎖可変領域配列は、配列番号１９０又は配列番号２９４のポリヌクレオチド配列によりコードされる。
一実施態様において、イムノコンジュゲートは、ＣＥＡに特異的なＦａｂ重鎖が、ノブ修飾を含むＦｃドメインサブユニットとカルボキシ末端のペプチド結合を共有し、同様にＩＬ−２ポリペプチドとカルボキシ末端ペプチド結合を共有するポリペプチド配列を含む。より具体的な実施態様において、イムノコンジュゲートは配列番号２２９、配列番号２７５、配列番号２７７及び配列番号２７９からなる群から選択されるポリペプチド配列、または機能性を保持したその変異体を含む。一実施態様において、イムノコンジュゲートは、ＣＥＡに特異的なＦａｂ重鎖が、ホール修飾を含むＦｃドメインサブユニットとカルボキシ末端のペプチド結合を共有するポリペプチド配列を含む。より具体的な実施態様において、イムノコンジュゲートは配列番号２２７又は配列番号２８２のポリペプチド配列、または機能性を保持したその変異体を含む。別の実施態様において、イムノコンジュゲートはＣＥＡに特異的なＦａｂ軽鎖を含む。より具体的な実施態様において、イムノコンジュゲートは配列番号２３１又は配列番号２８３のポリペプチド配列、または機能性を保持したその変異体を含む。別の実施態様において、イムノコンジュゲートは配列番号２２７、配列番号２２９及び配列番号２３１のポリペプチド配列、または機能性を保持したその変異体を含む。別の実施態様において、イムノコンジュゲートは配列番号２７５、配列番号２８１及び配列番号２８３のポリペプチド配列、または機能性を保持したその変異体を含む。別の実施態様において、イムノコンジュゲートは配列番号２７７、配列番号２８１及び配列番号２８３のポリペプチド配列、または機能性を保持したその変異体を含む。別の実施態様において、イムノコンジュゲートは配列番号２７９、配列番号２８１及び配列番号２８３のポリペプチド配列、または機能性を保持したその変異体を含む。別の特定の実施態様において、ポリペプチドは、共有結合、例えばジスルフィド結合により連結されている。幾つかの実施態様において、Ｆｃドメインポリペプチド鎖は、アミノ酸置換のＬ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ及びＰ３２９Ｇを含む。
具体的な実施態様において、イムノコンジュゲートは、配列番号２３０、配列番号２７６、配列番号２７８及び配列番号２８０の群から選択される配列に対して少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は９９％同一であるポリヌクレオチド配列によりコードされるポリペプチド配列を含む。別の具体的な実施態様において、イムノコンジュゲートは配列番号２３０、配列番号２７６、配列番号２７８及び配列番号２８０からなる群から選択されるポリヌクレオチド配列によりコードされるポリペプチド配列を含む。別の特定の実施態様において、イムノコンジュゲートは、配列番号２２８又は配列番号２８２の配列に対して少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は９９％同一であるポリヌクレオチド配列によりコードされるポリペプチド配列を含む。更に別の特定の実施態様において、イムノコンジュゲートは、配列番号２２８又は配列番号２８２のポリヌクレオチド配列によりコードされるポリペプチド配列を含む。別の特定の実施態様において、イムノコンジュゲートは、配列番号２３２又は配列番号２８４の配列に対して少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は９９％同一であるポリヌクレオチド配列によりコードされるポリペプチド配列を含む。更に別の特定の実施態様において、イムノコンジュゲートは、配列番号２３２又は配列番号２８４のポリヌクレオチド配列によりコードされるポリペプチド配列を含む。
幾つかの実施態様において、イムノコンジュゲートは、エフェクター部分のポリペプチドが、ノブ修飾を含むＦｃドメインサブユニットとカルボキシ末端のペプチド結合を共有するポリペプチド配列を含む。より具体的な実施態様において、イムノコンジュゲートは、配列番号２４７、配列番号２４９及び配列番号２５１からなる群から選択されるポリペプチド配列、または機能性を保持したその変異体を含む。一つのそのような実施態様において、イムノコンジュゲートは、ＦＡＰに特異的なＦａｂ重鎖が、ホール修飾を含むＦｃドメインサブユニットとカルボキシ末端のペプチド結合を共有するポリペプチド配列を更に含む。より具体的な実施態様において、配列番号１９３、配列番号２０１及び配列番号２０７の群から選択されるポリペプチド配列、または機能性を保持したその変異体を更に含む。別のそのような実施態様において、イムノコンジュゲートは、ＥＤＢ、ＴＮＣ Ａ１、ＴＮＣ Ａ２又はＣＥＡに特異的なＦａｂ重鎖が、ホール修飾を含むＦｃドメインサブユニットとカルボキシ末端のペプチド結合を共有するポリペプチド配列を更に含む。幾つかの実施態様において、Ｆｃドメインサブユニットの各々は、アミノ酸置換のＬ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ及びＰ３２９Ｇを含む。上の実施態様の何れかに従って、イムノコンジュゲートは、対応する抗原に特異的なＦａｂ軽鎖を更に含み得る。
本発明のイムノコンジュゲートは、配列番号２３、２５、２７、２９、３１、３３、３５、３７、３９、４１、４３、４５、４７、４９、５１、５３、５５、５７、５９、６１、６３、６５、６７、６９、７１、７３、７５、７７、７９、８１、８３、８５、８７、８９、９１、９３、９５、９７、９９、１０１、１０３、１０５、１０７、１０９、１１１、１１３、１１５、１１７、１１９、１２１、１２３、１２５、１２７、１２９、１３１、１３３、１３５、１３７、１３９、１４１、１４３、１４５、１４７、１４９、１５１、１５３、１５５、１５７、１５９、１６１、１６３、１６５、１６７、１６９、１７１、１７３、１７５、１７７、１７９、１８１、１８３、１８５、１８７、１８９、１９１、２９３、２９５、１９３、１９５、１９７、１９９、２０１、２０３、２０５、２０７、２０９、２１１、２１３、２１５、２１７、２２７、２２９、２３１、２３３、２３５、２３７、２３９、２４１、２４３、２４５、２４７、２４９、２５１、２６９、２７１、２７３、２７５、２７７、２７９、２８１、２８３、２８５及び２８７に明記される配列に対して少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％同一である配列を有するものを、その機能性断片又は変異体を含み、含む。本発明はまた、保存的アミノ酸置換を有するこれらの配列を含んでなるイムノコンジュゲートを包含する。
ポリヌクレオチド
本発明はさらに、本明細書に記載されるイムノコンジュゲートまたはその断片をコードする単離されたポリヌクレオチドを提供する。
本発明のポリヌクレオチドは、配列番号２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６、３８、４０、４２、４４、４６、４８、５０、５２、５４、５６、５８、６０、６２、６４、６６、６８、７０、７２、７４、７６、７８、８０、８２、８４、８６、８８、９０、９２、９４、９６、９８、１００、１０２、１０４、１０６、１０８、１１０、１１２、１１４、１１６、１１８、１２０、１２２、１２４、１２６、１２８、１３０、１３２、１３４、１３６、１３８、１４０、１４２、１４４、１４６、１４８、１５０、１５２、１５４、１５６、１５８、１６０、１６２、１６４、１６６、１６８、１７０、１７２、１７４、１７６、１７８、１８０、１８２、１８４、１８６、１８８、１９０、１９２、２９４、２９６、１９４、１９６、１９８、２００、２０２、２０４、２０６、２０８、２１０、２１２、２１４、２１６、２１８、２２８、２３０、２３２、２３４、２３６、２３８、２４０、２４２、２４４、２４６、２４８、２５０、２５２、２７０、２７２、２７４、２７６、２７８、２８０、２８２、２８４、２８６及び２８８に明記される配列に対して少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％同一であるものを、その機能性断片又は変異体を含み、含む。
本発明のイムノコンジュゲートをコードするポリヌクレオチドは、イムノコンジュゲート全体をコードする単一のポリヌクレオチドとして、又は共発現される複数（例えば、２つ以上の）ポリヌクレオチドとして発現され得る。共発現されるポリヌクレオチドによりコードされるポリペプチドは、例えばジスルフィド結合又は別の手段を介して会合することができ、機能性イムノコンジュゲートを形成しうる。例えば、抗原結合部分の軽鎖部分は、抗原結合部分、Ｆｃドメインサブユニット及び任意でエフェクター部分の重鎖部分を含んでなるイムノコンジュゲートの部分に由来する別々のポリヌクレオチドによりコードされ得る。共発現されたとき、重鎖ポリペプチドが軽鎖ポリペプチドと会合し、抗原結合部分を形成する。別の例において、第一の抗原結合部分の重鎖部分、２つのＦｃドメインサブユニットの一方及びエフェクター部分を含んでなるイムノコンジュゲートの部分は、第二の抗原結合部分の重鎖部分及び２つのＦｃドメインサブユニットの他方を含んでなるイムノコンジュゲートの部分に由来の別々のポリヌクレオチドによりコードされることができる。共発現されると、Ｆｃドメインのサブユニットが会合しＦｃドメインを形成する。
一実施態様において、単離された本発明のポリヌクレオチドは、イムノコンジュゲートの断片をコードする。第一の抗原結合部分、２つのサブユニットからなるＦｃドメイン、単一のエフェクター部分を含んでなるイムノコンジュゲートの断片をコードし、ここで抗原結合部分は、重鎖可変領域および軽鎖可変領域を含む抗原結合ドメイン、特にＦａｂ分子である。一実施態様において、本発明の単離されたポリヌクレオチドは、第一の抗原結合部分の重鎖、Ｆｃドメインのサブユニット、及びエフェクター部分をコードしている。別の実施態様において、本発明の単離されたポリヌクレオチドは、第一の抗原結合部分の重鎖、及びＦｃドメインのサブユニットをコードしている。更に別の実施態様において、本発明の単離されたポリヌクレオチドは、Ｆｃドメインのサブユニット及びエフェクター部分をコードする。更に具体的な実施態様において、単離されたポリヌクレオチドは、Ｆａｂ重鎖がＦｃドメインサブユニットとカルボキシ末端ペプチド結合を共有するポリペプチドをコードする。別の具体的な実施態様において、単離されたポリヌクレオチドは、Ｆｃドメインサブユニットがエフェクター部分のポリペプチドとカルボキシ末端ペプチド結合を共有するポリペプチドをコードする。更に別の実施態様において、単離されたポリヌクレオチドは、Ｆａｂ重鎖がＦｃドメインサブユニットとカルボキシ末端のペプチド結合を共有し、同様にエフェクター部分のポリペプチドとカルボキシ末端ペプチド結合を共有するポリペプチドをコードする。更に別の具体的な実施態様において、単離されたポリヌクレオチドは、エフェクター部分のポリペプチドがＦｃドメインサブユニットとカルボキシ末端ペプチド結合を共有するポリペプチドをコードする。
別の実施態様において、本発明はイムノコンジュゲート又はその断片をコードする単離されたポリヌクレオチドを対象とし、ここで該ポリヌクレオチドは、配列番号２３、２５、２７、２９、３１、３３、３５、３７、３９、４１、４３、４５、４７、４９、５１、５３、５５、５７、５９、６１、６３、６５、６７、６９、７１、７３、７５、７７、７９、８１、８３、８５、８７、８９、９１、９３、９５、９７、９９、１０１、１０３、１０５、１０７、１０９、１１１、１１３、１１５、１１７、１１９、１２１、１２３、１２５、１２７、１２９、１３１、１３３、１３５、１３７、１３９、１４１、１４３、１４５、１４７、１４９、１５１、１５３、１５５、１５７、１５９、１６１、１６３、１６５、１６７、１６９、１７１、１７３、１７５、１７７、１７９、１８１、１８３、１８５、１８７、１８９、１９１、２９３又は２９５に示される可変領域配列をコードする配列を含む。別の実施態様において、本発明はイムノコンジュゲート又はその断片をコードする単離されたポリヌクレオチドを対象とし、ここで該ポリヌクレオチドは、配列番号１９３、１９５、１９７、１９９、２０１、２０３、２０５、２０７、２０９、２１１、２１３、２１５、２１７、２２７、２２９、２３１、２３３、２３５、２３７、２３９、２４１、２４３、２４５、２４７、２４９、２５１、２６９、２７１、２７３、２７５、２７７、２７９、２８１、２８３、２８５又は２８７に示されるポリペプチド配列をコードする配列を含む。別の実施態様において、本発明はイムノコンジュゲート又はその断片をコードする単離されたポリヌクレオチドを更に指向し、ここで該ポリヌクレオチドは、配列番号２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６、３８、４０、４２、４４、４６、４８、５０、５２、５４、５６、５８、６０、６２、６４、６６、６８、７０、７２、７４、７６、７８、８０、８２、８４、８６、８８、９０、９２、９４、９６、９８、１００、１０２、１０４、１０６、１０８、１１０、１１２、１１４、１１６、１１８、１２０、１２２、１２４、１２６、１２８、１３０、１３２、１３４、１３６、１３８、１４０、１４２、１４４、１４６、１４８、１５０、１５２、１５４、１５６、１５８、１６０、１６２、１６４、１６６、１６８、１７０、１７２、１７４、１７６、１７８、１８０、１８２、１８４、１８６、１８８、１９０、１９２、２９４、２９６、１９４、１９６、１９８、２００、２０２、２０４、２０６、２０８、２１０、２１２、２１４、２１６、２１８、２２８、２３０、２３２、２３４、２３６、２３８、２４０、２４２、２４４、２４６、２４８、２５０、２５２、２７０、２７２、２７４、２７６、２７８、２８０、２８２、２８４、２８６又は２８８に示されるヌクレオチドに対して少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一である配列を含む。別の実施態様において、本発明はイムノコンジュゲート又はその断片をコードする単離されたポリヌクレオチドを対象とし、ここで該ポリヌクレオチドは、配列番号２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６、３８、４０、４２、４４、４６、４８、５０、５２、５４、５６、５８、６０、６２、６４、６６、６８、７０、７２、７４、７６、７８、８０、８２、８４、８６、８８、９０、９２、９４、９６、９８、１００、１０２、１０４、１０６、１０８、１１０、１１２、１１４、１１６、１１８、１２０、１２２、１２４、１２６、１２８、１３０、１３２、１３４、１３６、１３８、１４０、１４２、１４４、１４６、１４８、１５０、１５２、１５４、１５６、１５８、１６０、１６２、１６４、１６６、１６８、１７０、１７２、１７４、１７６、１７８、１８０、１８２、１８４、１８６、１８８、１９０、１９２、２９４、２９６、１９４、１９６、１９８、２００、２０２、２０４、２０６、２０８、２１０、２１２、２１４、２１６、２１８、２２８、２３０、２３２、２３４、２３６、２３８、２４０、２４２、２４４、２４６、２４８、２５０、２５２、２７０、２７２、２７４、２７６、２７８、２８０、２８２、２８４、２８６又は２８８に示される核酸配列を含む。別の実施態様において、本発明はイムノコンジュゲート又はその断片をコードする単離されたポリヌクレオチドを対象とし、ここで該ポリヌクレオチドは、配列番号２３、２５、２７、２９、３１、３３、３５、３７、３９、４１、４３、４５、４７、４９、５１、５３、５５、５７、５９、６１、６３、６５、６７、６９、７１、７３、７５、７７、７９、８１、８３、８５、８７、８９、９１、９３、９５、９７、９９、１０１、１０３、１０５、１０７、１０９、１１１、１１３、１１５、１１７、１１９、１２１、１２３、１２５、１２７、１２９、１３１、１３３、１３５、１３７、１３９、１４１、１４３、１４５、１４７、１４９、１５１、１５３、１５５、１５７、１５９、１６１、１６３、１６５、１６７、１６９、１７１、１７３、１７５、１７７、１７９、１８１、１８３、１８５、１８７、１８９、１９１、２９３又は２９５に示される可変領域配列をコードする配列を含む。別の実施態様において、本発明はイムノコンジュゲート又はその断片をコードする単離されたポリヌクレオチドを対象とし、ここで該ポリヌクレオチドは、配列番号１９３、１９５、１９７、１９９、２０１、２０３、２０５、２０７、２０９、２１１、２１３、２１５、２１７、２２７、２２９、２３１、２３３、２３５、２３７、２３９、２４１、２４３、２４５、２４７、２４９、２５１、２６９、２７１、２７３、２７５、２７７、２７９、２８１、２８３、２８５又は２８７のアミノ酸配列に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％同一であるポリペプチド配列をコードする配列を含む。本発明はイムノコンジュゲート又はその断片をコードする単離されたポリヌクレオチド包含し、ここで該ポリヌクレオチドは、保存的アミノ酸置換を有する、配列番号２３、２５、２７、２９、３１、３３、３５、３７、３９、４１、４３、４５、４７、４９、５１、５３、５５、５７、５９、６１、６３、６５、６７、６９、７１、７３、７５、７７、７９、８１、８３、８５、８７、８９、９１、９３、９５、９７、９９、１０１、１０３、１０５、１０７、１０９、１１１、１１３、１１５、１１７、１１９、１２１、１２３、１２５、１２７、１２９、１３１、１３３、１３５、１３７、１３９、１４１、１４３、１４５、１４７、１４９、１５１、１５３、１５５、１５７、１５９、１６１、１６３、１６５、１６７、１６９、１７１、１７３、１７５、１７７、１７９、１８１、１８３、１８５、１８７、１８９、１９１、２９３又は２９５の可変領域配列をコードする配列を含む。本発明はまた、本発明のイムノコンジュゲート又はその断片をコードする単離されたポリヌクレオチドを包含し、ここで該ポリヌクレオチドは、保存的アミノ酸置換を有する、配列番号１９３、１９５、１９７、１９９、２０１、２０３、２０５、２０７、２０９、２１１、２１３、２１５、２１７、２２７、２２９、２３１、２３３、２３５、２３７、２３９、２４１、２４３、２４５、２４７、２４９、２５１、２６９、２７１、２７３、２７５、２７７、２７９、２８１、２８３、２８５又は２８７のポリペプチド配列をコードする配列を含む。
ある実施態様において、ポリヌクレオチドまたは核酸はＤＮＡである。一実施態様において、本発明のポリヌクレオチドは、例えばメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）の形態のＲＮＡである。本発明のＲＮＡは、一本鎖または二本鎖であってもよい。
非標的化コンジュゲート
本発明は、特定の抗原（例えば腫瘍抗原）を標的としたイムノコンジュゲートだけでなく、任意の抗原に特異的に結合しない、とりわけ任意のヒト抗原に結合しない一以上のＦａｂ分子を含んでなる非標的化コンジュゲートも提供する。任意の抗原に対するこれらのコンジュゲートの特異的結合の欠如（即ち、非特異的相互作用から区別できる任意の結合の欠如）は、本明細書に記載されるように例えばＥＬＩＳＡ又は表面プラズモン共鳴により測定することができる。そのようなコンジュゲートは、例えば、それらが含むエフェクター部分の血清半減期を、特定の組織への標的化が望ましくない非結合型エフェクター部分の血清半減期と比較して、増強するために特に有用である。
具体的には、本発明は、特異的には任意の抗原に結合しない第一のＦａｂ分子、２つのサブユニットからなるＦｃドメイン、及びエフェクター部分を含み、１以下のエフェクター部分が存在するコンジュゲートを提供する。より具体的には、本発明は、配列番号２９９の重鎖可変領域配列及び配列番号２９７の軽鎖可変領域配列を含んでなる第一のＦａｂ分子、２つのサブユニットからなるＦｃドメイン、及びエフェクター部分を含み、１以下のエフェクター部分が存在するコンジュゲートを提供する。本発明のイムノコンジュゲートのように、コンジュゲートは上記「イムノコンジュゲートのフォーマット」に記述されるように様々な立体配置をとることができる（イムノコンジュゲートの抗原結合部分は、特異的に任意の抗原に結合しないＦａｂ分子、例えば配列番号２９９の重鎖可変領域配列及び配列番号２９７の軽鎖可変領域配列を含んでなるＦａｂ分子などによって置換されている）。同様に、Ｆｃドメイン並びにエフェクター部分の特徴は、本発明のイムノコンジュゲートについての「Ｆｃドメイン」及び「エフェクター部分」の下で上述したように、本発明の非標的化コンジュゲートに対して、単独又は組み合わせて適用する。
特定の実施態様において、コンジュゲートは、（ｉ）任意の抗原を特異的には結合しない第一及び第二のＦａｂ分子及びＦｃドメイン含む免疫グロブリン分子、及び（ｉｉ）エフェクター部分を含み、ここで１以下のエフェクター部分が存在し、そして免疫グロブリン分子は、ヒトＩｇＧ１サブクラスの免疫グロブリンであり；Ｆｃドメインは、その２つのサブユニットの一方にノブ修飾を、他方にホール修飾を含み、そのサブユニットの各々にアミノ酸置換Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ及びＰ３２９Ｇを含み；そしてエフェクター部分は、免疫グロブリン重鎖の一方のカルボキシ末端アミノ酸に、任意でリンカーペプチドを介して融合されるＩＬ−２分子である。特定の実施態様において、コンジュゲートは、配列番号２９９の重鎖可変領域配列、及び配列番号２９７の軽鎖可変領域配列を含む。
ある実施態様において、コンジュゲートは、（ｉ）配列番号２９９の重鎖可変領域配列及び配列番号２９７の軽鎖可変領域配列を含んでなる免疫グロブリン分子、及び（ｉｉ）エフェクター部分のポリペプチドを含み、１以下のエフェクター部分が存在する。一つのそのような実施態様において、免疫グロブリン分子は、ヒトＩｇＧ１サブクラスの免疫グロブリンである。一つのそのような実施態様において、Ｆｃドメインはその２つのサブユニットの一方にノブ修飾を、他方にホール修飾を含む。特定のそのような実施態様において、Ｆｃドメインはそのサブユニットの各々において、アミノ酸置換のＬ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ及びＰ３２９Ｇを含む。更に別のそのような実施態様において、エフェクター部分は、免疫グロブリン重鎖の一方のカルボキシ末端のアミノ酸に、任意でリンカーペプチドを介して融合しているＩＬ−２分子である。
一実施態様において、コンジュゲートは、任意の抗原に特異的には結合しないＦａｂ重鎖が、ノブ修飾を含むＦｃドメインサブユニットとカルボキシ末端のペプチド結合を共有し、同様にＩＬ−２ポリペプチドとカルボキシ末端ペプチド結合を共有するポリペプチド配列を含む。より具体的な実施態様において、コンジュゲートは配列番号２２１、配列番号２２３、配列番号２８９及び配列番号２９１の群から選択されるポリペプチド配列、または機能性を保持したその変異体を含む。一実施態様において、コンジュゲートは、任意の抗原に特異的には結合しないＦａｂ重鎖が、ホール修飾を含むＦｃドメインサブユニットとカルボキシ末端のペプチド結合を共有するポリペプチド配列を含む。更により具体的な実施態様において、コンジュゲートは配列番号２１９のポリペプチド配列、または機能性を保持したその変異体を含む。別の実施態様において、コンジュゲートは、任意の抗原に特異的には結合しないＦａｂ軽鎖を含む。更により具体的な実施態様において、コンジュゲートは配列番号２２５のポリペプチド配列、または機能性を保持したその変異体を含む。別の実施態様において、コンジュゲートは配列番号２１９、配列番号２２１及び配列番号２２５のポリペプチド配列、または機能性を保持したその変異体を含む。別の実施態様において、コンジュゲートは配列番号２１９、配列番号２２３及び配列番号２２５のポリペプチド配列、または機能性を保持したその変異体を含む。別の実施態様において、コンジュゲートは配列番号２１９、配列番号２８９及び配列番号２２５のポリペプチド配列、または機能性を保持したその変異体を含む。別の実施態様において、コンジュゲートは配列番号２１９、配列番号２９１及び配列番号２２５のポリペプチド配列、または機能性を保持したその変異体を含む。別の特定の実施態様において、ポリペプチドは、共有結合、例えばジスルフィド結合により連結されている。幾つかの実施態様において、Ｆｃドメインポリペプチド鎖は、アミノ酸置換のＬ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ及びＰ３２９Ｇを含む。
特定の実施態様において、イムノコンジュゲートは、配列番号２９８、配列番号３００、配列番号２２０、配列番号２２２、配列番号２２４、配列番号２２６、配列番号２９０及び配列番号２９２からなる群から選択される配列に対して少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％同一であるポリヌクレオチド配列によってコードされるポリペプチド配列を含む。別の具体的な実施態様において、イムノコンジュゲートは、配列番号２９８、配列番号３００、配列番号２２０、配列番号２２２、配列番号２２４、配列番号２２６、配列番号２９０及び配列番号２９２からなる群から選択されるポリヌクレオチド配列によってコードされるポリペプチド配列を含む。
本発明はまた、本発明のコンジュゲートをコードする単離されたポリヌクレオチドを提供する。特定の実施態様において、単離されたポリヌクレオチドは、配列番号２９８、配列番号３００、配列番号２２０、配列番号２２２、配列番号２２４、配列番号２２６、配列番号２９０及び配列番号２９２からなる群から選択される配列に対して少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一である配列を含む。本発明はさらに、単離されたポリヌクレオチドを含む発現ベクター及び本発明の単離されたポリヌクレオチド又は発現ベクターを含む宿主細胞を提供する。別の態様において、ａ）本発明の宿主細胞をコンジュゲートの発現に適した条件下で培養し、ｂ）コンジュゲートを回収する工程を含む、本発明のコンジュゲートを産生する方法が提供される。本発明はまた、本発明の方法により製造されたコンジュゲートを包含する。本発明のイムノコンジュゲートを製造する方法に関する本明細書中に提供される開示（例えば「組換え方法」を参照）は、本発明のコンジュゲートに等しく適用することができる。
本発明はさらに、本発明のコンジュゲートおよび薬学的に許容される担体を含む薬学的組成物を提供する。本発明のイムノコンジュゲートの薬学的組成物に関する本明細書中に提供される開示（例えば「組成物、製剤、及び投与の経路」を参照）は、本発明のコンジュゲートに等しく適用することができる。更に、コンジュゲートは、本発明のイムノコンジュゲートのために本明細書に記載の使用方法で使用することができる。本発明のイムノコンジュゲートを使用する方法に関する本明細書中に提供される開示（例えば「治療的方法及び組成物」、「他の薬剤及び治療」及び「製造品」を参照）は、本発明のコンジュゲートに等しく適用することができる。
組換え方法
本発明のイムノコンジュゲートは、例えば、固相ペプチド合成（例えばメリフィールド固相合成）又は組換え産生によって得ることができる。組換え生産のために、例えば上述したように、イムノコンジュゲート（断片）をコードする一又は複数のポリヌクレオチドが単離され、宿主細胞内での更なるクローニング及び／又は発現のために一又は複数のベクターに挿入される。このようなポリヌクレオチドは、一般的な手順を使用して容易に単離され配列決定されうる。一実施態様では、本発明の一又は複数のポリヌクレオチドを含んでなるベクター、好ましくは発現ベクターが提供される。当業者によく知られている方法は、適切な転写／翻訳制御シグナルとともに、イムノコンジュゲート（断片）のコード配列を含む発現ベクターを構築するために使用することができる。これらの方法は、インビトロでの組換えＤＮＡ技術、合成技術及びインビボでの組換え／遺伝子組換えが含まれる。例えば、Maniatis et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, N.Y. (1989);及びAusubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Associates and Wiley Interscience, N.Y (1989)に記載される技術を参照。発現ベクターはプラスミド、又はウイルスの一部でもよく、核酸断片でありうる。発現ベクターは、イムノコンジュゲート（断片）をコードするポリヌクレオチド（すなわちコーディング領域）がプロモーター及び／又は他の転写又は翻訳コントロール要素と作動可能な関係においてクローン化される発現カセットを含む。本発明で使用される場合、「コーディング領域」は、アミノ酸に翻訳されるコドンから成る核酸の一部である。「停止コドン」（ＴＡＧ、ＴＧＡ、又はＴＡＡ）はアミノ酸に翻訳されないが、存在するならばそれはコーディング領域として考えられ、しかし、任意の隣接配列、例えばプロモーター、リボソーム、結合部位、転写ターミネーター、イントロン、５’及び３’非翻訳領域などはコーディング領域の一部ではない。二以上のコーディング領域が、単一のポリヌクレオチドコンストラクト中、例えば単一ベクター上に、又は別個のポリヌクレオチドコンストラクト中、例えば別個の（異なる）ベクター上に存在してもよい。更に、何れかのベクターは単一のコーディング領域を有し得、又は二以上のコーディング領域を有し得、例えば本発明のベクターは、タンパク質分解切断により最終タンパク質へ翻訳後的又は共翻訳的に分けられる一又は複数のポリタンパク質をコードしうる。加えて、本発明のベクター、ポリヌクレオチド、又は核酸は、本発明のイムノコンジュゲート（断片）、又は変異体又はその誘導体をコードするポリヌクレオチドに融合又は非融合された異種性コーディング領域をコードしうる。異種性コーディング領域は、限定するものではないが、特殊化要素又はモチーフ、例えば分泌シグナルペプチド又は異種性機能ドメインを含む。作動的関係とは、遺伝子産物の発現を制御性配列の影響又はコントロール下に置かれるように、遺伝子産物、例えばポリペプチドのコーディング領域が一又は複数の制御性配列と関連する場合である。２つのＤＮＡ断片（例えばポリペプチドコーディング領域及びそれと関連するプロモーター）は、プロモーター機能の誘導が所望の遺伝子産物をコードするｍＲＮＡの転写をもたらし、２つのＤＮＡ断片間の連鎖の性質が遺伝子産物の発現を指示する発現制御性配列の能力を干渉しないか又は転写されるＤＮＡ鋳型の能力を干渉しない場合に「作動的に関連」する。このように、プロモーターがその核酸の転写に影響できる場合に、プロモーター領域はポリペプチドをコードする核酸と作動的に関連するだろう。プロモーターは、所定の細胞においてのみＤＮＡの実質的な転写を指示する細胞特異的プロモーターでありうる。プロモーターに加えて、他の転写コントロール要素、例えばエンハンサー、オペレーター、リプレッサー、及び転写終結シグナルが、細胞特異的転写を支持するためにポリヌクレオチドと作動的に関連していてもよい。好適なプロモーター及び他の転写コントロール領域がここに開示される。様々な転写コントロール領域が当業者に知られている。これらは、限定するものではないが、脊椎動物細胞において機能する転写コントロール領域、例えば限定するものではないがサイトメガロウイルスからのプロモーター及びエンハンサーセグメント（例えば、イントロン−Ａと併せて前初期プロモーター）、サルウイルス４０（例えば初期プロモーター）、及びレトロウイルス（例えばラウス肉腫ウイルスなど）を含む。他の転写コントロール領域は、脊椎動物遺伝子由来のもの、例えばアクチン、熱ショックタンパク質、ウシ成長ホルモン及びウサギβ−グロビン、並びに真核生物細胞における遺伝子発現をコントロールできる他の配列を含む。更なる好適な転写コントロール領域は、組織特異的プロモーター及びエンハンサー並びに誘導性プロモーター（例えばプロモーター誘導性テトラサイクリン）を含む。同様に、様々な転写コントロール要素が当業者に知られている。これらは、限定するものではないが、リボソーム結合部位、翻訳開始及び終止コドン、及びウィルス系由来の要素（特に、内部リボソーム進入部位、又はＩＲＥＳ、ＣＩＴＥ配列としても知られる）を含む。発現カセットはまた、他の特性、例えば複製起源、及び／又は染色体組込み要素、例えばレトロウイルス長末端反復（ＬＴＲ）、又はアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）末端逆位配列（ＩＴＲ）を含みうる。
本発明のポリヌクレオチド及び核酸コーディング領域は、本発明のポリヌクレオチドにコードされるポリペプチドの分泌を指示する分泌又はシグナルペプチドをコードする更なるコーディング領域を伴い得る。例えば、イムノコンジュゲートの分泌が望まれる場合、シグナル配列をコードするＤＮＡが本発明のイムノコンジュゲート又はその断片をコードする核酸の上流に配置されうる。シグナル仮説によると、哺乳類細胞によって分泌されるタンパク質はシグナルペプチド又は分泌リーダー配列を有し、これは一旦粗面小胞体を横切って成長するタンパク質鎖の排出が開始すると成熟タンパク質から切断される。当業者は、脊椎動物細胞によって分泌されるポリペプチドはポリペプチドのＮ末端に融合されたシグナルペプチドを一般的に有し、それはポリペプチドの分泌又は「成熟」形態を生産するために翻訳ポリペプチドから切断されることを認識しているだろう。ある実施態様では、天然シグナルペプチド、例えば免疫グロブリン重鎖又は軽鎖シグナルペプチドが使用され、又はその配列の機能的誘導体であって、それに作動的に関連したポリペプチドの分泌を指示する能力を保持した機能的誘導体が使用される。あるいは、異種性哺乳類シグナルペプチド、又はその機能性誘導体が使用されうる。例えば、野生型リーダー配列は、ヒト組織プラスミノーゲンアクチベーター（ＴＰＡ）又はマウスβ−グルクロニダーゼのリーダー配列と置換されうる。分泌シグナルペプチドの例示的なアミノ酸及びポリヌクレオチド配列を、配列番号８〜１６に示す。
後の精製を容易にし又は又はイムノコンジュゲートの標識化における補助のために使用されうる短タンパク質配列（例えば、ヒスチジンタグ）をコードするＤＮＡは、ポリヌクレオチドをコードするイムノコンジュゲート（断片）の中又は末端に含まれうる。
更なる実施態様では、本発明の一又は複数のポリヌクレオチドを含んでなる宿主細胞が提供される。ある実施態様では、本発明の一又は複数のベクターを含んでなる宿主細胞が提供される。ポリヌクレオチド及びベクターは、単独で又は組合せにおいて、それぞれポリヌクレオチド及びベクターに関して本明細書に記載されている特徴の何れかを組み込みうる。一つのそのような実施態様において、宿主細胞は、本発明のイムノコンジュゲート（の一部）をコードするポリヌクレオチドを含むベクターを含む（例えば該ベクターで形質転換又はトランスフェクトされる）。本明細書で使用される場合、「宿主細胞」なる用語は、本発明のイムノコンジュゲート又はその断片を生成するよう操作できる何れかの種類の細胞システムを指す。イムノコンジュゲートの複製及び発現の補助に好適な宿主細胞は当分野でよく知られている。このような細胞は特定の発現ベクターで適切にトランスフェクト又は形質導入され得、大量のベクター含有細胞が、臨床利用のための十分な量のイムノコンジュゲートを得るために、大規模発酵槽での播種のために増殖されうる。好適な宿主細胞は、原核生物微生物、例えば大腸菌、又は様々な真核生物細胞、例えばチャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ）、昆虫細胞などを含む。例えば、ポリペプチドは、特に糖鎖付加が必要でない場合、細菌において生産されうる。発現の後、ポリペプチドは可溶性画分において細菌の細胞ペーストから単離され得、更に精製することができる。原核生物に加えて、糸状菌又は酵母菌のような真核微生物は、菌類や酵母菌株を含むポリペプチドをコードするベクターのための、適切なクローニング宿主又は発現宿主であり、そのグリコシル化経路が、「ヒト化」されており、部分的または完全なヒトのグリコシル化パターンを有するポリペプチドの生成をもたらす。Gerngross, Nat Biotech 22, 1409-1414 (2004)、及びLi et al., Nat Biotech 24, 210-215 (2006)を参照。（グリコシル化）ポリペプチドの発現に適した宿主細胞はまた、多細胞生物（無脊椎動物と脊椎動物）から派生している。無脊椎動物細胞の例としては、植物および昆虫細胞が挙げられる。多数のバキュロウイルス株が同定され、これらは特にSpodoptera frugiperda細胞のトランスフェクションのために、昆虫細胞と組み合わせて使用することができる。植物細胞培養を宿主として利用することができる。例えば、米国特許第５９５９１７７号、第６０４０４９８号、第６４２０５４８号、第７１２５９７８号及び第６４１７４２９号（トランスジェニック植物における抗体産生に関するＰＬＡＮＴＩＢＯＤＩＥＳＴＭ技術を記載）を参照。脊椎動物細胞もまた宿主として用いることができる。例えば、懸濁液中で増殖するように適応された哺乳動物細胞株は有用であり得る。有用な哺乳動物宿主細胞株の他の例は、ＳＶ４０（ＣＯＳ−７）で形質転換されたサル腎臓ＣＶ１株、ヒト胚腎臓株（Graham et al., J Gen Virol 36, 59 (1977)に記載された２９３細胞又は２９３Ｔ細胞、ベビーハムスター腎臓細胞（ＢＨＫ）、マウスのセルトリ細胞（Mather, Biol Reprod 23, 243-251 (1980)に記載されるＴＭ４細胞）、サル腎細胞（ＣＶ１）、アフリカミドリザル腎細胞（ＶＥＲＯ−７６）、ヒト子宮頚癌細胞（ＨｅＬａ）、イヌ腎臓細胞（ＭＤＣＫ；バッファローラット肝臓細胞（ＢＲＬ ３Ａ）、ヒト肺細胞（Ｗ１３８）；ヒト肝細胞（ＨｅｐＧ２）、マウス乳腺腫瘍細胞（ＭＭＴ０６０５６２）、（例えばMather et al., Annals N.Y. Acad Sci 383, 44-68 (1982)に記載される）ＴＲＩ細胞、ＭＲＣ５細胞、およびＦＳ４細胞である。他の有用な哺乳動物宿主細胞株は、ｄｈｆｒ−ＣＨＯ細胞（Urlaub et al., Proc Natl Acad Sci USA 77, 4216 (1980）を含むチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、及びＹＯ、ＮＳ０、Ｐ３Ｘ６３およびＳｐ２／０などの骨髄腫細胞株を含む。タンパク質産生に適した特定の哺乳動物宿主細胞系の総説については、例えば、Yazaki and Wu, Methods in Molecular Biology, Vol. 248 (B.K.C. Lo, ed., Humana Press, Totowa, NJ), pp. 255-268 (2003)を参照。宿主細胞は、培養細胞、例えば、哺乳動物の培養細胞、酵母細胞、昆虫細胞、細菌細胞及び植物細胞、また、トランスジェニック生物、トランスジェニック植物又は培養植物又は動物組織に含まれる細胞を含む。一実施態様では、宿主細胞は真核生物細胞、好ましくは哺乳類細胞、例えばチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、ヒト胎児由来腎臓（ＨＥＫ）細胞又はリンパ球系細胞（例えば、Ｙ０、ＮＳ０、Ｓｐ２０細胞）である。
これらのシステムにおいて外来遺伝子を発現させるための標準的な技術は当分野で知られている。抗体等の抗原結合ドメインの重又は軽鎖のどちらかを含むポリペプチドを発現する細胞は、発現された生成物が重及び軽鎖の両方を有する抗体であるように、抗体鎖の他方をまた発現するように操作されうる。
一実施態様において、本発明によるイムノコンジュゲートを生産する方法が提供され、その方法は、本明細書に与えられるように、イムノコンジュゲートの発現に適した条件下で、イムノコンジュゲートをコードするポリヌクレオチドを含む宿主細胞を培養すること、及び宿主細胞（または宿主細胞培養培地）からイムノコンジュゲートを回収することを含む。
イムノコンジュゲートの構成要素は、遺伝的に互いに融合されている。イムノコンジュゲートは、その成分が、お互いに直接的に又はリンカー配列を介して互いに間接的に融合されるように設計することができる。リンカーの組成および長さは、当該技術分野において周知の方法に従って決定することができ、有効性について試験され得る。エフェクター部分とＦｃドメインとの間のリンカー配列の例は、配列番号１９５、１９７、１９９、２０３、２０９、２１５、２２９、２３５、２３７、２４３、２４５、２４７、２４９、２５１、２６９、２７１、２７３、２７５、２７７、２７９及び２８５に示される配列に見出される。さらなる配列はまた、所望であれば、融合体の個々の成分を分離するための切断部位、例えばエンドペプチダーゼ認識配列を組み込むことが含まれていてもよい。
ある実施態様では、イムノコンジュゲートの一又は複数の抗原結合部分は、抗原決定基に結合できる抗体可変領域を少なくとも含む。可変領域が、天然に又は非天然に生じる抗体及びその断片の一部を形成し、及びそれに由来しうる。ポリクローナル抗体及びモノクローナル抗体を生産する方法は、当分野でよく知られている（例えばHarlow and Lane, "Antibodies, a laboratory manual", Cold Spring Harbor Laboratory, 1988)を参照）。非天然に生じる抗体は、固相−ペプチド合成を使用して構築されるか、組換え的に生産されるか（例えば米国特許第４，１８６，５６７号に記載のように）、又は例えば可変重鎖及び可変軽鎖を含んでなるコンビナトリアルライブラリーのスクリーニング（例えばＭｃＣａｆｆｅｒｔｙの米国特許第５，９６９，１０８号を参照）によって得られうる。抗原結合部分及びその生産方法がまたＰＣＴ公開番号ＷＯ２０１１／０２０７８３に詳細に記載されており、その全体を出典明記によって本明細書に援用する。
何れかの動物種の抗体、抗体断片、抗原結合ドメイン又は可変領域が、本発明のイムノコンジュゲートで用いることができる。本発明において有用な非限定的抗体、抗体断片、抗原結合ドメイン又は可変領域は、マウス、霊長類、又はヒト起源のものでありうる。コンジュゲートがヒトでの使用を意図する場合、抗体の定常領域はヒトに由来するキメラ形態の抗体が使用され得る。ヒト化又は完全ヒト形態の抗体がまた、当分野でよく知られている方法に従って調製されうる（例えばＷｉｎｔｅｒの米国特許第５，５６５，３３２号を参照）。ヒト化は、様々な方法によって達成することができ、限定するものではないが（ａ）非ヒト（例えばドナー抗体）ＣＤＲの、ヒト（例えば、レシピエント抗体）フレームワーク及び定常領域への、決定的なフレームワーク残基（例えば、良好な抗原結合親和性又は抗体機能を保つのに重要なもの）の有無におけるグラフティング、（ｂ）非ヒト特異性決定領域（ＳＤＲ又はａ−ＣＤＲ；抗体−抗原相互作用に決定的な残基）のみの、ヒトフレームワーク及び定常領域へのグラフティング、又は（ｃ）全非ヒト可変ドメインの移植（ただし、表面残基の置換によりヒト様セクションでそれらを「覆う」）を含む。ヒト化抗体およびそれらの製造方法は、例えば、Almagro and Fransson, Front Biosci 13, 1619-1633 (2008)に総説され、更に、Riechmann et al., Nature 332:323-329 (1988); Queen et al., Proc. Nat’l Acad. Sci. USA 86:10029-10033 (1989); 米国特許第５，８２１，３３７号、第７，５２７，７９１号、第６，９８２，３２１号及び第７，０８７，４０９号; Jones et al., Nature 321:522-525 (1986); Morrison et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 81:6851-6855 (1984); Morrison and Oi, Adv. Immunol. 44:65-92 (1988); Verhoeyen et al., Science 239:1534-1536 (1988); Padlan, Molec. Immun. 31(3):169-217 (1994); Kashmiri et al., Methods 36:25-34 (2005)(ＳＤＲ（ａ−ＣＤＲ）グラフティングを記述); Padlan, Mol. Immunol. 28:489-498 (1991) (「リサーフェシング」を記述); Dall’Acqua et al., Methods 36:43-60 (2005) (「FRシャッフリング」を記述);及びOsbourn et al., Methods 36:61-68 (2005) 及びKlimka et al., Br. J. Cancer, 83:252-260 (2000) (ＦＲシャッフリングへの「誘導選択」アプローチを記述)に記載されている。ヒト可変領域は、ハイブリドーマ法によって生成されるヒトモノクローナル抗体の部分を形成し、それから得られることができる（例えばMonoclonal Antibody Production Techniques and Applications、pp. 51-63 (Marcel Dekker、Inc.、New York、1987)を参照）。ヒト抗体及びヒト可変領域はまた、抗原チャレンジに応答してインタクトなヒト抗体又はヒト可変領域を有するインタクトな抗体を生産するように改変されたトランスジェニック動物に免疫原を投与することによって調製されうる（例えばLonberg、Nat Biotech 23、1117-1125 (2005)を参照）。ヒト抗体及びヒト可変領域はまた、ヒト由来ファージディスプレイライブラリーから選択されるＦｖクローン可変領域配列を単離することによって生成されうる（例えば、Hoogenboom et al. in Methods in Molecular Biology 178, 1-37 (O’Brien et al., ed., Human Press, Totowa, NJ, 2001); 及びMcCafferty et al., Nature 348, 552-554; Clackson et al., Nature 352, 624-628 (1991)を参照）。ファージは典型的には、抗体断片を短鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）断片として又はＦａｂ断片としてディスプレイする。ファージディスプレイによるイムノコンジュゲートの抗原結合部分の調製の詳細な説明は、ＰＣＴ公開番号ＷＯ２０１１／０２０７８３に添付される実施例に見出される。
ある実施態様では、本発明に有用な抗原結合部分は、例えばＰＣＴ公開番号ＷＯ２０１１／０２０７８３（親和性成熟に関する実施例を参照）又は米国特許出願公開番号２００４／０１３２０６６（この全内容を出典明記によってここに援用する）に開示される方法に従い、増強された結合親和性を有するように操作される。特定の抗原決定基に結合する本発明のイムノコンジュゲートの能力は、酵素結合免疫吸着測定法（ＥＬＩＳＡ）または当業者によく知られている他の技術、例えば表面プラズモン共鳴技術（ＢＩＡｃｏｒｅＴ１００システムで解析される）（Liljeblad, et al., Glyco J 17, 323-329 (2000)）および伝統的な結合アッセイ（Heeley, Endocr Res 28, 217-229 (2002)）のいずれかによって測定することができる。競合アッセイは、特定の抗原への結合について参照抗体と競合する抗体、抗体断片、抗原結合ドメイン又は可変ドメイン、例えばフィブロネクチンのエクストラドメインＢ（ＥＤＢ）への結合についてＬ１９抗体と競合する抗体を同定するために使用されうる。ある実施態様では、このような競合する抗体は、参照抗体によって結合される同じエピトープ（例えば線状又はコンホメーションエピトープ）に結合する抗体が結合するエピトープをマッピングするための詳細な典型的な方法が、Morris (1996) “Epitope Mapping Protocols,”Methods in Molecular Biology vol. 66 (Humana Press, Totowa, NJ)に提供されている。典型的な競合アッセイにおいて、固定化抗原（例えばＥＤＢ）は、抗原（例えばＬ１９抗体）に結合する第一の標識された抗体、及び抗原へ結合について第一の抗体と競合するその能力について試験されている第二の未標識抗体を含む溶液中でインキュベートされる。第二抗体はハイブリドーマ上清中に存在してもよい。コントロールとして、固定化抗原が、第二の未標識の抗体でなく、第一の標識された抗体を含む溶液中でインキュベートされる。第一の抗体の抗原への結合を許容する条件下でインキュベートした後、過剰の未結合の抗体が除去され、固定化された抗原に結合した標識の量が測定される。もし、固定化抗原に結合した標識の量が、コントロールサンプルと比較して試験サンプル中で実質的に減少している場合、それは、第二抗体が、抗原への結合に対して、第一の抗体と競合していることを示している。Harlow and Lane (1988) Antibodies: A Laboratory Manual ch.14 (Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY)を参照。
本明細書で記載のように調製されるイムノコンジュゲートは、当分野で知られている技術、例えば高速液体クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、ゲル電気泳動、アフィニティークロマトグラフィー、サイズ排除クロマトグラフィー等によって精製されうる。特定のタンパク質を精製するために使用される実際の条件は、一部には正味荷電、疎水性、親水性等の要因に依存し、当業者に明瞭であろう。アフィニティークロマトグラフィー精製では、イムノコンジュゲートが結合する抗体、リガンド、受容体又は抗原が使用されうる。例えば、本発明のイムノコンジュゲートのアフィニティークロマトグラフィー精製では、プロテインＡ又はプロテインＧを伴うマトリックスが使用されうる。逐次的なプロテインＡ又はＧアフィニティークロマトグラフィー及びサイズ排除クロマトグラフィーが、実施例に本質的に記載されるようにイムノコンジュゲートを単離するために使用されうる。イムノコンジュゲートの純度は、ゲル電気泳動、高圧液体クロマトグラフィー等を含む様々なよく知られた分析方法の何れかによって決定されうる。例えば、実施例に記載されるように発現される重鎖融合タンパク質は、還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥで実証されるようにインタクトで、正しく会合していると示された（例えば図４を参照）。３つのバンドはおよそ分子量２５０００、分子量５００００及び分子量６００００で分離され、免疫グロブリン軽鎖、重鎖及び重鎖／エフェクター部分融合タンパク質の予測された分子量に対応する。
アッセイ
本明細書で提供されるイムノコンジュゲートは、同定され、当技術分野で公知の様々なアッセイによってその物理的／化学的性質及び／又は生物学的活性についてスクリーニングされ、または特徴づけることができる。
親和性アッセイ
Ｆｃ受容体又は標的抗原に対するエフェクター部分受容体（例えば、ＩＬ−１０Ｒ又は様々な形態のＩＬ−２Ｒ）に対するイムノコンジュゲートの親和性は、実施例に記載の方法に従って、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）によって、ＢＩＡｃｏｒｅ装置（ＧＥヘルスケア）のような標準的な器具類を使用して決定することができ、そしてそのような受容体又は標的タンパク質は、組換え発現によって得ることができる。代替的に、異なる受容体又は標的抗原に対するイムノコンジュゲートの結合を、特定の受容体又は標的抗原を発現する細胞株を用いて、例えば、フローサイトメトリー（ＦＡＣＳ）により評価することができる。結合親和性を測定するための具体的な実例であり、例示的な実施態様は、以下及び下記実施例に記載されている。
一実施態様によると、ＫＤは、ＣＭ５チップ上に固定されたリガンド（例えば、エフェクター部分受容体、Ｆｃ受容体または標的抗原）を用いて、２５℃で、ＢＩＡＣＯＲＥ（登録商標）Ｔ１００機器（GE Healthcare）を使用して表面プラズモン共鳴によって測定される。簡潔には、カルボキシメチル化デキストランバイオセンサーチップ（ＣＭ５，GE Healthcare）を、提供者の指示書に従ってＮ−エチル−Ｎ’−（３−ジメチルアミノプロピル）−カルボジイミド塩酸塩（ＥＤＣ）及びＮ−ヒドロキシスクシニミド（ＮＨＳ）で活性化する。組換えリガンドを１０ｍＭの酢酸ナトリウム、ｐＨ５．５で０．５−３０μｇ／ｍｌに希釈し、結合したタンパク質の応答単位（ＲＵ）がおよそ１００−５０００になるように１０μｌ／分の流速で注入する。リガンドの注入後、反応しない群をブロックするために１Ｍのエタノールアミンを注入する。動力学測定のために、イムノコンジュゲート３から５倍の段階希釈（〜０．０１ｎＭから３００ｎＭ）が、ＨＢＳ−ＥＰ＋（GE Healthcare、１０ｍＭのＨＥＰＥＳ、１５０ｍＭのＮａＣｌ、３ｍＭのＥＤＴＡ、０．０５％界面活性剤Ｐ２０、２５℃、ｐＨ７．４）中で約３０〜５０μｌ／分の流量で注入される。会合及び解離のセンサーグラムを同時にフィットさせることによる単純一対一ラングミュア結合モデル（simple one-to-one Langmuir binding model）（ＢＩＡＣＯＲＥ（登録商標）Ｔ１００評価ソフトウェアバージョン１．１．１）を用いて、会合速度（ｋｏｎ）と解離速度（ｋｏｆｆ）を算出した。平衡解離定数（ＫＤ）はｋｏｆｆ／ｋｏｎ比として算出される。例えば、Chen et al., J Mol Biol 293, 865-881 (1999)を参照。
活性のアッセイ
実施例に記載のように、本発明のイムノコンジュゲートの生物学的活性は、様々なアッセイによって測定することができる。生物学的活性は、例えば、エフェクター部分受容体保有細胞の増殖の誘導、エフェクター部分の受容体保有細胞におけるシグナル伝達の誘導、エフェクター部分受容体保有細胞によるサイトカイン分泌の誘導、及び腫瘍退縮の誘導、及び／又は生存の改善を含んでもよい。
組成物、製剤、及び投与の経路
更なる態様においは、本発明は、例えば下記の治療方法の何れかにおける使用のための、本明細書に提供されるイムノコンジュゲートの何れかを含んでなる薬学的組成物を提供する。一実施態様では、薬学的組成物は、本明細書に提供されるイムノコンジュゲートの何れか及び薬学的に許容可能な担体を含む。別の実施態様では、薬学的組成物は、本明細書に提供されるイムノコンジュゲートの何れか及び少なくとも一つの更なる治療剤、例えば下記のものを含む。
更に提供されるのは、インビボでの投与に適した形態における本発明のイムノコンジュゲートを生産する方法であって、（ａ）本発明によるイムノコンジュゲートの獲得、及び（ｂ）少なくとも一つの薬学的に許容可能な担体を伴うイムノコンジュゲートの製剤化を含んでなり、それによってイムノコンジュゲートの調整物がインビボでの投与のために製剤化される方法である。
本発明の薬学的組成物は、薬学的に許容可能な担体中に溶解又は分散された治療的に有効な量の一又は複数のイムノコンジュゲートを含む。「薬学的に又は薬理学的許容可能な」なる語句は、用いられる投与量及び濃度ではレシピエントに一般的に非毒性であり、すなわち、例えばヒトなどの動物に適宜投与された時に、有害な、アレルギー性の又は他の望まない応答をもたらさない分子実体及び組成物を指す。少なくとも一つのイムノコンジュゲート及び場合によっては更なる活性成分を含有する薬学的組成物の調製は、本開示に照らして当業者によく知られており、Remington's Pharmaceutical Sciences, 18th Ed. Mack Printing Company, 1990に例示され、出典明記によってここに援用する。更に、動物（例えばヒト）投与では、調製物が、生物学的基準のＦＤＡオフィス（FDA Office of Biological Standards）又は他の国において対応する当局によって要求される無菌性、発熱性、一般的な安全性及び純度標準を満たすべきであることが理解されるだろう。好ましい組成物は凍結乾燥製剤又は水溶液である。本明細書で使用される場合、「薬学的に許容可能な担体」は、当業者に知られているありとあらゆる溶剤、バッファー、分散媒、コーティング、界面活性剤、抗酸化剤、保存剤（例えば、抗菌剤、抗真菌剤）、等張剤、吸収遅延剤、塩、保存剤、抗酸化剤、タンパク質、薬物、薬物安定剤、ポリマー、ゲル、結合剤、賦形剤、崩壊剤、潤滑剤、甘味剤、香味剤、色素、同様な物質及びその組合せを含む（例えばRemington's Pharmaceutical Sciences, 18th Ed. Mack Printing Company, 1990, pp. 1289-1329を参照（出典明記によってここに援用する））。
何れかの一般的な担体が活性成分と不適合である場合を除き、治療的又は薬学的組成物におけるその使用が意図される。
組成物は、それが固体、液体又はエアロゾル形態で投与されるか、またそれが注射などの投与経路のために無菌である必要があるかに依存して、異なるタイプの担体を含みうる。本発明のイムノコンジュゲート（及び何れかの追加の治療剤）は、当業者に知られているように、静脈内に、皮内に、動脈内に、腹腔内に、病巣内に、頭蓋内に、関節内に、前立腺内に、脾臓内に、腎内に、胸膜内に、気管内に、鼻腔内に、硝子体内に、腟内に、直腸内に、腫瘍内に、筋肉内に、腹腔内に、皮下に、結膜下に、小胞内に、粘膜に、心膜内に、臍内に、眼球内に、経口で、局所的に、局在的に、吸入によって（例えば、エアロゾル吸入）、注射によって、注入によって、持続注入によって、標的細胞を浸す限局灌流によって直接、カテーテルによって、洗浄（lavage）によって、クリームにおいて、液体組成物（例えばリポソーム）において、又は他の方法によって、又は前述の何れかの組合せによって投与されうる（例えば、Remington's Pharmaceutical Sciences, 18th Ed. Mack Printing Company, 1990を参照（出典明記によってここに援用する））。非経口投与、特に静脈内注射が、発明のイムノコンジュゲートなどのポリペプチド分子の投与に最も一般的に使用される。
非経口組成物は、注射、例えば皮下、皮内、病巣内、静脈内、動脈内、筋肉内、くも膜下腔内又は腹腔内注射による投与のために設計されたものを含む。注射では、本発明のイムノコンジュゲートは、水溶液中、好ましくは生理学的適合したバッファー、例えばハンクス液、リンガー液、又は生理学的緩衝生理食塩水中に製剤化されうる。溶液は、懸濁、安定及び／又は分散剤などのフォーミュラトリー剤を含みうる。あるいは、イムノコンジュゲートは、使用前は、適切なビヒクル、例えば滅菌発熱性物質除去蒸留水の構成用に粉末形態でありうる。滅菌注射溶液は、本発明のイムノコンジュゲートを、必要に応じて下に挙げる様々な他の成分を伴う適切な溶媒中に必要量で組み入れることによって調製される。滅菌は、例えば滅菌濾過膜を通す濾過によって容易に達成されうる。一般的に分散液は、様々な滅菌された活性成分を、基礎分散培地及び他の成分を含有する無菌ビヒクルに組み入れることによって調製される。滅菌注射溶液、懸濁液又はエマルションの調製のための滅菌粉末の場合、好ましい調製方法は、活性成分＋任意の追加の所望成分の粉末を、先に滅菌−濾過されたその液体培地から得る真空乾燥又は凍結乾燥技術である。液体培地は、必要であれば適切に緩衝化されるべきであり、液体希釈剤は注射の前に十分な生理食塩水又はグルコースでまず等張にされるべきである。組成物は、製造及び保管の条件下で安定でなければならなく、細菌及び真菌などの微生物の汚染作用に対して保護されなければならない。内毒素汚染は安全なレベル、例えば０．５ｎｇ／ｍｇ未満のタンパク質で最小限に保たれるべきであることが理解されるだろう。適な薬学的に許容可能な担体は、限定するものではないが；リン酸塩、クエン酸塩および他の有機酸のような緩衝液；アスコルビン酸およびメチオニンを含む抗酸化剤；防腐剤（例えば、オクタデシルジメチオルベンジルアンモニウムクロライド；ヘキサメトニウムクロライド；塩化ベンザルコニウム、塩化ベンゼトニウム、フェノール、ブチルまたはベンジルアルコール；アルキルパラベン、例えば、メチルまたはプロピルパラベン；カテコール；レゾルシノール；シクロヘキサノール；３−ペンタノール；およびｍ−クレゾール）；低分子量（約１０残基未満）ポリペプチド；タンパク質、例えば、血清アルブミン、ゼラチン、または免疫グロブリン；親水性ポリマー、例えば、ポリビニルピロリドン；アミノ酸、例えば、グリシン、グルタミン、アスパラギン、ヒスチジン、アルギニンまたはリジン；マンノサッカライド、ジサッカライド、およびグルコース、マンノースまたはデキストリンを含む他の炭水化物；キレート剤、例えば、ＥＤＴＡ；糖、例えば、スクロース、マンニトール、トレハロースまたはソルビトール；塩形成対イオン、例えば、ナトリウム、金属錯体（例えば、Ｚｎ−タンパク質錯体）；及び／又はポリエチレングリコール（ＰＥＧ）等の非イオン性界面活性剤が挙げられる。水性注射懸濁液は、カルボキシルメチル・セルロース・ナトリウム、ソルビトール、デキストランなど、懸濁液の粘度を増加させる化合物を含有しうる。
場合によっては、懸濁液は、高濃縮液の調製を可能にするために、適切な安定剤又は化合物の溶解度を増加させる薬剤をまた含有しうる。更に、活性化合物の懸濁液は、適切な油性注射懸濁液として調製されうる。適切な親油性溶媒又はビヒクルは、脂肪油、例えばゴマ油、又は合成脂肪酸エステル、例えばエチルクリート（ethyl cleatｓ）又はトリグリセリド、又はリポソームを含む。
活性成分は、例えばコアセルベーション技術あるいは界面重合により調製されたマイクロカプセル、例えばそれぞれヒドロキシメチルセルロース又はゼラチンマイクロカプセル及びポリ−（メタクリル酸メチル）マイクロカプセルに、コロイド状ドラッグデリバリー系（例えば、リポソーム、アルブミンミクロスフィア、マイクロエマルション、ナノ−粒子及びナノカプセル）に、あるいはマクロエマルションに捕捉させてもよい。このような技術は、Remington's Pharmaceutical Sciences (18th Ed. Mack Printing Company, 1990)に開示されている。徐放性製剤を調製してもよい。徐放性製剤の適切な例は、ポリペプチドを含む疎水性固体ポリマーの半透性マトリクスを含み、そのマトリクスは成形物、例えばフィルム又はマイクロカプセルの形態である。特定の実施態様では、注射可能な組成物の持続的吸収は、吸収を遅延させる薬剤、例えばモノステアリン酸アルミニウム、ゼラチン又はその組合せの組成物における使用によって実施されうる。
前述の組成物に加えて、イムノコンジュゲートはまた、デポー調製物として製剤化されうる。そのように長く作用する製剤は、インプラント術（例えば皮下又は筋肉内）又は筋肉内注射によって投与されうる。従って、例えば、イムノコンジュゲートは、適切なポリマー又は疎水性材料（例えば許容可能な油中のエマルションとして）又はイオン交換樹脂とともに、又は難溶性誘導体として、例えば難溶性塩として製剤化されうる。
本発明のイムノコンジュゲートを含んでなる薬学的組成物は、慣習的な混合、溶解、乳化、カプセル化、封入、凍結乾燥プロセスによって製造されうる。薬学的組成物は、薬剤的使用可能な調製物へのタンパク質の加工を容易にする一又は複数の薬学的に許容可能な担体、希釈剤、賦形剤又は補助剤を使用して、一般的な方法において製剤化されうる。適切な製剤は、選択された投与経路に依存する。イムノコンジュゲートは、遊離酸又は塩基、中性又は塩形態の組成物に製剤化されうる。薬学的に許容可能な塩は、遊離酸又は塩基の生物学的活性を実質的に保った塩である。これらは酸付加塩、例えばタンパク質組成物の遊離アミノ基で形成されるもの、又は塩酸又はリン酸などの無機酸、又は酢酸、シュウ酸、酒石酸又はマンデル酸などの有機酸で形成されるものを含む。遊離カルボキシル基で形成される塩はまた、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、水酸化アンモニウム、水酸化カルシウム又は水酸化第二鉄などの無機塩基；又はイソプロピルアミン、トリメチルアミン、ヒスチジン又はプロカインなどの有機塩基から得られうる。薬学的塩は、対応する遊離塩基形態よりも水性及び他のプロトン性溶媒中において溶けやすい傾向がある。
治療方法及び組成物
本明細書で提供される任意のイムノコンジュゲートは、治療方法に使用することができる。本発明の免疫複合体は、免疫治療剤として、例えば癌の治療において使用することができる。
治療的方法において使用のために、本発明のイムノコンジュゲートは良好な医療行為に合致した方法で処方され、投与され、投薬される。この観点において考慮すべき要因は、治療すべき特定の障害、治療すべき特定の哺乳類、個々の患者の臨床状態、障害の原因、薬剤送達部位、投与方法、投与日程及び医療従事者が知る他の要因を包含する。
一態様では、医薬として使用するために本発明のイムノコンジュゲートが提供される。更なる態様では、疾患の治療において使用のために本発明のイムノコンジュゲートが提供される。ある実施態様において、治療の方法における使用のために本発明のイムノコンジュゲートが提供される。一実施態様において、本発明は、それを必要としている個体において、疾患の治療に使用のために、本明細書に記載されるイムノコンジュゲートを提供する。ある実施態様において、本発明は、個体にイムノコンジュゲートの治療的有効量を投与することを含む、疾患を有する個体を治療する方法に使用のためのイムノコンジュゲートを提供する。ある実施態様において、治療すべき疾患は、増殖性疾患である。特定の実施態様において、疾患は癌である。他の実施態様において、治療すべき疾患は、炎症性疾患である。ある実施態様において、本方法は、少なくとも一の更なる治療剤、例えば、治療すべき疾患が癌である場合には抗癌剤の治療的有効量を個体に投与することを更に含む。上記実施態様のいずれかに記載の「個体」は、哺乳動物であり、好ましくはヒトである。
更なる態様では、本発明は、必要している個体における疾患の治療のための医薬の製造又は調製における、本発明のイムノコンジュゲートの使用を提供する一実施態様において、本医薬は、疾患を有する個体に、医薬の治療的有効量を投与することを含む、疾患を治療する方法で使用するためのものである。ある実施態様において、治療すべき疾患は、増殖性疾患である。特定の実施態様において、疾患は癌である。他の実施態様において、治療すべき疾患は、炎症性疾患である。一実施態様において、本方法は、少なくとも一の更なる治療剤、例えば、治療すべき疾患が癌である場合には抗癌剤の治療的有効量を個体に投与することを更に含む。上記実施態様のいずれかに記載の「個体」は、哺乳動物であり、好ましくはヒトであり得る。
更なる態様において、本発明は、本発明のイムノコンジュゲートの治療的有効量を前記個体に投与することを含む、個体において疾患を治療するための方法を提供する。一実施態様において、本発明のイムノコンジュゲートを薬学的に許容される形態で含むイムノコンジュゲートが前記個体に投与される。ある実施態様において、治療すべき疾患は、増殖性疾患である。特定の実施態様において、疾患は癌である。他の実施態様において、治療すべき疾患は、炎症性疾患である。ある実施態様において、本方法は、少なくとも一の更なる治療剤、例えば、治療すべき疾患が癌である場合には抗癌剤の治療的有効量を個体に投与することを更に含む。上記実施態様のいずれかに記載の「個体」は、哺乳動物であり、好ましくはヒトであり得る。
ある実施態様において、治療すべき疾患は、増殖性疾患、特に癌である。癌の非限定的例は、膀胱癌、脳癌、頭頸部癌、膵臓癌、肺癌、乳癌、卵巣癌、子宮癌、子宮頸癌、子宮内膜癌、食道癌、結腸癌、結腸直腸癌、直腸癌、胃癌、前立腺癌、血液癌、皮膚癌、扁平上皮癌、骨癌、及び腎臓癌を含む。本発明のイムノコンジュゲートを使用して治療できる他の細胞増殖障害は、限定するものではないが、腹部、骨、***、消化器系、肝臓、膵臓、腹膜、内分泌腺（副腎、副甲状腺、下垂体、精巣、卵巣、胸腺、甲状腺）、眼、頭頸部、神経系（中枢及び末梢）、リンパ系、骨盤、皮膚、軟部組織、脾臓、胸部、及び泌尿生殖器系の新生物を含む。また含まれるのは、前癌性の状態又は病変及び癌転移を含む。ある実施態様では、癌は、腎細胞癌、皮膚癌、肺癌、結腸直腸癌、乳癌、脳癌、頭頸部癌から成る群から選択される。幾つかの実施態様において、特にイムノコンジュゲートのエフェクター部分がＩＬ−１０である場合、治療すべき疾患は炎症性疾患である。炎症性疾患の非限定的な例としては、慢性関節リウマチ、乾癬又はクローン病が挙げられる。当業者は、多くの場合において、イムノコンジュゲートが治癒ではなく、部分的恩恵のみをもたらしうることを認識するだろう。幾つかの実施態様では、何らかの利益を有する生理学的変化がまた治療的に有益であると考えら得る。従って、幾つかの実施態様では、生理学的変化をもたらすイムノコンジュゲートの量が、「有効な量」又は「治療的に有効な量」と考えられる。治療を必要とする被験体、患者、又は個体は典型的には哺乳動物、より具体的にはヒトである。
本発明のイムノコンジュゲートはまた、診断用試薬として有用である。抗原決定基へのイムノコンジュゲートの結合は、エフェクター部分に特異的な二次抗体を使用して容易に検出できる。一実施態様では、二次抗体及びイムノコンジュゲートは、細胞又は組織表面上に位置する抗原決定基へのイムノコンジュゲートの結合の検出を容易にする。
幾つかの実施態様では、有効量の本発明のイムノコンジュゲートが、細胞に投与される。他の実施態様では、治療的に有効な量の本発明のイムノコンジュゲートが、疾患の治療のために個体に投与される。
疾患の予防又は治療のためには、本発明のイムノコンジュゲートの適切な用量（単独で使用されるか、又は、一以上の更なる治療的薬剤との組み合わされる場合）は治療すべき疾患の種類、投与の経路、患者の体重、イムノコンジュゲートの種類、疾患の重症度及び経過、イムノコンジュゲートを予防又は治療目的のいずれにおいて投与するか、前の又は同時の治療介入、イムノコンジュゲートに対する患者の臨床的履歴及び応答性、及び担当医の判断に依存する。何れの場合も、投与に責任のある実践者が、個々の被験体に対し、組成物中の活性成分の濃度及び適切な用量を決定するだろう。限定するものではないが、単回又は様々な時間点にわたる複数回投与、ボーラス投与、及びパルス注入を含む様々な投与スケジュールが、ここで考えられる。
イムノコンジュゲートは、患者に対して、単回、又は一連の治療にわたって適切に投与される。疾患の種類及び重症度に応じて、例えば一回以上の別個の投与によるか、連続注入によるかに関わらず、イムノコンジュゲートの約１μｇ／ｋｇから１５ｍｇ／ｋｇ（例えば０．１ｍｇ／ｋｇから１０ｍｇ／ｋｇ）が患者への投与のための初期候補用量となり得る。１つの典型的な一日当たり用量は上記した要因に応じて約１μｇ／ｋｇから１００ｍｇ／ｋｇ又はそれ以上の範囲である。数日間以上にわたる反復投与の場合には、状態に応じて、治療は疾患症状の望まれる抑制が起こるまで持続するであろう。イムノコンジュゲートの１つの例示される用量は約０．０５ｍｇ／ｋｇから約１０ｍｇ／ｋｇの範囲であろう。他の非限定的な例では、用量はまた、投与あたり約１マイクログラム／ｋｇ／体重から、約５マイクログラム／ｋｇ／体重、約１０マイクログラム／ｋｇ／体重、約５０マイクログラム／ｋｇ／体重、約１００マイクログラム／ｋｇ／体重、約２００マイクログラム／ｋｇ／体重、約３５０マイクログラム／ｋｇ／体重、約５００マイクログラム／ｋｇ／体重、約１ミリグラム／ｋｇ／体重、約５ミリグラム／ｋｇ／体重、約１０ミリグラム／ｋｇ／体重、約５０ミリグラム／ｋｇ／体重、約１００ミリグラム／ｋｇ／体重、約２００ミリグラム／ｋｇ／体重、約３５０ミリグラム／ｋｇ／体重、約５００ミリグラム／ｋｇ／体重、約１０００ｍｇ／ｋｇ／体重まで又はそれ以上、及びその中で導きだされる何れかの範囲を含む。ここで挙げた数値から導きだされる範囲の非限定的な例は、約５ｍｇ／ｋｇ／体重〜約１００ｍｇ／ｋｇ／体重、約５マイクログラム／ｋｇ／体重〜約５００ミリグラム／ｋｇ／体重などの範囲が、上記の数値に基づき投与されうる。このように、約０．５ｍｇ／ｋｇ、２．０ｍｇ／ｋｇ、５．０ｍｇ／ｋｇ又は１０ｍｇ／ｋｇの一又は複数（又はその何れかの組合せ）の用量が、患者に投与されうる。このような用量は、間欠的に、例えば毎週又は３週間毎に投与されうる（例えば、患者は約２〜約２０、又は例えば約６用量のイムノコンジュゲートを受ける）。最初の高負荷用量と、その後の一又は複数の低用量が投与されうる。しかしながら、他の投与レジメンが有用でありうる。この療法の進行は、一般的な技術及びアッセイによって容易にモニタリングされる。
本発明のイムノコンジュゲートは一般的に、意図した目的を達成するために有効な量において使用されるだろう。疾患状態を治療又は防止するための使用では、発明のミュータントＩＬ−２ポリペプチド及びイムノコンジュゲート又はその薬学的組成物は、治療的に有効な量において投与又は適用される。治療的に有効な量の決定は、特にここに提供される詳細な開示の考慮のもと、十分に当業者の能力の範囲内である。
全身性投与では、治療的に有効な用量は最初に、細胞培養アッセイなどのインビトロアッセイから推定されうる。次いで用量は、細胞培養において決定されるＩＣ５０を含む循環濃度範囲を得るために、動物モデルにおいて組み立てられうる。このような情報は、ヒトにおいて有用な用量をより正確に決定するために使用されうる。
最初の投与量はまた、当分野においてよく知られている技術を使用して、インビボデータ、例えば動物モデルから推定されうる。当業者は、動物データに基づいてヒトへの投与を容易に最適化できるだろう。
投与量及び間隔は、治療効果を維持するのに十分なイムノコンジュゲートの血漿レベルを提供するために、個々に調整されうる。注射による投与のための通常の患者の投与量は、約０．１〜５０ｍｇ／ｋｇ／日、典型的には約０．５〜１ｍｇ／ｋｇ／日である。治療的に有効な血漿レベルは、毎日の複数回投与によって達成されうる。血漿中のレベルは、例えばＨＰＬＣによって測定されうる。
局所投与又は選択的取込みの場合、イムノコンジュゲートの有効な局所濃度は血漿濃度と関連しない場合がある。当業者は、過度な実験をすることなく、治療的に有効な局所投与量を最適化できるだろう。
治療的に有効な用量のイムノコンジュゲートは一般的に、実質的な毒性をもたらすことなく治療効果を提供するだろう。イムノコンジュゲートの毒性及び治療効果は、細胞培養又は実験動物において標準的な手順によって決定できる。細胞培養アッセイ及び動物研究は、ＬＤ５０（集団の５０％に致死性である用量）及びＥＤ５０（集団の５０％に治療的に有効である用量）を決定するために使用できる。毒性及び治療効果間の用量比は、比ＬＤ５０／ＥＤ５０として表現される治療指数である。大きい治療指数を示すイムノコンジュゲートが好ましい。一実施態様では、本発明によるイムノコンジュゲートは、高い治療指数を示す。細胞培養アッセイ及び動物研究から得られるデータは、ヒトにおける使用に好適な投与量の範囲の策定に使用されうる。投与量は好ましくは、ほとんどあるいは全く毒性の無いＥＤ５０を含む循環濃度の範囲内である。投与量は、様々な要因、例えば採用される剤形、利用される投与経路、被験体の状態などに応じて、この範囲内において変わりうる。正確な処方、投与の経路及び投与量は、患者の状態を考慮してそれぞれの医師によって選択されうる。（例えばFingl et al., 1975, in: The Pharmacological Basis of Therapeutics, Ch. 1, p. 1（出典明記によってその全体をここに援用する）を参照）。
本発明のイムノコンジュゲートで治療される患者の主治医は、毒性、臓器不全などに対し、どのように及びいつ投与を終了、中断、調整するかを知っているだろう。逆に、主治医はまた、臨床反応が十分でない場合、治療を高レベルに調整することを知っているだろう（毒性を除く）。目的の障害の管理における投与量の程度は、治療される状態の重症度、投与の経路などによって様々だろう。状態の重症度は、例えば標準的な予後評価方法によって一部には評価されうる。さらに、用量及びおそらくは投与頻度はまた、個々の患者の年齢、体重及び反応によって様々だろう。
他の薬剤及び治療
本発明によるイムノコンジュゲートは、治療において一又は複数の他の薬剤との組合せにおいて投与されうる。例えば、本発明のイムノコンジュゲートは、少なくとも一つの追加の治療剤と共投与されうる。「治療剤」なる用語は、治療を必要としている個体における症状又は疾患を治療するために投与される何れかの薬剤を包含する。このような追加の治療剤は、治療されている特定の徴候に好適な何れかの活性成分、好ましくは互いに悪影響を及ぼさない相補活性を伴うものを含みうる。ある実施態様では、追加の治療剤は、免疫調節剤、細胞***阻害剤、細胞接着の阻害剤、細胞傷害剤、細胞アポトーシスの活性化剤、又はアポトーシス誘導物質に対する細胞の感受性を増加させる薬剤である。特定の実施態様では、追加の薬剤は、抗癌剤、例えば微小管撹乱物質、代謝拮抗剤、トポイソメラーゼ阻害剤、ＤＮＡインターカレーター、アルキル化剤、ホルモン療法、キナーゼ阻害剤、受容体アンタゴニスト、腫瘍細胞アポトーシスの活性化剤、又は抗血管新生剤である。
このような他の薬剤は、意図した目的のために有効な量で組み合わされ適切に存在する。そのような他の薬剤の有効量は、使用されるイムノコンジュゲートの量、障害又は治療の種類及び上記した他の要因に依存する。イムノコンジュゲートは一般的には本明細書に記載されるのと同じ用量及び投与経路において、又は、本明細書に記載された用量の１％から９９％で、又は経験的に／臨床的に妥当であると決定された任意の用量及び任意の経路により使用される。
上記のこうした併用療法は、併用投与（２つ以上の治療剤が、同一または別々の組成物に含まれている）、及び、本発明のイムノコンジュゲートの投与が、追加の治療剤及び／又はアジュバントの投与の前、同時、及び／又はその後に起きうる分離投与を包含する。本発明のイムノコンジュゲートはまた放射線治療と併用して用いることができる。
製造品
本発明の他の態様では、上記の疾患の治療、予防及び／又は診断に有用な物質を含む製造品が提供される。該製造品は容器と該容器上又は該容器に付随するラベル又はパッケージ挿入物を具備する。好適な容器には、例えば、ビン、バイアル、シリンジ、ＩＶ液バッグ等々が含まれる。容器は、様々な材料、例えばガラス又はプラスチックから形成されうる。容器は、症状を治療、予防及び／又は診断するために有効な組成物単独又は他の組成物と組み合わせる組成物を収容し、滅菌アクセスポートを有しうる（例えば、容器は皮下注射針が貫通可能なストッパーを有するバイアル又は静脈内投与溶液バッグでありうる）。組成物中の少なくとも一つの活性剤は本発明のイムノコンジュゲートである。ラベル又はパッケージ挿入物は、組成物が選択された症状の治療に使用されることを示す。更に、製造品は、（ａ）本発明のイムノコンジュゲートを含有する組成物を中に収容する第一の容器と（ｂ）更なる細胞障害剤又はそれ以外の治療薬を含有する組成物を中に収容する第二の容器とを含みうる。本発明のこの実施態様における製造品は、組成物を特定の症状の治療に使用することができることを示しているパッケージ挿入物を更に含む。あるいは、もしくは付加的に、製造品は、薬学的に許容されるバッファー、例えば注射用の静菌水（ＢＷＦＩ）、リン酸緩衝生理食塩水、リンガー液及びデキストロース溶液を含む第二の（又は第三の）容器を更に具備してもよい。更に、他のバッファー、希釈剤、フィルター、針、及びシリンジを含む、商業上及び使用者の見地から望ましい他の材料を含んでもよい。
以下は本発明の方法および組成物の例である。上記提供される一般的な説明を前提として、他の様々な実施態様が実施され得ることが理解される。
実施例１：
一般的な方法
組換えＤＮＡ技術
Sambrook et al., Molecular cloning: A laboratory manual; Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York, 1989に既述されるように、標準的な方法がＤＮＡを操作するために使用された。分子生物学的試薬を、製造元の指示に従って使用した。ヒト免疫グロブリンの軽鎖及び重鎖の塩基配列に関する一般情報については次に与えられる：Kabat, E.A. et al., (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Ed., NIH Publication No 91-3242。
ＤＮＡ配列決定
ＤＮＡ配列は、二本鎖配列決定により決定した。
遺伝子合成
必要な場合、所望の遺伝子を、適切な鋳型を使用してＰＣＲによって生成するか、又は自動化遺伝子合成による合成オリゴヌクレオチド及びＰＣＲ産物からＧｅｎｅａｒｔ ＡＧ（Regensburg, Germany）によって合成した。正確な遺伝子配列が入手可能でない場合、オリゴヌクレオチドプライマーを最も近いホモログからの配列に基づいて設計し、遺伝子を適切な組織に由来するＲＮＡからＲＴ−ＰＣＲによって単離した。特異な制限エンドヌクレアーゼ切断部位に隣接する遺伝子セグメントを標準のクローニング／シークエンシングベクターにクローン化した。プラスミドＤＮＡを形質転換した細菌から精製し、ＵＶ分光法により濃度を決定した。サブクローニング遺伝子断片のＤＮＡ配列を、ＤＮＡ配列決定によって確認した。遺伝子セグメントは、それぞれの発現ベクター中にサブクローニングできるように適切な制限部位を伴って設計された。全てのコンストラクトは、真核細胞内の分泌のためにタンパク質を標的とするリーダーペプチドをコードする５’末端ＤＮＡ配列を含んでいた。配列番号８から１６は、典型的なリーダーペプチドを提供し、ポリヌクレオチド配列はそれらをコードする。
ＩＬ−２Ｒ βγサブユニット−Ｆｃ融合体及びＩＬ−２Ｒ αサブユニットＦｃ融合体の調製
ＩＬ−２受容体結合の親和性を試験するために、ヘテロ二量体ＩＬ−２受容体の発現を可能にするツールが生成され；「ノブ・イントゥ・ホール（knobs-into-holes）」技術を用いて、ＩＬ−２受容体のβサブユニットが、ヘテロ二量体化（Ｆｃ（ホール））（配列番号１７及び１８を参照）するように操作されたＦｃ分子に融合された（Merchant et al., Nat Biotech. 16, 677-681 (1998)）。次いでＩＬ−２受容体のγサブユニットがＦｃ（ノブ）変異体（配列番号１９及び２０）へ融合され、Ｆｃ（ホール）とヘテロ二量体化した。次いでこのヘテロ二量体化Ｆｃ融合タンパク質は、ＩＬ−２／ＩＬ−２受容体相互作用を解析するために基質として使用された。ＩＬ−２Ｒαサブユニットが、ＡｃＴｅｖ開裂部位とＡｖｉ Ｈｉｓタグを持つ単量体鎖として発現された（配列番号２１及び２２）。それぞれのＩＬ−２Ｒサブユニットを、ＩＬ−２Ｒβγサブユニットコンストラクトについては血清を含み、α−サブユニットコンストラクトについては血清を含まずに、一過性にＨＥＫ ＥＢＮＡ２９３で発現させた。ＩＬ−２ＲβγサブユニットコンストラクトはプロテインＡで精製され（GE Healthcare）、続いてサイズ排除クロマトグラフィーで精製した（GE Healthcare, Superdex 200）。ＩＬ−２Ｒαサブユニットは、ＮｉＮＴＡカラム（Qiagen）上でＨｉｓタグを介して精製され、続いてサイズ排除クロマトグラフィーで精製した（GE Healthcare, Superdex 75）。様々な受容体コンストラクトのヌクレオチド配列に対応するアミノ酸が配列番号１７〜２２及び２５５〜２６８に与えられる。
イムノコンジュゲートの調製
ＦＡＰを指向する抗原結合部分の生成及び親和性成熟についての詳細は、その全体が出典明記により本明細書に援用されるＰＣＴ特許出願公開番号ＷＯ２０１２／０２０００６に追加された実施例に見いだすことができる。そこに記載されるように、ＦＡＰを指向した様々な抗原結合ドメインが、ファージディスプレイにより生成され、以下の実施例で使用される４Ｇ８、２８Ｈ１及び４Ｂ９と指定されたものを含む。クローン２８Ｈ１は親クローンの４Ｇ８ベースの親和性成熟抗体であるが、クローン４Ｂ９は親クローン３Ｆ２ベースの親和性成熟抗体である。本明細書に使用されている２Ｂ１０と指定される抗原結合ドメインは、テネイシンＣのＡ２ドメイン（ＴＮＣ Ａ２）に指向される。ＴＮＣ Ａ２を指向するこれと他の抗原結合部分についての詳細は、その全体が出典明記により本明細書に援用されるＰＣＴ特許出願公開番号ＷＯ２０１２／０２００３８号に見いだすことができる。Ｌ１９と指定される抗原結合ドメインは、フィブロネクチンのエキストラドメインＢ（ＥＤＢ）を指向し、ＰＣＴ特許出願公開番号ＷＯ２００７／１２８５６３に記載されるＬ１９抗体に由来する。本明細書で使用されるＣＨ１Ａ１Ａ及びＣＨ１Ａ１Ａ ９８／９９ ２Ｆ１と指定された抗原結合ドメインはＣＥＡに対して指向し、その詳細は、その全体が出典明記により本明細書に援用されるＰＣＴ特許出願公開番号ＰＣＴ／ＥＰ２０１２／０５３３９０に記載される。
以下の実施例の幾つかでエフェクター部分として使用されるＩＬ−２四重変異体（ｑｍ）は、詳細が、その全体が出典明記により本明細書に援用されるＰＣＴ特許出願公開番号ＰＣＴ／ＥＰ２０１２／０５１９９１に記載される。簡潔には、ＩＬ−２ ｑｍは、以下の変異によって特徴付けられる。
１．Ｔ３Ａ−予測Ｏ−糖鎖付加部位のノックアウト
２．Ｆ４２Ａ−ＩＬ−２／ＩＬ−２Ｒα相互作用のノックアウト
３．Ｙ４５Ａ−ＩＬ−２／ＩＬ−２Ｒα相互作用のノックアウト
４．Ｌ７２Ｇ−ＩＬ−２／ＩＬ−２Ｒα相互作用のノックアウト
５．Ｃ１２５Ａ−ジスルフィド架橋ＩＬ−２二量体を避けるための変異
Ｔ３Ａ変異は、それを含むＩＬ−２ ｑｍポリペプチド又はイムノコンジュゲートが例えば、ＣＨＯまたはＨＥＫ２９３細胞などの真核細胞で発現されるときに、Ｏ−グリコシル化部位を排除しより高い均一性および純度のタンパク質生成物を得るために選択された。３つの変異Ｆ４２Ａ、Ｙ４５Ａ及びＬ７２Ｇは、ＩＬ−２受容体のαサブユニット、ＣＤ２５への結合を妨げるために選択された。ＣＤ２５結合の減少または消滅は、活性化誘導細胞死（ＡＩＣＤ）、調節性Ｔ細胞の選択的活性化の欠如、並びに毒性の減少を生じた（欧州特許出願公開第１１１５３９６４．９号に記載されるように）。
ＤＮＡ配列は、遺伝子合成及び／又は古典的な分子生物学の技術によって生成され、ＭＰＳＶプロモーターの制御下で、哺乳動物発現ベクター中、合成ポリＡ部位の上流に、サブクローニングし、各ベクターがＥＥＢＶ ＯｒｉＰ配列を保有する。下記の実施例に適用されるイムノコンジュゲートは、リン酸カルシウムトランスフェクションを用いて、指数関数的に増殖しているＨＥＫ２９３−ＥＢＮＡ細胞を哺乳動物発現ベクターとともに共トランスフェクトすることにより産生された。あるいは、懸濁液中で増殖するＨＥＫ２９３細胞を、それぞれの発現ベクターを用いてポリエチレンイミン（ＰＥＩ）によりトランスフェクトした。あるいは、安定的にトランスフェクトされたＣＨＯ細胞プール又はＣＨＯ細胞クローンを無血清培地での生産のために使用した。続いて、ＩｇＧ−サイトカイン融合タンパク質を上清から精製した。簡単に述べると、ＩｇＧ−サイトカイン融合タンパク質は、２０ｍＭリン酸ナトリウム、２０ｍＭのクエン酸ナトリウムｐＨ７．５中で平衡化されたプロテインＡ（HiTrap ProtA, GE Healthcare）による一親和性工程で精製した。上清をロードした後、カラムを最初に２０ｍＭリン酸ナトリウム、２０ｍＭクエン酸ナトリウム、ｐＨ７．５で洗浄し、続いて１３．３ｍＭリン酸ナトリウム、２０ｍＭクエン酸ナトリウム、５００ｍＭ塩化ナトリウム、ｐＨ５．４５で洗浄した。ＩｇＧ−サイトカイン融合タンパク質は、２０ｍＭクエン酸ナトリウム、１００ｍＭ塩化ナトリウム、１００ｍＭグリシンｐＨ３で溶出した。画分を中和し、プールし、最終製剤緩衝液：２５ｍＭリン酸カリウム、１２５ｍＭ塩化ナトリウム、１００ｍＭグリシンｐＨ６．７でサイズ排除クロマトグラフィー（HiLoad 16/60 Superdex 200, GE Healthcare）によって精製した。典型的な詳細な精製手順および結果が以下の選択されたコンストラクトにおいて与えられる。精製されたタンパク質サンプルのタンパク質濃度を、アミノ酸配列に基づいて計算されたモル吸光係数を用いて、２８０ｎｍでの光学密度（ＯＤ）を測定することによって決定した。イムノコンジュゲートの純度及び分子量は、還元剤（５ｍＭの１，４−ジチオトレイトール）の存在下及び非存在下でのＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分析され、クマシーブルー（SimpleBlueTM SafeStain,インビトロジェン）により染色される。ＮｕＰＡＧＥ（登録商標）Ｐｒｅ−Ｃａｓｔゲルシステム（インビトロジェン）を、製造業者の取扱説明書に従って使用した（４−２０％のトリスグリシン・ゲル又は３−１２％のＢｉｓ−Ｔｒｉｓ）。イムノコンジュゲートサンプルの凝集体量を、２ｍＭのＭＯＰＳ、１５０ｍＭのＮａＣｌ、０．０２％のＮａＮ３、ｐＨ７．３の泳動バッファー中、２５℃にてＳｕｐｅｒｄｅｘ２００ １０／３００ＧＬ分析用サイズ排除カラム(GE Healthcare)を使用して分析した。還元した抗体軽鎖及び重鎖のアミノ酸骨格の完全性を、ペプチド−Ｎ−グリコシダーゼＦ（Roche Molecular Biochemicals）での酵素的処理によるＮ−グリカンの除去後のナノエレクトロスプレー(NanoElectrospray) Ｑ−ＴＯＦ質量分析によって確認することができる。イムノコンジュゲートのＦｃドメインに結合したオリゴ糖は、後述するように、ＭＡＬＤＩ ＴＯＦ−ＭＳによって分析される。オリゴ糖はＰＮＧａｓｅＦ消化によりイムノコンジュゲートから酵素的に放出される。放出オリゴ糖を含む得られた消化溶液は、ＭＡＬＤＩ ＴＯＦ−ＭＳ分析のために直接調製されるか、又はＭＡＬＤＩ ＴＯＦ−ＭＳ分析のためのサンプル調製に先立ち、ＥｎｄｏＨグリコシダーゼで更に消化する。
実施例２：
ＦＡＰ−標的化ＩｇＧ−ＩＬ−２ ｑｍ融合タンパク質は、ＦＡＰ−抗体４Ｇ８、２８Ｈ１及び４Ｂ９に基づいて生成され、ここでは図２Ａに示すように、一つのＩＬ−２四重変異体（ｑｍ）が一つのヘテロ二量体化重鎖のＣ末端に融合したことを特徴とする。ＦＡＰが選択的に発現される腫瘍間質への標的化は、二価抗体のＦａｂ領域を介して達成される（アビディティー効果）。単一のＩＬ−２四重変異体の存在下で生じるヘテロ二量体は、ノブ・イントゥ・ホール技術の適用によって達成される。ホモ二量体ＩｇＧ−サイトカイン融合体の生成を最小限にするために、サイトカインは、（Ｇ４Ｓ）３またはＧ４−（ＳＧ４）２リンカーを介してノブを含むＩｇＧ重鎖の（Ｃ末端Ｌｙｓ残基の欠失を有する）Ｃ−末端に融合させた。抗体−サイトカイン融合体は、ＩｇＧ様特性を有する。ＦｃγＲ結合／エフェクター機能を低下させ、ＦｃＲ同時活性化を防止するために、Ｐ３２９Ｇ Ｌ２３４Ａ Ｌ２３５Ａ（ＬＡＬＡ）の変異がＦｃドメインに導入された。これらのイムノコンジュゲートの配列が、配列番号１９３、２６９及び２０５（（Ｇ４Ｓ）３リンカーを含む２８Ｈ１）、配列番号１９３、１９５及び２０５（Ｇ４−（ＳＧ４）２リンカーを含む２８Ｈ１）、配列番号２０１、２０３及び２０５（Ｇ４−（ＳＧ４）２リンカーを含む４Ｇ８）、配列番号２０７、２０９及び２１１（Ｇ４−（ＳＧ４）２リンカーを含む４Ｂ９）、配列番号２０７、２７１及び２１１（（Ｇ４Ｓ）３リンカーを含む４Ｂ９）に与えられる。
更に、抗ＣＥＡ抗体ＣＨ１Ａ１Ａ ９８／９９ ２Ｆ１ベースのＣＥＡ標的化ＩｇＧ−ＩＬ−２ ｑｍの融合タンパク質、ＩｇＧが指定された標的に結合しない、コントロールＤＰ４７ＧＳ非標的化ＩｇＧ−ＩＬ−２ ｑｍの融合タンパク質、並びにテネイシン−ＣのＡ２ドメインを標的とする腫瘍間質特異的２Ｂ１０ベースのＩｇＧ−ＩＬ−２ ｑｍ融合タンパク質が生成された。これらのイムノコンジュゲートの配列が、配列番号２７５、２８１及び２８３（Ｇ４−（ＳＧ４）２リンカーを含むＣＨ１Ａ１Ａ ９８／９９ ２Ｆ１）、配列番号２７７、２８１及び２８３（（Ｇ４Ｓ）３リンカーを含むＣＨ１Ａ１Ａ ９８／９９ ２Ｆ１）、配列番号２１９、２２１及び２２５（Ｇ４−（ＳＧ４）２リンカーを含むＤＰ４７ＧＳ）、配列番号２１９、２８９及び２２５（ＳＧ４−（ＳＧ４）２リンカーを含むＤＰ４７Ｇ）、配列番号２８５、２８７及び２３９（（Ｇ４Ｓ）３リンカーを含む２Ｂ１０）に与えられる。コンストラクトはＨＥＫ２９３ ＥＢＮＡ細胞における一過性発現によって生成され、上記のように精製した。図３から９は、精製の典型的なクロマトグラム及び溶出プロファイル（Ａ、Ｂ）、並びに最終の精製されたコンストラクトの分析用ＳＤＳ−ＰＡＧＥ及びサイズ排除クロマトグラフィー（Ｃ、Ｄ）を示す。一過性の発現収率は、４Ｇ８ベースのＩｇＧ−ＩＬ−２ ｑｍイムノコンジュゲートで４２ｍｇ／Ｌ、２８Ｈ１ベースのＩｇＧ−ＩＬ−２ ｑｍイムノコンジュゲートで２０ｍｇ／Ｌ、ＣＨ１Ａ１Ａ ９８／９９ ２Ｆ１ベースのＩｇＧ−ＩＬ−２ ｑｍイムノコンジュゲートで１０ｍｇ／Ｌ、ＣＨ１Ａ１Ａ ９８／９９ ２Ｆ１ベースのＩｇＧ−ＩＬ−２ ｑｍイムノコンジュゲートで５．３ｍｇ／Ｌ、２Ｂ１０ベースのＩｇＧ−ＩＬ−２ ｑｍイムノコンジュゲートで３６．７ｍｇ／Ｌ及びＤＰ４７ＧＳベースのＩｇＧ−ＩＬ−２ ｑｍイムノコンジュゲートで１３．８ｍｇ／Ｌであった。
更に、２８Ｈ１ベースのＦＡＰ標的化ＩｇＧ−ＩＬ−１５イムノコンジュゲートが生成され、その配列は配列番号１９３、１９９及び２０５に与えられる。ＩＬ−１５ポリペプチド配列において、ＩＬ−１５受容体のαサブユニットへの結合を減少させるために、５３位のグルタミン酸残基がアラニンで置換され、グリコシル化を消滅するために、７９位のアスパラギン残基がアラニンに置換される。ＩｇＧ−ＩＬ−１５融合タンパク質は、一過性発現によって生成され、上記のように精製される。
ＦＡＰ結合親和性
４Ｇ８及び２８Ｈ１抗ＦＡＰ抗体に基づいたＩｇＧ−ＩＬ−２ ｑｍイムノコンジュゲートのＦＡＰ結合活性が、対応する非修飾型ＩｇＧ抗体に比較してＢｉａｃｏｒｅ機器で表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）によって測定された。簡潔には、抗Ｈｉｓ抗体（Penta-His, Qiagen 34660）をＣＭ５チップ上に固定し、１０ｎＭのＨｉｓタグ付ヒトＦＡＰ（２０ｓ）を捕獲した。温度は２５℃であり、ＨＢＳ−ＥＰを緩衝液として使用した。分析物濃度は５０ｎＭから０．０５ｎＭまで下がり、流量は５０μｌ／分（会合：３００ｓ，解離：９００ｓ、再生：６０ｓ１０ｍＭグリシンｐＨ２）だった。フィッティングを１：１結合モデル、ＲＩ＝０、Ｒｍａｘ＝ｌｏｃａｌ（捕獲フォーマットのため）に基づいて実施した。以下の表は、１：１結合モデル、ＲＩ＝０、Ｒｍａｘ＝ｌｏｃａｌを用いて適合したＳＰＲによって測定された、推定される見かけの二価の親和性（ｐＭアビディティ）を与える。
データは、この方法の誤差の範囲内で、対応する未修飾抗体と比較した場合、ヒトＦＡＰの親和性は２８Ｈ１ベースのイムノコンジュゲートでは保持され、又は４Ｇ８ベースのイムノコンジュゲートではほんのわずか減少したことを示している。
同様に、４Ｂ９ ＩｇＧ−ＩＬ−２ ｑｍ（１６ｐＭ）、ＣＨ１Ａ１Ａ ９８／９９ ２Ｆ１ ＩｇＧ−ＩＬ−２ ｑｍ（４００ｐＭ）、ＣＨ１Ａ１Ａ ９８／９９ ２Ｆ１ ＩｇＧ−ＩＬ−２ ｗｔ（実施例４参照；４７０ｐＭ）、及び２Ｂ１０ ＩｇＧ−ＩＬ−２ ｑｍ（非結合型２Ｂ１０ ＩｇＧにおいて１５０ｐＭ対３００ｐＭ）のヒトＦＡＰ、ＣＥＡ及びＴＮＣ Ａ２に対するそれぞれの親和性（ＫＤ）が２５℃でＳＰＲによって測定された。ヒト、マウス及びカニクイザルのＦＡＰ又はＴＮＣ Ａ２のそれぞれに対する４Ｂ９および２Ｂ１０抗体の交差反応性もまた確認された。
続いて、ＩＬ−２Ｒβγヘテロ二量体とＩＬ−２Ｒαサブユニットへの４Ｇ８−及び２８Ｈ１ベースのＩｇＧ−ＩＬ−２ ｑｍイムノコンジュゲートの親和性を表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）により測定し、ＰＣＴ特許出願ＰＣＴ／ＥＰ２０１２／０５１９９１に記載されたＦａｂ−ＩＬ−２ ｑｍ−Ｆａｂ−イムノコンジュゲートのフォーマットと直接比較した。簡単に言うと、リガンド−ヒトＩＬ−２Ｒαサブユニット又はヒトＩＬ−２Ｒβγヘテロ二量体のどちらか−をＣＭ５チップ上に固定化した。続いて、比較のために４Ｇ８−及び２８Ｈ１ベースのＩｇＧ−ＩＬ−２ ｑｍイムノコンジュゲート又は４Ｇ８−及び２８Ｈ１ベースのＦａｂ−ＩＬ−２ ｑｍ−Ｆａｂイムノコンジュゲートが、分析物として、３００ｎＭから下限１．２ｎＭの範囲の濃度でＨＢＳ−ＥＰ緩衝液中で２５℃でチップに適用された（１：３希釈）。流速は３０μｌ／分で以下の条件が、会合：１８０ｓ、解離：３００ｓ、及び再生：ＩＬ−２Ｒ βγヘテロ二量体では３ＭのＭｇＣｌ２を含み２ｘ３０ｓ、ＩＬ−２Ｒ α−サブユニットでは５０ｍＭのＮａＯＨを含み１０ｓに適用された。１：１結合がフィッティングに適用された（１：１結合 ＲＩ≠０、Ｒｍａｘ＝ｌｏｃａｌ（ＩＬ−２Ｒ βγにおいて）、見かけのＫＤ、１：１結合ＲＩ＝０、Ｒｍａｘ＝ｌｏｃａｌ（ＩＬ−２Ｒ αにおいて）。それぞれのＫＤ値を以下の表に示す。
本データは、４Ｇ８−及び２８Ｈ１ベースのＩｇＧ−ＩＬ−２ ｑｍイムノコンジュゲートは、Ｆａｂ−ＩＬ−２ ｑｍ−Ｆａｂイムノコンジュゲートと少なくとも同程度に良好な親和性でＩＬ−２Ｒβγヘテロ二量体に結合するが、それらはＣＤ２５の結合に干渉する変異の導入に起因してＩＬ−２Ｒαサブユニットに結合しないことを示している。それぞれのＦａｂ−ＩＬ−２ ｑｍ−Ｆａｂイムノコンジュゲートに比べて、ＩｇＧ−ＩＬ−２ ｑｍ融合タンパク質の親和性はこの方法の誤差の範囲内でわずかに増強されるように見える。
同様に、ＩＬ−２ ｗｔ（実施例４参照）又はＩＬ−２ ｑｍのどちらかを含む更なるコンストラクト（４Ｂ９、ＤＰ４７ＧＳ、２Ｂ１０、ＣＨ１Ａ１Ａ ９８／９９ ２Ｆ１）のＩＬ−２Ｒβγヘテロ二量体及びＩＬ−２Ｒαサブユニットに対する親和性が２５℃でＳＰＲによって測定された。全てのコンストラクトにおいて、ヒトＩＬ−２Ｒβγヘテロ二量体の見かけのＫＤは、（コンストラクトがＩＬ−２ ｗｔ又はＩＬ−２ ｑｍを含むかどうかに関わらず）６と１２ｎＭの間であったが、ＩＬ−２ ｗｔを含むコンストラクトだけがＩＬ−２Ｒαサブユニットに結合する（ヒトＩＬ−２ＲαのＫＤは２０ｎＭ程度）。
ＩｇＧ−サイトカインイムノコンジュゲートとの生物学的活性アッセイ
ＦＡＰ標的化４Ｇ８ベースのＩｇＧ−ＩＬ−２ ｑｍ融合体の生物学的活性を、市販のＩＬ−２（Proleukin, Novartis/Chiron）及び／又はＥＰ１１１５３９６４．９に記載されるＦａｂ−ＩＬ−２Ｆａｂイムノコンジュゲートと比較して幾つかの細胞アッセイで調べた。
ＦＡＰ発現細胞への結合
ＦＡＰ標的化４Ｇ８ベースのＩｇＧ−ＩＬ−２ ｑｍイムノコンジュゲートの、安定的にトランスフェクトしたＨＥＫ２９３細胞に発現したヒトＦＡＰに対する結合を、ＦＡＣＳにより測定した。簡潔には、丸底９６ウェルプレートにおいて、ウェルあたり２５００００細胞を、イムノコンジュゲートの指示された濃度でインキュベートし、４℃で３０分間インキュベートし、ＰＢＳ／０．１％のＢＳＡで１回洗浄した。結合したイムノコンジュゲートを、ＦＡＣＳ ＣａｎｔｏＩＩ（Software FACS Diva）を使用して、ＦＩＴＣ結合ＡｆｆｉｎｉＰｕｒｅ Ｆ（ａｂ’）２断片ヤギ抗ヒトＦ（ａｂ’）２ Ｓｐｅｃｉｆｉｃ（Jackson Immuno Research Lab #109-096-097、希釈標準溶液：ＰＢＳ／０．１％ＢＳＡで１：２０に希釈、新たに調製）を用いて４℃で３０分間インキュベーション後に検出した。結果を図１０に示す。本データは、ＩｇＧ−ＩＬ−２ ｑｍイムノコンジュゲートは、４Ｇ８ベースのＦａｂ−ＩＬ−２ ｑｍ−Ｆａｂコンストラクトのそれ（０．７ｎＭ）に匹敵する、０．９ｎＭのＥＣ５０値でＦＡＰ発現細胞に特異的に結合することを示している。
ＮＫ細胞によるＩＦＮ−γ放出（溶液中）
続いて、ＦＡＰ標的化４Ｇ８ベースのＩｇＧ−ＩＬ−２ ｑｍイムノコンジュゲートは、ＩＬ−２Ｒβγシグナル伝達の活性化によって誘発されるＮＫ９２細胞によるＩＦＮ−γ放出の誘導について研究された。簡潔には、ＩＬ−２欠乏ＮＫ９２細胞（９６Ｕウェルプレート中に１００，０００細胞／ウェル）を、四重変異体ＩＬ−２を含んでいる異なる濃度のＩＬ−２イムノコンジュゲートとともに、２４時間、ＮＫ培地中（１０％ＦＣＳ、１０％ウマ血清、０．１ｍＭの２−メルカプトエタノール、０．２ｍＭのイノシトールおよび０．０２ｍＭの葉酸を添加したインビトロジェンのＭＥＭアルファ（＃２２５６１−０２１））でインキュベートした。上清を回収し、ＩＦＮ−γの放出は、ベクトン・ディッキンソン（＃５５０６１２）からの抗ヒトＩＦＮ−γＥＬＩＳＡキットＩＩを使用して分析した。プロロイキン（ノバルティス）と２８Ｈ１ベースのＦａｂ−ＩＬ−２ ｑｍ−Ｆあｂは、細胞のＩＬ−２媒介性活性化の陽性対照とした。図１１は、ＦＡＰ標的化４Ｇ８ベースのＩｇＧ−ＩＬ−２ ｑｍイムノコンジュゲートは、ＩＦＮ−γの放出の誘導において、親和性成熟型２８Ｈ１ベースのＦａｂ−ＩＬ−２ ｑｍ−Ｆａｂイムノコンジュゲートと等しく有効であることを示している。
ＳＴＡＴ５リン酸化アッセイ
実験の最後の組において、我々は、ＳＴＡＴ５のリン酸化の誘導における、ＦＡＰ標的化４Ｇ８ベースのＩｇＧ−ＩＬ−２ ｑｍイムノコンジュゲートの効果を、２８Ｈ１ベースのＦａｂ−ＩＬ−２−Ｆａｂ及びＦａｂ−ＩＬ−２ ｑｍ−Ｆａｂイムノコンジュゲート、並びにヒトＰＢＭＣからのヒトＮＫ細胞、ＣＤ４＋ Ｔ細胞、ＣＤ８＋ Ｔ細胞、およびＴｒｅｇ細胞上のプロロイキンと比較して研究した。簡単に言えば、健康なボランティアからの血液をヘパリン含有注射器で採取し、ＰＢＭＣを単離した。ＰＢＭＣを指定した濃度で指定したイムノコンジュゲートで処理し、又は対照としてプロロイキン（ノバルティス）と処理した。３７℃で２０分間インキュベートした後、ＰＢＭＣを、３７℃で１０分間、予め温めたＣｙｔｏｆｉｘ緩衝液（Becton Dickinson #554655）を用いて固定し、その後４℃で３０分間Ｐｈｏｓｆｌｏｗ Ｐｅｒｍ Ｂｕｆｆｅｒ ＩＩＩ（Becton Dickinson #558050）で透過処理した。細胞を、０．１％ＢＳＡを含有するＰＢＳで２回洗浄し、その後異なる細胞集団およびＳＴＡＴ５のリン酸化の検出のため、ＦＡＣＳ染色をフローサイトメトリー抗体の混合物を使用して行った。サンプルはBecton DickinsonからのＨＴＳでＦＡＣＳＣａｎｔｏＩＩを用いて分析した。ＮＫ細胞はＣＤ３−ＣＤ５６＋として定められ、ＣＤ８陽性Ｔ細胞はＣＤ３＋ＣＤ８＋として定められ、ＣＤ４陽性Ｔ細胞はＣＤ４＋ＣＤ２５−ＣＤ１２７＋として定められ、Ｔｒｅｇ細胞はＣＤ４＋ＣＤ２５＋ＦｏｘＰ３＋として定められた。ＣＤ２５の発現が非常に低いか又は全く発現を示さないＮＫ細胞およびＣＤ８＋ Ｔ細胞においては（ＩＬ−２Ｒのシグナル伝達は、主に、ＩＬ−２Ｒβγヘテロ二量体によって媒介されることを意味する）、結果は、４Ｇ８ベースのＩｇＧ−ＩＬ−２ ｑｍイムノコンジュゲートは、プロロイキンよりもＳＴＡＴ５のリン酸化の誘導が１０倍より強くなく、２８Ｈ１ベースのＦａｂ−ＩＬ−２のＦａｂおよびＦａｂ−ＩＬ−２ ｑｍ−Ｆａｂのイムノコンジュゲートよりもわずかに強いことを示している。刺激されるとＣＤ２５の急速な上方制御を示すＣＤ４＋ Ｔ細胞においては、４Ｇ８ベースのＩｇＧ−ＩＬ−２ｑｍイムノコンジュゲートは、２８Ｈ１ Ｆａｂ−ＩＬ−２−Ｆａｂイムノコンジュゲートよりも弱かったが、２８Ｈ１ Ｆａｂ−ＩＬ−２ ｑｍ−Ｆａｂイムノコンジュゲートよりわずかに強力なであり、プロロイキン及び２８Ｈ１ Ｆａｂ−ＩＬ−２−Ｆａｂと同等の飽和濃度でなおＩＬ−２Ｒシグナル伝達の誘導を示していた。このことは、４Ｇ８ベースのＩｇＧ−ＩＬ−２ ｑｍイムノコンジュゲートの効力が、Ｔｒｅｇ細胞における高度なＣＤ２５の発現、及びＣＤ２５に対する４Ｇ８ベースのＩｇＧ−ＩＬ−２ ｑｍイムノコンジュゲートの低い結合親和性に起因して、Ｆａｂ−ＩＬ−２−Ｆａｂイムノコンジュゲートに比べて著しく低下しているＴｒｅｇ細胞とは対照的である。４Ｇ８ベースのＩｇＧ−ＩＬ−２ ｑｍイムノコンジュゲートにおけるＣＤ２５結合の消滅の結果、Ｔｒｅｇ細胞におけるＩＬ−２シグナル伝達は、ＩＬ−２Ｒのシグナル伝達がＩＬ−２Ｒβγヘテロ二量体を通じてＣＤ２５陰性エフェクター細胞上で活性化された濃度で、ＩＬ−２Ｒ βγヘテロ二量体を介してのみ活性化される。まとめると、４Ｇ８ベースのＩｇＧ−ＩＬ−２ ｑｍイムノコンジュゲートは、ＩＬ−２Ｒβγヘテロ二量体を通じて、ＩＬ−２Ｒのシグナル伝達を活性化することができるが、他のエフェクター細胞よりもＴｒｅｇ細胞の優先的な刺激をもたらさない。これらの実験の結果を図１２に示す。
２Ｂ１０ ＩｇＧ−ＩＬ−２ ｑｍのＴＮＣ Ａ２発現細胞への結合
ＴＮＣ Ａ２を標的とした２Ｂ１０ ＩｇＧ−ＩＬ−２ ｑｍイムノコンジュゲートの、Ｕ８７ＭＧ細胞上に発現されるヒトＴＮＣ Ａ２に対する結合がＦＡＣＳにより測定される。簡潔には、丸底９６ウェルプレートにおいて、ウェルあたり２０００００細胞を、イムノコンジュゲートの指示された濃度でインキュベートし、４℃で３０分間インキュベートし、ＰＢＳ／０．１％のＢＳＡで２回洗浄した。結合したイムノコンジュゲートを、ＦＡＣＳ ＣａｎｔｏＩＩ（Software FACS Diva）を使用して、ＦＩＴＣ結合ＡｆｆｉｎｉＰｕｒｅ Ｆ（ａｂ’）２断片ヤギ抗ヒトＩｇＧ Ｆｃγ Ｓｐｅｃｉｆｉｃ（Jackson Immuno Research Lab #109-096-098、希釈標準溶液：ＰＢＳ／０．１％ＢＳＡで１：２０に希釈、新たに調製）を用いて４℃で３０分間インキュベーション後に検出した。結果を図１３に示す。データは、２Ｂ１０ ＩｇＧ−ＩＬ−２ ｑｍイムノコンジュゲートは、ＴＮＣ Ａ２発現Ｕ８７ＭＧ細胞対して、対応する非結合型ＩｇＧと等しく良好に結合する。
ＩｇＧ−ＩＬ−２イムノコンジュゲートによるＮＫ９２細胞増殖の誘導
２Ｂ１０ ＩｇＧ−ＩＬ−２ ｑｍ、ＣＨ１Ａ１Ａ ９８／９９ ２Ｆ１ ＩｇＧ−ＩＬ−２ ｑｍ、ＣＨ１Ａ１Ａ ９８／９９ ２Ｆ１ ＩｇＧ−ＩＬ−２ ｗｔ、４Ｂ９ ＩｇＧ−ＩＬ−２ ｑｍ及び４Ｂ９ ＩｇＧ−ＩＬ−２ ｗｔイムノコンジュゲートがＮＫ９２細胞の増殖を誘導するそれらの能力について試験された。増殖アッセイにおいて、ＮＫ９２細胞を、２時間、ＩＬ−２を含まない培地中で飢餓状態にし、１００００細胞／ウェルで平底９６ウェルプレートに播種し、次いでＩＬ−２イムノコンジュゲートの存在下で、３７℃、５％ＣＯ２の加湿インキュベーター中で３日間インキュベートした。３日後、細胞溶解物のＡＴＰ含量は、ＰｒｏｍｅｇａからのＣｅｌｌＴｉｔｅｒ−Ｇｌｏ発光細胞生存率アッセイ（＃Ｇ７５７１／２／３）を用いて測定した。増殖の割合を算出し、１．１ｍｇ／ｍｌのプロロイキン（ノバルティス）濃度を１００％の増殖に、ＩＬ−２刺激を伴わない未処理細胞を０％の増殖に設定した。結果を図１４及び１５に示す。データは、全てのコンストラクトはＮＫ９２細胞増殖を誘導することができ、ＣＨ１Ａ１Ａベースのコンストラクトは２Ｂ１０ ＩｇＧ−ＩＬ−２ ｑｍイムノコンジュゲートよりも活性であり、ＩＬ−２ ｗｔを含むコンストラクトはＩＬ−２ ｑｍを含む対応するコンストラクトよりも活性であった。
実施例３：
一般に、それぞれのサイトカイン受容体がＦｃγＲシグナル伝達と共活性化されるときに、ＦｃγＲ結合／エフェクター機能を低下させ、よって過剰なサイトカイン放出を防ぐために、ほぼ完全ヒトＩｇＧ１抗体のＦｃγＲとの相互作用を消失したＰ３２９Ｇ ＬＡＬＡ変異（その全体が参照により本明細書に組み入れられる欧州特許出願ＥＰ１１１６０２５１．２を参照）が導入される。具体的な場合、例えば抗体が高度に腫瘍特異的抗原を標的としたとき、Ｆｃエフェクター機能は非修飾型ＩｇＧのＦｃドメインを使用して保持することができ、又はＩｇＧのＦｃドメインの糖鎖工学を介して更に強化することができる。
その一例として、我々は、一つのＩＬ−２四重変異体が、抗ＣＥＡ抗体クローンＣＨ１Ａ１Ａに基づいた（ＳＧ４）３−リンカーを介して１つのヘテロ二量体重鎖のＣ末端に融合された、ＣＥＡを標的としたＩｇＧ−ＩＬ−２ ｑｍイムノコンジュゲートを生成した。このイムノコンジュゲートには、Ｐ３２９Ｇ ＬＡＬＡ変異が含まれていなかった（配列番号２２７、２２９及び２３１を参照）。イムノコンジュゲートは、後述するようにヒト野生型ＩｇＧ−又は糖鎖操作型ＩｇＧ−ＩＬ−２ ｑｍ融合タンパク質として発現され精製された。
（糖鎖操作型）ＩｇＧ−ＩＬ−２ ｑｍイムノコンジュゲートの調製
ＣＥＡを標的としたＣＨ１Ａ１ＡベースのＩｇＧ−ＩＬ−２ ｑｍイムノコンジュゲートは、哺乳動物抗体発現ベクターによりＨＥＫ２９３−ＥＢＮＡ細胞を同時導入することにより産生した。指数関数的に増殖しているＨＥＫ２９３−ＥＢＮＡ細胞は、リン酸カルシウム法により遺伝子導入された。あるいは、懸濁液中で増殖しているＨＥＫ２９３細胞は、ポリエチレンイミンにより遺伝子導入される。非修飾型の非糖鎖操作型ＩｇＧ−ＩＬ−２ ｑｍイムノコンジュゲートの産生のために、細胞は、抗体の重鎖および軽鎖発現ベクターのみを１：１の比率で遺伝子導入した（抗体の重鎖ベクターは、二つのベクターの１：１混合物である：エフェクター部分を有する重鎖用のベクター、及びエフェクター部分のない重鎖用ベクター）。糖鎖操作型ＣＥＡ標的化ＩｇＧ−ＩＬ−２ ｑｍイムノコンジュゲートの産生に対しては、細胞に、２つの追加のプラスミド、一つはＧｎＴＩＩＩ融合ポリペプチド発現用（ＧｎＴ−ＩＩＩ発現ベクター）、もう一つはマンノシダーゼＩＩ発現用（ゴルジマンノシダーゼＩＩ発現ベクター）をそれぞれ４：４：１：１の比で同時導入した。細胞を、１０％のＦＣＳを補填したＤＭＥＭ培養培地を使用してＴフラスコ中で付着単層培養として増殖させ、それらが５０及び８０％集密になったときに形質移入した。Ｔ１５０フラスコの遺伝子導入では、ＦＣＳ（最終１０％Ｖ／Ｖで）を補填した２５ｍｌのＤＭＥＭ培養培地に遺伝子導入の２４時間前に１５００万細胞を播種し、細胞を５％ＣＯ２大気のインキュベーターに３７℃で一晩配した。遺伝子導入される各Ｔ１５０フラスコに対して、ＤＮＡ、ＣａＣｌ２及び水の溶液を、軽鎖及び重鎖発現ベクター間に等しく分配された９４μｇの全プラスミドベクターＤＮＡ、４６９μｌの最終容量までの水及び４６９μｌの１ＭのＣａＣｌ２溶液を混合することによって調製した。この溶液に、９３８μｌの５０ｍＭのＨＥＰＥＳ、２８０ｍＭのＮａＣｌ、１．５ｍＭのＮａ２ＨＰＯ４溶液（ｐＨ７．０５）を加え、直ぐに１０秒間混合し、室温で２０秒間静置した。懸濁液を、２％のＦＣＳを補填した１０ｍｌのＤＭＥＭで希釈し、既存の培地の代わりにＴ１５０フラスコに加えた。ついで、更なる１３ｍｌの遺伝子導入培地を加えた。細胞を約１７から２０時間、３７℃、５％ＣＯ２でインキュベートし、ついで培地を２５ｍｌのＤＭＥＭ、１０％ＦＣＳに置換した。条件培養培地を２１０×ｇでの１５分の遠心分離による培地交換から約７日後に収集した。溶液を滅菌濾過（０．２２μｍフィルター）し、０．０１％ｗ／ｖの最終濃度のアジ化ナトリウムを加え、４℃に維持した。
分泌された野生型又は糖鎖操作型ＣＥＡ ＩｇＧ−ＩＬ−２ ｑｍイムノコンジュゲートを、上述のように、プロテインＡ親和性クロマトグラフィーを用いた親和性クロマトグラフィーにより、その後ＨｉＬｏａｄ Ｓｕｐｅｒｄｅｘ２００カラム（GE Healthcare）上でのサイズ排除クロマトグラフィー工程により細胞培養上清から精製した。上述したように、タンパク質濃度、純度、分子量、凝集体含有量および完全性を分析した。
（糖鎖操作型）ＩｇＧ−ＩＬ−２ ｑｍイムノコンジュゲートのオリゴ糖構造解析
フコース含有オリゴ糖構造及び非フコシル化オリゴ糖構造の相対比の測定のために、精製したイムノコンジュゲート材料の放出されたグリカンをＭＡＬＤＩ ＴＯＦ質量分析法によって分析する。タンパク質骨格からオリゴ糖を放出するために、イムノコンジュゲートサンプル（約５０μｇ）を２ｍＭのＴｒｉｓ、ｐＨ７．０中で５ｍＵのＮ−グリコシダーゼＦ（ＱＡｂｉｏ；ＰＮＧａｓｅＦ：Ｅ−ＰＮＧ０１）と一緒に３７℃にて一晩インキュベートするグリカンの脱アミノ化のために、酢酸が最終濃度１５０ｍＭまで添加され、３７℃で１時間インキュベートされる。ＭＡＬＤＩ ＴＯＦ質量分析法による分析のために、２μＬのサンプルがを２μＬのＤＨＢマトリックス溶液（４ｍｇ／ｍｌで５０％エタノール／５ｍＭのＮａＣｌに溶解された２，５−ジヒドロキシ安息香酸[Bruker Daltonics #201346]）とともにＭＡＬＤＩターゲット上で混合され、ＭＡＬＤＩ ＴＯＦ質量分析計ＡｕｔｏｆｌｅｘＩＩ測定器(Bruker Daltonics）で分析される。日常的に、５０から３００ショットが記録され、単一の実験にまとめられる。得られたスペクトルを、フレックス分析ソフトウェア(Bruker Daltonics）によって評価し、そして質量を検出したピークのそれぞれについて決定する。続いて、計算した質量を、それぞれの構造物（例えばそれぞれフコースを含む及び含まない複合体、ハイブリッド、及びオリゴ又は高マンノース）について理論的に予想した質量を比較することによって、ピークをフコース含有及び非フコシル化糖鎖構造物に割り当てる。
ハイブリッド構造の比率を決定するために、抗体サンプルはＮ−グリコシダーゼＦとＥｎｄｏ−グリコシダーゼＨ［ＱＡｂｉｏ；ＥｎｄｏＨ：Ｅ−ＥＨ０２］とで同時に消化される。Ｎ−グリコシダーゼＦはタンパク質骨格から全てのＮ−結合型糖鎖構造（複合体、ハイブリッド、及びオリゴ及び高マンノース構造）を放出し、ＥｎｄｏグリコシダーゼＨは、グリカンの還元末端で、２つのＮ−アセチルグルコサミン（ＧｌｃＮＡｃ）残基の間の全てのハイブリッドタイプのグリカンをさらに開裂する。この消化物は、その後、Ｎ−グリコシダーゼＦ消化サンプルについて上記と同様にＭＡＬＤＩ ＴＯＦ質量分析法によって処理され、分析される。Ｎ−グリコシダーゼＦ消化物からのパターンをＮ−グリコシダーゼＦ／Ｅｎｄｏ Ｈの組み合わせによる消化物と比較することにより、特定の糖鎖構造のシグナルの減少の程度が、ハイブリッド構造の相対含量を推定するために使用される。各糖鎖構造の相対的な量は、個々の構造のピーク高さと検出された全オリゴ糖のピーク高さの和との比から算出される。フコースの量は、Ｎ−グリコシダーゼＦ処理した試料（例えば、複合体、ハイブリッド、及びオリゴ及び高マンノース構造物）に同定された全ての糖鎖構造に関連したフコース含有構造の割合である。非フコシル化の程度は、Ｎ−グリコシダーゼＦ処理した試料（例えば、複合体、ハイブリッド、及びオリゴ及び高マンノース構造物）に同定された全ての糖と比べたフコース欠失構造の割合である。
抗体依存性細胞傷害アッセイ
野生型及び糖鎖操作型ＣＥＡ標的化ＣＨ１Ａ１Ａ ＩｇＧ−ＩＬ−２ ｑｍイムノコンジュゲートを、抗体媒介性細胞傷害を媒介するそれらの可能性についてＡＤＣＣアッセイで比較された。簡潔には、ＣＥＡを過剰発現するＡ５４９ヒト腫瘍細胞を収集し、洗浄し、培地中に再懸濁し、３０分間３７℃で新たに調製したカルセインＡＭ（Molecular Probes）で染色し、３回洗浄し、カウントされ、３０００００細胞／ｍｌに希釈した。この懸濁液を丸底９６ウェルプレート（３００００細胞／ウェル）に移し、それぞれのイムノコンジュゲート希釈液を添加し、試験されたイムノコンジュゲートの細胞に対する結合を容易にするために、エフェクター細胞と接触させる前に、１０分間インキュベートした。新鮮に単離されたＰＢＭＣについてエフェクターと標的の比率は１〜２５であった。共インキュベーションは４時間実施された。二つの異なる読み出しシステムを使用した：攻撃された細胞の分解後の上清への乳酸デヒドロゲナーゼ（ＬＤＨ）の放出、及び残存生細胞におけるカルセインの保持。共培養上清からのＬＤＨはＬＤＨ検出キット(Roche Applied Science)を使用して収集され分析された。ＬＤＨ酵素による基質変換は、ＥＬＩＳＡ吸光リーダー（ＳｏｆｔＭａｘＰｒｏソフトウェア、リファレンス波長：４９０ｎｍ対６５０ｎｍ）を用いて測定された。ペレット化した細胞からの上清の残余を除去し、溶解前にＰＢＳ中での１回洗浄工程、及びホウ酸緩衝液（５０ｍＭのホウ酸、０．１％トリトン）による細胞の固定の後、生細胞における残留カルセインが蛍光リーダー（Wallac VICTOR3 1420 Multilabel COUNTER (Perkin Elmer))で分析された。
図１６は、ＬＤＨの検出に基づく結果を示している。同様の結果はカルセイン保持率に基づいて得られた（示さず）。両方のコンストラクトがＡＤＣＣを媒介することができ、糖鎖操作コンストラクトは、対応する糖鎖操作型非結合型ＩｇＧと同様に活性であった。期待どおりに、非糖鎖操作型コンストラクトは糖鎖操作型コンストラクトと比較して活性の低下を示した。
実施例４：
ＦＡＰ標的化２８Ｈ１又は４Ｂ９ベースの、ＣＥＡ標的化ＣＨ１Ａ１Ａ ９８／９９ ２Ｆ１ベースの、及び非標的化ＤＰ４７ＧＳベースのＩｇＧ−ＩＬ−２イムノコンジュゲートが産生され、ここでは一つの単一野生型ＩＬ−２ポリペプチドが、一本のヘテロ二量体重鎖のＣ末端へ融合している。単一のＩＬ−２部分を持つイムノコンジュゲートにおいて生じるヘテロ二量体は、ノブ・イントゥ・ホール技術の適用によって達成される。ホモ二量体ＩｇＧ−ＩＬ−２融合体の生成を最小限にするために、サイトカインは、Ｇ４−（ＳＧ４）２又はａ（Ｇ４Ｓ）３リンカーを介して、ノブを含むＩｇＧ重鎖（Ｃ末端Ｌｙｓ残基の欠失を有する）に融合させた。これらのイムノコンジュゲートの配列が、配列番号１９３、１９７及び２０５（Ｇ４−（ＳＧ４）２リンカーを含む２８Ｈ１）、配列番号２０７、２７３及び２１１（（Ｇ４Ｓ）３リンカーを含む４Ｂ９）、配列番号２７７、２７９及び２８３（（Ｇ４Ｓ）３リンカーを含むＣＨ１Ａ１Ａ ９８／９９ ２Ｆ１）、配列番号２１９、２２３及び２２５（Ｇ４−（ＳＧ４）２リンカーを含むＤＰ４７ＧＳ）、配列番号２１９、２９３及び２２５（（Ｇ４Ｓ）３リンカーを含むＤＰ４７ＧＳ）に与えられる。抗体−サイトカイン融合体は、ＩｇＧ様特性を有する。ＦｃγＲ結合／エフェクター機能を低下させ、ＦｃＲ同時活性化を防止するために、Ｐ３２９Ｇ ＬＡＬＡの変異がＦｃドメインに導入された。両方のコンストラクトは上記の方法に従って精製された。最終精製は、最終製剤緩衝液：２０ｍＭヒスチジン、１４０ｍＭ塩化ナトリウム、ｐＨ６において、サイズ排除クロマトグラフィー(HiLoad 26/60 Superdex 200、GE Healthcare)によって行われた。図１７から２０は、精製の各クロマトグラム及び溶出プロファイル（Ａ、Ｂ）、並びに最終の精製されたコンストラクトの分析用ＳＤＳ−ＰＡＧＥ及びサイズ排除クロマトグラフィー（Ｃ、Ｄ）を示す。収率は、非標的化ＤＰ４７ＧＳ ＩｇＧ−ＩＬ−２イムノコンジュゲートにおいて１５．６ｍｇ／Ｌ、２８Ｈ１ ＩｇＧ−ＩＬ−２イムノコンジュゲートにおいて２６．７ｍｇ／ｍｌ、ＣＨ１Ａ１Ａ ９８／９９ ２Ｆ１ ＩｇＧ−ＩＬ−２イムノコンジュゲートにおいて４．６ｍｇ／Ｌ、及び４Ｂ９ ＩｇＧ−ＩＬ−２イムノコンジュゲートにおいて１１ｍｇ／Ｌであった。
続いて、ＦＡＰに対する結合特性、それぞれの結合の欠如、並びにＩＬ−２Ｒ βγ及びＩＬ−２Ｒ αへの結合が上述のようにＳＰＲによって測定された（実施例２を参照）。免疫エフェクター細胞集団における細胞活性及びインビボでの薬力学的効果も検討した。
実施例５：
ＦＡＰ標的化４Ｇ８ベース、並びにＴＮＣ Ａ２標的化２Ｂ１０ベースのＩｇＧ−ＩＬ−１０イムノコンジュゲートが、２つの異なるＩＬ−１０サイトカインフォーマットを、ホール修飾を含んでなるヘテロ二量体ＩｇＧの重鎖のＣ末端へ融合させることにより構築された：（Ｇ４Ｓ）４２０量体リンカーが２つのＩＬ−１０分子の間に挿入された単鎖ＩＬ−１０、又は操作された単量体ＩＬ−１０のどちらか (Josephson et al., J Biol Chem 275, 13552-7 (2000))。両方の分子は、（Ｇ４Ｓ）３１５量体リンカーを介して、Ｃ末端Ｌｙｓ残基の欠失を伴い、ホール修飾を含んでなる重鎖のＣ末端へ融合された。ＩＬ−１０部分を保有する一重鎖のみにて生じる生じるヘテロ二量体は、ノブ・イントゥ・ホール技術の適用によって達成される。ＩｇＧ−サイトカイン融合体は、ＩｇＧ様特性を有する。ＦｃγＲ結合／エフェクター機能を低下させ、ＦｃＲ同時活性化を防止するために、Ｐ３２９Ｇ ＬＡＬＡの変異がイムノコンジュゲートのＦｃドメインに導入された。各コンストラクトの配列は配列番号２３３、２３５及び２３９（ｓｃＩＬ−１０を含む２Ｂ１０）、配列番号２３３、２３７及び２３９（単量体ＩＬ−１０“ＩＬ−１０Ｍ１”を含む２Ｂ１０）、配列番号２４１、２４３及び２０５（ｓｃＩＬ−１０を含む４Ｇ８）、配列番号２４１、２４５及び２０５（ＩＬ−１０Ｍ１を含む４Ｇ８）に与えられる。これらの全てのイムノコンジュゲートは上記の方法に従って精製された。続いて、ＦＡＰ又はＴＮＣ Ａ２のそれぞれに対する結合特性、並びにヒトＩＬ−１０Ｒ１へのそれらの親和性がＰｒｏｔｅＯｎ ＸＰＲ３６バイセンサーを用いてＳＰＲによって測定された。簡潔には、標的のＦＡＰ又はＴＮＣ Ａ２並びにヒトＩＬ−１０Ｒ１はセンサーチップ表面に垂直な配向で固定化された（ＦＡＰは標準的なアミンカップリングにより、ＴＮＣ Ａ２及びヒトＩＬ−１０Ｒ１（両方ともＣ末端ａｖｉ−タグを介してビオチン化）はニュートラアビジン捕捉による）。続いて、ＩｇＧ−ＩＬ−１０イムノコンジュゲートは、水平配向での分析物として、ゼロ濃度を含む６つの異なる濃度で注入された。二重に参照した後、運動速度定数および親和性を決定するために、センサーグラムは１：１相互作用モデルに適合させた。分析的ＳＤＳ ＰＡＧＥ分析及び標的抗原並びにＩＬ−１０受容体に対するＳＰＲに基づいた親和性決定の結果を図２１および図２２に示す。データは、イムノコンジュゲートはＴＮＣ Ａ２又はＦＡＰにＫＤ値がそれぞれ５２又は２６で結合するが、ＩＬ−１０受容体に対するＫＤ値は５２０と８１５ｐＭであることを示している。
実施例６：
上述の方法に従って、ホール修飾を含むＦｃドメインサブユニットのＮ末端に融合したＦＡＰを指向し、一つの単一２８Ｈ１ベース又は４Ｂ９ベースのＦａｂ領域からなるが、ノブ修飾を持つＩｇＧ重鎖の第二のＦａｂ領域が（Ｇ４Ｓ）ｎリンカー（ｎ＝１）を介してサイトカインにより置換されているＩｇＧ−サイトカイン融合タンパク質が生成され及び発現された。このイムノコンジュゲートフォーマット（「１＋１」フォーマットとも言う）の概略については、図２Ｃを参照。使用したサイトカイン部分は、上記及びＰＣＴ特許出願ＰＣＴ／ＥＰ２０１２／０５１９９１に記載されるＩＬ−２四重変異体（配列番号３を参照）、ＩＬ−７及びＩＦＮ−αであった。リンカーペプチドを介してノブ修飾を含むＦｃドメインサブユニットのＮ末端に融合した、サイトカイン部分を含む融合ポリペプチドの対応する配列は、配列番号２４７（四重変異体ＩＬ−２を含む）、２４９（ＩＬ−７を含む）、及び２５１（ＩＦＮ−αを含む）に与えられる。これらのコンストラクトにおいては、イムノコンジュゲートの標的化は、高親和性の一価Ｆａｂ領域を介して達成される。このフォーマットは、抗原の内在化が一価の結合剤を用いて減少しうる場合に推奨されうる。イムノコンジュゲートは上述のように産生され精製され分析された。ＩＬ−２ ｑｍ又はＩＬ−７、プロテインＡ親和性クロマトグラフィー及びサイズ排除クロマトグラフィーは１回の実行において組み合わされた。２０ｍＭヒスチジン、１４０ｍＭのＮａＣｌ、ｐＨ６．０を、サイズ排除クロマトグラフィー及び最終製剤緩衝液として使用した。図２３から−２６は、精製の溶出プロファイル及びクロマトグラム、並びに最終の精製されたコンストラクトの分析用ＳＤＳ−ＰＡＧＥ及びサイズ排除クロマトグラフィーを示す。収率は、４Ｂ９「１＋１」ＩｇＧ−ＩＬ−２ ｑｍにおいて１１ｍｇ／Ｌ、２８Ｈ１「１＋１」ＩｇＧ−ＩＬ−２ ｑｍにおいて４３ｍｇ／Ｌ、４Ｂ９「１＋１」ＩｇＧ−ＩＬ−７において２０．５ｍｇ／Ｌ、及び４Ｂ９「１＋１」ＩｇＧ−ＩＦＮ−αコンストラクトにおいて１０．５ｍｇ／Ｌであった。
ＩＬ−２ ｑｍを含む「１＋１」コンストラクトのＮＫ細胞増殖を誘導する能力は、ＩｇＧ−ＩＬ−２ ｑｍイムノコンジュゲートと比較して検証された。ＮＫ−９２細胞を、９６ウェル−黒の平らな透明底プレートに１００００細胞／播種する前に、２時間飢餓状態にした。イムノコンジュゲートは播種されたＮＫ−９２細胞上において滴定された。７２時間後、ＡＴＰ含有量が測定され、ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ−Ｇｌｏ発光細胞生存率アッセイキット（Ｐｒｏｍｅｇａ）を製造業者の指示に従って使用して生存細胞の数を決定した。図２７は、「１＋１」コンストラクトはＮＫ９２細胞の増殖を誘導することができ、対応するＩｇＧ−ＩＬ−２ ｑｍコンストラクトよりもわずかに活性が弱いことを示している。
ＩＬ−２ｑｍ又はＩＬ−７を含む４Ｂ９ベースの「１＋１」コンストラクトは、ＩｇＧ−ＩＬ−２イムノコンジュゲートと比較して、Ｔ細胞増殖を誘導するそれらの能力について試験された。末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を、Ｈｉｓｔｏｐａｑｕｅ−１０７７ (Sigma Diagnostics Inc., St. Louis, MO, USA)を使用して調製した。簡単に言えば、バフィーコートからの血液を、カルシウム及びマグネシウムを含まないＰＢＳで５：１希釈し、Ｈｉｓｔｏｐａｑｕｅ−１０７７上に積層した。グラジエントは中断することなく、室温（ＲＴ）で３０分間、４５０×ｇで遠心分離した。ＰＢＭＣを含有する中間相を回収し、ＰＢＳで３回洗浄した（室温で１０分間、３５０×ｇ、その後３００×ｇ）。ＰＢＭＣは、１００ｎＭ ＣＦＳＥ（カルボキシフルオレセインスクシンイミジルエステル）で１５分間３７℃で標識される前に、１μｇ／ｍｌのＰＨＡ−Ｍ（シグマアルドリッチ＃Ｌ８９０２）で一晩、前もって刺激された。標識されたＰＢＭＣを３０分間３７℃で回収する前に、細胞は２０ｍｌの培地で洗浄された。細胞を洗浄し、計数し、１０００００細胞を９６ウェルＵ底プレートに播種した。イムノコンジュゲートは、６日間のインキュベーション時間のために播種した細胞上で滴定された。その後、細胞を洗浄し、適切な細胞表面マーカーについて染色し、ＢＤ ＦＡＣＳＣａｎｔｏＩＩを用いてＦＡＣＳによって分析した。ＣＤ４ Ｔ細胞はＣＤ３＋／ＣＤ８−として定義されＣＤ８ Ｔ細胞はＣＤ３＋／ＣＤ８＋として定義された。
図２８は、ＩＬ−２ ｑｍ又はＩＬ−７のどちらかを含む「１＋１」コンストラクトはＰＨＡ活性化ＣＤ４（Ａ）及びＣＤ８ Ｔ細胞（Ｂ）の増殖を誘導することができることを示す。ＮＫ細胞については、ＩＬ−２ ｑｍを含む「１＋１」コンストラクトは、ＩｇＧ−ＩＬ−２ ｑｍコンストラクトよりもわずかに弱い活性である。
ＩＦＮ−αを含む４Ｂ９ベースの「１＋１」コンストラクトは、ロフェロンＡ（ロッシュ）と比較して、ダウディ細胞増殖を阻害するその能力について試験された。簡潔には、ダウディ細胞を、１００ｎＭのＣＦＳＥで標識し、９６ウェルＵ底プレート（５０’０００細胞／ウェル）に播種した。分子は、示された濃度で添加され、続いて３７℃で３日間インキュベートした。増殖は、ＣＦＳＥ希釈を分析し、生存／死滅の染色を使用して分析から死細胞を除くことによって測定した。
図２９は、コンストラクトは少なくともロフェロンＡと同様に強力に、ダウディ細胞の増殖を阻害することができたことを示している。
実施例７：
野生型又は四重変異体ＩＬ−２のどちらかを含むＦＡＰ標的化ＩｇＧ−ＩＬ−２イムノコンジュゲート、及び野生型又は四重変異体ＩＬ−２のどちらかを含む非標的化ＩｇＧ−ＩＬ−２イムノコンジュゲートについて、単一用量薬物動態学的（ＰＫ）研究が腫瘍のない免疫応答性１２９のマウスで実施された。
実験の開始時に８〜９週齢のメスの１２９匹のマウス（Harlan, United Kingdom)が特定病原体フリー条件下で、確約されたガイドライン（GV-Solas; Felasa; TierschG)に従って１２時間明／１２時間の暗闇の日々のサイクルを伴い維持された。実験研究プロトコールはレビューされ、地方政府によって承認された(P2008016)。到着後、動物を新しい環境に慣れさせてそして観察のために１週間維持した。持続的な健康モニタリングを定期的に実施した。
マウスに、ＦＡＰ標的化２８Ｈ１ ＩｇＧ−ＩＬ２ ｗｔ（２．５ｍｇ／ｋｇ）又は２８Ｈ１ ＩｇＧ−ＩＬ２ ｑｍ（５ｍｇ／ｋｇ）、又は非標的化ＤＰ４７ＧＳ ＩｇＧ−ＩＬ２ ｗｔ（５ｍｇ／ｋｇ）又はＤＰ４７ＧＳ ＩｇＧ−ＩＬ２ ｑｍ （５ｍｇ／ｋｇ）を１回静脈注射した。全てのマウスは２００μｌの適切な溶液で静脈注射された。２００μｌあたりの適切なる量のイムノコンジュゲートを得るために、ストック溶液は必要に応じてＰＢＳで希釈した。
マウスは１、８、２４、４８、７２、９６時間後に採血し、その後２日ごとに３週間採血した。血清を抽出し、ＥＬＩＳＡ分析まで−２０℃で保存した。血清中のイムノコンジュゲート濃度は、ＩＬ−２イムノコンジュゲート抗体(Roche-Penzberg）の定量化のためのＥＬＩＳＡを用いて測定した。吸収は、４０５ｎｍの測定波長および４９２ｎｍの参照波長を用いて測定した（ＶｅｒｓａＭａｘの調整可能なマイクロプレートリーダー、Molecular Devices）。
図３０は、これらのＩＬ−２イムノコンジュゲートの薬物動態を示す。ＦＡＰ標的化（Ａ）及び非標的化（Ｂ）ＩｇＧ−ＩＬ２ ｑｍコンストラクトは、対応するＩｇＧ−ＩＬ−２ ｗｔコンストラクト（約１５時間）よりも長い血清半減期（約３０時間）を有している。注目すべきは、実験条件は直接比較することはできないものの、例えばGillies et al., Clin Cancer Res 8, 210-216 (2002)に報告されるように、本発明のＩＬ−２イムノコンジュゲートの血清半減期は、当該技術分野で公知の報告「２＋２」のＩｇＧ−ＩＬ−２イムノコンジュゲート（図２を参照）の血清半減期よりも長いように思われる。
実施例８：
生体内分布の研究が、本発明のイムノコンジュゲートの腫瘍標的化を評価するために行われた。ＦＡＰ標的化２８Ｈ１ベースのＩｇＧ−ＩＬ−２ ｑｍは、ＦＡＰ標的化非結合型２８Ｈ１ ＩｇＧ及び４Ｂ９ ＩｇＧ、及び非標的化ＤＰ４７ＧＳ ＩｇＧに対して比較された。更に、ＳＰＥＣＴ／ＣＴイメージング研究が４Ｂ９ ＩｇＧ−ＩＬ−２ ｑｍを用いて行われ、ＤＰ４７ＧＳ ＩｇＧ−ＩＬ−２ ｑｍ、４Ｂ９ ＩｇＧ及びＤＰ４７ＧＳ ＩｇＧにｇと比較された。
ＤＴＰＡのコンジュゲーション及び１１１Ｉｎ標識化
２８Ｈ１ ＩｇＧ−ＩＬ−２ ｑｍ、２８Ｈ１ ＩｇＧ１、４Ｂ９ ＩｇＧ−ＩＬ−２ ｑｍ、４Ｂ９ ＩｇＧ１及びＤＰ４７ ＩｇＧ１の溶液を、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ、１５ｍＭ）に対して透析した。２ｍｇのコンストラクト（５ｍｇ／ｍｌ）を０．１Ｍの炭酸水素ナトリウム、ｐＨ８．２の中で、厳格に金属を含まない条件下で、室温（ＲＴ）で１時間ＩＴＣ−ＤＴＰＡの５倍モル過剰とのインキュベーションにより、イソチオシアネートベンジル−ジエチレントリアミン五酢酸 (ITC-DTPA, Macrocyclis, Dallas, TXと結合させた。非結合体ＩＴＣ−ＤＴＰＡを０．１Ｍの２−（Ｎ−モルフォリノ）エタンスルホン酸（ＭＥＳ）緩衝液、ｐＨ５．５に対する透析によって除去した。
精製されたコンジュゲートを、０．０５％のウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）と０．０５％のＴｗｅｅｎ８０を含有する、０．１ＭのＭＥＳ緩衝液、ｐＨ５．５中で、厳格に金属を含まない条件下で室温え３０分間１１１Ｉｎ(Covidien BV, Petten, The Netherlands)とのインキュベーションにより放射標識した。エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）を放射性標識した後に、未結合の１１１Ｉｎをキレート化するために５ｍＭの最終濃度まで添加した。１１１Ｉｎ標識化生成物を使い捨てＧ２５Ｍカラムでゲル濾過により精製した(PD10, Amersham Biosciences, Uppsala, Sweden)。精製された１１１Ｉｎ標識化コンストラクトの放射化学的純度を、ＴＥＣコントロールクロマトグラフィーストリップ（Ｂｉｏｄｅｘ、Ｓｈｉｒｌｅｙ、ＮＹ）上のインスタント薄層クロマトグラフィー（ＩＴＬＣ）によって、移動相として、０．１Ｍクエン酸緩衝液、ｐＨ６．０を用いて決定した。１１１Ｉｎで標識された調製物の比活性は、０．６から４．６ＭＢｑで／μｇであった。
Ｌｉｎｄｍｏアッセイ
１１１Ｉｎ標識化抗体調製物の免疫反応性画分は以前に記述されたように決定された (Lindmo et al. (1984) J Immunol Methods 72, 77-89)。簡潔には、線維芽細胞活性化タンパク質（ＦＡＰ）ｃＤＮＡを遺伝子導入されたヒト胚腎臓（ＨＥＫ）細胞の連続希釈系列を、３７℃で１時間１１１Ｉｎ標識したコンストラクトの２００ベクレルと共にインキュベートした。最低の細胞濃度の複製物を、非特異的結合について補正するために、過剰量の非標識化コンストラクトの存在下でインキュベートした。インキュベーション後、細胞を洗浄し、スピンダウンし、細胞結合性放射活性をガンマカウンター（ワラックウィザード３’’１４８０自動γ−カウンター、ファルマシアＬＫＢ）で細胞ペレット中で測定した。調製物の免疫反応性画分は、７５から９４％の範囲であった。
動物
雌のＢＡＬＢ／ｃヌードマウス（８−９週齢、＋／−２０ｇ）をジャンバーから購入し、Ｒａｄｂｏｕｄ大学ナイメーヘン医療センターの中央動物施設において、５匹の動物を個別に換気したケージ内で、自由に食料と水を利用する標準的条件下で飼育した。１週間の順応後に、動物に、左脇腹にマトリゲル（１：３）中の０ｘ１０６ ＨＥＫ−ＦＡＰ細胞を、任意で、右脇腹にマトリゲル（１：３）中の５ｘ１０６ ＨＥＫ−２９３細胞を皮下接種した。異種移植片の増殖はキャリパー測定（体積＝（４／３・π）・（１／２・長さ）・（１／２・幅）・（１／２・高さ）によりモニターした。異種移植片が１００立方ミリメートルの体積に達したとき、マウスに１１１Ｉｎ標識されたコンストラクトを静脈注射した。
体内分布（２８Ｈ１ ＩｇＧ−ＩＬ−２ ｑｍ、２８Ｈ１ ＩｇＧ１、４Ｂ９ ＩｇＧ１及びＤＰ４７ＧＳ ＩｇＧ１）
１１１Ｉｎで標識されたコンストラクト（５ＭＢｑ、１５０μｇ、２００μｌ）を尾静脈から静脈内注射した。注射の２４時間後に動物をＣＯ２／Ｏ２の大気中で窒息により安楽死させた。血液、筋肉、異種移植、肺、脾臓、膵臓、腎臓、胃（空）、十二指腸（空）と肝臓を集め、計量し、放射活性をガンマカウンター(Wallac Wizard)で測定した。注射用量（１％）の標準規格を同時に計数し、組織取り込みは、グラム組織あたりの注射用量の％として計算した（％ＩＤ／ｇ）。
ＳＰＥＣＴ−ＣＴ解析（４Ｂ９ ＩｇＧ−ＩＬ−２ ｑｍ、４Ｂ９ ＩｇＧ１、ＤＰ４７ＧＳ ＩｇＧ−ＩＬ−２ ｑｍ及びＤＰ４７ＧＳ ＩｇＧ１）
１１１Ｉｎ−標識化４Ｂ９−ＩｇＧ−ＩＬ−２ ｑｍ、４Ｂ９−ＩｇＧ１、ＤＰ４７ＧＳ−ＩｇＧ−ＩＬ−２ ｑｍ及びＤＰ４７ＧＳ−ＩｇＧ１を静脈注射した。（２０ＭＢｑ、５０、１５０、３００μｇ、２００μｌ）。注入後４、２４、７２および１４４時間で、動物はイソフラン／Ｏ２で麻酔し、１．０ミリメートルマウスコリメータを備えたＵ−ＳＰＥＣＴ ＩＩ ｍｉｃｒｏＳＰＥＣＴ／ＣＴカメラ（MILabs、Utrecht、The Netherlands)で３０〜６０分間スキャンした。コンピュータ断層撮影（ＣＴ）は、ＳＰＥＣＴの直後に実施された。ＳＰＥＣＴ（０．４ミリメートルのボクセルサイズ）とＣＴスキャンの両方がＭＩＬａｂｓソフトウェアを使用して再構成され、ＳＰＥＣＴとＣＴスキャンは放射性シグナルの正確な位置を決定するために共に記録された。３Ｄ画像は、シーメンスＩｎｖｅｏｎリサーチワークプレースソフトウェアを使用して作成された。
図３１は、２４時間での２８Ｈ１及び４Ｂ９ ＩｇＧ１及び２８Ｈ１ ＩｇＧ−ＩＬ−２ ｑｍの組織分布と腫瘍標的化の間に有意差はなく（それ故サイトカインはイムノコンジュゲートの組織分布および腫瘍標的化の特性を有意には変更せず）、そしてＦＡＰ標的化コンストラクトの腫瘍対血液比は、非標的化ＤＰ４７ＧＳ対照ＩｇＧよりも有意に大きいことを示している。
これらの結果は、４Ｂ９ ＩｇＧ−ＩＬ−２ ｑｍイムノコンジュゲートのＳＰＥＣＴ／ＣＴイメージングで確認された（データは示さず）。４Ｂ９ ＩｇＧ−ＩＬ−２ ｑｍはＦＡＰ陽性ＨＥＫ−ＦＡＰに局在化するが、ＦＡＰ陰性ＨＥＫ−２９３対照腫瘍には局在化せず、一方非標的化ＤＰ４７ＧＳイムノコンジュゲートはどちらの腫瘍にも局在化しなかった。非結合体のＩｇＧとは異なり、４Ｂ９ ＩｇＧ−ＩＬ−２ ｑｍの弱い取り込みは、脾臓でも観察された。
実施例９：
２８Ｈ１ベースのＩｇＧ−ＩＬ−２ ｑｍ及び２８Ｈ１ベースのＩｇＧ−（ＩＬ−２ ｑｍ）２（すなわち、図１に示される「２＋２」フォーマットのイムノコンジュゲート：配列は配列番号２５３及び２０５に示される）のＮＫ９２細胞への結合が比較された。ウェル当たり２０００００個のＮＫ９２細胞を９６ウェルプレートに播種した。イムノコンジュゲートＮＫ９２細胞上に滴定し、結合を可能にするために４℃で３０分間インキュベートした。細胞を、０．１％ＢＳＡを含有するＰＢＳで２回洗浄し、未結合のコンストラクトを除去した。イムノコンジュゲートの検出のため、ＦＩＴＣ標識化抗ヒトＦｃ特異的抗体が４℃で３０分間加えられた。細胞を再び０．１％ＢＳＡを含有するＰＢＳで２回洗浄し、ＢＤ ＦＡＣＳＣａｎｔｏＩＩを用いてＦＡＣＳにより分析した。
図３２に示されるように、「２＋２」イムノコンジュゲートは、対応する「２＋１」コンストラクトよりもＮＫ９２細胞に対する良好な結合を示している。
実施例１０：
ＩＬ−２イムノコンジュゲートによるヒトＰＢＭＣ増殖の誘導
末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を、Ｈｉｓｔｏｐａｑｕｅ−１０７７(Sigma Diagnostics Inc., St. Louis, MO, USA)を使用して調製した。簡潔には、健康なボランティアからの静脈血をヘパリン化シリンジ内に吸引した。血液を、カルシウム及びマグネシウムを含まないＰＢＳで２：１希釈し、Ｈｉｓｔｏｐａｑｕｅ−１０７７上に積層した。グラジエントは中断することなく、室温（ＲＴ）で３０分間、４５０×ｇで遠心分離した。ＰＢＭＣを含有する中間相を回収し、ＰＢＳで３回洗浄した（室温で１０分間、３５０×ｇ、その後３００×ｇ）。
続いて、ＰＢＭＣは、４０ｎＭのＣＦＳＥ（カルボキシフルオレセインスクシンイミジルエステル）で１５分間３７℃で標識された。標識されたＰＢＭＣを３０分間３７℃で回収する前に、細胞は２０ｍｌの培地で洗浄された。細胞を洗浄し、計数し、１０００００細胞を９６ウェルＵ底プレートに播種した。予め希釈しプロロイキン（市販の野生型ＩＬ−２）又はＩＬ２イムノコンジュゲートは、示された時点でインキュベートした播種された細胞において滴定された。４〜６日後、細胞を洗浄し、適切な細胞表面マーカーについて染色し、ＢＤ ＦＡＣＳＣａｎｔｏＩＩを用いてＦＡＣＳによって分析した。ＮＫ細胞はＣＤ３−／ＣＤ５６＋として定義され、ＣＤ４ Ｔ細胞はＣＤ３＋／ＣＤ８−として定義され、ＣＤ８ Ｔ細胞はＣＤ３＋／ＣＤ８＋として定義される。
図３３は、ＦＡＰを標的とした２８Ｈ１ ＩＬ−２イムノコンジュゲートによる４日間（Ａ）、５日間（Ｂ）又は６日間（Ｃ）のインキュベーション後のＮＫ細胞の増殖を示す。試験した全てコンストラクトは濃度依存的にＮＫ細胞の増殖を誘導した。プロロイキンは低濃度でイムノコンジュゲートよりも有効であったが、しかしながらこの違いはより高い濃度ではもはや存在しなかった。より早期の時点では（４日目）、ＩｇＧ−ＩＬ２コンストラクトは、Ｆａｂ−ＩＬ２−ＦＡＢコンストラクトよりも若干強力に見えた。その後の時点では（６日目）、全てのコンストラクトは同等の有効性を持っており、Ｆａｂ−ＩＬ２ ｑｍ−Ｆａｂコンストラクトは、低濃度で最小の強さであった。
図３４は、ＦＡＰを標的とした２８Ｈ１ ＩＬ−２イムノコンジュゲートによる４日間（Ａ）、５日間（Ｂ）又は６日間（Ｃ）のインキュベーション後のＣＤ４ Ｔ細胞の増殖を示す。試験した全てコンストラクトは濃度依存的にＣＤ４ Ｔ細胞の増殖を誘導した。プロロイキンはイムノコンジュゲートよりも高い活性を有しており、野生型ＩＬ−２を含むイムノコンジュゲートは、四重変異体ＩＬ−２を含むものよりもわずかに強力であった。ＮＫ細胞においては、Ｆａｂ−ＩＬ２ ｑｍ−Ｆａｂコンストラクトは最低の活性を有していた。最も可能性の高い増殖性ＣＤ４ Ｔ細胞は、少なくとも野生型ＩＬ−２コンストラクトにおいては、部分的調節性のＴ細胞である。
図３５は、ＦＡＰを標的とした２８Ｈ１ ＩＬ−２イムノコンジュゲートによる４日間（Ａ）、５日間（Ｂ）又は６日間（Ｃ）のインキュベーション後のＣＤ８ Ｔ細胞の増殖を示す。試験した全てコンストラクトは濃度依存的にＣＤ８ Ｔ細胞の増殖を誘導した。プロロイキンはイムノコンジュゲートよりも高い活性を有しており、野生型ＩＬ−２を含むイムノコンジュゲートは、四重変異体ＩＬ−２を含むものよりもわずかに強力であった。ＮＫ細胞とＣＤ４ Ｔ細胞においては、Ｆａｂ−ＩＬ２ ｑｍ−Ｆａｂコンストラクトは最低の活性を有していた。
実施例１１：
ＩＬ−２活性化型ＰＢＭＣの増殖および活性化誘導性細胞死
健康なドナーから新たに単離したＰＢＭＣを、１０％ＦＣＳ及び１％グルタミンを含むＲＰＭＩ１６４０中で１μｇ／ｍｌのＰＨＡ−Ｍで一晩予め活性化した。予め活性化した後で、ＰＢＭＣをを回収し、ＰＢＳ中の４０ｎＭのＣＦＳＥで標識し、そして１０００００細胞／ウェルで９６ウェルプレートに播種した。予め活性化したＰＢＭＣはＩＬ−２イムノコンジュゲート（４Ｂ９ ＩｇＧ−ＩＬ−２ ｗｔ、４Ｂ９ ＩｇＧ−ＩＬ−２ ｑｍ、４Ｂ９ Ｆａｂ−ＩＬ−２ ｗｔ−Ｆａｂ、及び４Ｂ９ Ｆａｂ−ＩＬ−２ ｑｍ−Ｆａｂ）の異なる濃度で刺激された。ＩＬ−２処理の６日後に、ＰＢＭＣは０．５μｇ／ｍｌの活性化抗Ｆａｓ抗体で一晩処置された。ＣＤ４（ＣＤ３＋ＣＤ８−）及びＣＤ８（ＣＤ３＋ＣＤ８＋）Ｔ細胞の増殖はＣＦＳＥ希釈により６日後に分析された。抗Ｆａｓ処置後の生存Ｔ細胞の割合は、ＣＤ３＋アネキシンＶ陰性の生存細胞をゲーティングすることにより確定された。
図３６に示されるように、全てのコンストラクトは事前に活性化されたＴ細胞の増殖を誘導した。低濃度では、野生型ＩＬ−２ ｗｔを含むコンストラクトは、ＩＬ−２ ｑｍを含有するコンストラクトよりもより活性であった。ＩｇＧ−ＩＬ−２ ｗｔ、Ｆａｂ−ＩＬ−２ ｗｔ−Ｆａｂ及びプロロイキンは類似の活性を持っていた。Ｆａｂ−ＩＬ−２ ｑｍ−ＦａｂはＩｇＧ−ＩＬ−２ ｑｍよりもわずかに弱い活性であった。野生型ＩＬ−２を含むコンストラクトは、おそらくは調節性Ｔ細胞の活性化の可能性のため、ＣＤ８ Ｔ細胞上よりもＣＤ４ Ｔ細胞上でより活性であった。四重変異体ＩＬ−２を含むコンストラクトは、ＣＤ８およびＣＤ４ Ｔ細胞において同様に活性であった。
図３７に示されるように、高濃度の野生型ＩＬ−２で刺激したＴ細胞は、四重変異体ＩＬ−２で処理したＴ細胞よりも抗Ｆａｓ誘導性アポトーシスに対する感受性が高い。
実施例１２：
非標的化ＤＰ４７ＧＳコンストラクト（ＶＨ及びＶＬ配列はそれぞれ配列番号２９９及び２９７）は更に特徴付けされた。上述のように、ＤＰ４７ＧＳ ＩｇＧの野生型又は四重変異体ＩＬ−２のコンジュゲートを作成した。これらのコンストラクトは、ＩＬ−２Ｒに対する結合および免疫細胞（例えばＮＫ細胞、ＣＤ８＋細胞およびＣＤ４＋細胞）のインビボでの増殖の誘導に、対応する標的化コンストラクトに類似した結合を示した（データ非表示）。腫瘍抗原を標的とするイムノコンジュゲートとは対照的に、しかしながら、それらは、腫瘍組織に蓄積しなかった（実施例８を参照）。
（実施例７に示されたものに加えて）更なる薬物動態学的研究が、野生型又は四重変異体ＩＬ−２のいずれかを含む非標的化ＤＰ４７ＧＳ ＩｇＧ−ＩＬ−２コンストラクトにより実施された。オスＣ５７ＢＬ／６Ｊマウス（各群ｎ＝６）に、０．３、１、３又は１０ｍｇ／ｋｇのＤＰ４７ＧＳ ＩｇＧ−ＩＬ−２ ｗｔ又はＤＰ４７ＧＳ ＩｇＧ−ＩＬ−２ ｑｍコンストラクトを静脈内注射した。注入容量は全てのマウスで１ｍｌであった。血液サンプルは、注射後２、４、８、２４、４８、７２、９６および１６８時間に採取し（各時点で３匹のマウスから）、分析まで−２０℃で保存した。コンストラクトはコンストラクトの捕捉および検出のために抗Ｆａｂ抗体を用いて、ＥＬＩＳＡにより、血清試料中で定量した。全ての試料及び較正用標準を、分析前に（Bioreclamationから得られた）マウス血清中で１：２５に希釈した。簡潔には、ストレプトアビジン被覆９６ウェルプレート（ロシュ）を、ＰＢＳ／０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０で１０秒間３回洗浄し、その後室温で１時間、１００μｌ／ウェル（０．５μｇ／ｍｌ）のビオチン化抗ヒトＦａｂ抗体（（Ｍ−１．７．１０；ロシュ・ダイアグノスティックス）とインキュベーションした。ＰＢＳ／０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０で再度３回プレートを洗浄した後、５０μｌの血清サンプル又は校正標準及び５０μｌ／ウェルのＰＢＳ／０．５％ＢＳＡが添加され、１：５０の最終サンプル希釈物を与えた。サンプルを室温で１時間インキュベートした後に、ＰＢＳ／０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０で再度３回プレートを洗浄した。次に、次に、プレートを１００μｌ／ウェル（０．５μｇ／ｍｌ）のジゴキシゲニン標識抗ヒトＦａｂ抗体（Ｍ−１．１９．３１；ロシュ・ダイアグノスティックス）と共に室温で１時間インキュベートし、洗浄し、１００μｌ／ウェルの抗ジゴキシゲニンＰＯＤ（ロシュ・ダイアグノスティックスのカタログ番号１１６３３７１６００１）と共に１時間室温でインキュベートし、そして再び洗浄した。最後に、１００μｌ／ウェルのＴＭＢペルオキシダーゼ基質（ロシュ・ダイアグノスティックスのカタログ番号１１４８４２８１００１）を約５分間添加し、基質反応を、５０μｌ／ウェルでの２ＮのＨＣｌで停止した。プレートは、４５０ｎｍで反応を停止させた２分以内に、６５０ｎｍの参照波長により読まれた。
この研究の結果を図３８に示す。両方のコンストラクトは長い血清半減期を示し、四重変異体ＩＬ−２（Ｂ）を含むコンストラクトは野生型ＩＬ−２（Ａ）を含むものよりも更に長く生存される。
加えて、種々のタンパク質およびヒト細胞（ＰＢＭＣ）へのＤＰ４７ＧＳ ＩｇＧの結合の欠如が確認された。
ＤＰ４７ＧＳ抗体の結合特異性（または欠如）は、異なる無関係の抗原のパネルによりＥＬＩＳＡベースの試験系で評価した。試験は、３８４ウェルマキシソープマイクロタイタープレート（Thermo Scientific Nunc,カタログ番号４６０３７２）で実施した。各インキュベーションの工程後、プレートをＰＢＳ／０．０５％のＴｗｅｅｎ−２０で３回洗浄した。最初に、ＰＢＳ中に希釈した異なる抗原を６℃で一晩プレート上にコーティングした。使用される抗原の試験濃度及び情報の詳細を次の表に示す。
その後、ウェルを室温で１時間、水中の２％ゼラチン（ＲＴ）でブロックした。ＤＰ４７ＧＳ抗体（ＰＢＳ中で１μｇ／ｍｌ）を、室温で１．５時間、捕捉した抗原のパネルとインキュベートした。結合した抗体を、抗ヒトＩｇＧ抗体−ＨＲＰコンジュゲート（ＧＥヘルスケア、カタログ番号９３３０Ｖ、０．２％のＴｗｅｅｎ−２０及び０．５％のゼラチンを含むＰＢＳで１：１０００に希釈）を用いて検出した。１時間のインキュベーション後に、プレートをＰＢＳ／０．０５％Ｔｗｅｅｎ−２０で６回洗浄し、新たに調製したＢＭブルーＰＯＤ基質溶液（ＢＭブルー：３，３’−５，５’−テトラメチルベンジジン、ロシュ・ダイアグノスティックス、カタログ番号１１４８４２８１００１）で室温で３０分間展開した。吸光度を３７０ｎｍで測定した。ブランク値は、抗体を添加せずに定義した。捕捉した抗原のほぼ全てに非特異的結合を示す社内のヒトＩｇＧ１抗体が陽性対照としての役割を果たした。
この実験の結果を図３９に示す。ＤＰ４７ＧＳ抗体は捕捉された抗原の何れにも結合を示さなかった。検出されたシグナルは抗体を含まない対照サンプルの範囲であった。
最後に、ヒトＰＢＭＣに対するＤＰ４７ＧＳ抗体の結合を評価した。典型的な免疫応答の過程において、細胞表面に提示されるタンパク質の組み合わせは、劇的に変化するので、結合は、健康な成人から分離した直後のＰＢＭＣ、並びに二つの異なる刺激を用いたインビトロでの活性化後のＰＢＭＣで試験した。
ヒトＰＢＭＣを、Ｈｉｓｔｏｐａｑｕｅ１０７７（シグマアルドリッチ、ドイツ）を使用して、健康なボランティアからのバフィーコート又はヘパリン処理した新鮮な血液から、フィコール密度勾配遠心分離によって単離した。ＰＢＭＣは、結合アッセイ（新鮮なＰＢＭＣ）にかけるか又は培養され、さらに刺激した。ＰＢＭＣを、１０％（ｖ／ｖ）の熱不活化ＦＢＳ（PAA Laboratories）を補充したＲＰＭＩ１６４０（Ｇｉｂｃｏ）、１ｍＭピルビン酸ナトリウム（シグマアルドリッチ）、１％（ｖ／ｖ）のＬ−アラニル−Ｌ−グルタミン（Biochrom）、及び１０ｎＭのβ−メルカプトエタノール（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）からなるＴ細胞培地中で、３７℃で、２×１０６細胞／ｍｌの細胞密度で培養した。インビトロでの刺激のため、プロロイキン（２００単位／ｍｌ、ノバルティス）とフィトヘマグルチニン（ＰＨＡ−Ｌ、２μｇ／ｍＬ、シグマアルドリッチ）が、６日間の培養（ＰＨＡ−Ｌ活性化ＰＢＭＣ）の間に追加された。インビトロでの再刺激において、６ウェルの細胞培養プレートは、マウス抗ヒトＣＤ３（クローンＫＴ３、１μｇ／ｍｌ）及びマウス抗ヒトＣＤ２８抗体（クローン２８．２、２μｇ／ｍｌ、両方ともｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅから）で被覆され、そしてＰＨＡ−Ｌ活性化ＰＢＭＣをさらに２４時間添加した（再刺激されたＰＢＭＣ）。細胞表面タンパク質へのＤＰ４７ＧＳ抗体の結合を（Ｆｃドメイン中Ｌ２３４Ａ Ｌ２３５Ａ（ＬＡＬＡ）Ｐ３２９Ｇ変異の有無にかかわらず）、５倍連続希釈系列（最高濃度２００ｎＭ）において、フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）（ジャクソン・ラボラトリーズ）にコンジュゲートしたヤギ抗ヒトＩｇＧのＦｃ特異的二次抗体及びフローサイトメトリー分析を用いてモニターした。全てのアッセイは、表面タンパク質の内在化を防ぐために、４℃で行った。一次および二次抗体のインキュベーションは、それぞれ、２時間、１時間であった。白血球の同時タイピングを可能にするために、蛍光色素で標識したマウス抗ヒトＣＤ１４、ＣＤ１５、ＣＤ４、ＣＤ１９（全てBiolegend）、ＮＫｐ４６、ＣＤ３、ＣＤ５６、ＣＤ８（全てBD Pharmingen））に、二次抗体が添加された。ヨウ化プロピジウム（１μｇ／ｍｌ）をＦＡＣＳＣａｎｔｏＩＩデバイス上での測定の直前に添加し、ＦＡＣＳ Ｄｉｖａソフトウェア（両方ともＢＤバイオサイエンス）を実行し、透過性の死細胞を除外した。ヨウ化プロピジウム陰性の生存細胞を、Ｔ細胞（ＣＤ１４−ＣＤ３＋ＣＤ４＋／ＣＤ８＋）、Ｂ細胞（ＣＤ１４−ＣＤ１９＋）、ＮＫ細胞（ＣＤ１４−ＮＫｐ４６＋／ＣＤ５６＋）または単球／好中球（ＣＤ３−ＣＤ５６−ＣＤ１４＋／ＣＤ１５＋）についてゲートした。様々な白血球タイプのＦＩＴＣ蛍光の中央値を結合した一次抗体の指標として測定し、Ｐｒｉｓｍ４（グラフパッドソフトウェア）を用いた一次抗体濃度に対してブロットした。
図４０に示すように、Ｆｃ変異のないＤＰ４７ＧＳ ＩｇＧ抗体は、例えばＮＫ細胞および単球／好中球などのＦｃγ受容体を保有する細胞に対してのみ結合を示した。ＤＰ４７ＧＳ（ＬＡＬＡ Ｐ３２９Ｇ）の結合はその活性化状態に関わりなく、ヒトＰＢＭＣで検出されなかった。Ｆｃドメイン中のＬＡＬＡ Ｐ３２９Ｇ変異は、またＦｃγ受容体保有細胞に対しても完全に結合を撤廃した。
前述の発明は、理解を明確にする目的のために例示および実施例によってある程度詳細に説明してきたが、説明や例は、本発明の範囲を限定するものとして解釈されるべきではない。すべての特許および本明細書に引用される科学文献の開示は、参照によりその全体が援用される。

Claims (82)

  1. 第一の抗原結合部分、２つのサブユニットからなるＦｃドメイン、及びエフェクター部分を含み、１以下のエフェクター部分が存在するイムノコンジュゲート。
  2. 前記エフェクター部分はＦｃドメインの前記２つのサブユニットの一方のアミノ末端又はカルボキシ末端のアミノ酸に、任意でリンカーペプチドを介して融合している、請求項１に記載のイムノコンジュゲート。
  3. 前記第一の抗原結合部位は、Ｆｃドメインの前記２つのサブユニットの一方のアミノ末端のアミノ酸に、任意でリンカーペプチド又は免疫グロブリンのヒンジ領域を介して融合している、請求項１に記載のイムノコンジュゲート。
  4. 前記第一の抗原結合部分が抗体の抗原結合ドメインを含む、請求項１から３の何れか一項に記載のイムノコンジュゲート。
  5. 前記第一の抗原結合部分がＦａｂ分子である、請求項４に記載のイムノコンジュゲート。
  6. 前記Ｆｃドメインが２つの非同一ポリペプチド鎖のヘテロ二量体化を促進する修飾を含む、請求項１から５の何れか一項に記載のイムノコンジュゲート。
  7. 前記修飾が、Ｆｃドメインのサブユニットの一つにおいてノブ修飾及びＦｃドメインの２つのサブユニットの他方においてホール修飾を含む、ノブ・イントゥ・ホール（knob into hole)修飾である、請求項６に記載のイムノコンジュゲート。
  8. 前記エフェクター部分は、ノブ修飾を含むＦｃドメインのサブユニットのアミノ末端又はカルボキシ末端のアミノ酸に融合している、請求項７に記載のイムノコンジュゲート。
  9. 前記ＦｃドメインがＩｇＧのＦｃドメインである、請求項１から８の何れか一項に記載のイムノコンジュゲート。
  10. 前記Ｆｃドメインは、Ｆｃ受容体への結合を改変されるように、及び／又はエフェクター機能を改変されるように操作される、請求項１から９の何れか一項に記載のイムノコンジュゲート。
  11. 前記Ｆｃ受容体がＦｃγ受容体である、請求項１０に記載のイムノコンジュゲート。
  12. 前記エフェクター機能がＡＤＣＣである、請求項１０に記載のイムノコンジュゲート。
  13. 前記改変される結合及び／又はエフェクター機能は、結合及び／又はエフェクター機能の減少である、請求項１０に記載のイムノコンジュゲート。
  14. 前記Ｆｃドメインは、Ｆｃ受容体、特にＦｃγ受容体に対するＦｃドメインの結合を減少させる一以上のアミノ酸変異を含む、請求項１３に記載のイムノコンジュゲート。
  15. 前記アミノ酸変異が、位置Ｐ３２９でのアミノ酸置換である、請求項１４に記載のイムノコンジュゲート。
  16. Ｆｃドメインが、そのサブユニットの各々において、アミノ酸置換のＬ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ及びＰ３２９Ｇを含む、請求項１４又は１５に記載のイムノコンジュゲート。
  17. 前記改変される結合及び／又はエフェクター機能は、結合及び／又はエフェクター機能の増加である、請求項１０に記載のイムノコンジュゲート。
  18. 前記Ｆｃドメインが、非操作型Ｆｃドメインと比較して、改変されたオリゴ糖構造を有するように操作される、請求項１７に記載のイムノコンジュゲート。
  19. 前記Ｆｃドメインが、非操作型Ｆｃドメインと比較して、非フコシル化オリゴ糖の増加した割合を含む、請求項１８に記載のイムノコンジュゲート。
  20. イムノコンジュゲートが第一及び第二の抗原結合部分を含む、請求項１から１９の何れかに記載のイムノコンジュゲート。
  21. 前記第一及び第二の抗原結合部分及び前記Ｆｃドメインが免疫グロブリン分子の一部である、請求項２０に記載のイムノコンジュゲート。
  22. 前記免疫グロブリン分子がＩｇＧクラスの免疫グロブリンである、請求項２１に記載のイムノコンジュゲート。
  23. 前記エフェクター部分が、免疫グロブリン重鎖の一方のカルボキシ末端のアミノ酸に、任意でリンカーペプチドを介して融合している、請求項２０又は２１に記載のイムノコンジュゲート。
  24. 前記第一の抗原結合部分又は前記第一及び前記第二の抗原結合部分が、病状と関連した抗原を指向する、請求項１から２３の何れか一項に記載のイムノコンジュゲート。
  25. 前記第一の抗原結合部分又は前記第一及び前記第二の抗原結合部分が、線維芽細胞活性化タンパク質（ＦＡＰ）、テネイシンＣのＡ１ドメイン（ＴＮＣ Ａ１）、テネイシン−ＣのＡ２ドメイン（ＴＮＣ Ａ２）、フィブロネクチンのエキストラドメインＢ（ＥＤＢ）、癌胎児性抗原（ＣＥＡ）、及びメラノーマ関連コンドロイチン硫酸プロテオグリカン（ＭＣＳＰ）からなる群から選択される抗原を指向する、請求項１から２３の何れか一項に記載のイムノコンジュゲート。
  26. 前記エフェクター部分が単鎖エフェクター部分である、請求項１から２５の何れか一項に記載のイムノコンジュゲート。
  27. エフェクター部分がサイトカインである、請求項１から２６の何れか一項に記載のイムノコンジュゲート。
  28. 前記サイトカインがＩＬ−２である、請求項２７に記載のイムノコンジュゲート。
  29. 前記サイトカインが、ＩＬ−２受容体のαサブユニットへの結合親和性が減少した変異体ＩＬ−２ポリペプチドである、請求項２７又は２８に記載のイムノコンジュゲート。
  30. 前記変異体ＩＬ−２ポリペプチドが、ヒトＩＬ−２の残基４２、４５及び７２に対応する位置から選択される一以上の位置でアミノ酸置換を含む、請求項２９に記載のイムノコンジュゲート。
  31. 前記サイトカインがＩＬ−１０である、請求項２７に記載のイムノコンジュゲート。
  32. 請求項１から３１の何れか一項に記載のイムノコンジュゲート又はその断片をコードする単離されたポリヌクレオチド。
  33. 請求項３２に記載の単離されたポリヌクレオチドを含む発現ベクター。
  34. 請求項３２に記載の単離されたポリヌクレオチド、又は請求項３３に記載の発現ベクターを含む宿主細胞。
  35. 前記宿主細胞が、β（１，４）−Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＩＩＩ（ＧｎＴＩＩＩ）活性を有する一以上のポリペプチドの増加したレベルを発現するように操作されている、請求項３４に記載の宿主細胞。
  36. 請求項３４又は３５に記載の宿主細胞を、イムノコンジュゲートの発現に適した条件下で培養すること、及び任意でイムノコンジュゲートを回収することを含む、請求項１から３１の何れか一項に記載のイムノコンジュゲートを生成する方法。
  37. 前記イムノコンジュゲートが請求項３６に記載の方法により生成される、抗原結合部分、Ｆｃドメイン及び単一エフェクター部分を含むイムノコンジュゲート。
  38. 請求項１から３１又は請求項３７の何れか一項に記載のイムノコンジュゲートと薬学的に許容される担体を含む薬学的組成物。
  39. 必要とする個体における疾患の治療における使用のための、請求項１から３３又は請求項３７の何れか一項に記載のイムノコンジュゲート、又は請求項３８に記載の薬学的組成物。
  40. 必要とする個体における疾患の治療のための医薬の製造のための、請求項１から３３又は請求項３７の何れか一項に記載のイムノコンジュゲート、又は請求項３８に記載の薬学的組成物。
  41. 請求項１から３１又は請求項３７の何れか一項に記載のイムノコンジュゲートを薬学的に許容される形態で含む組成物の治療的有効量を前記個体に投与することを含む、個体における疾患を治療する方法。
  42. 前記疾患が癌である、請求項３９又は４０に記載のイムノコンジュゲート又は薬学的組成物、又は請求項４１に記載の方法。
  43. 前記疾患が炎症性疾患である、請求項３９又は４０に記載のイムノコンジュゲート又は薬学的組成物、又は請求項４１に記載の方法。
  44. イムノコンジュゲートのエフェクター部分がＩＬ−１０である、請求項４３に記載のイムノコンジュゲート、薬学的組成物又は方法。
  45. 特異的には任意の抗原に結合しない第一のＦａｂ分子、２つのサブユニットからなるＦｃドメイン、及びエフェクター部分を含み、１以下のエフェクター部分が存在するコンジュゲート。
  46. 前記第一のＦａｂ分子が、配列番号２９９の重鎖可変領域配列、及び配列番号２９７の軽鎖可変領域配列を含む、請求項４５に記載のコンジュゲート。
  47. 前記エフェクター部分が、Ｆｃドメインの前記２つのサブユニットの一方のアミノ末端又はカルボキシ末端のアミノ酸に、任意でリンカーペプチドを介して融合している、請求項４５又は４６に記載のイムノコンジュゲート。
  48. 前記第一のＦａｂ分子が、Ｆｃドメインの前記２つのサブユニットの一方のアミノ末端のアミノ酸に、任意でリンカーペプチド又は免疫グロブリンのヒンジ領域を介して融合している、請求項４５又は４６に記載のコンジュゲート。
  49. 前記Ｆｃドメインが２つの非同一ポリペプチド鎖のヘテロ二量体化を促進する修飾を含む、請求項４５から４８の何れか一項に記載のコンジュゲート。
  50. 前記修飾が、Ｆｃドメインのサブユニットの一つにおいてノブ修飾及びＦｃドメインの２つのサブユニットの他方においてホール修飾を含む、ノブ・イントゥ・ホール（knob into hole）修飾である、請求項４９に記載のコンジュゲート。
  51. 前記エフェクター部分が、ノブ修飾を含むＦｃドメインのサブユニットのアミノ末端又はカルボキシ末端のアミノ酸に融合している、請求項５０に記載のコンジュゲート。
  52. 前記ＦｃドメインがＩｇＧのＦｃドメインである、請求項４５から５１の何れか一項に記載のコンジュゲート。
  53. 前記Ｆｃドメインが、Ｆｃ受容体への結合を改変されるように、及び／又はエフェクター機能を改変されるように操作される、請求項４５から５２の何れか一項に記載のコンジュゲート。
  54. 前記Ｆｃ受容体がＦｃγ受容体である、請求項５３に記載のコンジュゲート。
  55. 前記エフェクター機能がＡＤＣＣである、請求項５３に記載のコンジュゲート。
  56. 前記改変される結合及び／又はエフェクター機能が、結合及び／又はエフェクター機能の減少である、請求項５３に記載のコンジュゲート。
  57. 前記Ｆｃドメインが、Ｆｃ受容体、特にＦｃγ受容体に対するＦｃドメインの結合を減少させる一以上のアミノ酸変異を含む、請求項５６に記載のコンジュゲート。
  58. 前記アミノ酸変異が、位置Ｐ３２９でのアミノ酸置換である、請求項５７に記載のコンジュゲート。
  59. Ｆｃドメインが、そのサブユニットの各々において、アミノ酸置換のＬ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ及びＰ３２９Ｇを含む、請求項５７又は５８に記載のコンジュゲート。
  60. 前記改変される結合及び／又はエフェクター機能が、結合及び／又はエフェクター機能の増加である、請求項５３に記載のコンジュゲート。
  61. Ｆｃドメインが、非操作型Ｆｃドメインと比較して、改変されたオリゴ糖構造を有するように操作される、請求項６０に記載のコンジュゲート。
  62. Ｆｃドメインが、非操作型Ｆｃドメインと比較して、非フコシル化オリゴ糖の増加した割合を含む、請求項６１に記載のコンジュゲート。
  63. コンジュゲートが第一及び第二のＦａｂ分子を含む、請求項４５から６２の何れかに記載のコンジュゲート。
  64. 前記第一及び前記第二のＦａｂ分子の各々が、配列番号２９９の重鎖可変領域配列、及び配列番号２９７の軽鎖可変領域配列を含む、請求項６３に記載のコンジュゲート。
  65. 前記第一及び第二のＦａｂ分子及び前記Ｆｃドメインが免疫グロブリン分子の一部である、請求項６４に記載のコンジュゲート。
  66. 前記免疫グロブリン分子がＩｇＧクラスの免疫グロブリンである、請求項６５に記載のコンジュゲート。
  67. 前記エフェクター部分が、免疫グロブリン重鎖の一方のカルボキシ末端のアミノ酸に、任意でリンカーペプチドを介して融合している、請求項６５又は６６に記載のコンジュゲート。
  68. 前記エフェクター部分が単鎖エフェクター部分である、請求項４５から６７の何れか一項に記載のコンジュゲート。
  69. エフェクター部分がサイトカインである、請求項４５から６８の何れか一項に記載のコンジュゲート。
  70. 前記サイトカインがＩＬ−２である、請求項６９に記載のコンジュゲート。
  71. 前記サイトカインが、ＩＬ−２受容体のαサブユニットへの結合親和性が減少した変異体ＩＬ−２ポリペプチドである、請求項６９又は７０に記載のコンジュゲート。
  72. 前記変異体ＩＬ−２ポリペプチドが、ヒトＩＬ−２の残基４２、４５及び７２に対応する位置から選択される一以上の位置でアミノ酸置換を含む、請求項７１に記載のコンジュゲート。
  73. 請求項４５から７２の何れか一項に記載のコンジュゲート又はその断片をコードする単離されたポリヌクレオチド。
  74. 請求項７３に記載の単離されたポリヌクレオチドを含む発現ベクター。
  75. 請求項７３に記載の単離されたポリヌクレオチド、又は請求項７４に記載の発現ベクターを含む宿主細胞。
  76. 請求項７５に記載の宿主細胞を、コンジュゲートの発現に適した条件下で培養すること、及び任意でコンジュゲートを回収することを含む、請求項４５から７２の何れか一項に記載のコンジュゲートを生成する方法。
  77. 特異的には任意の抗原に結合しないＦａｂ断片、Ｆｃドメイン、及び単一エフェクター部分を含むコンジュゲートであって、前記コンジュゲートが請求項７６に記載の方法により生成されるコンジュゲート。
  78. 請求項４５から７２又は請求項７７の何れか一項に記載のコンジュゲート及び薬学的に許容される担体を含む薬学的組成物。
  79. 必要とする個体における疾患の治療において使用のための、請求項４５から７２又は請求項７７の何れか一項に記載のコンジュゲート、又は請求項７８に記載の薬学的組成物。
  80. 必要とする個体における疾患の治療のための医薬の製造のための、請求項４５から７２又は請求項７７の何れか一項に記載のコンジュゲート又は請求項７８に記載の薬学的組成物。
  81. 請求項４５から７２又は請求項７７の何れか一項に記載のコンジュゲートを薬学的に許容される形態で含む組成物の治療的有効量を前記個体に投与することを含む、個体における疾患を治療する方法。
  82. 上記に記載される発明。
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