CN1930300A - 预测患者治疗药物耐受性的体外试验*** - Google Patents
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Abstract
描述了预测患者对治疗药物如细胞因子、淋巴因子和免疫毒素的耐受性的方法。该方法利用血管渗透综合征(VLS)体外模型来评价药物对大分子蛋白质通过内皮细胞(EC)融合单层的作用。
Description
技术领域
本发明一般涉及体外分析方法。具体地说，本发明涉及预测患者对特定治疗药物，包括免疫治疗药物如IL-2突变蛋白的耐受能力的方法。
背景技术
白介素-2(IL-2)是天然杀伤细胞(NK)和T-细胞增殖和功能的强效刺激物(Morgan等，(1976)，Science 193：1007-1011)。这种天然存在的淋巴因子单独或与淋巴因子激活的杀伤(LAK)细胞或肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)联合(使用)显示对各种恶性肿瘤具有抗肿瘤活性(参见，例如Rosenberg等，(1987)，N.Engl.J.Med.，316：889-897；Rosenberg，(1988)，Ann.Surg.，208：121-135；Topalian等，(1988)，J.Clin.Oncol.6：839-853；Rosenberg等，(1988)，N.Engl.J.Med.，319：1676-1680；和Weber等，(1992)，J.Clin.Oncol.，10：33-40)。在转移性黑色素瘤和肾细胞癌患者中，当使用Proleukin(一种从Chiron Corporation，Emeryville，CA商品化可购得的IL-2制剂)时，IL-2的抗肿瘤活性得到最充分的描述。其它疾病，包括淋巴瘤也显示对IL-2治疗有反应(Gisselbrecht等，(1994)，Blood，83(8)：2020-2022)。
也可使用具有抗肿瘤活性的许多其它治疗药物来治疗癌症。这些药物包括白介素如IL-3、IL-4、干扰素(IFN)-α、GM-CSF、抗神经节苷抗体、环孢素A、环磷酰胺、丝裂霉素C、FK973、野百合碱吡咯和阿糖胞苷；以及许多免疫毒素，例如由蓖麻毒蛋白A链(RTA)、封端的蓖麻毒蛋白(blR)、皂草素(SAP)、美洲商陆抗病毒蛋白(PAP)和假单胞菌外毒素(PE)构建的免疫毒素。
然而，许多这些治疗剂的治疗应用受到其差的耐受性和毒性的限制。例如，高剂量IL-2免疫治疗常伴随着严重的毒副作用，最显著的有血管渗漏综合征(VLS)、严重的流感样症状(发热、寒颤、呕吐)、低血压和神经变化(参见，例如Duggan等，(1992)，J.Immunotherapy，12：115-122；Gisselbrecht等，(1994)，Blood，83：2081-2085；和Sznol与Parkinson，(1994)，Blood，83：2020-2022)。采用如上所述的其它化学治疗药物时也可观察到VLS。VLS的机制可能是由于活化的PBMC与内皮细胞相互作用所介导的内皮损伤。细胞因子、炎症介质或药物固有的结构基序的产生(Baluna和Vitetta(1997)Immunopharmacology 37：117-132；Baluna等，(1999)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 96：3957-3962)。虽然尚不清楚毒性和VLS的确切机制，但累积的数据提示，由于激活单核细胞/巨噬细胞的致炎细胞因子如IFN-γ、TNF-α、TNF-β、IL-1β和IL-6的过度产生，IL-2-诱导的天然杀伤(NK)细胞触发了剂量限制性毒性(DLT)，诱导一氧化氮(NO)产生，导致后续内皮细胞的损伤(Dubinett等，1994；Samlowski等，1995)。
已开发了几种IL-2突变蛋白用来克服天然分子所显示的毒性。这些突变蛋白的例子参见2004年3月5日提交的共同拥有、共同待批的美国临时专利申请序列号60/550,868。
已开发了体外模型，用来检测VLS的机制。例如，Damle和Doyle在J.Bacteriol.(1989)142：2660-2669中描述了一种体外试验***，用来检测IL-2-活化的杀伤(IAK)淋巴细胞和许多细胞因子对穿过内皮细胞单层的经内皮大分子通量的作用。该***测定穿过人脐带内皮细胞的FITC-白蛋白通量。Kotasek等，Cancer Res.(1988)48：5528-5532描述了一种体外试验，用来测定淋巴因子活化的细胞介导的细胞毒机制，也采用内皮细胞单层。Lindstrom等，Blood(1997)90：2323-2334，描述了一种用于毒素介导的VLS的体外模型，采用生长在微孔支持物上，并在存在或不存在蓖麻毒蛋白毒素A链的情况下，低压下培养的人内皮细胞。
虽然采用了这些试验***来研究VLS的机制，但迄今尚未采用这些***来预测患者对各种治疗，例如采用修饰的淋巴因子和化学治疗免疫毒素的免疫治疗的耐受性。
发明概述
本发明提供一种用于预测患者对特定治疗药物如免疫治疗药物的耐受能力的简单有效的体外分析方法，从而预测这种分子的治疗应用。该方法利用检测蛋白质通过内皮细胞单层的渗漏的分析***，作为受试治疗耐受性的预测因子。这种分析尤其适合在人体中预测各种免疫治疗的耐受性，因为人的DLT(发热/寒颤，VLS和低血压)都与致炎细胞因子和一氧化氮(NO)的产生具有衍生相关性。
因此，在一个实施方式中，本发明涉及一种预测患者对选定治疗药物耐受或不耐受的体外方法。该方法包括：
(a)提供贴附于粘附基质的内皮细胞的融合单层；
(b)使该单层与以下成分接触：
(i)选定的治疗药物或淋巴因子活化的杀伤(LAK)细胞制剂，其中，通过用治疗药物或LAK细胞的上清液激活外周血单核细胞产生LAK细胞；和
(ii)可检测的标记大分子，其中，当融合单层保持完整时，所述融合单层可基本上保留该可检测的标记大分子；
(c)在该单层的完整性受损时，可检测的标记大分子能通过该融合单层和粘附基质的条件下，孵育步骤(b)的单层一段时间；和
(d)检测穿过融合单层和粘附基质的大分子，作为患者对特定治疗药物耐受或不耐受的指标。
在该方法的某些实施方式中，治疗药物是免疫治疗剂如IL-2突变蛋白，或免疫毒素，或小分子化学治疗剂。
在其它实施方式中，本方法中使用的粘附基质包括胶原基质。
在又一些实施方式中，本方法中使用的内皮细胞是人脐静脉内皮细胞(HUVEC)。
在其它实施方式中，本方法中使用的可检测的标记大分子是可检测的标记白蛋白，例如标记的牛血清白蛋白(BSA)。BSA可被荧光标记，例如用FITC标记。
在又一些其它的实施方式中，本发明涉及预测患者对IL-2突变蛋白耐受或不耐受的体外方法。该方法包括：
(a)提供贴附于粘附基质的内皮细胞融合单层；
(b)使该单层与以下成分接触：
(i)淋巴因子活化的杀伤(LAK)细胞制剂，其中，通过用IL-2突变蛋白激活外周血单核细胞产生LAK细胞，和
(ii)可检测的标记大分子，其中，融合单层保持完整时，所述融合单层可基本上保留该可检测的标记大分子；
(c)在该单层的完整性受损时，可检测的标记大分子能通过该融合单层和粘附基质的条件下，孵育步骤(b)的单层一段时间；和
(d)检测穿过融合单层和粘附基质的大分子，作为患者对IL-2突变蛋白耐受或不耐受的指标。
在某些实施方式中，本方法中使用的粘附基质包括胶原基质。
在另一些实施方式中，本方法中使用的内皮细胞是人脐静脉内皮细胞(HUVEC)。
在其它实施方式中，本方法中使用的可检测的标记大分子是可检测的标记白蛋白，例如标记的BSA。BSA可被荧光标记，例如用FITC标记。
在另一个实施方式中，本发明涉及预测患者对IL-2突变蛋白耐受或不耐受的体外方法。该方法包括：
(a)提供贴附于粘附基质如胶原基质的人脐静脉内皮细胞(HUVEC)的融合单层；
(b)使该单层与以下成分接触：
(i)淋巴因子活化的杀伤(LAK)细胞制剂，其中，通过用IL-2突变蛋白激活外周血单核细胞产生LAK细胞，和
(ii)荧光标记的白蛋白；
(c)在该单层的完整性受损时，标记荧光白蛋白能通过该融合单层和粘附基质的条件下，孵育步骤(b)的单层一段时间；和
(d)检测穿过融合单层的荧光标记的白蛋白，作为患者对IL-2突变蛋白耐受或不耐受的指标。
在其它实施方式中，荧光标记的白蛋白是BSA。BSA可被荧光标记，例如用FITC标记。
参考本说明书，本领域技术人员容易明白本发明的这些和其它实施方式。
附图简要说明
图1A-1C描述了在分别来自三位不同对象的刺激培养物上清液的存在下，采用25nM IL-2突变蛋白-刺激的LAK细胞进行实验的结果。使用荧光强度作为与LAK细胞和上清液孵育22小时后，FITC-BSA穿过HUVEC单层的迁移测定指标。*：与培养液对照相比，P值＜0.1，t检验：配对比较两样品的平均值(n＝5)；$：与Proleukin相比，P值＜0.1，t检验：配对比较两样品的平均值(n＝5)；&：与F42E相比，P值＜0.1，t检验：配对比较两样品的平均值(n＝5)；@：与rIL-2相比，P值＜0.1，t检验：配对比较两样品的平均值(n＝5)。
图2A-2C描述了采用分别来自三位不同对象的25nM IL-2突变蛋白-刺激的LAK细胞进行实验的结果。使用荧光强度作为与不含上清液的LAK细胞孵育22小时后，FITC-BSA穿过HUVEC单层的迁移测定指标。*：与培养液对照相比，P值＜0.1，t检验：配对比较两样品的平均值(n＝5)；$：与Proleukin相比，P值＜0.1，t检验：配对比较两样品的平均值(n＝5)；&：与F42E相比，P值＜0.1，t检验：配对比较两样品的平均值(n＝5)；@：与rIL-2相比，P值＜0.1，t检验：配对比较两样品的平均值(n＝5)。
图3A-3C显示了采用分别来自三位不同对象的25nM IL-2突变蛋白-刺激的LAK细胞的上清液进行实验的结果。使用荧光强度作为与上清液孵育22小时后，FITC-BSA穿过HUVEC单层的迁移测定指标。*：与培养液对照相比，P值＜0.1，t检验：配对比较两样品的平均值(n＝5)；$：与Proleukin相比，P值＜0.1，t检验：配对比较两样品的平均值(n＝5)；&：与F42E相比，P值＜0.1，t检验：配对比较两样品的平均值(n＝5)；@：与rIL-2相比，P值＜0.1，t检验：配对比较两样品的平均值(n＝5)。
图4A-4C显示了采用25nM IL-2突变蛋白进行三次独立实验的结果。使用荧光强度作为与IL-2孵育22小时后，FITC-BSA穿过HUVEC单层的迁移测定指标。*：与培养液对照相比，P值＜0.1，t检验：配对比较两样品的平均值(n＝5)；$：与Proleukin相比，P值＜0.1，t检验：配对比较两样品的平均值(n＝5)；&：与F42E相比，P值＜0.1，t检验：配对比较两样品的平均值(n＝5)；@：与rIL-2相比，P值＜0.1，t检验：配对比较两样品的平均值(n＝5)。
发明详述
除非另有说明，本发明的实施采用本领域内药理学、化学、生物化学、重组DNA技术、免疫学的常规技术。文献中详细解释了这些技术。例如，参见《实验免疫学手册》(Handbook of Experimental Immunology)，第I-IV卷(D.M.Weir和C.C.Blackwell编，Blackwell Scientific Publications)；A.L.Lehninger，Biochemistry(Worth Publishers，Inc.，目前的附刊)；Sambrook等，Molecular Cloning：A LaboratoryManual(第2版，1989)；Methods In Enzymology(S.Colowick和N.Kaplan编，Academic Press，Inc.)。
I.定义
为了描述本发明，将采用以下术语，其定义如下所述。
应当注意，如说明书和权利要求书所述，除非内容中清楚地另行指出，单数形式“一”、“一个”和“这个”包括复数形式。因此，例如，“一细胞”包括两个或多个细胞，等等。
术语“包含”涵盖了“由……组成”和“含有”，例如，组合物“包含”X可以是只由X构成，或是包含一些其它成分，例如X+Y。
术语“基本上”不排除“完全”，例如，组合物“基本上不含”Y可以是完全不含Y。必要时，本发明定义中可省略“基本上”。
术语“来源于”在这里指分子的来源，而不限于分子制备的方法(例如，化学合成或重组方法)。
术语“免疫治疗剂”在这里指可用于治疗癌症的免疫促进剂或免疫抑制剂。这些药剂包括但不限于各种细胞因子和淋巴因子，例如各种白介素，如IL-1、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-12和这些分子的突变蛋白；干扰素，包括但不限于IIFN-α、IFN-β、IFN-γ及其突变蛋白；集落刺激因子如GM-CSF和GM-CSF的突变蛋白；肿瘤坏死因子，例如TNF-α和TNF-β及这些分子的突变蛋白。术语“免疫治疗剂”还包括免疫毒素。“免疫毒素”指抗体-毒素偶合物，用于破坏具有与该抗体同源的抗原的特定靶细胞(例如，肿瘤细胞)。与这种抗体偶合毒素的例子包括但不限于：蓖麻毒蛋白A链(RTA)、封端的蓖麻毒蛋白(blR)、皂草素(SAP)、美洲商陆抗病毒蛋白(PAP)和假单胞菌外毒素(PE)，以及其它毒性化合物，例如放射性同位素和其它化学治疗药物。
术语“IL-2”在这里指来源于淋巴因子的蛋白质，淋巴因子由正常外周血淋巴细胞产生，体内低浓度存在。IL-2首先由Morgan等，(1976)，Science，193：1007-1008描述，由于它能诱导激活的T淋巴细胞增殖而最初称为T细胞生长因子。这是一种报道分子量为13,000-17,000的蛋白质(Gillis和Watson，(1980)，J.Exp.Med.，159：1709)，其等电点为6-8.5。该定义包括全长度IL-2蛋白及其生物学活性片段，该术语还包括IL-2的表达后修饰，例如，糖基化、乙酰化、磷酸化等。
术语“突变蛋白”在这里指包括修饰的蛋白质，例如，对原有序列的删除、去头、添加和取代。一般，该蛋白质保持生物学活性，即抗肿瘤活性。这些修饰可以是精心设计的，例如通过定向诱变，或是意外的，例如通过产生该蛋白质的宿主的突变或由于PCR扩增的误差。术语“突变蛋白”可与术语“变体”和“类似物”互换使用。这些突变蛋白的氨基酸序列与参比序列具有高度序列同源性，例如，当两个序列比对时，氨基酸序列同源性大于50％，通常大于60-70％，甚至大于80-85％或以上，例如至少90-95％或以上。常常，类似物包括相同数量的氨基酸但包括取代物，如本文所述。制备多肽突变蛋白的方法是本领域已知的，如下所述。
突变蛋白包括性质上保守性或非保守性的取代。保守性取代指发生在与其侧链相关的氨基酸家族中的取代。具体地说，氨基酸通常分为四个家族：(1)酸性--天冬氨酸和谷氨酸；(2)碱性--赖氨酸、精氨酸、组氨酸；(3)非极性--丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、蛋氨酸、色氨酸；和(4)不带电荷的极性--甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、半胱氨酸、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸。苯丙氨酸、色氨酸和酪氨酸有时也可归类为芳香族氨基酸。例如，可合理地预测，用异亮氨酸或缬氨酸独立地取代亮氨酸，用谷氨酸独立地取代天冬氨酸，用丝氨酸独立地取代苏氨酸，或用结构上相关的氨基酸类似地保守性取代一个氨基酸，将不会对生物学活性有重大影响。例如，感兴趣的蛋白质可包括多达约5-10个保守性或非保守性氨基酸取代，或甚至多达约15-25个、50个或75个保守性或非保守性氨基酸取代，或5-75之间的任何整数，只要不影响该分子的所需功能。本领域技术人员容易确定感兴趣的蛋白质耐受改变的区域。
术语“突变蛋白”也指天然分子的衍生物。“衍生物”指感兴趣天然多肽、天然多肽片段或它们各自的类似物的任何合适的修饰，例如糖基化、磷酸化、聚合物偶联(如与聚乙二醇偶联)或加入其它外来成分的类似物，只要保留天然多肽所需的生物学活性。制备多肽片段、类似物和衍生物的方法是本领域公知的。
“片段”指仅由完整全长序列和结构的一部分所形成的分子。片段包括天然多肽的C-端删除、N-端删除和/或中间删除。特定蛋白质的活性片段通常包括至少约5-10个全长分子的连续氨基酸残基，优选至少约15-25个全长分子的连续氨基酸残基，最优选至少约20-50或更多个全长分子的连续氨基酸残基，或5个氨基酸与全长序列之间的任何整数，只要感兴趣片段保留生物学活性，例如抗肿瘤活性，如本文所述。
当指多肽时，“分离的”表示所指的分子与完整生物体(该分子在自然界中在该生物体中被发现)离析并分开，或该分子以基本上不存在相同类型的其它生物大分子的状态存在。指多核苷酸时，术语“分离的”指全部或部分地缺少天然状态下与其正常相关的序列的核酸分子；或自然存在，但具有与其相关的异源序列的序列；或从染色体解离的分子。
术语“细胞培养”和“组织培养”可互换使用，指在液体介质的悬浮培养液中，或在具有液体介质的表面如玻璃、塑料、琼脂或其它合适的基质上，体外维持细胞。一般来说，“细胞培养”需要缓冲以维持恒定适当pH的介质。通常配制细胞培养中使用的介质，以包含足够的必需营养物质，且渗透压调节到适合需维持的特定细胞，温度和气体也控制在合适的范围内。细胞培养技术是本领域已知的。例如，参见Morgan等，Animal Cell Culture，BIOS Scientific Publishers，Oxford，UK(1993)，和Adams，R.L.P.Cell Culture for Biochemists，第2版，Elsevier(I990)。
术语“内皮细胞”在这里指来源于心脏空腔和血管和***细胞最内层的分化的扁平细胞。内皮细胞来源于中胚层胚胎细胞层。
内皮细胞的例子如下所述。
“外周血单核细胞”或“PBMC”指采用例如密度离心，从哺乳动物如人的外周血分离的细胞群。通常，PBMC群包括大多数淋巴细胞和单核细胞，不包括血红细胞和大多数多形核白细胞和粒细胞。
“代”指传代培养细胞群的行为。“传代培养”指用上一次培养的样品接种新鲜无菌培养液建立的细胞培养。每次重复的传代培养计为一次传代。
本发明分析中使用的合适的“大分子”是足够大的大分子，除非单层破裂，融合单层可基本上保留该大分子，从而提高大分子通过融合单层的渗透性。“提高”的渗透性指与不存在破裂试剂(即用导致血管渗漏综合征的免疫治疗剂刺激LSK细胞)条件下转运通过单层相比，转运通过单层的大分子的量更大，速率更快。尤其有用的大分子包括血清白蛋白如牛血清白蛋白(BSA)、卵清蛋白、钥孔血蓝蛋白、免疫球蛋白分子、甲状球蛋白及本领域技术人员已知的其它蛋白质。
如本文所用，术语“标记”和“可检测的标记”指能够检测的分子，包括但不限于，放射性同位素、荧光剂、半导体纳米结晶、化学发光物质、发色团、酶、酶底物、酶辅因子、酶抑制剂、染料、金属离子、金属溶胶、配基(例如，生物素、抗生蛋白链菌素或半抗原)等。术语“荧光剂”指在检测范围内能够显示荧光的物质或其一部分。本发明中可使用的标记的具体例子包括但不限于：辣根过氧化物酶(HRP)，荧光素化合物如称为“FITC”的荧光素5(6)-异氰酸酯或荧光素异氰酸酯异构体I，罗丹明、丹酰、羟基香豆素、二甲基吖啶鎓酯(DMAE)、德克萨斯红、鲁米诺、NADPH和α-β-半乳糖苷酶。
II.实施本发明的方式
在详细描述本发明之前，应理解本发明并不限于这些具体制剂或方法参数，这些制剂或方法参数可变化。还应理解，本文所用术语仅仅是为了描述本发明的具体实施方式，而不是限制性的。
虽然可采用许多与本发明所述类似或等价的方法和材料来实施本发明，本文描述了优选的材料和方法。
如上所述，采用免疫疗法如IL-2疗法来治疗各种癌症，例如转移性黑色素瘤、肾细胞癌和淋巴瘤。但是，与免疫疗法相关的严重毒性限制了这些治疗方法，例如血管渗漏综合征(VLS)、严重的流感样症状(发热、寒颤、呕吐)、低血压、神经变化、一氧化氮(NO)产生，导致后续内皮细胞的损伤。因此，制备了许多免疫治疗剂的突变蛋白，如淋巴因子突变蛋白，希望能够克服上述副作用。本发明提供了试验这些突变蛋白，和其它治疗剂的体外方法，来预测毒性。
具体地说，本发明基于以下发现：体外方法可用于精确和有效地预测患者对采用特定IL-2突变蛋白的耐受能力，而不发生当患者经历IL-2免疫疗法时所产生的常见副作用。该分析方法利用体外内皮渗透性模型来监测大分子通过融合内皮细胞单层的渗漏。该分析中使用的大分子一般被融合单层保留，或仅少量泄漏。然而，当细胞单层的完整性受到损伤时，例如，暴露于可引起血管渗漏综合征的治疗药物，或暴露于由引起血管渗漏综合征等的治疗药物刺激产生的LAK细胞(或其上清液)，大分子的内皮渗透性增加。
本分析方法尤其适用于预测人对各种基于淋巴因子的免疫疗法如IL-2免疫疗法的耐受性，因为人的DLT(发热/寒颤，VLS和低血压)都与致炎细胞因子和NO具有衍生相关性。
本领域已知许多渗透性试验，可用于检测治疗药物如IL-2突变蛋白。例如，参见Damle和Doyle，J.Bacteriol.(1989)142：2660-2669；Kotasek等，Cancer Res.(1988)48：5528-5532；Stone-Wolff等，J Exp.Med.(1984)159：828；Lindstrom等，Blood(1997)90：2323-2334。
一般来说，这些试验采用具有融合单层的粘附基质，它通常允许可溶性营养物、代谢物和激素因子通过，但基本上阻止细胞迁移通过，除非融合单层的完整性受损。本发明试验中采用的融合单层通常来自内皮细胞，例如血管和淋巴内皮细胞。这些细胞的例子包括但不限于：人脐静脉内皮细胞(HUVEC)，可根据例如Jaffe等，J.Clin.Invest.(1973)52：2745；Stroncek等，Arteriosclerosis(1986)137：1735-1742所述的方法获得，购自各供应商如美国标准培养菌种库(ATCC)，Manassas，VA(例如商品目录CRL-1730)和Cascade Biologics，Poland，OR；WB572细胞(自发转化的人隐静脉平滑肌细胞)；SV-E6细胞(稳定转染E6病毒癌基因的人隐静脉细胞)；A7R5细胞(自发转化的大鼠胸主动脉平滑肌细胞；ATCC)；GH3B6细胞(大鼠脑垂体细胞；ATCC，Bethesda，Md.)；PVEC细胞(大鼠肺静脉内皮细胞；J.Tissue CultureRes.(1986)10：9)；CPA47(牛内皮细胞；ATCC CRL 1733)；CPAE细胞(牛内皮细胞；ATCC CCL 209)；EJG细胞(牛内皮细胞；ATCC CRL 8659)；FBHE(牛内皮细胞；ATCC CRL 1395)；HW-EC-C细胞(人内皮细胞；ATCC CRL 1730)；和T/GHA-VSMC细胞(人血管平滑肌细胞；ATCC CRL 1999)。
在使用本发明试验之前，在合适的培养液中常规传代细胞并培养，如本领域技术人员所公知。例如，可在市售培养液，例如实施例所述的RPMI-10AB培养液；如Damel和Doyle，J.Bacteriol.(1989)142：2660-2669所述的RPMI1640补给性培养液；如Lindstrom等，Blood(1997)90：2323-2334所述的M199补给性培养液；得自Cambrex，Baltimore，MD，含2％胎牛血清的内皮生长培养液以及本领域技术人员已知的其它组织培养介质中，培养内皮细胞。可使用其它因子，如内皮细胞生长因子(ECGF)、肝素等。例如，参见Thornton等，Science(1983)222：623。使用前合适的代数可变化，取决于所用细胞系的期望寿命。通常，本发明中使用的HUVEC的代数为2-20代，优选3-10代，甚至更优选，少于5代，例如2、3、4代。
经过所需次数的传代之后，将大约1×103-1×107，有效1×104-1×107，例如1×105-1×106的细胞加入到合适的粘附基质中。根据细胞类型，培养适当时间，得到融合单层。例如，HUVAC一般培养约1-7天，通常2-5天，例如1、2、3、4、5、6或7天，直到形成融合单层。可采用本领域已知的技术评价融合度，例如用结晶紫检测。
本发明试验中试验的合适的基质包括膜支持物，例如用于组织培养的渗透性微孔薄膜，通常允许物质如可溶性营养物、代谢物和激素因子自由通过该膜，同时阻止细胞迁移通过该膜。例如，粘附支持物包括葡聚糖聚合物、聚氯乙烯、聚乙醇酸、聚乳酸、聚乳酸乙醇酸共聚物(polylactic coglycolic acids)和/或硅。通常，基质还可包括胶原、纤维蛋白、纤连蛋白、层粘连蛋白和/或透明质酸。这些支持物是本领域所公知的，例如，可购自Costar(Cambridge，MA)。一个例子是TrranswellTM支持物(例如，TRANSWELL-COL PTFE膜，膜厚度25-50μm，孔径0.4-3.0μm，用来自牛胎盘的I型和II型胶原处理)。这些支持物允许物质从上室通过单层进入下室，在下室中收集和测定物质。然而，本发明方法可使用任何合适的渗透膜支持物，只要可监测通过单层的迁移。
融合单层一旦建立，在不存在试验物质的情况下，将可检测的标记大分子加入到单层(例如转移孔支持物的上室)，以提供背景测定。可检测的标记大分子的尺寸大到足以被融合单层保留，除非由于可使单层破裂的分子的存在而导致单层渗漏。如上所述，本发明方法中一般使用的大分子包括血清白蛋白如牛血清白蛋白(BSA)、卵清蛋白、钥孔血蓝蛋白、免疫球蛋白分子、甲状球蛋白及本领域技术人员已知的其它蛋白质。加入标记大分子之后，试验进行15分钟到几个小时，例如，30分钟到48小时，优选1小时到24小时，更优选2小时到12小时，例如1...2...3...4...5...6...7...8...12...20...24...40...48或更多个小时。例如，采用分光光度计，可检测通过单层进入(例如)底室的标记分子，以提供基线测定。如果采用荧光标记，可使用荧光光度计测定荧光，表示为相对荧光单位。测定可以是定性或定量的。例如，可采用以下公式计算白蛋白清除：白蛋白清除(μl)＝VL×A/L，其中，VL是取样时的底室体积，A是取样时每微升底室中的荧光单位，L是试验开始时，每微升顶室中的荧光单位。通过线性回归分析计算白蛋白的清除率(μl/分钟)。例如，可测定清除(μl±SEM/分钟)。
进行适当测定之后，除去任何残留的标记大分子，将试验化合物以及含标记大分子的培养液加入到顶孔中。例如，加入感兴趣的治疗药物，或已用治疗药物刺激活化的LAK细胞(或其上清液)，以及对照，如下所述。采用选定的治疗药物以激活PBMC，通过活化外周血单核细胞(PBMC)，产生LAK细胞。可采用本领域公知的技术，例如采用Ficoll-Hypaque密度梯度离心，从全血分离用于激活的PBMC。离心后，通过在37℃下，粘附塑料的相继循环持续45分钟，粘附的单核细胞可与(但不必需)非粘附单核细胞(NAMNC)分离。为了制备活化细胞，联合(使用)治疗药物和PBMC。加入的药物量取决于特定的受试物质。因此，例如，当分析淋巴因子如IL-2突变蛋白时，突变蛋白的加入浓度为10-500nM，通常浓度为25-250nM，甚至更优选浓度为35-100nM。本领域技术人员可容易地确定合适的使用浓度。例如，参见Damle和Doyle，J.Bacteriol.(1989)142：2660-2669；Damle等，J.Immunol.(1987)138：1779；Damle和Doyle，Int.J.Cancer(1987)40：519；Damle等，J.Immunol.(1986)137：2814。
参考如上所述基线测定，进行试验。可在多个时间点从底室取样，测定存在的标记大分子。可进行各种对照，如下所述。具体地说，可使用具有改善的耐受性的治疗药物作为阴性对照，以建立不存在引起VLS的治疗药物时发生的基线渗漏。例如，IL-2突变蛋白F42E和Y107R是耐受性提高的取代突变蛋白。参见，2005年3月5日提交的共同拥有、共同待批的美国临时专利申请序列号60/550,868。体内外模型中，就NK和T细胞增殖，以及NK/LAK/ADCC活性方面而言，这些突变蛋白也维持效应子作用。此外，可采用阳性对照，例如去污剂和已知可破坏细胞单层的物质等，例如皂苷。还可使用培养液对照。
如上所述，使用本发明方法测定治疗剂如IL-2突变蛋白的患者耐受性。已知许多IL-2突变蛋白，如下所述。然而，本发明方法也可应用于本文未具体描述的其它IL-2突变蛋白。这些IL-2突变蛋白可来源于任何种类的IL-2。这些变体应保留天然多肽所需的生物学活性，使得给予患者时，含变体多肽的药物组合物具有与含天然多肽的药物组合物相同的治疗效果。即，变体多肽可以类似于天然多肽的方式，用作药物组合物中的治疗活性成分。本领域已知测定变体多肽是否保留所需的生物学活性的方法，因而可用作药物组合物中的治疗活性成分。可采用特别用于测定天然多肽或蛋白质活性的试验来测定生物学活性。天然或天然来源的IL-2的合适的生物学活性突变蛋白可以是该多肽的片段、类似物以及衍生物，如上所述。
例如，可通过在编码感兴趣天然多肽的克隆DNA序列中产生突变来制备多肽的氨基酸序列变体。诱变和改变核苷酸序列的方法是本领域所所熟知的。例如，参见以下文献：Walker和Gaastra编，(1983)，《分子生物学技术》(Techniques in Molecular Biology)，(MacMillan Publishing Company，New York)；Kunkel，(1985)，Proc.Natl.Acad.Sci.，USA 82：488-492；Kunkel等，(1987)，Methods Enzymol.，154：367-382；Sambrook等，(1989)，《分子克隆：实验室手册》(Molecular Cloning：A Laboratory Manual)，(冷泉港实验室出版社，Plainview，New York)；美国专利号4,873,192；和本文引用的参考文献。不影响感兴趣的多肽的生物学活性的合适氨基酸取代的指南可参见Dayhoff等，(1978)，在《蛋白质序列和结构图》(Atlas of Protein Sequence andStructure)(Natl.Biomed.Res.Found.，Washington，D.C.)中所述的模型。优选保守性取代，例如用具有相似性质的另一种氨基酸替换一种氨基酸。保守性取代的例子包括但不限于：GlyAla、ValIleLeu、AspGlu、LysArg、AsnGln和PheTrpTyr。
可在专业文献中找到残基取代、删除或***来改变IL-2蛋白质诸区域的指导。例如，参见以下文献所述的结构/功能关系和/或结合研究：Bazan，(1992)，Science，257：410-412；McKay，(1992)，Science，257：412；Theze等，(1996)，Immunol.Today，17：481-486；Buchli和Ciardelli，(1993)，Arch.Biochem.Biophys.，307：411-415；Collins等，(1988)，Proc.Natl.Acad.Sci.，USA 85：7709-7713；Kuziel等，(1993)，J.Immunol.，150：5731；Eckenberg等，(1997)，Cytokine，9：488-498。
在构建感兴趣IL-2多肽的变体的过程中，进行的修饰应使变体继续具有所需活性。显然，在编码变体多肽的DNA中产生的任何突变不能将该序列置于读码框外，并且优选不会产生可能产生二级mRNA结构的互补区域。参见，欧洲专利申请号75,444。
IL-2的生物学活性变体一般与用作比较基准的参比IL-2多肽分子，例如天然的人IL-2具有至少约70％、优选至少约80％、更优选至少约90％-95％或更高、最优选至少约98％、99％或更高的氨基酸序列相同性。序列相同性百分比可用Smith-Waterman同源性检索算法，以亲族缺口(affine gap)检索测定，所用参数为缺口开放罚分12、缺口延伸罚分2和BLOSUM矩阵62。Smith-Waterman同源性检索算法的说明见Smith和Waterman，(1981)，Adv.Appl.Math.2：482-489。例如，变体可有少至1-15个氨基酸残基、少至1-10个氨基酸残基，如6-10，少至5个、少至4个、3个、2个、甚至1个氨基酸残基不同。
就两条氨基酸序列的最佳比对而言，与参比氨基酸序列相比，变体氨基酸序列的连续区段可具有相同的氨基酸数、加入的氨基酸残基或删除的氨基酸残基。用于和参比氨基酸序列比较的连续区段包含至少20个连续的氨基酸残基，可以是30、40、50或更多个氨基酸残基。可对与保守性残基取代或缺口相关的序列相同性进行校正(参见Smith-Waterman同源性检索算法)。感兴趣的天然IL-2多肽的生物学活性变体与天然多肽相比有少至1-15个氨基酸残基、少至1-10个氨基酸残基，如6-10，少至5个、少至4个、3个、2个、甚至1个氨基酸残基的不同。
具有IL-2活性的多肽的精确化学结构取决于许多因素。由于分子中存在可电离的氨基和羧基，获得的特定多肽可以是酸性盐或碱性盐，或中性形式。在合适的环境中可保留它们的生物学活性的所有这些制剂包括在本文所用具有IL-2活性的多肽的定义中。此外，可通过利用糖分子衍生化(糖基化)或其它补充分子，例如脂质、磷酸、乙酰基团等增加该多肽的一级氨基酸序列。也可通过和糖偶联来增加该多肽的一级氨基酸序列。这种增加的某些方面可通过生产宿主的翻译后加工***来实现；其它这种修饰可在体外引入。在任何情况中，只要多肽的IL-2活性未遭破坏，这种修饰就包括在本文所用的IL-2多肽的定义中。在各种试验中，期望这种修饰可通过提高或降低该多肽的活性来定量或定性地影响其活性。此外，可通过氧化、还原或其它衍生化方式来修饰链中的单个氨基酸残基，可切割该多肽而得到保留活性的片段。这种不破坏活性的改变不将这种多肽序列排除在本文所用感兴趣的IL-2多肽的定义之外。
本领域为多肽变体的制备和使用提供了基本指导。在制备IL-2变异蛋白过程中，本领域的技术人员不难确定对天然蛋白质的核苷酸或氨基酸序列的哪种修饰将导致产生适合用作本发明方法药物组合物中治疗活性组分的变体。
用于本发明方法中的IL-2或其变异蛋白可以是任何来源，但优选重组产生。“重组IL-2”或“重组IL-2变异蛋白”指具有与天然序列IL-2相当生物学活性并通过例如Taniguchi等，(1983)，Nature，302：305-310和Devos，(1983)，NucleicAcids Research，11：4307-4323所述重组DNA技术制备的白介素-2或其变体；或者如Wang等，(1984)，Science，224：1431-1433所述经突变而改变的IL-2。大体上，克隆编码IL-2的基因，然后在转化的生物，优选微生物中表达。宿主生物能在表达条件下表达外来基因而产生IL-2。生长、收集、破裂(disrupt)或自细胞者中提取IL-2的方法的基本描述见，例如全文纳入本文作为参考的美国专利号4,604,377；4,738,927；4,656,132；4,569,790；4,748,234；4,530,787；4,572,798；4,748,234。
例如IL-2突变蛋白，参见欧洲专利(EP)公布号EP 136,489(公开了天然存在的IL-2的氨基酸序列中的一种或多种以下改变：Asn26-Gln26；Trp121-Phe121；Cys58-Ser58或Ala58；Cys105-Ser105或Ala105；Cys125-Ser125或Ala125；删除Arg 120之后的所有残基；和它们的Met-1形式)；1983年10月13日提交的欧洲专利申请号83306221.9所述的重组IL-2突变蛋白(1984年5月30日以公布号EP 109,748公布)，该专利是比利时专利号893,016和共有的美国专利4,518,584的等同专利(这两份专利公开了重组的人IL-2突变蛋白，其中天然人IL-2编号的125位半胱氨酸被删除或被中性氨基酸所取代；丙氨酰-ser125-IL-2；和脱-丙氨酰-ser125-IL-2)。也参见美国专利号4,752,585(该专利公开了以下IL-2突变蛋白：ala104 ser125 IL-2、ala104 IL-2、ala104 ala125 IL-2、val104 ser125IL-2、val104 IL-2、val104 ala125 IL-2、脱-ala1 ala104 ser125 IL-2、脱-ala1 ala104IL-2、脱-ala1 ala104 ala125 IL-2、脱-ala1 val104 ser125 IL-2、脱-ala1 val104 IL-2、脱-ala1 val104 ala125 IL-2、脱-ala1脱-pro2 ala104 ser0125 IL-2、脱-ala1脱-pro2ala104 IL-2、脱-ala1脱-pro2 ala104 ala125IL-2、脱-ala1脱-pro2 val104 ser125IL-2、脱-ala1脱-pro2 val104 IL-2、脱-ala1脱-pro2 val104 ala125 IL-2、脱-ala1脱-pro2脱-thr3 ala104 ser125 IL-2、脱-ala1脱-pro2脱-thr3 ala104 IL-2、脱-ala1脱-pro2脱-thr3 ala104 ala125 IL-2、脱-ala1脱-pro2脱-thr3 val104 ser125 IL-2、脱-ala1脱-pro2脱-thr3 val104 IL-2、脱-ala1脱-pro2脱-thr3 val104 ala125IL-2、脱-ala1脱-pro2脱-thr3脱-ser4 ala104 ser125 IL-2、脱-ala1脱-pro2脱-thr3脱-ser4 ala104 IL-2、脱-ala1脱-pro2脱-thr3脱-ser4 ala104 ala125 IL-2、脱-ala1脱-pro2脱-thr3脱-ser4 val104 ser125 IL-2、脱-ala1脱-pro2脱-thr3脱-ser4 val104 IL-2、脱-ala1脱-pro2脱-thr3脱-ser4 val104 ala125 IL-2、脱-ala1脱-pro2脱-thr3脱-ser4脱-ser5 ala104 ser125IL-2、脱-ala1脱-pro2脱-thr3脱-ser4脱-ser5 ala104 IL-2、脱-ala1脱-pro2脱-thr3脱-ser4脱-ser5 ala104ala125 IL-2、脱-ala1脱-pro2脱-thr3脱-ser4脱-ser5 val104 ser125IL-2、脱-ala1脱-pro2脱-thr3脱-ser4脱-ser5 val104 IL-2、脱-ala1脱-pro2脱-thr3脱-ser4脱-ser5 val104 ala125 IL-2、脱-ala1脱-pro2脱-thr3脱-ser4脱-ser5脱-ser6ala104 ala125 IL-2、脱-ala1脱-pro2脱-thr3脱-ser4脱-ser5脱-ser6 ala104IL-2、脱-ala1脱-pro2脱-thr3脱-ser4脱-ser5脱-ser6 ala104 ser125 IL-2、脱-ala1脱-pro2脱-thr3脱-ser4脱-ser5脱-ser6 val104 ser125IL-2、脱-ala1脱-pro2脱-thr3脱-ser4脱-ser5脱-ser6 val104 IL-2和脱-ala1脱-pro2脱-thr3脱-ser4脱-ser5脱-ser6 val104 ala125IL-2)和美国专利号4,931、543(该专利公开了用于本文实施例的IL-2突变蛋白脱-丙氨酰-1，丝氨酸-125人IL-2以及其它IL-2突变蛋白)。
也参见欧洲专利公布号EP 200,280(1986年12月10日公布)，该专利公开了重组IL-2突变蛋白，其中104位的甲硫氨酸被保守性氨基酸取代。例子包括以下突变蛋白：ser4脱-ser5 ala104 IL-2；脱-ala1脱-pro2脱-thr3脱-ser4脱-ser5 ala104 ala125 IL-2；脱-ala1脱-pro2脱-thr3脱-ser4脱-ser5 glu104 ser125IL-2；脱-ala1脱-pro2脱-thr3脱-ser4脱-ser5 glu104 IL-2；脱-ala1脱-pro2脱-thr3脱-ser4脱-ser5 glu104 ala125IL-2；脱-ala1脱-pro2脱-thr3脱-ser4脱-ser5脱-ser6 ala104 ala125 IL-2；脱-ala1脱-pro2脱-thr3脱-ser4脱-ser5脱-ser6 ala104 IL-2；脱-ala1脱-pro2脱-thr3脱-ser4脱-ser5脱-ser6 ala104ser125 IL-2；脱-ala1脱-pro2脱-thr3脱-ser4脱-ser5脱-ser6 glu104 ser125IL-2；脱-ala1脱-pro2脱-thr3脱-ser4脱-ser5脱-ser6 glu104 IL-2和脱-ala1脱-pro2脱-thr3脱-ser4脱-ser5脱-ser6 glu104 ala125 IL-2。也参见欧洲专利申请号EP 118,617和美国专利号5,700,913，该两份专利公开了以丙氨酸取代天然IL-2的甲硫氨酸作为N-末端氨基酸的未糖基化人IL-2变体；删除了起始甲硫氨酸从而使脯氨酸是N-末端氨基酸的未糖基化人IL-2；和在N-末端甲硫氨酸和脯氨酸之间***丙氨酸的未糖基化人IL-2。
其它IL-2突变蛋白包括公开于WO 99/60128的(用组氨酸或异亮氨酸取代20位的天冬氨酸，用精氨酸、甘氨酸或异亮氨酸取代88位的天冬酰胺，或者用亮氨酸或谷氨酸取代126位的谷氨酰胺)，据报道这些突变蛋白对T细胞受体表达细胞所表达的高亲和力IL-2受体具有优于NK细胞所表达受体的选择性活性并且IL-2毒性降低；美国专利号5,229,109所公开的突变蛋白(用丙氨酸取代38位的精氨酸，或者用赖氨酸取代42位的苯丙氨酸)，与天然IL-2相比这些突变蛋白显示与高亲和力IL-2受体结合(能力)降低但仍能激活LAK细胞；国际公布号WO 00/58456所公开的突变蛋白(改变或删除天然IL-2中天然存在的(x)D(y)序列，其中D是天冬氨酸，(x)是亮氨酸、异亮氨酸、甘氨酸或缬氨酸，(y)是缬氨酸、亮氨酸或丝氨酸)；公开于国际公布号WO 00/04048中的IL-2 p1-30肽(对应于IL-2的前30个氨基酸，该肽含有IL-2的整个α-螺旋A并能与IL-2受体的b链相互作用)；和公开于WO 00/04048的IL-2 p1-30肽的突变形式(用赖氨酸取代20位的天冬氨酸)。
具有预计的毒性降低的IL-2突变蛋白的其它例子公开于2004年3月5日提交的美国临时专利申请序列号60/550,868中。这些突变蛋白包括在成熟人IL-2序列的125位用丝氨酸取代半胱氨酸的成熟人IL-2氨基酸序列，并且在该成熟人IL-2序列中具有至少一处额外的氨基酸取代从而使该突变蛋白具有以下功能特征：在可比试验条件下与类似量的脱-丙氨酰-1、C125S人IL-2或C125S人IL-2相比，1)能维持或提高天然杀伤(NK)细胞的增殖，和2)诱导NK细胞产生的致炎细胞因子水平降低。在一些实施方式中，此额外取代选自：T7A、T7D、T7R、K8L、K9A、K9D、K9R、K9S、K9V、K9W、T10K、T10N、Q11A、Q11R、Q11T、E15A、H16D、H16E、L19D、L19E、D20E、124L，K32A、K32W、N33E、P34E、P34R、P34S、P34T、P34V、K35D、K35I、K35L、K35M、K35N、K35P、K35Q、K35T、L36A、L36D、L36E、L36F、L36G、L36H、L36I、L36K、L36M、L36N、L36P、L36R、L36S、L36W、L36Y、R38D、R38G、R38N、R38P、R38S、L40D、L40G、L40N、L40S，T41E、T41G、F42A、F42E、F42R、F42T、F42V、K43H、F44K、M46I、E61K、E61M、E61R、E62T、E62Y、K64D、K64E、K64G、K64L、K64Q、K64R、P65D、P65E、P65F、P65G、P65H、P65I、P65K、P65L、P65N、P65Q、P65R、P65S、P65T、P65V、P65W、P65Y、L66A、L66F、E67A、L72G、L72N、L72T、F78S、F78W、H79F、H79M、H79N、H79P、H79Q、H79S、H79V、L80E、L80F、L80G、L80K、L80N、L80R、L80T、L80V、L80W、L80Y、R81E、R81K、R81L、R81M、R81N、R81P、R81T、D84R、S87T、N88D、N88H、N88T、V91A、V91D、V91E、V91F、V91G、V91N、V91Q、V91W、L94A、L94I、L94T、L94V、L94Y、E95D、E95G、E95M、T102S、T102V、M104G、E106K、Y107H、Y107K、Y107L、Y107Q、Y107R、Y107T、E116G、N119Q、T123S、T123C、Q126I和Q126V；其中氨基酸残基位置相对于成熟人IL-2氨基酸序列编号。在其它实施方案中，这些突变蛋白包括在成熟人IL-2序列的125位用丙氨酸取代半胱氨酸的成熟人IL-2氨基酸序列，并且在该成熟人IL-2序列中具有至少一处额外的氨基酸取代从而使该突变蛋白具有相同的功能特征。在一些实施方案中，此额外取代选自：T7A、T7D、T7R、K8L、K9A、K9D、K9R、K9S、K9V、K9W、T10K、T10N、Q11A、Q11R、Q11T、E15A、H16D、H16E、L19D、L19E、D20E、124L、K32A、K32W、N33E、P34E、P34R、P34S、P34T、P34V、K35D、K35I、K35L、K35M、K35N、K35P、K35Q、K35T、L36A、L36D、L36E、L36F、L36G、L36H、L36I、L36K、L36M、L36N、L36P、L36R、L36S、L36W、L36Y、R38D、R38G、R38N、R38P、R38S、MOD、L40G、L40N、L40S、T41E、T41G、F42A、F42E、F42R、F42T、F42V、K43H、F44K、M46I、E61K、E61M、E61R、E62T、E62Y、K64D、K64E、K64G、K64L、K64Q、K64R、P65D、P65E、P65F、P65G、P65H、P65I、P65K、P65L、P65N、P65Q、P65R、P65S、P65T、P65V、P65W、P65Y、L66A、L66F、E67A、L72G、L72N、L72T、F78S、F78W、H79F、H79M、H79N、H79P、H79Q、H79S、H79V、L80E、L80F、L80G、L80K、L80N、L80R、L80T、L80V、L80W、L80Y、R81E、R81K、R81L、R81M、R81N、R81P、R81T、D84R、S87T、N88D、N88H、N88T、V91A、V91D、V91E、V91F、V91G、V91N、V91Q、V91W、L94A、L94I、L94T、L94V、L94Y、E95D、E95G、E95M、T102S、T102V、M104G、E106K、Y107H、Y107K、Y107L、Y107Q、Y107R、Y107T、E116G、N119Q、T123S、T123C、Q126I和Q126V；其中氨基酸残基位置相对于成熟人IL-2氨基酸序列编号。在其它实施方案中，这些突变蛋白包括在成熟人IL-2序列内至少一处额外的氨基酸取代的成熟人IL-2氨基酸序列，从而使该突变蛋白具有相同的功能特征。在一些实施方案中，此额外取代选自：T7A、T7D、T7R、K8L、K9A、K9D、K9R、K9S、K9V、K9W、T10K、T10N、Q11A、Q11R、Q11T、E15A、H16D、H16E、L19D、L19E、D20E、124L、K32A、K32W、N33E、P34E、P34R、P34S、P34T、P34V、K35D、K35I、K35L、K35M、K35N、K35P、K35Q、K35T、L36A、L36D、L36E、L36F、L36G、L36H、L36I、L36K、L36M、L36N、L36P、L36R、L36S、L36W、L36Y、R38D、R38G、R38N、R38P、R38S、L40D、L40G、L40N、L40S、T41E、T41G、F42A、F42E、F42R、F42T、F42V、K43H、F44K、M46I、E61K、E61M、E61R、E62T、E62Y、K64D、K64E、K64G、K64L、K64Q、K64R、P65D、P65E、P65F、P65G、P65H、P65I、P65K、P65L、P65N、P65Q、P65R、P65S、P65T、P65V、P65W、P65Y、L66A、L66F、E67A、L72G、L72N、L72T、F78S、F78W、H79F、H79M、H79N、H79P、H79Q、H79S、H79V、L80E、L80F、L80G、L80K、L80N、L80R、L80T、L80V、L80W、L80Y、R81E、R81K、R81L、R81M、R81N、R81P、R81T、D84R、S87T、N88D、N88H、N88T、V91A、V91D、V91E、V91F、V91G、V91N、V91Q、V91W、L94A、L94I、L94T、L94V、L94Y、E95D、E95G、E95M、T102S、T102V、M104G、E106K、Y107H、Y107K、Y107L、Y107Q、Y107R、Y107T、E116G、N119Q、T123S、T123C、Q126I和Q126V；其中氨基酸残基位置相对于成熟人IL-2氨基酸序列编号。除了在成熟人IL-2序列1位删除了起始丙氨酸残基之外，美国临时专利申请序列号60/550,868中描述的其它突变蛋白包括上述突变蛋白。
IL-2突变蛋白也可以是IL-2融合物或偶联物，所述融合物或偶联物包括与第二蛋白融合或与聚脯氨酸或水溶性聚合物共价偶联的IL-2，以降低给药频率或提高IL-2耐受性。例如，可采用本领域已知的方法(参见，WO 01/79258)，使IL-2突变蛋白与人白蛋白或白蛋白片段融合。或者，可采用本领域已知的方法(参见，例如美国专利号4,766,106；5,206,344和4,894,226)，使IL-2突变蛋白与聚脯氨酸或聚乙二醇均聚物和聚氧乙基化多元醇共价偶联，其中所述均聚物未取代或一端被烷基取代，所述多元醇未取代。
本发明分析方法也可由于检测其它治疗药物，例如其它免疫治疗剂、细胞因子和淋巴因子突变蛋白，以及免疫毒素和小分子化学治疗剂。这些药物包括但不限于：白介素，例如IL-1、IL-2、IL-3、IL-4，IL-5、IL-12和这些分子的突变蛋白；干扰素，例如但不限于IFN-α、IFN-β、IFN-γ及其突变蛋白；GM-CSF和GM-CSF的突变蛋白；肿瘤坏死因子，例如TNF-α和TNF-β及这些分子的突变蛋白；抗神经节苷抗体、环孢素A、环磷酰胺、丝裂霉素C、FK973、野百合碱吡咯(monocrotalinepyrrole)和阿糖胞苷及这些分子的突变蛋白；以及各种免疫毒素。
III.实验
下面是进行本发明的具体实施方式的例子。提供这些实施例仅仅是为了说明目的，而不是为了以任何方式限制本发明的范围。
为确保使用的各种数值的准确性(例如，量、温度等)，进行了研究，但应当允许一定的实验误差和偏差。
材料和方法
A.培养液和试剂：
-PBS(不含Ca/Mg)，冰冷；
-培养液200(Cascade Biologics，Portland，OR)；
-培养液200PRF(Cascade Biologics，Portland，OR)；
-LSGS：低血清生长添加剂(50×)。(Cascade Biologics，Portland，OR)。补给性培养液中这些组分的最终浓度为：2％v/v胎牛血清；1μg/ml氢化可的松；10ng/ml人表皮生长因子；10ng/ml人表皮生长因子；3ng/ml基本的成纤维细胞生长因子和10g/ml肝素；
-PSA溶液(Cascade Biologics，Portland，OR)：完全培养液中的最终浓度含有100U/ml青霉素，100μg/ml硫酸链霉素和0.25μg/ml两性霉素B；
-胰蛋白酶(0.25％)/EDTA(0.1％)(Cellgro，Hemdon，VA)；
-FITC-白蛋白(50mg)(Sigma，St.Louis，MO)；
-FITC-BSA储备液(20×)。FITC-BSA悬浮在2.5ml完全培养液200中。
-人AB血清(SeraCare Life Sciences，Oceanside，CA)
-人AB培养液(500mL)
RPMI(不含酚红)............................................426.5ml
人AB-加热灭活*............................................50ml
青霉素/链霉素(终浓度100μg/ml).................................5ml
HEPES(1M储备液，终浓度25mM)....................................12.5ml
L-谷氨酰胺(100×储备液，终浓度2mM).............................5ml
两性霉素B(250μg/ml储备液，终浓度0.5μg/ml)....................1ml
4℃下，储存培养液至多4周。
*4℃下过夜解冻血清，56℃加热灭活45分钟
-RPMI：冰冷，不含血清
-PBS/EDTA：5.7ml 0.5M EDTA加入到500ml PBS(不含Ca/Mg)中，最终pH7.2；
-台盼蓝染料(Invitrogen Life Technologies，Carlsbad，CA，或等价的0.4％溶液)；
-10％皂苷储备液：2.5g皂苷在25ml PBS中，4℃下储存；
-完全培养液200：
培养液200/培养液200PRF..........................................500ml
LSGS............................................................10ml
PSA溶液.........................................................1ml
B.细胞培养：
HUVEC(人脐静脉内皮细胞)得自Cascade Biologics，Portland，OR。每小管含有≥5×105个细胞。通过浸入37℃的水，解冻小管。用完全培养液200将细胞稀释至10ml，采用台盼蓝计数确定每毫升中的活细胞数。然后，再用完全培养液200将小管内容物稀释至1.25×104活细胞/毫升。将5ml或15ml细胞悬浮液分别加入到25cm2或75cm2培养瓶中，在培养瓶中涡旋培养液以分散细胞。在湿润的5％CO2孵育箱中，37℃下孵育培养物。24-36小时后，将培养液换成新鲜补给性培养液200，以后每天换液，直到培养物达到约80％融合。这大概需要5-6天。
然后如下所述传代培养HUVEC。除去培养液，将胰蛋白酶/EDTA溶液加入到培养瓶中，通过轻拍和吸取并加入完全培养液200取出细胞，将细胞转移至15ml无菌锥形试管中。细胞在1000rpm下离心10分钟，计数，并以2.5×103活细胞/平方厘米接种。
2或3代期间的细胞在冻存培养液(90％FBS，10％DMSO)中冷冻保存，储存在液氮中备用。
实施例1
筛选IL-2突变蛋白的体外试验
为了试验预测IL-2突变蛋白患者耐受性的能力，进行了以下试验。试验中使用两种耐受性提高的IL-2突变蛋白，作为原理证据。这两种突变蛋白是F42E和Y107R取代突变蛋白。参见2005年3月5日提交的共同拥有、共同待批的美国临时专利申请序列号60/550,868。体内外模型中，在NK和T细胞增殖，以及NK/LAK/ADCC活性方面，这些突变蛋白也保持了效应子功能。此外，使用由Emeryville，CA的Chiron Corporation生产的Proleukin作为引起VLS的代表性IL-2分子。该制剂中的IL-2是重组产生的，未糖基化的人IL-2突变蛋白，称为aldesleukin，其删除了起始丙氨酸残基并用丝氨酸残基取代125位半胱氨酸残基(称为脱-丙氨酰-1，丝氨酸-125人白介素-2)而与天然人IL-2氨基酸序列不同。该IL-2突变蛋白在大肠杆菌中表达，然后如美国专利号4,931543所述经渗滤和离子交换层析纯化。IL-2制剂以Proleukin商品名提供，为无菌、白色至灰白色无防腐剂的冻干粉，每小管含有1.3mg蛋白质(22MIU)。
如下制备本试验中使用的淋巴因子-活化的杀伤(LAK)细胞。从正常供体收集全血，置于Vacutainer CPT管(ACDA，Becton Dickinson，Franklin Lakes，NJ)中。根据CPT生产商的说明书分离PBMC。简言之，倒置试管以混合，1500-1800×g下离心20分钟，除去血沉棕黄层，置于锥形管中，用PBS 2％FBS洗(最多300×g，15分钟)。除去上清液，洗涤细胞2次。将PBMC悬浮在RPMI-10AB培养液中，采用血细胞计数器进行台盼蓝排斥试验计数。将PBMC以1.5×106细胞/毫升悬浮在RPMI-10AB中(不含酚红)。24孔组织培养板的每孔中加入1ml PBMC悬浮液，并加入含50nm所需IL-2突变蛋白的1ml/孔37℃RPMI-10AB培养液。盖上培养板，在湿润的37℃、5％CO2培养箱中孵育3天，然后将培养板置于冰上约30分钟，除去上清液，4℃，300×g下离心5分钟，收集在冰上的50ml锥形试管中。每孔中加入1ml冰冷的PBS/EDTA，孵育20分钟。取出粘附细胞，加入到冰上的试管中。每孔中加入1ml冷的PBS。4℃，将50ml锥形试管在300×g下离心5分钟。同时，洗涤各孔，将洗涤液收集在冰上50ml锥形试管中。倒出上清液，细胞团悬浮在12ml冷RPMI中，加入到PBS洗涤液中。4℃，300×g下再次离心5分钟。再次倒出上清液，悬浮细胞团，离心，如上所述。将洗涤的细胞悬浮在冷的完全RPMI中，台盼蓝排斥试验计数。
将600μl完全培养液200PRF加入到胶原涂覆转移孔(Transwell-COLTM，胶原涂覆PTFE膜，Costar(Corning，Inc.，Coming，NY)的下室中，从培养瓶中取出代系小于5的HUVEC，以1.0×106细胞/毫升悬浮在完全培养液200PRF中。将100μlHUVEC悬浮液加入到转移孔的上室中。设立含培养液但无细胞的对照转移孔，以测定FITC-BSA穿过胶原膜的最大转移。将转移孔在湿润的5％CO2培养箱中，37℃孵育3天，以建立融合单层。第4天，用结晶紫(Sigma，St.Louis，MO；2.3％w/v，草酸铵0.1％w/v，乙醇，SD3A 20％v/v)染色单层，检查融合。当单层达到90％融合时进行试验。
从转移孔的上室中全部取出完全培养液200，将100μl含FITC-BSA(1mg/ml)的完全培养液200加入到试验和对照转移孔中。用铝箔覆盖培养板，30分钟时，从转移孔的下室中取出10μl样品，置于具有透明底部的黑色96-孔板中。然后，补充10μl完全培养液至下室中。将40μl完全培养液200加入到黑色96-孔板中，混合。利用IL-2突变蛋白-荧光素(485/575nm，1.0s)进行，样品读数。基于荧光强度读数，再次分配转移孔，对于90％融合或更高的融合单层，读数应低于6,000。孵育3小时后，培养板再次取样，读数，如上所述。3小时强度读数作为基线或时间0时的读数。
FITC-BSA从上室除去，将100μl含FITC-BSA(1mg/ml)的试验化合物加入到上室中：(1)IL-2突变蛋白F42E、Y107R或Proleukin(25nM)；(2)3天25nM IL-2-突变蛋白-刺激的PBMC上清液；(3)3天25nM IL-2-突变蛋白-刺激的LAK细胞；和(4)3天25nM IL-2-突变蛋白-刺激的LAK细胞的上清液。另外，采用0.05％皂苷作为阳性对照(皂苷能破坏单层)，完全培养液200用作培养液对照。用铝箔覆盖培养板，37℃孵育。与试验化合物孵育3小时后收集样品，荧光读数，如上所述。
结果如图1-4所示。所示数据例子为3次独立的实验，每种试验条件n＝5或6，图中数据来自3位不同的正常人供体。如图1A-1C所示，Proleukin-刺激的PBMC(LAK)和上清液导致内皮细胞单层明显损伤。在3位受试供体的2位中，与Proleukin相比，F42E和Y107R突变蛋白的VLS显著降低。如图2A-2C所示，3位受试供体的2位中，仅Proleukin-诱导的LAK细胞显示超过培养液对照样品的VLS显著增加，但培养液对照与F42E或Y107R之间没有显著性差异。如图3A-3C所示，仅来自IL-2-诱导的PBMC培养物上清液不足以在体外明显诱导VLS综合征。如图4A-4C所示，仅Proleukine或F42E和Y107R都不能直接引起EC单层损伤。如图1-4所示，单独用F42E和Y107R之间，F42E-和Y107R-刺激的上清液之间，单独用F42E-和Y107R-刺激的LAK细胞与培养液对照之间没有显著性差异。
因此，测定FITC-BSA穿过内皮细胞融合单层的渗透性的VLS的体外模型有效且一致。
因此，描述了用于预测IL-2突变蛋白患者耐受性的新型体外试验***。虽然详细描述了本发明优选的实施方式，但应理解，不背离权利要求书所述的本发明精神和范围，可进行各种明显改变。
Claims (19)
1.一种预测患者对选定的治疗药物耐受或不耐受的体外方法，所述方法包括：
(a)提供贴附于粘附基质的内皮细胞融合单层；
(b)使所述单层与以下成分接触：
(i)所述选定的治疗药物或淋巴因子活化的杀伤(LAK)细胞制剂，其中，通过用所述治疗药物或所述LAK细胞的上清液激活外周血单核细胞产生所述LAK细胞，和
(ii)可检测标记的大分子，其中，当所述单层保持完整时，所述融合单层可基本上保留所述可检测标记的大分子；
(c)在所述单层的完整性受损时，在所述可检测标记的大分子能穿过所述融合单层和所述粘附基质的条件下，孵育步骤(b)的所述单层一段时间；和
(d)检测穿过所述融合单层和所述粘附基质的大分子，作为患者对所述治疗药物耐受或不耐受的指标。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述治疗药物是免疫治疗剂、免疫毒素或小分子化学治疗剂。
3.如权利要求2所述的方法，其特征在于，所述免疫治疗剂是白介素-2(IL-2)突变蛋白。
4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述粘附基质包括胶原基质。
5.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述内皮细胞是人脐静脉内皮细胞(HUVEC)。
6.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述可检测标记的大分子是可检测标记的白蛋白。
7.如权利要求6所述的方法，其特征在于，所述可检测标记的白蛋白是标记的牛血清白蛋白(BSA)。
8.如权利要求7所述的方法，其特征在于，所述BSA是荧光标记的。
9.如权利要求8所述的方法，其特征在于，所述荧光标记是FITC。
10.一种预测患者对白介素-2(IL-2)突变蛋白耐受或不耐受的体外方法，所述方法包括：
(a)提供贴附于粘附基质的内皮细胞融合单层；
(b)使所述单层与以下成分接触：
(i)淋巴因子活化的杀伤(LAK)细胞制剂，其中，通过用所述IL-2突变蛋白激活外周血单核细胞产生所述LAK细胞，和
(ii)可检测标记的大分子，其中，当所述单层保持完整时，所述融合单层可基本上保留所述可检测标记的大分子；
(c)在所述单层的完整性受损时，在所述可检测标记的大分子能穿过所述融合单层和所述粘附基质的条件下，孵育步骤(b)的所述单层一段时间；和
(d)检测穿过所述融合单层和所述粘附基质的大分子，作为患者对IL-2突变蛋白耐受或不耐受的指标。
11.如权利要求10所述的方法，其特征在于，所述粘附基质包括胶原基质。
12.如权利要求10所述的方法，其特征在于，所述内皮细胞是人脐静脉内皮细胞(HUVEC)。
13.如权利要求10所述的方法，其特征在于，所述可检测标记的大分子是可检测标记的白蛋白。
14.如权利要求13所述的方法，其特征在于，所述可检测标记的白蛋白是标记的牛血清白蛋白(BSA)。
15.如权利要求14所述的方法，其特征在于，所述BSA是荧光标记的。
16.如权利要求15所述的方法，其特征在于，所述荧光标记是FITC。
17.一种涉及预测患者对白介素-2(IL-2)突变蛋白耐受或不耐受的体外方法，所述方法包括：
(a)提供贴附于粘附基质如胶原基质的人脐静脉内皮细胞(HUVEC)的融合单层；
(b)使所述单层与以下成分接触：
(i)淋巴因子活化的杀伤(LAK)细胞制剂，其中，通过用所述IL-2突变蛋白激活外周血单核细胞产生所述LAK细胞，和
(ii)荧光标记的白蛋白；
(c)在所述单层的完整性受损时，在所述荧光标记的白蛋白能穿过所述融合单层和所述粘附机制的条件下，孵育步骤(b)的所述单层一段时间；和
(d)检测穿过所述融合单层的荧光标记的白蛋白，作为患者对所述IL-2突变蛋白耐受或不耐受的指标。
18.如权利要求17所述的方法，其特征在于，所述荧光标记的白蛋白是标记的牛血清白蛋白(BSA)。
19.如权利要求18所述的方法，其特征在于，所述荧光标记是FITC。
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