JP2008507294A - 菌株遺伝子操作による改善されたタンパク質発現のための方法 - Google Patents

菌株遺伝子操作による改善されたタンパク質発現のための方法 Download PDF

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Abstract

本発明は、組換えタンパク質又はペプチドの生産レベルを改善する又は宿主細胞において発現される活性組換えタンパク質又はペプチドのレベルを改善するための方法である。本発明は、組換えタンパク質を発現する細胞の２つの遺伝的プロフィールを比較し、組換えタンパク質発現に応答して上方調節される遺伝子産物の発現を変化させるように前記細胞を修飾する方法である。前記方法は、例えば組換えタンパク質の溶解度を上昇させることによって、タンパク質の生産を改善することができる又はタンパク質の品質を改善することができる。

Description

（関連出願の参照）
本出願は、２００４年７月２６日出願の米国特許仮出願第６０／５９１，４８９号の優先権を主張する。
本発明はタンパク質生産の分野に関し、特に組換えタンパク質又はペプチドの生産レベルを改善する又は宿主細胞において発現される活性組換えタンパク質又はペプチドのレベルを改善するための方法に関する。
１５５以上の組換え生産タンパク質及びペプチドが、バイオテクノロジー薬剤及びワクチンとしての使用のために米国食品医薬品局（ＦＤＡ）によって既に承認されており、さらに３７０が臨床試験段階にある。化学合成を通して生産される低分子治療薬と異なり、タンパク質及びペプチドは生細胞において最も効率的に生産される。多くの場合、細胞又は生物は、タンパク質を生産するように又はタンパク質の生産を高めるように遺伝的に修飾されている。
細胞が大量の標的タンパク質を生産するように修飾されるとき、細胞はストレス下に置かれ、しばしば他のタンパク質を誘導する又は抑制することによって反応する。組換えタンパク質の生産の間に宿主細胞が受けるストレスは、例えば過剰発現組換えタンパク質の分解を引き起こす特異的タンパク質又は補因子の発現を上昇させる。補償タンパク質の発現上昇は、高レベルの活性な完全長組換えタンパク質を発現するという目標には逆効果であり得る。他のタンパク質の発現低下又は適切な発現の欠如は、組換えタンパク質のミスフォールディング及び凝集を引き起こすことがある。ストレス下の細胞はそのタンパク質発現のプロフィールを変化させることが知られているが、どの特定タンパク質が上方調節又は下方調節されるかはいずれの例においても不明である。
マイクロアレイ
マイクロアレイテクノロジーは、単一アッセイにおいて数多くのポリヌクレオチドの存在と発現レベルを特定するために使用することができる。例えば、全てＡｆｆｙｍｅｔｒｉｘ，Ｉｎｃ．に許諾された、１９９５年９月１５日出願の米国特許第６，０４０，１３８号、１９９７年６月２５日出願の米国特許第６，３４４，３１６号、１９９９年４月１５日出願の米国特許第６，２６１，７７６号、２０００年１０月１６日出願の米国特許第６，４０３，９５７号、２０００年９月２７日出願の米国特許第６，４５１，５３６号、２００１年８月２７日出願の米国特許第６，５３２，４６２号、２００１年５月９日出願の米国特許第６，５５１，７８４号、１９９８年２月９日出願の米国特許第６，４２０，１０８号、１９９８年１２月１４日出願の米国特許第６，４１０，２２９号、２００１年１月２５日出願の米国特許第６，５７６，４２４号、２０００年１１月２日出願の米国特許第６，６８７，６９２号、１９９８年４月２１日出願の米国特許第６，６００，０３１号、２００１年４月１６日出願の米国特許第６，５６７，５４０号参照。
Ｅ．Ｉ．ｄｕＰｏｎｔ ｄｅ Ｎｅｍｏｕｒｓ ａｎｄ Ｃｏ．への米国特許第６，６０７，８８５号は、細菌細胞を、発現を変化させる条件に供した後、第一と第二のマイクロアレイ測定を比較することによって遺伝子発現の変化を特徴付け、特定するための方法を述べる。
Ｗｅｉらは、ｌａｃ遺伝子誘導に関する大腸菌の遺伝子発現プロフィールを検討するためにマイクロアレイ分析を使用した(Wei Y., et al.(2001) High-density microarray-mediated gene expression profiling of Escherichia coli. J Bacteriol. 183(2):545-56)。他のグループも、内在性遺伝子の突然変異又は調節遺伝子の欠失後に調節される転写プロフィールを検討している (Sabina, J. et al (2003) Interfering with Different Steps of Protein Synthesis Explored by Transcriptional Profiling of Escherichia coli K- 12 J Bacteriol. 185:6158-6170; Lee JH (2003) Global analyses of transcriptomes and proteomes of a parent strain and an L-threonine-overproducing mutant strain. J Bacteriol. 185(18):5442-51 ; Kabir MM, et al. (2003) Gene expression patterns for metabolic pathway in pgi knockout Escherichia coli with and without phb genes based on RT-PCR J Biotechnol. 105(l-2):11-31; Eymann C, et al. (2002) Bacillus subtilis functional genomics: global characterization of the stringent response by proteome and transcriptome analysis. J Bacteriol. 184(9):2500-20)。
Ｇｉｌｌらは、組換えクロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ融合タンパク質の発現後の大腸菌におけるストレス関連遺伝子の発現の変化を特定するためのマイクロアレイテクノロジーの使用を開示している(Gill et al. (2001) Genomic Analysis of High-Cell-Density Recombinant Escherichia coli Fermentation and "Cell Conditioning" for Improved Recombinant Protein Yield Biotech. Bioengin. 72:85-95)。高細胞密度の、全ゲノムの１６％だけを構成する、ストレス遺伝子転写プロフィールを、組換えタンパク質過剰発現の前にシャペロン、プロテアーゼ及び他の細胞内タンパク質のレベルを変化させる「細胞順化（cell conditioning）」戦略を評価するために使用した。「順化」のための戦略は、ジチオトレイトール及びエタノール処理を含む、細胞の薬理学的操作を含んだ。
Ａｓａｉは、細胞ストレス後に典型的に誘導されるある種のσ因子の過剰発現によって活性化される標的遺伝子を特定するためのマイクロアレイ分析の使用を述べた(Asai K., et al. (2003) DNA microarray analysis of Bacillus subtilis sigma factors of extracytoplasmic function family. FEMS Microbiol. Lett. 220(1):155-60)。σ因子並びにσ因子プロモーターに連結されたレポーター遺伝子を過剰発現する細胞が、ストレス調節遺伝子誘導を示すために使用された。
Ｃｈｏｉらは、ヒトインスリン様増殖因子融合タンパク質（ＩＧＦ−Ｉf）を発現する大腸菌の高密度バッチ培養において下方調節される、代謝遺伝子の分析及び上方調節を述べた(Choi et al. (2003) Enhanced Production of Insulin-Like Growth Factor I Fusion Protein in Escherichia coli by Coexpression of the Down-Regulated Genes Identified by Transcriptome Profiling App. Envir. Microbio. 69:4737-4742)。この研究の焦点は、タンパク質誘導後の高密度状態の間に起こる代謝変化であった。高密度増殖条件の間の組換えタンパク質生産の誘導後に下方調節される遺伝子が特定され、下方調節されていた特定代謝遺伝子が組換えＩＧＦ−Ｉfを生産する細胞において発現された。この研究は、ある種のヌクレオチド塩基とアミノ酸の代謝生産の上昇がタンパク質生産を高め得ること及び増殖速度は、下方調節される代謝輸送体分子の発現を上昇させることによって調節し得ることを示した。これらの戦略は、タンパク質生産全般に関連する又は高密度培養に関連する代謝ストレスを低減するように細胞環境を変化させるために設計された。
タンパク質分解
組換えタンパク質の望ましくない分解は、ある種の発現系の効率的な使用に対する障害となる。外来性タンパク質の発現は、しばしば宿主細胞においてストレス応答を誘導し、それは、例えば限られた炭素源に対する天然防御であり得る。全ての細胞は、分解性タンパク質を生産することができる数多くの遺伝子を含む。いずれのプロテアーゼが特定組換えタンパク質の発現に応答して所与の宿主によって調節されるかを予測することは不可能である。例えばＰ．フルオレセンス細菌は、２００までのプロテアーゼとプロテアーゼ関連タンパク質を含む。
大腸菌の細胞質では、一般にプロテアーゼと補因子分子の群によってタンパク質分解が行われる。大部分の初期分解工程は、５個のＡＴＰ依存性Ｈｓｐ：Ｌｏｎ／Ｌａ ＦｔｓＨ／ＨｆｌＢ、ＣＩｐＡＰ、ＣｌｐＸＰ及びＣｌｐＹＱ／ＨｓｌＵＶによって実施される(Gottesman S (1996) Proteases and their targets in Escherichia coli. Annu. Rev. Genet. 30:465-506)。ＦｔｓＨ（活性部位が細胞質に面する内膜関連プロテアーゼ）と共に、ＣｌｐＡＰ及びＣｌｐＸＰは、非極性不安定化尾部ＡＡＮＤＥＮＹＡＬＡＡの付加によってそれらのカルボキシル末端で修飾されるタンパク質の分解の責任を担う(Gottesman S, et al. (1998) The ClpXP and ClpAP proteases degrade proteins with carboxyl-terminal peptide tails added by the SsrA-tagging system. Genes Dev. 12:1338-1347; Herman C, et al. (1998) Degradation of carboxy-terminal-tagged cytoplasmic proteins by the Escherichia coli protease HfIB (FtsH). Genes Dev. 12:1348-1355)。
組換えタンパク質生産の間の分解を回避するためにいくつかのアプローチが為されてきた。１つのアプローチは、プロテアーゼ遺伝子内に突然変異を担持する宿主菌株を生産することである。ＢａｎｅｙｘおよびＧｅｏｒｇｉｏｕは、例えば、プロテインＡ−β−ラクタマーゼ融合タンパク質の収率を改善するためにプロテアーゼ欠損菌株を使用した (Baneyx F, Georgiou G. (1991) Construction and characterization of Escherichia coli strains deficient in multiple secreted proteases: protease III degrades high-molecular-weight substrates in vivo. J Bacterial 173: 2696-2703)。Ｐａｒｋらは、大腸菌の親株と比較して組換えタンパク質活性を３０％改善するために同様の突然変異アプローチを用いた(Park S. et al. (1999) Secretory production of recombinant protein by a high cell density culture of a protease negative mutant Escherichia coli strain. Biotechnol. Progr. 15:164-167)。米国特許第５，２６４，３６５号及び同第５，２６４，３６５号は、タンパク質分解感受性ポリペプチドを生産するための、プロテアーゼ欠損大腸菌の構築、特にプロテアーゼ欠損菌株の増殖を述べている。ＰＣＴ国際公開公報第ＷＯ９０／０３４３８号は、プロテアーゼ欠損菌株又はプロテアーゼ阻害剤を含む菌株を含む、大腸菌株の生産を述べている。同様に、ＰＣＴ国際公開公報第ＷＯ０２／４８３７６号は、プロテアーゼＤｅｇＰ及びＰｒｃを欠損する大腸菌株を述べている。
タンパク質フォールディング
宿主細胞での組換えタンパク質の生産におけるもう１つの主要な障害は、細胞がしばしば可溶性又は活性タンパク質のいずれかを生産するように適切に用意されていないことである。タンパク質の一次構造はそのアミノ酸配列によって規定されるが、二次構造はαヘリックス又はβシートの存在によって規定され、三次構造は隣接する一続きのタンパク質の間の共有結合、例えばジスルフィド結合によって規定される。組換えタンパク質を発現するとき、特に大規模生産では、タンパク質自体の二次及び三次構造が決定的に重要である。タンパク質構造の何らかの有意の変化は、機能的に不活性な分子又は有意に低い生物活性を有するタンパク質を生じ得る。多くの場合、宿主細胞は、活性組換えタンパク質の適切な生産のために必要なフォールディング調節剤（ＦＭ）を発現する。しかし、使用可能な、経済的に満足し得るバイオテクノロジー産物を生産するために一般に必要とされる高い発現レベルでは、細胞はしばしば、組換えタンパク質をプロセシングするために十分な天然フォールディング調節剤を生産することができない。
ある種の発現系では、外来性タンパク質の過剰生産は、それらのミスフォールディング及び不溶性凝集物への分離を伴うことがある。細菌細胞では、これらの凝集物は封入体として知られる。大腸菌では、フォールディング調節剤／シャペロンのネットワークはＨｓｐ７０ファミリーを含む。主要なＨｓｐ７０シャペロンであるＤｎａＫは、タンパク質凝集を効率的に予防し、損傷したタンパク質のリフォールディングを支持する。タンパク質凝集物内への熱ショックタンパク質の組込みは解離を促進し得る。しかし、封入体へとプロセシングされたタンパク質は、一部の場合、不溶性分画のさらなるプロセシングを通して回収され得る。封入体内に認められるタンパク質は、典型的には変性と再生を含む多くの工程を通して精製しなければならない。封入体標的タンパク質のための典型的な再生工程は、凝集物を濃縮変性剤に溶解する試みとその後の希釈による変性剤の除去を含む。しばしばこの段階で再び凝集物が形成される。さらなるプロセシングはコストを上昇させ、インビトロでのリフォールディングが生物活性産物を生成するという保証はなく、そして回収されたタンパク質は大量の断片不純物を含み得る。
タンパク質凝集を低減するための１つのアプローチは発酵工学を通してであり、最も一般的には培養温度を低下させることによる（Baneyx F (1999) In vivo folding of recombinant proteins in Escherichia coli. In Manual of Industrial Microbiology and Biotechnology, Ed. Davies et al. Washington, DC: American Society for Microbiology ed. 2:551-565及びその中の参考文献参照）。インビボでのタンパク質フォールディングは、フォールディング中間体と一過性に相互作用することによって他のポリペプチドの適切な異性化と細胞ターゲティングを促進する分子シャペロンによって、及び折りたたみ経路に沿って速度制限工程を加速するフォルダーゼによって支援されるという最近の認識は、封入体形成の問題に対抗するさらなるアプローチを提供した（例えばThomas JG et al. (1997). Molecular chaperones, folding catalysts and the recovery of active recombinant proteins from E. coli: to fold or to refold. Appl Biochem Biotechnol, 66:197- 238参照）。
一部の場合、シャペロンの過剰発現は凝集しやすいタンパク質の可溶性収量を上昇させることが認められた（Baneyx, F. (1999) Recombinant Protein Expression in E. coli Curr. Opin. Biotech. 10:411-421及びその中の参考文献参照）。その過程はあらかじめ形成された組換え封入体の溶解を含まないと思われるが、新たに合成されるタンパク質鎖のフォールディング改善に関連する。例えばＮｉｓｈｉｈａｒａらは、組換えＣｒｙｊ２（スギ花粉のアレルゲン）の安定性と蓄積を改善するために細胞質においてｇｒｏＥＳＬとｄｎａＪＫ／ｇｒｐＥを共発現させた (Nishihara K, Kanemori M, Kitagawa M, Yanagi H, Yura T. 1998. Chaperone coexpression plasmids: differential and synergistic roles of DnaK-DnaJ-GrpE and GroEL-GroES in assisting folding of an allergen of Japanese cedar pollen, Cryj2, in Escherichia coli. Appl. Environ. Microbiol. 64:1694)。Lee and Olinsも、ＧｒｏＥＳＬとＤｎａＫを共発現させ、ヒトプロコラゲナーゼの蓄積を１０倍上昇させた(Lee S, Olins P. 1992. Effect of overproduction of heat shock chaperones GroESL and DnaK on human procollagenase production in Escherichia coli. JBC 267:2849-2852)。これらのシャペロンの細胞内濃度の上昇に関連する有益な作用は過剰生産されるタンパク質の性質に高度に依存すると思われ、成功は決して保証されていない。
製造コストを低下させ、活性生成物の収率を上昇させるために、改善された組換えタンパク質又はペプチド、活性又は溶解度を示す宿主菌株の開発のための方法が認められている。
それ故、宿主における組換えタンパク質発現を改善するための方法を提供することが本発明の１つの目的である。
組換えタンパク質又はペプチドを発現する宿主細胞において発現レベルを上昇させる方法を提供することが本発明のさらなる目的である。
組換え発現系において生成される可溶性タンパク質のレベルを上昇させる方法を提供することが本発明のもう１つの目的である。
組換え発現系において生成される活性タンパク質のレベルを上昇させる方法を提供することが本発明のさらにもう１つの目的である。
ｉ）宿主細胞において組換えタンパク質又はペプチドを発現すること；
ｉｉ）前記細胞の遺伝的プロフィールを分析し、組換えタンパク質又はペプチドの発現又は過剰発現時に上方調節される１又はそれ以上の内在性遺伝子産物を特定すること；及び
ｉｉｉ）細胞を遺伝的に修飾することによって１又はそれ以上の特定された内在性遺伝子産物の発現を変化させること
を含む、組換えタンパク質又はペプチドの発現を改善するための方法を提供する。
前記方法は、タンパク質の収率改善によって測定されるように発現の改善を提供し得るか、又は、例えば発現される組換えタンパク質、又は関連タンパク質又はペプチドの溶解度を上昇させることによって、活性タンパク質の回収率を改善させ得る。
この方法を用いて、多くの細胞タンパク質のうちのいずれが、異種組換えタンパク質の発現を補償するために細胞によって「選択される」かを判定することができ、この情報は、より有効なタンパク質発現系の開発を導くことができる。例えば、典型的には、細胞は過剰発現された組換えタンパク質を分解するために１又はそれ以上のプロテアーゼを選択的に上方調節することが知られている。しかし、所与の組換えタンパク質によって引き起こされるストレスを補償するために細胞がどのプロテアーゼを上方調節するかをあらかじめ予測することはできない。マイクロアレイ又は等価のテクノロジーによる細胞の遺伝的プロフィールの分析は、外来性タンパク質生産に応答して所与の細胞においてどのプロテアーゼが上方調節されるかを特定することができる。この情報は、次に、有用な、さらには細胞ホメオスタシスのために必要な他のタンパク質はそのまま残しながら、これらの特定プロテアーゼの発現を低下させるように細胞を遺伝的に修飾するために使用される。
もう１つの例として、細胞は、組換えタンパク質の折りたたみ能力又は溶解度を上昇させるために１又はそれ以上のフォールディング調節剤又は補因子を選択的に情報調節し得る。やはり、特定組換えタンパク質のプロセシングを助けるために所与の系においてどのフォールディング調節剤又は補因子が選択されるかをあらかじめ予測することはできない。マイクロアレイ又は等価のテクノロジーによって遺伝的プロフィールを分析することは、上方調節されたフォールディング調節剤又は補因子の特定を可能にする。この情報に基づき、所与の組換えタンパク質に関して細胞によって優先される選択フォールディング調節剤又は補因子の発現を上昇させるように細胞を遺伝的に修飾する。この修飾は、細胞ホメオスタシスへの有害な影響を最小限に抑えながら、回収される活性タンパク質のパーセントを上昇させることができる。
それ故、選択的であり、細胞の他の有益な機構全体を残す方法で、補償タンパク質（すなわち所与の細胞ストレスに応答して上方調節されるタンパク質）を上昇させる又は低下させることを通して宿主生物を修飾することにより、組換えタンパク質の収率及び／又は活性及び／又は溶解度を高めることができる。
前記方法は、活性組換えタンパク質の発現が最適化されるまで繰り返し使用することができる。例えば上述した方法を用いて、宿主細胞又は生物を、１又はそれ以上の特定された補償タンパク質を上方調節、下方調節、ノックイン又はノックアウトするように遺伝的に修飾する。そのように修飾された宿主細胞又は生物を、次に、組換えタンパク質、又は関連タンパク質又はペプチド、及びマイクロアレイ又は等価分析を通して特定された付加的な補償タンパク質を発現するために培養することができる。修飾された宿主細胞又は生物を、その後再び、さらなる選択補償タンパク質を上方調節、下方調節、ノックイン又はノックアウトするように遺伝的に修飾する。この工程は、宿主細胞又は生物を過度に衰弱させずに、活性及び／又は可溶性タンパク質の最大発現を示す宿主細胞又は生物が得られるまで反復することができる。これらの工程は、例えば１、２、３、４、５、６、７、８、９又は１０回又はそれ以上反復できる。
もう１つの実施形態では、前記方法は、ｉｖ）遺伝的に修飾された細胞において組換えタンパク質又はペプチドを発現すること、をさらに含む。さらにもう１つの実施形態では、前記方法は、ｖ）組換えタンパク質又はペプチドを発現する遺伝的に修飾された細胞の第二の遺伝的プロフィールを分析し、組換えタンパク質又はペプチドを発現する修飾細胞において区別して発現される１又はそれ以上の付加的な遺伝子産物を特定すること、をさらに含む。さらなる実施形態では、前記方法は付加的に、ｖｉ）二重修飾された細胞を与えるために１又はそれ以上の特定された付加的な遺伝子産物の発現を変化させること、を含む。場合により、組換えタンパク質又はペプチド、又は関連タンパク質又はペプチドを二重修飾細胞において発現させ得る。修飾細胞において特定された区別して調節される遺伝子産物を、宿主細胞と比較して又は組換えタンパク質又はペプチドを発現しない修飾細胞と比較して、上方又は下方調節することができる。
さらにもう１つの実施形態では、前記方法は、ｉｖ）組換えタンパク質又はペプチドを発現する遺伝的に修飾された細胞の第二の遺伝的プロフィールを分析し、組換えタンパク質又はペプチドを発現しない修飾細胞において区別して発現される１又はそれ以上の付加的な遺伝子産物を特定すること、をさらに含む。さらなる実施形態では、前記方法は付加的に、ｖ）二重修飾された細胞を与えるために１又はそれ以上の付加的な特定遺伝子産物の発現を変化させること、を含む。修飾細胞において特定された区別して調節される遺伝子産物を、宿主細胞又は生物と比較して又は組換えタンパク質又はペプチドを発現しない修飾細胞と比較して、上方又は下方調節することができる。
１つの特定実施形態では、ｉ）宿主細胞において組換えタンパク質又はペプチドを発現すること；ｉｉ）前記細胞の遺伝的プロフィールを分析し、組換えタンパク質又はペプチドが発現されるときに上方調節される少なくとも１つのプロテアーゼを特定すること；及びｉｉｉ）上方調節されるプロテアーゼの発現を低下させるように宿主細胞又は生物を遺伝的に修飾することによって特定されたプロテアーゼの発現を変化させること、を含む、組換えタンパク質又はペプチドの発現を改善するための方法が提供される。さらなる実施形態では、前記方法は、二重にプロテアーゼ修飾された細胞を与えるために修飾細胞において少なくとも第二の特定されたプロテアーゼの発現を変化させることを含む。もう１つの実施形態では、前記方法は、ｉｖ）プロテアーゼ修飾された細胞において組換えタンパク質又はペプチド、又は関連タンパク質又はペプチドを発現すること、をさらに含む。もう１つの実施形態では、前記方法は、修飾細胞において区別して発現される１又はそれ以上の付加的な遺伝子産物を特定するためにプロテアーゼ修飾細胞の第二の遺伝的プロフィールを分析することをさらに含む。
もう１つの実施形態では、ｉ）宿主細胞において組換えタンパク質又はペプチドを発現すること；ｉｉ）前記細胞の遺伝的プロフィールを分析し、組換えタンパク質又はペプチドの過剰発現後に上方調節される少なくとも１つの上方調節フォールディング調節剤（ＦＭ）を特定すること；及びｉｉｉ）ＦＭ修飾された細胞を与えるように細胞を遺伝的に修飾することによって少なくとも１つの特定されたフォールディング調節剤の発現を変化させること、を含む、組換えタンパク質又はペプチドの発現を改善するための方法が提供される。さらなる実施形態では、前記方法は、二重にＦＭ修飾された細胞を与えるために修飾細胞において少なくとも第二の特定されたフォールディング調節剤の発現を変化させることを含む。もう１つの実施形態では、前記方法は、ｉｖ）ＦＭ修飾された細胞において組換えタンパク質又はペプチド、又は関連タンパク質又はペプチドを発現すること、をさらに含む。もう１つの実施形態では、前記方法は、修飾細胞において区別して発現される１又はそれ以上の付加的な遺伝子産物を特定するためにＦＭ修飾細胞の第二の遺伝的プロフィールを分析することをさらに含む。
ここで使用する「遺伝的プロフィール」という用語は、ゲノム内の遺伝子、ゲノム内の遺伝子から転写されるｍＲＮＡ（又は等価ｃＤＮＡ）、細胞によって修飾された転写産物、例えば真核細胞系における遺伝子のスプライシング変異体、又は細胞によって修飾される又はゲノムから翻訳されたｍＲＮＡのスプライシング変異体から翻訳されるタンパク質を含む、ゲノム内の遺伝子から翻訳されるタンパク質又はペプチドの分析を含むことが意図されている。遺伝的プロフィールは、２個以上の遺伝子又は遺伝子産物を含むこと、典型的には分析される少なくとも５、１０、５０、１００又はそれ以上の遺伝子又は遺伝子産物の群を含むことが意図されている。
１つの実施形態では、分析する遺伝的プロフィールは、転写プロフィール、すなわちゲノムからの遺伝子の転写産物のプロフィールであり得る。前記方法は、マイクロアレイ又は等価テクノロジーを用いてトランスクリプトームプロフィールを分析することを含み得る。この実施形態では、マイクロアレイは、宿主細胞のトランスクリプトームの少なくとも一部に対する結合パートナーを含むことができ、典型的には生物のゲノムの少なくとも５０％の遺伝子産物に対する結合パートナーからの試料を含む。より典型的には、マイクロアレイは、宿主細胞のゲノム内の遺伝子産物に対する結合パートナーの少なくとも８０％、９０％、９５％、９８％、９９％又は１００％からの試料を含む。
別の実施形態では、マイクロアレイは、組換えタンパク質発現によって影響を受ける産物のクラスを代表する遺伝子又は遺伝子産物に対する結合パートナーの選択サブセットを含み得る。非限定的な例は、推定上の又は公知のプロテアーゼ、プロテアーゼ又はプロテアーゼ様タンパク質の補因子；フォールディング調節剤、タンパク質の折りたたみ又は溶解度を改善し得るフォールディング調節剤又はタンパク質の補因子；転写因子；核酸の安定性又は翻訳開始に関与するタンパク質；キナーゼ；細胞外又は細胞内受容体；代謝酵素；代謝補因子；エンベロープタンパク質；σ因子；膜結合タンパク質；膜貫通タンパク質；膜関連タンパク質及びハウスキーピング遺伝子を含む。遺伝的プロフィールは、組換えタンパク質又はペプチドを発現する宿主細胞の発現遺伝子のマイクロアレイへの結合を測定することによって分析できる。トランスクリプトームプロフィールはまた、非マイクロアレイアッセイ、例えばノーザンブロットアッセイを含むブロットアッセイ、又は結合パートナーで被覆したカラムを用いて分析することもできる。
もう１つの実施形態では、分析する遺伝的プロフィールは、プロテオームプロフィール、すなわち所与の生物内の遺伝子から生産されるタンパク質のプロフィールであり得る。本発明の方法は、例えば二次元電気泳動を用いてプロテオームプロフィールを分析することを含み得る。分離ツール、例えば二次元ゲル電気泳動又は多次元液体クロマトグラフィーと組み合わせた質量分析のような手法も、前記方法において使用することができる。二次元電気泳動では、分離されるタンパク質は、生物のプロテオームの少なくとも１０％からのタンパク質を含み得る。より典型的には、宿主細胞のプロテオーム内のタンパク質の少なくとも２０％、３０％、４０％、６０％、８０％又は９０％からのタンパク質が分離され、タンパク質染色及び／又は質量分析などの手法によって分析される。
さらなる実施形態では、プロテオームプロフィールは質量分析法を用いて分析される。タンパク質を特定し、それらの相対存在率を測定するために、質量分析法（ＭＳ）及びタンデム質量分析法（ＭＳ／ＭＳ）と組み合わせて液体クロマトグラフィー（ＬＣ）を使用するいくつかの関連手法が存在する。しばしば、１つの試料を、化学的性質を変化させずにもう１つの別の試料と比較することを可能にする重同位体タグで標識する。例えば１つの試料においてアミノ酸システインを、８個の水素原子を含むタグで標識することができる。他方の試料は、その代わりに８個のジュウテリウム（「重水素」）原子（＋８ダルトン）を含むタグで標識する。ＭＳデータは、８ダルトンのペプチドの対を別々に検出し、その差を数量化するために使用できる。同じペプチドからのＭＳ／ＭＳデータは、おおよその一次配列とタンパク質ＩＤを提供する。他の実験は、「重」アミノ酸を有する細胞を増殖させることによってインビボでタンパク質を標識する。これらの種類の手法は、単一実験において数千のタンパク質を特定し、両方の試料に存在する場合は相対存在率を推定するために使用できる（Goodlett DR and Aebersold RH (2001). Mass Spectrometry in Proteomics. Chem Rev 101:269-295参照）。ＩＣＡＴはＭＳ／ＭＳの一種であり、同位体コードアフィニティータグ（Isotope Coded Affinity Tags）を表わす (Gygi SP, Rist B, Gerber SA, Turecek F, Gelb MH, and Aebersold RH (1999). Quantitative analysis of complex protein mixtures using isotope-coded affinity tags. Nat Biotech 17:994-999参照)。
もう１つの実施形態では、本発明の方法は、例えばマイクロアレイを使用して、プロテオームプロフィールを分析することを含み得る。この実施形態では、アレイは、適切な増殖条件下で宿主細胞によって発現されるタンパク質の少なくとも一部に対する結合パートナーを含むことができ、典型的には生物のプロテオームの少なくとも１０％からのタンパク質に対する結合パートナーを含む。より典型的には、マイクロアレイは、宿主細胞のプロテオーム内のタンパク質の少なくとも２０％、３０％、４０％、６０％、８０％又は９０％からのタンパク質に対する結合パートナーを含む。結合パートナーは抗体であり得、抗体は抗体フラグメント、例えば一本鎖抗体フラグメントであり得る。別の実施形態では、マイクロアレイは、例えば推定上のプロテアーゼタンパク質又は推定上のフォールディング調節剤を含む、プロテオームからのタンパク質の選択サブセットについての結合パートナーを含み得る。マイクロアレイはまた、典型的には対照として使用されるタンパク質に対する結合パートナーのセットを含み得る。遺伝的プロフィールは、組換えタンパク質又はペプチドを発現する宿主細胞のタンパク質の、マイクロアレイ上の結合パートナーへの結合を測定することによって分析できる。プロテオームプロフィールはまた、標準アッセイ様式、例えばＥｌｉｓａアッセイ又は標準ウエスタンブロットアッセイにおいても分析することができる。
遺伝的プロフィール中の試料は、個別に分析するか又はクラスターに分類することができる。クラスターは、典型的には遺伝子発現の類似度によって分類できる。特定実施形態では、クラスターは、類似の程度に上方調節される遺伝子又は類似の程度に下方調節される遺伝子として分類することができる。
特定される上方調節遺伝子は、典型的には、組換えタンパク質又はペプチドを発現する宿主細胞の遺伝的プロフィールを、組換えタンパク質又はペプチドを発現しない宿主細胞の遺伝的プロフィールと比較することによって特定される。さらなる実施形態では、第一組換えタンパク質に相同なタンパク質を発現する宿主細胞を分析する。
組換えタンパク質又はペプチドを発現する宿主細胞のゲノムは、組換えによって、例えば相同的組換え又は非相同的組換えによって修飾することができる。ゲノムはまた、遺伝子、特に特定されたプロテアーゼをコードするオープンリーディングフレーム内の１又はそれ以上のヌクレオチドの突然変異によっても修飾できる。もう１つの実施形態では、宿主細胞は、特定された遺伝子又は遺伝子産物の阻害剤、例えばプロテアーゼ阻害剤をコードする１又はそれ以上のベクターを含むことによって修飾される。もう１つの実施形態では、宿主細胞はプロモーターの阻害によって修飾され、前記プロモーターは天然プロモーターであり得る。別の実施形態では、宿主細胞は、遺伝子、典型的にはフォールディング調節剤又はフォールディング調節剤の補因子をコードする１又はそれ以上のベクターを含むことによって修飾される。もう１つの実施形態では、宿主細胞は、宿主細胞ゲノムに外来性プロモーターを付加することを含む、特定されたフォールディング調節剤又はフォールディング調節剤の補因子についてのプロモーターを増強することによって修飾される。
宿主細胞は、組換えタンパク質又はペプチドを生産することができるいかなる細胞でもあり得る。１つの実施形態では、宿主細胞は、原核細胞、例えばエシェリキア属又はシュードモナス属を含むがこれらに限定されない細菌細胞である。宿主細胞は、シュードモナス菌（Pseudomonad）細胞、例えばＰ．フルオレセンス（P. fluorescence）細胞であり得る。他の実施形態では、宿主細胞は大腸菌細胞である。もう１つの実施形態では、宿主細胞は、真核細胞、例えばスポドプテラ属、トリコプルシア・ドロソフィラ又はエスチグメネ種（Estigmene species）からの細胞を含むがこれらに限定されない、昆虫細胞、又はマウス細胞、ハムスター細胞、サル、霊長動物又はヒト細胞を含むがこれらに限定されない、哺乳動物細胞である。もう１つの実施形態では、宿主細胞は、タバコ細胞、トウモロコシ、アラビドプシス（シロイヌナズナ）種からの細胞、ジャガイモ又はイネ細胞を含むがこれらに限定されない、植物細胞である。もう１つの実施形態では、トランスジェニック生物を含むがこれらに限定されない、全生物が本発明の方法において分析される。
１つの実施形態では、特定される上方調節補償遺伝子又は遺伝子産物は、１又はそれ以上のプロテアーゼ及び／又は１又はそれ以上のフォールディング調節剤である。ある実施形態では、特定される遺伝子又は遺伝子産物はまた、プロテアーゼ又はフォールディング調節剤のサブユニット又はプロテアーゼの補因子又はフォールディング調節剤の補因子であり得る。１つの実施形態では、特定される遺伝子は、セリン、トレオニン、システイン、アスパラギン酸又はメタロペプチダーゼから選択され得る。ある他の実施形態では、特定される遺伝子又は遺伝子産物は、ｈｓｌＶ、ｈｓｌＵ、ｃｌｐＡ、ｃｌｐＢ及びｃｌｐＸから選択され得る。特定される遺伝子又は遺伝子産物はまた、プロテアーゼの補因子であり得る。もう１つの実施形態では、特定される遺伝子又は遺伝子産物はフォールディング調節剤である。ある実施形態では、特定される遺伝子又は遺伝子産物は、シャペロンタンパク質、フォルダーゼ、ペプチジルプロリルイソメラーゼ及びジスルフィド結合イソメラーゼから選択され得る。１つの実施形態では、特定される遺伝子又は遺伝子産物は、ｈｔｐＧ、ｃｂｐＡ、ｄｎａＪ、ｄｎａＫ及びｆｋｂＰから選択され得る。１つの実施形態では、特定される上方調節遺伝子に相同な遺伝子又は遺伝子産物が宿主のゲノム内で修飾される。
本発明の方法は、例えば所与の時点で宿主タンパク質（全細胞タンパク質）のグラム当りのタンパク質の量を上昇させること、又は細胞又は生物が組換えタンパク質を生産している時間の長さの量を上昇させることによって、宿主細胞における組換えタンパク質又はペプチドの高い生産を導くことができる。高い生産は、例えばエネルギー消費を低下させること、使用可能な供給源の使用を上昇させること、又は増殖培地中の増殖サプリメントについての要求条件を低下させることによって、細胞又は生物の効率を最適化し得る。高い生産はまた、組換えタンパク質のグラム当たり又は宿主細胞タンパク質のグラム当たりに生産される、回収可能なタンパク質又はペプチド、例えば可溶性タンパク質のレベル上昇をもたらし得る。
本発明はまた、特許請求する方法によって生産される改善された組換え宿主細胞を含む。
ｉ）宿主細胞において組換えタンパク質又はペプチドを発現すること；ｉｉ）前記細胞の遺伝的プロフィールを分析し、組換えタンパク質又はペプチドの発現時に上方調節される１又はそれ以上のプロテアーゼ又はフォールディング調節剤を含む、１又はそれ以上の内在性上方調節遺伝子産物を特定すること；及びｉｉｉ）細胞を遺伝的に修飾することによって１又はそれ以上の特定された遺伝子産物の発現を変化させること、を含む、組換えタンパク質又はペプチドの発現を改善するための方法を提供する。もう１つの実施形態では、前記方法は、遺伝的に修飾された細胞において組換えタンパク質又はペプチドを発現することをさらに含む。もう１つの実施形態では、前記方法は、修飾細胞において区別して発現される１又はそれ以上の付加的な遺伝子産物を特定するために遺伝的修飾細胞の第二の遺伝的プロフィールを分析することをさらに含む。さらなる実施形態では、前記方法は、二重修飾された細胞を提供するために修飾細胞において少なくとも第二の特定された遺伝子産物の発現を変化させることを含む。前記方法は、タンパク質の改善された収率によって測定されるように改善された発現を提供することができるか、又は、例えば発現される組換えタンパク質の溶解度を上昇させることにより、活性タンパク質の回収率を改善することができる。
より一般には、本発明は、
ｉ）組換え宿主細胞又は生物において組換えタンパク質又はペプチドを発現すること；
ｉｉ）組換えタンパク質を発現するように修飾されていない宿主細胞又は組換えタンパク質を発現していない組換え細胞のいずれか１つにおけるよりも高いレベルで組換え細胞において発現される補償遺伝子又は遺伝子産物を特定するために組換え細胞の遺伝的プロフィールを分析すること；及び
ｉｉｉ）組換えタンパク質の発現、活性又は溶解度の上昇を達成する修飾組換え細胞を提供するために、組換え細胞における特定された補償遺伝子又は遺伝子産物の発現を遺伝子修飾によって変化させること
を含む、宿主細胞又は生物における組換えタンパク質又はペプチドの発現を改善するための方法を含む。
本明細書全体を通じて、範囲が提供されるときは、構成要素が独立することを意味すると了解されるべきである。例えば１−６の範囲は、独立して１、２、３、４、５又は６を意味する。
本発明の方法の工程を以下でより詳細に説明する。
工程Ｉ：宿主細胞において組換えタンパク質又はペプチドを発現するための宿主細胞又は生物の遺伝的修飾
本発明の方法の第一工程では、宿主細胞を、組換えタンパク質又はペプチドを発現する能力を有するように修飾する。宿主細胞は、当技術分野で公知の何らかの手法を用いて修飾することができる。例えば組換えタンパク質は、細胞のゲノムに内在性であり、細胞にトランスフェクト又は形質転換される発現ベクターから発現することができる。発現ベクターの構築並びにトランスフェクション又は形質転換のための手法を以下で述べる。宿主細胞はまた、以下で述べるようにゲノム挿入物から組換えタンパク質又はペプチドを発現するように修飾することもできる。組換えタンパク質又はペプチドをコードする遺伝子を、相同的又は非相同的組換えなどの手法によって宿主細胞又は生物のゲノムに挿入することができる。これらの手法を以下で述べる。
組換えタンパク質又はペプチドは、細胞のさらなる操作を必要とするエレメントの制御下で発現され得る。例えばタンパク質又はペプチド発現を開始させる又は上昇させるためには細胞の化学的処理が必要であり得る。宿主細胞における組換えタンパク質又はペプチドの発現を支配するプロモーター及びリプレッサーエレメントを以下で説明するが、これらは当技術分野において周知である。これらは、ＩＰＴＧに応答性の、「ｔａｃ」プロモーターに基づくプロモーターエレメントを含み得る。
本発明の方法は、真核又は原核生物起源のものを含む、所与の宿主系において使用することができる。前記方法は一般に、特定される遺伝子を特定するための遺伝的プロフィールの分析に十分な遺伝子情報の入手可能性によってのみ制限される。一般に、ゲノムの大きなパーセンテージからの代表的配列、例えばゲノム、トランスクリプトーム又はプロテオームにおいて発現される又は認められる配列の少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９８％、９９％又は１００％が入手可能であることが典型的であるが、本発明は、ゲノム、トランスクリプトーム又はプロテオーム内の配列の一部だけを用いて実施することができる。特に、入手可能な情報が関連配列の群、例えば代謝的連鎖群に関する情報を含む場合、ゲノムからの代表配列の小さな部分だけを本発明の方法のために使用することができる。本発明の方法はまた、方法の鍵となる態様が、組換えタンパク質又はペプチドの発現時に宿主細胞において起こる細胞変化を特定し、当技術分野で公知の手法を用いて宿主細胞を修飾するための手法に基づく、発現系を合理的且つ反復可能に設計する能力であるので、発現される特定組換えタンパク質に限定されない。
宿主細胞は、組換えタンパク質又はペプチドを生産することができるいかなる細胞でもあり得る。１つの実施形態では、宿主細胞は微生物細胞、すなわち細菌、真菌、酵母、又は他の単細胞真核生物、原核生物及びウイルスからの細胞である。組換えタンパク質又はペプチドを生産するために最も一般的に使用される系は、それらの比較的安価な増殖必要条件と大規模なバッチ培養においてタンパク質を生産する潜在的能力の故に、ある種の細菌細胞、特に大腸菌を含む。酵母も、特に研究目的のために、生物学的に関連するタンパク質及びペプチドを発現するために使用される。系は、サッカロミセス・セレビシエ又はピキア・パストリスを含む。これらの系は十分に特性決定されており、一般的に許容されるレベルの総タンパク質発現を提供し、比較的迅速且つ安価である。昆虫細胞発現系も、生物活性形態の組換えタンパク質を発現するための選択肢として浮上してきた。一部の場合には、翻訳後修飾されている正しく折りたたまれたタンパク質が生産できる。哺乳動物発現系、例えばチャイニーズハムスター卵巣細胞も組換えタンパク質の発現のために使用されてきた。小規模では、これらの発現系はしばしば有効である。ある種の生物学的製剤は、特に動物又はヒト医療適用において、哺乳動物タンパク質に由来し得る。もう１つの実施形態では、宿主細胞は、タバコ細胞、トウモロコシ、アラビドプシス（シロイヌナズナ）種からの細胞、ジャガイモ又はイネ細胞を含むがこれらに限定されない、植物細胞である。もう１つの実施形態では、トランスジェニック生物を含むがこれらに限定されない、多細胞生物が本発明の方法において分析又は修飾される。多細胞生物を分析及び／又は修飾するための手法は、一般に以下で述べる細胞を修飾するために記述されている手法に基づく。
１つの実施形態では、宿主細胞は、原核細胞、例えばエシェリキア属又はシュードモナス属種を含むがこれらに限定されない細菌細胞であり得る。典型的細菌細胞は、例えばURL: http://www.emc.maricopa.edu/faculty/farabee/BIOBK/BioBookDiversity#2.html.においてDr MJ Farabee of the Estrella Mountain Community College, Arizona, USA によって提供される、"Biological Diversity: Bacteria and Archaeans", a chapter of the On-Line Biology Bookに述べられている。ある実施形態では、宿主細胞はシュードモナス属細胞であり得、典型的にはＰ．フルオレセンス細胞であり得る。他の実施形態では、宿主細胞はまた、大腸菌細胞であり得る。もう１つの実施形態では、宿主細胞は、真核細胞、例えばスポドプテラ属、トリコプルシア・ドロソフィラ又はエスチグメネ種からの細胞を含むがこれらに限定されない、昆虫細胞、又はマウス細胞、ハムスター細胞、サル、霊長動物又はヒト細胞を含むがこれらに限定されない、哺乳動物細胞であり得る。
ある実施形態では、宿主細胞はシュードモナス属細胞であり、例えばＰ．フルオレセンス生物であり得る。
１つの実施形態では、宿主細胞は、細菌分類群のいずれかの成員であり得る。細胞は、例えば真正細菌のいずれかの種の成員であり得る。宿主は、以下の分類群：アシドバクテリウム門（Acidobacteria）、放線菌門（Actinobacteira）、アキフェックス門（Aquificae）、バクテロイデス門（Bacteroidetes）、クロロビウム門（Chlorobi）、クラミジア門（Chlamydiae）、クロロフレクサス門（Chorofexi）、クリシオゲネス門（Chrysiogenetes）、シアノバクテリア門（Cyanobacteria）、デフェリバクター門（Deferribacteres）、デイノコックス門（Deinococcus）、ディクチオグロムス門（Dictyoglomi）、フィブロバクター門（Fibrobacteres）、グラム陽性細菌門（Firmicutes）、フソバクテリウム門（Fusobacteria）、ゲマティモナス門（Gemmatimonadetes）、レンティスファエラ門（Lentisphaerae）、ニトロスピラ門（Nitrospirae）、プランクトミセス門（Planctomycetes）、プロテオバクテリア門（Proteobacteria）、スピロヘータ門（Spirochaetes）、テルモデスルフォバクテリウム門（Thermodesulfobacteria）、サーモミクロビア門（Thermomicrobia）、テルモトガ門（Thermotogae）、テルムス門（Thermales）、又はヴェルコミクロビウム門（Verrucotnicrobia）のいずれか１つの成員であり得る。真正細菌宿主細胞の１つの実施形態では、細胞は、シアノバクテリア門を除く真正細菌のいずれかの種の成員であり得る。
細菌宿主はまた、プロテオバクテリア門のいずれかの種の成員であり得る。プロテオバクテリア宿主細胞は、分類群：アルファプロテオバクテリア綱（Alphaproteobacteria）、ベータプロテオバクテリア綱（Betaproteobacteria）、ガンマプロテオバクテリア綱（Gammaproteobacteria）、デルタプロテオバクテリア綱（Deltaproteobacteria）又はイプシロンプロテオバクテリア綱（Epsilonproteobacteria）のいずれか１つの成員であり得る。加えて、宿主は、分類群：アルファプロテオバクテリア綱（Alphaproteobacteria）、ベータプロテオバクテリア綱（Betaproteobacteria）又はガンマプロテオバクテリア綱（Gammaproteohacteria）のいずれか１つの成員であり得、ガンマプロテオバクテリア綱（Gammaproteobacteria）のいずれかの種の成員であり得る。
ガンマプロテオバクテリア綱宿主の１つの実施形態では、宿主は、分類群：エアロモナス目（Aeromonadales）、アルテロモナス目（Alteromonadales）、エンテロバクター目（Enterobacteriales）、シュードモナス目（Pseudornonadales）又はキサントモナス目（Xanthomonadales）のいずれか１つの成員；又はエンテロバクター目（Enterobacterial）又はシュードモナス目（Pseudornonadales）のいずれかの種の成員である。１つの実施形態では、宿主細胞はエンテロバクター目（Enterobacteriales）であり得、宿主細胞は、腸内細菌科（Enter obacteriaceae）の成員、又はエルウィニア属（Erwinia）、エシェリキア属（Escherichia）又はセラチア属（Serratia）のいずれか１つの成員、又はエシェリキア属（Escherichia）の成員である。シュードモナス目（Pseudomonadales）の宿主細胞の１つの実施形態では、宿主細胞は、シュードモナス科（Pseudomonadaceae）、さらにはシュードモナス属（Pseudomonas）の成員である。ガンマプロテオバクテリア宿主は、大腸菌（Escherichia coli）種の成員及びシュードモナス・フルオレセンス（Pseudomonas fluorescens）種の成員を含む。
他のシュードモナス属（Pseudomonas）生物も有用であり得る。シュードモナス属及び密接に関連する種は、R.E. Buchanan and N.E. Gibbons (eds.), Bergey's Manual of Determinative Bacteriology, pp. 217-289 (8th ed., 1974) (The Williams & Wilkins Co., Baltimore, MD, USA) （以下「バージェイ（１９７４）」)によって「グラム陰性好気性杆菌及び球菌」と表わされる科及び／又は属に属するプロテオバクテリアの群を含む、グラム陰性のプロテオバクテリアサブグループ１を含む。以下の表はこれらの科及び属の生物を示す。
Figure 2008507294
「グラム陰性プロテオバクテリアサブグループ１」はまた、分類で使用される判定基準に従ってこの表題に分類されるプロテオバクテリアを含む。この表題はまた、以前にこの項に分類されていたが現在はもはやそうではない群、例えばアシドボラクス（Acidovorax）、ブレブンディモナス（Brevundimonas）、ブルクホルデリア（Burkholderia）、ヒドロゲノファガ（Hydrogenophaga）、オセアニモナス（Oceanimonas）、ラルストニア（Ralstonia）及びステノトロフォモナス属（Stenotrophomonas）、キサントモナス属（Xanthomonas）に属する（及び以前にキサントモナス属の種と呼ばれていた）生物を再分類することによって作られた、スフィンゴモナス属（Sphingomonas）（及びそれに由来するブラストモナス属（Blastomonas））、バージェイ（１９７４）において定義されるアセトバクター属（Acetobacter）に属する生物を再分類することによって作られたアシドモナス属（Acidomonas）を含む。加えて、宿主は、シュードモナス属からの細胞、すなわちそれぞれアルテロモナス・ハロプランクティス（Alteromonas haloplanktis）、アルテロモナス・ニグリファシエンス（Alteromonas nigrifaciens）及びアルテロモナス・プトレファシエンス（Alteromonas putrefaciens）として再分類された、シュードモナス・エナリア（Pseudomonas enalia）（ＡＴＣＣ １４３９３）、シュードモナス・ニグリファシエンス（Pseudomonas nigrifaciens）（ＡＴＣＣ １９３７５）及びシュードモナス・プトレファシエンス（Pseudomonas putrefaciens）（ＡＴＣＣ ８０７１）を含み得る。同様に、例えばシュードモナス・アシドボランス（Pseudomonas acidovorans）（ＡＴＣＣ １５６６８）及びシュードモナス・テストステローニ（Pseudomonas testosteroni）（ＡＴＣＣ １１９９６）は、その後それぞれコマモナス・アシドボランス（Comamonas acidovorans）及びコマモナス・テストステローニ（Comamonas testosteroni）として再分類され；シュードモナス・ニグリファシエンス（Pseudomonas nigrifaciens）（ＡＴＣＣ １９３７５）及びシュードモナス・ピスキキダ（Pseudomonas piscicida）（ＡＴＣＣ １５０５７）は、それぞれシュードアルテロモナス・ニグリファシエンス（as Pseudoalteromonas nigrifaciens）及びシュードアルテロモナス・ピスキキダ（Pseudoalteromonas piscicida）として再分類された。「グラム陰性プロテオバクテリアサブグループ１」はまた、以下の科：シュードモナス、アゾトバクター（現在はしばしば、シュードモナス科の「アゾトバクター群」という同義語で呼ばれる）、リゾビウム及びメチロモナス（現在はしばしば「メチロコッカス」という同義語で呼ばれる）のいずれかに属すると分類されるプロテオバクテリアを含む。その結果、ここで述べる属に加えて、「グラム陰性プロテオバクテリアサブグループ１」に含まれるさらなるプロテオバクテリア属は、１）アゾリゾフィルス属（Azorhizophilus）のアゾトバクター群細菌；２）セルビブリオ（Cellvibrio）、オリゲラ（Oligella）及びテレディニバクター属（Teredinibacter）のシュードモナス科細菌；３）ケラトバクター（Chelatobacter）、エンシファー（Ensifer）、リベリバクター（Liberibacter）（「カンジダ・リベリバクター（Candidatus Liberibacter）」とも呼ばれる）、及びシノリゾビウム属（Sinorhizobium）のリゾビウム科細菌；及び４）メチロバクター（Methylobacter）、メチロカルダム（Methylocaldum）、メチロミクロビウム（Methylomicrobium）、メチロサルシナ（Methylosarcina）及びメチロスフェラ属（Methylosphaera）のメチロコッカス科細菌を含む。
もう１つの実施形態では、宿主細胞は、「グラム陰性プロテオバクテリアサブグループ２」から選択される。「グラム陰性プロテオバクテリアサブグループ２」は、以下の属のプロテオバクテリアの群と定義される（カタログにリストされており、公的に入手可能な、その寄託菌株の総数を括弧内に示しており、異なる指示があるものを除き、全てＡＴＣＣに寄託されている）：アシドモナス（Acidomonas）（２）；アセトバクター（Acetobacter）（９３）；グルコノバクター（Gluconobacter）（３７）；ブレブンディモナス（Brevundimonas）（２３）；ベイジェリンキア（Beijerinckia）（１３）；デルキシア（Derxia）（２）；ブルセラ（Brucella）（４）；アグロバクテリウム（Agrobacterium）（７９）：ケラトバクター（Chelatobacter）（２）；エンシファー（Ensifer）（３）；リゾビウム（Rhizobium）（１４４）；シノリゾビウム（Sinorhizobium）（２４）；ブラストモナス（Blastomonas）（１）；スフィンゴモナス（Sphingomonas）（２７）；アルカリゲネス（Alcaligenes）（８８）；ボルデテラ（Bordetella）（４３）；ブルクホルデリア（Burkholderia）（７３）；ラルストニア（Ralstonia）（３３）；アシドボラクス（Acidovorax）（２０）；ヒドロゲノファガ（Hydrogenophaga）（９）；ズーグレア（Zoogloea）（９）；メチロバクター（Methylobacter）（２）；メチロカルダム（Methylocaldum）（ＮＣＩＭＢに１）；メチロコッカス（Methylococcus）（２）；メチロミクロビウム（Methylomicrobium）（２）；メチロモナス（Methylomonas）（９）；メチロサルシナ（Methylosarcina）（１）；メチロスフェラ（Methylosphaera）；アゾモナス（Azomonas）（９）；アゾリゾフィルス（Azorhizophilus）（５）；アゾトバクター（Azotobacter）（６４）；セルビブリオ（Cellvibrio）（３）；オリゲラ（Oligella）（５）；シュードモナス（Pseudomonas）（１１３９）；フランシセラ（Francisella）（４）；キサントモナス（Xanthomonas）（２２９）；ステノトロフォモナス（Stenotrophomonas）（５０）；及びオセアニモナス（Oceanimonas）（４）。
「グラム陰性プロテオバクテリアサブグループ２」の例示的な宿主細胞種は、以下の細菌を含むが、これらに限定されない（その例示的な菌株のＡＴＣＣ又は他の寄託数を括弧内に示す）：アシドモナス・メタノリカ（Acidomonas methanolica）（ＡＴＣＣ ４３５８１）；アセトバクター・アセチ（Acetobacter aceti）（ＡＴＣＣ１５９７３）；グルコノバクター・オキシダンス（Gluconobacter oxydans）（ＡＴＣＣ １９３５７）；ブレブンディモナス・ディミヌータ（Brevundimonas diminuta）（ＡＴＣＣ １１５６８）；ベイジェリンキア・インディカ（Beijerinckia indica）（ＡＴＣＣ ９０３９及びＡＴＣＣ １９３６１）；デルキシア・ガモサ（Derxia gummosa）（ＡＴＣＣ１５９９４）；ブルセラ・メリテンシス（Brucella melitensis）（ＡＴＣＣ ２３４５６）、ブルセラ・アボルツス（Brucella abortus）（ＡＴＣＣ ２３４４８）；アグロバクテリウム・ツメファシエンス（Agrobacterium tumefaciens）（ＡＴＣＣ ２３３０８）、アグロバクテリウム・ラジオバクター（Agrobacterium radiobacter）（ＡＴＣＣ １９３５８）、アグロバクテリウム・リゾゲネス（Agrobacterium rhizogenes）（ＡＴＣＣ １１３２５）；ケラトバクター・ヘインツィイ（Chelatobacter heintzii）（ＡＴＣＣ ２９６００）；エンシファー・アドヘレンス（Ensifer adhaerens）（ＡＴＣＣ ３３２１２）；リゾビウム・レグミノサルム（Rhizobium leguminosarum）（ＡＴＣＣ １０００４）；シノリゾビウム・フレディイ（Sinorhizobium fredii）（ＡＴＣＣ ３５４２３）；ブラストモナス・ナタトリア（Blastomonas natatoria）（ＡＴＣＣ ３５９５１）；スフィンゴモナス・パウシモビリス（Sphingomonas paucimobilis）（ＡＴＣＣ ２９８３７）；アルカリゲネス・フェカリス（Alcaligenes faecalis）（ＡＴＣＣ ８７５０）；ボルデテラ・ペルタッシス（Bordetella pertussis）（ＡＴＣＣ ９７９７）；ブルクホルデリア・セパシア（Burkholderia cepacia）（ＡＴＣＣ ２５４１６）；ラルストニア・ピケッティイ（Ralstonia pickettii）（ＡＴＣＣ ２７５１１）；アシドボラクス・ファシリス（Acidovorax facilis）（ＡＴＣＣ １１２２８）；ヒドロゲノファガ・フラバ（Hydrogenophaga flava）（ＡＴＣＣ ３３６６７）；ズーグレア・ラミゲラ（Zoogloea ramigera）（ＡＴＣＣ １９５４４）；メチロバクター・ルテウス（Methylobacter luteus）（ＡＴＣＣ ４９８７８）；メチロカルダム・グラシル（Methylocaldum gracile）（ＮＣＩＭＢ １１９１２）；メチロコッカス・カプスラツス（Methylococcus capsulatus）（ＡＴＣＣ １９０６９）；メチロミクロビウム・アジール（Methylomicrobium agile）（ＡＴＣＣ ３５０６８）；メチロモナス・メタニカ（Methylomonas methanica）（ＡＴＣＣ ３５０６７）；メチロサルシナ・フィブラタ（Methylosarcina fibrata）（ＡＴＣＣ ７００９０９）；メチロスフェラ・ハンソニイ（Methylosphaera hansonii）（ＡＣＡＭ ５４９）；アゾモナス・アジリス（Azomonas agilis）（ＡＴＣＣ ７４９４）；アゾリゾフィルス・パスパリ（Azorhizophilus paspali）（ＡＴＣＣ ２３８３３）；アゾトバクター・クロオコッカム（Azotobacter chroococcum）（ＡＴＣＣ９０４３）；セルビブリオ・ミクツス（Cellvibrio mixtus）（ＵＱＭ ２６０１）；オリゲラ・ウレトラリス（Oligella urethralis）（ＡＴＣＣ １７９６０）；緑膿菌（Pseudomonas aeruginosa）（ＡＴＣＣ １０１４５）、シュードモナス・フルオレセンス（Pseudomonas fluorescens）（ＡＴＣＣ ３５８５８）；フランシセラ・ツラレンシス（Francisella tularensis）（ＡＴＣＣ ６２２３）；ステノトロフォモナス・マルトフィリア（Stenotrophomonas maltophilia）（ＡＴＣＣ １３６３７）；キサントモナス・カンペストリス（Xanthomonas campestris）（ＡＴＣＣ ３３９１３）；及びオセアニモナス・ドゥドロフィイ（Oceanimonas doudoroffii）（ＡＴＣＣ ２７１２３）。
もう１つの実施形態では、宿主細胞は、「グラム陰性プロテオバクテリアサブグループ３」から選択される。「グラム陰性プロテオバクテリアサブグループ３」は、以下の属のプロテオバクテリアの群と定義される：ブレブンディモナス（Brevundimonas）；アグロバクテリウム（Agrobacterium）；リゾビウム（Rhizohium）；シノリゾビウム（Sinorhizobium）；ブラストモナス（Blastomonas）；スフィンゴモナス（Sphingomonas）；アルカリゲネス（Alcaligenes）；ブルクホルデリア（Burkholderia）；ラルストニア（Ralstonia）；アシドボラクス（Acidovorax）；ヒドロゲノファガ（Hydrogenophaga）；メチロバクター（Methylobacter）；メチロカルダム（Methylocaldum）；メチロコッカス（Methylococcus）；メチロミクロビウム（Methylomicrobium）；メチロモナス（Methylomonas）；メチロサルシナ（Methylosarcina）；メチロスフェラ（Methylosphaera）；アゾモナス（Azomonas）；アゾリゾフィルス（Azorhizophilus）；アゾトバクター（Azotobacter）；セルビブリオ（Cellvibrio）；オリゲラ（Oligella）；シュードモナス（Pseudomonas）；テレディニバクター（Teredinibacter）；フランシセラ（Francisella）；ステノトロフォモナス（Stenotrophomonas）；キサントモナス（Xanthomonas）；及びオセアニモナス（Oceanimonas）。
もう１つの実施形態では、宿主細胞は、「グラム陰性プロテオバクテリアサブグループ４」から選択される。「グラム陰性プロテオバクテリアサブグループ４」は、以下の属のプロテオバクテリアの群と定義される：ブレブンディモナス（Brevundimonas）；ブラストモナス（Blastomonas）；スフィンゴモナス（Sphingomonas）；ブルクホルデリア（Burkholderia）；ラルストニア（Ralstonia）；アシドボラクス（Acidovorax）；ヒドロゲノファガ（Hydrogenophaga）；メチロバクター（Methylobacter）；メチロカルダム（Methylocaldum）；メチロコッカス（Methylococcus）；メチロミクロビウム（Methylomicrobium）；メチロモナス（Methylomonas）；メチロサルシナ（Methylosarcina）；メチロスフェラ（Methylosphaera）；アゾモナス（Azomonas）；アゾリゾフィルス（Azorhizophilus）；アゾトバクター（Azotobacter）；セルビブリオ（Cellvibrio）；オリゲラ（Oligella）；シュードモナス（Pseudomonas）；テレディニバクター（Teredinibacter）；フランシセラ（Francisella）；ステノトロフォモナス（Stenotrophomonas）；キサントモナス（Xanthomonas）；及びオセアニモナス（Oceanimonas）。
もう１つの実施形態では、宿主細胞は、「グラム陰性プロテオバクテリアサブグループ５」から選択される。「グラム陰性プロテオバクテリアサブグループ５」は、以下の属のプロテオバクテリアの群と定義される：メチロバクター（Methylobacter）；メチロカルダム（Methylocaldum）；メチロコッカス（Methylococcus）；メチロミクロビウム（Methylomicrobium）；メチロモナス（Methylomonas）；メチロサルシナ（Methylosarcina）；メチロスフェラ（Methylosphaera）；アゾモナス（Azomonas）；アゾリゾフィルス（Azorhizophilus）；アゾトバクター（Azotobacter）；セルビブリオ（Cellvibrio）；オリゲラ（Oligella）；シュードモナス（Pseudomonas）；テレディニバクター（Teredinibacter）；フランシセラ（Francisella）；ステノトロフォモナス（Stenotrophomonas）；キサントモナス（Xanthomonas）；及びオセアニモナス（Oceanimonas）。
もう１つの実施形態では、宿主細胞は、「グラム陰性プロテオバクテリアサブグループ６」から選択することができる。「グラム陰性プロテオバクテリアサブグループ６」は、以下の属のプロテオバクテリアの群と定義される：ブレブンディモナス（Brevundimonas）；ブラストモナス（Blastomonas）；スフィンゴモナス（Sphingomonas）；ブルクホルデリア（Burkholderia）；ラルストニア（Ralstonia）；アシドボラクス（Acidovorax）；ヒドロゲノファガ（Hydrogenophaga）；アゾモナス（Azomonas）；アゾリゾフィルス（Azorhizophilus）；アゾトバクター（Azotobacter）；セルビブリオ（Cellvibrio）；オリゲラ（Oligella）；シュードモナス（Pseudomonas）；テレディニバクター（Teredinibacter）；ステノトロフォモナス（Stenotrophomonas）；キサントモナス（Xanthomonas）；及びオセアニモナス（Oceanimonas）。
宿主細胞は、「グラム陰性プロテオバクテリアサブグループ７」から選択することができる。「グラム陰性プロテオバクテリアサブグループ７」は、以下の属のプロテオバクテリアの群と定義される：アゾモナス（Azomonas）；アゾリゾフィルス（Azorhizophilus）；アゾトバクター（Azotobacter）；セルビブリオ（Cellvibrio）；オリゲラ（Oligella）；シュードモナス（Pseudomonas）；テレディニバクター（Teredinibacter）；ステノトロフォモナス（Stenotrophomonas）；キサントモナス（Xanthomonas）；及びオセアニモナス（Oceanimonas）。宿主細胞は、「グラム陰性プロテオバクテリアサブグループ８」から選択することができる。「グラム陰性プロテオバクテリアサブグループ８」は、以下の属のプロテオバクテリアの群と定義される：ブレブンディモナス（Brevundimonas）；ブラストモナス（Blastomonas）；スフィンゴモナス（Sphingomonas）；ブルクホルデリア（Burkholderia）；ラルストニア（Ralstonia）；アシドボラクス（Acidovorax）；ヒドロゲノファガ（Hydrogenophaga）；シュードモナス（Pseudomonas）；ステノトロフォモナス（Stenotrophomonas）；キサントモナス（Xanthomonas）；及びオセアニモナス（Oceanimonas）。
宿主細胞は、「グラム陰性プロテオバクテリアサブグループ９」から選択することができる。「グラム陰性プロテオバクテリアサブグループ９」は、以下の属のプロテオバクテリアの群と定義される：ブレブンディモナス（Brevundimonas）；ブルクホルデリア（Burkholderia）；ラルストニア（Ralstonia）；アシドボラクス（Acidovorax）；ヒドロゲノファガ（Hydrogenophaga）；シュードモナス（Pseudomonas）；ステノトロフォモナス（Stenotrophomonas）；及びオセアニモナス（Oceanimonas）。
宿主細胞は、「グラム陰性プロテオバクテリアサブグループ１０」から選択することができる。「グラム陰性プロテオバクテリアサブグループ１０」は、以下の属のプロテオバクテリアの群と定義される：ブルクホルデリア（Burkholderia）；ラルストニア（Ralstonia）；シュードモナス（Pseudomonas）；ステノトロフォモナス（Stenotrophomonas）；及びキサントモナス（Xanthomonas）。
宿主細胞は、「グラム陰性プロテオバクテリアサブグループ１１」から選択することができる。「グラム陰性プロテオバクテリアサブグループ１１」は、以下の属のプロテオバクテリアの群と定義される：シュードモナス（Pseudomonas）；ステノトロフォモナス（Stenotrophomonas）；及びキサントモナス（Xanthomonas）。宿主細胞は、「グラム陰性プロテオバクテリアサブグループ１２」から選択することができる。「グラム陰性プロテオバクテリアサブグループ１２」は、以下の属のプロテオバクテリアの群と定義される：ブルクホルデリア（Burkholderia）；ラルストニア（Ralstonia）；シュードモナス（Pseudomonas）。宿主細胞は、「グラム陰性プロテオバクテリアサブグループ１３」から選択することができる。「グラム陰性プロテオバクテリアサブグループ１３」は、以下の属のプロテオバクテリアの群と定義される：ブルクホルデリア（Burkholderia）；ラルストニア（Ralstonia）；シュードモナス（Pseudomonas）；及びキサントモナス（Xanthomonas）。宿主細胞は、「グラム陰性プロテオバクテリアサブグループ１４」から選択することができる。「グラム陰性プロテオバクテリアサブグループ１４」は、以下の属のプロテオバクテリアの群と定義される：シュードモナス（Pseudomonas）及びキサントモナス（Xanthomonas）。宿主細胞は、「グラム陰性プロテオバクテリアサブグループ１５」から選択することができる。「グラム陰性プロテオバクテリアサブグループ１５」は、シュードモナス属（Pseudomonas）のプロテオバクテリアの群と定義される。
宿主細胞は、「グラム陰性プロテオバクテリアサブグループ１６」から選択することができる。「グラム陰性プロテオバクテリアサブグループ１６」は、以下のシュードモナス（Pseudomonas）種のプロテオバクテリアの群と定義される（例示的な菌株のＡＴＣＣ又は他の寄託数を括弧内に示す）：シュードモナス・アビエタニフィラ（Pseudomonas abietaniphila）（ＡＴＣＣ ７００６８９）；緑膿菌（Pseudomonas aeruginosa）（ＡＴＣＣ １０１４５）；シュードモナス・アルカリゲネス（Pseudomonas alcaligenes）（ＡＴＣＣ １４９０９）；シュードモナス・アンギリセプティカ（Pseudomonas anguilliseptica）（ＡＴＣＣ ３３６６０）；シュードモナス・シトロネロリス（Pseudomonas citronellolis）（ＡＴＣＣ １３６７４）；シュードモナス・フラベセンス（Pseudomonas flavescens）（ＡＴＣＣ ５１５５５）；シュードモナス・メンドシナ（Pseudomonas mendocina）（ＡＴＣＣ ２５４１１）；シュードモナス・ニトロレドゥセンス（Pseudomonas nitroreducens）（ＡＴＣＣ ３３６３４）；シュードモナス・オレオボランス（Pseudomonas oleovorans）（ＡＴＣＣ ８０６２）；シュードモナス・シュードアルカリゲネス（Pseudomonas pseudoalcaligenes）（ＡＴＣＣ １７４４０）；シュードモナス・レシノボランス（Pseudomonas resinovorans）（ＡＴＣＣ １４２３５）；シュードモナス・ストラミネア（Pseudomonas straminea）（ＡＴＣＣ ３３６３６）；シュードモナス・アガリシ（Pseudomonas agarici）（ＡＴＣＣ ２５９４１）；シュードモナス・アルカリフィラ（Pseudomonas alcaliphila）；シュードモナス・アルギノボラ（Pseudomonas alginovora）；シュードモナス・アンダーソニイ（Pseudomonas andersonii）；シュードモナス・アスプレニイ（Pseudomonas asplenii）（ＡＴＣＣ ２３８３５）；シュードモナス・アゼライカ（Pseudomonas azelaica）（ＡＴＣＣ ２７１６２）；シュードモナス・ベイジェリンキイ（Pseudomonas beijerinckii）（ＡＴＣＣ １９３７２）；シュードモナス・ボレアリス（Pseudomonas borealis）；シュードモナス・ボレオポリス（Pseudomonas boreopolis）（ＡＴＣＣ ３３６６２）；シュードモナス・ブラシカセラム（Pseudomonas brassicacearum）；シュードモナス・ブタノボラ（Pseudomonas butanovora）（ＡＴＣＣ ４３６５５）；シュードモナス・セルロサ（Pseudomonas cellulosa）（ＡＴＣＣ ５５７０３）；シュードモナス・アウランティアカ（Pseudomonas aurantiaca）（ＡＴＣＣ ３３６６３）；シュードモナス・クロロラフィス（Pseudomonas chlororaphis）（ＡＴＣＣ ９４４６、ＡＴＣＣ １３９８５、ＡＴＣＣ １７４１８、ＡＴＣＣ １７４６１）；シュードモナス・フラジ（Pseudomonas fragi）（ＡＴＣＣ ４９７３）；シュードモナス・ルンデンシス（Pseudomonas lundensis）（ＡＴＣＣ ４９９６８）；シュードモナス・テトロレンス（Pseudomonas taetrolens）（ＡＴＣＣ ４６８３）；シュードモナス・シシコラ（Pseudomonas cissicola）（ＡＴＣＣ ３３６１６）；シュードモナス・コロナファシエンス（Pseudomonas coronafaciens）；シュードモナス・ジターペニフィラ（Pseudomonas diterpeniphila）；シュードモナス・エロンガータ（Pseudomonas elongata）（ＡＴＣＣ １０１４４）；シュードモナス・フレクテンス（Pseudomonas βectens）（ＡＴＣＣ １２７７５）；シュードモナス・アゾトフォルマンス（Pseudomonas azotoformans）；シュードモナス・ブレネリ（Pseudomonas brenneri）；シュードモナス・セドレラ（Pseudomonas cedrella）；シュードモナス・コルガタ（Pseudomonas corrugata）（ＡＴＣＣ ２９７３６）；シュードモナス・エクストレモリエンタリス（Pseudomonas extremorientalis）；シュードモナス・フルオレセンス（Pseudomonas fluorescens）（ＡＴＣＣ ３５８５８）；シュードモナス・ゲッサルディイ（Pseudomonas gessardii）；シュードモナス・リバネンシス（Pseudomonas libanensis）；シュードモナス・マンデリイ（Pseudomonas mandelii）（ＡＴＣＣ ７００８７１）；シュードモナス・マージナリス（Pseudomonas marginalis）（ＡＴＣＣ １０８４４）；シュードモナス・ミグレ（Pseudomonas migulae）；シュードモナス・ムシドレンス（Pseudomonas mucidolens）（ＡＴＣＣ ４６８５）；シュードモナス・オリエンタリス（Pseudomonas orientalis）；シュードモナス・ローデシエ（Pseudomonas rhodesiae）；シュードモナス・シンキサンタ（Pseudomonas synxantha）（ＡＴＣＣ ９８９０）；シュードモナス・トラアシイ（Pseudomonas tolaasii）（ＡＴＣＣ３３６１８）；シュードモナス・ベロニイ（Pseudomonas veronii）（ＡＴＣＣ ７００４７４）；シュードモナス・フレデリクスベルゲンシス（Pseudomonas frederiksbergensis）；シュードモナス・ゲニクラータ（Pseudomonas geniculata）（ＡＴＣＣ １９３７４）；シュードモナス・ギンゲリ（Pseudomonas gingeri）；シュードモナス・グラミニス（Pseudomonas graminis）；シュードモナス・グリモンティイ（Pseudomonas grimontii）；シュードモナス・ハロデニトリフィカンス（Pseudomonas halodenitrificans）；シュードモナス・ハロフィラ（Pseudomonas halophila）；シュードモナス・ヒビシコラ（Pseudomonas hibiscicola）（ＡＴＣＣ １９８６７）；シュードモナス・ハティエンシス（Pseudomonas huttiensis）（ＡＴＣＣ １４６７０）；シュードモナス・ヒドロゲノボラ（Pseudomonas hydrogenovora）；シュードモナス・ジェセニイ（Pseudomonas jessenii）（ＡＴＣＣ ７００８７０）；シュードモナス・キロネンシス（Pseudomonas kilonensis）；シュードモナス・ランセオラータ（Pseudomonas lanceolata）（ＡＴＣＣ １４６６９）；シュードモナス・リニ（Pseudomonas lini）；シュードモナス・マージナータ（Pseudomonas marginata）（ＡＴＣＣ ２５４１７）；シュードモナス・メフィティカ（Pseudomonas mephitica）（ＡＴＣＣ ３３６６５）；シュードモナス・デニトリフィカンス（Pseudomonas denitrificans）（ＡＴＣＣ １９２４４）；シュードモナス・ペルタシノゲナ（Pseudomonas pertucinogena）（ＡＴＣＣ １９０）；シュードモナス・ピクトラム（Pseudomonas pictorum）（ＡＴＣＣ ２３３２８）；シュードモナス・プシクロフィラ（Pseudomonas psychrophila）；シュードモナス・ファルヴァ（Pseudomonas fiilva）（ＡＴＣＣ ３１４１８）；シュードモナス・モンテイリイ（Pseudomonas monteilii）（ＡＴＣＣ ７００４７６）；シュードモナス・モッセリイ（Pseudomonas mosselii）；シュードモナス・オリジハビタンス（Pseudomonas oryzihabitans）（ＡＴＣＣ ４３２７２）；シュードモナス・プレコグロシシダ（Pseudomonas plecoglossicida）（ＡＴＣＣ ７００３８３）；シュードモナス・プチダ（Pseudomonas putida）（ＡＴＣＣ １２６３３）；シュードモナス・レアクタンス（Pseudomonas reactans）；シュードモナス・スピノザ（Pseudomonas spinosa）（ＡＴＣＣ １４６０６）；シュードモナス・バレアリカ（Pseudomonas balearica）；シュードモナス・ルテオラ（Pseudomonas luteola）（ＡＴＣＣ ４３２７３）；シュードモナス・スタツェリ（Pseudomonas stutzeri）（ＡＴＣＣ １７５８８）；シュードモナス・アミグダリ（Pseudomonas amygdali）（ＡＴＣＣ ３３６１４）；シュードモナス・アヴェラネ（Pseudomonas avellanae）（ＡＴＣＣ ７００３３１）；シュードモナス・カリカパパイエ（Pseudomonas caricapapayae）（ＡＴＣＣ ３３６１５）；シュードモナス・シコリイ（Pseudomonas cichorii）（ＡＴＣＣ １０８５７）；シュードモナス・フィカセレクテ（Pseudomonas ficuserectae）（ＡＴＣＣ３５１０４）；シュードモナス・ファスコバギネ（Pseudomonas fuscovaginae）；シュードモナス・メリエ（Pseudomonas meliae）（ＡＴＣＣ３３０５０）；シュードモナス・シリンゲ（Pseudomonas syringae）（ＡＴＣＣ １９３１０）；シュードモナス・ビリディフラバ（Pseudomonas viridiflava）（ＡＴＣＣ １３２２３）；シュードモナス・サーモカルボキシドボランス（Pseudomonas thermocarboxydovorans）（ＡＴＣＣ ３５９６１）；シュードモナス・サーモトレランス（Pseudomonas thermotolerans）；シュードモナス・チベルバレンシス（Pseudomonas thivervalensis）：シュードモナス・バンクベレンシス（Pseudotnonas vancouverensis）（ＡＴＣＣ ７００６８８）；シュードモナス・ウィスコンシネンシス（Pseudomonas wisconsinensis）；及びシュードモナス・キシアメネンシス（Pseudomonas xiamenensis）。
宿主細胞は、「グラム陰性プロテオバクテリアサブグループ１７」から選択することができる。「グラム陰性プロテオバクテリアサブグループ１７」は、例えば以下のシュードモナス（Pseudomonas）種に属するものを含む、「蛍光シュードモナス菌」として当技術分野で公知のプロテオバクテリアの群と定義される：シュードモナス・アゾトフォルマンス（Pseudomonas azotoformans）；シュードモナス・ブレネリ（Pseudomonas brenneri）；シュードモナス・セドレラ（Pseudomonas cedrella）；シュードモナス・コルガタ（Pseudomonas corrugata）；シュードモナス・エクストレモリエンタリス（Pseudomonas extremorientalis）；シュードモナス・フルオレセンス（Pseudomonas fluorescens）；シュードモナス・ゲッサルディイ（Pseudomonas gessardii）；シュードモナス・リバネンシス（Pseudomonas libanensis）；シュードモナス・マンデリイ（Pseudomonas mandelii）；シュードモナス・マージナリス（Pseudomonas marginalis）；シュードモナス・ミグレ（Pseudomonas migulae）；シュードモナス・ムシドレンス（Pseudomonas mucidolens）；シュードモナス・オリエンタリス（Pseudomonas orientalis）；シュードモナス・ローデシエ（Pseudomonas rhodesiae）；シュードモナス・シンキサンタ（Pseudomonas synxantha）；シュードモナス・トラアシイ（Pseudomonas tolaasii）；及びシュードモナス・シュードモナス・ベロニイ（Pseudomonas veronii）。
宿主細胞は、「グラム陰性プロテオバクテリアサブグループ１８」から選択することができる。「グラム陰性プロテオバクテリアサブグループ１８」は、例えば以下に属するものを含む、シュードモナス・フルオレセンス（Pseudomonas fluorescens）種の全ての亜種、品種、菌株及び他の特定サブユニットの群と定義される（例示的な菌株のＡＴＣＣ又は他の寄託数を括弧内に示す）：ビオバル１又はビオバルＩとも呼ばれるシュードモナス・フルオレセンス（Pseudomonas fluorescens）バイオタイプ（同遺伝子型個体群）Ａ（ＡＴＣＣ １３５２５）；ビオバル２又はビオバルＩＩとも呼ばれるシュードモナス・フルオレセンス（Pseudomonas fluorescens）バイオタイプＢ（ＡＴＣＣ １７８１６）；ビオバル３又はビオバルＩＩＩとも呼ばれるシュードモナス・フルオレセンス（Pseudomonas fluorescens）バイオタイプＣ（ＡＴＣＣ １７４００）；ビオバル４又はビオバルＩＶとも呼ばれるシュードモナス・フルオレセンス（Pseudomonas fluorescens）バイオタイプＦ（ＡＴＣＣ １２９８３）；ビオバル５又はビオバルＶとも呼ばれるシュードモナス・フルオレセンス（Pseudomonas fluorescens）バイオタイプＧ（ＡＴＣＣ １７５１８）；シュードモナス・フルオレセンス（Pseudomonas fluorescens）ビオバルＶＩ；シュードモナス・フルオレセンス（Pseudomonas fluorescens）Ｐｆ０−１；シュードモナス・フルオレセンス（Pseudomonas fluorescens）Ｐｆ−５（ＡＴＣＣ ＢＡＡ−４７７）；シュードモナス・フルオレセンス（Pseudomonas fluorescens）ＳＢＷ２５；及びシュードモナス・フルオレセンス亜種セルロサ（Pseudomonas fluorescens subsp. cellulosa）（ＮＣＩＭＢ １０４６２）。
宿主細胞は、「グラム陰性プロテオバクテリアサブグループ１９」から選択することができる。「グラム陰性プロテオバクテリアサブグループ１９」は、シュードモナス・フルオレセンス（Pseudomonas fluorescens）バイオタイプＡの全ての菌株の群と定義される。このバイオタイプの典型的な菌株は、Ｐ．フルオレセンス（P. fluorescens）菌株ＭＢ１０１（Ｗｉｌｃｏｘへの米国特許第５，１６９，７６０号参照）及びその誘導体である。その誘導体の一例は、ＭＢ１０１染色体ａｓｄ（アスパラギン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子）遺伝子座に天然大腸菌ＰｌａｃＩ−ｌａｃＩ−ｌａｃＺＹＡを挿入することによって構築される（すなわちＰｌａｃＺが欠失した）、Ｐ．フルオレセンス（P. fluorescens）菌株ＭＢ２１４である。
本発明において使用できるさらなるＰ．フルオレセンス（P. fluorescens）菌株は、以下のＡＴＣＣ番号を有する、シュードモナス・フルオレセンス（Pseudomonas fluorescens）・ミグラ及びシュードモナス・フルオレセンス（Pseudomonas fluorescens）・ロイトキトクを含む：［ＮＣＩＢ ８２８６］；ＮＲＲＬ Ｂ−１２４４；ＮＣＩＢ ８８６５菌株ＣＯ１；ＮＣＩＢ ８８６６菌株ＣＯ２；１２９１［ＡＴＣＣ １７４５８；ＩＦＯ １５８３７；ＮＣＩＢ ８９１７；ＬＡ；ＮＲＲＬ Ｂ−１８６４；ピロリジン；ＰＷ２［ＩＣＭＰ ３９６６；ＮＣＰＰＢ ９６７；ＮＲＲＬ Ｂ−８９９］；１３４７５；ＮＣＴＣ １００３８；ＮＲＲＬ Ｂ−１６０３［６；ＩＦＯ １５８４０］；５２−１Ｃ；ＣＣＥＢ ４８８−Ａ［ＢＵ １４０］；ＣＣＥＢ ５５３［ＩＥＭ １５／４７］；ＩＡＭ １００８［ＡＨＨ−２７］；ＩＡＭ １０５５［ＡＨＨ−２３］；１［ＩＦＯ １５８４２］；１２［ＡＴＣＣ ２５３２３；ＮＩＨ １１；ｄｅｎ Ｄｏｏｒｅｎ ｄｅ Ｊｏｎｇ ２１６］；１８［ＩＦＯ １５８３３；ＷＲＲＬ Ｐ−７］；９３［ＴＲ−１０］；１０８［５２−２２；ＩＦＯ １５８３２］；１４３［ＩＦＯ １５８３６；ＰＬ］；１４９ ［２−４０−４０；ＩＦＯ １５８３８］；１８２［ＩＦＯ ３０８１；ＰＪ ７３］；１８４［ＩＦＯ １５８３０］；１８５［Ｗ２ Ｌ−１］；１８６［ＩＦＯ １５８２９；ＰＪ ７９］；１８７［ＮＣＰＰＢ ２６３］；１８８［ＮＣＰＰＢ ３１６］；１８９［ＰＪ２２７；１２０８］；１９１［ＩＦＯ １５８３４；ＰＪ ２３６；２２／１］；１９４［Ｋｌｉｎｇｅ Ｒ−６０；ＰＪ ２５３］；１９６［ＰＪ ２８８］；１９７［ＰＪ ２９０］；１９８［ＰＪ ３０２］；２０１［ＰＪ ３６８］；２０２［ＰＪ ３７２］；２０３［ＰＪ ３７６］；２０４［ＩＦＯ １５８３５；ＰＪ ６８２］；２０５［ＰＪ ６８６］；２０６［ＰＪ ６９２］；２０７［ＰＪ ６９３］；２０８［ＰＪ ７２２］；２１２［ＰＪ ８３２］；２１５［ＰＪ ８４９］；２１６［ＰＪ ８８５］；２６７［Ｂ−９］；２７１［Ｂ−１６１２］；４０１［Ｃ７１Ａ；ＩＦＯ １５８３１；ＰＪ １８７］；ＮＲＲＬ Ｂ−３１７８［４；ＩＦＯ １５８４１］；ＫＹ ８５２１；３０８１；３０−２１；［ＩＦＯ ３０８１］；Ｎ；ＰＹＲ；ＰＷ；Ｄ９４６−Ｂ８３［ＢＵ ２１８３；ＦＥＲＭ−Ｐ ３３２８］；Ｐ−２５６３［ＦＥＲＭ−Ｐ ２８９４；ＩＦＯ １３６５８］；ＩＡＭ−１１２６［４３Ｆ］；Ｍ−１；Ａ５０６［Ａ５−０６］；Ａ５０５［Ａ５−０５−１］；Ａ５２６［Ａ５−２６］；Ｂ６９；７２；ＮＲＲＬ Ｂ−４２９０；ＰＭＷ６［ＮＣＩＢ １１６１５］；ＳＣ １２９３６；Ａ１［ＩＦＯ １５８３９］；Ｆ １８４７［ＣＤＣ−ＥＢ］；Ｆ １８４８［ＣＤＣ ９３］；ＮＣＩＢ １０５８６；Ｐ１７；Ｆ−１２；ＡｍＭＳ ２５７；ＰＲＡ２５；６１３３Ｄ０２；６５１９Ｅ０１；Ｎｌ；ＳＣ１５２０８；ＢＮＬ−ＷＶＣ；ＮＣＴＣ ２５８３［ＮＣＩＢ ８１９４］；Ｈ１３；１０１３［ＡＴＣＣ １１２５１；ＣＣＥＢ ２９５］；ＩＦＯ ３９０３；１０６２；又はＰｆ−５。
他の適切な宿主は、前記参考文献の他の項に分類されているもの、例えばグラム陽性プロテオバクテリアを含む。１つの実施形態では、宿主細胞は大腸菌である。大腸菌についてのゲノム配列は、大腸菌ＭＧ１６５５に関して確立されており (Blattner, et al. (1997) The complete genome sequence of Escherichia coli K-12 Science 277(5331): 1453-74)、大腸菌Ｋ１２についてのＤＮＡマイクロアレイは（ＭＷＧ Ｉｎｃ，Ｈｉｇｈ Ｐｏｉｎｔ，ＮＣ）が市販されている。大腸菌は、富化培地、例えばルリア−エルタニ（ＬＢ）（１０ｇ／Ｌ トリプトン、５ｇ／Ｌ ＮａＣｌ、５ｇ／Ｌ 酵母抽出物）又は規定最小培地、例えば１％グルコースのような適切な炭素源を添加したＭ９（６ｇ／Ｌ Ｎａ2ＨＰＯ4、３ｇ／Ｌ ＫＨ2ＰＯ4、１ｇ／Ｌ ＮＨ4Ｃｌ、０．５ｇ／Ｌ ＮａＣｌ、ｐＨ７．４）のいずれかで培養することができる。常套的には、大腸菌細胞の一晩培養物を希釈し、振とうフラスコ又は発酵槽のいずれかにおいて新鮮富化又は最小培地に接種して、３７℃で増殖させる。
宿主はまた、哺乳動物起源、例えばヒト又は非ヒト哺乳動物を含む哺乳動物に由来する細胞であり得る。哺乳動物は、霊長動物、サル、ブタ、ヒツジ、ウシ、げっ歯動物、有蹄動物、ブタ、ヒツジ、子ヒツジ、ヤギ、ウシ、シカ、ラバ、ウマ、サル、類人猿、イヌ、ラット及びマウスを含むが、これらに限定されない。
宿主細胞はまた、植物起源でもよい。遺伝子及び調節配列の特定のためにいかなる植物も選択することができる。遺伝子及び調節配列の単離のための適切な植物標的の例は、アルファルファ、リンゴ、アプリコット、シロイヌナズナ、アーティチョーク、ルッコラ、アスパラガス、アボカド、バナナ、オオムギ、マメ、ビート、ブラックベリー、ブルーベリー、ブロッコリー、芽キャベツ、キャベツ、カノーラ、マスクメロン、ニンジン、カッサバ、トウゴマ、カリフラワー、セロリ、サクランボ、チコリ、コリアンダー、柑橘類、クレメンタイン、クローバー、ココナツ、コーヒー、トウモロコシ、綿、クランベリー、キュウリ、ダグラスモミ、ナス、エンダイブ、キクヂシャ、ユーカリ、ウイキョウ、イチジク、ニンニク、ウリ、ブドウ、グレープフルーツ、ハネデューメロン、葛芋、キウイフルーツ、レタス、リーキ、レモン、ライム、テーダマツ、アマニ、マンゴー、メロン、マッシュルーム、ネクタリン、木の実、カラスムギ、油ヤシ、アブラナ、オクラ、オリーブ、タマネギ、オレンジ、観賞植物、ヤシ、パパイヤ、パセリ、アメリカボウフウ、エンドウマメ、モモ、落花生、洋ナシ、コショウ、カキ、マツ、パイナップル、オオバコ、プラム、ザクロ、ポプラ、ジャガイモ、カボチャ、マルメロ、ラジアタマツ、ｒａｄｉｓｃｃｈｉｏ、ラディッシュ、ナタネ、ラズベリー、イネ、ライ麦、ソルガム、サザンパイン、ダイズ、ホウレンソウ、スカッシュ、イチゴ、テンサイ、サトウキビ、ヒマワリ、サツマイモ、モミジバフウ、タンジェリン、茶、タバコ、トマト、ライコムギ、芝、カブ、ブドウの木、スイカ、コムギ、山芋及びズッキーニを含むが、これらに限定されない。一部の実施形態では、本発明の方法において有用な植物は、シロイヌナズナ、トウモロコシ、コムギ、ダイズ及び綿である。
組換えタンパク質又はペプチドの発現のため、又は特定された補償遺伝子の調節のために、いかなる植物プロモーターも使用できる。プロモーターは、植物ＲＮＡポリメラーゼＩＩプロモーターであり得る。植物プロモーターに含まれるエレメントは、典型的には転写開始部位の約２５−３５塩基対上流に位置する、ＴＡＴＡボックス又はゴールドバーグ・ホグネスボックス、及び７０−１００塩基対上流に位置するＣＣＡＡＴボックスであり得る。植物では、ＣＣＡＡＴボックスは、哺乳動物プロモーターの機能的類似配列とは異なるコンセンサス配列を有し得る(Messing et al., In: Genetic Engineering of Plants, Kosuge et al., eds., pp. 211-227, 1983)。加えて、実質的に全てのプロモーターが、転写開始部位の約−１００ｂｐから−１０００ｂｐ又はそれ以上の上流に及ぶ、付加的な上流活性化配列又はエンハンサーを含む(Benoist and Chambon, Nature 290:304-310, 1981; Grass et al., Proc. Nat. Acad. Sci. USA 78:943-947, 1981; and Khoury and Grass, Cell 27:313-314, 1983)。
組換えタンパク質又はペプチドの発現
以下で述べるように、宿主細胞又は生物は、標準手法を用いて組換えタンパク質又はペプチドを発現するように工作することができる。例えば組換えタンパク質は、宿主のゲノムに挿入したベクターから又は外来性遺伝子から発現することができる。外来性タンパク質を発現するために使用できるベクターは当技術分野において周知であり、以下で述べる。組換えタンパク質又はペプチドを発現するための遺伝子はまた、以下で述べるように、相同的又は非相同的組換えなどの手法を用いてゲノムに挿入することができる。
組換えタンパク質又はペプチドは、化合物による誘導後又は外来性遺伝子又は遺伝子産物の発現時に発現され得る。組換えタンパク質はまた、宿主細胞を特定環境に置いたときにも発現され得る。詳細なプロモーターエレメントを以下で述べる。これらは、化学物質、例えばＩＰＴＧ、安息香酸塩又はアントラニル酸塩で細胞を処理したときに誘導され得るプロモーターを含むが、これらに限定されない。
組換えタンパク質／ペプチド
宿主細胞は、組換えタンパク質又はペプチドを発現するように設計されてきた。これらはいかなる種及びいかなる大きさでもあり得る。しかし、ある実施形態では、組換えタンパク質又はペプチドは、治療上有用なタンパク質又はペプチドである。一部の実施形態では、タンパク質は、哺乳動物タンパク質、例えばヒトタンパク質であり得、例えば増殖因子、サイトカイン、ケモカイン又は血液タンパク質であり得る。組換えタンパク質又はペプチドは、主として宿主細胞において不活性形態で発現され得る。ある実施形態では、組換えタンパク質又はペプチドは、１００ｋＤ未満、５０ｋＤ未満又は３０ｋＤ未満の大きさである。ある実施形態では、組換えタンパク質又はペプチドは、少なくとも５、１０、１５、２０、３０、４０、５０又は１００アミノ酸のペプチドである。
大腸菌における組換えタンパク質生産を可能にする発現ベクターが存在する。これらのタンパク質発現系全てに関して、先に記述されているような常套的クローニング手法に従うことができる(Sambrook, et al. (2000) Molecular cloning: A laboratory manual, third edition Cold Spring Harbor, New York, Cold Spring Harbor Laboratory Press)。
Ｃｈａｍｐｉｏｎ（商標）ｐＥＴ発現系は高レベルのタンパク質生産を提供する。発現は、強力なＴ７ｌａｃプロモーターから誘導される。この系は、対象遺伝子の高レベル転写のためにバクテリオファージＴ７ ＲＮＡポリメラーゼの高い活性と特異性を利用する。プロモーター領域内に位置するｌａｃオペレーターは、伝統的なＴ７に基づくベクターよりも厳密な調節を提供し、プラスミドの安定性と細胞の生存率を改善する(Studier, F. W. and B. A. Moffatt (1986) Use of bacteriophage T7 RNA polymerase to direct selective high-level expression of cloned genes Journal of Molecular Biology 189(1): 113-30; Rosenberg, et al. (1987) Vectors for selective expression of cloned DNAs by T7 RNA polymerase Gene 56(1): 125-35)。Ｔ７発現系は、対象遺伝子の高レベル転写のためにＴ７プロモーターとＴ７ ＲＮＡポリメラーゼ（Ｔ７ ＲＮＡＰ）を使用する。Ｔ７ ＲＮＡＰは天然大腸菌ＲＮＡＰよりもプロセシング能力が高く、対象遺伝子の転写専用であるので、Ｔ７発現系における高レベル発現が達成される。特定された遺伝子の発現は、宿主細胞においてＴ７ ＲＮＡＰのソースを提供することによって誘導される。これは、Ｔ７ ＲＮＡＰ遺伝子の染色体コピーを含むＢＬ２１大腸菌宿主を使用することによって達成される。Ｔ７ ＲＮＡＰ遺伝子は、ＩＰＴＧによって誘導され得るｌａｃＵＶ５プロモーターの制御下にある。誘導時にＴ７ ＲＮＡＰが発現されて、対象遺伝子を転写する。
ｐＢＡＤ発現系は、特定炭素源、例えばグルコース、グリセロール及びアラビノースの存在を通して組換えタンパク質の厳密に制御された、測定可能な発現を可能にする(Guzman, et al. (1995) Tight regulation, modulation, and high-level expression by vectors containing the arabinose PBAD promote" Journal of Bacteriology 177(14): 4121- 30)。ｐＢＡＤベクターは、発現レベルの正確な調節を与えるように独自に設計される。ｐＢＡＤベクターからの異種遺伝子発現はａｒａＢＡＤプロモーターで開始される。前記プロモーターは、ａｒａＣ遺伝子の産物によって正と負の両方に調節される。ＡｒａＣは、Ｌ−アラビノースと複合体を形成する転写調節剤である。Ｌ−アラビノース不在下では、ＡｒａＣ二量体は転写をブロックする。最大転写活性化のためには２つの事象が必要である；（ｉ）Ｌ−アラビノースがＡｒａＣに結合して転写の開始を可能にする、（ｉｉ）ｃＡＭＰ活性化因子タンパク質（ＣＡＰ）−ｃＡＭＰ複合体がＤＮＡに結合して、ＡｒａＣのプロモーター領域の正しい位置への結合を刺激する。
ｔｒｃ発現系は、ｔｒｃプロモーターからの大腸菌における高レベルの調節された発現を可能にする。ｔｒｃ発現ベクターは、大腸菌における真核細胞遺伝子の発現のために最適化された。ｔｒｃプロモーターは、トリプトファン（ｔｒｐ）及びラクトース（ｌａｃ）プロモーターに由来する強力なハイブリッドプロモーターである。ｌａｃＯオペレーター及びｌａｃＩQ遺伝子の産物によって調節される(Brosius, J. (1984) Toxicity of an overproduced foreign gene product in Escherichia coli and its use in plasmid vectors for the selection of transcription terminators Gene 27(2): 161-72)。
本発明はまた、特許請求する方法によって生産される改善された組換え宿主細胞を含む。１つの実施形態では、本発明は、記述する方法によって生産される細胞を含む。もう１つの実施形態では、本発明は、少なくとも２つのプロテアーゼの発現を低下させるように遺伝的に修飾された組換えタンパク質を発現する宿主細胞又は生物を含む。他の実施形態では、本発明は、ｈｓｌＶ、ｈｓｌＵ、ｃｌｐＸ、ｃｌｐＡ及びｃｌｐＢ遺伝子の産物から成る群より選択される少なくとも１つのプロテアーゼの発現を低下させるように遺伝的に修飾された組換えタンパク質を発現する宿主細胞又は生物を含み、ある小実施形態では、細胞又は生物は、ＨｓｌＶ又はＨｓｌＵの発現を低下させるように修飾されている。ある実施形態では、修飾された宿主細胞又は生物は、組換え哺乳動物由来タンパク質を発現し、ヒト成長ホルモンであり得る、組換えヒト由来タンパク質を発現し得る。細胞は、当技術分野で公知の何らかの手法によって、例えば少なくとも１個のプロテアーゼ遺伝子をゲノムからノックアウトする手法によって、又はプロテアーゼの発現を低下させるように少なくとも１個のプロテアーゼ遺伝子を突然変異させることによって、又はプロテアーゼの発現を低下させるように少なくとも１個のプロテアーゼ遺伝子の少なくとも１個のプロモーターを変化させることによって、修飾することができる。
もう１つの実施形態では、少なくとも１個、少なくとも２個のフォールディング調節剤、又は少なくとも３個のフォールディング調節剤の発現を上昇させるように遺伝的に修飾された組換えタンパク質を発現する宿主又は生物が提供される。ある小実施形態では、フォールディング調節剤はフォールディング調節剤サブユニットではない。フォールディング調節剤は、ｃｂｐＡ、ｈｔｐＧ、ｄｎａＫ、ｄｎａＪ、ｆｋｂＰ２、ｇｒｏＥＳ及びｇｒｏＥＬ遺伝子の産物から成る群より選択でき、ある小実施形態では、ｈｔｐＧ又はｃｂｐＡであり得る。宿主細胞又は生物は、非限定的な例では、哺乳動物タンパク質、例えばヒトタンパク質を発現する。前記タンパク質はヒト成長ホルモンであり得る。フォールディング調節剤は、例えばここで述べる発現ベクターを細胞に含めることによって、上昇させ得る。フォールディング調節剤発現はまた、例えばフォールディング調節剤又はフォールディング調節剤サブユニットのプロモーターを突然変異させることによって上昇させ得る。組換えタンパク質を発現する宿主細胞又は生物はまた、少なくとも１個のフォールディング調節剤の発現を上昇させ、少なくとも１個のプロテアーゼ又はプロテアーゼタンパク質の発現を低下させるように遺伝的に修飾することができる。ここで述べる方法によって生産される１又はそれ以上の細胞を含む生物も、本発明に包含される。
工程ＩＩ：組換え細胞においてより高レベルで発現される補償遺伝子又は遺伝子産物を特定するために遺伝的プロフィールを分析すること
本発明の方法は、組換えタンパク質を発現するように修飾されていない宿主細胞又は組換えタンパク質を発現しない組換え細胞よりも高いレベルで組換え細胞において発現される補償遺伝子又は遺伝子産物を特定するために、組換え細胞の遺伝的プロフィールを分析することを含む。
ここで使用する「遺伝的プロフィール」は、ゲノム内の遺伝子、ゲノム内の遺伝子から転写されたｍＲＮＡ又はゲノム内の遺伝子から転写されたｍＲＮＡに由来するｃＤＮＡを含み得る。遺伝的プロフィールはまた、細胞によって修飾された転写産物、例えば真核細胞系における遺伝子のスプライシング変異体、又は細胞によって修飾される又はゲノムから翻訳されたｍＲＮＡのスプライシング変異体から翻訳されるタンパク質を含む、ゲノム内の遺伝子から翻訳されるタンパク質を含み得る。遺伝的プロフィールは、もっぱら、複数同時ブロット分析又はパッキングに結合した多数の結合パートナーに関するカラムクロマトグラフィーを含む、アレイ又は他の多重システムにおけるような、複数の実体の同時分析を指すことが意図されている。本発明によれば、少なくとも５、１０、２５、５０、７０、８０、９０又は１００又はそれ以上の遺伝子又は遺伝子産物が同時に分析される。
トランスクリプトーム
１つの実施形態では、分析する遺伝的プロフィールはトランスクリプトームプロフィールである。完全なトランスクリプトームとは、一度にゲノムによって生産されるｍＲＮＡ転写産物の完全なセットを指す。ゲノムと異なり、トランスクリプトームは動的であり、遺伝子発現の異なるパターンの故に異なる状況においてはかなり変化する。トランスクリプトームの研究であるトランスクリプトミクスは、遺伝子発現パターンを特定する包括的な手段である。分析するトランスクリプトームは、転写される遺伝子の公知の完全なセット、すなわち宿主細胞又は宿主生物のｍＲＮＡ含量又は対応するｃＤＮＡを含み得る。ｃＤＮＡは、ヌクレオチドの鎖、単離ポリヌクレオチド、ヌクレオチド、核酸分子、又は組換え又は合成によって創出される何らかのフラグメント又はその相補物であり得、二本鎖又は一本鎖、コード及び／又は非コードであり得、ゲノムＤＮＡ分子のエクソン又はイントロンであり得、炭水化物、脂質、タンパク質又は無機元素又は物質と結合し得る。ヌクレオチド鎖は、少なくとも５、１０、１５、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０又は１００ヌクレオチドの長さであり得る。トランスクリプトームはまた、遺伝子転写産物の公知のセットの一部だけを含み得る。例えばトランスクリプトームは、宿主における公知の転写産物の９８％、９５、９０、８５、８０、７０、６０又は５０％未満を含み得る。トランスクリプトームはまた、遺伝子の特定セットを標的することができる。
１つの実施形態では、スクリーニング方法は、遺伝的プロフィールを特定するためにアレイ又はマイクロアレイを使用するスクリーニングを含み得る。もう１つの実施形態では、トランスクリプトームプロフィールは、公知の方法、例えばブロットアッセイにおけるハイブリダイゼーション、例えばノーザンブロット法におけるハイブリダイゼーションを使用することによって分析できる。もう１つの実施形態では、前記方法は、ＰＣＲに基づく方法、例えば特定セットの遺伝子の発現を定量することができるＲＴ−ＰＣＲを含み得る。本発明の１つの実施形態では、特定される遺伝子、例えばフォールディング調節剤タンパク質（ＦＭ）又はプロテアーゼタンパク質、すなわちプロテアーゼ、ペプチダーゼ又は関連ポリペプチド又は補因子を、高流量スクリーニング工程によって特定する。
前記方法は、マイクロアレイ又は等価手法を用いてトランスクリプトームプロフィールを分析することを含み得る。この実施形態では、マイクロアレイは、宿主細胞の転写ゲノムの少なくとも一部を含むことができ、典型的には生物の転写遺伝子の少なくとも５０％の遺伝子からの試料に対する結合パートナーを含む。より典型的には、マイクロアレイ又は等価手法は、宿主細胞のゲノム内の転写遺伝子の少なくとも８０％、９０％、９５％、９８％、９９％又は１００％からの試料についての結合パートナーを含む。しかし、別の実施形態では、マイクロアレイは、推定上のプロテアーゼ遺伝子又は推定上のフォールディング調節剤遺伝子を含むがこれらに限定差ない、ゲノムからの遺伝子の選択サブセットに対する結合パートナーを含み得る。マイクロアレイ又は等価手法はまた、典型的には対照として使用される遺伝子、例えばハウスキーパー遺伝子のセットに対する結合パートナーを含み得る。マイクロアレイ又は等価手法はまた、群にクラスター化された遺伝子、例えば分解性タンパク質、フォールディング調節剤及び補因子、代謝性タンパク質、例えばグルコース代謝又はアミノ酸又はヌクレオ塩基合成に関与するタンパク質、転写因子、核酸安定化因子、細胞外シグナル調節遺伝子、例えばキナーゼ及び受容体又は骨格タンパク質をコードする遺伝子を含み得る。
マイクロアレイは一般に、ポリヌクレオチド、アプタマー、化学物質、抗体又は他のタンパク質又はペプチドを含み得る、多数の別個の結合パートナーを、規定されたパターンで固体支持体、例えばマイクロチップ、スライドガラス等に連結することによって形成される。マイクロアレイを対象細胞から得た試料と接触させ、チップ上の配列にハイブリダイズする、細胞において発現される結合パートナーの結合を検出することにより、ハイブリダイズするポリヌクレオチドによって形成されるパターンは、細胞において発現される遺伝子又は遺伝子のクラスターの特定を可能にする。さらに、固体支持体に結合した各々の成員が公知である場合は、核酸試料からのハイブリダイズパートナーの同一性を特定することができる。マイクロアレイテクノロジーの１つの長所は、単にハイブリダイゼーションのパターンを比較することによって識別的な遺伝子発現の特定を可能にすることである。
高流量スクリーニング方法の例は、ハイブリダイズ可能なアレイ又はマイクロアレイへの、宿主細胞のｍＲＮＡ又は実質的に対応するｃＤＮＡのハイブリダイゼーションを含む。アレイ又はマイクロアレイは、核酸又は核酸類似体オリゴマー又はポリマーの１又はそれ以上のアレイであり得る。１つの実施形態では、アレイ又はマイクロアレイは、独立して又は集合的に、そのヌクレオチド配列が、宿主細胞菌株においてＦＭをコードすることが公知であるか又はＦＭをコードすると予測される全ての遺伝子又は宿主細胞菌株においてプロテアーゼをコードすることが公知であるか又はプロテアーゼをコードすると予測される全ての遺伝子の代表的部分にハイブリダイズし得る、核酸又は核酸類似体オリゴマー又はポリマーの個体群を含む、宿主細胞ゲノム全域（host-cell-genome-wide）のアレイ又はマイクロアレイである。ゲノム全域のマイクロアレイは、宿主のｍＲＮＡ又は対応するｃＤＮＡからのような、公知の又は予測上のオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）配列全部の代表的部分に結合する配列を含む。
アレイ内のオリゴヌクレオチド配列又は類似体は、典型的には宿主細胞からのｍＲＮＡ又は対応するｃＤＮＡ配列にハイブリダイズし、典型的には宿主のｍＲＮＡ又はｃＤＮＡ配列の少なくとも一部に相補的なヌクレオチド配列又は宿主のｍＲＮＡ又はｃＤＮＡ配列に相同な配列を含む。相補的配列を有する一本鎖ＤＮＡは、互いに対合して、二本鎖分子を形成することができる。マイクロアレイは一般に、ハイブリダイゼーション原理を高度に平行な様式で適用する。特定された１個の代わりに、数千の異なる潜在的特定物を微小な固体支持体上に整列することができる。ユニークな標識ＤＮＡプローブの代わりに、特定細胞型又は組織のＲＮＡから作製された、標識ＤＮＡ分子の複雑な混合物を使用する。この複雑なプローブ中の個々の標識ＤＮＡ分子の存在率は、典型的には対応する遺伝子の発現レベルを反映する。単純化した方法では、アレイにハイブリダイズしたとき、豊富な配列は強力なシグナルを生成し、まれな配列は弱いシグナルを生成する。シグナルの強さは、もとの試料における遺伝子発現のレベルを表わすことができる。
１つの実施形態では、ゲノム全域アレイ又はマイクロアレイを使用する。１つの実施形態では、アレイは、宿主のゲノム内のオープンリーディングフレームの５０％より多く、又はゲノム内の公知のオープンリーディングフレームの５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％より多くを提示する。アレイはまた、宿主細胞内のタンパク質をコードすることが知られる配列の少なくとも５０％の少なくとも一部を提示することができる。別の実施形態では、アレイは、宿主細胞の遺伝子又は推定上の遺伝子の５０％以上、公知の遺伝子又は推定上の遺伝子の５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％より多くを提示する。１つの実施形態では、各々の遺伝子又は推定上の遺伝子の配列又はオープンリーディングフレームについて２個以上のオリゴヌクレオチド又は類似体を使用することができる。１つの実施形態では、これらの複数のオリゴヌクレオチド又は類似体は、公知の遺伝子又は推定上の遺伝子の配列の種々の部分を表わす。各々の遺伝子又は推定上の遺伝子の配列に関して、約１−約１００００又は１−約１００又は１−約５０、４５、４０、３５、３０、２５、２０、１５、１０又はそれ以下のオリゴヌクレオチド又は類似体をアレイ上に提示することができる。
マイクロアレイ又は完全なゲノム全域アレイ又はマイクロアレイは、宿主細胞ゲノムの配列又はゲノム内の提案されるコード配列の知識に基づき、あるいは宿主細胞又は宿主生物において発現されるｍＲＮＡ配列の知識に基づき、当技術分野で公知の何らかの方法に従って作製し得る。
様々な種類の宿主細胞に関して、同じタイプのマイクロアレイを適用することができる。マイクロアレイの種類は、相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）マイクロアレイ(Schena, M. et al. (1995) Quantitative monitoring of gene expression patterns with a complementary DNA microarray. Science 270:467-70)及びオリゴヌクレオチドマイクロアレイ (Lockhart, et al. (1996) Expression monitoring by hybridization to high-density oligonucleotide arrays. Nat Biotechnol 14:1675-80)を含む。ｃＤＮＡマイクロアレイについては、オープンリーディングフレームの部分又は全体のＤＮＡフラグメントがスライドにプリントされる。分子の異なる部分は異なる位置にプリントされ得るので、ハイブリダイゼーション特性はスライド全体にわたって異なり得る。オリゴヌクレオチドアレイについては、２０−８０マーオリゴをインサイチューで（チップ上で）又は従来の合成とそれに続くチップ上固定化によって合成することができるが、一般に全てのプローブはハイブリダイゼーション温度及び結合親和性に関して同様に設計される(Butte, A. (2002) The use and analysis of microarray data. Nat Rev Drug Discov 1:951-60)。
トランスクリプトームプロフィールを分析するとき、核酸又は核酸類似体オリゴマー又はポリマーは、ＲＮＡ、ＤＮＡ、あるいはＲＮＡ又はＤＮＡの類似体であり得る。そのような核酸類似体は当技術分野において公知であり、例えば以下のものを含む：ペプチド核酸（ＰＮＡ）；アラビノース核酸；アルトリトール核酸；架橋核酸（ＢＮＡ）、例えば２’−Ｏ，４’−Ｃ−エチレン架橋核酸及び２’−Ｏ，４’−Ｃ−メチレン架橋核酸；シクロヘキセニル核酸；２’，５’−結合ヌクレオチドに基づく核酸；モルホリノ核酸（例えばホスホロジアミデート結合によって連結されたヌクレオ塩基置換モルホリノ単位）；骨格置換核酸類似体、例えばオリゴ糖又は多糖型核酸又は類似体の２’炭素原子の少なくとも１個が、独立して、例えばハロ、チオ、アミノ、脂肪族、オキシ脂肪族、チオ脂肪族又はアミノ脂肪族基（脂肪族は、典型的にはＣ1−Ｃ10脂肪族である）のいずれか１つで置換されている、２’置換核酸。
アレイ内のオリゴヌクレオチド又はオリゴヌクレオチド類似体は、均一な大きさであり得、１つの実施形態では、約１０−約１０００ヌクレオチド、約２０−約１０００、２０−約５００、２０−約１００、約２０、約２５、約３０、約４０、約５０、約６０、約７０、約８０、約９０又は約１００ヌクレオチド長であり得る。
オリゴヌクレオチドプローブのアレイは、約１００以上、又は約１，０００以上、又はそれ以上の異なるオリゴヌクレオチドプローブを含む高密度アレイであり得る。そのような高密度アレイは、約６０以上、より一般的には約１００以上、最も一般的には約６００以上、しばしば約１０００以上、より頻繁には約５，０００以上、最も頻繁には約１０，０００以上、典型的には約４０，０００以上、より典型的には約１００，０００以上のプローブ密度を含むことができ、一部の場合にはｃｍ2当り約４００，０００個以上の異なるオリゴヌクレオチドプローブ（異なるオリゴヌクレオチドとは、異なる配列を有するオリゴヌクレオチドを指す）である。オリゴヌクレオチドプローブは、約５−約５００、又は約５−５０、又は約５−約４５ヌクレオチド、又は約１０−約４０ヌクレオチド、最も典型的には約１５−約４０ヌクレオチドの長さにわたる。特定アレイは、約２０−約２５オリゴヌクレオチドの長さにわたるプローブを含む。アレイは、各々の特定される遺伝子に特異的な１０以上、又は５０以上、又は１００以上、典型的には１０００以上のオリゴヌクレオチドプローブを含み得る。１つの実施形態では、アレイは、各々の遺伝子について少なくとも１０個の異なるオリゴヌクレオチドプローブを含む。もう１つの実施形態では、アレイは、各々の遺伝子に相補的な２０又はそれ以下のオリゴヌクレオチドを有する。平面のアレイ表面が典型的であるが、アレイは、実質的にいかなる形状の表面でも、さらには多数の表面上でも作製し得る。
アレイは、ミスマッチ対照プローブをさらに含み得る。そのようなミスマッチ対照が存在する場合、定量工程は、オリゴヌクレオチドプローブの各々とその対応するミスマッチ対照プローブの間のハイブリダイゼーションシグナルの強度の差を算定することを含み得る。定量は、各々の遺伝子に関してオリゴヌクレオチドプローブの各々とその対応するミスマッチ対照プローブの間のハイブリダイゼーションシグナルの強度の差の平均を算定することをさらに含み得る。
一部のアッセイ形式では、オリゴヌクレオチドプローブは、例えば共有結合によって、固体支持体に固定され得る。オリゴヌクレオチドアレイは、平行固定化ポリマー合成法によって又は例えはスライドガラスなどのポリ−Ｌ−リシン基質上での、光指向ポリマー合成法によって化学合成することができる。化学合成されたアレイは、プローブの作製がクローニング、核酸増幅工程又は酵素合成を必要としないという点で好都合である。前記アレイは、各々が、その発現を検出すべき遺伝子（又はｍＲＮＡ又は対応するアンチセンスｃＲＮＡ）の１個のサブ配列に相補的な配列を有する、オリゴヌクレオチドプローブである試験プローブを含む。加えて、アレイは、ここで述べるような基準化対照、ミスマッチ対照及び発現レベル対照を含み得る。
アレイは、ゲノム内の公知の遺伝子につき１個のハイブリダイズオリゴヌクレオチドを含むように設計し得る。オリゴヌクレオチド又は等価結合パートナーは、エポキシ被覆スライドへの共有結合を支持するように５’アミノ修飾することができる。オリゴヌクレオチドは、例えばオリゴヌクレオチド間の配列同一性を２５％未満に低下させることによって、クロスハイブリダイゼーションを低減するように設計することができる。一般に、一貫したＧＣ含量とＴｍを保証するためにアレイの設計前にオリゴヌクレオチドの融解温度を分析し、オリゴヌクレオチド結合パートナーの二次構造を最適化する。トランスクリプトームプロファイリングに関しては、二次構造は、典型的には最小化される。１つの実施形態では、精度を高めるために各々のオリゴヌクレオチドをスライド上の少なくとも２つの異なる位置にプリントする。対照オリゴヌクレオチドも、バックグラウンド結合を示すために宿主細胞又は生物とは異なる種からの配列に基づいて設計することができる。
遺伝的プロフィールにおける試料は、個別に分析するか又はクラスターに分類することができる。クラスターは、典型的には遺伝子発現の類似度によって分類することができる。１つの実施形態では、クラスターは、宿主細胞において類似の程度に調節される遺伝子として個々に分類し得る。クラスターはまた、組換え宿主細胞において類似の程度に調節される遺伝子の群、例えば宿主細胞あるいは修飾又は非修飾細胞と比較して類似の程度に上方調節又は下方調節される遺伝子の群を含み得る。クラスターはまた、遺伝子又はタンパク質の構造、機能によって、又はトランスクリプトームアレイの場合は、宿主のゲノム内の遺伝子に対する結合パートナーの位置又は分類によって、関連する群を含み得る。分析する結合パートナーの群あるいは遺伝子又はタンパク質の群は、推定上又は公知のプロテアーゼ、プロテアーゼ又はプロテアーゼ様タンパク質の補因子；フォールディング調節剤、フォールディング調節剤の補因子又はタンパク質の折りたたみ又は溶解度を改善し得るタンパク質；転写因子；核酸の安定性又は翻訳開始に関与するタンパク質；キナーゼ；細胞外又は細胞内受容体；代謝酵素；代謝補因子；エンベロープタンパク質；σ因子；膜結合タンパク質；膜貫通タンパク質；膜関連タンパク質及びハウスキーピング遺伝子、をコードする遺伝子から選択される遺伝子を含み得るが、これらに限定されない。
プロテオーム
もう１つの実施形態では、分析する遺伝的プロフィールはプロテオームプロフィールである。宿主のプロテオームは、一度にゲノムによって生産されるタンパク質の完全なセットである。プロテオームは、各々のタンパク質が合成後に化学修飾され得るので、一般にゲノム又はトランスクリプトームよりもはるかに複雑である。多くのタンパク質は、宿主細胞に依存して、生産の間に切断されたり、リン酸化、アセチル化、メチル化されたり、又はそれらに付加された炭水化物基を有する。プロテオームはまた、非常に動的である。プロテオームの研究であるプロテオミクスは、タンパク質構造、タンパク質発現及び機能の数多くの異なる態様をカバーし得る。プロテオーム分析のための手法は、トランスクリプトミクスにおいて使用されるものほど直接的ではない。しかし、プロテオミクスの利点は、細胞の機能的分子が検討されることである。
本発明の方法は、タンパク質の発現レベル、タンパク質−タンパク質相互作用、タンパク質−低分子相互作用又は酵素活性を測定する手法を含み得る。１つの実施形態では、プロテオームは、ある種のタンパク質の大きさの測定を含むスクリーニング方法を使用して、典型的には質量分析法を用いて分析される。１つの実施形態では、プロテオームプロフィールを分析するための手法は、対象タンパク質への抗体のハイブリダイゼーションを含む。例えば前記方法は、当技術分野で公知のウエスタンブロット法を含み得るか又はカラムクロマトグラフィーを含み得る。方法はまた、標準方法、例えば当技術分野で公知のＥｌｉｓａスクリーニングを含み得る。方法はまた、アプタマーであり得るか、又はプロテオーム内のタンパク質あるいはタンパク質又はペプチドフラグメントについての化学結合パートナーであり得る、核酸修飾結合パートナーの結合を含むことができ、スクリーニング工程は核酸の増幅を含み得る。方法はまた、プロテオーム内のタンパク質又はタンパク質のフラグメントに結合する化合物を含むことができ、その工程は化学的手段による結合の測定を含み得る。前記測定はまた、化学反応における反応産物の測定又は発蛍光団の活性化による測定を含み得る。分離ツール、例えば二次元ゲル電気泳動又は多次元液体クロマトグラフィーと組み合わせた質量分析のような手法も、前記方法において使用することができる。典型的には、本発明の方法は高流量スクリーニング手法を含む。
本発明の方法は、例えば二次元電気泳動を用いてプロテオームプロフィールを分析することを含み得る。これは、互いに直角に方向付けた二次元の移動による試料中のタンパク質の分離と特定のための方法である。これは、試料をより広い領域にわたって分離することを可能にし、各々の成分の分離度を上昇させる。一次元目は、典型的には特定分子の電荷に基づき、二次元目は分子の大きさに基づき得る。一次元目には、タンパク質は、固定化ｐＨ勾配電気泳動（ＩＰＧＥ）、等電点電気泳動（ＩＥＦ）又は非平衡ｐＨ勾配電気泳動を用いてそれらの等電点に従って分離される。温度及び尿素濃度の標準条件下では、タンパク質の大部分の観察される等電点は、タンパク質のアミノ酸組成から算定される予測等電点に極めて近似する。一般に、宿主試料の調製後の最初の工程は、等電点電気泳動として知られる方法である、ｐＨ勾配に対して試料を泳動させることを含む。ｐＨ勾配は、アクリルアミドゲルに両性電解質を添加することによって生成され得る。これらは、一連のｐＨ値を有する両性種の混合物である。ｐＨ勾配はまた、両性電解質に類似するが、ポリアクリルアミドゲル内に固定化されている、インモビリンを添加することによっても生成でき、前焦点化する必要のない固定化ｐＨ勾配を生じる。
二次元電気泳動の二次元目は、タンパク質の大きさによる分離であり得る。ドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミド電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）を用いて、タンパク質をそれらのおおよその分子量に従って分離し得る。その手法は広く使用されており、当技術分野において公知である。基本概念は、試料中の全てのタンパク質を被覆し、それらを負に荷電させる、界面活性剤（ＳＤＳ）でタンパク質を被覆することである。タンパク質を、次に、ゲル電気泳動に供する。ゲルは、典型的にはアクリルアミドゲルであり、密度の勾配であり得る。ゲル上に位置する電荷は、大きさに基づきゲルを通ってタンパク質を移動させる。二次元電気泳動では、分離されるタンパク質は、生物のプロテオームの少なくとも１０％からのタンパク質を含み得る。より典型的には、宿主細胞のプロテオーム内のタンパク質の少なくとも２０％、３０％、４０％、６０％、８０％又は９０％からのタンパク質が分離され、タンパク質の染色及び／又は質量分析などの手法によって分析される。
本発明の方法はまた、マイクロアレイを用いてプロテオームプロフィールを分析することを含み得る。この実施形態では、マイクロアレイは、適切な増殖条件下で宿主細胞によって発現されるタンパク質の少なくとも一部に対する結合パートナーを含むことができ、典型的には生物のプロテオームの少なくとも５％からのタンパク質に対する結合パートナーを含む。より典型的には、マイクロアレイは、宿主細胞のプロテオーム内のタンパク質の少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、６０％、８０％又は９０％からのタンパク質に対する結合パートナーを含む。結合パートナーは抗体であり得、抗体は抗体フラグメント、例えば一本鎖抗体フラグメントであり得る。結合パートナーはまた、特定タンパク質又はタンパク質の部分に結合する核酸を含む分子である、アプタマーを含み得る。別の実施形態では、マイクロアレイは、例えば推定上のプロテアーゼタンパク質又は推定上のフォールディング調節剤を含む、プロテオームからのタンパク質の選択サブセットについての結合パートナーを含み得る。マイクロアレイはまた、典型的には対照として使用されるタンパク質に対する結合パートナーのセットを含み得る。遺伝的プロフィールは、組換えタンパク質又はペプチドを発現する宿主細胞のタンパク質の、マイクロアレイ上の結合パートナーへの結合を測定することによって分析できる。
最も簡単なタンパク質アレイ様式は、一般に平面支持物質状の規定スポットに結合した数多くのタンパク質捕獲試薬から成る。このアレイを、次に、複雑なタンパク質試料に暴露する。その後、種々のアプローチを用いて個々のスポットへの特定分析物タンパク質の結合を観測することができる。分析物が蛍光染料であらかじめ標識されている場合は、蛍光スキャナーを使用して結合を直接観測できる。しばしば古典的な抗体サンドイッチ型様式が使用され、この様式では、２つのタンパク質結合試薬を同時に同じ抗原に結合させる：１つの抗体は表面上に固定化され、他方は、蛍光標識されるか又は適切な基質が供給されたとき蛍光、発酵又は着色産物を生じることができる酵素に複合される。
モノクローナル抗体又はそれらの抗原結合フラグメントは、現在、それらの高い特異性、親和性及び安定性の故に捕獲試薬のための１つの選択である。それらは、１９７０年代以後様々な古典的単一分析物タンパク質プロファイリングアッセイにおいて、例えば固相酵素免疫検定法（ＥＬＩＳＡ）において使用されてきた。加えて、抗体フラグメントのファージディスプレイライブラリーは、プロテオーム規模での抗体生産のための潜在的可能性を提供する。これらのライブラリーは、免疫に基づく方法で可能であるよりも有意に短い時間枠内で、特定されるタンパク質に対する高親和性結合物質を単離するために使用できる。リボソームディスプレイ及びｍＲＮＡディスプレイは、ライブラリータンパク質を、それらをコードするｍＲＮＡ配列に物理的に結びつけることに基づく、付加的な、完全にインビトロでの方法である。そのような方法は、特定されたタンパク質に対する高親和性結合試薬を選択するために使用され、成功を収めた(Wilson, DS, et al. (2001) The use of mRNA display to select high-affinity protein-binding peptides Proc Natl Acad Sd US A 98:3750-3755)。いくつかのグループは、タンパク質バイオチップのための高親和性タンパク質捕獲試薬を開発するために異なるアプローチをとってきた。例えば、タンパク質に対して高い親和性を有する、インビトロ選択実験（ＳＥＬＥＸ：試験管内人工進化法（systematic evolution of ligands by exponential enrichment）と称される）から生じる一本鎖ＲＮＡ又はＤＮＡ分子である、アプタマーが使用されてきた。アプタマーテクノロジーのさらなる進展がいわゆるフォトアプタマーである。これらの分子は、タンパク質捕獲試薬としてのそれらの有用性を高める付加的な属性を有する。それらは、紫外線によって活性化されたとき、結合特定タンパク質と共有結合架橋を生じさせることができる、光活性化架橋基５’−ブロモデオキシウリジンを担持する(Petach, H & Gold, L (2002) Dimensionality is the issue: use of photoaptamers in protein microarrays Curr Opin Biotechnol 13:309-314)。光架橋事象は、サンドイッチ免疫検定法における二次検出抗体の結合に類似した二次元目の特異性を提供する。
多種多様な表面基質及び結合化学が、タンパク質マイクロアレイへの捕獲試薬の固定化のために評価されてきた。固体支持体にタンパク質を固定化するための１つの方法は、疎水性又はファンデルワールス相互作用、水素結合又は静電力に基づく非共有結合相互作用を基礎とする。静電固定化の例は、ニトロセルロース及びポリリシン又はアミノプロピルシラン被覆スライドなどの物質の使用を含む。タンパク質マイクロアレイはまた、９６穴プレートのプラスチック表面への物理的吸着によって作製された。前記表面へのタンパク質の共有結合の一例がMacBeath and Schreiber によって記述されている(MacBeath, G & Schreiber, SL(2000) Printing proteins as microarrays for high-throughput function determination Science 289:1760-1763)。ストレプトアビジンのビオチンへの非常に高い親和性の故に、ストレプトアビジン表面へのビオチニル化タンパク質の固定化はほとんど共有結合とみなすことができる(Peluso, P et al. (2003) Optimizing antibody immobilization strategies for the construction of protein microarrays Anal Biochem 312:113-124)。さらなる戦略も記述されている (Ruiz-Taylor, LA, et al (2001) X-ray photoelectron spectroscopy and radiometry studies of biotin-derivatized poly(L-lysine)-grafted- poly(ethylene glycol) monolayers on metal oxides (Langmuir) 7313-7322; Ruiz-Taylor, LA et al. (2001) Monolayers of derivatized pory(L-lysine)-grafted poly(ethylene glycol) on metal oxides as a class of biomolecular interfaces Proc Natl Acad Sci U S A 2001, 98:852-857; Espejo A, Bedford MT. (2004) Protein-domain microarrays Processes Mol Biol. 264:173-81; Zhu, H. et al. (2001) Global analysis of protein activities using proteome chips. Science Express)。
遺伝的プロフィールにおける試料は、個別に分析するか又はクラスターに分類することができる。クラスターは、典型的には遺伝子発現の類似度によって分類できる。１つの実施形態では、クラスターは、宿主細胞において類似の程度に調節されるタンパク質として個別に分類し得る。クラスターはまた、組換え宿主細胞において類似の程度に調節されるタンパク質の群、例えば宿主細胞あるいは修飾又は非修飾細胞と比較して類似の程度に上方調節又は下方調節されるタンパク質の群を含み得る。クラスターはまた、タンパク質の構造、機能又はプロセシングによって関連する群を含み得る。アレイにおけるタンパク質結合パートナーの群、又は異なるアッセイにおいて、例えば二次元電気泳動において分析するタンパク質の群は、推定上又は公知のプロテアーゼ、プロテアーゼ又はプロテアーゼ様タンパク質の補因子；フォールディング調節剤、フォールディング調節剤の補因子又はタンパク質の折りたたみ又は溶解度を改善し得るタンパク質；転写因子；核酸の安定性又は翻訳開始に関与するタンパク質；キナーゼ；細胞外又は細胞内受容体；代謝酵素；代謝補因子；エンベロープタンパク質；及びハウスキーピング遺伝子から選択され得るが、これらに限定されない。
メタボローム
プロテオーム分析法は、多くのタンパク質の存在率と分布を同時に測定することを可能にする。しかし、プロテオームへの変化の機能的影響は間接的にしか報告されない。もう１つのアプローチは、これらの低分子又は代謝産物のレベルを測定することである。本発明の方法において分析する遺伝的プロフィールは、それ故、メタボロームプロフィールを含み得る。特定宿主のメタボロームを分析するための方法は、様々な化学的及び物理的性質に従って代謝産物を分離するための、ガスクロマトグラフィー、高圧液体クロマトグラフィー及びキャピラリー電気泳動を含む。その後、質量分析などの方法を用いて分子を特定することができる。
検出／分析
本発明の方法は、組換え細胞においてより高いレベルで発現される補償遺伝子又は遺伝子産物を特定するために遺伝的プロフィールを分析することを含む。一般に、この工程は、多数の遺伝子又は遺伝子産物の発現の観測（例えば発現を検出すること及び／又は定量すること）を含む。発現は一般に、上述したようなトランスクリプトーム、プロテオーム又はメタボロームプロフィールへの宿主細胞遺伝子産物の結合を検出することによって観測される。結合の分析は、組換えタンパク質又はペプチドを発現する組換え宿主細胞とナイーブ宿主細胞又は前記タンパク質又はペプチドを発現しない組換え宿主細胞の間の結合の比較を含み得る。
検出
この工程は、多数の遺伝子又は遺伝子産物の発現の観測（例えば発現を検出すること及び／又は定量すること）を含む。発現は一般に、上述したようなトランスクリプトーム、プロテオーム又はメタボロームプロフィールへの宿主細胞遺伝子産物の結合を検出することによって観測される。典型的には、少なくとも約１０個の遺伝子、又は少なくとも約１００個、又は少なくとも約１０００個、及び／又は少なくとも約１０，０００個の異なる遺伝子を一度に検定することができる。前記方法は、前記遺伝子の１又はそれ以上のＲＮＡ転写産物を含む特定された核酸又はＲＮＡ転写産物に由来する核酸のプールを提供すること；核酸のプールを、表面に固定化されたオリゴヌクレオチドプローブのアレイにハイブリダイズすること、但し、前記アレイは１００個以上の異なるオリゴヌクレオチドを含み、各々の異なるオリゴヌクレオチドは前記表面のあらかじめ定められ領域に位置し、各々の異なるオリゴヌクレオチドは少なくとも１つの共有結合を通して表面に結合しており、オリゴヌクレオチドプローブはＲＮＡ転写産物又はＲＮＡ転写産物に由来する核酸に相補的である；及びアレイ内のハイブリダイズした核酸を定量すること、を含み得る。２つの試料の間の遺伝子産物の発現を観測するための１つの手法の絵画的表示を図１２に示す。
本発明の方法はまた、細胞タンパク質のプールを提供することを含み得る。これらは、洗浄剤又は界面活性剤を使用して；浸透圧溶解を用いて；熱変化、例えば凍結−解凍サイクルを用いて；機械的手段又は圧変化を用いて、細胞を溶解することによって作られる細胞溶解産物から誘導することができる。典型的には、タンパク質の分解を制限するために、ある種のタンパク質、例えばプロテアーゼ、特に非特異的プロテアーゼを阻害する化学物質を、細胞又は細胞系を溶解する工程に含める。加えて、細胞溶解産物は処理の間４℃又はそれ以下に保持され、０℃又はそれ以下あるいは２０℃又はそれ以下に保持することができる。細胞溶解産物は、例えばサイズ排除クロマトグラフィー、イオン交換又は例えばＨＰＬＣを用いたアフィニティーマトリックスクロマトグラフィーによって、さらなるプロセシングの前に分離することができる。
典型的には、特定される遺伝子産物、ｍＲＮＡ、ｃＤＮＡ、タンパク質又は代謝産物は、検出可能なマーカー又はプローブで標識される。マーカー又はプローブは、１又はそれ以上の蛍光分子又は発蛍光団であり得る。これらは、例えばスクリーニングのための検出可能な分子を提供するために逆転写されたｃＤＮＡに組み込まれ得る特定ヌクレオチドに結合した市販の分子、例えばＣｙ３及びＣｙ５であり得る。１つの実施形態では、第一発蛍光団は宿主から試料中に組み込まれ、第二発蛍光団は、組換えタンパク質又はペプチドを発現する宿主から試料に組み込まれる。１つの実施形態では、第一発蛍光団と第二発蛍光団は異なる波長の光を発する。この実施形態では、宿主からの試料の結合と組換えタンパク質を発現する宿主細胞からの試料の結合を同じアッセイにおいて観測することができる。もう１つの実施形態では、発蛍光団を異なる波長の光で励起する。もう１つの実施形態では、第一と第二の発蛍光団は、同じ波長の光で励起されるか又は同じ波長の光を発する。この実施形態では、宿主からの試料と組換えタンパク質を発現する宿主細胞からの試料を、典型的には異なるアッセイにおいて観測する。
前記方法は、特定された核酸又はタンパク質又は化学的代謝産物のハイブリダイゼーションを定量する工程を付加的に含み得る。定量は、１又はそれ以上の遺伝子の転写のレベルの測定を含み得る。典型的には、例えば特定された核酸のプールは、特定された核酸（プレｍＲＮＡ転写産物、ｍＲＮＡ転写産物又はＲＮＡ転写産物に由来する核酸）の濃度がそれらの特定された核酸をコードする遺伝子の発現レベルに比例する定量である。
トランスクリプトーム分析については、ハイブリダイゼーションの前、ハイブリダイゼーションの間又はハイブリダイゼーション後に核酸のプールを標識し得るが、典型的にはハイブリダイゼーションの前に核酸を標識する。蛍光標識が典型的に使用され、しばしば単一発蛍光団であり、蛍光標識を使用する場合は、ハイブリダイズした核酸の定量は、ハイブリダイズした蛍光標識核酸からの蛍光の定量によってであり得る。そのような定量は、アレイの自動操作を可能にする自動化工程を備え得る、及び自動測定記録及びその後の蛍光強度情報の処理のためのデータ獲得システムを備え得る、共焦点レーザースキャナー又は蛍光顕微鏡、例えば共焦点蛍光顕微鏡の使用によって容易となる。そのようなアレイを読み取るための装置は、Ｂｉｏｄｉｓｃｏｖｅｒｙ， Ｉｎｃ．，Ｅｌ Ｓｅｇｕｎｄｏ，Ｃａｌｉｆ．より入手可能な、ＣｌｏｎｅＴｒａｃｋｅｒ（商標）、ＩｍａＧｅｎｅ（商標）、ＧｅｎｅＳｉｇｈｔ（商標）モジュール及びＧｅｎｅＤｉｒｅｃｔｏｒ（商標）データベース、又はＡｆｆｙｍｅｔｒｉｘ，Ｉｎｃ．ｏｆ Ｓａｎｔａ Ｃｌａｒａ，Ｃａｌｉｆ．より入手可能な、ＧｅｎｅＣｈｉｐ（商標）リーダーを含む。１つの実施形態では、ハイブリダイゼーションは低ストリンジェンシー（例えば約２０℃−約５０℃、又は約３０℃−約４０℃、又は約３７℃）で起こる。ハイブリダイゼーションは、所望レベルのハイブリダイゼーション特異性が達成されるまで漸増ストリンジェンシーでのその後の洗浄を含み得る。
ハイブリダイゼーションシグナルの定量は当業者に公知のいかなる手段によってでもあり得る。しかし、１つの実施形態では、定量は共焦点蛍光スキャナーの使用によって達成される。データは、典型的には各々のオリゴヌクレオチドプローブとその対応するミスマッチ対照プローブの間のハイブリダイゼーションシグナル強度の差を算定することによって評価される。典型的には、この差は各々の遺伝子について算定し、評価することができる。一部の分析方法をここで提供する。
適切な細菌ハイブリダイゼーションプローブを作製するための手法が開発されている（例えばChoi et al. (2003) App. Envir. Microbio. 69:4737-4742参照）。例えば細胞は、ＲＮＡ安定化剤、例えばＲＮＡｌａｔｅｒ（Ａｍｂｉｏｎ，Ａｕｓｔｉｎ，ＴＸ）中で保存することができる。ＲＮＡは一般に３段階で精製される：（１）全ＲＮＡの単離、（２）汚染ＤＮＡの除去及び（３）全ＲＮＡの清浄化。全ＲＮＡを単離し、次にランダムな六量体プライマー及び逆転写酵素と混合してｃＤＮＡを作製することができる。典型的には、少なくとも１個の蛍光プローブをｃＤＮＡに組み込む。１つの実施形態では１個の蛍光プローブを組み込み、別の実施形態では２個以上のプローブ、例えば２、３、４、５又はそれ以上の蛍光プローブを同じか又は異なるｃＤＮＡの試料に組み込む。真核生物宿主では、特定される核酸のプールはまた、生物学的試料から単離された全ポリＡ+ｍＲＮＡ、又はＲＮＡの逆転写によって作製されたｃＤＮＡ又は二本鎖ｃＤＮＡ中間体から転写された２番目のｃＤＮＡ又はＲＮＡであり得る。
典型的には、逆転写反応の間に蛍光染料をｃＤＮＡ分子に組み込む。原核生物（細菌）と真核生物（酵母、哺乳動物細胞等）の間ではｍＲＮＡ構造が異なるため、異なるプライマーを使用することができるが、ランダムプライマーはどちらの場合にも使用でき、オリゴ−ｄＴプライマーは、ポリＡ尾部を有する真核生物において使用できる。選択的方法は、シグナル強度を高めるためのアミノ−アリル標識である。この方法は、逆転写反応後に蛍光染料が結合し得る化学反応基を特徴とするヌクレオチド類似体を含む(Manduchi, E. et al. (2002) Comparison of different labeling processes for two-channel high- density microarray experiments. Physiol Genomics 10:169-79)。
特定された核酸のプールは、試料の複雑さを低減し、それによってハイブリダイゼーションで得られるバックグラウンドシグナルを低下させるように処理することができる。「バックグラウンド」又は「バックグラウンドシグナル」という用語は、標識特定核酸とオリゴヌクレオチドアレイの成分（例えばオリゴヌクレオチドプローブ、対照プローブ、アレイ基質等）の間の非特異的結合又は他の相互作用から生じるハイブリダイゼーションシグナルを指す。１つのアプローチでは、生物学的試料に由来するｍＲＮＡのプールを、アレイ内に存在するオリゴヌクレオチドプローブを含むオリゴヌクレオチドのプールとハイブリダイズさせる。ハイブリダイズした核酸のプールを、次に、一本鎖領域を消化するＲＮアーゼＡで処理する。その後、残りの二本鎖ハイブリダイゼーション複合体を変性し、オリゴヌクレオチドプローブを除去して、アレイ内のオリゴヌクレオチドプローブに相補的なｍＲＮＡが強化されたｍＲＮＡのプールを残す。
バックグラウンド低下へのもう１つのアプローチは、生物学的試料に由来するｍＲＮＡのプールを、対合する特定された特異的オリゴヌクレオチドが、アレイ内のオリゴヌクレオチドプローブに相補的なｍＲＮＡのサブ配列に隣接する領域に相補的である、前記の対合する特定された特異的オリゴヌクレオチドとハイブリダイズさせる。ハイブリダイズした核酸のプールを、ハイブリダイズした（二本鎖）核酸配列を消化するＲＮアーゼＨで処理する。その後、対合する特定された特異的オリゴヌクレオチドによって隣接される領域にほぼ等しい長さを有する残りの一本鎖核酸配列を単離し（例えば電気泳動によって）、遺伝子発現を観測するための核酸のプールとして使用する。
バックグラウンド低下への３番目のアプローチは、特定のあらかじめ選択された同定ｍＲＮＡメッセージ（例えば試料において特徴的に過剰発現されるメッセージ）のプールにおける提示を排除又は低減することを含む。この方法は、あらかじめ選択された同定ｍＲＮＡメッセージに相補的なオリゴヌクレオチドプローブを、生物学的試料に由来するポリＡ+ｍＲＮＡのプールにハイブリダイズすることを含む。オリゴヌクレオチドプローブは、それが相補的である特定のあらかじめ選択されたポリＡ+ｍＲＮＡとハイブリダイズする。ハイブリダイズした核酸のプールを、二本鎖（ハイブリダイズした）領域を消化し、それによってメッセージをそのポリＡ+尾部から分離する、ＲＮアーゼＨで処理する。その後、プール中のポリＡ+ｍＲＮＡを単離するか又は増幅すること（例えばオリゴｄＴカラムを使用して）によって、あらかじめ選択された同定ｍＲＮＡメッセージの提示が低下した又は排除されたプールが得られる。
分析
特定される遺伝子は、典型的には組換えタンパク質又はペプチドを発現する宿主細胞の遺伝的プロフィールを、組換えタンパク質又はペプチドを発現しない宿主細胞の遺伝的プロフィールと比較することによって特定される。反復実施形態では、修飾すべき特定遺伝子は、修飾すべき細胞（第二細胞）の遺伝的プロフィールを、それが修飾された細胞（第一細胞）と比較することによって特定される。特定される遺伝子は、第二細胞の遺伝的プロフィールを第一細胞の遺伝的プロフィールと比較すること及び第二細胞において発現が上昇している１又はそれ以上の遺伝子を特定することによって特定される。
ｃＤＮＡマイクロアレイは、２つの試料の間の相対的ｍＲＮＡ存在率を測定する。一連の誘導後時点の試料を、同じ菌株についての誘導前試料と比較することができ（一時的発現プロフィール）、又は誘導後試料を同じ時点の異なる菌株と比較することができる。比較は、コンピュータプログラム、例えばＧｅｎｅＳｉｇｈｔ（商標）を通してであり得る。例えば蛍光標識を用いたマイクロアレイを使用するときは、アレイに結合した各々の試料（例えばＤＮＡ配列）についてスポット強度を測定することができる。次に、スポット強度をバックグラウンドに関して補正し、宿主と組換えタンパク質又はペプチドを発現する宿主からの試料に関して、又は組換えタンパク質又はペプチドを発現する宿主を組換えタンパク質又はペプチドを発現する修飾された宿主と比較して、強度の比を測定することができる。前記比は、特定される遺伝子の特定を可能にする、組換えタンパク質又はペプチドの発現時に又は宿主細胞の修飾時に上方調節される又はその発現が上昇する遺伝子を特定するための測定を提供する。
遺伝子が上方調節されるかどうかを特定するために、標準又は「カットオフ」比を確立する。カットオフ比は、特定アッセイに関連するバックグラウンドノイズの影響を克服するように設計し得る。一般に、測定値の間の１より大きい比率は、上方調節された遺伝子を示すことができる。しかし、アッセイ間の変動は、１より高い比率、例えば１．５、又は２以上、又は２．５以上、又は３以上、又は３．５以上、又は４以上、又は４．５以上、又は５以上、又は６以上、又は７以上、又は８以上、又は９以上、又は１０以上の比率を必要とすることがある。標準は、当技術分野で公知の標準に基づき、工程の前に確立し得るか、又は対照遺伝子又は遺伝子産物、例えばハウスキーパー遺伝子のレベルの比を比較することによって測定の間に確立し得る。
工程ＩＩＩ：組換えタンパク質の発現、活性又は溶解度の上昇を実現する修飾組換え細胞を提供するために、細胞を遺伝的に修飾することによって特定された補償遺伝子又は遺伝子産物の発現を変化させること
特定される補償遺伝子
工程ｉｉ）において特定される補償遺伝子又は遺伝子産物、又はその相同的類似体、補因子又はサブユニットは、１又はそれ以上の特定された遺伝子の発現を上昇させる、低下させる、ノックイン又はノックアウトするように細胞を遺伝的に修飾するための戦略を設計するために使用される。公的データベースにおいて特定される遺伝子配列が、上述した手法によって遺伝子の発現を調節するための戦略を設計する、特にそのための構築物を設計するために使用できる。そのような手法は周知である。
１つの実施形態では、特定される遺伝子は、少なくとも１個の推定上のプロテアーゼ、プロテアーゼ様タンパク質、プロテアーゼの補因子又はサブユニットである。他の実施形態では、特定される遺伝子は、少なくとも１個のフォールディング調節剤、推定上のフォールディング調節剤、フォールディング調節剤の補因子又はサブユニットである。ある実施形態では、特定される遺伝子はプロテアーゼのサブユニットである。１つの実施形態では、特定される遺伝子は、セリン、トレオニン、システイン、アスパラギン酸又はメタロペプチダーゼであり得る。１つの実施形態では、特定される遺伝子は、ｈｓｌＶ、ｈｓｌＵ、ｃｌｐＡ、ｃｌｐＢ及びｃｌｐＸから選択され得る。特定される遺伝子はまた、プロテアーゼの補因子であり得る。もう１つの実施形態では、特定される遺伝子はフォールディング調節剤である。一部実施形態では、特定される遺伝子は、シャペロンタンパク質、フォルダーゼ、ペプチジルプロリルイソメラーゼ及びジスルフィド結合イソメラーゼから選択され得る。一部の実施形態では、特定される遺伝子は、ｈｔｐＧ、ｃｂｐＡ、ｄｎａＪ、ｄｎａＫ及びｆｋｂＰから選択され得る。
細菌遺伝子は、強調機能、例えば所与のアミノ酸の生合成を実施するために必要なタンパク質をコードする遺伝子クラスターである、オペロンに組織化される。それ故、１つの実施形態では、特定される遺伝子はオペロンの一部である。特定実施形態では、特定される遺伝子は、単独で又は組合せとしてプロテアーゼ活性を有する１又はそれ以上のタンパク質をコードするオペロン内にあるか、又はフォルダーゼ、シャペロン及びイソメラーゼを含む、フォールディング調節剤活性を有する１又はそれ以上のタンパク質をコードするオペロン内にある。
プロテアーゼ
本発明の１つの実施形態では、ゲノムからの少なくとも１個のプロテアーゼの発現を低下させる、前記少なくとも１個のプロテアーゼを阻害する又は除去することによって宿主細胞を修飾する。修飾はまた、一部の実施形態では、２個以上のプロテアーゼに対してであり得る。関連実施形態では、プロテアーゼ補因子又はプロテアーゼタンパク質の発現を低下させることによって細胞を修飾する。もう１つの実施形態では、天然プロモーターであり得る、プロテアーゼ又は関連タンパク質についてのプロモーターの阻害によって宿主細胞を修飾する。遺伝子修飾は、特定された遺伝子に対して相同なタンパク質を修飾するためであり得る。
ＭＥＲＯＰＳデータベースでは、ペプチダーゼを族（clans）とファミリーに分類している。ファミリーは、密接に関連する機能的に類似のペプチダーゼの群である。ファミリーはそれらの触媒型によって分類される：Ｓ、セリン；Ｔ、トレオニン；Ｃ、システイン；Ａ、アスパラギン酸；Ｍ、メタロ及びＵ、不明。セリンプロテアーゼの２０以上のファミリー（Ｓ１−Ｓ２７と表わされる）が特定されており、これらは、構造的類似度及び他の機能的証拠に基づいて６つの族（ＳＡ、ＳＢ、ＳＣ、ＳＥ、ＳＦ及びＳＧ）に分類される。族のうちの４つ（ＳＡ、ＳＢ、ＳＣ及びＳＥ）については構造が公知である。トレオニンペプチダーゼは、成熟酵素のＮ末端のトレオニン求核試薬によって特徴付けられる。この族についての型例は、サーモプラスマ・アシドフィルムの古細菌プロテアソームβ成分である。システインペプチダーゼは特徴的な分子トポロジーを有し、求核試薬がシステイン残基のスルフヒドリル基であるペプチダーゼである。システインプロテアーゼは、それらの触媒２残基又は３残基の構造に基づいて、族（進化的に関連するタンパク質）に分けられ、さらにファミリーに細分される：
ＣＡ族は、パパイン（Ｃ１）、カルパイン（Ｃ２）、ストレプトパイン（Ｃ１０）及びユビキチン特異的ペプチダーゼ（Ｃ１２、Ｃ１９）のファミリー、並びにウイルスシステインエンドペプチダーゼの多くのファミリーを含む。
ＣＤ族は、クロストリパイン（Ｃ１１）、ギンギパインＲ（Ｃ２５）、レグマイン（Ｃ１３）、カスパーゼー１（Ｃ１４）及びセパリン（Ｃ５０）のファミリーを含む。これらの酵素は、Ｓ１サブサイトの相互作用に支配される特異性を有する。
ＣＥ族は、アデノウイルスからのアデナイン（Ｃ５）、真核生物Ｕｌｐ１プロテアーゼ（Ｃ４８）及び細菌ＹｏｐＪプロテアーゼ（Ｃ５５）を含む。
ＣＦ族は、ピログルタミルペプチダーゼＩ（Ｃ１５）だけを含む。
ＰＡ族は、おそらくセリンペプチダーゼから進化した、この族内の酵素の大部分を形成する、ピコルナイン（Ｃ３）を含む。
ＰＢ及びＣＨ族は、自己分解性システインペプチダーゼを含む。
脊椎動物、真菌及びレトロウイルス起源のアスパラギン酸エンドペプチダーゼが特性決定されている。アスパラギン酸エンドペプチダーゼは、触媒残基が特定された全ての例においてＡｓｐ残基が活性化水分子のリガンドであるためそのように称されるが、少なくとも１個のウイルス酵素は、その触媒２残基としてＡｓｐとＡｓｎを有すると考えられる。全ての又は大部分のアスパラギン酸ペプチダーゼはエンドペプチダーゼである。これらの酵素は族（進化的に関連するタンパク質）に割り当てられており、主としてそれらの三次構造に基づいて、さらにファミリーに細分されている。
メタロプロテアーゼは４つの主要タイプのプロテアーゼのうちで最も多様であり、現在までに３０以上のファミリーが特定されている。これらの酵素では、二価陽イオン、通常は亜鉛が、水分子を活性化する。金属イオンは、通常は３個の、アミノ酸リガンドによって正しい位置に保持される。公知の金属リガンドはＨｉｓ、Ｇｌｕ、Ａｓｐ又はＬｙｓであり、求電子的役割を果たし得る、少なくとも１個の他の残基が触媒のために必要である。公知のメタロプロテアーゼのうちで、ほぼ半数が、結晶学試験において金属結合部位の一部を形成することが示された、ＨＥＸＸＨモチーフを含む。ＨＥＸＸＨモチーフは比較的一般的であるが、メタロプロテアーゼに関しては、より厳密にはａｂＸＨＥｂｂＨｂｃ［式中、「ａ」は、ほとんどの場合バリン又はトレオニンであり、サーモリシン及びネプリリシンにおけるＳ１’サブサイトの一部を形成し、「ｂ」は無電荷残基であり、「ｃ」は疎水性残基である］と定義される。プロリンは、おそらくメタロプロテアーゼにおいてこのモチーフによって採用されるらせん構造を破壊するために、この部位では絶対に認められない。
Ｕ−族に関連するペプチダーゼについては、活性部位ドメインのタンパク質折りたたみ及び活性部位残基が報告されていないので触媒機構は不明である。
ある種のプロテアーゼ（例えばＯｍｐＴ）は、封入体の表面に吸着することができ、再生されている間に所望タンパク質を分解し得る。それ故、ある種の特定されるタンパク質は、封入体に接着するプロテアーゼ又はプロテアーゼタンパク質であり得、これらは、例えば接着を低下させるように、修飾することができる。
プロテアーゼ又はプロテアーゼタンパク質はまた、アミノペプチダーゼ；ジペプチダーゼ；ジペプチジル−ペプチダーゼ及びトリペプチジルペプチダーゼ；ペプチジル−ジペプチダーゼ；セリン型カルボキシペプチダーゼ；メタロカルボキシペプチダーゼ；システイン型カルボキシペプチダーゼ；ωペプチダーゼ；セリンプロテイナーゼ；システインプロテイナーゼ；アスパラギン酸プロテイナーゼ；メタロプロテイナーゼ；又は未知の機構のプロテイナーゼと分類することができる。
アミノペプチダーゼは、サイトゾルアミノペプチダーゼ（ロイシルアミノペプチダーゼ）、膜アラニルアミノペプチダーゼ、シスチニルアミノペプチダーゼ、トリペプチドアミノペプチダーゼ、プロリルアミノペプチダーゼ、アルギニルアミノペプチダーゼ、グルタミルアミノペプチダーゼ、ｘ−ｐｒｏアミノペプチダーゼ、細菌ロイシルアミノペプチダーゼ、好熱菌アミノペプチダーゼ、クロストリジウムアミノペプチダーゼ、サイトゾルアラニルアミノペプチダーゼ、リシルアミノペプチダーゼ、ｘ−ｔｒｐアミノペプチダーゼ、トリプトファニルアミノペプチダーゼ、メチオニルアミノペプチダーゼ、ｄ−立体特異性アミノペプチダーゼ、アミノペプチダーゼｅｙを含む。ジペプチダーゼは、ｘ−ｈｉｓジペプチダーゼ、ｘ−ａｒｇジペプチダーゼ、ｘ−メチル−ｈｉｓジペプチダーゼ、ｓｙｓ−ｇｌｙジペプチダーゼ、ｇｌｕ−ｇｌｕジペプチダーゼ、ｘ−ｐｒｏジペプチダーゼ、ｍｅｔ−ｘジペプチダーゼ、非立体特異性ジペプチダーゼ、サイトゾル非特異性ジペプチダーゼ、膜ジペプチダーゼ、β−ａｌａ−ｈｉｓジペプチダーゼを含む。ジペプチジル−ペプチダーゼ及びトリペプチジルペプチダーゼは、ジペプチジル−ペプチダーゼｉ、ジペプチジル−ペプチダーゼｉｉ、ジペプチジル−ペプチダーゼｉｉｉ、ジペプチジル−ペプチダーゼｉｖ、ジペプチジル−ペプチダーゼ、トリペプチジル−ペプチダーゼＩ、トリペプチジル−ペプチダーゼＩＩを含む。ペプチジル−ジペプチダーゼは、ペプチジル−ジペプチダーゼａ及びペプチジル−ジペプチダーゼｂを含む。セリン型カルボキシペプチダーゼは、リソソームｐｒｏ−ｘカルボキシペプチダーゼ、セリン型Ｄ−ａｌａ−Ｄ−ａｌａカルボキシペプチダーゼ、カルボキシペプチダーゼＣ、カルボキシペプチダーゼＤを含む。メタロカルボキシペプチダーゼは、カルボキシペプチダーゼａ、カルボキシペプチダーゼＢ、リシン（アルギニン）カルボキシペプチダーゼ、ｇｌｙ−Ｘカルボキシペプチダーゼ、アラニンカルボキシペプチダーゼ、ムラモイルペンタペプチドカルボキシペプチダーゼ、カルボキシペプチダーゼｈ、グルタミン酸カルボキシペプチダーゼ、カルボキシペプチダーゼＭ、ムラモイルテトラペプチドカルボキシペプチダーゼ、亜鉛ｄ−ａｌａ−ｄ−ａｌａカルボキシペプチダーゼ、カルボキシペプチダーゼＡ２、膜ｐｒｏ―ｘカルボキシペプチダーゼ、チューブリニル−ｔｙｒカルボキシペプチダーゼ、カルボキシペプチダーゼｔを含む。ωペプチダーゼは、アシルアミノアシル−ペプチダーゼ、ペプチジル−グリシンアミダーゼ、ピログルタミル−ペプチダーゼＩ、β−アスパルチル−ペプチダーゼ、ピログルタミル−ペプチダーゼＩＩ、ｎ−ホルミルメチオニル−ペプチダーゼ、プテロイルポリ−［γ］グルタミン酸カルボキシペプチダーゼ、γ−ｇｌｕ−Ｘカルボキシペプチダーゼ、アシルムラモイル−ａｌａ−ペプチダーゼを含む。セリンプロテイナーゼは、キモトリプシン、キモトリプシンｃ、メトリジン、トリプシン、トロンビン、第Ｘａ血液凝固因子、プラスミン、エンテロペプチダーゼ、アクロシン、α溶解プロテアーゼ、グルタミルエンドペプチダーゼ、カテプシンＧ、第ＶＩＩａ血液凝固因子、ブラキウリン、血漿カリクレイン、組織カリクレイン、膵臓エラスターゼ、白血球エラスターゼ、第ＸＩＩａ血液凝固因子、キマーゼ、補体成分ｃ１ｒ５５、補体成分ｃ１ｓ５５、古典的補体経路ｃ３／ｃ５コンバターゼ、セレビシン、ハイポダーミンＣ、リシルエンドペプチダーゼ、エンドペプチダーゼ１ａ、γ−レニ、ベノンビンａｂ、ロイシルエンドペプチダーゼ、トリプターゼ、スクテラリン、ケキシン、サブチリシン、オリジン、エンドペプチダーゼｋ、サーモミコリン（thermomycolin）、サーミターゼ（thermitase）、エンドペプチダーゼＳＯ、Ｔ−プラスミノーゲン活性化因子、プロテインＣ、膵臓エンドペプチダーゼＥ、膵臓エラスターゼｉｉ、ＩｇＡ特異的セリンエンドペプチダーゼ、Ｕ−プラスミノーゲン活性化因子、ベノンビンＡ、フューリン、ミエロブラスチン、セメノゲラーゼ、グランザイムＡ又は細胞傷害性Ｔリンパ球プロテイナーゼ１、グランザイムＢ又は細胞傷害性Ｔリンパ球プロテイナーゼ２、ストレプトグリシンＡ、トレプトグリシンＢ、グルタミルエンドペプチダーゼＩＩ、オリゴペプチダーゼＢ、カブトガニ凝固因子、カブトガニ凝固酵素、オンプチン、リプレッサーＬｅｘａ、細菌リーダーペプチダーゼＩ、トガビリン、フラビリンを含む。システインプロテイナーゼは、カテプシンＢ、パパイン、フィシン、キモパパイン、アスクレパイン、クロストリパイン、ストレプトパイン、アクチニド、カテプシンｌ、カテプシンＨ、カルパイン、カテプシンｔ、グリシルエンドペプチダーゼ、癌凝血原、カテプシンＳ、ピコルナイン３Ｃ、ピコルナイン２Ａ、カリカイン、アナナイン、幹ブロメライン、果実ブロメライン、レグマイン、ヒストリサイン（histolysain）、インターロイキン１−β変換酵素を含む。アスパラギン酸プロテイナーゼは、ペプシンＡ、ペプシンＢ、ガストリシン、キモシン、カテプシンＤ、ネオペンテシン、レニン、レトロペプシン、プロオピオメラノコルチン変換酵素、アスペルギロペプシンＩ、アスペルギロペプシンＩＩ、ペニシロペプシン、リゾプスペプシン、エンドチアペプシン、ムコロペプシン、カンジダペプシン、サッカロペプシン、ロドトルラペプシン、フィサロペプシン、アクロシリンドロペプシン、ポリポロペプシン、ピクノポロペプシン、シタリドペプシンａ、シタリドペプシンｂ、キサントモナペプシン、カテプシンｅ、バリアペプシン、細菌リーダーペプチダーゼＩ、シュードモナペプシン、プラスメプシンを含む。メタロプロテイナーゼは、アトロリシンａ、微生物コラゲナーゼ、ロイコリシン、間質コラゲナーゼ、ネプリリシン、エンベリシン、ＩｇＡ特異的メタロエンドペプチダーゼ、プロコラーゲンＮ−エンドペプチダーゼ、チメットオリゴペプチダーゼ、ニューロリシン、ストロメリシン１、メプリンＡ、プロコラーゲンＣ−エンドペプチダーゼ、ペプチジル−ｌｙｓメタロエンドペプチダーゼ、アスタシン、ストロメリシン２、マトリリシンゲラチナーゼ、アエロモノロシン、シュードリシン、サーモリシン、バシロリシン、アウレオリシン、コッコリシン、ミコリシン、β−溶解メタロエンドペプチダーゼ、ペプチジル−ａｓｐメタロエンドペプチダーゼ、好中球コラゲナーゼ、ゲラチナーゼＢ、リーシュマノリシン、サッカロリシン、自己溶解素、ジュウテロリシン、セラリシン、アトロリシンＢ、アトロリシンＣ、アトロキサーゼ、アトロリシンＥ、アトロリシンＦ、アダマリシン、ホリリシン、ルベルリシン（ruberlysin）、ボトロパシン、ボトロリシン、オフィオリシン、トリメレリシンＩ、トリメレリシンＩＩ、ムクロリシン、ピトリリシン、インスリシン、Ｏ−シアロ糖タンパク質エンドペプチダーゼ、ラッセルリシン、ミトコンドリア中間体ペプチダーゼ、ダクチルリシン、ナルジリシン、マグノリシン、メプリンＢ、ミトコンドリアプロセシングペプチダーゼ、マクロファージエラスターゼ、コリオリシン、トキシリシンを含む。未知の機構のプロテイナーゼは、サーモプシン及び多機能性エンドペプチダーゼ複合体を含む。
Ｐ．フルオレセンスの一部のプロテアーゼを表Ａに列挙する。

表Ａ
Figure 2008507294
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大腸菌起源の一部のプロテアーゼを表Ｂに列挙する。

表Ｂ
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Figure 2008507294
Ｓ．セレビシエ起源の一部のプロテアーゼを表Ｃに列挙する。

表Ｃ
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フォールディング調節剤
特定される上方調節遺伝子又は遺伝子産物は、１又はそれ以上のフォールディング調節剤であり得る。フォールディング調節剤は、例えばＨＳＰ７０タンパク質、ＨＳＰ１１０／ＳＳＥタンパク質、ＨＳＰ４０（ＤＮＡＪ関連）タンパク質、ＧＲＰＥ様タンパク質、ＨＳＰ９０タンパク質、ＣＰＮ６０及びＣＰＮ１０タンパク質、サイトゾルシャペロニン、ＨＳＰ１００タンパク質、低分子ＨＳＰ、カルネキシン及びカルレティキュリン、ＰＤＩ及びチオレドキシン関連タンパク質、ペプチジル−プロリルイソメラーゼ、シクロフィリンＰＰＩアーゼ、ＦＫ−５０６結合タンパク質、パーブリン（Parvulin）ＰＰＩアーゼ、個々のシャペロニン、タンパク質特異的シャペロン又は細胞内シャペロンであり得る。フォールディング調節剤は、"Guidebook to Molecular Chaperones and Protein-Folding Catalysts" (1997) ed. M. Gething, Melbourne University, Australiaにおいて一般的に記述されている。
大腸菌の細胞質において最もよく特性付けられている分子シャペロンは、ＡＴＰ依存性ＤｎａＫ−ＤｎａＪ−ＧｒｐＥ及びＧｒｏＥＬ−ＧｒｏＥＳ系である。インビトロ試験及び相同性検討に基づき、多くの付加的な細胞質タンパク質が大腸菌における分子シャペロンとして機能すると提案されてきた。これらは、ＤｎａＫ−ＤｎａＪ−ＧｒｐＥ及びＧｒｏＥＬ−ＧｒｏＥＳと同様に、ストレスレギュロンに属する熱ショックタンパク質（Ｈｓｐ）である、ＣｌｐＢ、ＨｔｐＧ及びＩｂｐＡ／Ｂを含む。Ｘ−Ｐｒｏ結合のトランス配座は新生タンパク質鎖においてエネルギー的に有利に働く；しかし、天然タンパク質では全てのプロリルペプチド結合の〜５％がシス配座で認められる。Ｘ−Ｐｒｏ結合のトランスからシスへの異性化は、多くのポリペプチドの折りたたみにおいて速度制限的であり、インビボではペプチジルプロリルシス／トランスイソメラーゼ（ＰＰＩアーゼ）によって触媒される。現在までに３つの細胞質ＰＰＩアーゼ、ＳｌｙＤ、ＳｌｐＡ及びトリガー因子（ＴＦ）が大腸菌において特定されている。５０Ｓリボソームサブユニットと結合する４８ｋＤａタンパク質であるＴＦは、新たに合成されたタンパク質の正しい折りたたみを保証するために大腸菌内のシャペロンと協力すると推定されてきた。少なくとも５個のタンパク質（それぞれｔｒｘＡ、ｔｒｘＣ、ｇｒｘＡ、ｇｒｘＢ及びｇｒｘＣ遺伝子の産物である、チオレドキシン１及び２、及びグルタレドキシン１、２及び３）が、細胞質酵素において一過性に生じるジスルフィド結合の還元に関与する。それ故、特定される遺伝子は、正しいジスルフィド結合形成を可能にするジスルフィド結合形成タンパク質又はシャペロンであり得る。
Ｐ．フルオレセンスにおける一部のフォールディング調節剤を表Ｄに列挙する。
Figure 2008507294
Figure 2008507294
大腸菌における一部のフォールディング調節剤を表Ｅに列挙する。
Figure 2008507294
Figure 2008507294
Ｓ．セレビシエ（S. cervisia）の一部のフォールディング調節剤を表Ｆに示す。

表Ｆ
Figure 2008507294
Figure 2008507294
Figure 2008507294
Figure 2008507294
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遺伝子操作
工程ｉｉｉ）において、本発明の方法は、修飾組換え細胞を提供するために遺伝子操作によって組換え細胞内の特定された補償遺伝子又は遺伝子産物の発現を変化させることを含む。１又はそれ以上の上方調節遺伝子、タンパク質又は代謝工程の特定後に、宿主のゲノムを修飾し得る。ある種の遺伝子又は遺伝子産物は、上方調節されると特定されても、細胞に必須であるか若しくは細胞又は生物に必須であり得る他の工程に影響を及ぼすことが知られているために、調節のために使用可能でないことがある。
ゲノムは、発現ベクターを用いてゲノム内又は宿主内に外来性遺伝子又はプロモーターエレメントを含めることによって、特定された遺伝子のｍＲＮＡ又はタンパク質を生産する能力を高めることによって、又は遺伝子又はプロモーターエレメントを欠失させる又は破壊することによって、又は遺伝子のｍＲＮＡ又はタンパク質を生産する能力を低下させることによって修飾し得る。遺伝暗号を変化させることができ、それによって、例えば置換、欠失（「ノックアウト」）、共発現又は挿入（「ノックイン」）手法を通して、遺伝子の転写及び／又は翻訳に影響を及ぼし得る。所望タンパク質についての付加的な遺伝子又は既存配列の転写を調節する調節配列も挿入することができる。
組換え
組換えタンパク質を発現する宿主細胞のゲノムは、挿入又は組換え、例えば相同的組換えによってであり得る、遺伝子ターゲティング事象を通して修飾することができる。相同的組換えとは、配列相同性に基づくＤＮＡ組換えの過程を指す。相同的組換えは、内在性遺伝子における部位特異的修飾を可能にし、それ故ゲノム内に新規変化を工作することができる。相同的組換えにおける１つの工程はＤＮＡ鎖交換であり、これは、ヘテロ二本鎖ＤＮＡを含む中間体組換え構造を形成するための、相補的配列を含む少なくとも１本のＤＮＡ鎖とＤＮＡ二本鎖の対合を含む（例えばRadding, C. M. (1982) Ann. Rev. Genet. 16: 405; U.S. Pat. No. 4,888,274参照)。ヘテロ二重鎖ＤＮＡは、１本の相補鎖がＤＮＡ二本鎖に侵入している三重鎖形態を有する三本鎖ＤＮＡを含む、いくつかの形態をとり得ることができ（Hsieh, et al., Genes and Development 4: 1951 (1990); Rao, et al., (1991) PNAS 88:2984))、２本の相補的ＤＮＡ鎖がＤＮＡ二本鎖と対合するときは、古典的オリデイ組換え連結又はχ構造 (Holliday, R., Genet. Res. 5: 282 (1964))あるいは二重Ｄループ ("Diagnostic Applications of Double-D Loop Formation" U.S. Ser. No. 07/755,462, filed Sep. 4, 1991)が形成され得る。ひとたび形成されると、ヘテロ二本鎖構造は、侵入ＤＮＡ鎖の全部又は一部が受容ＤＮＡ二本鎖にスプライシングされて、受容ＤＮＡ二本鎖のセグメントを付加する又は置換するように、鎖切断と交換によって分割することができる。あるいは、ヘテロ二本鎖構造は、侵入鎖の配列が、侵入鎖を鋳型として用いるミスマッチ塩基の修復機構によって受容ＤＮＡ二本鎖に導入される、遺伝子変換をもたらし得る(Genes, 3rd Ed. (1987) Lewin, B., John Wiley, New York, N. Y.; Lopez, et al., Nucleic Acids Res. 15: 5643(1987))。切断と再連結の機構によるか又は遺伝子交換の機構によるかに関わらず、相同的に対合する連結部でのヘテロ二本鎖ＤＮＡの形成は、１個のＤＮＡ分子から別のＤＮＡ分子に遺伝子配列情報を導入するのに役立ち得る。
相同的組換えでは、導入されるＤＮＡは、実質的に相同なＤＮＡ配列を含むゲノム内の部位と相互作用して、そこに組み込まれる。非相同的（「ランダム」又は「不正（illicit）」）組込みでは、導入されるＤＮＡは、ゲノム内の相同的配列においてではなく別の場所、数多くの潜在的位置の１つで組み込まれる。多くの論文が哺乳動物細胞における相同的組換えの使用を述べている。
特定された遺伝子座での相同的組換えのために様々な構築物を作製することができる。通常は、構築物は、特定遺伝子座と相同な少なくとも１０ｂｐ、２０ｂｐ、３０ｂｐ、４０ｂｐ、５０ｂｐ、７０ｂｐ、１００ｂｐ、５００ｂｐ、１ｋｂｐ、２ｋｂｐ、４ｋｂｐ、５ｋｂｐ、１０ｋｂｐ、１５ｋｂｐ、２０ｋｂｐ又は５０ｋｂｐの配列を含み得る。特定されたＤＮＡ配列の相同性の程度を決定するには、様々な検討、例えば特定された遺伝子座の大きさ、配列のアベイラビリティー、特定遺伝子座での二重交差事象の相対効率及び特定された配列と他の配列の類似性が含まれ得る。
標的ＤＮＡは、実質的に同質遺伝子のＤＮＡが、修飾すべきゲノム内の対応する特定配列を有する所望配列修飾に隣接している配列を含み得る。実質的な同質遺伝子配列は、対応する特定配列に少なくとも約９５％、９７−９８％、９９．０−９９．５％、９９．６−９９．９％又は１００％同一であり得る（所望配列修飾を除いて）。標的ＤＮＡと特定ＤＮＡは、１００％同一である少なくとも約１０、２０、３０、５０、７５、１５０又は５００塩基対にわたるＤＮＡを共有し得る。
ＤＮＡ構築物は、内在性の特定された遺伝子産物を修飾するように設計することができる。構築物を特定するための相同的配列は、生じる遺伝子産物の機能を破壊するように設計された１又はそれ以上の欠失、挿入、置換又はそれらの組合せを有し得る。１つの実施形態では、変化は、特定された遺伝子の上流配列と読み枠内で融合した選択マーカー遺伝子の挿入であり得る。
ゲノムはまた、挿入欠失を用いて修飾することができる。この実施形態では、遺伝子産物形成を阻害する遺伝子内の配列を組み換えることによってゲノムを修飾する。この挿入は、別のエレメントを挿入することによって遺伝子を破壊するか、又は遺伝子の必須部分を除去することができる。１つの実施形態では、挿入欠失は、特定ストレス因子、例えば抗生物質に対する耐性、又は特定培地中での増殖、例えば必須アミノ酸の生産をコードする遺伝子の挿入を含む。
ゲノムはまた、相同的組換えとは無関係な機構によって原核生物ゲノム内の部位に挿入することができる遺伝因子である、トランスポゾンの使用によっても修飾できる。トランスポゾンは、例えば大腸菌におけるＴｎ７、黄色ブドウ球菌（S. aureus）のＴｎ５５４、パラ結核菌（M. paratuberculosis）（ヨーネ菌）のＩＳ９００、シュードモナス・アトランティカ（Pseudomonas atlantica）からのＩＳ４９２、ストレプトミセス（Streptomyces）からのＩＳ１１６及びパラ結核菌（M. paratuberculosis）からのＩＳ９００を含み得る。転位に関与すると考えられる工程は、３’ＯＨを生じるトランスポゾンの末端の切断；トランスポザーゼがトランスポゾンの３’ＯＨ露出末端と特定配列を結合させる、鎖転移；及びトランスポゾンの特定ＤＮＡへの共有結合を生じる１段階エステル結合転移反応を含む。トランスポザーゼによって実施される鍵となる反応は、一般にニッキング又は鎖交換であると思われ、残りの工程は宿主酵素によって行われる。
１つの実施形態では、特定された遺伝子又はそのホモログをコードする遺伝子配列を組換えによってゲノムに組み込むことにより、前記遺伝子又はホモログのレベルを上昇させるための方法が提供される。もう１つの実施形態では、特定された遺伝子又はホモログの発現を高めるためにプロモーターをゲノムに挿入する。別の実施形態では、不活性遺伝子との組換えによって特定された遺伝子又はそのホモログの発現を低下させるための方法が提供される。もう１つの実施形態では、細胞において別の機能を有し得る又はレポーター遺伝子、例えば耐性マーカー又はさもなければ検出マーカー遺伝子であり得る、異なる遺伝子をコードする配列を、組換えを通してゲノムに挿入することができる。さらにもう１つの実施形態では、１又はそれ以上の位置で突然変異した特定遺伝子の少なくとも一部のコピーを、組換えを通してゲノムに挿入することができる。突然変異型の特定遺伝子はタンパク質をコードすることができないか、又は突然変異遺伝子によってコードされるタンパク質は不活性になり得るか、活性が変化し得る（上昇又は低下する）か、又は突然変異型タンパク質は天然タンパク質と比較して異なる活性を有し得る。
一般に大腸菌で例示されてきた、細菌において遺伝子をノックアウトするための戦略がある。１つの経路は、遺伝子内部のＤＮＡフラグメントを、抗生物質（例えばアンピシリン）耐性遺伝子を含むベクターにクローニングすることである。細胞を接合伝達、化学的形質転換又は電気穿孔によって形質転換する前に(Puehler, et al. (1984) Advanced Molecular Genetics New York, Heidelberg, Berlin, Tokyo, Springer Verlag)、複製起点、例えば植物プラスミド複製の起点（ｏｒｉＶ遺伝子座）を切り出し、残りのＤＮＡフラグメントを再連結して精製する(Sambrook, et al. (2000) Molecular cloning: A laboratory manual, third edition Cold Spring Harbor, New York, Cold Spring Harbor Laboratory Press)。あるいは、ＤＮＡ複製起点を有する抗生物質耐性プラスミドを使用することができる。形質転換後、細胞を、例えば適切な抗生物質（例えば２００μｇ／ｍＬアンピシリン）を含むＬＢ寒天プレートに塗布する。抗生物質を含むプレートで増殖するコロニーは、おそらく、相同的遺伝子座でのゲノム内へのＤＮＡフラグメント全体の組込みを導く単一組換え事象(Snyder, L., W. Champness, et al. (1997) Molecular Genetics of Bacteria Washington DC, ASM Press) を受けている。所望遺伝子のノックアウトが所望遺伝子座で起こったことを確認するための抗生物質耐性細胞のさらなる分析は、例えば診断ＰＣＲによる(McPherson, M. J., P. Quirke, et al. (1991) PCR: A Practical Approach New York, Oxford University Press)。この場合は、少なくとも２個のＰＣＲプライマーを設計する：遺伝子ノックアウトの構築のために使用したＤＮＡ領域の外側でハイブリダイズする１個；及び残りのプラスミド骨格内でハイブリダイズする１個。正しい大きさを有するＤＮＡフラグメントのＰＣＲ増幅の成功とそれに続くＤＮＡ配列分析により、遺伝子ノックアウトが細菌染色体の正しい位置で起こったことが確認される。新たに構築された突然変異株の表現型を、次に、例えばＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動によって分析することができる(Simpson, R. J. (2003) Proteins and Proteomics - A Laboratory Manual. Cold Spring Harbor, New York, Cold Spring Harbor Laboratory Press)。
遺伝子ノックアウトを作製するための選択的経路は、遺伝子置換を促進するための温度感受性レプリコン、例えばｐＳＣ１０１レプリコンの使用による(Hamilton, et al. (1989) New process for generating deletions and gene replacements in Escherichia coli. Journal of Bacteriology 171(9): 4617-22)。この方法は、染色体上の遺伝子とＤＮＡ複製に関して温度感受性のプラスミド上に担持される相同的配列の間での相同的組換えによって進行する。適切な宿主へのプラスミドの形質転換後、４４℃で染色体へのプラスミドの組込みに関して選択することができる。これらの共組込み体の３０℃でのその後の増殖は第二の組換え事象を導き、それらの分解を生じさせる。第二組換え事象がどこで起こるかに依存して、染色体は、遺伝子置換を受けるか又はもとのコピーの遺伝子を保持する。
特定遺伝子産物の発現を阻害するための他の戦略が開発されている。例えば、特に低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）を使用する、ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）は、特定遺伝子産物の発現を低下させる、さらには排除するために広汎に開発されてきた。ｓｉＲＮＡは、分解のために相補的ｍＲＮＡを標的することができる短い二本鎖ＲＮＡ分子である。ＲＮＡｉは、二本鎖ＲＮＡの導入が相同的遺伝子の発現を抑制する現象である。二本鎖ＲＮＡ分子は、インビボで、ＲＮＡｉ作用のメディエイタである２１−２３ヌクレオチドのｓｉＲＮＡに低減される。導入後、二本鎖ＲＮＡは、ダイサーと呼ばれるＲＮアーゼＩＩＩ様酵素によって２０−２５ヌクレオチドのｓｉＲＮＡにプロセシングされる（開始段階）。次に、ｓｉＲＮＡは、工程においてほどける、ＲＮＡ誘導沈黙化複合体（ＲＩＳＣ）として知られるエンドリボヌクレアーゼ含有複合体に構築される。ｓｉＲＮＡ鎖はその後ＲＩＳＣを相補的ＲＮＡ分子へと導き、そこで開裂して、コグネイトＲＮＡを破壊する（エフェクター段階）。コグネイトＲＮＡの切断は、ｓｉＲＮＡによって結合される領域の中央近くで起こる。ＲＮＡｉは、ゼブラフィッシュ、線虫（Ｃ．エレガンス（C. elegans））、昆虫（キイロショウジョウバエ（Drosophila melanogaster））、プラナリア、刺胞動物、トリパノソーマ、マウス及び哺乳動物細胞を含む様々な生物において遺伝子発現を低下させるために成功裏に使用されてきた。
突然変異
ゲノムはまた、特定された遺伝子、特に特定されたプロテアーゼをコードするオープンリーディングフレーム内の１又はそれ以上のヌクレオチドの突然変異によって修飾することができる。遺伝子突然変異のための手法、例えば位置指定突然変異誘発は、当技術分野において周知である。一部のアプローチは、染色体ＤＮＡにおけるランダム突然変異の生成、例えばＸ線及び化学物質によって誘導されるものを焦点とする。ＤＮＡの規定領域を標的する突然変異誘発は多くの手法を含み、普及度は様々である。位置指定突然変異誘発へのインビトロアプローチは一般に３つのカテゴリーに分けられる：ｉ）ＤＮＡのフラグメントを再構築する方法、例えばカセット突然変異誘発；ｉｉ）局在化ランダム突然変異誘発；及びｉｉｉ）オリゴヌクレオチド指定突然変異誘発。
オリゴヌクレオチド指定突然変異誘発は、所望突然変異をコードするオリゴヌクレオチドを対象ＤＮＡの一本鎖にアニーリングし、ＤＮＡ合成の開始のためのプライマーとして使用するという概念に基づく。このようにして、突然変異誘発性オリゴヌクレオチドを新しく合成された鎖に組み込む。突然変異誘発性オリゴヌクレオチドは少なくとも１個の塩基変化を組み込むが、多数の置換、挿入又は欠失を生成するように設計することができる。例は、ＰＣＲに基づく方法及び今日使用されている実際上全ての非ＰＣＲベースの方法を含む。これらの手法は、陽性抗生物質選択(Lewis, M.K. and Thompson, D.V. (1990) Nucl. Acids Res. 18, 3439; Bohnsack, R.N. (1996) Meth. Mol. Biol. 57, 1; Vavra, S. and Brondyk, W.H. (1996) Promega Notes 58, 30; Altered Sites(R) II in vitro Mutagenesis Systems Technical Manual #TM001, Promega Corporation)、ユニーク制限部位選択 (Deng, W.P. and Nickoloff, J.A. (1992) Anal. Biochem. 200, 81)、ウラシル組込み (Kunkel, T.A. (1985) Proc. Natl. Acad. Sd. USA 82, 488; Kunkel, T.A., Roberts, J.D. and Zakour, R.A. (1987) Meth. Enzymol. 154, 367)、及びホスホロチオエート組込み (Taylor, J.W., Ott, J. and Eckstein, F. (1985) Nucl. Acids Res. 13, 8764; Nakamaye, K. and Eckstein, F. (1986) Nucl. Acids Res. 14, 9679)を含む。オリゴヌクレオチドはまた、化学合成の間に部位の塩基組成をランダム化することによって縮重又は「ドープした」オリゴヌクレオチドを生じる突然変異のライブラリーをコードすることができる。突然変異を局在化し、指定する能力は、ＤＮＡ挿入物を含むプラスミドベクターにハイブリダイズした合成オリゴヌクレオチドの使用によって大きく上昇する。
部位指定突然変異誘発の一般的様式は：一本鎖領域を生成するための、対象鋳型（ｃＤＮＡ、プロモーター等）を含むプラスミドＤＮＡの変性；合成突然変異型オリゴヌクレオチド特定鎖へのアニーリング；例えばＴ４ＤＮＡポリメラーゼを用いた、新しい相補鎖の合成；及び例えばＴ４ＤＮＡリガーゼを用いた、新しい鎖の末端とオリゴヌクレオチドの間で生じたニックの密封、である。生じたヘテロ二本鎖を、例えば大腸菌において、形質転換によって伝搬する。突然変異鎖の回収効率を大きく改善するために選択と富化の方法が突然変異誘発工程に組み込まれており、８０−９０％に近い率が可能である。種々のタイプの突然変異を生成し、突然変異体の選択を上昇させるための数多くの方法が存在する。突然変異体の選択を上昇させるための方法の例は、インビボで選択的に分解され得るウラシル含有ＤＮＡ鎖を使用した、突然変異鎖の陽性抗生物質選択、及びヘテロ二本鎖ＤＮＡの１本の鎖を消化に対して不浸透性にすることができる、ｄＮＴＰ類似体組込みを含む。小さな定義された領域内のランダム突然変異のライブラリーを作製するために、一部のアプローチ、例えばカセット突然変異誘発と「ドープした」オリゴヌクレオチドの使用を組み合わせることができる。
部位指定突然変異誘発のいわゆる「標準」方法の拡大は、ＤＮＡ増幅、特にポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）に基づくものを含む。部位指定突然変異誘発における主要な共通点は、突然変異誘発性オリゴヌクレオチドの使用である。突然変異誘発性オリゴヌクレオチドは、鋳型に効率的にハイブリダイズするべきである。効率的ハイブリダイゼーションのために、例えば二次構造の形成を伴わない、特定された配列のいずれかの末端での１００％塩基対合が存在し得るが、１００％未満の同一性もあり得、例えば配列の９８％、９５％、９２％、９０％、８５％、８０％、７０％又はごく一部だけが同一であり得る。小さな置換に関しては、ミスマッチのいずれかの側でハイブリダイズする１０−１５塩基で通常は十分である。ポリメラーゼは、典型的にはミスマッチ又はハイブリダイズ不良の３’末端からは伸長しないので、プライマーの３’末端の組成は特に重要である。
陽性抗生物質選択のための部位指定等誘発のための基礎は、抗生物質耐性遺伝子を修復するために、選択オリゴヌクレオチド（１又はそれ以上）が突然変異誘発性オリゴヌクレオチドと同時にアニーリングすることである（１０−１３）。突然変異鎖の選択は、突然変異型ＤＮＡの抗生物質耐性及び非突然変異鎖の感受性によって可能である。このアプローチは、実際上ほとんど時間をかけずに無限の数の所望突然変異を生成する非常に効率的な手段を提供する。
ユニーク制限部位の使用による部位指定突然変異誘発は、ＤｅｎｇとＮｉｃｋｏｌｏｆｆの方法に基づく(Deng, W.P. and Nickoloff, J.A. (1992) Anal. Biochem. 200, 81)。このアプローチでは、ユニーク制限部位についての突然変異配列を含む選択オリゴヌクレオチドを突然変異誘発性オリゴヌクレオチドと同時にアニーリングする。選択オリゴヌクレオチドは、必須でない部位を対応する酵素による制限に対して免疫性にする。生じたプラスミドのプールをユニーク制限酵素で消化することによって突然変異鎖についての選択が上昇する。消化は親プラスミドを線形化し、それによって細菌を形質転換するその能力を有効に低下させる。
デオキシウリジン組込みによる部位指定突然変異誘発は、チミジン（Ｔ）の代わりにウラシル（Ｕ）を含む鋳型ＤＮＡを分解する宿主菌株の能力に基づく。ｄＵＴＰアーゼ（ｄｕｔ−）及びウラシルＮ−デグリコシダーゼ（ｕｎｇ−）活性を欠く宿主においてｄＴＴＰの代わりに少数のｄＵＴＰを鋳型鎖に組み込む。（ウラシル自体は突然変異誘発性ではなく、アデニンと塩基対合する。）正常であれば、ｄＵＴＰアーゼはデオキシウリジンを分解し、ウラシルＮ−デグリコシダーゼは組み込まれたウラシルを除去する。ｄｕｔ＋ｕｎｇ＋菌株での突然変異後複製が、その後、非特定鎖ＤＮＡを分解するために使用される。このアプローチは、１本の鎖だけが分解に対して感受性のＵを含むように、一本鎖ＤＮＡを使用することを必要とする。
部位指定突然変異誘発へのホスホロチオエート組込みアプローチは、チオール基を含むｄＮＴＰ類似体が、ヘテロ二本鎖ＤＮＡを制限酵素消化に対して耐性にする能力に基づく。突然変異鎖を、ｄＣＴＰαＳの存在下で突然変異誘発性オリゴヌクレオチドから伸長し、合成する。使用されなかった鋳型ＤＮＡはエキソヌクレアーゼでの消化によって除去する。理論的には、環状のヘテロ二本鎖ＤＮＡだけが残る。次に、制限部位でヘテロ二量体にニックを入れるが、切断しない。エキソヌクレアーゼＩＩＩを使用してニックを入れた鎖を消化し、その後残りのフラグメントを再重合のためのプライマーとして使用して、突然変異型ホモ二本鎖を作製する。
ＤＮＡにおいて突然変異を生成するためのポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）に基づくアプローチでは、１個のオリゴヌクレオチド、又は多数の増幅を用いるプロトコールではそれ以上が、所望突然変異を含むことを除いて、遺伝子特異的オリゴヌクレオチドプライマーのセットを使用して鋳型を増幅する。変法は、オーバーラップ内に突然変異を有する多数のオーバーラップＰＣＲフラグメントを生成するようにオリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーション部位を変化させること、及び３個のオリゴヌクレオチドと２回の増幅を使用し、第一増幅からの産物の鎖を第二増幅におけるプライマーとして使用する、「メガプライマー」アプローチを含む。
オーバーラップ伸長アプローチでは、重複末端を有する２個のＤＮＡフラグメントを生成するために相補的オリゴデオキシリボヌクレオチド（オリゴ）プライマーとポリメラーゼ連鎖反応を使用する。これらのフラグメントを、重複末端をアニーリングして、各々の鎖の３’重複を相補鎖の３’伸長のためのプライマーとして使用することを可能にする、その後の「融合」反応において組み合わせる。生じた融合産物をＰＣＲによってさらに増幅する。ヌクレオチド（ｎｔ）配列内の特異的変化は、オーバーラップオリゴプライマーにヌクレオチド変化を組み込むことによって導入できる。
ベクター構築物
別の実施形態では、特定された遺伝子、典型的にはフォールディング調節剤又はフォールディング調節剤の補因子をコードする１又はそれ以上のベクターを含めることによって宿主細胞を修飾する。もう１つの実施形態では、外来性プロモーターを宿主細胞ゲノムに付加することを含む、フォールディング調節剤又はフォールディング調節剤の補因子についてのプロモーターを増強することによって宿主細胞を修飾する。
もう１つの実施形態では、特定された補償遺伝子の阻害剤、例えばプロテアーゼ阻害剤をコードする１又はそれ以上のベクターを含めることによって宿主細胞を修飾する。そのような阻害剤は、特定された補償遺伝子、特定された遺伝子の補因子又は特定された遺伝子のホモログの発現を制限するアンチセンス分子であり得る。アンチセンスは一般に、特定された遺伝子の少なくとも一部に相補的な配列を有する核酸分子を表わすために使用される。加えて、阻害剤は、干渉ＲＮＡ又は干渉ＲＮＡをコードする遺伝子であり得る。真核生物では、そのような干渉ＲＮＡは、例えばFire, A. et al.(1998) Nature 391:806-11, Elbashir et al. (2001) Genes & Development 15(2): 188-200, Elbashir et al. (2001) Nature 411(6836):494-8、Ｃａｒｎｅｇｉｅ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅへの米国特許第６，５０６，５５９号、Ｂｅｎｉｔｅｃへの米国特許第６，５７３，０９９号、Ｗｈｉｔｅｈｅａｄ Ｉｎｓｔ．への米国特許出願第２００３／０１０８９２３号及び同第２００３／０１１４４０９号、ＰＣＴ国際公開公報第ＷＯ ０３／００６４７７、同第ＷＯ０３／０１２０５２号、同第ＷＯ０３／０２３０１５号、同第ＷＯ０３／０５６０２２号、同第ＷＯ０３／０６４６２１号及び同第ＷＯ０３／０７０９６６号に述べられているような、低分子干渉ＲＮＡ又はリボザイムであり得る。阻害剤はまた、もう１つ別のタンパク質又はペプチドであり得る。阻害剤は、例えばプロテアーゼ又はプロテアーゼタンパク質についてのコンセンサス配列を有するペプチドであり得る。阻害剤はまた、宿主においてプロテアーゼ又はプロテアーゼタンパク質についての直接又は間接阻害性分子を生産することができるタンパク質又はペプチドであり得る。プロテアーゼ阻害剤は、アマスタチン、Ｅ−６４、アンチパイン、エラスタチナール、ＡＰＭＳＦ、ロイペプチン、ベスタチン、ペプスタチン、ベンズアミジン、１，１０−フェナントロリン、キモスタチン、ホスホルアミドン、３，４−ジクロロイソクマリン、ＴＬＣＫ、ＤＦＰ、ＴＰＣＫを含み得る。１００以上の天然に生じるタンパク質プロテアーゼ阻害剤がこれまでに特定されている。それらは細菌から動物及び植物までにわたる多種多様な生物において単離された。それらは、立体障害を通して基質の活性部位へのアクセスを妨げるプロテアーゼの密接結合可逆性又は偽不可逆性阻害剤として行動する。それらの大きさも、５０残基（例えばＢＰＴＩ：ウシ膵トリプシン阻害剤）から４００残基（例えばα−１ＰＩ：α−１プロテイナーゼ阻害剤）まで極めて多様である。それらは、分子捕捉機構を通して大部分のプロテアーゼに結合し、阻害するα−マクログロブリンファミリー（例えばα−２マクログロブリン）のタンパク質を除いて、厳密にクラス特異的である。
外来性ベクター又はＤＮＡ構築物は、宿主細胞にトランスフェクト又は形質転換することができる。真核及び原核細胞をそれぞれ外来性核酸でトランスフェクトする及び形質転換するための手法は当技術分野において周知である。これらは、脂質小胞を介した取り込み、リン酸カルシウムを介したトランスフェクション（リン酸カルシウム／共沈）、ウイルス感染、特に改変ウイルス、例えば改変アデノウイルスを用いたウイルス感染、微量注入及び電気穿孔を含み得る。原核細胞形質転換に関しては、手法は、熱ショックを介した取り込み、無傷細胞との細菌プラトプラスト融合、微量注入及び電気穿孔を含み得る。植物形質転換のための手法は、アグロバクテリウム（Agrobacterium）、例えばＡ．トゥメファシエンス（A. tumefaciens）を介した導入、急速推進タングステン又は金マイクロプロジェクタイル、電気穿孔、微量注入及びポリエチレングリコールを介した取り込みを含む。ＤＮＡは、一本鎖又は二本鎖、線状又は環状、弛緩型又は超コイルＤＮＡであり得る。哺乳動物細胞をトランスフェクトするための様々な手法に関しては、例えばKeown et al. (1990) Processes in Enzymology Vol. 185, pp. 527-537参照。
組換え事象のために、構築物は、１又はそれ以上の核酸配列を異なる配列に挿入する又は転位することができる、１又はそれ以上の挿入配列を含み得る。しかし、構築物は、既存の細胞ＤＮＡ／ゲノム内への組込みを伴わない、特定された補償遺伝子又はそのホモログの外来性発現のために設計することができる。
構築物は、１又は２以上のリボソーム内部進入部位（internal ribosome entry site）（ＩＲＥＳ）を含み得る。構築物はまた、特定された遺伝子の少なくとも一部、又は特定された遺伝子の補因子、特定された補償遺伝子の少なくとも一部の突然変異型、又はプロテアーゼの場合は、特定された遺伝子の阻害剤をコードする核酸配列に作動可能に連結されたプロモーターを含み得る。あるいは、構築物はプロモーターレスであり得る。構築物が細胞ＤＮＡ／ゲノムに組み込まれるように設計されていない場合、ベクターは、典型的には少なくとも１個のプロモーターエレメントを含む。前記核酸配列に加えて、発現ベクターは選択マーカー配列を含み得る。発現構築物は、転写開始、終結のための部位、及び／又はリボソーム結合部位をさらに含み得る。特定された構築物を、細菌細胞、例えばＰ．フルオレセンス（P. fluorescens）又は大腸菌、酵母細胞、哺乳動物細胞、例えばＣＨＯ細胞、又は植物細胞を含むが、これらに限定されない、何らかの原核又は真核細胞において発現することができる。
クローニングベクターは、例えばプラスミドｐＢＲ３２２(Bolivar, Rodriguez et al. 1977)、ｐＵＣシリーズのプラスミド (Vieira and Messing 1982)、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ(Short, Fernandez et al. 1988)、ｐＡＣＹＣ１７７及びｐＡＣＹＣ１８４ (Chang and Cohen 1978)を含み得る。そのような構築物における使用のための外来性プロモーターは、ファージλＰＬプロモーター、大腸菌ｌａｃ、大腸菌ｔｒｐ、大腸菌ｐｈｏＡ、大腸菌ｔａｃプロモーター、ＳＶ４０初期、ＳＶ４０後期、レトロウイルスＬＴＲ、ＰＧＫＩ、ＧＡＬＩ、ＧＡＬＩＯ遺伝子、ＣＹＣＩ、ＰＨ０５、ＴＲＰＩ、ＡＤＨＩ、ＡＤＨ２、リン酸フォルグリムアルデヒド（forglymaldehyde）デヒドロゲナーゼ、ヘキソキナーゼ、ピルビン酸デカルボキシラーゼ、ホスホフルクトキナーゼ、リン酸トリオースイソメラーゼ、ホスホグルコースイソメラーゼ、グルコキナーゼα−接合因子フェロモン、ＰＲＢＩ、ＧＩＴ２、ＧＰＤＩプロモーター、メタロチオネインプロモーター、及び／又は哺乳動物ウイルスプロモーター、例えばアデノウイルス及びワクシニアウイルス由来のものを含むが、これらに限定されない。他のプロモーターは当業者に公知である。
外来性ベクターのためのプロモーター、又はゲノムに挿入するように設計された外来性プロモーターは、細胞における特異的応答エレメントに基づき得る。例えばプロモーターは、ＰＣＴ国際公開公報第ＷＯ２００４／００５２２１号に述べられているように、化合物、例えばアントラニレート又はベンゾエートに応答性であり得る。構築物は１又はそれ以上のプロモーターを含み得る。これらは独立しているか又は縦列であり得る。例えばプロモーターは、特定された補償遺伝子が、特定時間枠内で組換えタンパク質又はペプチドによって上方又は下方調節されるように設計することができる。例えば特定された遺伝子がフォールディング調節剤である場合、そのフォールディング調節剤又は補因子を、組換えタンパク質又はペプチドの誘導の直前に誘導することができる。プロモーターは、以下を含むがこれらに限定されない：

Figure 2008507294
構築物は、修飾された細胞を特定するための選択マーカーを含み得る。適切な選択マーカー遺伝子は以下を含むが、これらに限定されない：ある種の培地基質で増殖する能力を付与する遺伝子、例えばＨＡＴ培地（ヒポキサンチン、アミノプテリン及びチミジン）で増殖する能力を与えるｔｋ遺伝子（チミジンキナーゼ）又はｈｐｒｔ遺伝子（ヒポキサンチンホスホリボシルトランスフェラーゼ）；ＭＡＸ培地（ミコフェノール酸、アデニン及びキサンチン）での増殖を可能にする細菌ｇｐｔ遺伝子（グアニン／キサンチンホスホリボシルトランスフェラーゼ）。例えばSong, K-Y., et al. (1987) Proc. Nat 'I Acad. Sci. U.S.A. 84:6820-6824; Sambrook, J., et al. (1989) Molecular Cloning-A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N. Y., Chapter 16参照。選択マーカーの他の例は、化合物、例えば抗生物質に対する耐性を付与する遺伝子、選択基質で増殖する能力を付与する遺伝子、検出可能なシグナル、例えば発光を生じるタンパク質、例えば緑色蛍光タンパク質、高感度緑色蛍光タンパク質（ｅＧＦＰ）をコードする遺伝子を含む。例えば抗生物質耐性遺伝子、例えばネオマイシン耐性遺伝子（ｎｅｏ）(Southern, P., and P. Berg, (1982) J. Mol. Appl. Genet. 1:327-341)；及びハイグロマイシン耐性遺伝子（ｈｙｇ）((1983) Nucleic Acids Research 11:6895-6911, and Te Riele, H., et al. (1990) Nature 348:649-651)を含む、多種多様なそのようなマーカーが公知であり、入手可能である。他の選択マーカーは、アセトヒドロキシ酸シンターゼ（ＡＨＡＳ）、アルカリホスファターゼ（ＡＰ）、βガラクトシダーゼ（ＬａｃＺ）、βグルクロニダーゼ（ＧＵＳ）、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、赤色蛍光タンパク質（ＲＦＰ）、黄色蛍光タンパク質（ＹＦＰ）、シアン蛍光タンパク質（ＣＦＰ）、ホースラディッシュペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）、ルシフェラーゼ（Ｌｕｃ）、ノパリンシンターゼ（ＮＯＳ）、オクトピンシンターゼ（ＯＣＳ）、及びそれらの誘導体を含む。アンピシリン、ブレオマイシン、クロラムフェニコール、ゲンタマイシン、ハイグロマイシン、カナマイシン、リンコマイシン、メトトレキセート、ホスフィノトリシン、ピューロマイシン及びテトラサイクリンに対する耐性を付与する、多重選択マーカーが入手可能である。本発明において有用なさらなる選択マーカー遺伝子は、例えば米国特許第６，３１９，６６９号；同第６，３１６，１８１号；同第６，３０３，３７３号；同第６，２９１，１７７号；同第６，２８４，５１９号；同第６，２８４，４９６号；同第６，２８０，９３４号；同第６，２７４，３５４号；同第６，２７０，９５８号；同第６，２６８，２０１号；同第６，２６５，５４８号；同第６，２６１，７６０号；同第６，２５５，５５８号；同第６，２５５，０７１号；同第６，２５１，６７７号；同第６，２５１，６０２号；同第６，２５１，５８２号；同第６，２５１，３８４号；同第６，２４８，５５８号； 同第６，２４８，５５０号；同第６，２４８，５４３号；同第６，２３２，１０７号；同第６，２２８，６３９号；同第６，２２５，０８２号；同第６，２２１，６１２号；同第６，２１８，１８５号；同第６，２１４，５６７号；同第６，２１４，５６３号；同第６，２１０，９２２号；同第６，２１０，９１０号；同第６，２０３，９８６号；同第６，１９７，９２８号；同第６，１８０，３４３号；同第６，１７２，１８８号；同第６，１５３，４０９号；同第６，１５０，１７６号；同第６，１４６，８２６号；同第６，１４０，１３２号；同第６，１３６，５３９号；同第６，１３６，５３８号；同第６，１３３，４２９号；同第６，１３０，３１３号；同第６，１２４，１２８号；同第６，１１０，７１１号；同第６，０９６，８６５号；同第６，０９６，７１７号；同第６，０９３，８０８号；同第６，０９０，９１９号；同第６，０８３，６９０号；同第６，０７７，７０７号；同第６，０６６，４７６号；同第６，０６０，２４７号；同第６，０５４，３２１号；同第６，０３７，１３３号；同第６，０２７，８８１号；同第６，０２５，１９２号；同第６，０２０，１９２号；同第６，０１３，４４７号；同第６，００１，５５７号；同第５，９９４，０７７号；同第５，９９４，０７１号；同第５，９９３，７７８号；同第５，９８９，８０８号；同第５，９８５，５７７号；同第５，９６８，７７３号；同第５，９６８，７３８号；同第５，９５８，７１３号；同第５，９５２，２３６号；同第５，９４８，８８９号；同第５，９４８，６８１号；同第５，９４２，３８７号；同第５，９３２，４３５号；同第５，９２２，５７６号；同第５，９１９，４４５号；及び同第５，９１４，２３３号に述べられている。
欠失は、少なくとも約５ｂｐ、１０ｂｐ、２０ｂｐ、３０ｂｐ、４０ｂｐ又は５０ｂｐ、普通は少なくとも約１００ｂｐ、一般には約２０ｋｂｐ以上であり得、その場合、欠失は通常、１又はそれ以上のエクソン又はその一部、１又はそれ以上のイントロン又はその一部を含むコード領域の少なくとも一部であり得、隣接する非コード領域、特に５’非コード領域（転写調節領域）の一部を含み得るか又は含まない。それ故相同領域は、コード領域を超えて５’非コード領域まで、あるいは３’非コード領域までに及び得る。挿入は、一般には１０ｋｂｐを超えることができず、通常名５ｋｂｐを超えず、一般には少なくとも５０ｂｐであり、より通常は少なくとも２００ｂｐである。
相同の領域は突然変異を含むことができ、そこでは突然変異は、フレームシフトを与えるか又は鍵となるアミノ酸を変化させて、特定された遺伝子をさらに不活性化し得るか、又は突然変異は機能不全遺伝子を矯正し得る、等である。通常、突然変異は、相同なフランキング配列の約５％を超えないわずかな変化であり得る。
構築物は、当技術分野で公知の方法に従って作製することができ、様々なフラグメントを一緒にして、適切なベクターに導入し、クローニングして、分析し、その後所望構築物が達成されるまでさらに操作することができる（例えば図５−１１参照）。制限分析、切り出し、プローブの特定等を可能にするために、配列に様々な修飾を施すことができる。所望に応じて、沈黙突然変異を導入することができる。様々な段階で、制限分析、配列決定、ポリメラーゼ連鎖反応による増幅、プライマー修復、インビトロ突然変異誘発等を用いることができる。抗生物質耐性遺伝子及び陰性選択因子の組込みのための方法は当業者によく知られている（例えばWO 99/15650; U.S. Patent No. 6,080,576; U.S. Patent No. 6.136,566; Niwa, et al, J. Biochem. 113:343-349 (1993); and Yoshida, et al., Transgenic Research, 4:277-287 (1995)参照)。
構築物は、原核細胞複製系、例えば原核細胞、例えばＰ．フルオレセンス（P. fluorescens）又は大腸菌によって認識され得る起点を含む、細菌ベクターを使用して作製できる。挿入のために使用するマーカーと同じか又は異なる、マーカーを使用することができ、特定細胞への導入の前に除去することができる。ひとたび構築物を含むベクターが完成すれば、例えばある種の配列の欠失、線形化、あるいは相同配列に突然変異、欠失又は他の配列を導入することによって、前記ベクターをさらに操作することができる。最終的な操作後に、構築物を細胞に導入することができる。
本発明の方法は反復することができる。１つの実施形態では、宿主の修飾及び修飾した宿主における組換えタンパク質の発現後、その発現が修飾宿主細胞において変化している１又はそれ以上のさらなる特定遺伝子を特定するために、修飾宿主細胞の遺伝的プロフィールを分析する。特に、補償遺伝子は、組換えタンパク質又はペプチドを発現する修飾宿主細胞と比較したとき、又は非修飾宿主細胞と比較したとき、組換えタンパク質を発現する修飾宿主において高い発現を示すものであり得る。前記方法は、さらなる特定された遺伝子の発現を変化させること及び二重修飾された細胞において前記タンパク質又はペプチドを発現させることをさらに含む。これらの工程は、タンパク質発現を改善するために反復でき、１、２、３、４、５、６、７、８、９又は少なくとも１０回繰り返すことができる。
タンパク質の生産
本発明の方法は、最適には宿主細胞における組換えタンパク質又はペプチドの生産上昇を導く。生産上昇は、所与の時間での宿主タンパク質のグラム当りのタンパク質の量の上昇を含み得るか、又は宿主細胞が組換えタンパク質又はペプチドを生産している時間の長さの上昇を含み得る。生産上昇は、組換え宿主細胞の増殖のために必要条件の改善を含み得る。生産上昇は、完全長タンパク質又はペプチドの生産上昇であり得る。改善がタンパク質レベルの上昇である場合は、タンパク質又はペプチドは、宿主細胞内の１又はそれ以上の封入体において生産され得る。
生産上昇は、あるいは、生産されるタンパク質のグラム当り又は宿主タンパク質のグラム当りの活性タンパク質又はペプチドのレベル上昇であり得る。生産上昇はまた、組換えタンパク質のグラム当り又は宿主細胞タンパク質のグラム当りに生産される、回収可能なタンパク質又はペプチド、例えば可溶性タンパク質のレベル上昇であり得る。生産上昇はまた、タンパク質の総レベルの上昇と活性又は可溶性レベルの上昇の何らかの組合せであり得る。
生産上昇は、典型的には、修飾細胞における一定期間の誘導後の生産のレベルを、非修飾細胞における同じ誘導後の生産レベルと比較することによって測定される。
可溶性／不溶性
組換えタンパク質の改善された発現は、タンパク質の溶解度の上昇であり得る。組換えタンパク質又はペプチドは、宿主細胞の細胞質、ペリプラズム又は細胞外媒質から生産し、回収することができる。前記タンパク質又はペプチドは、不溶性又は可溶性であり得る。タンパク質又はペプチドは、１又はそれ以上の標的配列又は精製を助けるための配列を含み得る。
ある実施形態では、本発明は、宿主細胞における組換えタンパク質又はペプチドの溶解度を改善するための方法を提供する。ここで使用する「可溶性」という用語は、タンパク質が、生理的条件下に緩衝液中で１０−３０分間遠心したとき約５，０００−２０，０００ｘｇの遠心分離によって沈殿しないことを意味する。可溶性の活性タンパク質は、機能を発揮することができ、封入体又は他の沈殿塊の一部ではない。
本発明はまた、活性組換えタンパク質又はペプチドの回収率を改善することができる。例えば特定されたポリペプチドと親ポリペプチドの間の相互作用、ポリペプチド変異体、セグメント置換ポリペプチド及び／又は残基置換ポリペプチドは、何らかの好都合なインビトロ又はインビボアッセイによって測定できる。例えば、特定されたポリペプチドと親ポリペプチドの間、例えば酵素と基質の間、ホルモンとホルモン受容体の間、抗体と抗原の間、等の検出可能な相互作用を測定するためにインビトロアッセイが使用できる。そのような検出は、比色変化、放射能の変化、溶解度の変化、ゲル電気泳動及び／又はゲル排除法によって測定される分子量の変化、等の測定を含み得る。インビボアッセイは、生理的作用、例えば体重増加、電解質平衡の変化、血液凝固時間の変化、血餅溶解及び抗原応答の誘導の変化を検出するためのアッセイを含むが、これらに限定されない。一般に、特定されたポリペプチドと対象ポリペプチドの間の相互作用の変化を検出するための可変パラメータが存在する限り、いかなるインビボアッセイも使用できる。例えば米国特許第５，８３４，２５０号参照。
細胞質／ペリプラズム／分泌
ある実施形態では、タンパク質はまた、適切なシグナル分泌配列に融合している場合、ペリプラズム内に分泌され得る。１つの実施形態では、シグナル配列は、リン酸結合タンパク質、Ｌｙｓ−Ａｒｇ−Ｏｒｎ結合タンパク質（ＬＡＯｂｐ又はＫＲＯｂｐ）分泌シグナルペプチド、外膜ポーリンＥ（ＯｐｒＥ））分泌シグナルペプチド、アズリン）分泌シグナルペプチド、鉄（ＩＩＩ）結合タンパク質［Ｆｅ（ＩＩＩ）ｂｐ］）分泌シグナルペプチド、又はリポタンパク質Ｂ（ＬｐｒＢ））分泌シグナルペプチドであり得る。
１つの実施形態では、修飾宿主細胞あるいは二重又は多重修飾細胞から活性な可溶性形態のジスルフィド結合を含む特定ポリペプチドを回収するために、付加的なジスルフィド結合促進条件又は試薬は必要としない。１つの実施形態では、トランスジェニックペプチド、ポリペプチド、タンパク質、又はそれらのフラグメントは、その活性状態で折りたたまれた分子内立体配座を有する。細胞質において可溶性の複雑な哺乳動物タンパク質は、その後のペリプラズム内でのジスルフィド結合形成のためにチオール基の正しい位置づけによって適切に配置され得ることが認められた。１つの実施形態では、トランスジェニックペプチド、ポリペプチド、タンパク質、又はフラグメントは、その活性状態で少なくとも１つの分子内ジスルフィド結合を含み、おそらく２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８又は２０まで又はそれ以上のジスルフィド結合を含む。
１つの実施形態では、生産されて発現されるトランスジェニックペプチド、ポリペプチド、タンパク質、又はそれらのフラグメントの５０％以上は、細胞質又はペリプラズムにおいて可溶性活性形態又は不溶性で容易に再生される形態の単一機能性ペプチド、ポリペプチド、タンパク質、又はそれらのフラグメントとして生産される。もう１つの実施形態では、発現されるタンパク質の約６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％が活性形態で又は容易に活性形態に再生される形態で得られる。
（実施例）
本試験において使用した細菌株を表１に列挙する。Ｐ．フルオレセンス（P. fluorescens）の菌株を振とうフラスコにおいて３０℃で増殖させた。様々な時点で各々の菌株についてＯＤ575を記録した。

表１ 細菌株の概略
Figure 2008507294
以下の実験で使用したプラスミドを表２に列挙する。

表２ プラスミドの概略
Figure 2008507294
試料の収集及びＲＮＡ単離
全ての試料を２００ｍｌ標準振とうフラスコ実験から収集した。試料は、図に示すような種々の時点で採取した。各々の時点で、振とうフラスコから細胞培養１０ｍｌを収集し、ＲＮＡを安定化するためにＲＮＡｌａｔｅｒ（Ａｍｂｉｏｎ，Ａｕｓｔｉｎ，ＴＸ）試薬１０ｍｌと混合した。
マイクロアレイハイブリダイゼーション及びデータ解析
各々のＲＮＡ試料について、蛍光ヌクレオチドＣｙ３−ｄＵＴＰ又はＣｙ５−ｄＵＴＰ（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ， Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ， ＮＪ）を、ランダム六量体プライマー（Ａｍｅｒｓｈａｍ）を用いた逆転写（ＲＴ）反応においてｃＤＮＡに組み込んだ。２つの標識ｃＤＮＡプールを一緒にし、マイクロアレイスライドに適用した。マイクロアレイスライドは、Ｐ．フルオレセンス（P. fluorescens）の各々のＯＲＦである５０量体アミノ修飾オリゴデオキシリボヌクレオチド（オリゴ）を含む。各々のオリゴを、ＳＤＤＣ−２ロボット（Ｖｉｒｔｅｋ，Ｔｏｒｏｎｔｏ，Ｃａｎａｄａ−現在はＢｉｏ−Ｒａｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，ＣＡを通して配給されている）及びＳＭＰ３ピン（ＴｅｌｅＣｈｅｍ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｃ．，Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ，ＣＡ）を使用して異なる位置の２つのスポットに関して２回プリントした。使用した顕微鏡スライドは、効率的なＤＮＡ結合のために正に荷電したエポキシ樹脂で被覆した（ＭＷＧ Ｉｎｃ，Ａｌａｍｅｄａ，ＣＡ）。プリント後、スライドをＭＷＧの仕様書に従って後処理した。データ解析をようにするためにＢｉｏＤｉｓｃｏｖｅｒｙ Ｉｎｃ．（Ｅｌ Ｓｅｇｕｎｄｏ，ＣＡ）からのソフトウエアパッケージを使用した。このパッケージは、ＣｌｏｎｅＴｒａｃｋｅｒ（商標）、ＩｍａＧｅｎｅ（商標）、ＧｅｎｅＳｉｇｈｔ（商標） モジュール及びＧｅｎｅＤｉｒｅｃｔｏｒ（商標）データベースから成る。各々のハイブリダイズしたスライドを、マイクロアレイに結合したＣｙ３及びＣｙ５標識ｃＤＮＡの蛍光を測定するためにＳｃａｎＡｒｒａｙ ５０００（Ｐａｃｋａｒｄ ＢｉｏＳｃｉｅｎｃｅ，Ｂｉｌｌｅｒｉｃａ，ＭＡ）を用いて走査した。獲得した画像をＩｍａＧｅｎｅ（商標）で数量化し、生データをＧｅｎｅＳｉｇｈｔ（商標）で処理した。データ作成の間に、各遺伝子についてのスポット強度をバックグラウンド補正した；アレイ全体についての総シグナル強度を使用して、Ｃｙ５チャネルについてのシグナルをＣｙ３チャネルに基準化した；各遺伝子についてのＣｙ５対Ｃｙ３の基準化した比をｌｏｇ２変換し、複製を一緒にした。
ＳＤＳ−ＰＡＧＥによるタンパク質発現分析
ＩＰＴＧ誘導後様々な時点で培養アリコートを収集し、１０のＯＤ600に基準化した。細胞溶解産物を１１，０００ｇで５分間の遠心分離によって可溶性と不溶性の分画に分けた。２．５μｌのアリコートを２Ｘ ＮｕＰＡＧＥ ＬＤＳ試料緩衝液（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）、５０μＭ ＤＴＴと混合し、Ｈ2Ｏを加えて１０μｌにして、その後９５℃で５分間加熱した。タンパク質を分離し、Ｓｉｍｐｌｙ Ｂｌｕｅ Ｓａｆｅｓｔａｉｎ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）を用いてクマシーブルーで染色した１２％Ｎｕｐａｇｅゲル上で視覚化した。
蛍光活性測定
緑色蛍光タンパク質（ＣＯＰ）とヒト成長ホルモン（ｈＧＨ）の融合物の蛍光活性によってタンパク質収率も測定した。ｈｇｈ：：ＣＯＰ融合構築物を野生型又はｈｓｌＵ突然変異型菌株に形質転換し、ウラシルを含まないＭ９グルコース寒天プレートで選択した。ＩＰＴＧ誘導細胞培養を５のＯＤ600に基準化した。Ｓｐｅｃｔｒａｍａｘ Ｇｅｍｉｎｉマイクロプレート分光蛍光計（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ，Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ，ＣＡ）を適切な設定（Ｅｘ４８５、Ｅｍ５３８５３０バンドパスフィルター）下で使用して相対蛍光（ＲＦ）活性を測定した。
細胞質及びペリプラズムタンパク質を生産する菌株の遺伝子発現分析−種々の時点の比較
異種タンパク質の生産の間のＦＭ及びプロテアーゼ遺伝子発現を検討するため、Ｐ．フルオレセンス（P. fluorescens）菌株ＤＣ２０６、２８０、２４０及び２７１を初期マイクロアレイ実験において使用した。ＤＣ２０６は宿主菌株であり、細胞増殖についての対照として使用した；ＤＣ２８０はベクターだけのプラスミドであり、マイクロアレイ実験についての対照として使用した；ＤＣ２４０は、可溶性である細胞質ニトリラーゼ酵素をコードするプラスミドを有するＤＣ２０６である；ＤＣ２７１は、部分的に不溶性であるペリプラズムヒト成長ホルモン（ｐｂｐ：：ｈＧＨ）をコードするプラスミドを有するＤＣ２０６である。菌株を振とうフラスコ培地２００ｍｌ中で増殖させ、ＯＤ575を測定することによって細胞増殖を観測した。接種後２４時間目にＩＰＴＧ誘導を実施した。全ての菌株が同様に増殖し、ＲＮＡ単離及びＤＮＡマイクロアレイを用いた転写プロファイリング（ＴｘＰ）のための誘導の直前（０時間目）と４時間後に培養試料を採取した（図１）。
遺伝的プロフィール、すなわち転写プロフィールは、誘導後４時間目の時点の試料と０時間目の試料の比較に基づき、２つの試料をＣｙ３−ｄＵＴＰ又はＣｙ５−ｄＵＴＰのいずれかの蛍光染料で標識し、各々の菌株について同じスライドに共ハイブリダイズした。各々のハイブリダイゼーションを染料交換実験によって２回実施した（すなわち試料をＣｙ３−ｄＵＴＰ又はＣｙ５−ｄＵＴＰで標識した）（表３、スライド１−６）。ハイブリダイズしたスライドを、共焦点レーザースキャナーを用いて走査した。各々の遺伝子についてのシグナル強度を測定し、Ｂｉｏｄｉｓｃｏｖｅｒｙ（Ｅｌ Ｓｅｇｕｎｄｏ，ＣＡ）からのマイクロアレイソフトウエアパッケージを用いて処理した。各々の遺伝子についての２つの時点の発現比を算定し、菌株全体にわたる全ての遺伝子についての比を、３つの菌株（ＤＣ２８０、ＤＣ２４０及びＤＣ２７１）の間での比の数値と傾向に基づいてクラスター化した（図２）。

表３ 実施例１−３において実施したマイクロアレイ実験の要約
Figure 2008507294
高レベルの組換えタンパク質生産によって課せられるストレス下でのＰ．フルオレセンス（P. fluorescens）におけるＦＭ及びプロテアーゼ遺伝子発現に焦点を当てるために、ＦＭ及びプロテアーゼ遺伝子のリストをクラスター分析と比較した。ＤＣ２８０、ＤＣ２４０及びＤＣ２７１からの全ての遺伝子の階層的クラスター化分析後、２つのクラスターにおいてＦＭとプロテアーゼが特定された（クラスター６及び７内の直線；図２）。
クラスター７内の４個の遺伝子は、可溶性細胞質ニトリラーゼを生産するＤＣ２４０又はいかなるタンパク質も過剰生産しないＤＣ２８０と比較して、主として不溶性のペリプラズムヒト成長ホルモンを発現するＤＣ２７１において有意に高い発現を示す。４個の遺伝子は、ＨｓｌＶをコードするｒｘｆ０１９６１、ＨｓｌＵをコードするｒｘｆ０１９５７、ＣｂｐＡをコードするｒｘｆ０３９８７及びＨｔｐＧをコードするｒｘｆ０５４５５である。大腸菌ＨｓｌＶ（ＣｌｐＱ）とＨｓｌＵ（ＣｌｐＹ）は共に細胞質プロテアーゼを形成する。小さなサブユニット、ＨｓｌＶは、真核生物のプロテアソームαサブユニットに関連するペプチダーゼである。大きなサブユニット、ＨｓｌＵは、他のＣｌｐファミリーのＡＴＰアーゼ、例えばＣｌｐＡ及びＣｌｐＸに相同性を有するＡＴＰアーゼである。大腸菌のＣｂｐＡは、その構造だけでなくその機能からも判断されるように、広く特性決定されているコシャペロンＤｎａＪの類似体である。ＤｎａＪにおける損傷の表現型、例えば増殖についての温度感受性は、多コピープラスミドへのｃｂｐＡ遺伝子の導入後に修復される。大腸菌のＨｔｐＧは、インビトロでＡＴＰ非依存性分子シャペロンとして機能する。非天然フォールディング中間体を認識し、一過性に結合して、溶液中のそれらの遊離濃度を低下させ、それ故非特異的凝集を予防する。
図２のクラスター６内の遺伝子を、あまり顕著でない作用を特定するために再び階層的クラスター化を用いて分類した。図３は、ＦＭ及びプロテアーゼが２つの主要クラスター（クラスター６及び８における直線）において特定されたことを示す。クラスター８内の２個のＦＭは、数多くのタンパク質を折りたたむために共に働くことが広く知られている２個の主要シャペロン、ＤｎａＫとＤｎａＪである。クラスター６からの遺伝子の発現値のさらなる分析は、付加的なＦＭ、ニトリラーゼを生産するＤＣ２４０又はいかなるタンパク質も過剰生産しないＤＣ２８０と比較したときｐｂｐ：：ｈＧＨを生産するＤＣ２７１においてより高く発現されるＣｌｐＸを特定した。大腸菌ＣｌｐＸ熱ショックタンパク質は、原核及び真核生物ＨＳＰ１００／Ｃｌｐ ＡＴＰアーゼファミリーの成員に相同である。大腸菌のＣｌｐＸを、ＣｌｐＰプロテアーゼサブユニットによるタンパク質分解に関してコンピテントな形態のある種のポリペプチドを保持する、ＡＴＰ依存性Ｃｌｐプロテアーゼの特異的成分として単離した。ＣｌｐＸは、ＣｌｐＰの不在下で、ＤＮＡ複製に関与する開始タンパク質を活性化することにより、分子シャペロンとして働くことができる。ペリプラズムｈＧＨ生産のために重要な、特定されたＦＭ及びプロテアーゼを表４に列挙する。

表４ 定常状態ｍＲＮＡ比のレベルがＤＣ２４０及びＤＣ２８０と比較してＤＣ２７１においてより高いＦＭ及びプロテアーゼ遺伝子のリスト。列記した数値は、ＩＰＴＧ誘導後４時間目対０時間目の比である。
Figure 2008507294
 *ｄｎａＫに関しては、２個のプローブがマイクロアレイチップ上に存在し、それ故２つの遺伝子発現値が示されている。
細胞質及びペリプラズムタンパク質を生産する菌株の遺伝子発現分析−種々の菌株の直接比較
上記で得た結果を確認するため、２つの菌株ＤＣ２７１とＤＣ２４０の直接比較によって付加的なマイクロアレイ実験を実施した（表３のスライド７−１０）。誘導後４時間目の時点での２つの菌株の比較は、部分的に可溶性のｐｂｐ：：ｈＧＨを発現する細胞においてほとんど同一のセットのＦＭ及びプロテアーゼ遺伝子が上方調節されることを確認した（表５）。表５に列記する全ての遺伝子が、完全に可溶性のニトリラーゼを生産する細胞と比較したとき、部分的に不溶性のｈＧＨを生産する菌株において有意に（すなわち≧２倍）高く発現される。ＤＣ２７１とＤＣ２４０の直接比較において、部分的に不溶性のｈＧＨ生産の間に有意に高い遺伝子発現値を示した時点比較に比べて（表４参照）数個の付加的なタンパク質が特定された。それらの遺伝子は、ＣｌｐＢをコードするｒｘｆ０８３４７、ＣｌｐＡをコードするｒｘｆ０４５８７、及びＦｋｂＰをコードするｒｘｆ０５７５３を含んだ。大腸菌ＣｌｐＢホモログは、ＤｎａＫＪ−ＧｒｐＥと共に封入体の再活性化に関与する。大腸菌からのＣｌｐＡはシャペロン機能を有し、ＣｌｐＰと一緒になったとき、タンパク質を分解する。大腸菌において、ＦｋｂＰはペプチジル−プロリルイソメラーゼとして機能する。

表５ 定常状態ｍＲＮＡレベルがＤＣ２４０と比較してＤＣ２７１においてより高いＦＭ及びプロテアーゼ遺伝子のリスト。列記した数値は、ＩＰＴＧ誘導後４時間目のＤＣ２７１対ＤＣ２４０の比である。
Figure 2008507294
 *ｄｎａＫに関しては、２個のプローブがマイクロアレイチップ上に存在し、それ故２つの遺伝子発現値が示されている。
不溶性細胞質タンパク質を生産する菌株の遺伝子発現分析
ＤＣ２７１は部分的にペリプラズムヒト成長ホルモン（ｐｂｐ：：ｈＧＨ）を発現するので、主として不溶性の細胞質ｈＧＨを発現する菌株において類似の又は異なるＦＭ及びプロテアーゼ遺伝子が上方調節されるかどうかを検討した。ＤＣ３６９をこの実験で使用した。誘導後４時間目の試料を０時間目の時点の試料と比較し、表３（スライド１１及び１２）に示すようにマイクロアレイ実験を実施した。やはり、類似のＦＭ及びプロテアーゼ遺伝子が上方調節されることが認められ、特定された遺伝子がペリプラズムフォールディング及びタンパク質分解ではなく細胞質フォールディング及びタンパク質分解に関与することを示唆した（表６）。実験において特定された遺伝子の要約を、上方調節の倍数と共に図４のベン図に示す。

表６ 定常状態ｍＲＮＡレベルが０時間目の時点と比較して誘導後４時間目にＤＣ３６９においてより高いＦＭ及びプロテアーゼ遺伝子のリスト。列記した数値は、ＩＰＴＧ誘導後４時間目対０時間目（誘導の直前）の比である。
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 *ｄｎａＫに関しては、２個のプローブがマイクロアレイチップ上に存在し、それ故２つの遺伝子発現値が示されている。
Ｐ．フルオレセンスＤＣ２０６におけるｈｓｌＵ突然変異型菌株の生成
２個の遺伝子ｈｓｌＶＵが、最も高く上方調節される特定遺伝子の中に認められた。ＨｓｌＵは細胞質ＡＴＰアーゼである。大腸菌における相同タンパク質は、大腸菌のエネルギー依存性タンパク質分解を促進する第二タンパク質と共同して働くことができる。ＨｓｌＵは、プロテアソームのαサブユニットに相同性を有するタンパク質、ＨｓｌＶと相互作用する。大腸菌ＨｓｌＶＵホモログは、Missiakas, D., et al. (1996) Identification and characterization of HsIV HsIU (CIpQ CIpY) proteins involved in overall proteolysis of misfolded proteins in Escherichia coli. Embo J 15:6899-909の中で、折りたたみ異常タンパク質の全体的タンパク質分解に関与することが報告された。ＤＮＡ塩基配列分析は、Ｐ．フルオレセンスｈｓｌＶＵ遺伝子が２シストロン性オペロンの一部である可能性が高いことを示唆した（図５）。
ＨｓｌＶＵが実際にｈＧＨの分解に関与することを確認するため、ｈｓｌＵノックアウト菌株を構築した。そのような菌株は、ｈｓｌＵの挿入不活性化によって生成した（図６）。ｈｓｌＵに対して内側の約５５０ｂｐ ＤＮＡフラグメントをカナマイシン耐性ｐＣＲ２．１−ＴＯＰＯベクターにクローニングした。このベクターは、大腸菌において機能性であるがＰ．フルオレセンス（P. fluorescens）では機能性でない複製起点（ＣｏｌＥ１）を有するので、カナマイシン耐性を付与するために相同的組換えを通して構築したプラスミドをＤＣ２０６の染色体に組み込む。カナマイシン耐性コロニーについての正しい挿入部位を、最初に増幅された領域の外側で且つプラスミド骨格内にハイブリダイズするプライマーを使用した診断コロニーＰＣＲによって確認した（表３）。構築したｈｓｌＵ突然変異型菌株をＤＣ３７０と称した。
ｈｓｌＵ遺伝子の〜５５０ｂｐの内側領域を増幅するプライマーを設計した（表７）。内側フラグメントを、Ｔａｑポリメラーゼ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を用いて増幅し、精製して、ｐＣＲ２．１−ＴＯＰＯベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）にクローニングした。プラスミドをコンピテントＰ．フルオレセンス（P. fluorescens）ＤＣ２０６に形質転換し、２５０μｇ／ｍｌ ウラシル及び５０μｇ／ｍｌ カナマイシンを添加したＭ９グルコース寒天プレートで選択した。

表７ プライマー
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ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析によるタンパク質発現の比較
ｈｓｌＵ遺伝子ノックアウトの影響を検討するため、２個の外来性タンパク質発現を、親菌株ＤＣ２０６と新たに構築した突然変異型菌株ＤＣ３７０の間で比較した。ｐｂｐ：：ｈＧＨ（ｐＤＯＷ１３２３）及びｈＧＨ（ｐＤＯＷ１４２６）をコードする遺伝子を担持するプラスミドを各々コンピテントＤＣ３７０細胞に形質転換し、それぞれ菌株ＤＣ３７３及びＤＣ３７２を生じた。４つの菌株に関して標準振とうフラスコ増殖実験を実施した。図７は、野生型と突然変異型菌株が同様の増殖速度を有することを示す。試料をＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルで泳動させた（図８及び９）。結果は、プロテアーゼサブユニットＨｓｌＵの欠失の故に突然変異型がより高い量のタンパク質を生産したことを示唆する。
蛍光活性によるタンパク質発現の比較
認められたＨｓｌＵの欠如のｈＧＨの収率への影響はＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を用いて定量することが困難であるので、ＣＯＰ緑色蛍光タンパク質とｈＧＨの間の融合タンパク質の蛍光によってタンパク質生産の一時的プロフィールを観測した。ｈＧＨ：：ＣＯＰ融合物を含むプラスミドを構築し、親菌株ＤＣ２０６及びｈｓｌＵ遺伝子欠失菌株ＤＣ３７０に形質転換して、菌株ＨＪ１０４及びＨＪ１０５を生成した（表１）。標準振とうフラスコ増殖実験を実施し、蛍光測定のために様々な時点で試料を採取した（図１０）。蛍光光度計からの読み取りは、ｈｓｌＵプロテアーゼ突然変異型菌株が親菌株と比較して有意に高いタンパク質発現レベルを有することを明らかに示した（図１１）。この所見はＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析によって得られた結果を裏付ける。野生型菌株と比較して、ｈｓｌＵ突然変異型は、誘導後２４時間目に相対蛍光の３３．０５％を上昇させた（図１１の挿入図参照）。
ｈｓｌＵＶ完全ノックアウト菌株の構築
Ｈｓｌプロテアーゼは２つのサブユニット：ｈｓｌＵによってコードされるＡＴＰ結合サブユニット及びｈｓｌＶによってコードされるプロテアーゼサブユニット、から成る。先に構築したＨｓｌプロテアーゼノックアウト菌株はｈｓｌＵ遺伝子の挿入不活性化である。ＨｓｌＶが、もう１つ別のプロテアーゼのＡＴＰ結合サブユニットと結合できることによってまだプロテアーゼとして機能し得るという懸念を取り除くため、ｈｓｌＵとｈｓｌＶ遺伝子の両方が染色体から除去された欠失菌株を構築した。
図１３に示すように、ｈｓｌＵＶ領域に隣接する２個のＤＮＡフラグメントのＰＣＲ増幅によってプラスミドｐＤＯＷ２０５０を構築し、その後オーバーラップ伸長によるスプライシング（ＳＯＥ）ＰＣＲ法（Ho, S.N. (1991) Method for gene splicing by overlap extension using the polymerase chain reaction. Application: US patent 89-3920955023171参照)を用いて２個のフラグメントを融合した。次に、融合ＤＮＡフラグメントをベクターｐＤＯＷ１２６１−２のＳｒｆＩ部位に連結した。挿入物をＤＮＡ塩基配列決定によって確認した後、欠失プラスミドをｐＤＯＷ２０５０と命名した。
プラスミドｐＤＯＷ２０５０をＤＣ２０６に電気穿孔し、１％グルコースと１５μｇ／ｍｌ テトラサイクリンを添加したＭ９寒天プレートに塗布した。テトラサイクリン耐性は、ゲノム内の２つの相同領域の１つでプラスミド全体を染色体内に組み換える組込み事象によるものである（図１３）。組み込まれたプラスミドと染色体内の相同ＤＮＡ領域の間の第二相同的組換えから生じるｈｓｌＵＶ遺伝子の欠失を有する細胞を選択するために、２５０μｇ／ｍｌ ウラシルを添加したＬＢ培地でテトラサイクリン耐性コロニーを定常期まで増殖させた。その後、５００μｇ／ｍｌ ５−フルオロオロト酸（５−ＦＯＡ）を添加したＬＢ寒天プレートに細胞を塗布した。第二組換え事象によって組み込まれたプラスミドを喪失した細胞は同時にｐｙｒＦ遺伝子も喪失しており、それ故５−ＦＯＡに耐性であり、ＤＣ４１７と称する所望の染色体ｈｓｌＵＶ欠失菌株を生じる。
ｈｓｌＵＶ欠失菌株の表現型分析
ｈＧＨタンパク質を発現するｈｓｌＵＶ欠失菌株（菌株ＨＪ１１５）のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析は、ｈｓｌＵ挿入突然変異型菌株ＤＣ３７２を使用して先に認められたものと同様に（データは示していない）、野生型菌株ＤＣ３６９よりもはるかに高いタンパク質収率を示した。
タンパク質収率を、先に述べたのと同じ方法を用いてｈＧＨ：：ＣＯＰ融合物の蛍光活性によっても測定した。ｈＧＨ：：ＣＯＰ融合物を含むプラスミドｐＤＯＷ１３４９を野生型及び突然変異型菌株に形質転換し、それぞれ菌株ＨＪ１０４及びＨＪ１１７を生じた。標準振とうフラスコ増殖実験を実施し、相対蛍光測定のために様々な時点で試料を採取した（図１４）。蛍光光度計からの読み取りは、ｈｓｌＵＶプロテアーゼ欠失菌株が野生型菌株と比較して有意に高いタンパク質発現レベル（約５０％の収率上昇）を有することを示した。この結果は、ｈｓｌＵノックアウト菌株に関して先に認められたのと同様である。
新しいセットのプロテアーゼがｈｓｌＵＶプロテアーゼ欠失菌株において上方調節されるかどうかを調べるために、ＤＮＡマイクロアレイ実験を実施した。野生型（ＤＣ３６９）及びｈＧＨを発現する突然変異型菌株（ＨＪ１１５）を使用して標準振とうフラスコ増殖実験を実施した。各々の菌株について、誘導後４時間目の試料を０時間目の時点の試料（異種タンパク質誘導の直前）と比較し、ＤＮＡマイクロアレイ実験を実施した。野生型と突然変異型菌株の間で２つの時点の比を比較して、ｈｓｌＵＶプロテアーゼ欠失菌株において上方調節されるプロテアーゼ遺伝子の新しいリストを特定した（表８）。プロテアーゼをコードするこれらの新たに特定された遺伝子は、今や、異種タンパク質生産の収率をさらに改善するための２回目の遺伝子欠失事象の標的であり得る。

表８ ＩＰＴＧ誘導後４時間目対０時間目（誘導の直前）の比に基づき、その定常状態ｍＲＮＡレベルが野生型菌株（ＤＣ３６９）と比較してｈｓｌＵＶプロテアーゼ欠失菌株（ＨＪ１１５）においてより高いプロテアーゼ遺伝子。
Figure 2008507294
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フォールディング調節剤の共過剰発現は標的タンパク質ｈＧＨの溶解度を上昇させる
図４に示す転写プロファイリングデータに基づき、フォールディング調節剤（ＦＭ）ＤｎａＫ及びＤｎａＪの発現は、対照菌株と比較して組換えタンパク質を生産する菌株において上昇した（表４及び５参照）。ｈＧＨと共にＧｒｐＥ、ＤｎａＫ及びＤｎａＪを共過剰生産した菌株を生産し、これが可溶性ｈＧＨのレベル上昇の蓄積を生じさせるかどうかを特定するために試験した。
ｈＧＨとの共過剰発現のためのｇｒｐＥ−ｄｎａＫＪ含有プラスミドの構築
Ｐ．フルオレセンス（P. fluorescens）ｇｒｐＥ−ｄｎａＫＪ遺伝子を、ＭＢ２１４（ＤＮｅａｓｙ；Ｑｉａｇｅｎ，Ｖａｌｅｎｃｉａ，ＣＡ）から単離した染色体ＤＮＡを鋳型とし、ＲＣ１９９（５’−ＡＴＡＴＡＣＴＡＧＴＡＧＧＡＧＧＴＡＡＣＴＴＡＴＧＧＣＴＧＡＣＧＡＡＣＡＧＡＣＧＣＡ−３’）及びＲＣ２００（５’−ＡＴＡＴＴＣＴＡＧＡＴＴＡＣＡＧＧＴＣＧＣＣＧＡＡＧＡＡＧＣ−３’）をプライマーとして使用して増幅し、ＰｆｕＴｕｒｂｏ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ，Ｌａ Ｊｏｌｌａ，ＣＡ）を製造者の指示に従って使用した。生じたＰＣＲ産物（４ｋｂ）をＳｐｅＩ及びＸｂａＩ（上記プライマーにおいて下線を付した制限部位）で消化し、ｐＤＯＷ２２３６に連結して、ｔａｃプロモーターの制御下にｇｒｐＥ−ｄｎａＫＪ遺伝子を含むｐＤＯＷ２２４０を作製した。プラスミドｐＤＯＷ２２４０をＳｐｅＩ及びＨｉｎｄＩＩＩで消化し、生じたｇｒｐＥ ｄｎａＫＪを含む４．０ｋｂフラグメントを、Ｑｉａｑｕｉｃｋ（Ｑｉａｇｅｎ）を用いてゲル精製し、同じくＳｐｅＩとＨｉｎｄＩＩＩで消化したｐＤＯＷ２２４７に連結した。マンニトールプロモーターの制御下にｇｒｐＥ−ｄｎａＫＪを含む、生じたプラスミド、ｐＤＯＷ３５０１を、２５０μｇ／ｍｌ ウラシルを添加したＭ９グルコースプレート上で選択することによってＤＣ３８８に形質転換した。最後に、ｐＤＯＷ１４２６を上記菌株（ＤＣ４６２）に電気穿孔し、Ｍ９グルコースプレートで選択して、２個の誘導的プラスミド：１）ＰtacｈＧＨを担持するｐＤＯＷ１４２６及び２）ＰmtlｇｒｐＥ−ｄｎａＫＪを担持するｐＤＯＷ３５０１、を有する菌株ＤＣ４６３を生じた。
振とうフラスコ発酵、試料収集及び分析
ＤＣ４６３の２つの培養を振とうフラスコで増殖させた。誘導後２４時間目にｈＧＨについては０．１ｍＭ ＩＰＴＧ及びＧｒｐＥ−ＤｎａＫＪについては０．５％マンニトールを添加してタンパク質誘導を実施した。誘導後０、４、８、２４及び４８時間目に試料を収集した。各々の時点で、１ｍＬに基準化した２０個のＯＤ600細胞を採集し、ＥａｓｙＬｙｓｅ（商標）（Ｅｐｉｃｅｎｔｒｅ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）を用いて溶解して、１４，０００ｒｐｍで３０分間の遠心分離によって可溶性と不溶性の分画に分けた。等容量の試料をＢｉｏＲａｄ（Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，ＣＡ）２ｘレムリ緩衝液と混合し、９５℃で５分間加熱して、３０μＬを、１ｘトリスグリシンＳＤＳランニング緩衝液（ＢｉｏＲａｄ）を用いてＢｉｏＲａｄ １５％トリスＨＣｌ Ｃｒｉｔｅｒｉｏｎゲルに負荷した。図１５に示すようにＳｉｍｐｌｙ Ｂｌｕｅ Ｓａｆｅｓｔａｉｎ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）でタンパク質を視覚化した。生じたクマシー染色ゲルをＭｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ Ｐｅｒｓｏｎａｌ Ｄｅｎｓｉｔｏｍｅｔｅｒ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ，Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ，ＣＡ）を用いて走査し、ＩｍａｇｅＱｕａｎｔとエクセルを用いて解析を行った。図１５に示すように、ＧｒｐＥ、ＤｎａＫＪの共過剰発現はｈＧＨの溶解度を有意に上昇させ、総タンパク質収率はより低かったが、標的タンパク質のほぼ１００％を可溶性分画に変換した。ＩＰＴＧとマンニトールの同時添加を用いてＤＣ４６３の増殖と誘導を反復する付加的な実験は、ＧｒｐＥ ＤｎａＫＪが共過剰生産されたとき、ｈＧＨ溶解度の度合は様々であったが（５０−１００％：データは示していない）、ここで示す結果を厳密に模倣した。これらの所見は、転写プロファイリングに基づく標的菌株遺伝子操作が、組換えタンパク質の溶解度及び／又は収率を高めるための合理的菌株設計を導き得ることをさらに明らかにする。
ある種の実施形態と非限定的実施例を参照して本発明を説明した。本発明の他の実施形態も可能であることは当業者には明白である。
図１は、Ｐ．フルオレセンスの種々の菌株の増殖比較（経時的な光学密度）のグラフである。細胞を、接種後２４時間目に０．３Ｍ ＩＰＴＧで誘導した。菌株は、空ベクターｐＤＯＷ１３３９を担持するＤＣ２８０、可溶性細胞質ニトリラーゼ酵素を産生するＤＣ２４０、及び部分的に不溶性のペリプラズムｈＧＨを産生するＤＣ２７１である。ＤＣ２８０、ＤＣ２４０及びＤＣ２７１の親株、ＤＣ２０６を対照として含めた。矢印で示すように、ＩＰＴＧ誘導後０時間目と４時間目にＲＮＡ単離と遺伝子発現プロファイリングのために試料を採取した。 図２は、ＩＰＴＧ０時間目（図の下部に示す）と比較したときのＩＰＴＧ後４時間目の、１２のクラスターへのＰ．フルオレセンス菌株ＤＣ２８０、ＤＣ２４０及びＤＣ２７１からの全ての遺伝子の階層的クラスタリングのグラフである。数値と傾向に基づき、Ｓｐｏｔｆｉｒｅ ＤｅｃｉｓｉｏｎＳｉｔｅからの階層的クラスタリングアルゴリズムを用いて遺伝子をクラスター化し、分類した。破線は、スポットの質の不良又は低い発現レベルのために除去したデータ点を示す。ｘ軸は各々の菌株の比較を示す；ｙ軸はＩＰＴＧ誘導前に対するＩＰＴＧ誘導後４時間目の相対発現値を示す。全ての特定されるＦＭは強調される。クラスター７は、ペリプラズムｈＧＨタンパク質を過剰生産する菌株ＤＣ２７１において高発現される２個のＦＭ及び２個のプロテアーゼサブユニット遺伝子を示す。残りのＦＭ遺伝子はクラスター６に分類される。 図３は、図２からのクラスター６の階層的クラスター分析である。新しくラスター８において、どちらも先に特定されたＨｓｌＶＵ、ＣｂｐＡ及びＨｔｐＧと同様のペリプラズム組換えタンパク質生産に関するより高い発現レベルを示す２個のフォールディング調節剤、ＤｎａＫ及びＤｎａＪが特定された。クラスター６は、残りのＦＭがどこに分類されるかを示す。 図４は、表５、６及び７の３セットの実験からの上方調節プロテアーゼ及びＦＭを示すベン図である。表５、６及び７に要約するように、隅に示した３セットの実験における遺伝子リストの重複を強調するために遺伝子のリストをベン図に整理した。各々の遺伝子に関して、各々の実験の比率を、２をカットオフ点として示した。 図５は、Ａｒｔｅｍｉｓによって作製したＰ．フルオレセンスからのｈｓｌＶ（ＲＸＦ０１９６１）及びｈｓｌＵ（ＲＸＦ０１９５７）遺伝子の配列分析のグラフである。コドン使用頻度のプロット（上のパネル）は、遺伝子境界が正確であることを指示する。これは、ＲＸＦ０１９６１及びＲＸＦ０１９５７の遺伝子の下に示すように、力納金に対するＨｓｌＶ及びＨｓｌＵタンパク質配列という最良ホモログによって裏付けられる。Ｐｈｒａｐクオリティスコアのプロットは、シーケンスクオリティが良好である、すなわちスコアの直線が、１０ｋｂ中１個のエラーよりも良好なクオリティを指示する水平直線よりも上であることを示す（中央のパネル）。遺伝子の下の白い先のとがった箱は、ＤＮＡマイクロアレイ実験において使用するために作製されたプローブの位置を示す。 図６は、ｈｓｌＵの約５５０ｂｐのＰＣＲ産物（淡青色の箱）をＴＯＰＯ ＴＡ２．1１クローニングベクター（円）に連結したｈｓｌＵ突然変異型構築の概略図である。生じたプラスミドをコンピテントＰ．フルオレセンス細胞に形質転換し、ｈｓｌＵ遺伝子における挿入突然変異の構築を確認するためにカナマイシン（ｋａｎ）耐性コロニーを診断ＰＣＲで分析した。 図７は、野生型を、振とうフラスコ生産培地でｈＧＨ又はｐｂｐ：：ｈＧＨを過剰生産するｈｓｌＵ突然変異型菌株と比較する増殖曲線アッセイのグラフである。矢印は試料を採取した時点を指示する。 図８は、ｐｂｐ：：ｈＧＨを発現する菌株ＤＣ２７１とＤＣ３７３のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析の画像である。試料は、誘導の直前（０時間目）及びＩＰＴＧ添加後４時間目、８時間目、２４時間目及び３０時間目にＤＣ２７１（野生型、Ｗ）とＤＣ３７３（ｈｓｌＵ突然変異型、Ｍ）から採取した。可溶性（Ｓ）及び不溶性（Ｉ）分画を、分析した各々の試料について調製した。プロセシングされていないｈＧＨとプロセシングされたｈＧＨの生産を矢印で示す。分子量（ＭＷ）マーカー（Ｍａ）をゲルの右側に示す。 図９は、細胞質内でｈＧＨを発現する菌株ＤＣ３６９とＤＣ３７２のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析の画像である。試料は、誘導の直前（０時間目）及びＩＰＴＧ添加後４時間目、８時間目、２４時間目、３０時間目及び５０時間目にＤＣ３６９（野生型、Ｗ）とＤＣ３７２（ｈｓｌＵ突然変異型、Ｍ）から採取した。可溶性（Ｓ）及び不溶性（Ｉ）分画を、分析した各々の試料について調製した。ｈＧＨの生産を矢印で示す。分子量（ＭＷ）マーカー（Ｍａ）をゲルの右側に示す。 図１０は、ｈＧＨ：：ＣＯＰ融合タンパク質を発現する菌株の増殖曲線のグラフである。菌株は、陰性対照としてｈＧＨだけを発現するＤＣ３６９（ＣＯＰに融合していない）；ｈＧＨ：：ＣＯＰを発現する野生型、ＨＪ１０４；ｈＧＨ：：ＣＯＰを発現するｈｓｌＵ突然変異型、ＨＪ１０５を含む。 図１１は、蛍光光度計を用いたｈＧＨ：：ＣＯＰ融合タンパク質を発現する菌株についての緑色蛍光活性測定のグラフである。５個のＯＤ６００の細胞培養を、ＩＰＴＧ誘導後種々の時点でｈＧＨ又はｈＧＨ：：ＣＯＰを担持する各々の菌株について採取した。試験した菌株は、陰性対照としてｈＧＨだけを発現するＤＣ３６９（ＣＯＰに融合していない）；ｈＧＨ：：ＣＯＰを発現する野生型、ＨＪ１０４；ｈＧＨ：：ＣＯＰを発現するｈｓｌＵ突然変異型、ＨＪ１０５を含む。挿入されている表は、ＩＰＴＧ誘導後種々の時点で野生型と比較したｈｓｌＵ突然変異型における相対蛍光の上昇パーセントを示す。 図１２は、２つの試料の間のｍＲＮＡの相対存在率を測定する工程の絵画的表示である。 図１３は、ｐｙｒＦ陰性菌株におけるｈｓｌＵＶ遺伝子の染色体欠失の構築の表示である。Ａ．プラスミドｐＤＯＷ２０５０は、ｈｓｌＵＶ遺伝子に隣接する５０５ｂｐ及び６３４ｂｐのＤＮＡフラグメントを含む。自殺プラスミドｐＤＯＷ２０５０はＰ．フルオレセンスを複製することができないので、プラスミド全体をゲノム内に組み込む相同領域の１つでの単一組換え事象後にテトラサイクリン耐性細胞だけが生成される。Ｂ．テトラサイクリン耐性細胞はゲノムに組み込まれたプラスミド全体を含む。これらの細胞はまた、プラスミドからコードされるｐｙｒＦ遺伝子も含む。ｐｙｒＦ陽性菌株では毒性化合物に変換される、ＦＯＡを添加した寒天平板に細胞をプレートすることによって第二組換え事象を有する細胞についての選択が起こった。染色体欠失菌株を配列解析によって確認した。 図１４は、蛍光光度計を用いたｈＧＨ：：ＣＯＰ融合タンパク質を発現する菌株に関する緑色蛍光活性測定の経時的な相対蛍光のグラフである。野生型（ＨＪ１０４）及びｈｓｌＵＶ欠失菌株（ＨＪ１１７）の両方について２つの試料を使用した。 図１５は、フォールディング調節剤ＧｒｐＥ−ＤｎａｋＪを含む又は含まない、ｈＧＨを発現する菌株のＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルの画像である。試料を、ＩＰＴＧによる誘導後様々な時点で（０、４、８、２４及び４８時間目）採取し、２０のＯＤ６００に基準化し、ＥａｓｙＬｙｓｅを用いて溶解した。可溶性（Ｓ）及び不溶性（Ｉ）分画をＢｉｏＲａｄ Ｃｒｉｔｅｒｉｏｎ １５％トリスＨＣｌ ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルで分離し、クマシーで染色した。

Claims (53)

  1. ｉ）組換え宿主細胞又は生物において組換えタンパク質又はペプチドを発現すること；
    ｉｉ）前記組換え細胞の遺伝的プロフィールを分析し、前記組換えタンパク質を発現するように修飾されていない宿主細胞又は前記組換えタンパク質を発現していない組換え細胞におけるよりも高いレベルで前記組換え細胞において発現される１又はそれ以上の補償遺伝子又は遺伝子産物を特定すること；及び
    ｉｉｉ）前記組換え細胞における前記特定された補償遺伝子又は遺伝子産物の発現を遺伝子修飾によって変化させ、組換えタンパク質の発現、活性又は溶解度の上昇を達成する修飾組換え細胞を提供すること、
    を含む、宿主細胞又は生物における組換えタンパク質又はペプチドの発現を改善する方法。
  2. 前記修飾組換え細胞において前記タンパク質又はペプチドを発現することをさらに含む、請求項１に記載の方法。
  3. （ａ）前記修飾組換え細胞において前記組換えタンパク質又はペプチドを発現すること；
    （ｂ）前記修飾組換え細胞の遺伝的プロフィールを分析し、前記修飾組換え細胞において区別して発現される少なくとも１つの第二遺伝子又は遺伝子産物を特定すること；
    （ｃ）前記修飾組換え細胞における第前記二の特定された遺伝子産物の発現を変化させ、二重修飾された細胞を提供すること；及び
    （ｄ）前記二重修飾組換え細胞において前記タンパク質又はペプチドを発現すること
    をさらに含む、請求項１に記載の方法。
  4. 工程ａ）−ｄ）を反復することをさらに含む、請求項３に記載の方法。
  5. 前記特定された遺伝子又は遺伝子産物の発現を変化させることによって、細胞生存率が影響を受けるまで工程ａ）−ｄ）を反復することを含む、請求項４に記載の方法。
  6. 前記組換えタンパク質又はペプチドの発現が標的エンドポイントに達するまで工程ａ）−ｄ）を反復することを含む、請求項４に記載の方法。
  7. 前記遺伝的プロフィールが、前記組換え細胞の遺伝的プロフィールを前記宿主細胞の第二の遺伝的プロフィールと比較することによって分析される、請求項１に記載の方法。
  8. 前記遺伝的プロフィールがトランスクリプトームプロフィールである、請求項１に記載の方法。
  9. 前記トランスクリプトームプロフィールがマイクロアレイを通して決定される、請求項８に記載の方法。
  10. 前記遺伝的プロフィールがプロテオームプロフィールである、請求項１に記載の方法。
  11. 前記プロテオームプロフィールが二次元ゲル電気泳動、ＩＣＡＴ又はＬＣ／ＭＳを通して決定される、請求項１０に記載の方法。
  12. 前記プロテオームプロフィールがペプチドアレイを通して決定される、請求項１０に記載の方法。
  13. 前記ペプチドアレイが抗体アレイである、請求項１２に記載の方法。
  14. 前記特定される遺伝子産物が、プロテアーゼ、プロテアーゼのサブユニット、プロテアーゼの補因子、プロテアーゼの発現に影響を及ぼす細胞又は遺伝子調節剤である、請求項１に記載の方法。
  15. 前記特定される遺伝子産物がプロテアーゼである、請求項１４に記載の方法。
  16. 前記特定される遺伝子産物がプロテアーゼのサブユニットである、請求項１４に記載の方法。
  17. 前記特定される遺伝子産物がプロテアーゼの補因子である、請求項１４に記載の方法。
  18. 前記特定される遺伝子産物が、プロテアーゼの発現に影響を及ぼす細胞又は遺伝子調節剤である、請求項１４に記載の方法。
  19. 前記特定される遺伝子産物が、Ｄ−アラニル−メソ−ジアミノピメリン酸エンドペプチダーゼ、亜鉛プロテアーゼ、ミクロソームジペプチダーゼ、細胞外メタロプロテアーゼ前駆体、細胞***タンパク質ｆｔｓＨ及び、遺伝子ｈｓｌＶ、ｈｓｌＵ、ｃｌｐＸ、ｃｌｐＡ及びｃｌｐＢ由来の遺伝子産物から成る群より選択される、請求項１４に記載の方法。
  20. 前記組換えタンパク質又はペプチドが前記宿主細胞において発現されるとき、特定される遺伝子産物のｍＲＮＡレベルが上方調節される、請求項１４に記載の方法。
  21. 前記特定された遺伝子産物を宿主細胞ゲノムから除去する、請求項１４に記載の方法。
  22. 前記特定された遺伝子産物を相同的組換えによって除去する、請求項２１に記載の方法。
  23. 前記特定される遺伝子産物が、フォールディング調節剤、フォールディング調節剤のサブユニット、フォールディング調節剤の補因子、又はフォールディング調節剤の発現に影響を及ぼす細胞又は遺伝子調節剤である、請求項１に記載の方法。
  24. 前記特定される遺伝子産物がフォールディング調節剤である、請求項２３に記載の方法。
  25. 前記特定される遺伝子産物がフォールディング調節剤のサブユニットである、請求項２３に記載の方法。
  26. 前記特定される遺伝子産物がフォールディング調節剤の補因子である、請求項２３に記載の方法。
  27. 前記特定される遺伝子産物が、フォールディング調節剤の発現に影響を及ぼす細胞又は遺伝子調節剤である、請求項２３に記載の方法。
  28. 前記フォールディング調節剤がシャペロンタンパク質である、請求項２３に記載の方法。
  29. 前記フォールディング調節剤が、遺伝子ｃｂｐＡ、ｈｔｐＧ、ｄｎａＫ、ｄｎａＪ、ｆｋｂＰ２、ｇｒｏＥＳ及びｇｒｏＥＬの遺伝子産物から成る群より選択される、請求項２３に記載の方法。
  30. 前記特定される遺伝子産物の発現が、前記特定遺伝子、特定遺伝子の補因子、又は特定遺伝子の細胞又は遺伝子調節剤の発現を上昇させることによって変化する、請求項２３に記載の方法。
  31. 前記発現上昇が、前記特定遺伝子産物をコードするＤＮＡの組込みによる、請求項３０に記載の方法。
  32. 前記発現上昇が、宿主細胞ゲノムへのプロモーターの挿入による、請求項３０に記載の方法。
  33. 前記発現上昇が、前記宿主細胞への外来性ベクターの組込みによる、請求項３０に記載の方法。
  34. 前記宿主細胞が微生物細胞である、請求項１に記載の方法。
  35. 前記宿主細胞がシュードモナス菌（Pseudomonad）である、請求項１に記載の方法。
  36. 前記宿主細胞がＰ．フルオレセンス（P. fluorescence）細胞である、請求項１に記載の方法。
  37. 前記宿主細胞が大腸菌細胞である、請求項１に記載の方法。
  38. 前記宿主細胞が、昆虫細胞、哺乳動物細胞、酵母細胞、真菌細胞及び植物細胞から成る群より選択される、請求項１に記載の方法。
  39. 前記マイクロアレイが、前記宿主細胞のゲノムの少なくとも５０％に対する結合パートナーの試料を含む、請求項９に記載の方法。
  40. 前記マイクロアレイ手法が、前記宿主細胞のゲノムの少なくとも８０％に対する結合パートナーの試料を含む、請求項９に記載の方法。
  41. 前記マイクロアレイが、前記宿主細胞のゲノムの少なくとも９０％に対する結合パートナーの試料を含む、請求項９に記載の方法。
  42. 前記マイクロアレイが、前記宿主細胞のゲノムの少なくとも９５％に対する結合パートナーの試料を含む、請求項９に記載の方法。
  43. 前記改善された発現が、組換えタンパク質又はペプチドの量の上昇である、請求項１に記載の方法。
  44. 前記改善された発現が、前記組換えタンパク質又はペプチドの溶解度の上昇である、請求項１に記載の方法。
  45. 前記改善された発現が、前記組換えタンパク質又はペプチドの活性の上昇である、請求項１に記載の方法。
  46. 前記遺伝的プロフィールが、遺伝子ファミリーにおける遺伝子のプロフィールである、請求項１に記載の方法。
  47. 前記プロフィールが、プロテアーゼ及びフォールディング調節剤を含む、請求項１に記載の方法。
  48. 前記プロフィールが本質的にプロテアーゼから成る、請求項４６に記載の方法。
  49. 少なくとも２つのプロテアーゼの発現を低下させるように遺伝的に修飾された組換えタンパク質を発現する宿主細胞又は生物。
  50. Ｄ−アラニル−メソ−ジアミノピメリン酸エンドペプチダーゼ、亜鉛プロテアーゼ、ミクロソームジペプチダーゼ、細胞外メタロプロテアーゼ前駆体、細胞***タンパク質ｆｔｓＨ、及び遺伝子ｈｓｌＶ、ｈｓｌＵ、ｃｌｐＸ、ｃｌｐＡ及びｃｌｐＢ由来の遺伝子産物から成る群より選択される少なくとも１つのプロテアーゼの発現を低下させるように遺伝的に修飾された組換えタンパク質を発現する宿主細胞又は生物。
  51. 少なくとも１つのプロテアーゼの発現を低下させるように遺伝的に修飾された哺乳動物由来の組換えタンパク質を発現する宿主細胞又は生物。
  52. 前記組換えタンパク質がヒト成長ホルモンである、請求項５２に記載の宿主細胞又は生物。
  53. フォールディング調節剤サブユニットではない少なくとも２つのフォールディング調節剤の発現を上昇させるように遺伝的に修飾された組換えタンパク質を発現する宿主細胞又は生物。
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