JP2010510794A - 修飾型エリスロポエチンポリペプチド及びこの治療用用途 - Google Patents
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Abstract
Description
A.定義
B.エリスロポエチン(EPO)
C.EPOポリペプチドと他の修飾型治療用ポリペプチドの代表的な修飾方法
1.非制限推論的な突然変異誘発1次元的(1D)スキャニング
2.2次元(2D)推論的スキャニング(限られた推論的突然変異誘発)
a. インシリコHITの同定
b. 置換するアミノ酸の同定
c. 突然変異タンパク質の製造及び生物学的検定
3.3次元的(3D)スキャニング
a. 相同性
b. 3Dスキャニング(構造的相同性)方法
4.スーパーLEAD及び付加的方向性突然変異誘発(additive directional
mutagenesis;ADM)
5.多重重複されたプライマー伸張
D.増強されたタンパク質安定性を示す修飾型EPOポリペプチド
1.タンパク質分解酵素抵抗性
a. セリンタンパク質分解酵素
b. マトリックスメタロプロテイナーゼ
c. タンパク質分解位置の除去により増強された
タンパク質分解抵抗性
d. 増強されたタンパク質分解抵抗性を示す修飾型EPO
ポリペプチド
e. タンパク質分解に対して増強された抵抗性を有するEPO修飾の評価
2.スーパーLEAD
3.他のEPO修飾
a. 免疫原性
b. 糖化
c. さらなる修飾
E.増強されたタンパク質分解酵素抵抗性のための糖化型治療用ポリペプチドの非糖化型若しくは部分糖化型の修飾
1.タンパク質分解酵素敏感性位置の修飾
2.非糖化型修飾型治療用ポリペプチドの製作
3.修飾のための糖化型治療用ポリペプチドの例示
4.その他の修飾
a. 溶解性を向上させるための修飾
5.標的化された修飾による部分糖化型または非糖化型治療用ポリペプチドのタンパク質分解酵素抵抗性を増強させる方法
a. 脱糖化により露出されたタンパク質分解酵素敏感性位置の
標的化された修飾
F.EPOポリペプチド及び他の修飾型治療用ポリペプチドの産生
1.発現システム
a.原核細胞発現
b.酵母
c.昆虫及び昆虫細胞
d.哺乳動物細胞
e.植物
2.精製
3.融合タンパク質
4.ポリペプチド修飾
5.ヌクレオチド配列
G.修飾型EPOポリペプチドの特性及び活性評価
1.試験管内分析
2.非ヒト動物モデル
3.臨床分析
H.製剤/包装/投与
1.修飾型EPOポリペプチド及び他の修飾型治療用ポリペプチドの
投与
2.修飾型EPOポリペプチドまたは他の修飾型治療用ポリペプチドを
暗号化するヌクレオチドの投与(遺伝子治療)
I.治療学的用途
1.貧血症
2.組織保護的な治療
J. 診断的用途
K. 併用治療法
L. 製品及びキット
M. 修飾型EPOポリペプチド及び他の修飾型治療用ポリペプチドに
対する抗体
N. 実施例
特に断わりのない限り、本願明細書で使用されたあらゆる技術及び科学用語は、本発明が属する当業界における熟練者が通常、理解しているところと同じ意味を有する。この明細書の全体に亘って言及された全ての特許、特許出願、公開された出願及び公報、GenBank配列、ウェブサイト及び他の公開された資料は、特に断わりのない限り、その全文が参照として取り込まれる。本願の用語に対する定義が多数存在する場合には、このセクションにある定義が優先する。URLまたは他のこのような識別子またはアドレスを参照した場合、このような識別子は変更可能であり、インターネット上の特定の情報が変わることもあるが、インターネットまたは他の情報源を検索して同等な情報を見出すことが可能であるということを理解しなければならない。これを参照することは、このような情報の入手容易性及び大衆的普及性を照明する。
エリスロポエチン(EPO)は、ホルモンとして作用する造血成長因子群の1種である。これは、赤血球細胞産生調節、および適切な範囲における身体の赤血球量調節に関与する。EPO産生は、腎臓動脈循環において減少された酸素含量により刺激され、酸素敏感性転写因子により媒介される。EPOは、腎臓の細尿管毛細血管コーティング細胞において主として産生される。分泌されたEPOは骨髄赤血球前駆体表面のEPO受容体に付着され、その結果、急激な複製と機能的な赤血球細胞に成熟する。この刺激により赤血球細胞数が急増され、その結果、ヘマトクリット(血中赤血球細胞の%)(D'andrea et al., (1989) Cell 57: 277-285; Lodish et al., (1995) Cold Spring Harb Symp Quant Biol 60: 93-104)において上昇する。
本願は、タンパク質分解に対する増強された抵抗性によるEPOポリペプチドと、他の治療用ポリペプチドの半減期及び安定性の増強のための方法を提供する。本願は、タンパク質分解酵素(血液、血清、胃腸管など)によるタンパク質分解に対する抵抗性を増強させるためのEPOポリペプチドと他の治療用タンパク質の修飾方法を提供することにより、修飾型ポリペプチドは試験管内及び/または生体内において増加された半減期を示す。本願は、タンパク質安定性を付与するために1次アミノ酸配列が修飾されたEPOポリペプチド及び他の治療用ポリペプチドを提供する。本願で提供されるアミノ酸修飾の一つは、ポリペプチドのタンパク質分解切断を減少させるためにEPOポリペプチド及び他の治療用ポリペプチドの1次配列のアミノ酸置換を含む修飾である。修飾型EPOポリペプチドと治療用ポリペプチドのさらなる修飾は、炭水化物、リン酸、硫黄、水酸基、カルボキシ基及びポリエチレングリコール(PEG)残基の付加などを含むが、これらに限定されるものではない。このため、本願で提供される修飾型EPOポリペプチドと他の治療用ポリペプチドは、例えば、糖化、リン酸化、硫化、水酸化、カルボキシル化及び/またはPEG化によりさらに修飾可能である。このような修飾は、生体内または試験管内において行われうる。
推論的突然変異誘発(1Dスキャニングとも称する。)は2段階過程であり、同時係留中の米国出願第10/022、249号(米国公開番号第2003/0134351−A1号)に記述されている。1Dスキャニングは、EPOポリペプチド及び他の治療用ポリペプチド修飾と、付加的に2D及び3Dスキャニングなどの他の方法によるさらなる修飾のための位置を同定するために使用可能である。簡略に、第1段階において、全長アミノ酸スキャニングが行われるが、ここで、開始治療用ポリペプチド配列(例えば、配列番号2のEPOポリペプチド)の全体またはそれぞれのアミノ酸は提示の標準アミノ酸(例えば、アラニン)により置換される。単一のアミノ酸が一括してそれぞれのタンパク質分子に置換される。
タンパク質推論的進化のための2Dスキャニング(または、制限された推論的突然変異誘発)方法(同時係属中の米国出願公開第US2005−0202438A1及びUS−2004−0132977−A1、及び国際出願公開WO2004/022593及びWO2004/022747参照)は、2次元上におけるスキャニングに基づく。第1次元は、is−HIT標的位置を同定するためのタンパク質配列によるアミノ酸位置である。第2次元は、特定のis−HITアミノ酸位置を置換するために選別されたアミノ酸類型をスキャニングすることである。本願で提供される2Dスキャニング方法のメリットは、少なくとも1以上の、通常的にアミノ酸位置及び/または置換アミノ酸が制限されて、タンパク質骨格上の全てのアミノ酸よりも少数のアミノ酸がアミノ酸置換のために選別され、及び/または、元(例えば、天然)のアミノ酸を置換するのに利用可能な残りの19個アミノ酸の全部よりも少数のアミノ酸が置換のために選別可能である。
タンパク質の志向的進化のための2Dスキャニング方法には、進化する特徴に直接的または間接的に関連すると考慮されるタンパク質配列により特定のアミノ酸及びアミノ酸位置(本願において、is−HITと称する。)を(インシリコ分析を用いて)同定して選別することが含まれる。上述したように、提供された2Dスキャニング方法には、下記の2段階が含まれる。第1段階は、進化させる活性の標的でありうる全ての可能なアミノ酸位置を同定するためにタンパク質の標的アミノ酸配列をインシリコにて調査することである。この段階は、例えば、タンパク質上の変更される特性に対するアミノ酸残基の効果を任意の公知の標準ソフトウェアを用いて評価することにより行う。インシリコ分析の詳細事項は、修飾される特性と関係がある。
一旦is−HIT標的位置が選別されると、次の段階は、進化する特定の特徴に対する活性レベルを変更する各is−HIT位置にある、天然などの元のアミノ酸を置換するアミノ酸を同定することである。各is−HIT位置にある、天然などの元のアミノ酸を置換するのに用いられる置換アミノ酸のセットは特定のis−HIT位置ごとに異なり、これに対して特異的でありうる。置換アミノ酸の選択は、必須的な(例えば、触媒する、結合するなど)残基の疎水性、電荷及び極性などの物理化学的特性を保存させ、タンパク質の一部の他の特性(例えば、タンパク質安定性)を変更する必要性を考慮する。特定のis−HIT標的位置を置換するのに使用可能な残余19個の非天然(または非本来)アミノ酸のうち置換アミノ酸の数は、特定の修飾のための特性により、1個〜約19個及びこの間の範囲である。
上述したようにして一旦is−HITが選別されると、置換アミノ酸を導入する。突然変異タンパク質は、通常、組換えDNA方法を用いて製造し、最適化された特定の活性(特徴)に対する適切な生物学的アッセイにおいて評価する。突然変異タンパク質を製造する代表的な方法は、当業界に既に公知の方法を用いて、天然などの元の遺伝子の突然変異を誘発することである。突然変異分子を、例えば、アドレス可能なアレイにおいて1回につき1つずつ生成して、生成された個々の突然変異体をそれぞれの単一及び独立した突然変異誘発反応の単一生成物にする。個々の突然変異誘発反応は、これらが互いに物理的に分離されているアドレス可能なアレイでのように個別的に行う。一旦それぞれの突然変異タンパク質を暗号化する核酸分子のセットの集団が製造されると、それぞれ適切な細胞内に1回に1つずつ個別的に導入して対応する突然変異タンパク質を産生する。これはまた、例えば、それぞれの突然変異タンパク質を暗号化する核酸分子の各セットを多重ウェルマイクロタイタープレートのウェル内などの分離された位置に限定された細胞内に導入するアドレス可能なアレイにおいて行うことができる。個々の突然変異タンパク質を個別的に表現型的に特性化させ、最適化される特徴(すなわち、進化する特徴)に適したアッセイを用いて性能を定量的に評価する。また、前記段階は、アドレス可能なアレイにおいて行うことができる。天然などの元の分子と比べて目的とする増減された性能を示す突然変異体を同定し、LEADと命名する。突然変異DNA分子を生成する過程の開始から性能結果の判読及び分析まで、それぞれの候補LEAD突然変異体を、アドレス可能なアレイでのこの個別的なアドレスのように個別的に生成し、産生し、且つ、分析する。当該過程は自動化可能である。
同時係属中の米国公開出願第2005−0202438A1及び第2004−0132977−A1号、PCT公開出願WO2004/022747号及びWO2004/022593号に記述された3Dスキャニングは、突然変異誘発のための潜在的標的部位(is−HIT)の同定に基づくタンパク質のさらなる推論的進化方法である。当該方法は、比較されるタンパク質の基本的な配列とは無関係に、構造的に関連するタンパク質間のタンパク質骨格折り畳みパターンの比較を使用する。一旦関心対象のタンパク質上に構造的に関連するアミノ酸位置が同定されると、PAM分析などの適当なアミノ酸置換基準を用いて作製及びスクリーニングのための候補LEADを同定することができる。
一般的に、タンパク質間の相同性は、百分率に基づくそれらのアミノ酸配列レベルまたは配列が一般的に開始コドンにより暗号化された残基の基準から始まって整列されるときにアミノ酸対アミノ酸、それぞれのアミノ酸の一致レベルにおいて比較される。例えば、2種類のタンパク質はそれらの個別的アミノ酸配列が整列比較においてどれくらい一致するかを示す度に、「相同的」があるというか、または、ある程度の類似性を有していると言う。比較分子生物学は最初にこのような接近に基づく。アミノ酸配列間の類似性の度合いまたは一致から2以上のタンパク質配列と生物学的体系との間の進化的な間隔の結論を導き出すことができる。
構造的相同性とは、2つのタンパク質の位相学と3次元構造との間の相同性のことを言う。構造的相同性は「収束進化」または「分岐進化」に必須的に関連するものではなく、根源的なアミノ酸配列と関連しない。むしろ、構造的な相同性はその環境により課せられた特定の構造要求を合わせるためのタンパク質の必要により(自然的進化により)なされたと言われる。固有の根源的な配列が分岐されるときでさえ、特に構造的に一致する「個所」または「位置」は構造的に元の構造から分岐しない。このような構造的な相同性は、本願において、突然変異のための位置を確認するために開発された。
EPOポリペプチドと他の治療用ポリペプチドの修飾はまた、2以上の突然変異結合を含む。例えば、付加的な志向的突然変異誘発(ADM)は、スーパーLEAD突然変異タンパク質を生成するために、個別的なLEAD分子にある多重の突然変異を1個の突然変異タンパク質に集めることができる(同時係属中の米国公開出願第2005−0202438A1号及び第2004−0132977−A1号及び公開PCT出願WO2004/022747号及びWO2004/022593号参照)。ADMはスーパーLEAD突然変異タンパク質を生成し続けるために以前のLEAD突然変異タンパク質に最初のLEAD突然変異タンパク質生成後、各段階において新たなLEAD突然変異を付加する反復的な多段階過程である。ADMは、遺伝子組換え機序またはシャッフリング方法に基づくものではない。この代わりに、同じ分子内に所望の突然変異の総数になるまで1回につき1つの突然変異を所要数だけ繰り返し導入する単純な過程である。本願は、与えられた数の単一突然変異を同じ分子に構成することにより可能な組み合わせの数が指数的に増加することを避ける方法を提供し、たとえ全ての組み合わせ可能な空間を含んでいないとしても、依然として組み合わせ潜在力の大きな部分を占める。「組み合わせ」は、本願において数学的意味(すなわち、ある可能な順序において要素の一部を含む要素グループの部分集合)で用いられ、分子生物学または志向的進化(すなわち、それらの構成成分のランダム混合による分子の集合、混合物、または集合物)を意味するものではない。
m1
m1+m2
m1+m2+m3
m1+m2+m3+m4
m1+m2+m3+m4+m5
m1+m2+m3+m4+m5+...+mn
m1+m2+m4
m1+m2+m4+m5
m1+m2+m4+m5+...+mn
m1+m2+m5
m1+m2+m5+...+mn
m2
m2+m3
m2+m3+m4
m2+m3+m4+m5
m2+m3+m4+m5+...+mn
m2+m4
m2+m4+m5
m2+m4+m5+...+mn
m2+m5
m2+m5+...+mn
...、 et al., ..。
2以上の突然変異の組み合わせを生成するために使用可能な他の方法は、「多重重複されたプライマー伸張」と呼ばれるオリゴヌクレオチド媒介の突然変異誘発である。この方法は、スーパーLEADを形成する目的で突然変異LEADを合理的に組み合わせるために使用可能である。この方法は、小さなタンパク質または公知された配列のタンパク質領域の全体に亘って多数の突然変異を同時に挿入するような方法である。典型的に約20個の塩基領域において重ね合わせるように、一般的に約70個の塩基長の(より長いオリゴヌクレオチドは誤りを増加させる)オリゴヌクレオチドを重ね合わせることは、突然変異LEADタンパク質を暗号化するDNA配列(遺伝子)から考案される。たとえ重複オリゴヌクレオチドを生成するために典型的に約70個の塩基が使用されるが、使用するための付加的重複オリゴヌクレオチドの長さは約30個の塩基から約100個の塩基までの範囲でありうる。同様に、重複オリゴヌクレオチドの重複領域が典型的に約20個の塩基であるが、本願明細書で使用される他の重複領域の長さは約5個の塩基から約40個の塩基までの範囲でありうる。これら重複オリゴヌクレオチド(点突然変異を包含または排除する。)をPCR(意外の突然変異を避けるための校正ポリメラーゼ、例えば、PfuDNAポリメラーゼを使用する。)の第1段階において鋳型及びプライマーとして用いて少量の全長遺伝子を生成する。次いで、第1のPCRから生成された全長遺伝子をそれぞれが後続的クローニングを促進するために制限部位にタグされたフランキングプライマーを用いてPCRの第2段階において選択的に増幅させる。1回の多重重複された伸張過程によりLEAD突然変異タンパク質から由来した、内部に多数の突然変異を有する候補スーパーLEADタンパク質を暗号化する全長(多重突然変異された)核酸分子が導き出される。
本願は、増強されたタンパク質安定性(タンパク質分解酵素抵抗性が増強されたかまたは立体配座の安定性が増強された、例えば、温度またはpH変化による変性に対する抵抗性をさらに高めたポリペプチド)を示す修飾型EPOポリペプチド(本願において、EPO変異体とも呼ばれる。)を提供する。本願は、試験管内(例えば、産生、精製、保管中に)または生体内(例えば、対象への投与後)において増加された半減期を導いてタンパク質安定性の増強を示す修飾型EPOポリペプチドを提供する。例えば、増加された半減期は、ヒトなどの対象に前記ポリペプチドを投与後に発生可能である。修飾型EPOポリペプチドの増加された半減期は、未修飾型EPOポリペプチドの半減期と比べて、少なくとも1%、2%、3%、4%、5%、6%、7%、8%、9%、10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、100%、200%、300%、400%、500%、またはそれ以上に増加可能である。一部のケースにおいて、修飾型EPOポリペプチドの増加された半減期は、未修飾型EPOポリペプチドの半減期と比べて、少なくとも6倍、7倍、8倍、9倍、10倍、20倍、30倍、40倍、50倍、60倍、70倍、80倍、90倍、100倍、200倍、300倍、400倍、500倍、600倍、700倍、800倍、900倍及び1000倍、またはそれ以上に増加可能である。このため、本願で提供される修飾型EPOポリペプチドは、血清中の十分な薬物レベルを維持するために必要とされる注射回数を減少させるメリットを付与して被験者に対する便宜性及び許容性を達成し、さらに低い服用量により同等な生物学的効果及び2次的効果の減少を達成する。
患者への安定したペプチド及びタンパク質薬物の伝達は、薬剤産業の主な挑戦である。人体内において、このような形態の薬は、内在化、糸球体ろ過及びタンパク質分解などの異なる生理学的過程により絶えず排出されたり循環血から除去される。後者は、時々経口投与及び静脈または筋肉注射時に治療薬物として用いられるタンパク質の半減期に影響を及ぼす制限段階である。このため、タンパク質分解酵素による消化に対する増強された抵抗性として現れるタンパク質安定性を増強させる治療用タンパク質は興味深いものである。治療用タンパク質のための修飾の中では、治療剤として、または治療用活性を破壊または除去することなくタンパク質分解酵素に対する保護を向上させるものがある。このような変化は、持続性治療用タンパク質の産生に有用である。このため、本発明の一局面においては、本願で提供されるEPOポリペプチドはタンパク質分解に対する抵抗性が増強されるように修飾され、それにより、試験管内(例えば、産生、加工、貯蔵、分析など)または生体内(例えば、血清安定性)において修飾型EPOポリペプチドの半減期が増加される。
セリンタンパク質分解酵素は、原核性生物及び真核性生物の両方において、血液凝固、炎症だけではなく、消化酵素を含む体内の広範な機能に関与する。セリンタンパク質分解酵素は配列特異的である。タンパク質分解酵素活性化の連続増幅段階は、血液凝固及び補体を制御する一方、他のタンパク質分解酵素は異なる細胞または細胞外区画において信号伝達経路、酵素活性化及び分解機能に関与する。
マトリックスメタロプロテイナーゼ(MMP)は、細胞外基質(ECM)の成分を分解するZn2+及びカルシウム依存的なエンドペプチダーゼの系列である。また、MMPは、多くの細胞表面サイトカイン、受容体及び他の可溶性タンパク質をプロセッシングすることができる。これらは、傷治癒、妊娠及び血管新生などの正常組織リモデリング過程に関連している。生理学的な条件下において、MMPは不活性前駆体(ザイモゲン)として生成され、プロセッシングされて活性型となる。加えて、前記酵素は、マトリックスメタロプロテイナーゼの組織抑制剤(TIMP)と呼ばれる内因性抑制剤により特異的に調節される。MMPのタンパク質分解活性は、生理学的及び病理学的な条件下において組織リモデリングのエフェクター機構として作用し、炎症の調節因子として作用する。このようなタンパク質の過剰合成及び産生はECM分解の加速化を誘導するが、これは、例えば、骨恒常性、関節炎、癌、多発性硬化症及びリウマチ関節炎などの様々な疾病及び状態と関連する。神経炎症性疾患の範疇において、MMPは、(a)血液−脳障壁(BBB)及び血液−神経障壁割れ、(b)血液由来の免疫細胞による神経組織の浸透、(c)サイトカイン及びサイトカイン受容体の脱落、及び(d)抹消及び中樞神経系疾患における直接的な細胞損傷などの過程に関連している(Leppert et al., Brain Res. Rev. 36(2-3): 249-57 (2001); Borkakoti et al., Prog. Biophys. Mol. Biol. 70(1): 73-94 (1998)参照)。
2Dスキャニング方法は、タンパク質分解酵素(血液、胃腸管など)、血液溶解物または血清への露出時に安定性の増強をもたらすhEPOにおいてアミノ酸変化を同定するのに利用された。本願において、タンパク質分解酵素(血液、溶解物、腸血清など)に対するタンパク質安定性の増強は、特別なタンパク質分子に対する生体内においてさらに長い半減期を有するようにして、被験者に対する投与回数を低減できるように考えられた。
本願明細書に記述された方法を用いて、次のis−HIT位置がEPOポリペプチドのタンパク質分解酵素敏感性部位を除去し、タンパク質安定性を向上させるために同定された:2、3、4、5、7、8、10、12、13、14、15、16、17、18、20、21、23、29、31、35、37、42、43、45、48、49、51、52、53、54、55、62、64、67、69、70、72、75、76、80、81、87、88、89、90、91、93、96、97、102、103、105、108、109、110、112、116、117、121、122、123、129、130、131、136、138、139、140、141、142、143、145、148、149、150、152、153、154、155、156、159、162、165、及び166。アミノ酸置換は、配列番号2に示される成熟型EPOポリペプチドのアミノ酸位置であるP2、P3、R4、L5、C7、D8、R10、L12、E13、R14、Y15、L16、L17、E18、K20、E21、E23、C29、E31、L35、E37、P42、D43、K45、F48、Y49、W51、K52、R53、M54、E55、E62、W64、L67、L69、L70、E72、L75、R76、L80、L81、P87、W88、E89、P90、L91、L93、D96、K97、L102、R103、L105、L108、L109、R110、L112、K116、E117、P121、P122、D123、P129、L130、R131、D136、F138、R139、K140、L141、F142、R143、Y145、F148、L149、R150、K152、L153、K154、L155、Y156、E159、R162、D165、及びR166に対応する1以上の位置を含むことができる。
EPO変異体のタンパク質分解に対する抵抗性の増強は、タンパク質安定性、耐熱性、タンパク質分解酵素敏感性及び抵抗性及び/またはEPO活性を評価する当業界に周知な任意の方法により評価することができる。例えば、タンパク質分解酵素抵抗性は、1以上のタンパク質分解酵素と修飾型EPOポリペプチドを一緒に反応した後に、未処理対照群と残留活性を測定する。特別の変異体の方が未修飾型EPOよりも活性が上手に維持されるかどうかを確認するために、類似する条件下において、修飾型EPOは未修飾型及び/または野生型天然型EPOと比較可能である。活性は、例えば、赤血球産生または組織保護活性を測定することにより当業界に周知な方法により評価可能である。
EPOポリペプチドの修飾は、2以上の修飾を組み合わせることを含むことができる。修飾型EPOスーパーLEADポリペプチドは、2つまたはそれ以上の各修飾型EPOLEADポリペプチドに存在する一つのアミノ酸修飾の組み合わせである。このため、修飾型EPOスーパーLEADポリペプチドは、2つまたはそれ以上の各修飾型EPOLEADから由来した2つまたはそれ以上の単一アミノ酸置換を有する。これを詳細に後述すると、本願で提供される修飾型EPOポリペプチドは、タンパク質分解に対する抵抗性の増強として現れる増強されたタンパク質安定性を示す。一般的に生成された修飾型EPOLEADポリペプチドの性質は、未修飾型ポリペプチドの一つのis−HIT位置における単一アミノ酸置換修飾により最適化された。
本願で提供される1以上のアミノ酸修飾に加えてさらに修飾されたEPOポリペプチドはまた、PEG化、高糖化、脱免疫原化、及び他の方法など当業者に公知のものを含む1以上のさらなる修飾を含むが、これに限定されない(例えば、米国特許番号第5、856、298号、米国特許公開番号第2003−0120045号、第2004−0063917号、第2005−0220800号、第2005−0107591号、第2006−0035322号、及び第2006−0073563号及びPCT国際公開番号WO01/81405号参照)。一般的に、修飾は、未修飾型EPOポリペプチドの1以上の活性、例えば、赤血球細胞生成または組織保護活性を失うことなく(すなわち、本願における定義のように、少なくとも一つの活性が維持される。)、増強された安定性をもたらす。例えば、EPOポリペプチドにおける他のさらなる修飾は、1以上の付加的なアミノ酸修飾及び/または1以上の化学的な修飾を含む。このような修飾は、免疫原性、糖化、活性、またはEPOポリペプチドの他の公知の特性を変更することを含むが、これらに限定されない。他の例として、化学的な修飾は、タンパク質翻訳後修飾、例えば、炭水化物部位による糖化、アシル化(例えば、アセチル化またはサクシニル化、メチル化、リン酸化、ハシル化、カルバミル化、硫化、プレニル化、酸化、グアニジル化、アミジン化、カルバミル化(例えば、カルバモイル化)、トリニトロフェニル化、窒酸化、PEG化、またはこれらの組み合わせを含む。加えて、タンパク質修飾はまた、ポリペプチドの検出、精製、及び分析開発を容易化させるための修飾、例えば、タンパク質の1次アミンへの共有結合のためのスルホ−NHS−LC−ビオチンとポリペプチドの修飾、または、蛍光、非同位性または放射性標識のための他の類似する修飾を含むことができる。代表的なEPOポリペプチドにさらなる修飾は、後述する。さらに、接合及び/または標識された修飾型ポリペプチドが提供される。例えば、本願は、PEG部位と接合されたか、または、ポリペプチド上における1以上の糖化部位に共有結合された炭水化物部位を含む修飾型ポリペプチドを提供する。
治療用タンパク質の効能は、多くの場合、治療用タンパク質に対する不所望の免疫反応により制限される。EPOなどの治療用タンパク質に対する免疫反応は、MHCクラスIIペプチド提示経路により起こる。外来性タンパク質はのみ込まれてDR、DQ、またはDP型のMHCクラスII分子と関連して提示のために加工される。MHCクラスII分子は、他のもののうち大食細胞と樹脂状細胞などの専門的な抗原提示細胞(APCs)により発現される。CD4分子などの任意の他の共受容体への交差結合と共に、T細胞の表面にあるT細胞受容体によるMHCクラスIIペプチド複合体の結合は、T細胞内活性化された状態を誘導する。活性化はサイトカインの排出をもたらし、さらに、B細胞などの他のリンパ球を活性化させて抗体を産生したり、全体的な細胞性免疫反応としてTキラー細胞を活性化させる。
Q、I133R、I133S、I133T、I133W、I133Y、A135H、A135P、D136P、D136T、F138A、F138C、F138D、F138E、F138G、F138H、F138K、F138N、F138P、F138Q、F138R、F138S、F138T、F138M、F138W、F138Y、R139A、R139C、R139G、R139P、R139T、R139H、R139K、R139Q、R139N、R139D、R139E、R139D、R139S、R139A、K140A、K140C、K140G、K140P、K140D、K140E、L141A、L141C、L141D、L141E、L141G、L141H、L141K、L141N、L141P、L141Q、L141R、L141S、L141T、L141F、L141I、L141H、L141V、L141W、L141Y、F142A、F142C、F142D、F142E、F142G、F142H、F142K、F142N、F142P、F142Q、F142R、F142S、F142T、F142W、R143A、R143C、R143G、R143H、R143P、R143M、R143L、R143K、R143Q、R143E、R143W、R143D、R143N、R143A、R143T、R143S、V144A、V144C、V144D、V144E、V144G、V144H、V144K、V144N、V144P、V144Q、V144R、V144S、V144T、Y145A、Y145C、Y145D、Y145E、Y145G、Y145H、Y145K、Y145N、Y145P、Y145Q、Y145R、Y145S、Y145T、Y145W、S146D、S146H、S146P、S146T、S146F、S146L、S146Y、S146E、S146W、S146A、S146M、S146K、S146Q、S146G、S146N、N147P、N147T、N147D、F148A、F148C、F148D、F148E、F148G、F148H、F148K、F148N、F148P、F148Q、F148R、F148S、F148T、F148M、L149A、L149C、L149D、L149E、L149G、L149H、L149K、L149N、L149P、L149Q、L149R、L149S、L149T、L149F、L149I、L149H、L149V、L149W、L149Y、R150A、R150C、R150D、R150G、R150H、R150P、R150T、R150K、R150E、R150Q、G151E、G151H、G151N、G151P、G151Q、G151S、G151T、G151A、K152A、K152C、K152D、K152G、K152N、K152P、K152Q、K152S、K152T、L153A、L153C、L153D、L153E、L153G、L153H、L153K、L153N、L153P、L153Q、L153R、L153S、L153T、L153F、L153I、L153M、L153V、L153W、L153Y、K154A、K154C、K154D、K154E、K154G、K154H、K154N、K154P、K154Q、K154S、K154T、K154F、K154W、K154L、K154M、K154Y、L155A、L155C、L155D、L155E、L155G、L155H、L155K、L155N、L155P、L155Q、L155R、L155S、L155T、L155F、L155I、L155M、L155V、L155W、L155Y、Y156A、Y156C、Y156D、Y156E、Y156G、Y156H、Y156K、Y156N、Y156P、Y156Q、Y156R、Y156S、Y156T、Y156M、Y156W、Y156Y、T157A、T157C、T157F、T157G、T157I、T157L、T157M、T157P、T157V、T157W、T157Y、T157N、T157D、T157E、G158C、G158D、G158E、G158F、G158H、G158I、G158K、G158M、G158N、G158P、G158Q、G158R、G158S、G158T、G158V、G158W、G158Y、E159A、E159C、E159F、E159G、E159I、E159L、E159M、E159P、E159T、E159V、E159K、E159Y、A160D、A160F、A160H、A160I、A160L、A160P、A160V、A160W、A160Y、C161D、C161E、C161F、C161H、C161I、C161K、C161L、C161N、C161P、C161Q、C161R、C161S、C161T、C161V、C161W、C161Y、R162T、T163A、T163C、T163F、T163G、T163I、T163L、T163M、T163P、T163V、T163W、T163Y、G164F、G164H、G164I、G164N、G164P、G164Q、G164S、G164T、G164V、G164W、及びG164Y。
治療活性を有する多くのタンパク質は、1以上の糖化部位、すなわち、真核細胞により糖化されるアミノ酸配列を含む。例えば、アミノ酸配列は、真核性細胞により糖化される。治療用タンパク質の糖化の度合いは、1)免疫原性減少、2)タンパク質投与回数の減少、3)血清内半減期の増加などのタンパク質安定性の増強、及び4)炎症反応などの副作用の減少のために変更可能である。糖化部位は、糖化能がある真核細胞において対象ポリペプチドが産生されるときに糖化される対象ポリペプチドに炭水化物部位の結合のための位置を提供する。EPOポリペプチドのさらなる糖化は、血清半減期増加、免疫原性減少、生体内半減期増加、胃腸管条件、例えば、胃腸管タンパク質分解酵素による分解減少及び腸上皮細胞の吸収率増加を含む1以上のメリットを付与する。腸上皮細胞による吸収率増加と胃腸管条件による分解減少は、EPOポリペプチドの腸溶(例えば、経口)製剤において重要である。
本願で提供されるポリペプチドのさらなる修飾はポリペプチドの化学的誘導体化を含み、アセチル化及びカルボキシル化、PEG化または他の変更に敏感なタンパク質を生成したりEPOポリペプチドの特性を変えるアミノ酸配列の変更を含むが、これに限定されない。EPOポリペプチドの修飾のための部位は、ポリエチレングリコール及びポリプロピレングリコールの重合体、カルボキシメチルセルローズ、デキストラン、ポリビニールアルコール、ポリビニールピロリジンまたはポリプロリンを含んで考慮されるが、これに限定されない(Abuchowski et. al., (1981); Newmark et. al., (1982); and Katre et. al., (1987))。本願で提供される修飾型EPOポリペプチドは1以上のポリエチレングリコール成分を用いて修飾(PEG化)可能である。活性化されたPEG誘導体はEPOポリペプチドと直接的に反応するために使用可能であり、カルボン酸またはカルボネート誘導体の活性エステル、特に、離脱基がN−ヒドロキシサクシンイミド、p−ニトロフェノル、イミダゾールまたは1−ヒドロキシ−2−ニトロベンゼン−4−スルホネートであるものを含む。スルフヒドリル基の修飾のためにマレイミドまたはハロアセチル基を含むPEG誘導体を使用することができ、炭水化物グループの過ヨード酸の酸化により生成されたアルデヒドを修飾するためにヒドラジンまたはヒドラジド基を含有するPEG試薬を使用することができる。場合によっては、本願で提供される修飾型EPOポリペプチドは減少された血清除去を有するPEG誘導体化されたポリペプチドを提供可能に操作された1以上の非天然発生PEG化位置を含むことができる。PEG化を誘導するための代表的なアミノ酸修飾は、成熟型EPOポリペプチドのA1C、P2C、P3C、R4C、D8C、S9C、N24C、I25C、T26C、T27C、G28C、A30C、E31C、H32C、S34C、N36C、N38C、I39C、T40C、D43C、T44C、K45C、N47C、A50C、K52C、E55C、G57C、Q58C、G77C、Q78C、A79C、N83C、S84C、S85C、Q86C、W88C、E89C、T107C、R110C、A111C、G113C、A114C、Q115C、K116C
、E117C、A118C、S120C、P121C、P122C、D123C、A124C、A125C、A127C、A128C、T132C、K154C、T157C、G158C、E159C、A160C、T163C、G164C、及びD165Cを含むが、これらに限定されない(例えば、米国特許公開番号第2005−0107591号及び国際特許公開番号WO90/12874参照)。加えて、PEG部位などの作用基付着のための自由チオール基を産生するためにEPOポリペプチドにN末端システインを付加することができる(例えば、米国特許公開番号第2005−0170457号参照)。
本願は、非糖化型治療用ポリペプチド、または、糖化部位の数が減少した修飾型治療用ポリペプチドを提供する。治療用タンパク質は、修飾の不在と比べて増強されたタンパク質分解酵素抵抗性を示すために1次配列において修飾される。また、治療用ポリペプチドは生体内において糖化されるか、1以上の糖化部位を含むものである。糖化の減少または除去は、任意の適切な方法、例えば、原核宿主内発現、または突然変異、例えば、1以上の糖化部位を除去するために糖化部位の1以上のアミノ酸残基を置換して達成される。
本願は、治療用ポリペプチドが糖化されないか、または、ポリペプチドに付着した炭水化物部位の数の減少を有する場合、タンパク質分解酵素から抵抗性を増強させるために1次配列が修飾された糖化型治療用ポリペプチドを提供する。非糖化の治療用ポリペプチドは生体内において増強されたタンパク質分解のために部分的にしばしば不安定である。このため、糖化の除去を補充する、増強されたタンパク質分解酵素抵抗性のための修飾が提供される。修飾型治療用ポリペプチドは、修飾不在の治療用ポリペプチドと比べて増強されたタンパク質分解酵素抵抗性を示す。提供された治療用ポリペプチドは、治療用ポリペプチドの1以上のタンパク質分解酵素敏感性位置の置換または除去により修飾される。前記提供された治療用タンパク質は、1以上のタンパク質分解酵素敏感性位置の修飾により治療用ポリペプチドのタンパク質分解酵素抵抗性を増強させる1以上のアミノ酸修飾を含む。本願で提供される治療用タンパク質のアミノ酸修飾は、タンパク質分解酵素に対する抵抗性を増強させて糖化の不在時に前記修飾されたタンパク質が未修飾型ポリペプチドと比べてさらにタンパク質分解酵素に対する抵抗性を有するようにする。一部のケースにおいて、炭水化物部位の全体または部分の除去は、タンパク質分解的な攻撃に対するタンパク質分解酵素敏感性位置を露出させることにより、タンパク質分解酵素により分解される治療用ポリペプチドの敏感性を増強させる。ポリペプチドの糖化型において、糖化は、前記タンパク質分解酵素敏感性位置を遮蔽または隠蔽することにより分解から治療用ポリペプチドを保護することができる。例えば、糖化は、炭水化物部位による物理的妨害またはタンパク質構造の変化によりタンパク質分解酵素敏感性位置に対する接近を防ぐことができる。本願は、1以上のタンパク質分解酵素敏感性位置が完全糖化型ポリペプチドと比べて糖化されていないかまたは部分的に糖化された治療用ポリペプチドがタンパク質分解的攻撃に敏感な場合、治療用ポリペプチド内の1以上のタンパク質分解酵素敏感性位置が除去または置換により修飾された治療用ポリペプチドを提供する。非糖化型ポリペプチドまたは部分糖化型ポリペプチドのタンパク質分解酵素抵抗性を増強させる変異体を操作することにより、タンパク質の糖化型及び非糖化型が両方とも分解から保護される。糖化型タンパク質が要求されるならば、提供された修飾は生体内において治療用タンパク質が糖化されない場合、分解から治療用タンパク質を保護するであろう。糖化型治療用タンパク質の脱糖化は、循環系及び消化系の細胞外グルコシダーゼ(例えば、ラクターゼ、ニューラミニダーゼ、アミラーゼ)に露出されることにより生体内において起こりうる。シアリダーゼ、例えば、ニューラミニダーゼによる末端シアル酸残基の除去はガラクトース残基を露出させ、これは、循環から糖タンパク質の除去を媒介する肝細胞内ガラクトース特異的な他の糖特異的受容体(例えば、N−アセチルグルコサミン、マンノース、フコース、及びリン酸マンノース)により認識及び結合される(Ashwell and Harford (1982) Ann. Rev. Biochem. 51 : 531においてレビューされる)。本願で提供されるアミノ酸修飾は、投与後1以上の炭水化物部位の生体内除去に起因する分解に対する抵抗性を有する糖化型治療用ポリペプチドの生成を許容する。また、本願で提供されるアミノ酸修飾は、炭水化物部位を認識する除去機序による分解を回避する非糖化型治療用ポリペプチドの産生を可能にする。
本願で提供されるタンパク質分解酵素抵抗性を増強させる方法は、生体内において一般的に糖化された治療用ポリペプチドの非糖化型の産生を可能にする。真核細胞において糖化されたタンパク質の産生は、代替糖残基の高い変異性をもたらす。基の異質性は、生体内に投与されるときに不所望の抗体の産生を惹起する可能性がある。このため、非糖化型治療用ポリペプチドのタンパク質分解酵素抵抗性を増強させる提供された修飾はまた、治療用製品の均一性を増強させる。より均一な治療用製品を産生する能力は、治療用ポリペプチドの産生コストの低減分だけ製品の免疫原性を減らすことができる。
天然型糖化治療用タンパク質は、提供された方法を用いて非糖化型または部分糖化型のタンパク質分解酵素抵抗性ポリペプチドの産生のために修飾可能である。典型的に、本願で提供される方法を用いた修飾型治療用ポリペプチドは、糖化型でさらに高い生体内治療活性を有する。例えば、治療用タンパク質の脱糖化型は投与後に一層高速にて分解され、これは、さらに低い治療活性をもたらす。糖化型治療用ポリペプチドの代表例としては、ホルモン(例えば、インシュリン、甲状腺ホルモン、カテコールアミン、性線刺激ホルモン、栄養ホルモン、プロラクチン、オキシトシン、ドパミン、牛成長ホルモンまたはレプチン)、成長ホルモン(例えば、ヒト成長ホルモン)、成長因子(例えば、上皮成長因子、神経成長因子またはインシュリン類似成長因子)、成長因子受容体、サイトカイン及び免疫体系タンパク質(例えば、インターロイキン、コロニー刺激因子(CSF)、顆粒球コロニー刺激因子(G−CSF)、顆粒球・大食細胞コロニー刺激因子(GM−CSF)、腫瘍怪死因子(TNF)、インターフェロン-α、インターフェロン−β、またはインターフェロン−γなどのインターフェロン、エリスロポエチン、インテグリン、アドレシン、セレクチン、帰還受容体、T細胞受容体、免疫グロブリン、溶解性主組織複合体抗原、細菌、寄生、またはウィルス抗原またはアレルゲンまたは自己抗原などの免疫的活性抗原、酵素(例えば、組織プラスミノゲン活性剤、ストレプトキナーゼ、コレステロール生合成または分解酵素、ステロイド合成酵素、キナーゼ、ホスホダイエステラーゼ、メチラーゼ、脱メチラーゼ、脱水素酵素、セルラーゼ、タンパク質分解酵素、リパーゼ、ホスホリパーゼ、アロマターゼ、サイトクロム、アデニレートまたはグアニレートサイクラーゼ及びニューラミダーゼ)、受容体(例えば、ステロイドホルモン受容体またはペプチド受容体)、結合タンパク質(例えば、ステロイド結合タンパク質、成長ホルモンまたは成長因子結合タンパク質)、転写または翻訳因子、腫瘍タンパク質または原始腫瘍タンパク質(例えば、細胞周期タンパク質)、筋肉タンパク質(例えば、ミオシンまたはトロポミオシン)、ミエロタンパク質、神経活性タンパク質、腫瘍成長抑制タンパク質(例えば、アンジオスタチンまたはエンドスタチン)、抗腐敗タンパク質(例えば、殺菌透過性増強タンパク質)、構造タンパク質(例えば、コラゲン、フィブロイン、フィブリノゲン、エラスチン、チュブリン、アクチンまたはミオシン)、血液タンパク質(例えば、トロンビン、血清アルブミン、血液凝固第VII因子、血液凝固第VIII因子、インシュリン、血液凝固第IX因子、血液凝固第X因子、組織プラスミノゲン活性剤、タンパク質C、フォンヴィレブランド因子、抗トロンビン、グルコセレブロシダーゼ、顆粒球コロニー刺激因子(GCSF)または修飾FacorVIII、フリジンなどの抗凝固剤)を含むが、これらに限定されない。
糖化サイトカインの代表例は、エリスロポエチン(EPO)である。上述したように、EPOは腎臓において主として産生され、赤血球産生の主な調節子である。EPO遺伝子は193個のアミノ酸からなるタンパク質前駆体を暗号化し(配列番号1)、N末端に27個のアミノ酸からなるシグナルペプチドを含む。プロセッシングされた結果として糖化された成熟型EPOタンパク質は166個のアミノ酸を有するか(配列番号2)、もしC末端アルギニン残基が切断されると165個のアミノ酸を有する(配列番号237)。EPOポリペプチドは、配列番号2及び237に示される成熟型EPO配列のN24、N38及びN83、そして配列番号1に示される前駆体ポリペプチドのN51、N65及びN110に対応する3個のN糖化部位を含む。また、配列番号2及び237に示される成熟タンパク質の136番アミノ酸残基に位置するO糖化部位(配列番号1に示される前駆体ポリペプチドの153番アミノ酸残基に対応する)がある。EPOの重要な機能の一つは、赤血球の分化と成長を促進させ、且つ、ヘモグロビンの産生を開始することである。EPOは、骨髄エリスロイド前駆体上の受容体と結合することにより作用し、成熟した赤血球に転換するために刺激する。
顆粒球・大食細胞コロニー刺激因子(GM−CSF)は、リンパ細胞、内皮細胞、肥満細胞、繊維芽細胞、単核細胞、及び一部の悪性細胞を含むが、これらに限定されない様々な細胞により産生された糖タンパク質である。GM−CSF遺伝子は、17個のアミノ酸からなるシグナルペプチドを含む144個のアミノ酸からなる前駆体タンパク質を暗号化する(配列番号273)。翻訳後プロセッシングは、127個のアミノ酸長の糖化成熟型GM−CSFタンパク質を生成する(配列番号274)。成熟型GM−CSFは、配列番号274に示される成熟型GM−CSF配列のN27及びN37、及び配列番号273に示される前駆体ポリペプチドのN44及びN54に対応する2つの位置においてN糖化が生成される。また、成熟タンパク質のN末端に位置する、配列番号274に示される配列のアミノ酸位置S5、S7、S9及びT10(配列番号273に示される前駆体ポリペプチドのS22、S24、S26及びT27に対応する)に4個のO糖化部位がある。GM−CSFは、好中性白血球、好酸性白血球及び単核球起源の造血前駆細胞の増殖及び分化を刺激可能な複数系統のコロニー刺激因子である。例えば、このように、GM−CSFは、骨髄移植または骨髄移植失敗または遅延後、自家組織抹消血液前駆細胞の移植後、及び急性骨髄性白血病を有する高齢者における誘導化学療法後の骨髄再建に治療的に使用可能である。
M−CSFは、リンパ球、単核球、繊維芽細胞、内皮細胞、筋芽細胞及び骨芽細胞を含む様々な細胞により産生された糖化サイトカインである。差別的スプライシングの結果として、M−CSF遺伝子は、3種類の異なる同種型を産生する。同種型1は、32個のアミノ酸からなるシグナル配列を含む554個のアミノ酸前駆体(配列番号275)として発現される。成熟した同種型1M−CSFタンパク質は522個のアミノ酸からなり、配列番号276に示されている。同種型2は、32個のアミノ酸からなるシグナル配列を含む438個のアミノ酸前駆体(配列番号277)として発現される。成熟した同種型2M−CSFタンパク質は406個のアミノ酸からなり、配列番号278に示されている。同種型3は、32個のアミノ酸からなるシグナル配列を含む256個のアミノ酸前駆体(配列番号279)として発現される。成熟した同種型3M−CSFタンパク質は224個のアミノ酸からなり、配列番号280に示されている。M−CSFは、2つのN糖化部位(配列番号275、277及び279のそれぞれに示される前駆体ポリペプチドのアミノ酸残基154及び172、及び配列番号276、278及び280のそれぞれに示される成熟ポリペプチドのアミノ酸122及び140に対応する)を有している。M−CSFは、細胞の増殖、分化、及び血液単核球、組織大食細胞、及びそれらの前駆細胞の生存の核心調節子である。M−CSFはまた、真皮の厚さ、及び雌雄受精を調節するのに重要な役割を果たすことが判明された。
糖化サイトカインの代表例は、顆粒球コロニー−刺激因子(G−CSF)である。G−CSFは、30個のアミノ酸からなるシグナル配列を含む207個のアミノ酸前駆体ポリペプチド(配列番号281)であり、単核細胞、大食細胞、好中性白血球、繊維芽細胞及び内皮細胞により産生される。配列番号282に示される177個のアミノ酸からなる成熟タンパク質は、シグナル配列の切断後に産生される。G−CSFmRNAの差別的なスプライシングは、他の前駆体変異体、204個のアミノ酸からなる同種型b(配列番号283)をもたらす。シグナル配列の切断は、174個のアミノ酸からなる成熟した同種型bG−CSFポリペプチドをもたらす(配列番号284)。G−CSFは、配列番号282に示される成熟ポリペプチドのアミノ酸位置T136(配列番号281の前駆体ポリペプチドのT166、配列番号284の成熟した同種型bポリペプチドのT133、配列番号283の前駆体同種型bポリペプチドのT163に対応する)においてO結合型糖化されている。顆粒球コロニー刺激因子(G−CSF)は顆粒球生成の主な細胞外調節子であり、特定の骨髄前駆細胞の増殖と生存及びこれらの顆粒球への分化を刺激することにより好中性白血球の生成を調節する。
白血病抑制因子(LIF)は、糖タンパク質である。LIF遺伝子は、22個のアミノ酸からなるシグナルペプチドを含む202個のアミノ酸からなる前駆体タンパク質(配列番号285)を暗号化する。翻訳後プロセッシングは、180個のアミノ酸からなる糖化型成熟LIFタンパク質をもたらす(配列番号286)。成熟LIFは、配列番号286に示される成熟LIF配列のN7、N34、N63、N73、N96及びN116(配列番号285の前駆体ポリペプチドのN31、N56、N85、N95、N118及びN138)に対応する複数のN糖化部位を含む。LIFは、血小板形成、一部造血細胞の増殖、骨形成、脂肪細胞脂質輸送、副腎皮質刺激ホルモン生成、ニューロンの生存及び形成、筋肉衛星細胞増殖、及び肝細胞による急性期産生のための刺激として作用するものを含む広い範囲の作用をする。LIFは、嚢胞移植及び海馬及び嗅覚器受容体ニューロンの正常的な発達に欠かせないものである。
インターロイキン−1β(IL−1β)は、116個のアミノ酸からなるプロペプチドを含む268個のアミノ酸前駆体(配列番号287)として合成される。成熟IL−1βの配列は配列番号288に示されており、152個のアミノ酸からなる。IL−1βは配列番号287に示される前駆体ポリペプチドの123番アミノ酸及び配列番号288に示される成熟ポリペプチドの7番アミノ酸に対応する一つのN結合型糖化部位を有している。IL−1βは、単核細胞、組織大食細胞、角質形成細胞、及び他の内皮細胞を含む様々な細胞において産生された炎症誘発サイトカインである。IL−1α及びIL−1βは両方とも同じ受容体に結合し、同一ではなければ、類似する生物学的特性を有している。このようなサイトカインは。IL−2放出誘導による胸腺細胞増殖、B細胞成熟と増殖、ミトゲンFGF類似活性及び滑液細胞からのプロスタグランジンと膠原質分解酵素の放出を刺激する能力の刺激を含む広い範囲の活性を有している。
インターロイキン−2(IL−2)は、抗原性またはミトゲン性刺激に対する反応においてT細胞により産生された糖タンパク質である。IL−2遺伝子は、20個のアミノ酸からなるシグナルペプチドを含む153個のアミノ酸からなる前駆体タンパク質(配列番号289)を暗号化する。翻訳後プロセッシングは、133個の糖化アミノ酸からなる糖化型成熟IL−2タンパク質(配列番号290)をもたらす。成熟IL−2は、配列番号290に示される成熟IL−2のT3及び配列番号289に示される前駆体ポリペプチドのT23に対応する位置においてO糖化されている。IL−2は、T−細胞増殖及び免疫反応の調節に重要な他の活性を必要とする。これは、B細胞、単核球、リンホカイン活性化されたキラー細胞、自然殺害細胞及び神経膠腫細胞を刺激することができる。
糖化サイトカインの代表例として、インターロイキン−3(IL−3)がある。IL−3は、19個のアミノ酸からなるシグナル配列を含む152個のアミノ酸からなる前駆体ポリペプチド(配列番号291)として活性化されたT細胞、単核細胞/大食細胞及びストロマ細胞により産生される。配列番号292に示される133個のアミノ酸からなる成熟タンパク質は、シグナル配列の分離後に産生される。IL−3ポリペプチドは、配列番号292に示される成熟ポリペプチドのN15及びN70位(配列番号291の前駆体ポリペプチドのN34及びN89に対応する)にN結合型糖化部位を含む。IL3は、骨髄、赤血球及び去核細胞系統の産生前駆細胞の成長と分化を調節し、成熟した好中性白血球及び大食細胞を機能的に活性化させる多能性造血成長因子である。このようなIL−3は、造血細胞個体群を拡張するのに使用可能である。
糖化サイトカインの代表例には、インターロイキン−4(IL−4)がある。IL−4は、24個のアミノ酸シグナルペプチドを含む153個のアミノ酸の前駆体(配列番号293)として合成される。成熟IL−4の配列は配列番号294であり(ユニプロット番号P05112)、129個のアミノ酸からなる。IL−4は、2つのN結合型糖化部位(配列番号293に示される前駆体ポリペプチドのアミノ酸62及び129、及び配列番号294に示される成熟ポリペプチドのアミノ酸38及び105に対応する)を有している。IL−4はまた、2硫化結合の形成に関与する6個のシステイン残基を含む。IL−4は、純水ヘルパーT細胞のTh2細胞への分化を誘導する。IL−4はまた、活性化されたB細胞の刺激及びT細胞の増殖を行う役割を果たす。このため、IL−4は、体液性及び適応性免疫の調節子である。
糖化サイトカインの代表例には、IL−5がある。IL−5は、好酸球白血球の増殖、分化、及び活性化を促進するホモ二量体型糖タンパク質である。IL−5は、また、B細胞成長を刺激する機能をし、免疫グロブリン分泌を増強させる。IL−5は19個のアミノ酸からなるシグナルペプチドを含む134個のアミノ酸前駆体(配列番号134)として合成される。成熟IL−5の配列は配列番号296に示されており、115個のアミノ酸からなる。IL−5は、2つのシステイン(配列番号296に示されるアミノ酸配列のC44とC86に対応する)により結合された逆平行二量体である。IL−5はまた、配列番号296に示されるアミノ酸配列に対応するT3及びN28位置においてそれぞれO結合型及びN結合型糖化により糖化されている(Minamitake et. al., (1990) J. Biochem., 107:2:292-297)。本願は、タンパク質分解酵素抵抗性を示す非糖化IL−5ポリペプチドを提供する。このようなIL−5タンパク質分解酵素抵抗性ポリペプチドは1以上の修飾を有するものであり、前記1以上のアミノ酸修飾はタンパク質分解酵素に対する抵抗性を増強させる。このような修飾の代表例として、配列番号296に示されるアミノ酸配列のアミノ酸置換に対応する表12に示す修飾があるが、これらに限定されない。一例として、非糖化型タンパク質分解酵素抵抗性IL−5サイトカインは、例えば、大腸菌などの原核性宿主を例として含む糖化能がない宿主細胞においてタンパク質分解酵素抵抗性ポリペプチドを産生することにより得られる。他の例として、非糖化型タンパク質分解酵素抵抗性IL−5サイトカインは、ポリペプチドの糖化部位の1以上から全部までを突然変異させることにより発生可能である。例えば、配列番号296に示されるアミノ酸置換に対応する表12に示す1以上の修飾を有するタンパク質分解酵素抵抗性ポリペプチドは、アミノ酸位置T3及び/またはN28において1以上の修飾をさらに含むことができる。本願で提供される非糖化型タンパク質分解酵素抵抗性ポリペプチドは、タンパク質分解酵素抵抗性がない完全糖化型IL−5ポリペプチドの活性を維持する。このような非糖化型タンパク質分解酵素抵抗性ポリペプチドは、例えば、好酸球増強症が予後に貢献する任意の場合を含む一般的にIL−
5が治療のために用いられる疾病や障害の治療に使用可能である。このような疾病の代表例には、大腸癌、胃癌、そして、肺、膀胱、子宮頸部及び頭部・頸部の癌腫及び移植拒否があるが、これらに限定されない。
糖化サイトカインの代表例には、インターロイキン−6(IL−6)がある。IL−6は多面発現性サイトカインであり、多くの造血細胞発達、増殖、及び成熟を刺激することができる。IL−6はまた、免疫グロブリン分泌細胞であり、B細胞成熟に必要とされる。さらに、IL−6は、神経細胞の分化、骨の代謝作用及び肝細胞における急性期タンパク質の誘導作用をする。IL−6は、29個のアミノ酸からなるシグナルペプチドを含む212個のアミノ酸前駆体(配列番号297)として合成される。成熟IL−6の配列は配列番号298に示されており、183個のアミノ酸からなる。IL−6は、T細胞、大食細胞、繊維芽細胞、内皮細胞及び角質形成細胞により発現される。発現の根源に従属して、分泌された成熟したヒトIL−6は、183から186個の残基を含む。例えば、繊維芽細胞由来のIL−6のアミノ末端は、配列番号297のアミノ酸配列のAla28である。IL−6は、N結合型およびO結合型糖化により翻訳後修飾される。例えば、Thr166はO結合型糖化部位であり、Asn73及びAsn172は配列番号297に示される前駆体配列の残基に対応するN結合型糖化部位である(それぞれ配列番号298の137、44及び143残基に対応する)。
代表的な糖化サイトカインは、オンコスタチンM(OSM)である。刺激されたOSMは、T細胞と単核球により合成された多面発現性サイトカインであり、肝発達、造血、炎症及び中樞神経発達に関与する。OSMは、25個のアミノ酸からなるシグナルペプチドを含む252個のアミノ酸前駆体(配列番号299)として合成される。成熟したOSM配列は配列番号300に示され、227個のアミノ酸長を有する。チロシン類似切断位置における31カルボキシ末端アミノ酸部位は、OSMの完全に活性化された196残基を提供する。OSM配列内の5個のシステイン残基のうち4個は、2硫化結合に関与する(すなわち、配列番号299に示される残基に対応するC31及びC152、C74及びC192位におけるシステイン間)、螺旋A及びB(C74及びC192)間の2硫化結合はOSM活性に欠かせないものである。システインがない残基(C105)はOSMの二量体化を調節することができない。OSMはN結合型糖化により翻訳後さらに修飾される。例えば、Asn100及びAsn217は配列番号299に示される前駆体配列内残基に対応するN結合型糖化部位である(及び、配列番号300に示される残基75及び192にそれぞれ対応する)。本願は、タンパク質分解酵素抵抗性を示す非糖化OSMを提供する。このようなOSMタンパク質分解酵素抵抗性ポリペプチドは1以上のアミノ酸修飾を有し、前記1以上のアミノ酸修飾はさらに高いタンパク質分解酵素抵抗性をもたらす。このような修飾の例は、配列番号300に示されるアミノ酸配列におけるアミノ酸置換に対応する下記表14に示す修飾を含むが、これらに限定されない。一例として、非糖化型タンパク質分解酵素抵抗性OSMサイトカインは、例えば、大腸菌などの原核性宿主を含む糖化能がない宿主細胞においてタンパク質分解酵素抵抗性ポリペプチドの産生により生成可能である。他の例において、非糖化型タンパク質分解酵素抵抗性OSMサイトカインは、ポリペプチド内の糖化部位の1以上から全部までの修飾により生成可能である。例えば、配列番号300のアミノ酸置換に対応する表14に示す1以上の修飾を有するタンパク質分解酵素抵抗性ポリペプチドは、1以上のアミノ酸位置N75及びN192の修飾をさらに含むことができる。本願で提供される非糖化型タンパク質分解酵素抵抗性ポリペプチドは、タンパク質分解酵素抵抗性がない完全糖化型OSMポリペプチドの活性を維持する。このような非糖化型タンパク質分解酵素抵抗性ポリペプチドは、一般的に、OSMが治療に用いられる疾病や障害を治療するのに使用可能である。このような疾病や治療の例は、慢性炎症疾患、急性及び慢性胃腸管炎症、リウマチ関節炎及び多発性硬化症及び組織損傷抑制を含むが、これらに限定されない。
代表的な糖化サイトカインは、幹細胞因子(SCF)である。SCF(「スチール因子」または「cキットリガンド」と知られている)は、CD117(cキット)と結合したサイトカインであり、造血幹細胞及び他の造血前駆細胞の生存、増殖、及び分化に重要である。これらの機能の一つは、例えば、赤血球系列内初期赤血球前駆体であるBFU−E(破裂形成単位赤血球)をCFU−E(コロニー形成の単位赤血球)細胞に変化させることである。SCFは、25個のアミノ酸からなるシグナルペプチドを含む273個のアミノ酸前駆体(配列番号301)として合成される。成熟SCFの配列は配列番号302に示され、その長さはアミノ酸248個である。SCFは、細胞表面に結合したSCF及び溶解性(または、自由)SCFの2種類の形態として存在する。受容性SCFは、メタロタンパク質分解酵素により表面に結合したSCFを切断することにより製造されて、配列番号301の26から214のアミノ酸に対応する189アミノ酸ポリペプチドを産生する。SCFは、配列番号301に示される前駆体配列内残基に対応するC29及びC114、及びC68及びC163位のシステイン間に2つの2硫化結合を有している。SCFは、N結合型糖化により翻訳後にさらに修飾される。例えば、Asn90、Asn97、Asn118、Asn145、及びAsn195は配列番号301に示される前駆体配列内残基に対応するN結合型糖化部位である(配列番号302の65、72、93、120と170残基にそれぞれ対応する)。
代表的な糖化サイトカインは、インターフェロン−β(IFN−β)である。インターフェロンのI型クラスの構成要素であるIFN−βは、5個のアルファ螺旋を含む球状タンパク質である。一般的に、IFN−βは抗炎症分子であり、この様々な免疫細胞(例えば、T細胞、NK細胞、単核細胞、大食細胞及び樹脂状細胞)に対する観察効果は、例えば、次を含む:T細胞の細胞毒性強化、抗体生成調節T細胞の増殖及び移動阻害接着分子の抑制、腫瘍結合表面抗原の発現増加、MHCクラスI抗原などの表面分子の刺激、親細胞自滅遺伝子及びタンパク質(例えば、腫瘍怪死因子関係の細胞死滅誘導リガンド、キャスパーゼ、Bak、Bax、及びp53)の誘導及び活性化、抗細胞自滅遺伝子(例えば、Bcl−2、細胞死滅タンパク質の阻害剤)の抑制、及び血管新生の阻害(Pestka et. al., Immunological Reviews 202: 8-32 (2004); Holten et. al., (2002), Arthritis Research, 4: 346-352)。
代表的な糖化サイトカインがインターフェロン−γ(IFN−γ)である。一般的に、IFN−γは、活性化されたT細胞及びNK細胞を含む免疫細胞において産生される多面発現性サイトカインである。IFN−γ及びこれを産生した細胞は、様々な細胞形態に抗ウィルス、抗増殖及び免疫調節効果を及ぼすことにより宿主防御において中樞的な役割を果たす。例えば、IFN−γは、大食細胞の機能的な活性を向上させ、T及びB細胞分化を促進し、様々な細胞においてクラスI及びIIMHC基抗原発現を調節し、天然キラー細胞及び中性球を活性化させ、中性球生存を延ばす能力を有する。IFN−γポリペプチドは様々なアミノ酸配列長から構成された非均質性ポリペプチドであり、組換え的に産生されたポリペプチド、合成的に産生されたポリペプチド及び細胞及び組織、例えば、Tリンパ球及び天然キラー(NK)細胞から抽出されたIFN−γでありうる。一般的に、IFN−γは、シグナル配列の切断によりさらに小さなポリペプチドとして成熟するさらに大きなポリペプチドとして産生される。成熟IFN−γポリペプチドは、シグナル配列の切断後に、通常、124から146個のアミノ酸長からなる。ヒトIFN−γの前駆体形態は166個のアミノ酸ポリペプチドであり(例えば、配列番号305)、切断されるシグナル配列(すなわち、アミノ酸1−20)を含み、配列番号306に示される146個のアミノ酸の成熟ポリペプチドなどの成熟ポリペプチドをもたらす。IFN−γは、N結合型糖化によりさらに翻訳後修飾される。例えば、Asn48とAsn120は、配列番号305に示される前駆体配列の残基に対応(及び、配列番号306内の28番及び100番の残基に対応)するN結合型糖化部位である。
本願で提供されるタンパク質分解酵素抵抗性増強のための任意の1以上のアミノ酸修飾にさらに修飾された治療用ポリペプチドはまた、1以上のさらなる修飾を含むことができる。一般的に、修飾は、治療用ポリペプチドの少なくとも一つの活性の損失なしで安定性増強をもたらす。
前記提供された修飾型治療用ポリペプチドはまた、タンパク質の溶解性を増強させるためにさらに修飾可能である。例えば、タンパク質の活性のために要求されない表面の極性残基は、細菌内において産生される場合、ポリペプチドの凝集を防止するために修飾可能である(Narhi et. al., (2001) Prot. Eng. 14(2) 135-140)。一般的に、残基は、前記タンパク質が修飾されない治療用タンパク質の1以上の活性を維持するように修飾される。修飾のための残基は、タンパク質糖化部位であるアスパラギン残基を含むが、これに限定されない。典型的に、中性のアスパラギン残基は、リシンまたはヒスチジンなどの塩基性アミノ酸残基に代替可能である。一例において、修飾型治療用タンパク質は修飾型EPOタンパク質であり、アミノ酸N24、N38及びN83からなる群より選択される1以上のアスパラギン残基が修飾されている。特別な例において、EPOポリペプチド内のN24、N38、及びN83残基は、リシンに代替することができる(例えば、配列番号309または310)。
タンパク質分解酵素抵抗性を増強させる治療用ポリペプチドの修飾のための位置を確認する方法は本願の他の個所に開示されており、当業界に周知である(国際公開番号WO04/022593号及びWO04/022747)。タンパク質分解酵素抵抗性の増強をもたらす修飾は、非糖化型または部分糖化型ポリペプチドとして生成または修飾されて1以上の糖化部位が除去された任意の糖化型治療用ポリペプチド内に生成可能である。非糖化型または部分糖化型治療用ポリペプチドにおいて、タンパク質分解酵素抵抗性増強をもたらす修飾は、炭水化物部位の除去に起因するタンパク質変性増強を補償する。修飾型治療用ポリペプチド内のタンパク質分解酵素抵抗性のための修飾の例は、表3、表5から17に示してある。
本願は、翻訳後修飾、例えば、糖化により隠されたタンパク質分解酵素敏感性位置の確認及び修飾による治療用タンパク質のタンパク質分解酵素抵抗性を増強させる方法を提供する。本願で提供される方法を用いて、完全糖化の天然型治療用ポリペプチドと対等なタンパク質分解敏感性を有する治療用ポリペプチドの非糖化型変異体が達成可能である。
1.発現システム
(修飾及び未修飾)EPOポリペプチドと他の治療用ポリペプチドは、タンパク質産生のために当業界に周知な任意の方法により製造可能であり、これは、EPOポリペプチドまたは他の治療用ポリペプチドを暗号化する核酸分子の宿主細胞、宿主動物への導入、及びEPOポリペプチドまたは他の治療用ポリペプチドを暗号化する核酸分子の試験管内発現を含む。発現宿主は、大腸菌、酵母、植物、昆虫細胞、ヒト細胞株や遺伝子挿入動物を含む哺乳動物細胞を含む。発現宿主は、それらのタンパク質産生レベルだけではなく、発現されたタンパク質に存在する翻訳後修飾型において異なる場合がある。発現宿主は、前記及び他の要素、例えば、規定及び安定性の考慮、産生コスト及び精製の必要及び方法に基づいて選択することができる。
原核細胞、特に、大腸菌は、EPOポリペプチド及び他の治療用ポリペプチドの大量産生のためのシステムを提供する(例えば、Plastis et. al., (2003) Protein Exp. Purif. 31(2):222-30, and Khalizzadeh et. al., (2004) J. Ind. Microbiol. Biotechnol. 31(2): 63-69参照)。大腸菌形質転換は当業者に広く公知された単純で且つ迅速な技術である。大腸菌の発現ベクターは高レベルのタンパク質発現を誘導し、宿主細胞に対する若干の毒性を示すタンパク質を発現させるのに有用な誘導性プロモータを含有することができる。誘導性プロモータの例には、lacプロモータ、trpプロモータ、ハイブリッドtacプロモータ、T7及びSP6RNAプロモータ及び温度調節性Lプロモータが含まれる。
出芽酵母(Saccharomyces cerevisiae)、***酵母(Schizosaccharomyces pombe)、ヤロウィア・リポリチカ(Yarrowia lipolytica)、キラー酵母(Kluyveromyces lactis)及びメタノール資化酵母(Pichia paseris)などの酵母は、EPOポリペプチド及び他の治療用ポリペプチドのための有用な発現宿主である(Skoko et. al., (2003) Biotechnol. Appl. Biochem. 38(Pt3):257-65参照)。酵母は、エピソーム複製ベクターを有するか、または相同組換えによる安定した染色体統合により形質転換可能である。通常、誘導性プロモータを用いて遺伝子発現を調節する。このようなプロモータの例には、GAL1、GAL7及びGAL5及びメタロチオネインプロモータ(例えば、CUP1)が含まれる。発現ベクターにはしばしば、形質転換されたDNAの選別及び維持のためのLEU2、TRP1、HIS3及びURA3などの選択マーカーが含まれる。酵母において発現されるタンパク質はしばしば溶解性であり、シャヘロニン、例えば、Bip及びタンパク質2硫化物イソメラーゼとの共同発現は、発現レベル及び溶解度を向上させることができる。また、酵母において発現されたタンパク質は、出芽酵母からの酵母交配型α−因子分泌シグナルなどの分泌シグナルペプチド融合及び酵母細胞表面タンパク質、例えば、Aga2p交配付着受容体またはアルシュラ・アデニニヴィランス(Arxula adeninivirans)グルコアミラーゼとの融合を用いて分泌されるように指示可能である。タンパク質分解酵素切断位置(例えば、Kex−2タンパク質分解酵素)を操作して、これらが分泌経路を抜け出るときに融合された配列がポリペプチドから除去されるようにもできる。酵母はまた、Asn−X−Ser/Thrモチーフにおいて糖化可能である。
昆虫及び昆虫細胞、特に、バキュロウイルス発現システムの使用は、EPOポリペプチド及び他の治療用ポリペプチドなどのポリペプチドを発現させる上で有用である(Quelle et. al., (1992) Protein Expr. Purif. 3(6): 461-9参照)。血リンパにおける発現を含む昆虫細胞及び昆虫幼虫は高レベルのタンパク質を発現し、高等真核細胞により用いられるほとんどの翻訳後修飾が可能である。バキュロウイルスは制限的宿主範囲を有していて安定性を向上させ、真核性発現の規制的恐れを減少させる。通常、発現ベクターは、高レベル発現のためのバキュロウイルスのポリヘドリンプロモータなどのプロモータを使用する。一般的に用いられるバキュロウイルスシステムには、バキュロウイルス、例えば、オートグラファ・カリフォニア(Autographa californica)核ポリヘドロシスウィルス(AcNPV)及びボムビックス・モリ(bombyx mori)核ポリヘドロシスバイサス(BmNPV)、及び昆虫細胞株、例えば、スポドプテラ・フルギペルダ(Spodoptera frugiperda)から由来のSf9、シュダラチア・ウニパンクタ(Psuedlaetia unipuncta)(A7S)及びダナウス・フレキシプス(DpN1)を含む。高レベル発現のために、発現される分子のヌクレオチド配列は、ウィルスのポリヘドリン開始コドンの下流に直ちに融合される。哺乳動物分泌信号は昆虫細胞において正確にプロセッシングされ、発現されたタンパク質を培養培地に分泌させるために使用可能である。また、細胞株シュダラチア・ウニパンクタ(Psuedlaetia unipuncta)(A7S)及びダナウス・フレキシプス(DpN1)は、哺乳動物細胞システムと類似する糖化パターンを有するタンパク質を産生する。昆虫細胞における代案的発現システムは、安定的に形質転換された細胞を使用することである。細胞株シュナイダー2(S2)及びKc細胞(ドロソフィラ・メラノガスター)及びC7細胞(アエデス・アルボピクタス)などの細胞株を発現用に使用することができる。ドロソフィラ・メタロチオネインプロモータを用いて、カドミウムまたは銅を用いた重金属誘導の存在下において高レベルの発現を誘導することができる。通常、ネオマイシン及びハイグロマイシンなどの選択マーカーを用いて発現ベクターを維持する。
哺乳動物発現システムを用いてEPOポリペプチド及び他の治療用ポリペプチドを発現させることができる。発現製作物は、アデノウィルスまたはワクシニアウイルスなどのウィルス性感染により、またはリポソーム、リン酸カルシウム、DEAE−デキストランなどの直接的DNA伝達により、及び電気穿孔及び微細注入などの物理的手段により哺乳動物細胞に伝達可能である。哺乳動物細胞用発現ベクターには、通常、mRNAキャップ位置、TATAボックス、翻訳開始配列(コザク共通配列)及びポリアデニル化要素が含まれる。このようなベクターには、しばしば、高レベル発現のための転写プロモータ−エンハンサ、例えば、SV40プロモータ−エンハンサ、ヒトサイトメガロウィルス(CMV)プロモータ及びラウス肉腫ウィルス(RSV)の長末端反復部が含まれる。これらのプロモータ−エンハンサは、多くの細胞類型において活性がある。組織及び細胞類型プロモータ及びエンハンサ領域もまた発現のために使用することができる。代表的なプロモータ/エンハンサ領域には、エルサスターゼI、インシュリン、免疫グロブリン、マウス***腫瘍ウィルス、アルブミン、α−胎児タンパク質、アルファ1−抗トリプシン、ベータ−グロビン、ミエリン基礎タンパク質、ミオシン軽鎖−2及び性線刺激ホルモン放出ホルモン遺伝子制御などの遺伝子からのものが含まれるが、これらに限定されるものではない。選別可能マーカーを用いて発現構築物を有する細胞を選別及び維持することができる。選別可能なマーカー遺伝子の例には、ハイグロマイシンBホスホトランスフェラーゼ、アデノシンデアミナーゼ、キサンチン−グアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ、アミノグリコシドホスホトランスフェラーゼ、ジヒドロ葉酸還元酵素及びチミジンキナーゼが含まれるが、これらに限定されるものではない。細胞表面信号伝達分子、例えば、TCR−ζ及びFcεRI−γとの融合は、細胞表面において活性状態であるタンパク質の発現を指示することができる。
EPOポリペプチド及び他の治療用ポリペプチドの発現のために遺伝子挿入された植物細胞及び植物を使用することができる。通常、微細粒子投射法及びPEG媒介の原形質体内への伝達などの直接的DNA伝達及びアグロバクテリウム媒介の形質転換を用いて発現構築物を植物に伝達する。発現ベクターには、プロモータ及びエンハンサ配列、転写終結要素及び翻訳制御要素(例えば、Tiプラスミド)が含まれうる。発現ベクター及び形質転換技術は、一般的に、シロイヌナズナ及びタバコなどの双子葉宿主とトウモロコシ及び稲などの単子葉宿主との間において区分される。発現のために用いられる植物プロモータの例には、カリフラワーモザイクウィルスプロモータ、ノパリン合成酵素プロモータ、リボースビフォスフェイトカルボキシラーゼプロモータ及びユビキチン及びUBQ3プロモータが含まれる。ハイグロマイシン、ホスホマンノースイソメラーゼ及びネオマイシンホスホトランスフェラーゼなどの選別マーカーをよく用いて形質転換された細胞の選別及び維持を容易化させる。形質転換された植物細胞は、細胞、凝集体(カルス組織)として培養物中に維持されるが、全体植物に再生可能である。遺伝子挿入された植物細胞にはまた、タンパク質を産生するように設計された鳥類が含まれうる(例えば、 Mayfield et. al., (2003) PNAS100:438-442参照)。さらに、植物細胞発現システムは、例えば、カリフラワーモザイクウィルス(CaMV)またはタバコモザイクウィルス(TMV)などのウィルス発現ベクターに感染された植物を含む。植物は、哺乳動物細胞と異なる糖化パターンを有するため、これは前記宿主においてEPOを産生するための選択に影響を与えることができる。
宿主細胞からEPOポリペプチド及び他の治療用ポリペプチドを精製する方法は、選択された宿主細胞及び発現システムにより異なってくる。分泌される分子の場合、一般的に細胞を除去した後、培養培地からタンパク質を精製する。細胞内発現の場合、細胞を溶解させ、タンパク質を抽出物から精製することができる。発現のために遺伝子挿入植物及び動物などの遺伝子挿入有機体を使用する場合、組織または器官を開始物質として用いて融解された細胞抽出物を得ることができる。また、遺伝子挿入された動物の製造には、回収可能な乳汁または卵におけるポリペプチドの産生が含まれ、必要に応じて、当業界における標準方法を用いてさらにタンパク質を抽出して精製することができる。
一部の具現例において、修飾型EPOポリペプチドまたは他の治療用ポリペプチドは、融合タンパク質を形成するための外来のポリペプチド(例えば、融合パトナー)をさらに混合するか、あるいは、リンカー、例えば、化学的手段によりポリペプチドと結合される。融合パトナーの好適な例としては、生体内における増強された安定性を与えるペプチド及びポリペプチド(例えば、血清半減期増加)、精製し易さを提供するペプチド及びポリペプチド、例えば、ヒスチジンタグ(His)n(例えば、6xHis及び類似物)、細胞から融解タンパク質の分泌を提供するペプチド及びポリペプチドエピトープタグを提供するペプチド及びポリペプチド(例えば、GST、ヘマグルチニン(HA)、FLAG、c−myc及び類似物)探知可能な信号(探知可能な産物を産生する酵素(例えば、β−ガラクトシダーゼ、ルシペラーゼ))、または自家検出可能なタンパク質(例えば、緑色蛍光タンパク質(GFP)など)を提供するペプチド及びポリペプチド重合体を提供するペプチド及びポリペプチド(例えば、免疫グロブリンのFc部分などの重合体部分)などを含む。
修飾型EPOポリペプチド及び他の治療用タンパク質は、裸出型ポリペプチド鎖として、または複合体として製造可能である。一部の適用例において、翻訳後または他の化学的修飾がない「裸出型」である修飾型EPOまたは他の治療ポリペプチドを製造することが好ましい。裸出型ポリペプチド鎖は、治療用ポリペプチドを翻訳後修飾させない適当な宿主において製造可能である。また、このようなポリペプチドは、試験管内システム及び化学的ポリペプチド合成を用いて製造可能である。他の適用例において、PEG化、アルブミン化、糖化、カルボキシル化、ヒドロキシル化、リン酸化または他の公知の修飾を含む特定の修飾が好ましい。修飾は、試験管内において、または、例えば、このような修飾を生み出す適切な宿主において修飾型EPO及び他の治療的ポリペプチドを産生することにより製造可能である。
本願は、原核性または哺乳動物細胞などの真核性細胞における発現のために誘導性プロモータなどのプロモータに操作的に結合された修飾型EPOポリペプチド及び他の治療用ポリペプチドまたはこれらの融合タンパク質を暗号化する核酸分子を提供する。前記プロモータは、原核性、真核性、またはウィルス性プロモータを含むが、これらに限定されない。細胞内発現のためのプロモータの選択は、発現に用いられる細胞類型に依存的である。哺乳動物細胞内発現のための例示的なプロモータには、CMV及びSV40プロモータ、アデノウィルスプロモータ、例えば、HPVE7腫瘍タンパク質に反応性を示すE2遺伝子プロモータPVプロモータ、例えば、PVE2タンパク質に反応するPBVp38プロモータ及びHIVまたはPVまたは腫瘍遺伝子により活性化される他のプロモータが含まれるが、これらに限定されない。
EPO活性及び特性は、試験管内及び/または生体内において評価することができる。このような評価のための分析は当業者に公知されており、検査された活性及び結果と治療学的及び生体内活性を関連付けることが公知されている。一例として、EPO変異体は未修飾型及び/または野生型EPOと比較して評価することができる。他の例として、修飾型EPOポリペプチドは、タンパク質安定性−変更条件(例えば、タンパク質分解酵素、または温度やpHなどの変性化剤への露出)に対する試験管内や生体内露出による生物学的活性により評価可能である。試験管内分析は、例えば、細胞基礎分析、例えば、赤血球生成分析、細胞生存力分析、細胞生存分析、タンパク質分析及び分子生物学的分析などの当業界に周知な任意の実験実績分析法を含む。生体内分析は、動物モデル分析だけではなく、ヒトに投与したEPO分析をも含む。一部の場合、生体内EPO活性は、血液、血清または分析決定子のためのその他の体液を評価して決定可能である。EPO変異体はまた、生体内において安定性(例えば、半減期)などの特性または活性及び治療効果を評価するために試験可能である。このような分析結果は、治療的有効性、容量レベル、投薬ガイドライン及びEPO媒介疾病または状態に対する有用性などのパラメータを評価するために利用可能である。
代表的な試験管内分析は、ポリペプチドの安定性及び活性を評価するための分析を含む。安定性分析は、試験管内や生体内においてタンパク質分解酵素に対する抵抗性やポリペプチドの安定性を指示する物理的性質を評価する分析を含む。安定性はまた、当業界に周知なタンパク質の構造及び構造解析により評価可能である。活性分析は赤血球細胞増殖分析法を含むが、これに限定されない。
非ヒト動物モデルは、修飾型EPOポリペプチドの活性及び安定性を評価するのに利用可能である。例えば、非ヒト動物モデルは、疾病または状態に対するモデルとして使用可能である。疾病及び/または疾病の進行に対する効果をモニターリングするために、EPO投与前に非ヒト動物モデルに表現型誘発物質を注射することができる。遺伝学的なモデルも有用である。マウスなどの動物は1以上の遺伝子の過発現、発現低下または除去により疾病または状態と同様に誘導することができる。このような動物は当業界に周知な遺伝子挿入動物製造技術または自然発生的または誘導された突然変異種により産生することができる。EPOと関連する疾病の有用な非ヒト動物モデルの例は、マウス、ラット、兔、犬及び霊長類などの動物における、鎌状赤血球貧血、後天性骨髄不全症、β−地中海性貧血、急性貧血、再生不良性貧血、悪性貧血及び腎不全または癌から誘発された貧血のモデルを含む貧血モデルである(例えば、Nagel (1998) N. Engl J Med. 339(3): 194-5; Chen (2005) Clin. Med. Res. 3:102-108; Chen et. al., (2004) Blood 104: 1671-1678; McMullin et. al., (1989) Biochem Med Metab Biol. 41(1): 30-5; Alderuccio et. al., (2002) Clin. Immun. 102(1): 48-58; Kawamura et. al., (1990) Biotherapy 2(1): 77-85; Bohl et. al., (2000) Blood 95: 2793-2798参照)。前記非ヒト動物モデルは、野生型EPOポリペプチドと比べてEPO修飾活性をモニターリングするのに利用可能である。
臨床用EPOの活性を評価するために多くの分析法を利用することができる。このような分析法には、赤血球細胞生成活性、組織保護活性、タンパク質安定性及び生体内半減期の評価及び表現型分析が含まれる。表現型分析及びEPO処理の治療効果を測定する分析は、血中EPOレベル(例えば、体質量指数(BMI)を考慮した投与前及び初回投与、最後の投与後に直ちに、及び投与間時点を含む投与後時点の血清EPOの測定)、未修飾型及び/または野生型EPOまたはプラスボにより処理された被験者と比べて経時による症状の緩和を含むEPO処理に対する表現型反応を含む。EPO活性を評価する臨床実験の例は、例えば、Marsden(2006) Ann Clin Biochem 43: 97-104; Gascon (2005) Eur J Cancer 41(17): 2601-12; ANNA J. (1989) Aug;16(5):344-8に開示されている。患者は、日常的または反復的投与の所定の期間中に薬物投与による急性症状、例えば、出血、外傷または外科的経過が定期的にモニターリングされた。
本願明細書に記述された方法により製造された最適化EPO変異体または他の治療用ポリペプチドを含む薬剤組成物は、EPO変異体(修飾型)ポリペプチド、修飾型EPO融合タンパク質または暗号化する核酸分子を含み、1以上の生理学的に許容される運搬体または賦形剤とポリペプチドの選択される量を混合して通常の方法により製剤化可能である。運搬体または賦形剤の選択は、多数のパラメータによる専門的投与技術による。例えば、これは、治療の対象となる疾病及び投与モード(例えば、全身(例えば、静脈内または腹腔内)、経口、鼻腔、経肺、経皮、非経口、直腸、局所、外用またはその他のモード)を含む。EPOポリペプチド及び他の治療用ポリペプチドの組成物は、治療の対象となる疾病または状態に有用な1以上の治療剤などの付加成分を添加して製剤化することができる。前記提供された組成物に用いられる治療剤の組み合わせは、本願に他の個所に記載されている。
前記ポリペプチドは、組成物内一つの薬剤学的に活性を示す成分として製剤化可能である。前記ポリペプチドは、例えば、抗体などの標的化試薬に接合することにより伝達のために標的化可能である。また、組織標的化されたリポソームを含むリポソーム懸濁液は、薬剤学的に許容される担体として用いて好適である。これは、当業者に周知な方法により製造可能である。例えば、リポソーム製剤は、例えば、米国特許番号第6、645、522号または第6、726、924号に開示の方法により製造可能である。リポソーム運搬はまた、コラゲンゲルとフィブロネクチンにより修飾されたリポソーム(例えば、Weiner et. al., (1985) J Pharm Sci. 74(9):922-5)などの薬剤学的基材を含む徐放型製剤を含むことができる。
本願は、修飾型EPOポリペプチドまたは他の修飾型治療用ポリペプチドを暗号化した核酸分子及び遺伝子治療のために適したこれらが暗号化された発現ベクターの組成物を提供する。タンパク質を輸送するよりは、むしろ、核酸は、全身で、または他の経路により生体内において、または、リンパ球を含んで、細胞の摘出、その中への核酸の導入、そして宿主や適切な供与体への再導入によるなどの生体外において投与可能である。
A. 91(24): 11557-11561; Svensson et. al., (1997) Hum Gene Ther 8: 1797; Setoguchi et. al., (1994) Blood 84(9): 2946-2953、米国特許第6、613、319号)。他の例において、暗号化されたEPOポリペプチドまたは他の修飾型治療用ポリペプチドを暗号化するウィルス性または非ウィルス性ベクターは、順次的伝達のための分離された細胞内に形質導入可能である。EPO及び他の修飾型治療用ポリペプチドの発現及び伝達のための付加的な細胞種類は当業界に知られており、膵臓細胞、肺の上皮細胞及び中皮細胞を含むが、これらに限定されない(Fenjves et. al., (2004) Transplantation 77(1): 13-8; Davis et. al., (2004) Mol Ther. 10(3): 500-6)。
本願で提供される修飾型EPOポリペプチドと他の修飾型治療用ポリペプチド、及び核酸分子は、未修飾型EPOまたは未修飾型治療用ポリペプチドが用いられるいかなる条件の治療にも使用可能である。修飾型EPOポリペプチドと他の修飾型治療用ポリペプチドは、単独または他の薬剤と組み合わせられて治療効果を有する。本願で提供される修飾型ポリペプチドは治療効果を維持するために考案されたが、修飾された特性、特に、安定性が増強されることを示す。例えば、このような修飾された特性はポリペプチド治療効果を向上させたり、経口投与などの追加経路を介する投与を可能にする。本願で提供される修飾型EPOポリペプチドと他の修飾型ポリペプチド、及び暗号化された核酸分子は、未修飾型EPOまたは未修飾型治療用タンパク質が用いられるいかなる条件の治療にも使用可能である。このセクションでは、投与方法と典型的な使用法を提供する。ここで説明された治療法は例示であり、修飾型EPOポリペプチドまたは他の修飾型治療用ポリペプチドの適用に限定されない。
EPOと関連する貧血症などの疾病の治療に使用可能な精製されたEPO治療剤中には、Epogen(登録商標)、Procrit(登録商標)、Eprex(登録商標)、Erypo(登録商標)、Epopen(登録商標)、Epoxitin(登録商標)、Globuren(登録商標)、Epoade(登録商標)及びEspo(登録商標)などの製品を含むEpoietinα同種型、Recormon(登録商標)、Neorecormon(登録商標)、Epogin(登録商標)、Epoch(登録商標)、Eritrogen(登録商標)、Erantin(登録商標)及びMarogen(登録商標)などの製品を含むEpoietinβ同種型、Epomax(登録商標)及びHemax(登録商標)などのEpoietinω同種型、Dynepo(登録商標)などの製品を含むEpoietinδ同種型、Aranesp(登録商標)などの製品を含むDarbepoietinα同種型、R−744連続的なエリストポエイチン受容体活性成分(CERA)及び合成赤血球生成タンパク質(SEP)がある。これらの製品は、いずれも、本願において説明されたように修飾可能であり、及び/または、本願で提供される修飾型EPOポリペプチドに代替可能である。本願で提供される修飾型EPOポリペプチドと本願で提供される修飾型EPOポリペプチドを暗号化する核酸は、赤血球細胞の欠乏と関連する状態の治療を含む貧血症の治療に使用可能である。本願で提供される修飾型EPOポリペプチドは赤血球生成を促進し、赤血球再生などの例にも使用可能である。本願で提供される修飾型EPOポリペプチドにより治療可能な典型的な貧血症は、腎不全、後天性免疫欠乏症、悪性腫瘍、及び慢性的な炎症により引き起こされる貧血症を含む。本願で提供される修飾型EPOポリペプチドを用いた付加的な貧血症の例は、地中海貧血と鎌状赤血球障害などの異常血色素症、早熟性貧血、鉄貯蔵障害、シス型白金または放射能などの化学治療剤の処理により惹起される貧血症、再生不良性貧血、リバビリンなどのC型感染の治療のための治療用薬物による貧血症、悪性の疾病(例えば、固形癌、転移された乳癌、白血病、リンパ腫または多発性骨髄腫を含む血液癌のあらゆる類型)と連携された貧血症、過度な血液細胞破壊(溶血、溶血性貧血、赤血球死滅、過度な血液損失(赤血球破壊などの急性損失または低体積損失などの慢性的損失)、老化、慢性腎臓疾患(CDK)、肝炎、腎臓の衰弱、後天性免疫欠乏症患者におけるジドブジン治療療法(例えば、アジドチミジン(AZT)処置)、発作性夜間血色素尿症(PNH)、包嚢の繊維腫、糖尿病性腎臓疾患、敗血症、脳の低酸素症/虚血、リウマチ性疾患、骨髄異形成症候群、鬱血性心臓機能喪失(CHF)、ゴーシェ病、キャッスルマン病、及び骨髄移植と集中的な放射線療法及び/または化学療法による貧血症が含まれる(例えば、Little et. al., (2006) Haematologica 91(8): 1076-83; Eisenstaedt et. al., (2006) Blood Rev. 20(4): 213-26; Rodgers and Lessin (1989) Blood 73(8): 2228-9; Boogaerts et. al., (2005) Oncology. 69 Suppl 2: 22-30; Regnier et. al., (1989) ANNA J. (7): 512-3, Olsson et. al., (2002) Acta Oncol. 41(6): 517-24; Ritz and Haxsen (2005) Eur J Clin Invest. 35 Suppl 3: 66-74, Nurko (2006) Cleveland Clin. J. Med. 73(3): 289-297; Koltwasser et. al., (2001) J Rheumatol. 28(11): 2430-6; Kuehl and No ormohamed (1995) Ann Pharmacother. 29(7-8): 778-9; Singer et. al., (2005) Ann N Y Acad Sci. 1054: 250-6参照)。本願で提供される修飾型EPOポリペプチドは、狹心症、肺疾患、低血圧、鬱血性心臓機能喪失または一過性脳虚血発作と関連する貧血症治療にも使用可能である。本願で提供される修飾型EPOポリペプチドはまた、過度な血液損失の危険性がある非心臓または非血管手術などの手術前、手術中、または手術後に同じ手術を受けた患者の治療にも使用可能である。また、本願で提供される修飾型EPOポリペプチドは、鉄またはビタミン補助療法と共に、鉄欠乏貧血症と葉酸欠乏貧血症などの栄養分欠乏貧血症の治療にも使用可能である。
本願で提供される修飾型EPOポリペプチドと本願で提供される修飾型EPOポリペプチドを暗号化する核酸は、損傷に対する予防または反応性哺乳類細胞、組織、または器官に対する損傷による機能回復のための治療法に使用可能である。典型的な反応性哺乳類細胞は、ニューロン、脳、脊髄、網膜、筋肉、心臓、肺、肝、腎臓、小腸、副腎皮質、副腎髓質、毛細血管、内皮、精素、卵素、子宮内膜または幹細胞を含む。付加的な反応性哺乳類細胞の例は、光受容器、神経節、双極細胞、水平細胞、アマクリン、ミュラー、心筋、ペースメーカー、洞房結節、洞結節、房室結節、ヒス筋続、肝細胞、星細胞、クッパー、メサンギウム細胞、杯細胞、腸線、消化管、内分泌、 球状帯細胞、 束生細胞、網状帯細胞、親クロム、血管周囲細胞、ライディッヒ、セストリ、***、グラーフ濾胞、原始濾胞、子宮内膜基質、及び子宮内膜細胞がある。
本願で提供される修飾型EPOポリペプチドは、診断上の目的でも使用可能である。例えば、修飾型EPOポリペプチドは、必要に応じて、エリストポエチン受容体の存在を測定し、その量を測定するためにまたは赤血球生成を誘導する成分の活性を比較するために分析過程に使用可能である。例えば、向上された活性を有する修飾型EPOポリペプチドは、受容体への結合と関連する分析の敏感度を増加させ、分析時間を減少させる上で有用である。本願で提供される修飾型EPOポリペプチドはまた、エリスロポエチンタンパク質がその受容体への結合に対する新たな薬物の影響を決定するための試験管内結合分析に使用可能である。
本願において言及された任意の修飾型EPOポリペプチドと修飾型EPOポリペプチドを暗号化する核酸は、これらに限定されるものではないが、他の生物製剤、小分子型化合物及び手術を含む治療用薬物や施術前に、これと一緒に間欠的に、またはこれよりも後に複合的に投与可能である。前記例示された全ての疾患または状態、EPOが指示または使用されており、他の薬剤及び治療が利用可能な任意の疾患または状態の場合、EPOをこれと一緒に使用することができる。このため、本願で提供される修飾型ポリペプチドは同様に使用することができる。しかも、本願で提供される修飾型EPOポリペプチドは同様に使用可能である。治療する疾患または状態により、典型的な併用投与は、これらに限定されるものではないが、コロニー刺激因子、ヘモグロビン、化学治療用薬物(例えば、サイトカイン、成長因子、ホルモン、光感覚剤、放射性核種、毒素、代謝拮抗物質、信号調節子、抗癌性抗生剤、抗癌性抗体、抗癌性オリゴペプチド、新生血管生成阻害剤、放射能治療、化学的治療用化合物、またはその組み合わせ物)または鉄(例えば、タブロン、フェロゾル、色源体、ニフェレックス、硫酸鉄(II)またはフマル酸鉄(II)の組成物、デキストラン鉄)と併用可能である。
修飾型EPOポリペプチドと他の修飾型治療用ポリペプチド、または修飾型ポリペプチドを暗号化する核酸またはその誘導体、または生物学的な活性部分の薬剤学的化合物は、包装材料、EPO媒介の疾患または障害または治療用ポリペプチド関連疾病または障害を治療する薬剤組成物、修飾型EPOポリペプチドまたは核酸分子がEPO関連疾病または障害治療のために用いられるか、または、治療用ポリペプチド関連疾病または障害を治療するために用いられるということを指示するラベルを含む製品として包装可能である。
本願で提供される修飾型治療用ポリペプチドと他の修飾型EPOポリペプチドを認知する抗原が産生可能である。例えば、抗体は、単一クローン抗体、多クローン抗体、単一筋抗体、キメリック抗体、二重機能のまたは二重特有性質の抗体、ヒト化抗体、ヒト抗体、及び相補性決定領域(CDR)または抗原結合配列を含む化合物を含む相補性決定領域(complementary determining region(CDR))−移植抗体(CDR−grafted antibodies)を含む。前記抗体は、本願で提供される修飾型EPOポリペプチドまたは修飾型治療用ポリペプチドと特異的に結合する。また、本願は、Fab、Fab、Fab’、F(ab’).sub.2、及びFvを含む抗体断片を提供する。本願で提供される抗体の特異的または独店的な結合を決定する選別分析法は当業者に既に公知されている(Harlow et. al., (Eds), Antibodies A LaboratoryManual; Cold Spring Harbor Laboratory; Cold Spring Harbor, N.Y. (1988)参照)。
下記の実施例は単に例示的な目的で含まれ、本願で提供される態様の範囲を制限するためのものではない。
EPO突然変異体のクローニング及び産生
1.EPOを暗号化するcDNAクローニング及び哺乳動物発現ベクターへの挿入
ヒトエリスロポエチンを暗号化する配列を含む塩基配列を(配列番号229)当業者に標準技術として広く知られた重合酵素連鎖反応(PCR)を用いてResGen OR F Expression Positive Gollectionから得たGenestorm(登録商標) Human Clone ID RG001720(販売元; Invitrogen, Catalog #H-K1000)において増幅した。塩基配列は、哺乳動物発現プラスミドであるpcDNA3.1/GS(販売元;Invitrogen、配列番号230)に挿入した。このときに用いたプライマーは、下記の通りである。
EPOBamHI順方向プライマー:5’GGAATTCCATATGGGGGTGCACGAATGTCCTGCCTGG−3’(配列番号231)。
EPONdeI逆方向プライマー:5’GGGATCCTCATCTGTCCCCTGTCCTGCAGGCCTCCC−3’(配列番号232)。
pNAUT順方向プライマー:5’TATAAGCAGAGCTCTCTG−3’(配列番号234)
pNAUT逆方向プライマー:5’CACAGTCGAGGCTGATCAG−3’(配列番号235)
暗号化された成熟型EPOポリペプチドは、配列番号2と同じアミノ酸配列を有する。
予め考案された標的化された突然変異体の集団を生成させて、アドレス可能なアレイにおいて個々の突然変異体が生成され、個別的にプロセッシングされ、互いに物理的に分離されるようにした。本願明細書に記述され、且つ、米国出願公開第2004−0132977−A1号及び米国出願公開第2005−0202438A1号に記述された2Dスキャニング技術を用いて、タンパク質分解に対して増強された抵抗性を有するEPO突然変異体を考案して得た。(1)進化するタンパク質特性(例えば、タンパク質分解に対する抵抗性または安定性)、(2)アミノ酸配列、及び(3)個々のアミノ酸の特性によりis−HITが同定された。
2Dスキャニングを用いてタンパク質分解に対する抵抗性を付与する位置を同定するために変異体が考案された。hEPO(配列番号2)上において選択された位置(is−HIT)は、次の通りである(番号付けは、シグナル配列を除く配列番号2の成熟hEPOポリペプチドのアミノ酸位置に対応する):P2、P3、R4、L5、D8、R10、L12、E13、R14、Y15、L16、L17、E18、K20、E21、E23、E31、L35、E37、P42、D43、K45、F48、Y49、W51、K52、R53、M54、E55、E62、W64、L67、L69、L70、E72、L75、R76、L80、L81、P87、W88、E89、P90、L91、L93、D96、K97、L102、R103、L105、L108、L109、R110、L112、K116、E117、P121、P122、D123、P129、L130、R131、D136、F138、R139、K140、L141、F142、R143、Y145、F148、L149、R150、K152、L153、K154、L155、Y156、E159、R162、D165、R166。
哺乳動物細胞における天然型及び修飾型ヒトEPOポリペプチド(タンパク質)の産生及び数率決定
中国ハムスター卵巣(CHO)細胞を10%胎仔子牛血清(FCS)入り Dulbecco(登録商標) Modified Eagle(登録商標) 培地(DMEM、販売元: Invitrogen)において成長させた。
TF−1増殖検出法によるヒトEPOの不活性決定
それぞれのキネチックポイント試料における残余増殖活性(EC50)を決定するために、ヒト赤白血病TF−1細胞株生分析に際し、タンパク質分解酵素分解キネチックスの異なる時間帯に得られたそれぞれの分注試料に対して増殖分析を行った。TF−1細胞株をT175(175cm2)ポリスチレン組織培養フラスコにおいて、37℃、7%CO2/95%空気組成を含む湿潤な大気下において、10%FCS、2mML−グルタミン、及び2ng/mlヒト組換えGM−CSF入りRPMI1640培地(製造社:Invitrogen)に維持し、1週間に2回ずつ継代培養した。増殖検定24時間前に、細胞は冷たいPBSにより2回洗浄し、GM−CSFなし2mMグルタミンと10%FCS入りRPMI培地において16時間再懸濁した。
タンパク質分解抵抗性
EPO変異体のタンパク質分解酵素抵抗性を評価した。天然型EPO対比EPO突然変異体の保護効果を評価するために、37℃において、異なる時間帯に酵素分解を行った。天然型EPOとそれぞれのEPO突然変異体に対して、α−キモトリプシン、エンドプロテイナーゼ−GluC及びトリプシン(製造社:Sigma)をそれぞれ含む1.5%タンパク質分解酵素混合液(wt/wt)を無血清RPMI培地400μlに混合することにより、タンパク質分解酵素混合溶液を準備した。キネチック分析のために1%FCS入りDMEM培地(CHOK1培養培地)300μlに入っているそれぞれのEPO突然変異体または天然型タンパク質557.2ngにタンパク質分解酵素混合溶液を添加することにより、タンパク質分解酵素による分解を開始した。培養時間は、次の通りである:0h、0.5h、1h、2、3h、4h、5h、6h、及び7h。異なるキネチック時点においてそれぞれの試料に対して70μlの分画を取り、タンパク質分解酵素反応を中断させるために抗タンパク質分解酵素混合液(mini EDTA free、製造社:Roche−1つの錠剤を10%FCS入り10mLのRPMI培地において溶解した)10μlずつ添加した。試料は、残留している増殖活性の測定前まで−80(登録商標)に保管した。
糖化により隠されたタンパク質分解可能な位置の同定
天然型EPOにおいて糖化により隠蔽可能なタンパク質分解に敏感な位置を決定するために、N24H(配列番号244)、N38H(配列番号245)またはN83H(配列番号246)アミノ酸置換を含むEPO変異体をそれぞれ産生してタンパク質分解に対する抵抗性を実験した。各脱糖化型変異体は、CHO細胞において発現された。簡略に説明すれば、形質感染の一日前にCHO細胞を10%FCS入りDMEM培地(INtrogen,CA)において5x105細胞/ウェル濃度にて6−ウェルプレートにおいて接種した後、37℃の湿潤な大気下において培養した。
タンパク質分解に増強された抵抗性を有する脱糖化型EPO変異体の産生
タンパク質分解に対して増強された抵抗性を有する脱糖化型EPO変異体を産生するために選択される一つまたはそれ以上のis−HIT位置において、糖化が減少されたEPOポリペプチドを修飾した。下記のセクション1−3において説明したように、3つの初期過程は部分脱糖化型EPO突然変異体に対する保護効果を有する突然変異を究明するために用いられた。EPOポリペプチドは、N38及びN83のどちらか一方の一連の突然変異により増進的に脱糖化された。各脱糖化段階において、タンパク質分解に対する敏感な位置を除去するために選択されるis−HIT位置において突然変異をポリペプチドに導入し、いかなる突然変異がN38及びN83位置において脱糖化型変異体を保護することができるかを決定した。このような突然変異体は、実施例1〜4においてタンパク質分解に対する保護的効果を有すると同定されたLEADにより保有されるR139H、K20Q、E159N、L153V、K52N、L80I、L93I、L93V、及びR4Hアミノ酸置換を含む。EPO変異体はタンパク質分解酵素抵抗性を評価し、タンパク質分解酵素抵抗性が増強された変異体は新たな突然変異を導入するための鋳型として用いられた。下記のセクション4において説明されたように、この過程の最後の段階は、最後のN糖化部位、N−24の突然変異を含み、このような突然変異の導入がタンパク質分解に対する保護作用を有するN糖化なしEPO変異体を保護するということを示す。
最初の実験過程により、N38H突然変異体に起因する部分脱糖化型タンパク質分解酵素に対して抵抗性を有するEPOポリペプチドを究明した。N38H突然変異体を含む部分脱糖化型EPOポリペプチドから確認されたタンパク質分解敏感性を回復させるために、実施例2〜4において同定された選択されたLEAD突然変異をN38H変異体ポリペプチドに順次に挿入し、タンパク質分解に対する抵抗性を実験した。完全糖化型または非糖化型(例えば、完全脱糖化型)EPOポリペプチドに対しても実験を行った
第2の実験段階は、N38とN83の両方の突然変異に起因する部分脱糖化型タンパク質分解酵素抵抗性EPOポリペプチドを究明した。R139H突然変異をN38H/N83H2重突然変異EPO変異体内に挿入した。これにより得られたN38H/N83H/R139H変異体(配列番号254)が4重突然変異K20Q/N38H/N83H/R139H(配列番号255)を生成するためにK20Qなどの付加的な突然変異が導入される鋳型として用いられた。EPO変異体はCHO細胞において発現されて、上記したようにタンパク質分解抵抗性を分析した。単一N38H突然変異または2重N38H/R139H突然変異、完全糖化型EPOポリペプチド、及び部分脱糖化型EPOポリペプチドを含むEPO変異体に対するタンパク質分解酵素抵抗性を分析した。N38H/R139H変異体と完全糖化型EPOタンパク質がタンパク質分解1時間後にそれぞれ45%と49%残っていたのに対し、N38H/N83H/R139H変異体は僅か17%が前者と比較したときにタンパク質分解抵抗性が減少したことを示す。これは、N83位における糖化がEPOポリペプチドにタンパク質分解に対する保護効果をいかに大きく付与するかを示す。しかしながら、この保護効果は、K20Q突然変異挿入により回復された。K20Q/N38H/N83H/R139H4重突然変異体は、N38H/R139H変異体と完全糖化型EPOタンパク質から観察される程度のタンパク質分解抵抗性を示す。タンパク質分解1時間後に、K20Q/N38H/N83H/R139H変異体の48%が残っていた。タンパク質分解2時間後には21%が残り、これは、N38H/R139H変異体(16%)よりも僅かに高く、かつ、完全糖化型EPOタンパク質(25%)よりは僅かに低かった。
第3の実験過程は、タンパク質分解抵抗性を増強させるためのこれらの突然変異体の能力を評価するために、N38H/N83H/R139H変異体を鋳型として用いて付加的な突然変異を挿入した。N38H/N83H/R139HとL93V(配列番号256)、L80I(配列番号257)またはL93I(配列番号258)をそれぞれ含むEPO変異体を製作し、CHO細胞において発現させた。変異体のタンパク質分解酵素に対する抵抗性を分析し、このとき、N38H/N83H/R139H変異体、完全糖化型EPOポリペプチド及び部分脱糖化型EPOポリペプチドも分析した。N38H/N83H/R139HにL93V、L80I、L93I突然変異のいかなるものを挿入しても、N38H/N83H/R139H突然変異体と比べてタンパク質分解酵素に対する抵抗性が増強された。タンパク質分解1時間後にN38H/N83H/R139Hの26%が残っており、完全糖化型天然型EPOは46%残っていた。これと比較すれば、N38H/N83H/R139H/L93I、N38H/N83H/R139H/L80I及びN38H/N83H/R139H/L93V変異体はそれぞれ30%、37%、45%がタンパク質分解酵素との1時間反応後にも残っていた。タンパク質分解2時間後の完全糖化型タンパク質は14%が残り、且つ、N38H/N83H/R139H変異体は4%残っていたのに対し、N38H/N83H/R139H/L80I及びN38H/N83H/R139H/L93Vは8%、N38H/N83H/R139H/L93I変異体は3%残っていた。
K20Q/N38H/L80I/N83H/R139H(配列番号259)、
K20Q/N38H/N83H/L93I/R139H(配列番号260)、
及びK20Q/N38H/N83H/L93V/R139H(配列番号261)。
上記の1−3に示す3過程を通じて部分脱糖化型EPOポリペプチドに顕著なタンパク質分解酵素抵抗性を付与する突然変異体を確認した。特に、K20is−HIT位置はタンパク質分解に重要な位置であることが示され、この位置の適切な突然変異はN38及び/またはN83位の突然変異を含む部分脱糖化型EPOポリペプチドに増強されたタンパク質分解酵素抵抗性を付与することができるということを示唆する。他のN糖化部位、すなわち、N24に近い接近性のために、K20H突然変異は24位置における脱糖化に対する保護効果を示すかもしれない。脱糖化型EPOポリペプチドのタンパク質分解酵素抵抗性の付与に関与するK20H突然変異と他のLEAD突然変異の能力を評価するために、各N糖化部位を突然変異させた一連の変異体を製造した。
N24H/N38H/N83H/R139H/L80I(配列番号262)、
N24H/N38H/N83H/R139H/L93I(配列番号263)、
または、N24H/N38H/N83H/R139H/L93V(配列番号264)。
K20Q/N24H/N38H/N83H/R139H/L80I(配列番号265)、
K20Q/N24H/N38H/N83H/R139H/L93I(配列番号266)、または
K20Q/N24H/N38H/N83H/R139H/L93V(配列番号267)。
R4H/K20Q/N24H/N38H/N83H/R139H/L80I(配列番号268)、
E159N/K20Q/N24H/N38H/N83H/R139H/L93I(配列番号269)、
K20Q/N24H/N38H/N83H/R139H/L153V(配列番号270)、
L153V/K20Q/N24H/N38H/N83H/R139H/L80I(配列番号271)及び、
E159N/K20Q/N24H/N38H/N83H/R139H/L80I(配列番号272)。
Claims (196)
- 薬剤学的に許容可能なビヒクル内に修飾型治療用ポリペプチドまたはそのポリペプチドの活性断片を含む薬剤組成物であって、
未修飾型治療用ポリペプチドは少なくとも一つの糖化部位を含み、前記糖化は未修飾型治療用ポリペプチドの治療活性に必要であり、
修飾型治療用ポリペプチドは:
(i)未修飾型治療用ポリペプチドと比べて1以上のアミノ酸置換、挿入及び/または欠失を含み、
(ii)1以上のアミノ酸置換、挿入及び/または欠失により、未修飾型治療用ポリペプチドと比べて、タンパク質分解に対する増強された抵抗性を示し、
(iii)糖化されず、且つ、治療活性を示し、
(iv)前記ポリペプチドが活性断片である場合、前記活性断片がタンパク質分解に対する抵抗性を増強させる修飾を含む、薬剤組成物。 - 薬剤学的に許容可能なビヒクル内に修飾型治療用ポリペプチドまたはそのポリペプチドの活性断片を含む薬剤組成物であって、
未修飾型治療用ポリペプチドは少なくとも一つの糖化部位を含み、
修飾型治療用ポリペプチドは:
(i)未修飾型治療用ポリペプチドと比べて1以上のアミノ酸置換、挿入及び/または欠失を含み、
(ii)前記1以上のアミノ酸置換、挿入及び/または欠失により、未修飾型治療用ポリペプチドと比べて、タンパク質分解に対する増強された抵抗性を示し、
(iii)糖化されず、且つ、インターフェロン-αではなく、
(iv)前記ポリペプチドが活性断片である場合、前記活性断片がタンパク質分解に対する抵抗性を増強させる修飾を含む、薬剤組成物。 - 前記修飾型治療用ポリペプチドまたはその断片が非天然糖化部位を導入する修飾をさらに含む、請求項1または請求項2に記載の薬剤組成物。
- 前記修飾型治療用ポリペプチドが全ての糖化部位を除去する1以上の修飾を含む、請求項1または請求項2に記載の薬剤組成物。
- 前記修飾型治療用ポリペプチドが原核性宿主において産生されて糖化されないものである、請求項1または請求項2に記載の薬剤組成物。
- 前記原核性宿主が大腸菌である、請求項5に記載の薬剤組成物。
- 前記修飾型治療用ポリペプチドがサイトカインである、請求項1から請求項6のいずれかに記載の薬剤組成物。
- 前記治療用ポリペプチドが、エリスロポエチン(EPO)、インターロイキン−1β(IL−1)、インターロイキン−2(IL−2)、インターロイキン−3(IL−3)、インターロイキン−4(IL−4)、インターロイキン−5IL−5)、インターロイキン−6(IL−6)、インターロイキン−9(IL−9)、インターフェロン−β(IFN−β)、インターフェロン−γ(IFN−γ)、顆粒球コロニー刺激因子(G−CSF)、顆粒球・大食細胞コロニー刺激因子(GM−CSF)、大食細胞・コロニー刺激因子(M−CSF)、トロンボポエチン(TPO)、白血病抑制因子(LIF)、幹細胞因子(SCF)、オンコスタチンM(OSM)及び血管内皮成長因子(VEGF)からなる群より選択される、請求項1から請求項7のいずれかに記載の薬剤組成物。
- 前記修飾型治療用ポリペプチドが治療用ポリペプチドの前駆体の形態である、請求項1から請求項8のいずれかに記載の薬剤組成物。
- 前記修飾型治療用ポリペプチドが治療用ポリペプチドの成熟形態である、請求項1から請求項8のいずれかに記載の薬剤組成物。
- 前記修飾型治療用ポリペプチドがエリスロポエチン(EPO)ポリペプチドである、請求項1から請求項10のいずれかに記載の薬剤組成物。
- 前記治療用ポリペプチドはEPOであり、未修飾型ポリペプチドの成熟形態は、配列番号2または237に示されるアミノ酸配列を有するか、あるいは、配列番号2または237に示される配列を有するポリペプチドと少なくとも、または、少なくとも約60%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%、若しくはそれ以上の配列同一性を有する対立遺伝子型、種間変異体、または他の変異体である、請求項11に記載の薬剤組成物。
- 未修飾型EPOポリペプチドが配列番号227、228、309及び310のいずれかに示されるアミノ酸配列、その対立遺伝子型または種間変異体を含む、請求項12に記載の薬剤組成物。
- 1以上のアミノ酸置換が、P2S、P2A、P3S、P3A、R4H、R4Q、L5I、L5V、C7S、C7V、C7A、C7I、C7T、D8Q、D8H、D8N、R10H、R10Q、L12V、L12I、E13Q、E13H、E13N、R14H、R14Q、Y15H、Y15I、L16I、L16V、L17I、L17V、E18Q、E18H、E18N、E21Q、E21H、E21N、E23Q、E23H、E23N、C29S、C29V、C29A、C29I、C29T、E31Q、E31H、E31N、L35V、L35I、E37Q、E37H、E37N、K20Q、K20T、K20N、P42S、P42A、D43Q、D43H、D43N、K45Q、K45T、K45N、F48I、F48V、Y49H、Y49I、W51S、W51H、K52Q、K52T、K52N、R53H、R53Q、M54V、M54I、E55Q、E55H、E55N、E62Q、E62H、E62N、W64S、W64H、L67I、L67V、L69V、L69I、L70I、L70V、E72Q、E72H、E72N、L75V、L75I、R76H、R76Q、L80V、L80I、L81I、L81V、P87S、P87A、W88S、W88H、E89Q、E89H、E89N、P90S、P90A、L91I、L91V、L93V、L93I、D96Q、D96H、D96N、K97Q、K97T、K97N、L102V、L102I、R103H、R103Q、L105I、L105V、L108I、L108V、L109I、L109V、R110H、R110Q、L112V、L112I、K116Q、K116T、K116N、E117Q、E117H、E117N、P121S、P121A、P122S、P122A、D123Q、D123H、D123N、P129S、P129A、L130V、L130I、R131H、R131Q、D136Q、D136H、D136N、F138I、F138V、R139H、R139Q、K140N、K140Q、L141I、L141V、F142I、F142V、R143H、R143Q、Y145H、Y145I、F148I、F148V、L149I、L149V、R150H、R150Q、K152Q、K152T、K152N、L153I、L153V、K154Q、K154T、K154N、L155V、L155I、Y156H、Y156I、E159Q、E159H、E159N、R162H、R162Q、D165Q、D165H、D165N、R166H及びR166Qからなる群より選択されるいずれかに対応する、請求項11から請求項13のいずれかに記載の薬剤組成物。
- 前記修飾型治療用ポリペプチドが、糖化を除去するために、1以上のN24、N38及びN83糖化部位におけるアミノ酸修飾をさらに含む、請求項14に記載の薬剤組成物。
- 前記修飾がN24H、N38H及びN83Hからなる群より選択されるアミノ酸置換である、請求項15に記載の薬剤組成物。
- 前記修飾がN24K、N38K及びN83Kからなる群より選択されるアミノ酸置換である、請求項15に記載の薬剤組成物。
- 前記未修飾型EPOポリペプチドが160、161、162、163、164、165または166個のアミノ酸長を有する、請求項11から請求項17のいずれかに記載の薬剤組成物。
- 前記未修飾型EPOポリペプチドが配列番号2または237に示されるアミノ酸配列を含む、請求項11から請求項18のいずれかに記載の薬剤組成物。
- 前記修飾型治療用ポリペプチドが、修飾型治療用ポリペプチドと同じ条件下において未修飾型治療用ポリペプチドの1以上の活性を維持する、請求項1から請求項19のいずれかに記載の薬剤組成物。
- 前記修飾型治療用ポリペプチドが完全糖化型未修飾型治療用ポリペプチドの1以上の活性を維持する、請求項1から請求項20のいずれかに記載の薬剤組成物。
- 前記治療用ポリペプチドの1以上の活性が未修飾型治療用ポリペプチドと比べて増強された、請求項1から請求項21のいずれかに記載の薬剤組成物。
- 治療用ポリペプチドの1以上の活性が未修飾型治療用ポリペプチドと比べて減少された、請求項1から請求項21のいずれかに記載の薬剤組成物。
- 治療用ポリペプチドの活性部分または断片を含み、前記活性部分または断片は未修飾型治療用ポリペプチドの1以上の活性を維持し、未修飾型治療用ポリペプチドと比べて1以上のアミノ酸置換を含む、請求項20から請求項23のいずれかに記載の薬剤組成物。
- 修飾型治療用ポリペプチドがEPOポリペプチドであり、その活性が赤血球増殖、細胞生存促進及び組織損傷抑制からなる群より選択される、請求項1から請求項24のいずれかに記載の薬剤組成物。
- 修飾型治療用ポリペプチドが2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、または20個のアミノ酸修飾を含む、請求項1から請求項25のいずれかに記載の薬剤組成物。
- 修飾型治療用ポリペプチドが、血清、血液、唾液、消化液または試験管内の1以上のタンパク質分解酵素によるタンパク質分解に対して増強された抵抗性を示す、請求項1から請求項26のいずれかに記載の薬剤組成物。
- 1以上のタンパク質分解酵素が、ペプシン、トリプシン、キモトリプシン、エラスターゼ、アミノペプチダーゼ、ゼラチナーゼB、ゼラチナーゼA、α−キモトリプシン、カルボキシペプチダーゼ、エンドプロテイナーゼArg−C、エンドプロテイナーゼAsp−N、エンドプロテイナーゼGlu−C、エンドプロテイナーゼLys−C、及びトリプシン、内腔ペプシン、微絨毛エンドペプチダーゼ、ジペプチジルペプチダーゼ、エンテロペプチダーゼ、ヒドロラーゼ、NS3、血液凝固因子Xa、グランザイムB、トロンビン、トリプシン、プラスミン、ウロキナーゼ、tPA及びPSAからなる群より選択される、請求項1から請求項27のいずれかに記載の薬剤組成物
- 増強されたタンパク質分解酵素の抵抗性が、前記修飾型治療用ポリペプチドが経口投与されたとき、または、消化管内に存在するときに現れる、請求項1から請求項28のいずれかに記載の薬剤組成物。
- 前記修飾型治療用ポリペプチドが裸出型ポリペプチド鎖である、請求項1から請求項29のいずれかに記載の薬剤組成物。
- 前記修飾型治療用ポリペプチドがさらに修飾され、且つ、前記修飾は、カルボキシル化、水酸化、ハシル化、カルバミル化、硫化、リン酸化、アルブミン化、酸化またはポリエチレングリコール(PEG)残基への接合のいずれか1種以上である、請求項1から請求項30のいずれかに記載の薬剤組成物。
- 前記修飾型治療用ポリペプチドが、変化した免疫原性、糖化、カルボキシル化、水酸化、ハシル化、カルバミル化、硫化、リン酸化、アルブミン化、酸化、PEG化、または、変化した治療用ポリペプチドのタンパク質分解酵素抵抗性に寄与する1以上の付加的なアミノ酸修飾を含む、請求項1から請求項31のいずれかに記載の薬剤組成物。
- 未修飾型EPOポリペプチド、その対立遺伝子型、種間変異体、または活性断片における修飾を含む修飾型エリスロポエチン(EPO)ポリペプチドまたはその活性断片であって、
前記修飾は、配列番号2または237に示されるアミノ酸配列を有する成熟型EPOポリペプチド、配列番号2または237に示される配列を有するポリペプチドと少なくとも、または、少なくとも約60%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%、若しくはそれ以上の配列同一性を有するその対立遺伝子型、種間変異体、または他の変異体における、K20Q及び/またはR139Hのアミノ酸置換に対応し、
前記活性断片が前記修飾を含む、修飾型EPOポリペプチドまたはその活性断片。 - K20QまたはR139Hが唯一の修飾である、請求項33に記載の修飾型EPOポリペプチド。
- アミノ酸置換、欠失及び/または挿入からなる群より選択される1以上のアミノ酸位置において1以上のさらなる修飾を含む、請求項33に記載の修飾型EPOポリペプチド。
- 1以上のさらなる修飾が、2、3、4、5、7、8、10、12、13、14、15、16、17、18、20、21、23、29、31、35、37、42、43、45、48、49、51、52、53、54、62、64、67、69、70、72、75、76、80、81、87、88、89、90、91、93、96、97、102、103、105、108、109、110、112、116、117、121、122、123、129、130、131、136、138、139、140、141、142、143、145、148、149、150、152、153、154、155、156、159、162、165、及び166からなる群より選択されるアミノ酸位置にあり、前記アミノ酸位置は、配列番号2または237に示される配列を有する成熟型ヒトEPOポリペプチドにおいて位置を参照したものである、請求項35に記載の修飾型EPOポリペプチド。
- 1以上のさらなる修飾は、P2S、P2A、P3S、P3A、R4H、R4Q、L5I、L5V、C7S、C7V、C7A、C7I、C7T、D8Q、D8H、D8N、R10H、R10Q、L12V、L12I、E13Q、E13H、E13N、R14H、R14Q、Y15H、Y15I、L16I、L16V、L17I、L17V、E18Q、E18H、E18N、K20Q、K20T、K20N、E21Q、E21H、E21N、E23Q、E23H、E23N、C29S、C29V、C29A、C29I、C29T、E31Q、E31H、E31N、L35V、L35I、E37Q、E37H、E37N、P42S、P42A、D43Q、D43H、D43N、K45Q、K45T、K45N、F48I、F48V、Y49H、Y49I、W51S、W51H、K52Q、K52T、K52N、R53H、R53Q、M54V、M54I、E55Q、E55H、E55N、E62Q、E62H、E62N、W64S、W64H、L67I、L67V、L69V、L69I、L70I、L70V、E72Q、E72H、E72N、L75V、L75I、R76H、R76Q、L80V、L80I、L81I、L81V、P87S、P87A、W88S、W88H、E89Q、E89H、E89N、P90S、P90A、L91I、L91V、L93V、L93I、D96Q、D96H、D96N、K97Q、K97T、K97N、L102V、L102I、R103H、R103Q、L105I、L105V、L108I、L108V、L109I、L109V、R110H、R110Q、L112V、L112I、K116Q、K116T、K116N、E117Q、E117H、E117N、P121S、P121A、P122S、P122A、D123Q、D123H、D123N、P129S、P129A、L130V、L130I、R131H、R131Q、D136Q、D136H、D136N、F138I、F138V、R139H、R139Q、K140N、K140Q、L141I、L141V、F142I、F142V、R143H、R143Q、Y145H、Y145I、F148I、F148V、L149I、L149V、R150H、R150Q、K152Q、K152T、K152N、L153I、L153V、K154Q、K154T、K154N、L155V、L155I、Y156H、Y156I、E159Q、E159H、E159N、R162H、R162Q、D165Q、D165H、D165N、R166H、及びR166Qのいずれか1以上からなる群より選択される1以上のアミノ酸置換である、請求項35または請求項36に記載の修飾型EPOポリペプチド。
- 前記修飾型EPOにおけるアミノ酸置換が、R139H/R4H、R139H/L93I、R139H/K20Q、R139H/E159N、R139H/K52N、R139H/L153V、R139H/L93V、R139H/L80I、R139H/L93I、K20Q/L80I/R139H、K20Q/L93I/R139H、K20Q/L93V/R139H、R4H/K20Q/R139H/L80I、E159N/K20Q/R139H/L93I、K20Q/R139H/L153V、L153V/K20Q/R139H/L80I及びE159N/K20Q/R139H/L80Iからなる群より選択される、請求項35から請求項37のいずれかに記載の修飾型EPOポリペプチド。
- 糖化された、請求項33から請求項38のいずれかに記載の修飾型EPOポリペプチド。
- 1以上の天然糖化部位において脱糖化された、請求項33から請求項38のいずれかに記載の修飾型EPOポリペプチド。
- 原核性宿主において産生されてポリペプチドが糖化されない、請求項33から請求項40のいずれかに記載の修飾型EPOポリペプチド。
- 原核性宿主が大腸菌である、請求項41に記載の修飾型EPOポリペプチド。
- 一つから全てまでの糖化部位を除去する1以上の修飾を含む、請求項33から請求項42のいずれかに記載の修飾型EPOポリペプチド。
- 前記糖化部位がO糖化部位である、請求項43に記載の修飾型EPOポリペプチド。
- 前記糖化部位がS126である、請求項44に記載の修飾型EPOポリペプチド。
- 前記糖化部位がN糖化部位である、請求項43に記載の修飾型EPOポリペプチド。
- 前記糖化部位がN24、N38及びN83からなる群より選択される、請求項46に記載の修飾型EPOポリペプチド。
- 前記修飾がN24H、N38H及びN83Hからなる群より選択される1以上のアミノ酸置換である、請求項47に記載の修飾型EPOポリペプチド。
- 前記修飾がN24K、N38K及びN83Kからなる群より選択される1以上のアミノ酸置換である、請求項47に記載の修飾型EPOポリペプチド。
- 前記アミノ酸置換がN38Hである、請求項48に記載の修飾型EPOポリペプチド。
- 前記修飾型EPOポリペプチドが、N38H/R139H、N38H/R139H/R4H、N38H/R139H/L93I、N38H/R139H/K20Q、N38H/R139H/E159N、N38H/R139H/K52N、N38H/R139H/L153V及びN38H/N83H/R139Hからなる群より選択される、請求項50に記載の修飾型EPOポリペプチド。
- 前記アミノ酸置換がN38H及びN83Hである、請求項48に記載の修飾型EPOポリペプチド。
- 前記修飾型EPOポリペプチドが、K20Q/N38H/N83H/R139H、N38H/N83H/R139H/L93V、N38H/N83H/R139H/L80I、N38H/N83H/R139H/L93I、K20Q/N38H/L80I/N83H/R139H、K20Q/N38H/N83H/L93I/R139H、及びK20Q/N38H/N83H/L93V/R139Hからなる群より選択される、請求項52に記載の修飾型EPOポリペプチド
- アミノ酸置換がN24H、N38H及びN83Hである、請求項48に記載の修飾型EPOポリペプチド。
- 修飾型EPOポリペプチドが、N24H/N38H/N83H/R139H/L80I、N24H/N38H/N83H/R139H/L93I、N24H/N38H/N83H/R139H/L93V、K20Q/N24H/N38H/N83H/R139H/L80I、K20Q/N24H/N38H/N83H/R139H/L93I、K20Q/N24H/N38H/N83H/R139H/L93V、R4H/K20Q/N24H/N38H/N83H/R139H/L80I、E159N/K20Q/N24H/N38H/N83H/R139H/L93I、K20Q/N24H/N38H/N83H/R139H/L153V、L153V/K20Q/N24H/N38H/N83H/R139H/L80I及びE159N/K20Q/N24H/N38H/N83H/R139H/L80Iからなる群より選択される、請求項54に記載の修飾型EPOポリペプチド。
- A30N、H32T、P87V、W88N、及びP90Tからなる群より選択される1以上の付加的なアミノ酸修飾を含む、請求項33から請求項55のいずれかに記載の修飾型EPOポリペプチド。
- 未修飾型EPOポリペプチドにおいて1以上の修飾を含む修飾型エリスロポエチン(EPO)ポリペプチドまたはその活性断片であって、
前記1以上の修飾は、配列番号2または237に示されるアミノ酸配列を有する成熟型EPOポリペプチドにおける、または、配列番号2または237に示される配列を有するポリペプチドと少なくとも、または、少なくとも約60%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%、若しくはそれ以上の配列同一性を有するその対立遺伝子型、種間変異体、または他の変異体における、P2S、P2A、P3S、P3A、R4H、R4Q、L5I、L5V、C7V、C7I、C7T、D8Q、D8H、D8N、R10H、R10Q、L12V、L12I、E13H、E13N、R14H、Y15H、L16I、L16V、L17I、L17V、E18Q、E18H、E18N、K20Q、K20T、K20N、E21Q、E21H、E21N、E23Q、E23H、E23N、C29I、C29T、E31Q、E31H、E31N、L35V、L35I、E37Q、E37H、E37N、P42S、D43H、K45T、W51H、K52T、E62Q、E62H、E62N、W64S、W64H、L67I、L67V、L69V、L69I、L70I、L70V、L80V、L80I、L81I、L81V、P87A、W88S、W88H、E89Q、E89H、E89N、P90S、L91I、L91V、L93V、L93I、D96Q、D96H、D96N、K97Q、K97T、K97N、L102V、L102I、L105I、L105V、L108I、L108V、L109I、L109V、R110H、R110Q、L112V、L112I、K116Q、K116T、K116N、E117Q、E117H、E117N、D123H、D136Q、D136H、D136N、R139H、R139Q、K140N、K140Q、L141I、L141V、R143H、R143Q、Y145H、F148I、L149I、L149V、R150H、K152Q、K152T、K152N、L153I、L153V、K154Q、K154N、L155V、L155I、Y156H、E159Q、E159H、E159N、D165H、R166H、及びR166Qからなる群より選択されるアミノ酸置換に対応するものである、修飾型EPOポリペプチドまたはその活性断片。 - 1以上のアミノ酸修飾が、P2S、P2A、P3S、P3A、R4H、R4Q、L5I、L5V、C7V、C7I、C7T、D8Q、D8H、D8N、R10H、R10Q、E13H、E13N、L16I、L16V、E18Q、E18H、E18N、K20Q、K20N、E21Q、E21H、E21N、E23Q、E23H、E23N、E31Q、E31H、E31N、L35V、L35I、E37Q、E37H、E37N、P42S、D43H、K45T、K52T、E62Q、E62H、E62N、L69V、L70V、L80V、L81I、L81V、P87A、E89Q、E89H、E89N、P90S、L91I、L93V、L93I、D96Q、D96N、K97Q、K97T、K97N、L102V、L108I、L108V、K116Q、K116T、K116N、E117Q、E117N、D123H、D136Q、D136H、D136N、K140N、K140Q、F148I、E159Q、E159H、E159N、D165H、R166H、及びR166Qからなる群より選択される、請求項57に記載の修飾型EPOポリペプチド。
- 1以上のアミノ酸修飾が、P3A、R4H、R4Q、R10H、L16I、L16V、L17I、L17V、E18Q、K20Q、E21Q、E31Q、E37Q、K45T、K52T、L69I、L80I、P87A、E89Q、E89H、E89N、P90S、L93V、L93I、D96Q、D96H、D96N、L105I、R110Q、K116Q、K116T、K116N、D123H、D136N、R139H、R139Q、R143H、R143Q、R150H、L153V、E159N、D165H、R166H、及びR166Qからなる群より選択される、請求項57または請求項58に記載の修飾型EPOポリペプチド。
- 1以上のアミノ酸修飾が、P3A、L16I、L16V、L17I、K20Q、K45T、L80I、E89Q、E89H、P90S、L93I、D96Q、K116T、K116N、D136N、R139H、R139Q、R143H、R143Q、R150H、L153V、E159N、D165H、及びR166Hからなる群より選択される、請求項59に記載の修飾型EPOポリペプチド。
- 1以上のアミノ酸修飾が、P3A、K20Q、L93I、D96Q、R139H、R139Q、R143Q、R150H、及びE159Nからなる群より選択される、請求項60に記載の修飾型EPOポリペプチド。
- 1以上のアミノ酸修飾が、R4H、L16I、L16V、K20Q、L80I、P90S、L93I、D96Q、K116T、K116N、R139Q、D136N、R139H、R143Q、R143H、R150H、L153V、E159N、D165H、及びR166Hからなる群より選択される、請求項57または請求項58に記載の修飾型EPOポリペプチド
- 1以上のアミノ酸修飾が、R4H、K20Q、L93I、D96Q、R139Q、R139H、R143Q、R150H、L153V及びE159Nからなる群より選択される、請求項62に記載の修飾型EPOポリペプチド。
- 他のアミノ酸位置において1以上の付加的なアミノ酸修飾を含む、請求項57から請求項63のいずれかに記載の修飾型EPOポリペプチド。
- 1以上の付加的なアミノ酸修飾が、2、3、4、5、7、8、10、12、13、14、15、16、17、18、20、21、23、29、31、35、37、42、43、45、51、52、54、62、64、67、69、70、80、81、87、88、89、90、91、93、96、97、102、103、105、108、109、110、112、116、117、123、136、138、139、140、141、142、143、145、148、149、150、152、153、154、155、156、159、165、及び166からなる群より選択されるアミノ酸位置における修飾に対応し、前記アミノ酸位置は、配列番号2または237に示される配列を有する成熟型ヒトEPOポリペプチドにおいて位置を参照したものである、請求項64に記載の修飾型EPOポリペプチド。
- 1以上の付加的なアミノ酸修飾が、P2S、P2A、P3S、P3A、R4H、R4Q、L5I、L5V、C7S、C7V、C7A、C7I、C7T、D8Q、D8H、D8N、R10H、R10Q、L12V、L12I、E13Q、E13H、E13N、R14H、R14Q、Y15H、Y15I、L16I、L16V、L17I、L17V、E18Q、E18H、E18N、K20Q、K20T、K20N、E21Q、E21H、E21N、E23Q、E23H、E23N、C29S、C29V、C29A、C29I、C29T、E31Q、E31H、E31N、L35V、L35I、E37Q、E37H、E37N、P42S、P42A、D43H、K45T、W51S、W51H、K52T、M54V、M54I、E62Q、E62H、E62N、W64S、W64H、L67I、L67V、L69V、L69I、L70I、L70V、L80V、L80I、L81I、L81V、P87S、P87A、W88S、W88H、E89Q、E89H、E89N、P90S、P90A、L91I、L91V、L93V、L93I、D96Q、D96H、D96N、K97Q、K97T、K97N、L102V、L102I、R103H、R103Q、L105I、L105V、L108I、L108V、L109I、L109V、R110H、R110Q、L112V、L112I、K116Q、K116T、K116N、E117Q、E117H、E117N、D123H、D136Q、D136H、D136N、F138I、F138V、R139H、R139Q、K140N、K140Q、L141I、L141V、F142I、F142V、R143H、R143Q、Y145H、Y145I、F148I、F148V、L149I、L149V、R150H、R150Q、K152Q、K152T、K152N、L153I、L153V、K154Q、K154T、K154N、L155V、L155I、Y156H、Y156I、E159Q、E159H、E159N、D165H、R166H、及びR166Qからなる群より選択される修飾に対応する、請求項64または請求項65に記載の修飾型EPOポリペプチド。
- 未修飾型EPOポリペプチドにおいて2以上のアミノ酸修飾を含む修飾型エリスロポエチン(EPO)ポリペプチドまたはその活性断片であって、
前記2以上のアミノ酸修飾は、配列番号2または237に示される配列を有する成熟型EPOポリペプチドにおける、または、配列番号2または237に示される配列を有するポリペプチドと少なくとも、または、少なくとも約60%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%、若しくはそれ以上の配列同一性を有するその対立遺伝子型、種間変異体、または他の変異体におけるP2S、P2A、P3S、P3A、R4H、R4Q、L5I、L5V、C7S、C7V、C7A、C7I、C7T、D8Q、D8H、D8N、R10H、R10Q、L12V、L12I、E13Q、E13H、E13N、R14H、R14Q、Y15H、Y15I、L16I、L16V、L17I、L17V、E18Q、E18H、E18N、K20Q、K20T、K20N、E21Q、E21H、E21N、E23Q、E23H、E23N、C29S、C29V、C29A、C29I、C29T、E31Q、E31H、E31N、L35V、L35I、E37Q、E37H、E37N、P42S、P42A、D43H、K45T、W51S、W51H、K52T、M54V、M54I、E62Q、E62H、E62N、W64S、W64H、L67I、L67V、L69V、L69I、L70I、L70V、L80V、L80I、L81I、L81V、P87S、P87A、W88S、W88H、E89Q、E89H、E89N、P90S、P90A、L91I、L91V、L93V、L93I、D96Q、D96H、D96N、K97Q、K97T、K97N、L102V、L102I、R103H、R103Q、L105I、L105V、L108I、L108V、L109I、L109V、R110H、R110Q、L112V、L112I、K116Q、K116T、K116N、E117Q、E117H、E117N、D123H、D136Q、D136H、D136N、F138I、F138V、R139H、R139Q、K140N、K140Q、L141I、L141V、F142I、F142V、R143H、R143Q、Y145H、Y145I、F148I、F148V、L149I、L149V、R150H、R150Q、K152Q、K152T、K152N、L153I、L153V、K154Q、K154T、K154N、L155V、L155I、Y156H、Y156I、E159Q、E159H、E159N、D165H、R166H、及びR166Qからなる群より選択されるアミノ酸置換に対応するものである、修飾型エリスロポエチン(EPO)ポリペプチドまたはその活性断片。 - 前記EPOポリペプチドが、D43Q、D43N、K45Q、K45N、F48I、F48V、Y49H、Y49I、K52Q、K52N、R53H、R53Q、E55Q、E55N、E55H、E72Q、E72N、E72H、L75V、L75I、R76H、R76Q、P121S、P121A、P122S、P122A、D123Q、D123N、P129S、P129A、L130V、L130I、R131H、R131Q、R162H、R162Q、D165Q、及びD165Nからなる群より選択されるアミノ酸置換に対応する1以上の位置においてさらに修飾され、前記アミノ酸修飾及びその位置は、配列番号2または237に示される配列を有する成熟型ヒトEPOポリペプチドにおける位置を参照したものである、請求項57から請求項67のいずれかに記載の修飾型EPOポリペプチド。
- さらなる修飾が、K45N、F48I、K52Q、K52N、D123N、L130I、R131Q、D165Q、及びD165Nからなる群より選択される、請求項68に記載の修飾型EPOポリペプチド。
- A30N、H32T、P87V、W88N及びP90Tからなる群より選択される1以上の付加的なアミノ酸修飾を含む、請求項57から請求項69のいずれかに記載の修飾型EPOポリペプチド。
- 糖化された、請求項57から請求項70のいずれかに記載の修飾型EPOポリペプチド。
- 1以上の天然糖化部位において脱糖化された、請求項57から請求項70のいずれかに記載の修飾型EPOポリペプチド。
- 原核性細胞から産生された、請求項57から請求項72のいずれかに記載の修飾型EPOポリペプチド。
- 原核性細胞が大腸菌である、請求項73に記載の修飾型EPOポリペプチド。
- 一つから全てまでの糖化部位が除去される1以上の修飾を含む、請求項57から請求項74のいずれかに記載の修飾型EPOポリペプチド。
- 前記糖化部位がO糖化部位である、請求項75に記載の修飾型EPOポリペプチド。
- 前記糖化部位がS126である、請求項76に記載の修飾型EPOポリペプチド。
- 前記糖化部位がN糖化部位である、請求項75に記載の修飾型EPOポリペプチド。
- 前記糖化部位がN24、N38及びN83からなる群より選択される、請求項78に記載の修飾型EPOポリペプチド。
- 1以上の修飾がN24H、N38H及びN83Hからなる群より選択されるアミノ酸置換である、請求項79に記載の修飾型EPOポリペプチド。
- 前記修飾がN24K、N38K及びN83Kからなる群より選択される1以上のアミノ酸置換である、請求項79に記載の修飾型EPOポリペプチド。
- 前記修飾型治療用ポリペプチドと同じ条件下において産生された未修飾型治療用ポリペプチドの1以上の活性を維持する、請求項33から請求項81のいずれかに記載の修飾型EPOポリペプチド。
- 完全糖化型未修飾型治療用ポリペプチドの1以上の活性を維持する、請求項33から請求項82のいずれかに記載の修飾型EPOポリペプチド。
- 前記未修飾型EPOポリペプチドが166個のアミノ酸長を有する、請求項33から請求項83のいずれかに記載の修飾型EPOポリペプチド。
- 前記未修飾型EPOポリペプチドが配列番号2に示されるアミノ酸の配列を有する、請求項33から請求項84のいずれかに記載の修飾型EPOポリペプチド。
- 前記未修飾型EPOポリペプチドが160、161、162、163、164または165個のアミノ酸長を有する、請求項33から請求項83のいずれかに記載の修飾型EPOポリペプチド。
- 前記未修飾型EPOポリペプチドが165個のアミノ酸長を有する、請求項86に記載の修飾型EPOポリペプチド。
- 前記未修飾型EPOポリペプチドが配列番号237に示されるアミノ酸配列を有する、請求項87に記載の修飾型EPOポリペプチド。
- 配列番号3から201または配列番号247から272のいずれかに示されるアミノ酸配列を含む、請求項33から請求項88のいずれかに記載の修飾型EPOポリペプチド。
- 配列番号2に示される成熟型EPOポリペプチドの166位に対応するアミノ酸が修飾、置換、または欠失された、請求項33から請求項89のいずれかに記載の修飾型EPOポリペプチド。
- 前記未修飾型EPOポリペプチドが配列番号2または237に示されるポリペプチドの対立遺伝子型または種間変異体である、請求項33から請求項90のいずれかに記載の修飾型EPOポリペプチド。
- 前記未修飾型EPOポリペプチドが、配列番号2または237に示される配列を有するポリペプチドと少なくとも、または、少なくとも約60%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%、若しくはそれ以上の配列同一性を有する対立遺伝子型、種間変異体または他の変異体である、請求項33から請求項90のいずれかに記載の修飾型EPOポリペプチド。
- 前記未修飾対立遺伝子型、種間変異体、または他の変異体が、配列番号202、203、204、205、206、207、208、209、210、211、212、213、214、215、216、217、218、219、220、221、222、223、224、225、226、227、228、309または310のいずれかに示されるアミノ酸配列を有する、請求項92に記載の修飾型EPOポリペプチド。
- 成熟ポリペプチドである、請求項33から請求項93のいずれかに記載の修飾型EPOポリペプチド。
- 前駆体ポリペプチドである、請求項33から請求項93のいずれかに記載の修飾型EPOポリペプチド。
- シグナルペプチドを含む、請求項95に記載の修飾型EPOポリペプチド。
- シグナルペプチドが欠失された、請求項33から請求項95のいずれかに記載の修飾型EPOポリペプチド。
- 分泌される、請求項33から請求項97のいずれかに記載の修飾型EPOポリペプチド。
- 少なくとも2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、または20個のアミノ酸修飾を含む、請求項33から請求項98のいずれかに記載の修飾型EPOポリペプチド。
- タンパク質分解に対する増強された抵抗性が1次配列の修飾によるものである、請求項33から請求項99のいずれかに記載の修飾型EPOポリペプチド。
- 前記ポリペプチドが、血清、血液、唾液、消化液または試験管内の1以上のタンパク質分解酵素によるタンパク質分解に対する増強された抵抗性を示す、請求項100に記載の修飾型EPOポリペプチド。
- 一つまたはそれ以上のタンパク質分解酵素が、ペプシン、トリプシン、キモトリプシン、エラスターゼ、アミノペプチダーゼ、ゼラチナーゼB、ゼラチナーゼA、α−キモトリプシン、カルボキシペプチダーゼ、エンドプロテイナーゼArg−C、エンドプロテイナーゼAsp−N、エンドプロテイナーゼGlu−C、エンドプロテイナーゼLys−C、及びトリプシン、内腔ペプシン、微絨毛エンドペプチダーゼ、ジペプチジルペプチダーゼ、エンテロペプチダーゼ及びヒドロラーゼ、NS3、血液凝固因子Xa、グランザイムB、トロンビン、トリプシン、プラスミン、ウロキナーゼ、tPA及びPSAからなる群より選択される、請求項101に記載の修飾型EPOポリペプチド。
- 前記増強されたタンパク質分解酵素の抵抗性が、前記修飾型治療用ポリペプチドが経口投与されたとき、または、消化管内に存在するときに現れる、請求項100から請求項102のいずれかに記載の修飾型EPOポリペプチド。
- 裸出型ポリペプチド鎖である、請求項33から請求項103のいずれかに記載の修飾型EPOポリペプチド。
- EPOポリペプチドがさらに修飾され、且つ、その修飾が、カルボキシル化、水酸化、ハシル化、カルバミル化、硫化、リン酸化、アルブミン化、酸化、またはポリエチレングリコール(PEG)残基への接合のいずれか1種以上である、請求項33から請求項103のいずれかに記載の修飾型EPOポリペプチド。
- EPOポリペプチドが糖化によりさらに修飾される、請求項33から請求項103のいずれかに記載の修飾型EPOポリペプチド。
- 前記ポリペプチドが、変化した免疫原性、糖化、カルボキシル化、水酸化、ハシル化、カルバミル化、硫化、リン酸化、アルブミン化、酸化、PEG化、または修飾型EPOポリペプチドのタンパク質分解酵素抵抗性に寄与する1以上の付加的なアミノ酸修飾を含む、請求項33から請求項105のいずれかに記載の修飾型EPOポリペプチド。
- 一つまたはそれ以上の付加的なアミノ酸修飾がポリペプチドの非天然糖化部位に付加される、請求項107に記載の修飾型EPOポリペプチド
- 1以上の付加的なアミノ酸修飾が天然アミノ酸、非天然アミノ酸、及び天然アミノ酸と天然アミノ酸との組み合わせからなる群より選択される、請求項107または請求項108に記載の修飾型治療用ポリペプチドまたは修飾型EPOポリペプチド。
- EPOポリペプチドの炭水化物含量が修飾された、請求項33から請求項109のいずれかに記載の修飾型EPOポリペプチド。
- 前記修飾型EPOポリペプチドが1以上の非天然糖化部位において糖化された、請求項110に記載の修飾型EPOポリペプチド。
- EPOポリペプチド当たりのシアル酸残基の数がさらに修飾された、請求項110または請求項111に記載の修飾型EPOポリペプチド。
- 未修飾型EPOポリペプチドの1以上の活性を維持する、請求項33から請求項112のいずれかに記載の修飾型EPOポリペプチド。
- EPOポリペプチドの1以上の活性が未修飾型EPOポリペプチドと比べて増強された、請求項113に記載の修飾型EPOポリペプチド。
- EPOポリペプチドの1以上の活性が未修飾型EPOポリペプチドと比べて減少された、請求項113に記載の修飾型EPOポリペプチド。
- EPOポリペプチドの活性部分または断片を含み、前記活性部分または断片が未修飾型EPOポリペプチドの1以上の活性を維持し、未修飾型EPOポリペプチドと比べて1以上のアミノ酸置換を含む、請求項33から請求項113のいずれかに記載の修飾型EPOポリペプチド。
- 前記活性が赤血球細胞増殖である、請求項113から請求項115のいずれかに記載の修飾型EPOポリペプチド。
- 前記修飾型EPOポリペプチドが赤血球細胞増殖を促進する、請求項33から請求項117のいずれかに記載の修飾型EPOポリペプチド。
- 前記修飾型EPOポリペプチドが細胞生存を促進する、請求項33から請求項118のいずれかに記載の修飾型EPOポリペプチド。
- 治療用ポリペプチドまたは修飾型EPOポリペプチドが組織損傷を阻害する、請求項33から請求項119のいずれかに記載の修飾型EPOポリペプチド。
- 請求項33から請求項120のいずれかに記載の修飾型EPOポリペプチドを暗号化するヌクレオチドの配列を含む核酸分子。
- 請求項121に記載の複数の分子を含む核酸分子の集合。
- 請求項121に記載の核酸分子を含むベクター。
- 作動可能にプロモータに結合された核酸を含む、請求項123に記載のベクター。
- 前記ベクターが、原核性ベクター、ウィルス性ベクター及び真核性ベクターからなる群より選択される、請求項123または請求項124に記載のベクター。
- 前記ウィルス性ベクターが、アデノウィルス、アデノ連関ウィルス、レトロウィルス、ヘルペスウィルス、レンチウィルス、ポックスウィルス、及びサイトメガロウィルスからなる群より選択される、請求項125に記載のベクター。
- プロモータが、原核性プロモータ、ウィルス性プロモータ、及び真核性プロモータからなる群より選択される、請求項124から請求項126のいずれかに記載のベクター。
- プロモータが常時性プロモータ及び誘導性プロモータからなる群より選択される、請求項124から請求項126のいずれかに記載のベクター。
- 請求項123から請求項128のいずれかに記載の複数のベクターを含む集合。
- 請求項121に記載の核酸分子または請求項123から請求項128のいずれかに記載のベクターを含む宿主細胞。
- 真核性細胞である、請求項130に記載の宿主細胞
- 原核性細胞である、請求項130に記載の宿主細胞。
- 前記細胞が修飾型EPOポリペプチドを発現させる、請求項130から請求項132のいずれかに記載の宿主細胞。
- 請求項133に記載の細胞により産生される、修飾型EPOポリペプチド。
- (i)請求項121に記載の核酸分子または請求項123から請求項128のいずれかに記載のベクターを含む核酸を細胞に導入する工程と、
(ii)暗号化された修飾型EPOポリペプチドが発現される条件下において細胞を培養する工程と、
を含む、修飾型EPOポリペプチドの発現方法。 - 前記細胞が真核性細胞である、請求項135に記載の方法。
- 前記細胞が原核性細胞である、請求項135に記載の方法。
- 修飾型EPOポリペプチドを検出する工程をさらに含む、請求項135から請求項137のいずれかに記載の方法。
- 薬剤学的に許容可能なビヒクル内に請求項33から請求項120または請求項134のいずれかに記載の修飾型EPOポリペプチドを含む薬剤組成物。
- 局所、全身、または皮膚投与のために製剤化された、請求項1から請求項32または請求項139のいずれかに記載の薬剤組成物。
- 経口、鼻腔、経肺、口腔、粘膜、経皮、皮下、十二指腸内、直腸、非経口、静脈または筋肉内投与のために製剤化された、請求項1から請求項32または請求項139から請求項140のいずれかに記載の薬剤組成物。
- 前記薬剤組成物が経口投与のために製剤化された、請求項141に記載の薬剤組成物。
- 前記薬剤組成物が静脈投与のために製剤化された、請求項141に記載の薬剤組成物。
- 前記薬剤組成物が皮下投与のために製剤化された、請求項141に記載の薬剤組成物。
- 前記薬剤組成物が、液剤、丸剤、錠剤、トローチ剤及びカプセル剤からなる群より選択されるいずれか1種に経口投与のために製剤化された、請求項1から請求項32または請求項139から請求項144のいずれかに記載の薬剤組成物。
- 前記薬剤組成物が修飾型治療用ポリペプチドの制御型放出のために製剤化された、請求項1から請求項32または請求項139から請求項145のいずれかに記載の薬剤組成物。
- 前記組成物が丸剤、錠剤、トローチ剤またはカプセル剤である、請求項146に記載の薬剤組成物。
- 丸剤、錠剤またはカプセル剤が胃腸管に修飾型治療用ポリペプチドを伝達する、請求項1から請求項32または請求項139から請求項147のいずれかに記載の薬剤組成物。
- 前記薬剤組成物は外来のさらなるタンパク分解酵素抑制剤を含有しない、請求項1から請求項32または請求項139から請求項148のいずれかに記載の薬剤組成物。
- 請求項121に記載の核酸分子または請求項123から請求項128のいずれかに記載のベクターを含む薬剤組成物。
- 活性型EPOを投与して治療される疾病または状態を有する被験者に、請求項1から請求項32または請求項139から請求項150のいずれかに記載の薬剤組成物を投与することにより、被験者を治療する工程を含む方法。
- 不活性型EPOを投与して治療される疾病または状態を有する被験者に、請求項1から請求項32または請求項139から請求項150のいずれかに記載の薬剤組成物を投与することにより、被験者を治療する工程を含む方法。
- 前記治療される疾病または状態が貧血である、請求項151に記載の方法
- 前記貧血が、慢性炎症、腎不全及び癌からなる群より選択される障害に存在するものである、請求項153に記載の方法。
- 前記薬剤組成物の投与が被験者の赤血球産生を促進する、請求項151または請求項153から請求項154のいずれかに記載の方法。
- 貧血治療のために1以上の付加薬物を被験者に投与する工程をさらに含む、請求項151または請求項153から請求項154のいずれかに記載の方法。
- 1以上の付加薬物が、治療用ポリペプチド、リンホカイン、インターロイキン、造血細胞成長因子、ヘモグロビン、鉄及び化学療法剤からなる群より選択される、請求項156に記載の方法。
- 1以上の付加薬物が、GM−CSF、G−CSF、TPO、M−CSF、IL−1、IL−4、IL−2、IL−3、IL−5、IL−6、IL−7、IL−8、IL−9、IL−10、IL−11、IL−12、IL−13、IL−15、LIF、ヒト成長ホルモン、B細胞成長因子、B細胞分化因子、好酸性白血球分化因子及び幹細胞因子からなる群より選択される、請求項157に記載の方法。
- 治療される疾病または状態が、発作障害、多発性硬化症、脳卒中、低血圧、心臓麻痺、虚血、心筋梗塞、炎症、老化による認知機能の消失、放射線損傷、脳性麻痺、退行性神経疾患、アルツハイマー病、パーキンソン病、リー脳症、後天性免疫欠乏症、痴呆、記憶喪失、筋萎縮性側索硬化症、アルコール中毒、気分障害、不安障害、集中力障害、精神***症、自閉症、クロイツフェルト・ヤコブ病、脳または脊髄の外傷または虚血、心肺バイパス、慢性頭部不全、視力減退、毒素誘発性神経障害、糖尿病性神経病症、糖尿病性網膜病症、緑内障、網膜性虚血及び網膜外傷からなる群より選択される、請求項151から請求項152のいずれかに記載の方法。
- 薬剤組成物が組織保護活性を有する、請求項151から請求項159のいずれかに記載の方法。
- 薬剤組成物の投与が被験者の細胞生存を促進する、請求項151から請求項160のいずれかに記載の方法。
- 修飾型EPOポリペプチドが配列番号3から201または配列番号247から272のいずれかに示されるアミノ酸配列を有する、請求項151から請求項161のいずれかに記載の方法。
- 請求項1から請求項32または請求項139から請求項150のいずれかに記載の薬剤組成物を被験者に投与して被験者を治療する工程を含む方法により、前記被験者は前記治療用ポリペプチドにより治療可能な疾病または状態にある方法。
- 請求項1から請求項32または請求項139から請求項150のいずれかに記載の薬剤組成物または請求項33から請求項120または請求項134のいずれかに記載のEPOポリペプチド、及び貧血治療のために1以上の付加薬物を含む複合剤。
- 1以上の付加薬物が、治療用ポリペプチド、リンホカイン、インターロイキン、造血細胞成長因子、ヘモグロビン、鉄及び化学療法剤からなる群より選択される、請求項164に記載の複合剤。
- 1以上の付加薬物が、GM−CSF、G−CSF、TPO、M−CSF、IL−1、IL−4、IL−2、IL−3、IL−5、IL6、IL−7、IL−8、IL−9、IL−10、IL−11、IL−12、IL−13、IL−15、LIF、ヒト成長ホルモン、B細胞成長因子、B細胞分化因子、好酸性白血球分化因子及び幹細胞因子からなる群より選択される、請求項165に記載の複合剤。
- 請求項1から請求項32または請求項139から請求項150のいずれかに記載の薬剤組成物または請求項33から請求項120または請求項134のいずれかに記載のEPOポリペプチドと、
発作障害、多発性硬化症、脳卒中、低血圧、心臓麻痺、虚血、心筋梗塞、炎症、老化による認知機能の消失、放射線損傷、脳性麻痺、退行性神経疾患、アルツハイマー病、パーキンソン病、リー脳症、後天性免疫欠乏症、痴呆、記憶喪失、筋萎縮性側索硬化症、アルコール中毒、気分障害、不安障害、集中力障害、精神***症、自閉症、クロイツフェルト・ヤコブ病、脳または脊髄の外傷または虚血、心肺バイパス、慢性頭部不全、視力減退、毒素誘発性神経障害、糖尿病性神経病症、糖尿病性網膜病症、緑内障、網膜性虚血、または網膜外傷の治療のための1以上の付加薬物と、
を含む複合剤。 - 2以上のEPOポリペプチドを含み、少なくとも一つの前記EPOポリペプチドは、請求項33から請求項120または請求項134のいずれかに記載のEPOポリペプチドからなる群より選択される、請求項164から請求項167のいずれかに記載の複合剤。
- 治療用ポリペプチドにより治療可能な疾病または状態を治療するための請求項1から請求項32または請求項139から請求項150のいずれかに記載の組成物の使用。
- 治療用ポリペプチドにより治療可能な疾病または状態を治療するための薬剤を製剤化するための請求項1から請求項32または請求項139から請求項150のいずれかに記載の組成物の使用。
- 活性型EPOポリペプチドにより治療可能な疾病または状態を治療するための請求項1から請求項32または請求項139から請求項150のいずれかに記載の組成物の使用。
- 不活性型EPOポリペプチドにより治療可能な疾病または状態を治療するための請求項1から請求項32または請求項139から請求項150のいずれかに記載の組成物の使用。
- 活性型EPOポリペプチドにより治療可能な疾病または状態を治療するための薬剤を製剤化するための請求項1から請求項32または請求項139から請求項150のいずれかに記載の組成物の使用。
- 不活性型EPOポリペプチドにより治療可能な疾病または状態を治療するための薬剤を製剤化するための請求項1から請求項32または請求項139から請求項150のいずれかに記載の組成物の使用。
- 前記疾病または状態が貧血である、請求項171または請求項173に記載の使用。
- 前記貧血が、慢性炎症、腎不全及び癌からなる群より選択される障害に存在するものである、請求項175に記載の使用。
- 前記疾病または状態が、発作障害、多発性硬化症、脳卒中、低血圧、心臓麻痺、虚血、心筋梗塞、炎症、老化による認知機能の消失、放射線損傷、脳性麻痺、退行性神経疾患、アルツハイマー病、パーキンソン病、リー脳症、後天性免疫欠乏症、痴呆、記憶喪失、筋萎縮性側索硬化症、アルコール中毒、気分障害、不安障害、集中力障害、精神***症、自閉症、クロイツフェルト・ヤコブ病、脳または脊髄の外傷または虚血、心肺パイパス、慢性頭部不全、視力減退、毒素誘発性神経障害、糖尿病性神経病症、糖尿病性網膜病症、緑内障、網膜性虚血及び網膜外傷からなる群より選択されるものである、請求項170から請求項174のいずれかに記載の使用。
- 前記薬剤組成物が組織保護活性を有するものである、請求項170から請求項177のいずれかに記載の使用。
- 薬剤学的に許容可能なビヒクル内に修飾型治療用ポリペプチドまたはポリペプチドの活性断片を含む薬剤組成物であって、
(i)修飾型治療用ポリペプチドが、未修飾型治療用ポリペプチドと比べて2以上のアミノ酸置換を含み、
(ii)少なくとも一つのアミノ酸置換が、未置換の治療用ポリペプチドと比べてタンパク質分解に一層高い抵抗性を示す修飾型治療用ポリペプチドを提供し、
(iii)未修飾型治療用ポリペプチドは少なくとも一つの糖化部位を含み、
(iv)少なくとも一つのアミノ酸置換は治療用タンパク質の天然糖化部位を除去し、
(v)ポリペプチドが活性断片である場合、活性断片がタンパク質分解に対する増強された抵抗性を示す修飾を含む、薬剤組成物。 - 前記修飾型治療用ポリペプチドが、全ての天然糖化部位が除去される1以上の修飾を含む、請求項179に記載の薬剤組成物。
- 前記修飾型治療用ポリペプチドがサイトカインである、請求項179または請求項180に記載の薬剤組成物。
- 前記治療用ポリペプチドが、エリスロポエチン(EPO)、インターロイキン−1β(IL−1)、インターロイキン−2(IL−2)、インターロイキン−3(IL−3)、インターロイキン−4(IL−4)、インターロイキン−5(IL−5)、インターロイキン−6(IL−6)、インターロイキン−9(IL−9)、インターフェロン−β(IFN−β)、インターフェロン−γ(IFN−γ)、顆粒球コロニー刺激因子(G−CSF)、顆粒球・大食細胞コロニー刺激因子(GM−CSF)、大食細胞・コロニー刺激因子(M−CSF)、トロンボポエチン(TPO)、白血球抑制因子(LIF)、幹細胞因子(SCF)、オンコスタチンM(OSM)及び血管内皮成長因子(VEGF)からなる群より選択される、請求項179から請求項181のいずれかに記載の薬剤組成物。
- 前記修飾型治療用ポリペプチドが治療用ポリペプチドの前駆体形態である、請求項179から請求項182のいずれかに記載の薬剤組成物。
- 前記修飾型治療用ポリペプチドが治療用ポリペプチドの成熟形態である、請求項179から請求項182のいずれかに記載の薬剤組成物。
- 前記修飾型治療用ポリペプチドがエリスロポエチン(EPO)ポリペプチドである、請求項179から請求項184のいずれかに記載の薬剤組成物。
- 前記ポリペプチドがEPOであり、未修飾型ポリペプチドの成熟形態は配列番号2または237に示されるアミノ酸配列を有するか、あるいは、配列番号2または237に示される配列を有するポリペプチドと少なくとも、または、少なくとも約60%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%、若しくはそれ以上の配列同一性を有するその対立遺伝子型、種間変異体、または他の変異体であり、前記活性断片が修飾を含む、請求項185に記載の薬剤組成物。
- 前記1以上のアミノ酸置換は、P2S、P2A、P3S、P3A、R4H、R4Q、L5I、L5V、C7S、C7V、C7A、C7I、C7T、D8Q、D8H、D8N、R10H、R10Q、L12V、L12I、E13Q、E13H、E13N、R14H、R14Q、Y15H、Y15I、L16I、L16V、L17I、L17V、E18Q、E18H、E18N、E21Q、E21H、E21N、E23Q、E23H、E23N、C29S、C29V、C29A、C29I、C29T、E31Q、E31H、E31N、L35V、L35I、E37Q、E37H、E37N、K20Q、K20T、K20N、P42S、P42A、D43Q、D43H、D43N、K45Q、K45T、K45N、F48I、F48V、Y49H、Y49I、W51S、W51H、K52Q、K52T、K52N、R53H、R53Q、M54V、M54I、E55Q、E55H、E55N、E62Q、E62H、E62N、W64S、W64H、L67I、L67V、L69V、L69I、L70I、L70V、E72Q、E72H、E72N、L75V、L75I、R76H、R76Q、L80V、L80I、L81I、L81V、P87S、P87A、W88S、W88H、E89Q、E89H、E89N、P90S、P90A、L91I、L91V、L93V、L93I、D96Q、D96H、D96N、K97Q、K97T、K97N、L102V、L102I、R103H、R103Q、L105I、L105V、L108I、L108V、L109I、L109V、R110H、R110Q、L112V、L112I、K116Q、K116T、K116N、E117Q、E117H、E117N、P121S、P121A、P122S、P122A、D123Q、D123H、D123N、P129S、P129A、L130V、L130I、R131H、R131Q、D136Q、D136H、D136N、F138I、F138V、R139H、R139Q、K140N、K140Q、L141I、L141V、F142I、F142V、R143H、R143Q、Y145H、Y145I、F148I、F148V、L149I、L149V、R150H、R150Q、K152Q、K152T、K152N、L153I、L153V、K154Q、K154T、K154N、L155V、L155I、Y156H、Y156I、E159Q、E159H、E159N、R162H、R162Q、D165Q、D165H、D165N、R166H、及びR166Qからなる群より選択されるいずれか1種に対応する、請求項185または請求項186に記載の薬剤組成物。
- 前記修飾型治療用ポリペプチドが、N24、N38及びN83の糖化部位におけるアミノ酸修飾を含む、請求項185から請求項187のいずれかに記載の薬剤組成物。
- 前記修飾がN24H、N38H及びN83Hからなる群より選択されるアミノ酸置換である、請求項188に記載の薬剤組成物。
- 前記修飾がN24K、N38K及びN83Kからなる群より選択されるアミノ酸置換である、請求項188に記載の薬剤組成物。
- 前記修飾型治療用ポリペプチドが、修飾型治療用ポリペプチドと同じ条件下において産生された未修飾型治療用ポリペプチドの1以上の活性を維持する、請求項179から請求項190のいずれかに記載の薬剤組成物。
- 修飾型治療用ポリペプチドが、変化した免疫原性、糖化、カルボキシル化、水酸化、ハシル化、カルバミル化、硫化、リン酸化、酸化、PEG化、または修飾型EPOポリペプチドのタンパク質分解酵素抵抗性に寄与する1以上の付加的なアミノ酸修飾を含む、請求項179から請求項191のいずれかに記載の薬剤組成物。
- 1以上の付加的なアミノ酸修飾が治療用ポリペプチドの非天然糖化部位に付加された、請求項192に記載の薬剤組成物。
- 経口、鼻腔、経肺、口腔、粘膜、経皮、皮下、十二指腸内、直腸、非経口、静脈または筋肉内投与のために製剤化された、請求項179から請求項193のいずれかに記載の薬剤組成物。
- 治療用ポリペプチドにより治療可能な疾病または状態を治療するための請求項179から請求項194のいずれかに記載の組成物の使用。
- 治療用ポリペプチドにより治療可能な疾病または状態を治療するための薬剤を製剤化する請求項179から請求項194のいずれかに記載の組成物の使用。
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