BR112012003983A2 - Molecula de ligação abm moleculas de ligação de antigenos abm variante polipeptideo isolado molecula de ligação de antigeneos humanizada anticorpo polinucleotideo isolado composição vetor celula hospedeira metodo de produção de abm metodo de indução da lise celular de tumor, metodo de diagnostico de doença em pacientes que possuem um cancer metodo de aumento de tempo de sobrevivencia em pacientes que possuem um cancer metodo de indução em pacientes de regressão de um motor uso abm e invenção - Google Patents

Abstract

molécula de ligação de antígeno (abm), anticorpo anti-cea, anticorpo que se liga especificamente a cea, polinucleotídeo, vetor, micro-organismo transgênico, método de produção de uma abm, composição, método para diagnóstico in vitro de doença, uso de abm, uso do anticorpo e uso da composição a presente invenção refere-se a moléculas de ligação de antígenos (abms). em realizações específicas, a presente invenção refere-se a anticorpos monoclonais recombinantes, incluindo anticorpos quiméricos, primatizados, humanizados ou suas variantes específicas para cea humano ligado à membrana ou superfície celular. além disso, a presente invenção refere-se a moléculas de ácidos nucleicos que codificam essas abms e vetores e células hospedeiras que compreendem essas moléculas de ácido nucleico. a presente invenção refere-se ainda a métodos de produção das abms conforme definido na presente invenção e a métodos de uso dessas abms no tratamento de doenças. além disso, a presente invenção refere-se a abms com glicosilação modificada que possuem propriedades terapêuticas aprimoradas, incluindo anticorpos com aumento da ligação de receptor fc e aumento da função efetora.

Description

"MOLÉCULA DE LIGAÇÃO DE ANTÍGENO (ABM), ANTICORPO ANTI-CEA, ANTICORPO QUE SE LIGA ESPECIFICAMENTE A CEA, POLINUCLEOTÍDEO, VETOR, MICRO-ORGANISMO TRANSGÊNICO, MÉTODO DE PRODUÇÃO DE UMA ABM, COMPOSIÇÃO, MÉTODO PARA 5 DIAGNÓSTICO IN V/TRO DE DOENÇA, USO DE ABM, USO DO ANTICORPO E USO DA COMPOSIÇÃO"

ANTECEDENTES DA INVENÇÃO

CAMPO DA INVENÇÃO A presente invenção refere-se a moléculas de ligação de antígenos (ABMs). Em realizações específicas, a presente invenção refere-se a anticorpos monoclonais recombinantes, incluindo anticorpos quiméricos, primatizados ou humanizados específicos para antígeno carcinoembriônico (CEA) humano. Além disso, a presente invenção refere-se a moléculas de ácido nucleico que codificam essas ABMs e vetores e células hospedeiras que compreendem essas moléculas de ácido nucleico. A presente invenção refere-se ainda a métodos de produção das ABMs de acordo com a presente invenção e a métodos de uso dessas ABMs no tratamento de doenças. Além disso, a presente invenção refere-se a ABMs com glicosilação modificada que possuem propriedades terapêuticas aprimoradas, incluindo anticorpos com aumento da ligação de receptor Fc e aumento da função efetora, tais como ADCC.

ANTECEDENTES DA TÉCNICA Antígeno carcinoembriônico (CEA) e anticorpos anti-CEA: Antígeno carcinoembriônico (CEA, também conhecido como CEACAM-5 ou CD66e) é uma glicoproteína que possui peso molecular de cerca de 180 kDa. CEA é um membro da superfamília de imunoglobulina e contém sete domínios que são ligados à membrana celular por meio de uma âncora de glicosilfosfatidilinositol (GPI) (Thompson, J. A., J. Clin. Lab. Anal. 5: 344-366, 1991 ). Os sete domínios incluem um único domínio variável de lg N-terminal e seis domínios (A1-81-A2-82-A3-83) homólogos ao domínio constante de lg (Hefta, L J. et ai, Cancer Res. 52: 5647-5655, 1992).

A família de CEA humana contém 29 genes, dos quais 18 são expressos: sete pertencentes ao subgrupo de CEA e onze ao subgrupo de 5 glicoproteína específico de gravidez. Acredita-se que diversos membros subgrupos de CEA possuam propriedades de adesão celular. Acredita-se que CEA desempenha um papel na imunidade inata (Hammarstrõm, S., Semin.

Cancer Biol. 9(2):67-81 (1999)). Devido à existência de proteínas com relação próxima a CEA, pode ser desafiador levantar anticorpos anti-CEA que sejam específicos para CEA com reatividade cruzada mínima para as demais proteínas com relação próxima.

CEA foi identificado há muito tempo como antígeno associado a tumor (Gold e Freedman, J. Exp. Med., 121: 439-462, 1965; Berinstein, N. L., J.

Clin. Oncol., 20: 2197-2207, 2002). Originalmente classificado como proteína expressa apenas em tecido do feto, CEA foi agora identificado em diversos tecidos adultos normais. Estes tecidos possuem origem principalmente epitelial, incluindo células dos tratos gastrointestinal, respiratório e urogenital, e células do cólon, cervical, glândulas sudoríparas e próstata (Nap et ai, TumourBiol., 9 (2-3): 145-53, 1988; Nap et ai, Cancer Res., 52 (8): 2329-23339, 1992).

Os tumores de origem epitelial, bem como suas metástases, contêm CEA como antígeno associado a tumores. Embora a própria presença de CEA não indique transformação em uma célula cancerosa, a distribuição de CEA é indicativa. Em tecido normal, CEA geralmente é expresso sobre a superfície de ápice da célula (Hammarstrõm, S., Semin. Cancer Biol. 9 (2): 67-81 (1999)), tornando-a inacessível ao anticorpo no fluxo sanguíneo. Ao contrário do tecido normal, CEA tende a ser expresso sobre toda a superfície de células cancerosas (Hammarstrõm, S., Semin. Cancer Biol. 9 (2): 67-81 (1999)). Esta mudança de padrão de expressão torna CEA acessível à ligação de anticorpos em células cancerosas. Além disso, a expressão de CEA aumenta em células cancerosas.

Adicionalmente, o aumento da expressão de CEA promove aumento de adesões intercelulares, o que pode gerar metástase (Marshall, J., Semin. Oncol., 30 (a Supl. 8): 30-6, 2003).

5 CEA é facilmente dividido da superfície celular e cortado no fluxo sanguíneo a partir de tumores, seja diretamente ou por meio da via linfática.

Devido a esta propriedade, o nível de CEA no soro foi utilizado como marcador clínico de diagnóstico de câncer e seleção em busca de recorrência de cânceres, particularmente câncer colorretal (Goldenberg, O. M., The /ntemational Joumal of Bio/ogica/ Markers, 7: 183-188, 1992; Chau, I. et ai, J. Clin. Oncol., 22: 1420-1429, 2004; Flamini et ai, C/in. Cancer Res. 12 (23): 6985-6988, 2006). Esta propriedade também representa um dos desafios do uso de CEA como alvo, pois CEA de soro se liga à maior porção dos anticorpos anti-CEA disponíveis atualmente, impedindo-os de atingir o seu alvo sobre a superfície celular e limitando potenciais efeitos clínicos.

Diversos anticorpos monoclonais foram levantados contra CEA para fins de pesquisa, como ferramentas de diagnóstico, e para fins terapêuticos (tal como em Nap et ai, Cancer Res., 52 (8): 2329-23339, 1992; Sheahan et ai, Am. J.

Clin. Path. 94: 157-164, 1990; Sakurai et ai, J. Surg. Onco/., 42: 39-46, 1989; Goldenberg, D. M., The lnternationa/ Journal of Biological Markers, 7: 183-188, 1992; Ledermann, J. A., Br. J. Cancer, 58: 654, 1988; Ledermann, J. A., Br. J. Cancer, 68: 69-73, 1993; Pedley, R. B. et ai, Br. J. Cancer, 68: 69-73, 1993; Boxer, G. M. et ai, Br. J. Cancer, 65: 825-831, 1992). Chester et ai isolaram um anticorpo anti-CEA de fita smples de uma biblioteca de exibição de fagos a ser utilizada em radioimunodetecção e radioimunoterapia (Patente Norte-Americana no 5.876.691) e o anticorpo foi humanizado em seguida (Patente Norte-Americana no 7.232.888).

Anticorpos anti-CEA foram isolados de bibliotecas de exibição de fagos humanos (Patente Norte-Americana no 5.872.215).

O anticorpo monoclonal de camundongo PR1A3 foi elevado por meio de fusão de células de mieloma NS1 (P3/NS1/I-Ag-4-1) com células do baço de camundongos imunizados com epitélio colorretal normal (Richman, P.l. e 8odmer, W. F., lnt. J. Cancer, 39: 317-328, 1987). PR1A3 reage fortemente a carcinomas 5 colorretais bem e mal diferenciados e apresenta vantagens sobre outros anticorpos reativos ao epitélio colorretal, pois o seu antígeno aparentemente é fixado ao tumor e não é encontrado nos linfáticos ou nódulos linfáticos normais que drenam um tumor (Granowska, M. et ai, Eur. J. Nucl. Med., 20: 690-698, 1989). PR1A3 reagiu, por exemplo, com 59/60 tumores colorretais (Richman, P. I.

e 8odmer, W. F., lnt. J. Cancer, 39: 317-328, 1987}, enquanto o anticorpo reativo CEA 872.3 reagiu com apenas 75% de tumores colorretais (Mansi, L. et ai, lnt. J.

Rad. Appl. lnstrum. B., 16 (2): 127-35, 1989).

O mapeamento de epítopos de PR1A3 demonstra que o anticorpo dirige-se ao domínio 83 e à âncora GPI da molécula CEA (Durbin, H. et ai, Proc.

Natl. Acad. Sei. U. S. A., 91:4313-4317, 1994). Consequentemente, o anticorpo PR1A31iga-se apenas ao CEA ligado à membrana e não à forma de CEA solúvel que pode ser encontrada nos fluxos sanguíneos de pacientes com câncer. Devido a essa propriedade de ligação, é improvável que o anticorpo PR1A3 seja sequestrado pelo CEA de soro; por outro lado, ele pode dirigir CEA expresso sobre células cancerosas. O epítopo ligado por PR1A3 é um epítopo de conformação, não um epítopo linear, que se acredita contribuir com a perda de ligação de PR 1A3 a CEA solúvel (Stewart et ai, Cancer lmmunol. lmmunother., 4 7: 299-06, 1999).

O anticorpo PR1A3 foi previamente humanizado por meio de enxerto das CDRs do anticorpo parenta! murino nas regiões de cadeia principal de cadeia pesada 1 a 3 do anticorpo humano RF-TS3'CL (que retém a cadeia principal murino 4 de PR1A3) e as regiões de cadeia principal de cadeia leve do anticorpo REI. (Stewart et ai, Cancer /mmunol. lmmunother., 47: 299-06, 1999). Esta versão humanizada de PR1A3 reteve especificidade para CEA expresso na superfície com afinidade similar à do anticorpo murino (Stewart et ai, Cancer lmmunol.

lmmunother., 47: 299-06, 1999; Patente Norte-Americana no 5,965,710).

Demonstrou-se que um PR1A3 humanizado (hPR1A3) induz a morte dirigida de 5 linhagens de células de câncer colorretal (Conaghhan, P. J. et ai, Br. J. Cancer, 98 (7): 1217-1225). A afinidade de hPR1A3 para CEA, entretanto, é relativamente baixa.

Anticorpos anti-CEA radiomarcados foram utilizados em ensaios clínicos em pacientes com câncer colorretal. Um minibody quimérico marcado com 123 1T84.66 (cT84.66), por exemplo, foi utilizado em um estudo clínico piloto em pacientes com câncer colorretal. O minibody radiomarcado foi capaz de dirigir-se a células cancerosas (Wong, J. Y. et ai, Clin. Cancer Res. 10 (15): 5014-21, (2004)).

Em um outro exemplo, (131 )1-labetuzumab, um anticorpo anti-CEA humanizado radiomarcado, foi testado em radioimunoterapia adjuvante em pacientes com metástases do fígado de câncer colorretal e concluiu-se que ele fornece uma vantagem de sobrevivência promissora (Liersch, T. et ai, Am. Surg. Onco/. 14 (9): 2577-90, (2007)).

GLICOSILAÇÃO DE ANTICORPOS: O componente oligossacarídeo pode afetar significativamente as propriedades relevantes para a eficácia de uma glicoproteína terapêutica, incluindo a estabilidade física, resistência a ataque de protease, interações com o sistema imunológico, farmacocinética e atividade biológica específica. Essas propriedades podem depender não apenas da presença ou ausência, mas também das estruturas específicas de oligossacarídeos. Podem ser realizadas algumas generalizações entre estrutura de oligossacarídeos e função de glicoproteína. Certas estruturas de oligossacarídeos mediam, por exemplo, a rápida liberação da glicoproteína do fluxo sanguíneo por meio de interações com proteínas de ligação de carboidratos específicas, enquanto outras podem ser ligadas por anticorpos e acionar reações imunológicas indesejadas (Jenkins et ai, Nature Biotechnol. 14: 975-81, 1996).

Células de mamíferos têm sido os hospedeiros preferidos para a produção de glicoproteínas terapêuticas, devido à sua capacidade de glicosilar proteínas na forma mais compatível para aplicação humana. (Cumming et ai, Glycobio/ogy 1: 115-30, 1991; Jenkins et ai, Nature Biotechnol. 14: 975-981, 1996). Bactérias glicosilam proteínas muito raramente e, como outros tipos de hospedeiros comuns, tais como leveduras, fungos filamentosos e células vegetais e de insetos, geram padrões de glicosilação associados à rápida liberação do fluxo sanguíneo, interações imunológicas indesejáveis e, em alguns casos específicos, redução da atividade biológica. Dentre as células de mamíferos, células de ovário de hamster chinês (CHO) vêm sendo mais comumente utilizadas durante as últimas duas décadas. Além de fornecerem padrões de glicosilação apropriados, essas células permitem a geração consistente de linhagens celulares clonais altamente produtivas e geneticamente estáveis. Elas podem ser cultivadas em altas densidades em biorreatores simples utilizando meios livres de soro e permitem o desenvolvimento de bioprocessos seguros e reproduzíveis. Outras células de animais comumente utilizadas incluem células do rim de filhote de hamster (BHK) e células de mieloma de camundongo NSO e SP2/0. Mais recentemente, foi também testada a produção a partir de animais transgênicos (Jenkins et ai, Nature Biotechno/. 14: 975-81, 1996).

Todos os anticorpos contêm estruturas de carboidratos em posições conservadas nas regiões constantes de cadeia pesada, em que cada isotipo possui um conjunto distinto de estruturas de carboidratos ligadas por N, que afetam de forma variável a montagem, secreção ou atividade funcional de proteínas (Wright, A. e Morrison, S. L., Trends Biotech. 15: 26-32, 1997). A estrutura do carboidrato N-ligado anexo varia consideravelmente, dependendo do grau de processamento, e pode incluir alta manose, múltiplas ramificações e também oligossacarídeos complexos biantenados (Wright, A. e Morrison, S. L., Trends Biotech. 15: 26-32, 1997). Tipicamente, existe processamento heterogêneo das estruturas de oligossacarídeos centrais ligadas em um local de glicosilação específico, de tal forma que mesmo os anticorpos monoclonais existam na forma 5 de população de múltiplas glicoformas. De forma similar, demonstrou-se que as principais diferenças da glicosilação de anticorpos ocorrem entre linhagens celulares e mesmo diferenças pequenas são observadas para uma determinada linhagem celualr cultivada sob diferentes condições de cultivo (Lifely, M. R. et ai, Glycobiology 5 (8): 813-22, 1995).

Uma forma de obter grandes aumentos de potência, mantendo ao mesmo tempo um processo de produção simples e potencialmente evitando efeitos colaterais indesejáveis significativos, é a melhoria das funções efetoras mediadas por células naturais de anticorpos monoclonais por meio de projeção do seu componente de oligossacarídeo conforme descrito em Uma na, P. et ai, Nature Biotechnol. 17: 176-180 (1999); e Patente Norte-Americana no 6.6082.84, cujo teor é integralmente incorporado ao presente como referência. Anticorpos do tipo lgG1, os anticorpos mais comumente utilizados em imunoterapia de câncer, são glicoproteínas que possuem um local de glicosilação N-ligado conservado em Asn297 em cada domínio CH2. Os dois oligossacarídeos biantenados complexos ligados a Asn297 são enterrados entre os domínios CH2, formando extensos contatos com a cadeia principal de polipeptídeos e sua presença é essencial para que o anticorpo medie funções efetoras tais como citotoxicidade celular dependente de anticorpos (ADCC) (Lifely, M. R. et ai, G/ycobiology 5: 813-822 (1995); Jefferis, R. et ai, lmmunol. Rev. 163: 59-76 (1998); Wright, A e Morrison, S. L., Trends Biotechnol. 15: 26-32 (1997)).

Umaria et ai observaram-se anteriormente que a sobre-expressão em células de ovário de hamster chinês (CHO) de ~(1 ,4)-N- acetilglicosaminiltransferase 111 ("GnTIII"), uma glicosiltransferase que catalisa a formação de oligossacarídeos bisseccionados, aumenta significativamente a atividade de ADCC in vitro de um anticorpo monoclonal quimérico antineuroblastoma (chCE7) produzido pelas células de CHO projetadas (vide Umafía, P. et ai, Nature Biotechnol. 17: 176-180 (1999) e Patente Internacional no 5 WO 99/54342, cujo teor total é incorporado ao presente como referência). O anticorpo chCE7 pertence a uma grande classe de mAbs não conjugados que possui alta afinidade e especificidade tumoral, mas possui muito pouca potência para que seja clinicamente útil quando produzido em linhagens celulares industriais padrão que não contêm a enzima GnTIII (Umana, P. et ai, Nature Biotechnol. 17: 176-180 (1999)). Este estudo foi o primeiro a demonstrar que grandes aumentos da atividade de ADCC poderão ser obtidos por meio da projeção das células produtoras de anticorpos para que expressem GnTIII, o que também gerou um aumento da proporção de oligossacarídeos bisseccionados associados à região constante (Fc), incluindo oligossacarídeos não fucosilados bisseccionados, acima dos níveis encontrados em anticorpos de ocorrência natural.

Permanece a necessidade de abordagens terapêuticas aprimoradas dirigidas a CEA, particularmente CEA ligado à membrana para o tratamento de cânceres em primatas, incluindo, mas sem limitações, seres humanos.

DESCRIÇÃO RESUMIDA DA INVENÇÃO Reconhecendo o tremendo potencial terapêutico de moléculas de ligação de antígenos (ABMs) que possuem a especificidade de ligação do anticorpo PRIA3 e que foram maturadas por afinidade e/ou glicoprojetadas para aumentar a afinidade de ligação do receptor Fc e/ou sua função efetora, os inventores do presente forneceram essas ABMs. Em um aspecto, a presente invenção refere-se a ABMs variantes e/ou ABMs maturadas por afinidade que são capazes de competir com o anticorpo PR1A3 pela ligação de antígenos. A eficácia dessas ABMs é adicionalmente aprimorada por meio da projeção do perfil de glicosilação da região Fc de anticorpo.

Em um aspecto, a presente invenção também se refere a uma molécula de ligação de antígeno (ABM) que compreende um domínio de ligação de antígeno humanizado, maturado por afinidade, que compreende uma ou mais 5 regiões determinantes de complementaridade (CDRs), em que o dito domínio de ligação de antígenos se liga especificamente ao antígeno carcinoembriônico (CEA) humano ligado à membrana e em que o dito domínio de ligação de antígeno se liga ao mesmo epítopo ou é capaz de competir pela ligação com o anticorpo monoclonal murino PR1A3. A presente invenção refere-se ainda a uma ABM de acordo com a presente invenção, em que a dita ABM contém oligossacarídeos modificados. Em uma realização, os oligossacarídeos modificados possuem fucosilação reduzida em comparação com oligossacarídeos não modificados. Em outras realizações, os oligossacarídeos modificados são híbridos ou complexos. Em um outro aspecto, a presente invenção também se refere a polipeptídeos, polinucleotídeos, células hospedeiras e vetores de expressão relativos às ABMs. Em um aspecto adicional, a presente invenção refere-se a métodos de projeção das ABMs. Em um aspecto adicional, a presente invenção refere-se a métodos de uso das ABMs, particularmente para o tratamento de doenças relativas à expressão anormal de CEA, tal como câncer.

BREVE DESCRIÇÃO DAS FIGURAS A Figura 1 exibe um diagrama esquemático do antígeno de CEA (CEACAM-5, CD66e). O anticorpo PRIA3 liga-se especificamente ao domínio 83 do antígeno, quando é ligado à membrana celular.

A Figura 2 exibe atividade de ADCC aprimorada de um anticorpo PR1A3 quimérico glicoprojetado com PBMCs humanas como efetores.

A Figura 3 exibe atividade de ligação de antígenos de um anticorpo PR1A3 humanizado que compreende uma construção de região variável de cadeia pesada, CH7 A, e uma construção de região variável de cadeia leve, CL 1A.

A Figura 4 exibe locais de aleatorização para gerar uma biblioteca de anticorpos para maturação por afinidade da cadeia leve de anticorpo PR1A3 humanizado. As posições marcadas com X foram aleatorizadas.

A Figura 5 exibe locais de aleatorização para gerar uma biblioteca de 5 anticorpos para maturação por afinidade da cadeia pesada de anticorpo PR1A3 humanizado. As posições marcadas com X foram aleatorizadas.

A Figura 6 exibe atividade de ligação de anticorpos anti-CEA maturados por afinidade derivados de um anticorpo PR1A3 humanizado que compreende uma construção de região variável de cadeia pesada CH7 ArF9 e uma construção de região variável de cadeia leve CL 1ArH11.

A Figura 7 exibe os resultados de um estudo de eficácia em camundongos SCID/bg que receberam administração intraesplênica de células de carcinoma colorretal humano LS174T, a fim de ter um modelo tumoral ortotópico.

A terapia com anticorpos foi iniciada sete dias mais tarde por meio da injeção dos anticorpos em uma dose de 25 mg/kg de peso do corpo, seguida por duas injeções semanais adicionais. "CH7A" representa um anticorpo humanizado que compreende as CDRs de PR1A3, conforme descrito no presente. "SM3E" designa um anticorpo anti-CEA gerado anteriormente. "GA201" representa um anticorpo anti-EGF humannizado utilizado como controle positivo. "PBS" designa solução salina tamponada com fosfato, que foi utilizada como controle negativo. A sobrevivência foi medida de acordo com os critérios de término definidos pela autoridade reguladora suíça.

A Figura 8 exibe os resultados de um estudo de eficácia em camundongos SCID/bg que receberam injeção intravenosa com células de carcinoma do pulmão A549, em que o tumor é enxertado no pulmão dos animais.

A terapia com anticorpos foi iniciada sete dias mais tarde por meio da injeção dos anticorpos em uma dose de 25 mg/kg de peso do corpo, seguida por duas injeções semanais adicionais. "CH7A", "SM3E" e "GA201" são conforme definido para a Figura 7, acima. A denominação "CH7ArF9 CL 1A rH11" representa uma variante de anticorpo CH7A com cadeias leve e pesada maturadas por afinidade.

A denominação "ge" indica que o anticorpo foi glicoprojetado para possuir quantidades reduzidas de oligossacarídeos fucosilados na região Fc. "Veículo" designa o controle negativo. Células de carcinoma do pulmão A549 são fortemente positivas para a expressão de EGFR e fracamente positivas para a expressão de CEA.

A Figura 9 exibe os resultados de um estudo de eficácia em camundongos SCID/bg que receberam administração intraesplênica de células de carcinoma gástrico MKN45, que gera metástase de tumores no fígado dos animais. As denominações "CH7ArF9 CL 1A rH11", "SM3E", "ge" e "PBS" são conforme definido para as Figuras 7 e 8 acima.

A Figura 1O exibe análise cinética de clones maturados por afinidade: (a) exibe um sensorgrama de Fabs anti-CEA com uma cadeia pesada maturada por afinidade CH7A H4E9 SEQ 10 No 199) em conjunto com CL 1A de cadeia leve não maturado (SEQ 10 No 105); uma cadeia leve maturada por afinidade CL 1A pAC18 (SEQ 10 No 209) combinada com cadeia pesada não maturada CH7A; e uma de suas combinações, CH7A H4E9 e CL 1A pAC18 (SEQ 10 No 199 e 209); (b) resumo da análise cinética de clones maturados por afinidade.

A Figura 11 exibe uma vista geral esquemática da aleatorização de COR 1 e CDR2 da cadeia pesada de anticorpo anti-CEA CH7 A humanizado.

A Figura 12 exibe uma vista geral esquemática da aleatorização de CDR1 e CDR2 da cadeia leve de anticorpo anti-CEA CL 1A humanizado.

A Figura 13 exibe uma vista geral esquemática da aleatorização de CDR3 da cadeia pesada de anticorpo anti-CEA CH7A humanizado.

A Figura 14 exibe uma vista geral esquemática da aleatorização de CDR3 da cadeia leve de anticorpo anti-CEA CL 1A humanizado.

A Figura 15 exibe afinidade de ligação de anticorpos anti-CEA para CEA ligado à membrana sobre células alvo MKN45. Anticorpos anti-CEA humanizados com uma cadeia leve maturada por afinidade (Quadro A, CH?A, CL 1ArH7 ou CH?A, CL 1ArH11) ou cadeias leve e pesada maturadas por afinidade 5 (Quadro B, CH?A rB9, CL 1A rH11 G2(1)) que foram convertidas em lgG exibem ligação aprimorada em comparação com o anticorpo controle (CH?A, CL 1A).

A Figura 16 exibe os resultados de um ensaio de citotoxicidade celular dependente de anticorpo (ADCC) por anticorpos maturados por afinidade (CH7ArB9, CL1A rH11G2(1), CH7Arf9, CL1A rH11G2(1) e CH?A, CL1A rH11 G2(1)) em comparação com anticorpos controle (CH?A, CL 1A G2(R2)).

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO Definições: Os termos são utilizados no presente da forma geralmente empregada na técnica, a menos que definido em contrário conforme segue.

Da forma utilizada no presente, a expressão "molécula que se liga a antígeno" designa, no seu sentido mais amplo, uma molécula que se liga especificamente a um determinante antigênico. Um exemplo não limitador de uma molécula de ligação de antígenos é um anticorpo ou fragmento do mesmo que mantém a ligação específica de antígenos. Mais especificamente, da forma utilizada no pesente, uma molécula de ligação de antígeno que se liga ao antígeno carcinoembriônico humano (CEA) ligado à membrana é uma ABM que se liga especificamente a CEA, mais especificamente a CEA ligado à membrana ou supefície celular e não a CEA solúvel que é dividido da superfície da célula. Por "liga-se especificamente", indica-se que a ligação é seletiva para o antígeno e pode ser discriminada de interações indesejadas e não específicas.

Da forma utilizada no presente, o termo "anticorpo" destina-se a incluir moléculas de anticorpos inteiras, incluindo anticorpos monoclonais, policlonais e multiespecíficos (tais como biespecíficos), bem como fragmentos de anticorpos que possuem uma região Fc e retêm a especificidade de ligação, e proteínas de fusão que incluem uma região equivalente à região Fc de uma imunoglobulina e retêm a especificidade de ligação. Também são englobados fragmentos de anticorpos que retêm a especificidade de ligação, incluindo, mas sem limitações, fragmentos de VH, fragmentos de VL, fragmentos de Fab, fragmentos F(ab')2, fragmentos scFv, fragmentos Fv, minibodys, diabodys, triabodys e tetrabodys (vide, por exemplo, Hudson e Souriau, Nature Med. 9: 129- 134 (2003)).

Da forma utilizada no presente, a expressão "domínio de ligação de antígenos" designa a porção de uma molécula de ligação de antígenos que compreende a área que se liga especificamente a um antígeno, no todo ou em parte, e a ela é complementar. Quando um antígeno for grande, uma molécula de ligação de antígeno pode ligar-se apenas a uma porção específica do antígeno, que é denominada epítopo. Um domínio de ligação de antígeno pode ser fornecido, por exemplo, por um ou mais domínios variáveis de anticorpos.

Preferencialmente, um domínio de ligação de antígenos compreende uma região variável de cadeia leve de anticorpo (VL) e uma região variável de cadeia pesada de anticorpo (VH).

Da forma utilizada no presente, a expressão "maturado por afinidade", no contexto de moléculas de ligação de antígenos (tais como anticorpos), designa uma molécula de ligação de antígenos que é derivada de uma molécula de ligação de antígenos de referência, tal como por meio de mutação, liga-se ao mesmo antígeno, preferencialmente liga-se ao mesmo epítopo, do anticorpo de referência; e possui afinidade mais alta para o antígeno que a da molécula de ligação de antígeno de referência. A maturação por afinidade geralmente envolve a modificação de um ou mais resíduos de aminoácidos em uma ou mais CDRs da moléula de ligação de antígeno.

Tipicamente, a molécula de ligação de antígeno maturada por afinidade liga-se ao mesmo epítopo da molécula de ligação de antígeno de referência inicial.

Da forma utilizada no presente, "afinidade de ligação" geralmente é expressa em termos de constantes de associação ou dissociação de equilíbrio (Ka ou Kd, respectivamente), que são, por sua vez, razões recíprocas de constantes 5 de velocidade de dissociação e associação (kd e ka, respectivamente). Desta forma, afinidades equivalentes podem compreender diferentes constantes de velocidade, desde que a razão entre as constantes de velocidade permaneça a mesma.

Da forma utilizada no presente, a expressão "região Fc" designa uma região C-terminal de uma cadeia pesada de lgG. Embora as fronteiras da região Fc de uma cadeia pesada de lgG possam variar levemente, a região Fc de cadeia pesada de lgG humano é normalmente definida como estendendo-se a partir do resíduo de aminoácido na posição Cys226 até o terminal carboxila.

Da forma utilizada no presente, a expressão "região equivalente à região Fc de uma imunoglobulina" destina-se a incluir variantes alélicas de ocorrência natural da região Fc de uma imnoglobulina, bem como variantes que possuem alterações que produzem substituições, adições ou exclusões, mas que não reduzem substancialmente a capacidade da imunoglobulina de mediar funções efetoras (tais como citotoxicidade celular dependente de anticorpos). Um ou mais aminoácidos podem ser excluídos, por exemplo, do terminal N ou terminal C da região Fc de uma imunoglobulina sem perda substancial da função biológica.

Essas variantes podem ser selecionadas de acordo com regras gerais conhecidas na técnica, de forma a possuírem efeito mínimo sobre a atividade (vide, por exemplo, Bowie, J. U. et ai, Science 247: 1306-10 (1990).

Da forma utilizada no presente, a expressão "CEA humano ligado à membrana" designa antígeno carcinoembriônico (CEA) humano que é ligado a uma porção de membrana de uma célula ou à superfície de uma célula, especificamente à superfície de uma célula tumoral. A expressão "CEA humano ligado à membrana" pode, em certas circunstâncias, designar CEA que não é ligado à membrana de uma célula, mas que foi construído de forma a preservar o epítopo ao qual se liga ao anticorpo PR1A3. A expressão "CEA solúvel" designa antígeno carcinoembriônico humano que não é ligado ou é dividido de uma 5 membrana celular ou superfície celular (tal como uma superfície de célula tumoral) e/ou que, tipicamente, não preserva o epítopo de conformação que é ligado pelo anticorpo PR1A3. CEA solúvel pode ser encontrado, por exemplo, no fluxo sanguíneo ou linfático de um paciente com câncer.

Da forma utilizada no presente, a expressão "ausência de reatividade 1o cruzada substancial contra CEA solúvel" indica que uma molécula (tal como uma molécula de ligação de antígeno) não reconhece nem se liga especificamente a CEA solúvel, particularmente em comparação com CEA ligado à membrana. Uma molécula de ligação de antígeno pode ligar, por exemplo, menos de cerca de 10% a menos de cerca de 5% de CEA solúvel ou pode ligar CEA solúvel em quantidade selecionada a partir do grupo que consiste em menos de cerca de 10%, 9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4%, 3%, 2%, 1%, 0,5%, 0,2% ou O, 1%, preferencialmente menos de cerca de 2%, 1% ou 0,5% de CEA solúvel e, de preferência superior, menos de cerca de 0,2% ou O, 1% de CEA solúvel.

Da forma utilizada no presente, os termos "fusão" e "quimérico", quando utilizados com referência a polipeptídeos tais como ABMs, designam polipeptídeos que compreendem sequências de aminoácidos derivadas de dois ou mais polipeptídeos heterólogos, tais como porções de anticorpos de diferentes espécies. Para ABMs quiméricas, por exemplo, os componentes de ligação não de antígenos podem ser derivados de uma ampla variedade de espécies, incluindo primatas, tais como chimpanzés e seres humanos. A região constante da ABM quimérica geralmente é substancialmente idêntica à região constante de um anticorpo humano natural; a região variável do anticorpo quimérico geralmente compreende uma sequência que é derivada de um anticorpo anti-CEA recombinante que contém a sequência de aminoácidos da região variável murino PR1A3. Os anticorpos humanizados são uma forma particularmente preferida de anticorpo de fusão ou quimérico.

Da forma utilizada no presente, o termo "humanizado" é utilizado 5 para designar uma molécula de ligação de antígenos derivada, em parte, de uma molécula de ligação de antígenos não humanos, tal como um anticorpo murino, que retém ou retém substancialmente as propriedades de ligação de antígenos da molécula parenta! mas que é menos imunogênico em seres humanos. Isso pode ser atingido por meio de diversos métodos (denominados no presente "humanização") que incluem, mas sem limitações, (a) enxerto dos domínios variáveis não humanos inteiros sobre regiões constantes humanas para gerar anticorpos quiméricos, (b) enxerto apenas das CDRs não humanas (tal como molécula de ligação de antígeno doador) sobre estrutura principal humana (tal como molécula de ligação de antígenos receptores) e regiões constantes com ou sem retenção de resíduos de cadeia principal críticos (tais como aqueles que são importantes para a retenção de boa afinidade de ligação de antígenos ou funções de anticorpos) ou (c) transplante dos domínios variáveis não humanos totais, mas "disfarçando-os" com uma seção similar a humana por meio da substituição de resíduos da superfície. Esses métodos são descritos em Jones et ai, Morrison et ai, Proc. Natl. Acad. Sei., 81:6851-6855 (1984); Morrison e Oi, Adv.lmmunol., 44: 65-92 (1988); Verhoeyen et ai, Science, 239: 1534-1536 (1988); Padlan, Molec.

lmmun., 28:489-498 (1991); Padlan, Molec.lmmun., 31 (3): 169-217 (1994), todos os quais são integralmente incorporados ao presente como referência. Existem geralmente três regiões determinantes de complementaridade ou CDRs (COR 1, CDR2 e CDR3) em cada um dos domínios variáveis de cadeia leve e pesada de um anticorpo, que são ladeadas por quatro subregiões de cadeia principal (ou seja, FR1, FR2, FR3 e FR4) em cada um dos domínios variáveis de cadeia leve e pesada de um anticorpo: FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4. Uma discussão de anticorpos humanizados pode ser encontrada, entre outros, na Patente Norte- Americana n° 6.632.927 e no Pedido Norte-Americano publicado no 2003/0175269, ambos os quais são integralmente incorporados ao presente como referência. Pode-se também atingir humanização por meio de transplante de CORs truncadas que contêm apenas os resíduos de aminoácidos determinantes da especificidade para a determinada COR sobre uma cadeia principal selecionada. Por "resíduos de determinação da especificidade", indica-se os resíduos que são envolvidos diretamente em interação específica com o antígeno e/ou que são necessários para a ligação específica de antígeno. Geralmente, apenas cerca de um quinto a um terço dos resíduos em uma determinada COR participa da ligação a antígeno. Os resíduos de determinação da especificidade em uma COR específica podem ser identificados, por exemplo, por meio de computação de contatos interatômicos por modelagem tridimensional e determinação da variabilidade de sequências em uma determinada posição de resíduo de acordo com os métodos descritos em Padlan et ai, FASEB J. 9 (1): 133-139 (1995), cujo teor é integralmente incorporado ao presente como referência.

Em alguns casos, os resíduos de região de estrutura (FR) da imunoglobulina humana são substituídos por resíduos não humanos correspondentes. Além disso, as moléculas de ligação de anticorpos humanizados podem compreender resíduos que não são encontrados no anticorpo receptor nem no anticorpo doador. Essas modificações são feitas para refinar ainda mais o desempenho da molécula de ligação de antígeno. Geralmente, a molécula de ligação de antígeno humanizada compreenderá substancialmente todos dentre pelo menos um, tipicamente dois domínios variáveis, em que pelo menos uma, substancialmente todas ou todas as regiões hipervariáveis correspondem às de uma imunoglobulina não humana e todas ou substancialmente todas as FRs são as de uma sequência de imunoglobulina humana. A molécula de ligação de antígeno humanizada também compreenderá opcionalmente pelo menos uma porção de uma região constante de imunoglobulina (Fc), tipicamente a de uma imunoglobulina humana. Vide, por exemplo, Jones et ai, Nature 321: 522-525 (1986); Riechmann et ai, Nature 332: 323-329 (1988); e Presta, Curr. Op. Struct.

5 Biol. 2: 593-596 (1992).

De forma similar, conforme utilizado no presente, o termo "primatizado" é utilizado para designar uma molécula de ligação de antígenos derivada de uma molécula de ligação de antígenos não primatas, tal como um anticorpo murino, que retém ou retém substancialmente as propriedades de ligação de antígenos da molécula parenta!, mas que é menos imunogênico em primatas.

Da forma utilizada no presente, o termo polipeptídeo ou polinucleotídeo "variante" (ou análogo) designa um polinucleotídeo ou polipeptídeo diferente de um polipeptídeo ou polinucleotídeo de acordo com a presente invenção indicado especificamente por meio de inserções, exclusões e substituições, criado utilizando, por exemplo, métodos de DNA recombinante.

Especificamente, variantes recombinantes que codificam estes mesmos polipeptídeos ou similares podem ser sintetizadas ou selecionadas utilizando a "redundância" no código genético. Diversas substituições de códons, tais como as alterações silenciosas que produzem diversos locais de restrição, podem ser introduzidas para otimizar a clonagem em um plasmídeo ou vetor viral ou a expressão em um sistema procariótico ou eucariótico específico. Mutações na sequência de polinucleotídeos podem ser refletidas no polipeptídeo ou domínios de outros peptídeos adicionados ao polipeptídeo para modificar as propriedades de qualquer porção do polipeptídeo, alterar características tais como afinidades de ligação de ligantes, afinidades entre cadeias ou velocidade de degradação/rendimento.

Da forma utilizada no presente, a expressão "molécula de ligação de antígeno anti-CEA variante" designa uma molécula que difere de sequência de aminoácidos de uma sequência de aminoácidos de molécula de ligação de antígeno anti-CEA "parenta!" em virtude da adição, exclusão e/ou substituição de um ou mais resíduos de aminoácidos na sequência de anticorpo parenta I. Em uma 5 realização específica, a variante compreende uma ou mais substituições de aminoácidos em uma ou mais regiões hipervariáveis ou CDRs da cadeia leve e/ou pesada da molécula de ligação de antígenos parentais. A variante pode compreender, por exmeplo, pelo menos uma, tal como pelo menos cerca de uma a cerca de dez (ou seja, cerca de 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 1O) e, preferencialmente, cerca de duas a cerca de cinco substituições em uma ou mais regiões hipervariáveis ou CDRs (ou seja, uma, duas, três, quatro, cinco ou seis regiões hipervariáveis ou CDRs) da molécula de ligação de antígeno parenta!.

Uma molécula de ligação de antígeno anti-CEA variante pode também compreender uma ou mais adições, exclusões e/ou substituições em uma ou mais regiões de cadeia principal da cadeia pesada ou leve. Normalmente, a variante conterá uma sequência de aminoácidos que possui pelo menos cerca de 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% de identidade de sequência de aminoácidos com as sequências de domínio variável de cadeia leve ou cadeia pesada de molécula de ligação de antígeno parenta!, tipicamente pelo menos cerca de 80%, 90%, 95% ou 99%. A identidade com relação a uma sequência é definida no presente como o percentual de resíduos de aminoácidos na sequência possível que são idênticos aos resíduos de anticorpos parentais, após o alinhamento das sequências e introdução de intervalos, se necessário, para atingir o percentual máximo de identidade de sequências. Nenhuma das extensões N- terminais, C-terminais ou internas, exclusões ou inserções na sequência de anticorpos deverá ser interpretada como afetando a homologia ou identidade de sequências. A molécula de ligação de antígeno variante retém a capacidade de ligação de CEA humano ligado por membana, ligando, por exemplo, o mesmo epítopo ao da molécula de ligação de antígeno parenta! e preferencialmente possui propriedades que são superiores às da molécula de ligação de antígeno parenta!. A variante pode possuir, por exemplo, afinidade de ligação mais forte e maior capacidade de indução de citotoxicidade celular mediada por anticorpos in 5 vitro e in vivo. Para analisar essas propriedades, dever-se-á geralmente comparar uma molécula de ligação de antígenos variante e a molécula de ligação de antígenos parenta! no mesmo formato; uma forma Fab da molécula de ligação de antígenos variante com uma forma Fab da molécula de ligação de antígenos parenta I, por exemplo, ou uma forma de comprimento total da molécula de ligação 1o de antígeno variante com uma forma de comprimento total da molécula de ligação de antígeno parenta!. A molécula de ligação de antígeno variante de interesse específico no presente é aquela que possui aumento de pelo menos cerca de duas vezes, três vezes, quatro vezes, cinco vezes, seis vezes, sete vezes, oito vezes, nove vezes, dez vezes, onze vezes, doze vezes, treze vezes, quatorze vezes, quinze vezes, dezesseis vezes, dezessete vezes, dezoito vezes, dezenove vezes ou vinte vezes da atividade biológica em comparação com a molécula de ligação de antígenos parenta!.

O termo molécula de ligação de antígeno "parenta!" designa uma ABM que é utilizada como ponto de partida ou base da preparação da variante.

Em uma realização específica, a molécula de ligação de antígeno parenta! possui uma região de cadeia principal humana e, quando presente, possui região(ões) constante(s) de anticorpo humano. O anticorpo parenta! pode ser, por exemplo, um anticorpo humano ou humanizado.

"Substituições" de aminoácidos podem resultar na substituição de um aminoácido por um outro aminoácido que possui propriedades químicas e/ou estruturais similares, tais como substituições de aminoácidos conservadores.

Substituições de aminoácidos "conservadores" podem ser realizadas com base na similaridade de polaridade, carga, solubilidade, hidrofobicidade, hidrofilicidade e/ou na natureza anfifática dos resíduos envolvidos. Os aminoácidos não polares (hidrofóbicos) incluem, por exemplo, alanina, leucina, isoleucina, valina, prolina, fenilalanina, triptofano e metionina; os aminoácidos neutros polares incluem glicina, serina, treonina, cisteína, tirosina, asparagina e glutamina; os aminoácidos 5 com carga positiva (básicos) incluem arginina, lisina e histidina; e aminoácidos com carga negativa (ácidos) incluem ácido aspártico e ácido glutâmico.

"Inserções" ou "exclusões" encontram-se geralmente na faixa de cerca de um a cerca de vinte aminoácidos, mais especificamente cerca de um a cerca de dez aminoácidos e, ainda mais especificamente, cerca de dois a cerca de cinco aminoácidos. Substituições não conservadoras causarão a substituição de um membro de uma dessas classes por outra classe. Substituições de aminoácidos podem também resultar, por exemplo, na substituição de um aminoácido por um outro aminoácido que possui propriedades químicas e/ou estruturais diferentes, substituindo, por exemplo, um aminoácido de um grupo (tal como polar) por outro aminoácido de um grupo diferente (tal como básico). A variação permitida pode ser determinada experimentalmente por meio da projeção sistemática de inserções, exclusões ou substituições de aminoácidos em uma molécula de polipeptídeo utilizando métodos de DNA recombinante e testando as variantes recombinantes resultantes da atividade.

Da forma utilizada no presente, a expressão "F v de fita simples" ou "scFv" designa um fragmento de anticorpo que compreende um domínio VH e um domínio VL na forma de cadeia de polipeptídeo isolada. Tipicamente, os domínios de VH e VL são ligados por uma sequência de ligação. Vide, por exemplo, Pluckthun em The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, vol. 113, Rosenburg e Moore eds. Springer-Verlag, Nova Iorque, págs. 269-315 (1994).

Da forma utilizada no presente, o termo "minibody" designa um derivado de scFv homodimérico bivalente que contém uma região constante, tipicamente a região CH3 de uma imunoglobulina, preferencialmente lgG, de maior preferência lgG1, como a região de dimerização. Geralmente, a região constante é conectada ao scFv por meio de uma região de articulação e/ou uma região de ligação. Exemplos de proteínas de minibodys podem ser encontrados em Hu et ai (1996), Cancer Res. 56: 3055-61.

5 Da forma utilizada no presente, o termo "diabody'' designa pequenos fragmentos de anticorpos com dois locais de ligação de antígenos, que compreendem um domínio variável de cadeia pesada (VH) conectado a um domínio variável de cadeia leve (VL) na mesma cadeia de polipeptídeos (VH- VL).

Utilizando um ligante que é curto demais para permitir o emparelhamento entre os dois domínios sobre a mesma cadeia, os domínios são forçados a emparelhar-se com os domínios complementares de uma outra cadeia e criar dois locais de ligação de antígenos. Os diabodys são descritos mais completamente, por exemplo, em EP 404.097, WO 93/11161 e Hollinger et ai, Proc. Natl. Acad. Sei. U.

S. A., 90: 6444-6448 (1993). Um triabody resulta da formação de um trímero trivalente de três scFvs, gerando três locais de ligação, e um tetrabody é um tetrâmero tetravalente de quatro scFvs, o que resulta em quatro locais de ligação.

Caso houvesse duas ou mais definições de um termo que é utilizado e/ou aceito na técnica, a definição do termo da forma utilizada no presente destina-se a incluir todos esses significados, a menos que indicado explicitamente em contrário. Um exemplo específico é o uso da expressão "região determinantes de complementaridade" ("COR") para descrever os locais de combinação de antígenos não contíguos (também conhecidos como regiões de ligação de antígenos) encontrados na região variável de polipeptídeos de cadeia leve e pesada. CDRs também são denominadas "regiões hipervariáveis" e aquele termo é utilizado de forma intercambiável no presente com o termo "COR" com referência às porções da região variável que formam as regiões de ligação de antígenos. Essa região específica foi descrita por Kabat et ai, Departamento de Serviços Humanos e de Saúde dos Estados Unidos, Sequences of Proteins of lmmunological lnterest (1983) e por Chothia et ai, J. Moi. Biol. 196: 901-917 (1987), que são incorporados ao presente como referência em que as definições incluem a sobreposição ou subconjuntos de resíduos de aminoácidos em comparação entre si. A aplicação de qualquer definição para que se refira a uma 5 COR de um anticorpo ou suas variantes destina-se, entretanto, a encontrar-se dentro do escopo da expressão conforme definido e utilizado no presente. Os resíduos de aminoácidos apropriados que englobam as CORs conforme definido por qualquer uma das referências ditas acima são descritos abaixo na Tabela I como comparação. Os números de resíduos exatos que englobam uma COR 1o específica variarão dependendo da sequência e do tamanho da COR. Os técnicos no assunto podem determinar rotineiramente quais resíduos compreendem uma COR específica, considerando a sequência de aminoácidos da região variável do anticorpo.

TABELA 1 1

DEFINIÇÕES DE CDR COR Kabat Chothia AbM 2 COR1 VH 31-35 26-32 26-35 COR2 VH 50-65 52-58 50-58 COR3 VH 95-102 95-102 95-102 COR1 VL 24-34 26-32 24-34 COR2 VL 50-56 50-52 50-56 COR3 VL 89-97 91-96 89-97 A numeração de todas as definições de COR na Tabela 1 está de acordo com as convenções de numeração estabelecidas por Kabat et ai (vide abaixo). 2 "AbM" com "b" em minúscula conforme utilizado na Tabela 1 designa as CORs conforme definido pelo software de modelagem de anticorpos "AbM" da Oxford Molecular.

Kabat et ai também definiram um sistema de numeração para sequências de domínio variável que é aplicável a qualquer anticorpo. Os técnicos comuns no assunto podem atribuir de forma inequívoca este sistema de "numeração de Kabat" a qualquer sequência de domínio variável, sem depender 5 de nenhum dado experimental além da própria sequência. Da forma utilizada no presente, "numeração de Kabat" designa o sistema de numeração descrito por Kabat et ai, Departamento de Serviços Humanos e de Saúde dos Estados Unidos, Sequences of Proteins of lmmuno/ogica/ lnterest (1983). A menos que especificado em contrário, as referências à numeração de posições de resíduos de aminoácidos específicos em uma ABM são de acordo com o sistema de numeração de Kabat. As sequências da listagem de sequências (ou seja, SEQ ID No 1 a SEQ ID No 216) não são numeradas de acordo com o sistema de numeração de Kabat. Os técnicos comuns no assunto são, entretanto, familiares com a forma de conversão das sequências na Listagem de Sequências na numeração de Kabat.

Por ácido nucleico ou polinucleotídeo que possui uma sequência de nucleotídeos, por exemplo, pelo menos 95% "idêntica" a uma sequência de nucleotídeos de referência de acordo com a presente invenção, pretende-se que a sequência de nucleotídeos do polinucleotídeo seja idêntica à sequência de referência, exceto pelo fato de que a sequência de polinucleotídeos pode incluir até cinco mutações pontuais para cada cem nucleotídeos da sequência de nucleotídeos de referência. Em outras palavras, para obter um polinucleotídeo que possui uma sequência de nucleotídeos pelo menos 95% idêntica a uma sequência de nucleotídeos de referência, até 5% dos nucleotídeos na sequência de referência podem ser excluídos ou substituídos por outro nucleotídeo ou um número de nucleotídeos de até 5% do total de nucleotídeos na sequência de referência pode ser inserido na sequência de referência.

De forma prática, pode-se determinar convencionalmente se qualquer polipeptídeo ou molécula de ácido nucleico específica é pelo menos 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% idêntica a uma sequência de nucleotídeos ou sequência de polipeptídeos de acordo com a presente invenção utilizando programas de computador conhecidos. Um método de determinação da 5 melhor coincidência geral entre uma sequência de consulta (uma sequência de acordo com a presente invenção) e uma sequência objeto, também denominada alinhamento de sequências global, pode ser escolhido utilizando o programa de computador FASTDB com base no algoritmo de Brutlag et ai, Comp. App. Bíoscí.

6:237-245 (1990). Em um alinhamento de sequências, as sequências de consulta e objeto são ambas sequências de DNA. Uma sequência de RNA pode ser comparada por meio da conversão deUs em Ts. O resultado do dito alinhamento de sequências global encontra-se em percentual de identidade. Os parâmetros preferidos utilizados em um alinhamento FASTDB de sequências de DNA para calcular o percentual de identidade são: Matriz = Unitária, múltiplo k = 4, penalidade de falta de coincidência= 1, penalidade de união= 30, comprimento do grupo de aleatorização =O, avaliação de corte= 1, penalidade de intervalo= 5, penalidade de tamanho de intervalo = 0,05, tamanho de janela = 500 ou o comprimento da sequência de nucleotídeos objeto, o que for mais curto.

Caso a sequência objeto seja mais curta que a sequência de consulta devido a exclusões 5' ou 3', não devido a exclusões internas, deve-se realizar correção manual dos resultados. Isso ocorre porque o programa FASTDB não considera truncagens 5' e 3' da sequência objeto ao calcular o percentual de identidade. Para sequências objeto truncadas nas extremidades 5' ou 3', com relação à sequência de consulta, o percentual de identidade é corrigido por meio do cálculo do número de bases da sequência de consulta que se encontram a 5' e 3' da sequência objeto, que não são coincidentes/alinhados, como percentual do total de bases da sequência de consulta. Determina-se se um nucleotídeo é coincidente/alinhado por resultados do alinhamento de sequências FASTDB. Este percentual é subtraído em seguida do percentual de identidade, calculado pelo programa FASTDB acima utilizando os parâmetros especificados, para chegar a uma avaliação final de percentual de identidade. Esta avaliação corrigida é a utilizada para os propósitos da presente invenção. Apenas bases fora das bases 5' 5 e 3' da sequência objeto, conforme exibido pelo alinhamento FASTDB, que não são coincidentes/alinhadas com a sequência de consulta, são calculadas para fins de ajuste manual da avaliação de percentual de identidade.

Uma sequência objeto de 90 bases é alinhada, por exemplo, a uma sequência de consulta de cem bases para determinar o percentual de identidade.

As exclusões ocorrem na extremidade 5' da sequência objeto e, portanto, o alinhamento FASTDB não exibe um alinhamento/coincidência das primeiras dez bases na extremidade 5'. As dez bases não emparelhadas representam 10% da sequência (número de bases nas extremidades 5' e 3' não coincidentes/número total de bases na sequência de consulta), de tal forma que 10% sejam subtraídos da avaliação de percentual de identidade calculada pelo programa FASTDB. Caso as noventa bases restantes fossem perfeitamente coincidentes, o percentual final de identidade seria de 90%. Em um outro exemplo, uma sequência objeto de noventa bases é comparada com uma sequência de consulta de cem bases.

Nesse momento, as exclusões são exclusões internas de tal forma que não há bases sobre o 5' ou 3' da sequência objeto que não sejam coincidentes/alinhadas com a consulta. Neste caso, o percentual de identidade calculado por FASTDB não é corrigido manualmente. Novamente, apenas bases 5' e 3' da sequência objeto que não são coincidentes/alinhadas com a sequência de consulta são corrigidas manualmente. Nenhuma outra correção manual deve ser feita para os propósitos da presente invenção.

Por um polipeptídeo que possui uma sequência de aminoácidos, por exemplo, pelo menos 95% "idêntica" a uma sequência de aminácidos de consulta de acordo com a presente invenção, pretende-se que a sequência de aminoácidos do polipeptídeo objeto seja idêntica à sequência de consulta, exceto pelo fato de que a sequência de polipeptídeos objeto pode incluir até cinco alterações de aminoácidos para cada cem aminoácidos da sequência de aminoácidos de consulta. Em outras palavras, para obter um polipeptídeo que possui uma 5 sequência de aminoácidos pelo menos 95% idêntica a uma sequência de aminoácidos de consulta, até 5% dos resíduos de aminoácidos na sequência objeto podem ser inseridos, excluídos ou substituídos por um outro aminoácido.

Estas alterações da sequência de referência podem ocorer nas posições terminal amino ou carbóxi da sequência de aminoácidos de referência ou em qualquer ponto entre essas posições terminais, intercaladas individualmente entre resíduos na sequência de referência ou em um ou mais grupos contíguos na sequência de referência.

De forma prática, pode-se determinar convencionalmente se qualquer polipeptídeo específico é pelo menos 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% idêntico a um polipeptídeo de referência utilizando programas de computador conhecidos. Um método de determinação da melhor coincidência geral entre uma sequência de consulta (uma sequência de acordo com a presente invenção) e uma sequência objeto, também denominada alinhamento de sequências global, pode ser escolhido utilizando o programa de computador FASTDB com base no algoritmo de Brutlag et ai, Comp. App. Biosci. 6: 237-245 (1990). Em um alinhamento de sequências, as sequências objeto e de consulta são ambas sequências de nucleotídeos ou sequências de aminoácidos. O resultado do dito alinhamento de sequências global encontra-se em percentual de identidade. Os parâmetros preferidos utilizados em um alinhamento de aminoácidos FASTDB são: Matriz= PAM O, múltiplo k = 2, penalidade de falta de coincidência = 1, penalidade de união = 20, comprimento do grupo de aleatorização = O, avaliação de corte = 1, tamanho da janela = comprimento de sequência, penalidade de intervalo = 5, penalidade de tamanho de intervalo =

0,05, tamanho de janela= 500 ou o comprimento da sequêncía de aminoácidos objeto, o que for mais curto.

Caso a sequência objeto seja mais curta que a sequência de consulta devido a exclusões N ou C terminais, não devido a exclusões internas, 5 deve-se realizar correção manual dos resultados. Isso ocorre porque o programa FASTDB não representa truncagens N e C terminais da sequêncía objeto ao calcular o percentual de identidade global. Para sequências objeto truncadas nos terminais N e C, com relação à sequência de consulta, o percentual de identidade é corrigido por meio do cálculo do número de resíduos da sequência de consulta que são N e C terminais da sequência objeto, que não são coincidentes/alinhados com um resíduo objeto correspondente, na forma de percentual do total de bases da sequência de consulta. Determina-se se um resíduo é coincidente/alinhado por resultados do alinhamento de sequências FASTDB. Este percentual é subtraído em seguida do percentual de identidade, calculado pelo programa FASTDB acima utilizando os parâmetros especificados, para chegar a uma avaliação final de percentual de identidade. Esta avaliação de percentual de identidade final é a utilizada para os propósitos da presente invenção. Apenas resíduos dos terminais N e C da sequêncía objeto, que não são coincidentes/alinhados com a sequêncía de consulta, são considerados para fins de ajuste manual da avaliação de percentual de identidade. Isso significa apenas posições de resíduos de consulta fora dos resíduos N e C terminais mais distantes da sequência objeto.

Uma sequência objeto de noventa resíduos de aminoácidos é alinhada, por exemplo, a uma sequência de consulta de cem resíduos para determinar o percentual de identidade. A exclusão ocorre no terminal N da sequência objeto e, portanto, o alinhamento de FASTDB não exibe uma coincidência/alinhamento dos dez primeiros resíduos no terminal N. Os dez resíduos não emparelhados representam 10% da sequêncía (número de resíduos nos terminais N e C não coincidentes/número total de resíduos na sequência de consulta), de tal forma que 10% sejam subtraídos da avaliação de percentual de identidade calculada pelo programa FASTDB. Caso os noventa resíduos restantes fossem perfeitamente coincidentes, o percentual final de identidade seria de 90%.

Em um outro exemplo, uma sequência objeto de noventa resíduos é comparada 5 com uma sequência de consulta de cem resíduos. Nesse momento, as exclusões são exclusões internas de tal forma que não haja resíduos nos terminais N ou C da sequência objeto que não sejam coincidentes/alinhados com a consulta. Neste caso, o percentual de identidade calculado por FASTDB não é corrigido manualmente. Novamente, posições apenas de resíduos fora das extremidades N e C terminais da sequência objeto, conforme exibido no alinhamento FASTDB, que não são coincidentes/alinhados com a sequência objeto, são corrigidas manualmente. Nenhuma outra correção manual deve ser feita para os propósitos da presente invenção.

O percentual de identidade de polinucleotídeos e/ou polipeptídeos pode também ser determinado utilizando os programas BLAST disponíveis por meio do Centro Nacional de Informações Biotecnológicas (NCBI), com os parâmetros padrão indicados nos programas.

Da forma utilizada no presente, um ácido nucleico que se "hibridiza sob condições estringentes" em uma sequência de ácidos nucleicos de acordo com a presente invenção designa um polinucleotídeo que se hibridiza sob condições especificadas, tais como em uma incubação por uma noite a 42 oc em uma solução que compreende 50% de formamida, 5x SSC (750 mM de NaCI, 75 mM de citrato de sódio), 50 mM de fosfato de sódio (pH 7,6), 5x solução de Denhardt, sulfato de dextran a 10% e 20 ~g/ml de DNA de esperma de salmão cortado desnaturado, seguido pela lavagem dos filtros em O, 1x SSC a cerca de 65 °C. Da forma utilizada no presente, a expressão "polipeptídeo que possui atividade de GnTIII" designa polipeptídeos que são capazes de catalisar a adição de um resíduo de N-acetilglicosamina (GicNAc) em ligação 13-1-4 à manosida ligada por 13 do núcleo trimanosila de oligossacarídeos ligados por N. Isso inclui polipeptídeos de fusão que exibem atividade enzimática similar, mas não necessariamente idêntica a uma atividade de 13(1 ,4)-N- 5 acetilglicosaminiltransferase 111, também conhecida como 13-1 ,4-manosil glicoproteína 4-beta-N-acetilglicosaminiltransferase (EC 2.4.1.144), de acordo com o Comitê de Nomenclatura da União Internacional de Bioquímica e Biologia Molecular (NC-IUBMB), conforme medido em um ensaio biológico específico, com ou sem dependência de dosagem. Caso realmente exista dependência de dosagem, ela não necessita ser idêntica à de GnTIII, mas sim substancialmente similar à dependência de dosagem em uma determinada atividade em comparação com GnTIII (ou seja, o possível polipeptídeo exibirá atividade maior ou não mais de cerca de 25 vezes menor, preferencialmente não mais de cerca de dez vezes menos atividade e, de preferência superior, não mais de cerca de três vezes menos atividade com relação ao Gn Til I).

Da forma utilizada no presente, a expressão "domínio de localização Golgi" designa a sequência de aminoácidos de um polipeptídeo residente Golgi que é responsável pelo ancoramento do polipeptídeo a um local no complexo de Golgi. Geralmente, domínios de localização compreendem "caudas" de terminal amíno de uma enzima.

Da forma utilizada no presente, a expressão "função efetora" designa as atividades biológicas que podem ser atribuídas à região Fc (região Fc de sequência nativa ou região Fc com variação de sequência de aminoácidos) de um anticorpo. Exemplos de funções efetoras de anticorpos incluem, mas sem limitações, afinidade de ligação de receptor Fc, citotoxicidade celular dependente de anticorpos (ADCC), fagocitose celular dependente de anticorpos (ADCP), secreção de citoquinas, absorção de antígeno mediada por complexo imune por células que apresentam antígenos, regulagem para baixo de receptores da superfície celular etc.

Da forma utilizada no presente, os termos "projetar, projetado, projeção", particularmente com o prefixo "glico", bem como a expressão "projeção por glicosilação", são considerados incluindo qualquer manipulação do padrão de 5 glicosilação de um polipeptídeo recombinante ou de ocorrência natural ou fragmento do mesmo. Projeção por glicosilação inclui projeção metabólica da maquinaria de glicosilação de uma célula, incluindo manipulações genéticas dos processos de síntese de oligossacarídeos para atingir glicosilação alterada de glicoproteínas expressas nas células. Além disso, projeção por glicosilação inclui os efeitos de mutações e ambiente celular mediante glicosílação. Em uma realização, a projeção por glicosilação é uma alteração da atividade de glicosiltransferase. Em uma realização específica, a projeção resulta na alteração da atividade de glicosaminiltransferase e/ou atividade de fucosiltransferase.

Da forma utilizada no presente, a expressão "célula hospedeira" cobre qualquer tipo de sistema celular que pode ser projetado para gerar os polipeptídeos e as moléculas de ligação de antígenos de acordo com a presente invenção. Em uma realização, a célula hospedeira é projetada para permitir a produção de uma molécula de ligação de antígenos com glicoformas modificadas.

Em uma realização preferida, a molécula de ligação de antígenos é um anticorpo, fragmento de anticorpo ou proteína de fusão. Em certas realizações, as células hospedeiras foram adicionalmente manipuladas para expressar níveis mais altos de um ou mais polipeptídeos que possuem atividade de GnTIII. As células hospedeiras incluem células cultivadas, tais como células cultivadas de mamíferos, como células CHO, células BHK, células NSO, células SP2/0, células de mieloma YO, células de mieloma de camundongos P3X63, células PER, células PER.C6 ou células de hibridoma, células de levedura, células de insetos e células de plantas, para indicar apenas algumas, mas também células compreendidas em um animal transgênico, planta transgênica ou tecido animal ou vegetal cultivado.

Da forma utilizada no presente, a expressão "citotoxicidade celular mediada por Fc" inclui citotoxicidade celular dependente de anticorpos (ADCC) e citotoxicidade celular mediada por uma proteína de fusão Fc solúvel que contém 5 uma região Fc humana. É um mecanismo imunológico que gera alise de "células dirigidas" por "células efetoras imunes humanas".

Da forma utilizada no presente, a expressão "células efetoras imunes humanas" designa uma população de leucócitos que exibem receptores de Fc sobre as suas superfícies, através das quais elas se ligam à região Fc de moléculas de ligação de antígenos ou de proteínas de fusão de Fc e realizam funções efetoras. Essa população pode incluir, mas sem limitações, células mononucleares do sangue periférico (PBMC) e/ou células natural killers (NK).

Da forma utilizada no presente, a expressão "células alvo" designa células às quais moléculas de ligação de antígenos que compreendem uma região Fc (tais como anticorpos ou seus fragmentos que compreendem uma região Fc) ou proteínas de fusão de Fc ligam-se especificamente. As moléculas de ligação de antígenos ou proteínas de fusão de Fc ligam-se a células alvo por meio da porção de proteína que é N terminal para a região Fc.

Da forma utilizada no presente, a expressão "aumento da citotoxicidade celular mediada por Fc" é definida como aumento da quantidade de "células alvo" que são lisadas em um determinado tempo, em uma determinada concentração de molécula de ligação de antígenos ou de proteína de fusão de Fc no meio em volta das células alvo, por meio do mecanismo de citotoxicidade celular mediada por Fc definida acima e/ou redução da concentração de molécula de ligação de antígenos ou de proteína de fusão Fc, no meio em volta das células alvo, necessário para atingir a lise de um determinado número de "células alvo", em um determinado tempo, pelo mecanismo de citotoxicidade celular mediada por Fc. O aumento da citotoxicidade celular mediada por Fc refere-se à citotoxicidade celular mediada pela mesma molécula de ligação de antígenos ou proteína de fusão Fc produzida pelo mesmo tipo de células hospedeiras, utilizando os mesmos métodos padrão de produção, purificação, formulação e armazenagem (que são conhecidos dos técnicos no assunto), mas que não foi produzida por células 5 hospedeiras projetadas para que possuam um padrão de glicosilação alterado (tal como para expressar a glicosiltransferase, GnTIII, ou outras glicosiltransferases) por meio dos métodos descritos no presente.

Por "molécula de ligação de antígenos que possui citotoxicidade celular dependente de anticorpos (ADCC) mais alta", indica-se uma molécula de ligação de antígenos, da forma em que essa expressão é definida no presente, que possui ADCC mais alta conforme determinado por meio de qualquer método apropriado conhecido dos técnicos comuns no assunto. Um ensaio ADCC in vítro aceito é o seguinte: 1) o ensaio utiliza células alvo que conhecidamente expressam o antígeno alvo reconhecido pela região de ligação de antígenos do anticorpo; 2) o ensaio utiliza células mononucleares do sangue periférico (PBMCs) humanas, isoladas do sangue de um doador saudável selecionado aleatoriamente, como células efetoras; 3) o ensaio é conduzido de acordo com o protocolo a seguir: i) as PBMCs são isoladas utilizando procedimentos padrão de centrifugação de densidade e são suspensas a 5 x 106 células/ml em meio de cultivo celular RPMI; ii) as células alvo são cultivadas por meio de métodos de cultivo de tecidos padrão, colhidas da fase de crescimento exponencial com viabilidade de mais de 90%, lavadas em meio de cultivo celular RPMI, marcadas com 100 microCuries de 51 Cr, lavadas por duas vezes com meio de cultivo celular e novamente suspensas em meio de cultivo celular sob densidade de 105 células/ml;

iii) 100 micro litros da suspensão final de células alvo acima são transferidos para cada cavidade de uma placa de microtítulos com 96 cavidades; iv) o anticorpo é diluído em série de 4000 ng/ml para 0,04 ng/ml em meio de cultivo celular e 50 microlitros das soluções de anticorpo resultantes 5 são adicionados às células alvo na placa de microtítulos com 96 cavidades, testando em três cópias diversas concentrações de anticorpos que cobrem toda a faixa de concentração acima; v) para os controles de liberação máxima (MR), três cavidades adicionais na placa que contém as células alvo marcadas recebem 50 microlitros de uma solução aquosa a 2% (VN) de detergente não iônico (Nonidet, Sigma, St.

Louis), em vez da solução de anticorpo (ponto iv acima); vi) para controles de liberação espontânea (SR), três cavidades adicionais na placa que contém as células alvo marcadas recebem 50 microlitros de meio de cultivo celular RPMI no lugar da solução de anticorpo (ponto iv acima); vii) a placa de microtítulos com 96 cavidades é centrifugada em seguida a 50 X g por um minuto e incubada por uma hora a 4 °C; viii) 50 microlitros da suspensão de PBMC (ponto i acima) são adicionados a cada cavidade para gerar uma razão de células efetoras:alvo de 25:1 e as placas são colocadas em um incubador sob atmosfera de C02 a 5% a 37 oc por quatro horas; ix) o sobrenadante livre de células de cada cavidade é colhido e a radioatividade liberada experimentalmente (ER) é quantificada utilizando um contador gama; x) o percentual de lise específica é calculado para cada concentração de anticorpo de acordo com a fórmula (ER-MR)/(MR-SR) x 100, em que ER é a radioatividade média quantificada (vide o ponto ix acima) para aquela concentração de anticorpo, MR é a radioatividade média quantificada (vide o ponto ix acima) para os controles MR (vide o ponto v acima) e SR é a radioatividade média quantificada (vide o ponto ix acima) para os controles SR (vide o ponto vi acima); 4) "aumento de ADCC" é definido como aumento do percentual máximo de lise específica observado na faixa de concentração de anticorpos 5 testada acima e/ou uma redução da concentração de anticorpos necessária para atingir a metade do percentual máximo de lise específica observado na faixa de concentração de anticorpos testada acima. O aumento de ADCC é relativo à ADCC, medido com o ensaio acima, mediado pelo mesmo anticorpo, produzido pelo mesmo tipo de células hospedeiras, utilizando os mesmos métodos padrão de produção, purificação, formulação e armazenagem, que são conhecidos dos técnicos no assunto, mas que não foram produzidos por células hospedeiras projetadas para sobre-expressar GnTIII.

MOLÉCULAS DE LIGAÇÃO DE ANTÍGENOS ANTI-CEA: CEA vem sendo utilizado há muito tempo como marcador de câncer para fins de diagnóstico. Ele é expresso anormalmente (tal como sobre-expresso e/ou distribuído em um padrão diferente na célula) em muitos tecidos tumorais em comparação com tecidos não tumoral do mesmo tipo de célula. Como CEA geralmente é dividido da superfície de células tumorais e a maior porção dos anticorpos anti-CEA disponíveis também se liga a CEA solúvel, entretanto, anticorpos não conjugados para CEA geralmente não são utilizados para fins terapêuticos. Os anticorpos anti-CEA que se encontram atualmente em ensaios piloto são administrados, por exemplo, como rádio conjugados (Wong et ai, 2004; Liersch et ai, 2007).

Diversos mecanimos estão envolvidos na eficácia terapêutica de anticorpos anti-CEA, incluindo citotoxicidade celular dependente de anticorpos (ADCC) e citotoxicidade dependente de complemento (CDC). O aumento da expressão de CEA promove aumento da adesão intercelular, que pode gerar metástase de células cancerosas (Marshall, J., Semin. Oncol. 30 (3), Supl. 8: 30-

36). Desta forma, as moléculas de ligação de antígenos anti-CEA podem também desempenhar um papel na inibição da adesão celular mediada por CEA e na metástase de células cancerosas.

Em um aspecto, a presente invenção refere-se a uma molécula de 5 ligação de antígenos (tal como um anticorpo ou fragmento do mesmo) que compreende uma ou mais (tal como uma, duas, três, quatro, cinco ou seis) CDRs do anticorpo murino PR1A3, em que pelo menos uma das CDRs possui substituição de pelo menos um resíduo de aminoácido em comparação com a COR correspondente de PR1A3 e em que a molécula de ligação de antígenos possui afinidade aprimorada para CEA, preferencialmente CEA ligado à membrana em comparação com uma molécula de ligação de antígeno PR1A3 parenta!. Essa uma ou mais CDRs podem ser CDRs truncadas e conterão, pelo menos, os resíduos de determinação da especificidade (SDRs), da forma em que esse termo é definido no presente, para uma determinada COR. Em uma realização, a molécula de ligação de antígenos compreende pelo menos uma (tal como uma, duas, três, quatro, cinco ou seis) das CDRs descritas na Tabela 2 abaixo, que compreende os resíduos das CDRs que reterão a ligação específica.

Em uma outra realização, a molécula de ligação de antígeno compreende pelo menos uma (tal como uma, duas, três, quatro, cinco ou seis) CDRs descritas na Tabela 2 abaixo ou uma de suas variantes ou formas truncadas que contém pelo menos os resíduos determinantes da especificidade para a dita COR e compreende uma sequência derivada de um polipeptídeo heterólogo. Em uma realização específica, quando a molécula de ligação de antígenos compreender uma variante CDR1 de cadeia pesada de PR1A3, o HCDR1 possui um glutamato substituído por uma valina na posição Kabat 31. Em uma realização, a molécula de ligação de antígenos compreende três CDRs de cadeia pesada (tais como HCDR1, HCDR2 e HCDR3) e/ou três CDRs de cadeia leve (tais como LCDR1, LCDR2 e LCDR3) da Tabela 2 ou suas variantes ou formas truncadas que contêm pelo menos os resíduos de determinação da especificidade para cada uma das três CDRs ditas. Em uma realização mais específica, a molécula de ligação de antígenos compreende três CDRs de cadeia pesada (tais como HCDR 1, HCDR2 e HCDR3) e/ou três CDRs de cadeia leve (tais como LCDR 1, LCDR2 e LCDR3) da 5 Tabela 2. Em uma outra realização, a molécula de ligação de antígenos compreende a(s) região(ões) variável(is) de uma cadeia leve e/ou pesada de anticorpo, preferencialmente uma região variável de cadeia leve e pesada. Em uma realização mais específica, a região de cadeia leve e/ou cadeia pesada é selecionada a partir da região variável de cadeia leve e/ou pesada da Tabela 4 ou uma de suas combinações, em que a região de cadeia leve e pesada não é uma combinação de SEQ ID No 99 e SEQ ID No 103 ou SEQ ID No 100 e SEQ ID No

104. Em uma realização, a molécula de ligação de antígenos é um anticorpo quimérico e, mais especificamente, um anticorpo humanizado. Em uma outra realização, a molécula de ligação de antígenos compreende uma região Fc. Em uma outra realização, a molécula de ligação de antígenos é maturada por afinidade. Em uma outra realização, a molécula de ligação de antígenos possui atividade de ADCC mais alta em comparação com PR1A3. Em uma realização, o aumento de ADCC da molécula de ligação de antígenos deve-se a um aumento da afinidade da molécula de ligação de antígenos para CEA ligado à membrana, tal como por meio de maturação por afinidade ou outros métodos de aumento da afinidade (vide Tang et ai, J. lmmuno/. 2007, 179: 2815-2823, cujo teor total é incorporado ao presente como referência). Em uma outra realização, a molécula de ligação de antígenos compreende uma região Fc que é glicoprojetada. Em um outro aspecto, a presente invenção também se refere a métodos de projeção dessas moléculas de ligação de antígenos e seu uso no tratamento de doenças, particularmente distúrbios da proliferação celular em que CEA é expresso, particularmente em que CEA é expresso anormalmente (tal como sobre-expresso ou expresso em um padrão diferente na célula) em comparação com tecido normal do mesmo tipo de célula. Esses distúrbios incluem, mas sem limitações, câncer colorretal, NSCLC (câncer de pulmão de células não pequenas), câncer gástrico, câncer pancreático e câncer de mama. Os níveis de expressão de CEA podem ser determinados por meio de métodos conhecidos na técnica e os 5 descritos no presente (tais como por meio de ensaio imuno-histoquímico, ensaio de imunofluorescência, ensaio de imunoenzimas, ELISA, citometria de fluxo, radioimunoensaio, Western Blot, ligação de ligantes, atividade de quinase etc.).

Em um outro aspecto, a presente invenção também se refere a um polinucleotídeo isolado que compreende uma sequência que codifica um 1o polipeptídeo que compreende uma ou mais (tal como uma, duas, três, quatro, cinco ou seis) regiões determinantes de complementaridade do anticorpo murino PR1A3 ou suas variantes ou formas truncadas que contêm pelo menos os resíduos de determinação da especificidade para as ditas regiões determinantes de complementaridade. Tipicamente, esses polinucleotídeos isolados codificam um ou mais polipeptídeos de fusão que formam uma molécula de ligação de antígenos. Em uma realização, o polinucleotídeo compreende uma sequência que codifica uma ou mais (tal como uma, duas, três, quatro, cinco ou seis) das CDRs descritas na Tabela 2 abaixo, que compreende os resíduos das CDRs que reterão a ligação específica. Em uma realização, o polinucleotídeo compreende uma sequência que codifica pelo menos três CORs de cadeia pesada (tais como HCDR1, HCDR2 e HCOR3) e/ou três CDRs de cadeia leve (tais como LCDR1, LCDR2 e LCDR3) da Tabela 2 ou suas variantes ou formas truncadas que contêm pelo menos os resíduos de determinação da especificidade para cada uma das ditas três regiões determinantes de complementaridade. Em uma realização mais específica, o polinucleotídeo codifica um polipeptídeo que compreende três CDRs de cadeia pesada (tais como HCDR 1, HCDR2 e HCDR3) e três CDRs de cadeia leve (tais como LCDR1, LCDR2 e LCDR3) da Tabela 2. Em uma outra realização, o polinucleotídeo codifica um polipeptídeo que compreende a(s) região(ões)

variável(is) de uma cadeia leve e/ou pesada de anticorpo.

Os polinucleotídeos que codificam os polipeptídeos de região variável de cadeia leve e pesada podem ser expressos em um ou mais vetores de expressão.

Em uma realização mais específica, o polinucleotídeo que codifica uma região variável de cadeia leve e/ou

5 de cadeia pesada é selecionado a partir do grupo de polinucleotídeos apresentado na Tabela 5 ou uma de suas combinações, em que as regiões variáveis de cadeia leve e pesada não são codificadas por uma combinação de SEQ lO No 11 e SEQ

10 No 115 ou SEQ 10 No 112 e SEQ 10 No 116. Em uma realização, os polipeptídeos de região variável de cadeia leve e pesada codificados pelos

1o polinucleotídeos combinam-se para formar um anticorpo quimérico, mais especificamente um anticorpo humanizado.

Em uma realização específica, em que o polinucleotídeo compreende uma sequência que codifica COR 1 de cadeia pesada de PR1A3 ou uma de suas variantes, o dito polinucleotídeo codifica um glutamato substituído por uma valina na posição Kabat 31. Em uma outra realização, o polinucleotídeo compreende uma sequência que codifica uma região

Fc.

A presente invenção refere-se ainda aos polipeptídeos codificados por esses polinucleotídeos.

Em uma realização, o polipeptídeo codificado pelos polinucleotídeos ditos acima compreende uma região Fc.

Em uma realização mais específica, os polipeptídeos codificados pelos polinucleotídeos são glicoprojetados para que possuam um padrão alterado de glicosilação na região Fc.

Em uma realização específica, a afinidade para CEA ligado à membrana dos polipeptídeos codificados pelos polinucleotídeos aumenta em comparação com o anticorpo

PR1A3 parenta!. Em uma outra realização, o polipeptídeo codificado pelo polinucleotídeo apresenta aumento da atividade de ADCC.

Em uma realização, o aumento de ADCC do polipeptídeo codificado pelo polinucleotídeo deve-se a um aumento da afinidade do polipeptídeo para CEA ligado à membrana, tal como por meio de maturação por afinidade ou outros métodos de aumento da afinidade.

Em um outro aspecto, a presente invenção também se refere ao uso dos polipeptídeos

(tais como moléculas de ligação de antígenos) codificados pelos polinucleotídeos no tratamento de doenças, particularmente distúrbios da proliferação celular em que CEA é expresso, particularmente em que CEA é expresso anormalmente (tal como sobre-expresso ou expresso em um padrão diferente na célula) em 5 comparação com tecido normal do mesmo tipo de célula. Esses distúrbios incluem, mas sem limitações, câncer colorretal, NSCLC (câncer de pulmão de células não pequenas), câncer gástrico, câncer pancreático e câncer de mama. Os níveis de expressão de CEA podem ser determinados por meio de métodos conhecidos na técnica e os descritos no presente (tais como por meio de ensaio imuno-histoquímico, ensaio de imunofluorescência, ensaio de imunoenzimas, ELISA, citometria de fluxo, radioimunoensaio, Western Blot, ligação de lígantes, atividade de quinase etc.).

Em uma realização específica, a presente invenção refere-se a uma molécula de ligação de antígenos humanizada ou uma porção da mesma ou fragmentos específicos para CEA ligado à membrana que compreende uma região variável de cadeia pesada que compreende a sequência de qualquer um dentre SEQ lO No 101, 107 ou 188-206. Em uma outra realização, a presente invenção refere-se a uma molécula de ligação de antígenos humanizada ou uma porção da mesma ou fragmentos específicos para CEA ligado à membrana que compreende uma região variável de cadeia leve que compreende a sequência de qualquer um dentre SEQ lO No 105, 108 ou 207-216. Em uma realização específica, a molécula de ligação de antígenos humanizada ou uma porção da mesma ou fragmentos específicos para CEA ligado à membrana compreende uma região variável de cadeia pesada que compreende a sequência de qualquer um dentre SEQ 10 No 1O1, 107 ou 188-206 e uma região variável de cadeia leve que compreende a sequência de qualquer um dentre SEQ 10 No 105, 108 ou 207-216. Em uma realização, a molécula de ligação de antígenos humanizada compreende adicionalmente uma região constante de cadeia pesada humana e/ou uma região constante de cadeia leve humana. Essas regiões constantes são descritas no presente e conhecidas na técnica. Em uma realização mais específica, a molécula de ligação de antígenos humanizada compreende uma região Fc, mais especificamente uma região Fc que tenha sido glicoprojetada.

5 Métodos de humanização de anticorpos não humanos são bem conhecidos na técnica. ABMs humanizadas de acordo com a presente invenção podem ser preparadas, por exemplo, segundo os métodos de acordo com a Patente Norte-Americana no 5.225.539 de Winter, Patente Norte-Americana no

6.180.370 de Queen et ai ou a Patente Norte-Americana no 6.632.927 de Adair et ai, cujos teores são integralmente incorporados ao presente como referência.

Preferencialmente, anticorpo humanizado contém um ou mais resíduos de aminoácidos nele introduzidos a partir de fonte que não é humana. Estes resíduos de aminoácidos não humanos são frequentemente denominados resíduos "importados", que são tomados tipicamente de um domínio variável "importado". A humanização pode ser essencialmente realizada seguindo-se o método de Winter e colaboradores (Jones et ai, Nature, 321: 522-525 (1986); Riechmann et ai, Nature, 332: 323-327 (1988); Verhoeyen et ai, Science, 239: 1534-1536 (1988)), por meio da substituição de sequências de regiões hipervariáveis pelas sequências correspondentes de anticorpo humano. Consequentemente, esses anticorpos "humanizados" são anticorpos quiméricos (Patente Norte-Americana no

4.816.567), em que substancialmente menos de um domínio variável humano intacto foi substituído pela sequência correspondente de espécie não humana.

Tipicamente, os anticorpos humanizados são anticorpos humanos nos quais alguns resíduos de regiões hipervariáveis e possivelmente alguns resíduos de FR são substituídos por resíduos de locais análogos em anticorpos não humanos (tais como de roedores). Os anticorpos anti-CEA humanizados do presente compreenderão opcionalmente regiões constantes de uma imunoglobulina humana.

A seleção de domínios variáveis humanos de cadeia leve e pesada para projeção dos anticorpos humanizados é muito importante para reduzir a antigenicidade. Segundo o chamado método de "melhor adequação", a sequência do domínio variável de um anticorpo doador (tal como de roedor) é selecionada 5 em comparação com toda a biblioteca de sequências de domínio variável humanas conhecidas. A sequência humana que é a mais próxima da do doador (tal como roedor) é então aceita como a região de estrutura humana (FR) para o anticorpo humanizado (Sims et ai, J. lmmuno/., 151: 2296 (1993); Chothia et ai, J.

Mo/. Biol., 196: 901 (1987)). Um outro método de seleção da sequência de cadeia principal humana é a comparação da sequência de cada subregião individual da estrutura principal de doador (tal como roedor) completa (ou seja, FR1, FR2, FR3 e FR4) ou alguma combinação das subregiões individuais (tais como FR1 e FR2) contra uma biblioteca de sequências de região variável humanas conhecidas que correspondem àquela subregião de cadeia principal (tal como conforme determinado pela numeração de Kabat) e seleção da sequência humana para cada sub região ou combinação que é a mais próxima do roedor (Leung, Pedido de Patente Norte-Americano publicado no 2003/0040606A 1, publicado em 27 de fevereiro de 2003). Um outro método utiliza uma região de cadeia principal específica derivada da sequência de consenso de todos os anticorpos humanos de um subgrupo específico de cadeias leves ou pesadas (Carter et ai, Proc. Natl.

Acad. Sei. U. S. A., 89: 4285 (1992); Presta et ai, J. lmmunol., 151: 2623 (1993)).

Em uma realização, as regiões de cadeia principal humana são selecionadas a partir de uma série de sequências de linhagem de germens humana. Essas séries de sequências de linha de germens humanas podem ser encontradas em bancos de dados tais como IMGT ou VBase. Regiões de cadeia principal podem ser selecionadas individualmene (a FR1-3 selecionada para o receptor para as regiões variáveis de cadeia leve e/ou pesada das ABMs anti-CEA humanizadas, por exemplo, pode ser codificada por genes de linhagem de germens diferentes)

ou como parte da mesma linhagem de germens. Em uma realização mais específica, FR1-3 de cadeia pesada é codificada pela sequência de genes de linhagem de germens de imunoglobulina humana IGHV7_ 4_1*02 (Acesso no X62110, SEQ 10 N° 114). Em uma outra realização específica, FR1-3 de cadeia 5 leve é codificada pela sequência de genes de linhagem de germens de imunoglobulina humana IMGT_hVK_1_39 (Acesso no X59315, SEQ lO N° 118).

Em uma outra realização específica, FR4 de cadeia pesada é codificada pela sequência de genes de linhagem de germens JH6 (vide Acesso GenBank no M63030). Em uma outra realização específica, FR4 de cadeia leve é codificada pela sequência de genes de linhagem de germens JK2 (vide Acesso GenBank no X61584).

É geralmente desejável que moléculas de ligação de antígenos, tais como anticorpos e seus fragmentos, sejam humanizadas com retenção de alta afinidade para o antígeno e outras propriedades biológicas favoráveis.

Consequentemente, em uma realização, anticorpos humanizados são preparados por meio de análise das sequências parentais e diversos produtos humanizados conceituais, utilizando modelos tridimensionais das sequências parenta! e humanizada. Modelos de imunoglobulina tridimensionais são comumente disponíveis e familiares para os técnicos no assunto. São disponíveis programas de computador que ilustram e exibem estruturas conformacionais tridimensionais prováveis de possíveis sequências de imunoglobulina selecionadas. A análise dessas exibições ajuda a elucidar o papel provável dos resíduos no funcionamento da possível sequência de imunoglobulina, tal como a análise dos resíduos que influenciam a capacidade da imunoglobulina possível de ligar o seu antígeno.

Desta forma, os resíduos de FR podem ser selecionados e combinados a partir das sequências receptora e importada para atingir a característica de anticorpo desejada, tal como maior afinidade para o(s) antígeno(s) alvo. Geralmente, os resíduos da região hipervariável são direta e mais substancialmente envolvidos na influência da ligação de antígenos.

Em um aspecto, a presente invenção refere-se a moléculas de ligação de antígenos anti-CEA humanizados, maturados por afinidade e/ou variantes com propriedades desejáveis e características que incluem, mas sem 5 limitações: forte afinidade de ligação para o antígeno de CEA (particularmente, CEA ligado à membrana), embora não possua substancialmente nenhuma reatividade cruzada contra CEA solúvel; uma capacidade de indução da lise celular de células que expressam CEA in vitro e ex vivo, preferencialmente de forma dependente da dosagem; uma capacidade de inibir a adesão celular 1o mediada por CEA in vitro; uma capacidade de inibir o crescimento de tecidos tu morais e/ou induzir a regressão de tecidos tumorais (conforme demonstrado, por exemplo, em modelos tumorais (tais como xenoenxerto de camundongo)).

Conforme descrito no presente, em algumas realizações, moléculas de ligação de antígenos de acordo com a presente invenção possuem maior afinidade de ligação, devido, por exemplo, a maturação por afinidade de um anticorpo parenta! que compreende uma ou mais CDRs do anticorpo PR1A3. A afinidade das moléculas de ligação de antígenos de acordo com a presente invenção pode ser determinada por meio de métodos conhecidos na técnica e conforme descrito no presente. Em uma realização específica, moléculas de ligação de antígenos anti-CEA humanizadas ou variantes de acordo com a presente invenção ligam-se a CEA humano, preferencialmente CEA ligado à membrana, com valor de constante de afinidade monovalente (Ko) de não mais de cerca de 1 !JM a cerca de 0,001 nM, mais especificamente não mais de cerca de 800 nM a cerca de 1 nM e, ainda mais especificamente, não mais de cerca de 550 nM a cerca de 10 nM. Em uma realização específica, a molécula de ligação de antígenos anti-CEA variante é um anticorpo maturado por afinidade ou fragmento do mesmo que se liga a CEA ligado à membrana com valor de constante de afinidade monovalente (Ko) menor que cerca de 100 nM a cerca de 1O nM.

Em uma realização, a molécula de ligação de antígenos de acordo com a presente invenção se liga tipicamente ao mesmo epítopo conforme reconhecido pelo anticorpo de camundongo PR 1A3 ou é capaz de competir com o anticorpo PR1A pela ligação a CEA ligado à membrana. Para selecionar 5 anticorpos que se ligam ao epítopo sobre CEA humano ligado por um anticorpo de interesse (tal como os que bloqueiam a ligação do anticorpo PR1A3 a CEA humano), pode-se realizar um ensaio de bloqueio cruzado de rotina, tal como o descrito em Antibodies, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Ed.

Harlow e Lane (1988). Alternativamente, pode-se realizar mapeamento de epítopos, tal como conforme descrito em Champe et ai, J. Biol. Chem. 270: 1388- 1394 (1995) para determinar se o anticorpo se liga um epítopo de interesse. Em uma realização, moléculas que ligam antígeno variante específicas para CEA humano são projetadas a partir de uma molécula de ligação de antígenos anti-CEA parenta! que compreende pelo menos uma COR do anticorpo monoclonal PR1A3, em que o anticorpo anti-CEA parenta! se liga ao mesmo epítopo do anticorpo PR1A3 e é capaz de competir com PR1A3 pela ligação de antígenos. Em uma realização, a molécula de ligação de antígenos parentais compreende pelo menos uma, duas ou tipicamente três CDRs de cadeia pesada do anticorpo PR1A3; em outra realização, a molécula de ligação de antígenos parenta I compreende pelo menos uma, duas ou tipicamente três CDRs de cadeia leve do anticorpo PR1A3; em outra realização, a molécula de ligação de antígenos parenta! compreende as três CDRs de cadeia pesada e as três CDRs de cadeia leve do anticorpo PR1A3. Preferencialmente, quando a molécula de ligação de antígenos compreender HCDR1 de PR1A3, o dito HCDR1 compreende uma substituição de glutamato por vali na na posição Kabat 31. As ABMs variantes possuem tipicamente uma afinidade maior por CEA que o parenta!. Em uma realização, a ABM variante compreende uma região Fc. Em uma realização, a ABM variante é glicoprojetada. Em uma realização, a ABM variante possui atividade de AOCC mais alta em comparação com a ABM parenta!. Em uma realização específica, o AOCC mais alto é o resultado da maior afinidade atingida, por exemplo, por meio de maturação por afinidade da ABM parenta! para gerar a ABM variante. Em uma realização mais específica, o aumento de AOCC é de pelo 5 menos cerca de 40% a cerca de 100% em comparação com a dita molécula de ligação de antígenos parentais. Em uma outra realização específica, a ABM variante aumenta AOCC em pelo menos cerca de 10% a cerca de 100% em um ensaio de citotoxicidade in vítro. Em uma realização mais específica, a ABM variante é pelo menos cerca de dez vezes a cerca de mil vezes mais potente na 1o indução de AOCC em uma determinada concentração em comparação com o anticorpo murino PR1A3. Em uma outra realização específica, o aumento da atividade de AOCC é resultado da glicoprojeção da região Fc. Em uma outra realização específica, o aumento da atividade de AOCC é o resultado de uma combinação de aumento da afinidade e glicoprojeção.

Em uma realização, as moléculas de ligação de antígenos variantes de acordo com a presente invenção compreendem uma ou mais substituições de aminoácidos em pelo menos uma COR. O número de substituições de aminoácidos pode variar de uma a dez (tal como uma, duas, três, quatro, cinco, seis, sete, oito, nove ou dez), preferencialmente de duas a cinco (tal como duas, três, quatro ou cinco). Em uma realização, pelo menos uma COR de cadeia pesada compreende uma ou mais substituições de aminoácidos. Em uma outra realização, pelo menos uma COR de cadeia leve compreende uma ou mais substituições de aminoácidos. Em uma outra realização, pelo menos uma COR de cadeia pesada compreende uma ou mais substituições e pelo menos uma COR de cadeia leve compreende uma ou mais substituições. Preferencialmente, quando a molécula de ligação de antígenos compreender HCOR1 de PR1A3, o dito HCOR1 compreende uma substituição de glutamato por valina na posição Kabat 31.

Modificações substanciais das propriedades biológicas das moléculas de ligação de antígeno são atingidas por meio da seleção de substituições que difiram significativamente de efeito sobre a manutenção (a) da estrutura da cadeia principal de polipeptídeo na área da substituição, tal como na forma de folha ou em conformação helicoidal; (b) da carga ou hidrofobicidade da 5 molécula no local desejado; ou (c) do volume da cadeia lateral. Moléculas de ligação de antígeno variantes que compreendem substituições de aminoácidos podem possuir atividades biológicas aprimoradas, tais como afinidade de ligação de antígenos aprimorada e ADCC aprimorado, em comparação com a molécula de ligação de antígenos parenta!. Substituições de aminoácidos podem ser introduzidas por meio de diversos métodos conhecidos na técnica, que incluem, mas sem limitações, mutagênese dirigida a local e/ou maturação por afinidade da molécula de ligação de antígenos parentais, por exemplo, por meio de exibição de fagos.

A fim de identificar possíveis locais, tais como resíduos de regiões hipervariáveis para modificação, mutagênese de varrimento de alanina pode ser realizada para encontrar resíduos que contribuem significativamente para a ligação de antígenos. Alternativa ou adicionalmente, pode ser benéfico analisar uma estrutura de cristal do complexo de antígeno e anticorpo para identificar pontos de contato entre o anticorpo e CEA humano. Esses resíduos de contato e resíduos vizinhos são candidatos para substituição de acordo com métodos conhecidos na técnica e/ou descritos no presente. Após a geração dessas variantes, o quadro de variantes pode ser seleciondo por meio de métodos conhecidos na técnica e/ou descritos no presente e os anticorpos com propriedades superiores em um ou mais ensaios relevantes podem ser selecionados para desenvolvimento adicional.

Pode-se utilizar exibição de fagos para gerar um repertório de sequências de região hipervariável de uma molécula de ligação de antígenos parentais que contém mutação(ões) de aminoácidos aleatórios. Diversos locais de regiões hipervariáveis (tais como seis a sete locais) sofrem mutações, por exemplo, para gerar todas as substituições amino possíveis em cada local.

Alternativamente, pode-se realizar mutagênese aleatória sobre regiões variáveis de cadeia leve e/ou pesada. Mutações podem ser geradas por meio de métodos 5 conhecidos na técnica, incluindo, mas sem limitações, o uso de primers de mutagênese, controle da quantidade de ciclos e uso de análogos de nucleotídeos mutagênicos 8-oxo-dGTP e dPTP durante amplificação por PCR. As variantes de anticorpos geradas desta forma são exibidas de maneira mo nova lente a partir de partículas de fagos filamentosos na forma de fusões para o produto de gene 111 de M13 embalado em cada partícula. As variantes exibidas de fagos são selecionadas em seguida pelas suas atividades biológicas (tais como afinidade de ligação) conforme descrito no presente e os candidatos que possuem uma ou mais atividades aprimoradas serão utilizados para desenvolvimento adicional.

Métodos de projeção de bibliotecas de exibição de fagos podem ser encontrados em Huse et ai, Science, 246: 1275-1281 (1989); Proc. Natl. Acad. Sei. U. S. A., 88: 4363-4366 (1991), cujo teor é incorporado ao presente como referência. Um método alternativo de identificação de moléculas de ligação de antígenos maturados por afinidade pode ser encontrado, por exemplo, na Patente Norte- Americana no 7.432.063 de Balint et ai, cujo teor é integralmente incorporado ao presente como referência.

Em algumas realizações, as moléculas de ligação de antígenos de acordo com a presente invenção compreendem uma região Fc, preferencialmente uma região Fc humana. As sequências e estruturas de regiões Fc são conhecidas na técnica e foram caracterizadas. Em uma realização específica, a região constante humana é lgG1, conforme descrito em SEQ 10 No 121 e 122 e detalhado abaixo.

Sequência de nucleotídeos de lgG1 (SEQ ID No 121)

ACCAAGGGCCCATCGGTCTTCCCCCTGGCACCCTCCTCCAAGAGCACCTCTG GGGGCACAGCGGCCCTGGGCTGCCTGGTCAAGGACTACTTCCCCGAACCGG TGACGGTGTCGTGGAACTCAGGCGCCCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCC CGGCTGTCCTACAGTCCTCAGGACTCTACTCCCTCAGCAGCGTGGTGACCGT

GCCCTCCAGCAGCTTGGGCACCCAGACCTACATCTGCAACGTGAATCACAAG 5 CCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGAAAGCAGAGCCCAAATCTTGTGACAAAA

CTCACACATGCCCACCGTGCCCAGCACCTGAACTCCTGGGGGGACCGTCAG TCTTCCTCTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACCCTCATGATCTCCCGGACCCCT GAGGTCACATGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCACGAAGACCCTGAGGTCAAG TTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCGC GGGAGGAGCAGTACAACAGCACGTACCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCC TGCACCAGGACTGGCTGAATGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAACAA AGCCCTCCCAGCCCCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCC CGAGAACCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCGGGATGAGCTGACCAAG AACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGACATCG CCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGC CTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAAGCTCACCGT GGACAAGAGCAGGTGGCAGCAGGGGAACGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCAT GAGGCTCTGCACAACCACTACACGCAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCCGGGTA

AATGA Sequência de aminoácidos lgG1 (SEQ 10 No 122)

TKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSVVNSGALTSGVHTFPAVL QSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKAEPKSCDKTHTCPPC PAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNVVYVDGVEV HNAKTKPREEQYNSTYRWSVLTVLHQDVVLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKA KGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEVVESNGQPENNYKT

TPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK Variantes e isoformas da região Fc humana também são, entretanto, englobadas pela presente invenção. Regiões Fc variantes apropriadas para uso na presente invenção podem ser produzidas, por exemplo, de acordo com os métodos ensinados na Patente Norte-Americana no 6.737.056 de Presta (variantes de região Fc com função efetora alterada devido a uma ou mais modificações de aminoácidos); ou nos Pedidos de Patente Norte-Americanos no 60/439.498, 5 60/456.041, 60/514.549 ou WO 2004/063351 (regiões Fc variantes com aumento da afinidade de ligação devido a modificações de aminoácidos); ou no Pedido de Patente Norte-Americano no 10/672.280 ou WO 2004/099249 (variantes Fc com alteração da ligação para FcyR devido a modificações de aminoácidos), cujo teor é integralmente incorporado ao presente como referência. Em uma realização 1o específica, as ABMs anti-CEA e ABMs variantes compreendem uma região Fc que foi glicoprojetada para alterar a atividade de função efetora da ABM (reduzem, por exemplo, a fucosilação, aumentam a afinidade de ligação do receptor Fc, aumentam ADCC etc.). Métodos de glicoprojeção que podem ser utilizados são descritos em detalhes abaixo e são conhecidos na técnica).

Em uma realização, a molécula de ligação de antígenos de acordo com a presente invenção é conjugada a uma porção adicional, tal como uma radiomarcador ou uma toxina. Essas moléculas de ligação de antígenos conjugadas podem ser preparadas por meio de diversos métodos que são bem conhecidos na técnica. Conjugados de ABM anti-CEA de acordo com a presente invenção são descritos em detalhes abaixo no capítulo intitulado "Conjugados de Molécula de Ligação de Antígenos Anti-CEA".

POLIPEPTÍDEOS E POLINUCLEOTÍDEOS DE ABMs ANTt-CEA Em um aspecto, a presente invenção refere-se a moléculas de ligação de antígenos e polipeptídeos que possuem a mesma especificidade de ligação do anticorpo murino PR1A3 (tal como ligação ao mesmo epítopo de CEA ligado à membrana) e que possui atividades biológicas aprimoradas ou comparáveis (tais como maior afinidade para CEA ligado à membrana e/ou ADCC aprimorado). Em uma realização, a molécula de ligação de antígenos compreende uma ou mais das CDRs descritas na Tabela 2 abaixo. Em uma realização mais específica, a molécula de ligação de antígenos compreende três CDRs de cadeia pesada da Tabela 2 abaixo. Em uma outra realização específica, a molécula de ligação de antígenos compreende três CDRs de cadeia leve da Tabela 2 abaixo.

5 Em uma outra realização específica, a presente invenção refere-se a uma molécula de ligação de antígenos específica para CEA humano ligado à membrana, que compreende: (a) uma sequência de CDR1 de cadeia pesada selecionada a partir do grupo que consiste em: SEQ lO No 1, SEQ lO No 2, SEQ ID No 3, SEQ ID No 5, SEQ ID No 6, SEQ ID No 7, SEQ ID No 8, SEQ ID No 9, SEQ ID No 10, SEQ ID No 11 e SEQ ID No 12; (b) uma sequência de CDR2 de cadeia pesada selecionada a partir do grupo que consiste em: SEQ ID No 13, SEQ ID No 14, SEQ ID No 15, SEQ ID No 16, SEQ ID No 17, SEQ ID No 18, SEQ ID No 19, SEQ lO No 20, SEQ lO No 21, SEQ lO No 22, SEQ ID No 23 e SEQ lO No 24; e (c) uma sequência de CDR3 de cadeia pesada selecionada a partir do grupo que consiste em: SEQ ID No 25, SEQ ID No 26, SEQ ID No 27, SEQ ID No 28, SEQ 10 No 29, SEQ lO No 30, SEQ ID No 31, SEQ lO No 32, SEQ lO No 33, SEQ lO No 34 e SEQ lO No 35. Em uma outra realização específica, a presente invenção refere- se a uma molécula de ligação de antígenos específica para CEA humano ligado à membrana, que compreende: (a) uma sequência de CDR1 de cadeia leve selecionada a partir do grupo que consiste em: SEQ lO No 36, SEQ lO No 37, SEQ ID No 38, SEQ lO No 39, SEQ 10 No 40, SEQ 10 No 41, SEQ lO No 42, SEQ lO No 43, SEQ 10 No 44 e SEQ ID No 45; (b) uma sequência de COR de cadeia leve selecionada a partir do grupo que consiste em: SEQ lO No 46, SEQ ID No 47, SEQ ID No 48, SEQ ID No 49, SEQ ID No 50, SEQ ID No 51, SEQ lO No 52, SEQ lO No 53, SEQ lO No 54 e SEQ lO No 55; e (c) uma CDR3 de cadeia leve de SEQ lO No

56. Em uma realização específica, a molécula de ligação de antígenos não possui reatividade cruzada substancial contra CEA humano solúvel. Em uma outra realização, a molécula de ligação de antígenos compreende uma região constante de cadeia leve e/ou pesada humana. Em uma realização, por exemplo, a molécula de ligação de antígenos compreende uma região Fc. Em uma realização mais específica, a molécula de ligação de antígenos compreende uma região Fc que foi glicoprojetada. A presente invenção também se refere a polinucleotídeos que 5 codificam qualquer uma das moléculas de ligação de antígenos de acordo com a presente invenção específicos para CEA humano ligado à membrana.

Em um aspecto, a presente invenção refere-se a uma molécula de ligação de antígenos específica para CEA humano ligado à membrana que compreende uma região variável de cadeia pesada e/ou uma região variável de cadeia leve. Em uma realização, a região variável de cadeia pesada compreende um polipeptídeo que possui a sequência de SEQ ID No 101. Em uma outra realização, a região variável de cadeia pesada compreende um polipeptídeo que possui pelo menos cerca de 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% de identidade para a sequência de SEQ ID No 101. Em uma realização, a região variável de cadeia leve compreende um polípeptídeo que possui a sequência de SEQ ID No 105.

Em uma outra realização, a região variável de cadeia pesada compreende um polipeptídeo que possui pelo menos cerca de 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% de identidade para a sequência de SEQ ID No 105.

Em uma realização, a molécula de ligação de antígenos específica para CEA humano ligado à membrana compreende uma região variável de cadeia pesada e/ou uma região variável de cadeia leve. Em uma realização específica, a região variável de cadeia pesada compreende um polipeptídeo que possui a sequência de SEQ ID No 4 conforme segue: 1 2 3 4

QVQLVQSGSELKKPGASVKVSCKASGYTFTEX X MX WVRQAPGQGLEWMGX 8 9 INTKX5 GEAX 6YX7 EEFKGRFVFSLDTSVSTAYLQISSLKAEDTAVYYCARWDX X X 1oyx11X12X13X14DYWGQGTTVTVSS 4 em que X 1é You F; X 2é Sou G; X 3 é N ou S; X é Wou Y; X é N, T 5 ou S·' X6 é T ou N·, X7 é V ou 1·, X8 é F ou A ' X9 é Y ' A , V ' F ou S·' X10 é O' H, W ' E ou Y; X11 é V, L ou F; X12 é E, K ou Q; X13 é A ou T; e X14 é M ou L.

Em uma realização específica, a região variável de cadeia leve compreende um polipeptideo que possui a sequência de SEQ 10 No 11 conforme 5 segue: OIQMTQSPSSLSASVGORVTITCKASX 15X16X17 X18X19X20VAWYQQKPGKAPKX 21 L IYX22ASX 23X24 X25 X26 GVPSRFSGSGSGTOFTLTISSLQPEOFATYYCHQYYTYPLF

TFGQGTKLEIK em que X15 é Q, A, K ou H; X16 é N, A, Y, I, K, T ou F; X17 é V, A, G ou M; X18 é G, S, T ou L; X19 é T, N, P ou A; X20 é N ou Y; X21 é P ou L; X22 éS, L ou W; X23 é Y, N ou H; X24 é R, L, P ou H; X25 é Y, S, Q, K, E, F ou P; e X26 éS, G, I ou R.

Em uma outra realização específica, a região variável de cadeia pesada compreende um polipeptídeo que possui a sequência de SEQ 10 No 107.

Em uma outra realização específica, a região variável de cadeia pesada compreende um polipeptídeo que possui uma sequência que é pelo menos cerca de 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% idêntica à sequência de SEQ IO No 107. Em uma outra realização específica, a região variável de cadeia leve de antígeno compreende um polipeptídeo que possui a sequência de SEQ lO No 108.

Em uma outra realização específica, a região variável de cadeia leve compreende uma sequência que é pelo menos cerca de 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% idêntica à sequência de SEQ 10 No 108. Em uma realização, a molécula de ligação de antígenos compreende um polipeptídeo de cadeia pesada que é pelo menos cerca de 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% idêntico a uma sequência selecionada a partir do grupo que consiste em: SEQ lO No 101, 107 e 188 a 206 e um polipeptídeo de cadeia leve que é pelo menos cerca de 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% idêntico a uma sequência selecionada a partir do grupo que consiste em: SEQ lO No 105, 108 e

207 a 216. Uma molécula de ligação de antígenos que compreende a região variável de cadeia leve e/ou pesada é específica para CEA, particularmente CEA ligada à membrana. Em uma realização, uma molécula de ligação de antígenos que compreende a região variável de cadeia leve e/ou pesada não possui 5 substancialmente nenhuma reatividade cruzada contra CEA solúvel. Em uma outra realização, a cadeia pesada compreende adicionalmente uma região Fc. Em uma realização específica, a região Fc foi glicoprojetada para possuirfucosilação reduzida dos oligossacarídeos N-ligados conforme descrito com detalhes abaixo.

Em um aspecto, a presente invenção também se refere a um polipeptídeo isolado que compreende uma ou mais CORs descritas na Tabela 2.

Em uma realização, o polipeptídeo isolado compreende: sequência de COR 1 de cadeia pesada selecionada a partir do grupo que consiste em: SEQ lO No 1, SEQ 10 No 2, SEQ lO No 3, SEQ lO No 5, SEQ lO No 6, SEQ lO No 7, SEQ lO No 8, SEQ 10 No 9, SEQ 10 No 10, SEQ 10 No 11 e SEQ 10 No 12; (b) uma sequência de CDR2 de cadeia pesada selecionada a partir do grupo que consiste em: SEQ 10 No 13, SEQ 10 No 14, SEQ 10 No 15, SEQ 10 No 16, SEQ 10 No 17, SEQ 10 No 18, SEQ lO No 19, SEQ lO No 20, SEQ lO No 21, SEQ lO No 22, SEQ lO No 23 e SEQ lO No 24; e (c) uma sequência de COR3 de cadeia pesada selecionada a partir do grupo que consiste em: SEQ 10 No 25, SEQ 10 No 26, SEQ 10 No 27, SEQ 10 No 28, SEQ lO No 29, SEQ lO No 30, SEQ lO No 31, SEQ lO No 32, SEQ lO No 33, SEQ 10 No 34 e SEQ 10 No 35; Em uma realização, o polipeptídeo isolado compreende uma sequência que é pelo menos cerca de 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% idêntica à sequência de SEQ 10 No 107. Em uma outra realização, a presente invenção refere-se a um polipeptídeo que compreende: (a) uma sequência de CDR1 de cadeia leve selecionada a partir do grupo que consiste em: SEQ 10 No 36, SEQ 10 No 37, SEQ ID No 38, SEQ 10 No 39, SEQ lO No 40, SEQ lO No 41, SEQ lO No 42, SEQ lO No 43, SEQ lO No 44 e SEQ 10 No 45; (b) uma sequêncía de COR de cadeia leve selecionada a partir do grupo que consiste em: SEQ 10 No 46, SEQ 10 No 47, SEQ 10 No 48, SEQ 10 No 49, SEQ lO No 50, SEQ lO No 51, SEQ lO No 52, SEQ lO No 53, SEQ lO No 54 e SEQ 10 No 55; e (c) uma CDR3 de cadeia leve de SEQ 10 No 56. Em uma realização, o polipeptídeo isolado compreende uma sequência que é pelo menos 5 cerca de 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% idêntica à sequência de SEQ 10 No 108. Em um outro aspecto, a presente invenção também se refere a polinucleotídeos que codificam qualquer um desses polipeptídeos e moléculas de ligação de antígenos que compreendem qualquer um desses polipeptídeos. Uma molécula de ligação de antígenos que compreende o polipeptídeo é específica para CEA, particularmente CEA ligado à membrana. Em uma realização, a molécula de ligação de antígenos não possui reatividade cruzada substancial contra CEA humano solúvel. Em uma realização, o polipeptídeo compreende adicionalmente uma região constante de cadeia leve e/ou pesada. Em uma outra realização, o polipeptídeo compreende uma região Fc, mais especificamente uma região Fc glicoprojetada. Em uma realização específica, a região Fc foi glicoprojetada para possuir fucosilação reduzida dos oligossacarídeos N-ligados conforme descrito com detalhes abaixo.

Em um outro aspecto, a presente invenção refere-se adicionalmente a polinucleotídeos isolados que codificam moléculas de ligação de antígenos específicas para CEA humano ligado à membrana. Em uma realização, o polinucleotídeo isolado compreende uma ou mais das sequências de COR exibidas na Tabela 3 abaixo ou uma de suas combinações, em que o polinucleotídeo codifica um polipeptídeo que, como parte de uma molécula de ligação de antígenos, se liga especificamente a CEA, particularmente a CEA ligado à membrana. Em uma realização, o polinucleotídeo isolado compreende uma sequência que é pelo menos cerca de 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% idêntica a uma ou mais das sequências de região variável exibidas na Tabela 5. Em uma realização, a presente invenção refere-se a uma composição que compreende um primeiro polinucleotídeo isolado que compreende uma sequência que é pelo menos cerca de 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% idêntica a uma sequência selecionada a partir do grupo que consiste em SEQ 10 No 113, 119 e 159-177 e um segundo 5 polinucleotídeo isolado que compreende uma sequência que é pelo menos cerca de 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% idêntica a uma sequência selecionada a partir do grupo que consiste em SEQ ID No 117, 120 e 178-187. Em uma realização, o polinucleotídeo codifica uma cadeia pesada que compreende uma região variável e uma região constante (tal como uma região constante de lgG ou fragmento do mesmo, particularmente uma região constante lgG que compreende uma região Fc). Em uma realização, o polinucleotídeo codifica uma cadeia leve que compreende uma região variável e uma região constante (tal como uma região constante capa ou lambda). Em uma realização, moléculas de ligação de antígenos codificadas por esses polinucleotídeos isolados não possuem reatividade cruzada substancial contra CEA humano solúvel.

Em uma outra realização, a presente invenção também engloba um polinucleotídeo isolado que compreende uma sequência que codifica um polipeptídeo que contém uma sequência que é pelo menos cerca de 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% idêntica a uma sequência selecionada a partir do grupo que consiste em: SEQ lO No 101, 105, 107, 108 e 188-216 com substituições de aminoácidos conservadoras, em que uma molécula de ligação de antígeno que compreende o polipeptídeo (uma molécula de ligação de antígeno que compreende um polipeptídeo, por exemplo, que é pelo menos cerca de 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% idêntico a uma sequência selecionada a partir do grupo que consiste em: SEQ lO No 101, 107 e 188 a 206 e um polipeptídeo que é pelo menos cerca de 80%,85%,90%,95%,96%,97%,98%, 99% ou 100% idêntico a uma sequência selecionada a partir do grupo que consiste em SEQ 10 No 105, 108 e 207-216) liga-se especificamente a CEA, particularmente CEA ligado à membrana. Em uma realização, o polipeptídeo compreende adicionalmente uma região constante humana. Em uma realização específica, o 5 polipeptídeo compreende uma região Fc humana. Em uma realização mais específica, a região Fc é uma região Fc de lgG glicoprojetada.

Em uma realização, a presente invenção refere-se a um polinucleotídeo que compreende: (a) uma sequência que codifica uma CDR1 de cadeia pesada a partir do grupo que consiste em SEQ lO No 57-59 e 61, (b) uma sequência de CDR2 da cadeia pesada selecionada a partir do grupo que consiste em SEQ lO No 62-66 e (c) uma sequência de CDR3 de cadeia pesada selecionada a partir do grupo que consiste em SEQ lO No 67-77. Em uma outra realização, a presente invenção refere-se a um polinucleotídeo que compreende: (a) uma sequência de COR 1 de cadeia leve selecionada a partir do grupo que consiste em SEQ lO No 78-88, (b) uma sequência de CDR2 de cadeia leve selecionada a partir do grupo que consiste em SEQ 10 No 89-97 e (c) uma sequência de CDR3 de cadeia leve de SEQ 10 No 98.

TABELA2 COR Sequência de Aminoácidos SEQIDW EFGMN 1 EYGMN 2 Kabat EYSMN 3 CDR1 EFGMS 5 de GYTFTEF 6 Chothia cadeia GYTFTEY 7 pesada GYTFTEFGMN 8 GYTFTEYGMN 9 AbM GYTFTEYSMN 10 GYTFTEFGMS 12

COR Sequência de Aminoácidos SEQIDW

WINTKTGEATYVEEFKG 13 WINTKTGEATYIEEFKG 14 Kabat WINTKSGEATYVEEFKG 15 YINTKNGEANYVEEFKG 16 CDR2 WINTKNGEATYIEEFKG 17 de NTKTGEAT 18 cadeia Chothia NTKSGEAT 19 pesada NTKNGEAN 20 WINTKTGEAT 21 WINTKSGEAT 22 AbM YINTKNGEAN 23 WINTKNGEAT 24 WDFYDYVEAMDY 25 WDFYHYVEAMDY 26 WDFVDYVEAMDY 27 WDFYWYVEAMDY 28 CDR3 Kabat WDAFEYVKALDY 29 de Chothia WDFFEYFKTMDY 30 cadeia eAbM WDFFYYVQTMDY 31 pesada WDFSYYVEAMDY 32 WDFAHYFQTMDY 33 WDFAYYFQTMDY 34

WDFAYYLEAMDY 35 KASQNVGTNVA 36 KASANVGNNVA 37 KASKNVGTNVA 38 CDR1 de cadeia KASAAVGTYVA 39 leve KASQYASTNVA 40 KASHNVGTNVA 41 KASQIMGPNVA 42 KASQIVGTNVA 43

COR Sequência de Aminoácidos SEQ 10 W KASQKVLTNVA 44 KASQTVSANVA 45 SASYRYS 46 YLASNLSG 47 YLASYPQI 48 YSASYRKR 49 COR2 de cadeia YWASYRYS 50 leve YSASHRYS 51 YLASYHES 52 YSASHRPS 53 YLASYRYS 54 YLASYRYR 55 COR3 de cadeia HQYYTYPLFT 56 leve TABELA 3 COR Sequência de Nucleotídeos SEQ 10 No GGATACACCTTCACTGAGTTTGGAATGAAC 57 COR1 de GGATACACCTTCACTGAGTATGGTATGAAC 58 cadeia GGATACACCTTCACTGAGTATTCTATGAAC 59 pesada GGATACACCTTCACTGAGTTTGGAATGAGC 61 TGGATAAACACCAAAACTGGAGAGGCAACATATGTTGA 62 COR2 de AGAGTTT AAGGGA cadeia TGGATAAACACCAAAACTGGAGAGGCAACATATATTGA 63 pesada AGAGTTTAAGGGA TGGATAAACACCAAAAGTGGAGAGGCAACATATGTTGA 64

AGAGTTTAAGGGA TATATAAACACCAAAAATGGAGAGGCAAACTATGTTGA 65

AGAGTTT AAGGGA TGGATAAACACCAAAAATGGAGAGGCAACATATATTGA 66

COR Sequência de Nucleotídeos SEQIDW

AGAGTTTAAGGGA CDR3 de TGGGACTTCTATGATTACGTGGAGGCTATGGACTAC 67 cadeia TGGGACTTCTATCATTACGTGGAGGCTATGGACTAC 68 pesada TGGGACTTCGTGGATTACGTGGAGGCTATGGACTAC 69 TGGGACTTCTATTGGTACGTGGAGGCTATGGACTAC 70 TGGGACGCCTTTGAGTACGTGAAGGCGCTGGACTAC 71 TGGGATTTCTTTGAGTATTTTAAGACTATGGACTAC 72 TGGGACTTTTTTTATTACGTGCAGACTATGGACTAC 73 TGGGATTTTTCTTATTACGTTGAGGCGATGGACTAC 74 TGGGACTTTGCTCATTACTTTCAGACTATGGACTAC 75 TGGGACTTCGCTTATTACTTTCAGACTATGGACTAC 76 TGGGATTTCGCGTATTACCTTGAGGCTATGGACTAC 77 CDR1 de AAGGCCAGTCAGAATGTGGGTACTAATGTTGCC 78 cadeia AAGGCCAGTGCCAATGTGGGTAATAATGTTGCC 79 leve AAGGCCAGTAAGAATGTGGGGACTAATGTTGCG 80 AAGGCCAGTGCGGCTGTGGGTACGTATGTTGCG 81 AAGGCCAGTCAGATAGCGAGTACTAATGTTGCC 82 AAGGCCAGTCACAATGTGGGTACCAACGTTGCG 83 AAGGCCAGTCAGATTATGGGTCCTAATGTTGCG 84 AAGGCCAGTCAAATTGTGGGTACTAATGTTGCG 85 AAGGCCAGTCAGAAGGTGCTTACTAATGTTGCG 86 AAGGCCAGTCAGACTGTGAGTGCTAATGTTGCG 87 CDR2 de TATTCGGCATCCTACCGCTACAGT 88 cadeia TATTTGGCCTCCAACCTCTCCGGT 89 leve TACCTGGCATCCTACCCCCAGATT 90 TATTCGGCATCCTACCGCAAAAGG 91

COR Sequência de Nucleotídeos SEQ 10 No TATTGGGCATCCTACCGCTATAGT 92 TATTCGGCATCCCACCGGTACAGT 93 TATTTGGCATCCTACCACGAAAGT 94 TATTCGGCATCCCACCGTCCCAGT 95 TATTTGGCATCCTACCGCTACAGT 96 TATTTGGCATCCTACCGCTACAGA 97 CDR3 de CACCAATATTACACCTATCCTCTATTCACG 98 cadeia leve TABELA 4 CONSTRUÇÃO Sequência de Peptídeos SEQID No PR1A3 VH QVKLQQSGPELKKPGETVKISCKASGYTFTEFGMNWVK 99

QAPGKGLKWMGWINTKTGEATYVEEFKGRFAFSLETSA TTAYLQINNLKNEDTAKYFCARWDFYDYVEAMDYWGQG

TTVTVSS pEM1496 QVQLVQSGSELKKPGASVKVSCKASGYTFTEFGMNWV 100 huPR1A3 RQAPGQGLEWMGWI NTKTGEATYVEEFKGRFVFSLDTS

VH VSTA YLQISSLKADDTAVYYCARWDFYDYVEAMDYWGQ

GTTVTVSS CH?A QVQLVQSGSELKKPGASVKVSCKASGYTFTEFGMNWV 101

RQAPGQGLEWMGWI NTKTGEATYVEEFKGRFVFSLDTS VSTAYLQISSLKAEDTA VYYCARWDFYDYVEAMDYWGQ

GTTVTVSS IGHV7-4- QVQLVQSGSELKKPGASVKVSCKASGYTFTSYAMNWV 102 1*02 RQAPGQGLEWMGWI NTNTGNPTYAQGFTGRFVFSLDT

SVSTAYLQISSLKAEDTAVYYCAR PR1A3 VL DIVMTQSQRFMSTSVGDRVSVTCKASQNVGTNVAWYQ 103

QKPGQSPKALIYSASYRYSGVPDRFTGSGSGTDFTLTIS NVQSEDLAEYFCHQYYTYPLFTFGSGTKLEMKRT

CONSTRUÇÃO Sequência de Peptídeos SEQIDW pEM1495 DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCKASQNVGTNVAWYQQ 104 huPR1A3 VL KPGKAPKLLIYSASYRYSGVPSRFSGSGSGTDFTFTISSL

QPEDIATYYCHQYYTYPLFSFGQGTKVEI KR CL1A DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCKASQNVGTNVAWYQQ 105

KPGKAPKLLIYSASYRYSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSL

QPEDF ATYYCHQYYTYPLFTFGQGTKLEI K IMGT_hVK DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSISSYLNWYQQK 106 - 1_39 PGKAPKLLIYAASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQ

PEDFATYYCQQSYSTP CH7 rF9 QVQLVQSGSELKKPGASVKVSCKASGYTFTEYGMNWV 107

RQAPGQGLEWMGWINTKSGEATYVEEFKGRFVFSLDTS VSTAYLQISSLKAEDTAVYYCARWDFYDYVEAMDYWGQ

GTTVTVSS CLA1 rH11 DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCKASQTVSANVAWYQQ 108

KPGKAPKLLIYLASYRYRGVPSRFSGSGSGTDFTL TISSL

QPEDFATYYCHQYYTYPLFTFGQGTKLEIKRT PMS22 QVQLVQSGSELKKPGASVKVSCKASGYTFTEFGMNWV 188

RQAPGQGLEWMGWINTKTGEATYVEEFKGRFVFSLDTS VSTAYLQISSLKAEDTAVYYCARWDFYDYVEAMDYWGQ

GTTVTVSS 1C8 QVQLVQSGSELKKPGASVKVSCKASGYTFTEFGMNWV 189

RQAPGQGLEWMGWINTKTGEATYVEEFKGRFVFSLDTS VSTAYLQISSLKAEDTA VYYCARWDFYHYVEAMDYWGQ

GTTVTVSS 3E1 QVQLVQSGSELKKPGASVKVSCKASGYTFTEFGMNWV 190

RQAPGQGLEWMGWI NTKTGEATYVEEFKGRFVFSLDTS VSTAYLQISSLKAEDTAVYYCARWDFVDYVEAMDYWGQ GTTVTVSS

CONSTRUÇÃO Sequência de Peptídeos SEQIDW 207 QVQLVQSGSELKKPGASVKVSCKASGYTFTEFGMNVVV 191

RQAPGQGLEWMGWINTKTGEATYVEEFKGRFVFSLDTS VSTAYLQISSLKAEDTAVYYCARWDFYWYVEAMDYWGQ

GTTVTVSS Cadeia QVQLVQSGSELKKPGASVKVSCKASGYTFTEFGMNVVV 192 pesada RQAPGQGLEWMGWINTKTGEATYVEEFKGRFVFSLDTS maturada VSTAYLQISSLKAEDTAVYYCARWDFAHYFQTMDYWGQ por afinidade GTTVTVSS Cadeia QVQLVQSGSELKKPGASVKVSCKASGYTFTEFGMNWV 193 pesada RQAPGQGLEWMGWI NTKTGEATYVEEFKGRFVFSLDTS maturada VSTAYLQISSLKAEDTAVYYCARWDFAYYFQTMDYWGQ por afinidade GTTVTVSS Cadeia QVQLVQSGSELKKPGASVKVSCKASGYTFTEFGMNVVV 194 pesada RQAPGQGLEWMGWI NTKTGEATYVEEFKGRFVFSLDTS maturada VSTAYLQISSLKAEDTAVYYCARWDFAYYLEAMDYWGQ por afinidade GTTITVSS H3 Pleno (5) QVQLVQSGSELKKPGASVKVSCKASGYTFTEFGMSVVV 195 19 RQAPGQGLEWMGWI NTKTGEATYVEEFKGRFVFSLDTS

VSTAYLQISSLKAEDTAVYYCARWDAFEYVKALDYWGQ

GTTVTVSS H3 Pleno (5) QVQLVQSGSELKKPGASVKVSCKASGYTFTEFGMNWV 196 8 RQAPGQGLEWMGWI NTKTGEATYVEEFKGRFVFSLDTS

VSTA YLQISSLKAEDTAVYYCARWDFFEYFKTMDYWGQ

GTTVTVSS H3 Pleno (5) QVQLVQSGSELKKPGASVKVSCKASGYTFTEFGMNVVV 197 28 RQAPGQGLEWMGWINTKTGEATYVEEFKGRFVFSLDTS

VSTAYLQISSLKAEDTAVYYCARWDFFYYVQTMDYWGQ

GTTVTVSS H3 Pleno (5) QVQLVQSGSELKKPGASVKVSCKASGYTFTEFGMNVVV 198 27 RQAPGQGLEWMGWI NTKTGEATYVEEFKGRFVFSLDTS

VSTAYLQISSLKAEDTAVYYCARWDFSYYVEAMDYWGQ GTTVTVSS

CONSTRUÇÃO Sequência de Peptídeos SEQIDW Cadeia QVQLVQSGSELKKPGASVKVSCKASGYTFTEFGMNWV 199 pesada de RQAPGQGLEWMGWINTKTGEATYIEEFKGRFVFSLDTS H4E9 VSTAYLQISSLKAEDTAVYYCARWDFYDYVEAMDYWGQ

GTTVTVSS pAC14 (89) QVQLVQSGSELKKPGASVKVSCKASGYTFTEFGMNWV 200

RQAPGQGLEWMGWI NTKSGEATYVEEFKGRFVFSLDTS VSTAYLQISSLKAEDTAVYYCARWDFYDYVEAMDYWGQ

GTTVTVSS pAC15 (F9) QVQLVQSGSELKKPGASVKVSCKASGYTFTEYGMNWV 201

RQAPGQGLEWMGWI NTKSGEATYVEEFKGRFVFSLDTS VSTAYLQISSLKAEDTAVYYCARWDFYDYVEAMDYWGQ

GTTVTVSS H1/H2 (5) 2 QVQLVQSGSELKKPGASVKVSCKASGYTFTEYSMNWV 202

RQAPGQGLEWMGYINTKNGEANYVEEFKGRFVFSLDTS VSTAYLQISSLKAEDTAVYYCARWDFYDYVEAMDYWGQ

GTTVTVSS H1/H2 (5) 11 QVQLVQSGSELKKPGASVKVSCKASGYTFTEYGMNWV 203

RQAPGQGLEWMGWINTKNGEATYIEEFKGRFVFSLDTS VSTA YLQISSLKAEDTAVYYCARWDFYDYVEAMDYWGQ

GTTVTVSS H1/H2 (5) 13 QVQLVQSGSELKKPGASVKVSCKASGYTFTEFGMNWV 204

RQAPGQGLEWMGYINTKNGEANYVEEFKGRFVFSLDAS VSTAYLQISSLKAEDTAVYYCARWDFYDYVEAMDYWGQ

GTTVTVSS H1/H2 (5) 14 QVQLVQSGSELKKPGASVKVSCKASGYTFTEYGMNWV 205

RQAPGQGLEWMGYINTKNGEANYVEEFKGRFVFSLDTS VSTAYLQISSLKAEDTAVYYCARWDFYDYVEAMDYWGQ

GTTVTVSS H3 Pleno (5) QVQLVQSGSELKKPGASVKVSCKASGYTFTEFGMSWV 206 19 RQAPGQGLEWMGWINTKTGEATYVEEFKGRFVFSLDTS

VSTAYLQISSLKAEDTAVYYCARWDAFEYVKALDYWGQ GTTVTVSS

CONSTRUÇÃO Sequência de Peptídeos SEQIDW pAC21 (3A1) DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCKASANVGNNVAWYQQ 207

KPGKAPKLLIYLASNRSGGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSL

QPEDFATYYCHQYYTYPLFTFGQGTKLEIKRT pAC19 (2C6) DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCKASKNVGTNVAWYQQ 208

KPGKAPKPLIYLASYPQIGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSL

QPEDFATYYCHQYYTYPLFTFGQGTKLEI KRT pAC18 (2F1) DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCKASAAVGTYVAWYQQ 209

KPGKAPKLLIYSASYRKRGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSL

QPEDFATYYCHQYYTYPLFTFGQGTKLEI KRT pAC23 DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCKASQIASTNVAWYQQK 210 (2F11) PGKAPKLLIYWASYRYSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSL

QPEDFATYYCHQYYTYPLFTFGQGTKLEI KRT Cadeia leve DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCKASQNVGTNVAWYQQ 211 de H4E9 KPGKAPKPLIYSASYRYSGVPSRFSGSGSGTDFTLTI SSL

QPEDF ATYYCHQYYTYPLFTFGQGTKLEI KRT L2D2 DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCKASHNVGTNVAWYQQ 212

KPGKAPKLLIYSASHRYSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSL

QPEDFATYYCHQYYTYPLFTFGQGTKLEIKRT pAC6 (C1) DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCKASQIMGPNVAWYQQ 213

KPGKAPKLLIYLASYH ESGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSL

QPEDF ATYYCHQYYTYPLFTFGQGTKLEI KRT pAC7 (E1 O) DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCKASQIVGTNVAWYQQK 214

PGKAPKLLIYSASHRPSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQ

PEDFATYYCHQYYTYPLFTFGQGTKLEIKRT pAC12 (H?) DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCKASQKVLTNVAWYQQK 215

PGKAPKLLIYLASYRYSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQ PEDFATYYCHQYYTYPLFTFGQGTKLEIKRT

CONSTRUÇÃO Sequência de Peptídeos SEQIDW pAC13 (H11) DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCKASQTVSANVAWYQQ 216

KPGKAPKLLIYLASYRYRGVPSRFSGSGSGTDFTL TISSL

QPEDFATYYCHQYYTYPLFTFGQGTKLEIKRT TABELA 5 CONSTRUÇÃO Sequência de Nucleotídeos SEQIDW PR1A3 VH CAGGTGAAGCTGCAGCAGTCAGGACCTGAGTTGAAGA 111

AGCCTGGAGAGACAGTCAAGATCTCCTGCAAGGCTTC TGGATATACCTTCACAGAATTCGGAATGAACTGGGTGA AGCAGGCTCCTGGAAAGGGTTTAAAGTGGATGGGCTG GATAAACACCAAAACTGGAGAGGCAACATATGTTGAAG AGTTTAAGGGACGGTTTGCCTTCTCTTTGGAGACCTCT GCCACCACTGCCTATTTGCAGATCAACAACCTCAAAAA TGAGGACACGGCTAAATATTTCTGTGCTCGATGGGATT TCTATGACTATGTTGAAGCTATGGACTACTGGGGCCAA

GGGACCACCGTGACCGTCTCCTCA pEM1496 CAGGTGCAGCTGGTGCAATCTGGGTCTGAGTTGAAGA 112

AGCCTGGGGCCTCAGTGAAGGTTTCCTGCAAGGCTTC TGGATACACCTTCACTGAGTTGGAATGAACTGGGTGC GACAGGCCCCTGGACAAGGGCTTGAGTGGATGGGAT GGATAAACACCAAAACTGGAGAGGCAACATATGTTGAA GAGTTTAAGGGACGGTTTGTCTTCTCCTTGGACACCTC TGTCAGCACGGCATATCTGCAGATCAGCAGCCTAAAG GCTGACGACACTGCCGTGTATTACTGTGCGAGATGGG ACTTCTATGATTACGTGGAGGCTATGGACTACTGGGGC

CAAGGGACCACGGTCACCGTCTCCTCA CH7A CAGGTGCAATTGGTGCAATCTGGGTCTGAGTTGAAGA 113

AGCCTGGGGCCTCAGTGAAGGTTTCCTGCAAGGCTTC TGGATACACCTTCACTGAGTTTGGAATGAACTGGGTGC GACAGGCCCCTGGACAAGGGCTTGAGTGGATGGGAT GGATAAACACCAAAACTGGAGAGGCAACATATGTTGAA GAGTTTAAGGGACGGTTTGTCTTCTCCTTGGACACCTC TGTCAGCACGGCATATCTGCAGATCAGCAGCCTAAAG GCTGAAGACACTGCCGTGTATTACTGTGCGAGATGGG ACTTCTATGATTACGTGGAGGCTATGGACTACTGGGGC CAAGGGACCACGGTCACCGTCTCCTCA

CONSTRUÇÃO Sequência de Nucleotídeos SEQIDW IGHV? -4-1 *02 CAGGTGCAGCTGGTGCAATCTGGGTCTGAGTTGAAGA 114

AGCCTGGGGCCTCAGTGAAGGTTTCCTGCAAGGCTTC TGGATACACCTTCACTAGCTATGCTATGAATTGGGTGC GACAGGCCCCTGGACAAGGGCTTGAGTGGATGGGAT GGATCAACACCAACACTGGGAACCCAACGTATGCCCA GGGCTTCACAGGACGGTTTGTCTTCTCCTTGGACACCT CTGTCAGCACGGCATATCTGCAGATCAGCAGCCTAAA

GGCTGAGGACACTGCCGTGTATTACTGTGCGAGA PR1A3 VL GATATCGTGATGACCCAGTCTCAAAGATTCATGTCCAC 115

ATCAGTAGGAGACAGGGTCAGCGTCACCTGCAAGGCC AGTCAGAATGTGGGTACTAATGTTGCCTGGTATCAACA GAAACCAGGACAATCCCCTAAAGCACTGATTTACTCGG CATCCTACCGGTACAGTGGAGTCCCTGATCGCTTCACA GGCAGTGGATCTGGGACAGATTTCACTCTCACCATCA GCAATGTACAGTCTGAAGACTTGGCGGAGTATTTCTGT CACCAATATTACACCTATCCTCTATTCACGTTCGGCTC

GGGGACAAAGTTGGAAATGAAACGTACG pEM1495 GACATCCAGATGACTCAGAGCCCAAGCAGCCTGAGCG 116

CCAGCGTGGGTGACAGAGTGACCATCACCTGTAAGGC CAGTCAGAATGTGGGTACTAATGTTGCCTGGTACCAGC AGAAGCCAGGTAAGGCTCCAAAGCTGCTGATCTACTC GGCATCCTACCGGTACAGTGGTGTGCCAAGCAGATTC AGCGGTAGCGGTAGCGGTACCGACTTCACCTTCACCA TCAGCAGCCTCCAGCCAGAGGACATCGCCACCTACTA CTGCCACCAATATTACACCTATCCTCTATTCAGCTTCG

GCCAAGGGACCAAGGTGGAAATCAAACGT CL 1A GATATCCAGATGACCCAGTCTCCATCCTCCCTGTCTGC 117

ATCTGTGGGAGACAGAGTCACCATCACTTGCAAGGCC AGTCAGAATGTGGGTACTAATGTTGCCTGGTATCAGCA GAAACCAGGGAAAGCACCTAAGCTCCTGATCTATTCG GCATCCTACCGCTACAGTGGAGTCCCATCAAGGTTCA GTGGCAGTGGATCTGGGACAGATTTCACTCTCACCATC AGCAGTCTGCAACCTGAAGATTTCGCAACTTACTACTG TCACCAATATTACACCTATCCTCTATTCACGTTTGGCCA GGGCACCAAGCTCGAGATCAAG

CONSTRUÇÃO Sequência de Nucleotídeos SEQIDW IMGT_hVK_1 GACATCCAGATGACCCAGTCTCCATCCTCCCTGTCTGC 118 - 39 ATCTGTAGGAGACAGAGTCACCATCACTTGCCGGGCA

AGTCAGAGCATTAGCAGCTATTTAAATTGGTATCAGCA GAAACCAGGGAAAGCCCCTAAGCTCCTGATCTATGCT GCATCCAGTTTGCAAAGTGGGGTCCCATCAAGGTTCA GTGGCAGTGGATCTGGGACAGATTTCACTCTCACCATC AGCAGTCTGCAACCTGAAGATTTTGCAACTTACTACTG

TCAACAGAGTTACAGTACCCCT CH7 rF9 CAGGTGCAATTGGTGCAATCTGGGTCTGAGTTGAAGA 119

AGCCTGGGGCCTCAGTGAAGGTTTCCTGCAAGGCTTC TGGATACACCTTCACTGAGTATGGTATGAACTGGGTGC GACAGGCCCCTGGACAAGGGCTTGAGTGGATGGGAT GGATAAACACGAAATCTGGAGAGGCAACCTATGTTGAA GAGTTTAAGGGACGGTTTGTCTTCTCCTTGGACACCTC TGTCAGCACGGCATATCTGCAGATCAGCAGCCTAAAG GCTGAAGACACTGCCGTGTATTACTGTGCGAGATGGG ACTTCTATGATTACGTGGAGGCTATGGACTACTGGGGC

CAAGGGACCACGGTCACCGTCTCCTCAGCTAGC CLA1 rH11 GATATCCAGATGACCCAGTCTCCATCCTCCCTGTCTGC 120

ATCTGTGGGAGACAGAGTCACCATCACTTGCAAGGCC AGTCAGACTGTGAGTGCTAATGTTGCGTGGTATCAGCA GAAACCAGGGAAAGCACCTAAGCTCCTGATCTACTTG GCATCCTACCGCTACAGAGGAGTCCCATCAAGGTTCA GTGGCAGTGGATCTGGGACAGATTTCACTCTCACCATC AGCAGTCTGCAACCTGAAGATTTCGCAACTTACTACTG TCACCAATATTACACCTATCCTCTATTCACGTTTGGCCA

GGGCACCAAGCTCGAGATCAAGCGTACG PMS22 CAGGTGCAATTGGTGCAATCTGGGTCTGAGTTGAAGA 159

AGCCTGGGGCCTCAGTGAAGGTTTCCTGCAAGGCTTC TGGATACACCTTCACTGAGTTTGGAATGAACTGGGTGC GACAGGCCCCTGGACAAGGGCTTGAGTGGATGGGAT GGATAAACACCAAAACTGGAGAGGCAACATATGTTGAA GAGTTTAAGGGACGGTTTGTCTTCTCCTTGGACACCTC TGTCAGCACGGCATATCTGCAGATCAGCAGCCTAAAG GCTGAAGACACTGCCGTGTATTACTGTGCGAGATGGG ACTTCTATGATTACGTGGAGGCTATGGACTACTGGGGC CAAGGGACCACGGTCACCGTCTCCTCA

CONSTRUÇÃO Sequência de Nucleotídeos SEQIDW 1C8 CAGGTGCAATTGGTGCAATCTGGGTCTGAGTTGAAGA 160

AGCCTGGGGCCTCAGTGAAGGTTTCCTGCAAGGCTTC TGGATACACCTTCACTGAGTTTGGAATGAACTGGGTGC GACAGGCCCCTGGACAAGGGCTTGAGTGGATGGGAT GGATAAACACCAAAACTGGAGAGGCAACATATGTTGAA GAGTTTAAGGGACGGTTTGTCTTCTCCTTGGACACCTC TGTCAGCACGGCATATCTGCAGATCAGCAGCCTAAAG GCTGAAGACACTGCCGTGTATTACTGTGCGAGATGGG ACTTCTATCATTACGTGGAGGCTATGGACTACTGGGGC

CAAGGGACCACGGTCACCGTCTCCTCA 3E1 CAGGTGCAATTGGTGCAATCTGGGTCTGAGTTGAAGA 161

AGCCTGGGGCCTCAGTGAAGGTTTCCTGCAAGGCTTC TGGATACACCTTCACTGAGTTTGGAATGAACTGGGTGC GACAGGCCCCTGGACAAGGGCTTGAGTGGATGGGAT GGATAAACACCAAAACTGGAGAGGCAACATATGTTGAA GAGTTTAAGGGACGGTTTGTCTTCTCCTTGGACACCTC TGTCAGCACGGCATATCTGCAGATCAGCAGCCTAAAG GCTGAAGACACTGCCGTGTATTACTGTGCGAGATGGG ACTTCGTGGATTACGTGGAGGCTATGGACTACTGGGG

CCAAGGGACCACGGTCACCGTCTCCTCA 207 CAGGTGCAATTGGTGCAATCTGGGTCTGAGTTGAAGA 162

AGCCTGGGGCCTCAGTGAAGGTTTCCTGCAAGGCTTC TGGATACACCTTCACTGAGTTTGGAATGAACTGGGTGC GACAGGCCCCTGGACAAGGGCTTGAGTGGATGGGAT GGATAAACACCAAAACTGGAGAGGCAACATATGTTGAA GAGTTTAAGGGACGGTTTGTCTTCTCCTTGGACACCTC TGTCAGCACGGCATATCTGCAGATCAGCAGCCTAAAG GCTGAAGACACTGCCGTGTATTACTGTGCGAGATGGG ACTTCTATTGGTACGTGGAGGCTATGGACTACTGGGG CCAAGGGACCACGGTCACCGTCTCCTCA

CONSTRUÇÃO Sequência de Nucleotídeos SEQIDW Cadeia CAGGTGCAATTGGTGCAATCTGGGTCTGAGTTGAAGA 163 pesada AGCCTGGGGCCTCAGTGAAGGTTTCCTGCAAGGCTTC maturada por TGGATACACCTTCACTGAGTTTGGAATGAACTGGGTGC afinidade GACAGGCCCCTGGACAAGGGCTTGAGTGGATGGGAT

GGATAAACACCAAAACTGGAGAGGCAACATATGTTGAA GAGTTTAAGGGACGGTTTGTCTTCTCCTTGGACACCTC TGTCAGCACGGCATATCTGCAGATCAGCAGCCTAAAG GCTGAAGACACTGCCGTGTATTACTGTGCGAGATGGG ACTTTGCTCATTACTTTCAGACTATGGACTACTGGGGC

CAAGGGACCACGGTCACCGTCTCCTCA Cadeia CAGGTGCAATTGGTGCAATCTGGGTCTGAGTTGAAGA 164 pesada AGCCTGGGGCCTCAGTGAAGGTTTCCTGCAAGGCTTC maturada por TGGATACACCTTCACTGAGTTTGGAATGAACTGGGTGC afinidade GACAGGCCCCTGGACAAGGGCTTGAGTGGATGGGAT

GGATAAACACCAAAACTGGAGAGGCAACATATGTTGAA GAGTTTAAGGGACGGTTTGTCTTCTCCTTGGACACCTC TGTCAGCACGGCATATCTGCAGATCAGCAGCCTAAAG GCTGAAGACACTGCCGTGTATTACTGTGCGAGATGGG ACTTCGCTTATTACTTTCAGACTATGGACTACTGGGGC

CAAGGGACCACGGTCACCGTCTCCTCA Cadeia CAGGTGCAATTGGTGCAATCTGGGTCTGAGTTGAAGA 165 pesada AGCCTGGGGCCTCAGTGAAGGTTTCCTGCAAGGCTTC maturada por TGGATACACCTTCACTGAGTTTGGAATGAACTGGGTGC afinidade GACAGGCCCCTGGACAAGGGCTTGAGTGGATGGGAT

GGATAAACACCAAAACTGGAGAGGCAACATATGTTGAA GAGTTTAAGGGACGGTTTGTCTTCTCCTTGGACACCTC TGTCAGCACGGCATATCTGCAGATCAGCAGCCTAAAG GCTGAAGACACTGCCGTGTATTACTGTGCGAGATGGG ATTTCGCGTATTACCTTGAGGCTATGGACTACTGGGGC CAAGGGACCACGATCACCGTCTCCTCA

CONSTRUÇÃO Sequência de Nucleotídeos SEQIDW H3 Pleno (5) CAGGTGCAATTGGTGCAATCTGGGTCTGAGTTGAAGA 166 19 AGCCTGGGGCCTCAGTGAAGGTTTCCTGCAAGGCTTC

TGGATACACCTTCACTGAGTTTGGAATGAGCTGGGTGC GACAGGCCCCTGGACAAGGGCTTGAGTGGATGGGAT GGATAAACACCAAAACTGGAGAGGCAACATATGTTGAA GAGTTTAAGGGACGGTTTGTCTTCTCCTTGGACACCTC TGTCAGCACGGCATATCTGCAGATCAGCAGCCTAAAG GCTGAAGACACTGCTGTGTATTACTGTGCGAGATGGG ACGCCTTTGAGTACGTGAAGGCGCTGGACTACTGGGG

CCAAGGGACCACGGTCACCGTCTCCTCA H3 Pleno (5) CAGGTGCAATTGGTGCAATCTGGGTCTGAGTTGAAGA 167 8 AGCCTGGGGCCTCAGTGAAGGTTTCCTGCAAGGCTTC

TGGATACACCTTCACTGAGTTTGGAATGAACTGGGTGC GACAGGCCCCTGGACAAGGGCTTGAGTGGATGGGAT GGATAAACACCAAAACTGGAGAGGCAACATATGTTGAA GAGTTTAAGGGACGGTTTGTCTTCTCCTTGGACACCTC TGTCAGCACGGCATATCTGCAGATCAGCAGCCTAAAG GCTGAAGACACTGCCGTGTATTACTGTGCGAGATGGG ATTTCTTTGAGTATTTTAAGACTATGGACTACTGGGGC

CAAGGGACCACGGTCACCGTCTCCTCA H3 Pleno (5) CAGGTGCAATTGGTGCAATCTGGGTCTGAGTTGAAGA 168 28 AGCCTGGGGCCTCAGTGAAGGTTTCCTGCAAGGCTTC

TGGATACACCTTCACTGAGTTTGGAATGAACTGGGTGC GACAGGCCCCTGGACAAGGGCTTGAGTGGATGGGAT GGATAAACACCAAAACTGGAGAGGCAACATATGTTGAA GAGTTTAAGGGACGGTTTGTCTTCTCCTTGGACACCTC TGTCAGCACGGCATATCTGCAGATCAGCAGCCTAAAG GCTGAAGACACTGCCGTGTATTACTGTGCGAGATGGG ACTTTTTTTATTACGTGCAGACTATGGACTACTGGGGC CAAGGGACCACGGTCACCGTCTCCTCA

CONSTRUÇÃO Sequência de Nucleotídeos SEQIDW H3 Pleno (5) CAGGTGCAATTGGTGCAATCTGGGTCTGAGTTGAAGA 169 27 AGCCTGGGGCCTCAGTGAAGGTTTCCTGCAAGGCTTC

TGGATACACCTTCACTGAGTTTGGAATGAACTGGGTGC GACAGGCCCCTGGACAAGGGCTTGAGTGGATGGGAT GGATAAACACCAAAACTGGAGAGGCAACATATGTTGAA GAGTTTAAGGGACGGTTTGTCTTCTCCTTGGACACCTC TGTCAGCACGGCATATCTGCAGATCAGCAGCCTAAAG GCTGAAGACACTGCCGTGTATTACTGTGCGAGATGGG ATTTTTCTTATTACGTTGAGGCGATGGACTACTGGGGC

CAAGGGACCACAGTCACCGTCTCCTCA Cadeia CAGGTGCAATTGGTGCAATCTGGGTCTGAGTTGAAGA 170 pesada de AGCCTGGGGCCTCAGTGAAGGTTTCCTGCAAGGCTTC H4E9 TGGATACACCTTCACTGAGTTTGGTATGAACTGGGTGC

GACAGGCCCCTGGACAAGGGCTTGAGTGGATGGGAT GGATAAATACCAAAACTGGAGAGGCAACTTATATTGAA GAGTTTAAGGGACGGTTTGTCTTCTCCTTGGACACCTC TGTCAGCACGGCATATCTGCAGATCAGCAGCCTAAAG GCTGAAGACACTGCCGTGTATTACTGTGCGAGATGGG ACTTCTATGATTACGTGGAGGCTATGGACTACTGGGGC

CAAGGGACCACGGTCACCGTCTCCTCA pAC14 (89) CAGGTGCAATTGGTGCAATCTGGGTCTGAGTTGAAGA 171

AGCCTGGGGCCTCAGTGAAGGTTTCCTGCAAGGCTTC TGGATACACCTTCACTGAGTTTGGTATGAACTGGGTGC GACAGGCCCCTGGACAAGGGCTTGAGTGGATGGGAT GGATAAACACCAAAAGTGGAGAGGCAACCTATGTTGAA GAGTTTAAGGGACGGTTTGTCTTCTCCTTGGACACCTC TGTCAGCACGGCATATCTGCAGATCAGCAGCCTAAAG GCTGAAGACACTGCCGTGTATTACTGTGCGAGATGGG ACTTCTATGATTACGTGGAGGCTATGGACTACTGGGGC CAAGGGACCACGGTCACCGTCTCCTCA

CONSTRUÇÃO Sequência de Nucleotídeos SEQ ID No pAC15 (F9) CAGGTGCAATTGGTGCAATCTGGGTCTGAGTTGAAGA 172

AGCCTGGGGCCTCAGTGAAGGTTTCCTGCAAGGCTTC TGGATACACCTTCACTGAGTATGGTATGAACTGGGTGC GACAGGCCCCTGGACAAGGGCTTGAGTGGATGGGAT GGATAAACACGAAATCTGGAGAGGCAACCTATGTTGAA GAGTTTAAGGGACGGTTTGTCTTCTCCTTGGACACCTC TGTCAGCACGGCATATCTGCAGATCAGCAGCCTAAAG GCTGAAGACACTGCCGTGTATTACTGTGCGAGATGGG ACTTCTATGATTACGTGGAGGCTATGGACTACTGGGGC

CAAGGGACCACGGTCACCGTCTCCTCA H1/H2 (5) 2 CAGGTGCAATTGGTGCAATCTGGGTCTGAGTTGAAGA 173

AGCCTGGGGCCTCAGTGAAGGTTTCCTGCAAGGCTTC TGGATACACCTTCACTGAGTATTCTATGAACTGGGTGC GACAGGCCCCTGGACAAGGGCTTGAGTGGATGGGATA CATAAACACCAAAAATGGAGAGGCAAACTATGTTGAAG AGTTTAAGGGACGGTTTGTCTTCTCCTTGGACACCTCT GTCAGCACGGCATATCTGCAGATCAGCAGCCTAAAGG CTGAAGACACTGCCGTGTATTACTGTGCGAGATGGGA CTTCTATGATTACGTGGAGGCTATGGACTACTGGGGC

CAAGGGACCACGGTCACCGTCTCCTCA H1/H2 (5) 11 CAGGTGCAATTGGTGCAATCTGGGTCTGAGTTGAAGA 174

AGCCTGGGGCCTCAGTGAAGGTTTCCTGCAAGGCTTC TGGATACACCTTCACTGAGTATGGTATGAACTGGGTGC GACAGGCCCCTGGACAAGGGCTTGAGTGGATGGGAT GGATAAACACCAAAAATGGAGAGGCAACCTATATTGAA GAGTTTAAGGGACGGTTTGTCTTCTCCTTGGACACCTC TGTCAGCACGGCATATCTGCAGATCAGCAGCCTAAAG GCTGAAGACACTGCCGTGTATTACTGTGCGAGATGGG ACTTCTATGATTACGTGGAGGCTATGGACTACTGGGGC CAAGGGACCACGGTCACCGTCTCCTCA

CONSTRUÇÃO Sequência de Nucleotídeos SEQIDW H1/H2 (5) 13 CAGGTGCAATTGGTGCAATCTGGGTCTGAGTTGAAGA 175

AGCCTGGGGCCTCAGTGAAGGTTTCCTGCAAGGCTTC TGGATACACCTTCACTGAGTTTGGTATGAACTGGGTGC GACAGGCCCCTGGACAAGGGCTTGAGTGGATGGGATA TATAAACACCAAAAATGGAGAGGCAAACTATGTTGAAG AGTTTAAGGGACGGTTTGTCTTCTCCTTGGACGCCTCT GTCAGCACGGCATATCTGCAGATCAGCAGCCTAAAGG CTGAAGACACTGCCGTGTATTACTGTGCGAGATGGGA CTTCTATGATTACGTGGAGGCTATGGACTACTGGGGC

CAAGGGACCACGGTCACCGTCTCCTCA H1/H2 (5) 14 CAGGTGCAATTGGTGCAATCTGGGTCTGAGTTGAAGA 176

AGCCTGGGGCCTCAGTGAAGGTTTCCTGCAAGGCTTC TGGATACACCTTCACTGAGTATGGTATGAACTGGGTGC GACAGGCCCCTGGACAAGGGCTTGAGTGGATGGGATA TATAAACACCAAAAATGGAGAGGCAAACTATGTTGAAG AGTTTAAGGGACGGTTTGTCTTCTCCTTGGACACCTCT GTCAGCACGGCATATCTGCAGATCAGCAGCCTAAAGG CTGAAGACACTGCCGTGTATTACTGTGCGAGATGGGA CTTCTATGATTACGTGGAGGCTATGGACTACTGGGGC

CAAGGGACCACGGTCACCGTCTCCTCA H3 Pleno (5) CAGGTGCAATTGGTGCAATCTGGGTCTGAGTTGAAGA 177 19 AGCCTGGGGCCTCAGTGAAGGTTTCCTGCAAGGCTTC

TGGATACACCTTCACTGAGTTTGGAATGAGCTGGGTGC GACAGGCCCCTGGACAAGGGCTTGAGTGGATGGGAT GGATAAACACCAAAACTGGAGAGGCAACATATGTTGAA GAGTTTAAGGGACGGTTTGTCTTCTCCTTGGACACCTC TGTCAGCACGGCATATCTGCAGATCAGCAGCCTAAAG GCTGAAGACACTGCTGTGTATTACTGTGCGAGATGGG ACGCCTTTGAGTACGTGAAGGCGCTGGACTACTGGGG CCAAGGGACCACGGTCACCGTCTCCTCA

CONSTRUÇÃO Sequência de Nucleotídeos SEQIDW pAC21 (3A1) GATATCCAGATGACCCAGTCTCCATCCTCCCTGTCTGC 178

ATCTGTGGGAGACAGAGTCACCATCACTTGCAAGGCC AGTGCCAATGTGGGTAATAATGTTGCCTGGTATCAGCA GAAACCAGGGAAAGCACCTAAGCTCCTGATCTATTTGG CCTCCAACCGCTCCGGTGGAGTCCCATCAAGGTTCAG TGGCAGTGGATCTGGGACAGATTTCACTCTCACCATCA GCAGTCTGCAACCTGAAGATTTCGCAACTTACTACTGT CACCAATATTACACCTATCCTCTATTCACGTTTGGCCA

GGGCACCAAGCTCGAGATCAAGCGTACG pAC19 (2C6) GATATCCAGATGACCCAGTCTCCATCCTCCCTGTCTGC 179

ATCTGTGGGAGACAGAGTCACCATCACTTGCAAGGCC AGTAAGAATGTGGGGACTAATGTTGCGTGGTATCAGCA GAAACCAGGGAAAGCACCTAAGCCCCTGATCTACCTG GCATCCTACCCCCAGATTGGAGTCCCATCAAGGTTCA GTGGCAGTGGATCTGGGACAGATTTCACTCTCACCATC AGCAGTCTGCAACCTGAAGATTTCGCAACTTACTACTG TCACCAATATTACACCTATCCCCTATTCACGTTTGGCCA

GGGCACCAAGCTCGAGATCAAGCGTACG pAC18 (2F1) GATATCCAGATGACCCAGTCTCCATCCTCCCTGTCTGC 180

ATCTGTGGGAGACAGAGTCACCATCACTTGCAAGGCC AGTGCGGCTGTGGGTACGTATGTTGCGTGGTATCAGC AGAAACCAGGGAAAGCACCTAAGCTCCTGATCTATTCG GCATCCTACCGCAAAAGGGGAGTCCCATCAAGGTTCA GTGGCAGTGGATCTGGGACAGATTTCACTCTCACCATC AGCAGTCTGCAACCTGAAGATTTCGCAACTTACTACTG TCACCAATATTACACCTATCCTCTATTCACGTTTGGCCA

GGGCACCAAGCTCGAGATCAAGCGTACG pAC23 (2F11) GATATCCAGATGACCCAGTCTCCATCCTCCCTGTCTGC 181

ATCTGTGGGAGACAGAGTCACCATCACTTGCAAGGCC AGTCAGATAGCGAGTACTAATGTTGCCTGGTATCAGCA GAAACCAGGGAAAGCACCTAAGCTCCTGATCTATTGG GCATCCTACCGCTATAGTGGAGTCCCATCAAGGTTCAG TGGCAGTGGATCTGGGACAGATTTCACTCTCACCATCA GCAGTCTGCAACCTGAAGATTTCGCAACTTACTACTGT CACCAATATTACACCTATCCTCTATTCACGTTTGGCCA GGGCACCAAGCTCGAGATCAAGCGTACG

CONSTRUÇÃO Sequência de Nucleotídeos SEQIDW Cadeia leve GATATCCAGATGACCCAGTCTCCATCCTCCCTGTCTGC 182 de H4E9 ATCTGTGGGAGACAGAGTCACCATCACTTGCAAGGCC

AGTCAGAATGTGGGTACTAATGTTGCCTGGTATCAGCA GAAACCAGGGAAAGCACCTAAGCCCCTGATCTATTCG GCATCCTACCGCTACAGTGGAGTCCCATCAAGGTTCA GTGGCAGTGGATCTGGGACAGATTTCACTCTCACCATC AGCAGTCTGCAACCTGAAGATTTCGCAACTTACTACTG TCACCAATATTACACCTATCCTCTATTCACGTTTGGCCA

GGGCACCAAGCTCGAGATCAAGCGTACG L2D2 GATATCCAGATGACCCAGTCTCCATCCTCCCTGTCTGC 183

ATCTGTGGGAGACAGAGTCACCATCACTTGCAAGGCC AGTCACAATGTGGGTACCAACGTTGCGTGGTATCAGC AGAAACCAGGGAAAGCACCTAAGCTCCTGATCTATTCG GCATCCCACCGGTACAGTGGAGTCCCATCAAGGTTCA GTGGCAGTGGATCTGGGACAGATTTCACTCTCACCATC AGCAGTCTGCAACCTGAAGATTTCGCAACTTACTACTG TCACCAATATTACACCTATCCTCTATTCACGTTTGGCCA

GGGCACCAAGCTCGAGATCAAGCGTACG pAC6 (C1) GATATCCAGATGACCCAGTCTCCATCCTCCCTGTCTGC 184

ATCTGTGGGAGACAGAGTCACCATCACTTGCAAGGCC AGTCAGATTATGGGTCCTAATGTTGCGTGGTATCAGCA GAAACCAGGGAAAGCACCTAAGCTCCTGATCTATTTGG CATCCTACCACGAAAGTGGAGTCCCATCAAGGTTCAGT GGCAGTGGATCTGGGACAGATTTCACTCTCACCATCA GCAGTCTGCAACCTGAAGATTTCGCAACTTACTACTGT CACCAATATTACACCTATCCTCTATTCACGTTTGGCCA

GGGCACCAAGCTCGAGATCAAGCGTACG pAC7 (E1 O) GATATCCAGATGACCCAGTCTCCATCCTCCCTGTCTGC 185

ATCTGTGGGAGACAGAGTCACCATCACTTGCAAGGCC AGTCAAATTGTGGGTACTAATGTTGCGTGGTATCAGCA GAAACCAGGGAAAGCACCTAAGCTCCTGATCTATTCG GCATCCCACCGTCCCAGTGGAGTCCCATCAAGGTTCA GTGGCAGTGGATCTGGGACAGATTTCACTCTCACCATC AGCAGTCTGCAACCTGAAGATTTCGCAACTTACTACTG TCACCAATATTACACCTATCCTCTATTCACGTTTGGCCA GGGCACCAAGCTCGAGATCAAGCGTACG

CONSTRUÇÃO Sequência de Nucleotídeos SEQIDW pAC12 (H7) GATATCCAGATGACCCAGTCTCCATCCTCCCTGTCTGC 186

ATCTGTGGGAGACAGAGTCACCATCACTTGCAAGGCC AGTCAGAAGGTGCTTACTAATGTTGCGTGGTATCAGCA GAAACCAGGGAAAGCACCTAAGCTCCTGATCTATTTGG CATCCTACCGCTACAGTGGAGTCCCATCAAGGTTCAGT GGCAGTGGATCTGGGACAGATTTCACTCTCACCATCA GCAGTCTGCAACCTGAAGATTTCGCAACTTACTACTGT CACCAATATTACACCTATCCTCTATTCACGTTTGGCCA

GGGCACCAAGCTCGAGATCAAGCGTACG pAC13(H11) GATATCCAGATGACCCAGTCTCCATCCTCCCTGTCTGC 187

ATCTGTGGGAGACAGAGTCACCATCACTTGCAAGGCC AGTCAGACTGTGAGTGCTAATGTTGCGTGGTATCAGCA GAAACCAGGGAAAGCACCTAAGCTCCTGATCTACTTG GCATCCTACCGCTACAGAGGAGTCCCATCAAGGTTCA GTGGCAGTGGATCTGGGACAGATTTCACTCTCACCATC AGCAGTCTGCAACCTGAAGATTTCGCAACTTACTACTG TCACCAATATTACACCTATCCTCTATTCACGTTTGGCCA

GGGCACCAAGCTCGAGATCAAGCGTACG VETORES DE EXPRESSÃO E CÉLULAS HOSPEDEIRAS: Em um aspecto, a presente invenção refere-se a um vetor de expressão e/ou a uma célula hospedeira que compreende um ou mais polinucleotídeos isolados de acordo com a presente invenção. A célula hospedeira 5 ou o vetor de expressão compreende, por exemplo, qualquer um ou mais dos polinucleotídeos ou polinucleotídeos que codificam os polipeptídeos, ABMs e/ou ABMs variantes descritos acima nos capítulos intitulados "Moléculas de Ligação de Antígenos Anti-CEA" e "Polipeptídeos e Polinucleotídeos de ABMs Anti-CEA".

Em um outro aspecto, a presente invenção refere-se a um método de produção de ABM que se liga especificamente a CEA humano ligado à membrana, em que o método compreende: cultivar a célula hospedeira que compreende um ou mais polinucleotídeos isolados de acordo com a presente invenção ou um vetor de expressão que compreende um ou mais polinucleotídeos isolados de acordo com a presente invenção em um meio sob condições que permitam a expressão do dito um ou mais polinucleotídeos, em que os ditos um ou mais polinucleotídeos 5 codificam um ou mais polipeptídeos que fazem parte da ABM; e recuperar a dita ABM, em que a dita ABM ou uma porção da mesma se liga ao mesmo epítopo ou é capaz de competir pela ligação com o anticorpo monoclonal murino PR1A3.

Geralmente, qualquer tipo de linhagem celular cultivada pode ser utilizado para expressar a ABM de acordo com a presente invenção. Em uma realização preferida, células de CHO, células BHK, células NSO, células SP2/0, células de mieloma YO, células de mieloma de camundongo P3X63, células PER, células PER.C6 ou células de hibridoma, outras células de mamíferos, células de levedura, células de insetos ou células vegetais são utilizadas na linhagem celular de fundo para gerar as células hospedeiras projetadas de acordo com a presente invenção.

Em uma realização específica, a célula hospedeira ou o vetor de expressão compreende um ou mais polinucleotídeos que codificam uma ABM que é um anticorpo variante ou um dos fragmentos do mesmo que possuem a especificidade de ligação do anticorpo murino PR1A3; a ABM liga, por exemplo, o mesmo epítopo de PR1A3 ou é capaz de competir com o anticorpo PR1A3 pela ligação ao antígeno. Em uma realização preferida, o anticorpo é maturado por afinidade. O anticorpo maturado por afinidade geralmente possui afinidade de ligação aprimorada com relação à do anticorpo de referência do qual se derivou o anticorpo maturado por afinidade. Em uma outra realização preferida, o anticorpo possui propriedades terapêuticas desejáveis que incluem, mas sem limitações: forte afinidade de ligação para o antígeno de CEA (particularmente, CEA ligado à membrana), embora não possua substancialmente nenhuma reatividade cruzada contra CEA solúvel; uma capacidade de indução da lise celular de células que expressam CEA in vitro e ex vivo, preferencialmente de forma dependente da dosagem; uma capacidade de inibir a adesão celular mediada por CEA in vitro; uma capacidade de inibir o crescimento tumoral e/ou induzir a regressão de tecidos tumorais em modelos tu morais em camundongos (tais como xenoenxerto 5 de camundongo). Em uma outra realização preferida, o anticorpo variante ou fragmento do mesmo compreende Fc humano.

Em uma realização, um ou mais polinucleotídeos que codificam uma ABM de acordo com a presente invenção poem ser expressos sob o controle de um promotor constitutivo ou, alternativamente, um sistema de expressão regulada.

Sistemas de expressão regulada apropriados incluem, mas sem limitações, sistema de expressão regulada por tetraciclina, sistema de expressão indutível por ecdisona, sistema de expressão de chave lac, sistema de expressão indutível por glucocorticoide, sistema promotor indutível por temperatura e sistema de expressão indutível por metal metalotioneína. Caso diversos ácidos nucleicos diferentes que codificam uma ABM de acordo com a presente invenção sejam compreendidos dentro do sistema de células hospedeiras, alguns deles podem ser expressos sob o controle de um promotor constitutivo, enquanto outros são expressos sob o controle de um promotor regulado. O nível máximo de expressão é considerado o nível mais alto possível de expressão de polipeptídeo estável que não possui efeito adverso significativo sobre a velocidade de crescimento das células e será determinado utilizando experimentação rotineira. Os níveis de expressão são determinados por meio de métodos geralmente conhecidos na técnica, incluindo análise Western Blot, utilizando um anticorpo específico para a ABM ou um anticorpo específico para um marcador de peptídeo fundido à ABM; e análise Northern Blot. Em uma alternativa adicional, o polinucleotídeo pode ser ligado operativamente a um gene relator; os níveis de expressão de uma ABM descrita no presente são determinados por meio da medição de um sinal correlacionado ao nível de expressão do gene relator. O gene relator pode ser transcrito junto com o(s) ácido(s) nucleico(s) que codifica(m) a dita ABM como uma única molécula de mRNA; as suas sequências de codificação correspondentes podem ser ligadas por um local de entrada de ribossomos interno (IRES) ou por um aprimorador da tradução independente de tampa (CITE). O 5 gene relator pode ser traduzido em conjunto com pelo menos um ácido nucleico que codifica uma ABM descrita no presente, de maneira a formar uma única cadeia de polipeptídeo. Os ácidos nucleicos que codificam uma ABM de acordo com a presente invenção podem ser ligados operativa mente ao gene relator sob o controle de um único promotor, de tal forma que o ácido nucleico que codifica a ABM e o gene relator sejam transcritos em uma molécula deRNA que é alternativamente dividida em duas moléculas de RNA mensageiras (mRNA) separadas; um dos mRNAs resultantes é traduzido na dita proteína relatora e o outro é traduzido para a ABM.

Métodos que são bem conhecidos dos técnicos no assunto podem ser utilizados para construir vetores de expressão que contêm a sequência de codificação de uma ABM que se liga ao mesmo epítopo do anticorpo murino PR1A3 junto com sinais de controle de transcrição/tradução apropriados. Estes métodos incluem métodos de DNA recombinante in vitro, métodos sintéticos e recombinação genética/recombinação in vivo. Vide, por exemplo, os métodos descritos em Maniatis et ai, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Nova Iorque (1989) e Ausubel et ai, Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing e Wiley lnterscience, Nova Iorque (1989).

Diversos sistemas de vetores de expressão de hospedeiros podem ser utilizados para expressar a sequência de codificação das ABMs de acordo com a presente invenção. Preferencialmente, são utilizadas células de mamíferos como sistemas de células hospedeiras que sofreram transfecção com vetores de expressão de DNA de cosmídeo ou DNA de plasmídeo recombinante que contêm a sequência de codificação da proteína de interesse e a sequência de codificação do polipeptídeo de fusão. De preferência superior, células de CHO, células BHK, células NSO, células SP2/0, células de mieloma YO, células de mieloma de camundongo P3X63, células PER, células PER.C6 ou células de hibridoma, outras células de mamíferos, células de levedura, células de insetos ou células vegetais 5 são utilizadas como sistema de células hospedeiras. Alguns exemplos de sistemas de expressão e métodos de seleção são descritos nas referências a seguir e nas referências nelas ditas: Borth et ai, Biotechnol. Bioeng. 71 (4): 266-73 (2000- 2001 ), em Werner et ai, Arzneimittelforschung/Drug Res. 48 (8): 870-80 (1998), em Andersen e Krummen, Curr. Op. Biotechno/. 13: 117-123 (2002), em Chadd e Chamow, Curr. Op. Biotechnol. 12: 188-194 (2001) e em Giddings, Curr. Op.

Biotechnol. 12: 450-454 (2001).

Em realizações alternativas, podem ser utilizados outros sistemas de células hospedeiras eucarióticas, incluindo células de leveduras transformadas com vetores de expressão de leveduras recombinantes que contêm a sequência de codificação de um ABM de acordo com a presente invenção, tais como os sistemas de expressão ensinados no Pedido de Patente Norte-Americano no 60/344.169 e WO 03/056914 (métodos de produção de glicoproteína similar a humana em uma célula hospedeira eucariótica não humana) (cujo teor é integralmente incorporado como referência); sistemas de células de insetos infectados com vetores de expressão de vírus recombinantes (tais como bacilovírus) que contêm a sequência de codificação de uma ABM que se liga ao mesmo epítopo do anticorpo murino PR1A3 ou é capaz de competir com PR1A3 pela ligação de antígeno; sistemas de células vegetais infectados com vetores de expressão de vírus recombinantes (tais como vírus mosaico da couve-flor, CaMV; vírus mosaico do fumo, TMV) ou transformados com vetores de expressão de plasmídeos recombinantes (tais como plasmídeo de Ti) que contêm a sequência de codificação da ABM de acordo com a presente invenção, incluindo, mas sem limitações, os sistemas de expressão ensinados na Patente Norte-Americana no

6.815.184 (métodos de expressão e secreção de polipeptídeos biologicamente ativos a partir de Lemnaceae geneticamente projetada); WO 2004/057002 (produção de proteínas glicosiladas em células de plantas briófitas por meio da introdução de um gene glicosil transferase) e WO 2004/024927 (métodos de 5 geração de proteína não vegetal heteróloga extracelular em protoplasta de musgos); e nos Pedidos de Patente Norte-Americanos no 60/365.769, 60/368.047 e WO 2003/078614 (processamento de glicoproteína em plantas transgênicas que compreendem uma enzima GnTIII de mamíferos funcional) (cujo teor é integralmente incorporado ao presente como referência); ou sistemas de células animais infectados com vetores de expressão de vírus recombinantes (tais como adenovírus, vírus de vaccinia), incluindo linhagens celulares projetadas para conter diversas cópias do DNA que codifica uma ABM quimérica que se liga ao mesmo epítopo do anticorpo murino PR1A3, seja amplificado de forma estável (CHO/dhfr) ou amplificado de forma instável em cromossomos pequenos duplos (tais como linhagens de células murinos). Em uma realização, o vetor que compreende o(s) polinucleotídeo(s) que codifica(m) a ABM de acordo com a presente invenção é policistrônico. Além disso, em uma realização, a ABM discutida acima é um anticorpo ou fragmento do mesmo. Em uma realização preferida, a ABM é um anticorpo maturado por afinidade.

A expressão estável geralmente é preferida sobre a expressão transitória, pois ela tipicamente atinge resultados mais reproduzíveis e também é mais propensa a produção em larga escala; encontra-se, entretanto, dentro do conhecimento da técnica como determinar se a expressão transitória é melhor para uma situação específica. Em vez de utilizar vetores de expressão que contêm origens virais de reprodução, as células hospedeiras podem ser transformadas com os ácidos nucleicos codificadores correspondentes controlados por elementos de controle de expressão apropriados (tais como sequências promotoras, amplificadoras, terminais de transcrição, locais de poliadenilação etc.) e um marcador selecionável. Após a introdução de DNA externo, pode-se permitir que as células projetadas cresçam por um a dois dias em meio enriquecido e, em seguida, sejam comutadas para um meio seletivo. O marcador selecionável no plasmídeo recombinante confere resistência à seleção e permite a seleção de 5 células que tenham integrado de forma estável o plasmídeo nos seus cromossomos e crescer para formar focos que, por sua vez, podem ser elo nados e expandidos em linhagens celulares.

Podem ser utilizados diversos sistemas de seleção, incluindo, mas sem limitações, o vírus simplex da herpes timidino quinase (Wigler et ai, Ce// 11: 1o 223 (1977), hipoxantino-guanina fosforibosiltransferase (Szybalska &Szybalski, Proc. Natl. Acad. Sei. U. S. A. 48: 2026 (1962)) e genes adenino fosforibosiltransferase (lowy et ai, Ce/1 22: 817 (1980)), que podem ser empregados em células tk-, hgprr ou aprr, respectivamente. Além disso, pode-se utilizar resistência a antimetabólitos com base na seleção para dhfr, que confere resistência a metotrexato (Wigler et ai, Natl. Acad. Sei. U. S. A. 77: 3567 (1989); O'Hare et ai, Proc. Natl. Acad. Sei. U. S. A. 78: 1527 (1981)); gpt, que confere a resistência a ácido micofenólico (Mulligan & Berg, Proc. Natl. Acad. Sei. U. S. A.

78: 2072 (1981)); neo, que confere resistência ao aminoglicosídeo G-418 (Colberre-Garapin et ai, J. Mo/. Biol. 150: 1 (1981 )); e higro, que confere resistência a genes de higromicina (Santerre et ai, Gene 30: 147 (1984)).

Recentemente, foram descritos genes selecionáveis adicionais, nomeadamente trpB, que permite que as células utilizem indol no lugar de triptofano; hisD, que permite que as células utilizem histinol no lugar de histidina (Hartman & Mulligan, Proc. Natl. Acad. Sei. U. S. A. 85: 8047 (1988)); o sistema de sintase de glutamine; e ODC (descarboxilase de ornitina), que confere resistência ao inibidor de descarboxilase de ornitina, 2-(difluorometii)-DL-ornitina, DFMO (McConlogue, em Current Communications in Molecular Biology, Cold Spring Harbor Laboratory, Ed. (1987)).

A presente invenção refere-se ainda a um método de modificação do perfil de glicosilação das ABMs de acordo com a presente invenção que são produzidas por uma célula hospedeira, que compreende a expressão na dita célula hospedeira de um ácido nucleico que codifica uma ABM de acordo com a

5 presente invenção e um ácido nucleico que codifica um polipeptídeo com atividade de glicosiltransferase ou um vetor que compreende esses ácidos nucleicos.

Genes com atividade de glicosiltransferase incluem ~(1 ,4)-N-acetilglicosaminiltransferase

111 (GnTII), a-manosidase 11 (Manll), ~(1 ,4)-galactosiltransferase (GaiT), ~(1 ,2)-N-

acetilglicosaminiltransferase I (GnTI) e ~(1 ,2)-N-acetilglicosaminiltransferase 11

(GnTII). Em uma realização, uma combinação de genes com atividade de glicosiltransferase é expressa na célula hospedeira (tal como GnTIII e Man 11). De forma similar, o método também engloba a expressão de um ou mais polinucleotídeos que codificam a ABM em uma célula hospedeira em que um gene glicosiltransferase foi rompido ou desativado de outra forma (tal como uma célula hospedeira na qual a atividade do gene que codifica a1-6 fucosiltransferase de núcleo sofreu knock out). Em outra realização, as ABMs de acordo com a presente invenção podem ser produzidas em uma célula hospedeira que expressa adicionalmente um polinucleotídeo que codifica um polipetídeo que possui atividade de GnTIII para modificar o padrão de glicosilação.

Em uma realização específica, o polipeptídeo que possui atividade de GnTIII é um polipeptídeo de fusão que compreende o domínio de localização de Golgi de um polipeptídeo residente Golgi.

Em uma outra realização preferida, a expressão das ABMs de acordo com a presente invenção em uma célula hospedeira que expressa um polinucleotídeo que codifica um polipeptídeo que possui atividade de GnTIII resulta em ABMs com afinidade de ligação de receptor de Fc mais alta e função efetora aumentada.

Consequentemente, em uma realização, a presente invenção refere-se a uma célula hospedeira que compreende (a) um ácido nucleico isolado que compreende uma sequência que codifica um polipeptídeo que possui atividade de GnTIII; e (b) um polinucleotídeo isolado que codifica uma ABM de acordo com a presente invenção, tal como um anticorpo quimérico, primatizado ou humanizado que se liga a CEA humano. Em uma realização preferida, o polipeptídeo que possui atividade de GnTIII é um polipeptídeo de fusão que 5 compreende o domínio catalítico de GnTIII e o domínio de localização Golgi é o domínio de localização de manosidase 11. Métodos de geração desses polipeptídeos de fusão e seu uso para produzir anticorpos com funções efetoras aprimoradas são descritos no Pedido de Patente Provisório Norte-Americano no 60/495.142 e Pedido de Patente Norte-Americano publicado no 2004/0241817, 1o cujo teor total é expressamente incorporado ao presente como referência. Em uma realização específica, a ABM modificada produzida pela célula hospedeira possui uma região constante de lgG ou um dos fragmentos do mesmo que compreende a região Fc. Em uma outra realização específica, a ABM é um anticorpo humanizado ou um dos fragmentos do mesmo que compreende uma região Fc.

As ABMs com glicosilação altearda produzidas pelas células hospedeiras de acordo com a presente invenção exibem tipicamente aumento da afinidade de ligação de receptor Fc e/ou aumento da função efetora como resultado da modificação da célula hospedeira (tal como por meio da expressão de um gene glicosiltransferase). Preferencialmente, o aumento da afinidade de ligação de receptor Fc é o aumento de ligação a um receptor de ativação de Fcy, tal como o receptor FcyRIIIa. A função efetora mais alta é preferencialmente um aumento de um ou mais dos seguintes: aumento da citotoxicidade celular dependente de anticorpo, aumento da fagocitose celular dependente de anticorpo (ADCP), aumento da secreção de citoquina, aumento da absorção de antígeno mediada por complexo imune por células que apresentam antígeno, aumento da citotoxicidade celular mediada por Fc, aumento da ligação a células NK, aumento da ligação a macrófagos, aumento da ligação a células polimorfonucleares (PMNs), aumento da ligação a monócitos, aumento da retícula de anticorpos ligados a alvo, aumento da apoptose indutora de sinalização direta, aumento da maturação de células dendríticas e aumento de priming de células T.

GERAÇÃO E USO DE ABMS QUE POSSUEM FUNÇÃO EFETORA APRIMORADA,

INCLUINDO CITOTOXICIDADE CELULAR DEPENDENTE DE ANTICORPOS 5 Em um aspecto, a presente invenção fornece glicoformas de ABMs (tais como ABMs variantes) que ligam o mesmo epítopo ao do anticorpo murino PR1A3 e que possuem função efetora aprimorada, incluindo citotoxicidade celular dependente de anticorpo. A projeção por glicosilação de anticorpos foi descrita anteriormente. Vide, por exemplo, a Patente Norte-Americana n° 6.602.684, incorporada integralmente ao presente como referência. Métodos de produção de ABMs a partir de células hospedeiras que possuem atividade alterada de genes envolvidos na glicosilação também são descritos em detalhes no presente (vide, por exemplo, o capítulo anterior intitulado "Vetores de Expressão e Células Hospedeiras"). Aumentos de ADCC das ABMs de acordo com a presente invenção também são atingidos por meio de aumento da afinidade da molécula de ligação de antígenos para CEA ligado à membrana, tal como por meio de maturação por afinidade ou outros métodos de aumento da afinidade (vide Tang et ai, J.lmmunol. 2007, 179: 2815-2823). Combinações destas abordagens também são englobadas pela presente invenção.

Ensaios clínicos de anticorpos monoclonais não conjugados (mAbs) para o tratamento de alguns tipos de câncer geraram recentemente resultados encorajadores. Dillman, Cancer Biother. & Radiopharm. 12: 223-25 (1997); Deo et ai, lmmunology Today 18: 127 (1997). lgG1 não conjugado quimérico foi aprovado para linfoma não de Hodgkin de células B folicular ou de baixo grau. Dillman, Cancer Biother. & Radiopharm. 12: 223-25 (1997), enquanto outro mAb não conjugado, um lgG1 humanizado dirigido a tumores de mama sólidos, também demonstrou resultados promissores em ensaios clínicos de fase 111. Deo et ai, /mmunology Today 18: 127 (1997). Os antígenos desses dois mAbs são altamente expressos nas suas células tumorais correspondentes e os anticorpos mediam a destruição de tumores potentes por células efetoras in vitro e in vivo. Por outro lado, muitos outros mAbs não conjugados com especificidades tumorais finas não podem acionar funções efetoras com potência suficiente para que sejam 5 clinicamente úteis. Frost et ai, Cancer 80: 317-33 (1997); Surfus et ai, J.

lmmunother. 19: 184-91 (1996). Para alguns desses mAbs mais fracos, está atualmente sendo testada terapia de citoquinas adjunta. A adição de citoquinas pode estimular a citotoxicidade celular dependente de anticorpos (ADCC) aumentando a atividade e o número de linfócitos em circulação. Frost et ai, Cancer 80: 317-33 (1997); Surfus et ai, J. lmmunother. 19: 184-91 (1996). ADCC, ataque lítico sobre células dirigidas, é acionado mediante ligação de receptores de leucócitos à região constante (F c) de anticorpos. Deo et ai, lmmunology Today 18: 127 (1997).

Uma abordagem diferente, mas complementar para aumentar a atividade de ADCC de lgG1s não conjugados é a projeção da região Fc do anticorpo. Estudos de projeção de proteínas demonstraram que FcyRs interagem com a região de articulação inferior do domínio CH2 de lgG. Lund et ai, J.

lmmunol. 157: 4963-69 (1996). A ligação de FcyR também necessita, entretanto, da presença de oligossacarídeos ligados covalentemente no Asn 297 conservado na região CH2. Lund et ai, J. lmmuno/. 157: 4963-69 (1996); Wright e Morrison, Trends Biotech. 15: 26-31 (1997), o que sugere que oligossacarídeo e polipeptídeo contribuem ambos diretamente com o local de interação ou que o oligossacarídeo é necessário para manter uma conformação de polipeptídeo CH2 ativo. A modificação da estrutura de oligossacarídeo pode ser explorada, portanto, como meio de aumento da afinidade da interação.

Uma molécula de lgG conduz dois oligossacarídeos N-ligados na sua região Fc, um sobre cada cadeia pesada. Como qualquer glicoproteína, um anticorpo é produzido na forma de população de glicoformas que compartilham a mesma cadeia principal de polipeptídeo, mas possuem oligossacarídeos ligados aos locais de glicosilação. Os oligossacarídeos normalmente encontrados na região Fc de lgG de soro são do tipo biantenado complexo (Wormald et ai, Biochemistry 36: 130-38 (1997), com baixo nível de ácido siálico terminal e N- 5 acetilglucosamina bisseccionada (GicNAc) e um grau variável de galactosilação terminal e fucosilação central. Alguns estudos sugerem que a estrutura de carboidrato mínima necessária para ligação de FcyR repousa dentro do núcleo de oligossacarídeo. Lund et ai, J. lmmunol. 157: 4963-69 (1996).

As linhagens celulares derivadas de rato ou de hamster utilizadas na indústria e no meio acadêmico para a produção de mAbs terapêuticos não conjugados normalmente ligam os determinantes de oligossacarídeos necessários a locais Fc. lgGs expressos nessas linhagens celulares não possuem, entretanto, o GlcNAc bisseccionado encontrado em baixas quantidades em lgGs de soro.

Lifely et ai, Glycobiology 318: 813-22 (1995). Por outro lado, observou-se recentemente que um lgG1 humanizado produzido por mieloma de rato (CAMPATH-1 H) conduziu um GlcNAc bisseccionado em algumas das suas glicoformas. Lifely et ai, Glycobiology 318: 813-22 (1995). O anticorpo derivado de células de rato atingiu atividade de ADCC in vitro máxima similar como anticorpos CAMPATH-1 H produzidos em linhagens celulares padrão, mas em concentrações de anticorpos significativamente mais baixas.

O antígeno CAMPATH normalmente está presente em altos níveis sobre células de linfoma e este mAb quiméico possui alta atividade de ADCC na ausência de GlcNAc bisseccionado. Lifely et ai, Glycobiology 318: 813-22 (1995).

No processo de glicosilação N-ligado, um GlcNAc bisseccionado é adicionado por GnTIII. Schachter, Biochem. Ce/1 Biol. 64: 163-81 (1986).

Estudos anteriores utilizaram uma linhagem de células de CHO produtora de anticorpos que foi projetada anteriormente para expressar, de forma regulada externamente, níveis diferentes de um gene de enzima GnTIII clonado

(Umaria P. et ai, Nature Biotechnol. 17:176-180 (1999)). Esta abordagem estabeleceu pela primeira vez uma correlação rigorosa entre a expressão de uma glicosiltransferase (tal como GnTIII) e a atividade de ADCC do anticorpo modificado. Desta forma, a presente invenção contempla uma ABM variante (tal 5 como uma ABM maturada por afinidade) que se liga ao mesmo epítopo do anticorpo murino PR1A3, que compreende uma região Fc ou região equivalente a uma região Fc que possui glicosilação alterada resultante da mudança do nível de expressão de um gene glicosiltransferase na célula hospedeira produtora de ABM.

Em uma realização específica, a alteração do nível de expressão genética é um aumento da atividade de GnTIII. O aumento da atividade de GnTIIII resulta em um aumento do percentual de oligossacarídeos bissecionados, bem como uma redução do percentual de resíduos de fucose, na região Fc da ABM. Este anticorpo ou fragmento do mesmo possui a afinidade de ligação de receptor Fc mais alta e função efetora mais alta.

A presente invenção também se refere a um método de produção de uma ABM de acordo com a presente invenção que possui oligossacarídeos modificados, que compreende (a) cultivo de uma célula hospedeira projetada para expressar pelo menos um ácido nucleico que codifica um polipeptídeo que possui atividade de glicosiltransferase sob condições que permitem a produção de uma ABM de acordo com a presente invenção, em que o dito polipeptídeo que possui atividade de glicosiltransferase é expresso em quantidade suficiente para modificar os oligossacarídeos na região Fc da dita ABM produzida pela dita célula hospedeira; e (b) isolamento da dita ABM. Em uma realização, o polipeptídeo que possui atividade de glicosiltranserase é GnTIII. Em uma outra realização, existem dois polipeptídeos que possuem atividade de glicosiltransferase. Em uma realização específica, os dois peptídeos que possuem atividade de glicosiltransferase são GnTIII e Manll. Em uma outra realização, o polipeptídeo que possui atividade de glicosiltransferase é um polipeptídeo de fusão que compreende o domínio catalítico de GnTIII. Em uma realização mais específica, o polipeptídeo de fusão compreende adicionalmente o domínio de localização Golgi de um polipeptídeo residente Golgi. Preferencialmente, o domínio de localização de Golgi é o domínio de localização de manosidase li ou GnTI. Alternativamente, o 5 domínio de localização de Golgi é selecionado a partir do grupo que consiste em: o domínio de localização de manosidase I, o domínio de localização de GnTII e o domínio de localização de a1-6 fucosiltransferase de núcleo. As ABMs produzidas por meio dos métodos de acordo com a presente invenção aumentaram a afinidade de ligação de receptor Fc aprimorado e/ou função efetora aprimorada.

1o Geralmente, o aumento da função efetora é um ou mais dos seguintes: aumento da citotoxicidade celular mediada por Fc (incluindo aumento da citotoxicidade celular dependente de anticorpo), aumento da fagocitose celular dependente de anticorpo (ADCP), aumento da secreção de citoquina, aumento da absorção de antígeno mediada por complexo imune por células que apresentam antígeno, aumento da ligação a células NK, aumento da ligação a macrófagos, aumento da ligação a monócitos, aumento da ligação a células polimorfonucleares, aumento da apoptose indutora de sinalização direta, aumento da retícula de anticorpos ligados a alvo, aumento da maturação de células dendríticas e aumento de priming de células T. O aumento da afinidade de ligação de receptor Fc é preferencialmente o aumento de ligação a receptores de ativação de Fc, tais como FcyRIIIa. Em uma realização particularmente preferida, a ABM é um anticorpo humanizado ou fragmento do mesmo.

Em uma realização, o percentual de oligossacarídeos N-ligados bissecionados na região Fc da ABM é pelo menos de cerca de 10% a cerca de 100%, especificamente pelo menos cerca de 50%, mais especificamente pelo menos cerca de 60%, pelo menos cerca de 70%, pelo menos cerca de 80% ou pelo menos cerca de 90 a 95% do total de oligossacarídeos. Em ainda outra realização, a molécula de ligação de antígeno produzida por meio dos métodos de acordo com a presente invenção possui proporção mais alta de oligossacarídeos não fucosilados na região Fc como resultado da modificação dos seus oligossacarídeos por meio dos métodos de acordo com a presente invenção.

Em uma realização, o percentual de oligossacarídeos não fucosilados é pelo menos

5 de cerca de 20% a cerca de 100%, especificamente pelo menos cerca de 50%,

pelo menos cerca de 60% a cerca de 70% e, mais especificamente, pelo menos cerca de 75%. Os oligossacarídeos não fucosilados podem ser do tipo híbrido ou complexo.

Em ainda outra realização, a molécula de ligação de antígeno produzida por meio dos métodos de acordo com a presente invenção possui proporção mais alta de oligossacarídeos bissecionados na região Fc como resultado da modificação dos seus oligossacarídeos por meio dos métodos de acordo com a presente invenção.

Em uma realização, o percentual de oligossacarídeos bissecionados é pelo menos de cerca de 20% a cerca de 100%,

especificamente pelo menos cerca de 50%, pelo menos cerca de 60% a cerca de

70% e, mais especificamente, pelo menos cerca de 75%. Em uma realização particularmente preferida, a ABM produzida pelas células hospedeiras e métodos de acordo com a presente invenção possui uma proporção mais alta de oligossacarídeos não fucosilados bisseccionados na região Fc.

Os oligossacarídeos não fucosilados bissecionados podem ser híbridos ou complexos.

Especificamente, os métodos de acordo com a presente invenção podem ser utilizados para produzir moléculas de ligação de antígenos nas quais pelo menos cerca de 10% a cerca de 100%, especificamente pelo menos cerca de

15%, mais especificamente pelo menos cerca de 20% a cerca de 50%, mais especificamente pelo menos cerca de 20% a cerca de 25% e, mais especificamente, pelo menos cerca de 30% a cerca de 35% dos oligossacarídeos na região Fc da molécula de ligação de antígenos são bissecionados e não fucosilados.

As ABMs de acordo com a presente invenção podem também compreender uma região Fc na qual pelo menos cerca de 1O% a cerca de 100%,

especificamente pelo menos cerca de 15%, mais especificamente pelo menos cerca de 20% a cerca de 25% e, mais especificamente, pelo menos cerca de 30% a cerca de 35% dos oligossacarídeos na região Fc da ABM são não fucosilados híbridos bissecionados.

5 Em uma outra realização, a presente invenção refere-se a uma molécula de ligação de antígenos (tal como ABM variante) que é capaz de competir com o anticorpo PR 1A3 por CEA humano ligado à membrana projetada para possuir função efetora aprimorada e/ou afinidade de ligação de receptores Fc aprimorada, produzida por meio dos métodos de acordo com a presente invenção. O aumento da função efetora pode incluir, mas sem limitações, um ou mais dos seguintes: aumento da citotoxicidade celular mediada por Fc (incluindo aumento da citotoxicidade celular dependente de anticorpo), aumento da fagocitose celular dependente de anticorpo (ADCP), aumento da secreção de citoquina, aumento da absorção de antígeno mediada por complexo imune por células que apresentam antígeno, aumento da ligação a células NK, aumento da ligação a macrófagos, aumento da ligação a monócitos, aumento da ligação a células polimorfonuleres, aumento da apoptose indutora de sinalização direta, aumento da retícula de anticorpos ligados a alvo, aumento da maturação de células dendríticas ou aumento de priming de células T. Em uma realização preferida, o aumento da afinidade de ligação de receptor Fc é o aumento de ligação a um receptor de ativação de Fc, de preferência superior FcyRIIIa. Em uma realização, a molécula de ligação de antígenos é um anticorpo, fragmento de anticorpo que contém a região Fc ou uma proteína de fusão que inclui uma região equivalente à região Fc de uma imunoglobulina. Em uma realização particularmente preferida, a molécula de ligação de antígeno é um anticorpo maturado por afinidade humanizado.

A presente invenção fornece adicionalmente métodos de geração e uso de sistemas de células hospedeiras para a produção de glicoformas das

ABMs de acordo com a presente invenção, que possui afinidade de ligação de receptor Fc aprimorada, preferencialmente ligação aprimorada a receptores de ativação de Fc e/ou que possuem funções efetoras aprimoradas, incluindo citotoxicidade celular dependente de anticorpo. A metodologia de glicoprojeção 5 que pode ser utilizada com as ABMs de acordo com a presente invenção foi descrita com mais detalhes na Patente Norte-Americana no 6.602.684, Pedido de Patente Norte-Americano publicado no 2004/0241817 A 1, Pedido de Patente Norte-Americano publicado no 2003/0175884 A 1, Pedido de Patente Provisório Norte-Americano no 60/441.307 e WO 2004/065540, cujos teores são 1o integralmente incorporados ao presente como referência. As ABMs de acordo com a presente invenção podem ser alteranativamente glicoprojetadas para possuir resíduos de fucose reduzidos na região Fc de acordo com os métodos descritos no Pedido de Patente Norte-Americano publicado no 2003/01571 08 (Genentech) ou em EP 1.176.195 A 1 , WO 03/084570, WO 03/085119 e Pedidos de Patente Norte-Americanos publicados no 2003/0115614, 2004/093621, 2004/110282, 2004/110704 e 2004/132140 (Kyowa). O conteúdo de cada um desses documentos é integralmente incorporado ao presente como referência. ABMs glicoprojetadas de acordo com a presente invenção podem também ser produzidas em sistemas de expressão que produzem glicoproteínas modificadas, tais como as ensinadas no Pedido de Patente Norte-Americano publicado no 60/344.169 e WO 03/056914 (GiycoFi, Inc.) ou em WO 2004/057002 e WO 2004/024927 (Greenovation), cujos teores são integralmente incorporados ao presente como referência.

GERAÇÃO DE LINHAGENS CELULARES PARA A PRODUÇÃO DE PROTEÍNAS COM

PADRÃO DE GLICOSILAÇÃO ALTERADO Em um aspecto, a presente invenção fornece sistemas de expressão de céulas hospedeiras para a geração das ABMs de acordo com a presente invenção que possuem padrões de glicosilação modificados. Particularmente, a presente invenção fornece sistemas de células hospedeiras para a geração de glicoformas das ABMs de acordo com a presente invenção que possuem valor terapêutico aprimorado. A presente invenção fornece, portanto, sistemas de expressão de células hospedeiras selecionados ou projetados para expressar um 5 polipeptídeo que possui atividade de glicosiltransferase. Em uma realização específica, a atividade de glicosiltransferase é uma atividade de GnTIII. Em uma realização, o polipeptídeo que possui atividade de GnTIII é um polipeptídeo de fusão que compreende o domínio de localização Golgi de um polipeptídeo residente Golgi heterólogo. Especificamene, esses sistemas de expressão de 1o células hospedeiras podem ser projetados para compreender uma molécula de ácido nucleico recombinante que codifica um polipeptídeo que possui GnTIII, ligado operativamente a um sistema promotor constitutivo ou regulado.

Em uma realização específica, a presente invenção fornece uma célula hospedeira que foi projetada para expressar pelo menos um ácido nucleico que codifica um polipeptídeo de fusão que possui atividade de GnTIII e compreende o domínio de localização Golgi de um polipeptídeo residente Golgi heterólogo. Em um aspecto, a célula hospedeira é projetada com uma molécula de ácido nucleico que compreende pelo menos um gene que codifica um polipeptídeo de fusão que possui atividade de GnTIII e compreende o domínio de localização Golgi de um polipeptídeo residente Golgi heterólogo.

Geralmente, qualquer tipo de linhagem de células cultivadas, incluindo as linhagens celulares discutidas acima, pode ser utilizado como antecedente para projetar as linhagens de células hospedeiras de acordo com a presente invenção. Em uma realização preferida, células de CHO, células BHK, células NSO, células SP2/0, células de mieloma YO, células de mieloma de camundongo P3X63, células PER, células PER.C6 ou células de hibridoma, outras células de mamíferos, células de levedura, células de insetos ou células vegetais são utilizadas na linhagem celular de fundo para gerar as células hospedeiras projetadas de acordo com a presente invenção.

Contempla-se que a presente invenção engloba qualquer célula hospedeira projetada que expressa um polipeptídeo que possui atividade de glicosiltransferase, tal como atividade GnTIII, incluindo um polipeptídeo de fusão 5 que compreende o domínio de localização Golgi de um polipeptídeo residente Golgi heterólogo conforme definido no presente.

Um ou mais ácidos nucleicos que codificam um polipeptídeo que possui atividade de glicosiltransferase, tal como atividade GnTIII, podem ser expressos sob o controle de um promotor constitutivo ou, alternativamente, um sistema de expressão regulada. Esses sistemas são bem conhecidos na técnica e incluem os sistemas discutidos acima. Caso diversos ácidos nucleicos diferentes que codificam polipeptídeos de fusão que possuem atividade de glicosiltransferase, tal como atividade GnTIII, e compreendem domínio de localização Golgi de um polipeptídeo residente Golgi heterólogo estejam compreendidos no sistema de células hospedeiras, alguns deles podem ser expressos sob o controle de um promotor constitutivo, enquanto outros são expressos sob o controle de um promotor regulado. Os níveis de expressão dos polipeptídeos de fusão que possuem atividade de glicosiltransferase, tal como atividade GnTIII, são determinados por meio de métodos geralmente conhecidos na técnica, incluindo análise Western Blog, análise Northern Blot, análise de expressão de genes relatores ou medição da atividade de glicosiltransferase, tal como atividade GnTIII. Alternativamente, pode-se empregar uma lectina que se liga a produtos biossintéticos do GnTIII, tal como lectina E4 -PHA. Alternativamente, pode ser utilizado um ensaio funcional que mede o aumento da ligação de receptor Fc ou o aumento da função efetora mediada por anticorpos produzidos pelas células projetadas com o ácido nucleico que codifica um polipeptídeo com atividade de glicosiltransferase, tal como atividade GnTIII.

IDENTIFICAÇÃO DE TRANSFECTANTES OU TRANSFORMADORES QUE EXPRESSAM A

PROTEÍNA QUE POSSUI PADRÃO DE GICOSILAÇÃO MODIFICADO As células hospedeiras que contêm a sequência de codificação de uma ABM variante (tal como ABM humanizada e maturada por afinidade) que é 5 capaz de concorrer com o anticorpo PR 1A3 pela ligação de antígeno e expressa os produtos genéticos biologicamente ativos podem ser identificadas por pelo menos quatro abordagens gerais: (a) hibridização DNA-DNA ou DNA-RNA; (b) presença ou ausência de funções de genes "marcadores"; (c) determinação do nível de transcrição medido por meio da expressão dos transcritos de mRNA correspondentes na célula hospedeira; e (d) detecção do produto genético conforme medido por meio de imunoensaio ou de sua atividade biológica.

Na primeira abordagem, a presença da sequência de codificação de uma ABM variante que é capaz de competir com o anticorpo PR1A3 e/ou a sequência de codificação do polipeptídeo que possui atividade de glicosiltransferase (tal como GnTIII) pode ser deetectada por meio de hibridização DNA-DNA ou DNA-RNA utilizando sondas que compreendem sequências de nucleotídeos que são homólogas às sequências de codificação correspondentes, respectivamente, ou porção da mesma ou derivados.

Na segunda abordagem, o sistema de hospedeiro e vetor de expressão recombinante pode ser identificado e selecionado com base na presença ou ausência de certas funções de genes "marcadores" (tais como atividade de timidino quinase, resistência a antibióticos, resistência a metotrexato, fenótipo de transformação, formação de corpo de oclusão em bacilovírus etc.). Se a sequência de codificação do ABM de acordo com a presente invenção ou um dos fragmentos do mesmo e/ou a sequência de codificação do polipeptídeo que possui atividade de glicosiltransferase (tal como GnTIII) forem inseridas em uma sequência de gene marcador do vetor, por exemplo, podem ser identificados recombinantes que contêm as sequências de codificação correspondentes pela ausência da função de gene marcador. Alternativamente, um gene marcador pode ser colocado em conjunto com as sequências de codificação sob o controle do mesmo promotor utilizado para controlar a expressão das sequências de codificação ou de um promotor diferente. A expressão do marcador em resposta à 5 indução ou seleção indica a expressão da sequência de codificação da ABM de acordo com a presente invenção e/ou a sequência de codificação do polipeptídeo que possui atividade de glicosiltransferase (tal como GnTIII).

Na terceira abordagem, a atividade de transcrição para a região de codificação da ABM de acordo com a presente invenção ou um dos fragmentos do mesmo e/ou a sequência de codificação do polipeptídeo que possui atividade de glicosiltransferase (tal como GnTIII) pode ser determinada por meio de ensaios de hibridização. RNA pode ser isolado e analisado por meio de Northern Blot utilizando, por exemplo, uma sonda homóloga às sequências de codificação da ABM de acordo com a presente invenção ou um dos fragmentos do mesmo e/ou a sequência de codificação do polipeptídeo que possui atividade de glicosiltransferase (tal como GnTIII) ou porção específicas da mesma.

Alternativamente, os ácidos nucleicos totais da célula hospedeira podem ser extraídos e testados para determinar a hibridização nessas sondas.

Na quarta abordagem, a expressão dos produtos de proteína pode ser testada imunologicamente, tal como por meio de Western Blot, imunoensaios tais como radioimunoprecipitação, imunoensaios ligados por enzimas e similares.

O ensaio final do sucesso do sistema de expressão envolve, entretanto, a detecção dos produtos genéticos biologicamente ativos.

APLICAÇÕES TERAPÊUTICAS E MÉTODOS DE USO ANTI-CEA DE MOLÉCULAS DE

LIGAÇÃO DE ANTÍGENOS A presente invenção também se refere a um método de direcionamento de células in vivo ou in vitro que expressam CEA. Células que expressam CEA podem ser dirigidas para fins terapêuticos (tais como o tratamento de um distúrbio por meio de direcionamento a células que expressam CEA para destruição pelo sistema imunológico). Em uma realização, a presente invenção refere-se a um método de direcionamento de células que expressam CEA em um paciente que compreende a administração ao paciente de uma 5 composição que compreende uma ABM de acordo com a presente invenção. As células que expressam CEA podem também ser dirigidas para fins de diagnóstico (tais como para determinar se estão expressando CEA, seja normal ou anormalmente). Desta forma, a presente invenção também se refere a métodos de detecção da presença de CEA ou uma célula que expressa CEA, seja in vivo ou in vitro. Um método de detecção da expressão de CEA de acordo com a presente invenção compreende o contato de uma amostra a ser testada, opcionalmente com uma amostra controle, com uma ABM de acordo com a presente invenção, sob condições que permitem a formação de um complexo entre ABM e CEA A formação de complexo é detectada em seguida (tal como por meio de ELISA ou outros métodos conhecidos na técnica). Ao utilizar uma amostra de controle com a amostra de ensaio, qualquer diferença estatisticamente significativa na formação de complexos de ABM e CEA ao comparar as amostras de ensaio e controle é indicativa da presença de CEA na amostra de ensaio.

Em um aspecto, as ABMs de acordo com a presente invenção podem ser células alvo utilizadas in vivo ou in vitro que expressam CEA. As células que expressam CEA podem ser dirigidas com fins de diagnóstico ou terapêuticos. Em um aspecto, as ABMs de acordo com a presente invenção podem ser utilizadas para detectar a presença de CEA em uma amostra. CEA é expresso anormalmente (tal como sobre-expresso) em muitos tumores humanos em comparação com tecido não tumorais do mesmo tipo de célula. Desta forma, as ABMs de acordo com a presente invenção são particularmente úteis na prevenção da formação de tumores, erradicação de tumores e inibição do crescimento tumoral ou metástase. As ABMs de acordo com a presente invenção também agem para suspender o ciclo celular, causam apoptose das células alvo (tais como células tumorais) e inibem a angiogênese e/ou a diferenciação de células alvo. As ABMs de acordo com a presente invenção podem ser utilizadas para tratar qualquer tumor que expresse CEA. Malignidades específicas que 5 podem ser tratadas com as ABMs de acordo com a presente invenção incluem, mas sem limitações, câncer colorretal, câncer de pulmão de células não pequenas, câncer gástrico, câncer pancreático e câncer de mama.

As ABMs anti-CEA descritas no presente podem ser utilizadas isoladamente para inibir o crescimento tumoral ou matar células tumorais. As ABMs anti-CEA podem ligar-se, por exemplo, a CEA que está sobre a membrana ou superfície celular de células cancerosas e permitir, por exemplo, ADCC ou outra morte mediada por efetor das células cancerosas. As ABMs anti-CEA podem ser humanizadas, especificamente maturadas por afinidade, mais especificamente glicoprojetadas e maturadas por afinidade.

As ABMs podem ser alternativamente utilizadas a fim de bloquear a atividade do antígeno de CEA, particularmente por meio de interferência física com a sua ligação de outro composto. As moléculas de ligação de antígenos podem ser utilizadas, por exemplo, para bloquear a adesão celular mediada por CEA.

As ABMs anti-CEA de acordo com a presente invenção são administradas a mamíferos, preferencialmente seres humanos, em uma forma de dosagem farmaceuticamente aceitável tal como as discutidas abaixo, incluindo aquelas que podem ser administradas a seres humanos por via intravenosa na forma de mistura ou por meio de infusão contínua ao longo de um período de tempo, por via intramuscular, intraperitoneal, intracerebroespinhal, subcutânea, intra-articular, intrassinovial, intratecal, oral, tópica ou inalatória. As ABMs também são administradas adequadamente por vias intratumoral, peritumoral, intralesional ou perilesional, para exercer efeitos terapêuticos locais e sistêmicos. Espera-se que a via intraperitoneal seja particularmente útil, por exemplo, no tratamento de tumores colorretais.

Para o tratamento de doença, a dosagem apropriada de ABM dependerá do tipo de doença a ser tratado, da severidade e do curso da doença, 5 terapia anterior, histórico clínico do paciente, reação ao anticorpo e do critério do médico atendente. A ABM é administrada adequadamente ao paciente uma vez ou ao longo de uma série de tratamentos.

A presente invenção fornece um método para matar seletivamente células tumorais que expressam CEA. Este método compreende a reação das moléculas de ligação de antígenos ou os conjugados (tais como a imunotoxina) de acordo com a presente invenção com as ditas células tumorais. Essas células tumoraís podem ser de um carcinoma humano que incluí carcinoma colorretal, carcinoma do pulmão de células não pequenas (NSCLC), carcinoma gástrico, carcinoma pancreático e carcinoma de mama.

Em uma realização, a presente invenção fornece um método para inibir a adesão celular mediada por CEA de uma célula tumoral. Este método compreende contatar a dita célula tumoral com as moléculas de ligação de antígenos ou os conjugados de acordo com a presente invenção. Essas células tumoraís podem ser de células humanas, incluindo células de câncer colorretal, células de câncer de pulmão de células não pequenas (NSCLC), células de câncer gástrico, células de câncer pancreático e células de câncer de mama.

Além disso, a presente invenção fornece um método de tratamento de carcinomas (tais como carcinomas humanos) in vivo. Este método compreende a administração a um paciente de uma quantidade farmaceutícamente eficaz de uma composição que contém pelo menos uma das moléculas de ligação de antígenos ou os imunoconjugados (tais como a imunotoxina) de acordo com a presente invenção.

Em um aspecto adicional, a presente invenção refere-se a um método de tratamento de cânceres caracterizados pela sobre-expressão de CEA, incluindo, mas sem limitações, células de câncer colorretal, NSCLC (câncer de pulmão de células não pequenas), células de câncer gástrico, células de câncer pancreático e células de câncer de mama, por meio da administração de uma 5 quantidade terapeuticamente eficaz das moléculas de ligação de antígenos maturadas por afinidade e humanizadas ou moléculas de ligação de antígenos variantes descritas no presente.

Em uma realização adicional, a presente invenção refere-se a um método para induzir a regressão de tecido tumorais em um paciente utilizando as moléculas de ligação de antígenos maturados por afinidade e humanizadas ou moléculas de ligação de antígenos variantes descritas no presente. Exemplos não limitadores do tecido tu moral incluem tumor colorretal, tumor do pulmão de células não pequenas, tumor gástrico, tumor pancreático e tumor de mama. Em uma realização específica, o tecido tumoral é um tumor colorretal.

Segundo a prática da presente invenção, o paciente pode ser paciente humano, equino, suíno, bovino, murino, canino, felino e ave. Outros animais de sangue quente também são incluídos na presente invenção.

A presente invenção fornece ainda métodos de inibição do crescimento de células tumorais, tratamento de tumores em pacientes e tratamento de doenças do tipo proliferativo em pacientes. Estes métodos compreendem a administração ao paciente de uma quantidade eficaz da composição de acordo com a presente invenção.

Em outro aspecto, a presente invenção refere-se ao uso das moléculas de ligação de antígenos maturados por afinidade e humanizados ou moléculas de ligação de antígenos variantes descritas no presente para a fabricação de um medicamento para o tratamento de uma doença relativa à expressão de CEA anormal. Em uma realização específica, a doença é um câncer que sobre-expressa CEA, incluindo, mas sem limitações, tumor colorretal, tumor de pulmão de células não pequenas, tumor gástrico, tumor pancreático e tumor de mama. Em uma realização específica, o tumor é um tumor colorretal.

COMPOSIÇÕES, FORMULAÇÕES, DOSAGENS E VIAS DE ADMINISTRAÇÃO: Em um aspecto, a presente invenção refere-se a composições 5 farmacêuticas que compreendem as ABMs de acordo com a presente invenção e um veículo farmaceuticamente aceitável. A presente invenção refere-se ainda ao uso dessas composições farmacêuticas no método de tratamento de doenças tais como câncer ou na fabricação de um medicamento para o tratamento de doenças tais como câncer. Especificamente, a presente invenção refere-se a um método de tratamento de doenças e, mais especificamente, de tratamento de câncer, em que o método compreende a administração de uma quantidade terapeuticamente eficaz da composição farmacêutica de acordo com a presente invenção.

Em um aspecto, a presente invenção engloba composições farmacêuticas, combinações e métodos de tratamento de carcinomas humanos, tais como carcinoma colorretal. A presente invenção inclui, por exemplo, composições farmacêuticas para uso no tratamento de carcinomas humanos que compreende uma quantidade farmaceuticamente eficaz de um anticorpo de acordo com a presente invenção e um veículo farmaceuticamente aceitável.

As composições de ABM de acordo com a presente invenção podem ser administradas utilizando modos de administração convencionais que incluem, mas sem limitações, administração intravenosa, intraperitoneal, oral, intralinfática ou direta no tumor. Prefere-se administração intravenosa.

Em um aspecto da presente invenção, formulações terapêuticas que contêm as ABMs de acordo com a presente invenção são preparadas para armazenagem por meio da mistura de um anticorpo que possua o grau desejado de pureza com veículos, excipientes ou estabilizantes farmaceuticamente aceitáveis opcionais (Remington's Pharmaceutica/ Sciences, 16a edição, Osol, A.

Ed. (1980)), na forma de formulações liofilizadas ou soluções aquosas. Veículos, excipientes ou estabilizantes aceitáveis são não tóxicos para pacientes nas dosagens e concentrações empregadas.

As formulações a serem utilizadas para administração in vivo devem 5 ser estéreis. Isso é facilmente obtido por meio de filtragem através de membranas de filtragem estéreis.

O modo de administração e regime de dosagem mais eficaz para as composições farmacêuticas de acordo com a presente invenção depende da severidade e do curso da doença, da saúde do paciente, da reação ao tratamento 1o e do julgamento do médico atendente. Consequentemente, as dosagens das composições deverão ser tituladas para o paciente individual. Uma dose eficaz das composições de acordo com a presente invenção geralmente estará, entretanto, na faixa de cerca de 0,01 a cerca de 2000 mg/kg.

As moléculas descritas no presente podem encontrar-se em uma série de formas de dosagem que incluem, mas sem limitações, suspensões ou soluções líquidas, pastilhas, pílulas, pós, supositórios, microcápsulas poliméricas ou microbolhas, lipossomos e soluções injetáveis ou infusíveis. A forma preferida depende do modo de administração e da aplicação terapêutica.

A composição que compreende uma ABM de acordo com a presente invenção será formulada, dosada e administrada de forma consistente com a boa prática médica. Fatores para consideração neste contexto incluem a doença ou distúrbio específico sendo tratado, o mamífero específico sendo tratado, a condição clínica do paciente individual, a causa da doença ou distúrbio, o local de fornecimento do agente, o método de administração, o cronograma de administração e outros fatores conhecidos dos praticantes da medicina. A quantidade terapeuticamente eficaz do antagonista a ser administrado será regida por essas considerações.

Os exemplos abaixo explicam a presente invenção com mais detalhes. Os exemplos e preparações a seguir são fornecidos para permitir aos técnicos no assunto a compreensão mais clara e a prática da presente invenção.

A presente invenção não tem seu escopo limitado, entretanto, pelas realizações 5 exemplificadas, que se destinam a ser apenas ilustrações de aspectos isolados da presente invenção e métodos que são funcionalmente equivalentes encontram-se dentro do escopo da presente invenção. Na realidade, várias modificações da presente invenção, além das descritas no presente, tornar-se-ão evidentes para os técnicos no assunto a partir do relatório descritivo acima e das figuras anexas.

Essas modificações destinam-se a enquadrar-se dentro do escopo das reivindicações anexas.

EXEMPLOS A menos que especificado em contrário, as referências à numeração de posições de resíduos de aminoácidos específicos nos Exemplos a seguir são de acordo com o sistema de numeração de Kabat.

EXEMPLO 1 Geração de bibliotecas de maturação por afinidade: Biblioteca H1/H2 Para a geração de uma biblioteca de maturação por afinidade aleatorizada na região HCDR1 e HCDR2, trios que codificam as posições F32 G33 em COR 1 e as posições W50 N52 T52a K52b T54 E56 T58 em CDR2 foram aleatorizadas. Em uma primeira etapa, um fragmento de DNA (fragmento 1) foi amplificado utilizando pMS22 como modelo e os primers MS- 43 e EAB-679 que contêm as posições CDR1 aleatorizadas (Fig. 11 e Tabela 6). Utilizando o mesmo modelo, os primers MS-56 e MS-52 amplificaram um segundo fragmento (fragmento 2) que possui uma região sobreposta com a extremidade 3' do fragmento 1. As condições de amplificação incluíram uma etapa de incubação inicial a 94 oc por cinco minutos seguida por 25 ciclos,

cada qual consistindo de desnaturação a 94 c por um minuto, combinação a o 55 o c por um minuto e uma etapa de alongamento a 72 c por vinte segundos o e cinquenta segundos para o fragmento 1 e o fragmento 2, respectivamente.

Por fim, foi realizada uma etapa de incubação final a 72 oc por dez minutos. 5 Os dois fragmentos foram purificados sobre um gel de agarose. PCR de extensão sobreposta com fragmento 1 e fragmento 2 utilizando os primers MS-43 e EAB-680, que abrigaram posições aleatorizadas de CDR2, gerou um fragmento com as duas CDRs aleatorizadas (fragmento 3). Para a montagem dos fragmentos 1 e 2, foram utilizadas quantidades equimolares de fragmento 1 e fragmento 2. As condições de amplificação incluíram uma etapa de incubação inicial a 94 oc por cinco minutos seguida por cinco ciclos sem c por um minuto, primers, em que cada ciclo consiste em desnaturação a 94 o combinação a 55 oc por um minuto e uma etapa de alongamento a 72 oc por quarenta segundos. Após a adição dos primers externos, foram realizados vinte ciclos adicionais utilizando os mesmos parâmetros. Um quarto fragmento (fragmento 4) que se sobrepõe à região 3' do fragmento 3 foi amplificado por PCR utilizando novamente pMS22 como modelo e os primers MS-55 e MS-52.

Após purificação com gel, uma PCR de extensão sobreposta final utilizando os fragmentos 3 e 4 como modelos e os primers MS-43 e MS-52 gerou um fragmento que contém CL e porções de VH. Para isso, foram utilizadas quantidades equimolares de fragmento 3 e fragmento 4. As condições de amplificação incluíram uma etapa de incubação inicial a 94 oc por cinco minutos seguida por cinco ciclos sem primers, em que cada ciclo consiste em desnaturação a 94 oc por um minuto, combinação a 55 oc por um minuto e uma etapa de alongamento a 72 c por oitenta segundos. Após a adição dos o primers externos, foram realizados vinte ciclos adicionais utilizando os mesmos parâmetros. O fragmento resultante foi purificado com gel em seguida e ligado com pMS22 após digestão de Ncoi/Nhel.

TABELAS Prime r SEQ ID No Sequências de nucleotídeos de primers de bibliotecas H1/H2 MS-43 123 CCAGCCGGCCATGGCCGATATCCAGATGACCCAGTCT

CCATC MS-52 124 GAAGACCGATGGGCCTTTGGTGCTAG MS-55 125 GCAACATATGTTGAAGAGTTTAAGGGACGG MS-56 126 ATGAACTGGGTGCGACAGGCCCCTG EAB-679 127 CAGGGGCCTGTCGCACCCAGTTCATMNNAWACTCAGT

GAAGGTGTATCCAGAAGCC EAB-680 128 CCGTCCCTTAAACTCTTCAACATAGGTTGCCTCTCCAG

TTTTGGTGTTTATCCATCCCATCCACTCAAGCCCTTGTC

CAGG Aleatorização de primers EAB-679 e EAB-680: Sublinhado: 60% de base original e 40% de aleatorização como N Biblioteca L1/L2 Para a geração de uma biblioteca de maturação por afinidade aleatorizada na região LCDR1 e LCDR2, trios que codificam as posições Q27, N28, V29, G30 T31 N32 em CDR1 e as posições Y49 S50 Y53 R54 Y55 S56 em CDR2 foram aleatorizadas. Em uma primeira etapa, um fragmento de DNA (fragmento 1) foi amplificado utilizando pMS22 como modelo e os primers EAB-685 e EAB-681 que contêm as posições CDR1 aleatorizadas (Fig. 12 e Tabela 6). Utilizando o mesmo modelo, os primers EAB-686 e EAB-687 amplificaram um segundo fragmento (fragmento 2) que possui uma região sobreposta com a extremidade 3' do fragmento 1. As condições de amplificação incluíram uma etapa de incubação inicial a 94 oc por cinco minutos seguida por 25 ciclos, cada qual consistindo de desnaturação a 94 oc por um minuto, combinação a 55 oc por um minuto e uma etapa de alongamento a 72 o c por sessenta segundos para o fragmento 1 e fragmento 2, respectivamente.

Por fim, foi realizada uma etapa de incubação final a 72

5 oc por dez minutos.

Os dois fragmentos foram purificados sobre um gel de agarose.

PCR de extensão sobreposta com fragmento 1 e 2 utilizando os primers EAB-685 e EAB-682, que abrigaram posições aleatorizadas de CDR2,

gerou um fragmento com as duas CDRs aleatorizadas (fragmento 3). Para a montagem dos fragmentos 1 e 2, foram utilizadas quantidades equimolares de fragmento 1 e fragmento 2. As condições de amplificação incluíram uma etapa de incubação inicial a 94oc por cinco minutos seguida por cinco ciclos sem primers, em que cada ciclo consiste em desnaturação a 94 c por um minuto, o combinação a 55 oc por um minuto e uma etapa de alongamento a 72 oc por sessenta segundos.

Após a adição dos primers externos, foram realizados vinte ciclos adicionais utilizando os mesmos parâmetros.

Um quarto fragmento

(fragmento 4) que se sobrepõe à região 3' do fragmento 3 foi amplificado por

PCR utilizando novamente pMS22 como modelo e os primers EAB-688 e

EAB-687. Após purificação com gel, uma PCR de extensão sobreposta final utilizando os fragmentos 3 e 4 como modelos e os prmers EAB-685 e EAB-

687 gerou um fragmento que contém VL e porções de CL.

Para isso, foram utilizadas quantidades equimolares de fragmento 3 e fragmento 4. As condições de amplificação incluíram uma etapa de incubação inicial a 94 oc por cinco minutos seguida por 5 ciclos sem primers, em que cada ciclo oc por um minuto, combinação a 55 oc por um consiste em desnaturação a 94 minuto e uma etapa de alongamento a 72 oc por oitenta segundos.

Após a adição dos primers externos, foram realizados vinte ciclos adicionais utilizando os mesmos parâmetros.

Este fragmento foi ligado em seguida com pMS22 após a digestão de Hindiii/Sacl.

TABELA 7 Prime r SEQ ID No Sequências de nucleotídeos de primers de bibliotecas L1/L2 EAB-685 129 CAGCTATGACCATGATTACGCCAAGCTTGCATGCAA

ATTCTATTTCAAGG EAB-686 130 GTTGCGTGGTATCAGCAGAAACCAGGG EAB-687 131 GCTCTTTGTGACGGGCGAGCTCAGGCCCTGATGG EAB-688 132 GGAGTCCCATCAAGGTTCAGTGGCAGTGGATCTGG EAB-681 133 CCTGGTTTCTGCTGATACCACGCAACATTAGTACCC

ACATTCTGACTGGCCTTGCAAGTGATGGTGACTC EAB-682 134 CTGCCACTGAACCTTGATGGGACTCCACTGTAGCG

GTAGGATGCCGAATAGATCAGGAGCTTAGGTGCTT

TCCCTGG Aleatorização de primers EAB-681 e EAB-682: Sublinhado: 60% de base original e 40% de aleatorização como N.

Bibliotecas H3 Para a geração de bibliotecas de maturação por afinidade aleatorizadas na região HCOR3, trios que codificam as posições W95, 096, F97, Y98, 099, Y100, V100a, E100b, A100c e M100d foram aleatorizados em duas abordagens diferentes: (1) aleatorização de todo o segmento (bibliotecca completa H3) ou (2) aleatorização individual de cada posição, resultando em dez sub- 1o bibliotecas. Sub-bibliotecas contendo clones com posições individualmente aleatorizadas foram reunidas após transformação em bactérias (biblioteca reunida H3). Para aleatorização da região HCOR3, os fragmentos foram amplificados por PCR utilizando um primer que foi combinado na extremidade 3' de CL e primers que abrigam as sequências aleatorizadas de HCOR3 (Fig. 13). Realizou-se em seguida PCR de extensão sobreposta com um segundo fagmento que se sobrepõe à extremidade 3' do fragmento 1 e compreende a extremidade de VH e a região 5' de CH 1. Os fragmentos reunidos foram ligados em seguida em pMS22 após ingestão de Saci!Nhel. Para a geração da biblioteca reunida H3, dez 5 fragmentos de DNA foram amplificados por PCR separadamente utilizando cada um dos primers AC7-AC16 em combinação com o primer EAB-749. Para a geração da biblioteca completa L3, foram utilizados os primers AC17 e EAB-749.

O plasmídeo pMS22 foi utilizado como modelo. As condições de amplificação incluíram uma etapa de incubação inicial a 94 o c por cinco minutos seguida por 25 ciclos, cada qual consistindo de desnaturação a 94 o c por um minuto, combinação a 55 oc por um minuto e uma etapa de alongamento a 72 oc por 36 segundos, seguida por uma etapa de incubação final a 72 c por dez minutos. Isso resultou o em fragmentos com cerca de 580 bp de comprimento que foram purificados sobre gel de agarose. Para o PCR de extensão sobreposto, foi amplificado um segundo fragmento utilizando o primer EAB-750 ou EAB-751 em combinação com EAB-

752. Embora o primer EAB-750 possuísse uma sequência sobreposta com primers de aleatorizaçãoAC7-11, EAB-751 compartilhou homologias de sequência com os primers de aleatorização AC12-17. As condições de amplificação incluíram uma etapa de incubação inicial a 94oc por cinco minutos seguida por 25 ciclos, cada qual consistindo de desnaturação a 94 c por um minuto, combinação a 55 c por o o um minuto e uma etapa de alongamento a 72 c por doze segundos, seguida por o uma etapa de incubação final a 72 c por dez minutos. Os fragmentos resultantes o possuíam cerca de 180 bp de comprimento. Para a montagem dos dois fragmentos, foram utilizadas quantidades equimolares de fragmento 1 e do fragmento 2 correspondente. As condições de amplificação incluíram uma etapa de incubação inicial a 94 oc por cinco minutos seguida por cinco ciclos sem oc por um minuto, primers, em que cada ciclo consiste em desnaturação a 94 combinação a 55 oc por um minuto e uma etapa de alongamento a 72 oc por

11 o sessenta segundos. Após a adição dos primers externos EAB-749 e EAB-752, foram realizados vinte ciclos adicionais utilizando os mesmos parâmetros. Por fim, foi realizada uma etapa de incubação final a 72 oc por dez minutos. Os fragmentos purificados com gel foram ligados em seguida em pMS22 após digestão de Saci!Nhel e as ligações purificadas foram transformadas em bactérias TG1 por meio de eletroporação. TABELA 8 Primer SEQIDW Bibliotecas h3 - Sequência de Nucleotídeos de Primer AC7 135 CCAGTAGTCCATAGCCTCCACGTAATCATAGAAGTCMNNTCTCGCA

CAGTAATACACGGCAGTG AC8 136 CCAGTAGTCCATAGCCTCCACGTAATCATAGAAMNNCCATCTCGCA

CAGTAATACACGGCAGTG AC9 137 CCAGTAGTCCATAGCCTCCACGTAATCATAMNNGTCCCATCTCGCA

CAGTAATACACGGCAGTG AC10 138 CCAGTAGTCCATAGCCTCCACGTAATCMNNGAAGTCCCATCTCGCA

CAGTAATACACGGCAGTG AC11 139 CCAGTAGTCCATAGCCTCCACGTAMNNATAGAAGTCCCATCTCGCA

CAGTAATACACGGCAGTG AC12 140 CGTGGTCCCTTGGCCCCAGTAGTCCATAGCCTCCACMNNATCATA

GAAGTCCCATCTCGCACAG AC13 141 CGTGGTCCCTTGGCCCCAGTAGTCCATAGCCTCMNNGTAATCATAG

AAGTCCCATCTCGCACAG AC14 142 CGTGGTCCCTTGGCCCCAGTAGTCCATAGCMNNCACGTAATCATA

GAAGTCCCATCTCGCACAG AC15 143 CGTGGTCCCTTGGCCCCAGTAGTCCATMNNCTCCACGTAATCATAG

AAGTCCCATCTCGCACAG AC16 144 CGTGGTCCCTTGGCCCCAGTAGTCMNNAGCCTCCACGTAATCATA

GAAGTCCCATCTCGCACAG AC17 145 CGTGGTCCCTTGGCCCCAGTAGTCCATAGCCTCCACGTAATCATAG

AAGTCCCATCTCGCACAGTAATACACGGCAG EAB- 146 CCATCAGGGCCTGAGCTCGCCCGTC 749

Prime r SEQ 10 N° Bibliotecas h3 - Sequência de Nucleotídeos de Primer EAB- 147 CGTGGAGGCTATGGACTACTGGGGCCAAGG 750 EAB- 148 GACTACTGGGGCCAAGGGACCACGGTCAC 751 EAB- 149 GGTCAGGGCGCCTGAGTTCCACG 752 Aleatorização do primer AC17: Negrito e itálico: 60% de base original e 40% de aleatorização como M.

Sublinhado: 60% de base original e 40% de aleatorização como N.

5 Bibliotecas L3 Para a geração de bibliotecas de maturação por afinidade aleatorizadas na região CDR3 da cadeia leve, trios que codificam as posições Y91, Y92, T93, Y94 e L95a foram aleatorizados ao longo de todo o segmento (biblioteca completa L3) ou resultaram individualmente em cinco sub-bibliotecas.

Sub-bibliotecas contendo clones com posições individualmente aleatorizadas foram reunidas após transformação em bactérias (biblioteca reunida L3). Para a geração das sub-bibliotecas, cinco fragmentos de DNA foram amplificados por PCR utilizando cada um dos primers AC 1-AC5 em combinação com o primer MS43. Para a geração da biblioteca completa L3, foram utilizados os primers AC6 e MS43 (Fig. 14). O plasmídeo pMS22 foi utilizado como modelo. As condições de oc por cinco minutos amplificação incluíram uma etapa de incubação inicial a 94 seguida por 25 ciclos, cada qual consistindo de desnaturação a 94 oc por um minuto, combinação a 55 oc por um minuto e uma etapa de alongamento a 72 oc por 25 segundos, seguida por uma etapa de incubação final a 72 oc por dez minutos. Os fragmentos resultantes que englobam as posições 1 a 104 do domínio VL foram purificados sobre um gel de agarose e utilizados como modelo de amplificação por PCR adicional. Todas as reações foram realizadas com o primer

EAB-746, que possui uma sequência sobreposta com os primers de aleatorização e MS43 utilizando as mesmas condições descritas acima. Os fragmentos purificados, bem como pMS22, foram digeridos com Ncoi/Xhol. Para todas as cinco sub-bibliotecas, 0,51Jg de inserto foram ligados com 0,51Jg de pAC16. Para 5 a biblioteca completa de L3, realizou-se ligação com 9,81Jg de inserto e 9,81Jg de pMS22. As ligações purificadas foram transformadas em bactéria TG1 por meio de eletroporação.

TABELA 9 Primer SEQ ID No Bibliotecas L3 - Sequência de Nucleotídeos de Primer AC1 150 GGTGCCCTGGCCAAACGTGAATAGAGGATAGGTGTAMNNTT

GGTGACAGTAGTAAGTTGC AC2 151 GGTGCCCTGGCCAAACGTGAATAGAGGATAGGTMNNATATT

GGTGACAGTAGTAAGTTGC AC3 152 GGTGCCCTGGCCAAACGTGAATAGAGGATAMNNGTAATATT

GGTGACAGTAGTAAGTTGC AC4 153 GGTGCCCTGGCCAAACGTGAATAGAGGMNNGGTGTAATATT

GGTGACAGTAGTAAGTTGC AC5 154 GGTGCCCTGGCCAAACGTGAAMNNAGGATAGGTGTAATATT

GGTGACAGTAGTAAGTTGC AC6 155 GGTGCCCTGGCCAAACGTGAATAGAGGATAGGTGTAATATT

GGTGACAGTAGTAAGTTGC EAB-746 156 CGCTTGATCTCGAGCTTGGTGCCCTGGCCAAACGTG MS-43 123 CCAGCCGGCCATGGCCGATATCCAGATGACCCAGTCTCCAT c Aleatorização de primer AC6: Negrito e itálico: 60% de base original e 40% de aleatorização como M.

Sublinhado: 60% de base original e 40% de aleatorização como N.

GERAÇÃO DOS ANTÍGENOS: Como anticorpos murinos PR1A3 e humanizados reconhecem apenas CEA humano ligado à membrana mas não solúvel particulado, foi gerada 5 uma proteína quimérica recombinante que contém o epítopo de PR1A3 para maturação por afinidade in vitro de PR1A3 humanizado (SEQ 10 No 7 e 8). A geração desta proteína híbrida foi realizada conforme descrito em Steward et ai,

1999. Resumidamente, a sequência de ONA do domínio 8 de glicoproteína biliar humana (8GP) foi substituída pela sequência do domínio CEA-83 humano, que contém o epítopo de PR1A3. Como resultado, a sequência codifica uma proteína híbrida que compreende os domínios N e A 1 de 8GP, o domínio 83 de CEA e o domínio A2 de 8GP (N-A1-83-A2, huNA8A). Este produto de fusão foi ligado à porção Fc de lgG1 humano (huNA8A-Fc) (Steward et ai, Cancer lmmunol.

/mmunother., 47: 299-306, 1999) ou fundido a uma sequência que codifica o local de divisão de protease de precisão, um marcador avi e um marcador (His)6 (huNA8A-avi-his) (SEQ 10 No 158). huNA8A-Fc foi purificado a partir do sobrenadante de uma linhagem de células CHO adequadamente transfectadas utilizando uma coluna de proteína A. huNA8A-avi-his sofreu transfecção transitória em células HEK 293, que expressam de forma estável a proteína derivada de E8V EBNA. Um plasmídeo cotransfectado simultaneamente que codifica uma ligase de biotina permitiu a biotinilação específica do marcador avi in vivo. A proteína foi purificada em seguida por meio de cromatografia de afinidade de metal imobilizado (IMAC) seguida por filtragem de gel.

SEQ 10 No 158 (huNA8A-avi-his) pETR6592

QLTTESMPFNVAEGKEVLLLVHNLPQQLFGYSWYKGERVOGNRQIVGYAIGTQQ ATPGPANSGRETIYPNASLLIQNVTQNOTGFYTLQVIKSOLVNEEATGQFHVYPEL PKPSISSNNSNPVEOKOAMAFTCEPETQDTTYLWWINNQSLPVSPRLQLSNGNR TLTLLSVTRNDTGPYECEIQNPVSANRSOPVTLNVTYGPDTPTISPPDSSYLSGAN LNLSCHSASNPSPQYSWRINGIPQQHTQVLFIAKITPNNNGTYACFVSNLATGRN NSIVKSITVSALSPWAKPQIKASKTTVTGDKDSVNLTCSTNDTGISIRWFFKNQSL PSSERMKLSQGNITLSINPVKREDAGTYWCEVFNPISKNQSDPIMLNVNYNALPQ

ENLINVDLEVLFQGPGSGLNDIFEAQKIEWHEARAHHHHHH 5 MATURAÇÃO POR AFINIDADE DE PR 1A3 HUMANIZADO: A geração de PR1A3 Fabs humanizados maturados por afinidade foi conduzida por meio de exibição de fagos utilizando protocolos padrão (Silacci et ai, Proteomics, 5 (9): 2340-2350, 2005). Seleções com todas as bibliotecas de maturação por afinidade foram conduzidas em solução de acordo com o procedimento a seguir: 1. ligação de cerca de 1012 partículas de fagomídeo de cada biblioteca de maturação por afinidade a 100 nM de huNABA-avi-his biotinilado por meia hora em um volume total de 1 ml; 2. captura de huNABA-avi- his biotinilado e partículas de fago especificamente ligadas por meio da adição de 5,4 x 10 7 esferas magnéticas revestidas com estreptavidina por dez minutos; 3.

lavagem de esferas utilizando 5-10x 1 ml de PBSffween 20 e 5-10x 1 ml de PBS;

4. eluição de partículas de fago por meio da adição de 1 ml de 100 mM de TEA (trietilamina) por dez minutos e neutralização adicionando 500 IJI de 1 M de Tris/HCI, pH 7,4; e 5. reinfecção de bactéria TG1 de E co/i em crescimento exponencial, infecção com fago auxiliar VCSM13 e precipitação de PEG/NaCI subsequente de partículas de fagomídeos a serem utilizadas em rodadas de seleção subsequentes. As seleções foram conduzidas ao longo de três a cinco rodadas utilizando concentrações de antígeno constantes ou decrescentes (de 1o- 7 M para 2x1 o-9 M). Na rodada 2, a captura de complexos de antígeno e fago foi realizada utilizando placas de neutravidina no lugar de esferas de estreptavidina.

Aglutinantes específicos foram identificados por meio de ELISA conforme segue: 100 IJI de 1O nM de huNABA-avi-his biotinilado por cavidade foram revestidos sobre placas de neutravidina. Foram adicionados sobrenadantes bacterianos que contêm Fab e Fabs de ligação foram detectados por meio dos seus marcadores

Flag utilizando um anticorpo secundário anti-Fiag/HRP. Clones positivos para ELISA foram expressos de forma bacteriana como fragmentos de Fab solúveis em formato de 96 cavidades e os sobrenadantes foram submetidos a um experimento de seleção cinética por meio de análise de SP utilizando BIACORE T1 00. Clones 5 que expressam Fabs com as constantes de afinidade mais altas foram identificados e os fagomídeos correspondentes foram sequenciados.

PURIFICAÇÃO DE FABS E MEDIÇÃO DOS PARÂMETROS CINÉTICOS: Para análise exata dos parâmetros cinéticos, Fabs foram purificados a partir de cultivos bacterianos. Um cultivo de 500 ml foi inoculado e induzido com 1 mM de IPTG em 00600 de 0,9. As bactérias foram incubadas a 25 oc por uma noite e colhidas por meio de centrifugação. Após a incubação da pelota suspensa por vinte minutos em 25 ml de tampão PPB (30 mM de Tris-HCI, pH 8, 1 mM de EDTA, 20% de sacarose), as bactérias foram novamente centrifugadas e o sobrenadante foi colhido. Esta etapa de incubação foi repetida por uma vez com 25 ml de uma solução de 5 mM de MgS04. Os sobrenadantes das duas etapas de incubação foram reunidos, filtrados e carregados sobre uma coluna IMAC (His gravitrap, GE Healthcare). Em seguida, a coluna foi lavada com quarenta volumes.

Após a eluição (500 mM de NaCI, 500 mM de imidazol, 20 mM de NaH2P04, pH 7,4), o eluído foi novamente tamponado utilizando colunas PD1 O(GE Healthcare).

Os parâmetros cinéticos dos Fabs purificados foram estudados em seguida por meio de análise de SPR em uma fileira de diluição que variou de 200 nM a 6,25 nM.

EXEMPL02 O anticorpo PR 1A3 foi quimerizado para ter uma região constante de lgG1/capa humano e expresso utilizando a tecnologia GylcoMab, a fim de ter alto grau de açúcares afucosilados no Fc. Os anticorpos glicoprojetados e não glicoprojetados foram comparados em uma razão entre efetor e alvo de 25:1. A quantidade máxima de morte de células alvo dependentes de anticorpos foi dobrada por meio de glicoprojeção da região Fc (Figura 2). Aumento adicional da morte celular foi atingido aumentando a razão entre efetor e alvo (Figura 2).

PR1A3 foi humanizado utilizando estruturas idênticas a sequências de linhagem de germens humanas. A sequência IMGT IGHV?-4-1*02 (Acesso no 5 X6211 O) foi o receptor de VH humanizado e IMGT_hVK_1_39 (Acesso no X59315) foi o receptor de humanização VL. Um anticorpo PR1A3 humanizado que compreende uma construção de região variável de cadeia pesada CH7 A e uma construção de região variável de cadeia leve CL 1A exibiu ligação satisfatória a células de carcinoma do cólon humanas conforme medido por meio de citometria de fluxo (Figura 3).

Realizou-se maturação por afinidade de PR 1A3 por meio de exibição de fagos utilizando protocolos padrão conforme descrito em detalhes no Exemplo 1 do presente. O anticorpo PR1A3 humanizado parenta! que foi utilizado para maturação por afinidade compreende uma construção de região variável de cadeia pesada CH7A e uma construção de região variável de cadeia leve CL 1A. As Tabelas 3 a 6 abaixo exibem as bibliotecas utilizadas para maturação de afinidade. Para a biblioteca L 1/L2, as posições Valina 29, Alanina 50 ou Serina 51 nas CDRs foram mantidas constantes. Para a biblioteca H1/H2, as posições lsoleucina 51, Glicina 55 ou Alanina 57 nas CDRs foram mantidas constantes (Figuras 4 e 5).

Uma construção de região variável de cadeia pesada maturada por afinidade, CH7A rF9, e uma construção de região variável de cadeia leve maturada por afinidade, CL 1A rH11, foram emparelhadas com a construção de região variável de cadeia leve parenta! e a construção de região variável de cadeia pesada, respectivamente, e entre si. Todos os anticorpos foram convertidos em lgG1/capa humano e a ligação à linhagem celular positiva para CEA MKN45 foi medida por meio de citometria de fluxo. Os anticorpos que compreendem uma região variável de cadeia leve ou pesada maturada por afinidade ou as duas regiões variáveis de cadeia leve ou pesada maturadas por afinidade exibiram melhores características de ligação em comparação com o anticorpo parenta! humanizado (Figura 6). As Figuras 6, 1O e 15 exibem diversos exemplos em que as cadeias leve e pesada 5 maturadas contribuem independentemente com o aumento da afinidade. O anticorpo parenta I CH7A CL 1A possui a intensidade de sinal mais baixa, bem como o valor EC50 mais alto nas Figuras 6 e 15. A cadeia leve maturada substitui os valores EC50 por números mais baixos, enquanto as cadeias pesadas maturadas (rF9 na Figura 6 e rB9 na Figura 15) substituem a intensidade de sinal de fluorescência total em uma medição de citometria de fluxo. A Figura 1O exibe as contribiuções individuais de cadeia leve e pesada medidas por meio de metodologia Biacore. A combinação dessas duas cadeias aumenta ainda mais a afinidade.

As afinidades de ligação das CDRs de cadeia leve e pesada maturadas por afinidade foram determinadas por meio de Biacore e relacionadas na Tabela 10 abaixo.

TABELA 10 SEQ ID No CDR-H3 Afinidade Construção (os resíduos aleatorizados são resíduos (determinada por selecionados sublinhados em negrito) meio de Biacore) 25 WDFYDYVEAMDY 3681 nM PMS22 26 WDFYHYVEAMDY 586 nM 1C8 27 WDFVDYVEAMDY 1893 nM 3E1 28 WDFYWYVEAMDY 746 nM 207 33 WDFAHYFQTMD 59 nM CDRH-3 maturado por afinidade 34 WDFAYYFQTMD 44 nM CDRH-3 maturado por afinidade

35 WDFAYYLEAMD 69 nM CDRH-3 maturado por afinidade

29 W DA F E Y V K A L O Y 26 nM H3 total (5) 19

30 WDFFEYFKTMDY 51 nM H3 total (5) 8

31 WDFFYYVQTMDY 81 nM H3 total (5) 28

33 WDFSYYVEAMDY 132 nM H3 total (5) 27

CDR-H1 e CDR-H2

Os resíduos aleatorizados estão sublinhados e os resíduos selecionados em negrito

1 e 13 EFGMN e WINTKTG_EAIYVEEFKG 3681 nM pMS22

1 e 14 EFGMN e WINTKTGEATYIEEFKG 402 nM H4E9

1 e 15 EFGMN e WINTKSGEATYVEEFKG pAC14 (89)

2 e 15 EYGMN e WINTKSGEATYVEEFKG pAC15 (F9)

3 e 16 EYSMN e YINTKNGEANYVEEFKG H1/H2 (5) 2

2 e 17 EYGMN e WINTKNGEATYIEEFKG H1/H2 (5) 11

1 e 16 EFGMN e YINTKNGEANYVEEFKG H1/H2(5)13

2 e 16 EYGMN e YINTKNGEANYVEEFKG H1/H2 (5) 14 e 13 EFGMS e WINTKTG_EAIYVEEFKG 26 nM H3 total (5) 19

COR-L 1 e CDR-L2

Os resíduos aleatorizados estão sublinhados e os resíduos selecionados em negrito

36 e 46 QNVGTN e YSASYRYS 3681 nM pMS22

37 e 47 ANVGNN e YLASNLSG 250 nM pAC21 (3A1)

38 e 48 KNVGTN e YLASYPQI 700 nM pAC19 (2C6)

39 e 49 AAVGTY e YSASYRKR 220 nM pAC18 (2F1)

40 e 50 QYASTN e YWASYRYS 290 nM pAC23 (2F11)

36 e QNVGTN e PU-YSASYRYS 402 nM H4E9 - 41 e 51 HNVGTN e YSASHRYS 2255 nM L2D2

42 e 52 QIMGPN e YLASYHES pAC6 (C1)

43 e 53 QIVGTN e YSASHRPS pAC7 (E10)

COR-L 1 e CDR-L2

Os resíduos aleatorizados estão sublinhados e os resíduos selecionados em negrito

44 e 54 QKVL TN e YLASYRYS pAC12 (H?)

45 e 55 QTVSAN e YLASYRYR pAC13 (H11)

CDR-L3

Os resíduos aleatorizados estão sublinhados e os resíduos selecionados em negrito

56 HQYYTYP_bFT pMS22

A Tabela 11 abaixo resume as constantes de afinidade das diversas sequências de anticorpos maturados por afinidade.

O anticorpo parental PR1A3 é relacionado, bem como diversas combinações de cadeia leve e cadeia pesada de sequências maturadas e não maturadas.

Todos os valores foram obtidos por meio de tecnologia Biacore medindo-se as constantes de velocidade de associação (kon) e dissociação (kott) das diversas construções de anticorpo solúveis em formato Fab em um chip Biacore com reagente NABA-avi-his imobilizado (SEQ ID No 158) como antígeno.

A constante de afinidade é marcada com KD.

TABELA 11

ANÁLISE CINÉTICA DE CLONES MATURADOS POR AFINIDADE Nome do Cadeia Afinidade Monovalente Afinidade Bivalente Clone PR1A3 wt!wt k0 n: 6,74x10 3 1/Ms; koff: 2,48x10" kon: 2,82x10 5 1/Ms; koff: 5,52x10"4 2 1/s; KD 3681 x1 0" 9 M 1/s; KD: 2x10"9 M 1C8 hc/wt k0 n: 12,9x103 1/Ms; koff: 0,76x10" kan: 4,67x1 05 1/Ms; koff: 3,24x1 0"4 2 9 1/s; KD 586x1 0" M 1/s; 9 KD: 0,693x10" M H4E9 hc/wt k0 n: 5,22x1 03 1/Ms; kaff: 0,21 x1 o· kon: 2,92x10 5 1/Ms; koff: 2,04x10" 3 2 9 1/s; KD 402x1 0" M 1/s; KD: 0,7x10-9 M H3 Total hc/wt kan: 54,2x1 03 1/Ms; koff: O, 13x1 o· k0 n: 9,02x10 5 1/Ms; koff: 1,75x10-4 2 (5) 19 1/s; KD 24x10-9 M 1/s; 9 KD: O, 19x1 0" M H3 Total hc/wt k0 n: 27,3x10 3 1/Ms; koff: 0,14x10- N/D (5) 8 2 1/s·, KD 51x10-9 M 3A1 wt/lc kon: 46,8x1 03 1/Ms; kaff: 1, 17x1 o· kan: 2,42x1 05 1/Ms; kaff: 3,64x1 0"4 2 9 1/s; KD 250x1 0" M 1/s; KD: 1,5x10"9 M 5 4 2F1 wtJ lc k0 n: 95,7x103 1/Ms; koff: 2,07x10" kan: 4,23x1 0 1/Ms; koff: 4,1 Ox1 0" 2 1/s; KD 220x1 0"9 M 1/s; KD: 0,952x1 0"9 M 5L 1A10 hc/wt k0 n: 15,6x103 1/Ms; koff: 0,09x10- N/D 2 1/s·, KD 59x10-9 M 5HFF12 hc/wt k0 n: 20,8x10 3 1/Ms; koff: 0,09x10- N/D 2 1/s; KD 44x1 0"9 M M4F1 hc/wt kan: 25, 7x1 03 1/Ms; koff: O, 17x1 o· N/D 2 1/s; KD 69x1 0-9M k0 n: 36,4x1 03 1/Ms; koff: 0,35x1 o· 4 H4E9x hcllc k0 n: 4,23x105 1/Ms; koff: 1,91x10" 2 9 2F1 1/s; KD 96x1 0" M 1/s; 9 KD: 0,452x1 0" M

Nome do Cadeia Afinidade Monovalente Afinidade Bivalente Clone

H4E9 X hc/lc N/D kon: 2,46x10 5 1/Ms; koff: 1,36x10-4 3A1 1/s; KD: 0,55x1 o-9 M 1C8 X 2F1 hc/lc kon: 68,1 x1 03 1/Ms; koff: 0,87x1 o- kon: 9,68x10 5 1/Ms; koff: 6,36x10-4 2 1/s; KD 128x10-9 M 1/s; KD: 0,66x1 o-9 M 1C8 X 3A1 hc/lc N/D kon: 2,89x10 5 1/Ms; koff: 2,57x10-4 1/s; KD: 0,888x10-9 M kon: 1, 76x1 0 1/Ms; koff: 2,84x1 o-4 6 H3 Total hc/lc k0 n: 206x1 03 1/Ms; koff: 0,25x1 0- (5) 19 X 2 1/s; KD: 12,2x10-9 M 1/s;

2F1 KD: O, 16x1 o-9 M

H3 Total hc/lc N/D kon: 9,93x10 5 ; 1/Ms; koff: 2,71x10-4 (5) 8 X 2F1 1/s; KD: 0,28x1 o-9 M

Claims (28)

REIVINDICAÇÕES

1. MOLÉCULA DE LIGAÇÃO DE ANTÍGENO (ABM), caracterizada pelo fato de que compreende um domínio de ligação de antígeno humanizado, maturado por afinidade, em comparação ao anticorpo monoclonal 5 murino PR1A3 que compreende uma ou mais regiões determinantes de complementaridade (CDRs), em que dito domínio de ligação de antígeno se liga especificamente ao antígeno carcinoembriônico (CEA) humano ligado à membrana com um valor KD menor que cerca de 100 nM, e em que dito domínio de ligação de antígeno se liga ao mesmo epítopo ou é capaz de competir pela ligação com PR1A3.

2. ABM, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que dito domínio de ligação de antígeno compreende uma região variável de cadeia pesada que compreende: uma COR 1 de cadeia pesada selecionada a partir do grupo que consiste em SEQ lO No 1, SEQ lO No 2, SEQ lO No 3, SEQ lO No 5, SEQ lO No 6, SEQ 10 No 7, SEQ 10 No 8, SEQ 10 No 9, SEQ 10 No 10 e SEQ 10 No 12; e uma CDR2 de cadeia pesada selecionada a partir do grupo que consiste em SEQ ID No 13, SEQ 10 No 14, SEQ 10 No 15, SEQ 10 No 16, SEQ 10 No 17, SEQ lO No 18, SEQ lO No 19, SEQ lO No 20, SEQ lO No 21, SEQ lO No 22, SEQ ID No 23 e SEQ ID No 24; e uma CDR3 de cadeia pesada selecionada a partir do grupo que consiste em SEQ 10 No 25, SEQ ID No 26, SEQ 10 No 27, SEQ 10 No 28, SEQ lO No 29, SEQ 10 No 30, SEQ lO No 31, SEQ lO No 32, SEQ lO No 33, SEQ ID No 34 e SEQ 10 No 35; e uma região variável de cadeia leve que compreende: uma COR 1 de cadeia leve selecionada a partir do grupo que consiste em SEQ 10 No 36, SEQ 10 No 37, SEQ ID No 38, SEQ 10 No 39, SEQ 10 No 40, SEQ ID No 41, SEQ 10 No 42, SEQ 10 No 43, SEQ ID No 44 e SEQ 10 No 45; e uma CDR2 de cadeia leve selecionada a partir do grupo que consiste em SEQ ID No 46, SEQ ID No 47, SEQ ID No 48, SEQ ID No 49, SEQ ID No 50, SEQ ID No 51, SEQ ID No 52, SEQ ID No 53, SEQ ID No 54 e SEQ ID No 55; e uma CDR3 de cadeia leve da SEQ ID No 56.

5 3. ABM, de acordo com a reivindicação 2, caracterizada pelo fato de que dita região variável de cadeia pesada compreende: SEQ ID No 9; SEQ ID N° 15; e SEQ ID N° 25; e em que dita região variável de cadeia leve compreende: SEQ ID No 45; SEQ ID N° 55; e SEQ ID No 56.

4. ABM, de acordo com a reivindicação 2, caracterizada pelo fato de que dita região variável de cadeia pesada compreende: SEQ ID No 2; SEQ ID N° 15; e SEQ ID N° 25; e em que dita região variável de cadeia leve compreende: SEQ ID No 45; SEQ ID N° 55; e SEQ ID No 56.

5. ABM, de acordo com uma das reivindicações 2 a 4, caracterizada pelo fato de que dita região variável de cadeia pesada compreende a sequência da SEQ ID No 107.

6. ABM, de acordo com uma das reivindicações 2 a 4, caracterizada pelo fato de que dita região variável de cadeia leve compreende a sequência da SEQ ID No 108.

7. ABM, de acordo com uma das reivindicações 1 a 6, caracterizada pelo fato de que dito domínio de ligação de antígeno compreende uma região variável de cadeia pesada que compreende a sequência da SEQ ID No 107, e uma região variável de cadeia leve que compreende a sequência da SEQ 5 IDN°108.

8. ABM, de acordo com a reivindicação 3 ou 4, caracterizada pelo fato de que dita região variável de cadeia pesada compreende um polipeptídeo que possui pelo menos 95% de identidade com a sequência da SEQ ID No 107, e dita região variável de cadeia leve compreende um polipeptídeo que possui pelo menos 95% de identidade com a sequência da SEQ ID No 108.

9. ABM, de acordo com uma das reivindicações 1 a 8, caracterizada pelo fato de que dita ABM compreende uma região Fc.

1O. ABM, de acordo com a reivindicação 9, caracterizada pelo fato de que dita região Fc é uma região Fc de lgG humana.

11. ABM, de acordo com a reivindicação 9 ou 1O, caracterizada pelo fato de que a região Fc é uma região Fc glicoprojetada.

12. ABM, de acordo com a reivindicação 11, caracterizada pelo fato de que pelo menos cerca de 20% a cerca de 100% dos oligossacarídeos N- ligados na dita região Fc são não fucosilados.

13. ABM, de acordo com a reivindicação 11, caracterizada pelo fato de que pelo menos cerca de 20% a cerca de 100% dos oligossacarídeos N- ligados na dita região Fc são bissecionados.

14. ABM, de acordo com a reivindicação 11, caracterizada pelo fato de que pelo menos cerca de 20% a cerca de 50% dos oligossacarídeos N- ligados na dita região Fc são bissecionados, não fucosilados.

15. ABM, de acordo com uma das reivindicações 11 a 14, caracterizada pelo fato de que dita ABM possui pelo menos uma função efetora aumentada em comparação ao anticorpo murino PR1A3.

16. ABM, de acordo com a reivindicação 15, caracterizada pelo fato de que dita pelo menos uma função efetora aumentada é selecionada a partir do grupo que consiste em: afinidade de ligação ao receptor Fc aumentada, citotoxicidade celular dependente de anticorpos (ADCC) aumentada, ligação a 5 células natural killers (NK) aumentada, ligação a macrófagos aumentada, ligação a monócitos aumentada, ligação a células polimorfonucleares aumentada, sinalização direta indutora de apoptose, maturação de células dendríticas aumentada e priming de células T aumentada.

17. ABM, de acordo com a reivindicação 16, caracterizada pelo fato de que dita função efetora aumentada é ADCC aumentada ou ligação a células NK aumentada.

18. ABM, de acordo com uma das reivindicações 1 a 17, caracterizada pelo fato de que dita ABM é um anticorpo ou fragmento do mesmo, selecionado a partir do grupo que consiste em: um anticorpo total, um fragmento scFv, um fragmento Fv, um fragmento F(ab')2, um minibody, um diabody, um triabody e um tetrabody.

19. ABM, de acordo com uma das reivindicações 1 a 18, caracterizada pelo fato de que dita ABM é pelo menos de cerca de dez vezes a cerca de mil vezes mais potente na indução de ADCC em uma determinada concentração em comparação com o anticorpo murino PR1A3.

20. ANTICORPO ANTI-CEA, caracterizado pelo fato de que compreende uma região variável de cadeia pesada que compreende: SEQ 10 No 2; SEQ 10 N° 15; e SEQ 10 N° 25; e uma região variável de cadeia leve que compreende: SEQ ID No 45; SEQ ID N° 55; e

SEQ 10 No 56.

21. ANTICORPO, de acordo com a reivindicação 20, caracterizado pelo fato de que o anticorpo compreende: (a) um domínio variável de cadeia pesada que possui pelo menos 5 95% de identidade de sequência com a sequência de aminoácidos da SEQ lO No 107; (b) um domínio variável de cadeia leve que possui pelo menos 95% de identidade de sequência com a sequência de aminoácidos da SEQ lO No 108; ou (c) um domínio variável de cadeia pesada como em (a) e um domínio variável de cadeia leve como em (b).

22. ANTICORPO, de acordo com a reivindicação 20, caracterizado pelo fato de que o anticorpo compreende uma sequência de domínio variável de cadeia pesada da SEQ lO No 107.

23. ANTICORPO, de acordo com a reivindicação 20, caracterizado pelo fato de que o anticorpo compreende uma sequência de domínio variável de cadeia leve da SEQ lO No 108.

24. ANTICORPO, de acordo com a reivindicação 20, caracterizado pelo fato de que o anticorpo compreende uma sequência de domínio variável de cadeia pesada da SEQ ID No 107 e uma sequência de domínio variável de cadeia leve da SEQ lO No 108.

25. ANTICORPO QUE SE LIGA ESPECIFICAMENTE A CEA ligado à membrana, caracterizado pelo fato de que dito anticorpo compreende a região variável de cadeia pesada da SEQ lO No 107 e a região variável de cadeia leve da SEQ lO No 108, em que dito anticorpo possui AOCC aumentada em comparação com o anticorpo murino PR1A3.

26. ANTICORPO, de acordo com uma das reivindicações 20 a 25, caracterizado pelo fato de que dito anticorpo compreende uma região Fc que tenha sido glicoprojetada.

27. ANTICORPO, de acordo com uma das reivindicações 20 a 26, caracterizado pelo fato de que dito anticorpo aumenta ADCC em pelo menos cerca de 10% a cerca de 100% em um ensaio de citotoxicidade in vitro.

5

28. POLINUCLEOTÍDEO, caracterizado pelo fato de que codifica a ABM, conforme definida em uma das reivindicações 1 a 19, ou o anticorpo, conforme definido em uma das reivindicações 20 a 27.

29. VETOR, caracterizado pelo fato de que compreende o polinucleotídeo conforme definido na reivindicação 28.

30. MICRO-ORGANISMO TRANSGÊNICO, caracterizado pelo fato de que compreende o vetor conforme definido na reivindicação 29.

31. MÉTODO DE PRODUÇÃO DE UMA ABM, que se liga especificamente a CEA humano ligado à membrana, caracterizado pelo fato de que dito método compreende: (a) cultivar o micro-organismo transgênico, conforme definido na reivindicação 30, em um meio sob condições que permitam a expressão do dito polinucleotídeo, em que dito polinucleotídeo codifica um polipeptídeo que faz parte da dita ABM; e (b) recuperar dita ABM; em que dita ABM ou uma porção da mesma se liga ao mesmo epítopo que, ou é capaz de competir pela ligação com, o anticorpo monoclonal murino PR1A3.

32. COMPOSIÇÃO, caracterizada pelo fato de que compreende a ABM conforme definida em uma das reivindicações 1 a 19, ou o anticorpo conforme defindo em uma das reivindicações 20 a 27, e um veículo farmaceuticamente aceitável.

33. MÉTODO PARA DIAGNÓSTICO IN VITRO DE DOENÇA, em um paciente, caracterizado pelo fato de que dito método compreende a administração ao dito paciente de uma quantidade eficaz de um agente de diagnóstico, em que dito agente de diagnóstico compreende a ABM conforme definida em uma das reivindicações 1 a 19, ou o anticorpo conforme definido em uma das reivindicações 20 a 27, e um marcador que permite a detecção de um 5 complexo do dito agente de diagnóstico e CEA.

34. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 33, caracterizado pelo fato de que dito marcador é um agente de formação de imagens.

35. USO DE ABM, conforme definida em uma das reivindicações 1 a 19, caracterizado pelo fato de que é na fabricação de um medicamento para o 1o tratamento de um paciente que possui um câncer que expressa CEA anormalmente.

36. USO DO ANTICORPO, conforme definido em uma das reivindicações 20 a 27, caracterizado pelo fato de que é na fabricação de um medicamento para o tratamento de um paciente que possui um câncer que expressa CEA anormalmente.

37. USO DA COMPOSIÇÃO, conforme definida na reivindicação 32, caracterizado pelo fato de que é na fabricação de um medicamento para o tratamento de um paciente que possui um câncer que expressa CEA anormalmente.

38. USO, de acordo com uma das reivindicações 35 a 37, caracterizado pelo fato de que dito câncer é selecionado a partir do grupo que consiste em câncer colorretal, câncer de pulmão de células não pequenas (NSCLC), câncer gástrico, câncer pancreático e câncer de mama.

39. USO DE ABM, conforme definida em uma das reivindicações 1 a 19, caracterizado pelo fato de que é na fabricação de um medicamento para induzir lise celular em uma célula tumoral.

40. USO, de acordo com a reivindicação 39, caracterizado pelo fato de que dita célula tumoral é selecionada a partir do grupo que consiste em células de câncer colorretal, câncer de pulmão de células não pequenas (NSCLC), células de câncer gástrico, células de câncer pancreático e células de câncer de mama.

41. USO, de acordo com a reivindicação 39, caracterizado pelo 5 fato de que dita lise celular é induzida por citotoxicidade celular dependente de anticorpo da dita ABM.

42. USO, de acordo com uma das reivindicações 35 a 41, caracterizado pelo fato de que dito medicamento compreende ainda um agente quimioterapêutico.

43. USO, de acordo com uma das reivindicações 35 a 42, caracterizado pelo fato de que dito paciente é um ser humano.

NH2 /\..C Local da glicosilação s s Ponte dissulfeto entre cisteínas Domínio N

PR1A3 -- ~

~

Q)

Extracelular

Membrana da célula

Intracelular

Fig. 1

Carcinoma de cólon lovo como células alvo para ADCC Liberação-LDH, análise 4-h, huPBMC como efetores. ~ so r--- ·--·---·----·-------------------~~---------------~-------·-- ------------~~------------------------------------ - - ·- - - - - - - - - - - - - - - - -------1 ~ I --*- chCEA Glicoproj. (E:T"' 50.1} ~ 50 1 "'O

CD ! ::::~EA :~:oproj (E:T = 251)

I ::::J 1~~EA ~ 40 modificado (E:T"=25:1) ::::J éD ~ lll ::::J .---+- o· 20 -· 30 t-~------J~._

II i Ii' --

N ~ O> o ..., "'O --....-~

I o \ -....-.. ~ 10- ~ 0 -~--- ---------------·-------------T·--·------------------ -,..--------------------,-------------------,.-- ••• ••••••-:• ••••-_,n~••~u• .r • 1o' 000 1'000 100 1o 1 0.1 Concentração de anticorpos (ng/ml) Fig. 2

Ligação a células de carcinoma do colón humano LoVo medido por FACS 6000 5000 ', -...Quimérico I ü: 4000 I ---6- Re-humanizado , L___ I :::! 3000 w 2000 1000 -- _....lo.

O) o

0.01 0.1 1 10 100 Concentração de anticorpos (ng/ml) Fíg. 3

VL's Kabat V PR1A3-VL

YXT Y P L

L -- ~ ~ O>

Y Y X Y P L

YYTXPL

Y Y T Y X L

YYTYPX Fig. 4

VH's

Kabat VH PRIA3

-- 0'1 ~

O)

Fig. 5

30000 r·-·······---·-····-··--~---------------- r. ------- ----- -- ___..;::::::·:-~::: --···· · :-:-···r ·-i -.... - ,;~ ~-,~~-~,_...,.u •• -e- CH7.A. rF9 CUA ~ I ~ 25000 ' l·' . . . . ,._ ... ,7/'~------·-· ~ •• , ··•••o•_....,..._,._ .... _ , , , •• ~ : ' r·1 ·â 20000 l. . . . . . . . . :-:t_______ ,,, ..................... ~------·' ...•. ,.,..........-: ! .......,._ CH7 A rF9 CL 1A rH11 !l ~ Ii ~CH7ACL1A l l u ~ ·+i------ •••••• ••••...... OoOO"o •• ••--N--~-··--- ... ~ i L.

-- 15000 g ,._ 10000

I .L. ...... ~ CH7A CI..1A rH11 I Q') .....lo. Q') l . . ., _ , 4 Q) ' -o Q) l ~ -g 5000 1 -"'- - . -o i ~~ -~ o L-~------------------------~-----------------------------------.--------------------~~------- ____::;::as:_______________________._ c 100 10 1 0.1 0.01 0.001 Concentração de anticorpos (ng/ml) Fig. 6

Modelo de metástase de fígado LS174T

·----- ----------- --·----··--- ---------·

80 i-----·--· - --------\-k!F&&&~~ ~\··-E~OGG ' u · - - · -

~ i 70 _ _ _i ... -;:!2 o (I) \ \ ........ ·-------·1 60 u c l \ l ~ ~-- bE:!l . ---·t - -· -· - \- - -· <(]) > -::;;: (]) '-- _o o (f) 50

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30 .................-------------y----· .-. :-----· . . . . -... ..... ~.-:___::______ . \ ...........- - ·-----~

20 1-- -B-GA201 -fr- CH7A ~~~y------- . .. . __ ----~--- -~ ..... --------------------~---------------.1 \ l 10 1--- -e- SM3E ~~) __________ __\~Abl\b&-L\t~i-Yf.\-l'sf-:.6/t o 20 ~PBS 25 30 35 40 I---·········- -1 45 50 55 60 . \) . . _. J 65 70

Dia do estudo

Fig. 7

Modelo de metástase de pulmão A549

100 -e-GA201 90 ~Veículo

80 ~SM3Ege

70 ~CH7A rF9 CL1A 0?. o rH11 (I) 60 --e-CH7A ge ··I u c <(]) > ·:;;: (]) .__ _Q 50 40 -- (X) ....-\.. (j) o ({) 30

20 ~AfiXKX\1~

10 o 40 50 60 70 80 90 100 110 120 130 140 Dia do estudo

Fig. 8

Modelo de metástase de fígado MKN45 100 .,_... --- ~--···- ---- : 90 ..... -·-·-·-" ......... . 1------ I -a-PBS ao Li .. ... -ts- CH7 ArF9 CL 1A ge 1------ 70 1----·-- 1 -··· --- -11--- SM3E ge 1--- ::R ! ~ so r· o I ··· -\ . - ,~ ·u ''> Q) -g,_ 40 ' so L---- i

I l'

I ··- . -----------------·---· m.& - 6 "' -- -- (O ~ O> (f) ' l b '\ 30 l---- ................ .. -~~-~-- \----~--- i 20 ~m -~ 10 - o 30 40 50 60 Dia do estudo Fig. 9

Sensograma de Fabs anti-CEA ~ k0 n: 0.527 X 103 1201, :;) 80' /"'---··--------...• /~·=--=---.. - 100 l ------------ CH7A H4E9 CLlA k0 ff: 0.0027 I l ~~ l ~;;~~~-:;= !; so KD: 518 nM "' o\L .......,.. -20 \ 100 200 300 400 o Tempo (s) ~ 250 ,.-.•----··'"'1 /'~-,\ o ...._ k0 n: 9.57 104 l X _250 ~ 200 f/ "\\ ~ CH7A CLlA pAC18 koff: 0.0206 ; 150 ~--___,,·,.;>. . O) f ~ v--------<~:~~~~;~~-- 1 KD: 216 nM - .....

- 5 0 ' - - - - - ~----------- o 100 200 300 400 500 Tempo (s) 450 375 k 0 n: 3.64 X 104 ~300 ;225 CH7A H4E9 CL lA pAC18 k0 ff: 0.0035 :;:-=~ i 7~~L-~~~~----~~-~ ;:;150 KD: 96 nM -==··==-==- ---------------====== -75 ' - - - - - - - - - - - - - - - - o 75 150 225 300 375 Tempo (s) Fig. 10

Randomização CDR1 e CDR2 VH (CH7A)

EAB-679 MS-43 ~ ( ){ ~

.- 1_ MS-56 ------ MS-52 ~ 1 1-- -- - - - - - - - -----~:..::....:::::__ - I

Ncol CH7 A N;;!l

PCR1 PCR2 EAB-680 & -~ ~ ~

~

1 MS-55

1 -- ~

~

O)

PCR3 PCR4

~ ----7

PCR5 1 .----------- 1_

Ncol v A -------------- -----.I Nhel

Fig. 11

Randomização CDR1 e CDR2 VL (Cl 1A) EAB-681 EAB-685 ~ ( )( ~ EAB-687 I EAB-686 ~

I Hio;on -l CL1A l ""'I PCR1 PCR2 EAB-682 - .....Jo,.

-- ~ ~ EAB-688 N ~ I .....Jo,.

O) 1 PCR3 ! PCR4 ~ ~ PCR5 1 Hindlll Saci Fig. 12

Randomização CDR3 VH (CH7 A) randprimer- EAB-749 ~ ---7 EAB-752 ~ ---7

I .-------- EAB-7501751 1 Saci l -, Nhel 1 PCR1 PCR2 ~ EAB-749 ---7

I 1 - - ------- - ----,.,- EAB-752 ~ -- (..V ~ O) 1 PCR3 L__ Y J - ---------------------- • -------,- Saci Nhel Fig. 13

Randomização CDR3 VL (Cl 1A) rand primer - MS43 ---7 CL1A ~

I l 1 Ncol PCR1 ~ MS43 ---7 EAB-746 1ir -- ~ ~ O') 1 PCR2 ,----- I ~ I Ncol Xhol Fig. 14

Alvo de ligação CEA com células alvo MKN 45 O clone maturado por afinidade da ~ :~: fjfE;:!~:~.:;}········ /Z~;:=c:~::~=~! biblioteca de cadeia leve tem uma tem um aprimoramento de afinidade de um fator de 3, quando convertido para lgG. ~ 600 400 "l 1 ~~/Hno// ,A< .r:;-:::;;11 ~ 200 I i- uoHoo on•~?_,v..-/ . . ••• . 4V/ ,.,··'-----··-------------~ ~ Q ~:-::f;_;_:_-7.:f~~~~:~.. --·:·-....:. 1 ! 1 1 ~ I I I I! li' ! I I I I 1 I I

0.01 0.1 1 10 100 Concentração de anticorpos (IJg/ml) .---------------------------------· --Jo. Ligação de anticorpos maturados por afinidade e parentais em células alvo MKN45 CEA O clone maturado por afinidade da (J1 ....._ 30000 biblioteca de cadeia pesada mostra um --Jo. -.!t-CH7A 189 CL1AIH11 G2(1)· MI.,II'"S 25000 ~ sinal fortemente elevado, quando O> . . - CH7A Cl1A G2(R2)· MNK45 20000 "ªô convertido para lgG. 15000 ~ g 10000 ~ "O <D "O ·------- 5000 "' "O g; o 2l

0.001 om ~ 1 m 100 E Concentração de anticorpos (IJg/ml) 7 Cadeia leve e pesada do anticorpo, ambos contribuem para a afinidade da totalidade do anticorpo (Ligação à forma ligada em membrana é preservada depois da maturação por afinidade) Fig. 15

Teste in vitro de ADCC em diversos Abs anti-CEA maturados por afinidade comparados ao anticorpo parental não-maturado. 90r------------------------------------------ 80+--------------------------------------------------------------------------------------~ ~ o -e-CH7ACL1AG2(R2) ;::+ 70 m -&-CH7Ar89 CL 1ArH11G2(1) ~~=·····=i··············-·----~

0.. {g 60 ~CH7ArF9 Cl1ArH11G2(1) I ---···-··········· m ~CH7ACL1ArH11 G2(1)

6.. m 50 -/ ::::::1 ar 40 ~

0.. m ~ t E= -- m ::::::1 301-----------------------------------·

I O) ~ i--------E ;;e~; ~ O) 20 10 LmuuuUu ...: ; ; ; uOOuo u uU • ~ L-"····,=r-----··---·~T l Q __ .. ,. . . . . . . _: . -10 L ...

0.01 0.1 10 100 10000 concentração ab (ng/ml) Cadeia s leve~ pesada maturadas combinadas Cadeia leve somente maturada ~ Aperfeiçoamento da afinidade leva ao aperfeiçoamento do ADCC Fig. 16