CN103649114B - 新的免疫缀合物 - Google Patents

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T.U.霍佛
R.霍斯
C.克雷恩
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Abstract

本发明一般涉及抗原特异性免疫缀合物，其用于选择性投递影响细胞活性的效应器模块。更具体地，本发明提供包含第一抗原结合模块、Fc域和单一效应器模块的新免疫缀合物。另外，本发明涉及编码这类免疫缀合物的多核苷酸，以及包含这类多核苷酸的载体和宿主细胞。本发明还涉及用于生成本发明免疫缀合物的方法，以及在疾病治疗中使用这些免疫缀合物的方法。

Description

新的免疫缀合物
发明领域
本发明一般涉及抗原特异性免疫缀合物，其用于选择性投递影响细胞活性的效应器模块。另外，本发明涉及编码这类免疫缀合物的多核苷酸，以及包含这类多核苷酸的载体和宿主细胞。本发明还涉及用于生成本发明的免疫缀合物的方法，以及在疾病治疗中使用这些免疫缀合物的方法。
发明背景
在多种临床背景中，经常期望选择性破坏个别细胞或特定细胞类型。例如，癌症治疗的一个主要目的是特异性破坏肿瘤细胞，而使健康细胞和组织保持完整且未受损。细胞中的多个信号转导途径与细胞存活和/或死亡有关。因此，直接投递牵涉细胞存活或死亡的途径因子可用于帮助细胞的维持或破坏。类似地，可以投递刺激肿瘤微环境中的免疫效应细胞(如天然杀伤(NK)细胞或细胞毒性T淋巴细胞(CTL))的特定因子以攻击并破坏肿瘤细胞。
细胞因子是参与免疫***调节的细胞信号传导分子。当用于癌症治疗时，细胞因子能充当免疫调控剂，其具有抗肿瘤作用且能提高一些肿瘤类型的免疫原性。然而，快速的血液清除和肿瘤特异性的缺乏需要***性施用高剂量的细胞因子以在肿瘤部位达到足以激活免疫应答或具有抗肿瘤作用的细胞因子浓度。这些高水平的***性细胞因子可导致严重毒性和不良反应。
因此，对于在治疗中的使用，期望将信号转导途径因子(如细胞因子)特异性地投递至体内特定部位(例如在癌症治疗情况中为肿瘤或肿瘤微环境)。这可以通过将该因子缀合至特异于该部位的靶向性模块(例如抗体或抗体片段)来实现。早期策略的目的是将信号转导途径因子(如细胞因子)投递至体内特定部位，包括缀合至各种细胞因子的免疫球蛋白重链，所述细胞因子包括淋巴毒素、肿瘤坏死因子α(TNF-α)、白介素2(IL-2)、和粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)(例如综述于Lode等,Pharmacol Ther80,277-292(1998))。
研究者观察到它们不仅能将细胞因子靶向到体内特定部位，而且还能够利用以下事实，即单克隆抗体比大多数其它蛋白质具有更长的血清半衰期。鉴于与高剂量的某些未缀合细胞因子(例如IL-2)有关的***性毒性，较低剂量的免疫球蛋白-细胞因子融合蛋白将在期望部位处(例如肿瘤中)的治疗有益生物活性最大化，同时将***性副作用保持在最小值的能力使得研究者相信，免疫球蛋白-细胞因子免疫缀合物是最佳的治疗剂。
但是，存在与本领域中已知的免疫球蛋白-细胞因子免疫缀合物相关的某些缺点。例如，这些免疫缀合物具有至少一个偶联至两条免疫球蛋白重链中每一条的细胞因子，从而导致免疫缀合物具有二价靶物结合和两个或更多个细胞因子模块(例如综述于Chang等,Expert Opin Drug Discovery4,181-194(2009)，或Ortiz-Sanchez等,Expert Opin BiolTher8,609-632(2008))。图1绘出了常规的免疫球蛋白-细胞因子免疫缀合物(如其在本领域中已知的)，其中细胞因子融合至两条抗体重链中每条的C端。由于存在两个或更多个细胞因子模块，这类免疫缀合物对相应的细胞因子受体具有高亲合力(例如在IL-2情况中为皮摩尔亲和力)，且如此靶向表达该细胞因子受体的免疫效应细胞而非与该细胞因子连接的免疫球蛋白的靶抗原(nM亲和力)。此外，已知常规的免疫缀合物与输注反应有关(参见例如King等,J Clin Oncol22,4463-4473(2004))，其至少部分起因于免疫缀合物的细胞因子模块对外周血中免疫效应细胞上细胞因子受体的活化。
另外，经由其Fc域，免疫球蛋白-细胞因子免疫缀合物能激活补体并与Fc受体相互作用。这一内在的免疫球蛋白特征被视为不利的，因为治疗性免疫缀合物可能靶向至表达Fc受体的细胞而非优选的携带抗原的细胞。此外，对细胞因子受体和Fc受体信号传导途径的同时激活导致细胞因子释放，特别是在与免疫球蛋白融合蛋白的长半衰期联合时，使得其由于***性毒性而难以在治疗背景中应用。
克服此问题的一种办法是在免疫缀合物中使用没有Fc域的免疫球蛋白片段，如scFv或Fab片段。免疫球蛋白片段-细胞因子免疫缀合物的例子包括PCT公开文本WO2001/062298中列出的scFv-IL-2免疫缀合物，PCT公开文本WO2006/119897中列出的scFv-IL-12-scFv免疫缀合物(其中两个scFv片段中的每一个连接于通过二硫键保持在一起的IL-12异二聚体的亚基)或PCT公开文本WO2011/020783中列出的Fab-IL-2-Fab免疫缀合物。这些类型的免疫缀合物的大多数中维持了免疫球蛋白亲本分子的肿瘤结合反应性和细胞因子的功能活性两者，然而，这类构建体的半衰期比免疫球蛋白融合蛋白的半衰期短得相当多。
因此，仍然需要具有改进的特性的免疫缀合物、这些产品更大的治疗有效性和副作用(例如毒性、非肿瘤细胞的破坏等)的数目和严重性的降低。
本发明提供免疫球蛋白样免疫缀合物，其相对于已知的免疫缀合物展现出改进的功效、高作用特异性、降低的毒性以及改进的血液中半衰期和稳定性。
发明概述
本发明部分基于研究者的下述认识，即包含超过一个效应器模块(如例如细胞因子)的免疫缀合物可以靶向到相应的效应器模块受体而非该免疫缀合物的抗原结合模块的靶抗原。因此，在一个方面，本发明提供包含第一抗原结合模块、由两个亚基组成的Fc域和效应器模块的免疫缀合物，其中存在不超过一个效应器模块。在一个实施方案中，效应器模块融合至Fc域的两个亚基之一的氨基或羧基末氨基酸，任选地经由接头肽进行。在一个实施方案中，第一抗原结合模块融合至Fc域的两个亚基之一的氨基端氨基酸，任选地经由接头肽或免疫球蛋白铰链区进行。
在一个实施方案中，第一抗原结合模块包含抗体的抗原结合域。在一个具体的实施方案中，第一抗原结合模块是Fab分子。在某些实施方案中，Fc域包含促进两条不同多肽链异二聚化的修饰。在一个具体的实施方案中，所述修饰是突出-入-孔(knob-into-hole)修饰，其包含在Fc域的亚基之一中的突出修饰和在Fc域的两个亚基的另一个中的孔修饰。在一个具体的实施方案中，效应器模块融合至Fc域中包含突出修饰的亚基的氨基或羧基端氨基酸。
在一个实施方案中，Fc域是IgG Fc域，特别是IgG1Fc域。在一个具体的实施方案中，Fc域是人的。
在本发明的某些实施方案中，将Fc域工程化改造为具有改变的对Fc受体的结合，特别是改变的对Fcγ受体的结合，和/或改变的效应器功能，特别是改变的抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)。
尽管Fc域的存在是延长免疫缀合物的半衰期必需的，但发明人意识到在一些情况下，消除与Fc域对Fc受体的衔接有关的效应器功能会是有益的。因此，在具体的实施方案中，改变的对Fc受体的结合和/或效应器功能是降低的结合和/或效应器功能。在一个具体的这类实施方案中，Fc域包含一处或多处降低Fc域对Fc受体(特别是Fcγ受体)的结合的氨基酸突变。优选地，这类氨基酸突变不降低对FcRn受体的结合。在一个实施方案中，Fc域包含在位置P329处的氨基酸取代。在一个具体的实施方案中，Fc域包含在其每个亚基中的氨基酸取代L234A、L235A和P329G。
在另一方面，可能有期望增强免疫缀合物的效应器功能的情况。因此，在某些实施方案中，将本发明免疫缀合物的Fc域工程化改造为具有改变的对Fc受体(特别是Fcγ受体，更特别地是FcγIIIa受体)的结合和/或改变的效应器功能，其中所述改变的结合和/或效应器功能是升高的结合和/或效应器功能。在一个这类实施方案中，将Fc域工程化改造为相比于非工程化Fc域具有改变的寡糖结构。在一个具体的这类实施方案中，相比于非工程化Fc域，Fc域包含增加的非岩藻糖基化寡糖比例。在一个更具体的实施方案中，Fc域包含至少20%，特别是至少50%，更特别是至少70%非岩藻糖基化寡糖。在另一个具体的实施方案中，相比于非工程化Fc域，Fc域包含增加的两分型寡糖比例。在又一个具体的实施方案中，相比于非工程化Fc域，Fc域包含增加的两分型、非岩藻糖基化寡糖比例。在一些实施方案中，所述改变的寡糖结构起因于用于表达所述免疫缀合物的宿主细胞中增加的β(1,4)-N-乙酰葡糖胺基转移酶III(GnTIII)活性。
在一个具体的方面，本发明提供包含第一和第二抗原结合模块、由两个亚基组成的Fc域、和效应器模块的免疫缀合物，其中存在不超过一个效应器模块。在一个实施方案中，第一和第二抗原结合模块以及Fc域是免疫球蛋白分子的部分。在某些实施方案中，免疫缀合物基本由免疫球蛋白分子和效应器模块以及任选地一个或多个接头序列组成。在一个具体的实施方案中，免疫球蛋白分子是IgG类免疫球蛋白。在一个甚至更具体的实施方案中，免疫球蛋白是IgG1亚类免疫球蛋白。在一个实施方案中，效应器模块融合至免疫球蛋白重链之一的羧基端氨基酸，任选地经由接头肽进行。
在一个具体的实施方案中，本发明的免疫缀合物包含包括两个抗原结合模块和Fc域的免疫球蛋白分子，以及融合至免疫球蛋白重链之一的羧基端氨基酸的效应器模块，其中存在不超过一个效应器模块且其中Fc域工程化改造为具有降低的对Fc受体的结合(特别是改变的对Fcγ受体的结合)和/或降低的效应器功能。
在某些实施方案中，所述第一抗原结合模块，或所述第一和所述第二抗原结合模块针对与病理状况有关的抗原，如呈现在肿瘤细胞上或在肿瘤细胞环境中、在炎症部位、或在受病毒感染的细胞上的抗原。在一个更具体的实施方案中，所述抗原选自下组：成纤维细胞活化蛋白(FAP)、生腱蛋白C的A1域(TNC A1)、生腱蛋白C的A2域(TNC A2)、纤连蛋白的外域B(Extra Domain B)(EDB)、癌胚抗原(CEA)和黑色瘤有关的硫酸软骨素蛋白聚糖(MCSP)。
在某些实施方案中，效应器模块是单链效应器模块。在一个具体的实施方案中，效应器模块是细胞因子。在一个实施方案中，所述细胞因子选自下组：IL-2、IL-7、IL-10、IL-12、IL-15、IFN-α和IFN-γ。在一个具体的实施方案中，所述细胞因子是IL-2。在一个甚至更具体的实施方案中，所述细胞因子是突变体IL-2多肽，其对IL-2受体的α亚基具有降低的结合亲和力。在一个具体的实施方案中，所述突变体IL-2多肽包含在一个或多个选自下组的位置处的氨基酸取代：对应于人IL-2的残基42、45和72的位置。在另一个具体的实施方案中，细胞因子是IL-10。在又一个实施方案中，细胞因子是IL-15，特别是对IL-15受体的α亚基具有降低的结合亲和力的突变体IL-15多肽。在另一个实施方案中，细胞因子是IFN-α。
依照本发明的另一个方面，提供编码本发明免疫缀合物或其片段的分离的多核苷酸。本发明还提供包含本发明的分离的多核苷酸的表达载体，和包含本发明的分离的多核苷酸或表达载体的宿主细胞。在一些实施方案中，所述宿主细胞是真核细胞，特别是哺乳动物细胞。在一些实施方案中，所述宿主细胞已经操作为表达升高水平的一种或多种具有β(1,4)-N-乙酰葡糖胺基转移酶III(GnTIII)活性的多肽。在一个这类实施方案中，所述宿主细胞还操作为表达升高水平的一种或多种具有α-甘露糖苷酶II(ManII)活性的多肽。
在另一个方面，提供生成本发明免疫缀合物的方法，包括以下步骤：a)在适合于所述免疫缀合物表达的条件下培养本发明的宿主细胞，并b)回收所述免疫缀合物。本发明还涵盖通过本发明方法生成的免疫缀合物。
本发明进一步提供包含本发明的免疫缀合物和药学可接受载体的药物组合物。
本发明还涵盖的是使用本发明免疫缀合物和药物组合物的方法。在一个方面，本发明提供本发明的免疫缀合物或药物组合物，其用作药物。在一个方面，提供依照本发明的免疫缀合物或药物组合物，其用于治疗有此需要的个体中的疾病。在一个具体的实施方案中，所述疾病是癌症。在其它实施方案中，所述疾病是炎性病症。在一个具体的这类实施方案中，所述免疫缀合物包含IL-10效应器模块。
还提供本发明的免疫缀合物在制备用于治疗有此需要的个体中疾病的药物中的用途；以及治疗个体中疾病的方法，其包括对所述个体施用治疗有效量的组合物，其包含药学可接受形式的依照本发明的免疫缀合物。在一个具体的实施方案中，所述疾病是癌症。在其它实施方案中，所述疾病是炎性病症。在一个具体的这类实施方案中，所述免疫缀合物包含IL-10效应器模块。
在任一个上述实施方案中，所述个体优选为哺乳动物，特别是人。
在一个别的方面，本发明提供一种缀合物，其包含不特异性结合任何抗原的第一Fab分子、由两个亚基组成的Fc域、和效应器模块，其中存在不超过一个效应器模块。在一个具体的实施方案中，第一Fab分子包含SEQ ID NO:299的重链可变区序列和SEQ ID NO:297的轻链可变区序列。在一个实施方案中，所述缀合物包含(i)免疫球蛋白分子，其包含不特异性结合任何抗原的第一和第二Fab分子以及Fc域，和(ii)效应器模块，其中存在不超过一个效应器模块。在一个实施方案中，免疫球蛋白分子是IgG类免疫球蛋白，特别是IgG1亚类免疫球蛋白。在一个具体的实施方案中，免疫球蛋白分子包含SEQ ID NO:299的重链可变区序列和SEQ ID NO:297的轻链可变区序列。具体地，SEQ ID NO:299的重链可变区序列和SEQID NO:297的轻链可变区序列包含在免疫球蛋白分子的第一和第二Fab分子中。在一个实施方案中，效应器模块融合至免疫球蛋白重链之一的羧基端氨基酸，任选地经由接头肽进行。在一些实施方案中，将缀合物的Fc域工程化改造为具有降低的对Fc受体的结合(特别是降低的对Fcγ受体的结合)和/或降低的效应器功能(特别是降低的ADCC)。在一个具体的实施方案中，缀合物的Fc域包含在其每个亚基中的氨基酸取代L234A、L235A和P329G。在某些实施方案中，缀合物的Fc域包含促进两条不相同多肽链异二聚化的修饰。在一个具体的实施方案中，所述修饰是突出-入-孔修饰，其包含在Fc域的亚基之一中的突出修饰和在Fc域的两亚基的另一个中的孔修饰。在一个具体的实施方案中，效应器模块融合至Fc域中包含突出修饰的亚基的氨基或羧基端氨基酸。在一个实施方案中，所述效应器模块是细胞因子，特别是IL-2。另外，缀合物可以单独或组合掺入本文中关于本发明免疫缀合物的形式、Fc域或效应器模块描述的任一个特征。
本发明还提供编码本发明缀合物或其片段的分离的多核苷酸。在一个具体的实施方案中，分离的多核苷酸包含与SEQ ID NO:298或SEQ ID NO:300的序列至少约80%,85%,90%,95%,96%,97%,98%,99%或100%相同的序列。本发明还提供包含分离的多核苷酸的表达载体，和包含本发明的分离的多核苷酸或表达载体的宿主细胞。在另一个方面，提供生成本发明缀合物的方法，包括以下步骤：a)在适合于所述缀合物表达的条件下培养本发明的宿主细胞并b)回收所述缀合物。本发明还涵盖通过本发明方法生成的缀合物。
本发明还提供包含本发明的缀合物和药学可接受载体的药物组合物。此外，可在本文中针对本发明免疫缀合物所描述的使用方法中采用所述缀合物。
附图简述
图1：本领域中已知的典型免疫球蛋白-细胞因子免疫缀合物的示意图，其中细胞因子(打点)融合至两条免疫球蛋白重链中每条的C端。
图2：依照本发明的新免疫缀合物的示意图，所述免疫缀合物包含不超过一个效应器模块(打点)。效应器模块任选地经由接头肽(灰色盒)融合至Fc域的羧基端(形式A和B)或氨基端(形式C)氨基酸。所述免疫缀合物包含一个(形式B和C)或多个(通常两个，形式A)抗原结合模块，其可以是包含抗体重链和轻链可变域(阴影线)的Fab片段。Fc域可包含促进两条不相同多肽链异二聚化的修饰(黑点)和/或改变Fc受体结合和/或效应器功能的修饰(黑星)。
图3：基于4G8的FAP靶向性IgG-IL-2四重突变体(qm)免疫缀合物的纯化。A)蛋白A亲和层析步骤的洗脱概况。B)大小排阻层析步骤的洗脱概况。C)终产物的分析性SDS-PAGE(NuPAGE Novex Bis-Tris微型凝胶(Mini Gel),Invitrogen,MOPS运行缓冲液)。D)在Superdex200柱上对终产物的分析性大小排阻层析(97%单体含量)。
图4：基于28H1的FAP靶向性IgG-IL-2qm免疫缀合物的纯化。A)蛋白A亲和层析步骤的洗脱概况。B)大小排阻层析步骤的洗脱概况。C)终产物的分析性SDS-PAGE(还原性：NuPAGE Novex Bis-Tris微型凝胶,Invitrogen,MOPS运行缓冲液；非还原性：NuPAGE Tris-乙酸盐,Invitrogen,Tris-乙酸盐运行缓冲液)。D)在Superdex200柱上对终产物的分析性大小排阻层析(100%单体含量)。
图5：从CHO细胞纯化基于28H1的FAP靶向性IgG-IL-2qm免疫缀合物。A)蛋白A亲和层析步骤的洗脱概况。B)大小排阻层析步骤的洗脱概况。C)终产物的分析性SDS-PAGE(NuPAGE Novex Bis-Tris微型凝胶,Invitrogen,MOPS运行缓冲液)。D)在Superdex200柱上对终产物的分析性大小排阻层析(100%单体含量)。
图6：基于4B9的FAP靶向性IgG-IL-2qm免疫缀合物的纯化。A)蛋白A亲和层析步骤的洗脱概况。B)大小排阻层析步骤的洗脱概况。C)终产物的分析性SDS-PAGE(NuPAGE NovexBis-Tris微型凝胶,Invitrogen,MOPS运行缓冲液)。D)在Superdex200柱上对终产物的分析性大小排阻层析(100%单体含量)。
图7：基于CH1A1A98/992F1的CEA靶向性IgG-IL-2qm免疫缀合物的纯化。A)蛋白A亲和层析步骤的洗脱概况。B)大小排阻层析步骤的洗脱概况。C)终产物的分析性毛细管电泳SDS(Caliper)。D)在TSKgel G3000SW XL柱上对终产物的分析性大小排阻层析(98.8%单体含量)。
图8：基于2B10的TNC A2靶向性IgG-IL-2qm免疫缀合物的纯化。A)蛋白A亲和层析步骤的洗脱概况。B)大小排阻层析步骤的洗脱概况。C)终产物的分析性毛细管电泳SDS(Caliper)。D)在TSKgel G3000SW XL柱上对终产物的分析性大小排阻层析(100%单体含量)。
图9：基于DP47GS的非靶向性IgG-IL-2qm免疫缀合物的纯化。A)蛋白A亲和层析步骤的洗脱概况。B)大小排阻层析步骤的洗脱概况。C)终产物的分析性SDS-PAGE(NuPAGENovex Bis-Tris微型凝胶,Invitrogen,MOPS运行缓冲液)。D)在Superdex200柱上对终产物的分析性大小排阻层析(100%单体含量)。
图10：与相应的Fab-IL-2qm-Fab构建体相比，基于4G8的FAP靶向性IgG-IL-2qm免疫缀合物对在稳定转染的HEK293细胞上表达的人FAP的结合，通过FACS测量。
图11：与基于28H1的Fab-IL-2qm-Fab构建体相比，溶液中由基于4G8的FAP靶向性IgG-IL-2qm免疫缀合物诱导的NK92细胞上的干扰素(IFN)-γ释放。
图12：与基于28H1的Fab-IL-2-Fab和Fab-IL-2qm-Fab构建体以及阿地白介素(Proleukin)相比，在溶液中用基于4G8的FAP靶向性IgG-IL-2qm免疫缀合物刺激20分钟后，不同细胞类型中通过FACS对磷酸化STAT5的检测。A)NK细胞(CD3-CD56+)；B)CD8+T细胞(CD3+CD8+)；C)CD4+T细胞(CD3+CD4+CD25-CD127+)；D)调节性T细胞(CD4+CD25+FOXP3+)。
图13：TNC A2靶向性2B10IgG-IL-2qm和相应的未缀合IgG对表达TNCA2的U87MG细胞的结合，通过FACS测量。
图14：TNC A2靶向性2B10IgG-IL-2qm、CEA靶向性CH1A1A98/992F1IgG-IL-2qm和CH1A1A98/992F1IgG-IL-2wt免疫缀合物对NK92细胞增殖的诱导。
图15：FAP靶向性4B9IgG-IL-2qm和4B9IgG-IL-2wt免疫缀合物对NK92细胞增殖的诱导。
图16：与未缀合的糖工程化CH1A1A IgG相比，经由糖工程化(ge)和野生型(wt)CH1A1A IgG-IL-2qm免疫缀合物介导的ADCC，PBMC对过表达CEA的A549肿瘤细胞的杀伤(通过LDH释放测量)。
图17：非靶向性DP47GS IgG-IL-2wt免疫缀合物的纯化。A)蛋白A亲和层析步骤的洗脱概况。B)大小排阻层析步骤的洗脱概况。C)终产物的分析性SDS-PAGE(NuPAGE NovexBis-Tris微型凝胶,Invitrogen,MOPS运行缓冲液)。D)在Superdex200柱上对终产物的分析性大小排阻层析(99.6%单体含量)。
图18：基于28H1的FAP靶向性28H1IgG-IL-2wt免疫缀合物的纯化。A)蛋白A亲和层析步骤的洗脱概况。B)大小排阻层析步骤的洗脱概况。C)终产物的分析性SDS-PAGE(NuPAGENovex Bis-Tris微型凝胶,Invitrogen,MOPS运行缓冲液)。D)在Superdex200柱上对终产物的分析性大小排阻层析(99.6%单体含量)。
图19：基于CH1A1A98/992F1的CEA靶向性IgG-IL-2wt免疫缀合物的纯化。A)蛋白A亲和层析步骤的洗脱概况。B)大小排阻层析步骤的洗脱概况。C)终产物的分析性毛细管电泳SDS(Caliper)。D)在TSKgel G3000SW XL柱上对终产物的分析性大小排阻层析(100%单体含量)。
图20：基于4B9的FAP靶向性IgG-IL-2wt免疫缀合物的纯化。A)组合的蛋白A亲和层析和大小排阻层析的洗脱概况。B)A中大小排阻层析步骤的洗脱概况的图象放大。C)终产物的分析性SDS-PAGE(NuPAGE Novex Bis-Tris微型凝胶,Invitrogen,MOPS运行缓冲液)。D)在TSKgel G3000SW XL柱上对终产物的分析性大小排阻层析(98.5%单体含量)。
图21：A)分析性SDS-PAGE(NuPAGE Novex Bis-Tris微型凝胶(Invitrogen)，NuPAGE LDS样品缓冲液(4x)，在70℃加热10min，MOPS缓冲液，160V，60min，MW标志物Mark12，还原的(1)和非还原的(2)2B10IgG-IL-10M1的未染色标准品(Invitrogen,M)。B)全局拟合于1:1相互作用模型的2B10IgG-IL-10M1对人TNC A2的基于SPR的亲和力测定(ProteOn XPR36)。(芯片：NLC；配体：TNCA2(250RU)；分析物：TNCA22B10IgG-IL-10M1164kDa；浓度范围分析物：50,10,2,0.4,0.08,0nM；结合时间：180s；解离时间：600s；流速：50μl/min；k结合：1.80x1061/Ms；k解离：9.35x10-51/s；KD：52pM)。C)全局拟合于1:1相互作用模型的2B10IgG-IL-10M1对人IL-10R1的基于SPR的亲和力测定(ProteOn XPR36)(芯片：NLC；配体：IL-10R1(1600RU)；分析物：TNCA22B10IgG-IL-10M1164kDa；浓度范围分析物：50、10、2、0.4、0.08、0nM；结合时间：180s；解离时间：600s；流速：50μl/min；k结合：5.56x1051/Ms；k解离：2.89x10-41/s；KD：520pM)。
图22：A)分析性SDS-PAGE(NuPAGE Novex Bis-Tris微型凝胶(Invitrogen),NuPAGE LDS样品缓冲液(4x)，在70℃加热10min，MOPS缓冲液，160V，60min，MW标志物Mark12，还原的(1)和非还原的(2)4G8IgG-IL-10M1的未染色标准品(Invitrogen,M)。B)全局拟合于1:1相互作用模型的4G8IgG-IL-10M1对人FAP的基于SPR的亲和力测定(ProteOnXPR36)(芯片：GLM；配体：huFAP(500RU)；分析物：FAP4G8IgG-IL-10M1164kDa；浓度范围分析物：10、2、0.4、0.08、0nM；结合时间：180s；解离时间：600s；流速：50μl/min；k结合：6.68x1051/Ms；k解离：1.75x10-51/s；KD：26pM)。C)全局拟合于1:1相互作用模型的4G8IgG-IL-10M1对人IL-10R1的基于SPR的亲和力测定(ProteOn XPR36)(芯片：NLC；配体：IL10R1(1600RU)；分析物：FAP4G8IgG-IL-10M1164kDa；浓度范围分析物：50、10、2、0.4、0.08、0nM；结合时间：180s；解离时间：600s；流速：50μl/min；k结合：3.64x1051/Ms；k解离：2.96x10-41/s；KD：815pM)。
图23：基于4B9的FAP靶向性“1+1”IgG-IL-2qm免疫缀合物的纯化。A)组合的蛋白A亲和层析和大小排阻层析的洗脱概况。B)终产物的分析性SDS-PAGE(NuPAGE Novex Bis-Tris微型凝胶,Invitrogen,MOPS运行缓冲液)。C)在TSKgel G3000SW XL柱上对终产物的分析性大小排阻层析(99.2%单体含量)。
图24：基于28H1的FAP靶向性“1+1”IgG-IL-2qm免疫缀合物的纯化。A)组合的蛋白A亲和层析和大小排阻层析的洗脱概况。B)终产物的分析性SDS-PAGE(NuPAGE Novex Bis-Tris微型凝胶,Invitrogen,MOPS运行缓冲液)。C)在TSKgel G3000SW XL柱上对终产物的分析性大小排阻层析(100%单体含量)。
图25：基于4B9的FAP靶向性“1+1”IgG-IL-7免疫缀合物的纯化。A)组合的蛋白A亲和层析和大小排阻层析的洗脱概况。B)终产物的分析性毛细管电泳SDS(Caliper)。C)在TSKgel G3000SW XL柱上对终产物的分析性大小排阻层析(98.6%单体含量)。
图26：基于4B9的FAP靶向性“1+1”IgG-IFN-α免疫缀合物的纯化。A)蛋白A亲和层析步骤的洗脱概况。B)大小排阻层析步骤的洗脱概况。C)终产物的分析性毛细管电泳SDS(Caliper)。D)在TSKgel G3000SW XL柱上对终产物的分析性大小排阻层析(92.8%单体含量)。
图27：相比于相应的IgG-IL-2构建体，FAP靶向性4B9“1+1”IgG-IL-2qm和28H1“1+1”IgG-IL-2wt免疫缀合物对NK92细胞增殖的诱导。
图28：相比于IgG-IL-2qm和IgG-IL-2wt构建体，4B9“1+1”IgG-IL-7和4B9“1+1”IgG-IL-2qm免疫缀合物对PHA激活的(A)CD4和(B)CD8T细胞增殖的诱导。
图29：相比于Roferon A，4B9“1+1”IgG-IFN-α对Daudi细胞增殖的诱导。
图30：单次i.v.施用包含野生型(wt)或四重突变体(qm)IL-2的FAP靶向性(A)和非靶向性(B)IgG-IL-2构建体后，IL-2免疫缀合物的血清浓度。
图31：在i.v.注射后24小时，相比于未缀合的FAP靶向性28H1IgG和4B9IgG以及非靶向性DP47GS IgG，FAP靶向性28H1IgG-IL qm的组织分布。
图32：28H1IgG-IL-2qm和28H1IgG-(IL-2qm)2免疫缀合物对NK92细胞的结合，通过FACS测定。
图33：在与不同的FAP靶向性28H1IL-2免疫缀合物或阿地白介素温育4(A)、5(B)或6(C)天后NK细胞的增殖。
图34：在与不同的FAP靶向性28H1IL-2免疫缀合物或阿地白介素温育4(A)、5(B)或6(C)天后CD4T细胞的增殖。
图35：在与不同的FAP靶向性28H1IL-2免疫缀合物或阿地白介素温育4(A)、5(B)或6(C)天后CD8T细胞的增殖。
图36：在与不同的IL-2免疫缀合物温育6天后，预活化的CD8(A)和CD4(B)T细胞的增殖。
图37：在与不同的IL-2免疫缀合物温育6天并用抗Fas抗体过夜处理后，CD3+T细胞的激活诱导的细胞死亡。
图38.单次i.v.施用包含野生型(A)或四重突变体IL-2(B)的非靶向性DP47GSIgG-IL-2构建体后，IL-2免疫缀合物的血清浓度。
图39：DP47GS IgG对不同抗原的结合。在基于ELISA的测定法中用板上捕获的抗原检测结合。将对几乎所有捕获的抗原展现出非特异性结合的人IgG1抗体用作阳性对照，空白样品不含任何抗体。
图40：Fc域中有或无LALA P329G突变的DP47GS IgG对新鲜的(A)、PHA-L激活的(B)和再刺激的(C)人PBMC子集的结合，通过FACS分析测定。左上小图：B细胞(A、B中)或CD4+T细胞(C中)；右上小图：CD8+T细胞；左下小图：NK细胞；右下小图：CD14+细胞(单核细胞/嗜中性粒细胞)。
发明详述
定义
除非下文另外定义，如本领域中通常使用的那样在本文中使用术语。
如本文中使用的，术语“缀合物”指融合多肽分子，其包含一个效应器模块和别的肽分子，具体为免疫球蛋白分子。
如本文中使用的，术语“免疫缀合物”指融合多肽分子，其包含一个效应器模块、至少一个抗原结合模块和Fc域，只要存在不超过一个效应器模块。在某些实施方案中，所述免疫缀合物包含一个效应器模块、两个抗原结合模块和Fc域。依照本发明的具体免疫缀合物基本由通过一种或多种接头序列连接的一个效应器模块、两个抗原结合模块和Fc域组成。抗原结合模块和效应器模块可通过多种相互作用并以多种构造连接至Fc域，如本文中描述的。在一个具体的实施方案中，两个抗原结合模块和Fc域以如下的构造彼此连接，使得形成全免疫球蛋白分子。如本文中所指的免疫缀合物是融合蛋白，即免疫缀合物的组分通过肽键直接地或经由接头肽彼此连接。
如本文中使用的，术语“抗原结合模块”指特异性结合抗原决定簇的多肽分子。在一个实施方案中，抗原结合模块能指导其附接的实体(例如效应器模块或第二抗原结合模块)到达靶部位，例如到达携有抗原决定簇的特定类型的肿瘤细胞或肿瘤基质。抗原结合模块包括如本文中另外定义的抗体及其片段。具体的抗原结合模块包括抗体的抗原结合域，其包含抗体重链可变区和抗体轻链可变区。在某些实施方案中，抗原结合模块可以包含抗体恒定区，如本文中另外定义和本领域中已知的。可用的重链恒定区包括以下5种同种型中的任意一种：α、δ、ε、γ或μ。可用的轻链恒定区包括任意以下2种同种型中的任意一种：κ和λ。
如本文中使用的，术语“抗原决定簇”与“抗原”和“表位”同义，并且指多肽大分子上与抗原结合模块结合，从而形成抗原结合模块-抗原复合物的位点(例如氨基酸的连续区段或由不同的非连续氨基酸区构成的构象性构造)。可用的抗原决定簇可见于例如肿瘤细胞表面上、病毒感染的细胞的表面上、其它患病细胞的表面上、游离在血液血清中和/或在胞外基质(ECM)中。在一个具体的实施方案中，抗原决定簇是人抗原。
“特异性结合”意指结合对于抗原是选择性的，并且能与不想要的或非特异性的相互作用区别开来。抗原结合模块结合特定抗原决定簇的能力可以经由酶联免疫吸附测定法(ELISA)或本领域技术人员熟知的其它技术，例如表面等离振子共振(SPR)技术(在BIAcore仪器上分析)(Liljeblad等,Glyco J17,323-329(2000))，以及传统的结合测定法(Heeley,Endocr Res28,217-229(2002))来测量。在一个实施方案中，抗原结合模块对无关蛋白的结合程度小于该抗原结合模块对抗原的结合的约10%，如通过例如SPR测量的。在某些实施方案中，结合抗原的抗原结合模块，或包含该抗原结合模块的免疫缀合物具有≤1μM、≤100nM、≤10nM、≤1nM、≤0.1nM、≤0.01nM或≤0.001nM(例如10-8M或更低、例如10-8M至10- 13M、例如10-9M至10-13M)的解离常数(KD)。
“亲和力”指分子(例如受体)的单一结合位点与其结合配偶体(例如配体)之间非共价相互作用总和的强度。除非另外指示，如本文中使用的，“结合亲和力”指反映结合对的成员(例如受体和配体)之间1:1相互作用的内在结合亲和力。分子X对其配偶体Y的亲和力通常可以用解离常数(KD)来表述，其为解离与结合速率常数(分别为K解离和K结合)的比率。如此，相等的亲和力可能包含不同的速率常数，只要速率常数的比率保持相同。亲和力可以通过本领域知道的确立方法来测量，包括本文中描述的那些方法。用于测量亲和力的具体方法是表面等离振子共振(SPR)。
“降低的结合”，例如降低的对Fc受体或CD25的结合，指相应相互作用的亲和力降低，如例如通过SPR测量的。为了清楚，该术语还包括亲和力降低至0(或低于分析方法的检测限)，即完全消除相互作用。相反地，“增加的结合”指相应相互作用的结合亲和力的升高。
如本文中使用的，就抗原结合模块等而言的术语“第一”和“第二”为了在有超过一个每类模块时便于区分而使用。除非明确如此陈述，这些术语的使用不意图赋予免疫缀合物的特定次序或取向。
如本文中使用的，术语“效应器模块”指例如经由信号转导或其它细胞途径影响细胞活性的多肽例如蛋白质或糖蛋白。因此，本发明的效应器模块可与受体介导的信号传导关联，该信号传导从细胞膜外部传递信号以调控携带一种或多种针对该效应器模块的受体的细胞中的应答。在一个实施方案中，效应器模块能引发携带一种或多种针对该效应器模块的受体的细胞中的细胞毒性应答。在另一个实施方案中，效应器模块能引发携带一种或多种针对该效应器模块的受体的细胞中的增殖性应答。在另一个实施方案中，效应器模块能引发携带针对该效应器模块的受体的细胞中的分化。在另一个实施方案中，效应器模块能改变携带针对该效应器模块的受体的细胞中内源性细胞蛋白质的表达(即上调或下调)。效应器模块的非限制性例子包括细胞因子、生长因子、激素、酶、底物和辅因子。效应器模块可以以多种构造与抗原结合模块或Fc域联合以形成免疫缀合物。
如本文中使用的，术语“细胞因子”指介导和/或调节生物学或细胞功能或过程(例如免疫、炎症和造血作用)的分子。如本文中使用的，术语“细胞因子”包括“淋巴因子”、“趋化因子”、“单核因子”和“白介素”。可用的细胞因子的例子包括但不限于，GM-CSF、IL-1α、IL-1β、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-10、IL-12、IFN-α、IFN-β、IFN-γ、MIP-1α、MIP-1β、TGF-β、TNF-α和TNF-β。具体的细胞因子是IL-2、IL-7、IL-10、IL-12、IL-15、IFN-α和IFN-γ。在具体的实施方案中，所述细胞因子是人细胞因子。如本文中使用的，术语“细胞因子”还意为包括细胞因子变体，其在相应野生型细胞因子的氨基酸序列中包含一个或多个氨基酸突变，如例如记载于Sauvé等,Proc Natl Acad Sci USA88,4636-40(1991);Hu等,Blood101,4853-4861(2003)和美国专利公开文本No.2003/0124678;Shanafelt等,NatureBiotechnol18,1197-1202(2000);Heaton等,Cancer Res53,2597-602(1993)和美国专利No.5,229,109;美国专利公开文本No.2007/0036752;WO2008/0034473;WO2009/061853;或PCT专利申请no.PCT/EP2012/051991的IL-2变体。别的细胞因子变体，例如IL-15的变体记载于本文中。在某些实施方案中，细胞因子突变为消除糖基化。
如本文中使用的，术语“单链”指包含通过肽键线性连接的氨基酸单体的分子。在一个实施方案中，所述效应器模块是单链效应器模块。单链效应器模块的非限制性例子包括细胞因子、生长因子、激素、酶、底物和辅因子。当效应器模块是细胞因子且感兴趣的细胞因子正常在自然中以多聚体发现时，多聚体细胞因子的每个亚基由该效应器模块的单链连续编码。因此，可用的单链效应器模块的非限制性例子包括GM-CSF、IL-1α、IL-1β、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-10、IL-12、IL-15、IFN-α、IFN-β、IFN-γ、MIP-1α、MIP-1β、TGF-β、TNF-α和TNF-β。
如本文中使用的，术语“对照效应器模块”指未缀合的效应器模块。例如，当将本文中描述的IL-2免疫缀合物与对照效应器模块比较时，对照效应器模块是游离的、未缀合的IL-2。类似地，例如当将IL-12免疫缀合物与对照效应器模块比较时，对照效应器模块是游离的、未缀合物的IL-12(例如展现为异二聚体蛋白质，其中p40和p35亚基仅共享二硫键)。
如本文中使用的，术语“效应器模块受体”指能特异性结合效应器模块的多肽分子。例如，在IL-2是效应器模块的情况中，结合IL-2分子(例如包含IL-2的免疫缀合物)的效应器模块受体是IL-2受体。类似地，例如在IL-12是免疫缀合物的效应器模块的情况中，效应器模块受体是IL-12受体。在效应器模块特异性结合超过一种受体的情况中，所有特异性结合效应器模块的受体均为该效应器模块的“效应器模块受体”。
术语“免疫球蛋白分子”指具有天然存在的抗体结构的蛋白质。例如，IgG类的免疫球蛋白是约150,000道尔顿的异四聚体糖蛋白，其由二硫键连接的两条轻链和两条重链构成。从N端至C端，每条重链具有可变区(VH，也称为可变重域或重链可变域)，接着是3个恒定域(CH1、CH2和CH3，也称为重链恒定区)。类似地，从N端至C端，每条轻链具有可变区(VL，也称为可变轻域或轻链可变域)，接着是恒定轻(CL)域(也称为轻链恒定区)。免疫球蛋白的重链可以归入称为α(IgA)、δ(IgD)、ε(IgE)、γ(IgG)或μ(IgM)的5类之一，其中一些可以进一步分成亚类，例如γ1(IgG1)、γ2(IgG2)、γ3(IgG3)、γ4(IgG4)、α1(IgA1)和α2(IgA2)。基于其恒定域的氨基酸序列，免疫球蛋白的轻链可以归入称为卡帕(κ)和拉姆达(λ)的两类之一。免疫球蛋白基本由经由免疫球蛋白铰链区连接的两个Fab分子和Fc域组成。
术语“抗体”在本文中以最广义使用且涵盖各种抗体结构，包括但不限于单克隆抗体、多克隆抗体和抗体片段，只要它们展现出期望的抗原结合活性。
“抗体片段”指完整抗体外的分子，其包含完整抗体中结合与完整抗体结合的抗原的一部分。抗体片段的例子包括但不限于Fv、Fab、Fab’、Fab’-SH、F(ab’)2、双抗体、线性抗体、单链抗体分子(例如scFv)、和单域抗体。对于某些抗体片段的综述，参见Hudson等,NatMed9,129-134(2003)。对于scFv片段的综述，参见例如Plückthun,于The Pharmacology ofMonoclonal Antibodies,vol.113,Rosenburg和Moore编,Springer-Verlag,New York,pp.269-315(1994)；亦参见WO93/16185；和美国专利No.5,571,894和5,587,458。对包含补救受体结合表位残基且具有延长的体内半衰期的Fab和F(ab’)2片段的论述，参见美国专利No.5,869,046。双抗体是具有两个抗原结合位点的抗体片段，其可以是二价或双特异性的。参见，例如EP404,097;WO1993/01161;Hudson等,Nat Med9,129-134(2003)；和Hollinger等,Proc Natl Acad Sci USA90,6444-6448(1993)。三抗体和四抗体也记载于Hudson等,Nat Med9,129-134(2003)。单域抗体是包含抗体的整个或部分重链可变域、或整个或部分轻链可变域的抗体片段。在某些实施方案中，单域抗体是人单域抗体(Domantis,Inc.,Waltham,MA;参见例如美国专利No.6,248,516B1)。可以通过各种技术来制备抗体片段，包括但不限于对完整抗体的蛋白水解消化以及通过重组宿主细胞(例如大肠杆菌或噬菌体)产生，如本文中描述的。
术语“抗原结合域”指包含特异性结合部分或整个抗原且与其互补的区域的抗体部分。抗原结合域可由例如一个或多个抗体可变域(也称为抗体可变区)提供。具体地，抗原结合域包含抗体轻链可变区(VL)和抗体重链可变区(VH)。
术语“可变区”或“可变域”指牵涉抗体对抗原结合的抗体重链或轻链的域。天然抗体的重链和轻链的可变域(分别为VH和VL)一般具有类似的结构，每个域包含4个保守的框架区(FR)和3个高变区(HVR)。参见，例如Kindt等,Kuby Immunology,第6版,W.H.Freemanand Co.,第91页(2007)。单个VH或VL域可能足以赋予抗原结合特异性。
如本文中使用的，术语“高变区”或“HVR”指抗体可变域中序列中高度可变和/或形成结构上定义的环(“高变环”)的每个区域。通常，天然的四链抗体包含六个HVR；三个在VH中(H1、H2、H3)，三个在VL中(L1、L2、L3)。HVR一般包含来自高变环和/或来自互补性决定区(CDR)的氨基酸残基，后者具有最高序列变异性和/或涉及抗原识别。除了VH中CDR1外，CDR一般包含形成高变环的氨基酸残基。高变区(HVR)也称为“互补性决定区”(CDR)，并且在述及形成抗原结合区的可变区部分时这些术语在本文中可交换使用。此特定区域已由Kabat等,U.S.Dept.of Health and Human Services,Sequences of Proteins ofImmunological Interest(1983)及由Chothia等,J Mol Biol196:901-917(1987)描述，其中定义包括在彼此比较时氨基酸残基的重叠或子集。然而，应用任一种定义来指抗体或其变体的CDR意图在如本文中定义和使用的术语的范围内。涵盖如由上文引用的每篇参考文献定义的CDR的适宜的氨基酸残基在下表1中列出作为比较。涵盖特定CDR的确切残基数将随着CDR的序列和大小而变化。在给定抗体的可变区氨基酸序列情况下，本领域技术人员可以常规确定哪些残基构成特定CDR。
表1：CDR定义1
CDR Kabat Chothia AbM2
VH CDR1 31-35 26-32 26-35
VH CDR2 50-65 52-58 50-58
VH CDR3 95-102 95-102 95-102
VL CDR1 24-34 26-32 24-34
VL CDR2 50-56 50-52 50-56
VL CDR3 89-97 91-96 89-97
1表1中所有CDR定义的编号方式依照由Kabat等提出的编号惯例(见下文)。
2如表1中使用的具有小写字母“b”的“AbM”指由Oxford Molecular的“AbM”抗体建模软件定义的CDR。
Kabat等还定义针对可变区序列的编号***，其可应用于任何抗体。本领域的普通技术人员可以明确地将此“Kabat编号”***归入任何可变区序列，不依赖于序列本身外的任何实验数据。如本文中使用的，“Kabat编号方式”指由Kabat等,U.S.Dept.of Health andHuman Services,"Sequence of Proteins of Immunological Interest"(1983)提出的编号***。除非另外说明，提及抗体可变区中特定氨基酸残基位置的编号方式依照Kabat编号***。
序列表的多肽序列(即SEQ ID NO:23,25,27,29,31,33等)并不依照Kabat编号***编号。然而，本领域中普通技术人员完全能将序列表的序列编号方式转变成Kabat编号方式。
“框架”或“FR”指除高变区(HVR)残基外的可变域残基。可变域的FR一般由4个FR域组成：FR1、FR2、FR3和FR4。因此，HVR和FR序列一般以下列顺序出现在VH(或VL)中：FR1-H1(L1)-FR2-H2(L2)-FR3-H3(L3)-FR4。
抗体或免疫球蛋白的“类”指其重链具有的恒定域或恒定区的类型。抗体有5种主要的类：IgA、IgD、IgE、IgG和IgM，并且其中数种可以进一步分成亚类(同种型)，例如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1和IgA2。对应于不同免疫球蛋白类的重链恒定域分别称为α、δ、ε、γ和μ。
本文中术语“Fc域”或“Fc区”用于定义免疫球蛋白重链中至少含有恒定区的一部分的C端区域。该术语包括天然序列Fc区和变体Fc区。虽然IgG重链的Fc区的边界可以略微变化，但是人IgG重链Fc区通常定义为自Cys226或Pro230延伸至重链的羧基端。然而，可以存在或不存在Fc区的C端赖氨酸(Lys447)。除非本文中另外指定，Fc区或恒定区中氨基酸残基的编号方式依照EU编号***，也称为EU索引，如记载于Kabat等,Sequences of Proteinsof Immunological Interest,第5版Public Health Service,National Institutes ofHealth,Bethesda,MD,1991的。如本文中使用的，Fc域的“亚基”指形成二聚体Fc域的两个多肽之一，即包含免疫球蛋白重链中能够稳定自身联合的C端恒定区的多肽。例如，IgG Fc域的亚基包含IgG CH2和IgG CH3恒定域。
“促进异二聚化的修饰”是降低或防止多肽与相同多肽联合以形成同二聚体的肽主链操作或多肽的翻译后修饰。如本文中使用的，具体地，促进异二聚化的修饰包括对期望形成二聚体的两个多肽中的每一个进行的分开的修饰，其中所述修饰彼此互补，从而促进两个多肽的联合。例如，促进异二聚化的修饰可以改变期望形成二聚体的一个或两个多肽的结构或电荷，从而在立体或静电上分别促进它们的联合。异二聚化在两个不相同的多肽如Fc域的两个亚基之间发生，其中与每个亚基融合的别的免疫缀合物组分(例如抗原结合模块、效应器模块)是不相同的。在依照本发明的免疫缀合物中，促进异二聚化的修饰在Fc域中。在一些实施方案中，促进异二聚化的修饰包含氨基酸突变，具体为氨基酸取代。在一个具体的实施方案中，促进异二聚化的修饰包含Fc域的两个亚基的每一个中分开的氨基酸突变，具体为氨基酸取代。
术语“效应器功能”指那些可归于抗体Fc区且随抗体同种型而变化的生物学活性。抗体效应器功能的例子包括：C1q结合和补体依赖性细胞毒性(CDC)、Fc受体结合、抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)、抗体依赖性细胞吞噬作用(ADCP)、细胞因子分泌、免疫复合物介导的抗原呈递细胞的抗原摄取、细胞表面受体(例如B细胞受体)下调和B细胞活化。
如本文中使用的，术语“工程化”视为包括对肽主链的任意操作或对天然存在或重组的多肽或其片段的翻译后修饰。工程化包括对氨基酸序列、糖基化模式或各氨基酸侧链基团的修饰，以及这些办法的组合。“工程化”，特别是具有前缀“糖”时，以及术语“糖基化工程化”包括细胞的糖基化装置的代谢工程化，包括对寡糖合成途径的遗传操作以实现细胞中表达的糖蛋白的改变的糖基化。此外，糖基化工程化包括突变和细胞环境对糖基化的影响。在一个实施方案中，糖基化工程化是糖基转移酶活性的改变。在一个具体的实施方案中，工程化导致改变的葡糖胺基转移酶活性和/或岩藻糖基转移酶活性。糖基化工程化可用于获得“具有增加的GnTIII活性的宿主细胞”、“具有增加的ManII活性的宿主细胞”或“具有降低的α(1,6)岩藻糖基转移酶活性的宿主细胞”。
如本文中使用的，术语“氨基酸突变”意为涵盖氨基酸取代、缺失、***和修饰。可以进行取代、缺失、***和修饰的任意组合来实现最终构建体，只要最终构建体拥有期望的特性，例如降低的对Fc受体的结合，或降低的对CD25的结合。氨基酸序列缺失和***包括氨基和/或羧基端缺失和氨基酸***。具体的氨基酸突变是氨基酸取代。为了改变例如Fc区或细胞因子如IL-2的结合特征，特别优选非保守性的氨基酸取代，即将一个氨基酸用具有不同结构和/或化学特性的另一种氨基酸替换。氨基酸取代包括由非天然存在的氨基酸或由20种标准氨基酸的天然存在的氨基酸衍生物(例如4-羟脯氨酸、3-甲基组氨酸、鸟氨酸、高丝氨酸、5-羟赖氨酸)替换。可以使用本领域中公知的遗传或化学方法生成氨基酸突变。遗传方法可以包括定点诱变、PCR、基因合成等。通过与遗传工程化不同的方法如化学修饰来改变氨基酸侧链基团的方法也可能可用。本文中可使用各种名称来指示同一氨基酸突变。例如，从Fc域第329位脯氨酸到甘氨酸的取代可指示为329G、G329、G329、P329G或Pro329Gly。
如本文中使用的，术语“多肽”指由通过酰胺键(也称为肽键)线性连接的单体(氨基酸)构成的分子。术语“多肽”指具有两个或更多个氨基酸的任意链，并且不指特定长度的产物。如此，肽、二肽、三肽、寡肽、“蛋白质”、“氨基酸链”或任何其它用于指具有两个或更多个氨基酸的链的术语均包括在“多肽”的定义中，而且术语“多肽”可以代替这些术语中任一个或与其交换使用。术语“多肽”还意图指多肽的表达后修饰的产物，包括但不限于糖基化、乙酰化、磷酸化、酰化、通过已知的保护性/封闭性基团衍生化、蛋白水解切割、或通过非天然存在的氨基酸的修饰。多肽可以自天然的生物学来源衍生或通过重组技术生成，但不必从指定的核酸序列翻译。它可以以任何方式来生成，包括通过化学合成。本发明的多肽大小可以是约3个以上、5个以上、10个以上、20个以上、25个以上、50个以上、75个以上、100个以上、200个以上、500个以上、1,000个以上、或2,000个以上的氨基酸。多肽可以具有限定的三维结构，尽管它们不必具有这类结构。具有限定的三维结构的多肽被称为折叠的，而不具有限定的三维结构而可以采用大量不同构象的多肽被称为未折叠的。
“分离的”多肽或其变体或衍生物意图为不处于其天然环境中的多肽。不需要特定水平的纯化。例如，分离的多肽可以是从其天然或自然环境中取出。就本发明而言，在宿主细胞中表达的重组生成的多肽和蛋白质被视为分离的，已通过任何合适的技术分开、分级、或部分或基本上纯化的天然的或重组的多肽也是如此。
关于参照多肽序列的“百分比(%)氨基酸序列同一性”定义为在比对序列并在必要时引入缺口以获取最大百分比序列同一性后，且不将任何保守性取代视为序列同一性的一部分时，候选序列中与参照多肽序列中的氨基酸残基相同的氨基酸残基的百分比。为测定百分比氨基酸序列同一性目的比对可以以本领域技术范围内的多种方式进行，例如使用公众可得到的计算机软件，如BLAST、BLAST-2、ALIGN或Megalign(DNASTAR)软件。本领域技术人员可决定用于比对序列的适宜参数，包括在比较序列的全长里获得最大比对需要的任何算法。然而，就本文中目的而言，使用序列比较计算机程序ALIGN-2来生成%氨基酸序列同一性值。ALIGN-2序列比较计算机程序由Genentech,Inc.创作，并且源代码已与用户文档一起提交到美国版权局(U.S.Copyright Office)，Washington D.C.，20559，其在美国版权注册No.TXU510087下注册。ALIGN-2程序可从Genentech，Inc.，South San Francisco，California公开获得，或可从源代码汇编。ALIGN-2程序应当汇编用于UNIX操作***，包括数字UNIX V4.0D。所有序列比较参数均由ALIGN-2程序设定且不改变。在采用ALIGN-2进行氨基酸序列比较的情况下，给定的氨基酸序列A对/与/相对给定的氨基酸序列B的%氨基酸序列同一性(或其可以用短语表示为对/与/相对给定的氨基酸序列B具有或包含特定%氨基酸序列同一性的给定氨基酸序列A)如下计算：
分数X/Y的100倍
其中X是由序列比对程序ALIGN-2在所述程序对A和B的比对中评为相同匹配的氨基酸残基数，而其中Y是B中氨基酸残基的总数。会领会的是，当氨基酸序列A的长度不等于氨基酸序列B的长度时，A对B的%氨基酸序列同一性将不等于B对A的%氨基酸序列同一性。除非另外明确说明，本文中使用的所有%氨基酸序列同一性值如在上一段中描述的那样使用ALIGN-2计算机程序获得。
术语“多核苷酸”指分离的核酸分子或构建体，例如信使RNA(mRNA)、病毒衍生的RNA或质粒DNA(pDNA)。多核苷酸可以包含常规的磷酸二酯键或非常规的键(例如酰胺键，如在肽核酸(PNA)中发现的)。术语“核酸分子”指任何一种或多种存在于多核苷酸中的核酸区段，例如DNA或RNA片段。
“分离的”核酸分子或多核苷酸意指已从其天然环境取出的核酸分子、DNA或RNA。例如，就本发明而言，包含在载体中的编码治疗性多肽的重组多核苷酸被视为分离的。分离的多核苷酸的别的例子包括在异源宿主细胞中保持的重组多核苷酸或溶液中的(部分或基本上)纯化的多核苷酸。分离的多核苷酸包括在普遍含有该多核苷酸分子的细胞中含有的多核苷酸分子，但该多核苷酸分子存在于染色体外或在不同于其天然染色***置的染色***置处。分离的RNA分子包括本发明的体内或体外RNA转录本，以及正链和负链形式、和双链形式。依照本发明的分离的多核苷酸或核酸还包括合成生成的这类分子。另外，多核苷酸或核酸可以为或可以包括调节元件如启动子、核糖体结合位点或转录终止子。
与本发明的参照核苷酸序列具有至少例如95%“相同的”核苷酸序列的核酸或多核苷酸意指该多核苷酸的核苷酸序列与参照序列相同，只不过按照参照核苷酸序列的每100个核苷酸，该多核苷酸序列可以包含多达5处点突变。换言之，为了获得与参照核苷酸序列具有至少95%相同的核苷酸序列的多核苷酸，可以删除或用另一种核苷酸取代参照序列中高达5%的核苷酸，或者可以将参照序列中占总核苷酸的高达5%的数目的核苷酸***到参照序列中。参照序列的这些变更可以发生在参照核苷酸序列的5’或3’端位置或那些末端位置之间的任意地方，个别分散在参照序列中的残基中或分散在参照序列内的一或多个连续组中。作为一个实际问题，可以使用已知的计算机程序，如上文针对多肽论述的程序(例如ALIGN-2)来常规确定任何特定的多核苷酸序列是否与本发明的核苷酸序列为至少80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%相同。
术语“表达盒”指重组或合成生成的，具有一系列允许特定核酸在靶细胞中转录的指定核酸元件的多核苷酸。可以将重组表达盒掺入质粒、染色体、线粒体DNA、质体DNA、病毒或核酸片段中。通常，表达载体的重组表达盒部分包含要转录的核酸序列和启动子等。在某些实施方案中，本发明的表达盒包含编码本发明的免疫缀合物或其片段的多核苷酸序列。
术语“载体”或“表达载体”与“表达构建体”同义，并指用于在靶细胞中导入与其可操作联合的特定基因及指导表达的DNA分子。该术语包括作为自主复制核酸结构的载体以及掺入到已经接受其导入的宿主细胞的基因组中的载体。本发明的表达载体包含表达盒。表达盒允许转录大量稳定的mRNA。一旦表达载体在靶细胞内，就通过细胞转录和/或翻译装置生成基因编码的核糖核酸分子或蛋白质。在一个实施方案中，本发明的表达载体包含表达盒，其包含编码本发明的免疫缀合物或其片段的多核苷酸序列。
术语“人工的”指合成的或非宿主细胞衍生的组合物，例如化学合成的寡核苷酸。
术语“宿主细胞”、“宿主细胞系”和“宿主细胞培养物”可交换使用并指已引入外源核酸的细胞，包括这类细胞的后代。宿主细胞包括“转化体”和“经转化的细胞”，其包括初始转化的细胞和自其衍生的后代(不考虑传代数)。后代在核酸内含物上可能与亲本细胞不完全相同，但可以含有突变。本文中包括具有如原始转化细胞中筛选或选择的相同的功能或生物学活性的突变体后代。宿主细胞是能用于生成用于本发明的免疫缀合物的任意类型的细胞***。在一个实施方案中，将宿主细胞工程化为允许生成在其Fc区中具有经修饰寡糖的免疫缀合物。在某些实施方案中，操作宿主细胞为表达升高水平的一种或多种具有β(1,4)-N-乙酰葡糖胺基转移酶III(GnTIII)活性的多肽。在某些实施方案中，还操作宿主细胞为表达升高水平的一种或多种具有α-甘露糖苷酶II(ManII)活性的多肽。宿主细胞包括培养的细胞，例如哺乳动物培养细胞如CHO细胞、BHK细胞、NS0细胞、SP2/0细胞、YO骨髓瘤细胞、P3X63小鼠骨髓瘤细胞、PER细胞、PER.C6细胞或杂交瘤细胞、酵母细胞、昆虫细胞和植物细胞等，而且还包括在转基因动物、转基因植物或培养的植物或动物组织中包含的细胞。
如本文中使用的，术语“具有GnTIII活性的多肽”指能够催化将N-乙酰葡糖胺(GlcNAc)残基以β-1,4连接添加到N-连接的寡糖的三甘露糖基核心的β-连接的甘露糖苷的多肽。这包括根据特定的生物学测定法的测量在有或无剂量依赖性的情况中展现出的酶活性类似于但不一定等同于β(1,4)-N-乙酰葡糖胺基转移酶III的活性的融合多肽，依照国际生物化学与分子生物学联盟命名委员会(NC-IUBMB)，β(1,4)-N-乙酰葡糖胺基转移酶III也称为β-1,4-甘露糖基-糖蛋白4-β-N-乙酰葡糖胺基转移酶(EC2.4.1.144)。在确实存在剂量依赖性的情况中，其不需要等于GnTIII的，而是相比于GnTIII，基本类似于在给定活性的剂量依赖性(即，相对于GnTIII，候选多肽将展现出更大的活性或小不超过约25倍，而且优选地小不超过约10倍的活性，且最优选地，小不超过约3倍的活性)。在某些实施方案中，具有GnTIII活性的多肽是融合多肽，其包含GnTIII的催化域和异源高尔基(Golgi)驻留多肽的高尔基定位域。特定地，高尔基定位域是甘露糖苷酶II或GnTI的定位域，最特定地是甘露糖苷酶II的定位域。或者，高尔基定位域选自下组：甘露糖苷酶I的定位域、GnTII的定位域和α1,6核心岩藻糖基转移酶的定位域。用于生成这类融合多肽及使用它们来生成具有升高的效应器功能的抗体的方法在WO2004/065540、美国临时专利申请No.60/495,142和美国专利申请公开文本No.2004/0241817中披露，其完整内容通过提述明确并入本文。
如本文中使用的，术语“高尔基定位域”指高尔基驻留多肽中负责将多肽锚定到高尔基复合体内的位置的氨基酸序列。一般地，定位域包含酶的氨基端“尾部”。
如本文中使用的，术语“具有ManII活性的多肽”指能够催化N-连接的寡糖的分支GlcNAcMan5GlcNAc2甘露糖中间物中末端1,3-和1,6-连接的α-D-甘露糖残基的水解的多肽。这包括展现出的酶活性类似于但不一定等同于高尔基体α-甘露糖苷酶II的活性的多肽，依照国际生物化学与分子生物学联盟命名委员会(NC-IUBMB)，α-甘露糖苷酶II也称为甘露糖基寡糖1,3-1,6-α-甘露糖苷酶II(EC3.2.1.114)。
“激活Fc受体”是一种在抗体(或免疫缀合物)的Fc区衔接后，引发刺激携带该受体的细胞实施效应器功能的信号传导事件的Fc受体。激活Fc受体包括FcγRIIIa(CD16a)、FcγRI(CD64)、FcγRIIa(CD32)和FcαRI(CD89)。
抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)是一种导致通过免疫效应细胞对抗体包被的靶细胞裂解的免疫机制。靶细胞是包含Fc区的抗体、免疫缀合物或其片段一般经由Fc区的N端的蛋白质部分特异性结合的细胞。如本文中使用的，术语“升高的ADCC”定义为通过上文定义的ADCC机制，以靶细胞周围介质中给定浓度的免疫缀合物，在给定的时间内裂解的靶细胞数目的增加，和/或通过ADCC机制，实现给定时间内给定数目的靶细胞裂解需要的靶细胞周围介质中抗体浓度的降低。ADCC的升高相对于使用相同的标准生产、纯化、配制和贮存方法(其是本领域技术人员已知的)、由同一类型的宿主细胞生成但尚未工程化改造的相同免疫缀合物介导的ADCC。例如，由通过本文中描述的方法工程化改造为具有改变的糖基化模式(例如表达糖基转移酶、GnTIII或其它糖基转移酶)的宿主细胞生成的免疫缀合物介导的ADCC的升高，是相对于由同一类型的未工程化宿主细胞生成的相同免疫缀合物介导的ADCC而言。
“具有升高的抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)的免疫缀合物”意指一种具有升高的ADCC的免疫缀合物，如通过本领域普通技术人员已知的任何合适的方法测定的。一种公认的体外ADCC测定法如下：
1)该测定法使用已知表达由免疫缀合物的抗原结合模块识别的靶抗原的靶细胞；
2)该测定法使用从随机选择的健康供体的血液分离的人外周血单个核细胞(PBMC)作为效应器细胞；
3)该测定法依照以下方案实施：
i)使用标准的密度离心规程分离PBMC，并以5x106个细胞/ml重悬于RPMI细胞培养基中；
ii)通过标准的组织培养方法培养靶细胞，从存活率高于90%的指数生长阶段收获，在RPMI细胞培养基中清洗，用100微居里51Cr标记，并用细胞培养基清洗2次，并以105个细胞/ml的密度重悬于细胞培养基中；
iii)将100微升的上述最终靶细胞悬液转移至96孔微量滴定板的每个孔；
iv)在细胞培养基中将免疫缀合物从4000ng/ml连续稀释至0.04ng/ml，并将50微升所得免疫缀合物溶液添加至96孔微量滴定板中的靶细胞，以一式三份测试覆盖上述整个浓度范围的各种免疫缀合物浓度；
v)对于最大释放(MR)对照，在含有经标记的靶细胞的板中3个另外的孔接受50微升非离子型去污剂(Nonidet,Sigma,St.Louis)的2%(V/V)水性溶液，代替免疫缀合物溶液(上述第iv点)；
vi)对于自发性释放(SR)对照，在含有经标记的靶细胞的板中3个另外的孔接受50微升RPMI细胞培养基，代替免疫缀合物溶液(上述第iv点)；
vii)然后将96孔微量滴定板以50x g离心1分钟并在4℃温育1小时；
viii)将50微升PBMC悬液(上述第i点)添加至每孔以得到25:1的效应细胞:靶细胞比率，并将板在5%CO2气氛下置于培养箱中于37℃达4小时；
ix)收获来自每孔的无细胞上清液，并使用γ计数器量化实验释放的放射性(ER)；
x)依照公式(ER-MR)/(MR-SR)x100对每一免疫缀合物浓度计算特定裂解的百分比，其中ER是对该免疫缀合物浓度量化的平均放射性(见上述第ix点)，MR是对MR对照(见上述第v点)量化的平均放射性(见上述第ix点)，而SR是对SR对照(见上述第vi点)量化的平均放射性(见上述第ix点)；
4)“升高的ADCC”定义为在上文测试的免疫缀合物浓度范围内观察到的比裂解的最大百分比的增加，和/或实现上文测试的免疫缀合物浓度范围内观察到的比裂解的最大百分比的一半需要的免疫缀合物浓度的降低。ADCC的升高相对于用上述测定法测量的，使用本领域技术人员已知的相同的标准生成、纯化、配制和贮存方法，由相同类型的宿主细胞产生的，但是尚未工程化改造的相同免疫缀合物介导的ADCC。
药剂的“有效量”指引起接受其施用的细胞或组织中的生理学变化必需的量。
药剂例如药物组合物的“治疗有效量”指有效实现期望的治疗或预防结果的量（以必要的剂量且持续必要的时间）。治疗有效量的药剂例如消除、降低、延迟、最小化或预防疾病的不良作用。
“个体”或“受试者”是哺乳动物。哺乳动物包括但不限于驯养的动物(例如牛、棉羊、猫、犬和马)、灵长类(例如人和非人灵长类如猴)、家兔和啮齿动物(例如小鼠和大鼠)。优选地，所述个体或受试者是人。
术语“药物组合物”指其形式使得容许其中含有的活性成分的生物学活性有效，且不含对会接受配制剂施用的受试者有不可接受的毒性的别的成分的制剂。
“药学可接受载体”指药物组合物中活性成分以外对受试者无毒的成分。药学可接受载体包括但不限于缓冲剂、赋形剂、稳定剂或防腐剂。
如本文中使用的，“治疗/处理”(及其语法变体)指试图改变治疗个体中疾病的自然进程，并且可以是为了预防或在临床病理学的过程期间实施的临床干预。治疗的期望效果包括但不限于预防疾病的发生或复发、缓解症状、降低疾病的任何直接或间接病理学后果、预防转移、减缓疾病进展率、改善或减轻疾病状态、及消退或改善的预后。在一些实施方案中，本发明的免疫缀合物用于延迟疾病的形成或延缓病症的进展。
术语“包装插页”用于指治疗产品的商业化包装中通常含有的说明书，其含有关于适应症、使用、剂量、施用、组合疗法、禁忌症的信息和/或关于使用这类治疗产品的警告。
实施方案的详细说明
在第一个方面，本发明提供包含第一抗原结合模块、由两个亚基组成的Fc域和效应器模块的免疫缀合物，其中存在不超过一个效应器模块。别的效应器模块的缺乏可以减少该免疫缀合物对呈现相应效应器模块受体的部位的靶向，由此改进对其中呈现该免疫缀合物实际靶抗原(其由抗原结合模块识别)的部位的靶向和在该处的累积。此外，在静脉内施用该免疫缀合物后，缺少对相应效应器模块受体的亲合力效应可减少外周血中效应器模块受体阳性细胞的激活。而且，仅包含单个效应器模块的免疫缀合物的血清半衰期与包含两个或更多个效应器模块的免疫缀合物相比似乎更长。
免疫缀合物形式
免疫缀合物的组分可以以多种构造彼此融合。例示性构造绘于图2。在一个实施方案中，效应器模块融合至Fc域的两个亚基之一的氨基或羧基端氨基酸。在一个实施方案中，效应器模块融合至Fc域的两个亚基之一的羧基端氨基酸。效应器模块可直接地或经由接头肽融合至Fc域，所述接头肽包含一个或多个氨基酸，通常约2-20个氨基酸。接头肽是本领域中已知或本文中记载的。合适的、非免疫原性的接头肽包括例如(G4S)n、(SG4)n或G4(SG4)n接头肽。“n”一般是介于1和10之间的数字，通常介于2和4之间。或者，当效应器模块连接至Fc域亚基的N端时，其可经由免疫球蛋白铰链区或其部分，在有或无额外的接头肽的情况下连接。
类似地，第一抗原结合模块可融合至Fc域的两个亚基之一的氨基或羧基端氨基酸。在一个实施方案中，第一抗原结合模块融合至Fc域的两个亚基之一的氨基端氨基酸。第一抗原结合模块可直接地或经由接头肽融合至Fc域。在一个具体的实施方案中，第一抗原结合模块经由免疫球蛋白铰链区融合至Fc域。在一个具体的实施方案中，免疫球蛋白铰链区是人IgG1铰链区。
在一个实施方案中，第一抗原结合模块包含抗体的抗原结合域，该结合域包含抗体重链可变区和抗体轻链可变区。在一个具体的实施方案中，第一抗原结合模块是Fab分子。在一个实施方案中，Fab分子在其重链或轻链羧基端融合至Fc域的两个亚基之一的氨基端氨基酸。在一个具体的实施方案中，Fab分子在其重链羧基端融合至Fc域的两个亚基之一的氨基端氨基酸。在一个更具体的实施方案中，Fab分子经由免疫球蛋白铰链区融合至Fc域。在一个具体的实施方案中，所述免疫球蛋白铰链区是人IgG1铰链区。
在一个实施方案中，免疫缀合物基本由以下组成：抗原结合模块、由两个亚基组成的Fc域、效应器模块以及任选地一种或多种接头肽，其中所述抗原结合域是Fab分子且在其重链羧基端融合至Fc域的两个亚基之一的氨基端氨基酸，且其中所述效应器模块融合至(i)Fc域的两个亚基中另一个的氨基端氨基酸，或(ii)Fc域的两个亚基之一的羧基端氨基酸。在后一情况中，效应器模块和第一抗原结合模块均可融合至Fc域的同一亚基，或可各自融合至Fc域的两个亚基的不同亚基。
具有单一抗原结合模块的免疫缀合物形式(例如如图2B和2C中显示的)是有用的，特别是在高亲合力抗原结合模块的结合后会预期靶抗原内在化的情况下。在此类情况中，每个免疫缀合物存在超过一个抗原结合模快可以增强内在化，由此降低靶抗原的可用性。
然而，在许多其它情况中，会有利的是具有包含两个或更多个抗原结合模块以及单一的效应器模块的免疫缀合物，从而优化对靶抗原对效应器模块受体的靶向、以及免疫缀合物的药学窗口。
如此，在一个具体的实施方案中，本发明的免疫缀合物包含第一和第二抗原结合模块。在一个实施方案中，所述第一和第二抗原结合模块的每一个融合至Fc域的两个亚基之一的氨基端氨基酸。第一和第二抗原结合模块可直接或经由接头肽融合至Fc域。在一个具体的实施方案中，所述第一和第二抗原结合模块的每一个经由免疫球蛋白铰链区融合至Fc域亚基。在一个具体的实施方案中，所述免疫球蛋白铰链区是人IgG1铰链区。
在一个实施方案中，所述第一和第二抗原结合模块的每一个包含抗体的抗原结合域，该抗原结合域包含抗体重链可变区和抗体轻链可变区。在一个具体的实施方案中，所述第一和第二抗原结合模块的每一个是Fab分子。在一个实施方案中，所述Fab分子的每一个在其重链或轻链羧基端融合至Fc域的两个亚基之一的氨基端氨基酸。在一个具体的实施方案中，所述Fab分子的每一个在其重链羧基端融合至Fc域的两个亚基之一的氨基端氨基酸。在一个更具体的实施方案中，所述Fab分子的每一个经由免疫球蛋白铰链区融合至Fc域的亚基。在一个具体的实施方案中，所述免疫球蛋白铰链区是人IgG1铰链区。
在一个实施方案中，所述第一和第二抗原结合模块以及Fc域是免疫球蛋白分子的部分。在一个具体的实施方案中，免疫球蛋白分子是IgG类免疫球蛋白。在一个甚至更具体的实施方案中，免疫球蛋白是IgG1亚类免疫球蛋白。在另一个具体的实施方案中，所述免疫球蛋白是人免疫球蛋白。在其它实施方案中，所述免疫球蛋白是嵌合的免疫球蛋白或人源化的免疫球蛋白。在一个实施方案中，所述效应器模块融合至免疫球蛋白重链之一的羧基端氨基酸。所述效应器模块可直接或经由接头肽融合至免疫球蛋白。在一个具体的实施方案中，所述免疫缀合物基本由以下组成：免疫球蛋白分子、融合至免疫球蛋白重链之一的羧基端氨基酸的效应器模块、和任选地一种或多种接头肽。
在一个实施方案中，所述免疫缀合物包含其中的Fab重链与Fc域亚基共享羧基端肽键的多肽和其中的Fc域亚基与效应器模块多肽共享羧基端肽键的多肽。在另一个实施方案中，所述免疫缀合物包含其中的第一Fab重链与Fc域亚基共享羧基端肽键的多肽，和其中的第二Fab重链与Fc域亚基共享羧基端肽键，该Fc域亚基继而与效应器模块多肽共享羧基端肽键的多肽。在一个别的实施方案中，所述免疫缀合物包含其中的Fab重链与Fc域亚基共享羧基端肽键的多肽和其中的效应器模块多肽与Fc域亚基共享羧基端肽键的多肽。在一些实施方案中，所述免疫缀合物还包含Fab轻链多肽。在某些实施方案中，所述多肽例如通过二硫键共价连接。
依照上文任一个实施方案，免疫缀合物的组分(例如效应器模块、抗原结合模块、Fc域)可直接连接或经由本文中描述的或本领域中已知的各种接头，特别是包含一个或多个氨基酸(通常约2-20个氨基酸)的肽接头连接。合适的、非免疫原性的接头肽包括例如(G4S)n、(SG4)n或G4(SG4)n接头肽，其中n一般是介于1和10之间的数字，通常介于2和4之间。
Fc域
免疫缀合物的Fc域由一对包含免疫球蛋白分子重链域的多肽链组成。例如，免疫球蛋白G(IgG)分子的Fc域是二聚体，其各个亚基包含CH2和CH3IgG重链恒定域。Fc域的两个亚基能够彼此稳定联合。在一个实施方案中，本发明的免疫缀合物包含不超过一个Fc域。
在依照本发明的一个实施方案中，免疫缀合物的Fc域是IgG Fc域。在一个具体的实施方案中，Fc域是IgG1Fc域。在另一个实施方案中，Fc域是IgG4Fc域。在一个别的具体的实施方案中，Fc域是人的。人IgG1Fc区的一个例示性序列在SEQ ID NO:1给出。
相比于缺少Fc域的免疫缀合物形式，Fc域赋予所述免疫缀合物以极大延长的血清半衰期。特别是当免疫缀合物包含具有相当弱活性(但例如降低的毒性)的效应器模块时，较长的半衰期可能是实现体内最佳功效必需的。此外，Fc域能介导效应器功能，如将在下文进一步论述的。
促进异二聚化的Fc域修饰
依照本发明的免疫缀合物仅包含一个单一效应器模块，其融合至Fc域的两个亚基之一，如此它们包含两条不相同的多肽链。这些多肽的重组共表达和随后二聚化导致两种多肽的数种可能组合，其中仅两条不相同多肽的异二聚体依照本发明是可用的。为了改进重组生产的免疫缀合物的产率和纯度，如此在免疫缀合物的Fc域中引入阻碍两条相同多肽(即包含效应器模块的两个多肽，或缺乏效应器模块的两个多肽)的同二聚体形成和/或促进包含效应器模块的多肽和缺少效应器模块的多肽的异二聚体形成的修饰可能是有利的。
因此，在依照本发明的某些实施方案中，免疫缀合物的Fc域包含促进两条不相同多肽链的异二聚化的修饰。人IgG Fc域的两条多肽链之间最广泛的蛋白质-蛋白质相互作用的位点在Fc域的CH3域中。如此，在一个实施方案中，所述修饰在Fc域的CH3域中。
在一个具体的实施方案中，所述修饰是突出-入-孔修饰，其包含在Fc域的两个亚基之一中的突出修饰和在Fc域的两个亚基的另一个中的孔修饰。
突出-入-孔技术记载于例如US5,731,168;US7,695,936;Ridgway等,Prot Eng9,617-621(1996)和Carter,J Immunol Meth248,7-15(2001)。一般地，该方法牵涉在第一多肽的界面处引入***(“突出”)并在第二多肽的界面处引入相应的穴(“孔”)，从而使得***可以置于穴中以促进异二聚体形成并阻碍同二聚体形成。通过将来自第一多肽界面的小氨基酸侧链用更大的侧链(例如酪氨酸或色氨酸)替换来构建***。在第二多肽的界面中创建具有与***相同或相似大小的互补性穴，其通过将大氨基酸侧链用更小的氨基酸侧链(例如丙氨酸或苏氨酸)替换得到。可以通过改变编码多肽的核酸，例如通过位点专一诱变或通过肽合成来制备***和穴。在一个具体的实施方案中，突出修饰包含在Fc域的两个亚基之一中的氨基酸取代T366W，而孔修饰包含在Fc域的两个亚基的另一个中的氨基酸取代T366S、L368A和Y407V。在另一个具体的实施方案中，包含突出修饰的Fc域亚基另外包含氨基酸取代S354C，且包含孔修饰的Fc域亚基另外包含氨基酸取代Y349C。引入这两个半胱氨酸残基导致在Fc区的两个亚基之间形成二硫桥，从而进一步稳定二聚体(Carter,JImmunol Methods248,7-15(2001))。
在一个备选的实施方案中，促进两条不相同多肽链的异二聚化的修饰包含介导静电操纵效应(electrostatic steering effect)的修饰，例如如记载于PCT公开文本WO2009/089004的。一般地，此方法涉及将在两条多肽链界面处的一个或多个氨基酸残基替换为带电荷的氨基酸残基，从而在静电上不利于同二聚体形成而在静电上有利于异二聚化。
在一个具体的实施方案中，所述效应器模块融合至包含突出修饰的Fc域亚基的氨基或羧基端氨基酸。不希望受理论束缚，效应器模块与Fc域的含有突出的亚基的融合将进一步使包含两个效应器模块的同二聚体免疫缀合物的生成(两个含有突出的多肽的空间对撞)最小化。
改变Fc受体结合的Fc域修饰
在本发明的某些实施方案中，将免疫缀合物的Fc域工程化改造为相比于非工程化Fc域，具有改变的对Fc受体的结合亲和力，特别是改变的对Fcγ受体的结合亲和力。
可以容易地测定对Fc受体的结合，例如通过ELISA或通过使用标准仪器如BIAcore仪(GE Healthcare)的表面等离振子共振(SPR)，且Fc受体如可以通过重组表达获得。本文中描述了合适的这类结合测定法。或者，可以使用已知表达特定Fc受体的细胞系，如表达FcγIIIa受体的NK细胞来评估Fc域或包含Fc域的免疫缀合物对Fc受体的结合亲和力。
在一些实施方案中，将免疫缀合物的Fc域工程化改造为相比于非工程化Fc域，具有改变的效应器功能，特别是改变的ADCC。
可以通过本领域中已知的方法来测量Fc域或包含Fc域的免疫缀合物的效应器功能。本文中描述了适合用于测量ADCC的测定法。评估感兴趣分子的ADCC活性的体外测定法的其它例子记载于美国专利No.5,500,362;Hellstrom等Proc Natl Acad Sci USA83,7059-7063(1986)和Hellstrom等,Proc Natl Acad Sci USA82,1499-1502(1985);美国专利No.5,821,337;Bruggemann等,J Exp Med166,1351-1361(1987)。或者，可以采用非放射性的测定方法(参见，例如用于流式细胞术的ACTITM非放射性细胞毒性测定(CellTechnology,Inc.Mountain View,CA);和CytoTox非放射性细胞毒性测定(Promega,Madison,WI))。可用于这类测定法的效应细胞包括外周血单个核细胞(PBMC)和天然杀伤(NK)细胞。或者/另外，可以体内评估感兴趣分子的ADCC活性，例如在动物模型，如在Clynes等,Proc Natl Acad Sci USA95,652-656(1998)中披露的动物模型中。
在一些实施方案中，改变Fc域对补体成分，特别地对C1q的结合。因此，在Fc域工程化改造为具有改变的效应器功能的一些实施方案中，所述改变的效应器功能包括改变的CDC。可以实施C1q结合测定法来测定免疫缀合物能否结合C1q并因此具有CDC活性。参见，例如WO2006/029879和WO2005/100402中的C1q和C3c结合ELISA。为了评估补体激活，可以实施CDC测定法(参见，例如Gazzano-Santoro等,J Immunol Methods202,163(1996);Cragg等,Blood101,1045-1052(2003);以及Cragg和Glennie,Blood103,2738-2743(2004))。
a)降低的Fc受体结合和/或效应器功能
Fc域赋予免疫缀合物以有利的药动学特性，包括长血清半衰期，其有助于在靶组织中的较好累积和有利的组织-血液分配比。然而，同时它可能导致不想要的免疫缀合物对表达Fc受体的细胞而非优选的携带抗原的细胞的靶向。此外，Fc受体信号传导途径的共激活可能导致细胞因子释放，其与效应器模块以及免疫缀合物的长半衰期组合，在***性施用后引起细胞因子受体的过度激活和严重的副作用。与此相符的是，常规的IgG-IL-2免疫缀合物已被描述为与输注反应有关(参见例如King等,J Clin Oncol22,4463-4473(2004))。
因此，在依照本发明的具体的实施方案中，将免疫缀合物的Fc域工程化改造为具有降低的对Fc受体的结合亲和力。在一个这类实施方案中，所述Fc域包含一个或多个氨基酸突变，其降低Fc域对Fc受体的结合亲和力。通常，Fc域的两个亚基的每一个中存在相同的一个或多个氨基酸突变。在一个实施方案中，所述氨基酸突变将Fc域对Fc受体的结合亲和力降低至少2倍、至少5倍、或至少10倍。在有超过一个降低Fc域对Fc受体的结合亲和力的氨基酸突变的实施方案中，这些氨基酸突变的组合可以将Fc域对Fc受体的亲和力降低至少10倍、至少20倍、或甚至至少50倍。在一个实施方案中，包含工程化Fc域的免疫缀合物相比于包含非工程化Fc域的免疫缀合物，展现出低于20%，特别是低于10%，更特别地低于5%的对Fc受体的结合亲和力。在一个实施方案中，Fc受体是激活的Fc受体。在一个具体的实施方案中，Fc受体是Fcγ受体，更特定地是FcγRIIIa、FcγRI或FcγRIIa受体。优选地，降低对这些受体的每一种的结合。在一些实施方案中，还降低对补体成分的结合亲和力，特别是对C1q的结合亲和力。在一个实施方案中，不降低对新生儿Fc受体(FcRn)的结合亲和力。当Fc域(或包含Fc域的免疫缀合物)展现出Fc域的非工程化形式(或包含所述Fc域的非工程化形式的免疫缀合物)对FcRn的结合亲和力的超过约70%时，就实现对FcRn的基本类似的结合，即保留该Fc域对所述受体的结合亲和力。Fc域或包含所述Fc域的本发明的免疫缀合物可以展现出高于约80%和甚至高于约90%的这类亲和力。在一个实施方案中，所述氨基酸突变是氨基酸取代。在一个实施方案中，Fc域包含在第P329位的氨基酸取代。在一个更具体的实施方案中，所述氨基酸取代是P329A或P329G，特别是P329G。在一个实施方案中，Fc域在选自S228、E233、L234、L235、N297和P331的位置处包含另外的氨基酸取代。在一个更具体的实施方案中，另外的氨基酸取代是S228P、E233P、L234A、L235A、L235E、N297A、N297D或P331S。在一个具体的实施方案中，Fc域在位置P329、L234和L235处包含氨基酸取代。在一个更具体的实施方案中，Fc域包含氨基酸突变L234A、L235A和P329G(LALA P329G)。此氨基酸取代的组合几乎完全消除Fcγ受体对人IgG Fc域的结合，如记载于欧洲专利申请no.EP11160251.2的，其通过提述完整并入本文。EP11160251.2还描述了制备这类突变体Fc域的方法和用于测定其特性如Fc受体结合或效应器功能的方法。
可以使用本领域中公知的遗传或化学方法通过氨基酸缺失、取代、***或修饰来制备突变体Fc区。遗传方法可以包括对编码DNA序列的位点专一性诱变、PCR、基因合成等。正确的核苷酸变化可以通过例如测序来验证。
在一个实施方案中，将Fc域工程化改造为相比于非工程化Fc域具有降低的效应器功能。所述降低的效应器功能可包括但不限于下列一种或多种：降低的补体依赖性细胞毒性(CDC)、降低的抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)、降低的抗体依赖性细胞吞噬作用(ADCP)、降低的细胞因子分泌、降低的免疫复合物介导的抗原呈递细胞的抗原摄取、降低的对NK细胞的结合、降低的对巨噬细胞的结合、降低的对单核细胞的结合、降低的对多形核细胞的结合、降低的诱导凋亡的直接信号传导、降低的靶物结合的抗体的交联、降低的树突细胞成熟或降低的T细胞启动。
在一个实施方案中，所述降低的效应器功能是选自下组的一项或多项：降低的CDC、降低的ADCC、降低的ADCP和降低的细胞因子分泌。在一个具体的实施方案中，所述降低的效应器功能是降低的ADCC。在一个实施方案中，所述降低的ADCC小于由非工程化Fc域(或包含非工程化Fc域的免疫缀合物)诱导的ADCC的20%。
除了上文和欧洲专利申请no.EP11160251.2中描述的Fc域以外，具有降低的Fc受体结合和/或效应器功能的Fc域还包括那些具有对Fc域残基238、265、269、270、297、327和329中一个或多个的取代的Fc域(美国专利No.6,737,056)。这类Fc突变体包括在氨基酸位置265、269、270、297和327中两个或更多个处具有取代的Fc突变体，包括具有将残基265和297取代为丙氨酸的所谓的“DANA”Fc突变体(美国专利No.7,332,581)。
IgG4抗体相比于IgG1抗体展现出降低的对Fc受体的结合亲和力和降低的效应器功能。因此，在一些实施方案中，本发明的T细胞激活性双特异性抗原结合分子的Fc域是IgG4Fc域，具体为人IgG4Fc域。在一个实施方案中，IgG4Fc域包含在位置S228处的氨基酸取代，特定地为氨基酸取代S228P。为了进一步降低其对Fc受体的结合亲和力和/或其效应器功能，在一个实施方案中，IgG4Fc域包含在位置L235处的氨基酸取代，特定地为氨基酸取代L235E。在另一个实施方案中，IgG4Fc域包含在位置P329处的氨基酸取代，特定地为氨基酸取代P329G。在一个具体的实施方案中，IgG4Fc域包含在位置S228、L235和P329处的氨基酸取代，特定地为氨基酸取代S228P、L235E和P329G。这类IgG4Fc域突变体及其Fcγ受体结合特性记载于欧洲专利申请no.EP11160251.2，其通过提述完整并入本文。
b)降低的Fc受体结合和/或效应器功能
相反，可以存在期望维持或甚至增强免疫缀合物的Fc受体结合和/或效应器功能的情况，例如当免疫缀合物靶向高度特异性的肿瘤抗原时。因此，在某些实施方案中，将本发明的免疫缀合物的Fc域工程化改造为具有升高的对Fc受体的结合亲和力。升高的结合亲和力可以是Fc域对Fc受体的结合亲和力中增加至少2倍、至少5倍或至少10倍。在一个实施方案中，Fc受体是激活性Fc受体。在一个具体的实施方案中，Fc受体是Fcγ受体。在一个实施方案中，Fc受体选自下组：FcγRIIIa、FcγRI和FcγRIIa。在一个具体的实施方案中，Fc受体是FcγRIIIa。
在一个这类实施方案中，将Fc域工程化改造为相比于非工程化的Fc域，具有改变的寡糖结构。在一个具体的这类实施方案中，Fc域相比于非工程化的Fc域包含增加的非岩藻糖基化寡糖比例。在一个更具体的实施方案中，免疫缀合物Fc域中至少约20%、约25%、约30%、约35%、约40%、约45%、约50%、约55%、约60%、约65%、约70%、约75%、约80%、约85%、约90%、约95%或约100%，特别是至少约50%，更特别是至少约70%的N-连接的寡糖是非岩藻糖基化的。非岩藻糖基化的寡糖可以是杂合或复合类型的。在另一个具体的实施方案中，Fc域相比于非工程化Fc域包含增加的两分型寡糖比例。在一个更具体的实施方案中，免疫缀合物Fc域中至少约10%、约15%、约20%、约25%、约30%、约35%、约40%、约45%、约50%、约55%、约60%、约65%、约70%、约75%、约80%、约85%、约90%、约95%或约100%，特别是至少约50%，更特别是至少约70%的N-连接的寡糖是两分的。两分型寡糖可以是杂合或复合类型的。在又一个具体的实施方案中，Fc域相比于非工程化的Fc域包含增加的两分型非岩藻糖基化寡糖比例。在一个更具体的实施方案中，免疫缀合物Fc域中至少约10%、约15%、约20%、约25%、约30%、约35%、约40%、约45%、约50%、约55%、约60%、约65%、约70%、约75%、约80%、约85%、约90%、约95%或约100%，特别是至少约15%，更特别是至少约25%、至少约35%或至少约50%的N-连接的寡糖是两分的、非岩藻糖基化的。两分的、非岩藻糖基化的寡糖可以是杂合或复合类型的。
可以通过本领域中公知的方法来分析免疫缀合物Fc域中的寡糖结构，例如通过MALDI TOF质谱术进行，如记载于Umana等,Nat Biotechnol17,176-180(1999)或Ferrara等,Biotechn Bioeng93,851-861(2006)的。非岩藻糖基化的寡糖的百分比是相对于附接于Asn297的所有寡糖(例如复合、杂合和高甘露糖结构)并通过MALDI TOF MS在N-糖苷酶F处理的样品中鉴定的缺少岩藻糖残基的寡糖量。Asn297指位于Fc域中约第297位(Fc区残基的EU编号方式)的天冬酰胺残基；然而，由于免疫球蛋白中的微小序列变异，Asn297也可以位于第297位的上游或下游约±3个氨基酸，即介于位置294和300之间。类似地，测定两分型，或两分型非岩藻糖基化的寡糖的百分比。
免疫缀合物Fc域中的糖基化修饰可能起因于宿主细胞中免疫缀合物的生成，该宿主细胞已***作为表达改变的一种或多种具有糖基转移酶活性的多肽水平。
在一个实施方案中，将免疫缀合物的Fc域工程化改造为相比于非工程化Fc域具有改变的寡糖结构，其通过在具有改变的一种或多种糖基转移酶活性的宿主细胞中生成该免疫缀合物进行。糖基转移酶包括例如β(1,4)-N-乙酰葡糖胺基转移酶III(GnTIII),β(1,4)-半乳糖基转移酶(GalT)、β(1,2)-N-乙酰葡糖胺基转移酶I(GnTI)、β(1,2)-N-乙酰葡糖胺基转移酶II(GnTII)和α(1,6)-岩藻糖基转移酶。在一个具体的实施方案中，免疫缀合物的Fc域工程化改造为相比于非工程化的Fc域包含增加的非岩藻糖基化寡糖比例，其通过在具有增加的β(1,4)-N-乙酰葡糖胺基转移酶III(GnTIII)活性的宿主细胞中生成该免疫缀合物进行。在一个甚至更具体的实施方案中，宿主细胞另外具有增加的α-甘露糖苷酶II(ManII)活性。可用于糖工程化改造本发明的免疫缀合物的糖工程化方法学已详细记载于Umana等,Nat Biotechnol17,176-180(1999);Ferrara等,Biotechn Bioeng93,851-861(2006);WO99/54342(美国专利No.6,602,684;EP1071700);WO2004/065540(美国专利申请公开文本No.2004/0241817;EP1587921),WO03/011878(美国专利申请公开文本No.2003/0175884)，其中每篇的内容通过提述完整并入本文。
一般地，可以使用任意类型的培养的细胞系(包括在本文中论述的细胞系)来生成用于生产具有改变的糖基化模式的免疫缀合物的细胞系。具体的细胞系包括CHO细胞、BHK细胞、NS0细胞、SP2/0细胞、YO骨髓瘤细胞、P3X63小鼠骨髓瘤细胞、PER细胞、PER.C6细胞、或杂交瘤细胞和其它哺乳动物细胞。在某些实施方案中，宿主细胞已操作为表达升高水平的一种或多种具有β(1,4)-N-乙酰葡糖胺基转移酶III(GnTIII)活性的多肽。在某些实施方案中，宿主细胞还已操作为表达升高水平的一种或多种具有α-甘露糖苷酶II(ManII)活性的多肽。在一个具体的实施方案中，具有GnTIII活性的多肽是融合多肽，其包含GnTIII的催化域和异源高尔基驻留多肽的高尔基定位域。具体地，所述高尔基定位域是甘露糖苷酶II的高尔基定位域。用于生成这类融合多肽以及使用它们来生成具有增加的效应器功能的抗体的方法公开在Ferrara等,Biotechn Bioeng93,851-861(2006)和WO2004/065540中，其完整内容通过提述明确并入本文。
可以鉴定含有本发明的免疫缀合物的编码序列和/或具有糖基转移酶活性的多肽的编码序列，并且表达生物学活性基因产物的宿主细胞，例如通过DNA-DNA或DNA-RNA杂交，存在或缺乏“标志物”基因功能，评估转录水平(如通过宿主细胞中相应mRNA转录本的表达测量的)或检测基因产物(如通过免疫测定法或通过其生物学活性测量的)进行，这些方法是本领域中公知的。可以例如通过采用分别结合GnTIII或ManII的生物合成产物的凝集素来检测GnTIII或Man II活性。这类凝集素的一个例子是E4-PHA凝集素，其优先结合含有两分型GlcNAc的寡糖。还可以检测具有GnTIII或ManII活性的多肽的生物合成产物(即特定的寡糖结构)，其通过对从由表达所述多肽的细胞生成的糖蛋白释放的寡糖的质谱分析进行。或者，可以使用测量由免疫缀合物介导的增加的效应器功能和/或增加的Fc受体结合的功能测定法，所述免疫缀合物是由工程化为具有有GnTIII或ManII活性的多肽的细胞生成。
在另一个实施方案中，将Fc域工程化改造为相比于非工程化的Fc域包含增加的非岩藻糖基化寡糖比例，其通过在具有降低的α(1,6)-岩藻糖基转移酶活性的宿主细胞中生成该免疫缀合物进行。具有降低的α(1,6)-岩藻糖基转移酶活性的宿主细胞可以是其中α(1,6)-岩藻糖基转移酶基因已被破坏或以其它方式失活(例如敲除)的细胞(参见Yamane-Ohnuki等,Biotech Bioeng87,614(2004);Kanda等,Biotechnol Bioeng,94(4),680-688(2006);Niwa等,J Immunol Methods306,151-160(2006))。
能够生成去岩藻糖基化免疫缀合物的细胞系的其它例子包括在蛋白质岩藻糖基化中缺陷性的Lec13CHO细胞(Ripka等,Arch Biochem Biophys249,533-545(1986);美国专利申请No.US2003/0157108;和WO2004/056312，尤其在实施例11)。或者，可以将本发明的免疫缀合物糖工程化改造为在Fc域中有减少的岩藻糖残基，其依照在EP1176195A1、WO03/084570、WO03/085119和美国专利申请公开No.2003/0115614、2004/093621、2004/110282、2004/110704、2004/132140、美国专利No.6,946,292(Kyowa)中公开的技术，例如通过减小或消除用于免疫缀合物生成的宿主细胞中GDP-岩藻糖运输蛋白的活性进行。
本发明的糖工程化的免疫缀合物还可以在生成经修饰的糖蛋白的表达***中生成，如在WO03/056914(GlycoFi,Inc.)或WO2004/057002和WO2004/024927(Greenovation)中教导的那些***。
在一个实施方案中，将免疫缀合物的Fc域工程化改造为相比于非工程化的Fc域具有增加的效应器功能。增加的效应器功能可以包括但不限于下列一种或多种：增加的补体依赖性细胞毒性(CDC)、增加的抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)、增加的抗体依赖性细胞吞噬作用(ADCP)、增加的细胞因子分泌、增加的免疫复合物介导的抗原呈递细胞的抗原摄取、增加的对NK细胞的结合、增加的对巨噬细胞的结合、增加的对单核细胞的结合、增加的对多形核细胞的结合、增加的诱导凋亡的直接信号传导、增加的靶物结合的抗体的交联、增加的树突细胞成熟或增加的T细胞启动。
在一个实施方案中，增加的效应器功能选自下组一种或多种：增加的CDC、增加的ADCC、增加的ADCP和增加的细胞因子分泌。在一个具体的实施方案中，增加的效应器功能是增加的ADCC。在一个实施方案中，由工程化Fc域(或包含工程化Fc域的免疫缀合物)诱导的ADCC相比于由非工程化Fc域(或包含非工程化Fc域的免疫缀合物)诱导的ADCC增加至少2倍。
效应器模块
用于本发明的效应器模块一般是例如经由信号转导途径影响细胞活性的多肽。因此，可用于本发明的免疫缀合物的效应器模块可以与从细胞膜外传递信号以调控细胞内应答的受体介导的信号传导联合。例如，免疫缀合物的效应器模块可以是细胞因子。在具体的实施方案中，效应器模块是人的。
在某些实施方案中，所述效应器模块是单链效应器模块。在一个具体的实施方案中，所述效应器模块是细胞因子。可用细胞因子的例子包括但不限于，GM-CSF、IL-1α、IL-1β、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-10、IL-12、IL-21、IFN-α、IFN-β、IFN-γ、MIP-1α、MIP-1β、TGF-β、TNF-α和TNF-β。在一个实施方案中，免疫缀合物的效应器模块是选自下组的细胞因子：GM-CSF、IL-2、IL-7、IL-8、IL-10、IL-12、IL-15、IL-21、IFN-α、IFN-γ、MIP-1α、MIP-1β和TGF-β。在一个实施方案中，免疫缀合物的效应器模块是选自下组的细胞因子：IL-2、IL-7、IL-10、IL-12、IL-15、IFN-α和IFN-γ。在某些实施方案中，将细胞因子效应器模块突变为除去N-和/或O-糖基化位点。糖基化的消除增加可在重组生产中获得的产物的同质性。
在一个具体的实施方案中，免疫缀合物的效应器模块是IL-2。在一个具体的实施方案中，IL-2效应器模块能引发一种或多种选自下组的细胞应答：激活的细胞T淋巴细胞的增殖、激活的细胞T淋巴细胞的分化、细胞毒性T细胞(CTL)活性、激活的B细胞的增殖、激活的B细胞的分化、天然杀伤(NK)细胞的增殖、NK细胞的分化、激活的T细胞或NK细胞的细胞因子分泌、和NK/淋巴细胞激活的杀伤细胞(LAK)抗肿瘤细胞毒性。在另一个具体的实施方案中，IL-2效应器模块是突变体IL-2效应器模块，其具有降低的对IL-2受体α亚基的结合亲和力。α亚基(也称为CD25)与β和γ亚基(也分别称为CD122和CD132)一起形成异二聚体高亲合力IL-2受体，而仅由β-和γ亚基组成的二聚体受体称为中等亲合力IL-2受体。如记载于PCT专利申请号PCT/EP2012/051991(通过提述完整并入本文)的，与野生型IL-2多肽相比，具有降低的对IL-2受体α亚基结合的突变体IL-2多肽具有降低的诱导调节性T细胞中IL-2信号传导的能力，诱导T细胞中更少的激活诱导的细胞死亡(AICD)，且具有降低的体内毒性概况。在依照本发明的免疫缀合物中使用具有降低毒性的这类效应器模块特别有利，其由于存在Fc域具有较长的血清半衰期。在一个实施方案中，相比于非突变的IL-2效应器模块，依照本发明的免疫缀合物的突变体IL-2效应器模块包含至少一个氨基酸突变，该氨基酸突变降低或消除突变体IL-2效应器模块对IL-2受体(CD25)的α亚基的亲和力但保留该突变体IL-2效应器模块对中亲和力IL-2受体(由IL-2受体的β和γ亚基组成)的亲和力。在一个实施方案中，所述一个或多个氨基酸突变是氨基酸取代。在一个具体的实施方案中，突变体IL-2效应器模块包含在选自对应于人IL-2残基42、45和72的位置的一个、两个或三个位置处的一个、两个或三个氨基酸取代。在一个更具体的实施方案中，突变体IL-2效应器模块包含在对应于人IL-2残基42、45和72的位置处的三个氨基酸取代。在一个甚至更具体的实施方案中，突变体IL-2效应器模块是包含氨基酸取代F42A、Y45A和L72G的人IL-2。在一个实施方案中，突变体IL-2效应器模块另外在对应于人IL-2第3位的位置处包含氨基酸突变，其消除IL-2的O-糖基化位点。具体地，所述另外的氨基酸突变是由丙氨酸残基替换苏氨酸残基的氨基酸取代。可用于本发明的具体的突变体IL-2效应器模块包含在对应于人IL-2残基3、42、45和72的位置处的四个氨基酸取代。特定的氨基酸取代为T3A、F42A、Y45A和L72G。如PCT专利申请号PCT/EP2012/051991和所附实施例中显示的，所述四重突变体IL-2多肽(IL-2qm)展现出没有对CD25的可检测的结合、降低的诱导T细胞中凋亡的能力、降低的诱导T调节细胞中IL-2信号传导的能力、和降低的体内毒性概况。然而，其保留激活效应细胞中IL-2信号传导、诱导效应细胞的增殖和通过NK细胞生成IFN-γ作为次生细胞因子的能力。
依照上文任一个实施方案的IL-2或突变体IL-2效应器模块可包含另外的突变，其提供别的优点如增加的表达或稳定性。例如，位置125处的半胱氨酸可用中性氨基酸如丙氨酸替换以避免形成二硫化物桥接的IL-2二聚体。如此，在某些实施方案中，依照本发明的免疫缀合物的IL-2或突变体IL-2效应器模块在与人IL-2的残基125对应的位置处包含另外的氨基酸突变。在一个实施方案中，所述另外的氨基酸突变是氨基酸取代C125A。
在一个具体的实施方案中，免疫缀合物的IL-2效应器模块包含SEQ ID NO:2的多肽序列。在另一个具体的实施方案中，免疫缀合物的IL-2效应器模块包含SEQ ID NO:3的多肽序列。
在另一个实施方案中，免疫缀合物的IL-2效应器模块是IL-12。在一个具体的实施方案中，所述IL-12效应器模块是单链IL-12效应器模块。在一个甚至更具体的实施方案中，所述单链IL-12效应器模块包含SEQ ID NO:4的多肽序列。在一个实施方案中，IL-12效应器模块能引发一种或多种选自下组的细胞应答：NK细胞的增殖、NK细胞的分化、T细胞的增殖和T细胞的分化。
在另一个实施方案中，免疫缀合物的效应器模块是IL-10。在一个具体的实施方案中，所述IL-10效应器模块是单链IL-10效应器模块。在一个甚至更具体的实施方案中，所述单链IL-10效应器模块包含SEQ ID NO:5的多肽序列。在另一个具体的实施方案中，IL-10效应器模块是单体IL-10效应器模块。在一个更具体的实施方案中，单体IL-10效应器模块包含SEQ ID NO:6的多肽序列。在一个实施方案中，IL-10效应器模块能引发一种或多种选自下组的细胞应答：抑制细胞因子分泌、抑制抗原呈递细胞的抗原呈递、减少氧自由基释放和抑制T细胞增殖。其中的效应器模块是IL-10的依照本发明的免疫缀合物对于下调炎症特别有用，例如在治疗炎性病症中。
在另一个实施方案中，免疫缀合物的效应器模块是IL-15。在一个具体的实施方案中，所述IL-15效应器模块是突变体IL-15效应器模块，其具有降低的对IL-15受体α亚基的结合亲和力。不希望受理论束缚，相比于野生型IL-15多肽，具有降低的对IL-15受体α亚基的结合的突变体IL-15多肽具有降低的结合遍及身体的成纤维细胞的能力，产生改进的药动学和毒性概况。使用具有降低的毒性的效应器模块，如描述的突变体IL-2和突变体IL-15效应器模块，在依照本发明的免疫缀合物中特别有利，其由于存在Fc域而具有较长的血清半衰期。在一个实施方案中，相比于非突变的IL-15效应器模块，依照本发明的免疫缀合物的突变体IL-15效应器模块包含至少一个氨基酸突变，该氨基酸突变降低或消除突变体IL-15效应器模块对IL-15受体α亚基的亲和力但保留该突变体IL-15效应器模块对中亲和力IL-15/IL-2受体(由IL-15/IL-2受体的β和γ亚基组成)的亲和力。在一个实施方案中，所述氨基酸突变是氨基酸取代。在一个具体的实施方案中，突变体IL-15效应器模块包含在对应于人IL-15残基53的位置处的氨基酸取代。在一个更具体的实施方案中，突变体IL-15效应器模块是包含氨基酸取代E53A的人IL-15。在一个实施方案中，突变体IL-15效应器模块另外包含在对应于人IL-15第79位的位置处的氨基酸突变，其消除IL-15的N-糖基化位点。具体地，所述另外的氨基酸突变是由丙氨酸残基替换天冬酰胺残基的氨基酸取代。在一个甚至更具体的实施方案中，IL-15效应器模块包含SEQ ID NO:7的多肽序列。在一个实施方案中，IL-15效应器模块能引发一种或多种选自下组的细胞应答：激活的细胞T淋巴细胞的增殖、激活的细胞T淋巴细胞的分化、细胞毒性T细胞(CTL)活性、激活的B细胞的增殖、激活的B细胞的分化、天然杀伤(NK)细胞的增殖、NK细胞的分化、通过激活的T细胞或NK细胞的细胞因子分泌、和NK/淋巴细胞激活的杀伤细胞(LAK)抗肿瘤细胞毒性。
可以使用本领域中公知的遗传或化学方法通过缺失、取代、***或修饰来制备可用作免疫缀合物中效应器模块的突变体细胞因子分子。遗传方法可以包括编码DNA序列的定点诱变、PCR、基因合成等。正确的核苷酸变化能通过例如测序来验证。取代或缺失可牵涉天然以及非天然的氨基酸残基。氨基酸修饰包括公知的化学修饰方法，如添加或除去糖基化位点或碳水化合物附接等。
在一个实施方案中，免疫缀合物的效应器模块，特别是单链效应器模块，是GM-CSF。在一个具体的实施方案中，GM-CSF效应器模块能引发粒细胞、单核细胞或树突细胞的增殖和/或分化。在一个实施方案中，免疫缀合物的效应器模块，特别是单链效应器模块是IFN-α。在一个具体的实施方案中，IFN-α效应器模块能引发一种或多种选自下组的细胞应答：抑制受病毒感染的细胞中的病毒复制和上调主要组织相容性复合物I(MHC I)的表达。在另一个具体的实施方案中，IFN-α效应器模块能抑制肿瘤细胞中的增殖。在一个实施方案中，免疫缀合物的效应器模块，特别是单链效应器模块是IL-γ。在一个具体的实施方案中，IL-γ效应器模块能引发一种或多种选自下组的细胞应答：增加的巨噬细胞活性、增加的MHC分子的表达和增加的NK细胞活性。在一个实施方案中，免疫缀合物的效应器模块，特别是单链效应器模块是IL-7。在一个具体的实施方案中，IL-7效应器模块能引发T和/或B淋巴细胞的增殖。在一个实施方案中，免疫缀合物的效应器模块，特别是单链效应器模块是IL-8。在一个具体的实施方案中，IL-8效应器模块能引发嗜中性粒细胞的趋化性。在一个实施方案中，免疫缀合物的效应器模块，特别是单链效应器模块是MIP-1α。在一个具体的实施方案中，MIP-1α效应器模块能引发单核细胞和T淋巴细胞的趋化性。在一个实施方案中，免疫缀合物的效应器模块，特别是单链效应器模块是MIP-1β。在一个具体的实施方案中，MIP-1β效应器模块能引发单核细胞和T淋巴细胞的趋化性。在一个实施方案中，免疫缀合物的效应器模块，特别是单链效应器模块是TGF-β。在一个具体的实施方案中，TGF-β效应器模块能引发一种或多种选自下组的细胞应答：单核细胞的趋化性、巨噬细胞的趋化性、激活的巨噬细胞中IL-1表达的上调以及激活的B细胞中IgA表达的上调。
在一个实施方案中，本发明的免疫缀合物以比对照效应器模块大至少约1、1.5、2、2.5、3、3.5、4、4.5、5、5.5、6、6.5、7、7.5、8、8.5、9、9.5或10倍的解离常数(KD)结合效应器模块受体。在另一个实施方案中，所述免疫缀合物以比相应的包含两个或更多个效应器模块的免疫缀合物分子大至少2、3、4、5、6、7、8、9或10倍的KD结合效应器模块受体。在另一个实施方案中，所述免疫缀合物以比相应的包含两个或更多个效应器模块的免疫缀合物分子大大约10倍的解离常数KD结合效应器模块受体。
抗原结合模块
本发明的免疫缀合物包含至少一个抗原结合模块。在具体的实施方案中，所述免疫缀合物包含两个抗原结合模块，即第一和第二抗原结合模块。在一个实施方案中，所述免疫缀合物包含不超过两个抗原结合模块。
本发明的免疫缀合物的抗原结合模块一般是结合特定抗原决定簇并能指导其所附接的实体(例如效应器模块和Fc域)到达靶部位，例如到达携带该抗原决定簇的特定类型的肿瘤细胞或肿瘤基质的多肽分子。免疫缀合物能结合见于例如肿瘤细胞表面上、病毒感染的细胞表面上、其它患病细胞的表面上、游离于血液血清中和/或胞外基质(ECM)中的抗原决定簇。
在某些实施方案中，所述抗原结合模块针对与病理学状况有关的抗原，如呈现于肿瘤细胞或在肿瘤细胞环境中、在炎症部位、或在病毒感染的细胞上的抗原。
肿瘤抗原的非限制性例子包括MAGE、MART-1/Melan-A、gp100、二肽基肽酶IV(DPPIV)、腺苷脱氨酶结合蛋白(ADAbp)、亲环蛋白(cyclophilin)b、结肠直肠有关的抗原(CRC)-C017-1A/GA733、癌胚抗原(CEA)及其免疫原性表位CAP-1和CAP-2、etv6、aml1、***特异性抗原(PSA)及其免疫原性表位PSA-1、PSA-2和PSA-3、***特异性膜抗原(PSMA)、MAGE肿瘤抗原家族(例如MAGE-A1、MAGE-A2、MAGE-A3、MAGE-A4、MAGE-A5、MAGE-A6、MAGE-A7、MAGE-A8、MAGE-A9、MAGE-A10、MAGE-A11、MAGE-A12、MAGE-Xp2(MAGE-B2)、MAGE-Xp3(MAGE-B3)、MAGE-Xp4(MAGE-B4)、MAGE-C1、MAGE-C2、MAGE-C3、MAGE-C4、MAGE-C5)、GAGE肿瘤抗原家族(例如GAGE-1、GAGE-2、GAGE-3、GAGE-4、GAGE-5、GAGE-6、GAGE-7、GAGE-8、GAGE-9)、BAGE、RAGE、LAGE-1、NAG、GnT-V、MUM-1、CDK4、酪氨酸酶、p53、MUC家族、HER2/neu、p21ras、RCAS1、α-胎蛋白、E-钙粘蛋白、α-连环蛋白(catenin)、β-连环蛋白和γ-连环蛋白、p120ctn、gp100Pmel117、PRAME、NY-ESO-1、cdc27、腺瘤样结肠息肉蛋白(adenomatous polyposiscoli protein，APC)、胞衬蛋白(fodrin)、连接蛋白(Connexin)37、Ig独特型、p15、gp75、GM2和GD2神经节苷脂、病毒产物如人***状瘤病毒蛋白、Smad肿瘤抗原家族、lmp-1、P1A、EBV编码的核抗原(EBNA)-1、脑糖原磷酸化酶、SSX-1、SSX-2(HOM-MEL-40)、SSX-1、SSX-4、SSX-5、SCP-1和CT-7、以及c-erbB-2。
病毒抗原的非限制性例子包括流感病毒血凝素、埃巴病毒LMP-1、丙肝病毒E2糖蛋白、HIV gp160和HIV gp120。
ECM抗原的非限制性例子包括多配体聚糖(syndecan)、类肝素酶(heparanase)、整联蛋白、骨桥蛋白(osteopontin)、link、钙粘蛋白、层粘连蛋白、EGF型层粘连蛋白、凝集素、纤连蛋白、notch、生腱蛋白和matrixin。
本发明的免疫缀合物能结合细胞表面抗原的下列特定的非限制性例子：FAP、Her2、EGFR、IGF-1R、CD22(B细胞受体)、CD23(低亲和力IgE受体)、CD30(细胞因子受体)、CD33(髓样细胞表面抗原)、CD40(肿瘤坏死因子受体)、IL-6R(IL6受体)、CD20、MCSP、和PDGFβR(β血小板衍生的生长因子受体)。在具体的实施方案中，抗原是人抗原。
在某些实施方案中，所述抗原结合模块针对肿瘤细胞上或肿瘤细胞环境中呈现的抗原。在其它实施方案中，所述抗原结合模块针对炎症部位呈现的抗原。在一个具体的实施方案中，抗原结合模块针对选自下组的抗原：成纤维细胞活化蛋白(FAP)、生腱蛋白C的A1域(TNC A1)、生腱蛋白C的A2域(TNC A2)、纤连蛋白的外域B(EDB)、癌胚抗原(CEA)和黑素瘤有关的硫酸软骨素蛋白聚糖(MCSP)。
在一个实施方案中，本发明的免疫缀合物包含两个或更多个抗原结合模块，其中这些抗原结合模块的每一个特异性结合同一抗原决定簇。
所述抗原结合模块可以是保留对抗原决定簇的特异性结合的任何类型的抗体或其片段。抗体片段包括但不限于VH片段、VL片段、Fab片段、F(ab’)2片段、scFv片段、Fv片段、微型抗体、双抗体、三抗体和四抗体(参见例如Hudson和Souriau,Nature Med9,129-134(2003))。在一个具体的实施方案中，所述抗原结合模块是Fab分子。在一个实施方案中，所述Fab分子是人的。在另一个实施方案中，所述Fab分子是人源化的。在再一个实施方案中，所述Fab分子包含人重链和轻链恒定区。
在一个实施方案中，免疫缀合物包含至少一个，通常两个或更多个对纤连蛋白的外域B(EDB)特异性抗原结合模块。在另一个实施方案中，免疫缀合物包含至少一个，通常两个或更多个能与单克隆抗体L19竞争对EDB表位的结合的抗原结合模块。参见例如PCT公开文本WO2007/128563A1(通过提述完整并入本文)。
在又一个实施方案中，免疫缀合物包含一种多肽序列，其中自L19单克隆抗体衍生的Fab重链与包含突出修饰的Fc域亚基共享羧基端肽键，所述包含突出修饰的Fc域亚基继而与IL-2多肽共享羧基端肽键。在一个更具体的实施方案中，所述免疫缀合物包含SEQ IDNO:215的多肽序列或其保留有功能性的变体。在一个实施方案中，免疫缀合物包含一种多肽序列，其中自L19单克隆抗体衍生的Fab重链与包含孔修饰的Fc域亚基共享羧基端肽键。在一个更具体的实施方案中，所述免疫缀合物包含SEQ ID NO:213的多肽序列或其保留有功能性的变体。在另一个实施方案中，所述免疫缀合物包含自L19单克隆抗体衍生的Fab轻链。在一个更具体的实施方案中，免疫缀合物包含SEQ ID NO:217的多肽序列或其保留有功能性的变体。在又一个实施方案，所述免疫缀合物SEQ ID NO:213,SEQ ID NO:215和SEQ IDNO:217的多肽序列或其保留有功能性的变体。在另一个具体的实施方案中，所述多肽例如通过二硫键共价连接。在一些实施方案中，Fc域亚基各自包含氨基酸取代L234A、L235A和P329G。
在一个具体的实施方案中，免疫缀合物包含由与SEQ ID NO:216的序列至少约80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、或99%相同的多核苷酸序列编码的多肽序列。在另一个具体的实施方案中，免疫缀合物包含由SEQ ID NO:216的多核苷酸序列编码的多肽序列。在另一个具体的实施方案中，免疫缀合物包含由与SEQ ID NO:214的序列至少约80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、或99%相同的多核苷酸序列编码的多肽序列。在又一个具体的实施方案中，免疫缀合物包含由SEQ ID NO:214的多核苷酸序列编码的多肽序列。在另一个具体的实施方案中，免疫缀合物包含由与SEQ ID NO:218的序列至少约80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、或99%相同的多核苷酸序列编码的多肽序列。在再一个具体的实施方案中，免疫缀合物包含由SEQ ID NO:218的多核苷酸序列编码的多肽序列。
在一个实施方案中，本发明的免疫缀合物包含至少一个，通常两个或更多个对生腱蛋白C的A1域(TNC-A1)特异性的抗原结合模块。在另一个实施方案中，免疫缀合物包含至少一个，通常两个或更多个能与单克隆抗体F16竞争对TNC-A1表位的结合的抗原结合模块。参见例如PCT公开文本WO2007/128563A1(通过提述完整并入本文)。在一个实施方案中，免疫缀合物包含至少一个，通常两个或更多个对生腱蛋白C的A1和/或A4域(TNC-A1或TNC-A4或TNC-A1/A4)特异性的抗原结合模块。
在一个具体的实施方案中，免疫缀合物的抗原结合模块包含与SEQ ID NO:33或SEQ ID NO:35至少约80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%相同的重链可变区序列或其保留功能性的变体。在另一个具体的实施方案中，免疫缀合物的抗原结合模块包含与SEQID NO:29或SEQ ID NO:31至少约80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%相同的轻链可变区序列或其保留功能性的变体。在一个更具体的实施方案中，免疫缀合物的抗原结合模块包含与SEQ ID NO:33或SEQ ID NO:35至少约80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%相同的重链可变区序列或其保留功能性的变体，以及与SEQ ID NO:29或SEQ ID NO:31至少约80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%相同的轻链可变区序列或其保留功能性的变体。
在另一个具体的实施方案中，免疫缀合物的抗原结合模块的重链可变区序列由一种多核苷酸序列编码，所述多核苷酸序列与SEQ ID NO:34或SEQ ID NO:36至少约80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%相同。在再一个具体的实施方案中，免疫缀合物的抗原结合模块的重链可变区序列由SEQ ID NO:34或SEQ ID NO:36的多核苷酸序列编码。在另一个具体的实施方案中，免疫缀合物的抗原结合模块的轻链可变区序列由一种多核苷酸序列编码，所述多核苷酸序列与SEQ ID NO:30或SEQ ID NO:32至少约80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%相同。在再一个具体的实施方案中，免疫缀合物的抗原结合模块的轻链可变区序列由SEQ ID NO:30或SEQ ID NO:32的多核苷酸序列编码。
在一个实施方案中，免疫缀合物包含一种多肽序列，其中特异于生腱蛋白C的A1域的Fab重链与包含突出修饰的Fc域亚基共享羧基端肽键，所述包含突出修饰的Fc域亚基继而与IL-2多肽共享羧基端肽键。在另一个实施方案中，免疫缀合物包含一种多肽序列，其中特异于生腱蛋白C的A1域的Fab重链与包含孔修饰的Fc域亚基共享羧基端肽键。在一个更具体的实施方案中，免疫缀合物包含这两种多肽序列。在另一个实施方案中，免疫缀合物还包含特异于生腱蛋白C的A1域的Fab轻链。在另一个具体的实施方案中，多肽例如通过二硫键共价连接。在一些实施方案中，Fc域亚基各自包含氨基酸取代L234A、L235A和P329G。
在一个具体的实施方案中，免疫缀合物包含至少一个，通常两个或更多个对生腱蛋白C的A2域(TNC-A2)特异性的抗原结合模块。在一个具体的实施方案中，免疫缀合物的抗原结合模块包含与选自SEQ ID NO:27,SEQ ID NO:159,SEQ ID NO:163,SEQ ID NO:167,SEQ ID NO:171,SEQ ID NO:175,SEQ ID NO:179,SEQ ID NO:183和SEQ ID NO:187的组的序列至少约80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%相同的重链可变区序列或其保留功能性的变体。在另一个具体的实施方案中，免疫缀合物的抗原结合模块包含与选自SEQ IDNO:23,SEQ ID NO:25;SEQ ID NO:157,SEQ ID NO:161,SEQ ID NO:165,SEQ ID NO:169,SEQ ID NO:173,SEQ ID NO:177,SEQ ID NO:181和SEQ ID NO:185的组的序列至少约80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%相同的轻链可变区序列或其保留功能性的变体。在一个更具体的实施方案中，免疫缀合物的抗原结合模块包含与选自SEQ ID NO:27,SEQ IDNO:159,SEQ ID NO:163,SEQ ID NO:167,SEQ ID NO:171,SEQ ID NO:175,SEQ ID NO:179,SEQ ID NO:183和SEQ ID NO:187的组的序列至少约80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%相同的重链可变区序列或其保留功能性的变体，以及与选自SEQ ID NO:23,SEQ IDNO:25;SEQ ID NO:157,SEQ ID NO:161,SEQ ID NO:165,SEQ ID NO:169,SEQ ID NO:173,SEQ ID NO:177,SEQ ID NO:181和SEQ ID NO:185的组的序列至少约80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%相同的轻链可变区序列或其保留功能性的变体。在一个具体的实施方案中，免疫缀合物的抗原结合模块包含SEQ ID NO:27的重链可变区序列和SEQ ID NO:25的轻链可变区序列。
在另一个具体的实施方案中，免疫缀合物的抗原结合模块的重链可变区序列由一种多核苷酸序列编码，所述多核苷酸序列与选自SEQ ID NO:28,SEQ ID NO:160,SEQ IDNO:164,SEQ ID NO:168,SEQ ID NO:172,SEQ ID NO:176,SEQ ID NO:180,SEQ ID NO:184和SEQ ID NO:188的组的序列至少约80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%相同。在再一个具体的实施方案中，免疫缀合物的抗原结合模块的重链可变区序列由选自SEQ ID NO:28,SEQ ID NO:160,SEQ ID NO:164,SEQ ID NO:168,SEQ ID NO:172,SEQ ID NO:176,SEQ IDNO:180,SEQ ID NO:184和SEQ ID NO:188的组的多核苷酸序列编码。在另一个具体的实施方案中，免疫缀合物的抗原结合模块的轻链可变区序列由一种多核苷酸序列编码，所述多核苷酸序列与选自SEQ ID NO:24,SEQ ID NO:26,SEQ ID NO:158,SEQ ID NO:162,SEQ IDNO:166,SEQ ID NO:170,SEQ ID NO:174,SEQ ID NO:178,SEQ ID NO:182和SEQ ID NO:186的组的序列至少约80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%相同。在再一个具体的实施方案中，免疫缀合物的抗原结合模块的轻链可变区序列由选自SEQ ID NO:24,SEQ ID NO:26,SEQ ID NO:158,SEQ ID NO:162,SEQ ID NO:166,SEQ ID NO:170,SEQ ID NO:174,SEQ IDNO:178,SEQ ID NO:182和SEQ ID NO:186的组的多核苷酸序列编码。
在又一个实施方案中，免疫缀合物包含一种多肽序列，其中特异于生腱蛋白C的A2域的Fab重链与包含孔修饰的Fc域亚基共享羧基端肽键，所述包含孔修饰的Fc域亚基继而与IL-10多肽共享羧基端肽键。在一个更具体的实施方案中，免疫缀合物包含SEQ ID NO:235或SEQ ID NO:237的多肽序列，或其保留功能性的变体。在一个实施方案中，免疫缀合物包含一种多肽序列，其中特异于生腱蛋白C的A2域的Fab重链与包含突出修饰的Fc域亚基共享羧基端肽键。在一个更具体的实施方案中，免疫缀合物包含SEQ ID NO:233的多肽序列，或其保留功能性的变体。在另一个实施方案中，免疫缀合物包含特异于生腱蛋白C的A2域的Fab轻链。在一个更具体的实施方案中，免疫缀合物包含SEQ ID NO:239的多肽序列，或其保留功能性的变体。在另一个实施方案中，免疫缀合物包含SEQ ID NO:233、SEQ ID NO:235和SEQ ID NO:239的多肽序列，或其保留功能性的变体。在又一个实施方案中，免疫缀合物包含SEQ ID NO:233、SEQ ID NO:237和SEQ ID NO:239的多肽序列，或其保留功能性的变体。在另一个具体的实施方案中，所述多肽例如通过二硫键共价连接。在一些实施方案中，Fc域亚基各自包含氨基酸取代L234A、L235A和P329G。
在一个具体的实施方案中，免疫缀合物包含由一种多核苷酸序列编码的多肽序列，所述多核苷酸序列与SEQ ID NO:236或SEQ ID NO:238的序列至少约80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%相同。在另一个具体的实施方案中，免疫缀合物包含由SEQ ID NO:236或SEQ ID NO:238的多核苷酸序列编码的多肽序列。在另一个具体的实施方案中，免疫缀合物包含由一种多核苷酸序列编码的多肽序列，所述多核苷酸序列与SEQ ID NO:234的序列至少约80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%相同。在又一个具体的实施方案中，免疫缀合物包含由SEQ ID NO:234的多核苷酸序列编码的多肽序列。在另一个具体的实施方案中，免疫缀合物包含由一种多核苷酸序列编码的多肽序列，所述多核苷酸序列与SEQ ID NO:240的序列至少约80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%相同。在又一个具体的实施方案中，免疫缀合物包含由SEQ ID NO:240的多核苷酸序列编码的多肽序列。
在又一个实施方案中，免疫缀合物包含一种多肽序列，其中特异于生腱蛋白C的A2域的Fab重链与包含突出修饰的Fc域亚基共享羧基端肽键，所述包含突出修饰的Fc域亚基继而与IL-2多肽共享羧基端肽键。在一个更具体的实施方案中，免疫缀合物包含SEQ IDNO:285的多肽序列，或其保留功能性的变体。在一个实施方案中，免疫缀合物包含一种多肽序列，其中特异于生腱蛋白C的A2域的Fab重链与包含孔修饰的Fc域亚基共享羧基端肽键。在一个更具体的实施方案中，免疫缀合物包含SEQ ID NO:287的多肽序列，或其保留功能性的变体。在另一个实施方案中，免疫缀合物包含特异于生腱蛋白C的A2域的Fab轻链。在一个更具体的实施方案中，免疫缀合物包含SEQ ID NO:239的多肽序列，或其保留有功能性的变体。在另一个实施方案中，免疫缀合物包含SEQ ID NO:285,SEQ ID NO:287和SEQ ID NO:239的多肽序列，或其保留功能性的变体。在另一个具体的实施方案中，所述多肽例如通过二硫键共价连接。在一些实施方案中，Fc域亚基各自包含氨基酸取代L234A、L235A和P329G。
在一个具体的实施方案中，免疫缀合物包含由一种多核苷酸序列编码的多肽序列，所述多核苷酸序列与SEQ ID NO:286的序列至少约80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%相同。在另一个具体的实施方案中，免疫缀合物包含由SEQ ID NO:286的多核苷酸序列编码的多肽序列。在另一个具体的实施方案中，免疫缀合物包含由一种多核苷酸序列编码的多肽序列，所述多核苷酸序列与SEQ ID NO:288的序列至少约80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%相同。在再一个具体的实施方案中，免疫缀合物包含由SEQ ID NO:288的多核苷酸序列编码的多肽序列。在另一个具体的实施方案中，所述免疫缀合物包含由一种多核苷酸序列编码的多肽序列，所述多核苷酸序列与SEQ ID NO:240的序列至少约80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%相同。在又一个具体的实施方案中，免疫缀合物包含由SEQ IDNO:240的多核苷酸序列编码的多肽序列。
在一个具体的实施方案中，所述免疫缀合物包含至少一个，通常两个或更多个对成纤维细胞激活蛋白(FAP)特异性的抗原结合模块。在一个具体的实施方案中，所述免疫缀合物的抗原结合模块包含与选自下组的序列至少约80%,85%,90%,95%,96%,97%,98%,99%或100%相同的重链可变区序列：SEQ ID NO:41,SEQ ID NO:45,SEQ ID NO:47,SEQ ID NO:51,SEQ ID NO:55,SEQ ID NO:59,SEQ ID NO:63,SEQ ID NO:67,SEQ ID NO:71,SEQ ID NO:75,SEQ ID NO:79,SEQ ID NO:83,SEQ ID NO:87,SEQ ID NO:91,SEQ ID NO:95,SEQ IDNO:99,SEQ ID NO:103,SEQ ID NO:107,SEQ ID NO:111,SEQ ID NO:115,SEQ ID NO:119,SEQ ID NO:123,SEQ ID NO:127,SEQ ID NO:131,SEQ ID NO:135,SEQ ID NO:139,SEQ IDNO:143,SEQ ID NO:147,SEQ ID NO:151和SEQ ID NO:155，或其保留功能性的变体。在另一个具体的实施方案中，所述免疫缀合物的抗原结合模块包含与选自下组的序列至少约80%,85%,90%,95%,96%,97%,98%,99%或100%相同的轻链可变区序列：SEQ ID NO:37,SEQ ID NO:39,SEQ ID NO:43,SEQ ID NO:49,SEQ ID NO:53,SEQ ID NO:57,SEQ ID NO:61,SEQ IDNO:65,SEQ ID NO:69,SEQ ID NO:73,SEQ ID NO:77,SEQ ID NO:81,SEQ ID NO:85,SEQ IDNO:89,SEQ ID NO:93,SEQ ID NO:97,SEQ ID NO:101,SEQ ID NO:105,SEQ ID NO:109,SEQID NO:113,SEQ ID NO:117,SEQ ID NO:121,SEQ ID NO:125,SEQ ID NO:129,SEQ ID NO:133,SEQ ID NO:137,SEQ ID NO:141,SEQ ID NO:145,SEQ ID NO:149和SEQ ID NO:153，或其保留功能性的变体。在一个更具体的实施方案中，所述免疫缀合物的抗原结合模块包含与选自下组的序列至少约80%,85%,90%,95%,96%,97%,98%,99%或100%相同的重链可变区序列：SEQ ID NO:41,SEQ ID NO:45,SEQ ID NO:47,SEQ ID NO:51,SEQ ID NO:55,SEQ IDNO:59,SEQ ID NO:63,SEQ ID NO:67,SEQ ID NO:71,SEQ ID NO:75,SEQ ID NO:79,SEQ IDNO:83,SEQ ID NO:87,SEQ ID NO:91,SEQ ID NO:95,SEQ ID NO:99,SEQ ID NO:103,SEQID NO:107,SEQ ID NO:111,SEQ ID NO:115,SEQ ID NO:119,SEQ ID NO:123,SEQ ID NO:127,SEQ ID NO:131,SEQ ID NO:135,SEQ ID NO:139,SEQ ID NO:143,SEQ ID NO:147,SEQID NO:151和SEQ ID NO:155或其保留功能性的变体，以及与选自下组的序列至少约80%,85%,90%,95%,96%,97%,98%,99%或100%相同的轻链可变区序列：SEQ ID NO:37,SEQ ID NO:39,SEQ ID NO:43,SEQ ID NO:49,SEQ ID NO:53,SEQ ID NO:57,SEQ ID NO:61,SEQ IDNO:65,SEQ ID NO:69,SEQ ID NO:73,SEQ ID NO:77,SEQ ID NO:81,SEQ ID NO:85,SEQ IDNO:89,SEQ ID NO:93,SEQ ID NO:97,SEQ ID NO:101,SEQ ID NO:105,SEQ ID NO:109,SEQID NO:113,SEQ ID NO:117,SEQ ID NO:121,SEQ ID NO:125,SEQ ID NO:129,SEQ ID NO:133,SEQ ID NO:137,SEQ ID NO:141,SEQ ID NO:145,SEQ ID NO:149和SEQ ID NO:153或其保留功能性的变体。在一个具体的实施方案中，免疫缀合物的抗原结合模块包含SEQ IDNO:111的重链可变区序列和SEQ ID NO:109的轻链可变区序列。在一个别的具体的实施方案中，免疫缀合物的抗原结合模块包含SEQ ID NO:143的重链可变区序列和SEQ ID NO:141的轻链可变区序列。在又一个具体的实施方案中，免疫缀合物的抗原结合模块包含SEQ IDNO:51的重链可变区序列和SEQ ID NO:49的轻链可变区序列。
在另一个具体的实施方案中，所述免疫缀合物的抗原结合模块的重链可变区序列由一种多核苷酸序列编码，所述多核苷酸序列与选自下组的序列至少约80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%相同：SEQ ID NO:42,SEQ ID NO:46,SEQ ID NO:48,SEQ ID NO:52,SEQID NO:56,SEQ ID NO:60,SEQ ID NO:64,SEQ ID NO:68,SEQ ID NO:72,SEQ ID NO:76,SEQID NO:80,SEQ ID NO:84,SEQ ID NO:88,SEQ ID NO:92,SEQ ID NO:96,SEQ ID NO:100,SEQ ID NO:104,SEQ ID NO:108,SEQ ID NO:112,SEQ ID NO:116,SEQ ID NO:120,SEQ IDNO:124,SEQ ID NO:128,SEQ ID NO:132,SEQ ID NO:136,SEQ ID NO:140,SEQ ID NO:144,SEQ ID NO:148,SEQ ID NO:152和SEQ ID NO:156。在又一个具体的实施方案中，所述免疫缀合物的抗原结合模块的重链可变区序列由选自下组的多核苷酸序列编码：SEQ ID NO:42,SEQ ID NO:46,SEQ ID NO:48,SEQ ID NO:52,SEQ ID NO:56,SEQ ID NO:60,SEQ IDNO:64,SEQ ID NO:68,SEQ ID NO:72,SEQ ID NO:76,SEQ ID NO:80,SEQ ID NO:84,SEQ IDNO:88,SEQ ID NO:92,SEQ ID NO:96,SEQ ID NO:100,SEQ ID NO:104,SEQ ID NO:108,SEQID NO:112,SEQ ID NO:116,SEQ ID NO:120,SEQ ID NO:124,SEQ ID NO:128,SEQ ID NO:132,SEQ ID NO:136,SEQ ID NO:140,SEQ ID NO:144,SEQ ID NO:148,SEQ ID NO:152和SEQ ID NO:156.在另一个具体的实施方案中，所述免疫缀合物的抗原结合模块的轻链可变区序列由一种多核苷酸序列编码，所述多核苷酸序列与选自下组的序列至少约80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%相同：SEQ ID NO:38,SEQ ID NO:40,SEQ ID NO:44,SEQ IDNO:50,SEQ ID NO:54,SEQ ID NO:58,SEQ ID NO:62,SEQ ID NO:66,SEQ ID NO:70,SEQ IDNO:74,SEQ ID NO:78,SEQ ID NO:82,SEQ ID NO:86,SEQ ID NO:90,SEQ ID NO:94,SEQ IDNO:98,SEQ ID NO:102,SEQ ID NO:106,SEQ ID NO:110,SEQ ID NO:114,SEQ ID NO:118,SEQ ID NO:122,SEQ ID NO:126,SEQ ID NO:130,SEQ ID NO:134,SEQ ID NO:138,SEQ IDNO:142,SEQ ID NO:146,SEQ ID NO:150和SEQ ID NO:154。在又一个具体的实施方案中，所述免疫缀合物的抗原结合模块的轻链可变区序列由选自下组的多核苷酸序列编码：SEQ IDNO:38,SEQ ID NO:40,SEQ ID NO:44,SEQ ID NO:50,SEQ ID NO:54,SEQ ID NO:58,SEQ IDNO:62,SEQ ID NO:66,SEQ ID NO:70,SEQ ID NO:74,SEQ ID NO:78,SEQ ID NO:82,SEQ IDNO:86,SEQ ID NO:90,SEQ ID NO:94,SEQ ID NO:98,SEQ ID NO:102,SEQ ID NO:106,SEQID NO:110,SEQ ID NO:114,SEQ ID NO:118,SEQ ID NO:122,SEQ ID NO:126,SEQ ID NO:130,SEQ ID NO:134,SEQ ID NO:138,SEQ ID NO:142,SEQ ID NO:146,SEQ ID NO:150和SEQ ID NO:154。
在一个实施方案中，所述免疫缀合物包含一种多肽序列，其中FAP特异性的Fab重链与包含突出修饰的Fc域亚基共享羧基端肽键，所述突出修饰的Fc域亚基继而与IL-2多肽共享羧基端肽键。在一个更具体的实施方案中，所述免疫缀合物包含选自下组的多肽序列：SEQ ID NO:195,SEQ ID NO:197,SEQ ID NO:203,SEQ ID NO:209,SEQ ID NO:269,SEQ IDNO:271和SEQ ID NO:273或其保留功能性的变体。在一个实施方案中，所述免疫缀合物包含一种多肽序列，其中FAP特异性的Fab重链与包含突出修饰的Fc域亚基共享羧基端肽键，所述包含突出修饰的Fc域亚基继而与IL-15多肽共享羧基端肽键。在一个更具体的实施方案中，所述免疫缀合物包含SEQ ID NO:199的多肽序列或其保留功能性的变体。在一个实施方案中，所述免疫缀合物包含一种多肽序列，其中FAP特异性的Fab重链与包含孔修饰的Fc域亚基共享羧基端肽键。在一个更具体的实施方案中，所述免疫缀合物包含选自下组的多肽序列：SEQ ID NO:193,SEQ ID NO:201和SEQ ID NO:207或其保留功能性的变体。在另一个实施方案中，所述免疫缀合物包含特异于FAP的Fab轻链。在一个更具体的实施方案中，所述免疫缀合物包含SEQ ID NO:205或SEQ ID NO:211的多肽序列或其保留功能性的变体。在另一个实施方案中，所述免疫缀合物包含SEQ ID NO:205的多肽序列、SEQ ID NO:193的多肽序列和选自下组的多肽序列：SEQ ID NO:195,SEQ ID NO:197,SEQ ID NO:199和SEQ IDNO:269，或其保留有功能性的变体。在再一个实施方案中，所述免疫缀合物包含SEQ ID NO:201,SEQ ID NO:203和SEQ ID NO:205的多肽序列，或其保留有功能性的变体。在又一个实施方案中，所述免疫缀合物包含SEQ ID NO:207,SEQ ID NO:209和SEQ ID NO:211的多肽序列，或其保留有功能性的变体。在再一个实施方案中，所述免疫缀合物包含SEQ ID NO:205,SEQ ID NO:193和SEQ ID NO:269的多肽序列，或其保留有功能性的变体。在又一个实施方案中，所述免疫缀合物包含SEQ ID NO:211,SEQ ID NO:207和SEQ ID NO:271的多肽序列，或其保留有功能性的变体。在再一个实施方案中，所述免疫缀合物包含SEQ ID NO:211,SEQID NO:207和SEQ ID NO:273的多肽序列，或其保留有功能性的变体。在另一个具体的实施方案中，所述多肽例如通过二硫键共价连接。在一些实施方案中，所述Fc域亚基各自包含氨基酸取代L234A,L235A和P329G。
在又一个实施方案中，所述免疫缀合物包含一种多肽序列，其中FAP特异性的Fab重链与包含孔修饰的Fc域亚基共享羧基端肽键，所述包含孔修饰的Fc域亚基继而与IL-10多肽共享羧基端肽键。在一个更具体的实施方案中，所述免疫缀合物包含SEQ ID NO:243或SEQ ID NO:245的多肽序列或其保留功能性的变体。在一个实施方案中，所述免疫缀合物包含一种多肽序列，其中FAP特异性的Fab重链与包含突出修饰的Fc域亚基共享羧基端肽键。在一个更具体的实施方案中，所述免疫缀合物包含SEQ ID NO:241的多肽序列或其保留功能性的变体。在另一个实施方案中，所述免疫缀合物包含FAP特异性的Fab轻链。在一个更具体的实施方案中，所述免疫缀合物包含SEQ ID NO:205的多肽序列或其保留功能性的变体。在另一个实施方案中，所述免疫缀合物包含SEQ ID NO:205,SEQ ID NO:241和SEQ ID NO:243的多肽序列或其保留功能性的变体。在再一个实施方案中，所述免疫缀合物包含SEQ IDNO:205,SEQ ID NO:241和SEQ ID NO:245的多肽序列或其保留功能性的变体。在另一个具体的实施方案中，所述多肽例如通过二硫键共价连接。在一些实施方案中，所述Fc域亚基各自包含氨基酸取代L234A,L235A和P329G。
在一个具体的实施方案中，所述免疫缀合物包含由一种多核苷酸序列编码的多肽序列，所述多核苷酸序列与选自下组的序列至少约80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%相同：SEQ ID NO:196,SEQ ID NO:198,SEQ ID NO:200,SEQ ID NO:204,SEQ ID NO:210,SEQID NO:244,SEQ ID NO:246,SEQ ID NO:270,SEQ ID NO:272和SEQ ID NO:274。在另一个具体的实施方案中，所述免疫缀合物包含由选自下组的多核苷酸序列编码的多肽序列：SEQID NO:196,SEQ ID NO:198,SEQ ID NO:200,SEQ ID NO:204,SEQ ID NO:210,SEQ ID NO:244,SEQ ID NO:246,SEQ ID NO:270,SEQ ID NO:272和SEQ ID NO:274.在另一个具体的实施方案中，所述免疫缀合物包含由一种多核苷酸序列编码的多肽序列，所述多核苷酸序列与选自下组的序列至少约80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%相同：SEQ ID NO:194,SEQID NO:202,SEQ ID NO:208和SEQ ID NO:242。在又一个具体的实施方案中，所述免疫缀合物包含由选自下组的多核苷酸序列编码的多肽序列：SEQ ID NO:194,SEQ ID NO:202,SEQID NO:208和SEQ ID NO:242。在另一个具体的实施方案中，所述免疫缀合物包含由一种多核苷酸序列编码的多肽序列，所述多核苷酸序列与SEQ ID NO:206或SEQ ID NO:212的序列至少约80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%相同。在再一个具体的实施方案中，所述免疫缀合物包含由SEQ ID NO:206或SEQ ID NO:212的多核苷酸序列编码的多肽序列。
在一个实施方案中，所述免疫缀合物包含至少一个，通常两个或更多个对癌胚抗原(CEA)特异性的抗原结合模块。在一个具体的实施方案中，所述免疫缀合物的抗原结合模块包含与SEQ ID NO:191或SEQ ID NO:295的序列至少约80%,85%,90%,95%,96%,97%,98%,99%或100%相同的重链可变区序列，或其保留功能性的变体。在另一个具体的实施方案中，所述免疫缀合物的抗原结合模块包含与SEQ ID NO:189或SEQ ID NO:293的序列至少约80%,85%,90%,95%,96%,97%,98%,99%或100%相同的轻链可变区序列，或其保留功能性的变体。在一个更具体的实施方案中，所述免疫缀合物的抗原结合模块包含与SEQ ID NO:191的序列至少约80%,85%,90%,95%,96%,97%,98%,99%或100%相同的重链可变区序列或其保留功能性的变体，并包含与SEQ ID NO:189的序列至少约80%,85%,90%,95%,96%,97%,98%,99%或100%相同的轻链可变区序列或其保留功能性的变体。在另一个具体的实施方案中，所述免疫缀合物的抗原结合模块包含与SEQ ID NO:295的序列至少约80%,85%,90%,95%,96%,97%,98%,99%或100%相同的重链可变区序列或其保留功能性的变体，并包含与SEQ ID NO:293的序列至少约80%,85%,90%,95%,96%,97%,98%,99%或100%相同的轻链可变区序列或其保留功能性的变体。
在另一个具体的实施方案中，所述免疫缀合物的抗原结合模块的重链可变区序列由一种多核苷酸序列编码，该多核苷酸序列与SEQ ID NO:192或SEQ ID NO:296的序列至少约80%,85%,90%,95%,96%,97%,98%或99%相同。在再一个具体的实施方案中，所述免疫缀合物的抗原结合模块的重链可变区序列由SEQ ID NO:192或SEQ ID NO:296的多核苷酸序列编码。在另一个具体的实施方案中，所述免疫缀合物的抗原结合模块的轻链可变区序列由一种多核苷酸序列编码，该多核苷酸序列与SEQ ID NO:190或SEQ ID NO:294的序列至少约80%,85%,90%,95%,96%,97%,98%,或99%相同。在又一个具体的实施方案中，所述免疫缀合物的抗原结合模块的轻链可变区序列由SEQ ID NO:190或SEQ ID NO:294的多核苷酸序列编码。
在一个实施方案中，所述免疫缀合物包含一种多肽序列，其中CEA特异性的Fab重链与包含突出修饰的Fc域亚基共享羧基端肽键，所述突出修饰的Fc域亚基继而与IL-2多肽共享羧基端肽键。在一个更具体的实施方案中，所述免疫缀合物包含选自下组的多肽序列：SEQ ID NO:229,SEQ ID NO:275,SEQ ID NO:277和SEQ ID NO:279，或其保留功能性的变体。在一个实施方案中，所述免疫缀合物包含一种多肽序列，其中CEA特异性的Fab重链与包含孔修饰的Fc域亚基共享羧基端肽键。在一个更具体的实施方案中，所述免疫缀合物包含SEQ ID NO:227或SEQ ID NO:281的多肽序列，或其保留功能性的变体。在另一个实施方案中，所述免疫缀合物包含CEA特异性的Fab轻链。在一个更具体的实施方案中，所述免疫缀合物包含SEQ ID NO:231或SEQ ID NO:283的多肽序列，或其保留功能性的变体。在另一个实施方案中，所述免疫缀合物包含SEQ ID NO:227,SEQ ID NO:229和SEQ ID NO:231的多肽序列，或其保留功能性的变体。在另一个实施方案中，所述免疫缀合物包含SEQ ID NO:275,SEQ ID NO:281和SEQ ID NO:283的多肽序列，或其保留功能性的变体。在另一个实施方案中，所述免疫缀合物包含SEQ ID NO:277,SEQ ID NO:281和SEQ ID NO:283的多肽序列，或其保留功能性的变体。在另一个实施方案中，所述免疫缀合物包含SEQ ID NO:279,SEQ IDNO:281和SEQ ID NO:283的多肽序列，或其保留功能性的变体。在另一个具体的实施方案中，所述多肽例如通过二硫键共价连接。在一些实施方案中，所述Fc域多肽链包含氨基酸取代L234A、L235A和P329G。
在一个具体的实施方案中，所述免疫缀合物包含由一种多核苷酸序列编码的多肽序列，所述多核苷酸序列与选自下组的序列至少约80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%相同：SEQ ID NO:230,SEQ ID NO:276,SEQ ID NO:278和SEQ ID NO:280。在另一个具体的实施方案中，所述免疫缀合物包含由选自下组的多核苷酸序列编码的多肽序列：SEQ ID NO:230,SEQ ID NO:276,SEQ ID NO:278和SEQ ID NO:280。在另一个具体的实施方案中，所述免疫缀合物包含由一种多核苷酸序列编码的多肽序列，所述多核苷酸序列与SEQ ID NO:228或SEQ ID NO:282的序列至少约80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%相同。在再一个具体的实施方案中，所述免疫缀合物包含由SEQ ID NO:228或SEQ ID NO:282的多核苷酸序列编码的多肽序列。在另一个具体的实施方案中，所述免疫缀合物包含由一种多核苷酸序列编码的多肽序列，所述多核苷酸序列与SEQ ID NO:232或SEQ ID NO:284的序列至少约80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%相同。在再一个具体的实施方案中，所述免疫缀合物包含由SEQ ID NO:232或SEQ ID NO:284的多核苷酸序列编码的多肽序列。
在一些实施方案中，所述免疫缀合物包含一种多肽序列，其中效应器模块多肽与包含突出修饰的Fc域亚基共享羧基端肽键。在一个更具体的实施方案中，所述免疫缀合物包含选自下组的多肽序列：SEQ ID NO:247,SEQ ID NO:249和SEQ ID NO:251，或其保留功能性的变体。在一个这类实施方案中，所述免疫缀合物还包含一种多肽序列，其中FAP特异性的Fab重链与包含孔修饰的Fc域亚基共享羧基端肽键。在一个更具体的实施方案中，所述免疫缀合物还包含选自下组的多肽序列：SEQ ID NO:193,SEQ ID NO:201和SEQ ID NO:207，或其保留功能性的变体。在另一个此类实施方案中，所述免疫缀合物还包含一种多肽序列，其中EDB,TNC A1,TNC A2或CEA特异性的Fab重链与包含孔修饰的Fc域亚基共享羧基端肽键。在一些实施方案中，所述Fc域亚基各自包含氨基酸取代L234A、L235A和P329G。依照上文任一个实施方案，所述免疫缀合物可进一步包含特异于相应抗原的Fab轻链。
本发明的免疫缀合物包括那些具有与以下所列序列至少约80%,85%,90%,95%,96%,97%,98%,99%,或100%相同的序列的免疫缀合物：SEQ ID NO23,25,27,29,31,33,35,37,39,41,43,45,47,49,51,53,55,57,59,61,63,65,67,69,71,73,75,77,79,81,83,85,87,89,91,93,95,97,99,101,103,105,107,109,111,113,115,117,119,121,123,125,127,129,131,133,135,137,139,141,143,145,147,149,151,153,155,157,159,161,163,165,167,169,171,173,175,177,179,181,183,185,187,189,191,293,295,193,195,197,199,201,203,205,207,209,211,213,215,217,227,229,231,233,235,237,239,241,243,245,247,249,251,269,271,273,275,277,279,281,283,285和287，包括其功能性片段或变体。本发明还涵盖包含具有保守性氨基酸取代的这些序列的免疫缀合物。
多核苷酸
本发明还提供分离的多核苷酸，其编码如本文中描述的免疫缀合物或其片段。
本发明的多核苷酸包括那些与以下所列序列至少约80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%相同的多核苷酸：SEQ ID NO24,26,28,30,32,34,36,38,40,42,44,46,48,50,52,54,56,58,60,62,64,66,68,70,72,74,76,78,80,82,84,86,88,90,92,94,96,98,100,102,104,106,108,110,112,114,116,118,120,122,124,126,128,130,132,134,136,138,140,142,144,146,148,150,152,154,156,158,160,162,164,166,168,170,172,174,176,178,180,182,184,186,188,190,192,294,296,194,196,198,200,202,204,206,208,210,212,214,216,218,228,230,232,234,236,238,240,242,244,246,248,250,252,270,272,274,276,278,280,282,284,286和288，包括其功能性片段或变体。
可以将编码本发明的免疫缀合物的多核苷酸作为编码完整免疫缀合物的单一多核苷酸表达，或作为共表达的多个(例如两个或更多个)多核苷酸表达。由共表达的多核苷酸编码的多肽可以经由例如二硫键或其它手段联合以形成功能性免疫缀合物。例如，抗原结合模块的轻链部分可与包含抗原结合模块重链部分、Fc域亚基和任选地效应器模块的免疫缀合物部分由分开的多核苷酸编码。当共表达时，重链多肽将与轻链多肽联合以形成抗原结合模块。在另一个例子中，包含第一抗原结合模块的重链部分、两个Fc域亚基之一和效应器模块的免疫缀合物部分可与包含第二抗原结合模块重链部分、两个Fc域亚基中另一个的免疫缀合物部分由分开的多核苷酸编码。当共表达时，所述Fc域亚基将联合以形成Fc域。
在一个实施方案中，本发明的分离的多核苷酸编码免疫缀合物的片段，该免疫缀合物包含第一抗原结合模块、由两个亚基组成的Fc域和单个效应器模块，其中所述抗原结合模块是包含重链可变区和轻链可变区，特别是Fab分子的抗原结合域。在一个实施方案中，本发明的分离的多核苷酸编码第一抗原结合模块的重链、Fc域的亚基和效应器模块。在另一个实施方案中，本发明的分离的多核苷酸编码第一抗原结合模块的重链和Fc域的亚基。在再一个实施方案中，本发明的分离的多核苷酸编码Fc域的亚基和效应器模块。在一个更具体的实施方案中，所述分离的多核苷酸编码一种多肽，其中Fab重链与Fc域亚基共享羧基端肽键。在另一个具体的实施方案中，所述分离的多核苷酸编码一种多肽，其中Fc域亚基与效应器模块多肽共享羧基端肽键。在再一个具体的实施方案中，所述分离的多核苷酸编码一种多肽，其中Fab重链与Fc域亚基共享羧基端肽键，所述Fc域亚基继而与效应器模块多肽共享羧基端肽键。在又一个具体的实施方案中，所述分离的多核苷酸编码一种多肽，其中效应器模块多肽与Fc域亚基共享羧基端肽键。
在另一个实施方案中，本发明涉及编码免疫缀合物或其片段的分离的多核苷酸，其中所述多核苷酸包含编码如以下显示的可变区序列的序列：SEQ ID NO23,25,27,29,31,33,35,37,39,41,43,45,47,49,51,53,55,57,59,61,63,65,67,69,71,73,75,77,79,81,83,85,87,89,91,93,95,97,99,101,103,105,107,109,111,113,115,117,119,121,123,125,127,129,131,133,135,137,139,141,143,145,147,149,151,153,155,157,159,161,163,165,167,169,171,173,175,177,179,181,183,185,187,189,191,293或295。在另一个实施方案中，本发明涉及编码免疫缀合物或其片段的分离的多核苷酸，其中所述多核苷酸包含编码如以下显示的多肽序列的序列：SEQ ID NO193,195,197,199,201,203,205,207,209,211,213,215,217,227,229,231,233,235,237,239,241,243,245,247,249,251,269,271,273,275,277,279,281,283,285或287。在另一个实施方案中，本发明进一步涉及编码免疫缀合物或其片段的分离的多核苷酸，其中所述多核苷酸包含与以下显示的核苷酸序列至少约80%,85%,90%,95%,96%,97%,98%或99%相同的序列：SEQ ID NO24,26,28,30,32,34,36,38,40,42,44,46,48,50,52,54,56,58,60,62,64,66,68,70,72,74,76,78,80,82,84,86,88,90,92,94,96,98,100,102,104,106,108,110,112,114,116,118,120,122,124,126,128,130,132,134,136,138,140,142,144,146,148,150,152,154,156,158,160,162,164,166,168,170,172,174,176,178,180,182,184,186,188,190,192,294,296,194,196,198,200,202,204,206,208,210,212,214,216,218,228,230,232,234,236,238,240,242,244,246,248,250,252,270,272,274,276,278,280,282,284,286或288。在另一个实施方案中，本发明涉及编码免疫缀合物或其片段的分离的多核苷酸，其中所述多核苷酸包含以下显示的核酸序列：SEQ ID NO24,26,28,30,32,34,36,38,40,42,44,46,48,50,52,54,56,58,60,62,64,66,68,70,72,74,76,78,80,82,84,86,88,90,92,94,96,98,100,102,104,106,108,110,112,114,116,118,120,122,124,126,128,130,132,134,136,138,140,142,144,146,148,150,152,154,156,158,160,162,164,166,168,170,172,174,176,178,180,182,184,186,188,190,192,294,296,194,196,198,200,202,204,206,208,210,212,214,216,218,228,230,232,234,236,238,240,242,244,246,248,250,252,270,272,274,276,278,280,282,284,286或288。在另一个实施方案中，本发明涉及编码免疫缀合物或其片段的分离的多核苷酸，其中所述多核苷酸包含编码与以下显示的氨基酸序列至少约80%,85%,90%,95%,96%,97%,98%,或99%相同的可变区序列的序列：SEQ ID NO23,25,27,29,31,33,35,37,39,41,43,45,47,49,51,53,55,57,59,61,63,65,67,69,71,73,75,77,79,81,83,85,87,89,91,93,95,97,99,101,103,105,107,109,111,113,115,117,119,121,123,125,127,129,131,133,135,137,139,141,143,145,147,149,151,153,155,157,159,161,163,165,167,169,171,173,175,177,179,181,183,185,187,189,191,293或295。在另一个实施方案中，本发明涉及编码免疫缀合物或其片段的分离的多核苷酸，其中所述多核苷酸包含编码与以下的氨基酸序列至少80%,85%,90%,95%,96%,97%,98%,或99%相同的多肽序列的序列：SEQID NO193,195,197,199,201,203,205,207,209,211,213,215,217,227,229,231,233,235,237,239,241,243,245,247,249,251,269,271,273,275,277,279,281,283,285或287。本发明涵盖编码免疫缀合物或其片段的分离的多核苷酸，其中所述多核苷酸包含编码下列可变区序列且具有保守性氨基酸取代的序列：SEQ ID NO23,25,27,29,31,33,35,37,39,41,43,45,47,49,51,53,55,57,59,61,63,65,67,69,71,73,75,77,79,81,83,85,87,89,91,93,95,97,99,101,103,105,107,109,111,113,115,117,119,121,123,125,127,129,131,133,135,137,139,141,143,145,147,149,151,153,155,157,159,161,163,165,167,169,171,173,175,177,179,181,183,185,187,189,191,293或295。本发明还涵盖编码本发明免疫缀合物或其片段的分离的多核苷酸，其中所述多核苷酸包含编码下列多肽序列且具有保守性氨基酸取代的序列：SEQ ID NO193,195,197,199,201,203,205,207,209,211,213,215,217,227,229,231,233,235,237,239,241,243,245,247,249,251,269,271,273,275,277,279,281,283,285或287。
在某些实施方案中，所述多核苷酸或核酸是DNA。在其它实施方案中，本发明的多核苷酸是RNA，例如以信使RNA(mRNA)的形式。本发明的RNA可以是单链或双链的。
非靶向性缀合物
本发明不仅提供靶向特定抗原(例如肿瘤抗原)的免疫缀合物，而且还提供非靶向性缀合物，其包含一种或多种不特异性结合任何抗原(特别是不结合任何人抗原)的Fab分子。如本文中描述的，可以例如通过ELISA或表面等离振子共振来测量这些缀合物没有对任何抗原的特异性结合(即，不存在任何能与非特异性相互作用区分开来的结合)。此类缀合物对于例如相比于未缀合效应器模块的血清半衰期(其中不期望靶向到特定组织)，延长其包含的效应器模块的血清半衰期特别有用。
具体地，本发明提供一种缀合物，其包含不特异性结合任何抗原的第一Fab分子、由两个亚基组成的Fc域和效应器模块，其中存在不超过一个效应器模块。更具体地，本发明提供一种缀合物，其包含包括SEQ ID NO:299的重链可变区序列和SEQ ID NO:297的轻链可变区序列的第一Fab分子、由两个亚基组成的Fc域和效应器模块，其中存在不超过一个效应器模块。类似于本发明的免疫缀合物，缀合物可具有多种构造，如在上文“免疫缀合物形式”下描述的(免疫缀合物的抗原结合模块被不特异性结合任何抗原的Fab分子，如包含SEQ IDNO:299的重链可变区序列和SEQ ID NO:297的轻链可变区序列的Fab分子替换)。类似地，如上文在本发明免疫缀合物的“Fc域”和“效应器模块”下描述的Fc域以及效应器模块的特征单独或组合同样适用于本发明的非靶向性缀合物。
在一个具体的实施方案中，所述缀合物包含(i)免疫球蛋白分子，其包含不特异性结合任何抗原的第一和第二Fab分子和Fc域，和(ii)效应器模块，其中存在不超过一个效应器模块，且其中免疫球蛋白分子是人IgG1亚类免疫球蛋白；Fc域在其两个亚基的一个中包含突出修饰且在另一个亚基中包含孔修饰，并在其每个亚基中包含氨基酸取代L234A、L235A和P329G；所述效应器模块是融合至免疫球蛋白重链之一的羧基端氨基酸的IL-2分子，任选地经由接头肽进行。在一个具体的实施方案中，所述缀合物包含SEQ ID NO:299的重链可变区序列和SEQ ID NO:297的轻链可变区序列。
在某些实施方案中，所述缀合物包含(i)免疫球蛋白分子，其包含SEQ ID NO:299的重链可变区序列和SEQ ID NO:297的轻链可变区序列，和(ii)效应器模块，其中存在不超过一个效应器模块。在一个这类实施方案中，所述免疫球蛋白分子是人IgG1亚类免疫球蛋白。在一个这类实施方案中，Fc域在其两个亚基的一个中包含突出修饰且在另一个亚基中包含孔修饰。在特定的此类实施方案中，Fc域在其每个亚基中包含氨基酸取代L234A、L235A和P329G。在另一个此类实施方案中，效应器模块是融合至免疫球蛋白重链之一的羧基端氨基酸的IL-2分子，任选地经由接头肽进行。
在一个实施方案中，所述缀合物包含一种多肽序列，其中不特异性结合任何抗原的Fab重链与包含突出修饰的Fc域亚基共享羧基端肽键，所述突出修饰的Fc域亚基继而与IL-2多肽共享羧基端肽键。在一个更具体的实施方案中，所述缀合物包含选自下组的多肽序列：SEQ ID NO:221,SEQ ID NO:223,SEQ ID NO:289和SEQ ID NO:291，或其保留功能性的变体。在一个实施方案中，所述缀合物包含一种多肽序列，其中不特异性结合任何抗原的Fab重链与包含孔修饰的Fc域亚基共享羧基端肽键。在一个更具体的实施方案中，所述缀合物包含选自SEQ ID NO:219的多肽序列，或其保留功能性的变体。在另一个实施方案中，所述缀合物包含不特异性结合任何抗原的Fab轻链。在一个更具体的实施方案中，所述缀合物包含SEQ ID NO:225的多肽序列，或其保留功能性的变体。在另一个实施方案中，所述缀合物包含SEQ ID NO:219、SEQ ID NO:221和SEQ ID NO:225的多肽序列，或其保留功能性的变体。在另一个实施方案中，所述缀合物包含SEQ ID NO:219,SEQ ID NO:223和SEQ ID NO:225的多肽序列，或其保留功能性的变体。在另一个实施方案中，所述缀合物包含SEQ IDNO:219,SEQ ID NO:289和SEQ ID NO:225的多肽序列，或其保留功能性的变体。在另一个实施方案中，所述缀合物包含SEQ ID NO:219,SEQ ID NO:291和SEQ ID NO:225的多肽序列，或其保留功能性的变体。在另一个具体的实施方案中，所述多肽例如通过二硫键共价连接。在一些实施方案中，所述Fc域多肽链包含氨基酸取代L234A、L235A和P329G。
在一个具体的实施方案中，所述缀合物包含由一种多核苷酸序列编码的多肽序列，该多核苷酸序列与选自下组的序列至少约80%,85%,90%,95%,96%,97%,98%或99%相同：SEQ ID NO:298,SEQ ID NO:300,SEQ ID NO:220,SEQ ID NO:222,SEQ ID NO:224,SEQ IDNO:226,SEQ ID NO:290和SEQ ID NO:292。在另一个具体的实施方案中，所述缀合物包含由选自下组的多核苷酸序列编码的多肽序列：SEQ ID NO:298,SEQ ID NO:300,SEQ ID NO:220,SEQ ID NO:222,SEQ ID NO:224,SEQ ID NO:226,SEQ ID NO:290和SEQ ID NO:292。
本发明还提供编码本发明缀合物或其片段的分离的多核苷酸。在一个具体的实施方案中，所述分离的多核苷酸包含与选自下组的序列至少约80%,85%,90%,95%,96%,97%,98%,99%或100%相同的序列：SEQ ID NO:298,SEQ ID NO:300,SEQ ID NO:220,SEQ ID NO:222,SEQ ID NO:224,SEQ ID NO:226,SEQ ID NO:290和SEQ ID NO:292。本发明还提供包含分离的多核苷酸的表达载体，和包含本发明分离的多核苷酸或表达载体的宿主细胞。在另一个方面，提供了生成本发明缀合物的方法，包括以下步骤a)在适合所述缀合物表达的条件下培养本发明的宿主细胞以及b)回收所述缀合物。本发明还涵盖通过本发明方法生成的缀合物。本文中提供的关于生成本发明免疫缀合物的方法的公开内容(见例如“重组方法”下)可同样适用于本发明的缀合物。
本发明进一步提供包含本发明的缀合物和药学可接受载体的药物组合物。本文中提供的关于本发明免疫缀合物的药物组合物的公开内容(见例如“组合物、配制剂和施用路径”下)可同样适用于本发明的缀合物。此外，缀合物可用于本文中针对本发明免疫缀合物描述的使用方法中。本文中提供的关于在疾病治疗中使用本发明免疫缀合物的方法的公开内容(见例如“治疗方法和组合物”、“其它药剂和治疗”和“制品”下)可同样适用于本发明的缀合物。
重组方法
可以获得本发明的免疫缀合物，例如通过固相肽合成(例如Merrifield固相肽合成)或重组生成进行。对于重组生成，分离一种或多种编码所述免疫缀合物(片段)的多核苷酸(例如如上文描述的)，并将其***一种或多种载体中用于在宿主细胞中进一步克隆和/或表达。可以使用常规规程容易分离并测序这类多核苷酸。在一个实施方案中，提供包含一种或多种本发明的多核苷酸的载体(优选为表达载体)。可以使用本领域技术人员公知的方法来构建含有免疫缀合物(片段)的编码序列以及适宜的转录/翻译控制信号的表达载体。这些方法包括体外重组DNA技术、合成技术和体内重组/遗传重组。参见，例如记载于Maniatis等,MOLECULAR CLONING:A LABORATORY MANUAL,Cold Spring HarborLaboratory,N.Y.(1989);和Ausubel等,CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY,Greene Publishing Associates and Wiley Interscience,N.Y(1989)的技术。表达载体可以是质粒、病毒的一部分或可以是核酸片段。表达载体包含表达盒，对其中在与启动子和/或其它转录或翻译控制元件的可操作联合中克隆编码免疫缀合物(片段)的多核苷酸(即编码区)。如本文中使用的，“编码区”是核酸中由翻译成氨基酸的密码子组成的一部分。尽管“终止密码子”(TAG、TGA或TAA)不翻译成氨基酸，但可将其视为编码区的一部分(若存在的话)，但任何侧翼序列例如启动子、核糖体结合位点、转录终止子、内含子、5’和3’非翻译区等，不是编码区的一部分。两个或更多个编码区可以存在于单一的多核苷酸构建体中(例如单一的载体上)，或存在于分开的多核苷酸构建体中，例如在分开的(不同的)载体上。此外，任何载体可含有单个编码区，或可包含两个或更多个编码区，例如本发明的载体可以编码一种或多种多肽，其经由蛋白水解切割在翻译后或共翻译分开成最终蛋白质。另外，本发明的载体、多核苷酸或核酸可以编码异源编码区，其与编码本发明的免疫缀合物(片段)或其变体或衍生物的多核苷酸融合或未融合。异源编码区包括但不限于特殊化的元件或基序，如分泌信号肽或异源功能域。当基因产物例如多肽的编码区与一种或多种调节序列以某种方式联合从而使得该基因产物的表达置于该调节序列的影响或控制下时，即为可操作联合。若诱导启动子功能导致编码期望的基因产物的mRNA的转录并且如果两个DNA片段之间的连接的性质不干扰表达调节序列指导该基因产物表达的能力或不干扰DNA模板被转录的能力，则两个DNA片段(如多肽编码区和与其联合的启动子)为“可操作联合的”。如此，如果启动子能够实现编码多肽的核酸的转录，那么该启动子区将是与该核酸可操作联合。所述启动子可以是细胞特异性启动子，其仅指导预先确定的细胞中的DNA的实质性转录。除启动子以外，其它转录控制元件例如增强子、操纵基因、阻遏物和转录终止信号能与多核苷酸可操作联合以指导细胞特异性转录。在本文中公开了合适的启动子和其它转录控制区。多种转录控制区是本领域技术人员已知的。这些包括但不限于在脊椎动物细胞中发挥功能的转录控制区，如但不限于来自巨细胞病毒的启动子和增强子区段(例如立即早期启动子，以及内含子-A)、猿病毒40(例如早期启动子)和逆转录病毒(如例如劳斯(Rous)肉瘤病毒)。其它转录控制区包括那些自脊椎动物基因如肌动蛋白、热休克蛋白、牛生长激素和家兔β球蛋白衍生的，以及能够控制真核细胞中基因表达的其它序列。另外的合适的转录控制区包括组织特异性启动子和增强子以及诱导型启动子(例如四环素诱导型启动子)。类似地，多种翻译控制元件是本领域普通技术人员已知的。这些包括但不限于核糖体结合位点、翻译起始和终止密码子以及自病毒***衍生的元件(具体地，内部核糖体进入位点或IRES，亦称为CITE序列)。表达盒还可以包含其它特征，如复制起点和/或染色体整合元件，如逆转录病毒长末端重复(LTR)或腺伴随病毒(AAV)反向末端重复(ITR)。
本发明的多核苷酸和核酸编码区可以与编码分泌或信号肽的另外的编码区联合，所述分泌或信号肽指导由本发明的多核苷酸编码的多肽的分泌。例如，如果期望分泌所述免疫缀合物，那么可以将编码信号序列的DNA置于编码本发明免疫缀合物或其片段的核酸上游。依照信号假说，由哺乳动物细胞分泌的蛋白质具有信号肽或分泌前导序列，一旦启动将生长的蛋白质链跨越粗面内质网输出，就将该信号肽或分泌前导序列从成熟的蛋白质切去。本领域中普通技术人员知晓由脊椎动物细胞分泌的多肽一般具有融合至多肽N端的信号肽，其从所翻译的多肽切去以生成分泌的或“成熟的”多肽形式。在某些实施方案中，使用天然的信号肽，例如免疫球蛋白重链或轻链信号肽，或该序列的保留指导与其可操作联合的多肽分泌的能力的功能性衍生物。或者，可以使用异源哺乳动物信号肽或其功能性衍生物。例如，可以将野生型前导序列用人组织血纤维蛋白溶酶原激活剂(TPA)或小鼠β-葡糖醛酸糖苷酶的前导序列取代。分泌性信号肽的例示性氨基酸和相应的多核苷酸序列显示于SEQ ID NO8-16。
可以将编码能用于促进后期纯化(例如组氨酸标签)或辅助标记免疫缀合物的短蛋白序列的DNA纳入编码免疫缀合物(片段)的多核苷酸内或其末端。
在一个别的实施方案中，提供包含本发明的一种或多种多核苷酸的宿主细胞。在某些实施方案中，提供包含本发明的一种或多种载体的宿主细胞。多核苷酸和载体可以单独地或组合地纳入本文中分别关于多核苷酸和载体所描述的任何特征。在一个这类实施方案中，宿主细胞包含载体(例如已用该载体转化或转染)，所述载体包含编码本发明免疫缀合物(一部分)的多核苷酸。如本文中使用的，术语“宿主细胞”指任何能工程化以生成本发明的免疫缀合物或其片段的细胞***种类。适用于复制并支持免疫缀合物表达的宿主细胞是本领域中公知的。在适当时，可用特定的表达载体转染或转导这类细胞，并且可以培养大量的含载体细胞以用于接种大规模发酵罐，从而获得充足量的免疫缀合物用于临床应用。合适的宿主细胞包括原核微生物如大肠杆菌，或各种真核细胞，如中国仓鼠卵巢细胞(CHO)、昆虫细胞等。例如，可以在细菌中生成多肽，尤其在不需要糖基化时。在表达后，可以将多肽在可溶性级分中从细菌细胞糊分离并可以进一步纯化。除了原核生物外，真核微生物如丝状真菌或酵母也是适合编码多肽的载体的克隆或表达宿主，包括其糖基化途径已被“人源化”，导致生成具有部分或完全人的糖基化模式的多肽的真菌和酵母菌株。参见Gerngross,Nat Biotech22,1409-1414(2004)，和Li等,Nat Biotech24,210-215(2006)。适用于表达(糖基化)多肽的宿主细胞还自多细胞生物体(无脊椎动物和脊椎动物)衍生。无脊椎动物细胞的例子包括植物和昆虫细胞。已鉴定出可与昆虫细胞一起使用的大量杆状病毒株，特别是用于转染草地贪夜蛾(Spodoptera frugiperda)细胞。也可以将植物细胞培养物用作宿主。参见例如美国专利No.5,959,177,6,040,498,6,420,548,7,125,978和6,417,429(描述用于在转基因植物中生成抗体的PLANTIBODIESTM技术)。脊椎动物细胞也可以用作宿主。例如，适应于在悬液中生长的哺乳动物细胞系可以是有用的。可用的哺乳动物宿主细胞系的其它例子是由SV40转化的猴肾CV1系(COS-7)；人胚肾系(293或293T细胞，如例如记载于Graham等,J Gen Virol36,59(1977))、幼仓鼠肾细胞(BHK)、小鼠塞托利(sertoli)细胞(TM4细胞，如例如记载于Mather,Biol Reprod23,243-251(1980)的)、猴肾细胞(CV1)、非洲绿猴肾细胞(VERO-76)、人***细胞(HELA)、犬肾细胞(MDCK)，buffalo大鼠肝细胞(BRL3A)、人肺细胞(W138)、人肝细胞(Hep G2)、小鼠***肿瘤细胞(MMT060562)、TRI细胞(如例如记载于Mather等,Annals N.Y.Acad Sci383,44-68(1982)的)、MRC5细胞和FS4细胞。其它可用的哺乳动物宿主细胞系包括中国仓鼠卵巢(CHO)细胞，包括dhfr-CHO细胞(Urlaub等,Proc Natl Acad Sci USA77,4216(1980))；和骨髓瘤细胞系如YO、NS0、P3X63和Sp2/0。对于某些适用于蛋白质生产的哺乳动物宿主细胞系的综述，参见例如Yazaki和Wu,Methods in Molecular Biology,第248卷(B.K.C.Lo编,Humana Press,Totowa,NJ),pp.255-268(2003)。宿主细胞包括培养的细胞，例如哺乳动物培养细胞、酵母细胞、昆虫细胞、细菌细胞和植物细胞等，但还包括在转基因动物、转基因植物或培养的植物或动物组织中包含的细胞。在一个实施方案中，宿主细胞是真核细胞，优选为哺乳动物细胞如中国仓鼠卵巢(CHO)细胞、人胚肾(HEK)细胞或淋巴样细胞(例如Y0、NS0、Sp20细胞)。
本领域中已知在这些***中表达外来基因的标准技术。可以将表达包含抗原结合域如抗体的重链或轻链的多肽的细胞工程化改造为使得还表达另一抗体链，从而使得表达的产物是具有重链和轻链两者的抗体。
在一个实施方案中，提供了生成依照本发明的免疫缀合物的方法，其中所述方法包括在适合所述缀合物表达的条件下培养包含编码免疫缀合物的多核苷酸的宿主细胞(如本文中提供的)，并从宿主细胞(或宿主细胞培养基)回收所述缀合物。
所述免疫缀合物的组分彼此遗传融合。免疫缀合物可设计为使其组分直接彼此融合或经由接头序列间接融合。可依照本领域中公知的方法测定接头的组成和长度，并可以测试功效。效应器模块和Fc域之间的接头序列的例子见于以下显示的序列：SEQ ID NO195,197,199,203,209,215,229,235,237,243,245,247,249,251,269,271,273,275,277,279和285。还包含另外的序列以纳入切割位点来分开融合物的各个组分(若期望的话)，例如内肽酶识别序列。
在某些实施方案中，所述免疫缀合物的一个或多个抗原结合模块至少包含能结合抗原决定簇的抗体可变区。可变区可形成天然或非天然存在的抗体及其片段的一部分和自其衍生。生成多克隆抗体和单克隆抗体的方法是本领域中公知的(参见例如Harlow和Lane,"Antibodies,a laboratory manual",Cold Spring Harbor Laboratory,1988)。非天然存在的抗体可以使用固相肽合成构建生成，可以重组生成(例如如记载于美国专利No.4,186,567的)或可通过例如筛选包含可变重链和可变轻链的组合库获得(参见例如McCafferty的美国专利No.5,969,108)。抗原结合模块以及其生成方法还详细记载于PCT公开文本No.WO2011/020783，其完整内容通过提述并入本文。
可以将抗体、抗体片段、抗原结合域或可变区的任何动物种类用于本发明的免疫缀合物。可用于本发明的非限制性抗体、抗体片段、抗原结合域或可变区可以是鼠、灵长类或人起源的。如果免疫缀合物意图供人使用，那么可以使用嵌合形式的抗体，其中抗体的恒定区来自人。也可以依照本领域中公知的方法制备人源化或全人形式的抗体(参见例如Winter的美国专利No.5,565,332)。人源化可以通过各种方法实现，包括但不限于(a)将非人(例如供体抗体)CDR嫁接到人(例如受体抗体)框架和恒定区上，保留或不保留关键的框架残基(例如那些对于保留较好的抗原结合亲和力或抗体功能重要的残基)，(b)仅将非人特异性决定区(SDR或a-CDR；对于抗体-抗原相互作用关键的残基)嫁接到人框架和恒定区上，或(c)移植完整的非人可变域，但通过替换表面残基用人样部分来“掩饰(cloak)”它们。人源化的抗体及其制备方法综述于例如Almagro和Fransson,Front Biosci13,1619-1633(2008)，并且还记载于例如Riechmann等,Nature332,323-329(1988);Queen等,Proc NatlAcad Sci USA86,10029-10033(1989);美国专利No.5,821,337,7,527,791,6,982,321和7,087,409;Jones等,Nature321,522-525(1986);Morrison等,Proc Natl Acad Sci81,6851-6855(1984);Morrison和Oi,Adv Immunol44,65-92(1988);Verhoeyen等,Science239,1534-1536(1988);Padlan,Molec Immun31(3),169-217(1994);Kashmiri等,Methods36,25-34(2005)(描述SDR(a-CDR)嫁接);Padlan,Mol Immunol28,489-498(1991)(描述“表面重建”);Dall’Acqua等,Methods36,43-60(2005)(描述“FR改组”);和Osbourn等,Methods36,61-68(2005)以及Klimka等,Br J Cancer83,252-260(2000)(描述了FR改组的“引导选择”办法)。可以使用本领域中已知的各种技术来生成人抗体和人可变区。人抗体一般记载于van Dijk和van de Winkel,Curr OpinPharmacol5,368-74(2001)以及Lonberg,Curr Opin Immunol20,450-459(2008)。人可变区能形成通过杂交瘤方法制备的人单克隆抗体的一部分和自其衍生(参见例如Monoclonal Antibody Production Techniques andApplications,pp.51-63(Marcel Dekker,Inc.,New York,1987))。还可以通过对转基因动物施用免疫原来制备人抗体和人可变区，所述转基因动物已经过修饰以应答抗原激发而生成完整的人抗体或具有人可变区的完整抗体(参见例如Lonberg,Nat Biotech23,1117-1125(2005)。还可以通过分离选自人衍生的噬菌体展示库的Fv克隆可变区序列来生成人抗体和人可变区(参见例如Hoogenboom等，于Methods in Molecular Biology178,1-37(O’Brien等编,Human Press,Totowa,NJ,2001);和McCafferty等,Nature348,552-554;Clackson等,Nature352,624-628(1991))。噬菌体通常展示抗体片段，作为单链Fv(scFv)片段或作为Fab片段。通过噬菌体展示来制备免疫缀合物的抗原结合模块的详细描述可见于PCT公开文本No.WO2011/020783所附的实施例。
在某些实施方案中，将可用于本发明的抗原结合模块工程化改造为具有增强的结合亲和力，其依照例如公开于PCT公开文本No.WO2011/020783(参见涉及亲和力成熟的实施例)或美国专利申请公开文本No.2004/0132066的方法进行，其完整内容通过提述据此并入。可以经由酶联免疫吸附测定法(ELISA)或本领域技术人员熟知的其它技术来测量本发明的免疫缀合物结合特定抗原决定簇的能力，所述其它技术例如表面等离振子共振技术(在BIACORE T100***上分析)(Liljeblad等,Glyco J17,323-329(2000))和传统的结合测定法(Heeley,Endocr Res28,217-229(2002))。可以使用竞争测定法来鉴定与参照抗体竞争对特定抗原的结合的抗体、抗体片段、抗原结合域或可变域，例如与L19抗体竞争对纤连蛋白的外域B(EDB)的结合的抗体。在某些实施方案中，这类竞争性抗体结合由参照抗体结合的相同表位(例如线性或构象性表位)。用于定位抗体结合的表位的详细的例示性方法在Morris(1996)“Epitope Mapping Protocols,”于Methods in Molecular Biology vol.66(Humana Press,Totowa,NJ)中提供。在一种例示性竞争测定法中，将固定化的抗原(例如EDB)在溶液中温育，所述溶液包含结合该抗原的第一标记抗体(例如L19抗体)和测试其与第一抗体竞争对抗原的结合的第二未标记抗体。第二抗体可以存在于杂交瘤上清液中。作为对照，将固定化的抗原在溶液中温育，所述溶液包含第一标记抗体但没有第二未标记抗体。在允许第一抗体结合抗原的条件下温育后，除去过量的未结合的抗体，并测量与固定化抗原联合的标记物的量。如果与固定化抗原联合的标记物的量在测试样品中相对于对照样品实质性降低，那么这指示第二抗体在与第一抗体竞争对抗原的结合。参见Harlow和Lane(1988)Antibodies:A Laboratory Manual ch.14(Cold Spring Harbor Laboratory,ColdSpring Harbor,NY)。
可以通过本领域已知的技术来纯化如本文中描述的那样制备的免疫缀合物，所述技术如高效液相层析、离子交换层析、凝胶电泳、亲和层析、大小排阻层析等。用于纯化具体蛋白质的实际条件将部分取决于因素，如净电荷、疏水性、亲水性等，而且对于本领域中的技术人员将是明显的。对于亲和层析纯化，能使用免疫缀合物结合的抗体、配体、受体或抗原。例如，对于本发明的免疫缀合物的亲和层析纯化，可以使用具有蛋白A或蛋白G的基质。可以使用连续的蛋白A或G亲和层析和大小排阻层析来分离免疫缀合物，基本如实施例中描述的。可以通过多种公知的分析方法中的任一种来测定免疫缀合物的纯度，包括凝胶电泳、高压液相层析等。例如，如实施例中所描述的那样表达的重链融合蛋白显示为完整且适当装配的，如通过还原性SDS-PAGE证明的(见例如图4)。在约Mr25,000,Mr50,000和Mr60,000处解析出三条条带，其对应于预测的免疫球蛋白轻链、重链和重链/效应器模块融合蛋白的分子量。
测定法
通过本领域中已知的各种测定法，可以鉴定、筛选或表征本文中提供的免疫缀合物的物理/化学特性和/或生物学活性。
亲和力测定法
可以依照实施例中提出的方法通过表面等离振子共振(SPR)测定免疫缀合物对效应器模块受体(例如IL-10R或各种形式的IL-2R)、Fc受体或靶抗原的亲和力，其使用标准的仪器如BIAcore仪(GE Healthcare)，而且可以通过重组表达获得受体或靶蛋白。或者，可以例如通过流式细胞术(FACS)，使用已知表达特定受体或靶抗原的细胞系来评估免疫缀合物对不同受体或靶抗原的结合。一个用于测量结合亲和力的特定的说明性和例示性实施方案记载于下文和下文实施例。
依照一个实施方案，通过表面等离振子共振使用T100仪(GEHealthcare)于25℃用固定化于CM5芯片上的配体(例如效应器模块受体、Fc受体或靶抗原)测量KD。简言之，将羧甲基化的葡聚糖生物传感器芯片(CM5,GE Healthcare)依照供应商说明书用N-乙基-N’-(3-二甲基氨丙基)-碳二亚胺氢氯化物(EDC)和N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)活化。在以10μl/分钟的流速注射前，将重组配体用10mM醋酸钠pH5.5稀释至0.5-30μg/ml以实现约100-5000响应单位(RU)的偶联蛋白。在注射配体后，注射1M乙醇胺以封闭未反应的基团。对于动力学测量，将免疫缀合物的3至5倍连续稀释物(范围为约0.01nM至300nM)在HBS-EP+(GE Healthcare,10mM HEPES,150mM NaCl,3mMEDTA,0.05%表面活性剂P20,pH7.4)中于25℃以约30-50μl/分钟的流速注射。使用简单的1对1Langmuir结合模型(T100评估软件版本1.1.1)通过同时拟合结合和解离传感图来计算结合速率(k结合)和解离速率(k解离)。平衡解离常数(KD)计算为比率k解离/k结合。参见例如Chen等,J MolBiol293,865-881(1999)。
活性测定法
可以通过如实施例中描述的各种测定法来测量本发明的免疫缀合物的生物学活性。生物学活性可例如包括诱导携带效应器模块受体的细胞的增殖，诱导携带效应器模块受体的细胞中的信号传导，诱导通过携带效应器模块受体的细胞的细胞因子分泌，和诱导肿瘤消退和/或改善存活。
组合物、配制剂和施用路径
在一个别的方面，本发明提供包含本文中提供的任意一种免疫缀合物的药物组合物，例如用于以下任一种治疗方法。在一个实施方案中，药物组合物包含本文中提供的任一种免疫缀合物以及药学可接受的载体。在另一个实施方案中，药物组合物包含本文中提供的任一种免疫缀合物以及至少一种例如如下文描述的另外的治疗剂。
还提供以适于体内施用的形式生成本发明的免疫缀合物的方法，所述方法包括(a)获得依照本发明的免疫缀合物，并(b)将所述免疫缀合物与至少一种药学可接受的载体配制在一起，由此配制成用于体内施用的免疫缀合物的制备物。
本发明的药物组合物包含治疗有效量的一种或多种免疫缀合物溶解或分散在药学可接受的载体中。短语“药学或药理学可接受的”指在所采用的剂量和浓度一般对接受者无毒性，即在对动物如例如人(如适宜地)施用时不产生不利、过敏或其它不当反应的分子实体和组合物。根据本公开，制备含有至少一种免疫缀合物以及任选地另外的活性成分的药物组合物将是本领域技术人员已知的，如由Remington’s Pharmaceutical Sciences,18th Ed.Mack Printing Company,1990例示的，其通过提述并入本文。此外，对于动物(例如人)施用，会理解制备物应当满足FDA生物标准部门(FDA Office of BiologicalStandards)或其它国家的相应机构所需要的无菌性、热原性(pyrogenicity)、一般安全性和纯度标准。优选的组合物是冻干配制剂或水性溶液。如本文中使用的，“药学可接受的载体”包括任何和所有的溶剂、缓冲物、分散介质、涂料、表面活性剂、抗氧化剂、防腐剂(例如抗细菌剂、抗真菌剂)、等渗剂、吸收延缓剂、盐、防腐剂、抗氧化剂、蛋白质、药物、药物稳定剂、聚合物、凝胶、结合物、赋形剂、崩解剂(disintegration agent)、滑润剂、甜味剂、芳香剂、染料、这类材料及其组合，如本领域普通技术人员将已知的(参见，例如Remington’sPharmaceutical Sciences,18th Ed.Mack Printing Company,1990,pp.1289-1329，通过提述并入本文)。除非在任何常规载体与活性成分不相容的情况下，否则均涵盖其在治疗或药物组合物中的使用。
所述组合物可以包含不同类型的载体，这取决于是要以固体、液体还是气雾剂形式施用组合物，以及是否需要组合物无菌以用于这类施用路径如注射。可以静脉内、皮内、动脉内、腹膜内、损伤内、头颅内、关节内、***内、脾内、肾内、肋膜内、气管内、鼻内、玻璃体内、***内、直肠内、肿瘤内、肌内、腹膜内、皮下、结膜下、囊泡内、粘膜、心包内、脐内、眼内、口服、表面(topically)、局部(locally)、通过吸入(例如气雾剂吸入)、注射、输注、连续输注、直接浸洗靶细胞的局部灌注、经由导管、经由灌洗、以乳剂、以液体组合物(例如脂质体)、或通过如本领域中普通技术人员会知晓的其它方法或前述内容的任意组合施用本发明的免疫缀合物(以及任何另外的治疗剂)(参见例如，Remington’s PharmaceuticalSciences,18th Ed.Mack Printing Company,1990，通过提述并入本文)。胃肠外施用，特别是静脉内注射，最常用于施用多肽分子如本发明的免疫缀合物。
胃肠外组合物包括那些设计用于通过注射施用，例如皮下、皮内、损伤内、静脉内、动脉内、肌内、鞘内或腹膜内注射施用的组合物。对于注射，可以将本发明的免疫缀合物在水性溶液，优选地在生理学相容的缓冲液中配制，所述生理学相容的缓冲液如汉克(Hanks)氏溶液、林格(Ringer)氏溶液或生理学盐水缓冲液。溶液可以含有配制剂如悬浮剂、稳定剂和/或分散剂。或者，免疫缀合物可以粉末形式用于在使用前与合适的媒介物例如无菌无热原水构建。通过将本发明的免疫缀合物以需要的量掺入到合适的溶剂中，如需要的与下文列举的各种其它成分一起来制备无菌可注射溶液。可以容易地实现无菌，例如通过经由无菌过滤膜过滤。一般地，通过将各种无菌活性成分掺入到无菌媒介物来制备分散剂，所述无菌媒介物含有基础分散介质和/或其它成分。在用无菌粉末来制备无菌可注射溶液、悬液或乳剂的情况中，优选的制备方法是真空干燥或冻干技术，其从先前无菌过滤的液体介质得到活性成分以及任何另外的期望成分的粉末。液体介质应当是适当缓冲的(若需要)并且在用充足的盐水或葡萄糖注射之前首先使液体稀释物等渗。组合物在制备和储存条件下应当是稳定的，并且保存免于微生物如细菌和真菌的污染作用。会领会的是，应当将内毒素污染在安全水平上保持最小，例如低于0.5ng/mg蛋白。合适的药学可接受的载体包括但不限于：缓冲物如磷酸、柠檬酸和其它有机酸；抗氧化剂，包括抗坏血酸和甲硫氨酸；防腐剂(如十八烷基二甲基苄基氯化铵；氯化六甲双铵(hexamethonium chloride)；氯化苯甲烃铵(benzalkonium chloride)；氯化苄乙铵(benzethonium chloride)；酚、丁醇或苯甲醇；烷基对羟基苯甲酸酯如对羟基苯甲酸甲酯或对羟基苯甲酸丙酯；儿茶酚；间苯二酚；环己醇；3-戊醇；和间甲酚)；低分子量(低于约10个残基)多肽；蛋白质，如血清清蛋白、明胶、或免疫球蛋白；亲水性聚合物如聚乙烯吡咯烷酮；氨基酸如甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、组氨酸、精氨酸或赖氨酸；单糖、二糖、和其它碳水化合物包括葡萄糖、甘露糖或糊精；螯合剂如EDTA；糖如蔗糖、甘露醇、海藻糖或山梨糖醇；形成盐的反荷离子如钠；金属复合物(例如Zn-蛋白复合物)；和/或非离子型表面活性剂如聚乙二醇(PEG)。水性注射悬液可以含有提高悬液粘度的化合物，如羧甲基纤维素钠、山梨糖醇、葡聚糖等。任选地，悬液还可以含有合适的稳定剂或增加化合物溶解度的试剂以允许制备高度浓缩的溶液。另外，可以将活性化合物的悬液制备为合适的油性注射悬液。合适的亲脂溶剂或媒介物包括脂肪油如芝麻油或合成的脂肪酸酯，如乙基cleat或甘油三酸酯或脂质体。
可以例如通过凝聚技术或通过界面聚合作用将活性成分俘获在制备的微胶囊中，例如在胶质投递***(例如脂质体、清蛋白微球、微乳液、纳米颗粒和纳米胶囊)或粗乳液中分别的羟甲基纤维素或明胶微胶囊和聚-(甲基丙烯酸酯)微胶囊。这类技术披露于Remington’s Pharmaceutical Sciences(18th Ed.Mack Printing Company,1990)。可以制备持续释放的制备物。合适的持续释放的制备物的例子包括含多肽的固体疏水性聚合物的半透性基质，该基质以成形制品例如膜或微胶囊的形式。在具体的实施方案中，可以通过在组合物中使用延迟吸收的试剂如例如单硬脂酸铝、明胶或其组合，来产生可注射组合物的延长的吸收。
除了先前描述的组合物以外，免疫缀合物还可以配制为存留(depot)制剂。可以通过植入(例如皮下或肌内)或通过肌内注射来施用这类长期作用的配制物。如此，例如所述免疫缀合物可以与合适的聚合性或疏水材料(例如作为可接受油中的乳液)或离子交换树脂一起配制，或配制为少量可溶的衍生物，例如少量可溶的盐。
可以通过常规的混合、溶解、乳化、包裹、俘获或冻干过程来制备包含本发明的免疫缀合物的药物组合物。可以以常规方式配制药物组合物，其使用一种或多种生理学可接受的、有助于将蛋白质加工成可药学使用的制备物的载体、稀释剂、赋形剂或辅助剂。合适的剂型依赖于选择的施用路径。
可以将免疫缀合物以游离酸或碱、中性或盐形式配制成组合物。药学可接受的盐是基本保留游离酸或碱的生物学活性的盐。这些包括酸加成盐(acid addition salt)，例如与蛋白质性组合物的游离氨基基团形成的那些，或与无机酸(如例如盐酸或磷酸)或与此类有机酸如乙酸、草酸、酒石酸或扁桃酸形成的。与游离羧基基团形成的盐还可以自无机碱如例如氢氧化钠、氢氧化钾、氢氧化铵、氢氧化钙或氢氧化铁衍生；或自这类有机碱如异丙胺、三甲胺、组氨酸或普鲁卡因(procaine)衍生。药物盐倾向于比相应的游离碱形式更可溶于水性溶剂和其它质子溶剂中。
治疗方法和组合物
可以将本文中提供的任一种免疫缀合物用在治疗方法中。本发明的免疫缀合物可用作免疫治疗剂，例如在癌症的治疗中。
对于在治疗方法中的使用，将以与优良医学实践一致的方式配制、给药和施用本发明的免疫缀合物。在此背景中考虑的因素包括待治疗的特定病症、待治疗的特定哺乳动物、个体患者的临床状况、病症的起因、药剂的投递部位、施用方法、施用时间安排以及医学从业人员已知的其它因素。
在一个方面，提供将本发明的免疫缀合物用作药物。在别的方面，提供将本发明的免疫缀合物用于治疗疾病。在某些实施方案中，提供将本发明的免疫缀合物用于治疗方法。在一个实施方案中，本发明提供将如本文中描述的免疫缀合物用于治疗有此需要的个体中的疾病。在某些实施方案中，本发明提供将免疫缀合物用于治疗患疾病的个体的方法，所述方法包括对所述个体施用治疗有效量的免疫缀合物。在某些实施方案中，待治疗的疾病是增殖性病症。在一个具体的实施方案中，所述疾病是癌症。在其它实施方案中，待治疗的疾病是炎性病症。在某些实施方案中，所述方法进一步包括对个体施用治疗有效量的至少一种另外的治疗剂，例如抗癌剂(如果待治疗的疾病是癌症的话)。依照上文任意实施方案的“个体”是哺乳动物，优选是人。
在一个别的方面，本发明提供本发明的免疫缀合物在制造或制备用于治疗有此需要的个体中疾病的药物的用途。在一个实施方案中，所述药物用于治疗疾病的方法，该方法包括对患疾病的个体施用治疗有效量的药物。在某些实施方案中，待治疗的疾病是增殖性病症。在一个具体的实施方案中，所述疾病是癌症。在其它实施方案中，待治疗的疾病是炎性病症。在一个实施方案中，所述方法进一步包括对个体施用治疗有效量的至少一种另外的治疗剂，例如抗癌剂(如果待治疗的疾病是癌症的话)。依照上文任意实施方案的“个体”是哺乳动物，优选是人。
在一个别的方面，本发明提供用于治疗个体中的疾病的方法，包括对所述个体施用治疗有效量的本发明的免疫缀合物。在一个实施方案中，对所述个体施用组合物，其包含药学可接受的形式的本发明的免疫缀合物。在某些实施方案中，待治疗的疾病是增殖性病症。在一个具体的实施方案中，所述疾病是癌症。在其它实施方案中，待治疗的疾病是炎性病症。在某些实施方案中，所述方法进一步包括对个体施用治疗有效量的至少一种另外的治疗剂，例如抗癌剂(如果待治疗的疾病是癌症的话)。依照上文任意实施方案的“个体”是哺乳动物，优选是人。
在某些实施方案中，所述待治疗的疾病是增殖性病症，特别是癌症。癌症的非限制性例子包括膀胱癌、脑癌、头和颈癌、胰腺癌、肺癌、乳腺癌、卵巢癌、子宫癌、***、子宫内膜癌、食道癌、结肠癌、结肠直肠癌、直肠癌、胃癌、***癌、血液癌、皮肤癌、鳞状细胞癌、骨癌和肾癌。其它可使用本发明的免疫缀合物治疗的细胞增殖病症包括但不限于位于以下处的新生物：腹部、骨、***、消化***、肝、胰、腹膜、内分泌腺(肾上腺、副甲状腺、垂体、睾丸、卵巢、胸腺、甲状腺)、眼、头和颈、神经***(中枢和外周)、淋巴***、骨盆、皮肤、软组织、脾、胸部、和泌尿生殖***。还包括癌症前期状况或损伤以及癌症转移。在某些实施方案中，癌症选自下组：肾细胞癌、皮肤癌、肺癌、结肠直肠癌、乳腺癌、脑癌、头和颈癌。在一些实施方案中，特别是当免疫缀合物的效应器模块是IL-10时，待治疗的疾病是炎性病症。炎性病症的非限制性例子包括类风湿性关节炎、银屑病或克罗恩氏病(Crohn’s disease)。熟练技术人员容易地识别在许多情况下，免疫缀合物可能不提供治愈而仅提供部分益处。在一些实施方案中，具有一些益处的生理学变化也被视为治疗有益的。如此，在一些实施方案中，提供生理学变化的免疫缀合物的量被视为“有效量”或“治疗有效量”。需要治疗的受试者、患者或个体通常为哺乳动物，更特定地为人。
本发明的免疫缀合物还可用作诊断试剂。通过使用对效应器模块特异性的二抗，能够容易地检测出免疫缀合物对抗原决定簇的结合。在一个实施方案中，所述二抗和免疫缀合物帮助检测该免疫缀合物对位于细胞或组织表面上的抗原决定簇的结合。
在一些实施方案中，对细胞施用有效量的本发明的免疫缀合物。在其它实施方案中，对个体施用治疗有效量的本发明的免疫缀合物以治疗疾病。
为了预防或治疗疾病，本发明的免疫缀合物的合适剂量(当单独或与一种或多种其它另外的治疗剂组合使用时)将取决于待治疗疾病的类型、施用路径、患者的体重、免疫缀合物的类型、疾病的严重程度和进程、施用免疫缀合物是为了预防还是治疗目的、先前或同时的治疗干预、患者的临床史和对免疫缀合物的响应、以及主治医师的判断。负责施用的从业人员将在任何事件中确定组合物中活性成分的浓度和用于个体受试者的合适剂量。本文中涵盖各种给药方案，包括但不限于，在各个时间点的单次或多次施用、推注施用、和脉冲输注。
所述免疫缀合物适宜地在一次或一系列治疗中施用给患者。根据疾病的类型和严重程度，约1μg/kg至15mg/kg(例如0.1mg/kg–10mg/kg)的免疫缀合物可作为用于患者施用的起始候选剂量，不管是例如通过一次或多次分开的施用，还是通过连续输注。根据上文提及的因素，一种典型的每日剂量的范围可以从约1μg/kg至100mg/kg或更高。对于在数天或更长时间的重复施用，根据状况一般将持续治疗直至发生对疾病症状的期望的抑制。免疫缀合物的一种例示性剂量将在约0.005mg/kg至约10mg/kg的范围内。在其它非限制性例子中，剂量还可包括每次施用从约1微克/kg/体重、约5微克/kg/体重、约10微克/kg/体重、约50微克/kg/体重、约100微克/kg/体重、约200微克/kg/体重、约350微克/kg/体重、约500微克/kg/体重、约1毫克/kg/体重、约5毫克/kg/体重、约10毫克/kg/体重、约50毫克/kg/体重、约100毫克/kg/体重、约200毫克/kg/体重、约350毫克/kg/体重、约500毫克/kg/体重，至约1000mg/kg/体重或更高，以及可从其衍生的任何范围。在可从本文列出的数量衍生的范围的非限制性例子中，基于上文描述的数量，可以施用约5mg/kg/体重至约100mg/kg/体重的范围，约5微克/kg/体重至约500毫克/kg/体重的范围等。如此，可以对患者施用一剂或多剂的约0.5mg/kg、2.0mg/kg、5.0mg/kg或10mg/kg(或其任意组合)。可以间歇地施用这类剂量，例如每周或每3周(例如使得患者接受约2至约20、或例如约6剂的免疫缀合物)。可以施用起始较高的加载剂量继之以一剂或多剂较低剂量。然而，可以使用其它剂量方案。通过常规技术和测定法能容易地监测该疗法的进行。
本发明的免疫缀合物一般将以有效量使用以实现意图的目的。针对治疗或预防疾病状况的用途，以治疗有效量施用或应用本发明的免疫缀合物、或其药物组合物。对治疗有效量的确定完全在本领域技术人员的能力以内，尤其在按照本文中提供的详细公开时。
对于***性施用，能从体外测定法如细胞培养测定法初步估算出治疗有效剂量。然后可以在动物模型中配制剂量以达到包含如在细胞培养中测定的IC50的循环浓度范围。可以将此类信息用于更准确地确定人中的可用剂量。
使用本领域中公知的技术，还能从体外数据例如动物模型估算出初始剂量。本领域中的普通技术人员能容易地基于动物数据优化对人的施用。
可以分别调整剂量量和时间间隔以提供足以维持治疗效果的免疫缀合物的血浆水平。通过注射施用的可用患者剂量的范围为从约0.1至50mg/kg/天，通常约0.5至1mg/kg/天。通过每日施用多次剂量可以实现治疗有效的血浆水平。可以例如通过HPLC测量血浆中的水平。
在局部施用或选择性摄取的情况中，免疫缀合物的有效局部浓度可能不与血浆浓度有关。本领域技术人员将能够优化治疗有效的局部剂量，而无需不必要的实验。
本文中描述的免疫缀合物的治疗有效剂量一般将提供治疗益处，而不导致实质性毒性。能够通过在细胞培养物或实验动物中的标准药学规程来测定免疫缀合物的毒性和治疗功效。可以使用细胞培养测定法和动物研究来测定LD50(对50%的群体致命的剂量)和ED50(在50%的群体中治疗有效的剂量)。毒性和治疗效果之间的剂量比率为治疗指数，其可以表达为LD50/ED50比。优选展现出高治疗指数的免疫缀合物。在一个实施方案中，依照本发明的免疫缀合物展现出高治疗指数。可以将从细胞培养测定法和动物研究获得的数据用来配制适用于人的剂量范围。优选地，剂量处于包含ED50的循环浓度的范围内且有极小或无毒性。根据多种因素，例如采用的剂量形式、利用的施用路径、受试者的状况等可以改变在此范围内的剂量。确切的配制、施用路径和剂量可由各个医师考虑患者的状况而选定(参见，例如Fingl等,1975，于：The Pharmacological Basis of Therapeutics,Ch.1,p.1,通过提述完整并入本文)。
用本发明的免疫缀合物治疗的患者的主治医师将知晓如何及何时终止、中断或调整施用(由于毒性、器官功能障碍等)。与之相反，如果临床应答不适当(排除毒性)，主治医师还将知晓如何将治疗调整至更高水平。在对感兴趣的病症的管理中，施用的剂量的大小将随待治疗状况的严重程度、施用路径等而变。可以例如部分地通过标准的预后评估方法来评估状况的严重程度。另外，剂量以及可能的给药频率也将根据个体患者的年龄、体重和应答而变化。
其它药剂和治疗
本发明的免疫缀合物可以与一种或多种其它药剂在疗法中组合施用。例如，本发明的免疫缀合物可以与治疗一种另外的治疗剂共施用。术语“治疗剂”涵盖施用以治疗需要此类治疗的个体中的症状或疾病的任何药剂。这类另外的治疗剂可以包含任何适用于所治疗的特定适应征的任何活性成分，优选地具有不会彼此不利影响的互补活性的那些活性成分。在某些实施方案中，另外的治疗剂是免疫调控剂、细胞抑制剂、细胞粘着的抑制剂、细胞毒性剂、细胞凋亡的激活剂、或任何增加细胞对细胞凋亡诱导物的敏感性的药剂。在一个具体的实施方案中，另外的治疗剂是抗癌剂，例如微管破坏物、抗代谢物、拓扑异构酶抑制剂、DNA嵌入剂、烷化剂、激素治疗物、激酶抑制剂、受体拮抗剂、肿瘤细胞凋亡的激活剂、或抗血管生成的药剂。
这类其它药剂以对所意图目的有效的量适宜地以组合存在。这类其它药剂的有效量取决于使用的免疫缀合物的量、病症或治疗的类型以及上文所述其它因素。所述免疫缀合物一般以与本文中描述的相同的剂量和施用路径、或以本文中描述的剂量的约1至99%、或以经验/临床上确定为合适的任何剂量和任何路径使用。
上文记载的这类组合疗法涵盖组合施用(其中在同一组合物或分别的组合物中包含两种或更多种治疗剂)和分开施用，在后者的情况中，本发明的免疫缀合物的施用可以在施用另外的治疗剂和/或辅助剂之前、同时和/或之后发生。本发明的免疫缀合物还可以与放射疗法组合使用。
制品
在本发明的另一个方面，提供含有可用于治疗、预防和/或诊断上文描述的病症的材料的制品。所述制品包含容器和容器上或与容器联合的标签或包装插页。合适的容器包括，例如瓶、管形瓶、注射器、IV溶液袋等。所述容器可从多种材料如玻璃或塑料形成。所述容器容纳组合物，其自身或与其它组合物组合对于治疗、预防和/或诊断状况是有效的，并且可以具有无菌的存取口(例如，容器可以是具有由皮下注射针可穿过的塞子的静脉内溶液袋或管形瓶)。组合物中至少一种活性成分是本发明的免疫缀合物。标签或包装插页指示该组合物用于治疗选择的状况。此外，所述制品可以包含(a)其中含有组合物的第一容器，其中所述组合物包含本发明的免疫缀合物；和(b)其中含有组合物的第二容器，其中所述组合物包含另外的细胞毒性剂或其它治疗剂。本发明的这一实施方案中的制品还可以包含包装插页，其指示该组合物可用于治疗特定状况。或者/另外地，所述制品还可以包含第二(或第三)容器，其包含药学可接受的缓冲液，如抑菌性注射用水(BWFI)、磷酸盐缓冲盐水、林格(Ringer)氏溶液和右旋糖溶液。制品可以进一步包含从商业和用户观点看期望的其它材料，包括其它缓冲液、稀释剂、滤器、针、和注射器。
实施例
以下是本发明的方法和组合物的实施例。应理解鉴于上文提供的一般性描述，可以实践各种其他实施方案。
实施例1
通用方法
重组DNA技术
使用标准方法操作DNA，如Sambrook等,Molecular cloning:A laboratorymanual;Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,New York,1989中描述的。依照制造商的用法说明书使用分子生物学试剂。关于人免疫球蛋白的轻链和重链核苷酸序列的一般信息参见：Kabat,E.A.等,(1991)Sequences of Proteins ofImmunological Interest,Fifth Ed.,NIH Publication No91-3242。
DNA测序
通过双链测序来测定DNA序列。
基因合成
在需要的情况下，期望的基因片段通过使用合适的模板进行PCR来生成或由Geneart AG(Regensburg,Germany)通过自动化基因合成从合成的寡核苷酸和PCR产物合成。在确切基因序列不可用的情况下，基于来自最近的同源物的序列设计寡核苷酸引物，并通过RT-PCR从源自合适组织的RNA分离基因。将侧翼为单一限制性内切核酸酶切割位点的基因区段克隆到标准的克隆/测序载体中。从经转化的细菌纯化质粒DNA，并通过UV分光术测定浓度。通过DNA测序确认亚克隆的基因片段的DNA序列。基因片段设计为具有合适的限制性位点以允许亚克隆到相应的表达载体中。所有构建体均设计为具有编码前导肽的5’端DNA序列，该前导肽在真核细胞中将蛋白质靶向分泌。SEQ ID NO8-16给出了例示性前导肽和其编码多核苷酸序列。
制备IL-2Rβγ亚基-Fc融合物以及IL-2Rα亚基Fc融合物
为了研究IL-2受体结合亲和力，生成允许表达异二聚体IL-2受体的工具；使用“突出-入-孔”技术(Merchant等,Nat Biotech.16,677-681(1998))，将IL-2受体的β亚基与工程化以异二聚化的Fc分子(Fc(孔))融合(见SEQ ID NO17和18)。然后，将IL-2受体的γ亚基融合至Fc(突出)变体(见SEQ ID NO19和20)，其与Fc(孔)异二聚化。然后，将此异二聚体Fc融合蛋白用作底物来分析IL-2/IL-2受体相互作用。将IL-2Rα亚基表达为具有AcTev切割位点和Avi His标签(SEQ ID NO21和22)的单体链。将相应的IL-2R亚基在具有血清(对于IL-2Rβγ亚基构建体)和没有血清(对于α亚基构建体)的情况中在HEK EBNA293中瞬时表达。在蛋白A(GE Healthcare)上，接着进行大小排阻层析(GE Healthcare,Superdex200)来纯化IL-2Rβγ亚基构建体。经由His标签在NiNTA柱(Qiagen)上，接着进行大小排阻层析(GEHealthcare,Superdex75)来纯化IL-2Rα亚基。各种受体构建体的氨基酸和相应的核苷酸序列在SEQ ID NO17-22和255-268中给出。
制备免疫缀合物
关于针对FAP的抗原结合模块的生成和亲和力成熟的详情可见于PCT专利申请公开文本No.WO2012/020006所附的实施例中，其通过提述完整并入本文。如本文中描述的，已通过噬菌体展示生成针对FAP的各种抗原结合域，包括在下述实施例中使用的命名为4G8、28H1和4B9的抗原结合域。克隆28H1是一种基于亲本克隆4G8的亲和力成熟的抗体，而克隆4B9是一种基于亲本克隆3F2的亲和力成熟的抗体。本文中使用的称为2B10的抗原结合域针对生腱蛋白C的A2域(TNC A2)。关于针对TNC A2的这种和其它抗原结合模块的详情可见于PCT专利申请公开文本no.WO2012/020038，其通过提述完整并入本文。称为L19、针对纤连蛋白的外域B(EDB)的抗原结合域自PCT公开文本WO2007/128563中描述的L19抗体衍生。本文中使用的称为CH1A1A和CH1A1A98/992F1的抗原结合域针对CEA，且在PCT专利申请no.PCT/EP2012/053390中以更多细节描述，该申请通过提述完整并入本文。
在下述一些实施例中用作效应器模块的IL-2四重突变体(qm)在PCT专利申请no.PCT/EP2012/051991中详细描述，其通过提述完整并入本文。简言之，IL-2qm的特征在于以下突变：
1.T3A-敲除预测的O-糖基化位点
2.F42A-敲除IL-2/IL-2Rα相互作用
3.Y45A-敲除IL-2/IL-2Rα相互作用
4.L72G-敲除IL-2/IL-2Rα相互作用
5.C125A-避免二硫化物桥接的IL-2二聚体的突变
在真核细胞(如CHO或HEK293细胞)中表达IL-2qm多肽或包含其的免疫缀合物时，选择T3A突变来消除O-糖基化位点，并获得具有较高同质性和纯度的蛋白质产物。选择3种突变F42A、Y45A和L72G来干扰对CD25(IL-2受体的α亚基)的结合。降低的或消除的CD25结合导致降低的激活诱导的细胞死亡(AICD)、缺乏调节性T细胞的优先激活、以及降低的毒性(如EP11153964.9中描述的)。
通过基因合成和/或经典分子生物学技术生成DNA序列，并亚克隆到哺乳动物表达载体中在MPSV启动子的控制下并在合成的多聚A位点上游，每个载体携带EBV OriP序列。使用磷酸钙转染通过用哺乳动物表达载体共转染指数生长的HEK293-EBNA细胞生成下文实施例中应用的免疫缀合物。或者，通过聚乙烯亚胺(PEI)用相应的表达载体转染在悬浮液中生长的HEK293细胞。或者，将稳定转染的CHO细胞集合或CHO细胞克隆用于无血清培养基中的生产。随后，从上清液纯化IgG-细胞因子融合蛋白。简言之，用在20mM磷酸钠、20mM柠檬酸钠pH7.5中平衡的蛋白A(HiTrap ProtA,GE Healthcare)通过一个亲和步骤来纯化IgG-细胞因子融合蛋白。在加载上清液后，首先用20mM磷酸钠、20mM柠檬酸钠pH7.5清洗柱，接着用13.3mM磷酸钠、20mM柠檬酸钠、500mM氯化钠pH5.45清洗。将IgG-细胞因子融合蛋白用20mM柠檬酸钠、100mM氯化钠、100mM甘氨酸pH3洗脱。将级分中和、合并，并通过大小排阻层析(HiLoad16/60Superdex200,GE Healthcare)纯化在最终配制缓冲液中：25mM磷酸钾、125mM氯化钠、100mM甘氨酸pH6.7。下文对选定的构建体给出了例示性的详细纯化规程和结果。通过测量280nm处的光密度(OD)测定纯化的蛋白质样品的蛋白质浓度，其使用基于氨基酸序列计算的摩尔消光系数进行。通过在存在和缺乏还原剂(5mM1,4-二硫苏糖醇)情况下的SDS-PAGE并用考马斯蓝(SimpleBlueTM SafeStain,Invitrogen)染色来分析免疫缀合物的纯度和分子量。依照制造商的说明书使用预制凝胶***(Invitrogen)(4-20%Tris-甘氨酸凝胶或3-12%Bis-Tris)。在2mM MOPS、150mM NaCl、0.02%NaN3pH7.3运行缓冲液中于25℃使用Superdex20010/300GL分析性大小排阻柱(GE Healthcare)分析免疫缀合物样品的聚集物含量。在通过用肽-N糖苷酶F(Roche Molecular Biochemicals)酶促处理除去N-聚糖后，还原的抗体轻链和重链的氨基酸主链的完整性可通过NanoElectrosprayQ-TOF质谱术验证。如下文描述的，通过MALDI TOF-MS分析附接于免疫缀合物Fc域的寡糖。通过PNGaseF消化从免疫缀合物酶促释放寡糖。直接制备含有释放寡糖的所得消化物溶液以进行MALDI TOF-MS分析，或者在用于MALDI TOF-MS分析的样品制备前进一步用EndoH糖苷酶消化。
实施例2
基于FAP抗体4G8、28H1和4B9生成FAP靶向性IgG-IL-2qm融合蛋白，其中将一个单一IL-2四重突变体(qm)融合至一条异二聚体重链的C端，如图2A中显示的。经由二价抗体Fab区实现对选择性表达FAP的肿瘤基质的靶向(亲合力效应)。通过应用突出-入-孔技术实现导致单一IL-2四重突变体存在的异二聚化。为了使异二聚体IgG-细胞因子融合物的生成最小化，将细胞因子经由(G4S)3或G4-(SG4)2接头融合至含有突出的IgG重链的C端(缺失C端Lys残基)。该抗体-细胞因子融合物具有IgG样特性。为了降低FcγR结合/效应器功能并防止FcR共激活，将P329G L234A L235A(LALA)突变引入Fc域。这些免疫缀合物的序列在SEQID NO193、269和205(具有(G4S)3接头的28H1)、SEQ ID NO193、195和205(具有G4-(SG4)2接头的28H1)、SEQ ID NO201、203和205(具有G4-(SG4)2接头的4G8)、SEQ ID NO207、209和211(具有G4-(SG4)2接头的4B9)、SEQ ID NO207、271和211(具有(G4S)3接头的4B9)中给出。
另外，生成基于抗CEA抗体CH1A1A98/992F1的CEA靶向性IgG-IL-2qm融合蛋白、其中的IgG不结合指定靶物的对照DP47GS非靶向性IgG-IL-2qm融合蛋白、以及靶向生腱蛋白C的A2域的、基于肿瘤基质特异性的2B10的IgG-IL-2qm融合蛋白。这些免疫缀合物的序列在SEQ ID NO275、281和283(具有G4-(SG4)2接头的CH1A1A98/992F1)、SEQ ID NO277、281和283(具有(G4S)3接头的CH1A1A98/992F1)、SEQ ID NO219、221和225(具有G4-(SG4)2接头的DP47GS)、SEQ ID NO219、289和225(具有(G4S)3接头的DP47GS)、SEQ ID NO285、287和239(具有(G4S)3接头的2B10)中给出。通过在HEK293EBNA细胞中瞬时表达生成构建体，并如上文描述的那样进行纯化。图3至9显示纯化的例示性层析谱和洗脱概况(A、B)以及最终纯化的构建体的分析性SDS-PAGE和大小排阻层析(C、D)。瞬时表达产率为42mg/L(对于基于4G8的)，20mg/L(对于基于28H1的)，10mg/L(对于基于4B9的)，5.3mg/L(对于基于CH1A1A98/992F1的)，36.7mg/L(对于基于2B10的)，和13.8mg/L(对于基于DP47GS的IgG-IL-2qm免疫缀合物)。
另外，生成基于28H1的FAP靶向性IgG-IL-15免疫缀合物，其序列在SEQ ID NO193、199和205中给出。在IL-15多肽序列中，第53位的谷氨酸残基被丙氨酸替换以降低对IL-15受体α亚基的结合，且第79位的天冬酰胺残基被丙氨酸替换以消除糖基化。将IgG-IL-15融合蛋白通过瞬时表达生成并纯化，如上文描述的。
FAP结合亲和力
相比于相应的未修饰的IgG抗体，在Biacore仪上通过表面等离振子共振(SPR)测定基于4G8和28H1抗FAP抗体的IgG-IL-2qm免疫缀合物的FAP结合活性。简言之，将抗His抗体(Penta-His,Qiagen34660)在CM5芯片上固定化以捕获10nM带His标签的人FAP(20秒)。温度为25℃并将HBS-EP用作缓冲液。分析物浓度以50μl/分的流速从50nM降至0.05nM(结合：300秒，解离：900秒，用10mM甘氨酸pH2的再生：60秒)。基于1:1结合模型、RI=0、R最大=局部(由于捕获形式所致)实施拟合。下表给出了估测的表观二价亲和力(pM亲合力)，如通过用1:1结合、RI=0、R最大=局部拟合的SPR测定的。
Hu FAP
4G8IgG-IL-2qm 100pM
4G8IgG 50pM
28H1IgG-IL-2qm 175pM
28H1IgG 200pM
该数据显示，在方法的误差内，与相应的未修饰的抗体相比，对人FAP的亲和力对于基于28H1的免疫缀合物得到保留，或者对于基于4G8的免疫缀合物而言仅稍微降低。
类似地，通过SPR在25℃测定4B9IgG-IL-2qm(16pM)、CH1A1A98/992F1IgG-IL-2qm(400pM)、CH1A1A98/992F1IgG-IL-2wt(见实施例4；470pM)和2B10IgG-IL-2qm(150pM，对300pM(对于未缀合的2B10IgG))分别对人FAP、CEA和TNC A2的亲和力(KD)。还分别确认4B9和2B10抗体对人、鼠和猕猴FAP或TNC A2的交叉反应性。
随后，与PCT专利申请no.PCT/EP2012/051991中描述的Fab-IL-2qm-Fab免疫缀合物形式直接比较，通过表面等离振子共振(SPR)测定基于4G8和28H1的IgG-IL-2qm免疫缀合物对IL-2Rβγ异二聚体和IL-2Rα亚基的亲和力。简言之，将配体(人IL-2Rα亚基或人IL-2Rβγ异二聚体)在CM5芯片上固定化。然后，在25℃在HBS-EP缓冲液中以范围从300nM降至1.2nM(1:3稀释)的浓度将基于4G8和28H1的IgG-IL-2qm免疫缀合物或用于比较的基于4G8和28H1的Fab-IL-2qm-Fab免疫缀合物作为分析物应用于芯片。流速为30μl/分，并应用以下条件：结合：180秒，解离：300秒，和再生：对于IL-2Rβγ异二聚体用3M MgCl2进行2次30秒，对于IL-2Rα亚基用50mM NaOH进行10秒。将1:1结合用于拟合(对于IL-2Rβγ，1:1结合RI≠0，R最大=局部，表观KD，对于IL-2Rα，1:1结合RI=0，R最大=局部)。相应的KD值在下表给出。
表观KD[nM] Hu IL-2RβγHu IL-2Rα
4G8IgG-IL-2qm 5.9无结合
4G8Fab-IL-2qm-Fab 10.4无结合
28H1IgG-IL-2qm 6.2无结合
28H1Fab-IL-2qm-Fab 11.4无结合
数据显示，基于4G8和28H1的IgG-IL-2qm免疫缀合物以至少与Fab-IL-2qm-Fab免疫缀合物一样好的亲和力结合IL-2Rβγ异二聚体，而它们由于引入了干扰CD25结合的突变并不结合IL-2Rα亚基。相比于相应的Fab-IL-2qm-Fab免疫缀合物，IgG-IL-2qm融合蛋白的亲和力在方法的误差内似乎略微增强。
类似地，通过SPR在25℃测定包含IL-2wt(见实施例4)或IL-2qm的其它构建体(4B9、DP47GS、2B10、CH1A1A98/992F1)对IL-2Rβγ异二聚体和IL-2Rα亚基的亲和力。对于所有构建体，对人IL-2Rβγ异二聚体的表观KD介于6和12nM之间(不管构建体是包含IL-2wt或是包含IL-2qm)，而仅包含IL-2wt的构建体完全结合IL-2Rα亚基(对人IL-2Rα的KD为约20nM)。
用IgG-细胞因子免疫缀合物的生物学活性测定法
与商品化的IL-2(阿地白介素,Novartis/Chiron)和/或EP11153964.9中描述的Fab-IL-2-Fab免疫缀合物相比较，在数种细胞测定法中研究基于4G8的FAP靶向性IgG-IL-2qm融合物的生物学活性。
对FAP表达细胞的结合
通过FACS测量基于4G8的FAP靶向性IgG-IL-2qm免疫缀合物对稳定转染的HEK293细胞上表达的人FAP的结合。简言之，将每孔250000个细胞与指示浓度的免疫缀合物在圆底96孔板中于4℃一起温育30分钟，并用PBS/0.1%BSA清洗1次。在与缀合有FITC的AffiniPureF(ab’)2片段山羊抗人F(ab’)2特异性(Jackson Immuno Research Lab#109-096-097，工作溶液：在PBS/0.1%BSA中以1:20稀释，新鲜制备)在4℃一起温育30分钟后，使用FACSCantoII(软件FACS Diva)检测结合的免疫缀合物。结果显示于图10。数据显示IgG-IL-2qm免疫缀合物以0.9nM的EC50值(其与相应的基于4G8的Fab-IL-2qm-Fab构建体(0.7nM)相当)结合表达FAP的细胞。
NK细胞(溶液中)的IFN-γ释放
随后，研究基于4G8的FAP靶向性IgG-IL-2qm免疫缀合物对NK92细胞的IFN-γ释放的诱导，通过激活IL-2Rβγ信号传导诱导。简言之，将经IL-2饥饿的NK92细胞(100000个细胞/孔，在96-U孔板中)与不同浓度的IL-2免疫缀合物(包含四重突变体IL-2)在NK培养基(来自Invitrogen(#22561-021)的MEM alpha，其补充有10%FCS、10%马血清、0.1mM2-巯基乙醇、0.2mM肌醇和0.02mM叶酸)中一起温育24小时。收获上清液并使用来自BectonDickinson的抗人IFN-γELISA试剂盒II(#550612)分析IFN-γ释放。阿地白介素(Novartis)和基于28H1的Fab-IL-2qm-Fab充当IL-2介导的细胞激活的阳性对照。图11显示，基于4G8的FAP靶向性IgG-IL-2qm免疫缀合物在诱导IFN-γ释放中与亲和力成熟的基于28H1的Fab-IL-2qm-Fab免疫缀合物同等有效。
STAT5磷酸化测定法
在最后一组实验中，相比于基于28H1的Fab-IL-2-Fab和Fab-IL-2qm-Fab免疫缀合物以及阿地白介素，我们对来自人PBMC的人NK细胞、CD4+T细胞、CD8+T细胞和T调节细胞研究了基于4G8的FAP靶向性IgG-IL-2qm免疫缀合物对STAT5磷酸化诱导的影响。简言之，将来自健康志愿者的血液采集到含肝素的注射器中并分离PBMC。用指定的免疫缀合物以指定的浓度或用阿地白介素(Novartis)作为对照处理PBMC。在37℃温育20分钟后，将PBMC用预热的Cytofix缓冲液(Becton Dickinson#554655)在37℃固定10分钟，接着用Phosflow Perm缓冲液III(Becton Dickinson#558050)在4℃透化30分钟。将细胞用含0.1%BSA的PBS清洗2次，接着使用流式细胞术抗体的混合物实施FACS染色以检测不同细胞群体和STAT5的磷酸化。使用FACSCantoII及来自Becton Dickinson的HTS分析样品。NK细胞限定为CD3-CD56+，CD8阳性T细胞限定为CD3+CD8+，CD4阳性T细胞限定为CD4+CD25-CD127+，且T调节细胞限定为CD4+CD25+FoxP3+。对于显示无或非常低的CD25表达的NK细胞和CD8+T细胞(意味着主要经由IL-2Rβγ异二聚体介导IL-2R信号传导)，结果显示基于4G8的IgG-IL-2qm免疫缀合物在诱导STAT5磷酸化中的效力比阿地白介素低<10倍，而比基于28H1的Fab-IL-2-Fab和Fab-IL-2qm-Fab免疫缀合物的效力稍高。在刺激后显示CD25快速上调的CD4+T细胞上，基于4G8的IgG-IL-2qm免疫缀合物没有28H1Fab-IL-2-Fab免疫缀合物有效力，但比28H1Fab-IL-2qm-Fab免疫缀合物的效力稍高，且在饱和浓度仍显示与阿地白介素和28H1Fab-IL-2-Fab相当的IL-2R信号传导诱导。这与T调节细胞形成对比，其中基于4G8的IgG-IL-2qm免疫缀合物的效力相比于Fab-IL-2-Fab免疫缀合物显著降低，这是由于T调节细胞上的高CD25表达以及基于4G8的IgG-IL-2qm免疫缀合物对CD25的低结合亲和力所致。由于消除基于4G8的IgG-IL-2qm免疫缀合物中的CD25结合，在IL-2R信号传导在CD25阴性效应细胞上经由IL-2Rβγ异二聚体激活的浓度，T调节细胞中的IL-2信号传导仅经由IL-2Rβγ异二聚体激活。总之，此处描述的基于4G8的IgG-IL-2qm免疫缀合物能通过IL-2Rβγ异二聚体激活IL-2R信号传导，但不导致T调节细胞相对于其它效应细胞的优先刺激。这些实验的结果显示于图12。
2B10IgG-IL-2qm对TNC A2表达细胞的结合
通过FACS测量基于2B10的TNC A2靶向性IgG-IL-2qm免疫缀合物对U87MG细胞上表达的人TNC A2的结合。简言之，将每孔200000个细胞与指定浓度的免疫缀合物在圆底96孔板中于4℃温育30min，并用PBS/0.1%BSA清洗2次。在与缀合有FITC的AffiniPure F(ab’)2片段山羊抗人IgG Fcγ特异性(Jackson Immuno Research Lab#109-096-098，工作溶液：在PBS/0.1%BSA中以1:20稀释，新鲜制备)在4℃一起温育30分钟后，使用FACS CantoII(软件FACS Diva)检测结合的免疫缀合物。结果显示于图13。数据显示，2B10IgG-IL-2qm免疫缀合物与相应未缀合的IgG一样好地结合表达TNC A2的U87MG细胞。
IgG-IL-2免疫缀合物对NK92细胞增殖的诱导
测试2B10IgG-IL-2qm、CH1A1A98/992F1IgG-IL-2qm、CH1A1A98/992F1IgG-IL-2wt、4B9IgG-IL-2qm和4B9IgG-IL-2wt免疫缀合物诱导NK92细胞增殖的能力。对于增殖测定法，将NK92细胞在无IL-2的培养基中饥饿2小时，以10000细胞/孔接种到平底96孔板中，然后在湿润的培养箱中在IL-2免疫缀合物的存在下于37℃、5%CO2温育3天。3天后，使用来自Promega的CellTiter-Glo发光细胞存活力测定(#G7571/2/3)测量细胞裂解物的ATP含量。设定1.1mg/ml的阿地白介素(Novartis)浓度为100%增殖以及没有IL-2刺激的未处理细胞为0%增殖，计算生长百分比。结果显示于图14和15。数据显示，所有构建体均能诱导NK92细胞增殖，其中基于CH1A1A的构建体比2B10IgG-IL-2qm免疫缀合物更具活性，而包含IL-2wt的构建体比相应的具有IL-2qm的构建体更具活性。
实施例3
一般地，引入几乎完全消除人IgG1抗体的FcγR相互作用的P329G LALA突变(参见欧洲专利申请no.EP11160251.2，通过提述完整并入本文中)以降低FcγR结合/效应器功能，如此在与FcγR信号传导共激活相应的细胞因子受体时阻止过度的细胞因子释放。在特定的情况，例如当抗体靶向高度肿瘤特异性抗原时，Fc效应器功能可以通过使用未修饰的IgG Fc域得到保留，或者甚至可以经由IgG Fc域的糖工程化进一步增强。
作为一个其例子，我们生成了CEA靶向性IgG-IL-2qm免疫缀合物，其中基于抗CEA抗体克隆CH1A1A，将一个单一的IL-2四重突变体经由(SG4)3-接头融合至一条异二聚体重链的C端。在此免疫缀合物中，不包含P329G LALA突变(见SEQ ID NO227、229和231的序列)。将该免疫缀合物表达并纯化为人野生型IgG-或糖工程化IgG-IL-2qm融合蛋白，如下文描述的。
(糖工程化的)IgG-IL-2qm免疫缀合物的制备
通过用哺乳动物抗体表达载体共转染HEK293-EBNA细胞来生成基于CH1A1A的CEA靶向性IgG-IL-2qm免疫缀合物。通过磷酸钙方法转染指数生长的HEK293-EBNA细胞。或者，通过聚乙烯亚胺转染在悬浮液中生长的HEK293细胞。为了生成未修饰的未糖工程化的IgG-IL-2qm免疫缀合物，仅用抗体重链和轻链表达载体以1:1比率转染细胞(其中抗体重链载体是两种载体的1:1混合物：具有效应器模块的重链的载体，和没有效应器模块的重链的载体)。
为了生成糖工程化的CEA靶向性IgG-IL-2qm免疫缀合物，以4:4:1:1的比率将细胞用两种额外的质粒共转染，一种用于表达GnTIII融合多肽(GnT-III表达载体)，而一种用于甘露糖苷酶II表达(高尔基体甘露糖苷酶II表达载体)。使用补充有10%FCS的DMEM培养基将细胞作为粘附单层培养物在T烧瓶中培养，当其为50至80%汇合时进行转染。对于T150***转染，在25ml补充有FCS的DMEM培养基(最终10%v/v)中转染前24小时接种1500万个细胞，并将细胞置于培养箱中在37℃以5%CO2气氛过夜。对于每个要转染的T150烧瓶，制备DNA、CaCl2和水的溶液，其通过混合在轻链和重链表达载体之间等分的94μg总质粒载体DNA，至终体积469μl的水和469μl的1M CaCl2溶液进行。向此溶液添加938μl50mM HEPES、280mMNaCl、1.5mM Na2HPO4溶液pH7.05，立即混合10秒，并在室温保持静置20秒。将悬液用10ml补充有2%FCS的DMEM稀释，并添加到T150烧瓶，替换已有培养基。然后再添加13ml转染培养基。将细胞在37℃、5%CO2温育约17至20小时，接着将培养基用25ml DMEM、10%FCS替换。在培养基更换后约7天，通过以210x g离心15分钟收获该条件化的培养基。将溶液无菌过滤(0.22μm滤器)并以终浓度0.01%w/v添加叠氮化钠，于4℃保存。
通过使用蛋白A亲和层析的亲和层析，继之以在HiLoad Superdex200柱(GEHealthcare)上的大小排阻层析步骤来从细胞培养上清液纯化分泌性野生型或糖工程化CEA IgG-IL-2qm免疫缀合物，如上文描述的。如上文描述的，分析蛋白浓度、纯度、分子量、聚集物含量和完整性。
对(糖工程化的)IgG-IL-2qm免疫缀合物的寡糖结构分析
为了测定含岩藻糖的和非岩藻糖基化的寡糖结构的相对比率，通过MALDI TOF质谱术分析纯化的免疫缀合物材料释放的聚糖。将免疫缀合物样品(约50μg)与5mU N-糖苷酶F(QAbio;PNGaseF:E-PNG01)在2mM Tris,pH7.0中于37℃过夜温育，以从蛋白质主链释放出寡糖。对于聚糖的脱氨基化，添加乙酸至终浓度为150mM，并在37℃温育1小时。对于通过MALDI TOF质谱术的分析，将2μL样品在MALDI靶物上与2μL DHB基质溶液(以4mg/ml溶解于50%乙醇/5mM NaCl中的2,5-二羟基苯甲酸[Bruker Daltonics#201346])混合并用MALDITOF质谱仪Autoflex II仪器(Bruker Daltonics)分析。常规地，记录50-300个射击(shot)并总计到单个实验中。通过Flex分析软件(Bruker Daltonics)评估获得的光谱，并测定所检测的每个峰的质量。随后，通过比较对相应结构计算的质量和理论预期的质量来将峰归入含岩藻糖的或非岩藻糖基化的碳水化合物结构(例如在有和无岩藻糖的情况中分别为复合、杂合和寡甘露糖或高甘露糖)。
为了测定杂合结构的比率，将抗体样品用N-糖苷酶F和内切糖苷酶H[QAbio;EndoH:E-EH02]相伴消化。N-糖苷酶F从蛋白质主链释放所有N-连接的聚糖结构(复合、杂合和寡甘露糖和高甘露糖结构)，而内切糖苷酶H切割另外在聚糖还原端的两个乙酰葡糖胺(GlcNAc)残基之间所有杂合型聚糖。随后，以与上文对经N-糖苷酶F消化的样品描述的相同方式来处理该消化物并通过MALDI TOF质谱术分析。通过比较来自N-糖苷酶F消化物和组合的N-糖苷酶F/内切H消化物的模式，将特定碳水化合物结构的信号的降低程度用于估测杂合结构的相对含量。每种碳水化合物结构的相对量自各结构的峰高度与所有检测的寡糖的峰高度的总和的比率来计算。岩藻糖的量是含岩藻糖的结构相对于在经N-糖苷酶F处理的样品中鉴定的所有碳水化合物结构(例如复合、杂合和寡甘露糖和高甘露糖结构)的百分比。非岩藻糖基化的程度是缺乏岩藻糖的结构相对于在经N-糖苷酶F处理的样品中鉴定的所有碳水化合物(例如复合、杂合和寡甘露糖和高甘露糖结构)的百分比。
抗体依赖性细胞介导的细胞毒性测定法
在ADCC测定法中比较野生型和糖工程化的CEA靶向性CH1A1AIgG-IL-2qm免疫缀合物介导抗体介导的细胞毒性的潜力。简言之，收集过表达CEA的A549人肿瘤细胞作为靶细胞，清洗并重悬于培养基中，用新鲜制备的钙黄绿素AM(Molecular Probes)在37℃染色30min，清洗3次，计数并稀释至300000个细胞/ml。将此悬液转移至圆底96孔板(30000个细胞/孔)，添加相应的免疫缀合物稀释物，并温育10min以允许所测试的免疫缀合物在与效应细胞接触前与该细胞结合。效应器对靶物比率对于新鲜分离的PBMC为25对1。实施共温育4小时。使用两种不同的读出***：被攻击细胞崩解后乳酸脱氢酶(LDH)对上清液的释放，和钙黄绿素在剩余活细胞中的保留。收集来自共培养上清液的LDH，并用LDH检测试剂盒(Roche Applied Science)分析。用ELISA吸光度读数器测量通过LDH酶的底物转化(SoftMaxPro软件，参照波长：490nm对650nm)。在从成团细胞移去剩余上清液，在裂解前在PBS中的一个清洗步骤，并通过硼酸盐缓冲液(50mM硼酸盐，0.1%Triton)固定细胞后，在荧光阅读器(Wallac VICTOR31420Multilabel COUNTER(Perkin Elmer))中分析活细胞中的剩余钙黄绿素。
图16显示基于LDH检测的结果。基于钙黄绿素保留获得类似的结果(未显示)。两种构建体均能介导ADCC，其中糖工程化的构建体具有与相应的糖工程化的未缀合的IgG类似的活性。如预期的，相比于糖工程化的构建体，未糖工程化的构建体显示降低的活性。
实施例4
生成基于28H1或4B9的FAP靶向性、基于CH1A1A98/992F1的CEA靶向性和基于DP47GS的非靶向性IgG-IL-2免疫缀合物，其中一个单一的野生型IL-2多肽融合至一条异二聚体重链的C端。通过应用突出-入-孔技术实现产生具有单一IL-2模块的免疫缀合物的异二聚化。为了使同二聚体IgG-IL-2融合蛋白的生成最小化，将细胞因子经由G4-(SG4)2或(G4S)3接头融合至含突出的重链(缺失C端Lys残基)。这些免疫缀合物的序列在SEQ IDNO193、197和205(具有G4-(SG4)2接头的28H1)、SEQ ID NO207、273和211(具有(G4S)3接头的4B9)、SEQ ID NO277、279和283(具有(G4S)3接头的CH1A1A98/992F1)、SEQ ID NO219、223和225(具有G4-(SG4)2接头的DP47GS)、SEQ ID NO219、293和225(具有(G4S)3接头的DP47GS)中给出。抗体-细胞因子融合物具有IgG样特性。为了降低FcγR结合/效应器功能并阻止FcR共激活，在Fc域中引入P329G LALA突变。依照上文描述的方法纯化两种构建体。最终纯化通过大小排阻层析(HiLoad26/60Superdex200,GE Healthcare)在最终配制缓冲液20mM组氨酸、140mM氯化钠pH6中完成。图17至20显示纯化的相应层析谱和洗脱概况(A,B)以及最终纯化构建体的分析性SDS-PAGE和大小排阻层析(C,D)。产率为15.6mg/L（对于非靶向性DP47GSIgG-IL-2免疫缀合物），26.7mg/ml（对于28H1IgG-IL-2免疫缀合物），4.6mg/L（对于CH1A1A98/992F1IgG-IL-2免疫缀合物），和11mg/L（对于4B9IgG-IL-2免疫缀合物）。
随后，如上文描述的那样(见实施例2)通过SPR测定其对FAP的结合特性（相应地缺乏结合）、以及对IL-2Rβγ和IL-2Rα链的结合。还研究了对免疫效应细胞群体的细胞活性和体内药效学作用。
实施例5
构建基于4G8的FAP靶向性以及基于2B10的TNC A2靶向性IgG-IL-10免疫缀合物，其通过将两种不同的IL-10细胞因子形式融合至包含孔修饰的异二聚体IgG重链的C端：单链IL-10，其中(G4S)420聚物接头***两个IL-10分子之间，或工程化的单体IL-10(Josephson等,J Biol Chem275,13552-7(2000))。两种分子均经由(G4S)315聚物接头融合至包含孔修饰的重链的C端，其中缺失C端Lys残基。通过应用突出-入-孔技术实现产生仅一条携带IL-10模块的重链的异二聚化。IgG-细胞因子融合物具有IgG样特性。为了降低FcγR结合/效应器功能并阻止FcR共激活，在免疫缀合物的Fc域中引入P329G LALA突变。相应构建体的序列在SEQ ID NO233、235和239(具有scIL-10的2B10)、SEQ ID NO233、237和239(具有单体IL-10“IL-10M1”的2B10)、SEQ ID NO241、243和205(具有scIL-10的4G8)、SEQ IDNO241、245和205(具有IL-10M1的4G8)中给出。所有这些免疫缀合物均依照上文描述的方法纯化。随后，通过SPR使用ProteOn XPR36生物传感器来测定其分别对FAP或TNC A2的结合特性以及其对人IL-10R1的亲和力。简言之，将靶物FAP或TNC A2以及人IL-10R1以垂直取向固定化于传感器芯片表面上(FAP通过标准胺偶联，TNC A2和人IL-10R1(均经由C端avi标签生物素化)通过Neutravidin捕获)。随后，以包括0浓度在内的6种不同浓度注射IgG-IL-10免疫缀合物作为水平取向的分析物。在双重参照后，将传感图拟合至1:1相互作用模型以测定动力学速率常数和亲和力。来自分析性SDS PAGE分析和基于SPR的对靶抗原以及IL-10受体的亲和力测定的结果显示于图21和22。数据显示，免疫缀合物分别以52或26pM的KD值结合TNC A2或FAP，而对IL-10受体的KD值为520和815pM。
实施例6
依照上文描述的方法，生成并表达IgG-细胞因子融合蛋白，其由在用细胞因子模块替换具有突出修饰的IgG重链的第二Fab区的情况中针对FAP的一个单一的基于28H1或基于4B9的Fab区经由(G4S)n接头(n=1)融合至包含孔修饰的Fc域亚基的N端组成。关于此免疫缀合物形式(也称为“1+1”形式)的示意图，见图2C。使用的细胞因子模块是上文和PCT专利申请no.PCT/EP2012/051991(见SEQ ID NO:3)中描述的IL-2四重突变体、IL-7和IFN-α。包含经由接头肽融合至Fc域亚基(包含突出修饰)N末端的细胞因子模块的融合多肽的相应序列在SEQ ID NO247(包含四重突变体IL-2)、249(包含IL-7)、和251(包含IFN-α)中给出。在这些构建体中，经由高亲和力单价Fab区实现免疫缀合物的靶向。在使用单价结合剂可降低抗原内在化的情况中可推荐该形式。如上文描述的，将该免疫缀合物生成，纯化并分析。对于包含IL-2qm或IL-7的构建体，在单次运行中组合蛋白A亲和层析和大小排阻层析。将20mM组氨酸、140mM NaCl pH6.0用作大小排阻层析和最终配制缓冲液。图23-26显示了纯化的洗脱概况和层析谱(A、B)以及最终纯化构建体的分析性SDS-PAGE和大小排阻层析(C、D)。产率为11mg/L（对于4B9“1+1”IgG-IL-2qm），43mg/ml（对于28H1“1+1”IgG-IL-2qm），20.5mg/L（对于4B9“1+1”IgG-IL-7），和10.5mg/L（对于4B9“1+1”IgG-IFN-α构建体）。
相比于IgG-IL-2qm免疫缀合物，测试了包含IL-2qm的“1+1”构建体诱导NK细胞增殖的能力。将NK-92细胞饥饿2小时，接着以10000个细胞/孔接种到96孔黑色平坦透明底板中。将免疫缀合物滴定到接种的NK-92细胞上。在72小时后，测量ATP含量以测定存活细胞数，其依照制造商说明书使用“CellTiter-Glo发光细胞存活力测定法”试剂盒(Promega)进行。图27显示“1+1”构建体能诱导NK-92细胞增殖，其比相应的IgG-IL-2qm构建体的活性稍低。
相比于IgG-IL-2免疫缀合物，测试了包含IL-2qm或IL-7的基于4B9的“1+1”构建体诱导T细胞增殖的能力。使用Histopaque-1077(Sigma Diagnostics Inc.,St.Louis,MO,USA)制备外周血单个核细胞(PBMC)。简言之，将来自血沉棕黄层(buffy coat)的血液用无钙和镁的PBS以5:1稀释，并在Histopaque-1077上分层。将梯度在室温(RT)以450x g离心30min而无中断。收集含PBMC的界面并用PBS清洗3次(350x g，接着在RT以300x g持续10min)。将PBMC用1μg/ml PHA-M(Sigma Aldrich#L8902)过夜预刺激，接着将其用100nMCFSE(羧基荧光素琥珀酰亚胺酯)在37℃标记15min。用20ml培养基清洗细胞，接着在37℃回收标记的PBMC达30min。清洗细胞，计数，并将100000个细胞接种到96孔U形底板中。将免疫缀合物滴定到接种的细胞上，温育时间达6天。其后，清洗细胞，针对合适的细胞表面标志物染色，并通过FACS使用BD FACSCantoII分析。CD4T细胞限定为CD3+/CD8-，而CD8T细胞限定为CD3+/CD8+。
图28显示包含IL-2qm或IL-7的“1+1”构建体能诱导PHA激活的CD4(A)和CD8T细胞(B)增殖。对于NK细胞，包含IL-2qm的“1+1”构建体的活性稍微低于IgG-IL-2qm构建体的活性。
相比于Roferon A(Roche)，测试了包含IFN-α的基于4B9的“1+1”构建体抑制Daudi细胞增殖的能力。简言之，将Daudi细胞用100nM CFSE标记并接种到96孔U形底板中(50’000个细胞/孔)。以指定浓度添加分子，接着在37℃温育3天。通过分析CFSE稀释测量增殖，通过使用生命/死亡染剂将死亡细胞从分析排除。
图29显示构建体能至少与Roferon A一样有效力地抑制Daudi细胞的增殖。
实施例7
对于包含野生型或四重突变体IL-2的FAP靶向性IgG-IL2免疫缀合物以及包含野生型或四重突变体IL-2的非靶向性IgG-IL-2免疫缀合物，在无肿瘤的免疫活性129小鼠中实施单剂药动学(PK)研究。
将实验开始时8-9周龄的雌性129小鼠(Harlan,United Kingdom)在无特定病原体的条件下以12小时光照/12小时黑暗的每日周期依照承诺的原则(GV-Solas;Felasa;TierschG)维持。实验用研究方案得到地方政府审查并批准(P2008016)。在到达后，将动物维持1周以适应新环境并进行观察。定期实施连续的健康监测。
对小鼠i.v.注射一次FAP靶向性的28H1IgG-IL2wt(2.5mg/kg)或28H1IgG-IL2qm(5mg/kg)，或非靶向性的DP47GS IgG-IL2wt(5mg/kg)或DP47GS IgG-IL2qm(5mg/kg)。所有小鼠均用200μl合适溶液i.v.注射。为了获得每200μl合适量的免疫缀合物，在必要时将储备溶液用PBS稀释。
在1、8、24、48、72、96小时时对小鼠取血，并在其后每2天取血，持续3周。提取血清，并于-20℃贮存，直至ELISA分析。使用ELISA测定血清中的免疫缀合物浓度以量化IL2-免疫缀合物抗体(Roche-Penzberg)。使用405nm的测量波长和492nm的参照波长测量吸收(VersaMax可调微板读板仪,Molecular Devices)。
图30显示这些IL-2免疫缀合物的药动学。FAP靶向性(A)和非靶向性(B)IgG-IL2qm构建体两者均具有比相应的IgG-IL-2wt构建体(约15h)更长的血清半衰期(约30h)。值得注意的是，尽管实验条件不是直接相当的，但本发明IL-2免疫缀合物的血清半衰期似乎长于例如Gillies等,Clin Cancer Res8,210-216(2002)中报告的本领域已知的“2+2”IgG-IL-2免疫缀合物的血清半衰期(见图1)。
实施例8
实施生物分布研究以评估本发明免疫缀合物的肿瘤靶向。将基于28H1的FAP靶向性IgG-IL-2qm与未缀合的FAP靶向性28H1IgG和4B9IgG，以及非靶向性DP47GS IgG进行比较。此外，相比于DP47GS IgG-IL-2qm、4B9IgG和DP47GS IgG，用4B9IgG-IL-2qm实施SPECT/CT成像研究。
DTPA缀合和111In标记
将28H1IgG-IL-2qm、28H1IgG1、4B9IgG-IL-2qm、4B9IgG1和DP47IgG1的溶液对磷酸盐缓冲盐水(PBS,15mM)透析。将2mg构建体(5mg/ml)用0.1M NaHCO3pH8.2中的异硫氰酸苯甲基(isothiocyanatobenzyl)-二乙烯三胺五乙酸(ITC-DTPA,Macrocyclis,Dallas,TX)在严格的无金属条件下缀合，其通过与5倍摩尔过量的ITC-DTPA在室温(RT)温育1小时进行。通过对0.1M2-(N-吗啉代)乙磺酸(MES)缓冲液pH5.5透析除去未缀合的ITC-DTPA。
将纯化的缀合物放射性标记，其通过与在含0.05%牛血清清蛋白(BSA)和0.05%Tween-80的0.1M MES缓冲液pH5.5中的111In(Covidien BV,Petten,The Netherlands)于RT在严格的无金属条件下温育30min进行。在放射性标记后，添加乙二胺四乙酸(EDTA)至终浓度为5mM以螯合未结合的111In。通过在一次性G25M柱(PD10,Amersham Biosciences,Uppsala,Sweden)上凝胶过滤纯化经111In标记的产物。通过在TEC控制层析条(Biodex,Shirley,NY)上使用0.1M柠檬酸盐缓冲液pH6.0作为流动相的快速薄层层析(ITLC)测定纯化的经111In标记的构建体的放射化学纯度。经111In标记的制备物的比活性为0.6-4.6MBq/μg。
Lindmo测定法
测定经111In标记的抗体制备物的免疫反应性级分，如先前描述的(Lindmo等(1984)J Immunol Methods72,77-89)。简言之，将用成纤维细胞激活蛋白(FAP)cDNA转染的人胚肾(HEK)细胞(HEK-FAP细胞)的连续稀释系列与200Bq的经111In标记的构建体在37℃温育1小时。在过量的未标记构建体的存在下温育双份最低细胞浓度的重复以校正非特异性结合。在温育后，清洗细胞、向下旋转并在γ计数器(Wallac Wizzard3”1480自动化γ计数器，Pharmacia LKB)中测定细胞团粒中的细胞相关放射活性。制备物的放射反应性级分范围为75-94%。
动物
雌性BALB/c裸鼠(8-9周，+/-20g)购自Janvier并在标准条件下居住在Radboud大学Nijmegen医学中心的中心动物房，在各个通风的笼中有5只动物，随意获得食物和水。在一周环境适应后，对动物在左体侧中用基质胶(1:3)中10x106个HEK-FAP细胞s.c.接种，并任选地在右体侧中用基质胶(1:3)中5x106HEK-293细胞接种。通过测径器测量监测异种移植物生长(体积=(4/3·π)·(1/2长度)·(1/2宽度)·(1/2高度)。当异种移植物达到100mm3的体积时，用经111In标记的构建体i.v.注射小鼠。
生物分布(28H1IgG-IL-2qm、28H1IgG1、4B9IgG1和DP47GS IgG1)
经由尾静脉i.v.注射经111In标记的构建体(5MBq，150μg，200μl)。在注射后24小时，将动物通过在CO2/O2气氛中窒息实施安乐死。收集血液、肌肉、异种移植物、肺、脾、胰、肾、胃(空)、十二指肠(空)和肝，称重，并在γ计数器(Wallac Wizard)中测定放射活性。同时计数注射剂量的标准品(1%)并将组织摄取计算为每克组织的%注射剂量(%ID/g)。
SPECT-CT分析(4B9IgG-IL-2qm、4B9IgG1、DP47GS IgG-IL-2qm和DP47GS IgG1)
i.v.注射经111In标记的4B9-IgG-IL-2qm、4B9-IgG1、DP47GS-IgG-IL-2qm和DP47GS-IgG1(20MBq，50、150、300μg，200μl)。在注射后4、24、72和144小时时，将动物用异氟烷/O2麻醉并在装备有1.0mm小鼠瞄准仪的U-SPECT II microSPECT/CT照相机(MILabs,Utrecht,The Netherlands)中扫描30至60min。在SPECT后直接实施计算机断层摄影术(CT)。将SPECT(0.4mm的体素大小)和CT扫描均用MILabs软件重建，并共登记SPECT和CT扫描来测定放射信号的确切位置。使用Siemens Inveon Research Workplace软件创建3D成像。
图31显示在24小时时28H1和4B9IgG1和28H1IgG-IL-2qm的组织分布和肿瘤靶向之间没有显著差异(因此细胞因子不显著改变免疫缀合物的组织分布和肿瘤靶向特性)，而且FAP靶向性构建体的肿瘤对血液比率显著高于非靶向性DP47GS对照IgG的。
在4B9IgG-IL-2qm免疫缀合物的SPECT/CT成像中确认了这些结果(数据未显示)。4B9IgG-IL-2qm定位于FAP阳性HEK-FAP中但不在FAP阴性HEK-293对照肿瘤中，而非靶向性DP47GS免疫缀合物不定位于任一种肿瘤中。与未缀合的IgG不同，还在脾中观察到4B9IgG-IL-2qm的微弱摄取。
实施例9
比较基于28H1的IgG-IL-2qm和基于28H1的IgG-(IL-2qm)2(即图1所示的“2+2”形式免疫缀合物；序列显示在SEQ ID NO253和205)对NK92细胞的结合。将每孔200000个NK92细胞接种到96孔板中。将免疫缀合物滴定到NK92细胞上并在4℃温育30min以允许结合。将细胞用含0.1%BSA的PBS清洗2次以除去未结合的构建体。为了检测免疫缀合物，于4℃添加经FITC标记的抗人Fc特异性抗体达30min。将细胞用含0.1%BSA的PBS再清洗2次并通过FACS使用BD FACSCantoII分析。
如图32中例示的，“2+2”免疫缀合物比相应的“2+1”构建体显示更好的对NK92细胞的结合。
实施例10
IL-2免疫缀合物对人PBMC增殖的诱导
使用Histopaque-1077(Sigma Diagnostics Inc.,St.Louis,MO,USA)制备外周血单个核细胞(PBMC)。简言之，将来自健康志愿者的静脉血液吸入肝素化的注射器中。将血液用无钙和镁的PBS以2:1稀释，并在Histopaque-1077上分层。将梯度在室温(RT)以450x g离心30min而无中断。收集含PBMC的界面并用PBS清洗3次(350x g，接着在RT以300x g持续10min)。
随后，将PBMC用40nM CFSE(羧基荧光素琥珀酰亚胺酯)在37℃标记15min。用20ml培养基清洗细胞，接着在37℃回收经标记的PBMC达30min。清洗细胞，计数，并将100000个细胞接种到96孔U形底板中。将预稀释的阿地白介素(商品化的野生型IL-2)或IL2-免疫缀合物滴定到接种的细胞上，将其温育指定的时间点。在4-6天后，清洗细胞，针对合适的细胞表面标志物染色，并通过FACS使用BD FACSCantoII分析。NK细胞限定为CD3-/CD56+，CD4T细胞限定为CD3+/CD8-，且CD8T细胞限定为CD3+/CD8+。
图33显示在与不同的FAP靶向性28H1IL-2免疫缀合物一起温育4(A)、5(B)或6(C)天后NK细胞的增殖。所有测试的构建体均以浓度依赖性方式诱导NK细胞增殖。在较低浓度时，阿地白介素比免疫缀合物更有效，然而此差异在较高浓度时不再存在。在较早时间点(第4天)，IgG-IL2构建体似乎比Fab-IL2-Fab构建体略有效力。在较后时间点(第6天)，所有构建体具有相当的功效，其中Fab-IL2qm-Fab构建体在低浓度时效力最低。
图34显示在与不同的FAP靶向性28H1IL-2免疫缀合物一起温育4(A)、5(B)或6(C)天后CD4T细胞的增殖。所有测试的构建体均以浓度依赖性方式诱导CD4T细胞增殖。阿地白介素比免疫缀合物具有更高的活性，而包含野生型IL-2的免疫缀合物比包含四重突变体IL-2的免疫缀合物略有效力。对于NK细胞，Fab-IL2qm-Fab构建体具有最低活性。最可能地，至少对于野生型IL-2构建体，增殖的CD4T细胞是部分调节性T细胞。
图35显示在与不同的FAP靶向性28H1IL-2免疫缀合物一起温育4(A)、5(B)或6(C)天后CD8T细胞的增殖。所有测试的构建体均以浓度依赖性方式诱导CD8T细胞增殖。阿地白介素比免疫缀合物具有更高的活性，而包含野生型IL-2的免疫缀合物比包含四重突变体IL-2的免疫缀合物略有效力。对于NK和CD4T细胞，Fab-IL2qm-Fab构建体具有最低活性。
实施例11
IL-2激活的PBMC的增殖和激活诱导的细胞死亡
将来自健康供体的新鲜分离的PBMC用在具有10%FCS和1%谷氨酰胺的RPMI1640中1μg/ml的PHA-M预激活。预激活后收获PBMC，并用PBS中40nM CFSE标记，并以100000个细胞/孔接种到96孔板中。将预激活的PBMC用不同浓度的IL-2免疫缀合物(4B9IgG-IL-2wt、4B9IgG-IL-2qm、4B9Fab-IL-2wt-Fab和4B9Fab-IL-2qm-Fab)刺激。在IL-2处理6天后，用0.5μg/ml激活性抗Fas抗体过夜处理PBMC。在6天后通过CFSE稀释分析CD4(CD3+CD8-)和CD8(CD3+CD8+)T细胞的增殖。通过对CD3+膜联蛋白V阴性活细胞门控测定抗Fas处理后活T细胞的百分比。
如图36中显示的，所有构建体均诱导预激活的T细胞增殖。在低浓度，包含野生型IL-2wt的构建体比包含IL-2qm的构建体更具活性。IgG-IL-2wt、Fab-IL-2wt-Fab和阿地白介素具有类似的活性。Fab-IL-2qm-Fab比IgG-IL-2qm的活性略小。包含野生型IL-2的构建体在CD4T细胞上比在CD8T细胞上更具活性，最可能是由于调节性T细胞的激活所致。包含四重突变体IL-2的构建体在CD8和CD4T细胞上具有相似的活性。
如图37中显示的，用高浓度野生型IL-2刺激的T细胞比用四重突变体IL-2处理的T细胞对于抗Fas诱导的细胞凋亡更敏感。
实施例12
进一步表征非靶向性DP47GS构建体(VH和VL序列分别见SEQ ID NO:299和297)。如上文描述的，制备DP47GS IgG与野生型或四重突变体IL-2的缀合物。这些构建体与相应的靶向性构建体显示类似的对IL-2R的结合和在体外对免疫细胞(例如NK细胞、CD8+细胞和CD4+细胞)增殖的诱导(数据未显示)。然而，与靶向肿瘤抗原的免疫缀合物形成对比，它们不在肿瘤组织中积累(见实施例8)。
用包含野生型或四重突变体IL-2的非靶向性DP47GS IgG-IL-2构建体实施进一步的药动学研究(在实施例7中显示的研究外)。将雄性C57BL/6J小鼠(每组n=6)用0.3、1、3或10mg/kg DP47GS IgG-IL-2wt或DP47GS IgG-IL-2qm构建体i.v.注射。对于所有小鼠，注射体积为1ml。在注射后2、4、8、24、48、72、96和168小时(每个时间点从3只小鼠)采集血液样品并于-20℃贮存直至分析。使用用于捕捉并检测构建体的抗Fab抗体通过ELISA在血清样品中量化构建体。所有样品和校正标准品在分析前均在小鼠血清(从Bioreclamation获得)中以1:25稀释。简言之，将经链霉亲合素包被的96孔板(Roche)用PBS/0.05%Tween20清洗3次达10秒，接着与100μl/孔(0.5μg/ml)生物素化的抗人Fab抗体(M-1.7.10;RocheDiagnostics)在室温温育1小时。在用PBS/0.05%Tween20将板再清洗3次后，添加50μl/孔的血清样品或校正标准品和50μl/孔的PBS/0.5%BSA以产生1:50的最终样品稀释。将样品在室温温育1小时，接着将板用PBS/0.05%Tween20再清洗3次。接下来，将板与100μl/孔(0.5μg/ml)经洋地黄毒苷标记的抗人Fab抗体(M-1.19.31;Roche Diagnostics)在室温温育1小时，清洗，并与100μl/孔的抗洋地黄毒苷POD(Roche Diagnostics Cat#11633716001)在室温温育1小时，并再次清洗。最后，添加100μl/孔TMB过氧化物酶底物(Roche Diagnostics Cat#11484281001)达约5分钟，接着用50μl/孔的2N HCl停止底物反应。在停止反应后2分钟内以450nm读板，参照波长为650nm。
此研究的结果显示于图38。两种构建体均显示长血清半衰期，其中包含四重突变体IL-2(B)的构建体甚至比包含野生型IL-2(A)的构建体存在得更长。
另外，确认了缺乏DP47GS IgG对各种蛋白质以及人细胞(PBMC)的结合。
在基于ELISA的测试***中用一组不同无关抗原评估DP47GS抗体的结合特异性(或缺乏这类特异性)。此测试在384孔MaxiSorpTM微量滴定板(Thermo Scientific Nunc,产品目录编号460372)上实施。在每个温育步骤后，将板用PBS/0.05%Tween-20清洗3次。首先，将在PBS中稀释的不同抗原在6℃过夜包被在板上。使用抗原的测试浓度和详细信息列于下表。
然后，将孔用水中2%明胶在室温(RT)封闭1小时。将DP47GS抗体(PBS中1μg/ml)与一组捕获的抗原在RT温育1.5小时。使用抗人IgG抗体HRP缀合物(GE Healthcare,产品目录编号9330V；在具有0.2%Tween-20和0.5%明胶的PBS中以1:1000稀释)检测结合的抗体。在1小时温育后，将板用PBS/0.05%Tween-20清洗6次并用新鲜制备的BM蓝POD底物溶液(BM蓝：3,3’-5,5’-四甲基联苯胺，Roche Diagnostics,产品目录编号11484281001)在RT显色30分钟。在370nm测量吸光度。在不添加抗体的情况中定义空白值。内部人IgG1抗体充当阳性对照，其展现出对几乎所有捕获抗原的非特异性结合。
此实验的结果显示于图39。DP47GS抗体未展现出对任一捕获抗原的结合。检测的信号在无抗体的对照样品的范围内。
最后，评估DP47GS抗体对人PBMC的结合。由于在典型免疫应答的过程中，细胞表面呈现的蛋白质的组合急剧变化，因此在从健康成人分离后以及在体外用两种不同的刺激物激活后直接在PBMC上测试结合。
通过Ficoll密度梯度离心从血沉棕黄层，或者使用Histopaque1077(Sigma-Aldrich,Germany)从来自健康志愿者的肝素化新鲜血液分离人PBMC。对PBMC直接进行结合测定法(新鲜PBMC)或进一步培养并刺激。在由补充有10%(v/v)热灭活FBS(PAALaboratories)、1mM丙酮酸钠(Sigma-Aldrich)、1%(v/v)L-丙氨酰-L-谷氨酰胺(Biochrom)和10nMβ-巯基乙醇(Sigma-Aldrich)的RPMI1640(Gibco)组成的T细胞培养基中以2x106个细胞/ml的细胞密度于37℃培养PBMC。对于体外刺激，在6天的培养(PHA-L激活的PBMC)期间添加阿地白介素(200U/ml,Novartis)和植物血细胞凝集素(phytohaemagglutinin)(PHA-L;2μg/mL,Sigma-Aldrich)。对于体外再刺激，将6孔细胞培养板用小鼠抗人CD3(克隆KT3,1μg/ml)和小鼠抗人CD28抗体(克隆28.2,2μg/ml，两者均来自eBioscience)包被，并添加PHA-L激活的PBMC，再持续24小时(再刺激的PBMC)。对于5倍连续稀释系列(最高浓度200nM)，监测DP47GS抗体(在Fc域中有或无L234A L235A(LALA)P329G突变)对细胞表面蛋白质的结合，其使用缀合于荧光素异硫氰酸盐(FITC)的山羊抗人IgG Fc特异性二抗(JacksonLaboratories)和流式细胞检测分析进行。所有测定法均在4℃实施以预防表面蛋白质的内在化。一抗和二抗的温育分别为2小时和1小时。为了允许对白细胞的同时分型，向二抗添加经荧光染料标记的小鼠抗人CD14、CD15、CD4、CD19(均为Biolegend)、NKp46、CD3、CD56、CD8(均为BD Pharmingen)的组合。在运行FACS Diva软件的FACSCantoII(均BD Bioscience)装置上进行测量前直接添加碘化丙啶(1μg/ml)以排除可渗透的死细胞。针对T细胞(CD14-CD3+CD4+/CD8+)、B细胞(CD14-CD19+)、NK细胞(CD14-NKp46+/CD56+)或单核细胞/嗜中性粒细胞(CD3-CD56-CD14+/CD15+)对碘化丙啶阴性活细胞门控。测定各种白细胞类型的中值FITC荧光作为结合的一抗的指标，并使用Prism4(GraphPad Software)针对一抗浓度绘图。
如图40中显示的，没有Fc突变的DP47GS IgG抗体显示仅对携带Fcγ受体的细胞(例如NK细胞和单核细胞/嗜中性粒细胞)的结合。在人PBMC上未检测到DP47GS(LALAP329G)的结合，不管其激活状态如何。Fc域中的LALAP329G突变还完全消除了对携带Fcγ受体的细胞的结合。
***
尽管为了理解清楚已通过例示和实施例相当详细地描述了前述发明，但该描述和实施例不应理解为限制本发明的范围。本文中引用的所有专利和科学文献的公开内容均通过提述完整明确收录。

Claims (21)

1.一种免疫缀合物，其包含(i)包含第一和第二抗原结合Fab分子和由两个亚基组成的Fc域的免疫球蛋白分子和(ii)效应器模块，其中存在不超过一个效应器模块；且其中
所述第一和所述第二Fab分子针对CEA且均包含SEQ ID NO：191所示重链可变区序列和SEQ ID NO：189所示轻链可变区序列；且
所述效应器模块是突变体人白介素-2(IL-2)多肽，其中第42位苯丙氨酸残基用丙氨酸替换(F42A)、第45位酪氨酸残基用丙氨酸替换(Y45A)且第72位亮氨酸残基用甘氨酸替换(L72G)，或其中第42位苯丙氨酸残基用丙氨酸替换(F42A)、第45位酪氨酸残基用丙氨酸替换(Y45A)、第72位亮氨酸残基用甘氨酸替换(L72G)且第3位苏氨酸残基用丙氨酸替换，编号方式依照SEQ ID NO：2中的人IL-2序列；
所述效应器模块融合至所述Fc域的所述两个亚基之一的羧基端氨基酸，所述融合任选地经由接头肽，且其中在所述Fc域的每个亚基中，第234位亮氨酸残基用丙氨酸替换(L234A)、第235位亮氨酸残基用丙氨酸替换(L235A)且第329位脯氨酸残基用甘氨酸替换(P329G)，编号依照EU编号方式。
2.权利要求1的免疫缀合物，其中所述Fc域包含促进两条不相同的多肽链异二聚化的修饰。
3.权利要求2的免疫缀合物，其中所述修饰是突出-入-孔修饰，其包含在所述Fc域的所述亚基之一中的突出修饰和在所述Fc域的所述两个亚基的另一个中的孔修饰。
4.权利要求3的免疫缀合物，其中在所述突出修饰中第366位苏氨酸残基用色氨酸替换(T366W)，且在所述孔修饰中第366位苏氨酸残基用丝氨酸替换(T366S)、第368位亮氨酸残基用丙氨酸替换(L368A)且第407位酪氨酸残基用缬氨酸替换(Y407V)，编号依照EU编号方式。
5.权利要求3或4的免疫缀合物，其中所述效应器模块融合至所述Fc域中包含突出修饰的亚基的羧基端氨基酸。
6.权利要求1至5中任一项的免疫缀合物，其中所述Fc域是IgG Fc域。
7.权利要求6的免疫缀合物，其中所述Fc域是人IgG1Fc域。
8.权利要求1至7中任一项的免疫缀合物，其中所述免疫球蛋白分子是IgG类免疫球蛋白。
9.权利要求8的免疫缀合物，其中所述免疫球蛋白分子是IgG1亚类免疫球蛋白。
10.权利要求1至9中任一项的免疫缀合物，其中所述效应器模块融合至所述免疫球蛋白重链之一的羧基端氨基酸，所述融合任选地经由接头肽。
11.权利要求1至10中任一项的免疫缀合物，其中在所述突变体人白介素-2(IL-2)多肽中第125位半胱氨酸残基进一步用丙氨酸替换(C125A)。
12.权利要求1至11中任一项的免疫缀合物，其中所述突变体人白介素-2(IL-2)多肽由SEQ ID NO:3所示多肽序列组成。
13.权利要求1至12中任一项的免疫缀合物，其包含由SEQ ID NO:277、SEQ ID NO:281和SEQ ID NO:283所示多肽序列。
14.一种分离的多核苷酸，其编码权利要求1至13中任一项的免疫缀合物。
15.一种表达载体，其包含权利要求14的分离的多核苷酸。
16.一种宿主细胞，其包含权利要求14的分离的多核苷酸或权利要求15的表达载体。
17.一种生成免疫缀合物的方法，该免疫缀合物包含(i)包含第一和第二抗原结合Fab分子和由两个亚基组成的Fc域的免疫球蛋白分子和(ii)效应器模块，其中存在不超过一个效应器模块，该方法包括在适合于所述免疫缀合物表达的条件下培养权利要求16的宿主细胞以及任选地回收所述免疫缀合物。
18.一种免疫缀合物，其包含(i)包含第一和第二抗原结合Fab分子和由两个亚基组成的Fc域的免疫球蛋白分子和(ii)效应器模块，其中存在不超过一个效应器模块，其中所述免疫缀合物是通过权利要求17的方法生成的。
19.一种药物组合物，其包含权利要求1至13中任一项或权利要求18的免疫缀合物和药学可接受载体。
20.权利要求1-13中任一项或权利要求18的免疫缀合物，或权利要求19的药物组合物，其用于制备供治疗个体中的癌症用的药物。
21.包含药学可接受形式的权利要求1至13中任一项或权利要求18的免疫缀合物的组合物在制备用于治疗个体中的癌症的药物中的用途，其中所述治疗包括对所述个体施用治疗有效量的所述组合物。
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