JP2006519763A - 治療用ポリペプチドの投与法およびそのためのポリペプチド - Google Patents
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Abstract
Description
ポリペプチド治療剤および特に抗体系治療剤には、薬剤としての多大な可能性がある。その理由は、標的に対して顕著な特異性があり、固有の毒性が低いからである。しかし、重大な欠点が1点ある:これらは、複雑な大型分子であり、そのために比較的不安定で、プロテアーゼによる分解に弱い。従来の抗体およびそれに由来する断片または一本鎖構成体(例、scFv)の投与は、例えば消化管通過中に分解されるため、それほど有効でない。これは、従来の抗体薬剤は、経口、舌下、局所、鼻内、膣内、直腸内で、または吸入によって投与できないことを意味する。その理由は、それらがこれらの部位の低pHおよびこれらの部位および血中のプロテアーゼの作用に抵抗性がなく、および/またはそれらが大型であるからである。該薬剤は、これらの問題を一部でも克服するために、注射(静脈内、皮下など)で投与しなければならない。そのため、注射投与は、多くの短所を備えながらも最も頻繁に使用されている投与方法である。その短所とは、例えば次の通りである:(a)特に慢性疾患を治療する場合に患者の耐容性が低い;(b)薬剤が「救命手段」でない場合には、結果的には投与量による充足感が低くなる危険がある;(c)患者による自己投与の実施が困難である;(d)処置の無菌的実施に適した状況を得るのが難しい;(e)注射筒または針を正しく安全に使用するための専門的訓練が必要である。注射を必要としない治療用ポリペプチドの送達法は、費用/時間の節約となるだけでなく、対象にとってより便利でより快適でもある。
本発明の目的は、先行技術の問題を克服した、タンパク質治療分子の経口、舌下、局所、鼻内、膣内、直腸内、静脈内、皮下投与法または吸入による投与法を提供することである。前記治療分子を提供するのが、さらなる目的である。
本発明のある実施態様は、IgEに対する少なくとも1個の単一ドメイン抗体を含むポリペプチド構築物である。
本発明は、1個以上の標的分子に対する1個以上の単一ドメイン抗体を、それぞれ適切な剤型で、直接、あるいは送達を促進する成分を含有する組成物の一部として含むポリペプチド構築物に関する。
SerをSer、Thr、GlyおよびAsnで置換;
ArgをArg、His、Gln、LysおよびGluの1種類で置換;
LeuをLeu、Ile、Phe、Tyr、MetおよびValの1種類で置換;
ProをPro、Gly、AlaおよびThrの1種類で置換;
ThrをThr、Pro、Ser、Ala、Gly、HisおよびGlnの1種類で置換;
AlaをAla、Gly、ThrおよびProの1種類で置換;
ValをVal、Met、Tyr、Phe、IleおよびLeuの1種類で置換;
GlyをGly、Ala、Thr、ProおよびSerの1種類で置換;
IleをIle、Met、Tyr、Phe、ValおよびLeuの1種類で置換;
PheをPhe、Trp、Met、Tyr、Ile、ValおよびLeuの1種類で置換;
TyrをTyr、Trp、Met、Phe、Ile、ValおよびLeuの1種類で置換;
HisをHis、Glu、Lys、Gln、ThrおよびArgの1種類で置換;
GlnをGln、Glu、Lys、Asn、His、ThrおよびArgの1種類で置換;
AsnをAsn、Glu、Asp、GlnおよびSerの1種類で置換;
LysをLys、Glu、Gln、HisおよびArgの1種類で置換;
AspをAsp、GluおよびAsnの1種類で置換;
GluをGlu、Asp、Lys、Asn、Gln、HisおよびArgの1種類で置換;
MetをMet、Phe、Ile、Val、LeuおよびTyrの1種類で置換。
本発明のある態様は、アレルギーの症状緩和、治療および予防に適した治療化合物に関する。前記治療化合物は、IgEと相互作用し、アレルギー反応の原因である免疫応答カスケードを調節する。
本発明のポリペプチド構築物の送達に関する本発明の態様は、本明細書に開示の抗-IgE単一ドメイン抗体を含むポリペプチド構築物に限定されず、以下に示すように、どの標的にも適用できる。ポリペプチド構築物は、任意に上述の変形物を伴う1個以上の標的に対する単一ドメイン抗体を含むことができる。
本発明の別の態様は、細胞内部に治療ポリペプチドおよび/または作用物質を送達する方法および分子である。本発明のさらなる態様は、抗原提示細胞内部に抗原を送達し、それによって、該抗原への強力な免疫反応を誘発する方法および分子である。本発明のなおもさらなる態様は、血液-脳関門、肺-血液バリアなどの天然のバリアを通過する治療ポリペプチドおよび/または作用物質を送達する方法および分子を提供することである。
投与計画は、長期、毎日投与であることができる。「長期」は、少なくとも2週間、好ましくは数週間、数ヶ月または数年間であることを意味する。必要なこの投与量範囲の変更は、本明細書の内容に示される通常の実験によってのみ、当業者が決定できる。RemingtonのPharmaceutical Science(Martin, E. W., ed. 4)、Mack Publishing Co., Easton, PA参照。合併症の場合にも、個々の医師が投与量を調整できる。
図1:IgE領域を示す図
図2:pH2.2、pH3.2、pH4.2における基準およびペプシン処理TNF3EのELISA(100%は、1/100希釈で測定されたシグナルである)
図3:実験の設定
図4:ヒトのMMP12の触媒ドメインのタンパク質分解活性へのVHHクローンの阻害能
図5:ラマの血清におけるA431特異的抗体力価を検出するELISA
図6:ラマの血清におけるEGFR特異的抗体力価の検出
図7:ラマ024および025、ならびに、ラマ026および027の血清におけるEGFR特異的抗体力価の検出
図8:EGFRに対するファージの応答
図9:エピトープ特異的溶出選択手法によって同定されたクローン31個のアミノ酸のアラインメント
図10:エピトープ特異的溶出選択手順によって同定されたユニークなEGFR特異的クローン20個の細胞上(パネルA)または固相固定EGFR上(パネルB)のファージELISA
図11:レセプターの内部移行作用およびシグナリングに対するナノボディEGFR-lla42の作用。Her-14(パネルA)または3T3(パネルB)による、内部移行作用が可能な条件下でのEGFR-IIIa42の蛍光顕微鏡可視化。レセプターチロシンキナーゼ活性に対するEGFR-IIIa42の作用を示すウェスタンブロットをパネルCに示す。
図12:治療タンパク質、毒性化合物、薬剤またはポリヌクレオチドを送達するための内部移行レセプターに対するVHHの使用を示す図
(表の簡単な説明)
表1:実施例1に記載の免疫化スキーム
表2:実施例1に記載のベクター特異的プライマーを用いたPCRによる挿入の存在
表3:実施例1に記載の一次選択
表4:実施例1に記載の一次選択からレスキューされたファージを用いた二次選択
表5:実施例1に記載のニュートラアビジンコーティング管を用いた2回目の選択
表6:実施例1に記載のELISAにおいて試験されるクローンの数に対するヒトIgEおよびキメラIgEの両方への結合について陽性を記録するクローンの数
表7:処置スケジュール
表8:実施例7および8に記載の異なるラマおよび組織由来のライブラリー、それらの多様性および挿入%の概要
表9:免疫化スケジュールおよび組織採集物
表10:構築されたライブラリーの概要
表11:エピトープ特異的溶出選択手順の概要
表12:内部移行作用選択手順の概要
表13:プライマー配列
表14:配列リスト
IgE
実施例1:IgEに対するVHH
実施例2:抗-IgEのVHH製剤
実施例3:抗IgE製剤
実施例4:抗TNF-αの選択
実施例5:ヒトTNFαに特異的な抗体断片の安定性試験
実施例6:マウスにおける抗-ヒトTNFα特異的VHHの経口投与
実施例7:IBDの動物モデルにおける効力
実施例8:免疫化
実施例9:レパートリークローニング
実施例10:ライブラリーのレスキューおよびファージ調製
実施例11:ヒトMMP-12特異的VHHの選択
実施例12:選択されたVHHの特異性
実施例13:選択されたVHHの多様性
実施例14:VHHの発現および精製
実施例15:選択されたVHHの機能的特徴づけ:比色法におけるVHHによるMMP-12のタンパク質分解活性の阻害
実施例16:肺送達のための抗-MMP12 VHHの製剤
実施例17:免疫化
実施例18:レパートリークローニング
実施例19:ライブラリーのレスキューおよびファージ調製
実施例20:ヒト-IFNγ VHHの選択
実施例21:選択されたVHHの多様性
実施例22:VHHの発現および精製
実施例23:抗-IFNγ VHHの局所適用
実施例24:抗-TNFα VHH#3EのVHH-CDR3の発現
実施例25:免疫化
実施例26:免疫応答の評価
実施例27:重鎖抗体断片(VHH)レパートリーのクローニング
実施例28:クローン化レパートリーの評価
実施例29:EGFR特異的ナノボディの同定のための複数選択ストラテジー
実施例30:EGFR特異的ナノボディの特徴づけ
実施例31:EGFレセプターが媒介するナノボディの細胞内部移行
実施例32:ラマの免疫化
実施例33:レパートリークローニング
実施例34:ライブラリーのレスキュー、ファージ調製
実施例35:選択
実施例36:スクリーニング
実施例37:細胞内部移行VHHについてのスクリーニング
実施例38:VHHが阻害するPDK1-Akt相互作用についてのスクリーニング
実施例39:二重特異性構築物の作製
実施例40:腫瘍細胞のエンドサイトーシスおよび溶解
実施例41:本発明の抗-標的-単一ドメイン抗体間の相同性の計算
実施例42:抗血清アルブミンVHHに融合したVHH-CDR3断片を含む二重特異性構築物の構築
IgE
実施例1:IgEに対するVHH
2匹のラマを、ヒトIgE、Scripps laboratories, Cat nr. I0224、で免疫化した。以下の免疫化スキームを、表1に従って使用した。
- 最後の抗原注射4日後と10日後との間の免疫血液150ml
- 最後の抗原注射4日後のリンパ節生検
密度勾配遠心分離(Ficoll-Paque Plus Amersham Biosciences)によって、末梢血液リンパ球(PBL)を単離した。PBLおよびリンパ節を使用して総RNAを抽出(ChomczynskiおよびSacchi 1987)した。オリゴd(T)オリゴヌクレオチドを使用するMMLV逆転写酵素(Gibco BRL)を用いて、200μgの総RNAについてのcDNAを調製した(de Haardら、1999)。cDNAを、フェノール/クロロホルム抽出で精製し、続いてエタノール沈殿を行い、その後、鋳型として使用してVHHレパートリーを増幅した。
第1のPCRにおいて、従来の抗体遺伝子セグメント(1.6kb)および重鎖抗体遺伝子セグメント(1.3kb)の両方のレパートリーを、リーダー特異的プライマー(5'-GGCTGAGCTCGGTGGTCCTGGCT-3')およびオリゴd(T)プライマー(5'-AACTGGAAGAATTCGCGGCCGCAGGAATTTTTTTTTTTTTTTTTT-3’)を用いて増幅させた。得られたDNA断片をアガロースゲル電気泳動によって分離し、重鎖抗体セグメントをコードする1.3kb断片をアガロースゲルから精製した。FR1逆方向プライマー(国際特許出願公開WO03/054016、配列ABL037〜ABL043)および同一のオリゴd(T)順方向プライマーの混合物を用いて、第2のPCRを行った。
PCR産物を、(FR1プライマーに導入された)SfiIおよび(フレームワーク4に天然に存在する)BstEIIで消化した。ゲル電気泳動に続いて、約400塩基対のDNA断片をゲルから精製し、ファージミドpAX004の対応する制限酵素部位に連結して、Escherichia coli TG1にエレクトロポレーションした後に、クローン化VHHのライブラリーを得た。pAX004により、c-mycタグ、ヘキサヒスチジンタグおよびgeneIII産物との融合タンパク質として個々のVHHを発現しているファージ粒子の産生が可能になる。挿入率を、ベクターベースのプライマーの組合せを用いたPCRにおいて決定した。
結果を表2に要約する。
得られた結果を表3に示す。
眼の局所適用のための抗アレルギー性医薬組成物を得るために、抗-IgE VHHの溶液を以下のように調製した:
- 0.9gの塩化ナトリウム、0.02gのクエン酸ナトリウム、0.02gのパラオキシ安息香酸メチル、0.1gのクロロブタノールおよびpH6.5とするのに適切な量の酢酸を含む100mlの滅菌水に溶解した治療用量の抗IgE VHHを含む点眼液
- 治療用量の抗-IgE VHHを含む眼軟膏を、1.0gの流動パラフィンおよび100gの総混合物を得るのに適切な量のソフトパラフィンを含むように、従来法に従って調製した。
IgEのその高親和性レセプターへの結合を阻害する抗-IgE VHHは、アレルギーの処置において潜在的な治療的価値を有する。
高度に精製されたVHH#2H11を製剤用緩衝液中に透析し、続いて凍結乾燥用分散保護剤(lyoprotectant)を等張濃度で添加した。等張性処方を以下のように作成した:25mg/mlのVHH#2H11を、抗体1モル当たり500モルの糖を含む5mMヒスチジン緩衝液(pH6)中に処方した。この処方物をBWFI(0.9%ベンジルアルコール)により再構築し、等張性糖濃度340nM、pH6で20mMヒスチジン中に抗体が100mg/mlとなる体積にした。等張性処方物中の抗IgE VHHの結合活性を、IgEレセプター阻害アッセイで測定した。その後の4℃で3ヶ月までの間の貯蔵において、結合活性は本質的に不変であることを見出した。
実施例4:抗TNF-αの選択
2匹のラマを、実施例1に記載したスケジュールに従い、注射1回当たり100μgのヒトTNF-αで免疫化した。ライブラリー(短期および長期免疫化手順)を構築し、インビトロでビオチン化したTNF-αを用いて選択した。ビオチン化をMagniら(Anal Biochem 2001、298、181-188)に記載されるように行った。
経口投与されたタンパク質は、胃の酸性pHで変性され、同様にペプシンによって分解される。我々らは、ペプシンに対するVHHTNF3Eの耐性を研究するために胃の環境を模倣すると予想される条件を選択した。ヒトTNFαに特異的なVHHであるTNF3Eを、E.coliにおいて組換えタンパク質として産生させ、IMACおよびゲル濾過クロマトグラフィーによって均質に精製した。精製後のタンパク質濃度を、280nmで計算されたモル吸光係数を用いて分光光度的に決定した。それぞれpH2、pH3およびpH4のMcIlvaine緩衝液(J.Biol.Chem.49、1921、183)で100μg/mlに希釈した溶液を調製した。これらの溶液を37℃で15分間インキュベートし、その後にブタ胃粘膜ペプシンを1/30の体積比で添加した。プロテアーゼ添加の60分後に試料を収集し、直ちに0.1%カゼインを含むPBS(pH7.4)で100倍に希釈して、ペプシンを不活性化した。この試料から、7つのさらなる3倍希釈物を調製し、ELISAによって機能的抗体断片の存在を評価した。プロテアーゼ添加前に収集したアリコートから調製した同一の希釈物を、基準として供した。ELISAアッセイにおいて、ビオチン化TNFαを、ニュートラアビジンでコーティングされたマイクロタイタープレートのウェル中に捕捉した。ペプシン処理試料および基準試料の両方について、同様の試料段階希釈物を調製し、これらの希釈物100μlをウェルに添加した。1時間のインキュベーションの後、これらのプレートを洗浄した。捕捉されたTNFαに結合しているVHHの検出のために、ポリクローナルウサギ抗VHH抗血清(R42)および抗ウサギIgGアルカリホスファターゼ抱合体を用いた。洗浄の後、これらのプレートをリン酸パラニトロフェニルで発色させた。図2にプロットされたこれらのデータは、消化条件に曝露された全ての試料ならびに基準試料について、同様の曲線を示す。このことは、VHH 3Eが、選択された全ての条件下でその機能的活性を本質的に保持していることを示す。
抗ヒトTNFα特異的VHH#TNF3E(100倍希釈PBS中100μg/ml)を含む抗体溶液を調製した。3匹のマウスに、初めに12時間飲料水を与えず、続いて次の2時間の間、抗体溶液を自由に摂取させた。その後、これらのマウスを屠殺し、それらの胃を切開した。1%BSAを含む500μlのPBSでこれらの胃を洗い流すことによって、直ちに胃の内容物を採集した。続いて、洗い流された物質を用いて、1/5希釈から始まる段階的な3倍希釈物を非希釈液の物質から調製した。これらの試料100μlを、ヒトTNFαでコーティングされたマイクロタイタープレートの個々のウェルに移した。1時間のインキュベーションおよびその後の大規模な洗浄の後、免疫反応性物質の存在をポリクローナルウサギ抗VHH抗血清(R42)により評価し、次いで抗ウサギアルカリホスファターゼ抱合体と共にインキュベーションした。ELISAはリン酸パラニトロフェニルを用いて発色させた。10分後に得られたELISAシグナルは、これらのマウスの胃洗浄物中の機能性VHH TNF3Eの存在を明らかに示した。標準曲線と比較することにより、我々らは、試験した3匹のマウスについて、胃洗浄液中の機能性抗体断片の濃度が1.5μg/ml、12.6μg/mlおよび8.6μg/mlであることを決定した。
1)慢性大腸炎の動物モデル
種々の投与経路によって適用される二価のVHH構築物の効力を、BALB/cマウスにおけるDSS(デキストラン硫酸ナトリウム)で誘導された慢性大腸炎のモデルにおいて評価した。このモデルは、Okayasuら[Okayasuら、Gastroenterology 1990; 98:694-702]によって最初に記載され、Kojouharoffら[G. Kojouharoffら、Clin. Exp. Immunol. 1997;107: 353-8]によって改変された。これらの動物を、11週齢でCharles River Laboratories、ドイツから入手し、体重が21gと22gとの間に達するまで動物施設で飼育した。4回のDSS処置サイクルによって、これらの動物において慢性大腸炎を誘発した。各サイクルは、DSSを5%(w/v)の濃度で飲料水と共に供したDSS処置間隔(7日間)および飲料水中にDSSが存在しない回復間隔(12日間)から構成された。最後の回復期間を12日間から21日間に延長して、処置時に急性炎症よりもむしろ慢性炎症を示す炎症状態を提供した。最後の回復間隔の後で、マウスを8匹のマウスの群に無作為に割り当て、VHH-構築物で処置を開始した。処置間隔は2週間であった。処置間隔の終了から一週間後に動物を屠殺し、腸を切開して組織学的に検査した。実験の設定を図3に概略的に示す。
VHH処置期間の間、マウス(1群あたり8匹)を二価VHH#3F(VHH#3F-VHH#3F;配列番号14)で、100μgの二価VHH 3Fの胃内適用または静脈内適用によって、連続14日間毎日処置した。さらなる動物の群を、二価VHH#3Fで14日間の間、1日置きに直腸処置した。全ての処置群において、二価VHH#3Fの100μgの用量を、緩衝溶液中1mg/mlの濃度で適用した。陰性コントロール群は、他の点では同一の条件下で100μlのPBSを受けた。処置スケジュールを表7に示す。
マウスを屠殺した後、体重を測定し、結腸を切開した。切開した結腸の長さを測定し、結腸の組織学的分析をヘマトキシリン-エオシン(HE)染色(標準条件)によって評価した。陰性コントロール(PBS処置)と比較して、二価ナノボディ3Fで処置した群は、延長した結腸長さならびに改善された組織学的スコアを示し[G.Kojouharoffら、Clin. Exp. Immunol. 1997;107: 353-8]、したがって処置の効力を実証した。
実施例8:免疫化
1匹のラマ(ラマ5)を、MMP12の組換えヒト触媒ドメインで、適切な動物に優しいアジュバントであるStimune(Cedi Diagnostics BV、オランダ)を用いて筋肉注射で免疫化した。この組換え触媒ドメインを、H.Tschesche教授、Universitaet Bielefeldから入手し、5mM Tris/HCl pH=7.5、100mM NaCl、5mM CaCl2中の56μg/mlの溶液として加えた(Lang, Rら、(2001))。ラマは、一週間間隔で6回の注射、最初の2回の注射は各々10μgのMMP-12を含み、最後の4回の注射は各々5μgのMMP-12を含む、を受けた。最後の免疫化から4日後、リンパ節生検(LN)および血液試料(PBL1)150mlを動物から採集し、血清を調製した。最後の免疫化から10日後、第2の血液試料(PBL2)150mlを採取し、血清を調製した。ラマ重鎖免疫グロブリン(HcAb)の遺伝子供給源として末梢血液リンパ球(PBL)を、Ficoll-Paque勾配(Amersham Biosciences)を用いて血液試料から単離し、5×108個のPBLを得た。抗体の最大多様性は、採取したBリンパ球の数、すなわちPBLの数の約10%に等しいことが予想される(5×107個)。ラマにおける重鎖抗体の画分は、Bリンパ球の数の20%までである。従って、血液試料150ml中のHcAbの最大多様性を、107個の異なる分子として計算する。総RNAを、ChomczynskiおよびSacchi(1987)の方法に従って、PBLおよびリンパ節から単離した。
オリゴd(T)オリゴヌクレオチドを使用し、MMLV逆転写酵素(Gibco BRL)を用いて、200μgの総RNAについてcDNAを調製した(de Haardら、1999)。cDNAを、フェノール/クロロホルム抽出で精製し、続いてエタノール沈殿を行い、その後、VHHレパートリーを増幅させるための鋳型として使用した。
第1のPCRにおいて、従来の抗体遺伝子セグメント(1.6kb)および重鎖抗体遺伝子セグメント(1.3kb)の両方のレパートリーを、リーダー特異的プライマー(5'-GGCTGAGCTCGGTGGTCCTGGCT-3')およびオリゴd(T)プライマー(5'-AACTGGAAGAATTCGCGGCCGCAGGAATTTTTTTTTTTTTTTTTT-3')を用いて増幅させた。得られたDNA断片をアガロースゲル電気泳動によって分離し、重鎖抗体セグメントをコードする1.3kb断片をアガロースゲルから精製した。FR1逆方向プライマー(国際特許出願公開WO03/054016、配列ABL037〜ABL043)および同一のオリゴd(T)順方向プライマーの混合物を用いて、第2のPCRを行った。
PCR産物を、(FR1プライマーに導入された)SfiIおよび(フレームワーク4に天然に存在する)BstEIIで消化した。ゲル電気泳動に続いて、約400塩基対のDNA断片をゲルから精製し、ファージミドpAX004の対応する制限酵素部位に連結して、Escherichia coli TG1にエレクトロポレーションの後に、クローン化VHHのライブラリーを得た。pAX004により、c-mycタグ、ヘキサヒスチジンタグおよびgeneIII産物を含む融合タンパク質として個々のVHHを発現しているファージ粒子の産生が可能になる。TG1細胞のエレクトロポレーションの後に得られた多様性を表8に示す。挿入率を、ベクターベースのプライマーの組合せを用いたPCRにおいて決定した。
ライブラリーを、2%グルコースおよび100μg/mlのアンピシリンを含む10mlの2×TY培地中で37℃にてOD600nmが0.5に到達するまで増殖させた。M13KO7ファージ(1012個)を添加し、混合物を37℃で2回×30分間、最初は振盪せず、次に100 rpmで振盪してインキュベートした。細胞を、室温にて4,500 rpmで5分間遠心分離した。細菌のペレットを、100μg/mlのアンピシリンおよび25μg/mlのカナマイシンを含む50mlの2×TY培地に再懸濁し、250 rpmで活発に振盪させながら37℃で一晩インキュベートした。一晩の培養物を4℃にて4,500 rpmで15分間遠心分離した。ファージを氷上で30分間PEG沈殿させ(20%ポリエチレングリコールおよび1.5M NaCl)、4,500 rpmで20分間遠心分離した。このペレットを1mlのPBSに再懸濁した。ファージを再び氷上で10分間PEG沈殿させ、4℃にて14,000rpmで10分間遠心分離した。このペレットを1mlの0.5%スキムミルクまたはPBS-BSA[1mg/ml](Sigma, Cat NrA3059)に溶解した。
ファージを、実施例10に上述したようにレスキューおよび調製した。
MMP-12特異的結合剤を得るために、2つのアプローチを進めた:
100ngのヒトMMP-12触媒ドメイン(33μlのPBS中に希釈)を、製造元のガイドラインに従ってPVDF(Immobilon-P, Millipore, Cat Nr IPVH 15150)の小片(1cm2)上にスポットし、MeOH固定化により不活性MMPを得た。コントロールとして、等量のリゾチーム(Sigma, Cat Nr L-6876)および33μlのPBSもまたスポットし、固定化した。これらの膜片を、4℃にて5%スキムミルク中で一晩ブロッキングし、PBSで3回洗浄した後、ファージ調製物を加えた(5%スキムミルク1ml中に4×109個のファージ)。ファージおよび膜片(1,5ml管中)を室温にて3時間回転させながらインキュベートした。次いで、これらの膜を15ml管に移し、10mlの[PBS+0.05% Tween-20]で6回洗浄した。これらの膜を500μlのTEA[5mlのH2O中に70μl]に10分間回転させながら曝露することにより、ファージを溶出させた。溶出したファージを含む溶液を除去し、pHを1Mトリス(pH=7.5)で中和した。
対数増殖期のTG1細胞を、溶出したファージで感染させ、段階希釈物を選択培地にプレートした。MMP-12コーティングされた膜から得られた選択後の形質導入されたTG1コロニーの数を、リゾチームを固定化した陰性コントロールと比較することによって、濃縮度を決定した。濃縮を示すMMP選択由来の細菌を擦り落とし、2回目の選択に使用した。
これらの細菌をヘルパーファージで重感染させて組換えファージを産生し、MMP-12に対する二次選択を行った(実施例9に記載のように)。MMP-12を上記のように固定化し、この膜を5%スキムミルク中で4℃にて一晩ブロッキングした。ファージ(1ml中に2.5×109個)を調製してこれらの膜に曝露し、1回目の選択時と同様にMMP結合性についてさらに選択した。対数増殖期のTG1細胞を、溶出させてpHを中和したファージで感染させ、選択培地にプレートした。MMP-12コーティングされた膜由来の形質導入されたTG1コロニーの数を陰性コントロール(固定化リゾチーム)と比較することによって、濃縮度を決定した。
250ngのヒトMMP-12触媒ドメイン(Biomol Research laboratories Inc, SE 138-9090)を、納入業者のガイドラインに従って、Hybond-C extra(Amersham Biosciences, Cat Nr RPN 303E)の小片上に直接スポットした。コントロールとして、等容量のPBSをスポットした。スポット領域を含む直径5mmの円板をそれぞれの膜から切り抜き、1.5ml管に移して、1mlのBSA-PBS[1mg/ml]中で4℃にて一晩ブロッキングした。これらの円板を15mlのPBS中で3回洗浄し、続いて、マイクロタイタープレートウェル中の200μlのファージ調製物に移して曝露した。これらのファージは、室温にて15分間BSA-PBS中でプレインキュベートしたことを除いて、実施例9のように調製した。これらの円板をPBS/0.05%Tween-20で5回洗浄し、PBS-BSAを用いて室温にて2時間ブロッキングした。これらの膜を100μlのTEA[5mlのH2O中に70μl]に10分間回転させながら曝露することによって、ファージを溶出させた。溶出したファージを含む溶液を除去し、pHを1Mトリス(pH=7.5)で中和した。
対数増殖期のTG1細胞を、溶出したファージで感染させ、選択培地にプレートした。MMP-12膜円板上における選択後に形質導入されたTG1コロニーの数を陰性コントロール(PBS)と比較することによって濃縮度を決定した。MMP-12選択由来の細菌を擦り落とし、2回目の選択に使用した。
これらの細菌をヘルパーファージで重感染させて組換えファージを産生し、MMP-12に対する二次選択を行った(実施例9に記載のように)。MMP-12を上記のように固定化し、この膜をPBS-BSA[1mg/ml]中で4℃にて一晩ブロッキングした。ファージ(1ml中に2.5×109個)を調製してこれらの膜に曝露し、1回目の選択時と同様にMMP結合性についてさらに選択した。対数増殖期のTG1細胞を、溶出させて中和したファージで感染させ、選択培地にプレートした。MMP-12コーティングされた膜由来の形質導入されたTG1コロニーの数を、陰性コントロールと比較することによって濃縮度を決定した。
個々のクローンを採取し、マイクロタイタープレート中の0.1%グルコースおよび100mg/mlのアンピシリンを含む150mlの2×TY中で、37℃にてOD600nmが0.6になるまで増殖させた。次いで、1mM IPTGおよび5mM MgSO4を添加し、この培養物を37℃にて4時間インキュベートした。これらの細胞のペリプラズム抽出物(PE、調製法は実施例13を参照)についてELISAを行い、選択されたクローンの特異性を試験した。
固相コーティングされたヒトMMP-12を用いて選択されたクローンを試験するために、プレートを1μg/mlの濃度のヒトMMP-12触媒ドメインで4℃にて一晩コーティングした。プレートをPBS/0.05%Tween-20で5回洗浄した。ウェルを1%スキムミルクで室温にて2時間ブロッキングした。ペリプラズム抽出物(100μl)をこれらのウェルに加え、室温にて1時間インキュベートした。プレートをPBS/0.05% Tween-20で5回洗浄した。抗c-myc抗体の次に抗マウス-HRPおよびABTS/H2O2を基質として使用して、検出を行った。プレートを室温にて30分間のインキュベーションの後に405nmで読み取った。
膜固定化ヒトMMP-12を使用して選択されたクローンを試験するために、50ngのヒトMMP-12触媒ドメイン試料を、製造元のガイドラインに記載されるようにPVDF膜上にスポットした。50ngのリゾチームを陰性コントロールとしてスポットした。これらの膜を、4℃にて一晩スキムミルクでブロッキングし、PBSで5回洗浄して1,5ml管に移した。ペリプラズム抽出物(100μl)を1%スキムミルク中で10倍希釈し、膜(2cm2)当たり1mlを加えて室温にて1時間回転させた。膜をPBS/0.05% Tween-20で5回洗浄した。抗c-myc抗体の次に抗マウス-HRPおよびDAPを基質として使用して、検出を行った。明瞭なスポットが現れるまで、膜を基質と共に室温でインキュベートした。MMP-12特異的結合剤であると判定された7つのクローンを、表14の配列番号15〜21に示す。
他のMMPに対する非特異的結合についてチェックするために、同様のアプローチを続いて行い、そのアプローチにおいて、50ngのMMP1、MMP2、MMP3、MMP7、MMP9およびMMP13の活性触媒ドメイン(全て、Biomol Research laboratories Incより)をHybond C-extra上に固定化した。これらの膜を4℃にて一晩スキムミルクでブロッキングし、PBSで5回洗浄し、1,5ml管に移した。ペリプラズム抽出物(100μl)を1%スキムミルク中で10倍希釈し、膜(2cm2)当たり1mlを加えて室温にて1時間回転させた。膜をPBS/0.05% Tween-20で5回洗浄した。抗c-myc抗体の次に抗マウス-HRPおよびDAPを基質として使用して、検出を行った。明瞭なスポットが現れるまで、膜を基質とともに室温でインキュベートした。MMP-12以外のいずれのMMPにおいても、7つの選択されたVHHクローンの有意な検出は観察されなかった。
Hybond膜固定化によって選択されたMMP-12阻害剤に関する結果を表14の配列番号22に示す。
M13逆方向プライマーおよびgenIII順方向プライマーを使用してPCRを行った。Hinf1フィンガープリント法を使用してこれらのクローンを分析し、代表的なクローンを配列決定した。配列決定分析を行った結果、Immobilon-P選択について表14の配列番号15〜21に示す配列を得、Hybond-Cについて表14の配列番号22に示す配列を得た。
クローンを、振盪フラスコ中の0.1%グルコースおよび100μg/mlのアンピシリンを含む50mlの2×TY中で、37℃にてOD600nmが2になるまで増殖させた。1mM IPTGおよび5mM MgSO4を添加して、培養物を37℃にてさらに3時間インキュベートした。培養物を4℃にて4,500 rpmで10分間遠心分離した。このペレットを-20℃で一晩凍結させた。次に、このペレットを室温で40分間解凍し、1mlのPBS/1mM EDTA/1M NaCl中に再懸濁し、1時間氷上で振盪した。4,500 rpmで4℃にて10分間遠心分離することによってペリプラズム画分を単離した。VHHを含む上清をNi-NTA(Qiagen)に負荷し、Aekta FPLCクロマトグラフィーシステム(Amersham Biosciences)において均質に精製した。VHHを、25mMクエン酸pH=4,0を用いてNi-NTAから溶出し、25mMクエン酸pH=4,0中で平衡化した陽イオン交換カラムに直接加えた(HR5/5カラム中のSource 30S, Amersham Biosciences)。VHHを、PBS中の1M NaClで溶出し、さらにMMP-12アッセイ緩衝液[50mM HEPES、100mM NaCl、0,05% Brij-35]で平衡化したサイズ排除カラム(Superdex 75 HR10/30、Amersham Biosciences)で精製した。VHHの収率を吸光係数およびピーク表面積によって計算した。
VHHを発現させ、実施例13に記載されるように精製した。精製されたVHHを、BIOMOL Research Laboratories社からの創薬のためのMMP-12比色アッセイキット(MMP-12 Colorimetric Assay Kit for Drug Discovery)(AK-402)を使用して、ヒトMMP-12触媒ドメインを阻害する能力について分析した。キットに記載された実験方法条件に従った。
このキットと共に提供された阻害剤(PI115-9090)を陽性コントロールとして推奨濃度で使用した。VHHを7μMの濃度で加えた。BIOMOLキットと共に提供されたマイクロタイタープレート中でアッセイを行い、MMP-12タンパク質分解活性を37℃にてプレートリーダー(405nm)中で追跡した。
1つの阻害性VHHおよび1つの不活性VHHの結果を、陽性コントロールと共に図4に示す。
ニトロセルロース上にコーティングされた活性MMP-12を使用した選択(実施例12)由来の唯一のVHH分子(クローンP5-29)が、ヒトMMP-12触媒ドメインの阻害を示した。他のMMP-12結合剤は全て(クローンP5-5のみ図示する)、MMP-12に結合するにもかかわらず、MMP-12を阻害しなかった。
抗体の100%製剤を、1.0mlの脱イオン水中に5mgのVHHを溶解させることによって調製した。溶液のpHは6.5であった。抗体の90%製剤を、1.0mlの2mMクエン酸緩衝液中に4.5mgのVHHを溶解させることによって調製した。抗体の70%製剤を、1mlのpH6.5クエン酸緩衝液中の1mg/mlの賦形剤に3.5mgのVHHを溶解させることによって調製した。使用した様々な種類の賦形剤は以下のごとくであった:糖賦形剤:ショ糖、ラクトース、マンニトール、ラフィノースおよびトレハロース。高分子賦形剤:フィコールおよびPVP。タンパク質賦形剤:HSA。
上記製剤の乾燥粉末を、Buchi Spray Dryerを使用した噴霧乾燥によって生成した。
粒子サイズ分布を遠心沈降によって測定した。
実施例17:免疫化
4匹のラマ(ラマ5、ラマ6、ラマ22およびラマ23)を、ヒトIFN-γ(PeproTech Inc, USA, Cat Nr: 300-02)で、適切な動物に優しいアジュバントであるStimune(Cedi Diagnostics BV、オランダ)を用いて筋肉注射で免疫化した。2匹のラマ(ラマ29およびラマ31)を、マウスIFN-γ(Protein Expression & Purification core facility, VIB-RUG、ベルギー)で、適切な動物に優しいアジュバントであるStimune(Cedi Diagnostics BV、オランダ)を用いて筋肉注射で免疫化した。これらのラマは、一週間間隔で6回の注射を受け、初めの2回の注射はそれぞれ100μgのIFN-γを含み、最後の4回の注射はそれぞれ50μgのIFN-γを含んでいた。最後の免疫化から4日後に、150mlの血液試料(PBL1)およびリンパ節生検(LN)を各動物から採集し、血清を調製した。最後の免疫化の10日後、第2の血液試料(PBL2)150mlを各動物から採取し、血清を調製した。ラマ重鎖免疫グロブリン(HcAb)の遺伝子供給源として末梢血液リンパ球(PBL)をFicoll-Paque 勾配(Amersham Biosciences)を用いて血液試料から単離し、5×108個のPBLを得た。抗体の最大多様性は、サンプリングしたBリンパ球の数、すなわちPBLの数の約10%に等しいことが予想される(5×107個)。ラマにおける重鎖抗体の画分は、Bリンパ球の数の20%までである。従って、血液試料150ml中のHcAbの最大多様性を、107個の異なる分子として計算する。総RNAを、ChomczynskiおよびSacchi(1987)の方法に従って、PBLおよびリンパ節から単離した。
オリゴd(T)オリゴヌクレオチドを使用し、MMLV逆転写酵素(Gibco BRL)を用いて、200μgの総RNAについてcDNAを調製した(de Haardら、1999)。cDNAを、フェノール/クロロホルム抽出で精製し、続いてエタノール沈殿を行い、その後、VHHレパートリーを増幅させるための鋳型として使用した。
第1のPCRにおいて、従来の抗体遺伝子セグメント(1.6kb)および重鎖抗体遺伝子セグメント(1.3kb)の両方のレパートリーを、リーダー特異的プライマー(5'-GGCTGAGCTCGGTGGTCCTGGCT-3')およびオリゴd(T)プライマー(5'-AACTGGAAGAATTCGCGGCCGCAGGAATTTTTTTTTTTTTTTTTT-3')を用いて増幅させた。得られたDNA断片をアガロースゲル電気泳動によって分離し、重鎖抗体セグメントをコードする1.3kb断片をアガロースゲルから精製した。FR1逆方向プライマー(国際特許出願公開WO03/054016、配列ABL037〜ABL043)および同一のオリゴd(T)順方向プライマーの混合物を用いて、第2のPCRを行った。
PCR産物を、(FR1プライマーに導入された)SfiIおよび(フレームワーク4に天然に存在する)BstEIIで消化した。ゲル電気泳動に続いて、約400塩基対のDNA断片をゲルから精製し、ファージミドpAX004の対応する制限酵素部位に連結して、Escherichia coli TG1のエレクトロポレーションの後に、クローン化VHHのライブラリーを得た。pAX004により、c-mycタグ、ヘキサヒスチジンタグおよびgeneIII産物を含む融合タンパク質として個々のVHHを発現しているファージ粒子の産生が可能になる。TG1細胞のエレクトロポレーションの後に得られた多様性を表1に示す。挿入率を、ベクターベースのプライマーの組合せを用いたPCRにおいて決定した。
ライブラリーを、OD600nmが0.5に到達するまで、2%グルコースおよび100μg/mlのアンピシリンを含む10mlの2×TY培地中で37℃にて増殖させた。M13KO7ファージ(1012)を添加し、混合物を37℃で2回×30分間、最初は振盪せず、次に100 rpmで振盪してインキュベートした。細胞を、室温にて4,500 rpmで5分間遠心分離した。細菌のペレットを、100μg/mlのアンピシリンおよび25μg/mlのカナマイシンを含む50mlの2×TY培地に再懸濁し、250 rpmで活発に振盪させながら37℃で一晩インキュベートした。一晩の培養物を4℃にて4,500 rpmで15分間遠心分離した。ファージを氷上で30分間PEG沈殿(20%ポリエチレングリコールおよび1.5M NaCl)させ、4,500 rpmで20分間遠心分離した。このペレットを1mlのPBSに再懸濁した。ファージを再び氷上で10分間PEG沈殿させ、4℃にて14,000 rpmで10分間遠心分離した。このペレットを1mlのPBS-0.1%カゼインに溶解した。
ファージを、実施例17に上述したようにレスキューおよび調製した。
IFN-γ特異的結合剤を得るために、以下の2つのアプローチを進めた:
マイクロタイターウェルを10〜0.4μg/ウェルの異なる濃度でのヒトIFN-γで、4℃にて一晩コーティングした。プレートをPBS/0.05% Tween-20で5回洗浄した。ウェルをPBS+1%カゼインで室温にて2時間ブロッキングした。ファージを室温で2時間インキュベートした。ウェルをPBS+0.05% Tween-20で20回洗浄した。最後の2回の洗浄はPBSを用いて行った。特定のファージを1〜2μgのIFN-γ R1(R&D Systems, Cat Nr: 673-IR/CF)を用いて1時間溶出した。陰性コントロールとして10μg卵アルブミン(Ovalbumine)(Sigma,A2512)を無関係なタンパク質として用いて溶出を行った。対数増殖期のTG1細胞を、溶出したファージで感染させ、選択培地にプレートした。溶出のためにレセプターを用いた選択後に形質導入されたTG1コロニーの数を、溶出のために卵アルブミンを用いた陰性コントロールと比較することによって濃縮度を決定した。濃縮を示す選択由来の細菌を擦り落とし、2回目の選択に使用した。
これらの細菌を実施例3に記載のようにヘルパーファージで重感染させて組換えファージを産生した。マイクロタイターウェルを2〜0.1μg/ウェルの異なる濃度でのIFN-γで、4℃にて一晩コーティングした。プレートをPBS/0.05%Tween-20で5回洗浄した。ウェルをPBS+1%カゼインで室温にて2時間ブロッキングした。ファージを室温で2時間インキュベートした。ウェルをPBS+0.05%Tween-20で20回洗浄した。最後の2回の洗浄はPBSを用いて行った。特定のファージを、1〜2μgのIFN-γ R1または無関係なタンパク質として10μg卵アルブミンを用いて1時間、引き続いて4℃にて一晩溶出し、引き続いてファージを0.1MグリシンpH2.5を用いて室温にて15分間溶出し、1M Tris-HCl pH=7.5で中和した。対数増殖期のTG1細胞を、溶出させて中和したファージで感染させ、選択培地にプレートした。溶出のためにレセプターを用いた選択後に形質導入されたTG1コロニーの数を、溶出のために卵アルブミンを用いた陰性コントロールと比較することによって濃縮度を決定した。
マイクロタイターウェルを2μg/mlの濃度のニュートラアビジンで、4℃にて一晩コーティングした。プレートをPBS/0.05% Tween-20で5回洗浄した。ウェルをPBS+1%カゼインで室温にて2時間ブロッキングした。ビオチン化ヒトIFN-γを100〜10ng/ウェルの濃度で4℃にて一晩捕捉した。プレートをPBS/0.05% Tween-20で5回洗浄した。ファージを室温で2時間インキュベートした。ウェルをPBS+0.05% Tween-20で洗浄した。最後の2回の洗浄はPBSを用いて行った。特定のファージを1〜2μgのIFN-γ R1(R&D Systems, Cat Nr: 673-IR/CF)を用いて1時間溶出した。陰性コントロールとして10μg卵アルブミン(Sigma, A2512)を無関係なタンパク質として用いて溶出を行った。対数増殖期のTG1細胞を、溶出したファージで感染させ、選択培地にプレートした。溶出のためにレセプターを用いた選択後に形質導入されたTG1コロニーの数を、溶出のために卵アルブミンを用いた陰性コントロールと比較することによって濃縮度を決定した。濃縮を示す選択由来の細菌を擦り落とし、2回目の選択に使用した。
細菌をヘルパーファージで重感染させて組換えファージを産生した。マイクロタイターウェルを、2μg/mlの濃度でのニュートラビジンで4℃にて一晩コーティングした。プレートをPBS/0.05% Tween-20で5回洗浄した。ウェルをPBS+1%カゼインで室温にて2時間ブロッキングした。ビオチン化ヒトIFN-γを20〜2.5ng/100μlの濃度で4℃にて一晩捕捉した。プレートをPBS/0.05% Tween-20で5回洗浄した。ファージを室温で2時間インキュベートした。ウェルをPBS+0.05%Tween-20で20回洗浄した。最後の2回の洗浄はPBSを用いて行った。特定のファージを、1〜2μgのIFN-γ R1または無関係なタンパク質として10μg卵アルブミンを用いて1時間、引き続いて4℃にて一晩溶出し、引き続いてファージを0.1MグリシンpH2.5を用いて室温にて15分間溶出し、1M Tris-HCl pH=7.5で中和した。対数増殖期のTG1細胞を、溶出させて中和したファージで感染させ、選択培地にプレートした。溶出のためにレセプターを用いた選択後に形質導入されたTG1コロニーの数を、溶出のために卵アルブミンを用いた陰性コントロールと比較することによって濃縮度を決定した。
M13逆方向プライマーおよびgenIII順方向プライマーを使用してPCRを行った。Hinf1フィンガープリント法を使用してこれらのクローンを分析し、代表的なクローンを配列決定した。配列決定分析を行った結果、ヒトIFN-γについて表4に示す配列を得た(配列番号45〜70)。
WK6 Escherichia coli細胞へのDNAの形質転換後に、小規模発現を開始した。
クローンを、振盪フラスコ中の0.1%グルコースおよび100μg/mlのアンピシリンを含む50mlの2×TY中で、37℃にてOD600nmが2になるまで増殖させた。1mM IPTGおよび5mM MgSO4を添加して、培養物を37℃にてさらに3時間インキュベートした。培養物を4℃にて4,500 rpmで10分間遠心分離した。このペレットを-20℃で一晩凍結させた。次に、このペレットを室温で40分間解凍し、1mlのPBS/1mM EDTA/1M NaCl中に再懸濁し、1時間氷上で振盪した。4,500 rpmで4℃にて10分間遠心分離することによってペリプラズム画分を単離した。VHHを含む上清をTALON(Clontech)に負荷し、均質に精製した。VHHの収率を吸光係数によって計算した。
1:眼の局所適用のための抗アレルギー性医薬組成物を得るために、少なくとも1つの抗IFN-γ VHHの溶液を以下のように調製した:
- 0.9gの塩化ナトリウム、0.02gのクエン酸ナトリウム、0.02gのパラヒドロキシ安息香酸メチル、0.1gのクロロブタノールおよびpH6.5とするのに適切な量の酢酸を含む100mlの滅菌水に、治療用量の抗IFNγ VHHを溶解して含む点眼液
- 治療用量の抗IFNγ VHHを含む眼軟膏を、1.0gの流動パラフィンおよび100gの総混合物を得るのに適切な量のソフトパラフィンを含むように、従来法に従って調製した。
2:抗炎症性医薬塗布物を得るために、本発明の局所用の調製品は、少なくとも1つの抗IFNγ VHHおよび薬学的に許容されるキャリアを含んだ。これらを以下のように調製した:
- 基礎クリームの調製
基礎クリーム調製用の試薬は、以下のとおりである(100kgの基礎クリームに対する含量):ジメチルシリコンオイル(17kg)、流動パラフィン(9kg)、ステアリン酸(7.5kg)、セチルアルコール(1kg)、ステアリルアルコール(3kg)、グリセロール(20kg)、エチルパラベン(0.1kg)、Peregal A-20(0.45kg)、柔軟剤SG(0.85kg)、0.01Mリン酸緩衝液(pH7.2)(41.1kg)。
ステンレス鋼タンクを恒温水浴中に設置し、約10分間かけて80℃に加熱した。この液体を徹底的に混合した。次いで、乳化および均質化装置を開口したステンレス鋼タンク中に設置し、この混合物を完全に乳化するまで3500rpmで20分間攪拌した。この混合物が半固形クリームになるまで、恒温水浴の温度を室温まで自然に冷却した。この混合物は、絶えず攪拌されていた。
- 液状の抗体混合物の調製
VHH#MP3B1SRAを実施例22にしたがって調製した。凍結乾燥した抗体を、0.01Mリン酸緩衝液(pH7.2)で2mg/mlの濃度に再構成した。1000gの基礎クリームに対して45mgのVHH#MP3B1SRA抗体を添加した。
実施例24:抗-TNFα VHH#3EのVHH-CDR3断片の発現
VHH#3EのCDR3領域を、フレームワーク4領域に位置するセンスプライマー(順方向:CCCCTGGCCCCAGTAGTTATACG)およびフレームワーク3領域に位置するアンチセンスプライマー(逆方向:TGTGCAGCAAGAGACGG)を用いて増幅した。
pAX10中のCDR-3断片をクローン化するために、2回目のPCR増幅を、必要な制限酵素部位を導入する以下のプライマーを用いて行った:
逆方向プライマーSfi1:
GTCCTCGCAACTGCGGCCCAGCCGGCCTGTGCAGCAAGAGACGG
順方向プライマーNot1:
GTCCTCGCAACTGCGCGGCCGCCCCCTGGCCCCAGTAGTTATACG
Sfi1およびNot1での切断の後、PCR産物をpAX10中にクローン化した。
実施例25:免疫化
獣医学部の倫理委員会(Ethical Committee of the Faculty of Veterinary Medicine)(ヘント大学、ベルギー)の承認後、4匹のラマ(024、025、026および027)を、全ての現行の動物福祉規制(animal welfare regulation)にしたがい腫瘍抗原上皮細胞成長因子レセプター(EGFR)で免疫化した。抗体依存性の免疫応答(表9)を引き起こすために、2匹の動物に、細胞表面にEGFRを発現しているインタクトなヒト外陰扁平上皮癌細胞(A431, ATCC CRL1555)を注射し、一方で、A431由来の膜抽出物を他の2匹のラマ(026および027)に投与した。各動物は、一週間間隔で7回用量の皮下投与による抗原を受けた(表9)。インタクトな細胞を用いた免疫化の場合、各用量は108個の新しく採集されたA431細胞からなる。膜抽出物を用いた免疫化のための用量は、108個のA431細胞から調製された小胞からなる。小胞は、Cohenら(Cohen S, Ushiro H, Stoscheck C, Chinkers M, 1982年,「A native 170,000 epidermal growth factor receptor-kinase complex from shed plasmamembrane vesicles」, J. Biol. Chem. 257:1523-31)にしたがって調製した。小胞を投与前に-80℃で保存した。アジュバントStimune(CEDI Diagnostics B. V., Lelystad, オランダ)を含む乳濁液中の8μgの精製EGFR(Sigma)の2回の余分の注射を、ラマ025に筋肉内投与した(表9)。
0日目、28日目および42日目に10mlの免疫(プレ免疫)血液を採集し、血清を用いて4匹の動物における免疫応答の誘導を評価した。これらの動物がA431エピトープを認識する抗体を産生したか否かを検証するために、第1のELISAを行った。組織培養用処理した96ウェルプレートをゼラチンでコーティングした後(PBS中0.5%で10分間)、過剰のゼラチンを除去し、A431細胞をマイクロウェル中でコンフルエントになるまで一晩増殖させた。細胞をPBS中の4%パラホルムアルデヒドで室温にて30分間固定した。その後、固定剤をPBS中の100mMグリシンで10分間ブロッキングし、続いてウェルを4%スキムミルク-PBS溶液で再度10分間ブロッキングした。免疫された動物の血清希釈物を加え、ウサギにおいて生起させたポリクローナル抗ラマ抗血清、続いて二次的のヤギ抗ウサギセイヨウワサビペルオキシダーゼ(HRP)抱合体(Dako、デンマーク)を用いて、A431特異的抗体を検出した。4匹の動物すべてについて、インタクトな細胞または膜小胞で免疫化した結果、有意なA431特異的抗体力価の誘導がもたらされた(図5)。
これらの誘導されたラマ抗体がEGFR特異的であるか否かを検証するために、上記と同様に行って、血清中の抗体力価をヒトEGFR(Her-14)を発現しているマウス線維芽細胞において評価し、親株のマウス線維芽細胞株であるNIH3T3クローン2.2(3T3)と比較した(図6)。この場合もやはり、Her-14に結合している抗体の血清力価は、親株の3T3細胞についての力価と比較して高く、このことは、循環血清抗体がEGFR特異的であることを示している。
最後に、免疫された動物における血清応答を、固相コーティングした精製EGFRについて評価した。精製されたEGFR(Sigma)および無関係の癌胚性抗原(CEA, Scripps)(両方とも1μg/ml)を96ウェルMaxisorpプレート(Nunc)中で4℃にて一晩固定化した。ウェルをカゼイン溶液(PBS中の1%)でブロッキングした。血清希釈物の添加後、特異的に結合した免疫グロブリンを、ウサギ抗ラマ抗血清、続いてヤギ抗ウサギアルカリホスファターゼ抱合体(Sigma)を用いて検出し、全ての動物についてEGFRに対する有意な抗体依存性の免疫応答が誘導されたことを示した(図7)。
ラクダ科の免疫グロブリン個体発生についてほとんど知られていないので、別個の器官および異なる時点の組織を含むB細胞を、それぞれの動物について採集した(表9)。組織採集の後、総RNAをChomczynskiおよびSacchiによって記載された手順にしたがって単離した(Chomczynski PおよびSacchi N. 1987年,「Single-step method of RNA isolation by acid guanidinium thiocyanate-phenol-chloroformextraction」, Anal Biochem 162:156-159)。VHHレパートリーをクローン化する手順は、国際特許出願公開WO 03/054016に記載された方法に基づく。cDNAを、オリゴd(T)オリゴヌクレオチドを使用し、MMLV逆転写酵素(Invitrogen)を用いて総RNAについて調製した(de Haard HJ, van Neer N, ReursA, Hufton SE, Roovers RC, Henderikx P, de Bruine AP, Arends JW, Hoogenboom HR. 1999年,「A large non-immunized human Fab fragment phage library that permitsrapid isolation and kinetic analysis of high affinity antibodies」, J. Biol. Chem. 274:18218-30)。cDNA合成に用いた別個の組織のRNAの量を、表10に記載する。cDNAをフェノール/クロロホルム抽出、続いてエタノール沈殿で精製し、その後VHHレパートリーを増幅させるための鋳型として使用した。
第1のPCRにおいて、従来の抗体遺伝子セグメント(1.6kb)および重鎖抗体遺伝子セグメント(1.3kb)の両方のレパートリーを、リーダー特異的プライマー(ABL002)およびオリゴd(T)プライマーであるABL010を用いて増幅させた(プライマーのリストについて、表13を参照)。得られたDNA断片をアガロースゲル電気泳動によって分離した。重鎖抗体セグメントをコードしている増幅された1.3kb断片をアガロースゲルから精製し、FR1プライマー(ABL037〜ABL043)およびABL010の混合物を用いたネステッドPCRにおける鋳型として使用した。PCR産物を、(FR1プライマーに導入された)SfiIおよび(FR4に天然に存在する)BstEIIで消化した。ゲル電気泳動に続いて約400塩基対のDNA断片をゲルから精製し、330ngの増幅させたVHHレパートリーを1μgのファージミドpAX004の対応する制限酵素部位に連結して、Escherichia coli TG1にエレクトロポレーションの後に、ライブラリーを得た。pAX004により、geneIII産物を含む融合タンパク質として個々のVHHを発現しているファージ粒子の産生が可能になる。免疫化されたラマから採集した別個の組織から得られたライブラリーのサイズを、表10に記載する。品質管理として、M13逆方向プライマーおよびgeneIIIプライマーを用いたコロニーPCRを、各ライブラリーの24個の無作為に採取したコロニーについて行い、正しいサイズの挿入部を含むクローンの割合を計算した(表10)。
ポリクローナルファージELISAにおいて、クローン化されたファージレパートリーの特異性をEGFRおよび無関係の抗原(TNFα)について評価した。geneIII産物を含む融合タンパク質としてVHHレパートリーを発現している組換えビリオンを産生するために、ライブラリーを、2%グルコースおよび100μg/mlのアンピシリンを含む10mlの2×TY培地中で37℃にてOD600nmが0.5に到達するまで増殖させた。M13KO7ファージ(1012個)を添加し、混合物を37℃で2回×30分間、最初は振盪せず、次に100 rpmで振盪してインキュベートした。細胞を、室温にて4,500 rpmで5分間遠心分離した。細菌のペレットを、100μg/mlのアンピシリンおよび25μg/mlのカナマイシンを含む50mlの2×TY培地に再懸濁し、250 rpmで活発に振盪させながら37℃で一晩インキュベートした。一晩の培養物を4℃にて4,500 rpmで15分間遠心分離し、上清を用いてファージを濃縮した。ファージを氷上で30分間PEG沈殿させ(20%ポリエチレングリコールおよび1.5M NaCl)、4,500 rpmで20分間遠心分離した。このペレットを1mlのPBSに再懸濁した。ファージを再び氷上で10分間PEG沈殿させ、4℃にて14,000rpmで10分間遠心分離した。このペレットを1mlのPBSに溶解した。1μg/mlのEGFRまたはTNFαを96ウェルMaxisorpプレート(Nunc)中で固定化し、4℃にて一晩インキュベートした。プレートをPBS/0.05% Tween-20で5回洗浄し、ウェルをカゼイン溶液(PBS中1%)でブロッキングし、そしてファージ希釈物を室温で2時間添加した。結合したファージを、抗M13 gpVIII-HRP抱合型モノクローナル抗体(Amersham Biosciences)およびABTS/H2O2を基質として用いて検出した。プレートを室温で15分間のインキュベーションの後に405nmで読み取った。動物024および動物025のPBL1ライブラリーからレスキューされたファージのプールからのファージ応答の例を、図8に示す。
ライブラリーを、細菌を対数期(OD600=0.5)まで増殖させることによってレスキューし、続いてヘルパーファージで感染させて、クローン化VHHのレパートリーをgpIII融合タンパク質としてファージの先端に発現している組換えファージを得た(実施例18に記載されるように)。EGFR特異的抗体について選択する場合、2つの別個の選択ストラテジーに従った。
第1の選択ストラテジーは、EGFRがリガンド溶出によってアフィニティークロマトグラフィーで精製され得るという事実に基づいた。リガンド結合部位または重複エピトープを競合する過剰の分子を加える、4つの異なる溶出条件を実行した(表11)。選択がA431細胞またはHer-14細胞において行われた場合、非選択性の組換えファージを、それぞれ6×106個の血液細胞(主に単球、T細胞およびB細胞)または2×107個の3T3細胞と共に4℃で20分間混合し、一般的なEGFR非特異的エピトープを認識する組換えファージについて枯渇させた。次いで、非結合性ファージをEGFR+の選択細胞と共に2時間インキュベートし、氷冷PBSで6回洗浄した。その後、ファージを過剰のEGFリガンドであるマウスモノクローナル2e9(Defize LH,Moolenaar WH, van der Saag PT, de Laat SW 1986年,「Dissociation of cellular responses to epidermal growth factor usinganti-receptor monoclonal antibodies」, EMBO J. 5: 1187-92)または EGFR拮抗抗体225および528(Sato JD, Kawamoto T, Le AD, Mendelsohn J, Polikoff J, Sato GH 1983年,「Biological effects invitro of monoclonal antibodies to human epidermal growth factor receptors」, Mol. Biol. Med. 1: 511-529)で溶出させた。レセプター媒介性のファージの細胞内部移行を回避するために、全ての選択工程を4℃で行った。対数的に増殖したE. coli TG1を、溶出させたファージで感染させ、選択培地2×TY Ap100および2%グルコースで37℃にて一晩増殖させた。細胞を擦り落とし、必要があればいつでも次回のパニング(panning)に使用した。EGFR特異的組換えファージ(表11)を濃縮するために、2回または3回のパニングを行った。精製抗原を選択に用いる場合はいつでも(表11)、EGFRをMaxisorpマイクロタイタープレート上に1μg/mlで固定化した。
第2の選択ストラテジーは、リガンドのレセプターへの結合後、EGFR媒介性の細胞シグナル伝達がレセプターの内部移行作用の機構によって下方制御され得るという観察に基づいた。細胞表面分子を介して細胞内部移行され得る組換えファージを同定するために、Poulら(Poul MA, Becerril B, Nielsen UB, Morisson P, Marks JD. 2000年,「Selection of tumor-specific internalizing human antibodies from phage libraries」, J. Mol. Biol. 301: 1149-61.)によって記載されたプロトコルに従った。非選択性組換えファージを、2%スキムミルクを補充した氷冷結合培地(重炭酸塩緩衝化DMEM;10%FCS(ウシ胎児血清);25mM Hepes)中で4℃にて30分間、約2×107個のマウス線維芽細胞3T3に添加して、非特異的VHHについて枯渇させた。その後、非結合性ファージを、結合培地中で予冷却したEGFR+の選択細胞(Her-14またはA431)と共に4℃で1.5時間インキュベートし、続いて氷冷PBSで6回洗浄して非結合性のファージを除去した。細胞を予熱した結合培地で覆い、直ちに37℃に20分間移行し、内部移行作用を可能にした。その後、細胞を4℃に冷却させ、弱酸(500mM NaCl;100mMグリシンpH2.5)とともに10分間インキュベーションして剥ぎ取り、表面結合性の組換えファージを除去した。細胞をトリプシン処理によって細胞外基質から遊離させた。次いで、再懸濁した細胞を4℃にて100mM TEAで4分間溶解し、内部移行されたファージを遊離させた。対数的に増殖したE. coli TG1を溶出したファージで感染させ、選択培地(2%グルコースを含む2×TY Ap100)で37℃にて一晩増殖させた。A431についておよび平行してHer-14についての単回の選択に使用されるライブラリーを、表12にまとめる。
パニングのエピトープ特異的溶出手順後の個々のクローンのEGFR特異性を検証するために、ファージELISAを各クローンについて行った。各選択手順(1、2、3、4、IaおよびIIIa;表11)について無作為に採取した47個のクローンを対数期(OD600=0.5)まで増殖させ、続いてヘルパーファージで感染させて、実施例18に記載のように組換えファージを得た。ファージELISAを、固相コーティングEGFR(非コーティングウェルと比較する)およびゼラチンコーティングHer-14細胞(3T3と比較する)の両方について行った。EGFR特異的VHHの存在を、各クローンの約109個の組換えファージ粒子を使用して検証した後、抗M13gpVIII-HRP抱合型モノクローナル抗体を用いて検出した。細胞および/または固相固定化EGFRについてのファージELISAにおいて陽性と評価されたクローンを用いて(表11)、HinfIフィンガープリント分析を行った(データは示さず)。各々別個のフィンガープリントの代表的なクローンについてヌクレオチド配列を決定した結果、条件1、Ia、2、IIIa、3および4について、それぞれ5個、8個、3個、4個、7個および4個の異なる配列を得た。これらの31個の結合剤のアミノ酸配列アラインメント(図9)により、それらのうちの20個がユニークであることが示された(表14の配列番号23〜42に記載される)。ファージELISA(細胞および固相コーティングEGFRの両方について)における20個のユニークなクローンのEGFR特異性を図10に示す。
内部移行作用プロトコルによる選択のために、合計84個の個々のクローンを用いた細胞についてのファージELISAを、エピトープ特異的溶出選択手順によって同定されたクローンについてと同様に行った。HinfIフィンガープリント分析の後、20個のユニークな結合剤(データは示さず)、2個の新規の抗EGFRクローン、EGFR-B11およびクローンEGFR-F11の上記パネルに対するヌクレオチド配列決定およびアミノ酸配列アラインメントを同定した(表14の配列番号43〜44)。細胞についてのファージELISAにおける両方のクローンのEGFR特異性を、図10のパネルAに示す。
Her-14細胞および3T3細胞をカバーガラス片上で一晩増殖させ、結合培地(実施例19を参照)で洗浄し、4℃で20分間冷却した。ファージを実施例18に記載のようにナノボディEGFR-IIIa42から調製し、2%スキムミルクを補充した結合培地で希釈した約1012個の組換えビリオンを、氷冷細胞に4℃で1時間添加した。細胞を氷冷PBSで1回洗浄して非結合性のファージを除去した。その後、これらの細胞を20分間37℃に移行してファージの内部移行を可能にし、再度4℃に冷却させた。細胞をPBSで2回洗浄した。次いで、室温で7分間のストリッピング緩衝液(150mM NaCl、125mM HAc)を用いた2回の酸洗浄により、細胞表面結合性のファージを除去した。PBSで2回洗浄した後、細胞を室温で30分間4%パラホルムアルデヒドのPBS中で固定し、再度PBSで2回洗浄した。次いで、固定した細胞を0.2% Triton X-100のPBS中で室温にて5分間透過させ、続いてPBSで2回洗浄し、残存する固定剤を100mMグリシンのPBS中で室温にて10分間ブロッキングした。細胞をPBS-0.5%(w/v)ゼラチンで洗浄し、抗M13gpVIII-FITC(Amersham Biosciences)、続いて抗マウスFITC標識化モノクローナル抗体を用いた染色によって内部移行されたファージを可視化し、その後、蛍光顕微鏡によって可視化した。図11により、EGFRIIIa42はHer-14細胞(パネルA)に細胞内部移行できるが、3T3細胞(パネルB)に細胞内部移行できないことを示す。その後、FACS分析により、ナノボディEGFR-IIIa42はA431およびHer-14の両方に結合できるが、3T3には結合できないことを実証した(データは示さず)。
レセプターシグナル伝達に対するEGFレセプター特異的ナノボディの影響を実証するために、細胞を12ウェル組織培養プレート中の1ウェル当たり100,000細胞で10%(v/v)血清を含む培地(DMEM)中に播種した。8時間後、細胞を低濃度(0.5% v/v)の血清を含む培地(DMEM)で1回洗浄し、同培地中で一晩血清欠乏にした。アッセイ当日、培地を結合培地(DMEM/0.5% FCS/25mM Hepesおよび2%スキムミルク)に交換し、適切な場合、リガンドまたはナノボディ(一価または二価)を37℃で添加した。15分後、細胞を氷上で急速に冷却し、氷冷PBS(10mM Na-リン酸;150mM NaCl、pH7.4)で2回洗浄した。50μlのタンパク質試料緩衝液中でプレートから細胞を擦り落として、全細胞溶解物を調製した。タンパク質を6%(w/v)ポリアクリルアミドゲル上でサイズ分画し(2つの平行なゲル上に1ゲル当たり20μlを負荷した)、PVDF膜(Roche)にブロットした。ブロットを、EGFRの総量についてレセプターに対するウサギポリクローナル抗血清(Santa Cruz)を用いて染色し、リン酸化レセプターについてモノクローナル抗ホスホチロシン抗体(PY-20;Transduction Labs)を用いて、続いて適切にロバで発生させたペルオキシダーゼ抱合型二次抗体(抗ウサギまたは抗マウス)を用いて染色した。Western Lightning(商標)基質(Perkin Elmer Life Sciences)を使用し、増強された化学蛍光によって検出を行った。驚いたことに、抗EGFR-IIIa42ナノボディは、EGFを枯渇させたEGFR+細胞を活性化しなかった。これは、レセプターTyrキナーゼリン酸化の欠失によって示された(図11、パネルC)。EGFが細胞に2種類の濃度で添加された陽性コントロールは、レセプターのリン酸化を明らかに誘導し、従ってこれらの細胞の活性化を誘導した。
実施例32(1):ラマの免疫化
2匹のラマを組換えEGFレセプターの反応混液およびPDK1で免疫化する。これらのラマを、EGFレセプターを過剰発現している細胞株で追加免疫する。これらの免疫化スキームを表15にまとめる。
RNA抽出について以下の異なる供給源を使用する:
- 最後の抗原注射4日後と10日後との間の免疫血液150ml
- 最後の抗原注射4日後のリンパ節生検
密度勾配遠心分離(Ficoll-Paque Plus Amersham Biosciences)によって、末梢血液リンパ球(PBL)を単離する。PBLおよびリンパ節を、全RNAの抽出(ChomczynskiおよびSacchi 1987)に使用し、次いでヘキサヌクレオチドランダムプライマーを用いてcDNAの合成を行う。2つのヒンジ特異的プライマーである:AACAGTTAAGCTTCCGCTTGCGGCCGCGGAGCTGGGGTCTTCGCTGTGGTGCGおよびAACAGTTAAGCTTCCGCTTGCGGCCGCTGGTTGTGGTTTTGGTGTCTTGGGTT、ならびにフレームワーク1特異的プライマーである:GAGGTBCARCTGCAGGASTCYGGを使用して、レパートリーを増幅する。断片を、PstIおよびNotIを用いて消化し、ファージミドベクター中にクローン化する。このレパートリーをTG1エレクトロコンピテント細胞中に形質転換し、100μg/mlのアンピシリンおよび2%グルコースを含むLB寒天プレート上にプレートする。ベクター特異的プライマーを用いたPCRによって、挿入の存在についてコロニーをスクリーニングする。
ライブラリーを、2%グルコースおよび100μg/mlのアンピシリンを含む60mlの2×TY培地中で37℃にてOD600nmが0.5に到達するまで増殖させる。M13KO7ファージ(1012)を添加し、混合物を37℃で2回×30分間、最初は振盪せず、次に100 rpmで振盪してインキュベートする。細胞を、室温にて4,500 rpmで10分間遠心分離する。細菌のペレットを、100μg/mlのアンピシリンおよび25μg/mlのカナマイシンを含む300mlの2×TY培地に再懸濁し、250 rpmで活発に振盪させながら30℃で一晩インキュベートする。一晩の培養物を4℃にて10.000 rpmで15分間遠心分離する。ファージをPEG沈殿させ(20%ポリエチレングリコールおよび1.5M NaCl)、10.000 rpmで30分間遠心分離する。このペレットを20mlのPBSに再懸濁する。ファージを再びPEG沈殿させ、4℃にて20,000 rpmで30分間遠心分離する。このペレットを5mlのPBSに溶解する。ファージを、OD600nm=0.5でのTG1細胞の感染、ならびに100μg/mlのアンピシリンおよび2%グルコースを含むLB寒天プレート上へのプレーティングによって、滴定する。形質転換体の数は、ファージの数(pfu)を示す。これらのファージを15%グリセロールと共に-80℃で保存する。
免疫管を、2μg/mlのEGFR、2μg/mlのPDK1または1%カゼインを含むPBSでコーティングする。4℃で一晩インキュベーションの後、これらの管を、1%カゼインを含むPBSで室温にて3時間ブロッキングする。ラマ005の3つのライブラリーおよびラマ006の3つのライブラリーの200μlのファージをプールし、EGFRについては、PDK1については50mMTris/HCl(pH7.4)、150mM KCl、1.0mM DTT、1mM MgCl2および0.3mg/mlのBSA中に、2mlの最終容量で免疫管に添加する。
マイクロタイタープレートを、4℃にて一晩、2μg/mlのEGFRまたは2μg/mlのPDK1でコーティングする。これらのプレートを、300μlのPBS中の1%カゼインで室温にて2時間ブロッキングする。これらのプレートを、PBS-Tweenで3回洗浄する。ペリプラズム抽出物を単一のコロニーから調製し、このマイクロタイタープレートのウェルに加える。プレートをPBS-Tweenで6回洗浄し、その後、マウス抗ヒスチジンmABのPBS中の1/1000倍希釈物と共に室温で1時間インキュベーションし、続いてまた室温で1時間、抗マウス-アルカリホスファターゼ抱合体のPBS中の1/2000倍希釈物と共にインキュベーションすることによって、VHHの結合を検出する。基質PNPP(1Mジエタノールアミン、1mM Mg2SO4中の2mg/mlのリン酸p-ニトロフェニル、pH9.8)を用いて染色を行い、30分後にシグナルを405nmで測定する。各選択についてELISAで試験されるクローンの数に対する陽性クローンの期待数の例を、表18に示す。
EGFRに特異的な個々のクローンをPCRによって増幅し、CMVプロモーターによって駆動される緑色蛍光タンパク質レポーター遺伝子をパッケージ化するように操作されたファージ中にクローン化する(Poul MAら、J Mol Biol, 1999, 288: 203-211)。ファージを調製し、EGFRを過剰発現している腫瘍細胞(A431)と共にインキュベートする。EGFR媒介性のエンドサイトーシスを受けるファージを、GFP発現によって測定する。1 VHH(EGFR-21)は、極めて高いGFP発現を示すことが期待され、さらなる分析に使用される。別のアプローチにおいて、Laroccaら(Laroccoら, Molecular Therapy, 2001, 3: 476-484)およびPoulら(Poul MAら, J Mol Biol, 1999, 288: 203-211)に記載されるように、冷メタノールでの処理による細胞の透過化処理の後、細胞内部移行ファージを抗ファージ抗体(ポリクローナルまたはモノクローナル)で染色する。
PDK1を、上記のようにマイクロタイタープレート中にコーティングし、これらのプレートをブロッキングの後、ウェルを100μg/mlのAktと共に室温にて1時間インキュベートする。次いで(洗浄せずに)、これらのウェルに100μlのペリプラズム抽出物を添加し、VHH結合を上記のように測定する。PDK1に結合できないVHHを、PDK1とAktの間の相互作用に対する阻害剤として評価する。阻害ELISAにおいて試験されるVHHの数に対する阻害性VHHの期待数を、表19にまとめる。
EGFR-21、およびPDK1に対する5つの異なる強い阻害性VHH(PD-1、PD-7、PD-32、PD-33およびPD-72)の、二重特異性構築物を調製する(Conrathら, J Biol Chem, 2001, 276: 7346-7350)。これらの5つの二重特異性構築物についてタンパク質を調製および均質に精製して、ウエスタンブロット分析により安定であることを示す。
二重特異性構築物を、EGFRを過剰発現している腫瘍細胞(A431)と共にインキュベートする。うまくエンドサイトーシスによって取り込まれた全ての構築物を共焦点顕微鏡法によって示す。これらの構築物の1つであるEGFR-21-PD-32は、細胞増殖を阻害し、最終的に細胞死を引き起こすことができると期待される。
本発明の抗-標的単一ドメイン抗体間のアミノ酸配列相同性の程度を、Bioedit Sequence Alignment Editorを用いて算出した。これらの計算結果は、ClustalWによって位置あわせされるように、全ての配列間で一致する残基の比率を示す(Thompson, J. D., Higgins, D. G.およびGibson, T. J. (1994) CLUSTAL W: improving the sensitivity of progressive multiple sequence alignment through sequence weighting, position specific gap penalties and weight matrix choice. Nucleic Acids Research, submitted, June 1994)。表20は、本発明の抗TNF-α VHH間の相同性割合(fraction homology)を示す。表21は、本発明の抗IFN-γ VHH間の相同性百分率を示す。
機能的部分であるMP2F6SRのCDR3領域を、フレームワーク4領域に位置するセンスプライマー(F6 CRD3順方向プライマー:CTGGCCCCAGAAGTCATACC)およびフレームワーク3領域に位置するアンチセンスプライマー(F6 CDR3逆方向プライマー:TGTGCATGTGCAGCAAACC)を用いて増幅させた。
CDR-3断片を抗血清アルブミンVHH MSA-21と融合させるために、2回目のPCR増幅を以下のプライマーを用いて行った:
F6 CDR3順方向プライマー Sfi1:
GTCCTCGCAACTGCGGCCCAGCCGGCCTGTGCATGTGCAGCAAACC
F6 CDR3逆方向プライマー Not1:
GTCCTCGCAACTGCGCGGCCGCCTGGCCCCAGAAGTCATACC
Okayasu I, Hatakeyama S, Yamada M, Ohkusa T, Inagaki Y, Nakaya R. A novel method in the induction of reliable experimental acute and chronic ulcerative colitis in mice. Gastroenterology 1990; 98: 694-702.
Kojouharoff G,Hans W, Obermeier F, Mannel DN, Andus T, Scholmerich J, Gross V, Falk W. Neutralization of tumour necrosis factor (TNF) but not of IL-1 reducesinflammation in chronic dextran sulphate sodium-induced colitis in mice. Clin Exp Immunol 1997; 107: 353-8.
MMP12
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Parallel expression of macrophage metalloelastase (MMP-12) in duodenal and skin lesions ofpatients with dermatitis herpetiformis.
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Expression of human macrophage metalloelastase (MMP-12) by tumor cells in skin cancer.
Claims (63)
- IgEに対する少なくとも1個の単一ドメイン抗体を含むポリペプチド構築物。
- 少なくとも1個の単一ドメイン抗体がラクダ科 VHHである請求項1に記載のポリペプチド構築物。
- 少なくとも1個の単一ドメイン抗体が配列番号1〜11のいずれかで表される配列に相当する請求項1および2に記載のポリペプチド構築物。
- 抗-IgE単一ドメイン抗体数が少なくとも2個である請求項1〜3のいずれかに記載のポリペプチド構築物。
- 少なくとも1個の単一ドメイン抗体がヒト化ラクダ科VHHである請求項1〜4のいずれかに記載のポリペプチド構築物。
- 単一ドメイン抗体が全長単一ドメイン抗体の相同配列、機能部分または相同配列の機能部分である請求項1〜5のいずれかに記載のポリペプチド構築物。
- ポリペプチド構築物が全長ポリペプチド構築物の相同配列、機能部分または相同配列の機能部分である請求項1〜5のいずれかに記載のポリペプチド構築物。
- 請求項1〜7のいずれかに記載のポリペプチド構築物をコードする核酸。
- 炎症過程に関連する疾患を治療および/または予防および/または緩和するための、請求項1〜7のいずれかに記載のポリペプチド構築物。
- 炎症反応に関連する疾患を治療および/または予防および/または緩和する医薬品を調製するための、請求項1〜7のいずれかに記載のポリペプチド構築物の使用。
- 疾患の治療のために不活性化されることなく抗標的化合物を対象に送達する方法であって、前記標的に対する1個以上の単一ドメイン抗体を含むポリペプチド構築物をその対象に投与することによる方法。
- 前記標的が消化器系に位置し、前記ポリペプチド構築物を経口で送達する請求項11に記載の方法。
- 前記標的が膣および/または直腸に位置し、前記ポリペプチド構築物を膣および/または直腸に送達する請求項11に記載の方法。
- 前記標的が鼻、上気道および/または肺に位置し、前記ポリペプチド構築物を鼻、上気道および/または肺に送達する請求項11に記載の方法。
- 前記標的が腸粘膜に位置し、前記ポリペプチド構築物を経口で送達する請求項11に記載の方法。
- 前記標的が舌下組織に位置し、前記ポリペプチド構築物を舌下組織に送達する請求項11に記載の方法。
- 前記標的が皮膚に位置し、前記ポリペプチド構築物を局所的に送達する請求項11に記載の方法。
- 前記標的が血液中に存在するかまたは血液を介して到達可能であり、前記ポリペプチド構築物が、膣および/または直腸への経口、舌下組織への経鼻、口または鼻を経由する吸入、あるいは局所である請求項11に記載の方法。
- 標的に対する少なくとも1個の単一ドメイン抗体を含むポリペプチド構築物であって、不活性化されずに胃内環境を通過できる抗-標的治療化合物による調節に感応する疾患の治療、予防および/または症状緩和に使用するペプチド構築物。
- 標的に対する少なくとも1個の単一ドメイン抗体を含むポリペプチド構築物であって、不活性化されずに腸粘膜壁を通過できる抗-標的治療化合物による調節に感応する疾患の治療、予防および/または症状緩和に使用するペプチド構築物。
- 標的に対する少なくとも1個の単一ドメイン抗体を含むポリペプチド構築物であって、不活性化されずに鼻、上気道および/または肺の壁を通過できる抗-標的治療化合物による調節に感応する疾患の治療、予防および/または症状緩和に使用するポリペプチド構築物。
- 標的に対する少なくとも1個の単一ドメイン抗体を含むポリペプチド構築物であって、不活性化されずに膣および/または直腸壁を通過できる抗-標的治療化合物による調節に感応する疾患の治療、予防および/または症状緩和に使用するポリペプチド構築物。
- 標的に対する少なくとも1個の単一ドメイン抗体を含むポリペプチド構築物であって、不活性化されずに舌下組織を通過できる治療化合物による調節に感応する疾患の治療、予防および/または症状緩和に使用するポリペプチド構築物。
- 標的に対する少なくとも1個の単一ドメイン抗体を含むポリペプチド構築物であって、不活性化されずに皮膚を通過できる治療化合物による調節に感応する疾患の治療、予防および/または症状緩和に使用するためポリペプチド構築物。
- 前記標的がTNF-αで、疾患が炎症である請求項11〜18のいずれかに記載の方法または請求項19〜24のいずれかに記載のポリペプチド構築物。
- 単一ドメイン抗体が配列番号12〜14のいずれかで表される配列に相当する請求項25に記載の方法またはポリペプチド。
- 前記標的がCEAで、疾患が結腸癌である請求項11〜18のいずれかに記載の方法または請求項19〜24のいずれかに記載のポリペプチド構築物。
- 前記標的がEGFRで、疾患が頭部、頚部、肺および結腸の癌のいずれかである請求項11〜18のいずれかに記載の方法または請求項19〜24のいずれかに記載のポリペプチド構築物。
- 単一ドメイン抗体が配列番号23〜44のいずれかで表される配列に相当する請求項28に記載の方法またはポリペプチド構築物。
- 前記標的がピロリ菌の抗原で、疾患が消化不良、胃炎のいずれかである請求項11〜18のいずれかに記載の方法または請求項19〜24のいずれかに記載のポリペプチド構築物。
- 前記標的が結核菌の抗原で、疾患が結核である請求項11〜18のいずれかに記載の方法または請求項19〜24のいずれかに記載のポリペプチド構築物。
- 前記標的がインフルエンザウイルスの抗原で、疾患が流感である請求項11〜18のいずれかに記載の方法または請求項19〜24のいずれかに記載のポリペプチド構築物。
- 前記標的がIgEの抗原で、疾患がアレルギー反応である請求項11〜18のいずれかに記載の方法または請求項19〜24のいずれかに記載のポリペプチド構築物。
- 単一ドメイン抗体が配列番号1〜11のいずれかで表される配列に相当する請求項33に記載の方法またはポリペプチド構築物。
- 前記標的がMMPの抗原で、疾患が癌である請求項11〜18のいずれかに記載の方法または請求項19〜24のいずれかに記載のポリペプチド構築物。
- 単一ドメイン抗体が配列番号15〜22のいずれかで表される配列に相当する請求項35に記載の方法またはポリペプチド構築物。
- 前記標的がIFN-γの抗原で、疾患が癌、移植の拒絶反応、自己免疫疾患である請求項11〜18のいずれかに記載の方法または請求項19〜24のいずれかに記載のポリペプチド構築物。
- 単一ドメイン抗体が配列番号45〜70のいずれかで表される配列に相当する請求項37に記載の方法またはポリペプチド構築物。
- 前記標的がピロリ菌の抗原、結核菌の抗原、インフルエンザウイルスの抗原のいずれかである請求項11〜18のいずれかに記載の方法または請求項19〜24のいずれかに記載のポリペプチド構築物。
- 細胞内部移行レセプターに対する少なくとも1個の単一ドメイン抗体および治療標的に対する少なくとも1個の単一ドメイン抗体を含むポリペプチド構築物。
- 細胞内部移行レセプターに対する少なくとも1個の単一ドメイン抗体および少なくとも1個の治療ポリペプチドまたは作用物質を含むポリペプチド構築物。
- 前記細胞内部移行レセプターが上皮細胞増殖因子レセプターである請求項40および41に記載のポリペプチド構築物。
- 細胞内部移行レセプターに対する単一ドメイン抗体が配列番号23〜44のいずれかで表される配列に相当する請求項42に記載のポリペプチド構築物。
- 前記細胞内部移行レセプターがLDLレセプター、FGF2r、ErbB2r、転移レセプター、PDGr、VEGrまたはPsmArのいずれかである請求項40および41に記載のポリペプチド構築物。
- 治療標的に対する1個の単一ドメイン抗体がPDK1に対するものである請求項40〜44のいずれかに記載のポリペプチド構築物。
- 癌治療に使用するための請求項45に記載のポリペプチド構築物。
- 治療標的に対する1個の単一ドメイン抗体がGSK1、Bad、カスパーゼおよびフォークヘッドのいずれかに対するものである請求項40〜44のいずれかに記載のポリペプチド構築物。
- 癌治療に使用するための請求項47に記載のポリペプチド構築物。
- 請求項40〜48のいずれかに記載のポリペプチド構築物の対象への投与を含む、細胞内部に抗-標的治療化合物を送達する方法。
- 請求項40〜49のいずれかに記載のポリペプチド構築物の対象への投与を含む、不活性化されずに細胞内部に抗-標的治療化合物を送達する方法。
- 前記細胞が消化器系に位置し、前記ポリペプチド構築物を経口で送達する請求項50に記載の方法。
- 前記細胞が膣および/または直腸に位置し、前記ポリペプチド構築物を膣および/または直腸に送達する請求項50に記載の方法。
- 前記細胞が鼻、上気道および/または肺に位置し、前記ポリペプチド構築物を鼻、上気道および/または肺に送達する請求項50に記載の方法。
- 前記細胞が腸粘膜に位置し、前記ポリペプチド構築物を経口で送達する請求項50に記載の方法。
- 前記細胞が舌下組織に位置し、前記ポリペプチド構築物を舌下組織に送達する請求項50に記載の方法。
- 前記細胞が皮膚に位置し、前記ポリペプチド構築物を局所的に送達する請求項50に記載の方法。
- 前記細胞が血液中に存在するかまたは血液を介して到達可能であり、前記ポリペプチド構築物の送達が、膣および/または直腸への経口、舌下組織への経鼻、口または鼻を経由する吸入、あるいは局所である請求項50に記載の方法。
- 単一ドメイン抗体がヒト化ラクダ科VHHである請求項1〜7、19〜24、40〜48のいずれかに記載のポリペプチド構築物または請求項11〜18、25〜39、49〜57のいずれかに記載の方法。
- 前記単一ドメイン抗体が、全長単一ドメイン抗体の相同配列、機能部分または相同配列の機能部分である請求項1〜7、19〜24、40〜48、58のいずれかに記載のポリペプチド構築物または請求項11〜18、25〜39、49〜57のいずれかに記載の方法。
- ポリペプチド構築物が、全長ポリペプチド構築物の相同配列、機能部分または相同配列の機能部分である請求項1〜7、19〜24、40〜48、58および59のいずれかに記載のポリペプチド構築物または請求項11〜18、25〜39、49〜59のいずれかに記載の方法。
- 前記単一ドメイン抗体がラクダ科VHHである請求項1〜7、19〜24、40〜48、58〜60のいずれかに記載のポリペプチド構築物または請求項11〜18、25〜39、49〜60のいずれかに記載の方法。
- 請求項1〜7、19〜24、40〜48、58〜61のいずれかに記載のポリペプチド構築物をコードする核酸。
- 薬学的キャリアと合わせて、先行する請求項のいずれかに規定したポリペプチド構築物を含む組成物。
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