JP2988635B2 - ヒトＩｇＥに対するモノクローナル抗体 - Google Patents
ヒトＩｇＥに対するモノクローナル抗体Info
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- C07K16/4283—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against immunoglobulins against an allotypic or isotypic determinant on Ig
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Description
【発明の詳細な説明】 産業上の利用分野 本発明はヒト免疫グロブリンＥ（以下IgE）に対する
モノクローナル抗体、該モノクローナル抗体の混合物、
該モノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ、およ
び該モノクローナル抗体を用いるヒトIgEの免疫測定法
に関する。本発明のモノクローナル抗体は、ヒト血清Ig
Eを測定する臨床検査薬用抗体として有用である。
モノクローナル抗体、該モノクローナル抗体の混合物、
該モノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ、およ
び該モノクローナル抗体を用いるヒトIgEの免疫測定法
に関する。本発明のモノクローナル抗体は、ヒト血清Ig
Eを測定する臨床検査薬用抗体として有用である。
従来技術 IgEは、1966年石坂らにより発見された免疫グロブリ
ンであり、肥満細胞や好塩基球表面のFcレセプターを介
して結合し、アレルゲンと反応することによって即時型
アレルギーを引き起こす主要因となることが知られてい
る。また、IgEは他の免疫グロブリンに比べその血中濃
度が極めて低いが、アレルギー性疾患をはじめとして、
肝障害や寄生虫感染などの疾患を伴う場合可成りの程度
までIgE濃度が上昇するなど、血中濃度分布の広範なこ
とが特徴である。このようなことから、血中IgE濃度の
測定を行なうことは、アレルギー性疾患や、寄生虫感染
症の診断に有用と考えられており、現在一般的に普及し
ている方法は、ラジオイムノアッセイ（RIA）法や、エ
ンザイムイムノアッセイ（EIA）法である。
ンであり、肥満細胞や好塩基球表面のFcレセプターを介
して結合し、アレルゲンと反応することによって即時型
アレルギーを引き起こす主要因となることが知られてい
る。また、IgEは他の免疫グロブリンに比べその血中濃
度が極めて低いが、アレルギー性疾患をはじめとして、
肝障害や寄生虫感染などの疾患を伴う場合可成りの程度
までIgE濃度が上昇するなど、血中濃度分布の広範なこ
とが特徴である。このようなことから、血中IgE濃度の
測定を行なうことは、アレルギー性疾患や、寄生虫感染
症の診断に有用と考えられており、現在一般的に普及し
ている方法は、ラジオイムノアッセイ（RIA）法や、エ
ンザイムイムノアッセイ（EIA）法である。
発明が解決しようとする課題 ヒトIgEに特異的に反応するモノクローナル抗体は、
既に市森らによって報告されている［市森ら、ハイブリ
ドーマ（Hybridoma）４、47（1985）］ものなど多数知
られており、更に、これらのヒトIgE特異的モノクロー
ナル抗体を用いたヒト血中IgE測定法も、J.グラシらに
よって報告されている［J.グラシ（Grassi）ら、ザ・ジ
ャーナル・オブ・アレルギー・アンド・クリニカル・イ
ムノロジー（J.Allergy.Clin.Immunol.）77,808（198
6）］例など幾つか知られている。しかしながら、これ
らのモノクローナル抗体を用いた従来の方法で、ヒト血
中IgE量を測定しようとする際には、IgEの測定範囲が狭
い、測定操作が煩雑となる、検量線が直線的でないため
に、測定濃度域毎の感度が一様でなく、測定される濃度
に一様な信頼性を期待しにくい、あるいは測定に特殊な
装置を必要とするなどの問題点があり、これら全てを同
時に解決する手段は見出されていないのが現状である。
既に市森らによって報告されている［市森ら、ハイブリ
ドーマ（Hybridoma）４、47（1985）］ものなど多数知
られており、更に、これらのヒトIgE特異的モノクロー
ナル抗体を用いたヒト血中IgE測定法も、J.グラシらに
よって報告されている［J.グラシ（Grassi）ら、ザ・ジ
ャーナル・オブ・アレルギー・アンド・クリニカル・イ
ムノロジー（J.Allergy.Clin.Immunol.）77,808（198
6）］例など幾つか知られている。しかしながら、これ
らのモノクローナル抗体を用いた従来の方法で、ヒト血
中IgE量を測定しようとする際には、IgEの測定範囲が狭
い、測定操作が煩雑となる、検量線が直線的でないため
に、測定濃度域毎の感度が一様でなく、測定される濃度
に一様な信頼性を期待しにくい、あるいは測定に特殊な
装置を必要とするなどの問題点があり、これら全てを同
時に解決する手段は見出されていないのが現状である。
課題を解決するための手段 本発明が提供するヒトIgE特異的モノクローナル抗体
は、４種のモノクローナル抗体のそれぞれがヒトIgEの
異なる領域に結合し、なおかつこれら４種の中ではヒト
IgEに対する他の抗体の結合に影響されることなくヒトI
gEに結合することができる。更に、４種のヒトIgE特異
的モノクローナル抗体のそれぞれがヒトIgEに対して異
なる親和性で結合するので、これらを混合することによ
ってヒトIgEに対する反応性の強さを調節することがで
きるという特長を備えている。これらのことから、本発
明にかかるヒトIgE特異的モノクローナル抗体を用いる
ことにより、極めて簡便な操作で特殊な装置を必要とす
ることなく、広範囲のヒト血中IgE濃度を高い信頼性で
測定することが可能である。したがって、本発明モノク
ローナル抗体は、ヒト血中IgE測定用臨床検査薬として
利用することができる。
は、４種のモノクローナル抗体のそれぞれがヒトIgEの
異なる領域に結合し、なおかつこれら４種の中ではヒト
IgEに対する他の抗体の結合に影響されることなくヒトI
gEに結合することができる。更に、４種のヒトIgE特異
的モノクローナル抗体のそれぞれがヒトIgEに対して異
なる親和性で結合するので、これらを混合することによ
ってヒトIgEに対する反応性の強さを調節することがで
きるという特長を備えている。これらのことから、本発
明にかかるヒトIgE特異的モノクローナル抗体を用いる
ことにより、極めて簡便な操作で特殊な装置を必要とす
ることなく、広範囲のヒト血中IgE濃度を高い信頼性で
測定することが可能である。したがって、本発明モノク
ローナル抗体は、ヒト血中IgE測定用臨床検査薬として
利用することができる。
１）ハイブリドーマの調製 マウスをヒトIgEで免疫する。免疫されたマウスから
抗体産生細胞を得、これと骨髄腫細胞を融合し、得られ
たハイブリドーマのうち免疫したヒトIgEおよび由来の
異なるヒトIgEに強く反応し、ヒトIgGには反応しないハ
イブリドーマのウエルを選択する。選択されたハイブリ
ドーマをクローニングし、出現したハイブリドーマクロ
ーンにつき、由来の異なるヒトIgE3種およびヒトIgA、
ヒトIgM、ヒトIgGに対する抗体の反応特異性を詳しく検
定し、免疫したヒトIgEおよび由来の異なるヒトIgEに対
しては強く反応するが、他のヒト免疫グロブリンには反
応しないクローンを選択し、これを培養してモノクロー
ナル抗体を回収する。免疫法、細胞融合法、融合細胞の
選択等は公知の通常の方法によって行うことができる。
抗体産生細胞を得、これと骨髄腫細胞を融合し、得られ
たハイブリドーマのうち免疫したヒトIgEおよび由来の
異なるヒトIgEに強く反応し、ヒトIgGには反応しないハ
イブリドーマのウエルを選択する。選択されたハイブリ
ドーマをクローニングし、出現したハイブリドーマクロ
ーンにつき、由来の異なるヒトIgE3種およびヒトIgA、
ヒトIgM、ヒトIgGに対する抗体の反応特異性を詳しく検
定し、免疫したヒトIgEおよび由来の異なるヒトIgEに対
しては強く反応するが、他のヒト免疫グロブリンには反
応しないクローンを選択し、これを培養してモノクロー
ナル抗体を回収する。免疫法、細胞融合法、融合細胞の
選択等は公知の通常の方法によって行うことができる。
２）モノクローナル抗体の作製 選択したハイブリドーマをin vitro培養法又はin viv
o培養法により増殖させ、モノクローナル抗体を得る。i
n vitro培養法としては、ハイブリドーマを完全RPMI培
地で増殖限界になるまで培養し、その培養上清を回収す
ることによってモノクローナル抗体を得ることができ
る。in vivo培養法としては、あらかじめプリステンを
腹腔内投与処理したBALB/cマウスに、５×106〜107個の
ハイブリドーマを腹腔内に移植し、約３週後にマウスの
腹部肥大を確かめて、その腹水を採取し、腹水からIgG
画分を分離精製することによってモノクローナル抗体を
得ることができる。
o培養法により増殖させ、モノクローナル抗体を得る。i
n vitro培養法としては、ハイブリドーマを完全RPMI培
地で増殖限界になるまで培養し、その培養上清を回収す
ることによってモノクローナル抗体を得ることができ
る。in vivo培養法としては、あらかじめプリステンを
腹腔内投与処理したBALB/cマウスに、５×106〜107個の
ハイブリドーマを腹腔内に移植し、約３週後にマウスの
腹部肥大を確かめて、その腹水を採取し、腹水からIgG
画分を分離精製することによってモノクローナル抗体を
得ることができる。
本発明においては、上記の方法により、ヒトIgEに特
異的に結合するモノクローナル抗体HE−39E、HE−22A、
HE−69BおよびHE−35Aが得られた。これらの抗体を産生
するハイブリドーマHE−39Eシオノギ、HE−22Aシオノ
ギ、HE−69BシオノギおよびHE−35Aシオノギは、それぞ
れ、微工研菌寄第11381号、微工研菌寄第11382号、微工
研菌寄第11383号および微工研菌寄第11384号として、茨
城県つくば市東１−１−３の微生物工業技術研究所に、
平成２年３月27日から寄託されている。
異的に結合するモノクローナル抗体HE−39E、HE−22A、
HE−69BおよびHE−35Aが得られた。これらの抗体を産生
するハイブリドーマHE−39Eシオノギ、HE−22Aシオノ
ギ、HE−69BシオノギおよびHE−35Aシオノギは、それぞ
れ、微工研菌寄第11381号、微工研菌寄第11382号、微工
研菌寄第11383号および微工研菌寄第11384号として、茨
城県つくば市東１−１−３の微生物工業技術研究所に、
平成２年３月27日から寄託されている。
本発明のモノクローナル抗体は、ヒトIgA、ヒトIgGお
よびヒトIgMとは反応せず、ヒトIgE・λおよびヒトIgE
・κと強く反応し、ヒトIgEに特異的である。
よびヒトIgMとは反応せず、ヒトIgE・λおよびヒトIgE
・κと強く反応し、ヒトIgEに特異的である。
モノクローナル抗体HE−22Aは、糖タンパク質糖鎖を
切断するエンドグリコシダーゼＦで処理したヒトIgEと
反応せず、ヒトIgEの糖鎖と密接に関連する構造を認識
するものと推定された。
切断するエンドグリコシダーゼＦで処理したヒトIgEと
反応せず、ヒトIgEの糖鎖と密接に関連する構造を認識
するものと推定された。
モノクローナル抗体HE−35Aは、熱変性ヒトIgEに対す
る反応性が著しく低く、熱処理によりヒトIgEのＤε２
ドメインの構造変化が起こることが知られているので、
ヒトIgEのＤε２ドメインを認識するものと推定され
た。
る反応性が著しく低く、熱処理によりヒトIgEのＤε２
ドメインの構造変化が起こることが知られているので、
ヒトIgEのＤε２ドメインを認識するものと推定され
た。
モノクローナル抗体HE−39EおよびHE−69Bは、市販の
モノクローナル抗Ｄε１抗体（セロテック社）により、
ヒトIgEへの結合を阻害されたので、ヒトIgEのＤε１ド
メインを認識するものと推定された。但し、モノクロー
ナル抗体HE−39EおよびHE−69Bは、互いにヒトIgEへの
結合を阻害することはなく、Ｄε１ドメインの異なる部
分を認識している。
モノクローナル抗Ｄε１抗体（セロテック社）により、
ヒトIgEへの結合を阻害されたので、ヒトIgEのＤε１ド
メインを認識するものと推定された。但し、モノクロー
ナル抗体HE−39EおよびHE−69Bは、互いにヒトIgEへの
結合を阻害することはなく、Ｄε１ドメインの異なる部
分を認識している。
以上から、本発明のモノクローナル抗体は、それぞれ
がヒトIgEの異なる領域に結合し、なおかつ他のモノク
ローナル抗体のヒトIgEに対する結合に影響されること
なくヒトIgEに結合することができる。
がヒトIgEの異なる領域に結合し、なおかつ他のモノク
ローナル抗体のヒトIgEに対する結合に影響されること
なくヒトIgEに結合することができる。
本発明のモノクローナル抗体は全て、未変性のヒトIg
Eに強く結合するが、塩酸グアニジンおよび２−メルカ
プトエタノールで変性したヒトIgEには結合しない。
Eに強く結合するが、塩酸グアニジンおよび２−メルカ
プトエタノールで変性したヒトIgEには結合しない。
本発明のモノクローナル抗体は全て、マウスの免疫グ
ロブリンＧに属する。
ロブリンＧに属する。
本発明のモノクローナル抗体は、それぞれ、ヒトIgE
に対して異なる親和性で結合するので、その２種以上を
混合することにより、ヒトIgEに対する反応性の強さを
調節することができる。例えば、固相化モノクローナル
抗体HE−69Bを用いるサンドウィッチイムノアッセイに
おいて、標識抗体として、標識物の抗体当りの比活性が
同一であるモノクローナル抗体HE−22A、HE−35Aおよび
HE−39Eをタンパク質濃度比２〜7:1:5〜20で混合したも
のを用いれば、IgEの測定範囲が広く、検量線の調節が
可能になる。このように、本発明のモノクローナル抗体
HE−22A、HE−35AおよびHE−39Eからなる群から選択さ
れる異なる２種以上のモノクローナル抗体を混合した、
ヒトIgEに対して所望の反応性をもつモノクローナル抗
体混合物を得ることができる。
に対して異なる親和性で結合するので、その２種以上を
混合することにより、ヒトIgEに対する反応性の強さを
調節することができる。例えば、固相化モノクローナル
抗体HE−69Bを用いるサンドウィッチイムノアッセイに
おいて、標識抗体として、標識物の抗体当りの比活性が
同一であるモノクローナル抗体HE−22A、HE−35Aおよび
HE−39Eをタンパク質濃度比２〜7:1:5〜20で混合したも
のを用いれば、IgEの測定範囲が広く、検量線の調節が
可能になる。このように、本発明のモノクローナル抗体
HE−22A、HE−35AおよびHE−39Eからなる群から選択さ
れる異なる２種以上のモノクローナル抗体を混合した、
ヒトIgEに対して所望の反応性をもつモノクローナル抗
体混合物を得ることができる。
また、125Iなどの放射性同位体、西洋ワサビペルオキ
シダーゼなどの酵素、そのほかビオチン、アビジンなど
の公知の標識化合物により標識された本発明のモノクロ
ーナル抗体およびモノクローナル抗体混合物も本発明に
包含される。
シダーゼなどの酵素、そのほかビオチン、アビジンなど
の公知の標識化合物により標識された本発明のモノクロ
ーナル抗体およびモノクローナル抗体混合物も本発明に
包含される。
本発明は、さらに、上記のモノクローナル抗体を産生
するハイブリドーマ細胞系を提供する。
するハイブリドーマ細胞系を提供する。
本発明は、上記のモノクローナル抗体HE−22A、HE−3
5A、HE−39EおよびHE−69Bからなる群から選択されるモ
ノクローナル抗体を固相化し、得られた固相化抗体をヒ
トIgEを含有する試料と接触させることにより該固相化
固体と該ヒトIgEを結合させ、該固相化抗体に結合した
該ヒトIgEに、該群から選択され該固相化抗体とは異な
る標識されたモノクローナル抗体を結合させるヒトIgE
の免疫測定法を提供する。本発明のモノクローナル抗体
は、それぞれの認識部位が異なり、かつ互いに他の抗体
のIgEへの結合を阻害しないので、このようなサンドウ
ィッチ免疫測定法が可能になる。後記実施例に示すとお
り、いずれの抗体を固相化抗体としても、他の３種の抗
体のいずれも標識化抗体として用いることができる。
5A、HE−39EおよびHE−69Bからなる群から選択されるモ
ノクローナル抗体を固相化し、得られた固相化抗体をヒ
トIgEを含有する試料と接触させることにより該固相化
固体と該ヒトIgEを結合させ、該固相化抗体に結合した
該ヒトIgEに、該群から選択され該固相化抗体とは異な
る標識されたモノクローナル抗体を結合させるヒトIgE
の免疫測定法を提供する。本発明のモノクローナル抗体
は、それぞれの認識部位が異なり、かつ互いに他の抗体
のIgEへの結合を阻害しないので、このようなサンドウ
ィッチ免疫測定法が可能になる。後記実施例に示すとお
り、いずれの抗体を固相化抗体としても、他の３種の抗
体のいずれも標識化抗体として用いることができる。
さらに、本発明は上記のモノクローナル抗体HE−69B
を固相化し、得られた固相化抗体をヒトIgEを含有する
試料と接触させることにより該固相化抗体と該ヒトIgE
を結合させ、該固相化抗体に結合した該ヒトIgEに、標
識した上記モノクローナル抗体混合物を結合させるヒト
IgEの免疫測定法を提供する。この方法によれば、IgEの
測定範囲が広く、検量線が直線的になるので、より望ま
しい。
を固相化し、得られた固相化抗体をヒトIgEを含有する
試料と接触させることにより該固相化抗体と該ヒトIgE
を結合させ、該固相化抗体に結合した該ヒトIgEに、標
識した上記モノクローナル抗体混合物を結合させるヒト
IgEの免疫測定法を提供する。この方法によれば、IgEの
測定範囲が広く、検量線が直線的になるので、より望ま
しい。
本発明はまた、固相化抗原にヒトIgEを含有する試料
を接触させ、該試料中の該抗原に特異的なヒトIgE抗体
を該固相化抗原に結合させ、該固相化抗原に結合した抗
原特異性ヒトIgE抗体に、標識した上記のモノクローナ
ル抗体を結合させる抗原特異性ヒトIgE抗体の免疫測定
法を提供する。例えば、固相化抗原としてダニ抗原を用
いれば、ヒト血液などの試料中の、ダニ抗原特異IgE抗
体のみを測定することができる。
を接触させ、該試料中の該抗原に特異的なヒトIgE抗体
を該固相化抗原に結合させ、該固相化抗原に結合した抗
原特異性ヒトIgE抗体に、標識した上記のモノクローナ
ル抗体を結合させる抗原特異性ヒトIgE抗体の免疫測定
法を提供する。例えば、固相化抗原としてダニ抗原を用
いれば、ヒト血液などの試料中の、ダニ抗原特異IgE抗
体のみを測定することができる。
測定された試料中のIgE濃度は、種々の濃度のIgEを用
いて作成された検量線から求めることができる。
いて作成された検量線から求めることができる。
実施例１ （１） 免疫 ８週令の雌BALB/cマウス３匹に、それぞれ200μｇの
ヒトIgEをフロイント完全アジュバントとともに腹腔内
投与し、３週間後に、更に20μｇのヒトIgEをミョウバ
ン沈降懸濁液として腹腔内に３日連続投与した。
ヒトIgEをフロイント完全アジュバントとともに腹腔内
投与し、３週間後に、更に20μｇのヒトIgEをミョウバ
ン沈降懸濁液として腹腔内に３日連続投与した。
（２） 細胞融合 最終免疫の翌日に、３匹の脾臓を摘出し、RPMI培地を
用いて細胞浮遊液を調製した。この３×108個の脾細胞
と９×107個の骨髄腫細胞NS−１とを混合し、遠沈後、
沈渣に50％ポリエチレングリコール（平均分子量4000）
1mlをゆるやかに攪拌しながら加え、更に１分間攪拌し
た。RPMI培地1mlを１分間を要して加え、同じく1mlを追
加した後、更に、7mlを３分間を要して加えた。遠沈
後、沈残を15％ウシ胎児血清を含むRPMI培地（完全RPMI
培地）60mlに浮遊させ、96穴マイクロ培養プレート６枚
の各ウエルに0.1mlずつ接種し、７％炭酸ガスの存在
下、37℃で培養した。24時間後、ヒポキサンチン100μ
Ｍ、アミノプテリン0.4μＭ、チミジン16μＭを含む完
全RPMI培地（HAT培地）、0.1ml加える。培養開始後、
２、３、５および８日目に、培養上清0.1mlを捨て、HAT
培地0.1mlを加えた。11および14日目に、培養上清0.1ml
を捨て、ヒポキサンチン100μＭ、チミジン16μＭを含
む完全RPMI培地（HT培地）0.1mlを加えた。計506ウエル
の中で460のウエルからハイブリドーマのコロニーが出
現した。
用いて細胞浮遊液を調製した。この３×108個の脾細胞
と９×107個の骨髄腫細胞NS−１とを混合し、遠沈後、
沈渣に50％ポリエチレングリコール（平均分子量4000）
1mlをゆるやかに攪拌しながら加え、更に１分間攪拌し
た。RPMI培地1mlを１分間を要して加え、同じく1mlを追
加した後、更に、7mlを３分間を要して加えた。遠沈
後、沈残を15％ウシ胎児血清を含むRPMI培地（完全RPMI
培地）60mlに浮遊させ、96穴マイクロ培養プレート６枚
の各ウエルに0.1mlずつ接種し、７％炭酸ガスの存在
下、37℃で培養した。24時間後、ヒポキサンチン100μ
Ｍ、アミノプテリン0.4μＭ、チミジン16μＭを含む完
全RPMI培地（HAT培地）、0.1ml加える。培養開始後、
２、３、５および８日目に、培養上清0.1mlを捨て、HAT
培地0.1mlを加えた。11および14日目に、培養上清0.1ml
を捨て、ヒポキサンチン100μＭ、チミジン16μＭを含
む完全RPMI培地（HT培地）0.1mlを加えた。計506ウエル
の中で460のウエルからハイブリドーマのコロニーが出
現した。
（３） ハイブリドーマの選択 培養ウエル中のハイブリドーマを完全RPMI培地で培養
し、その培養上清中の特異抗体産生の有無を次のように
して検出した。
し、その培養上清中の特異抗体産生の有無を次のように
して検出した。
ポリスチレン製マイクロタイタープレートの各ウエル
に、ヒトIgE（免疫に用いたもの;IgE・λ）を0.01Mリン
酸緩衝食塩液（pH7.4）にとかした溶液（10μg/ml）50
μを入れ、37℃で１時間放置した後、10％ウシ胎児血
清を含む0.01Mリン酸緩衝食塩液（pH7.4）100μを加
え、37℃で20分間ブロックした。0.05％ツイーン20を含
む0.01Mリン酸緩衝食塩液（pH7.4）で洗浄し、ヒトIgE
固相ウエルを作製した。ヒトIgE固相ウエルに培養上清5
0μを加え、37℃で１時間インキュベートした。上記
と同様に洗浄後、第２抗体として、西洋ワサビペルオキ
シダーゼ標識家兎抗マウスIgG（Ｈ＋Ｌ）抗体50μを
加え、37℃で１時間インキュベートした。同様に洗浄
後、1.1％過酸化水素水と150μg/mlのアジノービス（３
−エチルベンゾチアゾリン−６−スルホン酸）（ABTS）
を含む50mMクエン酸緩衝液（pH4.5）50μを加え、25
℃で５分間発色させた。停止液として2mMアジ化ナトリ
ウムを50μ加え、450nmの吸光度をマイクロプレート
用の分光光度計により測定し、0.5以上の吸光度のある
ハイブリドーマを計145ウエル選択した。
に、ヒトIgE（免疫に用いたもの;IgE・λ）を0.01Mリン
酸緩衝食塩液（pH7.4）にとかした溶液（10μg/ml）50
μを入れ、37℃で１時間放置した後、10％ウシ胎児血
清を含む0.01Mリン酸緩衝食塩液（pH7.4）100μを加
え、37℃で20分間ブロックした。0.05％ツイーン20を含
む0.01Mリン酸緩衝食塩液（pH7.4）で洗浄し、ヒトIgE
固相ウエルを作製した。ヒトIgE固相ウエルに培養上清5
0μを加え、37℃で１時間インキュベートした。上記
と同様に洗浄後、第２抗体として、西洋ワサビペルオキ
シダーゼ標識家兎抗マウスIgG（Ｈ＋Ｌ）抗体50μを
加え、37℃で１時間インキュベートした。同様に洗浄
後、1.1％過酸化水素水と150μg/mlのアジノービス（３
−エチルベンゾチアゾリン−６−スルホン酸）（ABTS）
を含む50mMクエン酸緩衝液（pH4.5）50μを加え、25
℃で５分間発色させた。停止液として2mMアジ化ナトリ
ウムを50μ加え、450nmの吸光度をマイクロプレート
用の分光光度計により測定し、0.5以上の吸光度のある
ハイブリドーマを計145ウエル選択した。
免疫原としてのヒトIgEに対して抗体産生を行なって
いるハイブリドーマについて、由来の異なるヒトIgE（I
gE・κ）およびヒトIgGに対する反応の有無を、上記と
同様にELISA法で調べた。その結果、２種のヒトIgEに強
く反応し、ヒトIgGには反応しないハイブリドーマ40ウ
エルを選択した。選択されたハイブリドーマを限界希釈
法によりクローニングし、出現したハイブリドーマクロ
ーンの培養上清につき、ヒトIgE・λ、ヒトIgE・κ、ヒ
トIgA、ヒトIgG、ヒトIgMおよびヒト免疫グロブログリ
ンＬ鎖λタイプ、Ｌ鎖κタイプに対する抗体の反応特異
性をELISA法で検定した。
いるハイブリドーマについて、由来の異なるヒトIgE（I
gE・κ）およびヒトIgGに対する反応の有無を、上記と
同様にELISA法で調べた。その結果、２種のヒトIgEに強
く反応し、ヒトIgGには反応しないハイブリドーマ40ウ
エルを選択した。選択されたハイブリドーマを限界希釈
法によりクローニングし、出現したハイブリドーマクロ
ーンの培養上清につき、ヒトIgE・λ、ヒトIgE・κ、ヒ
トIgA、ヒトIgG、ヒトIgMおよびヒト免疫グロブログリ
ンＬ鎖λタイプ、Ｌ鎖κタイプに対する抗体の反応特異
性をELISA法で検定した。
このようにして、ヒトIgEに特異的に反応するモノク
ローナル抗体を産生するハイブリドーマが40クローン得
られた。
ローナル抗体を産生するハイブリドーマが40クローン得
られた。
これらのうちから、前記の特性を有し、後記実験例か
ら明らかな様に、本発明のヒトIgEの免疫測定方法に適
したモノクローナル抗体HE−39E、HE−22A、HE−69Bお
よびHE−35Aを産生するハイブリドーマHE−39Eシオノギ
（微工研菌寄第11381号）、HE−22Aシオノギ（微工研菌
寄第11382号）、HE−69Bシオノギ（微工研菌寄第11383
号）およびHE−35Aシオノギ（微工研菌寄第11384号）を
選択した。
ら明らかな様に、本発明のヒトIgEの免疫測定方法に適
したモノクローナル抗体HE−39E、HE−22A、HE−69Bお
よびHE−35Aを産生するハイブリドーマHE−39Eシオノギ
（微工研菌寄第11381号）、HE−22Aシオノギ（微工研菌
寄第11382号）、HE−69Bシオノギ（微工研菌寄第11383
号）およびHE−35Aシオノギ（微工研菌寄第11384号）を
選択した。
（４） モノクローナル抗体の作製 （ａ）in vitro培養法 ハイブリドーマを完全RPMI培地で増殖限界（１×106
個/ml）になるまで培養し、その培養上清を回収した。
個/ml）になるまで培養し、その培養上清を回収した。
（ｂ）in vivo培養法 あらかじめプリステン0.5mlで腹腔内投与処理したBAL
B/cマウスに、５×106個のハイブリドーマを腹腔内に移
植した。約３週間後、マウスの腹部肥大を確かめて、そ
の腹水を採取した。
B/cマウスに、５×106個のハイブリドーマを腹腔内に移
植した。約３週間後、マウスの腹部肥大を確かめて、そ
の腹水を採取した。
（５） モノクローナル抗体の精製 前工程で得られた腹水を18％硫酸ナトリウム溶液で塩
析し、生じた沈殿を0.01Mホウ酸緩衝食塩液（pH8.0）に
溶解後、同液にて透析した。塩析により得られたモノク
ローナル抗体20mgを0.01Mホウ酸緩衝食塩液（pH8.0）2m
lにとかし、プロテインＡ−セファロース［ファルマシ
ア社（Pharmacia AB）］のカラム（1.6×5cm）に吸着さ
せた。まず、0.01Mホウ酸緩衝食塩液（pH8.0）約50mlで
不純物を流出し、次いで0.01Mクエン酸緩衝食塩液（pH
4.0）約100mlで溶出して、精製モノクローナル抗体を得
た。
析し、生じた沈殿を0.01Mホウ酸緩衝食塩液（pH8.0）に
溶解後、同液にて透析した。塩析により得られたモノク
ローナル抗体20mgを0.01Mホウ酸緩衝食塩液（pH8.0）2m
lにとかし、プロテインＡ−セファロース［ファルマシ
ア社（Pharmacia AB）］のカラム（1.6×5cm）に吸着さ
せた。まず、0.01Mホウ酸緩衝食塩液（pH8.0）約50mlで
不純物を流出し、次いで0.01Mクエン酸緩衝食塩液（pH
4.0）約100mlで溶出して、精製モノクローナル抗体を得
た。
実験例１ ヒト免疫グロブリンとの反応性 ポリスチレン製マイクロタイタープレートの各ウエル
に、ヒトIgE2種［IgE・λ（免疫原）、IgE・κ（セロテ
ック社）］、ヒトIgA（カペル社）、ヒトIgM（マイルス
社）、ヒトIgG（マイルス社）およびヒト免疫グロブリ
ンＬ鎖λタイプ、Ｌ鎖κタイプをそれぞれ0.01Mリン酸
緩衝食塩液（pH7.4）にとかした溶液（10μg/ml）50μ
を入れ、37℃で１時間放置した後、10％ウシ胎児血清
を含む0.01Mリン酸緩衝食塩液（pH7.4）100μを加
え、37℃で20分間ブロックした。0.05％ツイーン20を含
む0.01Mリン酸緩衝食塩液（pH7.4）で洗浄し、各種ヒト
免疫グロブリン固相ウエルを作製した。次に、10％ウシ
胎児血清を含む0.01Mリン酸緩衝食塩液（pH7.4）にとか
した精製モノクローナル抗体HE−22A、HE−35A、HE−39
EおよびHE−69B（10μg/ml）50μを加え、37℃で１時
間反応させた。上記と同様に洗浄後、実施例１−（３）
と同様の方法で発色させて吸光度を測定した。
に、ヒトIgE2種［IgE・λ（免疫原）、IgE・κ（セロテ
ック社）］、ヒトIgA（カペル社）、ヒトIgM（マイルス
社）、ヒトIgG（マイルス社）およびヒト免疫グロブリ
ンＬ鎖λタイプ、Ｌ鎖κタイプをそれぞれ0.01Mリン酸
緩衝食塩液（pH7.4）にとかした溶液（10μg/ml）50μ
を入れ、37℃で１時間放置した後、10％ウシ胎児血清
を含む0.01Mリン酸緩衝食塩液（pH7.4）100μを加
え、37℃で20分間ブロックした。0.05％ツイーン20を含
む0.01Mリン酸緩衝食塩液（pH7.4）で洗浄し、各種ヒト
免疫グロブリン固相ウエルを作製した。次に、10％ウシ
胎児血清を含む0.01Mリン酸緩衝食塩液（pH7.4）にとか
した精製モノクローナル抗体HE−22A、HE−35A、HE−39
EおよびHE−69B（10μg/ml）50μを加え、37℃で１時
間反応させた。上記と同様に洗浄後、実施例１−（３）
と同様の方法で発色させて吸光度を測定した。
表１に示すように、HE−22A、HE−35A、HE−39Eおよ
びHE−69Bのモノクローナル抗体は、２種のヒトIgEには
それぞれ反応するが、他のヒト免疫グロブリンには反応
しなかった。
びHE−69Bのモノクローナル抗体は、２種のヒトIgEには
それぞれ反応するが、他のヒト免疫グロブリンには反応
しなかった。
実験例２ モノクローナル抗体のヨウ素（125I）標識 1,3,4,6−テトラクロロ−３α、６α−ジフェニルグ
リコールウリル（IODO−GEN、ピアスケミカル社）のジ
クロロメタン溶液（40μg/ml）50μをガラス試験管に
入れ、風乾した。この試験管に0.1Mリン酸緩衝液（pH7.
4）にとかしたモノクローナル抗体HE−22A、HE−35A、H
E−39EまたはHE−69B（2mg/ml）25μを加え、次いで
放射性ヨウ化ナトリウム（Na125I）0.5mCi/5μを加え
て、室温で15分間静かに振盪した。得られた反応液をセ
ファデックスＧ−25（ファルマシア社）のカラム（1.6
×18cm）に通してリン酸緩衝食塩水で溶出した。最先溶
出区分を分取して、125I標識モノクローナル抗体HE−22
A、HE−35A、HE−39EおよびHE−69Bをそれぞれ得た。
リコールウリル（IODO−GEN、ピアスケミカル社）のジ
クロロメタン溶液（40μg/ml）50μをガラス試験管に
入れ、風乾した。この試験管に0.1Mリン酸緩衝液（pH7.
4）にとかしたモノクローナル抗体HE−22A、HE−35A、H
E−39EまたはHE−69B（2mg/ml）25μを加え、次いで
放射性ヨウ化ナトリウム（Na125I）0.5mCi/5μを加え
て、室温で15分間静かに振盪した。得られた反応液をセ
ファデックスＧ−25（ファルマシア社）のカラム（1.6
×18cm）に通してリン酸緩衝食塩水で溶出した。最先溶
出区分を分取して、125I標識モノクローナル抗体HE−22
A、HE−35A、HE−39EおよびHE−69Bをそれぞれ得た。
実験例３ モノクローナル抗体の西洋ワサビペルオキシダーゼ（HR
P）標識 5mgのHRPを2mlの0.01M酢酸緩衝液にとかし、同緩衝液
0.2mlにとかしたメタ過ヨウ素酸ナトリウム2mgを加え、
25℃で20分間反応させた。得られた反応液を、セファデ
ックスＧ−25のカラム（1.6×18cm）に通して、0.001M
酢酸緩衝液（pH4.5）で溶出した。最先溶出区分を分取
して、413nmの吸光度から、1.4mgの活性化HRPを得た。
これに、1.2mlの0.1M炭酸緩衝食塩水にとかした2mgのモ
ノクローナル抗体HE−22A、HE−35A、HE−39EまたはHE
−69Bを加えて、25℃で２時間反応させた。次に0.2mgの
水素化ホウ素ナトリウム水溶液0.1mlを加えて、４℃で
２時間反応させた。得られた反応液を、セファデックス
Ｇ−25のカラム（1.6×18cm）に通して、0.01Mリン酸緩
衝食塩水（pH7.4）で溶出した。最先溶出区分4mlを分取
して、セファクリルＳ−200（ファルマシア社）のカラ
ム（1.6×70cm）に通して、0.01Mリン酸緩衝食塩水（pH
7.4）で溶出した。最先溶出区分を分取して、HRP標識モ
ノクローナル抗体HE−22A、HE−35A、HE−39EおよびHE
−69Bをそれぞれ得た。
P）標識 5mgのHRPを2mlの0.01M酢酸緩衝液にとかし、同緩衝液
0.2mlにとかしたメタ過ヨウ素酸ナトリウム2mgを加え、
25℃で20分間反応させた。得られた反応液を、セファデ
ックスＧ−25のカラム（1.6×18cm）に通して、0.001M
酢酸緩衝液（pH4.5）で溶出した。最先溶出区分を分取
して、413nmの吸光度から、1.4mgの活性化HRPを得た。
これに、1.2mlの0.1M炭酸緩衝食塩水にとかした2mgのモ
ノクローナル抗体HE−22A、HE−35A、HE−39EまたはHE
−69Bを加えて、25℃で２時間反応させた。次に0.2mgの
水素化ホウ素ナトリウム水溶液0.1mlを加えて、４℃で
２時間反応させた。得られた反応液を、セファデックス
Ｇ−25のカラム（1.6×18cm）に通して、0.01Mリン酸緩
衝食塩水（pH7.4）で溶出した。最先溶出区分4mlを分取
して、セファクリルＳ−200（ファルマシア社）のカラ
ム（1.6×70cm）に通して、0.01Mリン酸緩衝食塩水（pH
7.4）で溶出した。最先溶出区分を分取して、HRP標識モ
ノクローナル抗体HE−22A、HE−35A、HE−39EおよびHE
−69Bをそれぞれ得た。
実験例４ 熱処理IgEに対する反応性 ヒトIgE（10μg/ml）の10％ウシ胎児血清を含む0.01M
リン酸緩衝食塩液（pH7.4）1.5mlを、56℃で２時間熱処
理した。
リン酸緩衝食塩液（pH7.4）1.5mlを、56℃で２時間熱処
理した。
実験例１と同様の方法で、モノクローナル抗体HE−22
A、HE−35A、HE−39EおよびHE−69Bの固相プレートの作
製した。次いで、上記の熱処理ヒトIgE（500、167、5
6、19および2.1ng/ml）50μを加え、37℃で１時間反
応させた。また、対照実験として、未処理ヒトIgEを同
様の濃度で反応させた。洗浄の後、HRP標識モノクロー
ナル抗体ID−15F（本抗原ヒトIgEのイディオタイプ部分
に反応する特性を有する）（10μg/ml）50μを加え
て、37℃で１時間反応させた。洗浄後、実施例１−
（３）と同様の方法で発色させて吸光値を測定した。
A、HE−35A、HE−39EおよびHE−69Bの固相プレートの作
製した。次いで、上記の熱処理ヒトIgE（500、167、5
6、19および2.1ng/ml）50μを加え、37℃で１時間反
応させた。また、対照実験として、未処理ヒトIgEを同
様の濃度で反応させた。洗浄の後、HRP標識モノクロー
ナル抗体ID−15F（本抗原ヒトIgEのイディオタイプ部分
に反応する特性を有する）（10μg/ml）50μを加え
て、37℃で１時間反応させた。洗浄後、実施例１−
（３）と同様の方法で発色させて吸光値を測定した。
図１に示すように、モノクローナル抗体HE−22Aおよ
びHE−69Bは熱処理ヒトIgEに対して良く反応したが、HE
−35Aは熱処理ヒトIgEに対する反応が顕著に低下した。
このような熱処理により、IgEのＤε２領域の構造変化
が起こることが知られており、HE−35Aは、Ｄε２領域
の熱感受性の構造を認識すると考えられる。
びHE−69Bは熱処理ヒトIgEに対して良く反応したが、HE
−35Aは熱処理ヒトIgEに対する反応が顕著に低下した。
このような熱処理により、IgEのＤε２領域の構造変化
が起こることが知られており、HE−35Aは、Ｄε２領域
の熱感受性の構造を認識すると考えられる。
実験例５ エンドグリコシダーゼＦ処理IgEに対する反応性 エンドグリコシダーゼＦは、糖タンパク質の糖鎖部分
に作用して、切断する酵素である。
に作用して、切断する酵素である。
ヒトIgE（5mg/ml）の生理食塩溶液0.1mlに、エンドグ
リコシダーゼＦ（8.3U/ml）のエチレンジアミン四酢酸
ナトリウム（50mmol/）、0.05％アジ化ナトリウム、
0.5％ドデシル硫酸ナトリウムおよび0.05％ツイーン20
を含む0.1Mリン酸緩衝溶液（pH6.1）0.12mlを加えて、3
7℃で20時間反応させてエンドグリコシダーゼＦ処理ヒ
トIgEを得た。
リコシダーゼＦ（8.3U/ml）のエチレンジアミン四酢酸
ナトリウム（50mmol/）、0.05％アジ化ナトリウム、
0.5％ドデシル硫酸ナトリウムおよび0.05％ツイーン20
を含む0.1Mリン酸緩衝溶液（pH6.1）0.12mlを加えて、3
7℃で20時間反応させてエンドグリコシダーゼＦ処理ヒ
トIgEを得た。
実施例１−（３）と同様の方法でエンドグリコシダー
ゼ処理ヒトIgE固相プレートを作製した。また、対照実
験として未処理ヒトIgE固相プレートを作製した。次
に、HRP標識モノクローナル抗体HE−22A、HE−35A、HE
−22AおよびHE−69Bの10％ウシ胎児血清を含む0.01Mリ
ン酸緩衝溶液（pH7.4）50μを加えて37℃で１時間反
応させた。洗浄後、実施例１−（３）と同様の方法で発
色させて吸光値を測定した。
ゼ処理ヒトIgE固相プレートを作製した。また、対照実
験として未処理ヒトIgE固相プレートを作製した。次
に、HRP標識モノクローナル抗体HE−22A、HE−35A、HE
−22AおよびHE−69Bの10％ウシ胎児血清を含む0.01Mリ
ン酸緩衝溶液（pH7.4）50μを加えて37℃で１時間反
応させた。洗浄後、実施例１−（３）と同様の方法で発
色させて吸光値を測定した。
表２に示すように、モノクローナル抗体HE−35A、HE
−39EおよびHE−69BはエンドグルコシダーゼＦ処理ヒト
IgEにそれぞれ反応するが、HE−22Aはエンドグリコシダ
ーゼＦ処理ヒトIgEに反応しなかった。従って、HE−22A
はIgEを糖鎖と密接に関連する構造を認識すると考えら
れる。
−39EおよびHE−69BはエンドグルコシダーゼＦ処理ヒト
IgEにそれぞれ反応するが、HE−22Aはエンドグリコシダ
ーゼＦ処理ヒトIgEに反応しなかった。従って、HE−22A
はIgEを糖鎖と密接に関連する構造を認識すると考えら
れる。
実験例６ インヒビションテストによるモノクローナル抗体の反応
特性 実施例１−（３）と同様の方法で、ヒトIgE固相プレ
ートを作製した。次にHRP標識モノクローナル抗体HE−2
2A、HE−35A、HE−39EおよびHE−69B（10μg/ml）50μ
と、それぞれ未標識のモノクローナル抗体HE−22A、H
E−35A、HE−39E、HE−69Bおよび抗Ｄε１抗体、抗Ｃε
４抗体（2000、500、125、31.2、7.8および０μg/ml）5
0μずつを加えて、37℃で１時間反応させた。洗浄
後、実施例１−（３）と同様の方法で発色させて吸光値
を測定した。
特性 実施例１−（３）と同様の方法で、ヒトIgE固相プレ
ートを作製した。次にHRP標識モノクローナル抗体HE−2
2A、HE−35A、HE−39EおよびHE−69B（10μg/ml）50μ
と、それぞれ未標識のモノクローナル抗体HE−22A、H
E−35A、HE−39E、HE−69Bおよび抗Ｄε１抗体、抗Ｃε
４抗体（2000、500、125、31.2、7.8および０μg/ml）5
0μずつを加えて、37℃で１時間反応させた。洗浄
後、実施例１−（３）と同様の方法で発色させて吸光値
を測定した。
表３に示すように、HE−22A、HE−35A、HE−39Eおよ
びHE−69Bは、それぞれ同種の抗体によるヒトIgEに対す
る反応阻害効果が認められたが、異なる抗体間での反応
阻害は認められなかった。又、HE−39EおよびHE−69B
は、モノクローナル抗Ｄε１抗体による反応阻害が認め
られた。モノクローナル抗Ｃε４抗体により阻害される
抗体は認められなかった。
びHE−69Bは、それぞれ同種の抗体によるヒトIgEに対す
る反応阻害効果が認められたが、異なる抗体間での反応
阻害は認められなかった。又、HE−39EおよびHE−69B
は、モノクローナル抗Ｄε１抗体による反応阻害が認め
られた。モノクローナル抗Ｃε４抗体により阻害される
抗体は認められなかった。
実験例７ 変性IgEに対する反応性 ヒトIgE（5mg/ml）の生理食塩溶液0.2mlに塩酸グアニ
ジン（6M/）および４％の２−メルカプトエタノール
を含む水溶液0.2mlを加えて、60℃で２時間作用させ
て、変性ヒトIgEを得た。
ジン（6M/）および４％の２−メルカプトエタノール
を含む水溶液0.2mlを加えて、60℃で２時間作用させ
て、変性ヒトIgEを得た。
実施例１−（３）と同様の方法でモノクローナル抗体
HE−22A、HE−35A、HE−39EおよびHE−69B固相プレート
を作製した。洗浄後、上記の変性ヒトIgE（１μg/ml）
の10％ウシ胎児血清を含む0.01Mリン酸緩衝食塩溶液50
μを加え、37℃で１時間反応させた。又、この時対照
実験として、未変性ヒトIgE（１μg/ml）溶液50μを
加え、同様に37℃で１時間反応させた。洗浄後、HRP標
識モノクローナル抗体HE−22A、HE−35A、HE−39Eおよ
びHE−69B（10μg/ml）の10％ウシ胎児血清を含む0.01M
リン酸緩衝食塩溶液50μを加え、37℃で１時間反応さ
せた。洗浄後、実施例１−（３）と同様の方法で発色さ
せた吸光値を測定した。
HE−22A、HE−35A、HE−39EおよびHE−69B固相プレート
を作製した。洗浄後、上記の変性ヒトIgE（１μg/ml）
の10％ウシ胎児血清を含む0.01Mリン酸緩衝食塩溶液50
μを加え、37℃で１時間反応させた。又、この時対照
実験として、未変性ヒトIgE（１μg/ml）溶液50μを
加え、同様に37℃で１時間反応させた。洗浄後、HRP標
識モノクローナル抗体HE−22A、HE−35A、HE−39Eおよ
びHE−69B（10μg/ml）の10％ウシ胎児血清を含む0.01M
リン酸緩衝食塩溶液50μを加え、37℃で１時間反応さ
せた。洗浄後、実施例１−（３）と同様の方法で発色さ
せた吸光値を測定した。
表４に示すように、モノクローナル抗体HE−22A、HE
−35A、HE−39EおよびHE−69Bは、未変性IgEと反応する
が、変性IgEとは反応しなかった。
−35A、HE−39EおよびHE−69Bは、未変性IgEと反応する
が、変性IgEとは反応しなかった。
実験例８ IgEのサンドウィッチアッセイ 実施例１−（３）と同様の方法でモノクローナル抗体
HE−22A、HE−35A、HE−39EおよびHE−69B固相プレート
を作製した。洗浄後、ヒトIgE（10000、2000、400、8
0、16および０ IU/ml）の10％ウシ胎児血清を含む0.01
Mリン酸緩衝溶液（pH7.4）50μを加え、37℃で１時間
反応させた。洗浄後実験例５と同様の方法でHRP標識モ
ノクローナル抗体HE−22A、HE−35A、HE−39EおよびHE
−69Bと反応させた後、発色させて吸光度を測定した。
HE−22A、HE−35A、HE−39EおよびHE−69B固相プレート
を作製した。洗浄後、ヒトIgE（10000、2000、400、8
0、16および０ IU/ml）の10％ウシ胎児血清を含む0.01
Mリン酸緩衝溶液（pH7.4）50μを加え、37℃で１時間
反応させた。洗浄後実験例５と同様の方法でHRP標識モ
ノクローナル抗体HE−22A、HE−35A、HE−39EおよびHE
−69Bと反応させた後、発色させて吸光度を測定した。
図２に示すように、固相モノクローナル抗体と、HRP
標識モノクローナル抗体の間で、異なる抗体の組合わせ
例ではヒトIgEに対して反応性の高いアッセイ系とな
り、同種の抗体の組合わせ例では反応性の低いアッセイ
系となった。
標識モノクローナル抗体の間で、異なる抗体の組合わせ
例ではヒトIgEに対して反応性の高いアッセイ系とな
り、同種の抗体の組合わせ例では反応性の低いアッセイ
系となった。
実験例９ ヒトIgE抗体に対する親和定数 ヤケヒョウヒダニ（デルマトファゴイデス プテロニ
シナス;DP）特異IgE陽性ヒト血清を混合して、50mlのプ
ール血清とした。このプール血清200μを試験管（シ
オノギチューブ）に秤り取り、DP抗原結合ビーズ（ダニ
特異IgGテスト；シオノギ製薬）１個を加えて、25℃で
３時間振盪しながら反応させた。次に、0.05％ツイーン
20を含む0.01Mリン酸緩衝液（pH7.4）で洗浄した後、
125I−標識モノクローナル抗体HE−22A、HE−35A、HE−
39EおよびHE−69B（10、５、2.5、1.25、0.625、0.313
および0.156μCi/ml）の10％ウシ胎児血清を含む0.01M
りん酸緩衝液（pH7.4）200μを加えて、25℃で16時間
振盪しながら反応させた。洗浄後、各試験管の放射能量
をγ−カウンターにて測定した。
シナス;DP）特異IgE陽性ヒト血清を混合して、50mlのプ
ール血清とした。このプール血清200μを試験管（シ
オノギチューブ）に秤り取り、DP抗原結合ビーズ（ダニ
特異IgGテスト；シオノギ製薬）１個を加えて、25℃で
３時間振盪しながら反応させた。次に、0.05％ツイーン
20を含む0.01Mリン酸緩衝液（pH7.4）で洗浄した後、
125I−標識モノクローナル抗体HE−22A、HE−35A、HE−
39EおよびHE−69B（10、５、2.5、1.25、0.625、0.313
および0.156μCi/ml）の10％ウシ胎児血清を含む0.01M
りん酸緩衝液（pH7.4）200μを加えて、25℃で16時間
振盪しながら反応させた。洗浄後、各試験管の放射能量
をγ−カウンターにて測定した。
表５に示すように、DP特異IgE抗体の親和性は、HE−3
5A＞HE−69B＞HE−22A＞HE−39Eの順に高く、同様にモ
ノクローナル抗体の結合可能部位（エピトープ密度）
も、HE−35A＞HE−69B＞HE−22A＞HE−39Eの順に高かっ
た。
5A＞HE−69B＞HE−22A＞HE−39Eの順に高く、同様にモ
ノクローナル抗体の結合可能部位（エピトープ密度）
も、HE−35A＞HE−69B＞HE−22A＞HE−39Eの順に高かっ
た。
実験例10 ヒトIgE測定法 ポリスチレンビーズ（イムノケミカル社）1000個に、
モノクローナル抗体HE−69B（40μg/ml）0.01Mリン酸緩
衝食塩溶液（pH7.4）200mlを加え、37℃で20時間放置し
た。モノクローナル抗体溶液を除去した後、0.01Mリン
酸緩衝食塩液（pH7.4）でビーズを洗浄し、次に0.1％の
ウシ血清アルブミンを含む0.01Mリン酸緩衝食塩液（pH
7.4）200mlを加え、37℃で３時間放置した。0.05％ツイ
ーン20を含む0.01Mリン酸緩衝液（pH7.4）で洗浄し、モ
ノクローナル抗体HE−69B結合ビーズを作製した。
モノクローナル抗体HE−69B（40μg/ml）0.01Mリン酸緩
衝食塩溶液（pH7.4）200mlを加え、37℃で20時間放置し
た。モノクローナル抗体溶液を除去した後、0.01Mリン
酸緩衝食塩液（pH7.4）でビーズを洗浄し、次に0.1％の
ウシ血清アルブミンを含む0.01Mリン酸緩衝食塩液（pH
7.4）200mlを加え、37℃で３時間放置した。0.05％ツイ
ーン20を含む0.01Mリン酸緩衝液（pH7.4）で洗浄し、モ
ノクローナル抗体HE−69B結合ビーズを作製した。
ヒトIgEを、10％ウシ胎児血清を含む0.01Mリン酸緩衝
食塩液で、5000、1000、200、40、８、1.6および0IU/ml
となるように調製して、試験管にそれぞれ50μずつ秤
取した。次に、各試験管に125I−標識モノクローナル抗
体HE−22A、HE−35AまたはHE−39E（3.7μCi/ml）100μ
を加えて混和した。また、あらかじめ混合したHE−22
A、HE−35AおよびHE−39E（3.7μCi/ml）100μを加え
て混和した。モノクローナル抗体HE−69B結合ビーズを
各試験管に１個ずつ加え、25℃で３時間反応させた。洗
浄後、各試験管の放射能量をγ−カウンターにて測定し
た。
食塩液で、5000、1000、200、40、８、1.6および0IU/ml
となるように調製して、試験管にそれぞれ50μずつ秤
取した。次に、各試験管に125I−標識モノクローナル抗
体HE−22A、HE−35AまたはHE−39E（3.7μCi/ml）100μ
を加えて混和した。また、あらかじめ混合したHE−22
A、HE−35AおよびHE−39E（3.7μCi/ml）100μを加え
て混和した。モノクローナル抗体HE−69B結合ビーズを
各試験管に１個ずつ加え、25℃で３時間反応させた。洗
浄後、各試験管の放射能量をγ−カウンターにて測定し
た。
図３に示すように、HE−35AではヒトIgE0.32〜200IU/
ml（625倍）、HE−22Aでは1.6〜1000IU/ml（625倍）、H
E−39Eでは、40〜5000IU/ml（125倍）の濃度領域で、そ
れぞれヒトIgE濃度に対して感度曲線が得られた。一
方、同一の比放射能量を有する125I−標識モノクローナ
ル抗体HE−22A、HE−35AおよびHE−39Eを、あらかじめ
適当なタンパク質濃度比（3:1:6）で混合した場合、ヒ
トIgE0.32〜5000IU/ml（15625倍）に宜る広い濃度領域
で感度曲線が得られた。
ml（625倍）、HE−22Aでは1.6〜1000IU/ml（625倍）、H
E−39Eでは、40〜5000IU/ml（125倍）の濃度領域で、そ
れぞれヒトIgE濃度に対して感度曲線が得られた。一
方、同一の比放射能量を有する125I−標識モノクローナ
ル抗体HE−22A、HE−35AおよびHE−39Eを、あらかじめ
適当なタンパク質濃度比（3:1:6）で混合した場合、ヒ
トIgE0.32〜5000IU/ml（15625倍）に宜る広い濃度領域
で感度曲線が得られた。
第１図は、本発明のモノクローナル抗体の熱処理IgEに
対する反応性を示した図。 第２図は、本発明のモノクローナル抗体を組み合わせた
サンドウィッチELISA系における、モノクローナル抗体
のIgE感度曲線を示した図。 第３図は、本発明のモノクローナル抗体HE−69Bの固相
ビーズを用いたサンドウィッチRIA系での、３種のモノ
クローナル抗体（HE−22A、HE−35A、HE−39E）および
これら３種の混合抗体によるIgE感度曲線を示した図。
対する反応性を示した図。 第２図は、本発明のモノクローナル抗体を組み合わせた
サンドウィッチELISA系における、モノクローナル抗体
のIgE感度曲線を示した図。 第３図は、本発明のモノクローナル抗体HE−69Bの固相
ビーズを用いたサンドウィッチRIA系での、３種のモノ
クローナル抗体（HE−22A、HE−35A、HE−39E）および
これら３種の混合抗体によるIgE感度曲線を示した図。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 ＦＩ Ｃ１２Ｒ 1:91） (58)調査した分野(Int.Cl.6，ＤＢ名) C12N 15/06 C12P 21/08 ＢＩＯＳＩＳ（ＤＩＡＬＯＧ) ＷＰＩ（ＤＩＡＬＯＧ)
Claims (2)
- 【請求項１】ヒトIgEに特異的に結合するモノクローナ
ル抗体HE−22A、HE−35AおよびHE−39Eからなる群から
選択される異なる２種以上のモノクローナル抗体を混合
し、ヒトIgEに対して所望の反応性をもつようにしたモ
ノクローナル抗体混合物。 - 【請求項２】ヒトIgEに特異的に結合するモノクローナ
ル抗体HE−69Bを固相化し、得られた固相化抗体をヒトI
gEを含有する試料と接触させることにより該固相化抗体
と該ヒトIgEを結合させ、該固相化抗体に結合した該ヒ
トIgEに標識した請求項１に記載のモノクローナル抗体
混合物を結合させるヒトIgEの免疫測定法。
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|---|---|---|---|
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| DK91106578.7T DK0476226T3 (da) | 1990-09-18 | 1991-04-24 | Monoklonalt antistof mod humant IgE |
| ES91106578T ES2109242T3 (es) | 1990-09-18 | 1991-04-24 | Anticuerpos monoclonales contra inmunoglobulina e humana. |
| AT91106578T ATE159300T1 (de) | 1990-09-18 | 1991-04-24 | Monoklonale antikörper gegen menschliches ige |
| DE69127947T DE69127947T2 (de) | 1990-09-18 | 1991-04-24 | Monoklonale Antikörper gegen menschliches IgE |
| KR1019910006709A KR0181948B1 (ko) | 1990-09-18 | 1991-04-25 | 인체 IgE에 대한 모노클론 항체 |
| US08/145,317 US5478926A (en) | 1990-09-18 | 1993-11-03 | Monoclonal antibody against human IgE |
| US08/429,566 US5583005A (en) | 1990-09-18 | 1995-04-27 | Immunoassay for human IgE |
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|---|---|---|---|
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|---|---|
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| GR (1) | GR3025630T3 (ja) |
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| GB9220228D0 (en) * | 1992-09-24 | 1992-11-04 | Ciba Geigy Ag | Reshaped monoclonal antibodies against an immunologlobulin isotype |
| US5958708A (en) * | 1992-09-25 | 1999-09-28 | Novartis Corporation | Reshaped monoclonal antibodies against an immunoglobulin isotype |
| US6066718A (en) * | 1992-09-25 | 2000-05-23 | Novartis Corporation | Reshaped monoclonal antibodies against an immunoglobulin isotype |
| JP3825798B2 (ja) * | 1994-01-18 | 2006-09-27 | ジェネンテク，インコーポレイテッド | ＩｇＥアンタゴニストを用いる寄生虫感染症の治療法 |
| US5716791A (en) | 1996-05-09 | 1998-02-10 | Meridian Diagnostics, Inc. | Immunoassay for H. pylori in fecal specimens |
| US5932430A (en) * | 1996-05-09 | 1999-08-03 | Meridian Diagnostics, Inc. | Immunoassay for H. pylori in fecal specimens |
| US7074586B1 (en) * | 1999-06-17 | 2006-07-11 | Source Precision Medicine, Inc. | Quantitative assay for low abundance molecules |
| CA2404237C (en) * | 2000-04-05 | 2010-01-26 | University Of Tennessee Research Corporation | Methods of investigating, diagnosing, and treating amyloidosis |
| US7244580B2 (en) * | 2001-11-08 | 2007-07-17 | The Regents Of The University Of California | Epsilon immunoglobulin chain derived peptides for induction of anti-IgE antibodies |
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| US20060034845A1 (en) | 2002-11-08 | 2006-02-16 | Karen Silence | Single domain antibodies directed against tumor necrosis factor alpha and uses therefor |
| US9320792B2 (en) | 2002-11-08 | 2016-04-26 | Ablynx N.V. | Pulmonary administration of immunoglobulin single variable domains and constructs thereof |
| DE10327399A1 (de) * | 2003-06-18 | 2005-01-05 | Carl Zeiss Jena Gmbh | Verfahren und Messanordnung zur markierungsfreien Detektion von Bindungsereignissen zwischen Proteinen und oberflächengebundenen Antikörpern |
| US20210355237A1 (en) * | 2018-09-21 | 2021-11-18 | Riken | ANTI-IgE ANTIBODY SPECIFICALLY BINDING TO MEMBRANE-BOUND IgE ANTIBODY OF IgE ANTIBODY-PRODUCING B CELLS AND METHOD FOR DIAGNOSING AND TREATING ALLERGIC SYMPTOMS USING THE SAME |
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|---|---|---|---|---|
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| EP0259585B1 (en) * | 1986-07-29 | 1993-06-09 | Kishimoto, Tadamitsu, Prof. | Monoclonal antibodies specific to surface receptor for ige and hybrid cell lines producing these antibodies and use thereof |
-
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- 1990-09-18 JP JP2249530A patent/JP2988635B2/ja not_active Expired - Fee Related
-
1991
- 1991-04-24 ES ES91106578T patent/ES2109242T3/es not_active Expired - Lifetime
- 1991-04-24 DE DE69127947T patent/DE69127947T2/de not_active Expired - Fee Related
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- 1991-04-24 EP EP91106578A patent/EP0476226B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1991-04-24 AT AT91106578T patent/ATE159300T1/de not_active IP Right Cessation
- 1991-04-25 KR KR1019910006709A patent/KR0181948B1/ko not_active IP Right Cessation
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1993
- 1993-11-03 US US08/145,317 patent/US5478926A/en not_active Expired - Fee Related
-
1995
- 1995-04-27 US US08/429,566 patent/US5583005A/en not_active Expired - Fee Related
-
1997
- 1997-12-10 GR GR970403282T patent/GR3025630T3/el unknown
Non-Patent Citations (2)
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|---|
| Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｙａ，Ｎｏ．１（１９８９）ｐ．７７−８１ |
| Ｉｎｔ．Ａｒｃｈ．Ａｌｌｅｒｇｙ Ａｐｐｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，Ｖｏｌ．７２（１９８３）ｐ．２６７−２７２ |
Also Published As
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| KR0181948B1 (ko) | 1999-05-01 |
| US5478926A (en) | 1995-12-26 |
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| EP0476226A1 (en) | 1992-03-25 |
| ATE159300T1 (de) | 1997-11-15 |
| KR920006005A (ko) | 1992-04-27 |
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| GR3025630T3 (en) | 1998-03-31 |
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