ES2402527T3 - Procedimientos para obtener estructuras de carbohidrato de tipo mamífero mediante ingeniería genética - Google Patents

Abstract

Un procedimiento para producir una glicoproteína qUn procedimiento para producir una glicoproteína que comprende la expresión de un ácido nucleico queue comprende la expresión de un ácido nucleico que codificala glicoproteína en una célula huésped eu codificala glicoproteína en una célula huésped eucariótica inferior que tiene actividad disminuida cariótica inferior que tiene actividad disminuida o agotada de una o másenzimas seleccionadas de ento agotada de una o másenzimas seleccionadas de entre: (a) dolicil-P-Man:Man5GlcNAc2-PP-dolicil alfa-re: (a) dolicil-P-Man:Man5GlcNAc2-PP-dolicil alfa-1,3 manosiltransferasa (alg3); (b) dolicil-P-Man:M1,3 manosiltransferasa (alg3); (b) dolicil-P-Man:Man6GlcNAc2-PP-dolicil alfa-1,2 manosiltransferasa an6GlcNAc2-PP-dolicil alfa-1,2 manosiltransferasa (alg9); o (c) dolicil-P-Man:Man7GlcNAc2-PP-dolicil(alg9); o (c) dolicil-P-Man:Man7GlcNAc2-PP-dolicil alfa-1,6 manosiltransferasa (alg12); expresando a alfa-1,6 manosiltransferasa (alg12); expresando además dicha célulahuésped: (I) un dominio catalítidemás dicha célulahuésped: (I) un dominio catalítico de α-1,2-manosidasa fusionado a un péptidco de α-1,2-manosidasa fusionado a un péptido dirigido que se dirige al retículoendoplásmico (o dirigido que se dirige al retículoendoplásmico (RE) o aparato de Golgi en la célula huésped; y (IIRE) o aparato de Golgi en la célula huésped; y (II) un dominio catalítico de GlcNAc transferasa I (G) un dominio catalítico de GlcNAc transferasa I (GnT I) fusionado a un péptido dirigido que se dirignT I) fusionado a un péptido dirigido que se dirige al retículoendoplásmico (RE) o aparato de Golgi e al retículoendoplásmico (RE) o aparato de Golgi en la célula huésped; para producir una glicoproteen la célula huésped; para producir una glicoproteína que tiene estructuras de núcleo GlcNAcMan4GlcNína que tiene estructuras de núcleo GlcNAcMan4GlcNAc2 o GlcNAcMan3GlcNAc2. Ac2 o GlcNAcMan3GlcNAc2.

Description

Procedimientos para obtener estructuras de carbohidrato de tipo mamífero mediante ingeniería genética

Campo de la invención

La presente invención se refiere, en general, a la modificación de estructuras de glicosilación de proteínas recombinantes expresadas en hongos u otros eucariotas inferiores, para que se asemejen más a la glicosilación de proteínas de mamíferos superiores, en particular de seres humanos.

Antecedentes de la invención

Después de que el ADN se transcriba y se traduzca en una proteína, el procesamiento postraduccional adicional implica la unión de residuos de azúcar, un proceso conocido como glicosilación. Organismos diferentes producen enzimas de glicosilación diferentes (glicosiltransferasas y glicosidasas), y tienen sustratos diferentes (azúcares nucleotídicos) disponibles, de forma que los patrones de glicosilación, así como la composición de los oligasacáridos individuales, incluso de una misma proteína, serán diferentes dependiendo del sistema huésped en el que la proteína particular se está expresando. Las bacterias, típicamente, no glicosilan proteínas, y si lo hacen, solo de una forma muy inespecífica (Moens, 1997). Los eucariotas inferiores tales como hongos filamentosos y levaduras añaden principalmente azúcares de manosa y de manosilfosfato, mientras que las células de insectos tales como células Sf9 glicosilan proteínas de otro modo. Véase, por ejemplo (Bretthauer, 1999; Martinet, 1998; Weikert, 1999; Malissard, 2000; Jarvis, 1998 y Takeuchi, 1997).

La síntesis de una estructura de los oligosacáridos de tipo mamífero consiste en una serie de reacciones, en el transcurso de las cuales se añaden y se retiran residuos de azúcares mientras que la proteína se mueve a lo largo de la ruta secretora en el organismo huésped. Las enzimas que residen a lo largo de la ruta de glicosilación del organismo o célula huésped determinan los patrones de glicosilación resultantes de proteínas secretadas. Desafortunadamente, el patrón de glicosilación resultante de proteínas expresadas en células huésped eucariotas inferiores difiere sustancialmente de la glicosilación observada en eucariotas superiores tales como seres humanos y otros mamíferos (Bretthauer, 1999, Maras, 1999a). Además, el patrón de glicosilación considerablemente diferente, en algunos casos, se ha demostrado que aumenta la inmunogenicidad de estas proteínas en seres humanos y reduce su semivida (Takeuchi, 1997). Sería deseable producir glicoproteínas de tipo humano en células huésped no humanas, especialmente células eucariotas inferiores.

Las etapas tempranas de glicosilación humana pueden dividirse en al menos dos fases diferentes: (i) los oligosacáridos Glc3Man9GlcNAc2 unidos a lípidos se ensamblan mediante una serie secuencial de reacciones en la membrana del retículo endoplasmático (RE) y (ii) la transferencia de este oligosacárido desde el pirofosfato de dolicilo anclado a lípido a la proteína sintetizada de novo. El sitio de la transferencia específica está definido por un residuo de asparagina (Asn) en la secuencia Asn-Xaa-Ser/Thr (véase la Fig. 1), en la que Xaa puede ser cualquier aminoácido excepto prolina (Gavel, 1990). El procesamiento adicional mediante glucosidasas y manosidasas tiene lugar en el RE antes de que la glicoproteína naciente se transfiera al aparato de Golgi temprano, en el que los residuos de manosa adicionales se retiran mediante alfa (a)-1,2-manosidasas específicas del aparato de Golgi. El procesamiento continúa mientras la proteína avanza a través del aparato de Golgi. En el aparato de Golgi medio, una serie de enzimas modificadoras, incluidas N-acetilglucosaminiltransferasas (GnT I, GnT II, GnT III, GnT IV, GnT V, GnT VI), manosidasa II y fucosiltransferasas, añaden y retiran residuos de azúcar específicos (véase, por ejemplo, las Fig. 2 y 3). Finalmente, en la región trans del aparato de Golgi, las galactosiltransferasas y las sialiltransferasas producen una estructura de glicoproteína que se libera desde el aparato de Golgi. Es esta estructura, caracterizada por estructuras bi-, tri- y tetra-antenarias, que contiene galactosa, fucosa, Nacetilglucosamina y un nivel alto de ácido siálico terminal, la que proporciona a las glicoproteínas sus características humanas.

En casi todos los eucariotas, las glicoproteínas se derivan del precursor común de oligosacáridos de núcleo Glc3Man9GlcNAc2-PP-Dol, en el que PP-Dol representa pirofosfato de dolicol (Fig. 1). Dentro del retículo endoplasmático, la síntesis y el procesamiento de oligosacáridos unidos a pirofosfato de dolicol son idénticos entre todos los eucariotas conocidos. No obstante, el procesamiento adicional del oligosacárido de núcleo mediante levadura, una vez que se ha transferido a un péptido que abandona el RE y penetra en el aparato de Golgi, difiere significativamente del de seres humanos, ya que este se mueve a lo largo de la ruta secretora e implica la adición de varios azúcares manosa.

En levadura, estas etapas están catalizadas por las manosiltransferasas que residen en el aparato de Golgi, tales como Och1p, Mnt1p y Mnn1p, que añaden secuencialmente azúcares manosa al oligosacárido del núcleo. La estructura resultante no es deseable para la producción de proteínas humanoides y es, por lo tanto, deseable para reducir o eliminar la actividad de manosiltransferasa. Se ha demostrado que los mutantes de S. cerevisiae, deficientes en actividad manosiltransferasa (por ejemplo, los mutantes och1 o mnn9) no son mortales y muestran un contenido en manosa reducido en el oligosacárido de glicoproteínas de levadura. También puede tener que eliminarse otras enzimas que procesan oligosacáridos, tales como manosilfosfato transferasa, dependiendo del patrón de glicosilación endógeno particular del huésped. También se ha abordado en otros estudios la Nglicosilación en diversas células huésped.

Miele y col. (1999) caracterizaron las propiedades de estafiloquinasa recombinante expresada en Pichia pastoris, específicamente con respecto a N-glicanos presentes en el sitio consenso único de glicosilación unido a N en esta molécula.

5 Omtve y col. (2000) analizaron la estructura y conformación de la glicosilación de cadenas ligeras de inmunoglobulina asociada con amiloidosis.

Fukata y col. (2000) compararon la estructura de N-glicanos presentes en la región constante de la cadena de IgM producidos en una línea de linfocitos B humanos inmortalizados o en un hibridoma derivado de una fusión de los linfocitos B humanos inmortalizados con células de mieloma humanas.

10 Takahashi y col. (1987) realizaron un estudio estructural de los oligosacáridos de IgG unidos a N de IgG normal humana e IgG derivada de pacientes con mieloma múltiple.

Umana y col. (1997) desarrollaron un modelo matemático cuya función principal es calcular las tendencias cualitativas esperadas en la distribución de oligosacáridos unidos a N resultantes de cambios en los niveles de una o varias enzimas implicadas en la red de reacciones catalizadas por enzimas que realizan la biosíntesis de

15 oligosacáridos unidos a N en células de ovario de hámster chino (CHO).

Kato y col. (1989) estudiaron la regulación de la producción del exopolisacárido alginato en Pseudomonas aerigunosa y los genes que controlan la síntesis de alginato.

Duman y col. (1998) estudiaron la O-manosilación de proteínas celulares y recombinantes producidas en Pichia pastoris.

20 Miele y col. (1997) examinaron las propiedades de glicosilación de un dominio kringle 2 recombinante expresado en Pichia pastoris de activador plasminógeno de tipo tejido.

Tremblay y col. (1999) informaron de la clonación y expression de un ADNc humano nuevo que codifica una proteína de membrana de tipo II con una secuencia similar a a-1,2-manosidasa de clase I. La enzima recombinante elimina un único residuo de manosa de Man9GlcNAc para producir Man8GlcNAc.

25 Vasquez-Reyna (1993) describió la identificación y caracterización de una forma soluble de una a manosidasa de la levadura Candida albicans.

Suzuki y col. (2001) realizaron un análisis inmunoquímico y mutacional de una ATPasa de tipo P de levadura.

Precursores de oligosacáridos unidos a lípidos

Tienen un interés particular para la presente invención las etapas tempranas de N-glicosilación (Figs. 1 y 2). El 30 estudio de mutantes alg (glicosilación unida a asparagina) que no realizan la biosíntesis del Glc3Man9GlcNAc2-PP-Dol ha ayudado a elucidar las etapas iniciales de N-glicosilación (Cipolo y col. 1999).

El gen ALG3 de S. cerevisiae se ha clonado y se ha inactivado por deleción exitosamente (Aebi, 1996). Se ha demostrado que el ALG3 codifica la enzima Dol-P-Man:MansGlcNAc2-PP-Dol manosiltransferasa, que está implicada en la primera etapa de manosilación dependiente de Dol-P-Man a partir de ManSGlcNAc2-PP-Dol para dar

35 Man6GlcNAc2-PP-Dol en el lado luminar del RE (Sharma, 2001) (Fig 1 y 2). Las células de S.cerevisiae que tienen una mutación alg3-1 débil acumulan Man5GlcNAc2-PP-Dol (estructura I) (Huffaker, 1983).

Man5GlcNAc2 (estructura I) y Man8GlcNAc2 acumulan en la célula completa manoproteína de un mutante och1 mnn1

alg3 (Nakanishi-Shindo, 1993). Se demostró que este mutante och1, mnn1, alg3 de S.cerevisiae era viable, pero sensible a la temperatura y carecía de cadenas exteriores de a-1,6 polimanosa.

En otro estudio, se estudiaron las proteínas secretoras expresadas en una cepa con deleción de alg 3 (antecedente Lalg3) para determinar su resistencia a endo-1-N-acetilglucosaminidasa H (Endo H) (Aebi, 1996). Observaciones previas han indicado que solo los oligosacáridos mayores que Man5GlcNAc2 son susceptibles de escindirse mediante Endo H (Hubbard, 1950). En el fenotipo alg3-1, algunas glicoformas fueron sensibles a escisión con Endo H, confirmando su debilidad, mientras que en el mutante Lalg3 todas las glicoformas parecieron ser resistentes y del tipo Man5 (Aebi, 1996), sugiriendo un fenotipo estrecho y la transferencia de estructuras de oligosacárido Man5GlcNAc2 a la cadena polipeptídica naciente. Ningún fenotipo obvio se asoció con la inactivación del gel ALG3 (Aebi, 1996). Se encontró que la exogluconasa segregada producida en un mutante alg3 de Saccharomyces cerevisiae contenía entre el 35 y el 44 % de formas subglicosiladas y no glicosiladas y solo aproximadamente el 50 % de los oligosacáridos transferidos seguían siendo resistentes al tratamiento con Endo H (Cueva, 1996). La exoglucanasa (Exg), una enzima que contiene dos sitios de N-glicosilación potenciales en Asn165 y Asn325, se analizó con más detalle. Para moléculas de Exg que recibieron dos oligosacáridos, se demostró que el primer sitio de Nglicosilación (Asn165) estaba enriquecido en residuos truncados, mientras que el segundo (Asn325) estaba enriquecido en oligosacáridos regulares. El 35-44 % de exoglucanasa segregada estaba no glicosilada o subglicosilada y aproximadamente el 73-78 % de todos los sitios de N-glicosilación estaban ocupados por oligosacáridos bien truncados o bien normales (Cueva, 1996).

Transferencia de oligosacáridos unidos a lípidos glucosilados

La evidencia sugiere que, en células de mamífero, solo se transfieren a proteínas nacientes oligosacáridos unidos a lípidos glucosilados (Turco, 1977), mientras que en mutantes alg5, alg6 y dpg1 de levadura pueden transferirse oligosacáridos no glucosilados (Ballou, 1986; Runge, 1984). En un mutante alg8 de Saccharomyces cerevisiae, se transfiere GlcMan9GlcNAc2 subglucosilado (Runge, 1986). Verostek y colaboradores estudiaron un mutante alg3, sec18, gls1 y propusieron que la glucosilación de una estructura Man5GlcNAc2 (estructura I, anteriormente) es relativamente lenta en comparación con la glucosilación de una estructura Man9 unida a lípido. Además, la transferencia de esta estructura Man5GlcNAc2 a la proteína parece ser aproximadamente 5 veces más eficaz que la glucosilación para dar Glc3Man5GlcNAc2. La velocidad disminuida de la glucosilación de Man5GlcNAC2 en combinación con la velocidad comparativamente más rápida de la transferencia de la estructura Man5 a la proteína naciente se cree que es la causa de la acumulación observada de estructuras Man5 no glucosiladas en levadura mutante alg3 (Verostek 1993a; Verostek, 1993b).

Estudios anteriores al trabajo anterior no revelaron ningún oligosacárido glucosilado unido a lípido (Orlean, 1990; Huffaker, 1983), lo que permite concluir que se transfieren oligosacáridos glucosilados a una velocidad muy superior que sus homólogos no glucosilados y, por lo tanto, son más difíciles de aislar. Un trabajo reciente ha permitido la creación y el estudio de cepas de levadura con oligosacáridos no glucosilados o hipoglucosilados y ha confirmado también la importancia de la adición de glucosa a la antena de oligosacáridos unidos a lípidos para el reconocimiento de sustratos mediante el complejo oligosacariltransferasa (Reiss, 1996; Stagljar, 1994; Burda, 1998). El nivel reducido de glucosilación de los oligosacáridos Man5 unidos a lípidos en un mutante alg3 influye negativamente en la cinética de la transferencia de oligosacáridos unidos a lípidos en la proteína naciente y se cree que es la causa de la fuerte subglicosilación de proteínas segregadas en cepas con alg3 inactivado (Aebi, 1996).

El enamblaje del oligosacárido de núcleo unido a lípido Man9GlcNAc2 tiene lugar, tal como se ha descrito anteriormente, en la membrana del retículo endoplasmático. Las adiciones de tres unidades de glucosa a la antena a-1,3 de los oligosacáridos unidos a lípidos son las reacciones finales en el enamblaje de oligosacáridos. En primer lugar se añade un residuo de a-1,3 glucosa y después otro residuo de a-1,3 glucosa y un residuo de a-1,2 glucosa terminal. Se ha demostrado que los mutantes que acumulan Man9GlcNAc2 unido a dolicol tienen un locus ALG6 defectuoso, y Alg6p tiene similitudes con Alg8p, la a-1,3-glucosiltransferasa que cataliza la adición de la segunda glucosa unida en a-1,3 (Reiss, 1996). Las células con un locus ALG8 defectuoso acumulan Glc1Man9GlcNAc2 unido a dolicol (Runge, 1986; Stagljar, 1994). El locus ALG10 codifica la a-1,2-glucosiltransferasa responsable de la adición de una única glucosa terminal a Glc2Man9GlcNAc2-PP-Dol (Burda, 1998).

Procesamiento secuencial de N-glicanos mediante actividades de enzimas localizadas

Las transferasas y manosidasas de azúcar recubren la superficie interna (luminal) del RE y del aparato de Golgi y, por lo tanto, proporcionan una superficie "catalítica" que permite el procesamiento secuencial de glicoproteínas a medida que avanzan a lo largo de la red del RE y el aparato de Golgi. De hecho, los compartimentos multiples de las regiones cis, media y trans del aparato de Golgi y la red trans del aparato de Golgi (TGN), proporcionan las diferentes localizaciones en las que puede tener lugar la secuencia ordenada de reacciones de glicosilación. A medida que la glicoproteína avanza de la síntesis en el RE a la maduración completa en el aparato de Golgi tardío o en la TGN, se expone secuencialmente a diferentes glicosidasas, manosidasas y glicosiltransferasas de modo que pueda sintetizarse una estructura de carbohidrato específica. Se ha dedicado mucho esfuerzo a revelar el mecanismo exacto por el que estas enzimas se retienen y se anclan a sus orgánulos respectivos. La situación de desarrollo es compleja, pero la evidencia sugiere que la región troncal, la región que abarca la membrana y la cola citoplasmática, individualmente o en conjunto, dirigen las enzimas hacia la membrana de orgánulos individuales y, por lo tanto, localizan el dominio catalítico asociado a ese locus.

En algunos casos, se observó que estas interacciones específicas funcionan a lo largo de especies. Por ejemplo, se demostró que el dominio que abarca la membrana de a-2,6-ST de ratas, una enzima que se sabe que se localiza en la región trans del aparato de golgi del animal, también se localiza en un gen informador (invertasa) en el aparato de Golgi de levaduras (Schwientek, 1995). No obstante, el mismo dominio que abarca la membrana se retuvo como parte de una a-2,6 ST de longitud completa en el RE y no se transportó posteriormente al aparato de Golgi de levadura (Krezdorn, 1994). Una Gal-Tr de longitud completa de seres humanos ni siquiera se sintetizó en levaduras, a pesar de los altos niveles de transcripción demostrados. Por otra parte, la región transmembrana del mismo GalT humano fusionada a un informador invertasa fue capaz de dirigir la localización al aparato de Golgi de la levadura, aunque a niveles de producción bajos. Schwientek y colaboradores han demostrado que fusionando 28 aminoácidos de una manosiltransferasa (Mnt1) de levadura, una región que contiene una cola citoplasmática, una región transmembrana y ocho aminoácidos de la región troncal, al dominio catalítico de la GalT humana, estos son sufcientes para la localización en el Golgi de una GalT activa. Otras galactosiltransferasas parecen estar basadas en interacciones con enzimas residentes en orgánulos particulares, ya que después de su retirada de la región transmembrana todavía se pueden localizar apropiadamente. Hasta la fecha no existe un modo fiable de predecir si una glicosiltransferasa o manosidasa expresada heterologamente particular en un eucariota inferior (1), se traducirá suficientemente (2), será catalíticamente activa o (3) se localizará en el orgánulo apropiado dentro de la ruta secretora. Debido a que para lograr los patrones de glicosilación en eucariotas inferiores son necesarias las tres premisas, se ha diseñado un esquema sistemático para lograr la función catalítica deseada y la retención apropiada de enzimas en ausencia de herramientas predictivas, que no están disponibles actualmente.

Producción de glicoproteínas terapéuticas

Un número significativo de proteínas aisladas a partir de seres humanos o animales se modifican postraduccionalmente, siendo la glicosilación una de las modificaciones más significativas. Se estima que el 70 % de todas las proteínas terapéuticas están glicosiladas y, por tanto, actualmente dependen de un sistema de producción (es decir, célula huésped) que sea capaz de glicosilar de una manera similar a los seres humanos. Hasta la fecha, la mayor parte de las glicoproteínas se preparan en un sistema huésped de mamífero. Varios estudios han demostrado que la glicosilación tiene un papel importante en la determinación de (1) inmunogenicidad, (2) propiedades farmacocinéticas, (3) tránsito y (4) eficacia de proteínas terapéuticas. Por tanto, no es sorprendente que esfuerzos sustanciales realizados por la industria farmacéutica se hayan dirigido a desarrollar procedimientos para obtener glicoproteínas que sean tan “humanoides” o “de tipo humano” como sea posible. Esto puede implicar la obtención por ingeniería genética de dichas células de mamífero para potenciar el grado de sialilación (es decir, adición terminal de ácido siálico) de las proteínas expresadas por las células, que se sabe que mejora las propiedades farmacocinéticas de dichas proteínas. Alternativamente, se puede mejorar el grado de sialilación mediante la adición in vitro de dichos azúcares usando glicosiltransferasas conocidas y sus azúcares nucleotídicos respectivos (por ejemplo, 2,3 sialiltransferasa y ácido CMP-siálico).

Investigaciones futuras pueden revelar la importancia biológica y terapéutica de glicoformas específicas, haciendo deseable, por lo tanto, la capacidad de producir dichas glicoformas específicas. Hasta la fecha, los esfuerzos se han concentrado en fabricar proteínas con patrones de glicosilación muy bien caracterizados y que expresan un ADNc que codifica dicha proteína en uno de los sistemas de expresión de proteínas de eucariotas superiores siguientes:

1.

Eucariotas superiores tales como células de ovario de hamster chino (CHO), células de fibroblasto de ratón y células de mieloma de ratón (Werner, 1998);

2.

Animales transgénicos tales como cabras, ovejas, ratones y otros (Dente, 1988); (Cole, 1994); (McGarvey, 1995); (Bardor, 1999);

3.

Plantas (Arabidopsis thaliana, tabaco, etc.) (Staub, 2000); (McGarvey, 1995); (Bardor, 1999);

4.

Células de insecto (Spodoptera frugiperda Sf9, Sf21, Trichoplusia ni, etc.) en combinación con baculovirus recombinantes tales como el virus de la polihedrosis nuclear múltiple Autographa californica, que infecta células de lepidóptero (Altmann, 1999).

Aunque la mayor parte de los eucariotas superiores llevan a cabo reacciones de glicosilación que son similares a las observadas en seres humanos, las proteínas humanas recombinantes expresadas en los sistemas huésped mencionados anteriormente difieren invariablemente de su homólogo humano “natural” (Raju, 2000). Por lo tanto, el extenso trabajo de desarrollo se ha dirigido a encontrar maneras de mejorar el “carácter humano” de proteínas fabricadas en estos sistemas de expresión. Esto incluye la optimización de condiciones de fermentación y la modificación genética de huéspedes de expresión de proteínas mediante la introducción de genes que codifican enzimas implicadas en la formación de glicoformas de tipo humano (Werner, 1998); (Weikert, 1999); (Andersen, 1994); (Yang, 2000). Los problemas inherentes asociados con todos los sistemas de expresión de mamífero no se han resuelto.

Los procesos de fermentación basados en cultivo de células de mamífero (por ejemplo, células de CHO, murinas o humanas), por ejemplo, tienden a ser muy lentos (los tiempos de fermentación en exceso de una semana no son infrecuentes), a menudo producen valoraciones bajas del producto, requieren nutrientes y cofactores caros (por ejemplo, suero de bovino fetal), están limitados por la muerte celular programada (apoptosis) y, a menudo, no permiten la expresión de proteínas terapéuticamente valiosas particulares. De forma más importante, las células de mamífero son susceptibles a virus que tienen el potencial de ser patógenos humanos y se requieren controles de calidad estrictos para asegurar la seguridad del producto. Esto es una cuestión importante, ya que muchos de dichos procesos requieren la adición de complejo y componentes de medios sensibles a la temperatura que están derivados de animales (por ejemplo, suero de carnero bovino) que pueden portar agentes patógenos para los seres humanos tales como priones o virus de encefalopatía espongiforme bovina. Además, la producción de compuestos terapéuticos se lleva a cabo preferentemente en un entorno estéril bien controlado. Una granja de animales, no importa lo limpia que esté, no constituye un entorno de este tipo, constituyendo, por lo tanto, un problema adicional en el uso de animales transgénicos para la fabricación de proteínas terapéuticas en gran volumen.

La mayor parte de las glicoproteinas terapéuticas producidas actualmente, si no todas, se expresan, por lo tanto, en células de mamífero, y se han realizado muchos esfuerzos dedicados a mejorar (es decir, “humanizar”) el patrón de glicosilación de estas proteínas recombinantes. Se han usado exitosamente cambios en la composición del medio, así como la coexpresión de genes que codifican enzimas implicadas en la glicosilación humana (véase, por ejemplo, Weikert, 1999).

Aunque pueden fabricarse proteínas recombinantes similares a sus homólogos humanos en sistemas de expresión de mamíferos, actualmente no es posible fabricar proteínas con un patrón de glicosilación de tipo humano en eucariotas inferiores (hongos y levaduras). Aunque la estructura de oligsacáridos de núcleo transferida a una proteína en el retículo endoplasmático es básicamente idéntica en mamíferos y eucariotas inferiores, se han observado diferencias sustanciales en las reacciones de procesamiento subsiguientes que tienen lugar en el aparato de Golgi de hongos y mamíferos. De hecho, incluso entre diferentes eucariotas inferiores existe una gran variedad de estructuras de glicosilación. Esto ha evitado el uso de eucariotas inferiores como huéspedes para la producción de glicoproteínas humanas recombinantes a pesar de las ventajas notables en otro sentido sobre sistemas de expresión de mamíferos tales como: (1) valoraciones del producto generalmente más elevadas, (2) tiempos de fermentación más cortos, (3) tener una alternativa para proteínas que se expresan poco en células de mamífero, (4) la capacidad para cultivarlas en un medio exento de proteínas definido químicamente y no requieren, por lo tanto, componentes de medio derivados de animales complejos (5) y la ausencia de infecciones víricas, especialmente retrovíricas, de dichos huéspedes.

Diversas levaduras metilotróficas tales como Pichia pastoris, Pichia methanolica y Hansenula polymorpha, han tenido papeles particularmente importantes como sistemas de expresión eucariotas debido a que son capaces de multiplicarse hasta densidades celulares altas y segregar cantidades grandes de proteína recombinante. No obstante, tal como se ha indicado anteriormente, los eucariotas inferiores tales como levadura no glicosilan proteínas similares a mamíferos superiores. Véase, por ejemplo, Martinet y col. (1998) Biotechnol Let. Vol. 20. Nº 12, que divulga la expresión de una manosidasa heteróloga en el retículo endoplasmático (RE).

Chiba y col. (1998) han demostrado que la S.cerevisiae puede genomanipularse para proporcionar estructuras que varían de la estructura MangGlcNAc2 a Man5GlcNAc2 eliminando 1,6 manosiltransferasa (OCH1), 1,3 manosiltransferasa (MNN1) y un regulador de manosilfosfatotransferasa (MNN4) y dirigiendo el dominio catalítico de a-1,2-manosidasa I de Aspergillus saitoi al RE de S.cerevisiae usando una secuencia de recuperación del RE (Chiba, 1998). Sin embargo, este intento tuvo como consecuencia poca o nula producción del Man5GlcNAc2 deseado, por ejemplo, uno que se fabricara in vivo y que podría funcionar como sustrato para GnT1 (la etapa siguiente en la fabricación de estructuras de glicano de tipo humano). Chiba y col. (1998) mostraron que P. pastoris no es capaz de forma inherente de producir cantidades útiles (superiores al 5 %) de GlcNAc transferasa I que acepte carbohidratos.

Maras y colaboradores afirman que en T. reesei "están presentes concentraciones suficientes de sustrato aceptor (es decir, Man5GlcNAC2)", sin embargo, cuando se intenta convertir este sustrato aceptor en GlcNAcMan5GlcNAc2 in vitro se convirtió menos del 2 %, demostrando, por lo tanto, la presencia de estructuras Man5GlcNAc2 que no son precursores adecuados para la formación de N-glicanos complejos (Maras, 1997; Maras, 1999b, Calleweraert y col. 2001). Hasta la fecha no existe ninguna divulgación que permita la producción de cantidades significativas de GlcNAcMan5GlcNAc2 en eucariotas inferiores.

Por lo tanto, un objeto de la presente invencion es proporcionar un sistema y procedimientos para humanizar la glicosilación de glicoproteínas recombinantes expresadas en células huésped no humanas.

Sumario de la invención

La presente invención se refiere a células huésped tales como cepas de hongos que tienen oligosacáridos unidos a lípidos modificados que pueden modificarse adicionalmente mediante la expresión heteróloga de un conjunto de glicosiltransferasas, transportadores de azúcar y manosidasas para convertirse en cepas huésped para la producción de glicoproteínas terapéuticas de mamíferos, por ejemplo humanas. Se ha desarrollado un procedimiento de producción de proteínas usando (1) un huésped eucariota inferior tal como un hongo unicelular o filamentoso o (2) cualquier organismo eucariota no humano que tenga un patrón de glicosilación diferente al de los

seres humanos, para modificar la composición de glicosilación y estructuras de las proteínas fabricadas en un organismo huésped (“células huésped”) de tal modo que se parezcan más estrechamente a estructuras de carbohidrato encontradas en proteínas humanas. El proceso permite obtener una célula huésped genomanipulada que puede usarse para expresar y dirigir cualquier gen o genes implicados en la glicosilación mediante 5 procedimientos bien establecidos en la literatura científica y conocidos, en general, por el experto en el sector de la expresión de proteínas. Tal como se describe en el presente documento, las células huésped con oligosacáridos unidos a lípidos modificados se crean o se seleccionan. Los N-glicanos producidos en las células huésped genomanipuladas tienen una estructura de núcleo de GlcNAcMan3GlcNAc2 que puede modificarse después mediante la expresión heteróloga de una o varias enzimas, por ejemplo, glicosiltransferasas, transportadores de

10 azúcar y manosidasas, para proporcionar glicoproteínas de tipo humano. Para la producción de proteínas terapéuticas, este procedimiento puede adaptarse para obtener por ingeniería genética líneas celulares en las que puede obtenerse cualquier estructura de glicosilación deseada. La presente invención se define también en las reivindicaciones.

Breve descripción de las figuras 15 La Figura 1 es un esquema de la estructura del oligosacárido unido a dolicil pirofosfato.

La Figura 2 es un esquema de la generación de N-glicanos GlcNAc2Man3GlcNAc2 a partir de células huésped fúngicas deficientes en actividades alg3, alg9 o alg 12. La Figura 3 es un esquema de reacciones de procesamiento requeridas para producir estructuras de oligosacárido

de tipo mamífero en una célula huésped fúngica con un genotipo alg3, och1.

20 La Figura 4 muestra comparaciones de secuencias de Alg3 de S. cerevisiae (Blast) La Figura 5 muestra secuencias de Alg 3 y Alg 3p de S. cerevisiae La Figura 6 muestra secuencias de Alg3 y Alg 3p de P. pastoris. La Figura 7 muestra comparaciones de secuencias de Alg 3 de P. pastoris (Blast) La Figura 8 muestra secuencias de Alg 3 y Alg 3p de K.lactis

25 La Figura 9 muestra las comparaciones de secuencias de Alg 3 de K. lactis (Blast) La Figura 10 muestra secuencias de Alg 9 y Alg 9p de S. cerevisiae La Figura 11 muestra secuencias de Alg 9 y Alg 9p de P. pastoris La Figura 12 muestra comparaciones de secuencias de Alg 9 de P. pastoris (Blast) La Figura 13 muestra secuencias de Alg 12 y Alg 12p de S. cerevisiae

30 La Figura 14 muestra secuencias de Alg 12 y Alg 12p de P. pastoris La Figura 15 muestra comparaciones de secuencias de Alg 12 de P. pastoris (Blast) La Figura 16 es un análisis de EM MALDI-TOF de N-glicanos aislados a partir de una glicoproteína kringle 3

producidos en una P.pastoris que muestra que el N-glicano predominante es GlcNAcMan5GlcNAc2. La Figura 17 es un análisis de EM MALDI-TOF de N-glicanos aislados a partir de una glicoproteína kringle 3

35 producidos en una P.pastoris (Fig. 16) tratados con 1-N-hexosaminidasa (pico correspondiente a Man5GlcNAc2) para confirmar que el N-glicano predominante de la Fig. 16 es GlcNAcMan5GlcNAc2. La Figura 18 es un análisis de EM MALDI-TOF de N-glicanos aislados a partir de una glicoproteína kringle 3

producidos en un mutante de deleción alg3 de P.pastoris que muestra que los N-glicanos predominantes son y GlcNAcMan4GlcNAc2.

40 La Figura 19 es un análisis de EM MALDI-TOF de N-glicanos aislados a partir de una glicoproteína kringle 3 producidos en un mutante de deleción alg3 de P.pastoris tratados con a1,2 manosidasa que muestra que el GlcNAcMan4GlcNAc2 de la Fig. 18 se convierte en GlcNAcMan3GlcNAc2.

La Figura 20 es un análisis de EM MALDI-TOF de N-glicanos de la Fig. 19 tratados con 1-N-hexosaminidasa (pico correspondiente a Man3GlcNAc2) para confirmar que el N-glicano de la Fig. 19 es GlcNAcMan3GlcNAc2.

45 La Figura 21 es un análisis de EM MALDI-TOF de N-glicanos aislados a partir de una glicoproteína kringle 3 producidos en un mutante de deleción alg3 de P.pastoris tratados con a1,2 manosidasa y GnTII que muestra que el GlcNAcMan3GlcNAc2 de la Fig. 19 se convierte en GlcNAc2Man3GlcNAc2.

La Figura 22 es un análisis de EM MALDI-TOF de N-glicanos de la Fig. 21 tratados con 1-N-hexosaminidasa (pico correspondiente a Man3GlcNAc2) para confirmar que el N-glicano de la Fig. 21 es GlcNAc2Man3GlcNAc2.

La Figura 23 es un análisis de EM MALDI-TOF de N-glicanos aislados a partir de una glicoproteína kringle 3 producidos en un mutante de deleción alg3 de P.pastoris tratados con a1,2 manosidasa y GnTII en presencia de UDP-galactosa y 1-1,4-galactosiltransferasa que muestra que el GlcNAc2Man3GlcNAc2 de la Fig. 21 se convierte en Gal2GlcNAc2Man3GlcNAc2.

La Figura 24 es un análisis de EM MALDI-TOF de N-glicanos aislados a partir de una glicoproteína kringle 3 producidos en un mutante de deleción alg3 de P.pastoris tratados con a1,2 manosidasa y GnTII en presencia de UDP-galactosa y 1-1,4-galactosiltransferasa y tratados adicionalmente con ácido CMP-N-acetilneuramínico y sialiltransferasa que muestra que el Gal2GlcNAc2Man3GlcNAc2 se convierte en NANA2Gal2GlcNAc2Man3GlcNAc2.

La FigurA 25 muestra secuencias Alg6 y Alg 6p de S. cerevisiae

La Figura 26 muestra secuencias de Alg6 y Alg 6p de P. pastoris.

La Figura 27 muestra comparaciones de secuencias de Alg 6 de P. pastoris (Blast)

La Figura 28 muestra secuencias de Alg6 y Alg 6p de K.lactis

La Figura 29 muestra comparaciones de secuencias de Alg 6 de K. lactis (Blast)

Figura 30: Modelo de una inmunoglobulina IgG. La cadena pesada y la cadena ligera, en base a estructuras secundarias y terciarias similares, pueden estar subdivididas en dominios. Las dos cadenas pesadas (dominios VH, CH1, CH2 y CH3) están unidas a través de tres puentes disulfuro. Las cadenas ligeras (dominios VL y CL) están unidas mediante otro puente disulfuro a la porción CH1 de la cadena pesada y junto con el fragmento CH1 y VH forman la denominada región Fab. Los antígenos se unen a la porción terminal de la región Fab. Funciones efectoras, tales como la unión al receptor Fc-gamma, se han localizado en el dominio CH, justo cadena abajo de la región bisagra y están influenciadas por la N-glicosilación de asparagina 297 en la cadena pesada.

Figura 31: vista general esquemática de un vector de expresión IgG1 modular.

La Figura 32 muestra secuencias de ácido nucleido y aminoácidos de GnT III de M musculis

La Figura 33 muestra secuencias de ácido nucleido y aminoácidos de GnT IV de H sapiens

La Figura 34 muestra secuencias de ácido nucleido y aminoácidos de GnT V de M musculis

Descripción detallada de la invención

A menos que se definan de otra manera en el presente documento, los términos científicos y técnicos usados con respecto a la presente invención tendrán los significados que comprenden comúnmente los expertos en la técnica. Además, a menos que el contexto lo requiera de otra manera, los términos singulares incluirán pluralidades y los términos plurales incluirán el singular. Los procedimientos y técnicas de la presente invención se realizan generalmente según procedimientos convencionales bien conocidos en la técnica. En general, las nomenclaturas usadas con relación a, y las técnicas de, bioquímica, enzimología, biología molecular y celular, microbiología, genética y química de proteínas y de ácidos nucleicos e hibridación descritas en el presente documento son bien conocidas y se usan comúnmente en la técnica. Los procedimientos y técnicas de la presente invención se realizan generalmente según procedimientos convencionales bien conocidos en la técnica y tal como se ha descrito en diversas referencias generales y más específicas que se citan y se abordan a lo largo de la presente memoria descriptiva, a menos que se indique lo contrario. Véase, por ejemplo, Sambrook y cols. Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2ª ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (1989); Ausubel y col., Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Associates (1992 y suplementos hasta 2002); Harlow y Lane Antibodies: A Laboratory Manual Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (1990); Introduction to Glycobiology, Maureen E. Taylor, Kurt Drickamer, Oxford Univ. Press (2003); Worthington Enzyme Manual, Worthington Biochemical Corp. Freehold, NJ; Handbook of Biochemistry: Section A Proteins Vol I 1976 CRC Press; Handbook of Biochemistry: Section A Proteins Vol II 1976 CRC Press; Essentials of Glycobiology, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1999). Las nomenclaturas usadas con respecto a, y los procedimientos y técnicas de laboratorio de, bioquímica y biología molecular descritos en el presente documento son aquellos bien conocidos y que se usan comúnmente en la técnica.

Los términos siguientes, a no ser que se indique lo contrario, deberá entenderse que significan lo siguiente:

Tal como se usa en el presente documento, el término “N-glicano” se refiere a un oligosacárido unido a N, por ejemplo, uno que está unido mediante un enlace de asparagina-N-acetilglucosamina a un residuo de asparagina de un polipéptido. Los N-glicanos tienen un núcleo pentasacárido común de Man3GlcNAc2 ("Man" se refiere a manosa; "Glc" se refiere a glucosa y "NAc" se refiere a N-acetilo; GlcNAc se refiere a N-acetilglucosamina). Los N-glicanos difieren con respecto al número de ramas (antenas) que comprenden azúcares periféricos (por ejemplo, fucosa y ácido siálico) que se añaden a la estructura de núcleo Man3GlcNAc2 ("Man3"). Los N-glicano se clasifican según sus constituyentes ramificados (por ejemplo, alta manosa, complejo o híbrido). Un N-glicano de tipo de “alta manosa” tiene cinco o más residuos de manosa. Un N-glicano de tipo “complejo” tiene típicamente al menos un GlcNAc unido al brazo 1,3-manosa y al menos un GlcNAc unido al brazo 1,6-manosa del núcleo de “trimanosa”. El “núcleo de trimanosa” es un núcleo pentasacárido que tiene estructura de Man3. Los N-glicanos complejos también pueden tener residuos de galactosa (“Gal”) que están opcionalmente modificados con ácido siálico o sus derivados (“NeuAc”, donde “Neu” se refiere a ácido neuramínico y “Ac” se refiere a acetilo). Los N-glicanos complejos también pueden tener sustituciones intracatenarias que comprenden GlcNAc “bisecantes” y fucosa de núcleo (“Fuc”). Un Nglicano “híbrido” tiene al menos un GlcNAc en el extremo terminal del brazo 1,3-manosa del núcleo de trimanosa y cero o más manosas en el brazo 1,6-manosa del núcleo de trimanosa.

Las abreviaturas usadas en el presente documento son de uso común en la técnica, véanse, por ejemplo, abreviaturas de azúcares, anteriormente. Otras abreviaturas comunes incluyen “PNGasa”, que se refiere a Nglicosidasa F peptídica (EC 3.2.2.18); “GlcNAc Tr (I-III)”, que se refieren a enzimas N-acetilglucosaminiltransferasa; “NANA” se refiere a ácido N-acetilneuramínico.

Tal como se usa en este documento, la expresión “ruta de secreción” se refiere a la línea de ensamblaje de diversas enzimas de glicosilación a la que se exponen secuencialmente un precursor de oligosacárido unido a lípido y un sustrato de N-glicano, siguiendo el flujo molecular de una cadena polipeptídica naciente desde el citoplasma hasta el retículo endoplasmático (RE) y los compartimentos del aparato de Golgi. Se dice que las enzimas están localizada a lo largo de esta ruta. Una enzima X que actúa sobre un glicano unido a lípido o un N-glicano antes de una enzima Y se dice que está o actúa “cadena arriba” de la enzima Y; de forma similar, la enzima Y está o actúa “cadena abajo” de la enzima X.

Tal como se usa en el presente documento, la expresión “actividad de alg X” se refiere a la actividad enzimática codificada por el gen “alg X” y a una enzima que tiene esa actividad enzimática codificada por un gen o producto génico homólogo (véase más adelante) o por un gen o producto génico no relacionado.

Tal como se usa en el presente documento, el término “anticuerpo“ se refiere a un anticuerpo completo (que consta de dos cadenas pesadas y dos cadenas ligeras) o a un fragmento del mismo. Dichos fragmentos incluyen, pero sin estar limitados a, los producidos mediante digestión con diversas proteasas, los producidos por escisión química y/o disociación química y los producidos de forma recombinante, siempre que los fragmentos sigan siendo capaces de unirse específicamente a un antígeno. Entre estos fragmentos están Fab, Fab’, F(ab’)2 y fragmentos Fv (scFv) monocatenarios. Dentro del alcance del término "anticuerpo" se encuentran también anticuerpos a los que se ha modificado su secuencia, pero que siguen siendo capaces de unirse específicamente a un antígeno. Los ejemplos de anticuerpos modificados son anticuerpos quiméricos y humanizados interespecíficos; fusiones de anticuerpos y complejos de anticuerpos heteroméricos, tales como diacuerpos (anticuerpos biespecíficos), diacuerpos monocatenarios e intracuerpos (véase, por ejemplo, Marasco (ed.), Intracellular Antibodies: Research and Disease Applications, Springer-Verlag Nueva York, Inc. (1998) (ISBN: 3540641513).

Tal como se usa en el presente documento, el término “mutación” se refiere a cualquier cambio en la secuencia de ácidos nucleicos o aminoácidos de un producto génico, por ejemplo, de una enzima relacionada con glucosilación.

Las expresiones “polinucleótido” o “molécula de ácido nucleico” se refieren a una forma polimérica de nucleótidos de al menos 10 bases de longitud. Las expresiones incluyen moléculas de ADN (por ejemplo, ADNc o ADN genómico o sintético) y moléculas de ARN (por ejemplo, ARNm o ARN sintético), así como análogos de ADN o ARN que contienen análogos nucleotídicos no naturales, enlaces internucleósido no nativos o ambos. El ácido nucleico puede estar en cualquier conformación topológica. Por ejemplo, el ácido nucleico puede ser monocatenario, bicatenario, tricatenario, en cuádruplex, parcialmente bicatenario, ramificado, en horquilla, circular o en una conformación de candado. La expresión incluy formas monocatenarias y bicatenarias de ADN.

A menos que se indique lo contrario, un “ácido nucleico” que comprende “SEC ID Nº X” se refiere a un ácido nucleico, al menos una parte del mismo que tiene bien (i) la secuencia de SEC ID Nº: X o bien (ii) una secuencia complementaria a SEC ID Nº: X. La elección entre las dos está dictaminada por el contexto. Por ejemplo, si el ácido nucleico se usa como sonda, la elección entre las dos está dictaminada por la necesidad de que la sonda sea complementaria a la diana deseada.

Un ácido nucleico o polinucleótido “aislado” o “sustancialmente puro” (por ejemplo, un ARN, ADN o un polímero mixto) es uno que está sustancialmente separado de otros componentes celulares que acompañan de forma natural al polinucleótido nativo en su célula huésped natural, por ejemplo, ribosomas, polimerasas y secuencias genómicas con las que está asociado de forma natural. Las expresiones abarcan un ácido nucleico o polinucleótido que (1) se ha retirado de su entorno natural, (2) no está asociado con todo un polinucleótido, o una porción del mismo, en el que el “polinucleótido aislado” se encuentra en la naturaleza, (3) está unido operativamente a un polinucleótido al cual no está unido en la naturaleza o (4) no está presente en la naturaleza. Las expresiones “aislado” o “sustancialmente puro” también se pueden usar con referencia a aislados de ADN recombinante o clonado, análogos polinucleotídicos sintetizados químicamente o análogos de polinucleótidos que se sintetizan biológicamente mediante sistemas heterólogos.

No obstante, “aislado” no requiere necesariamente que el propio ácido nucleico o polinucleótido descrito de este modo se haya retirado físicamente de su entorno nativo. Por ejemplo, una secuencia de ácido nucleico endógena en el genoma de un organismo se considera en el presente documento “aislada” si se dispone una secuencia heteróloga (es decir, una secuencia que no es adyacente de forma natural a esta secuencia de ácidos nucleicos endógena) de forma adyacente a la secuencia de ácidos nucleicos endógena, de forma que la expresión de esta secuencia de ácidos nucleicos endógena esté alterada. A modo de ejemplo, se puede sustituir una secuencia promotora no nativa (por ejemplo, mediante recombinación homóloga) por el promotor nativo de un gen en el genoma de una célula humana, de forma que este gen tenga un patrón de expresión alterado. Este gen ahora estaría “aislado” debido a que está separado de al menos algunas de las secuencias que lo flanquean de forma natural.

Un ácido nucleico también se considera “aislado” si contiene cualesquiera modificaciones que no tengan lugar de forma natural en el ácido nucleico correspondiente en un genoma. Por ejemplo, una secuencia codificante endógena se considera “aislada” si contiene una inserción, deleción o una mutación puntual introducida artificialmente, por ejemplo, mediante intervención humana. Un “ácido nucleico aislado” también incluye un ácido nucleico integrado en un cromosoma de una célula huésped en un sitio heterólogo, una construcción de ácido nucleico presente como un episoma. Además, un “ácido nucleico aislado” puede estar sustancialmente exento de otro material celular o sustancialmente exento de medio de cultivo cuando se produce mediante técnicas recombinantes o sustancialmente exento de precursores químicos u otros productos químicos cuando se sintetiza químicamente.

Tal como se usa en el presente documento, la expresión “variante degenerada” de una secuencia de ácidos nucleicos de referencia abarca secuencias de ácidos nucleicos que se pueden traducir, según el código genético estándar, para proporcionar una secuencia de aminoácidos idéntica a la que se traduce a partir de la secuencia de ácidos nucleicos de referencia.

La expresión “porcentaje de identidad de secuencia” o “idéntico” en el contexto de secuencias de ácidos nucleicos se refiere a los residuos de las dos secuencias que son los mismos cuando se alinean para lograr una correspondencia máxima. La longitud de la comparación de identidad de secuencia puede ser a lo largo de un tramo de al menos aproximadamente nueve nucleótidos, habitualmente al menos aproximadamente 20 nucleótidos, más habitualmente al menos aproximadamente 24 nucleótidos, típicamente al menos aproximadamente 28 nucleótidos, más típicamente al menos aproximadamente 32 nucleótidos y preferentemente al menos aproximadamente 36 o más nucleótidos. Existe una serie de algoritmos diferentes conocidos en la técnica que se pueden usar para medir la identidad de secuencia de nucleótidos. Por ejemplo, las secuencias polinucleótidicas se pueden comparar usando FASTA, Gap o Bestfit, que son programas en Wisconsin Package Versión 10.0, Genetics Computer Group (GCG), Madison, Wisconsin. FASTA proporciona alineamientos y porcentaje de identidad de secuencia de las regiones de mejor solapamiento entre las secuencias de consulta y de búsqueda (Pearson, 1990). Por ejemplo, el porcentaje de identidad de secuencia entre secuencias de ácidos nucleicos se puede determinar usando FASTA con sus parámetros por defecto (un tamaño de palabra de 6 y el factor NOPAM para la matriz de puntuación) o usando Gap con sus parámetros por defecto tal como se proporcionan en GCG Versión 6.1.

La expresión “homología sustancial” o “similitud sustancial”, cuando se refiere a un ácido nucleico o fragmento del mismo, indica que, cuando está alineado óptimamente con inserciones o supresiones de nucleótidos apropiadas con otro ácido nucleico (o su hebra complementaria), existe una identidad de secuencia de nucleótidos en al menos aproximadamente el 50 %, más preferentemente el 60 % de las bases nucleótidas, habitualmente al menos aproximadamente el 70 %, más habitualmente al menos aproximadamente el 80 %, preferentemente al menos aproximadamente el 90 % y más preferentemente al menos aproximadamente el 95 %, el 96 %, el 97 %, el 98 % o el 99 % de las bases nucleótidas, medido mediante cualquier algoritmo bien conocido de identidad de secuencia, tales como FASTA, BLAST o Gap, tal como se ha descrito anteriormente.

Alternativamente, existe homología o similitud sustancial cuando un ácido nucleico o fragmento del mismo se hibrida a otro ácido nucleico, a una hebra de otro ácido nucleico o a la hebra complementaria del mismo, en condiciones de hibridación rigurosas. Las “condiciones de hibridación rigurosas” y las “condiciones de lavado rigurosas” en el contexto de experimentos de hibridación de ácido nucleico dependen de varios parámetros físicos diferentes. La hibridación de ácidos nucleicos se verá afectada por condiciones tales como la concentración de sal, temperatura, disolventes, la composición básica de las especies de hibridación, longitud de las regiones complementarias y el número de falta de coincidencias de bases nucleótidas entre los ácidos nucleicos que se están hibridando, como apreciarán fácilmente los expertos en la técnica. Un experto en la técnica sabe cómo variar estos parámetros para lograr una rigurosidad de hibridación particular.

En general, la “hibridación rigurosa” se realiza a aproximadamente 25 ºC por debajo del punto de fusión térmico (Tm) para el híbrido de ADN específico bajo una serie particular de condiciones. Se realiza un “lavado riguroso” a temperaturas de aproximadamente 5 ºC inferiores a la Tm para el híbrido de ADN específico bajo una serie particular de condiciones. La Tm es la temperatura a la que el 50 % de la secuencia diana se hibrida a una sonda perfectamente coincidente. Véase Sambrook y col., referencia anterior, página 9:51. Para los propósitos del presente documento, se definen “condiciones de rigurosidad elevadas” para la hibridación en fase de solución como hibridación acuosa (es decir, sin formamida) en 6X SSC (donde 20X SSC contiene NaCl 3,0 M y citrato sódico 0,3 M), SDS al 1% a 65 ºC durante 8-12 horas, seguido por dos lavados en 0,2X SSC, SDS al 0,1 % a 65 ºC durante 20 minutos. El experto apreciará que la hibridación a 65 ºC tendrá lugar a diferentes velocidades dependiendo de una serie de factores que incluyen la longitud y el porcentaje de identidad de las secuencias que se están hibridando.

Los ácidos nucleicos (también denominados polinucleótidos) de la presente invención pueden incluir tanto hebras en sentido correcto como antisentido de ARN, ADNc, ADN genómico y formas sintéticas y polímeros mixtos de los anteriores. Estos pueden estar modificados química o bioquímicamente o pueden contener bases nucleótidas no naturales o derivadas, tal como apreciarán fácilmente los expertos en la técnica. Dichas modificaciones incluyen, por ejemplo etiquetas, metilación, sustitución de uno o más nucleótidos naturales por un análogo, modificaciones internucleotídicas tales como enlaces no cargados (por ejemplo, fosfonatos de metilo, fosfotriésteres, amidatos de fósforo, carbamatos, etc.), enlaces cargados (por ejemplo, tioatos de fósforo, ditioatos de fósforo, etc.), restos pendientes (por ejemplo, polipéptidos), intercaladores (por ejemplo, acridina, psoralen, etc.), quelantes, alquilantes y enlaces modificados (por ejemplo, ácidos nucleicos alfa anoméricos, etc.). También se incluyen moléculas sintéticas que imitan polinucleótidos en su capacidad para unirse a una secuencia diseñada mediante unión de hidrógeno y otras interacciones químicas. Dichas moléculas se conocen en la técnica e incluyen, por ejemplo, aquellas en las que enlaces peptídicos sustituyen enlaces de fosfato en el esqueleto de la molécula.

El término “mutado”, cuando se aplica a secuencias de ácido nucleico se refiere a que se pueden insertar, suprimir o cambiar nucleótidos en una secuencia de ácido nucleico en comparación con una secuencia de ácido nucleico de referencia. Se puede realizar una alteración única en un locus (una mutación puntual) o se pueden insertar, suprimir

o cambiar múltiples nucleótidos en un locus único. Además, se pueden realizar una o más alteraciones en cualquier número de loci dentro de una secuencia de ácido nucleico. Una secuencia de ácido nucleico se puede mutar mediante cualquier procedimiento conocido en la técnica, incluidos, pero sin limitación, técnicas de mutagénesis tales como “PCR propensa a error” (un procedimiento para realizar la PCR en condiciones en las que la fidelidad de la copia de la ADN polimerasa es baja, de forma que se obtiene una cantidad elevada de mutaciones puntuales a lo largo de la totalidad de la longitud del producto de PCR. Véase, por ejemplo, Leung, D. W., y col, Technique, 1, páginas 11-15 (1989) y Caldwell, R. C. y Joyce G. F., PCR Methods Applic., 2, páginas 28-33 (1992)); y “mutagénesis dirigida a oligonucleótido” (un procedimiento que posibilita la generación de mutaciones específicas del sitio en cualquier segmento de ADN clonado de interés. Véase, por ejemplo, Reidhaar-Olson, J. F. y Sauer, R. T., y col., Science, 241, páginas 53-57 (1988)).

El término “vector”, tal como se usa en el presente documento, se refiere a una molécula de ácido nucleico capaz de transportar otro ácido nucleico al que se ha unido. Un tipo de vector es un "plásmido", que se refiere a un bucle de ADN bicatenario circular en el que se pueden ligar segmentos adicionales de ADN. Otros vectores incluyen cósmidos, cromosomas artificiales bacterianos (BAC) y cromosomas artificiales de levadura (YAC). Otro tipo de vector es un vector vírico, en el que segmentos de ADN adicionales se pueden ligar en el genoma vírico (se aborda con más detalle más adelante). Ciertos vectores son capaces de replicación autónoma en una célula huésped en la que se introducen (por ejemplo, vectores que tienen un origen de replicación que funciona en la célula huésped). Otros vectores pueden integrarse en el genoma de una célula huésped tras su introducción en la célula huésped y, por lo tanto, se replican junto con el genoma del huésped. Además, determinados vectores preferentes son capaces de dirigir la expresión de genes a los que están unidos operativamente. Dichos vectores se denominan en el presente documento "vectores de expresión recombinantes” (o simplemente, “vectores de expresión").

Secuencias de control de expresión “unidas operativamente” se refiere a un enlace en el que la secuencia de control de expresión está contigua al gen de interés para controlar el gen de interés, así como secuencias de control de la expresión que actúan en trans o a distancia para controlar el gen de interés.

La expresión “secuencia de control de expresión” tal como se usa en el presente documento, se refiere a secuencias de polinucleótidos que son necesarias para influir sobre la expresión de secuencias codificantes a las que las mismas están unidas operativamente. Las secuencias de control de expresión son secuencias que controlan la transcripción, eventos postraduccionales y la traducción de secuencias de ácido nucleico. Las secuencias de control de expresión incluyen secuencias apropiadas de iniciación de la transcripción, de terminación, promotoras y potenciadoras; señales de procesamiento de ARN eficaces tales como señales de ayuste y de poliadenilación, secuencias que estabilizan ARNm citoplasmático; secuencias que potencian la eficacia de la traducción (por ejemplo, sitios de unión a ribosoma); secuencias que potencian la estabilidad de proteínas y, si se desea, secuencias que potencian la secreción de proteínas. La naturaleza de dichas secuencias de control difiere dependiendo del organismo huésped; en procariotas, dichas secuencias de control generalmente incluyen secuencias promotoras, de sitio de unión a ribosoma y de terminación de la transcripción. Se pretende que la expresión “secuencias de control” incluya, como mínimo, todos los componentes cuya presencia sea esencial para la expresión, y también puede incluir componentes adicionales cuya presencia es ventajosa, por ejemplo, secuencias líder y secuencias de asociado de fusión.

Se pretende que la expresión “célula huésped recombinante” (o simplemente “célula huésped”), tal como se usa en el presente documento, se refiera a una célula en la que se ha introducido un vector recombinante. Debe entenderse que dichas expresiones se pretende que se refieran no solo a la célula objeto particular, sino también a la progenie de dicha célula. Debido a que tienen lugar determinadas modificaciones en generaciones sucesivas debido bien a mutación o bien a la influencia del entorno, dicha progenie puede no ser, de hecho, idéntica a la célula progenitora, pero todavía está incluida dentro del alcance de la expresión “célula huésped” tal como se usa en el presente documento. Una célula huésped recombinante puede ser una célula aislada o una línea celular desarrollada en cultivo o puede ser una célula que reside en un tejido u organismo vivo.

El término “péptido”, tal como se usa en el presente documento, se refiere a un polipéptido corto, por ejemplo, uno que típicamente tiene menos de aproximadamente 50 aminoácidos de longitud y más típicamente menos de aproximadamente 30 aminoácidos de longitud. El término, tal como se usa en el presente documento, abarca análogos y miméticos que imitan la función estructural y, por tanto, la biológica.

El término “polipéptido” abarca proteínas tanto naturales como no naturales y fragmentos, mutantes, derivados y análogos de las mismas. Un polipéptido puede ser monomérico o polimérico. Además, un polipéptido puede comprender una serie de dominios diferentes, cada uno de los cuales tiene una o más actividades diferentes.

La expresión “proteína aislada” o “polipéptido aislado” es una proteína o polipéptido que, en virtud de su origen o su fuente de obtención (1) no está asociada con componentes asociados de forma natural que la acompañan en su estado nativo (2) cuando existe en una pureza no encontrada en la naturaleza, en la que la pureza se puede considerar con respecto a la presencia de otro material celular (por ejemplo, está exento de otras proteínas de la misma especie) (3) se expresa mediante una célula procedente de una especie distinta o (4) no está presente en la naturaleza (por ejemplo, es un fragmento de un polipéptido encontrado en la naturaleza o incluye análogos o derivados de aminoácidos que no se encuentran en la naturaleza o enlaces diferentes a los enlaces peptídicos estándar). Por lo tanto, un polipéptido que se sintetiza químicamente o que se sintetiza en un sistema celular diferente de la célula en la que se origina de forma natural estará "aislado" de sus componentes asociados de forma natural. Un polipéptido o proteína también se puede liberar sustancialmente de componentes asociados de forma natural mediante aislamiento, usando técnicas de purificación de proteínas bien conocidas en la técnica. Por lo tanto, tal como se ha definido, “aislado” no necesariamente requiere que la proteína, polipéptido, péptido u oligopéptido descrito de esta manera se haya retirado físicamente de su entorno nativo.

La expresión "fragmento polipeptídico", tal como se usa en el presente documento, se refiere a un polipéptido que tiene una deleción en el extremo amino y/o carboxi terminal, en comparación con un polipéptido correspondiente de longitud completa. En una realización preferente, el fragmento polipeptídico es una secuencia contigua en la que la secuencia de aminoácidos del fragmento es idéntica a las posiciones correspondientes en la secuencia natural. Los fragmentos típicamente tienen al menos 5, 6, 7, 8, 9 o 10 aminoácidos de longitud, prefentemente al menos 12, 14, 16 o 18 aminoácidos de longitud, más preferentemente al menos 20 aminoácidos de longitud, más preferentemente al menos 25, 30, 35, 40 o 45 aminoácidos, incluso más preferentemente al menos 50 o 60 aminoácidos de longitud e incluso más preferentemente al menos 70 aminoácidos de longitud.

Un “derivado modificado” se refiere a polipéptidos o fragmentos de los mismos que son sustancialmente homólogos en secuencia estructural primaria pero que incluyen, por ejemplo, modificaciones químicas y bioquímicas in vivo o in vitro o que incorporan aminoácidos que no se encuentran en el polipéptido nativo. Tales modificaciones incluyen, por ejemplo, acetilación, carboxilación, fosforilación, glicosilación, ubiquitinación, marcaje, por ejemplo, con radionúclidos y diversas modificaciones enzimáticas, como se apreciará fácilmente por los expertos en la técnica. Una diversidad de procedimientos para marcar polipéptidos y de sustituyentes o marcadores útiles con tales propósitos se conocen bien en la técnica e incluyen isótopos radiactivos tales como 125l, 32P, 35S y 3H, ligandos que se unen a antiligandos marcados (por ejemplo, anticuerpos), fluoróforos, agentes quimioluminiscentes, enzimas y antiligandos que pueden servir como miembros de par de unión específicos para un ligando marcado. La elección del marcador depende de la sensibilidad requerida, de la facilidad de conjugación con el cebador, de los requerimientos de estabilidad y la instrumentación disponible. Los procedimientos de marcaje de polipéptidos son bien conocidos en la técnica. Véase Ausubel y col., 1992.

La expresión "proteína de fusión" se refiere a un polipéptido que comprende un polipéptido o fragmento asociado a secuencias de aminoácidos heterólogas. Las proteínas de fusion son útiles debido a que pueden construirse de modo que contengan dos o más elementos funcionales deseados a partir de dos o más proteínas diferentes. Una proteína de fusion comprende al menos 10 aminoácidos contiguos de un polipéptido de interés, más preferentemente al menos 20 o 30 aminoácidos, incluso más preferentemente al menos 40, 50 o 60 aminoácidos, aún más preferentemente al menos 75, 100 o 125 aminoácidos. Las proteínas de fusion pueden producirse de forma recombinante construyendo una secuencia de ácido nucleico que codifica un polipéptido o un fragmento del mismo con una secuencia de ácido nucleico que codifica una proteína o péptido diferente y que después expresa la proteína de fusión. Alternativamente, una proteína de fusión puede producirse químicamente mediante reticulación del polipéptido o un fragmento del mismo con otra proteína.

La expresión "análogo no peptídico" se refiere a un compuesto con propiedades que son análogas a las de un polipéptido de referencia. Un compuesto no peptídico puede denominarse también un "mimético peptídico” o un "peptidomimético". Véase, por ejemplo, Jones, (1992) Amino Acid and Peptide Synthesis, Oxford University Press; Jung, (1997) Combinatorial Peptide and Nonpeptide Libraries: A Handbook John Wiley; Bodanszky y col., (1993) Peptide Chemistry-A Practical Textbook, Springer Verlag; "Synthetic Peptides: A Users Guide", G. A. Grant, Ed, W.

H. Freeman and Co., 1992; Evans y col. J. Med. Chem. 30: 1229 (1987); Fauchere, J. Adv. Drug Res. 15:29 (1986); Veber y Freidinger TINS p. 392 (1985); y referencias citadas de cada uno de los documentos anteriores. Dichos compuestos se desarrollan frecuentemente con la ayuda de modelos moleculares computerizados. Los miméticos peptídicos que son estructuralmente similares a péptidos útiles de la invención pueden usarse para producir un efecto equivalente y se considera, por lo tanto, que son parte de la invención.

Un “mutante polipeptídico” o “muteína” se refiere a un polipéptido cuya secuencia contiene una inserción, duplicación, deleción, reordenamiento o sustitución de uno o más aminoácidos en comparación con la secuencia de aminoácidos de una proteína nativa o de tipo silvestre. Una muteína puede tener una o más sustituciones puntuales de aminoácidos, en las que un único aminoácido de una posición se ha cambiado por otro aminoácido, una o más inserciones y/o deleciones, en las que uno o más aminoácidos se insertan o suprimen, respectivamente, en la secuencia de la proteína de natural, y/o truncamientos de la secuencia de aminoácidos en cualquiera de los extremos amino o carboxi o en ambos. Una muteína puede tener la misma actividad biológica, pero preferentemente tiene una diferente en comparación con la proteína natural. Por ejemplo, una muteína puede tener una actividad neuronal o de unión a NgR aumentada o disminuida. En una realización preferente de la presente invención, un derivado de MAG que es una muteína (por ejemplo, en un dominio de tipo MAG Ig 5) ha disminuido la actividad inhibidora de creciemiento neuronal en comparación con MAG de tipo silvestre endógena o soluble.

Una muteína tiene una homología de secuencia general de al menos el 70 % con su homólogo de tipo silvestre. Incluso más preferentes son las muteínas que tienen una homología de secuencia general del 80 %, el 85 % o el 90 % con la proteína de tipo silvestre. En una realización aún más preferente, una muteína muestra una identidad de secuencia del 95 %, incluso más preferentemente del 97 %, incluso más preferentemente el 98 % e incluso más preferentemente el 99 % de identidad de secuencia general. La homología de secuencia se puede medir por cualquier algoritmo de análisis de secuencia común, tal como Gap o Bestfit.

Las sustituciones preferentes de aminoácidos son las que: (1) reducen la susceptibilidad a proteólisis, (2) reducen la susceptibilidad a oxidación, (3) alteran la afinidad de unión para formar complejos de proteínas, (4) alteran la afinidad de unión o la actividad enzimática y (5) confieren o modifican otras propiedades físicoquímicas o funcionales de dichos análogos.

Tal como se usa en el presente documento, los veinte aminoácidos convencionales y sus abreviaturas siguen el uso común. Véase Immunology - A Synthesis (2ª Edition, E.S. Golub y D.R Gren, Eds., Sinauer Associates, Sunderland, Mass. (1991). Los estereoisómeros (por ejemplo, aminoácidos D) de los veinte aminoácidos convencionales, aminoácidos no naturales tales como a -aminoácidos y a -aminoácidos disustituidos, N-alquilaminoácidos y otros aminoácidos no convencionales pueden ser también componentes adecuados para polipéptidos de la presente invención. Los ejemplos de aminoácidos convencionales incluyen: 4-hidroxiprolina, y-carboxiglutamato, £-N,N,Ntrimetillisina, £-N-acetillisina, O-fosfoserina, N-acetilserina, N-formilmetionina, 3-metilhistidina, 5-hidroxilisina, o-Nmetilarginina y otros aminoácidos e iminoácidos similares (por ejemplo, 4-hidroxiprolina). En la nomenclatura de polipéptidos usada en el presente documento, la dirección hacia la izquierda es la dirección amino-terminal y la dirección hacia la derecha es la dirección carboxi-terminal, de acuerdo con el uso y la convención estándar.

Una proteína tiene “homología” con, o es “homóloga” a, una segunda proteína si la secuencia de ácido nucleico que codifica la proteína tiene una secuencia similar a la secuencia de ácido nucleico que codifica la segunda proteína. Alternativamente, una proteína tiene homología con una segunda proteína si las dos proteínas tienen secuencias de aminoácidos “similares”. (Por tanto, la expresión “proteínas homólogas” se define de modo que signifique que las dos proteínas tienen secuencias de aminoácidos similares). En una realización preferente, una proteína homóloga es una que muestra una homología de secuencia del 60 % con la proteína de tipo silvestre y más preferentemente es una homología de secuencia del 70 %. Incluso más preferentes son homólogos de proteínas que muestran una homología de secuencia del 80 %, el 85 % o el 90% con la proteína de tipo silvestre. En una realización aún más preferente, una proteína homóloga muestra una identidad de secuencia del 95 %, el 97 %, el 98 % o el 99 %. Tal como se usa en el presente documento, la homología entre dos regiones de secuencia de aminoácidos (especialmente con respecto a similitudes estructurales predichas) se interpreta como que implica similitud de función.

Cuando se usa “homólogo” con referencia a proteínas o péptidos, se reconoce que las posiciones de los residuos que no son idénticos a menudo difieren en sustituciones de aminoácidos conservativas. Una “sustitución de aminoácido conservativa” es una en la que un residuo de aminoácido se sustituye por otro residuo de aminoácido que tiene una cadena lateral (grupo R) con propiedades químicas similares (por ejemplo, carga o hidrofobicidad). En general, una sustitución de aminoácidos conservativa no cambiará sustancialmente las propiedades funcionales de una proteína. En los casos en los que dos o más secuencias de aminoácidos difieren entre sí en sustituciones conservativas, el porcentaje de identidad de secuencia o el grado de homología se puede ajustar al alza para corregir la naturaleza conservativa de la sustitución. Los medios para realizar este ajuste son bien conocidos por los expertos en la materia (véase, por ejemplo, Pearson y col., 1994).

Cada uno de los siguientes seis grupos contiene aminoácidos que son sustituciones conservativas de otro: 1) serina (S), treonina (T); 2) ácido aspártico (D), ácido glutámico (E); 3) asparagina (N), glutamina (Q); 4) arginina (R), lisina (K); 5) isoleucina (I), leucina (L), metionina (M), alanina (A), valina (V) y 6) fenilalanina (F), tirosina (Y), triptófano (W).

La homología de secuencia para polipéptidos, que también se denomina porcentaje de identidad de secuencia, se mide típicamente usando programas informáticos de análisis de secuencia. Véase, por ejemplo, el paquete informático de análisis de secuencias de Genetics Computer Group (GCG), University of Wisconsin Biotechnology Center, 910 University Avenue, Madison, Wisconsin 53705. El programa informático de análisis de secuencias

5 empareja secuencias similares usando la medida de homología asignada a diversas sustituciones, deleciones y otras modificaciones, incluidas sustituciones de aminoácidos conservativas. Por ejemplo, GCG contiene programas tales como “Gap” y “Bestfit” que se pueden usar con parámetros por defecto para determinar la homología de secuencia o identidad de secuencia entre polipéptidos estrechamente relacionados, tales como polipéptidos homólogos de especies u organismos diferentes o entre una proteína de tipo silvestre y una muteína de la misma. Véase, por ejemplo, GCG Versión 6.1.

Un algoritmo preferente cuando se compara una secuencia de molécula inhibidora con una base de datos que contiene un gran número de secuencias de diferentes organismos es el programa informático BLAST (Altschul, S. F. y col.. (1990) J. Mol. Biol. 215: 403-410; Gish y States (1993) Nature Genet. 3:266-272; Madden, T.L. y col. (1996) Meth. Enzymol. 266:131-141; Altschul, S.F. y col. (1997) Nucleic Acids Res.25:3389-3402; Zhang, J. y Madden, T.L.

15 (1997) Gnome Res. 7:649-656), especialmente blastp o tblastn (Altschul y col., 1997). Los parámetros preferentes para BLASTp son:

Valor de expectación: 10 (por defecto)

Filtro: s (por defecto)

Coste de apertura de un hueco: 11 (por defecto)

Coste para extender un hueco: 1 (por defecto)

Alineamientos máximos: 100 (por defecto)

Tamaño de palabra: 11 (por defecto)

Nº de descripciones: 100 (por defecto)

Matriz de penalización: BLOWSUM6

25 2

La longitud de las secuencias polipeptídicas comparadas para determinar homología generalmente será de al menos aproximadamente 16 residuos aminoacídicos, habitualmente al menos aproximadamente 20 residuos, más habitualmente al menos aproximadamente 24 residuos, típicamente al menos aproximadamente 28 residuos y preferentemente más de aproximadamente 35 residuos. Cuando se realiza una búsqueda en una base de datos que contiene secuencias de un gran número de organismos diferentes, es preferible comparar las secuencias de aminoácidos. La búsqueda en bases de datos que usan secuencias de aminoácidos se puede medir mediante algoritmos diferentes a blastp conocidos en la técnica. Por ejemplo, las secuencias polipeptídicas se pueden comparar usando FASTA, un programa en GCG Versión 6.1. FASTA proporciona alineamientos y porcentaje de identidad de secuencia de las regiones de mejor solapamiento entre las secuencias problema y de búsqueda

35 (Pearson, 1990). Por ejemplo, el porcentaje de identidad de secuencia entre secuencias de aminoácidos se puede determinar usando FASTA con sus parámetros por defecto (un tamaño de palabra de 2 y la matriz de puntuación PAM250), tal como se proporciona en GCG Versión 6.1.

“Unión específica” se refiere a la capacidad de dos moléculas para unirse una a otra con preferencia de unión con respecto a otras moléculas del entorno. Típicamente, “unión específica” discrimina sobre la union accidental en una reacción de al menos dos veces , más típicamente de al menos 10 veces, a menudo de al menos 100 veces Típicamente, la afinidad o avidez de una reacción de unión específica es al menos aproximadamente 10-7 M (por ejemplo, al menos aproximadamente 10-8 M o 10-9 M).

El término “región”, tal como se usa en el presente documento, se refiere a una porción físicamente contigua de la estructura primaria de una biomolécula. En el caso de proteínas, una región está definida por una parte contigua de 45 la secuencia de aminoácidos de esa proteína.

El término “dominio”, tal como se usa en el presente documento, se refiere a una estructura de una biomolécula que contribuye a una función conocida de la biomolécula o que se sospecha que lo hace. Los dominios pueden coincidir con regiones o porciones de los mismos; los dominios también pueden incluir regiones diferentes no contiguas de una biomolécula. Los ejemplos de dominio de proteínas incluyen, pero sin limitación, un dominio de Ig, un dominio extracelular, un dominio transmembrana y un dominio citoplasmático.

Tal como se usa en el presente documento, el término “molécula” significa cualquier compuesto, que incluye, pero sin limitación, una molécula pequeña, péptido, proteína, azúcar, nucleótido, ácido nucleico, lípido, etc y dicho compuesto puede ser natural o sintético.

A menos de que se definan de otro modo, todos los términos técnicos y científicos que se usan en el presente documento tienen los mismos significados que entienden comúnmente los expertos en la técnica a la que pertenece la presente invención. Los procedimientos y materiales ejemplares se describen más adelante, aunque los procedimientos y materiales similares o equivalentes a los descritos en el presente documento también se pueden usar en la puesta en práctica de la presente invención y serán evidentes para los expertos en la técnica. En caso de conflicto, tendrá prioridad la presente memoria descriptiva, incluidas las definiciones. Los materiales, procedimientos y ejemplos son sólo ilustrativos y no pretenden ser limitantes.

A lo largo de la presente memoria descriptiva y las reivindicaciones, la palabra “comprender” o variaciones tales como “comprende” o “que comprende”, se entenderá que implican la inclusión de un número entero o grupo de números enteros indicados pero no la exclusión de cualquier otro número entero o grupo de números enteros.

Obtención por ingeniería genética o selección de huéspedes con oligosacáridos unidos a lípidos modificados para la generación de N-glicanos similares a humanos

La presente invención proporciona un procedimiento para producir una glicoproteína de tipo humano en una célula de un huésped eucariota no humano. El procedimiento implica fabricar o usar una célula huésped eucariota no humana con actividad génica alg disminuida o agotada (es decir, actividades alg, incluidas actividades enzimáticas equivalentes en células huésped no fúngica) e introducir en la célula huésped al menos una actividad glicosidasa. En una realización preferente, la actividad glicosidasa se introduce provocando la expresión de una o varias actividades manosidasa dentro de la célula huésped, por ejemplo, mediante la activación de una actividad manosidasa o mediante la expresión a partir de una molécula de ácido nucleico de una actividad manosidasa, en la célula huésped.

En otra realización, el procedimiento implica fabricar o usar una célula huésped con actividad disminuida o agotada de una o más enzimas que transfieren un residuo de azúcar al brazo 1,6 de precursores de oligosacáridos unidos a lípidos (Fig.1). Una célula huésped de la invención se selecciona para, o se genomanipula mediante, la introducción de una mutación en uno o más de los genes que codifican una enzima que transfiere un residuo de azúcar (por ejemplo, manosilatos) al brazo 1,6 de un precursor de oligosacáridos unido a lípido. El residuo de azúcar es más preferentemente manosa, es preferentemente un residuo de glucosa, GlcNAc, galactosa, ácido siálico, mucosa o fosfato de GlcNAc. En una realización preferente, la actividad de una o más enzimas que manosilan el brazo 1,6 de precursores de oligosacáridos unidos a lípidos está disminuida o anulada. El procedimiento puede comprender también la etapa de introducir en la célula huésped al emnos una actividad de glicosidasa (véase más adelante).

En otra realización más, la invención proporciona un procedimiento para producir una glicoproteína de tipo humano en un huésped no humano, en el que la glicoproteína comprende un N-glicano que tiene al menos dos GlcNAc unidas a una estructura de núcleo de trimanosa.

En cada una de las realizaciones anteriores, el procedimiento se dirige a fabricar una célula huésped en la que los precursores de oligosacáridos unidos a lípidos están enriquecidos en estructuras ManXGlcNAc2, en las X es 3, 4 o 5 (Fig. 2). Estas estructuras se transfieren en el RE de la célula huésped a cadenas polipeptídicas nacientes mediante una oligosacáridos-transferasa y después pueden procesarse mediante tratamiento con glicosidasas (por ejemplo, amanosidasas) y glicosiltransferasas (por ejemplo, GnT1) para producir N-glicanos que tienen estructuras de núcleo GlcNAcManXGlcNAc2, en las que X es 3, 4 o 5, y es preferentemente 3 (Fig. 2 y 3). Tal como se muestra en la Fig. 2, los N-glicanos que tienen una estructura de núcleo GlcNAcManXGlcNAc2 en la que X es superior a 3 pueden convertirse en GlcNAcMan3GlcNAc2, por ejemplo mediante tratamiento con una actividad a-1,3 y/o a-1,2-1,3 manosidasa, cuando pueda aplicarse.

El procesamiento adicional de GlcNAcMan3GlcNAc2 mediante tratamiento con glicosiltransferasas (por ejemplo, GnTII) produce estructuras de núcleo GIcNAc2Man3GlcNAc2 que pueden modificarse después, si se desea, por ejemplo mediante tratamiento ex vivo o mediante expresión heteróloga en la célula huésped de un conjunto de enzimas de glicosilación, que incluyen glicosiltransferasa, transportadores de azúcar y manosidasas (véase más adelante), para convertirse en N-glicanos de tipo humano. Las glicoproteínas de tipo humano preferentes que pueden producirse según la invención incluyen las que comprenden N-glicano que tiene siete o menos, o tres o menos, residuos de manosa, comprenden uno o más azúcares seleccionados del grupo que consiste en galactosa, GlcNAc, ácido siálico y fucosa; y comprenden al menos una rama de oligosacárido que comprende la estructura NeuNAc-Gal-GlcNAc-Man.

En una realización, la célula huésped ha disminuido o anulado su actividad Dol-P-Man:Man5GlcNAc2-PP-Dol manosiltransferasa, que es una actividad implicada en la primera etapa de manosilación a partir de Man5GlcNAc2PP-Dol para dar Man6GlcNAc2-PP-Dol en el lado luminal del RE (por ejemplo, ALG3 Fig.1; Fig. 2). En S.cerevisiae, esta enzima está codificada por el gen ALG3. Tal como se ha descrito anteriormente, las célula de S.cerevisiae que albergan una mutación de alg3-1 débil acumulan Man5GlcNAc2-PP-Dol y las células que tienen una deleción en alg3 parecen transferir estructuras Man5GlcNAc2 a cadenas polipeptídicas dentro del RE. En consecuencia, en la presente realización, las células huésped acumularán N-glicanos enriquecidos en estructuras Man5GlcNAc2 que pueden convertirse después en GlcNAc2Man3GlcNAc2 mediante tratamiento con glicosidasas (por ejemplo, con actividades a-1,2 manosidasa, a-1,3 manosidasa o a-1,2-1,3 manosidasa (Fig. 2).

Tal como se describe en el Ejemplo 1, se diseñaron cebadores degenerados en base a un alineamiento de secuencias de proteínas Alg3 a partir de S. cerevisiae, D. melanogaster y seres humanos (H. sapiens) (Fig. 4 y 5), y se usaron para amplificar un producto de ADN genómico de P. pastoris. El producto de PCR resultante se usó como sonda para identificar y aislar un clon genómico de P. pastoris que comprende un marco de lectura abierto (ORF) que codifica una proteína que tiene el 35 % de identidad de secuencia general y el 53 % de similitud de secuencia con el gen ALG3 de S. cerevisiae (Figs. 6 y 7). Este gen de P. pastoris se denomina en el presente documento "PpALG3". El gen ALG3 se identificó de forma similar y se aisló a partir de K. lactis (Ejemplo 1; Fig. 8 y 9).

Así, en otra realización, la invención proporciona una molécula de ácido nucleico aislada que tiene una secuencia de ácido nucleico que comprende, o consta de, al menos cuarenta y cinco, preferentemente al menos 50, más preferentemente al menos 60 y del modo más preferente 75 o más residuos de nucleótidos del gen ALG 3 de P.pastoris (Fig. 6) y el gen ALG 3 de K. lactis (Fig. 8) y homólogos, variantes y derivados de la misma. La invención también proporciona moléculas de ácido nucleico que se hibridan en condiciones rigurosas con las moléculas de ácido nucleico descritas anteriormente. De forma similar, se proporcionan polipéptidos (incluidos muteínas, variantes alélicas, fragmentos, derivados y análogos) aislados codificados por las moléculas de ácido nucleico de la invención (los genes ALG3 de P.pastoris y K. lactis se muestran en la Fig. 6 y la Fig. 8). Además, también se proporcionan vectores, incluidos vectores de expresión, que comprenden una molécula de ácido nucleico de la invención, tal como se describe más adelante en el presente documento.

Usando cebadores específicos de genes, se fabrica un constructo para suprimir el gen PpALG3 del genoma de P. pastoris (Ejemplo 1). Esta cepa se usó para generar una célula huésped con la actividad Dol-P-Man:Man5GlcNAc2PP-Dol manosiltransferasa anulada y producir precursores de Man5GlcNAc2-PP-Dol unidos a lípidos que se transfieren a cadenas polipeptídicas nacientes para producir N-glicanos que tengan estructuras de carbohidrato MansGlcNAc2.

Tal como se describe en el Ejemplo 2, dicha célula huésped puede genomanipularse mediante la expresión de manosidasas apropiadas para producir N-glicanos que tienen la estructura de carbohidrato de núcleo de Man3GlcNAc2 deseado. La expresión de GnT en la célula huésped (por ejemplo, dirigiendo una molécula de ácido nucleico o una biblioteca de moléculas de ácido nucleico tal como se describe más adelante) posibilita que la célula huésped modificada produzca N-glicanos que tienen una o más estructuras GlcNAc unidas a cada brazo de la estructura de núcleo Man3 (es decir, GlcNAc1Man3GlcNAc2 o GlcNAc2Man3GlcNAc2; véase la Fig. 3). Estas estructuras pueden procesarse adicionalmente usando los procedimientos de la invención para producir N-glicanos de tipo humano en proteínas que penetran en la ruta de secreción de la célula huésped.

En otra realización, la célula huésped ha disminuido o anulado la actividad dolicil-P-Man:Man6GlcNAc2-PP-dolicil a1,2 manosiltransferasa, que es una actividad a-1,2 manosiltransferasa implicada en la etapa de manosilación que convierte Man6GlcNAc2-PP-Dol en Man7GlcNAc2-PP-Dol en el lado luminal del RE (véase anteriormente y Fig. 1 y 2). En S.cerevisiae, esta enzima está codificada por el gen ALG9. Las células que albergan una mutación alg9 acumulan Man6GlcNAc2-PP-Dol (Fig. 2) y transfieren estructuras Man6GlcNAc2 a cadenas polipeptídicas nacientes dentro del RE. En consecuencia, en la presente realización, las células huésped acumularán N-glicanos enriquecidos en estructuras Man6GlcNAc2 que puede procesarse a la baja para dar estructuras Man3 de núcleo mediante tratamiento con a-1,2 y a-1,3 manosidasas (véase la Fig. 3 y Ejemplos 3 y 4).

Se construye una célula huésped en la que el gen alg9 (o gen que codifica una actividad equivalente) ha sido suprimido, Ejemplo 3). La deleción de ALG9 (o ALG12; véase más adelante) crea una célula huésped que produce N-glicanos con una o dos manosas adicionales, respectivamente, en el brazo 1,6 (Fig. 2). Con el fin de fabricar la manosa de núcleo 1,6 accesible a N-acetilglucosaminiltransferasa II (GnTII), estas manosas tienen que eliminarse mediante glicosidasa(s). La manosidasa del RE típicamente eliminará la 1,2 manosa terminal del brazo 1,6 y, posteriormente, la manosidasa II (alfa 1-3,6 manosidasa) u otras manosidasas tales como alfa 1,2, alfa 1,3 o alfa 12,3 manosidasas (por ejemplo, de Xanthomonas manihotis; véase el Ejemplo 4) pueden actuar sobre el brazo 1,6 y, posteriormente, GnTII puede transferir una N-acetilglucosamina, dando como resultado GlcNAc2Man3 (Fig. 2).

La célula huésped resultante, que tiene la actividad de alg9p anulada, está genomanipulada para que exprese actividad a-1,2 y a-1,3 manosidasa (de una o más enzimas, y preferentemente mediante la expresión una molécula de ácido nucleico introducida en la célula huésped y que expresa una enzima dirigida a un compartimento subcelular preferente (véase más adelante)). El Ejemplo 4 describe la clonación y la expresión de una de dichas enzimas de

Xanthomonas manihotis.

En otra realización, la célula huésped tiene actividad dolicil-P-Man:Man7GlcNAc2-PP-dolicil a-1,6 manosiltransferasa disminuida o agotada, que es una actividad a-1,6 manosiltransferasa implicada en la etapa de manosilación que convierte Man7GlcNAc2-PP-Dol en Man8GlcNAc2-PP-Dol (que manosila la a-1,6 manosa en el brazo 1,6 de la estructura de manosa del núcleo) en el lado luminal del RE (véase anteriormente y Fig. 1 y 2). En S.cerevisiae, esta enzima está codificada por el gen ALG12. Las células que albergan una mutación alg12 acumulan Man7GlcNAc2-PP-Dol (Fig. 2) y transfieren estructuras Man7GlcNAc2 a cadenas de polipéptidos nacientes dentro del RE. En consecuencia, en la presente realización, las células huésped acumularán N-glicanos enriquecidos en estructuras Man7GlcNAc2 que puede procesarse después a la baja para dar estructuras Man3 de núcleo mediante tratamiento con a-1,2 y a-1,3 manosidasas (véase la Fig. 3 y Ejemplos 3 y 4).

Tal como se ha descrito anteriormente para huésped mutantes alg9, la célula huésped resultante, que tiene la actividad alg12p anulada, está genomanipulada para que exprese actividad de a-1,2 y a-1,3 manosidasa (por ejemplo, de una o más enzimas, y preferentemente de una o más moléculas de ácido nucleico introducidas en la célula huésped y que expresan una actividad de enzima dirigida a un compartimento subcelular preferente (véase más adelante)).

Obtención por ingeniería genética o selección de huéspedes que tienen opcionalmente actividad a-1,6 manosiltransferasa de iniciación disminuida

En una realización preferente, el procedimiento de la invención implica fabricar o usar una célula huésped que tiene tanto (a) actividad disminuida o agotada de un gen alg o una o más actividades disminuidas o agotadas que manosilan N-glucanos en el brazo a-1,6 de la estructura de carbohidrato de núcleo Man3GlcNAc2 ("Man3"), como (b) actividad disminuida o agotada de una a-1,6-manosiltransferasa iniciadora, es decir, una enzima específica de iniciación que inicia la manosilación de la cadena exterior (en el brazo a-1,3 de la estructura de núcleos Man3). En S.cerevisiae, esta enzima está codificada por el gen OCH1. La interrupción del gen och1 en S.cerevisiae da como resultado un fenotipo en el que los azúcares unidos a N carecen completamiento de la cadena exterior de polimanosa. Los enfoques previos para obtener glicosilación de tipo mamífero en cepas fúngicas han requerido la inactivación de OCH1 (véase, por ejemplo, Chiba, 1998). La interrupción de la actividad iniciadora de a-1,6manosiltransferasa en una célula huésped de la invención, no obstante, es opcional (dependiendo de la célula huésped seleccionada), ya que la enzima Och1p requiere un MangGlcNAc intacto para la iniciación eficaz de la cadena exterior de manosa. Por lo tanto, las células huésped seleccionadas o producidas según la presente invención, que acumulan oligosacáridos unidos a lípidos que tienen siete o menos residuos de manosa producirán, después de la transferencia, N-glicanos hipoglicosilados que probablemente serán sustratos malos para Ochlp (véase, por ejemplo, Nakayama, 1997).

Obtención por ingenería genética o selección de huéspedes que tienen actividad de glicosiltransferasa aumentada

Tal como se ha debatido anteriormente, se piensa que los oligosacáridos glucosilados se pueden transferir a cadenas polipeptídicas nacientes a una velocidad muy superior a la de sus homólogos no glucosilados. Parece que el reconocimiento del sustrato por el complejo oligosacáriltransferasa se potencia mediante la adición de glucosa a la antena de oligosacáridos unidos a lípidos. Por lo tanto, es deseable crear o seleccionar células huésped capaces de glucosilación óptima de los oligosacáridos unidos a lípidos. En dichas células huésped, la subglicosilación se disminuirá o incluso se anulará, debido a una transferencia más rápida y más eficiente de estructuras Man5 glicosiladas a la cadena polipeptídica naciente.

En consecuencia, en otra realización de la invención, el procedimiento se dirige a fabricar una célula huésped en la que los precursores de N-glicano unidos a lípidos se transfieran eficazmente a la cadena polipeptídica naciente en el RE. En una realización preferente, la transferencia se aumenta incrementando el nivel de glucosilación de las ramas de oligosacáridos unidos a lípidos que, a su vez, mejorarán sustratos para oligosacariltransferasa.

En una realización preferente, la invención proporciona un procedimiento para fabricar una glicoproteína de tipo humano que usa una célula huésped en la que una o más enzimas responsables de la glucosilación de oligosacáridos unidos a lípidos en el RE ha aumentado su actividad. Un modo de aumentar el grado de glucosilación de los oligosacáridos unidos a lípidos es sobreexpresar una o más enzimas responsables de la transferencia de residuos de glucosa a la antena del oligosacáridos unido a lípido. En particular, una actividad a-1,3 glucosiltransferasa aumentada incrementará la cantidad de estructuras Man5 unidas a lípidos y reducirá o eliminará la subglicosilación de proteínas segregadas. En S.cerevisiae, esta enzima está codificada por el gen ALG6.

El ALG6 de Saccharomyces cerevisiae y su homólogo humano se han clonado (Imbach, 1999; Reiss, 1996). Debido a la conservación evolutiva de las etapas tempranas de glicosilación, se espera que los loci ALG6 sean homólogos entre especies y pueden clonarse en base a similitudes de secuencia por cualquier experto en la técnica. (Esto mismo tiene validez para la clonación e identificación de loci ALG8 y ALG10 de especies diferentes.) Además, pueden analizarse después glucosiltransferasas diferentes de especies diferentes para identificar las que tienen actividades óptimas.

La introducción de copias adicionales de un gen ALG6 y/o la expresión de ALG6 bajo el control de un promotor fuerte, tal como el promotor GAPDH, es una de las diversas maneras de aumentar el nivel de oligosacáridos unidos a lípidos glucosilados. El gen ALG6 de P. pastoris se clona y se expresa (Ejemplo 5). Las secuencias de ácido nucleico o de aminoácidos de ALG6 se muestran en la Fig. 25 (S. cerevisiae) y en la Fig. 26 (P. pastoris). Estas secuencias se comparan con otras secuencias de ALG6 eucariotas en la Fig. 27.

En consecuencia, otra realización de la invención proporciona un procedimiento para aumentar el grado de glucosilación de oligosacáridos unidos a lípidos que comprende la etapa de aumentar la actividad alfa-1,3 glucosiltransferasa en una célula huésped. El aumento en la actividad puede lograrse sobreexpesando las secuencias de ácido nucleico que codifican la actividad, por ejemplo uniendo operativamente el ácido nucleico que codifica la actividad con una o más secuencias de control de la expresión heterólogas. Las secuencias de control de la expresión preferentes incluyen secuencias de iniciación de la transcripción, de terminación, promotoras y potenciadoras, señales de ayuste del donante de ARN y de poliadenilación, secuencias estabilizantes de ARNm, sitios de unión a ribosomas, secuencias estabilizantes de proteínas y secuencias de secreción de proteínas.

En otra realización, el aumento de la actividad alfa-1,3 glucosiltransferasa se logra introduciendo una molécula de ácido nucleico que codifica la actividad de un plásmido multicopia usando técnicas bien conocidas por el experto. En otra realización más, el grado de glucosilación de oligosacáridos unidos a lípidos comprende disminuir la específicidad de sustrato de la actividad oligosacariltransferasa en una célula huésped. Esto se logra, por ejemplo, sometiendo al menos un ácido nucleico que codifica la actividad a una técnica tal como transposición de genes, mutagénesis in vitro y reacción en cadena de la polimerasa propensa a error, siendo todas ellas bien conocidas por el experto en la técnica. Naturalmente, ALG8 y ALG10 puede sobreexpresarse en una célula huésped y analizarse de un modo similar.

En consecuencia, en una realización preferente, la invención proporciona un procedimiento para fabricar una glicoproteína de tipo humano usando una célula huésped que está genomanipulada o seleccionada de modo que una o más enzimas responsables de la glucosilación de oligosacáridos unidos a lípidos en el RE haya aumentado su actividad. En una realización más preferente, la invención usa una célula huésped que tiene tanto (a) actividad disminuida o anulada de una o más actividades de gen alg o actividades que manosilan N-glicanos en el brazo a-1,6 de la estructura de carbohidrato de núcleo Man3GlcNAc2 ("Man3") como (b) se ha genomanipulado o seleccionado de modo que una o más enzimas responsables de la glucosilación de oligosacáridos unidos a lípidos en el RE haya aumentado su actividad. La estructura Man5 unida a lípido encontrada en un antecedente de mutante alg3, no es un sustrato preferente para Alg6p. En consecuencia, el experto puede identificar Alg6p, Alg8p y Alg10p con una especificidad de sustrato aumentada (Gibbs, 2001), por ejemplo sometiendo ácidos nucleicos que codifican dichas enzimas a uno o más ciclos de transposición de genes, PCR propensa a error o enfoques de mutagénesis in vitro y seleccionando la especificidad de sustrato aumentada en una célula de interés, usando técnicas de biología molecular y selección genética bien conocidas por los expertos en la técnica. El experto apreciará que dichas técnicas para mejorar las especificidades de sustrato de la enzima en una cepa huésped seleccionada no están limitadas a esta realización particular de la invención sino que más bien puede usarse cualquier realización para optimizar adicionalmente la producción de N-glicanos de tipo humano en una célula huésped no humana.

Tal como se ha descrito, una vez se transfiere Man5 a la cadena polipeptídica naciente, la expresión de a-1,2manosidasa(s) adecuada(s), tal como se proporciona por la presente invención, se recorta posteriormente a estructuras Man5GlcNAc2 para proporcionar las estructuras Man3GlcNAc2 de núcleo deseadas. Las a-1,2manosidasas eliminan solo residuos de manosa unidos en a-1,2 y se espera que reconozcan las estructuras específicas Man5GlcNAc2 -Man7GlcNAc2 fabricadas en células huésped mutantes alg3, 9 y 12 y en células huésped en las que están mutados homólogos de estos genes.

Tal como se presenta esquemáticamente en la Figura 3, la coexpresión de transportador(es) y transferasa(s) de UDP-azúcar cubrirá los residuos a-1,6 y a-1,3 terminales con GlcNAc, dando como resultado el precursor necesario para la N-glicosilación de híbridos y complejos de tipo mamífero: GlcNAc2Man5GlcNAc2. La cadena de oligosacárido unido a N unido a péptido GlcNAc2Man3GlcNAc2 (Figura 3) sirve después como precursor para la modificación adicional dando una estructura de oligasacárido de tipo mamífero. La expresión subsiguiente de galactosiltransferasas y la manipulación por ingeniería genética de la capacidad para transferir ácido siálico producirá una estructura de N-glicano de tipo mamífero (por ejemplo, de tipo humano).

Una célula huésped deseada según la invención puede genomanipularse para una enzima o más de una enzima simultáneamente. Además, puede crearse una biblioteca de genes que codifican enzimas potencialmente útiles, y una cepa que tiene una o más enzimas con actividades óptimas o que producen la mayor parte de las glicoproteínas “de tipo humano”, seleccionadas mediante la transformación de células huésped diana con uno o más miembros de la biblioteca. Los eucariotas inferiores que son capaces de producir glicoproteínas que tienen el N-glicano de núcleo Man3GlcNAc2 son particularmente útiles debido a la facilidad de realizar manipulaciones genéticas y las características de seguridad y eficacia. En una realización preferente, se realiza al menos una reacción de glicosilación adicional, ex vivo o in vivo, para producir un N-glicano de tipo humano. En una realización más preferente, se expresan formas activas de enzimas de glicosilación en el retículo endoplasmático y/o el aparato de Golgi de la célula huésped para producir la glicoproteína de tipo humano deseada.

Células huésped

Una célula huésped no humana preferente de la invención es una célula eucariota inferior, por ejemplo, un hongo unicelular o filamentoso, que tienen la actividad de una o más actividades de gen alg disminuida o anulada (incluida la actividad enzimática que es un homólogo o equivalente a una actividad alg. Otra célula huésped descrita en el presente documento tiene actividad disminuida o anulada de una o más enzimas (diferentes a las actividades alg) que manosilan el brazo a-1,6 de una estructura de oligosacárido unido a lípido.

Aunque son preferentes las células huésped eucariotas inferiores, se considera que son útiles una amplia diversidad de células huésped que tienen las propiedades mencionadas anteriormente en los procedimientos descritos en el presente documento. Pueden genomanipularse, por ejemplo, células vegetales para que expresen glicoproteínas de tipo humano según la invención. Asimismo, puede modificarse una diversidad de células huésped mamíferas no humanas para que expresen más glicoproteínas de tipo humano usando los procedimientos de la invención. Una célula huésped apropiada puede genomanipularse o puede usarse uno de los muchos mutantes de este tipo ya descritos en levaduras. Una célula huésped preferente de la invención, tal como se ejemplifica en el presente documento, es un mutante (OCH1) de hipermanosilación-menos en Pichia pastoris que se ha modificado para eliminar el gen alg3. Otros huéspedes preferentes son mutantes de Pichia pastoris que tienen mutaciones och1 y alg 9 o alg12.

Formación de N-glicanos complejos

La adición secuencial de azúcares a la estructura de N-glicano naciente modificada implica dirigir exitosamente glucosiltransferasas al aparato de Golgi y su expresión exitosa. Este proceso requiere la expresión funcional, por ejemplo, de GnT I, en el aparato de Golgi temprano o medio, así como asegurar un suministro suficiente de UDP-GlcNAc (por ejemplo, mediante la expresión de un transportador UDP-GlcNAc).

Para caracterizar las glicoproteínas y para confirmar la glicosilación deseada, las glicoproteínas se purificaron, los Nglicanos se liberaron de PNGasa-F y después se analizaron mediante EM MALDI-TOF (Ejemplo 2). El dominio Kringle 3 del plasminógeno humano se usó como proteína informadora. Esta glicoproteína soluble se produjo en P. pastoris en un antecedente inactivado de alg3, och1 (Ejemplo 2).

Se produjo GlcNAcMan5GlcNAc2 como el N-glicano predominante después de la adición de GnT I humano y transportador de UDP-GlcNAc de K. lactis, en la Fig.16 (Ejemplo 2). La masa de este N-glicano es consecuente con la masa de GlcNAcMan5GlcNAc2 a 1463 (m/z). Para confirmar la adición del GlcNAc a Man5GlcNAc2, se realizó la digestión de 1-N-hexosaminidasa, que reveló un pico a 1260 (m/z), consecuente con la masa de Man5GlcNAc2 (Fig.17).

Los N-glicanos obtenidos a partir de la deleción de alg3 och1 en una cepa RDP27 (Ejemplo 2) proporcionaron dos picos distintos a 1138 (m/z) y 1300 (m/z), lo que es consecuente con las estructuras GlcNAcMan3GlcNAc2 y GlcNAcMan4GlcNAc2(Fig. 18). Después de la digestión in vitro de una a1,2-manosidasa para manosas redundantes, un pico eluyó a 1138 (m/z), lo que es consecuente con GlcNAcMan3GlcNAc2 (Fig. 19). Para confirmar la adición del GlcNAc en la estructura de Man3GlcNAc2, se realizó la digestión de 1-N-hexosaminidasa, que reveló un pico a 934 (m/z), consecuente con la masa de Man3GlcNAc2 (Fig. 20).

La adición de la segunda GlcNAc a GlcNAcMan3GlcNAc2 se muestra en la figura Fig. 21. El pico a 1357 (m/z) corresponde a GlcNAc2Man3GlcNAc2. Para confirmar la adición de las dos GlcNAc a la estructura de manosa de núcleo Man3GlcNAc2, se realizó otra digestión de 1-N-hexosaminidasa, que reveló un pico a 934 (m/z), consecuente con la masa de Man3GlcNAc2 (Fig. 22). Estos son datos concluyentes que muestran una glicoproteína de tipo complejo en células de levadura.

La adición in vitro de UDP-galactosa y 1-1,4-galactosiltransferasa al GlcNAc2Man3GlcNAc2 dio como resultado un pico a 1664 (m/z), que es consecuente con la masa de Gal2GlcNAc2Man3GlcNAc2 (Fig. 23) Finalmente, la adición in vitro de ácido CMP-N- acetilneuramínico y sialiltransferasa dio como resultado un pico a 2248 (m/z), que es consecuente con la masa de NANA2Gal2GlcNAc2Man3GlcNAc2 (Fig. 24). Los datos anteriores apoyan el uso de células huésped no mamíferas que son capaces de producir glicoproteínas de tipo humano complejas.

Dirección de glicosil- y galactosil-transferasas a orgánulos específicos

Se han dedicado mucho esfuerzo a revelar el mecanismo exacto por el que estas enzimas se retienen y se anclan a sus orgánulos respectivos. Aunque compleja, la evidencia sugiere que la región troncal, la región que abarca la membrana y la cola citoplasmática, individualmente o en conjunto, dirigen las enzimas hacia la membrana de orgánulos individuales y, por lo tanto, se localizan en el dominio catalítico asociado a ese locus.

El procedimiento mediante el que pueden expresarse glicosiltransferasas activas y dirigirlas al orgánulo apropiado de modo que pueda tener lugar un orden secuencial de reacciones que tenga como consecuencia la formación de N-glicano complejo, es tal como sigue:

(A)

Establecer una biblioteca de ADN de regiones que se sabe que codifican proteínas/péptidos que median la localización de una ubicación particular en la ruta secretora (RE, aparato de Golgi, y red trans del aparato de Golgi). Una selección limitada de dichas enzimas y su ubicación respectiva se muestra en la tabla 1. Estas secuencias pueden seleccionarse a partir del huésped que se va a genomanipular, así como otros organismos relacionados o no relacionados. Estas secuencias, generalmente, entran en tres categorías: (1) secuencias Nterminales que codifican una cola citosólica (ct), un dominio transmembrana (tmd) y parte de algo más ambiguo definido región troncal (sr), que conjunta o individualmente anclan proteínas a la membrana interna (luminal) del aparato de Golgi, (2) señales de recuperación que se encuentran generalmente en el extremo C-terminal tal como el tetrapéptido HDEL o KDEL y (3) transportadores de azúcar nucleotídicos que abarcan la membrana que se sabe que se localizan en el aparato de Golgi. En el primer caso, en el que la región de localización consiste en diversos elementos (ct, tmd y sr) la biblioteca se diseña de modo que se representen la ct, el tmd y diversas partes

de la región troncal. Esto puede realizarse usando cebadores PCR que se unen al extremo 5’ del ADN que codiica la región citosólica y usando una serie de cebadores de oposición que se unen a diversas partes de la región troncal. Además, se crearían constructos de proteínas de fusión que codifican transportadores nucleotídicos de azúcar y señales de recuperación conocidas.

(B)

Una segunda etapa implica la creación de una serie de constructos de proteínas de fusión que codifican las secuencias de localización mencionadas anteriormente y el dominio catalítico de una glicosiltransferasa particular clonada en fase con dicha secuencia de localización (por ejemplo, GnT I, GalT, fucosiltransferasa o ST). En el caso de un transportador nucleotídico de azúcar fusionado a un dominio catalítico, se pueden diseñar dichos constructos de modo que el dominio catalítico (por ejemplo GnT I) sea bien el extremo N o bien el extremo C del polipéptido resultante. El dominio catalítico, como la secuencia de localización, puede estar derivado de diversas fuentes diferentes. La elección de dichos dominios catalíticos puede estar guiada por el conocimiento de un entorno particular en el que el dominio catalítico sea activo. Por ejemplo, si una glicosiltransferasa particular es para que sea activa en el aparato de Golgi tardío y todas las enzimas conocidas del organismo huésped en el aparato de Golgi tardío tienen un pH óptimo de 7,0, o se sabe que el aparato de Golgi tardío tiene un pH particular, se intentaría seleccionar un dominio catalítico que tenga una actividad máxima a ese pH. Los datos existentes in vivo sobre la actividad de dichas enzimas, en particular huéspedes, también pueden usarse. Por ejemplo, Schwientek y colaboradores mostraron que la actividad de GalT puede obtenerse mediante ingeniería genética en el aparato de Golgi de S.cerevisiae y mostraron que dicha actividad estaba presente demostrando la transferencia de algunos Gal a GlcNAc2 existente en un mutante alg de S. cerevisiae. Además, se pueden realizar varios ciclos de transposición de genes o de PCR propensa a error para obtener una diversidad más amplia de conjuntos de constructos de fusión, ya que se ha demostrado que mutaciones de amino únicas pueden alterar drásticamente la actividad de enzimas de procesamiento de glicoproteínas (Romero y col., 2000). También pueden usarse secuencias de longitud completa de glicosiltransferasas y su secuencia de anclaje endógena. En una realización preferente, dichas bibliotecas de dominios de localización/catalíticos se diseñan para incorporar información existente en la naturaleza secuencial de reacciones de glicosilación en eucariotas superiores. En otras palabras, reacciones que se sabe que tienen lugar de forma temprana en el transcurso del procesamiento de glicoproteínas requieren dirigir enzimas que catalizan dichas reacciones a una parte temprana del aparato de Golgi o del RE. Por ejemplo, el recorte de Man8GlcNAc2 para dar Man5GlcNAc2 es una etapa temprana en la formación de N-glicano complejo. Ya que el procesamiento de proteínas se inicia en el RE y después se realiza a lo largo del aparato de Golgi temprano, medio y tardío, es deseable hacer que esta reacción tenga lugar en el RE

o el aparato de Golgi temprano. Cuando se diseña una biblioteca para la localización de manosidasa I, se realiza de tal modo que coincidan las señales directoras del RE y el aparato de Golgi temprano con el domino catalítico de manosidasa 1.

Después de la transformación de la cepa huésped con la biblioteca de constructos de fusión, se usa un proceso seleccionado para identificar qué combinación particular de la secuencia de localización y el dominio catalítico tiene, de hecho, el efecto máximo sobre la estructura de carbohidrato encontrada en dicha cepa huésped. Dicha selección puede basarse en cualquier número de ensayos o procedimientos de detección. Pueden llevarse a cabo manualmente o pueden automatizarse mediante el uso de equipos de cribado de alto rendimiento.

En otro ejemplo, la actividad de GnT I se requiere para la maduración de N-glicanos complejos, debido a que solo después de la adición de GlcNAc al residuo de a1,3 manosa terminal puede tener lugar adicionalmente el recorte de dicha estructura para dar la estructura GlcNAcMan3GlcNAc2 intermedia subsiguiente. Es lo más probable que la manosidasa II no sea capaz de eliminar los residuos de a1,3- y a1,6-manosa terminales en ausencia de un 1-1,2-GlcNAc terminal y, por lo tanto, la formación de N-glicanos complejos no tendrá lugar en ausencia de actividad GnT I (Schachter, 1991). Alternativamente, en primer lugar, se puede obtener por ingeniería genética o seleccionar una cepa que tenga cantidades suficientes de Man5GlcNAc2 tal como se describe en la presente invención genomanipulando o seleccionando una cepa deficiente en actividad de Alg3P. En presencia de suficiente actividad de transportador UDP-GlcNAc, tal como puede lograrse obteniendo por ingeniería genética o seleccionando una cepa que tenga dicha actividad de transportador UDP-GlcNA, el GlcNAc puede añadirse al residuo a-1,3 terminal mediante GnTI, ya que in vitro una estructura Man3 se reconoce mediante GnTI de hígado de rata (Moller, 1992).

En otro enfoque, se puede incorporar la expresión de un transportador de UDP-GlcNAc en la biblioteca mencionada anteriormente, de modo el constructo diseñado contendrá: (1) una región mediante la que el constructo transformado se mantiene en la célula (por ejemplo, origen de replicación o una región que media la integración cromosómica), (2) un gen marcador que permite la selección de células que se han transformado, incluidos marcadores contraseleccionables y reciclables tales como ura3 o T urf13 (Soderholm, 2001) u otros marcadores de selección bien caracterizados (por ejemplo, his4, bla, Sh ble, etc.), (3) un gen que codifica un transportador UDP-GlcNAc (por ejemplo de K.lactis, (Abeijon, 1996), o de H.sapiens (Ishida, 1996) y (4) un promotor activador de la expresión de la bibioteca de constructos de fusión del dominio de localización/catalítico mencionado anteriormente.

Después de la transformación del huésped con la biblioteca de constructos de fusión descritos anteriormente, se pueden cribar las células que tienen la mayor concentración de GlcNAc terminal sobre la superficie celular o segregan la proteína con el contenido de GlcNAc terminal más alto. Dicho cribado puede basarse en un procedimiento visual, tal como una procedimiento de tinción, la capacidad de unirse a anticuerpos o lectinas de unión a GlcNAc terminal específicos conjugados a un marcador (dichas lectinas están disponibles de E.Y.

Laboratories Inc., San Mateo, CA), la capacidad disminuida de lectinas específicas para unirse a residuos de manosa terminal, la capacidad de incorporar un azúcar marcado radioactivamente in vitro, unión alterada a tintes o superficies cargadas o puede realizarse usando un dispositivo de clasificación de células asistida por fluorescencia (FACS) junto con una lectina o anticuerpo marcado con fluoróforos (Guillen, 1998). Puede ser ventajoso enriquecer 5 fenotipos particulares dentro de la población transformada con lectinas citotóxicas. La patente de Estados Unidos Nº

5.595.900 enseña varios procedimientos mediante los que pueden identificarse células con estructuras de carbohidrato extracelular deseado. LLevar a cabo repetidamente esta estrategia permite la obtención secuencial por ingeniería genética de más y más glicanos complejos en eucariotas inferiores.

Después de la transformación, se pueden seleccionar transformantes que permitan la transferencia más eficaz de

10 GlcNAc mediante GlcNAc transferasa II a partir de UDP-GlcNAc en un ensayo in vitro. Este cribado puede llevarse a cabo cultivando células que albergan la biblioteca transformada bajo una presión selectiva en una placa de agar y transfiriendo colonias individuales a placas de microvaloración de 96 pocillos. Después de cultivar las células, las células se centrifugan, las células se resuspenden en un tampón y después de la adición de UDP-GlcNAc y GnT V, la liberación de UDP se determina bien mediante HPLC o bien mediante un ensayo unido a enzima para UDP.

15 Alternativamente, se puede usar UDP-GlcNAc y GnT V marcados radiactivamente, lavar las células y después buscar la liberación de GlcNAc radiactiva mediante N-acetilglucosaminidasa. Todo esto puede realizarse manual o automáticamente mediante el uso de equipos de cribado de alto rendimiento.

Se espera que los transformantes que liberan más UDP, en el primer ensayo, o más GlcNAc marcado radiactivamente en el segundo ensayo, tengan un nivel más alto de GlcNAcMan3GlcNAc2 (Fig. 3) en su superficie y, 20 por lo tanto, constituyan el fenotipo deseado. Alternativamente, se puede usar cualquier otro cribado adecuado tal como un ensayo de unión a lectina que sea capaz de revelar patrones de glicosilación alterados en la superficie de células transformadas. En este caso, la unión reducida de lectinas específicas a manosas terminales puede ser una herramienta de selección adecuada. La lectina de Galantus nivalis se une específicamente a la a- 1,3 manosa terminal que se espera que se reduzca si hay presencia en el aparato de Golgi de actividad manosidasa II suficiente. 25 Se puede enriquecer también en transformantes deseados llevando a cabo una etapa de separación cromatográfica que permita la eliminación de células que contienen un contenido de manosa terminal alto. Esta etapa de separación se llevaría a cabo con una columna de lectina que se une específicamente a células con un contenido de manosa terminal alto (por ejemplo, lectina Galantus nivalis unida a agarosa, Sigma, St.Louis, MO) antes que a las que tienen un contenido de manosa terminal bajo. Además, se pueden crear directamente constructos de proteínas de fusión, 30 ya que la información adicional sobre la localización de enzimas que modifican carbohidratos activas en diferentes huéspedes eucariotas inferiores diferentes está disponible en la literatura científica. Por ejemplo, la técnica anterior nos enseña que 1-1,4-GalTr humana puede fusionarse al dominio de membrana de MNT, una manosiltransferasa de S. cerevisiae, y se localiza en el aparato de Golgi mientras que se mantiene su actividad catalítica (Schwientek y col., 1995). Si S. cerevisiae o un organismo relacionado es el huésped que se va a genomanipular, se pueden

35 incorporar directamente dichos hallazgos en la estrategia general para obtener N-glicanos complejos a partir de dicho huésped. Se ha identificado que muchos de dichos fragmentos génicos en P.pastoris están relacionados con glicosiltransferasas en S.cerevisiae y, por lo tanto, podrían usarse para estos fines.

Tabla 1

Gen o secuencia

Organismo Función Localización del producto génico

MnSI

S. cerevisiae manosidasa RE

Och1

S. cerevisiae 1,6-manosiltransferasa Aparato de Golgi (cis)

Mnn2

S. cerevisiae 1,2-manosiltransferasa Aparato de Golgi (medio)

Mnn1

S. cerevisiae 1,3-manosiltransferasa Aparato de Golgi (trans)

Och1

P. pastoris 1,6-manosiltransferasa Aparato de Golgi (cis)

2,6 ST

H. sapiens S. frugiperda 2,6-sialiltransferasa Red trans del aparato de Golgi

11,4 Gal T

leche bovina Transportador UDP-Gal Aparato de Golgi

Mnt1

S. cerevisiae 1,2-manosiltransferasa Aparato de Golgi (cis)

HDEL en el extremo C

S. cerevisiae Señal de recuperación RE

40 Sitios de integración

El objetivo último de este esfuerzo de modificación por ingeniería genética es una cepa de producción de proteína robusta con la que se pueden obtener buenos resultados en un proceso de fermentación industrial; la integración de múltiples genes en el cromosoma huésped (por ejemplo, fúngico) implica una planificación cuidadosa. Esta cepa obtenida por ingeniería genética tendrá, probablemente, que ser transformada con una serie de genes diferentes, y 5 estos genes tendrán que ser transformados de forma estable para asegurar que la actividad deseada se mantenga a la largo del proceso de fermentación. Cualquier combinación de las actividades de enzimas siguientes tendrá que ser obtenida por ingeniería genética en el huésped de expresión proteica fúngico: sialiltransferasas, manosidasas, fucosiltransferasas, galactosiltransferasas, glucosiltransferasas, GlcNAc transferasas, transportadores específicos del RE y del aparato de Golgi (por ejemplo, transportadores simporte y antiporte para UDP-galactosa y otros 10 precursores), otras enzimas implicadas en el procesamiento de oligosacáridos y enzimas implicadas en la síntesis de precursores de oligosacáridos activados tales como UDP-galactosa, ácido CMP-N-acetilneuramínico. Al mismo tiempo, un número de genes que codifican enzimas que se sabe que son características de reacciones de glicosilación no humanas, tendrán que eliminarse. Dichos genes y sus proteínas correspondientes se han caracterizado extensamente en una serie de eucariotas inferiores (por ejemplo, S.cerevisiae, T.reesei, A. nidulans, 15 etc.), proporcionando, de este modo, una lista de glicosiltransferasas conocidas en eucariotas inferiores, sus actividades y sus secuencias genéticas respectivas. Estos genes pueden seleccionarse, probablemente del grupo de manosiltransferasa, por ejemplo 1,3 manosiltransferasas (por ejemplo, MNN1 en S.cerevisiae) (Graham, 1991), 1,2 manosiltransferasas (por ejemplo, familia KTR/KRE de S.cerevisiae), 1,6 manosiltransferasas (OCH1 de S.cerevisiae), manosilfosfato transferasas (MNN4 y MNN6 de S.cerevisiae) y enzimas adicionales que están

20 implicadas en reacciones de glicosilación aberrantes, es decir, no humanas. Muchos de estos genes, de hecho, se han elimado individualmente dando lugar a fenotipos viables con perfiles de glicosilación alterados. Los ejemplos se muestran en la tabla 2:

Tabla 2

Cepa

Mutante Estructura de tipo silvestre Estructura del mutante Autores

Schizosaccharomyces pombe

OCH1 Mannan (es decir Man>9GlcNAc2) Man8GlcNAc2 Yoko-o y col., 2001

S.cerevisiae

OCH1, MNN1 Mannan (es decir Man>9GlcNAc2) Man8GlcNAc2 Nakanishi-Shindo y col., 1993

S.cerevisiae

OCH1, MNN1, MNN4 Mannan (es decir Man>9GlcNAc2) Man8GlcNAc2 Chiba y col., 1998

25 Debido a que cualquier estrategia para manipular por ingeniería genética la formación de N-glicanos complejos en un eucariota inferior implica tanto la eliminación como la adición de actividades glicosiltransferasa; un esquema integral intentará coordinar ambos requerimientos. Los genes que codifican enzimas que son no deseables sirven como sitios de integración potenciales para genes que son deseables. Por ejemplo, la actividad 1,6 manosiltransferasa es una característica de glicosilación en muchos eurcariotas inferiores conocidos. El gen que

30 codifica la alfa-1,6 manosiltransferasa (OCH1) se ha clonado a partir de S.cerevisiae y mutaciones en el gen dan lugar a un fenotipo viable con manosilación reducida. El locus del gen que codifica la actividad de alfa-1,6 manosiltransferasa, por lo tanto, es una diana principal para la integración de genes que codifican la actividad glicosiltransferasa. De un modo similar, uno puede elegir una serie de otros sitios de integración cromosómica que, en base a eventos de interrupción génicos en ese locus, se espera que: (1) mejoren la capacidad de las células para

35 glicosilar de un modo más similar al humano, (2) mejoren la capacidad de las células para segregar proteínas, (3) reduzcan la proteolisis de proteínas extrañas y (4) mejore otras características del proceso que faciliten la purificación o propio proceso de fermentación.

Proporcionar precursores nucleotídicos de azúcar

Una característica de glicosilación en eucariotas superiores es la presencia de galactosa, fucosa y un nivel alto de

40 ácido siálico terminal en glicoproteínas. Estos azúcares no se encuentran generalmente en glicoproteínas producidas en levaduras y hongos filamentosos y el procedimiento abordado anteriormente permite la genomanipulación de cepas que localizan glicosiltransferasa en el orgánulo deseado. La formación de la síntesis de N-glicano complejo es un proceso secuencial en el que residuos de azúcar específicos se retiran y se unen a la estructura de oligosacárido de núcleo. En eucariotas superiores, esto se logra habiendo expuesto secuenciamente el

45 sustrato a diversas enzimas de procesamiento. Estas enzimas llevan a cabo reacciones específicas dependiendo de su localización particular dentro de la totalidad de la cascada de procesamiento. Esta "línea de enamblaje" consiste en RE, aparato de Golgi temprano, medio y tardío, y la red trans del aparato de Golgi, todos con su entorno de procesamiento específico. Para recrear el procesamiento de glicoproteínas humanas en el aparato de Golgi y el RE de eucariotas inferiores tienen que expresarse numerosas enzimas (por ejemplo, glicosiltransferasas, glicosidasas,

50 fosfatasas y transportadores) y dirigirlas específicamente a estos orgánulos y, preferentemente, a una localización en la que funcionen más eficazmente con respecto a su entorno, así como a otras enzimas de la ruta.

Diversas glicosiltransferasas individuales se han clonado y expresado en S.cerevisiae (GalT, GnT I), Aspergillus nidulans (GnT I) y otros hongos, sin demostrar, no obstante, el resultado deseado de “humanización” sobre el patrón de glicosilación de los organismos (Yoshida, 1995; Schwientek, 1995; Kalsner, 1995). Se especuló que la estructura de carbohidrato requerida para aceptar azúcares mediante la acción de dichas glicosiltransferasas no estába presente en cantidades suficientes. Aunque esto contribuyó del modo más probable a la falta de formación de Nglicano complejo, no existen actualmente informes de un hongo que suministre una estructura de Man8GlcNAc2 que tenga una actividad de GnT I y que tenga una actividad de transportador de UDP-Gn genomanipulada en el hongo. Es la combinación de estos tres eventos bioquímicos lo que se requiere para la formación de N-glicano híbrido y complejo.

En seres humanos, la amplia serie de precursores de azúcar nucleotídicos (por ejemplo, UDP-N-acetilglucosamina, UDP-N-acetilgalactosamina, CMP-N-ácido acetilneuramínico, UDP-galactosa, etc.) se sintetizan generalmente en el citosol y se transportan al aparato de Golgi, en el que se unen al oligosacárido del núcleo mediante glicosiltransferasas. Para replicar este proceso en eucariotas inferiores, deben expresarse transportadores específicos nucleósidicos de azúcar en el aparato de Golgi para asegurar niveles adecuados de precursores de azúcar nucleosídicos (Sommers, 1981; Sommers, 1982; Perez, 1987). Un subproducto de esta reacción es bien un difosfato o bien monofosfato nucleosídico. Aunque los monofosfatos pueden exportarse directamente a cambio de azúcar de trifosfato nucleosídicos mediante un mecanismo antiporte, deben escindirse difosfonucleósidos (por ejemplo, GDP) mediante fosfatasas (por ejemplo, GDPasa) para proporcionar monofosfatos nucleosídicos y fosfato inorgánico antes de ser exportados. Esta reacción parece ser importante para una glicosilación eficaz, ya que se ha encontrado que la GDPasa de S.cerevisiae es necesaria para la manosilación. No obstante, la enzima solo tiene un 10 % de actividad frente a UDP (Berninsone, 1994). Los eucariotas inferiores no tienen a menudo actividad de difosfatasa específica de UDP en el aparato de Golgi, debido a que no utilizan precursores de UDP-azúcar para la síntesis de glicoproteínas en el aparato de Golgi.

Schizosaccharomyces pombe, una levadura que se ha observado que añade residuos de galactosa a polisacáridos de la pared celular (a partir de UDPgalactosa) se ha observado que tiene actividad de UDPasa específica, sugiriendo además la necesidad de una enzima de este tipo (Berninsone y col., 1994). UDP se sabe que es un inhibidor potente de glicosiltransferasas y la eliminación de este subproducto de glicosilación es importante para prevenir la inhibición de glicosiltransferasa en el lumen del aparato de Golgi (Khatara y col., 1974). Por lo tanto, se puede necesitar proporcionar para la eliminación de UDP, que se espera que se acumule en el aparato de Golgi de dichas cepas genomanipuladas (Berninsone, 1995; Beaudet, 1998).

En otro ejemplo, 2,3 sialiltransferasa y 2,6 sialiltransferasa cubren residuos de galactosa con ácido siálico en el lado trans del aparato de Golgi y TGN de humanos dando como resultado una forma madura de la glicoproteína. Para volver a realizar esta etapa de procesamiento en una levadura u hongo genomanipulado metabólicamente se requerirá (1) actividad de 2,3-sialiltransferasa y (2) un suministro suficiente de ácido CMP-N-acetilneuramínico en el aparato de Golgi tardío de la levadura. Para obtener suficiente actividad de 2,3-sialiltransferasa en el aparato de Golgi tardío, el dominio catalítico de una sialiltransferasa conocida (por ejemplo de humanos) debe dirigirse al aparato de Golgi tardío en hongos (véase anteriormente). Asimismo, los transportadores deben genomanipularse para permitir el transporte de ácido CMP-N-acetilneuramínico al aparato de Golgi tardío. Actualmente no existe ninguna indicación de qué hongos sintetizan suficientes cantidades de ácido CMP-N-acetilneuramínico, por no hablar del transportador de dicho azúcar-nucleótido al aparato de Golgi. En consecuencia, para asegurar el suministro adecuado de sustrato para las glicosiltransferasas correspondientes, se debe genomanipular metabólicamente la producción de ácido CMP-siálico en el hongo.

Procedimientos para proporcionar precursores nucleotídicos de azúcar al aparato de Golgi:

UDP-N-acetil-glucosamina

El ADNc de transportador humano de UDP-N-acetilglucosamina, que se reconoció a través de una búsqueda de homología en la base de datos de etiquetas de secuencia expresada (dbEST) se clonó por Ishida y colaboradores (Ishida, 1999). Guillen y colaboradores han clonado el transportador de membrana del aparato de Golgi de mamíferos para UDP-N-acetilglucosamina mediante corrección fenotípica con ADNc de células de riñón caninas (MDCK) de un mutante de Kluyveromyces lactis caracterizado recientemente que carecía de transporte del aparato de Golgi del azúcar nucleotídico anterior (Guillen, 1998). Estos resultados demuestran que el gen del transportador de UDP-GlcNAc del aparato de Golgi tiene toda la información necesaria para que la proteína se exprese y se dirija funcionalmente al aparato de Golgi de levadura y que dos proteínas con secuencias de aminoácidos muy diferentes puedan transportar el mismo soluto dentro de la misma membrana del aparato de Golgi (Guillen, 1998).

GDP-Fucosa

El transportador de GDP-fucosa de la membrana del aparato de Golgi de hígado de rata se ha identificado y purificado por Puglielli, L. y C. B. Hirschberg (Puglielli, 1999). El gen correspondiente no se ha identificado, pero puede usarse una secuenciación N-terminal para el diseño de sondas oligonucleótidas específicas para el gen correspondiente. Estos oligonucleótidos pueden usarse como sondas para clonar el gen que codifica el transportador de GDP-fucosa.

UDP-Galactosa

Dos genes heterólogos, gma12(+) que codifica alfa 1,2-galactosiltransferasa (alfa 1,2 GalT) de Schizosaccharomyces pombe y (hUGT2) que codifica el transportador de UDP-galactosa humana (UDP-Gal), se han expresado funcionalmente en S.cerevisiae para examinar las condiciones intracelulares requeridas para la galactosilación. La correlación entre la galactosilación de proteínas y la actividad de transporte de UDP-galactosa indicó que un suministro exógeno de transportador de UDP-Gal, en lugar de alfa 1,2 GalT, tenía un papel clave para la galactosilación eficaz en S.cerevisiae (Kainuma, 1999). Asimismo, se clonó un transportador de UDPgalactosa de

S. pombe (Aoki, 1999; Segawa, 1999).

Ácido CMP-N-acetilneuramínico (ácido CMP-siálico)

Se ha clonado el transportador de ácido CMP-siálico (hCST) y se ha expresado en células Lec 8 CHO (Aoki, 1999; Eckhardt, 1997). La expresión functional del transportador de ácido CMP-siálico murino se logró en Saccharomyces cerevisiae (Berninsone, 1997). Se ha encontrado ácido siálico en algunos hongos, pero no está claro si el sistema huésped elegido será capaz de suministrar niveles suficientes de ácido CMP-siálico. El ácido siálico puede suministrarse bien en el medio o bien, alternativamente, pueden integrarse también en el genoma huésped rutas fúngicas implicadas en la síntesis de ácido siálico.

Difosfatasas

Cuando se transfieren azúcares a una glicoproteína, se libera un difosfato o monofosfato nucleosídico de los precursores nucleotídicos del azúcar . Aunque los monofosfatos pueden exportarse directamente a cambio de azúcares trifosfato nucleosídicos mediante un mecanismo antiporte, deben escindirse difosfonucleósidos (por ejemplo, GDP) mediante fosfatasas (por ejemplo, GDPasa) para producir monofosfatos nucleosídicos y fosfato inorgánico antes de exportarse. Esta reacción parece ser importante para una glicosilación eficaz, ya que se ha encontrado que la GDPasa de S.cerevisiae es necesaria para la manosilación. No obstante, la enzima solo tiene un 10 % de actividad frente a UDP (Berninsone, 1994). Los eucariotas inferiores no tienen a menudo actividad difosfatasa específica de UDP en el aparato de Golgi, debido a que no utilizan precursores de UDP-azúcar para la síntesis de glicoproteínas en el aparato de Golgi. Schizosaccharomyces pombe, una levadura que se ha observado que añade residuos de galactosa a polisacáridos de la pared celular (a partir de UDP-galactosa), se ha observado que tiene actividad de UDPasa específica, sugiriendo además la necesidad de una enzima de este tipo (Berninsone, 1994). Se sabe que UDP es un inhibidor potente de glicosiltransferasas y la eliminación de este subproducto de glicosilación es importante para evitar la inhibición de glicosiltransferasa en el lumen del aparato de Golgi (Khatara y col., 1974).

Expresión de GnT para producir N-glicanos complejos

Expresión de GnT-III para reforzar la funcionalidad de anticuerpos

La adición de una N-acetilglucosamina a la estructura de GlcNAc1Man3GlcNAc2 por medio de Nacetilglucosaminiltransferasas II y III produce un denominado N-glicano bisecado GlcNAc3Man3GlcNAc2 (Fig. 3). La estructura se ha implicado en citotoxicidad celular dependiente de anticuerpo superior (ADCC) (Umana y col. 1999). Una nueva genomanipulación de glicoformas de inmunoglobulinas expresadas por células de mamífero es una tarea tediosa y engorrosa. Especialmente en el caso de GnTIII, en el que la sobreexpresión de esta enzima se ha implicado en la inhibición del crecimiento, se han debido emplear procedimientos que implican la expression génica regulada (inducible) para producir inmunoglobulinas con N-glicanos bisecados (Umana y col. 1999a, 1999b).

En consecuencia, en otra realización, la invención proporciona sistemas y procedimientos para producir N-glicanos de tipo humano que tienen N-acetilglucosamina bisecantes (GLcNAc) en la estructura de manosa de núcleo. En una realización preferente, la invención proporciona un sistema y procedimiento para producir inmunoglobulinas que tienen N-glicanos bisecados. Los sistemas y procedimientos descritos en el presente documento no padecen de problemas previos, por ejemplo, citotoxidad asociada con la sobreexpresión de GnTIII o ADCC, ya que las células huésped de la invención están genomanipuladas y seleccionadas para que sean viables y preferentemente células robustas que producen N-glicanos que tienen glicoformas de tipo humano modificadas sustancialmente tales como GlcNAc2Man3GlcNAc2. Por lo tanto, la adición de una N-acetilglucosamina bisecante en una célula huésped de la invención tendrá un efecto despreciable sobre el fenotipo de crecimiento o la viabilidad de esas células huésped.

Además, un trabajo previo (Umana) ha demostrado que no existe una correlación lineal entre niveles de expresión de GnTIII y el nivel de ADCC. Encontrar el nivel de expresión óptimo en células de mamífero y mantenerlo a lo largo de un proceso de fermentación aprobado de FDA parece ser un desafío. No obstante, en células de la invención, tales como células de hongos, encontrar un promotor de fuerza apropiada para establecer un nivel de expresión de GnTIII óptimo, robusto y fiable es una tarea comparativamente sencilla para un experto en la técnica.

Una célula huésped tal como una cepa de levadura capaz de producir glicoproteínas con N-glicanos bisecantes se genomanipula según la invención introduciendo en la célula huésped una actividad GnTIII (Ejemplo 6). Preferentemente, la célula huésped se transforma con un ácido nucleico que codifica GnTIII (véase, por ejemplo, la Fig. 32) o un dominio del mismo que tiene actividad enzimática, opcionalmente fusionado a un péptido director de la señal celular heterólogo (por ejemplo, usando las bibliotecas y procedimientos asociados de la invención.) Las células huésped genomanipuladas para que expresen GnTIII producirán valoraciones de anticuerpos más altos que las que son capaces de producir las células de mamífero. También producirán anticuerpos con una potencia más elevada con respecto a ADCC.

Se ha demostrado que los anticuerpos producidos por líneas celulares de mamífero transfectadas con GnTIII son tan eficaces como los anticuerpos producidos por líneas celulares no transfectadas, pero a una concentración 10-20 veces inferior (Davies y col. 2001). Un aumento de productividad del vehículo de producción de la invención sobre sistemas mamíferos por un factor de veinte y un aumento de diez veces de potencia tendrán como consecuencia una mejora de productividad neta de doscientos. La invención, por lo tanto, proporciona un sistema y procedimiento para producir valoraciones altas de un anticuerpo que tiene potencia alta (por ejemplo, hasta varios órdenes de magnitud más potente que lo que puede producirse actualmente). El sistema y procedimiento es seguro y proporciona anticuerpos de alta potencia a coste bajo en periodos de tiempo cortos. Las células huésped genomanipuladas para que expresen GnT III según la invención producen inmunoglobulinas que tienen N-glicanos bisecados a velocidades de al menos 50 mg/litro/día a al menos 500 mg/litro/día. Además, cada molécula de inmunoglobulina (Ig) (que comprende GlcNAc bisecantes) es más potente que la misma molécula de Ig producida sin GlcNAc bisecantes.

Clonación y expresión de GnT-IV y GnT-V

Todas las estructuras de ramificación en N-glicanos complejos se sintetizan en una pentasacárido de núcleo común (Man3GlcNAc2 o Man alfa1-6(Man alfa1-3)Man beta1-4 GlcNAc beta1-4 GlcNAc beta1-4 o Man3GlcNAc2) por medio de Nacetilglucosamina transferasas (GnT) I a VI (Schachter H y col. (1989) Methods Enzymo;179:351-97). El conocimiento actual de la biosíntesis de más N-glicanos altamente ramificados sugiere que después de la acción de GnTII (generación de estructuras GlcNAc2Man3GlcNAc2) GnTIV transfiere GlcNAc de UDP-GlcNAc en unión beta1,4 al brazo Man alfa1,3 Man beta1,4 de N-glicanos GlcNAc2Man3GlcNAc2 (Allen SD y col. (1984) J Biol Chem. Jun 10; 259(11):6984-90; y Gleeson PA y Schachter H.J (1983); J.Biol Chem 25;258(10):6162-73) dando como resultado una cadena de agalacto azúcar triantenaria. Este N-glicano (GlcNAc beta1-2 Man alfa1-6(GlcNAc beta1-2 Man alfa13) Man beta1-4 GlcNAc beta 1-4 GlcNAc beta1,4 Asn) es un sustrato común para GnT-III y -V, que conduce a la síntesis de estructuras triantenarias y tetraantenarias bisecadas. En las que la acción de GnTIII da como resultado un N-glicano bisecada y en las que GnTV cataliza la adición de beta 1-6GlcNAc al núcleo de alfa 1-6 manosilo, creando la rama beta 1-6. La adición de galactosa y ácido siálico a estas ramas conduce a la generación de un Nglicano complejo totalmente sialilado.

Los N-glicanos complejos ramificados se han implicado en la actividad fisiológica de proteínas terapéuticas tales como eritropoyetina humana (EPOh). Se ha demostrado que la EPO humana que tiene estructuras biantenarias tiene una actividad baja, mientras que la EPOh que tiene estructuras tetraantenarias da como resultado de una eliminación más lenta del torrente sanguíneo y, por lo tanto, una actividad más elevada (Misaizu T y col. (1995) Blood Dic 1;86(11):4097-104).

Con la información de secuencia de ADN, el experto puede clonar moléculas de ADN que codifican actividades GnT IV y/o V (Ejemplo 6; Fig. 33 y 34). Usando técnicas estándar bien conocidas por los expertos en la técnica, pueden insertarse moléculas de ácido nucleico que codifican GnT IV o V (o codifican fragmentos catalíticamente activos de los mismos) en vectores de expresión apropiados bajo el control transcripcional de promotores y otras secuencias de control de la expresión capaces de dirigir la transcripción en una célula huésped seleccionada de la invención, por ejemplo, un huésped fúngico tal como Pichia sp., Kluyveromyces sp. y Aspergillus sp., tal como se describe en el presente documento, de modo que uno o más de estas enzimas GnT de mamífero puedan expresarse activamente en una célula huésped de la elección para la producción de una glicoproteína compleja de tipo humano.

Los siguientes son ejemplos que ilustran las composiciones y procedimientos de la presente invención. Estos ejemplos no deberían tomarse como limitantes: los ejemplos están incluidos solo con fines de ilustración.

Ejemplo 1

Identificación, clonación y deleción del gen ALG3 en P.pastoris y K.lactis.

Los cebadores degenerados se generaron en base a un alineamiento de secuencias de proteína Alg3 a partir de S. cerevisiae, H. sapiens y D. melanogaster y se usaron para amplificar un producto de 83 pb a partir de ADN genómico de P. pastoris:

5’-GGTGTTTTGTTTTCTAGATCTTTGCAYTAYCARTT-3’ y

5’-AGAATTTGGTGGGTAAGAATTCCARCACCAYTCRTG-3’ El producto de PCR resultante se clonó en el vector pCR2.1 (Invitrogen, Carlsbad, CA) y el análisis de secuencias reveló homología con homólogos ALG3/RHK1/NOT56 conocidos (Genbank NC_001134.2, AF309689, NC_003424.1). Posteriormente, 1929 pb cadena arriba y 2738 pb cadena abajo del producto de PCR inicial se amplificaron a partir de una biblioteca de ADN genómico de P. pastoris (Boehm, T. Yeast 1999 May;15(7):563-72) usando los oligonucleótidos internos 5’-CCTAAGCTGGTATGCGTTCTCTTTGCCATATC-3’ y 5’-GCGGCATAAACAATAATAGATGCTATAAAG-3’ junto con T3 (5’-AATTAACCCTCACTAAAGGG-3’) y T7 (5’-GTAA TACGACTCACTATAGGGC-3’) (Integrated DNA

5 Technologies, Coralville, IA) en el esqueleto de la biblioteca que porta el plásmido lambda ZAP II (Stratagene, La Jolla, CA). Los fragmentos resultantes se clonaron en el vector pCR2.1-TOPO (Invitrogen) y se secuenciaron. A partir de esta secuencia, se identificó un ORF de 1395 pb que codifica una proteína con el 35 % de identidad y el 53 % de similitud con el gen ALG3 de S. cerevisiae (usando programas BLAST). El gen se denominó PpALG3.

La secuencia de PpALG3was se usó para crear un conjunto de cebadores para generar un constructo de deleción

10 del gen PpALG3 mediante solapamiento PCR (Davidson y col., 2002 Microbiol. 148(Pt 8):2607-15). Los cebadores siguientes se usaron para amplificar regiones 5’ y 3’ de 1 kb del ORF PpALG3 y el gen KANR, respectivamente:

RCD142 (5’-CCACATCATCCGTGCTACATATAG-3’),

RCD147 (5’-AGCCTCAGCGCCAACAAGCGATGG-3’), 15 RCD143 (5’-CTGGATAACCCTCGATACTTCGAGATCTGTTTAGCTTGCC TCGT-3’), y

Posteriormente, se usaron los cebadores RCD142 y RCD147 para sobrelapar los tres productos PCR resultantes en un único alelo de deleción de 3,6 kb alg3::KANR .

Identificación, clonación y deleción del gen ALG3 en K.lactis.

20 Las secuencias de ALG3p de S. cerevisiae, Drosophila melanogaster, Homo sapiens etc. se alinearon con secuencias de K. lactis (base de datos PENDANT EST). Las regiones de homología alta que eran homólogos comunes pero distintas en la secuencia exacta de los homólogos se usaron para crear pares de cebadores degenerados que se dirigieron directamente contra el ADN genómico de la cepa de K. lactis MG1/2 (Bianchi y col., 1987). En el caso de ALG3, la amplificación PCR con cebadores KAL-1 (5’-ATCCTTTACCGATGCTGTAT-3’) y KAL

25 2 (5’-ATAACAGTATGTGTTACACGCGTGTAG-3’) dio como resultado un producto que se clonó y se secuenció y la traducción predicha se demostró que tenía un grado alto de homología con proteínas Alg3p (>50 % con Alg3p de S. cerevisiae).

El producto PCR se usó para probar un análisis de inmunotransferencia (Southern) de la cepa de K. lactis (MG1/2) con alta exigencia (Sambrook y col., 1989). Se observó hibridazión en un patrón consecuente con un único gen. Este

30 análisis de inmunotransferencia (Southern) se usó para cartografíar los loci genómicos. Los fragmentos genómicos se clonaron digiriendo ADN genómico y ligando los fragmentos en el intervalo de tamaño apropiado en pUC19 para crear una biblioteca subgenómica de K. lactis. La biblioteca subgenómica se transformó en E. coli y se analizaron varios cientos de clones mediante PCR de colonia, usando debadores KAL-1 y KAL-2. Los clones que contenían los genes KlALG3 y KlALG61 predichos se secuenciaron y se identificaron en marcos de lectura abiertos.

35 Los cebadores para la construcción de un alelo de deleción alg3::NATR se diseñaron usando un procedimiento de solapamiento PCR (Davidson et al, 2002) y el alelo de deleción resultante se tranformó en dos cepas de K. lactis y colonias resistentes a NAT seleccionadas. Estas colonias se cribaron por PCR y se obtuvieron transformantes en los que el ORF de ALG3 se reemplazó por el alelo mutante och1::NATR .

Ejemplo 2

40 Generación de una cepa mutante de alg3/och1 que expresa una a-1,2-manosidasa, GnTI y GnTII para la producción de una glicoproteína de tipo humano.

El marco de lectura abierto de 1215 pb del gen OCH1 de P. pastoris así como 2685 pb cadena arriba y 1175 pb cadena abajo se amplificaron por PCR (B. K. Choi y col., presentado a Proc. Natl. Acad. Sci. USA 2002; véase también el documento WO 02/00879), se clonaron en el vector pCR2.1-TOPO (Invitrogen) y se denominó pBK9. Para crear una cepa sin och1 que contenía multiples marcadores auxótrofos, 100 μg de pJN329, un plásmido que contenía un alelo mutante ochl: : URA3 flanqueado con sitios de restricción SfiI se digirió con SfiI y se usó para transformer la cepa de P. pastoris JC308 (Cereghino y col. Gene 263 (2001) 159-169) por electroporación. Después de la incubación en medio definido que carecía de uracilo durante 10 días a temperatura ambiente, se escogieron 1000 colonias y se volvieron a sembrar en estrías. Los clones URA+ que eran capaces de multiplicarse a 37 °C, pero se multiplicaron a temperatura ambiente, se sometieron a PCR de colonia para probar la integración correcta del alelo mutante och1:: URA3. Un clon que mostraba el patrón de PCR esperado se denominó YJN153. El dominio Kringle 3 del plasminógeno humano (K3) se usó como proteína modelo. Un plásmido marcador NeoR que contenía el gen K3 se transformó en la cepa YJN153 y una cepa resultante, que expresa K3, se denominó BK64-1 (B. K. Choi y col., presentado a Proc. Natl. Acad. Sci. USA 2002).

El plásmido pPB103, que contenía el gen MNN2-2 de Kluyveromyces lactis, que codifica un transportador de UDPN-acetilglucosamina del aparato de Golgi se construtó clonando un fragmento romo de BglII-HindIII a partir del vector pDL02 (Abeijon y col. (1996) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 93:5963-5968) en pBLADE-SX digerido con BglII y BamHI que contenía el gen ADE1 de P. pastoris (Cereghino y col. (2001) Gene 263:159-169). Este plásmido se linearizó con EcoNI y se transformó en la cepa BK64-1 mediante electroporación y una cepa que se confirmó que contenía el MNN2-2 por análisis de PCR se denominó PBP1.

Se generó una biblioteca de constructos de manosidasa que comprendía fusiones en fase de los dominios líder de varias proteínas de membrana de tipo I o tipo II de S. cerevisiae y P. pastoris fusionadas con dominios catalíticos de varios genes de a-1,2-manosidasa de fuentes humanas, de ratón, de mosca, de lombriz y de levadura (véase, por ejemplo, el documento WO02/00879). Esta biblioteca se creó en un vector de integración HIS4 de P. pastoris y se cribó linealizando con SalI, transformando mediante electroporación en la cepa PBP1 y analizando los glicanos liberados a partir de la proteína informadora K3. Un constructo activo elegido era una quimera de los nucleótidos 988-1296 (extremo C) del gen SEC12 de levadura fusionado con una deleción N-terminal del gen de a-1,2manosidasa IA de ratón (MmMannIA), al que le faltaban los 187 nucleótidos. Una cepa de P. pastoris que expresa este constructo se denominó PBP2.

Se generó una biblioteca de constructos de GnTI, que comprendía fusiones en fase de la misma biblioteca líder con los dominios catalíticos de genes de GnTI a partir de fuentes humanas, de lombriz, de rana y de mosca (documento WO 02/00879). Esta biblioteca se creó en un vector de integración ARG4 de P. pastoris y se cribó linealizando con AatII, transformando por electroporación en la cepa PBP2 y analizando los glicanos liberados a partir de K3. Un constructo activo elegido fue una quimera de las primeras 120 pb del gen NFNN9 de S. cerevisiae fusionado a una deleción del gen de GnTI humana, al que le faltaban las primeras 154 pb. Una cepa de P. pastoris que expresa este constructo se denominó PBP3.

Posteriormente, se generó un constructo de delección de P. pastoris alg3::KANR tal como se ha descrito anteriormente. Aproximadamente 5 μg del producto PCR resultante se transformó en la cepa PBP3 y se seleccionaron colonias en medio YPD que contenía 200 μg/ml de G418. Se confirmó que una cepa de 20 cribadas por PCR contenía la integración correcta del alelo mutante alg3:: KANR y carecía de alelo de tipo silvestre. Esta cepa se denominó RDP27.

Finalmente, se generó una biblioteca de constructos de GnTII, que comprendía fusiones en fase de la biblioteca líder con los dominios catalíticos de genes de GnTII a partir de fuentes humanas y de rata (documento WO 02/00879). Esta biblioteca se creó en un vector de integración de P. pastoris que contenía el gen NSTR que confiere resistencia al fármaco noursetricina. Los plásmidos de la biblioteca se linearizaron con EcoRI, se transformaron en la cepa RDP27 por electroporación y las cepas resultantes se cribaron mediante análisis de los glicanos liberados a partir de K3 purificado.

Materiales

MOPS, cacodilato de sodio, cloruro de manganeso, UDP-galactosa y ácido CMP-N-acetilneuramínico fueron de Sigma. TFA fue de Aldrich. a2,6-Sialiltransferasa de rata recombinante de Spodoptera frugiperda y 1-1,4galactosiltransferasa de leche bovina fueron de Calbiochem. Proteína N-glicosidasa F, manosidasas y oligosacáridos fueron de Glyko (San Rafael, CA). Resina DEAE ToyoPearl fue de TosoHaas. Resina "HisBind" quelante metálica fue de Novagen (Madison, WI). Placas de eliminación de lisado de 96 pocillos fueron de Promega (Madison, WI). Placas de 96 pocillos de unión a proteínas fueron de Millipore (Bedford, MA). Sales y agentes tampón fueron de Sigma (St. Louis, MO). Matrices MALDI fueron de Aldrich (Milwaukee, WI).

Purificación de proteínas

Kringle 3 se purificó usando un formato de 96 pocillos en un robot de manejo de muestras Beckman Biomek 2000 (Beckman/Coulter Ranch Cucamonga, CA). Kringle 3 se purificó a partir de medios de expresión usando una etiqueta de hexa-histidina C-terminal. La purificación robótica fue una adaptación del protocolo proporcionado por Novagen para sus resinas HisBind. En resumen, un volumen sedimentado de 150 ul (1l) de resina se vertió en los pocillos de una placa de unión a lisado de 96 pocillos, se lavó con 3 volúmenes de agua y se cargó con 5 volúmenes de NiSO4 50 mM y se lavó con 3 volúmenes de tampón de unión (imidazol 5 mM, NaCl 0,5 M, Tris-HCl 20 mM, pH 7,9). Los medios de expresión de proteína se diluyeron 3:2, medios/PBS (PO4 60 mM, KCI 16 mM, NaCl 822 mM, pH 7,4) y se cargaron en las columnas. Después del drenaje, las columnas se lavaron con 10 volúmenes de tampón de unión y 6 volúmenes de tampón de lavado (imidazol 30 mM, NaCl 0,5 M, Tris-HCI 20 mM, pH 7,9) y la proteína se eluyó con 6 volúmenes de tampón de elución (imidazol 1 M, NaCl 0,5 M, Tris-HCI 20 mM, pH 7,9). Las glicoproteínas eluidas se evaporaron hasta sequedad mediante liofilización

Liberación de glicanos unidos a N

Los glicanos se liberaron y se separaron de las glicoproteínas mediante una modificación de un procedimiento indicado previamente (Papac y col. AJS (1998) Glycobiology 8, 445-454). Los pocillos de una placa MultiScreen IP de 96 pocillos (membrana Immobilon-P) (Millipore) se mojaron con 100 ul de metanol, se lavaron con 3 x 150 ul de agua y 50 ul de tampón RCM (urea 8 M, Tris 360 mM, EDTA 3,2 mM, pH 8,6), drenando con vacío ligero después de cada adición. Las muestras de proteína seca se disolvieron en 30 ul de tampón RCM y se transfirieron a los pocillos que contienen 10 ul de tampón RCM. Los pocillos se drenaron y se lavaron dos veces con tampón RCM. Las proteínas se redujeron mediante la adición de 601l de DDT 0,1 M en tampón RCM durante 1 h a 37 ºC. Los pocillos se lavaron tres veces con 300 ul de agua y se carboximetilaron mediante la adición de 60 ul de ácido yodoacético 0,1 M durante 30 min en la oscuridad a temperatura ambiente. Los pocillos se lavaron de nuevo tres veces con agua y las membranas se bloquearon mediante la adición de 100 ul de PVP 360 al 1% en agua durante 1 h a temperatura ambiente. Los pocillos se drenaron y se lavaron tres veces con 300 1l de agua y se desglicosilaron mediante la adición de 30 ul de NH4HCO3 10 mM, pH 8,3, que contiene una miliunidad de N-glicanasa (Glyko). Después de 16 horas a 37 ºC, la solución que contenía los glicanos se retiró mediante centrifugación y se evaporó hasta sequedad.

Espectrometría de masas de desorción/ionización por láser asistida por matriz-tiempo de vuelo

Los pesos moleculares de los glicanos se determinaron usando un espectrómetro de masa MALDI-TOF lineal Voyager DE PRO (Applied Biosciences) usando extracción retardada. Los glicanos secos de cada pocillo se disolvieron en 15 ul de agua y se aplicaron 0,5 ul en forma de punto en placas de muestra de acero inoxidable y se mezclaron con 0,5 ul de matriz S-DHB (9 mg/ml de ácido hidroxibenzoico, 1 mg/ml de ácido 5-metoxisalicílico en 1:1 de agua/acetonitrilo con TFA al 0,1 %) y se dejaron secar.

Se generaron iones mediante irradiación con un láser de nitrógeno pulsado (337 nm) con un tiempo de pulso de 4 ns. El instrumento se operó en el modo de extracción retardada con un retardo de 125 ns y un voltaje de aceleración de 20 kV. El voltaje de rejilla fue el 93,00 %, el voltaje del cable guía fue el 0,10 %, la presión interna fue menos de 5 X 10-7 torr, y la abertura de masa baja fue de 875 Da. Los espectros se generaron a partir de la suma de 100-200 pulsos de láser y se registraron con un digitalizador de 500 MHz. Se usó oligosacárido Man5 como patrón de peso molecular externo. Todos los espectros se generaron con el instrumento en el modo de ión positivo. La exactitud de masa estimada del espectro fue del 0,5 %.

Materiales:

MOPS, cacodilato de sodio, cloruro de manganeso, UDP-galactosa y ácido CMP-N-acetilneuramínico fueron de Sigma, Saint Louis, MO. Ácido trifluroacético (TFA) fue de Sigma/Aldrich, Saint Louis, MO. a2,6-Sialiltransferasa de rata recombinante de Spodoptera frugiperda y 1-1,4-galactosiltransferasa de leche bovina fueron de Calbiochem, San Diego, CA.

Digestión con -N-acetilhexosaminidasa

Los glicanos se liberaron y se separaron de las glicoproteínas mediante una modificación de un procedimiento indicado previamente (Papac, y col. A. J. S. (1998) Glycobiology 8, 445-454). Después de que las proteínas se redujeran y se carboximetilaran y las membranas se bloquearan, los pocillos se lavaron tres veces con agua. La proteína se desglicosiló mediante la adición de 30 1l de NH4HCO3 10 mM, pH 8,3 que contiene una miliunidad de Nglicanasa (Glyko, Novato, CA). Después de 16 h a 37 ºC, la solución que contenía los glicanos se retiró mediante centrifugación y se evaporó hasta sequedad. Después, los glicanos se secaron en un speed vac SC210A (Thermo Savant, Halbrook, NY). Los glicanos secos se dispusieron en NH4Ac 50 mM pH 5,0 a 37 ºC durante una noche y se añadió 1 mU de hexos (Glyko, Novato, CA).

Reacción con galactosiltransferasa

Aproximadamente 2 mg de proteína (r-K3:hPg [PBP6-5]) se purificaron mediante cromatografía de afinidad con níquel, se dializaron extensamente contraTFA al 0,1 % y se liofilizaron hasta sequedad. La proteína se volvió a disolver en 150 μl de MOPS 50 mM, MnCl2 20 mM, pH 7,4. Después de la adición de 32,5 μg (533 nmol) de UDPgalactosa y 4 mU de 1-1,4-galactosiltransferasa, la muestra se incubó a 37 °C durante 18 horas. Después las muestras se dializaron contra TFA al 0,1 % para el análisis por espectrometría de masas MALDI-TOF.

El espectro de la proteína reaccionada con galactosiltransferasa mostró un aumento de masa consecuente con la adición de dos restos de galactosa en comparación con el espectro de una muestra de proteína similar incubada sin enzima. A continuación, las muestras de proteína se redujeron, se carboximetilaron y desglicosilaron con PNGasa F. Los N-glicanos recuperados se analizaron mediante espectrometría de masas MALDI-TOF. La masa del glicano predominante a partir de la proteína reaccionada con galactosiltransferasa fue superior que la del glicano de control en una masa consecuente con la adición de dos restos de galactosa (325,4 Da).

Reacción con sialiltransferasa

Después de resuspender las proteínas (reaccionadas con galactosiltransferasa) en 10 μl de tampón de cacodilato de sodio 50 mM, pH 6,0, se añadieron 300 μg (488 nmol) de ácido CMP-N-acetilneuramínico (CMP-NANA) disuelto en 15 μl del mismo tampón y 5 μl (2 mU) de a-2,6 sialiltransferasa recombinante. Después de la incubación a 37 °C durante 15 horas, se añadieron 200 μg de CMP-NANA y 1mU de sialiltransferasa adicionales. Las muestras de proteína se incubaron durante 8 horas adicionales y después se dializaron y se analizaron mediante espectrometría de masas MALDI-TOF como anteriormente.

El espectro de la glicoproteína reaccionada con sialiltransferasa mostró un aumento de masa en comparación con la del material de partida (la proteína después de la reacción con galactosiltransferasa). Los N-glicanos se liberaron y se analizaron como anteriormente. El aumento de masa de los dos aductos iónicos del glicano predominante fueron consecuentes con la adición de dos residuos de ácido siálico (580 y 583 Da).

Ejemplo 3

Identificación, clonación y deleción de los genes ALG9 y ALG12 en P.pastoris.

De forma similar al Ejemplo 1, las secuencias de ALG9p y ALG12, respectivamente de S. cerevisiae, Drosophila melanogaster, Homo sapiens, etc., se alinearon y las regiones con homología alta se usaron para diseñar cebadores degenerados. Estos cebadores se usaron en una reacción PCR sobre ADN genómico de P. pastoris. El producto de PCR inicial resultante se subclonó, se secuenció y se usó para probar un análisis de inmunotransferencia (Southern) de ADN genómico de P. pastoris con alta exigencia (Sambrook y col., 1989). Se observa hibridación. Este análisis de inmunotransferencia (Southern) se usó para cartografíar los loci genómicos. Los fragmentos genómicos se clonaron digiriendo ADN genómico y ligando los fragmentos en el intervalo de tamaño apropiado en pUC19 para crear una biblioteca subgenómica de P. pastoris. Esta biblioteca subgenómica se transformó en E. coli y se analizaron varios cientos de clones mediante PCR de colonia usando cebadores diseñados en base a la secuencia del producto de PCR inicial. Los clones que contenían los genes predichos se secuenciaron y se identificaron en marcos de lectura abiertos. Se diseñaron cebadores para la construcción de un alelo de deleción alg9::NATR usando un procedimiento de sobrelapado de PCR (Davidson y col., 2002). El alelo de deleción resultante se transformó en dos cepas de P.pastoris y se seleccionaron colonias resistentes a NAT. Estas colonias se cribaron por PCR y se obtuvieron transformantes en los que el ORF de ALG9 se reemplazó por el alelo mutante och1::NATR. Véase, en general, Cipollo y col. Glycobiology 2002 (12)11:749-762; Chantret y col. J. Biol. Chem. Jul. 12, 2002 (277)28:2581525822; Cipollo y col. J. Biol. Chem. Feb. 11, 2000 (275)6:4267-4277; Burda y col. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. julio 1996 (93):7160-7165; Karaoglu y col. Biochemistry 2001, 40, 12193-12206; Grimme y col. J. Biol. Chem. 20 de julio, 2001 (276)29:27731-27739; Verostek y col. J. Biol. Chem. 5 de junio, 1993 (268)16:12095-12103; Huffaker y col. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. Dic. 1983 (80):7466-7470.

Ejemplo 4

Identificación, clonación y expresión de alfa 1,2-3 manosidasa de Xanthomonas Manihotis

La alfa 1,2-3 manosidasa de Xanthomonas Manihotis tiene dos actividades: una alfa-1,2 y una alfa-1,3 manosidasa. Los procedimientos de la invención también pueden usar dos manosidasas independientes que tengan estas actividades, que pueden identificarse de forma similar y clonarse a partir de un organismo de interés seleccionado.

Tal como se ha descrito por Landry y col., las alfa-manosidasas pueden purificarse a partir de Xanthomonas sp., tales como Xanthomonas manilaotis. X. manihotis puede adquirirse de la Colección Estadounidense de Cultivos Tipo (ATCC, número de catálogo 49764) (Xanthomonas axonopodis Starr y Garces pathovar manihotis depositadas como Xanlthomonas manihotis (Arthaud- Berthet) Starr). Las enzimas se purifican a partir de extractos celulares brutos tal como se ha descrito previamente (Wong-Madden, S.T. y Landry, D. (1995) Purification and characterization of novel glycosidases from the bacterial genus Xanthomonas; y Landry, D. patente de Estados Unidos Nº US 6.300.113 B1 Isolation and composition of novel Glycosidases). Después de la purificación de la manosidasa, se usa uno de varios procedimientos para obtener etiquetas de secuencias peptídicas (véase, por ejemplo, W. Quadroni M y col. (2000). A method for the chemical generation of N-terminal peptide sequence tags for rapid protein identification. Anal Chem (2000) Mar 1; 72(5):1006-14; Wilkins MR y col. Rapid protein identification using N-terminal "sequence tag" and amino acid analysis. Biochem Biophys Res Commun. (1996) 25 de abril; 221(3):609-13; y Tsugita A. (1987) Developments in protein microsequencing. Adv Biophys (1987) 23:81-113).

Las etiquetas de secuencia generadas usando un procedimiento anteriores se usan después para generar conjuntos de cebadores degenerados usando procedimientos bien conocidos por el experto. Los cebadores degenerados se usan para cebar la amplificación de ADN en reacciones en cadena de la polimerasa (por ejemplo, usando kits de Taq polimerasa según las instrucciones del fabricante) para amplificar fragmentos de ADN. Los fragmentos de ADN amplificados se usan como sondas para aislar moléculas de ADN que comprenden el gen que codifica una manosidasa deseada, por ejemplo, usando técnicas de hibridación de ADN de Southern estándar para identificar y aislar trozos genómicos (clon) que codifican la enzima de interés. Las moléculas de AND genómico se secuencian y se identifican marcos de lectura abiertos y secuencias codificantes. Un constructo de expresión adecuado que codifica la glicosidasa de interés puede generarse después usando procedimientos descritos en el presente documento bien conocidos en la técnica.

Los fragmentos de ácido nucleico que comprenden secuencias que codifican la actividad 1,2-3 manosidasa (o fragmentos catalíticamente activos de la misma) se clonan en vectores de expresión apropiados para la expresión, y preferentemente la expresión dirigida, de estas actividades en una célula huésped apropiada según los procedimientos establecidos en el presente documento.

Ejemplo 5

Identificación, clonación y deleción del gen ALG6 en P. pastoris.

De forma similar al Ejemplo 1, las secuencias de ALG6p de S. cerevisiae, Drosophila melanogaster, Homo sapiens, etc., se alinean y las regiones con homología alta se usan para diseñar cebadores degenerados. Estos cebadores se usan en una reacción PCR sobre ADN genómico de P. pastoris. El producto de PCR inicial resultante se subclona, se secuencia y se usa para probar un análisis de inmunotransferencia (Southern) de ADN genómico de P. pastoris con alta exigencia (Sambrook y col., 1989). Se observa hibridación. Este análisis de inmunotransferencia (Southern) se usa para cartografíar los loci genómicos. Los fragmentos genómicos se clonan digiriendo ADN genómico y ligando esos fragmentos en el intervalo de tamaño apropiado en pUC19 para crear una biblioteca subgenómica de

P. pastoris. Esta biblioteca subgenómica se transforma en E. coli y se analizan varios cientos de clones mediante PCR de colonia usando cebadores diseñados en base a la secuencia del producto de PCR inicial. Los clones que contienen los genes predichos se secuencian y se identifican en marcos de lectura abiertos. Los cebadores para la construcción de un alelo de deleción alg6::NATR se diseñan usando un procedimiento de solapamiento PCR (Davidson et al, 2002) y el alelo de deleción resultante se tranforma en dos cepas de K. lactis y colonias resistentes a NAT seleccionadas. Estas colonias se criban por PCR y se obtienen transformantes en los que el ORF de ALG9 está reemplazado por el alelo mutante och1::NATR. Véase, por ejemplo, Imbach y col. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. Junio 1999 (96)6982-6987.

Los fragmentos de ácido nucleico que comprenden secuencias que codifican Alg6p (o fragmentos catalíticamente activos de la misma) se clonan en vectores de expresión apropiados para la expresión, y preferentemente la expresión dirigida, de estas actividades en una célula huésped apropiada según los procedimientos establecidos en el presente documento. El gen ALG6 clonado puede llevarse bajo el control de cualquier promotor adecuado para lograr la sobreexpresión. Incluso es posible la expresión del gen bajo el control de su propio promotor. La expresión de plásmidos multicopia generará niveles de expresión altos (“sobreexpresión").

Ejemplo 6

Clonación y expresión de GnT III para producir GlcNAc bisecantes que refuerzan la funcionalidad de anticuerpos A. Antecedentes

La adición de una N-acetilglucosamina a la estructura de GlcNAc2Man3GlcNAc2 por medio de Nacetilglucosaminiltransferasa III produce un denominado N-glicano bisecado (véase la Figura 3). Esta estructura se ha implicado en citotoxicidad celular dependiente de anticuerpo superior (ADCC) (Umana y col. 1999).

Una célula huésped tal como una cepa de levadura capaz de producir glicoproteínas con N-glicanos bisecantes se genomanipula según la invención introduciendo en la célula huésped una actividad GnTIII. Preferentemente, la célula huésped se transforma con un ácido nucleico que codifica GnTIII (por ejemplo, un mamífero tal como el GnT III mostrado en la Fig. 32) o un dominio del mismo que tiene actividad enzimática, opcionalmente fusionado a un péptido director de la señal celular heterólogo (por ejemplo, usando las bibliotecas y procedimientos asociados de la invención.)

Las IgG constan de dos cadenas pesadas (VH, CH1, CH2 y CH3 en la Figura 30), interconectadas en la region bisagra a través de tres puentes disulfuro, y dos cadenas ligeras (VL, CL en la Figura 30). Las cadenas ligeras (dominios VL y CL) están unidas mediante otro puente disulfuro a la porción CH1 de la cadena pesada y junto con el fragmento CH1 y VH forman la denominada región Fab. Los antígenos se unen a la porción terminal de la región Fab. La Fc región de IgG consta de la región CH3, la región CH2 y la región bisagra y es responsable de ejercer las denominadas funciones efectoras (véase más adelante).

La función primaria del anticuerpo es unirse al antígeno. No obstante, a menos que la unión al antígeno inactivo directamente al antígeno (como en el caso de toxinas bacterianas), la mera unión no tiene sentido a menos que se desencadenen las funciones efectoras. Los anticuerpos de la subclase de las IgG ejercen dos funciones efectoras principales: la activación del sistema de complemento y la inducción de fagositosis. El sistema de complemento consta de un grupo complejo de proteínas de suero implicadas en controlar eventos inflamatorios, en la activación de fagocitos y en la destrucción lítica de membranas celulares. La activación del complemento comienza con la unión del complejo C1 a la porción Fc de dos IgG en una proximidad cercana. C1 consta de una molécula, C1q, y dos moléculas, C1r y C1s. La fagocitosis se inicia mediante una interacción entre los fragmentos Fc de IgG y Fcgamma-receptores (FeyRI, II y III en la Figura 30). Los receptores Fc se expresan principalmente en la superficie de células efectoras del sistema inmunitario, en particular macrófagos, monocitos, células mieloides y células dendríticas.

La porción CH2 alberga un sitio de N-glicosilación conservado en asparagina 297 (Asp297). Los N-glicanos con Asp297 son muy heterogeneous y se sabe que influyen en la unión del receptor Fc y la activación del complemento. Solo una minoría (es decir, aproximadamente el 15-20 %) de las IgG porta un N-glicano disialilado, y el 3-10 % tienen un N-glicano monosialilado (revisado en Jefferis, R., Glycosylation of human IgG Antibodies. BioPharm, 2001). De forma interesante, la estructura de N-glicano minima que se demostró que era necesaria para anticuerpos funcionales completos capaces de activación de complemento y unión al receptor Fc es un pentasacárido con residuos de N-acetilglucosaminasa terminales (GlcNAc2Man3) (revisado en Jefferis, R., Glycosylation of human IgG Antibodies. BioPharm, 2001). Los anticuerpos con menos de un N-glicano GlcNAc2Man3 o ninguna N-glicosilación en Asp297 pueden ser todavía capaces de unirse a un antígeno pero, más probablemente, no activarán los eventes cadena abajo cruciales tales como fagocitosis y activación de complemento. Además, los anticuerpos con N-glicanos de tipo fúngico unidos a Asp297 exigirán, con toda probabilidad, una respuesta inmunitaria en un organismo mamífero que hará ese anticuerpo inútil como glicoproteína terapéutica.

B. Clonación y expresión de GnTIII

El fragmento de ADN que codifica parte de la proteína GnTIII de ratón que carece del dominio TM se amplifica por PCR a partir de ADN genómico murino (o de otro mamífero) usando cebadores directos 5’-TCCTGGCGCGCCTTCCCGAGAGAACTGGCCTCCCTC-3’ e inversos 5’-AATTAATTAACCCTAGCCCTCCGCTGTATCCAACTTG-3’. Esos cebadores incluyen sitios de restricción AscI y PacI que se usarán para la clonación en el vector adecuado para la fusión con la biblioteca líder.

La secuencia de ácido nucleico y de aminoácidos de GnTIII murino se muestra en la Fig. 32.

C. Clonación de secuencias que codifican inmunoglobulinas

Previamente se han publicado protocolos para la clonación de las regiones variables de anticuerpos, incluyendo secuencias de cebadores. Las fuentes de anticuerpos y genes codificantes pueden ser, entre otras, linfocitos B humanos inmunizados in vitro (véase, por ejemplo, Borreback y col. (1988) Proc. Natl. Acad Sci. USA. 85:39953999), linfocitos de sangre periférica o linfocitos B humanos individuales (véase, por ejemplo, Lagerkvist y col (1995) Biotechniques 18:862-869 y Terness y col (1997) Hum Iminunol 56:17-27) y ratones transgénicos que contienen loci de inmunoglobulinas humanas que permiten la creación de líneas celulares de hibridoma.

Usando técnicas de ADN recombinante convencionales, pueden clonarse secuencias de ácido nucleico que codifican anticuerpos. Las fuentes para la información genética que codifican inmunoglobulinas de interés típicamente son preparaciones de ARN total de células de interés, tales como linfocitos sanguíneos o líneas celulares de hibridoma. Por ejemplo, empleando un protocolo basado en PCR con cebadores específicos, pueden clonarse regiones variables mediante transcripción inversa iniciada a partir de un cebador específico de secuencia que híbrida con el sitio del dominio CH1 de IgG y un segundo cebador que codifica los aminoácidos 111-118 de la región constante kappa murina. Los ADNc que codifican VH y VK pueden amplificarse después tal como se ha publicado previamente (véase, por ejemplo, Graziano, R.F. y col. (1995) J Immunol. 155(10): p. 4996-5002; Welschof, M. y col. (1995) J. Immunol. Methods 179, 203-214; y Orlandi, R. y col. (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA

86: 3833). También se han publicado procedimientos de clonación para inmunoglobulinas enteras (cadenas pesada y ligera) (véase, por ejemplo, Buckel, P. y col. (1987) Gene 51:13-19; Recinos A 3º y col. (1994) Gene 149: 385-386; (1995) Gene 9 de junio;158(2):311-2; y Recinos A 3º y col. (1994) Gene Nov 18;149(2):385-6) . Se han descrito protocolos adicionales para la clonación y generación de fragmentos de anticuerpo y constructos de expresión de anticuerpos en Antibody Engineering, R. Kontermann y S. Dübel (2001), Editores, Springer Verlag. Berlín Heidelberg Nueva York.

Se han descrito plásmidos de expresión fúngica que codifican la cadena pesada y la ligera de inmunoglobulinas (véase, por ejemplo, Abdel-Salam, H.A. y col. (2001) Appl. Microbiol. Biotechnol. 56: 157-164; y Ogunjimi, A.A. y col. (1999) Biotechnology Letters 21: 561-567). De esta manera, se pueden generar plásmidos de expresión que albergan las regiones constantes de inmunoglobulinas. Para facilitar la clonación de regiones variables en estos vectores de expresión, pueden disponerse sitios de restricción adecuados en la proximidad inmediata de los extremos de las regiones variables. Las regiones constantes pueden construirse de tal forma que las regiones variables puedan fusionarse fácilmente en fase con las mismas mediante un simple experimento de digestión de restricción/ligamiento. La Figura 31 muestra una visión general esquemática de dicho constructo de expresión, diseñado de una forma muy modular, que permite un fácil intercambio de promotores, terminadores de la transcripción, dominios de dirección de integración e incluso marcadores de selección.

Tal como se muestra en la Figura 31, los dominios VL así como los dominios VH elegidos pueden clonarse fácilmente en fase con regiones CL y CH, respectivamente. La integración inicial se dirige al locus AOX de P. pastoris (o un locus homólogo en otra célula fúngica) y el promotor AOX inducible por metanol dirigirá la expresión. Como alternativa, puede usarse cualquier otro casete de promotor constitutivo o inducible deseado. De esta manera, si se desea, las regiones 5'AOX y 3'AOX así como fragmentos terminadores de la transcripción (TT) pueden reemplazarse fácilmente por diferentes TT, promotores y dominios de dirección de integración para optimizar la expresión. Inicialmente, se emplea la señal de secreción del factor alfa con el sitio de proteasa KEX estándar para facilitar la secreción de cadenas pesada y ligera. Las propiedades del vector de expresión pueden refinarse adicionalmente usando técnicas convencionales.

An Ig expression vector such as the one described above is introduced into a host cell of the invention that expresses GnTIII, preferably in the Golgi apparatus of the host cell. The Ig molecules expressed in such a host cell comprise Nglycans having bisecting GlcNAcs.

Un vector de expresión de Ig tal como el descrito anteriormente se introduce en una célula huésped de la invención que expresa GnTIII, preferentemente en el aparato de Golgi de la célula huésped. Las moléculas de Ig expresadas en dicha célula huésped comprenden N-glicanos que tienen GlcNAc de bisección.

Ejemplo 7

Clonación y expresión de GnT-IV (UDP-GlcNAc:alfa-1,3-D-manosidasa beta-1,4-Nacetilglucosaminiltransferasa IV) y GnT-V (beta 1-6-N-acetilglucosaminiltransferasa)

Los ADNc que codifican GnTIV se aislaron a partir de células bovinas y humanas (Minowa,M.T. y col. (1998) J. Biol. Chem. 273 (19), 11556-11562; y Yoshida,A. y col. (1999) Glycobiology 9 (3), 303-310. Los fragmentos de ADN que codifican la longitud completa y una pare de la proteína GnT-IV humana (Figura 33) que carece de dominio TM se amplifican por PCR a partir de una biblioteca de ADNc usando debadores directos 5’-AATGAGATGAGGCTCCGCAATGGAACTG-3’, 5’-CTGATTGCTTATCAACGAGAATTCCTTG-3’ e inversos 5’-TGTTGGTTTCTCAGATGATCAGTTGGTG-3’, respectivamente. Los productos de PCR resultantes se clonan y se secuencian.

De forma similar, los genes que codifican la proteína GnT-V se han aislado a partir de varias especies de mamíferos, incluido ratón. [Véase, por ejemplo, Alverez, K. y col. Glycobiology 12 (7), 389-394 (2002)). Los fragmentos de ADN que codifican la longitud completa y una pare de la proteína GnT-V de ratón (Figura 34) que carece de dominio TM se amplifican por PCR a partir de una biblioteca de ADNc usando debadores 5’-AATGAGATGAGGCTCCGCAATGGAACTG-3’, 5’-CTGATTGCTTATCAACGAGAATTCCTTG-3’ directos y 5’-TGTTGGTTTCTCAGATGATCAGTTGGTG-3’ inverso, respectivamente. Los productos de PCR resultantes se clonan y se secuencian.

Los fragmentos de ácido nucleico que comprenden secuencias que codifican GnT IV o V (o fragmentos catalíticamente activos del mismo) se clonan en vectores de expresión apropiados para la expresión, y preferentemente la expresión dirigida, de estas actividades en una célula huésped apropiada según los procedimientos establecidos en el presente documento.

Referencias

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Claims (35)

1. REIVINDICACIONES

   1. Un procedimiento para producir una glicoproteína que comprende la expresión de un ácido nucleico que codifica la glicoproteína en una célula huésped eucariótica inferior que tiene actividad disminuida o agotada de una o más enzimas seleccionadas de entre:

   (a)

   dolicil-P-Man:Man5GlcNAc2-PP-dolicil alfa-1,3 manosiltransferasa (alg3);

   (b)

   dolicil-P-Man:Man6GlcNAc2-PP-dolicil alfa-1,2 manosiltransferasa (alg9); o

   (c)

   dolicil-P-Man:Man7GlcNAc2-PP-dolicil alfa-1,6 manosiltransferasa (alg12); expresando además dicha célula huésped:

   (I)

   un dominio catalítico de a-1,2-manosidasa fusionado a un péptido dirigido que se dirige al retículo endoplásmico (RE) o aparato de Golgi en la célula huésped; y

   (II)

   un dominio catalítico de GlcNAc transferasa I (GnT I) fusionado a un péptido dirigido que se dirige al retículo endoplásmico (RE) o aparato de Golgi en la célula huésped;

   para producir una glicoproteína que tiene estructuras de núcleo GlcNAcMan4GlcNAc2 o GlcNAcMan3GlcNAc2.

2. 2.

   El procedimiento de la reivindicación 1, en el que la célula huésped incluye además una molécula de ácido nucleico que codifica una manosidasa con actividad a-1,3-manosidasa y el procedimiento da como resultado la producción dentro de la célula huésped de glicoproteínas recombinantes que tienen N-glicanos unidos a las mismas que comprenden estructuras de núcleo GlcNAcMan3GlcNAc2.

3. 3.

   El procedimiento de la reivindicación 2, en el que la manosidasa es manosidasa II.

4. 4.

   El procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en el que la célula huésped incluye además una molécula de ácido nucleico que codifica una actividad GnT II y el procedimiento da como resultado la producción dentro de la célula huésped de glicoproteínas recombinantes que tienen N-glicanos unidos a las mismas que comprenden estructuras de núcleo de carbohidrato GlcNAc2Man3GlcNAc2.

5. 5.

   El procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en el que la célula huésped incluye además uno

   o varios ácidos nucleicos que codifican una o más actividades de enzima seleccionadas del grupo que consiste en galactosiltransferasa, sialiltransferasa, fucosiltransferasa y GlcNAc transferasa III, IV, V y VI.

6. 6.

   El procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en el que la actividad enzimática disminuida o agotada de una o varias enzimas seleccionadas entre alg3, alg9 o alg12 está disminuida o agotada mediante la mutación del gen o los genes de la célula huésped que codifican dichas actividades enzímaticas.

7. 7.

   El procedimiento de la reivindicación 6, en el que la mutación es una deleción parcial o total del gen o los genes de la célula huésped que codifican las actividades enzimáticas.

8. 8.

   El procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, en el que la glicoproteína comprende uno o más azúcares seleccionados del grupo que consiste en galactosa, GlcNAc, ácido siálico y fucosa.

9. 9.

   El procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, en el que la glicoproteína comprende al menos una rama de oligosacárido que comprende la estructura NeuNAc-Gal-GlcNAc-Man.

10. 10.

    El procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, en el que la célula huésped está seleccionada del grupo que consiste en Pichia pastoris, Pichia finlandica, Pichia trehalophila, Pichia koclamae, Pichia membranaefaciens, Pichia opuntiae, Pichia thermotolerans, Pichia salictaria, Pichia guercuum, Pichia pijperi, Pichia stiptis, Pichia methanolica, Pichia sp., Saccharomyces cerevisiae, Saccharomyces sp., Hansenula polymorpha, Kluyveromyces sp., Candida albicans, Aspergillus nidulans, Aspergillus niger, Aspergillus oryzae, Trichoderma reesei, Chrysosporium lucknowense, Fusarium sp., Fusarium gramineum, Fusarium venenatum y Neurospora crassa.

11. 11.

    El procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10, en el que la célula huésped es además deficiente en la expresión de la iniciación de la actividad 1-6-manosiltransferasa.

12. 12.

    El procedimiento de la reivindicación 11, en el que la célula huésped es un mutante OCH1 de Pichia pastoris.

13. 13.

    El procedimiento de la reivindicación 1 a 12, en el que la célula huésped incluye además una o varias moléculas de ácido nucleico que codifican uno o varios transportadores de azúcar seleccionados entre transportador de UDP-GlcNAc, transportador de UDP-galactosa, transportador de GDP-fucosa o transportador de CMP-ácido siálico.

14. 14.

    El procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 13, en el que la célula huésped incluye una molécula de ácido nucleico que codifica una actividad de difosfatasa específica de UDP o GDP.

15. 15.

    El procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 14, que además comprende la etapa de aislar la glicoproteína a partir del huésped.

16. 16.

    El procedimiento de la reivindicación 15, que además comprende la etapa de someter la glicoproteína aislada a al menos una reacción de glicosilación posterior in vitro, posteriormente a su aislamiento del huésped.

17. 17.

    El procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 16, en el que la actividad de a-1,2-manosidasa está derivada de ratón, ser humano, Lepidoptera, Aspergillus nidulans, C. elegans, D. melanogaster o Bacillus sp.

18. 18.

    Una molécula de ácido nucleico que comprende, o consiste en, al menos cuarenta y cinco residuos de nucleótido consecutivos del gen ALG 3 de P. pastoris tal como se expone en la Fig. 6.

19. 19.

    Un vector que comprende una mnolécula de ácido nucleico de la reivindicación 18.

20. 20.

    Una célula huésped que comprende una molécula de ácido nucleico de la reivindicación 18 o un vector de la reivindicación 19.

21. 21.

    Una célula huésped de P. pastoris en la que las secuencias del gen ALG3 de P. pastoris tal como se expone en la Fig. 6 están mutadas para agotar o disminuir la actividad de dolicil-P-Man: Man5GlcNAc2PP-dolicil alfa-1,3 manosiltransferasa

22. 22.

    Una célula huésped eucariota inferior que tiene actividad disminuida o agotada de una o varias enzimas seleccionadas entre:

    (a)

    dolicil-P-Man:Man5GlcNAc2-PP-dolicil alfa-1,3 manosiltransferasa (alg3);

    (b)

    dolicil-P-Man:Man6GlcNAc2-PP-dolicil alfa-1,2 manosiltransferasa (alg9); o

    (c)

    dolicil-P-Man:Man7GlcNAc2-PP-dolicil alfa-1,6 manosiltransferasa (alg12); comprendiendo además dicha célula huésped una o varias moléculas de ácido nucleico que codifican:

    (I)

    un dominio catalítico de a-1,2-manosidasa fusionado a un péptido dirigido que se dirige al retículo endoplásmico (RE) o aparato de Golgi en la célula huésped;

    (II)

    un dominio catalítico de GlcNAc transferasa I (GnT I) fusionado a un péptido dirigido que se dirige al retículo endoplásmico (RE) o aparato de Golgi en la célula huésped; y

    (III) una glicoproteína recombinante

23. 23.

    La célula huésped de la reivindicación 22, en la que la célula huésped incluye además una molécula de ácido nucleico que codifica una manosidasa con actividad a-1,3-manosidasa y es capaz de producir glicoproteínas recombinantes que tienen N-glicanos unidos a las mismas que comprenden estructuras de núcleo GlcNAcMan3GlcNAc2.

24. 24.

    La célula huésped de la reivindicación 23, en la que la manosidasa es manosidasa II.

25. 25.

    La célula huésped de las reivindicaciones 22 a 24, en la que la célula huésped incluye además una molécula de ácido nucleico que codifica una actividad GnT II y es capaz de producir glicoproteínas recombinantes que tienen Nglicanos unidos a las mismas que comprenden estructuras de núcleo GlcNAc2Man3GlcNAc2.

26. 26.

    La célula huésped de una cualquiera de las reivindicaciones 22 a 25, en la que la célula huésped incluye ademas uno o varios ácidos nucleicos que codifican una o más actividades de enzima seleccionadas del grupo que consiste en galactosiltransferasa, sialiltransferasa, fucosiltransferasa y GlcNAc transferasa III, IV, V y VI.

27. 27.

    La célula huésped de una cualquiera de las reivindicaciones 22 a 26, en la que la actividad enzimática disminuida o agotada de una o más enzimas seleccionadas entre alg3, alg9 o alg12 está disminuida o agotada por medio de la mutación del gen o los genes de la célula huésped que codifican dichas actividades enzímaticas.

28. 28.

    La célula huésped de la reivindicación 27, en la que la mutación es una deleción parcial o total del gen o los genes de la célula huésped que codifican las actividades enzimáticas.

29. 29.

    La célula huésped de una cualquiera de las reivindicaciones 22 a 28, en la que la célula huésped es capaz de producir una glicoproteína que comprende uno o varios azúcares seleccionados del grupo que consiste en galactosa, GlcNAc, ácido siálico y fucosa.

30. 30.

    La célula huésped de una cualquiera de las reivindicaciones 22 a 29, en la que la célula huésped es capaz de producir una glicoproteína que comprende al menos una rama de oligosacárido que comprende la estructura NeuNAc-Gal-GlcNAc-Man.

31. 31.

    La célula huésped de una cualquiera de las reivindicaciones 22 a 30, en la que la célula huésped está

    seleccionada del grupo que consiste en Pichia pastoris, Pichia finlandica, Pichia trehalophila, Pichia koclamae, Pichia membranaefaciens, Pichia opuntiae, Pichia thermotolerans, Pichia salictaria, Pichia guercuum, Pichia pijperi, Pichia stiptis, Pichia methanolica, Pichia sp., Saccharomyces cerevisiae, Saccharomyces sp., Hansenula polymorpha, Kluyveromyces sp., Candida albicans, Aspergillus nidulans, Aspergillus niger, Aspergillus oryzae,

    5 Trichoderma reesei, Chrysosporium lucknowense, Fusarium sp., Fusarium gramineum, Fusarium venenatum y Neurospora crassa.

32. 32.

    La célula huésped de una cualquiera de las reivindicaciones 22 a 31, en la que la célula huésped, además, es deficiente en la iniciación de la actividad de 1,6-manosiltransferasa.

33. 33.

    La célula huésped de la reivindicación 32, en la que la célula huésped es un mutante OCH1 de P. pastoris.

    10 34. La célula huésped de una cualquiera de las reivindicaciones 22 a 33, en la que la célula huésped incluye además una o más moléculas de ácido nucleico que codifican uno o más transportadores de azúcar seleccionados entre transportador de UDP-GlcNAc, transportador de UDP-galactosa, transportador de GDP-fucosa o transportador de CMP-ácido siálico.
34. 35. La célula huésped de una cualquiera de las reivindicaciones 22 a 34, en la que la célula huésped incluye además 15 una molécula de ácido nucleico que codifica una actividad difosfatasa específica de UDP o GDP.
35. 36. La célula huésped de una cualquiera de las reivindicaciones 22 a 35, en la que la actividad de a-1,2-manosidasa está derivada de ratón, ser humano, Lepidoptera, Aspergillus nidulans, C. elegans, D. melanogaster o Bacillus sp.