BRPI0709787A2

BRPI0709787A2 - citocinas com anticorpos alvejados para terapia

Info

Publication number: BRPI0709787A2
Application number: BRPI0709787-5A
Authority: BR
Inventors: Dario Neri; Manuela Kaspar; Eveline Trachsel
Original assignee: Philogen Spa
Priority date: 2006-05-08
Filing date: 2007-05-08
Publication date: 2011-03-29
Also published as: ES2606490T3; JP2009536170A; CN101437847A; EP2016098B1; AU2007247380B2; US8404814B2; EP2016098A1; MX2008013575A; WO2007128563A1; US20110256091A1; AU2007247380A1; KR20090008467A; CA2648484A1; EA200802289A1

Abstract

CITOCINAS COM ANTICORPOS ALVEJADOS PARA TERAPIA. presente invenção refere-se às proteínas de fusão que compreendem um anticorpo, seu fragmento funcional ou derivado funcional tendo afinidade de ligação específica ao domínio extracelular da fibronectina ncofetal (ED-B) ou a pelo menos um dos domínios extracelulares da tenascina oncofetal, fundido a uma citocina selecionada a partir do grupo que onsiste em IL-lO, 1L15, IL-24 e GM-CSF, fragmentos funcionais e derivados uncionais do mesmos. A invenção também é dirigida ao uso de pelo menos ma das ditas proteínas de fusão para a fabricação de um medicamento. Em articular, a invenção diz respeito ao uso do dito medicamento para o trataento de tumores ou doenças inflamatórias crónicas, tais como a ateroscleose, a artrite e a psoriase.

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para "CITOCINAS COM ANTICORPOS ALVEJADOS PARA TERAPIA ".

Campo da Invenção

A presente invenção refere-se às proteínas de fusão que com-preendem um anticorpo, seu fragmento funcional ou derivado funcional ten-do afinidade de ligação específica ao domínio extracelular da fibronectinaoncofetal (ED-B) ou a pelo menos um dos domínios extracelulares da tenas-cina oncofetal, fundido a uma citocina selecionada a partir do grupo queconsiste em IL-10, IL15, IL-24 e GM-CSF, seus fragmentos funcionais e de-rivados funcionais. A invenção também é dirigida ao uso de pelo menos umadas ditas proteínas de fusão para a fabricação de um medicamento. Em par-ticular, a invenção diz respeito ao uso do dito medicamento para o tratamen-to de tumores ou doenças inflamatórias crônicas, tais como a aterosclerose,a artrite e a psoríase.

Antecedentes Relevantes da Invenção

As citocinas são proteínas imunomoduladoras, algumas dasquais têm sido usadas de modo pré-clínico ou clínico não somente paracombater o câncer, como também para interferir com as condições inflama-tórias crônicas e com a doença infecciosa.

O potencial terapêutico das citocinas recombinantes é freqüen-temente limitado pelos efeitos colaterais graves, mesmo em baixas concen-trações, assim impedindo concentrações de citocinas suficientes nos teci-dos-alvo. Recentemente, os anticorpos monoclonais foram empregados paraalvejar e distribuir as citocinas para os locais da doença, para aumentar asua potência e poupar o tecido normal dos efeitos tóxicos. De fato, diversasproteínas de fusão de anticorpo-citocina já foram investigadas para a aplica-ção na terapia do câncer, freqüentemente com resultados impressionantes.Por exemplo, o anticorpo humano L19 específico para o domínio ED-B dafibronectina (um marcador de angiogênese) tem sido usado para distribuir ascitocinas pró-inflamatórias (tais como a IL-2, a IL-12 ou o TNF) para os tumo-res sólidos, algumas vezes com benefícios terapêuticos extraordinários[quanto a uma revisão e referências correspondentes, vide Neri e Bicknell,Nat. Rev. Câncer (2005) 5:436-446, e também o WO 01/62298]. Entretanto,muitas citocinas têm uma história de fracasso clínico, tanto quando usadascomo um agente individual, quanto como pares de fusão com os anticorposmonoclonais. Por exemplo, a IL-2 recombinante ("Proleucina", Quiron) foiaprovada para o tratamento de pacientes com carcinoma de célula renal,porém as taxas de respostas são tipicamente baixas (geralmente abaixo de20 %) para esta indicação e ainda menores para os outros tipos de câncer.Outras citocinas (tais como a interleucina-12 ou a interleucina-10, vide abai-xo) fracassaram em demonstrar eficácia substancial em uma série de estu-dos clínicos, o que desacelerou os programas de desenvolvimento clínicos.Estas citocinas não foram ainda aprovadas como substâncias biofarmacêuti-cas. O interferon gama é um outro exemplo de uma citocina aprovada parauma indicação muito estreita (tratamento de doença granulomatosa crônica,Genentech) que fracassou em demonstrar benefícios clínicos substanciaispara outras indicações.

Mesmo quando fundidas aos anticorpos, é imprevisível um ga-nho extraordinário no índice terapêutico. Por exemplo, a fusão de anticorpoanti-GD2-IL2 EMD273063 não conseguiu demonstrar benefícios terapêuticossubstanciais em diversos ensaios clínicos, finalmente e igualmente importan-te em um ensaio em crianças com neuroblastoma (Osenga e outros, Clin.Câncer Res. Mar 15; 12(6): 1750-9 (2006)).

A interleucina-10 (IL-10) é uma citocina homodimérica produzidapor monócitos e células T ativados que está profundamente envolvida naregulação das respostas inflamatórias e das reações imunes. A sua funçãoglobal principal é mais bem descrita como supressora das respostas imunes,porém a IL-10 também possui atividades estimuladoras. A IL-10 foi primei-ramente descrita como fator inibitório da síntese de citocinas (CSIF), umaatividade produzida pelas células Th2 de camundongo que inibia a ativaçãode e a produção de citocinas pelas células Th 1 [Fiorentino e outros, J. Exp.Med. 170(6): 2081-95 (1989)]. O gene codificando a IL-10 humana está loca-lizado sobre o cromossomo 1 [Kim e outros, J. Immunol. 148(11): 3618-23(1992)] e é traduzido em uma proteína composta de 160 aminoácidos comuma massa molecular de 18,5 kDa. A IL-10 humana é ativa como um homo-dímero não ligado ao dissulfeto de 37 kDa [Syto e outros, Biochemistry37(48): 16943-51 (1998)].

A IL-10 tem sido considerada uma candidata atraente para usoterapêutico com base em suas atividades imunomoduladoras in vitro poten-tes e efeitos comprovados em modelos de animais de inflamação aguda ecrônica, auto-imunidade, câncer e doença infecciosa. A Schering-Ploughdesenvolveu a IL-10 humana recombinante (ilodecacina, Tenovil®) para en-saios clínicos. A proteína é produzida em E. coli e consiste em 161 aminoá-cidos, idêntica com a proteína humana endógena, exceto por um resíduo demetionina na extremidade amino. Os ensaios clínicos de fases I e II, que in-vestigam a segurança, a tolerância, a farmacocinética, a farmacodinâmica,os efeitos imunológicos e hematológicos de doses individuais ou múltiplas daIL-10 administrada por rotas intravenosas ou subcutâneas, têm sido efetua-dos em diversos ambientes de voluntários saudáveis e populações específi-cas de pacientes [Moore e outros, Annu Rev. Immunol. 19: 683-765 (2001)].O desenvolvimento clínico, contudo, tem sido descontinuado devido à faltade eficácia do composto. Recentemente, apresentou-se um dado que podeexplicar, pelo menos em parte, o dilema da terapia da IL-10. Tilg e outrosverificaram que altas doses de IL-10 supra-regulam a produção de IFN-gamae neopterina, com isso contrabalançando as suas propriedades imunossu-pressoras. Os autores concluíram que a ação terapêutica da hulL-10 admi-nistrada sistemicamente é limitada pelos efeitos pró-inflamatórios da citocinae sugerem que este problema pode ser contornado por abordagens que re-sultem na distribuição mucosa efetiva sem causar um aumento nas concen-trações sistêmicas de IL-10 [Tilg e outros, Gut 50(2): 191-5 (2002)].

A interleucina-15 (IL-15) é um membro de 14 a 15 kDa da famíliado grupo da hélice 4a de citocinas compostas de 114 aminoácidos. Em par-ticular, a proteína IL-15 é regulada de modo pós-transcricional por múltiploselementos controladores que inibem a tradução, incluindo 12 AUGs a mon-tante da região não traduzida em 5' (UTR), 2 peptídeos de sinais incomuns(o peptídeo curto com 21 aminoácidos permanece de modo intracelular, opeptídeo longo com 48 aminoácidos é para secreção) e a extremidade de Cda proteína madura [Bamford e outros, J. Immunol., 160(9): 4418-26 (1998)].Há 97% de identidade de seqüência entre a IL-15 humana e de símio e 73%entre a humana e a de camundongo. Isto parece ser suficiente para a hulL-15 para torná-la biologicamente ativa sobre as células de símios e murinos.A IL-15 usa dois receptores distintos e vias de sinalização: Um sistema deIL-15R de alta afinidade que consiste nas subunidades de IL-2/15β, yc e IL-15Roc é expresso sobre as células T e NK. As subunidades de IL-2/15R β eas de yc são compartilhadas com o receptor de IL-2 [Giri e outros, EMBO J.,3(12):2822-30 (1994)]. Os mastócitos respondem à IL-15 com um sistema dereceptor que não compartilha elementos com o receptor de IL-2, porém usauma nova subunidade de IL-15RX de 60 a 65 kDa. Uma variedade de teci-dos, tais como a placenta, os músculos esqueléticos, o rim, os fibroblastos,as células epiteliais, as células dendríticas e os monócitos, expressa a IL-15.

A IL-15 estimula a produção de citocinas pró-inflamatórias (porexemplo, o TNFa, a IL-1, o IFNy), a proliferação e a síntese de Ig de célulasB ativadas, a ativação de TH1, monócitos e células exterminadoras ativadaspor linfocinas, a proliferação de mastócitos e células T e inibe a apoptosedas células TeB. Além das atividades funcionais mencionadas, a IL-15 de-sempenha um papel importante no desenvolvimento, na sobrevivência e nafunção das células NK [Joost J. Oppenheim e outros, Cytokine Reference;213-221, (2002)]. Os estudos in vivo demonstraram que a IL-15 exógenaaumenta a atividade antitumor das células T CD8+ reativas ao tumor [Feh-ninger e outros, Cytokine Growth Factor Rev., 13(2):169-83 (2002)].

Os altos níveis anormais da expressão da IL-15 foram descritosnas doenças inflamatórias, neoplásticas e nas doenças auto-imunes, porexemplo, a artrite reumatóide, a colite ulcerativa, a doença de Crohn e a es-clerose múltipla [Joost J. Oppenheim e outros, Cytokine Reference; 213-221,(2002)].

Porque a IL-2 e a IL-15 utilizam as mesmas subunidades de re-ceptores, elas compartilham muitas características. As diferenças principaissão os seus sítios de síntese e secreção. A IL-2 é produzida por células Tativadas. Em contraste, a IL-15 é expressa em uma variedade de tecidos,conforme acima mencionado. Enquanto que a IL-2 pode promover a apopto-se e a sobrevivência e a proliferação limitadas das células T de memóriaCD8+, a IL-15 auxilia a manter a população de CD8+ de memória e pode ini-bir a apoptose. A IL-15, inicialmente acreditada mediar efeitos biológicos bá-sicos como a IL-2, foi mostrada ter propriedades únicas em estudos básicose pré-clínicos que podem ser de benefício na imunoterapia do câncer [Feh-ninger e outros, Cytokine Growth Factor Rev., (2): 169-83 (2002)]. Também,o perfil de toxicidade da IL-15 assemelha-se àquele da IL-2 muito proxima-mente [Munger e outros, Cell Immunol., 5(2):289-93 (1995)], assim sugerin-s do que a distribuição alvejada da IL-15 é superior à distribuição sistêmica emtermos de índice terapêutico.

Os estudos para identificar os epítopos de IL-15 que são res-ponsáveis pela ligação ao receptor da IL-15 revelaram mutantes da IL-15que mostraram propriedades agonistas ou antagonistas que podem ser úteiscomo agentes terapêuticos [Bernard e outros, J. Biol. Chem., 279(23):24313-22 (2004)]. Os mutantes da IL-15 IL-15D8S e IL-15Q108S eram inati-vos em um bioensaio de CTLL-2, porém eram capazes de inibir competiti-vamente a atividade biológica da IL-15 não modificada [Pettit e outros, J. Biol.Chem., 272(4): 2312-8 (1997)].

O gene-7 associado à diferenciação do melanoma (mda-7 = IL-24) foi primeiramente identificado nos anos 90 como uma conseqüência desua propriedade de ser induzido durante a diferenciação do melanoma. Ele éum membro da família de citocinas IL-10. O cDNA do gene IL-24 codificauma proteína de 206 aminoácidos com 23,8 kDa. Nas células humanas, aproteína secretada tem um peso molecular significativamente mais elevado(40 kDa) devido à N-glicosilação forte comparada à proteína intracelular(30/23 kDa). A homologia da IL-24 humana ao correspondente do rato(MOB-5) é 68% e ao do camundongo (FISP) 69%. Existem dois receptoresheterodiméricos funcionais para a IL-24: IL-20R1/IL-20R2 e IL-22R1/IL-20R2[Wang e outros, Genes Immun., 5(5):363-70 (2004)], [Chada e outros, Mol.,Ther., 10(6):1085-95 (2004)]. Embora as cadeias dos receptores IL-20R1 eIL-22R1 sejam amplamente expressas, a expressão restrita do IL-20R2 co-mum em certos tecidos não hemopoéticos sugere uma função pleotrópica daIL-24 fora do sistema hemopoético [Wolk e outros, J. Immunol., 168(11):5397-402 (2002)]. A IL-24 é expressa por monócitos, células T, células den-dríticas e melanócitos. A IL-24 induz a secreção de IFNy, IL-6, TNFa1 IL-1-βe GM-CSF, indicando a sua função como uma citocina pró-Th1. A IL-10 (ci-tocina Th2) inibe a atividade da IL-24.

A quantidade de depósito de IL-24 está inversamente correlacio-nada com a progressão do melanoma. Estas verificações resultam na hipó-tese que a produção de mda-7 é perdida durante a invasão do melanoma,sugerindo uma função da IL-24 como um supressor do tumor [Chada e ou-tros, Mol. Ther., 10(6): 1085-95 (2004)].

A expressão da IL-24 nos tumores pode promover a apresenta-ção do antígeno por ativação ou estimulação das células imunes acessóriase efetoras [Chada e outros, Mol. Ther., 10(6):1085-95 (2004)].

Um grande acervo de dados demonstra que a superexpressãodo gene IL-24, usando os vetores de plasmídios ou um adenovírus defeituo-so de replicação, resulta na supressão do crescimento e na indução da a-poptose através da ativação das vias de sinalização intracelulares em umaampla faixa de células de câncer. Este tipo de transferência de gene exibetoxicidade mínima sobre as células normais, ao mesmo tempo induzindo aapoptose potente em uma variedade de células de câncer [Sieger e outros,Mol. Ther., 9(3):355-67 (2004)]. Um ensaio clínico de escalação de dose defase I, onde as construções adenovirais que expressam a IL-24 foram admi-nistradas a 22 pacientes com câncer avançado, resultou na expressão da IL-24, na indução da apoptose em todos os tumores e os pacientes mostraramaumentos nas células T CD3+CD8+ após o tratamento. [Tong e outros, Mol.Ther., 11(1): 160-72 (2005)]. Diferentes estudos de transferência de genes daIL-24 observaram que os tumores eram menores e pareciam menos vascula-rizados comparados aos tumores de controle, o que indica atividade antian-giogênica da IL-24 [Saeki e outros, Oncogene, 21(29): 4558-66 (2002)].Quando usando adenovírus mda-7 (Ad-mda7), é para ser observado queexistem desvantagens potenciais para a sua aplicação em uma indicaçãoclínica: em primeiro lugar, não é prática a transdução ex vivo das células decâncer humanas obtidas de pacientes com câncer com Ad-Mda7, seguidapor introdução novamente nos pacientes com câncer; em segundo lugar, aadministração intratumoral de Ad-mda7 para gerar uma resposta imune anti-tumor potente é aplicável somente aos tumores localizados e não para ostumores disseminados. Assim, abordagens alternativas necessitam ser de-senvolvidas [Miyahara e outros, Câncer Gene Ther. 2006].

O fator estimulador de colônias de granulócitos-macrófagos(GM-CSF) é uma proteína de 141 aminoácidos (camundongo)/144 aminoá-cidos (ser humano) contendo uma seqüência de secreção de 17 aminoáci-dos. O peso molecular aparente da proteína glicosilada madura é 14-33kDa, que é muito resistente às condições de desnaturação e proteolíticas. Asatividades in vivo do GM-CSF são mediadas por ligação a receptores de al-tas afinidades que compreendem uma cadeia a específica para o GM-CSF e,para os seres humanos, uma subunidade β de transdução de sinal que écompartilhada com a IL-3 e os receptores de IL-5 [Joost J. Oppenheim e ou-tros, Cytokine Reference, 899-908, 2002].

O GM-CSF é um regulador principal da linhagem de granulócitose macrófagos. Ele estimula a sobrevivência, a proliferação e a diferenciaçãodas células formadoras de colônias hematopoéticas das linhagens de neu-trófilos, macrófagos e eosinófilos. Em adição, ele mantém a sobrevivênciadas células formadoras de colônicas hematopoéticas das linhagens de célu-las megacariocíticas e eritróides [Joost J. Oppenheim e outros, Cytokine Re-ference, 899-908, 2002]. Ele também é um imunoestimulador potente comefeitos pleiotrópicos, incluindo o aumento da apresentação de Ag em umavariedade de células, a expressão aumentada do MHC classe Il sobre mo-nócitos e a amplificação da proliferação das células T [Fischer e outros, J.Immunol., 141(11):3882-8 (1988), Smith e outros, J. Immunol., 144(10):3829-34 (1990), Morrissey e outros, J. Immunol., 139(4):1113-9 (1987)].

Na patologia, a superexpressão do GM-CSF pode resultar emreações inflamatórias (por exemplo, artrite reumatóide), choque tóxico, ce-gueira e auto-imunidade, ao mesmo tempo em que os níveis subfisiológicospodem estar envolvidos em alguns casos de proteinose alveolar. A proteino-se alveolar é uma doença do pulmão fatal onde as proteínas tensoativas a-cumulam-se no pulmão devido a um defeito na depuração mediada por ma-crófagos [Joost J. Oppenheim e outros, Cytokine Reference; 899-908, 2002].

Em modelos de animais, a vacinação de camundongos contendoo melanoma B16 com células de tumor irradiadas adicionais que expressamo fator estimulador de colônias de granulócitos-macrófagos (GM-CSF) esti-mulou uma imunidade antitumor potente, de longa duração e específica, poraumento da imunogenicidade dos tumores [Dranoff e outros, Proc. Natl. A-cad. Sei. U.S.A., 90(8):3539-43 (1993)]. Adicionalmente, o GM-CSF é am-plamente usado em oncologia para reduzir a neutropenia relacionada à qui-mioterapia, uma redução de neutrófilos causada por fármacos quimiotera-pêuticos [Danova e outros, Haematologica, 82(5):622-9 (1997)], [Vose e ou-tros, J. Clin. Oncol., 13(4): 1023-35 (1995)]. Há um limiar acima do qual umavacina à base de GM-CSF não somente perde a sua eficácia, como, de mo-do mais importante, resulta em imunossupressão substancial in vivo. Os e-feitos duplos do GM-CSF são mediados pela concentração sistêmica, e nãopela local, desta citocina [Serafini e outros, Câncer Res., 64(17):6337-43(2004)]. Diversos eventos adversos são vistos em doses de 16 μg/kg por diapara os seres humanos [Joost J. Oppenheim e outros, Cytokine Reference;899-908 (2002)].

As fibronectinas são glicoproteínas adesivas de altos pesos mo-leculares, presentes, na forma solúvel, no plasma e em outros fluidos corpó-reos e, na forma insolúvel, na matriz extracelular. O EDB é um domínio dehomologia do tipo Ill de 91 aminoácidos, que é inserido na molécula de fi-bronectina por um mecanismo de remoção alternativa no nível do transcritoprimário sempre que ocorrer a remodelagem do tecido [Zardi e outros, EmboJ. 6(8): 2337-42 (1987)].

O EDB é essencialmente indetectável nos tecidos adultos sau-dáveis. A sua expressão está fortemente associada com a remodelagem damatriz extracelular e a angiogênese. O domínio é abundante em muitos tu-mores agressivos e, dependendo do tipo de tumor, mostra padrões estro-mais de expressão predominantemente vasculares ou difusos [Carnemolla eoutros, J. Cell Biol. 108(3): 1139-48 (1989)]. Apesar de sua expressão muitorestrita nos tecidos normais e de sua forte expressão em muitos tumoressólidos, a função do EDB não parece ser indispensável, porque os camun-dongos que não têm o exon de EDB desenvolvem-se normalmente, são fér-teis e curam os fragmentos ósseos. Além disso, os camundongos "nocautes"duplos que não têm o exon de EDB e p53 não mostraram qualquer diferençana duração da sobrevivência em comparação com os animais que expres-sam o EDB [Fukuda e outros, Câncer Res 62(19): 5603-10 (2002)].

Porque a seqüência de EDB é idêntica no camundongo, no rato,no coelho, no cão, no macaco e no homem, não tinha sido ainda possívelproduzir anticorpos contra este domínio por tecnologia de hibridoma, devidoà tolerância natural. Alguns anos atrás, os fragmentos de anticorpos scFv dealtas afinidades (L19) contra o EDB foram isolados por tecnologia de exposi-ção em fago [Carnemolla e outros, Int. J. Câncer 68(3): 397-405 (1996); Nerie col, Nat. Biotechnol. 15(12): 1271-5. (1997); Pini e outros, J. Biol. Chem.273(34): 21769-76 (1998)]. O L19 é capaz de tingir os vasos sangüíneos dotumor em uma ampla faixa de modelos experimentais de tumor e sobre sec-ções de tumores humanos e outros distúrbios angiogênicos [Carnemolla eoutros, J. Cell biol. 108(3): 1139-48 (1989); Kaczmarek e outros, Int. J. Cân-cer 59(1): 11-6 (1994); Berndt e outros, HistoChem. Cell Biol. 109(3): 249-55(1998)]. Castellani e outros mostraram que o L19 tinge os vasos sangüíneosdo tumor nos astrocitomas graus IlI-IV, porém menos do que 10% dos vasosnos astrocitomas graus I-II, sugerindo que a expressão do EDB nestas le-sões poderia ser usada para a graduação dos tumores [Castellani e outros,Am. J. Pathol. 161(5): 1695-700 (2002)].

Devido à conservação do antígeno, o desempenho de alveja-mento do L19 poderia ser investigado em modelos de animais singênicosimunocompetentes. Os estudos de biodistribuição com diferentes formatosde anticorpos radiomarcados (scFv, proteína imuno pequena/SIP e IgG)mostraram um acúmulo preferencial de até 20 % de dose injetada por gramade tecido (% de Dl/g) de L19 no local do tumor [Borsi e outros, Blood102(13): 4384-92 (2003)]. Os primeiros estudos de imunocintigrafia em paci-entes humanos tendo câncer com o fragmento de anticorpo biespecífico("diacorpo") L19 marcado com 123I confirmaram que o anticorpo também Io-caliza para tumores sólidos humanos e metástases [Santimaria e outros, Clin.Câncer Res. 9(2): 571-9 (2003)].

O domínio EDB de fibronectina é um marcador de boa qualidadeda angiogênese, o qual é superexpresso em uma variedade de tumores sóli-dos (por exemplo, carcinoma de célula renal, carcinoma colorretal, carcino-ma hepatocelular, astrocitomas de altos graus, tumores da cabeça e do pes-coço, câncer da bexiga, etc.), porém é virtualmente indetectável nos tecidosadultos normais (exceção feita para o endométrio na fase proliferativa e al-guns vasos nos ovários). Entretanto, o EDB é somente fracamente expressona maioria das formas de câncer de mama, câncer de próstata e alguns ti-pos de câncer de pulmão, assim estimulando a pesquisa por novos antíge-nos de tumores vasculares, os quais poderiam ser usados para a distribui-ção alvejada, mediada por anticorpos, de citocinas terapêuticas para estasneoplasias.

Além do EDB, os domínios extracelulares da tenascina oncofetaltêm sido estabelecidos como um alvo interessante na terapia. As isoformasde remoção da tenascina-C são consideradas alvos para as estratégias te-rapêuticas à base de anticorpos, particularmente para aquelas classes detumores nas quais podem ser detectados baixos níveis de EDB. A tenascina-C é uma glicoproteína da matriz extracelular. Ela compreende diversas repe-tições de homologia do tipo 3 de fibronectina que podem ser incluídas ouomitidas no transcrito primário por remoção alternativa, resultando em iso-formas pequenas e grandes que têm funções biológicas distintas. Embora aisoforma pequena seja expressa em diversos tecidos, a isoforma grande detenascina-C exibe um padrão de expressão mais restrito. Ela é virtualmenteindetectável em tecidos adultos saudáveis, porém é expressa durante a em-briogênese e é novamente expressa em tecidos adultos sofrendo remodela-gem, incluindo a neoplasia. A sua expressão está localizada em torno deestruturas vasculares no estroma do tumor de uma variedade de tumoresdiferentes, incluindo o carcinoma da mama, o carcinoma de célula escamosaoral, o câncer do pulmão, o adenocarcinoma prostático, o câncer colorretalou o astrocitoma e outros tumores do cérebro. Tradicionalmente, a comuni-dade científica referia-se à isoforma grande de tenascina-C para as molécu-las de tenascina, as quais compreenderiam putativamente todos os domíniosalternativamente removidos, e à isoforma pequena da tenascina-C sempreque estes domínios estavam ausentes. Carnemolla e colegas relataram queo domínio C alternativamente removido da tenascina-C exibia um padrãomais restrito de expressão, quando comparado aos outros domínios alterna-tivamente j;emovidos. Permaneceu confuso naquela ocasião se os outrosdomínios alternativamente removidos da tenascina-C também exibiam incor-poração restrita na molécula de tenascina e se seria mais apropriado avaliaros domínios removidos individuais separadamente como alvos para estraté-gias terapêuticas à base de anticorpos. Os anticorpos radiomarcados espe-cíficos para os domínios A1 e D da tenascina-C foram empregados com êxi-to na clínica para o tratamento de glioma e linfoma. Além disso, o alvejamen-to do tumor eficiente pelos anticorpos antitenascina tem sido demonstradoclinicamente usando uma abordagem pré-alvejamento à base de avidi-na/biotina ou, mais recentemente, com anticorpos monoclonais específicospara a isoforma pequena da tenascina-C. Entretanto, todos estes anticorpossão de origem de murino e, portanto, são mais provavelmente não adequa-dos para a administração repetitiva aos pacientes humanos e o desenvolvi-mento de substâncias biofarmacêuticas. Por estas razões, os anticorposhumanos específicos para os domínios A1, C e D da tenascina-C foram ge-rados usando a tecnologia de fago de anticorpo [PCT/EP2005/011624 dePhilogen S.p.A].

Conforme demonstrado acima, há ainda uma alta incerteza en-volvida no campo em relação à utilidade terapêutica das citocinas em geral,em particular à utilidade terapêutica das citocinas para o tratamento de tu-mores e/ou doenças inflamatórias. Embora a técnica anterior esporadica-mente indique que algumas proteínas de fusão específicas de anticorpos-citocinas poderiam permitir o tratamento terapêutico direcionado para o alvo,não há ainda nenhuma expectativa razoável de sucesso porque os resulta-dos não são previsíveis. A pessoa versada é deixada imaginando com rela-ção à natureza de uma citocina terapeuticamente útil e ao efeito que a suacombinação com um anticorpo ou seu derivado teria. Portanto, a pessoaversada requer habilidade inventiva para selecionar a combinação certa dasmuitas citocinas conhecidas e dos muitos anticorpos de alvejamento conhe-cidos porque o resultado não pode ser previsto.

É o objetivo da presente invenção proporcionar novas substân-cias terapêuticas para o tratamento de câncer e/ou doenças inflamatórias,em particular para o tratamento de psoríase, aterosclerose e artrite, quepermitam a distribuição alvejada da substância terapêutica para os locais dadoença, o que, por sua vez, permite a concentração do medicamento e aredução da carga tóxica para os tecidos saudáveis restantes.

Descrição da invenção

Foi surpreendentemente verificado que a combinação específicade um anticorpo que alveja o domínio extracelular da fibronectina oncofetal(ED-B) ou os domínios extracelulares da tenascina oncofetal, fundido a umacitocina selecionada a partir do grupo que consiste em (a) IL-10, (b) IL15, (c)IL-24 e (d) GM-CSF, proporciona uma nova proteína de fusão terapeutica-mente efetiva.

Portanto, o objetivo acima mencionado é resolvido proporcio-nando uma proteína de fusão compreendendo:

um anticorpo, seu fragmento funcional ou derivado funcional tendo umaafinidade de ligação específica ao domínio extracelular da fibronectina onco-fetal (ED-B) ou a pelo menos um dos domínios extracelulares da tenascinaoncofetal, fundido a

uma citocina selecionada a partir do grupo que consiste em (a) IL-10, (b)IL15, (c) IL-24 e (d) GM-CSF, seus fragmentos funcionais e derivados fun-cionais.

O termo "afinidade de ligação específica", como é usado nestedocumento, é para ser entendido significar que o anticorpo, o fragmento fun-cional ou o derivado funcional dele especificamente se liga à proteína-alvocom afinidade significativa e não a outras proteínas com afinidade significati-va que estão também localizadas no mesmo ambiente, isto é, o sistema deensaio ou o corpo, o órgão, etc., in vivo ou in vitro, e sob as mesmas condi-ções, por exemplo, pH, temperatura, tampão, etc. Em geral, uma especifici-dade de ligação é testada efetuando-se um ensaio de ligação com uma mo-lécula-alvo específica e com um grande número de substâncias não relacio-nadas. Além disso, os testes funcionais, a imunoistoquímica e os outros pro-cedimentos podem ser usados para avaliar a especificidade de ligação deum anticorpo especificado.

Para muitos bioensaios (por exemplo, ELISA) baseados em anti-corpos, fragmentos funcionais ou derivados funcionais deles capazes de li-gação específica, uma constante de dissociação de 1 micromolar ou menosé requerida para produzir sinais de ligação detectáveis, os quais são fre-qüentemente associados com um modo de ligação específico. De preferên-cia, os anticorpos, os fragmentos funcionais ou os derivados funcionais parauso na presente invenção têm uma afinidade de ligação específica corres-pondendo a uma constante de dissociação de menos do que cerca de 5,preferivelmente cerca de 1 ou menos micromolar (μΜ), mais preferivelmentecerca de 0,1 μΜ ou menos, mais preferivelmente ainda cerca de 1 nM oumenos ou mesmo 1 pM ou menos.

Os anticorpos, os fragmentos funcionais e os derivados funcio-nais deles, para praticar a invenção, estão rotineiramente disponíveis portecnologia de hibridoma (Kohler e Milstein, Nature 256, 495-497, 1975), ex-posição de anticorpo em fago (Winter e outros, Annu. Rev. Immunol. 12,433-455, 1994), exposição em ribossomo (Schaffitzel e outros, J. Immunol.Methods, 231, 119-135, 1999) e triagem em filtro de colônia iterativa (Gio-vannoni e outros, Nucleic Acids Res. 29, E27, 2001) assim que o antígeno-alvo estiver disponível. As proteases típicas para fragmentar os anticorposem produtos funcionais são bastante conhecidas. Outras técnicas de frag-mentação podem ser usadas também, desde que o fragmento resultantetenha uma alta afinidade específica e, preferivelmente uma constante dedissociação na faixa de micromolares a picomolares.

O desempenho de alvejamento do tumor vascular dos fragmen-tos de anticorpos no formato scFv tem sido mostrado para depender cruci-almente (pelo menos para a constante de dissociação de micromolares apicomolares) da afinidade do anticorpo pelo alvo. Por exemplo, o fragmentode anticorpo scFv(L19) de alta afinidade, específico para o domínio ED-B dafibronectina, um marcador da angiogênese, foi mostrado alvejar a neovascu-Iatura do tumor mais eficientemente do que o fragmento de anticorpo paren-tal scFv(E1), com uma afinidade menor pelo antígeno [Viti e outros, CâncerRes. 15;59(2):347-52 (1999)]. Em certos casos, a avidez da ligação (por e-xemplo, associada com certos formatos de anticorpos homobivalentes) podecompensar uma afinidade de ligação monomérica moderada [Nielsen e ou-tros, Câncer Res., 60(22):6434-40 (2000)].

Um fragmento de anticorpo muito conveniente para aplicaçõesde alvejamento é o fragmento Fv de cadeia individual, no qual um domíniopesado variável e um leve variável são unidos conjuntamente por um Iigadorde polipeptídeo. Os outros fragmentos de anticorpos para aplicações de al-vejamento vascular incluem os fragmentos Fab, os fragmentos Fab2, os mi-nianticorpos (também chamados proteínas imunes pequenas), as fusões descFv-scFv em série, bem como as fusões de scFv com domínios adequados(por exemplo, com a porção Fc de uma imunoglobulina). Quanto a uma revi-são sobre certos formatos de anticorpos, vide Holliger P, Hudson PJ.; Engi-neered antibody fragments and the rise of single domains. Nat Biotechnol.set. de 2005, 23(9): 1126-36.).

O termo "derivado funcional" de um anticorpo para uso na pre-sente invenção é pretendido incluir qualquer anticorpo ou fragmento deleque tenha sido química ou geneticamente modificado em sua seqüência deaminoácidos, por exemplo, por adição, substituição e/ou remoção de resí-duo(s) de aminoácido(s) e/ou tenha sido quimicamente modificado em pelomenos um de seus átomos e/ou grupos químicos funcionais, por exemplo,por adições, remoções, rearranjo, oxidação, redução, etc., desde que o deri-vado tenha substancialmente a mesma afinidade de ligação que ao seu an-tígeno original e, preferivelmente, tenha uma constante de dissociação nafaixa de micro-, nano- ou picomolares. Um derivado mais preferido dos anti-corpos para uso na presente invenção é uma proteína de fusão de anticorpoque será definida em mais detalhe abaixo.

Em uma modalidade preferida, o anticorpo, o fragmento ou oderivado funcional dele, para uso na invenção, é um que é selecionado apartir do grupo consistindo em anticorpos policlonais, anticorpos monoclo-nais, anticorpos quiméricos, anticorpos humanizados, anticorpos com CDRenxertada, fragmentos Fv, fragmentos Fab e fragmentos Fab2 e proteínas deligação similares aos anticorpos, por exemplo, afilinas, anticalinas e aptâme-ros.

Quanto a uma revisão das proteínas de ligação similares aosanticorpos, vide Binz e outros sobre proteínas de ligação de engenharia apartir de domínios que não de imunoglobulina em Nature Biotechnology. vol.23, N2 10, outubro de 2005, 12571268. O termo "aptâmero" descreve ácidosnucléicos que se ligam a um polipeptídeo com alta afinidade. Os aptâmerospodem ser isolados a partir de uma grande união de diferentes moléculas deRNA de fitas simples por métodos de seleção, tais como SELEX (vide, porexemplo, Jayasena, Clin. Chem., 45, págs. 1628 - 1650, (1999); Klug e Fa-mulok, M. Mol. Biol. Rep., 20, págs. 97 - 107 (1994); US 5.582.981). Os ap-tâmeros podem também ser sintetizados e selecionados na sua forma espe-cular, por exemplo, como o L-ribonucleotídeo (Noite e outros, Nat. Biotech-nol., 14, págs.1116 — 1119, (1996); Klussmann e outros, Nat. Biotechnol.,14, págs. 1112 - 1115, (1996)). As formas isoladas neste modo têm a vanta-gem que elas não são degradadas por ribonucleases de ocorrência natural e,portanto, têm uma estabilidade maior.

Uma outra proteína de ligação similar ao anticorpo e alternativaaos anticorpos clássicos são os assim chamados "andaimes protéicos", porexemplo, anticalinas, que são baseados na Iipocalina (Beste e outros, Proc.Natl. Acad. Sei. USA, 96, págs. 1898 - 1903, (1999)). Os sítios de ligação aoIigante naturais das lipocalinas, por exemplo, da proteína de ligação ao reti-nol ou proteína de ligação à bilina, podem ser alterados, por exemplo, em-pregando uma abordagem de "projeto de proteína com bi nato rio", e em ummodo tal que eles ligam haptenos selecionados (Skerra, BioChem. Biophys.Acta, 1482, págs. 337 - 350, (2000)). Quanto aos outros arcabouços protéi-cos, sabe-se também que eles são alternativos para os anticorpos (Skerra, J.Mol. Recognit, 13, págs. 167 - 287, (2000)). (Hey, Trends in Biotechnology,23, págs. 514-522, (2005)).

De acordo com a invenção, o termo derivado de anticorpo fun-cional é pretendido incluir as ditas alternativas derivadas de proteínas paraos anticorpos, isto é, as proteínas de ligação similares aos anticorpos, porexemplo, afilinas, anticalinas e aptâmeros que reconhecem especificamentepelo menos um domínio extracelular de fibronectina oncofetal ou tenascinaoncofetal.

Em resumo, os termos anticorpo, fragmento funcional e derivadofuncional dele significam todas as substâncias que têm afinidade de ligaçãoespecífica igual ou similar a qualquer um dos domínios extracelulares dafibronectina oncofetal ou da tenascina oncofetal como um anticorpo comple-to tendo afinidade de ligação específica a estes alvos.

Para a tenascina, há diversas isoformas disponíveis, por exem-plo, a tenascina-C, a tenascina-R e a tenascina-X. Para praticar a presenteinvenção, os domínios extracelulares da grande isoforma da tenascina-C sãomais preferidos como alvos específicos para o anticorpo, o seu fragmentofuncional ou derivado funcional que é parte das proteínas de fusão da pre-sente invenção.

Em uma modalidade preferida, o anticorpo, o seu fragmento fun-cional ou derivado funcional, que é parte de uma proteína de fusão da inven-ção, tem uma afinidade de ligação específica a pelo menos um dos domíniosextracelulares da tenascina-C oncofetal, mais preferivelmente a pelo menosum dos domínios extracelulares da isoforma grande da tenascina-C.

Os domínios extracelulares da tenascina-C são designados do-mínios A1, A2, A3, A4, B, C e D. Já existem diversos anticorpos disponíveisque são direcionados contra um destes domínios (vide Siri A. e outros, Diffe-rent susceptibility of small and Iarge human tenascin-C isoforms to degrada-tion by matrix metalloproteinases. J. Biol. Chem., 14 de abril de 1995,270(15):8650-4; Carnemolla B. e outros, Identification of a glioblastoma-associated tenascin-C isoform by a high affinity recombinant antibody. Am. J.Pathol. maio de 1999, 154(5): 1345-52; Silacci M. e col, Human monoclonalantibodies to domain C of tenascin-C selectively target solid tumors in vivo.Protein Eng. Des. Sei. out. de 2006, 19(10):471-8).

Em uma modalidade mais preferida, a presente invenção refere-se às proteínas de fusão da invenção compreendendo um anticorpo, seufragmento funcional ou derivado funcional tendo afinidade de ligação especí-fica a qualquer um dos domínios extracelulares da tenascina-C, isto é, A1,A2, A3, A4, B1 C e D, preferivelmente a qualquer um dos domínios A1, C ouD, mais preferivelmente ao domínio C da tenascina-C.

O termo "proteína de fusão", conforme é usado no contexto dapresente invenção, é pretendido incluir todos os conjugados, onde o dito an-ticorpo, fragmento ou derivado funcional está de certo modo ligado a umacitocina selecionada a partir do grupo que consiste em (a) IL-10, (b) IL15, (c)IL-24 e (d) GM-CSF, seus fragmentos funcionais e derivados funcionais, a-través de, por exemplo, ligações covalentes e/ou não-covalentes, por exem-plo, iônicas. O termo inclui ambos os arranjos de ligação, isto é, anticorpo -citocina ou citocina - anticorpo.

Os termos fragmento funcional e derivado funcional com relaçãoàs ditas citocinas são para serem interpretados essencialmente em analogiaaos mesmos termos para os anticorpos. Os fragmentos e os derivados fun-cionais das citocinas são aqueles que essencialmente têm a mesma fun-ção/atividade fisiológica que as citocinas de ocorrência natural. Por exemplo,os ensaios preferidos para determinar a função/atividade das citocinas, dosfragmentos e dos derivados delas, para preparar as proteínas de fusão deacordo com a presente invenção, são:

A atividade/função da citocina de IL-10 ou de seus derivadosfuncionais pode ser determinada efetuando-se um ensaio de proliferaçãosobre os mastócitos MC/9 de murinos. Por exemplo, as ditas células sãocultivadas em meio DMEM contendo 10% de FBS, 10% de T-Stim de Rato(Becton Dickinson), 1% de antibiótico, glutamina a 2 mM e β-mercaptoetanola 0,05 mM [Thompson-Snipes e outros, J. Exp. Med. 173(2): 507-10 (1991)].Para preparar o ensaio, 100 μΙ de meio sem T-Stim de Rato são colocadosem cada cavidade de uma placa de cultura de tecido de fundo plano de 96cavidades, com ligação ultra baixa (Costar® 3474), exceto pela primeira filei-ra. 200 μΙ de IL-10 humana recombinante (rhu) (100 ng/ml), ou uma quanti-dade molar equivalente da amostra a ser testada, são colocadas nas cavi-dades na primeira fileira. As diluições em série a 1:2 através das fileiras daplaca de microtítulo são preparadas por transferência de 100 μΙ da amostrapara a cavidade seguinte na fileira e mistura começando a partir da primeirafileira. Uma fileira das cavidades contém somente 100 μΙ de meio de ensaio(sem citocina) como um controle negativo. As células MC/9 são então conta-das e diluídas até uma concentração de 5 χ 105 células/ml. Para remover acitocina residual, as células são lavadas duas vezes com meio de culturasem T-Stim de Rato por centrifugação das células, aspiração do meio e re-suspensão delas novamente em meio novo. 100 μΙ desta suspensão celularsão adicionadas nas cavidades da placa de 96 cavidades (5 χ 104 célu-las/cavidade). Após 48 - 72 horas, 20 μΙ de solução de MTT a 5 mg/ml (emPBS, filtrada), um substrato para a desidrogenase mitocondrial, são adicio-nados às células. 4 horas mais tarde, a placa é centrifugada a 2400 g por 10minutos. O meio é aspirado e as células são Iisadas por adição de 100 μΙ deDMSO (Fluka 41641). Finalmente, as placas são lidas a 570 nm. Cada con-centração é efetuada em triplicata.

Por exemplo, a atividade/função da citocina de hulL15 ou deseus derivados funcionais pode ser determinada (manual de Biosource Cy-tokine Facts) efetuando-se um ensaio sobre a linhagem de linfócitos T cito-tóxicos 2 (CTLL-2). As ditas células são desenvolvidas em meio RPMI con-tendo 10% de FBS, 1% de antibióticos, glutamina a 2 mM (100x), piruvato desódio a 1 mM (100x) e 2-mercatoetanol a 50 μηπ (1000x). Adicionalmente, ascélulas CTLL-2 requerem 20 U/ml de hulL-2 (Roche 1 011 456). Aproxima-damente uma semana antes do início do ensaio, as células devem ser suba-limentadas e recebem somente 10 U/ml de hulL-2. Para a preparação doensaio, 50 μl do meio de ensaio de CTLL-2 são adicionados a cada cavidadede uma placa de cultura de tecido de fundo plano de 96 cavidades com liga-ção ultra baixa (Costar® 3474), exceto pela primeira fileira. 100 μΙ de padrãode IL-15 humana recombinante (10 ng/ml), ou uma quantidade equimolardaamostra de teste, são colocados no primeira cavidade. As diluições em sériea 1:2 são feitas por transferência de 50 μΙ para a cavidade seguinte na fileiracomeçando na primeira fileira. Uma fileira das cavidades contém somente 50μΙ de meio de ensaio (sem rhulL-15) como um controle negativo. As célulasCTLL-2 são contadas e diluídas até uma concentração de 5 χ 105 células/ml.Para remover a hulL-2 residual, as células são lavadas como se segue: apóscentrifugar as células 5 minutos a 1100 rpm, o meio é aspirado e os precipi-tados de células são novamente suspensos no meio novo. Este procedimen-to de lavagem é repetido duas vezes. 50 μΙ da suspensão celular são adicio-nados a cada cavidade da placa de microtítulos (5 χ 104 células/cavidade) ea placa é incubada a 37-C e 5% de CO2. As medições são feitas em triplica-ta. Após 72 horas, 20 μΙ de solução de MTT a 5 mg/ml (Sigma 206-069-5)(em PBS) são adicionados a cada cavidade. 2 a 4 horas mais tarde, a placaé centrifugada a 2400 g por 10 minutos. O meio é aspirado e as células sãolisadas por adição de 100 μΙ de DMSO (Fluka 41641). Então, a placa é lida a570 nm.

Por exemplo, para testar a função/atividade biológica da IL-24 oude um derivado funcional dela como uma citocina, a sua indução da secre-ção de citocinas secundárias (IL-26, TNFaIfa e IFNgama) pela PBMC podeser examinada [Caudell e outros, J. Immunol., 168(12):6041-6 (2002)]. A de-tecção das citocinas secundárias pode ser feita por ELISA(s) específico(s).

Uma outra opção é testar a capacidade da IL-24, ou de um deri-vado funcional dela, de induzir seletivamente a apoptose em células de cân-cer [Sauane e outros, Câncer Biol. Then, 3(8):739-51 (2004)]. Para efetuaristo, podem ser usadas células de câncer como DU-145, PC-3, LNCaP,MDA-MB-231 e outras. As células são preparadas em placas de 96 cavida-des e deixadas unir por 12 h, antes do tratamento com IL-24 (concentraçõesdiferentes, normalmente cerca de 25-50 μg/ml). As células são incubadaspor 5-7 dias. O desenvolvimento das células e os números de células viáveissão monitorados por coloração com MTT. A absorbância resultante medida a570 nm é diretamente proporcional ao número de células viáveis.

Por exemplo, a atividade/função da citocina de GM-CSF, ou deum derivado funcional dele, pode ser determinada (manual de BiosourceCytokine Facts) efetuando-se um ensaio de proliferação sobre os mastócitosde murinos MC/9. As ditas células são cultivadas em meio DMEM contendo10% de FBS, 10% de T-Stim de Rato (Becton Dickinson), 1% de antibiótico,glutamina a 2 mM e β-mercaptoetanol a 0,05 mM. O meio RPMI contendo10% de FBS, 1% de antibióticos, glutamina a 2 mM e β-mercaptoetanol a0,05 M é usado como meio de ensaio. Para preparar o ensaio, 100 μΙ demeio de ensaio são colocados em cada cavidade de uma placa de cultura detecido de fundo plano de 96 cavidades, com ligação ultra baixa (Costar®3474), exceto pela primeira fileira. 200 μΙ de muGM-CSF recombinante (5ng/ml), ou uma quantidade molar equivalente da amostra, são colocadas nascavidades na primeira fileira. As diluições em série a 1:2 através das fileirasda placa de microtítulo são feitas por transferência de 100 μΙ da amostra pa-ra a cavidade seguinte na fileira e mistura começando a partir da primeirafileira. Uma fileira das cavidades contém somente 100 μΙ de meio de ensaio(sem GM-CSF) como um controle negativo. As células MC/9 são contadas ediluídas até uma concentração de 5 χ 104 células/ml. Para remover a citocinaresidual, as células são lavadas duas vezes com RPMI por centrifugaçãodas células, aspiração do meio e re-suspensão delas novamente em RPMInovo. 100 μl desta suspensão celular são adicionadas nas cavidades deuma placa de 96 cavidades (5 χ 103 células/cavidade), a qual já contém 100μl do meio correspondente enriquecido com a proteína de fusão de rmuGM-CSF ou GM-CSF. Após 48 - 72 horas, 20 μl de solução de MTT a 5 mg/ml(em PBS, filtrada), um substrato para a desidrogenase mitocondrial, são adi-cionados às células. 4 horas mais tarde, a placa é centrifugada a 2400 g por10 minutos. O meio é aspirado e as células são Iisadas por adição de 100 μlde DMSO (Fluka 41641). Finalmente, as placas são lidas a 570 nm. Cadaconcentração é testada em triplicata.Em uma modalidade preferida da invenção, a proteína de fusãode acordo com a invenção compreende o fragmento de anticorpo biespecífi-co ("diacorpo") scFv L19 (longo) tendo a seqüência de aminoácidos descritaem SEQ ID NO: 6.

Em uma outra modalidade preferida da invenção, a proteína defusão de acordo com a invenção compreende o fragmento de anticorpo bi-específico ("diacorpo") L19 (curto) tendo a seqüência de amino descrita emSEQ ID NO: 7.

Em uma modalidade preferida adicional da invenção, a proteínade fusão é uma onde o anticorpo, o fragmento funcional ou o derivado fun-cional dele tendo afinidade de ligação específica a pelo menos um dos do-mínios extracelulares da tenascina oncofetal é selecionado a partir do grupoque consiste em F16 (longo), F16 (curto), F16 (A34M) (longo), F16 (A34M)(curto), G11 (longo) e G11 (curto) tendo as seqüências de amino descritasem SEQ ID NO: 8 até 13, respectivamente.

Mais preferivelmente, a proteína de fusão de acordo com a in-venção é uma onde um membro do grupo que consiste em L19 (longo), L19(curto), F16 (longo), F16 (curto), F16 (A34M) (longo), F16 (A34M) (curto),G11 (longo) e G11 (curto) está fundido a uma citocina selecionada a partirdo grupo que consiste em GM-CSF, IL-10, IL15 e IL-24, seus fragmentosfuncionais e derivados funcionais.

Para todas as modalidades e aspectos da presente invenção,prefere-se que a citocina seja uma citocina de murino ou humana, preferi-velmente uma humana, seu fragmento funcional ou derivado funcional.

As proteínas de fusão de acordo com a invenção podem ser dis-postas de modo tal que a citocina, o fragmento funcional ou o derivado fun-cional dela esteja fundido de modo N-terminal ou C-terminal ao anticorpo, aofragmento funcional ou ao derivado funcional dele.

Foi surpreendentemente verificado que os derivados funcionaiscom Iigadores curtos de L19, F16 e G11 resultam em uma formação aumen-tada de fragmentos de anticorpo biespecífico fragmentos de anticorpo bi-específico ("diacorpos"), quando comparados às variantes de Iigadores Ion-gos. Além disso, foi surpreendentemente observado que as proteínas defusão compreendendo scFv F16 (longo ou curto) com uma mutação na posi-ção 34 na seqüência de aminoácidos (A->M) (SEQ ID NOS: 10 e 11) de-monstraram taxas de expressão muito maiores comparadas à seqüência descFv F16 regular.

Por causa das vantagens acima mencionadas das variantes cur-tas, estas proteínas de fusão de acordo com a invenção são preferidas, ondeo fragmento de anticorpo ou o seu derivado funcional é selecionado a partirdo grupo que consiste em L 19 (curto), F16 (curto), F16 (A34M) (curto) eG11 (curto).

As proteínas de fusão compreendendo a variante F16 (A34M)(longa ou curta) são mais preferidas e aquelas compreendendo a varianteF16 (A34M) curta são mais preferidas.

Na verdade, em um aspecto independente, a presente invençãorefere-se a uma proteína de fusão compreendendo:

(i) F16 (A34M) (curto ou longo, preferivelmente curto) tendo afi-nidade de ligação específica a pelo menos um dos domínios extracelularesda tenascina oncofetal, fundido a qualquer citocina, fragmentos funcionais ederivados funcionais dela.

Em uma modalidade preferida, as proteínas de fusão de acordocom a invenção são selecionadas a partir do grupo que consiste em L19-IL-10, IL15-L19, IL-24-L19, L19-GM-CSF, L19-IL15, IL24-L19.

Em uma outra modalidade preferida, as proteínas de fusão deacordo com a invenção são selecionadas a partir do grupo que consiste na-quelas tendo a seqüência de aminoácidos descrita em SEQ ID NO: 14-19.

Em um outro aspecto, a presente invenção refere-se ao uso deuma proteína de fusão de acordo com a invenção para a fabricação de ummedicamento.

Em uma modalidade preferida, a presente invenção refere-se aouso das proteínas de fusão acima mencionadas para o tratamento de câncerem um mamífero, preferivelmente em um ser humano.

Em uma outra modalidade preferida, a presente invenção refere-se ao uso das proteínas de fusão acima mencionadas para o tratamento dedoenças inflamatórias, preferivelmente das doenças inflamatórias crônicas,em um mamífero, preferivelmente em um ser humano.

De preferência, a doença inflamatória é selecionada a partir dogrupo que consiste em psoríase, ate rose Ie rose, artrite, preferivelmente artritereumatóide.

Um aspecto adicional da presente invenção refere-se a umacomposição farmacêutica compreendendo pelo menos uma proteína de fu-são da invenção e opcionalmente um excipiente farmaceuticamente aceitável.

As composições farmacêuticas da presente invenção tipicamen-te compreendem uma quantidade terapeuticamente efetiva de uma proteínade fusão de acordo com a invenção e opcionalmente substâncias auxiliares,tais como excipiente(s) farmaceuticamente aceitável(is). As ditas composi-ções farmacêuticas são preparadas em um modo bastante conhecido natécnica farmacêutica. Um veículo ou excipiente pode ser um material líquidoque pode servir como um veículo ou meio para o ingrediente ativo. Os veícu-los ou os excipientes adequados são bastante conhecidos na técnica e in-cluem, por exemplo, os estabilizantes, os antioxidantes, as substâncias regu-ladoras do pH, os excipientes de liberação controlada. A preparação farma-cêutica da invenção pode ser adaptada, por exemplo, para uso parenteral epode ser administrada ao paciente na forma de soluções ou similares.

Finalmente, um outro aspecto da presente invenção diz respeitoa um método de tratamento, onde uma quantidade efetiva de uma composi-ção farmacêutica é administrada a um paciente que necessita dela, preferi-velmente um paciente sofrendo de câncer e/ou doenças inflamatórias.

Ao efetuar o tratamento de um paciente que sofre das doençasou das condições descritas acima, uma proteína de fusão da presente in-venção pode ser administrada em qualquer forma ou modo que torne biodis-ponível o composto terapêutico em uma quantidade efetiva, incluindo as ro-tas orais ou parenterais. Por exemplo, as composições da presente invençãopodem ser administradas de modo subeutâneo, intramuscular, intravenoso esimilar. Alguém versado na técnica no campo de preparar formulações podeprontamente selecionar a forma e o modo adequados de administração, de-pendendo das características particulares do produto selecionado, da doen-ça ou da condição a ser tratada, do estágio da doença ou da condição e deoutras circunstâncias relevantes (vide, por exemplo, Remingtons Pharma-ceutical Sciences, Mack Publishing Co. (1990)). As composições da presen-te invenção podem ser administradas sozinhas ou na forma de uma prepa-ração farmacêutica em combinação com veículos ou excipientes farmaceuti-camente aceitáveis, cuja proporção e natureza são determinadas pela solu-bilidade e pelas propriedades químicas do produto selecionado, pela rota deadministração escolhida e pela prática farmacêutica padrão. Os produtos dapresente invenção, embora efetivos eles próprios, podem ser formulados eadministrados na forma de seus sais farmaceuticamente aceitáveis, tais co-mo os sais de adição de ácidos ou os sais de adição de bases, para propósi-tos de estabilidade, conveniência de cristalização, solubilidade aumentada esimilar.

Listagens das Seqüências

A SEQ ID NO: 1 mostra a seqüência de aminoácidos da IL-10humana; n- de acesso: P22301 (SwissProt); Vieira e outros, Proc. Natl. Acad.Sei. U.S.A. 88(4), 1172-1176 (1991).

MHSSALLCCLVLLTGVRASPGQGTQSENSCTHFPGNLPNMLRDLRDAFSRVKTFFQMKDQLDNLLLKESLLEDFKGYLGCQALSEMIQFYLEEVMPQAENQDPDIKAHVNSLGENLKTLRLRLRRCHRFLPCENKSKAVEQVKNAFNKLQEKGIYKAMSEFDIFINYIEAYMTMKIRN

A SEQ ID NO: 2 mostra a seqüência de aminoácidos da IL-15humana; ne de acesso: P40933 (SwissProt); Grabstein e outros, Science 264(5161), 965-968(1994).

NWVNVISDLKKIEDLIQSMHIDATLYTESDVHPSCKVTAMKCFLLELQVISLESGDASIHDTVENLIILANNSLSSNGNVTESGCKECEELEEKNIKEFLQSFVHIVQMFINTS

A SEQ ID NO: 3 mostra a seqüência de aminoácidos da IL-24humana; n2 de acesso: Q13007 (SwissProt); Jiang e outros, Oncogene 11(12), 2477-2486(1995).

AQGQEFHFGPCQVKGVVPQKLWEAFWAVKDTMQAQDNITSARLLQQEVLQNVSDAESCYLVHTLLEFYLKTVFKNYHNRTVEVRTLKSFSTLANNFVLIVSQLQPSQENEMFSIRDSAHRRFLLFRRAFKQLDVEAALTKALGEVDILLTWMQKFYKL

A SEQ ID NO: 4 mostra a seqüência de aminoácidos do GM-CSF humano; n2 de acesso: P04141 (SwissProt); Lee e outros, Proc. Natl.Acad. Sei. U.S.A. 82 (13), 4360-4364 (1985).

APARSPSPSTQPWEHVNAIQEARRLLNLSRDTAAEMNETVEVISEMFDLQEPTCLQTRLELYKQGLRGSLTKLKGPLTMMASHYKQHCPPTPETSCATQIITFESFKENLKDFLLVIPFDCWEPVQE

A SEQ ID NO: 5 mostra a seqüência de aminoácidos do GM-CSF de murino; ns de acesso: P01587 (SwissProt); Miyatake e outros, EM-BO J. 4 (10), 2561-2568 (1985).

APTRSPITVTRPWKHVEAIKEALNLLDDMPVTLNEEVEVVSNEFSFKKLTCVQTRLKIFEQGLRGNFTKLKGALNMTASYYQTYCPPTPETDCETQVTTYADFIDSLKTFLTDIPFECKKPVQK

A SEQ ID NO: 6 mostra a seqüência de aminoácidos do L19(longo); Viti e outros, Câncer Res., 59(2): 347-52 (1999).EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSFSMSWVRQAPGKGLEWVSSISGSSGTTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKPFPYFDYWGQGTLVTVSSGDGSSGGSGGASTGEIVLTQSPGTLSLSPGERATLSCRASQSVSSSYLAWYQQKPGQAPRLLIYYASSRATGIPDRFSGSGSGTDFTLTISRLEPEDFAVYYCQQTGRIPPTFGQGTKVEIK

(As letras em negrito indicam o Iigador de 14 aminoácidos)

A SEQ ID NO: 7 mostra a seqüência de aminoácidos do L19(curto) (ainda não publicada).

EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSFSMSWVRQAPGKGLEWVSSISGSSGTTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKPFPYFDYWGQGTLVTVSSGSSGGEIVLTQSPGTLSLSPGERATLSCRASQSVSSSFLA WYQQKPGQAPRLLIYYASSRATGIPDRFSGSGSGTDFTLTISRLEPED FA VYYCQQTG RIPPTFGQGTKVEIK(As letras em negrito indicam o Iigador de 5 aminoácidos.)

A SEQ ID NO: 8 mostra a seqüência de aminoácidos do F16(longo).

EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSRYGASWVRQAPGKGLEWVSAISGSGGSTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKAHNAFDYWGQGTLVTVSRGGGGSGGGGSGGGGSSELTQDPAVSVALGQTVRITCQGDSLRSYYASWYQQKPGQAPVLVIYGKNNRPSGIPDRFSGSSSGNTASLTITGAQAEDEADYYCNSSVYTMPPVVFGGGTKLTVLG

A SEQ ID NO: 9 mostra a seqüência de aminoácidos do F16(curto).

EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSRYGASWVRQAPGKGLEWVS

AISGSGGSTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKAH

NAFDYWGQGTLVTVSRGSSGGSSELTQDPAVSVALGQTVRITCQGDSLRS

YYASWYQQKPGQAPVLVIYGKNNRPSGIPDRFSGSSSGNTASLTITGAQAE

DEADYYCNSSVYTMPPVVFGGGTKLTVLG

(As letras em negrito indicam o Iigador de 5 aminoácidos.)

A SEQ ID NO: 10 mostra a seqüência de aminoácidos doF16(A34M) (longo).

EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSRYGMSWVRQAPGKGLEWVS

AISGSGGSTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKAH

NAFDYWGQGTLVTVSRGGGGSGGGGSGGGGSSELTQDPAVSVALGQTV

RITCQGDSLRSYYASWYQQKPGQAPVLVIYGKNNRPSGIPDRFSGSSSGN

TASLTITGAQAEDEADYYCNSSVYTMPPVVFGGGTKLTVLG

(O aminoácido sublinhado indica a substituição de A por M.)

A SEQ ID NO: 11 mostra a seqüência de aminoácidos doF16(A34M) (curto).

EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSRYGMSWVRQAPGKGLEWVSAISGSGGSTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKAHNAFDYWGQGTLVTVSRGSSGGSSELTQDPAVSVALGQTVRITCQGDSLRSYYASWYQQKPGQAPVLVIYGKNNRPSGIPDRFSGSSSGNTASLTITGAQAEDEADYYCNSSVYTMPPVVFGGGTKLTVLG

(O aminoácido sublinhado indica a substituição de A por M. As letras em ne-grito indicam o Iigador de 5 aminoácidos.)

A SEQ ID NQ: 12 mostra a seqüência de aminoácidos do G11(longo).

EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSGSRMGWVRQAPGKGLEWVSAINEEGGQTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTA VYYCAKHPPHRPFDYWGQGTLVTVSRGGGGSGGGGSGGGGSSELTQDPA VSVALGQTVRITCQGDSLRLYYASWYQQKPGQAPVLVIYGKNNRPSGIPDRFSGSSSGNTASLTITGAQAEDEADYYCNSSHGPRRPVVFGGGTKLTVLG

A SEQ ID NO: 13 mostra a seqüência de aminoácidos do G11(curto).

EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSGSRMGWVRQAPGKGLEWVSAINEEGGQTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTA VYYCAKHPPHRPFDYWGQGTLVTVSRGSSGGSSELTQDPAVSVALGQTVRITCQGDSLRLYYASWYQQKPGQAPVLVIYGKNNRPSGIPDRFSGSSSGNTASLTITGAQAEDEADYYCNSSHGPRRPVVFGGGTKLTVLG

A SEQ ID NO: 14 mostra a seqüência de aminoácidos da proteí-na de fusão L19 (longo) - hulL-10:

EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSFSMSWVRQAPGKGLEWVS

SISGSSGTTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKPF

PYFDYWGQGTLVTVSSGDGSSGGSGGASTGEIVLTQSPGTLSLSPGERAT

LSCRASQSVSSSYLAWYQQKPGQAPRLLIYYASSRATGIPDRFSGSGSGT

DFTLTISRLEPEDFAVYYCQQTGRIPPTFGQGTKVEIKSSSSGSSSSGSSSS

GSPGQGTQSENSCTHFPGNLPNMLRDLRDAFSRVKTFFQMKDQLDNLLLK

ESLLEDFKGYLGCQALSEMIQFYLEEVMPQAENQDPDIKAHVNSLGENLKT

LRLRLRRCHRFLPCENKSKAVEQVKNAFNKLQEKGIYKAMSEFDIFINYIEAY

MTMKIRN

A SEQ ID NO: 15 mostra a seqüência de aminoácidos da proteí-na de fusão L19 (curto) - hulL15:

EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSFSMSWVRQAPGKGLEWVSSISGSSGTTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKPFPYFDYWGQGTLVTVSSGSSGGEIVLTQSPGTLSLSPGERATLSCRASQSVSSSFLA WYQQKPGQAPRLLIYYASSRATGIPDRFSGSGSGTDFTLTISRLEPEDFAVYYCQQTGRIPPTFGQGTKVEIKSSSSGSSSSGSSSSGNWVNVISDL

KKIEDLIQSMHIDATLYTESDVHPSCKVTAMKCFLLELQVISLESGDASIHDT

VENLIILANNSLSSNGNVTESGCKECEELEEKNIKEFLQSFVHIVQMFINTS

A SEQ ID NO: 16 mostra a seqüência de aminoácidos da proteí-na de fusão hulL15 - L19 (curto):

NWVNVISDLKKIEDLIQSMHIDATLYTESDVHPSCKVTAMKCFLLELQVISLESGDASIHDTVENLIILANNSLSSNGNVTESGCKECEELEEKNIKEFLQSFVHIVQMFINTSSSSSGSSSSGSSSSGEVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSFSMSWVRQAPGKGLEWVSSISGSSGTTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKPFPYFDYWGQGTLVTVSSGSSGGEIVLTQSPGTLSLSPGERATLSCRASQSVSSSFLAWYQQKPGQAPRLLIYYASSRATGIPDRFSGSGSGTDFTLTISRLEPEDFAVYYCQQTGRIPPTFGQGTKVEIK

A SEQ ID NO: 17 mostra a seqüência de aminoácidos da proteí-na de fusão hulL24-L19 (curto):

AQGQEFHFGPCQVKGVVPQKLWEAFWAVKDTMQAQDNITSARLLQQEVLQNVSDAESCYLVHTLLEFYLKTVFKNYHNRTVEVRTLKSFSTLANNFVLIVSQLQPSQENEMFSIRDSAHRRFLLFRRAFKQLDVEAALTKALGEVDILLTWMQKFYKLSSSSGSSSSGSSSSGEVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSFSMSWVRQAPGKGLEWVSSISGSSGTTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKPFPYFDYWGQGTLVTVSSGSSGGEIVLTQSPGTLSLSPGERATLSCRASQSVSSSFLAWYQQKPGQAPRLLIYYASSRATGIPDRFSGSGSGTDFTLTISRLEPEDFAVYYCQQTGRIPPTFGQGTKVEIK

A SEQ ID NO: 18 mostra a seqüência de aminoácidos da proteí-na de fusão L19 (curto) huGM-CSF:

EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSFSMSWVRQAPGKGLEWVSSISGSSGTTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKPFPYFDYWGQGTLVTVSSGSSGGEIVLTQSPGTLSLSPGERATLSCRASQSVSSSFLA WYQQKPGQAPRLLIYYASSRATGIPDRFSGSGSGTDFTLTISRLEPEDFAVYYCQQTGRIPPTFGQGTKVEIKSSSSGSSSSGSSSSGAPARSPSPSTQPWEHVNAIQEARRLLNLSRDTAAEMNETVEVISEMFDLQEPTCLQTRLELYKQGLRGSLTKLKGPLTMMASHYKQHCPPTPETSCATQIITFESFKENLKDFLLVIPFDCWEPVQEA SEQ ID NO: 19 mostra a seqüência de aminoácidos da proteí-na de fusão L19 (curto) - GM-CSF de murino:

EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSFSMSWVRQAPGKGLEWVS

SISGSSGTTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKPF

PYFDYWGQGTLVTVSSGSSGGEIVLTQSPGTLSLSPGERATLSCRASQSV

SSSFLAWYQQKPGQAPRLLIYYASSRATGIPDRFSGSGSGTDFTLTISRLEP

EDFAVYYCQQTGRIPPTFGQGTKVEIKSSSSGSSSSGSSSSGAPTRSPITV

TRPWKHVEAIKEALNLLDDMPVTLNEEVEVVSNEFSFKKLTCVQTRLKIFEQ

GLRGNFTKLKGALNMTASYYQTYCPPTPETDCETQVTTYADFIDSLKTFLTD

IPFECKKPVQK

Figuras

Figura 1 ilustra o acúmulo das proteínas de fusão nos tumoresF9 subcutâneos, nos camundongos 129Sv. Os dados de biodistribuição de-monstram que todas as quatro proteínas de fusão têm uma captação maiselevada no tumor comparado aos órgãos normais. Os dados em 24 h após ainjeção das proteínas radiomarcados são mostrados para: A) L19-IL10, B)IL15-L19, C) IL24-L19, D) L19-GMCSF e E) L19-IL15.

Figura 2 Imageamento por Infravermelho Próximo mediado porAnticorpo dos camundongos artríticos. Os animais foram injetados comSIP(L19)-Alexa750 (a), SIP(G11)-Alexa750 (b) ou SIP de controle-Alexa750(c). As fotos foram tiradas 24 h após a injeção dos anticorpos marcados fluo-rescentemente. As setas indicam o inchaço de grau 2 nas patas da frentedos camundongos.

Figura 3 Acúmulo de SIP(L19) e SIP(GH) radiomarcados naspatas artríticas. O painel A mostra as extremidades artríticas de um camun-dongo injetado com SIP(L19)-125I. A pata da esquerda foi classificada comoartrite de grau 2, a pata da direita como de grau 1. O painel B mostra omesmo experimento com SIP(GH)-125I. Aqui, a pata da esquerda foi classifi-cada como artrite de grau 1, a pata da direita como de grau 2. O painel Cmostra um camundongo injetado com SIP de controle-125!, um anticorpo quenão se liga a nenhuma estrutura no camundongo. Aqui, a pata da esquerdafoi classificada como artrite de grau 2, a pata da direita como de grau 1.Figura 4 ilustra o alvejamento das citocinas para as lesões artrí-ticas. Os camundongos artríticos foram injetados intravenosamente (i.v.) naveia da cauda lateral com solução salina (círculos pretos), com L19-IL2 (tri-ângulos pretos, linha tracejada), com L19-TNFalfa (cruzes, linha tracejada)ou com L19-IL10 (quadrados abertos) diluído em um volume de 200 μΙ desolução salina. As injeções foram iniciadas no dia 1, após o início da artrite,e então repetidas de dois em dois dias por 3 injeções por animal, conformeindicado pelas setas. As doses cumulativas para as proteínas de fusão e-ram: 20 μg equivalentes de IL2, 6 μg equivalentes de TNFaIfa e 150 μg equi-valentes de IL10 por camundongo, respectivamente. A pontuação artrítica foiavaliada diariamente e foi expressa como a média ± SEM. O inchaço daspatas foi medido de dois em dois dias e a média de todas as 4 patas foi es-pecificada como espessura da pata para cada animal. Os resultados mos-trados são a média ± SEM de cada grupo. Cada grupo consistia em 7 ca-mundongos.

Figura 5 demonstra que a distribuição alvejada de IL10 aos lo-cais de inflamação é superior ao tratamento de IL10 sistêmico. Os camun-dongos artríticos foram injetados intravenosamente (i.v.) na veia da caudalateral com solução salina (círculos pretos), com L19-IL10 (quadrados aber-tos) ou com HyHeMO-ILIO (cruzes, linha tracejada) diluído em um volume de200 μl de solução salina. As injeções foram iniciadas no dia 1 do início daartrite e então repetidas de dois em dois dias por 3 injeções por animal, con-forme indicado pelas setas. As doses cumulativas para as proteínas de fu-são eram 150 μg equivalentes de IL10 por camundongo. A pontuação artríti-ca foi avaliada diariamente e foi expressa como a média ± SEM. O inchaçodas patas foi medido de dois em dois dias e a média de todas as 4 patas foiespecificada como espessura da pata para cada animal. Os resultados mos-trados são a média ± SEM de cada grupo. Cada grupo continha 6 camun-dongos.

Figura 6 ilustra a terapia dos tumores F9 s.c. com diferentesquantidades de L19-GM-CSF. As injeções i.v. diárias por quatro dias conse-cutivos (setas) com 60 μg de L19-GM-CSF demonstraram retardo significati-vo do crescimento do tumor comparado ao grupo tratado com solução salina(PBS).

Figura 7 ilustra a terapia dos tumores F9 s.c. com L19-IL15. Asinjeções i.v. diárias por quatro dias consecutivos (setas) com 50 μg de L19-IL15 demonstraram retardo significativo do crescimento do tumor comparadoao grupo de controle (PBS).

Figura 8 ilustra a terapia dos tumores F9 s.c. com IL24-L19. Asinjeções i.v. diárias por quatro dias consecutivos (setas) com 50 μg de IL24-L19 mostraram retardo significativo do crescimento do tumor comparado aogrupo de controle (PBS).

Exemplos

Exemplo 1 - Preparação ds proteínas de fusão

As citocinas foram fundidas geneticamente à extremidade de Cou à de N dos fragmentos de anticorpos scFv separados por um Iigador deaminoácidos. Os fragmentos resultantes, precedidos por uma seqüênciade secreção requerida para a secreção de proteínas recombinantes, foramclonados em um vetor de expressão de mamífero e as proteínas de fusãoforam expressas em células HEK 293 estavelmente transfectadas. As cons-truções foram purificadas a partir do meio de cultura através de cromatogra-fia por afinidade sobre colunas de antígeno, em rendimentos de 1-2 mg/l. Ocontrole de qualidade foi efetuado por SDS-PAGE e filtração em gel.

Exemplo 2 - Formulação e administração das proteínas de fusão

As proteínas de fusão são resolvidas em soluções fisiológicas eadministradas intravenosamente aos animais. As proteínas são armazena-das em um dos seguintes tampões, dependendo do seu ponto isoelétrico edo tempo de armazenagem desejado. As proteínas são mantidas por umarmazenamento de longo tempo (mais de um mês) em menos 80°C. Paraimpedir a agregação pelos ciclos repetidos de descongelamento e congela-mento, o Glicerol a 1% e o Tween 80 a 0,04% podem ser adicionados.PBS (solução salina tamponada com fosfato): NaCI a 100 mM, Na2HPO4 amM χ 2 H2O, NaH2PO4 a 20 mM χ 2 H2O, pH 7,4

K-PBS: NaCI a 137 mM, Na2HPO4 a 8 mM, χ 2 H2O, KCI a 2,7 mM, KH2PO4a 1,5 mM, pH 7,4

PBS Siena: NaCI a 20 mM, Na2HPO4 a 6,7 mM χ 2 H2O, KCI a 1,8 mM, Ma-nitol a 133 mM, pH 6,3

TBS (solução salina tamponada com Tris): Tris a 20 mM, NaCI a 130 mM,pH 8,2

As injeções são tipicamente administradas 3-5 vezes, diariamen-te ou de dois em dois dias. A dosagem é selecionada de acordo com os va-lores da literatura, seguindo experimentação de rotina.

Exemplo 3 - Eficácia de alvejamento da proteína de fusão em camundongos129Sv enxertados com tumores F9 subcutâneos

As propriedades de alvejamento in vivo de uma preparação ra-dioiodada de L19-IL10 foram avaliadas em um experimento de biodistribui-ção em camundongos 129SvEv carregando os teratocarcinomas F9 subcu-tâneos. As razões de tumor/órgão favoráveis (variando entre 7:1 e 128:1)foram observadas 24 horas após a administração intravenosa. As proprieda-des de alvejamento in vivo das preparações radioiodadas de L19-IL15, IL15-L19, IL24-L19 e L19-GM-CSF foram avaliadas em um experimento de bio-distribuição em camundongos 129SvEv carregando os teratocarcinomas F9subcutâneos. As razões de tumor:órgão favoráveis foram observadas 24horas após a administração intravenosa.

Exemplo 4 - Os anticorpos monoclonais humanos L19 e G11 acumulam-seseletivamente nos locais de artrite

O desempenho de alvejamento in vivo de L19 e G11 no formatode minianticorpos (Borsi e outros, Int. J. Câncer, 102(1): 79-85 (2002)) foiestudado em camundongos artríticos usando tanto a fluorescência quanto aradioatividade para a detecção do anticorpo.

Os camundongos artríticos foram injetados com SIP(L19),SIP(GH) ou SIP de controle marcado com o corante de infravermelho pró-ximo Alexa 750. Vinte e quatro horas após a injeção intravenosa, os animaisforam representados por imagens usando um dispositivo formador de ima-gens de fluorescência no infravermelho, revelando um acúmulo forte e sele-tivo de anticorpos nas lesões presentes no membro artrítico no caso deSIP(L19) e SIP(GH) [Figura 2]. Em contraste, os camundongos injetadoscom SIP de controle, um anticorpo de especificidade irrelevante no camun-dongo, o qual foi usado como controle negativo, mostraram somente um si-nal de fluorescência fraco, devido ao extravasamento não específico do anti-corpo marcado através dos vasos que vazam na extremidade inflamada.

Os camundongos artríticos foram injetados com SIP(L19) eSIP(G11) marcados de modo radioativo. Após 24 h, os camundongos foramsacrificados e as patas foram representadas por imagens através de auto-radiografia. Um acúmulo preferencial de radioatividade foi observado nasextremidades inflamadas dos camundongos injetados com SIP(L19) eSIP(G11), enquanto que nenhum acúmulo de anticorpo preferencial pôde serdetectado nos camundongos exibindo graus comparáveis de inflamação, osquais tinham sido injetados com anticorpo SIP de especificidade irrelevanteno camundongo [Figura 3].

Exemplo 5 - Eficácia terapêutica da proteína de fusão L19-IL10 no modelode camundongo de artrite induzida por colágeno

O modelo de animal mais amplo usado e melhor conhecido paraa artrite reumatóide é a artrite induzida por colágeno (CIA) do tipo Il em ca-mundongo ou rato [Bliven e outros, Arthritis Rheum. 29(9): 1131-8 ((1986)].Este modelo foi descrito ter diversas características em comum com a artritereumatóide (RA) em seres humanos, incluindo as respostas imunológicashumorais e celulares ao colágeno, a ligação aos genes que residem no Iocusde histocompatibilidade maior e algumas manifestações histológicas simila-res. Maine e Feldmann efetuaram a maior parte deste trabalho pioneiro, talcomo a investigação dos anticorpos antifator de necrose tumoral como umaestratégia terapêutica para a RA, usando este modelo de animal [Williams eoutros, Proc. Natl. Acad. Sei. U.S.A., 89(20): 9784-8 (1992); Williams e ou-tros, J. Immunol. 165(12): 7240-5 (2000)].

Efeito da Distribuição Alvejada de Citocinas para as Lesões Artríticas:

Em um primeiro experimento, o potencial terapêutico da L19-IL10 foi comparado àquele de L19-IL2 e L19-TNF, usando camundongoscom CIA. Os camundongos injetados com solução salina foram usados co-mo um grupo de controle. Os camundongos receberam três injeções a cada48 h, começando no dia 1 após o início da artrite. As doses cumulativas, queeram iguais às anteriormente usadas para os experimentos de terapia detumor, foram 60 μg de L19-IL2 e 15 μς de L19-TNF. 450 μg de L19-IL10 porcamundongo foram usados neste experimento e nos experimentos subse-qüentes com as proteínas de fusão de anticorpo-IL10, de acordo com as do-ses de IL10 anteriormente verificadas serem ativas e não tóxicas nos ca-mundongos.

A L19-IL10 teve um efeito terapêutico claro sobre a pontuaçãoartrítica e sobre o inchaço da pata (vide a Figura 4). A magnitude deste efei-to foi comparável àquela observada para os anticorpos que neutralizam oTNF no mesmo modelo de animal. Em contraste, a L19-IL2 e a L19-TNF re-sultaram em um inchaço rápido e pronunciado dos membros afetados, quefoi mais grave do que no grupo de controle com solução salina. Nenhum dosanimais tratados morreu ou exibiu uma perda de peso de mais do que 15% eos parâmetros artríticos não pioraram significativamente após a terceira ad-ministração de anticorpo (Figura 4).

Comparação da Distribuição Alvejada Comparada com a Aplicação Sistêmi-ca de IL10:

Para demonstrar uma vantagem terapêutica de uma versão alve-jada de IL10, quando comparada à citocina não alvejada, as duas proteínasde fusão L19-IL10 e HyHaMO-ILIO foram investigadas no modelo de artriteCIA. Como no experimento anterior, os grupos de 6 camundongos artríticosforam tratados com três injeções de L19-IL10, HyHaHO-ILIO ou solução sali-na de dois em dois dias, começando no primeiro dia do início da artrite. Paraambas as proteínas de fusão, a dose cumulativa administrada a cada ca-mundongo foi 450 μg. Conforme esperado, a L19-IL10 demonstrou uma res-posta terapêutica significativa quando comparada ao grupo de controle comsolução salina, com a pontuação artrítica e o inchaço da pata permanecendobaixo até o dia 9 após o início da artrite (isto é, 4 dias após a última injeção).Consistente com as observações anteriores de uma atividade terapêutica daIL10 neste modelo, a proteína de fusão HyHELI0-IL10 mostrou um benefícioterapêutico comparado ao controle com solução salina, o qual não era, en-tretanto, tão eficiente quanto no caso de L19-IL10 (figura 5).

Exemplo 6 - Eficácia terapêutica das proteínas de fusão L19-IL15, IL24-L19e L19-GM-CSF em camundongos 129Sv enxertados com tumores F9 subcu-tâneos

Neste primeiro experimento, o potencial terapêutico de L19-GM-CSF, L19-IL15 e IL24-L19 foi avaliado usando camundongos com tumoresF9 s.c. Os camundongos injetados com solução salina foram usados comoum grupo de controle. Os camundongos receberam um total de quatro inje-ções a cada 24 h, começando no dia 4 após o implante da célula de tumor,quando os tumores já estavam visíveis e eram mensuráveis. As doses cu-mulativas, as quais eram iguais às anteriormente usadas para os experimen-tos de terapia de tumor, foram 240 μg para L19-GM-CSF, 200 μg para L19-IL15 e 200 μg para IL24-L19. Todas as três proteínas de fusão eram não-tóxicas neste meio e demonstraram um retardo significativo do crescimentodo tumor comparado ao grupo de controle (Figuras 6-8).LISTAGEM DE SEQÜÊNCIA

<110> Philogen S.p.A.

<120> CITOCINAS COM ANTICORPOS ALVEJADOS PARA TERAPIA<130> RP50020PCT<160> 19

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 178

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 1

Met His Ser Ser Ala Leu Leu Cys Cys Leu Val Leu Leu Thr Gly Val1 5 10 15

Arg Ala Ser Pro Gly Gln Gly Thr Gln Ser Glu Asn Ser Cys Thr His

20 25 30

Phe Pro Gly Asn Leu Pro Asn Met Leu Arg Asp Leu Arg Asp Ala Phe

35 40 45

Ser Arg Val Lys Thr Phe Phe Gln Met Lys Asp Gln Leu Asp Asn Leu

50 55 60

Leu Leu Lys Glu Ser Leu Leu Glu Asp Phe Lys Gly Tyr Leu Gly Cys65 70 75 80

Gln Ala Leu Ser Glu Met Ile Gln Phe Tyr Leu Glu Glu Val Met Pro

85 90 95

Gln Ala Glu Asn Gln Asp Pro Asp Ile Lys Ala His Val Asn Ser Leu

100 105 110

Gly Glu Asn Leu Lys Thr Leu Arg Leu Arg Leu Arg Arg Cys His Arg

115 120 125

Phe Leu Pro Cys Glu Asn Lys Ser Lys Ala Val Glu Gln Val Lys Asn

130 135 140

Ala Phe Asn Lys Leu Gln Glu Lys Gly Ile Tyr Lys Ala Met Ser Glu145 150 155 160

Phe Asp Ile Phe Ile Asn Tyr Ile Glu Ala Tyr Met Thr Met Lys Ile165 170 175

Arg Asn<210> 2<211> 114<212> PRT<213> Homo sapiens<400> 2

Asn Trp Val Asn Val Ile Ser Asp Leu Lys Lys Ile Glu Asp Leu Ile1 5 10 15

Gln Ser Met His Ile Asp Ala Thr Leu Tyr Thr Glu Ser Asp Val His

20 25 30

Pro Ser Cys Lys Val Thr Ala Met Lys Cys Phe Leu Leu Glu Leu Gln

35 40 45

Val Ile Ser Leu Glu Ser Gly Asp Ala Ser Ile His Asp Thr Val Glu

50 55 60

Asn Leu Ile Ile Leu Ala Asn Asn Ser Leu Ser Ser Asn Gly Asn Val65 70 75 80

Thr Glu Ser Gly Cys Lys Glu Cys Glu Glu Leu Glu Glu Lys Asn Ile

85 90 95

Lys Glu Phe Leu Gln Ser Phe Val His Ile Val Gln Met Phe Ile Asn100 105 110

Thr Ser

<210> 3

<211> 158

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 3

Ala Gln Gly Gln Glu Phe His Phe Gly Pro Cys Gln Val Lys Gly Val1 5 10 15

Val Pro Gln Lys Leu Trp Glu Ala Phe Trp Ala Val Lys Asp Thr Met

20 25 30

Gln Ala Gln Asp Asn Ile Thr Ser Ala Arg Leu Leu Gln Gln Glu Val35 40 45

Leu Gln Asn Val Ser Asp Ala Glu Ser Cys Tyr Leu Val His Thr Leu

50 55 60

Leu Glu Phe Tyr Leu Lys Thr Val Phe Lys Asn Tyr His Asn Arg Thr65 70 75 80

Val Glu Val Arg Thr Leu Lys Ser Phe Ser Thr Leu Ala Asn Asn Phe

85 90 95

Val Leu Ile Val Ser Gln Leu Gln Pro Ser Gln Glu Asn Glu Met Phe

100 105 110

Ser Ile Arg Asp Ser Ala His Arg Arg Phe Leu Leu Phe Arg Arg Ala

115 120 125

Phe Lys Gln Leu Asp Val Glu Ala Ala Leu Thr Lys Ala Leu Gly Glu

130 135 140

Val Asp Ile Leu Leu Thr Trp Met Gln Lys Phe Tyr Lys Leu145 150 155

<210> 4<211> 127<212> PRT<213> Homo sapiens<400> 4

Ala Pro Ala Arg Ser Pro Ser Pro Ser Thr Gln Pro Trp Glu His Val1 5 10 15

Asn Ala Ile Gln Glu Ala Arg Arg Leu Leu Asn Leu Ser Arg Asp Thr

20 25 30

Ala Ala Glu Met Asn Glu Thr Val Glu Val Ile Ser Glu Met Phe Asp

35 40 45

Leu Gln Glu Pro Thr Cys Leu Gln Thr Arg Leu Glu Leu Tyr Lys Gln

50 55 60

Gly Leu Arg Gly Ser Leu Thr Lys Leu Lys Gly Pro Leu Thr Met Met65 70 75 80

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210 215 220

Lys Val Glu Ile Lys Ser Ser Ser Ser Gly Ser Ser Ser Ser Gly Ser225 230 235 240

Ser Ser Ser Gly Ala Pro Ala Arg Ser Pro Ser Pro Ser Thr Gln Pro

245 250 255

Trp Glu His Val Asn Ala Ile Gln Glu Ala Arg Arg Leu Leu Asn Leu

260 265 270

Ser Arg Asp Thr Ala Ala Glu Met Asn Glu Thr Val Glu Val Ile Ser

275 280 285

Glu Met Phe Asp Leu Gln Glu Pro Thr Cys Leu Gln Thr Arg Leu Glu

290 295 300

Leu Tyr Lys Gln Gly Leu Arg Gly Ser Leu Thr Lys Leu Lys Gly Pro305 310 315 320

Leu Thr Met Met Ala Ser His Tyr Lys Gln His Cys Pro Pro Thr Pro

325 330 335

Glu Thr Ser Cys Ala Thr Gln Ile Ile Thr Phe Glu Ser Phe Lys Glu

340 345 350

Asn Leu Lys Asp Phe Leu Leu Val Ile Pro Phe Asp Cys Trp Glu Pro

355 360 365

Val Gln Glu

370<210> 19<211> 368<212> PRT<213> Artificial<220>

<223> Fusion protein L19(short) - murine GM-CSF<400> 19

Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Phe

20 25 30

Ser Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ser Ser Ile Ser Gly Ser Ser Gly Thr Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Lys Pro Phe Pro Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val

100 105 110

Thr Val Ser Ser Gly Ser Ser Gly Gly Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser

115 120 125

Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys

130 135 140

Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Ser Phe Leu Ala Trp Tyr Gln Gln145 150 155 160

Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile Tyr Tyr Ala Ser Ser Arg

165 170 175

Ala Thr Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp

180 185 190

Phe Thr Leu Thr Ile Ser Arg Leu Glu Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr

195 200 205

Tyr Cys Gln Gln Thr Gly Arg Ile Pro Pro Thr Phe Gly Gln Gly Thr

210 215 220

Lys Val Glu Ile Lys Ser Ser Ser Ser Gly Ser Ser Ser Ser Gly Ser225 230 235 240

Ser Ser Ser Gly Ala Pro Thr Arg Ser Pro Ile Thr Val Thr Arg Pro

245 250 255

Trp Lys His Val Glu Ala Ile Lys Glu Ala Leu Asn Leu Leu Asp Asp260

Met Pro Val Thr Leu Asn Glu Glu275 280

Ser Phe Lys Lys Leu Thr Cys Val

290 295

Gln Gly Leu Arg Gly Asn Phe Thr305 310

Thr Ala Ser Tyr Tyr Gln Thr Tyr325

Cys Glu Thr Gln Val Thr Thr Tyr340

Thr Phe Leu Thr Asp Ile Pro Phe355 360

265 270

Val Glu Val Val Ser Asn Glu Phe285

Gln Thr Arg Leu Lys Ile Phe Glu300

Lys Leu Lys Gly Ala Leu Asn Met315 320

Cys Pro Pro Thr Pro Glu Thr Asp

330 335

Ala Asp Phe Ile Asp Ser Leu Lys345 350

Glu Cys Lys Lys Pro Val Gln Lys365

Claims

1. Proteína de fusão compreendendo:(i) um anticorpo, seu fragmento funcional ou derivado funcional tendo afi-nidade de ligação específica ao domínio extracelular da fibronectinaoncofetal (ED-B) ou a pelo menos um dos domínios extracelulares datenascina oncofetal, fundido a(ii) uma citocina selecionada a partir do grupo que consiste em (a) IL-10,(b) IL15, (c) IL-24 e (d) GM-CSF, fragmentos funcionais e derivadosfuncionais dos mesmos.

2. Proteína de fusão de acordo com a reivindicação 1, em que oanticorpo, o fragmento ou o derivado funcional do mesmo é selecionado apartir do grupo consistindo em anticorpos policlonais, anticorpos monoclo-nais, anticorpos quiméricos, anticorpos humanizados, anticorpos com CDRenxertada, fragmentos Fv1 fragmentos Fab, fragmentos Fab2 θ proteínas deligação similares aos anticorpos.

3. Proteína de fusão de acordo com a reivindicação 1 ou 2, emque o derivado funcional do anticorpo é o fragmento de anticorpo biespecífi-co ("diacorpo") L19 (longo) tendo a seqüência de aminoácidos descrita emSEQ ID NO: 6.

4. Proteína de fusão de acordo com a reivindicação 1 ou 2, emque o derivado funcional do anticorpo é o fragmento de anticorpo biespecífi-co ("diacorpo") L19 (curto) tendo a seqüência de amino descrita em SEQ IDNO: 7.

5. Proteína de fusão de acordo com a reivindicação 1 ou 2, emque o anticorpo, o fragmento funcional ou o derivado funcional do mesmotendo afinidade de ligação específica a pelo menos um dos domínios extra-celulares da tenascina oncofetal é selecionado a partir do grupo que consisteem F16 (longo), F16 (curto), F16 (A34M) (longo), F16 (A34M) (curto), G11(longo) e G11 (curto) tendo as seqüências de amino descritas em SEQ IDNO: 8 até 13, respectivamente.

6. Proteína de fusão de acordo com qualquer uma das reivindi-cações 1 a 5, em que um membro do grupo que consiste em L19 (longo),L19 (curto), F16 (longo), F16 (curto), F16 (A34M) (longo), F16 (A34M) (curto),G11 (longo) e G11 (curto) está fundido a uma citocina selecionada a partirdo grupo que consiste em GM-CSF, IL-10, IL15 e IL-24, seus fragmentosfuncionais e derivados funcionais dos mesmos.

7. Proteína de fusão de acordo com qualquer uma das reivindi-cações 1 a 6, em que a citocina é uma citocina de murino ou humana, prefe-rivelmente uma humana, fragmento funcional ou derivado funcional do mesmo.

8. Proteína de fusão de acordo com qualquer uma das reivindi-cações 1 a 7, em que a citocina, o fragmento funcional ou o derivado funcio-nal do mesmo está fundido de modo N-terminal ou C-terminal, preferivel-mente de modo N-terminal, ao anticorpo, ao fragmento funcional ou ao deri-vado funcional do mesmo.

9. Proteína de fusão de acordo com qualquer uma das reivindi-cações 1 a 8, em que o fragmento de anticorpo ou o seu derivado funcionalé selecionado a partir do grupo que consiste em L 19 (curto), F16 (curto),F16 (A34M) (curto) e G11 (curto), preferivelmente F16 (A34M) (curto).

10. Proteína de fusão de acordo com qualquer uma das reivindi-cações 1 a 9, selecionada a partir do grupo que consiste em L19-IL-10, IL15-L19, IL-24-L19, L19-GM-CSF, L19-IL15, IL24-L19.

11. Proteína de fusão de acordo com qualquer uma das reivindi-cações 1 a 10 selecionada a partir do grupo que consiste naquelas tendo aseqüência de aminoácidos descrita em SEQ ID NO: 14-19.

12. Uso de uma proteína de fusão como definida em qualqueruma das reivindicações 1 a 11 para a fabricação de um medicamento.

13. Uso de acordo com a reivindicação 12 para o tratamento decâncer em um mamífero, preferivelmente em um ser humano.

14. Uso de acordo com a reivindicação 12 para o tratamento dedoenças inflamatórias, preferivelmente das doenças inflamatórias crônicas,em um mamífero, preferivelmente em um ser humano.

15. Uso de acordo com a reivindicação 14, em que a doençainflamatória é selecionada a partir do grupo que consiste em psoríase, ate-rosclerose, artrite, preferivelmente artrite reumatóide.

16. Composição farmacêutica compreendendo pelo menos umaproteína de fusão como definida em qualquer uma das reivindicações 1 a 11e opcionalmente um excipiente farmaceuticamente aceitável.

17. Método de tratamento, em que uma quantidade efetiva deuma composição farmacêutica como definida na reivindicação 16 é adminis-trada a um paciente que necessita do mesmo, preferivelmente um pacientesofrendo de câncer e/ou doenças inflamatórias.