CN101970730A - 通过融合到pⅨ或pⅦ来设计和生成人从头pⅨ噬菌体展示文库,载体、抗体及方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及用于生成pIX噬菌体展示文库以产生抗体或抗体片段的组合物和方法。
Description
技术领域
本发明涉及生成和使用pIX或pVII噬菌体展示文库来产生抗体或抗体片段的组合物和方法。
背景技术
在噬菌体或噬菌粒***中使用pIII和pVIII作为融合伴侣的丝状噬菌体展示已用作蛋白质工程、尤其是从头(de novo)抗体分离和亲和力成熟的一种技术。人样fab序列可以以已知的抗体序列为模板生成,而随机或诱变的互补决定区(CDR)或抗原结合区(例如重链CDR3(H3))可通过对所关注的抗原或其他蛋白质靶标进行淘选而无须进行免疫来从展示抗体片断序列的变型的噬菌体文库生成和分离。此前使用的人从头抗体文库通过合成法产生或通过未试验过的来源的lgG基因的分子克隆来产生。在合成的文库中,包含可变重链和轻链构架以及CDR区的抗体DNA序列基于以下进行设计和合成:1)确定的lgG基因,2)特定的lg种系基因,3)来自lg种系基因家族的共有序列以及4)来自天然来源的经PCR衍生的lgG片段。除了合成的抗体文库以外,也可通过源自人组织(例如骨髓和外周血细胞)的lgG DNA的组合克隆来产生文库。这些文库已用于提供fab抗体片段,并且用于进行连续几轮淘选和成熟或修饰,以试图找到具有所需特性(例如对选定的靶标蛋白质的高亲和力或抑制生物活性)的fab抗体片段。
已从噬菌体展示pIII或pVIII抗体文库分离出抗几种靶标蛋白质的人样fab抗体。虽然已成功分离出抗特定靶标的fab抗体,但是这种噬菌体展示文库方法遇到了这样的问题,即不得不重复进行文库生成、淘选和成熟几次来分离具有所需特性的fab抗体的这么一个过程。这些噬菌体文库还遇到这样的问题:它们不能完全涵盖或模拟人类中存在的人免疫多样性的范围,包括VH/VL配对的贡献、与抗原识别相关的不同种系家族的拓扑结构特征、氨基酸变异的位点和程度以及源自不同的人种系基因的抗体的相对丰度。合成抗体与天然抗体组库(repertoire)的差异可增加不利的生化特性的风险以及如果在人中用作治疗剂的话免疫原性的风险。
需要合成的抗体文库,和在施用于人时可同时递送人治疗性抗体的高亲和力和活性、高产率、良好溶液性能以及低免疫反应倾向这些关键要素的方法。还需要相对于目前的方法提高抗体从合成文库中分离的效率,以降低发现抗体所需的资源成本,并且加速抗体的递送以供进行生物学评估。本发明的文库和方法通过将全面的设计、组装技术以及噬菌体pIXFab展示相结合来满足这些需要。
发明内容
与现有技术的教导相反的是,现在已发现pVII和pIX可成功用于生成高亲和力的fab文库,例如通过使用诱变或其他多样性产生技术并任选使用同步成熟(in line maturation)来生成,从而为治疗性抗体的fab和抗体片段生成和选择提供有效和快速的平台。根据本发明,融合到pVII和pIX的抗体可变区或fab区在噬菌体表面上参与动态的相互作用以展示功能性抗体片段即代表性的异型二聚体基序。因此,在噬菌体上展示抗体重链和轻链可变区是一种合适的和优选的方法,可用来展示和测定组合异型二聚体阵列的多样性文库,其中的成员可充当二聚的人造抗体种类,使得可以选择新型的或所需的生物活性。
本发明提供多种改进的和新的pIX和pVII噬菌体展示从头文库生成方法和组分,例如(但不限于)以下的一种或多种:(i)设计的和展示的融合到pIX或pVII噬菌体蛋白的抗体Fab从头文库;(ii)使用与M13噬菌体的广泛使用的pIII和pVIII不同的噬菌体表面蛋白;(iii)使用代表人抗体组库的序列和结构的种系VH和VL基因的小阵列;(iv)使用这些噬菌体组分作为文库支架,以在Vh和VI区的互补区中提供改进的设计的组合多样性;(v)使得可以***性地检查设计的序列和拓扑结构对抗原识别的效果的抗体选择方法;(vi)作为文库选择的一部分的简单化的亲和力成熟和同步成熟方法。这样一个进行单个文库或群组文库的文库设计、选择、优化和成熟的新***提供了一种供成功进行抗体从头发现的可重复并且可靠的***,而且有利于理解抗体与抗原相互作用的结构功能关系。
上述的人Fab从头文库与目前的抗体文库技术现状不同之处在于它是通过M13噬菌体的pIX基因来展示。将代表性的人种系和结构序列用作文库支架以及设计CDR序列来模拟天然氨基酸分布能全面地覆盖人免疫组库,并且文库抗体与天然来源的人抗体具有高度的序列同一性。与文献报道的建立在单个种系或lgG基因支架上的文库相比,对人免疫组库的全面覆盖能增加抗体从头发现的机会。单独构建的子文库(每个都带有独特的支架(VH/VL对)和/或H-CDR3长度)可使鉴定独特抗体的机会最大化,并为***性地检查抗体/抗原结合的结构和功能关系提供机制。一体化的亲和力成熟方法将减少发现多样的高亲和力抗体所需的时间。
人造抗体在本文中定义为具有大的多样性的蛋白质基序,其使用抗体分子功能策略,但可以不受体内限制而生成,包括:(1)靶标抗原的序列同源性和毒性;(2)所生成的抗体在用来回收抗体的宿主或杂交瘤培养物中的生物影响;以及(3)筛选与选择所需活性。抗体分子为将肽元件组合阵列递呈于三维空间的一种生物装置。基本特征为在CDR(互补决定区)相互配合形成结合位点时,它们的相互作用是动态的和功能性的,CDR自身之间几乎没有结构关联。这样,氨基酸残基的全部补体以最低的结合能量消耗便可供抗原识别。已提出如果能够不仅控制序列空间的组合设计,而且控制三维空间的组合设计,则将能重演并最终超越免疫组库的天然设计。
因此,本发明描述了一种用于构建高度多样的异型二聚体多肽阵列的组合噬菌体展示形式。具体地讲,本发明描述了包裹编码融合多肽的基因组的丝状噬菌体颗粒,其中所述融合多肽包含融合到丝状噬菌体pVII或pIX蛋白质的氨基末端的外源多肽。优选地,噬菌体颗粒包含在噬菌体颗粒表面上表达的融合蛋白质。
在一个优选的实施例中,噬菌体基因组还编码第二融合多肽,其中第二融合多肽包含融合到pIX蛋白的氨基末端的第二外源多肽,并且第一融合多肽中的第一外源多肽融合到pVII蛋白的氨基末端。在该实施例中,第一融合多肽和第二融合多肽可缔合形成异型二聚体蛋白复合物,例如免疫球蛋白Fv、催化性Fv、受体、核酸结合蛋白或酶。
在一个相关的实施例中,本发明描述了用于在丝状噬菌体表面上表达融合蛋白质的载体,该载体包含用于表达融合蛋白质的表达盒。该表达盒包括上游和下游可翻译的DNA序列,所述DNA序列通过核苷酸序列可操作地连接,所述核苷酸序列适于DNA***片断的定向连接,即多位点接头,其中上游序列编码原核分泌信号,下游序列编码丝状噬菌体pVII或pIX蛋白。可翻译的DNA序列可操作地连接到一组DNA表达信号,所述信号用于将可翻译的DNA序列表达为融合多肽的部分。在一个优选的变型方案中,载体还包括第二表达盒,用于在丝状噬菌体表面上表达第二融合蛋白,其中第二表达盒具有第一表达盒的结构,前提条件是第一融合蛋白表达盒编码pVII蛋白,而第二融合蛋白表达盒编码pIX蛋白。该载体用作噬菌体基因组,以在噬菌体颗粒表面上表达异型二聚体蛋白复合物,在噬菌体颗粒中,异型二聚体的两种外源多肽通过分别与第一噬菌体蛋白质pVII和第二噬菌体蛋白质pIX融合而锚定在噬菌体颗粒上。
在另一个实施例中,本发明设想了根据本发明的噬菌体颗粒的文库,即组合文库,文库中每个代表性的颗粒各自展示不同的融合蛋白。在颗粒展示异型二聚体蛋白复合物时,该文库包括异型二聚体的组合文库,例如Fv分子文库形式的抗体。优选的文库具有至少103、104、105、106、107、108、109、1010、1011、1012、1013个(或其中任何范围或数值)不同种类的融合蛋白的组合多样性。
一个相关的实施例描述了包含第一多肽和第二多肽的融合蛋白,其中第一多肽为外源蛋白,第二多肽为丝状噬菌体pVII或pIX蛋白,其中外源蛋白融合到丝状噬菌体蛋白的氨基末端。
另外,本发明还设想了多种用于产生噬菌体的组合文库的方法,包括将编码外源多肽的全套基因克隆到本发明的载体中,通过诱变修饰外源多肽的结构,随机组合第一融合蛋白和第二融合蛋白文库的群体,通过靶向和亲和力选择(“淘选”)以改变文库的多样性等。
设计具有改进的或新颖的功能的蛋白质是一个具有多种医学、工业、环境以及基础研究应用的重要目标。随着组合抗体文库的发展,强有力的下一步是朝着人造抗体构建物以及其他蛋白质基序推进,所述人造抗体构建物以及其他蛋白质基序中二聚物是天然的或可能是功能性的。
本发明通过提供用于构建组合异型二聚体多肽阵列的噬菌体展示形式来应对这些挑战,所述组合异型二聚体多肽阵列中pVII和pIX用来展示可形成二聚物的融合蛋白。值得注意的是这是一种全新的方法,因为可独立地将两个蛋白基序靠近展示,以生成功能性相互作用的文库。
该技术的范围和能力所固有的是能够展示可参与二聚相互作用的各种蛋白质。这些蛋白质不仅包括抗体,还包括一些酶、激素和激素受体以及DNA结合蛋白。本文所述的展示技术可用于抗体骨架区的组合改变,以及用于改组和微型化抗体结构或将DNA结合蛋白(例如阻遏蛋白)展示为异型二聚体文库,供选择具有临床和治疗价值的特定DNA序列。
因此本发明的技术提供了突变型二聚蛋白和组合文库的展示和选择,所述组合文库中的成员由异型二聚体阵列组成。通过使用该技术,可以不同方式修饰天然的免疫球蛋白结构(本文所示的异型二聚体的V.sub.H-V.sub.L Fv形式),并筛选其特异性和活性。例如,通过构架区(FR)的组合改变或其他操作,以通过称为“互补决定区(CDR)改组(shuffling)”和“孪生抗体(twinibody)形成”的方法改组和微型化抗体结构,将形成含有新的抗体决定簇或完全不同的结构元件的抗体样二级结构。针对天然抗原和/或底物以及一些相关的化合物来选择结合和/或催化作用,可用来筛选异型二聚体蛋白的文库。
此外,用于形成文库的序列随机化以及用于形成杂交种的链改组方案可产生新型蛋白质的亚群。例如,以同型二聚体或异型二聚体形式展示和修饰锌指结构域的阵列可产生具有特定DNA相互作用的结构。此外,通过在预成型的支架如抗体链当中***所需的编码片段,可得到全新的结构。可能的***包括酶标记序列或阻遏蛋白结合蛋白。
应当理解,以上一般性的描述和以下详细的描述都仅出于示例性和说明性目的,不应限制受权利要求书保护的本发明。
附图说明
图1.支架VH和VL氨基酸序列。
图2.噬菌体展示和Fab表达载体的载体示意图:pCNTO-Fab-pIX-lacI。
图3A-C:文库支架Fab表达和展示的图示和图像。3A显示M13表面上的Fab表达的相对水平,3B显示在使用抗Fab’(2)作为检测试剂的蛋白质印迹中Fab的相对表达水平。3C显示通过与已知浓度的Fab比较得出的大肠杆菌(E.coli)培养基上清液中Fab支架的大致表达水平。该支架包括k基因支架(实心柱)和λ基因支架(阴影柱)。
图4.H-CDR3设计模式的示意图。
图5.H-CDR3寡核苷酸设计的示意图。
图6.H1-69模板的H-CDR3位置中的氨基酸分布。A.在393D位置(长度为9-14)处的分布。B.在2163N位置(长度为9-14)处的分布。C.在H-CDR3中973Y位置(长度为9-14)处的分布;D.在长度为7和8的H-CDR3中使用NNS密码子的所有位置处的分布。
图7.文库架构方案的概图。
图8.回文辅助的亲本链消除的示意图。
图9.大引物(mega-primer)靶向V区的整个区域的示意图。
图10.来自命中蛋白(hit)的VH片段通过PCR进行扩增并克隆到VL环载体中。所得质粒以ssDNA形式产生,并用作大引物杂交和消化诱变的模板。Lc文库大引物用来复制质粒,从而通过与分离的Hc序列相连而整合进Lc文库多样性。将该亲和力成熟文库包装成M13噬菌体,并用来对最初的抗原进行噬菌体淘选,以产生亲和力成熟的命中蛋白。
具体实施方式
本发明提供多种新的噬菌体展示从头文库生成方法和组分,例如(但不限于):(i)设计的和展示的融合到pIX或其他噬菌体蛋白的抗体Fab从头文库;(ii)使用与M13噬菌体的广泛使用的pIII和pVIII不同的噬菌体表面蛋白;(iii)使用代表人抗体组库的序列和结构的种系VH和VL基因的小阵列;(iv)使用这些噬菌体组分作为文库支架,以在Vh和VI区的互补区中提供改进的设计的组合多样性;(v)使得可以***性地检查设计的序列和拓扑结构对抗原识别的效果的抗体选择方法;(vi)作为文库选择的一部分的简单化的亲和力成熟方法。这样一个进行单个文库或群组文库的文库设计、选择、优化和成熟的新***提供了一种供成功进行抗体从头发现的可重复并且可靠的***,而且有利于理解抗体与抗原相互作用的结构功能关系。
上述的人Fab从头文库与目前的抗体文库技术现状不同之处在于它是通过M13噬菌体的pIX基因来展示。将代表性的人种系和结构序列用作文库支架以及设计CDR序列来模拟天然长度和氨基酸分布能全面地覆盖人免疫组库,并且文库抗体与天然来源的人抗体具有高度同源性。与文献报道的建立在单个种系或lgG基因支架上的文库相比,对人免疫组库的全面覆盖能增加抗体从头发现的机会。单独构建的子文库(每个都带有独特的支架(VH/VL对)和/或H-CDR3长度)可使鉴定独特抗体的机会最大化,并为***性地检查抗体/抗原结合的结构和功能关系提供机制。一体化的亲和力成熟方法将减少发现多样的高亲和力抗体所需的时间。
定义:
抗体:本文所用的术语“抗体”是指免疫球蛋白分子和免疫球蛋白分子的免疫活性部分,即含有抗体结合位点或抗体决定簇的分子。示例性抗体分子为完整的免疫球蛋白分子、基本完整的免疫球蛋白分子和免疫球蛋白分子的部分,其包括本领域所知的那些部分,如Fab、Fab′、F(ab′).sub.2和Fv。
抗体结合位点:“抗体结合位点”为抗体分子的这样的结构部分,其包括重链和轻链可变区以及超可变区,能特异性地与抗原结合(与抗原进行免疫反应)。术语“进行免疫反应”是指在含有抗原决定簇的分子与含有抗体结合位点的分子(例如全抗体分子或其部分)之间的特异性结合。
融合多肽:包括至少两个多肽和将所述两个多肽可操作地连接成一个连续多肽的连接序列的多肽。在融合多肽中连接的两个多肽通常来自两个独立来源,因此融合多肽包含两个连接的多肽,这两个连接的多肽在自然界中通常不会连接。
顺反子:DNA分子中的核苷酸序列,其编码氨基酸残基序列,并包括上游和下游DNA表达控制元件。
丝状噬菌体
本发明设想一种丝状噬菌体,该丝状噬菌体包含包裹编码融合蛋白的基因组的蛋白质基质。该融合蛋白包括融合到丝状噬菌体pVII或pIX蛋白的氨基末端的外源多肽部分。
所谓“外源的”意指融合到噬菌体蛋白的多肽通常不与丝状噬菌体的野生型种类中的噬菌体pVII或pIX蛋白相缔合,而是对于正常噬菌体蛋白而言是外来的。
典型的外源多肽为任何所关注的多肽,包括免疫球蛋白重链可变结构域(V.sub.H)、免疫球蛋白轻链可变结构域(V.sub.L)、天然或合成的多肽、单链抗体(scFv)等。
在一个优选的实施例中,丝状噬菌体包裹编码第一融合蛋白和第二融合蛋白的基因组,其中第一融合蛋白包含融合到pVII的第一外源多肽,第二融合蛋白包含融合到pIX的第二外源多肽。
丝状噬菌体还会含有如实例中所述的展示于噬菌体颗粒表面上的一种或多种融合蛋白。因此,如果存在第一融合蛋白和第二融合蛋白,噬菌体可以以功能性方式展示这些蛋白质,使得第一外源多肽和第二外源多肽可以相互作用成为异型二聚体,从而在噬菌体表面上形成功能性双链蛋白质复合物。
如果表达的异型二聚体蛋白具有结合配体的能力,它在本文中可另外称为配体结合异型二聚体受体。
在一个优选的实施例中,异型二聚体受体为表位结合复合物。也就是说,能够结合表位的第一多肽和第二多肽的复合物。优选地,第一多肽和第二多肽为抗体重链和轻链多肽。具体地讲,优选的实施例利用V.sub.H和V.sub.L来形成Fv复合物。其他的异型二聚体蛋白质复合物包括催化性Fv、受体、核酸结合蛋白和酶以及类似的异型二聚体蛋白质。
在存在于本发明噬菌体上的融合蛋白中,外源多肽和丝状噬菌体pVII或pIX蛋白之间的“融合”可包含典型的酰胺键,或可如实例中所述包含连接多肽(即“接头”)。可使用多种接头中的任何一种,所述接头通常为一段长度为约5至50个氨基酸的序列。尤其优选的接头可在靠近接头处给融合蛋白提供高度的活动性。
文库设计:以前的合成文库并入了以下内容的一部分,但没有一个全面地包括以下全部内容。
种系可变区家族多样性。人重链和轻链的全套可变区由通过序列同源性和长度来定义的相关序列的家族组成。在任何这样的家族中,各成员主要在互补决定区的序列和长度上有所差异。这些差异导致已知的结构变化模式(典范结构)以及在结构上相似的易与抗原发生相互作用的位置处的种系氨基酸变化。为文库仅选择单一的Vh和V1基因模板会减少可捕获的天然种系多样性的范围(引用Genentech文库)。选择所有的Vh和V1基因则会阻碍文库生成的效率。本发明的文库通过以下方式高效地捕获种系多样性:(1)鉴定重排的人抗体(IMGT、Kabat、NCBI)中少量的代表优势的典范结构群的种系Vh、Vk和Vλ,以及(2)通过组合寡核苷酸诱变将相关家族成员的天然人种系多样性整合进VH基因编码的CDR 1和2中,或者还整合进Vk和Vλ区的CDR 1-3中。
VH-CDR 3多样性。VH-CDR 3是通过连接V、D和J片段生成,并同时伴随末端添加事件和核酸外切事件。存在约25个种系D区片段,该数字加上复合物连接事件和体细胞突变能产生抗体的最具多样性的区域。这些事件发生于确定的一组种系序列中,因此不是随机的;但很难预测它们。然而,重排的人抗体序列的数据库现已达到足够的大小(约5000个VH区),可以在VH-CDR3中的每个位置同时对长度和氨基酸分布进行统计学评估。本发明的文库通过使用设计的简并寡核苷酸装配该区域来重演这个天然的人多样性。
体细胞多样性的位置和性质。体细胞多样性是人抗体如何成熟为高亲和力的选择性结合实体的标志。体细胞突变的产生和积累不是随机的。核苷酸突变的位点和类型因DNA序列和机理而具有偏向性,但是只有提供结合和功能优势的突变才被选择和储存,并且通常伴随中性置换。虽然不易从机理预测,但重排的人抗体序列和结构功能分析的数据库的确能鉴定在很多情况下与CDR区中的抗原识别(包括蛋白质、肽和小分子抗原之间的区分)相关的位置和氨基置换。本发明的文库通过使用设计的简并寡核苷酸将置换整合进VH CDR1和2或者还整合进Vk和Vλ区的CDR 1-3来重演这个天然的人多样性。
种系基因用法。人全套种系基因由约30个Vk、56个Vλ和40个V重链功能基因组成。然而,它们在重排抗体中的呈现具有很强的偏向性,这由不同的轻重链可变区的配对频率反映(de Wildt et al.,J Mol Bio285:895-901(1999)(de Wildt等人,《分子生物学杂志》,第285卷第895-901页,1999年)。本发明的文库通过为以上(a)中提到的每个多样性种类选择优势的种系可变区而捕获该偏向性。
表达、生物化学和生物物理特性。优选的人抗体不仅具有所需生物活性和结合活性,而且可由多种宿主高效生产,并且具有稳定性和良好的溶解特性。高频率种系基因用法(1d)也表明在哺乳动物***中的良好表达。此外,通过选择或筛选的细菌噬菌体展示方法来从文库回收的抗体应在细菌宿主中表达良好。本发明的文库是基于人种系衍生的模板,所述模板是从标准的重组哺乳动物宿主(例如HEK 293和CHO细胞)以及细菌宿主良好表达和纯化的,并具有高稳定性和良好的溶解特性。
成熟。可变区序列中可影响抗原识别的位置有很多,加上每个位置处最多有20种不同氨基酸的潜在变化,这排除了在单个文库中包括所有变化的实用性。人抗体通过体细胞突变的渐进过程来获得高亲和力和特异性。本发明的文库被设计和排列成容许平行选择和定向变化,同时保持每个抗体链的序列完整性,使得它们反映人抗体。
可选设计。上述设计能重演天然的人抗体。该***的模块化特性便于在任何一批位置整合进任何一批氨基酸。
文库组装技术。优选的从头抗体文库具有高的多样性(>1010),易于改变,容易组装,并且不需要的序列的背景低。这些背景序列包括亲代模板和低定向多样性。结合以下方法可加速文库装配并产生低背景:(a)基于Kunkle的单链诱变;(b)具有限制性位点的回文环;(c)大引物
pIX Fab噬菌体展示。除了单个Fv文库(Scripps参考文献)外,所有以前的丝状噬菌体从头人抗体文库都采用pIII或pVIII噬菌体外壳蛋白来展示。pIX与选定的Fab模板的组合是用于回收抗体更为高效的选择***,所回收的抗体在转化为单克隆抗体及其他相关分子时保留它们的选定的特性。
Fab展示。与scFv不同,Fab为人抗体的天然片段,当它们通过基因工程转入到完全抗体时可更好地重演它们的活性。Fab的高效丝状噬菌体展示除要求在细菌宿主良好表达这个特性之外还要求其他特性。本发明的可变区模板被选择用于通过pIX在丝状噬菌体上高效展示。
噬菌粒展示。Fab分子相对于噬菌体pIX外壳蛋白而言为大分子,因此如果连接到在细菌细胞中产生的所有pIX蛋白的话,则可能干扰重组噬菌体颗粒的装配。规避该干扰的一种方法为使用pIX噬菌粒***(如Scripps参考文献所述),凭此野生型和Fab连接的pIX蛋白都可整合进重组噬菌体颗粒中。在一个优选的应用中,本发明的文库是通过pIX在噬菌粒***中展示。
用于展示的噬菌体外壳蛋白pIX。与pIII一样,pIX以低拷贝数存在于噬菌体上,并适于对展示的Fab进行亲和选择。但是,pIII蛋白质参与侵染过程并起着关键作用,展示在该pIII蛋白质上的蛋白质可能干扰侵染效率。此外,重链Fd或轻链片段都可与pIX融合以进行展示。预计展示在pIX蛋白上的本发明文库可被高效复制和递呈,以进行选择和/或筛选。
Fab-pIX表达。筛选从噬菌体文库回收的Fab的一种方法是去除连接到用来展示Fab分子的噬菌体外壳蛋白。pIX蛋白的小尺寸提供了无需这个步骤而直接筛选Fab的生产选择。
设计文库支架。文库支架由一组人种系VH和VL基因组成。分析文献以及专有的抗体信息导致了鉴定出代表人lgG基因家族的种系基因、全套lgG中的用法和人抗体典范结构。在分析中也考虑了Vh和VL之间的良好配对以及来源自种系基因的抗体的成功制备的可能性。支架VH和VL的人天然和良好配对的设计优于使用人种系基因的共有序列作为文库支架的设计(MorphoSys HuCAL GOLD),并比基于单个种系基因作为文库支架的设计(Dyax VH和Affytech)更全面地代表了人全套序列。
文库支架的表达和展示能力。文库支架Fab的良好表达和展示能力与在支架基因上构建的文库的质量直接相关。在文库构建前检查文库支架Fab表达和展示能力。将一些可表达但不能展示或展示不佳的支架Fab从文库构建中排除。良好表达和展示的文库支架可确保文库中高比例的Fab是功能性的,与通过从天然来源(CAT)遗传扩增而来的VH和VL基因的组合克隆获得的文库相比更优越。
设计H-CDR 3多样性。文库VH-CDR 3在长度和序列上都是多样的。根据CDR长度,约109至1018个全部序列可能性被设计在VH-CDR3中,反映了VH-CDR3在抗原结合中的重要性。与使用所有氨基酸密码子获得氨基酸多样性(例如Genentech 2004年的NNK)和使用详尽的克隆方法来工程化改造天然来源的VH-CDR3序列(CAT、Dyax、Affytech)不同的是,我们通过使用设计的编码氨基酸密码子的寡核苷酸构建了VH-CDR3,所述氨基酸密码子模拟了人lgG全套序列中的氨基酸使用模式。该设计的VH-CDR3含有更少的不需要的氨基酸(如终止密码子)和更少的不利的氨基酸(如胱氨酸),但含有更高比率的lgG样CDR3序列。简并寡核苷酸可容易用来在诱变反应中生成大规模基因文库。
设计H-CDR1和H-CDR2多样性。设计VH-CDR1和VH-CDR2中的氨基酸多样性来模拟种系序列当中的变化。VH-CDR1和VH-CDR2中总共的序列多样性在102-105个的范围内。这与大量的VH-CDR3序列变化相结合,能增加文库中总的序列变化,从而增加鉴定出抗原结合抗体的机会。小的种系样多样性的独特设计有利于发现种系或天然样抗体序列,并使由于对文库构建的组合效应而分离非天然CDR组合的潜在可能减至最低。该设计不同于许多其他的合成或半合成抗体文库(Genentech、Dyax和MorphoSys),这些合成或半合成抗体文库在全部三个VH CDR中含有更大的序列变化,但只有一小部分的大的理论序列多样性能够在文库中捕捉到。
在LC中设计多样性。将文库轻链策略性地设计成在从头文库中是可变的,并在通过噬菌体淘选来选择Fab后,将Lc多样性引入CDR中。由于抗原结合Fab中的Lc多样性是设计来改进结合亲和力,因此选择被发现往往与已知结构的抗原-抗体复合物中的抗原接触的CDR位置用于多样化。逐步的CDR多样化策略能有效地管理大的理论CDR序列多样性,并产生更适于生物学表征的高结合亲和力的抗体。
文库生成方法。使用改进的Kunkel诱变方法来生成大的Fab文库,该Kunkel诱变方法可高效地产生几十亿个大肠杆菌(E.coli)菌落,每个菌落含有不同的Fab序列。虽然该方法有效,但用于生成高序列复杂性文库时,非诱变的亲代DNA的百分比会增加。此外,合成长寡核苷酸的技术限制降低了该方法在较远的区域中构建含有序列多样性的文库的有效性。为了克服这些局限,将用以生成>350个碱基的寡核苷酸(大引物)和用以在诱变模板中产生含有限制性酶识别位点的茎环序列的其他技术与标准的Kunkel诱变方法联合使用。与其他人用来进行文库生成的其他文库技术(例如限制性克隆(MorphoSys、CAT和Dyax)、噬菌体重组(Giggapack,Invitrogene)和序列特异性重组(CAT))相比,改进的基于Kunkel的方法在生成>109个序列多样性文库时明显更为有效,并能更为灵活地在靶DNA上的任何位置中引入序列多样性。
同步亲和力成熟。一体化的亲和力成熟方法或同步亲和力成熟被设计来改进选自文库的所有Fab的结合亲和力。由于该文库被策略性地设计来让Fab的VL变化,因此应能容易地通过CDR序列多样化而在VL中产生额外的抗原结合位点。淘选后改进所有Fab的结合亲和力能提高鉴定治疗性抗体前导物的成功率。使用Kunkel方法进行文库生成能确保VL序列多样化策略以简单且连续的过程有效执行。使用改进的Kunkel诱变方法的设计策略和技术优势使得该方法优于其他由CAT和MorphoSys所报道的合并(pooled)成熟策略,这些合并成熟策略采用冗长的文库生成方法,这种方法会该目的的效率和有益效果。
平行文库淘选。使用最新技术的、半自动的设备进行的平行淘选方法被开发来处理单独构建的子文库。平行淘选可以使发现多样的抗体组的可能性最大化,从而支持独特设计和生成的文库。在同步亲和力成熟中有效使用平行淘选也使得具有宽范围亲和力的抗体能够同时得到改进。基于设备的淘选的开发也容许***性地检查不同的淘选条件以发现具有所需特性的抗体。
亲和力排序。将基于亲和力的结合测定法应用于大的、多样的和高亲和力的抗原特异性结合抗体应用,以选择结合最佳的抗体用于进一步表征。为此目的,将标准的生物化学方法(如ELISA)和亲和力测量设备(例如适用于处理大量样品的BIAcore、Octet和BIND)单独使用或联合使用。
虽然已概括地描述了本发明,但是本发明的实施例还将在以下的实例中进一步公开,所述实例不应理解为限制权利要求的范围。
实例1:实例1.设计文库支架
将人种系基因设计成文库主链。基于以下特性最初鉴别了一组种系VH和VL基因:1)在天然表达的lgG中的用法,2)利于蛋白质和肽抗原识别的结构(主链构象)拓扑,3)来源自种系基因的抗体的生物化学和生物物理特性,以及4)VH和VL异型二聚体形成为抗体的可能性。从该组进一步选择了最能代表如上所列特性的四(4)个VH和四(4)个VL种系基因。将来源自具有序列修饰和人JH4片段的已知抗体的具有10个氨基酸的单一、人造H-CDR3序列与每个种系VH组合使用,以完成全部的VH序列。对于VL,将Jκ1片段用于与每个选定的种系VL进行组合。这些基于4VH和4VL种系的基因是化学合成的。通过与确定的CH和CL序列组合,它们组成了十六(16)个重组的人Fab。对于VL-λ,将Jλ2片段与每个选定的VL-λ种系支架进行组合。将三个VH(169、323和551)种系基因与VL-λ种系支架进行组合,并克隆进含有CH1和Cλ序列的载体中,从而产生12个重组的人Fab。这28个Fab用作文库支架或模板,以在重链和/或Lc链互补决定区(CDR)中展示序列多样性。图1示出了设计的4个VH和4个VL的序列。
实例2.文库支架的表达和展示
将合成的Fab DNA克隆进pCNTO-lacI-pIX载体中(图--)。VH基因通过NcoI和ApaI位点来克隆。VL基因(包括ompA信号序列和上游序列)通过NheI和BsiWI位点来克隆(图2)。分别在蛋白质印迹分析中和在噬菌体ELISA中检测支架Fab的表达和展示。
为检测展示,制备噬菌体并在噬菌体ELISA中试验。简单地讲,将pCNTO-Fab-pIX-lacI构建物转化进MC1061F′细胞,并在2xYT/Carb(100μg/ml)/TET(15μg/ml)/1%葡萄糖培养基中于37℃过夜振摇培养。次日上午,取该培养物50μl,接种到5ml的2×YT/Carb(100μg/ml)中,并培养至OD600为0.6-0.8。然后用(#噬菌体)辅助噬菌体在不振摇的情况下于37℃侵染该培养物40分钟。侵染的细胞经离心沉降,再重悬于5ml的2×YT/Carb(100μg/ml)/TET(15μg/ml)/Kan(35μg/ml)/0.5mM IPTG培养基中,并于30℃过夜振摇培养。次日上午,离心沉降细胞,并收集噬菌体上清液,用于噬菌体ELISA。将50μl的噬菌体上清液(未稀释)以及3个1∶5的连续稀释液加入ELISA孔中,所述孔包被有抗Fd(Hc特异性)或抗k(Lc特异性)抗体。温育后,将未结合的噬菌体冲洗掉,并用抗M13抗体检测结合的噬菌体。除了H3-53/L-B3和H3-53/L-A27以外,所有的支架组合均显示与抗Fd和抗k抗体的良好结合,表明Hc和Lc两者在噬菌体表面上充分展示(图3)。
为了检测Fab的表达,首先通过SpeI和NheI限制性内切酶消化将pIX基因从pCNTO-Fab-lacI-pIX载体上切除,然后使消化的载体DNA进行自我连接。这样便产生了Fab表达构建物pCNTO-Fab-lacI(图2)。将含有pCNTO-Fab-lacI噬菌粒的M1061F’细胞在2×YT/1%葡萄糖/Amp(100μg/ml)培养基中于37℃过夜振摇培养。取5ml过夜培养基等分试样用作未诱导的对照。将0.1ml的过夜培养物接种到10ml 2×YT/0.1%葡萄糖/Amp(100μg/ml)培养基中。该培养物在37℃下振摇培养至OD600nm为0.8-1.0。加入IPTG至0.5mM的最终浓度,以诱导Fab表达。将该培养物在30℃下继续振摇培养另外16-20小时。将诱导的培养物离心沉降,通过加入0.4mL BPER II试剂(Pierce)将每个细胞沉淀物裂解。收集完成的细胞裂解物的上清液,并通过蛋白质印迹分析Fab表达。所有Fab表达良好(>2μg/ml),例外的是含有B3 LC的那些,其表达水平低约10倍。也使用ELISA检测Fab表达。将50μl完成的细胞裂解液以及6个1∶5的连续稀释液加入包被有抗Fd(Hc特异性)的ELISA孔中。用抗k或抗λHRP缀合抗体检测Fab。相对于Fab对照标准曲线来定量Fab的量(图3C)。
实例3.H-CDR3多样性的设计
我们在H-CDR3中设计了大的序列多样性,以模拟天然免疫组库。从各种公共来源收集了总共约5250个非冗余和完整的(包括可变区、CDR3和构架4)人抗体序列。数据组含有所有7个Vh家族。根据Kabat定义编写了,呈专有程序来提取CDR3片段。根据CDR3长度进一步分析抗体序列。H-CDR3的长度范围为1至27个氨基酸,呈正态分布。最多数的抗体在H-CDR3中含有12个氨基酸。将具有相同长度的抗体序列进行比对和分组。将JH6衍生的序列从长度组中扣除,以使JH6相关的、多重的和连续的含酪氨酸序列减至最少。编写程序来计算每个长度的氨基酸分布。根据它们的频率将H-CDR3长度序列组的每个位置处的残基进行分类。使用内置的Weblogo(9-Crooks GE,Hon G,Chandonia JM,Brenner SE WebLogo:A sequence logo generator,Genome Research,14:1188-1190,(2004)(9-Crooks GE、Hon G、Chandonia JM和Brenner SE,WebLogo:一种序列标志生成程序,《基因组研究》,第14卷第1188-1190页,2004年)来绘制每个HCDR3长度的分布。我们决定研究H-CDR3中含有7-14个氨基酸的序列,它们大约覆盖了约65%的总人抗体组库。
通过分析氨基酸分布,我们鉴定了一种描述含有7-14个氨基酸的H-CDR3的氨基酸分布的模式。图4显示了H-CDR3的模式。尽管在H-CDR3中观察到高度多样的氨基酸,但甘氨酸和丙氨酸这两种氨基酸在所有位置都被经常使用。此外,天冬氨酸(D)经常在第95位中使用,酪氨酸(Y)经常被编码于较接近H-CDR3中的J片段的位置。虽然在第99-101位的序列可变,但苯基丙氨酸(F)、天冬氨酸(D)和酪氨酸(Y)等氨基酸在lgG中主要在这些位置使用。由于这些位置经常用作对H-CDR3的结构支持并不易接近抗原和/或接近lgG表面,我们分别将氨基酸F/L固定于99、D固定于100和Y固定于101。
为了模拟H-CDR3中高度多样的氨基酸分布,我们设计了混合碱基型寡核苷酸来编码H-CDR3序列并用它们构建文库。使用Wang和Saven描述的一种程序10-Wang W,Saven JG.Designing gene libraries from protein profiles for combinatorial protein experiments.Nucleic Acids Res.Vol 30,No 21,e120.2002(10-Wang W、Saven JG,从蛋白质表达谱设计基因文库用于组合蛋白质实验,《核酸研究》,第30卷第21期e120,2002年)来确定多个随机试验中的密码子三联体的每个位置处的核苷酸混合物比率的初始值,使得来源自密码子三联体的编码氨基酸能模拟靶氨基酸分布。为了通过混合碱基型寡核苷酸使终止密码子减至最低(<3%)以及减少半胱氨酸密码子,我们进一步使用MicroSoft ExcelTM的Solver中的脚本针对与Wang和Saven程序相同的靶功能修正了密码子三联体每个位置处的核苷酸混合物比率的值。用于D位置和N位置的核苷酸组成在图5中示出。对于较短的H-CDR3长度,例如7-8个氨基酸,则改为使用NNS密码子。
然后我们基于密码子设计生成了混合碱基型寡核苷酸。除了D位置和N位置以外,富含酪氨酸(约18%Y)的位置还另外享有与N位置中相似的氨基酸分布。产生出在N位置处具有N设计密码子并在每个酪氨酸位置处具有固定密码子TAT的单独寡核苷酸,并将该单独寡核苷酸用来与N设计密码子寡核苷酸混合,以用于带有11至14个氨基酸的CDR长度的文库。对于特定的Y位置,用来混合N密码子寡核苷酸和N加TAT密码子寡核苷酸的比率为约7∶1。由于N密码子设计器为酪氨酸给出约4.7%,该混合物因Y位置处的固定的TAT密码子而引起额外13%的酪氨酸。
使用实例6中描述的方法用寡核苷酸构建从头Fab文库。获得并分析了来自每个子文库的约100个克隆的DNA序列。从H-CDR3中的TAA终止密码子突变而来的克隆视为阳性克隆。用翻译的H-CDR3序列来确定在单个或组合的D、N和Y位置处的氨基酸分布。结果显示在这些位置处观察到的氨基酸分布逼真地模拟了数据库和设计中所见的分布(图6)。另外,与NNS简并寡核苷酸相比,设计的混合碱基型寡核苷酸显示更好地模拟了设计和数据库中这些位置的氨基酸分布(图6)。
实例4.设计H-CDR1和H-CDR2多样性。
我们在H-CDR1和H-CDR2中设计了多样性,以模拟种系基因全套序列。要进行多样性设计的H-CDR1和CDR2位置由以下因素来决定:1)种系基因中的多样性(11-Vbase)和2)通过溶剂暴露分析和文献(12-Almagro2004)得出的与已知结构的抗体-抗原复合物中的抗原接触的频率。这些位置处的氨基酸多样性由以下因素来决定:1)在种系基因(11)中的用法,2)在来源自种系基因(专有数据库)的lgG中最频繁使用的氨基酸,3)据预测由于体细胞突变而衍生的氨基酸以及4)有助于抗原识别的氨基酸的生物化学和生物物理特性。H-CDR1和CDR2中组合的序列多样性的范围为102至105。将用法频率用作过滤器,以限制在lgG中不常使用的氨基酸。这使得由组合突变产生的非天然序列减至最低。表1显示了H-CDR1和CDR2多样性的序列分析和设计。
设计并合成了极好地覆盖了H-CDR1和CDR2设计的简并寡核苷酸(表1)。将寡核苷酸在单个的Kunkle ssDNA依赖性诱变反应中用作引物。因此,在确定的H-CDR1和CDR2位置处的设计的简并性如所预期被引入到H-CDR1和H-CDR2中。在Kunkel诱变反应后对随机挑取的克隆的序列分析显示,所测序的克隆有31%至55.7%在H-CDR1和/或H-CDR2区具有突变(表2)。发现同时具有H-CDR1和H-CDR2突变的克隆的百分比等于或高于仅在一个CDR区中具有突变的克隆的百分比。
实例5.在Lc中设计多样性
在设计轻链CDR多样性时需考虑以下参数。第一,我们限定组合的Lc多样性不应超过108,由于Lc文库被用于亲和力成熟,因此被与一群在淘选文库的第一阶段期间来源自噬菌体选择的约102个独特Hc克隆进行组合。因此,组合的Hc和Lc的复杂度为约<1010,其可在通过单个Kunkel诱变反应产生的文库中被有效捕获。第二,我们靶向经常被发现与已知结构的抗原-抗体复合物中的抗原接触的多样化位置,或所谓的特异性决定残基(SDR;12);也就是说,对于分别为L-CDR1、L-CDR2和L-CDR3第30-32位、第50位和第91-94位。第三,第96位也是可变的,因为其编码于连接(J)基因中并且所有五个人J基因在该位置都不同。第四,与设计H-CDR1和H-CDR2中所用的概念一样,我们通过选择也经常在重排lgG中被发现于待多样化的位置处的种系编码氨基酸,使不太可能在自然界发生的序列多样性减至最低。最后,我们评估了在给定位置处适于抗原结合的氨基酸的生物化学和生物物理特性(13-Tomlinson等人,1995年)并用那些氨基酸补充了V种系基因多样性以达到108的标准。各个设计的Lc-CDR多样性在表5中示出。
使用重叠PCR方法生成在特定位置含有设计的多样性的Lc。可将简并密码子置于跨越各个CDR的扩增寡核苷酸当中的位置处。这些简并密码子在CDR位置处编码设计的氨基酸。作为另外一种选择,可以合成出在每个位置编码特定的所需密码子的若干寡核苷酸。然后,可将这些寡核苷酸混合以生成文库,该文库将用于扩增在重叠PCR中使用的文库DNA。将设计的寡核苷酸用来扩增Lc的片段,从而在所需的SDR位置产生一群序列变体。用简并寡核苷酸通过PCR合成出编码构架#1区、CDR1-2突变区和构架#3-CDR3突变区的Lc片段。然后,将前述的VL文库片段在重叠PCR中与侧翼扩增引物进行组合。该反应能产生全长VL文库,该文库在所有三个CDR中在所需位置处具有序列变化。
作为另外一种选择,可用DNA合成方法“GeneWriter”来根据这些设计合成出各个Lc文库。了使用大肠杆菌偏爱的密码子从设计的氨基酸序列反向翻译核苷酸序列。可合成出寡核苷酸(每个都覆盖设计的序列的一部分并含有设计的核苷酸变化),并用在别处描述的技术(14-美国专利0165946 A1)组装成基因。简单地讲,可通过软件“MultiWriter”处理寡核苷酸序列和设计的序列变化以进行寡核苷酸生成。可为有义链生成不同数量的文库寡核苷酸,以代表基于所需序列变化的所有组合。反义链可用相同的软件进行设计和合成。VL基因可通过合成的较小的低聚物的一系列退火-连接来组装,如在专利(14)“Gene assembler(基因组装仪)”所述。通过PCR扩增出全长VL DNA,所得PCR产物可用作Kunkel方法中的引物,或者用作来源供直接克隆进pCNTO-pIX-lacI载体中的设计位点以进行文库生成。也可使用替代的DNA合成和大基因组装方法来生成所设计的VL基因。
实例6.文库生成方法
使用改进的Kunkel单链诱变方法构建基于每个支架Fab的单个文库(15-Genentech论文、16-Henry Lowman的书籍)。为了使非诱变支架Fab模板对最终文库功能的影响减至最低,将TAA终止密码子***模板的H-CDR3区中。从CJ236菌株制备含有每个终止密码子的模板的单链DNA。每个寡核苷酸编码设计的H-CDR1和CDR2多样性,并在使用T7 DNA聚合酶和T4连接酶的DNA聚合反应中同时用作引物。用反应混合物转化MC1061F’感受态细胞,通常每文库构建物产生>109个单独菌落。从平板刮取菌落,接种于新鲜培养基,制备双链质粒DNA并用来转化CJ236细胞。转化的细胞用辅助噬菌体侵染,从过夜细胞培养物制备单链DNA,并将其用作反应模板以引入H-CDR3多样性。各个Fab支架/模板的文库被单独构建。在4个反应中构建了8个不同长度的H-CDR3,其中长度为7和8、9和10、11和12以及13和14个氨基酸的H-CDR3被分别分组。图7显示了文库架构方案。
目前的Kunkel方法虽然有效,但我们发现在构建序列高度复杂的文库时该方法消除非突变的亲本ssDNA通常仅达20-50%。在文库生成过程中在逐步的Kunkel反应中使用的短寡核苷酸进一步降低了该方法的效率。为了进一步消除亲本DNA,将含有酶切识别序列长度为6个碱基的限制性酶切位点(XbaI)的回文序列工程化转入靶向的诱变序列区(例如VH和/或VL)。在引物与ssDNA退火过程中,回文结构形成双链的阶梯-环结构,且诱变引物通过与侧翼序列杂交而跨越该回文序列(图8)。使用T7 DNA聚合酶使DNA复制沿退火的引物前进。闭环DNA通过T4DNA连接酶来产生。用限制性核酸内切酶将此产物在其在回文环当中的位置(XbaI)处进行消化,从而使亲本DNA链产生缺口并破坏其体内复制潜力。回文序列消除和Kunkel方法像组合,能消除95%以上的亲本DNA,这与目前单独使用Kunkel方法相比是一个显著改进。我们还通过重叠PCR生成了覆盖所有3个待进行序列多样化的靶CDR的大引物并用于诱变反应。这使得所有的组合序列多样化可在一个反应中完成,比使用短寡核苷酸的逐步反应更有效。例如,我们通过重叠PCR和/或通过使用GeneWriterTM的化学合成生成了VL文库片段并将它们用作大引物以进行杂交诱变。该大引物通过PCR产生,负链用生物素酰化的引物扩增(图9)。生物素酰化的链被捕获在链霉亲和素磁珠(Dynal)上,未生物素酰化的链通过在0.15M NaOH中变性而纯化。然后将洗脱的链用于在ssDNA上进行大引物介导的DNA复制(REStr420jw)。
在VH和VL中具有多样性的文库也可通过替代的方法和来源来生成。例如,VH和VL基因可从经免疫的动物组织扩增并与恒定区同框克隆以构建Fab文库(17-winter)。或者,来自经免疫的动物的CDR区(例如H-CDR3)可进行PCR扩增并克隆进从头文库中对应的区域,从而在从头的H-CDR1、H-CDR2和VL文库背景中形成免疫的H-CDR3的杂合体。此类文库的噬菌体淘选可分离出高亲和力结合的抗体。
实例7.同步亲和力成熟
我们设计了选自从头文库的结合物的亲和力成熟作为噬菌体淘选方法的一部分,并将该方法命名为“同步成熟”。该方法从一群经过或不经过详细表征的结合抗体开始,接着将结合物的Lc中的CDR序列多样化,所述结合物的Lc中的CDR序列来源自四个用作文库支架的种系Lc中的一个。Lc CDR多样性将产生额外的结合活性,这些结合活性可通过进一步的噬菌体淘选来选择。该方法在下面进行描述,也在下面进行详细说明(图10)。首先,将通过淘选Fab从头文库分离到的前导抗体的VH区亚克隆进VL回文环载体中。用VL文库大引物或实例6中描述的合适的方法制备这些载体的ssDNA用来进行杂交诱变。例如,可将回文序列消除和大引物Kunkel诱变方法有效地进行组合使用,以生成VL CDR多样化的二级文库,以进行同步亲和力成熟。亲本DNA通过XbaI消化和通过随后转化进非允许宿主菌株中来消除。该方法使得可以高效地生成覆盖设计的序列多样性的文库。然后通过用辅助噬菌体侵染突变的文库来构建噬菌体文库。接着使文库经历具有更高选择严格度的额外几轮淘选,以富集与最初选自原始文库的结合物相比结合亲和力得到改进的结合物。这些淘选方式包括降低抗原的浓度、增加洗涤时间和频率。作为另外一种选择,可将结合竞争物或其他结合压力因素(例如改变结合温度和添加洗涤剂)包括进结合和/或洗涤缓冲液中,以选择具有所需特性的结合物。其他适用于噬菌体结合和后续大肠杆菌侵染的生物化学和生物物理条件也可包括进淘选中。淘选后,从噬菌体回收DNA。表达了Fab并将其进行结合以及其他生物化学、生物物理学和生物学表征。还可将从噬菌体中回收的DNA直接克隆进lgG载体中。在这种情况中,mAb而非Fab将被表达和鉴定。例如,我们已经通过重叠PCR方法生成了VL文库片段,并将它们作为大引物用于杂交诱变。大引物通过PCR来产生,负链用生物素酰化的引物扩增(参见实例6)。生物素酰化的链被捕获在链霉亲和素磁珠(Dynal)上,非生物素酰化的链通过在0.15M NaOH中变性而纯化。然后将洗脱的链用于在ssDNA上进行大引物介导的DNA复制。将通过淘选Fab从头文库分离到的前导抗体的VH区亚克隆进VL环载体中。将这些选定的VH/VL环载体生成为ssDNA,以用VL文库大引物进行杂交诱变。经随机挑选的文库克隆的样品的序列测定出,亲本DNA的消除(由含有XbaI的回文结构的丢失表明)达100%。这3个CDR诱变成变体文库达75%。该方法使得可以高效地构建具有4×108个变体的文库。在用于Fab从头文库的其他3条VL-k链中进行文库的构建时,我们也观察到类似的结果。将文库转化为2×108,将噬菌体配制成1011cfu/mL。用从头pIX文库淘选BSA并分离命中蛋白(表3)。使用上述方法在针对BSA的初始命中蛋白上构建两个LC文库。文库由具有A27 LC多样性的F4 HC和一群具有B3 LC多样性的D6、F6、C2、C6 HC组成。
表3:BSA前导物
使用非严格或严格的洗涤条件,分别用10nM、1nM和1nM的抗原开展3轮淘选。对抗原阳性克隆进行测序,并纯化选定的克隆以获得亲和力数据。对于用较不严格条件淘选的B3文库,大多数富集的克隆为野生型。非野生型的那些克隆没有一个显示被富集,并且Biacore数据证实了它们在亲和力上没有改善。当将更加严格的淘选条件应用于此同一文库时,发现在LC CDR1中具有突变的克隆被富集,并且后续的Biacore分析显示亲和力改善了约3倍(表4)。从这个文库分离的所有克隆都含有D6重链,相对于其他重链,该D6重链对BSA的亲和力最高。对于A27文库,淘选方法既不产生出克隆富集也不回收到野生型。虽然未观察到单个克隆的富集,但在特定CDR位置处见到了氨基酸或氨基酸特性的富集。与亲本相比,选定的克隆显示了亲和力高达10倍的改善(表5和数据未示出)。
表4:B3文库的严格淘选
表5:A27文库的非严格淘选
实例8.平行文库淘选
由于我们的文库是设计和构建成使得每个亚文库可基于所用的支架HC或LC单独来使用,因此我们设计了平行淘选策略以淘选单个的以及子汇集(sub-pooled)的文库组,从而使鉴定多样的结合抗体的机会最大化。
选择BSA和溶菌酶作为模式抗原用于初始文库验证。我们通过使用Kingfisher保持LC构架分离以用于平行淘选,从而将1-69和3-23HC构架子文库汇集成4个亚组。作为比较,我们还将所有子文库1-69和3-23HC和相关的LC完全汇集在一个群中并用来针对BSA进行淘选。将生物素酰化的抗原包被的顺磁性小珠(Dyal)与噬菌体在室温下温育1小时。结合和洗涤以高通量形式在96孔板中进行。几次洗涤步骤后,将结合的噬菌体洗脱并通过侵染MC1061F′细胞进行扩增,以用于下轮选择(详细内容参见实例2)。几轮选择后,分离DNA,通过限制性酶切去除pIX,并将其连接和转化进MC1061F′中以表达可溶性Fab。用ELISA检测分离的单个克隆中Fab的表达以及抗原结合。通过在抗Fd包被的ELISA板上温育含有Fab的细胞提取物,然后使用抗k缀合HRR来检测Fab表达。通过在链霉亲和素包被的ELISA板上用后续加入的含有Fab的细胞裂解液捕获生物素酰化的抗原来检测抗原特异性。对于竞争性ELISA,包含了过量的非生物素酰化的抗原以竞争Fab结合。结合的Fab用抗k缀合HRP检测。
平行淘选的结果显示90个筛选的克隆中有30个与BSA结合,代表了本实验中命中率达33%。该命中率比使用完整的汇集文库来完成淘选时的7%的命中率高得多(表6)。虽然对于溶菌酶没有直接比较两种淘选策略,而只进行了一个完整汇集文库的淘选,其命中率为4%(表6)。鉴定出针对BSA的6个独特抗体和针对溶菌酶的3个独特抗体的序列分析示于图11中。
将独特的BSA和溶菌酶结合物纯化以确定结合亲和力(KD)。使用两步Fab纯化程序(REStm334bw.doc)来纯化Fab。简单地讲,首先对大肠杆菌裂解液进行单步IMAC程序。透析后,对IMAC柱洗脱液进行第二纯化步骤,使用QFF琼脂糖树脂进行阴离子交换,其将Fab的纯度提高至约80-90%。图12显示了纯化的BSA和溶菌酶Fab。
用BIAcore分析来确定6个BSA和3个溶菌酶结合物的亲和力。结果显示Fab的结合亲和力对于BSA结合物而言在0.1至28nM之间,对于溶菌酶结合物而言在6-260nM之间。没有检测到任一Fab组与BSA、溶菌酶或参照表面(空白、活化和封闭的CM5基质)的非特异性结合。表7和8示出了BSA和溶菌酶结合物的结合动力学。
实例9.亲和力排序
为了通过结合解离常数Koff来对Fab的顺序进行排列,采用Octet***(例如在公共网站如forteo.com上描述的)测量大肠杆菌粗上清液。用试验性生物素酰化抗原包被SA传感器探针。将大肠杆菌过夜诱导培养物用2×BBS/溶菌酶缓冲液进行裂解并将其置于96测定孔中。将校准的传感器尖端浸入含有大肠杆菌裂解液的测定孔中以测量结合缔合。然后将传感器尖端转移并置于单独的缓冲液中以测量结合解离。用制造商的软件分析结合动力学。表6用针对相同抗原的3个不同Fab样品比较了得自Octet和BIAcore的排序结果以供参考。还用BIND装置(例如通过srubio***)评估结合动力学,首先过滤表达Fab的细胞裂解液以去除未裂解的细胞、大细胞碎片、脂质和被剪切的核酸。校准链霉亲和素包被的传感器板,然后将其与生物素酰化的抗原一起温育。各孔以30秒的间隔读取2分钟,并用100μL/孔的1×PBS洗涤3次。然后将经过滤处理的Fab裂解液加入测定孔中,以让其结合到展示在链霉亲和素传感器板表面上的抗原。将各孔倒空,然后加入200μL的1×PBS。以30秒的间隔测量与生物素酰化抗原的结合信号2至5分钟。通过将解离数据拟合到结合于传感器表面的多个已知量的抗原获得Koff速率。虽然不能获得缔合速率,但解离速率(独立于Fab浓度)与Biacore结果相当。
上述测定形式的替代性测定形式是通过适于包含在Fab蛋白上的标签的抗F(ab’)2、抗Fd或抗HIS或抗FLAG来展示Fab。抗体可缀合到传感器板的氨基反应性表面上。含有Fab蛋白的经过滤的大肠杆菌裂解液或周质级分被缀合到传感器板上的抗F()2捕获。在与抗原温育后,可如上所述测量结合动力学。
开发了两种方法来用大肠杆菌粗上清液测量结合解离常数(Koff)。一种方法是使用大肠杆菌培养基粗上清液进行的基于ELISA的方法,另一种方法为Octet***(Fortebio网站),该***为能够一次测量多个样品的结合动力学的台式仪器。对于亲和力排序ELISA而言,对通过微表达(500μL)产生的Fab的量进行了定量。Fab表达ELISA能显示细胞裂解液部分和消耗的培养基部分中的Fab蛋白的量。由于两个部分都具有类似数量的Fab蛋白,而产生细胞裂解液需花费更多精力,因此选择消耗的培养基部分用于排序ELISA。使用了三种抗原来建立ELISA排序方法。它们是小鼠ST2L、人抗性蛋白和小鼠MCP-5。用序列独特的Fab试验它们结合其各自抗原的能力。对于每个样品,将含有表达的Fab的消耗培养基的多重稀释液应用于每个ELISA。将Fab的每个稀释液分成两份,一份等分试样用于与抗原结合,另一份等分试样用于测量每个稀释样品中含有的Fab蛋白的相对量。计算抗原结合和表达ELISA的结果,以建立每个稀释点的比活率。将比活率对相应的克隆作图可提供所有Fab样品的全局视图。从该视图,可确定哪个稀释液位于曲线的线性点并捕获最多的候选Fab用于排序。以1∶2稀释度和1∶4稀释度中检测53个mST2L样品。
1∶4稀释度用来确定这些Fab的排序,因为其显示位于稀释曲线的线性部分。8个mMCP-5Fab的排序使用更宽的稀释范围1∶2和1∶10来进行。这里所用的稀释范围位于结合曲线的线性范围之外。80个抗性蛋白Fab以1∶2、1∶4和1∶8稀释,以确定是否这三个稀释度可更好建立线性范围。在该稀释范围内这些Fab中仅有一部分具有线性的活性:浓度行为。再次表达抗性蛋白Fab,并将消耗的上清液按1∶5、1∶10和1∶20稀释。1∶5和1∶10的稀释液未使样品位于线性滴定曲线内,但是1∶20位于线性范围内。计算所有样品的比活率,并建立排序(表9A、B和C)。在Biacore上进行的亲和力测量显示,就其结合动力学而言,一些mST2LFab之间的差异很小,但排序ELISA数据的确显示了一些差异(表9A)。Fab28的排序在ELISA和Biacore结果之间的不一致可能是由于用于抗原取向的形式所致。ELISA具有在溶液中的抗原,而Biacore形式具有展示在表面上的抗原。Biacore结果中的Fab40显示较快的结合速率(ka),总体给出最差的KD。这可能是由于不准确的蛋白质浓度所致。mMCP-5 Fab显示ELISA和Biacore结果之间的排序具有良好的相关性。在两种测定法中,Fab S10、S14和S30为排序最低的结合物,Fab P9、P12、P20和S1为排序最高的结合物(表9B)。即使Fab P1在ELISA排序测定中是良好的结合物,但在1∶10稀释时它也显示降低的信号并且它在Biacore中为中等的结合物。
抗性蛋白Fab显示在ELISA和Biacore排序之间的相关性(表9C)。在ELISA和Biacore排序中,克隆551-22是最好的,克隆169-7是最差的。此外,323-7和323-32在ELISA和Biacore排序中仅次于克隆551-22。
表9A.采用Biacore结果的mST2L Fab比较图表
表9B.采用Biacore结果的mMCP-5Fab比较图表
表9C.采用Biacore结果的抗性蛋白Fab比较图表
除一些例外之外,ELISA排序数据与从Biacore相互作用分析所估计的解离值相关性最好。基于优化的ELISA的排序方法支持大量候选Fab的正确筛选和管理。使用Octet仪器时,开发了两种形式,用于通过动力学结合活性对候选Fab进行排序。溶液形式用施加于传感器尖端表面的Fab操作,并且抗原存在于溶液中。当抗原结合到Fab时,通过测量一段时间内加到传感器表面的生物量来计算缔合速率。在抗原结合于Fab后,将传感器放入缓冲液(即1×PBS)中,此时计算解离速率,得出传感器上生物量随着时间推移的减少量。在固定化的动力学结合测定中,将抗原施加到传感器尖端表面,并且Fab存在于溶液中。通过Fab随着时间推移增加然后减少尖端上的生物量来确定缔合速率和解离速率。
胺反应性传感器尖端的基本方案首先从建立最初的基线开始,然后进行活化步骤将第一分子(即第二rgt、Fab、Ag)施加于尖端传感器。在第一分子已结合到尖端传感器后进行猝灭步骤,并建立另一基线,然后允许与另一个分子发生结合相互作用。接着进行上样(即,将Fab或抗原加到第二试剂包被的尖端传感器)或缔合步骤(即,Fab或抗原包被传感器)。如果是上样步骤,那么在缔合步骤进行之前建立另一基线。一旦完成缔合步骤,即进行解离步骤,该实验即完成。溶液动力学结合测定使用高结合性SA包被的传感器尖端。按照如下方式制备样品96孔板(目录号675076,Greiner Bio-One):柱1用100μl的1×PBS填充以建立尖端传感器基线,柱2用浓度为10μg/ml的Bt-抗人F(Ab)’2(目录号109-066-097,Jackson Immunological)的1×PBS溶液填充以上样到SA包被的传感器尖端表面,柱3用100μl的1×PBS填充以建立第二基线,柱4用100μl浓度为10μg/ml的Fab样品的1×PBS溶液填充以进行第二上样步骤,柱5用100μg/ml的1×PBS填充以建立第三基线,柱6用10μg/ml的抗原的1×PBS溶液填充以进行缔合步骤,以及柱6孔含有1×PBS以进行解离步骤。为每步设定动力学方案,以在30℃下运行,并且振摇速度为1000rpm。第一基线运行100秒。第一上样步骤(抗人F(Ab)’2)运行600秒。第二基线运行200秒。第二上样步骤(候选Fab)运行600或900秒。第三基线运行不超过300秒。缔合步骤(抗原)运行600秒,解离步骤运行最多900秒。固定化动力学结合测定使用胺反应性传感器尖端。尖端传感器盒首先在室温下于合适的MES pH溶液(胺偶联试剂盒(Amine Coupling Kit),Fortebio)中温育10分钟。按照如下方式制备样品96孔板(目录号675076,Greiner Bio-One):柱1用合适的MES pH溶液填充以建立尖端传感器基线,柱2用溶于基线MES pH溶液中的1∶50比率的EDC/NHS(胺偶联试剂盒,Fortebio)以活化传感器表面,柱3用溶于MESpH溶液中的10μg/ml抗原填充以上样到传感器尖端,柱4用乙醇胺溶液(胺偶联试剂盒,Fortebio)填充以猝灭上样有抗原的传感器的未被占据表面,柱5用100μl 1×PBS填充以建立第二基线,柱6用10μg/ml的Fab样品的1×PBS溶液填充以进行缔合步骤,柱7孔用1×PBS填充以进行解离步骤。为每步设定动力学方案,以在30℃下运行,并且振摇速度为1000rpm。第一基线运行100秒。活化步骤运行最多900秒,抗原上样步骤运行600秒。猝灭步骤运行最多300秒。第二基线运行最多300秒。缔合步骤(抗原)运行600秒,解离步骤运行最多900秒。针对3种不同尺寸的抗原进行溶液动力学测定。该额外的变量(抗原的尺寸)是用来了解不同的生物量累积会如何影响用于候选Fab排序的最终计算结果。我们发现抗原的尺寸越大则产生的信号(Y轴)和R2值越好(表13A-C)。胺将Fab直接偶联到传感器可有助于增加溶液动力学测定中的缔合信号,这是由于从传感器表面消除了抗F(Ab)’2这个100kDa分子,因而增加了发现加入最后一个分子的质量的效应的能力。Octet可根据各Fab的缔合和解离信号曲线显示它们之间的差别,并且它们与计算的速率常数相关。mST2LFab 16、26和28与Fab 1和38相比具有更好的结合速率(图13a)。抗性蛋白Fab 323-11和551-7为最好的结合物,Fab 169-1和551-38为最差的结合物(图13b)。使用mMCP-5 Fab时,除了可区分Fab14是最差的以外,以这种形式无法区分抗原结合排序(图13c)。如前所述,用于测量mMCP-5的该形式可能不是最好的。mMCP-5的尺寸比Fab要小很多(分别为9kDa和50kDa),加上尖端用100kDa第二试剂包被,这将使得测量信号差别的能力更差。
固定化测定形式提供了评估Fab结合动力学的另一种方式。当抗原(例如mMCP-5)比溶液形式测定中的图13C中所见的Fab更小时,信号会减弱。试图读取已经建立在传感器上的大质量顶部的小蛋白质,效果很小。围绕较小分子mMCP-5位于传感器上的位置转动结合伴侣,然后读取较大分子(如Fab)的结合活性,这应产生更显著的信号。此效应在图14中观察到,其中mMCP-5通过胺偶联到传感器表面并且当加入Fab时测量缔合。这个测定形式中的信号增加为溶液形式中观察到的信号增加的至少两倍。另外,现在缔合R2值大于0.85,而这些值在溶液形式中平均为0.57。(表14)
Biacore目前为测定结合动力学的标准。我们比较了对于上述Fab得自Octet的数据和得自Biacore的数据。Biacore与Octet之间在灵敏性上似乎存在差别(图15)。Biacore的亲和常数KD通常大于Octet的亲和常数。在Octet实验中,使用的被分析物浓度为10μg/ml,而在Biacore中被分析物浓度为1μg/ml。Octet中使用10倍被分析物可导致缔合速率常数显得更快。另外,由于在测定中过量的被分析物进行竞争,解离速率常数会间接地受到影响。合在一起,这会导致Octet的亲和常数与Biacore相比显得更差。虽然并未直接证实,但是该灵敏性问题也会对排序产生影响。对于排序,抗性蛋白Fab在Biacore与Octet之间确实表现出一定的相关性。抗性蛋白与其他抗原例子之间的唯一差异为Fab与抗原之间分子大小的差异。Fab为50kDa,抗性蛋白为66kDa,使得它们的大小更接近,而mST2L为100kDa,mMCP-5为9kDa,它们的大小不同。
还使用了BIND(www.srubiosystems.com)测量结合动力学,BIND为另一款台式仪器,可以一次测量96个样品。首先过滤表达Fab的细胞的裂解液以去除未裂解的细胞、大细胞碎片、脂质和被剪切的核酸。将链霉亲和素包被的传感器板校准并与生物素酰化的抗原温育。以30秒的间隔对各孔进行读数2分钟,并用100μL/孔的1×PBS洗涤3次。然后将过滤器处理过的Fab裂解液加入各测定孔中,让其结合到展示在链霉亲和素传感器板表面上的抗原。倒空各孔并加入200μL的1×PBS。以30秒的间隔测量与生物素酰化抗原的结合信号2-5分钟。SRU-BIND软件可扣除从对照孔(其中加入无Fab的细胞裂解液)获得的本体信号。通过将解离数据拟合到结合于传感器表面的多个已知的抗原获得Koff。虽然缔合速率很难获得,但解离速率(与Fab浓度无关)与Biacore结果相当。
上述测定形式存在若干替代的测定形式。例如,使用BIND仪器,适当时可通过传感器板上的固定化抗F(ab’)2、抗Fd或抗HIS或抗FLAG捕捉Fab。让经过滤的含有Fab蛋白的大肠杆菌裂解液或周质级分被缀合在传感器板上的抗F(ab’)2捕捉。与抗原温育后,可如上所述测量结合动力学。另外,纯化的Fab可直接缀合到传感器板的胺反应性表面上,并以这种形式用于测量抗原结合。
还使用了BINDTM(Srubiosystems网站)测量结合动力学,BINDTM为另一台式仪器,可以一次测量96个样品。首先过滤表达Fab的细胞的裂解液以去除未裂解的细胞、大细胞碎片、脂质和被剪切的核酸。将链霉亲和素包被的传感器板校准并与生物素酰化的抗原温育。以30秒的间隔对各孔进行读数2分钟,并用100μL/孔的1×PBS洗涤3次。然后将过滤器处理过的Fab裂解液加入各测定孔中,以允许结合到展示在链霉亲和素传感器板表面上的抗原。倒空各孔并加入200μL的1×PBS。以30秒的间隔测量与生物素酰化抗原的结合信号2-5分钟。SRU-BINDTM软件将扣除从对照孔(其中加入无Fab的细胞裂解液)所得的本体信号。通过将解离数据拟合到结合于传感器表面的多个已知的抗原获得Koff。虽然缔合速率很难获得,但解离速率(与Fab浓度无关)与Biacore结果相当。
上述测定形式存在若干替代的测定形式。例如,使用BIND仪器,适当时可通过传感器板上的固定化抗F(ab’)2、抗Fd或抗HIS或抗FLAG捕捉Fab。让经过滤的含有Fab蛋白的大肠杆菌裂解液或周质级分被缀合在传感器板上的抗F(ab’)2捕捉。与抗原温育后,可如上所述测量结合动力学。另外,纯化的Fab可直接缀合到传感器板的胺反应性表面上,并以这种形式用于测量抗原结合。
优势
上述人Fab从头文库与其他此类文库截然不同,因为是通过M13噬菌体的pIX蛋白展示的。代表性的人种系和典范结构序列作为文库支架的使用,和模拟H-CDR3中氨基酸天然分布的CDR序列的设计,使得该文库能广泛地涵盖人免疫组库。与文献中报道的其他从头文库(建立在单个或共有的种系基因或成熟的单克隆抗体支架上)相比,该文库设计能增加对靶抗原进行抗体发现的可能性。单独的子文库(每个由独特的支架(VH/VL对)和/或H-CDR3长度构成),加上对各文库的平行淘选,使得对靶抗原进行具有多样化序列的抗体的发现的可能性最大化。此外,这还提供了一种机制,以详细研究每个VH/VL对及它们各自的序列和结构在抗体/抗原结合中的功能性。一体化的同步亲和力成熟方法是一种能分离高亲和力抗体同时又能保持多样性的有效方法。
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表
表1.重链CDR1和CDR2设计
模板3-23
来源自3-23种系亚家族的IgG中氨基酸的位置出现频率(%)设计密码
子编码的覆盖率
(来自3-23种系亚家族的氨基酸以红色粗体显示。)
模板5-51
来源自3-23种系亚家族的IgG中氨基酸的位置出现频率(%)设计密码
子编码的覆盖率
(来自5-51种系亚家族的氨基酸以红色粗体显示。)
模板1-69
来源自3-23种系亚家族的IgG中氨基酸的位置出现频率(%)设计密码
子编码的覆盖率
(来自1-69种系亚家族的氨基酸以红色粗体显示。)
模板3-53
来源自3-23种系亚家族的IgG中氨基酸的位置出现频率(%)设计密码
子编码的覆盖率
(来自3-53种系亚家族的氨基酸以红色粗体显示。)
粗体:出现在相同家族的种系序列中
斜体:核苷酸
表2.轻链CDR设计。
位置 | 0012 | LL6 | 位置 | AA27 | 位置 | B3 |
330 | SSRNAD | SRNAD | 30 | SSRNTD | ||
331 | NNSKD | NSKD | 31 | NNSR | 31 | SYHFA |
31a | SSRNADH | 31e | KTNE |
332 | YYWDFHSNA | YWDFHSNA | 32 | YYFHQSEK | 32 | YWDFHSNA |
550 | AADGKYFTN | ADGKYFTN | 50 | AADGS | 50 | ADWSRY |
991 | YYSHA | YSGFR | 91 | YYSHA | 91 | YSHA |
992 | YYNDSHIFK | YSNHLR | 92 | YYNDSHIFK | 92 | YNDSHIFK |
993 | SSNTDGHR | SNTDGHR | 93 | S SNTDGHR | 93 | SNTDGHR |
94 | TYLVFAS | WA | 94 | TYLVFAS | 94 | TYLVFAS |
96 | WYFLIR | WYFLIR | 96 | WYFLIR | 96 | WYFLIR |
多样性 | 1.2×107 | 1.5×106 | 2.4×107 | 9×106 |
λ
位置 | 1e | 位置 | 1b | 位置 | 2a2 | 位置 | 3L |
31b | GATND | 31a | NS | 31a | GS | 29 | STNR |
32 | DG | 32 | YTA | 31c | ND | ||
34 | HN | 34 | SN | 32 | YLR | 33 | SN |
50 | GSAD | 50 | DESR | 50 | ED | ||
51 | SN | 51 | ND | 53 | NK | 52 | NS |
53 | NHY | 52 | ND | ||||
53 | KQ | ||||||
89 | GA | ||||||
90 | TA | 92 | TA | ||||
93 | SNRTI | 93 | SD | 93 | SG | 93 | SNTG |
94 | SNRTI | SN | 94 | SGT | |||
95a | SHN | 95a | SN | 95a | TN | 95a | ND |
95b | GAV | 95b | AG | 95b | FLSPYHVAE |
95c | SHPL | 95c | DHSGAFNL | ||||
96 | 设计的 | 96 | 设计的 | 96 | 设计的 | 96 | 设计的 |
多样性 | 9.20E+06 | 2.30E+06 | 1.50E+05 | 4.00E+04 |
表6.BSA和溶菌酶淘选结果汇总
筛选总数 结合抗原Ag | |
BSA | |
子库:单个的4Lc | 90 30(33%) |
完整库 | 180 12(7%) |
溶菌酶 | |
完整库 | 180 7(4%) |
表7:纯化的Fab的活性及其与BSA(40RU)结合的表观K
D
Fab | ka×105M-1s-1 | kd×10-3s-1 | KD(nM) | Rmax(RU) |
C2 | 0.60(3) | 1.69(1) | 28 | 4* |
C6 | - | - | NB | NB |
D6 | 5.72 | 1.95(1) | 4 | 40 |
D11 | 56.16(2) | 0.53(1) | 0.09 | 44 |
F4 | 0.51(2) | 0.48(1) | 9 | 10* |
F6 | 4.3(1) | 11.3(1) | 26 | 43 |
NB:没有结合
表8:纯化的Fab的活性及其与溶菌酶(10RU)结合的表观K
D
Fab | ka×105M-1s-1 | kd×10-3s-1 | KD(nM) | Rmax(RU) |
E5 | 2.27(1) | 2.33(1) | 10 | 51 |
E7 | 4.6(1) | 120(2) | 260 | 50 |
E8 | 4.24(2) | 2.49(1) | 6 | 50.5 |
表13A
表13B
表13C
表13A-C示出得自Octet的溶液形式的动力学数据。A)用Octet通过缔合和解离速率常数对结合到100kD ST2L的Fab、Fab 26、Fab 28、Fab1、Fab 38进行排序。B)用Octet通过缔合和解离速率常数对结合到66kDa抗性蛋白的Fab 169-3、Fab 169-7、Fab 323-11、Fab 323-32、Fab 551-7、Fab 551-22和Fab 551-38进行排序。C)用Octet通过缔合和解离速率常数对结合到9kDa MCP-5的Fab P1、Fab P9、Fab P12、FabP20、Fab S1、Fab S14和Fab S30进行排序。
表14:
表14:得自Octet的固定形式的动力学数据。用Octet通过缔合和解离速率常数对结合到9kDa MCP-5的Fab P1、Fab P9、Fab P12、FabP20、Fab S1、Fab S14和Fab S30进行排序。
表15A:mST2L
Fab样品 | ka×105M-1s-1 | kd×10-4s-1 | KD(nM) | ka×105M-1s-1 | kd×10-4s-1 | KD(nM) |
16 | 2.41 | 7.2 | 3 | 0.903 | 2.65 | 2.9 |
26 | 1.469 | 6.31 | 4.3 | 1.02 | 1.86 | 1.8 |
28 | 2.12 | 0.6 | 0.31 | 0.508 | 1.86 | 3.6 |
表15B:抗性蛋白
表15C:mMCP-5
表15A-C:Biacore与Octet之间动力学速率常数的比较图表。从上到下的图表分别为mST2L、抗性蛋白和mMCP-5Fab组。
Claims (25)
1.一种工程化的重组核酸噬菌体载体,所述载体用于表达结合选定的生物活性配体的噬菌体展示pIX或pVII融合抗体fab片段氨基酸序列,并且所述载体包括:
a.编码重组噬菌体前导序列的核酸序列;其可操作地连接到:
b.编码重组标签、启动子或选择序列的核酸序列;其可操作地连接到:
c.编码选择性结合所述生物活性配体的可变重链种系的核酸序列;其可操作地连接到:
d.编码选择性结合所述生物活性配体的恒定重链种系的一部分的核酸序列;其可操作地连接到:
e.编码肽接头的核酸序列;其可操作地连接到a:
f.编码重组pIX或pVII的核酸序列:
g.编码选择性结合所述生物活性配体的可变轻链种系的核酸序列;其可操作地连接到:
h.编码选择性结合所述生物活性配体的恒定轻链种系的一部分的核酸序列。
2.根据权利要求1所述的工程化的核酸噬菌体载体,其中所述噬菌体前导序列编码序列为pelB序列。
3.根据权利要求1所述的工程化的核酸噬菌体载体,其中所述重组标签或选择序列为FLAG标签序列。
4.根据权利要求1所述的工程化的核酸噬菌体载体,其中所述启动子为诱导型启动子。
5.根据权利要求1所述的工程化的核酸噬菌体载体,其中所述诱导型启动子为lac启动子。
6.根据权利要求9所述的工程化的核酸噬菌体载体,其中所述生物活性配体介导至少一种体内生物活性。
7.一种细菌宿主细胞,所述细菌宿主细胞包含根据权利要求1所述的工程化的核酸噬菌体载体。
8.一种生物活性融合蛋白,所述生物活性融合蛋白由根据权利要求11所述的细菌宿主细胞表达。
9.一种生物活性fab抗体片段变体,所述生物活性fab抗体片段变体来源自根据权利要求13所述的融合蛋白。
10.一种细菌宿主细胞的噬菌体文库,所述噬菌体文库包含复数种根据权利要求1所述的工程化的核酸噬菌体载体。
11.根据权利要求14所述的噬菌体文库,其中所述生物活性fab抗体片段变体被表达为复数种fab抗体片段。
12.一种用于在噬菌体fab抗体片段文库中筛选具有所需生物活性的fab抗体片段的方法,所述方法包括:(a)从权利要求11所述的噬菌体文库表达fab抗体片段,以及(b)选择出表达具有所述所需生物活性的所述fab抗体片段的细菌细胞。
13.一种编码fab抗体片段的核酸,所述核酸得自根据权利要求12所述的方法。
14.一种IgG或IgA类免疫球蛋白,所述免疫球蛋白包含根据权利要求13所述的fab抗体片段。
15.一种药物组合物,所述药物组合物包含根据权利要求13所述的fab抗体片段。
16.根据权利要求11所述的噬菌体文库,其中所述复数种为选自至少下列数目的所述变体中的至少一者:103、104、105、106、107、108、109、1010、1011、1012或1013。
17.根据权利要求11所述的噬菌体文库,其中所述变体采用Kunkel诱变方法产生。
18.根据权利要求11所述的噬菌体文库,其中所述变体包括复数种包含在所述fab抗体片段中的多样的重链互补决定区(CDR)3变体。
19.根据权利要求18所述的噬菌体文库,其中所述多样的CDR3变体包括约109至1018个序列变化。
20.根据权利要求11所述的噬菌体文库,其中所述变体包括复数种包含在所述fab抗体片段中的多样的重链互补决定区(CDR)1和2变体。
21.根据权利要求20所述的噬菌体文库,其中所述多样的CDR3变体包括约102至105个序列变化。
22.根据权利要求11所述的噬菌体文库,其中所述噬菌体文库还包括亲和力成熟的fab抗体片段,所述抗体片段相比所述噬菌体文库的之前版本具有改善的结合亲和力。
23.根据权利要求22所述的噬菌体文库,其中所述fab抗体片段被进行淘选,以获得具有提高的亲和力或生物活性的所述fab抗体片段。
24.根据权利要求23所述的噬菌体文库,其中所述淘选作为文库生成过程的一部分进行,或者使用所述噬菌体文库的子集平行进行。
25.一种噬菌体文库的子集,所述噬菌体文库的子集包括根据权利要求11所述的噬菌体文库的一部分,其中所述噬菌体文库的子集包含具有与亲和力或生物活性相关的选定特性的fab抗体片段。
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