BRPI0922772B1 - Domínio variável único de imunoglobulina e polipeptídeos isolados - Google Patents

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Laurent Jespers
Malgorzata Pupecka
Ian M Tomlinson
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Abstract

métodos para selecionar polipeptídeos resistentes a protease. a invenção se refere a um método para selecionar, isolar e/ou recuperar um peptídeo ou polipeptídeo a partir de uma biblioteca ou um repertório de peptídeos e polipeptídeos (por exemplo, um sistema de exibição) que seja resistente a degradação por uma protease tal como uma protease encontrada no soro. geralmente, o método compreende fornecer uma biblioteca ou repertório de peptídeos ou polipeptídeos, incubando a biblioteca ou o repertório com uma protease sob condições adequadas para a atividade da protease, e selecionar, isolar e/ou recuperar um peptídeo ou polipeptídeo que seja resistente a degradação pela protease e tenha uma atividade biológica desejada. os peptídeos e os polipeptídeos selecionados têm utilidade como terapêuticos, por exemplo, para tratar doenças em humanos.

Description

ANTECEDENTE DA INVENÇÃO
[001]Polipeptídeos e peptídeos se tornaram agentes muito importantes em uma variedade de aplicações, incluindo aplicações industriais e uso como agentes médicos, terapêuticos e diagnóstico. No entanto, muitos peptídeos, polipeptídeos e proteínas terapêuticas são particularmente susceptíveis a degradação in vivo por pro-teases de ocorrência natural. Ainda, em certos estados fisiológicos, como estados inflamatórios (por exemplo, COPD) e câncer, a quantidade de proteases presente em um tecido, órgão ou animal (por exemplo, no pulmão, ou adjacente a um tumor) pode aumentar. Este aumento em proteases pode resultar em degradação e inativação aceleradas de proteínas endógenas e de peptídeos, polipeptídeos e proteínas terapêuticas que são administradas para tratar uma doença. Consequentemente, alguns agentes que têm potencial para uso in vivo (por exemplo, uso no tratamento, diagnóstico ou prevenção de doença em mamíferos, como humanos) têm somente eficácia limitada porque são rapidamente degradados e inativados por proteases.
[002]Polipeptídeos resistentes a proteases fornecem várias vantagens. Por exemplo, polipeptídeos resistentes à protease permanecem ativos in vivo por mais tempo do que agentes sensíveis a proteases e, consequentemente, permanecem funcionais por um período de tempo que é suficiente para produzir efeitos biológicos. Existe uma necessidade para métodos melhorados de seleção de polipeptídeos que são resistentes a degradação por protease e ainda têm uma atividade biológica dese-jável.
[003]Peptídeo tipo glucagon(GLP)-1 é um hormônio incretina com potentes ações insulinotrópicas e glucagonostáticas dependentes de glicose, efeitos tróficos nas células β pancreáticas e efeitos inibitórios na secreção gastrintestinal e motilidade, que combina para diminuir a glicose plasmática e reduzir as excursões glicêmicas. GLP-1 é um agonista do receptor de GLP-1. Além disso, através desta capacidade de melhorar a saciedade, GLP-1 reduz a ingesta de alimento, limitando, assim, o ganho de peso e pode ainda causar perda de peso. Tomadas juntos, estas ações fornecem à GLP-1 um perfil único, considerado altamente desejável para um agente antidiabé- tico, particularmente uma vez que a dependência de glicose de seus efeitos anti-hi- perglicêmicos poderia minimizar qualquer risco severo de hipoglicemia. No entanto, seu perfil farmacocinético/farmacodinâmico é tal que GLP-1 nativa não é útil terapeu- ticamente. Assim, enquanto GLP-1 é mais efetiva quando administrada continuamente, injeções simples subcutâneas têm efeitos de curta duração. GLP-1 é altamente susceptível a degradação enzimática in vivo, e a clivagem por dipeptidil peptidase IV (DPP-IV) é provavelmente a mais relevante, uma vez que isto ocorre rapidamente e gera um metabólito não insulinotrópico. Estratégias para aproveitar o potencial terapêutico de GLP-1, baseado em um entendimento dos fatores que influenciam sua estabilidade metabólica e perfil farmacocinético/farmacodinâmico foram, portanto, o foco de pesquisa intensa.
[004]Um trabalho extensivo tem sido feito para tentar inibir a peptidase ou para modificar GLP-1 de maneira que sua degradação seja diminuída enquanto mantém sua atividade biológica. WO05/027978 (US2007203058) revela derivados de GLP-1 contendo um perfil prolongado de ação (e incorporado aqui como referência, como exemplos de derivados e análogos de GLP-1 que podem ser usados na presente invenção). WO 02/46227 (US2004053370) revela proteínas heterólogas de fusão compreendendo um polipeptídeo (por exemplo, albumina) fundidas GLP-1 ou análogos (a revelação destes análogos é incorporado aqui como referência como exemplos de análogos de GLP-1 que podem ser usados na presente invenção). WO05/003296, WO03/060071, WO03/059934 revelam proteína de fusão onde GLP-1 foi fundido com albumina para tentar aumentar a meia-vida do hormônio.
[005]No entanto, apesar destes esforços, uma GLP-1 ativa de longa duração não foi produzida.
RESUMO DA INVENÇÃO
[006]A invenção refere-se a métodos para selecionar peptídeos ou polipeptí-deos resistentes a protease e métodos para selecionar peptídeos ou polipeptídeos que se ligam a ligantes alvos com alta afinidade. A invenção refere-se ainda a um método de produzir um repertório de peptídeos ou polipeptídeos resistentes a protea-ses.
[007]Em um aspecto, a invenção é um método para selecionar um peptídeo ou polipeptídeo resistente a protease. O método compreende fornecer um repertório de peptídeos ou polipeptídeos, incubando o repertório e uma protease sob condições apropriadas para atividade de protease, e recuperar um peptídeo ou polipeptídeo que tem uma atividade biológica desejada, por meio da qual um peptídeo ou polipeptídeo resistente a protease é selecionado.Em uma modalidade, o repertório de peptídeos ou polipeptídeos é expresso em um sistema de exibição e a protease é uma protease que é expressa em um sistema de exibição ou hospedeiro de expressão. Por exemplo, em uma modalidade, o repertório de peptídeos ou polipeptídeos é expresso em células bacterianas e a protease é uma protease endógena a uma bactéria. Apropriadamente, as condições para a expressão do repertório maximizam a expressão e a atividade da protease endógena, como protease bacteriana. A expressão de protease e a atividade são maximizadas, por exemplo, pelo aumento do tempo e/ou temperatura para expressão de proteína do repertório em bactéria. Por exemplo, o tempo de incubação pode ser de 1 hora à uma noite (por exemplo, de 12 até 24 horas) ou maior (por exemplo, de 24 até 48 horas, ou maior). Em uma modalidade, a temperatura pode ser de 30 a 37 graus C ou mais. Além disso, a expressão de protease pode ser aumentada usando diferentes cepas bacterianas e/ou modificações de ingredientes do meio. A densidade da cultura de bactéria pode ainda ser variada. Em outra modalidade, o sistema de exibição pode ser modificado, por exemplo, por modificação genética para melhorar a expressão da protease.
[008]Em uma modalidade, o repertório e fornecido como um sistema de exibi-ção de bacteriófago onde o repertório de bacteriófago é expresso e/ou amplificado em células bacterianas E. coli, como células E. coli TB1, células TC1 ou células de E.coli cepa HB2151. Consequentemente, nesta modalidade, a protease bacteriana é uma protease expressa endogenamente em células E. coli. Em uma modalidade, a protease bacteriana pode ser uma protease que é expressa em um periplasma bacteri- ano. Em uma modalidade, a expressão de protease pode ser durante a produção de fago, secreção ou no sobrenadante bacteriano. Assim, em uma modalidade da invenção, é fornecido um método que compreende as etapas de tomar uma biblioteca de bacteriófago, expressar tal biblioteca em bactéria sob condições apropriadas para atividade de protease bacteriana, incubar tal biblioteca expressa com um ligante alvo, por meio do qual uma peptídeo de ligação alvo resistente a protease é selecionado. Opcionalmente, dita incubação com um ligante alvo inclui a presença de outra protease.
[009]Em outra modalidade, o sistema de expressão é um sistema de expres-são de levedura como Pichia e a protease é uma protease endógena que é expressa em células de levedura.
[0010]Em uma modalidade, o método, de acordo com a invenção, compre-ende ainda combinar o repertório e outra protease sob condições apropriadas para dita atividade de protease e recuperar um peptídeo ou polipeptídeo que tem uma ati-vidade biológica desejada, por meio da qual um peptídeo ou polipeptídeo resistente a protease é selecionado. Em uma modalidade, a protease é combinada com o reper-tório em solução (ou seja, a protease não é imobilizada em um suporte). Adequada-mente, a outra protease é encontrada em um ou mais de soro, escarro, muco (por exemplo, muco gástrico, muco nasal, muco bronquial), lavagem broncoalveolar, ho- mogenato pulmonar, extrato pulmonar, extrato pancreático, fluido gástrico, saliva ou lágrimas.
[0011]Em outro aspecto, é fornecido um método para selecionar um peptídeo ou polipeptídeo resistente a protease. O método compreende fornecer um repertório de peptídeos ou polipeptídeos, incubar o repertório e uma primeira protease sob con-dições apropriadas para atividade de protease que compreende combinar o repertório com uma segunda protease sob condições apropriadas para a atividade de protease e recuperar um peptídeo ou polipeptídeo que tem uma atividade biológica desejada, por meio do qual um peptídeo ou polipeptídeo resistente a protease é selecionado. Em uma modalidade deste aspecto, a primeira protease é uma protease endógena ao sistema de exibição do repertório e a segunda protease é selecionado de uma protease encontrada em soro, escarro, muco (por exemplo, muco gástrico, muco nasal, muco bronquial), lavagem broncoalveolar, homogenato pulmonar, extrato pulmonar, extrato pancreático, fluido gástrico, saliva ou lágrimas. Deve ser apreciado, no entanto, que a “primeira” e “segunda” etapas de protease podem ser conduzidas em qualquer ordem. Além disso, deve ser apreciado que múltiplas repetições de qualquer uma das etapas podem ser incluídas no método da invenção.
[0012]Em uma modalidade de qualquer aspecto da invenção, tais condições para dita outra ou segunda atividade protease são (i) cerca de 10μg/ml a cerca de 3mg/ml de protease, (ii) cerca de 20°C a cerca de 40°C e (iii) por pelo menos 30 mi-nutos. Em uma modalidade, estas condições rigorosas permitem a seleção de peptí-deos ou polipeptídeos com uma alta afinidade e/ou Tm melhorada. Em tal caso, os peptídeos e polipeptídeos podem apresentar alta afinidade na forma monomérica.
[0013]Em uma modalidade, nos métodos da invenção, em conformidade com qualquer aspecto, para ditas condições apropriadas para atividade de protease, cerca de 10 a cerca de 10 a cerca de 100 μg/ml de protease é usada. Para ditas condições apropriadas para atividade de protease, uma temperatura de cerca de 30 a cerca de 37°C (por exemplo, cerca de 37°C ou cerca de temperatura ambiente) pode ser usada. Em uma modalidade, o repertório e a protease pode, ser combinados por pelo menos uma hora (por exemplo, cerca de 1 hora, cerca de duas horas, cerca de uma noite, por exemplo 18 a 24 horas). Nos métodos da invenção, o repertório e a protease são em uma modalidade incubados por um período de pelo menos 30 minutos. Em uma modalidade, a protease é usada em cerca de 100 μg/ml e o repertório combinado e a protease são incubados em cerca de 37°C por pelo menos 1 hora.
[0014]Em uma modalidade de qualquer aspecto da invenção, a razão (em uma base de mol/mol) de protease, por exemplo, tripsina, para polipeptídeo ou domí-nio variável é 8.000 a 80.000 de protease:domínio variável. Em uma modalidade, a razão (em uma base de peso/peso, por exemplo a base de micrograma/micrograma) de protease (por exemplo, tripsina), para polipeptídeo ou domínio variável é 16.000 a 160.000 de protease:domínio variável. Em uma modalidade, a protease é usada em uma concentração de pelo menos 100 ou 100 microgramas/ml de protease.
[0015]Qualquer protease desejada pode ser usada em um método de acordo com qualquer aspecto da invenção, como um ou mais dos seguintes, serina protease, cisteína protease, aspartato proteases, tiol proteases, metaloprotease da matriz, car- boxipeptidase (por exemplo, carboxipeptidase A, carboxipeptidase B), tripsina, quimo- tripsina, pepsina, papaína, elastase, leucozima, pancreatina, trombina, plasmina, ca- tepsinas (por exemplo, catepsina G), proteinase (por exemplo, proteinase 1, proteinase 2, proteinase 3), termolisina, quimosina, enteropeptidase, caspase (por exemplo, caspase 1, caspase 2, caspase 4, caspase 5, caspase 9, caspase 12, caspase 13), calpaína, ficaína, clostripaína, actinidaína, bromelaína, separase e dipeptidil peptidase IV (DPP-IV). Em modalidades particulares, a protease é tripsina, elastase ou leucozima. A protease pode ainda ser fornecida por um extrato biológico, homogenato biológico ou preparação biológica, por exemplo, células inteiras in vitro. Se desejado, o método compreende ainda adicionar um inibidor de protease à combinação do repertório e a protease após a incubação estar completa.
[0016]Em uma modalidade de qualquer um dos métodos da invenção, a(s) protease(s) está em solução quando combinada com o repertório.
[0017]Em uma modalidade de qualquer aspecto da invenção, a atividade bio-lógica desejada é atividade de ligação, por exemplo, a um ligante, por exemplo, a um ligante alvo ou a um ligante genérico. Em algumas modalidades, um peptídeo ou po- lipeptídeo que tem uma atividade biológica desejada é recuperado com base em uma atividade de ligação. Por exemplo, o peptídeo ou polipeptídeo pode ser recuperado com base em ligação a um ligante genérico, como a proteína A, proteína G ou proteína L. A atividade de ligação pode ainda ser uma ligação específica a um ligante alvo. Ligantes alvos exemplares incluem ApoE, Apo-SAA, BDNF, Cardiotrofina-1, CEA, CD40, CD40 Ligante, CD56, CD38, CD138, EGF, receptor de EGF, ENA-78, Eotaxina, Eotaxina-2, Exodus-2, FAPα, FGF-ácido, FGF-básico, fator de crescimento de fi- broblasto- 10, ligante FLT3, Fractalkine (CX3C), GDNF, G-CSF, GM-CSF, GF-β1, albumina sérica humana, insulina, IFN-Y, IGF-I, IGF-II, IL- 1α, IL-1 β, receptor de IL-1, receptor tipo 1 de IL-1, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8 (72 a.a.), IL-8 (77 a.a.), IL- 9, IL-10, IL-11, IL-12, IL-13, IL-15, IL-16, IL-17, IL-18 (IGIF), Inibina α, Inibina β, IP-10, fator de crescimento de queratinócito -2 (KGF-2), KGF, Leptina, LIF, Linfotactina, substância inibitória de Mullerian, fator inibitório de colônia de monócito, proteína que atrai monócito, M-CSF, MDC (67 a.a.), MDC (69 a.a.), MCP-1 (MCAF), MCP-2, MCP- 3, MCP-4, MDC (67 a.a.), MDC (69 a.a.), MIG, MIP-1a, MlP-1β, MIP-3α, MIP-3β, MIP- 4, fator inibidor de progenitor de mielóide - 1 (MPIF-I), NAP-2, Neurturina, fator de crescimento de nervo, β-NGF, NT-3, NT-4, Oncostatina M, PDGF-AA, PDGF-AB, PDGF-BB, PF-4, RANTES, SDF1α, SDF1β, SCF, SCGF, fator de célula tronco (SCF), TARC, TGF-α, TGF- β, TGF-β2, TGF-β3, fator de necrose tumoral (TNF), TNF-α, TNF- β, receptor I de TNF, receptor II de TNF, TNIL-I, TPO, VEGF, VEGF A, VEGF B, VEGF C, VEGF D, VEGF receptor 1, VEGF receptor 2, VEGF receptor 3, GCP-2, GRO/MGSA, GRO-β, GRO-Y, HCCl, 1-309, HER 1, HER 2, HER 3, HER 4, albumina sérica, vWF, proteínas amilóides (por exemplo, alfa amilóide), MMP12, PDK1, IgE, IL- 13Rα1, IL-13Ra2, IL-15, IL-15R, IL-16, IL-17R, IL-17, IL-18, IL-18R, IL-23 IL-23R, IL- 25, CD2, CD4, CD11a, CD23, CD25, CD27, CD28, CD30, CD40, CD40L, CD56, CD138, ALK5, EGFR, FcERl, TGFb, CCL2, CCLl 8, CEA, CR8, CTGF, CXCL12 (SDF- 1), quimase, FGF, Furina, Endotelina-1, Eotaxinas (por exemplo, Eotaxin, Eotaxina-2, Eotaxina-3), GM-CSF, ICAM-1, ICOS, IgE, IFNa, 1-309, integrinas, L-selectina, MIF, MIP4, MDC, MCP-I, MMPs, neutrofila elastase, osteopontina, OX-40, PARC, PD-I, RANTES, SCF, SDF-1, siglec8, TARC, TGFb, Trombina, Tim-1, TNF, TRANCE, Trip- tase, VEGF, VLA-4, VCAM, α4β7, CCR2, CCR3, CCR4, CCR5, CCR7, CCR8, alfa- vbeta8, alfavbeta8, cMET, CD8, vWF, proteínas amilóide (por exemplo, alfa amilóide), MMP12, PDK1, e IgE. Em outra modalidade, o ligante alvo é receptor de GLP-1 ou porções do mesmo. Por exemplo, no método, de acordo com qualquer aspecto da invenção, o ligante pode ser domínio extracelular de receptor de GLP-1. Em modalidades particulares de qualquer aspecto da invenção, o peptídeo ou polipeptídeo é recuperado por panning.
[0018]Em uma modalidade de qualquer um dos métodos da invenção, o re-pertório é exposto a um ligante (ligante alvo, ligante genérico) quando na presença de protease e um ou mais membros do repertório são selecionados com base na ligação ao ligante. Em algumas modalidades de qualquer um dos métodos da invenção, o repertório compreende um sistema de exposição. Por exemplo, o sistema de exposição pode ser uma exibição de bacteriófago, exibição de ribossomo, compartimentali- zação de emulsão e exposição, exposição de levedura, exposição de puromicina, exposição bacteriana, exposição em plasmídeo ou exposição covalente. Sistemas preferenciais de exposição ligam a função que codificam de um ácido nucleico e as características funcionais do peptídeo ou polipeptídeo que codificam pelo ácido nucléico. Em modalidades particulares, o sistema de exibição compreende pacotes genéticos replicáveis.
[0019]Em algumas modalidades de qualquer um dos métodos da invenção, o sistema de exibição compreende a exposição de bacteriófagos. Por exemplo, o bac-teriófago pode ser fd, M13, lambda, MS2 ou T7. Em modalidades particulares, o sis-tema de exibição de bacteriófago é multivalente. Em algumas modalidades, o peptídeo ou polipeptídeo é exposto como uma proteína de fusão pIII.
[0020]Em uma modalidade de qualquer um dos métodos de invenção, o re-pertório de peptídeos ou polipeptídeos (por exemplo, domínios variáveis) é exposto em bacteriófago, por exemplo, em uma biblioteca de fago de tamanho de 106 a 1013, por exemplo, 108 a 1012 unidades replicativas (vírions infecciosos). Em uma modali-dade, o repertório é exposto em bacteriófago quando incubado com a segunda ou outra protease.
[0021]Em outras modalidades de qualquer aspecto da invenção, o método compreende ainda amplificar o ácido nucleico que codifica um peptídeo ou polipeptí-deo que tem uma atividade biológica desejada. Em modalidades particulares, os áci-dos nucleicos são amplificados por amplificação de fago, crescimento celular ou rea-ção de cadeia em polimerase.
[0022]Em uma modalidade de qualquer aspecto da invenção, o repertório de peptídeos ou polipeptídeos é exposto em bacteriófago que são amplificados e expressos em células bacterianas como E. coli. Nesta modalidade, o repertório de peptídeos ou polipeptídeos é exposto a protease bacteriana quando expressa em células bacterianas.
[0023]Em algumas modalidades, o repertório é um repertório de domínios va-riáveis simples de imunoglobulina. Em modalidades particulares, o domínio variável simples de imunoglobulina é um domínio variável de cadeia pesada. Em modalidades particulares, o domínio variável de cadeia pesada é um domínio variável de cadeia pesada humana. Em outras modalidades, o domínio variável simples de imunoglobulina é um domínio variável de cadeia leve. Em modalidades particulares, o domínio variável de cadeia leve é um domínio variável de cadeia leve humana.
[0024]Em outro aspecto, a invenção é um método para selecionar um peptí-deo ou polipeptídeo que se liga a um ligante alvo com alta afinidade a partir de um repertório de peptídeos ou polipeptídeos. O método compreende fornecer um reper-tório de peptídeos ou polipeptídeos, combinação do repertório e protease sob condi-ções apropriadas para a atividade de protease, e recuperação de um peptídeo ou polipeptídeo que se liga a um ligante alvo.
[0025]Conforme os métodos da invenção acima, onde a atividade biológica desejada é a atividade de ligação, o ligante que se liga (ligante alvo, ligante genérico) não é o mesmo que a(s) protease(s).
[0026]Em outro aspecto, a invenção é um método de produzir um repertorio de peptídeos ou polipeptídeos resistentes a protease. O método compreende fornecer um repertório de peptídeos ou polipeptídeos, combinar o repertório de peptídeos ou polipeptídeos e uma protease sob condições apropriadas para a atividade de protease, e recuperar uma pluralidade de peptídeos ou polipeptídeos que têm uma atividade biológica desejada, por meio do qual um repertório de peptídeos ou polipeptídeos resistente a protease é produzido.
[0027]Em algumas modalidades, uma pluralidade de peptídeos ou polipeptí-deos que têm uma atividade biológica desejada é recuperada com base em uma ati-vidade de ligação. Por exemplo, uma pluralidade de peptídeos ou polipeptídeos pode ser recuperada com base na ligação a um ligante genérico, como a proteína A, prote-ína G ou proteína L. Em outro aspecto, a invenção é um método para selecionar um polipeptídeo resistente a protease compreendendo um domínio variável simples de imunoglobulina (dAb) que se liga a um ligante alvo a partir de um repertório. Em uma modalidade, o método compreende fornecer um sistema de exposição de fago com-preendendo um repertório de polipeptídeos que compreende um domínio variável simples de imunoglobulina, combinando o sistema de exposição de fago e uma protease selecionada do grupo que consiste de elastase, leucozima e tripsina, sob condições apropriadas para atividade de protease, e recuperação de um fago que expõe um polipeptídeo compreendendo um domínio variável de cadeia simples de imunoglobu- lina que se liga ao ligante alvo. De forma apropriada, em uma modalidade deste aspecto, o método compreende ainda a incubação de certas condições para a expressão de uma protease endógena. Por exemplo, uma protease endógena é uma protease que é expressa pelo sistema de exposição.
[0028]Em algumas modalidades, a protease é usada em cerca de 100 μg/ml e o sistema de exposição de fago combinado e a protease são incubadas em cerca de 37°C durante a noite.
[0029]Em algumas modalidades, o fago que expõe um polipeptídeo compre-endendo um domínio variável simples de imunoglobulina que se liga a um ligante alvo é recuperado pela ligação a dito alvo. Em outras modalidades, o fago que expõe um polipeptídeo compreendendo um domínio variável simples de imunoglobulina que se liga a um ligante alvo é recuperado por panning.
[0030]A invenção refere-se ainda a um peptídeo ou polipeptídeo resistente a protease isolado selecionável ou selecionado pelos métodos descritos aqui. Em uma modalidade particular a invenção refere-se a agonista de receptor de GLP-1 como peptídeos GLP-1 como descrito aqui. Peptídeos GLP-1 apropriados e derivados de peptídeo GLP-1 são estabelecidos nos Exemplos e na Figura 1. Outros peptídeos apropriados incluem homólogos ou derivados de GLP-1 como exendina e seus homólogos e derivados. Outros derivados apropriados incluem derivados de GLP-1 resistentes a dipeptidil peptidase IV. Um peptídeo preferencial é identificado pela sequência de aminoácido DMS7148 (sequência 6 na Figura 1). Outro peptídeo preferencial é identificado pela sequência de aminoácido DMS7161 (sequência 11 na Figura 1). Apropriadamente, estes peptídeos GLP-1 são fundidos a uma sequência AlbudAb™. Em outra modalidade, a invenção refere-se a um domínio variável simples de imunoglobulina (por exemplo, domínio variável de cadeia pesada de anticorpo hu-mano, domínio variável de cadeia leve de anticorpo humano) resistente a protease isolada (por exemplo, tripsina, elastase, leucozima) selecionável ou selecionado pelos métodos descritos aqui.
[0031]De forma vantajosa, peptídeos ou polipeptídeos, de acordo com a in-venção, podem exibir propriedades melhoradas em termos de expressão em hospe-deiros de baixo custo sem proteólise durante a expressão, tornando-os assim mais apropriados para produção em larga escala.
[0032]A invenção refere-se ainda a um ácido nucleico recombinante ou iso-lado que codifica um peptídeo ou polipeptídeo resistente a protease (por exemplo, domínio variável simples de imunoglobulina resistente a tripsina, elastasa ou leuco-zima) selecionável ou selecionado pelos métodos descritos aqui, e a vetores (por exemplo, vetores de expressão) e células hospedeiras que compreende os ácidos nucleicos.
[0033]A invenção refere-se ainda a um método para criar um peptídeo ou po- lipeptídeo resistente a protease (por exemplo, domínio variável simples de imunoglo-bulina resistentes a tripsina, elastase ou leucozima) selecionável ou selecionado pelos métodos descritos aqui que compreendem manter uma célula hospedeira que contém um ácido nucleico recombinante que codifica um peptídeo ou polipeptídeo resistente a protease sob condições apropriadas para expressão, por meio do qual, um peptídeo ou polipeptídeo resistente a protease seja produzido. Assim, no contexto de qualquer aspecto da presente invenção, a protease pode ser uma protease endógena ao sistema de exibição como uma protease que é encontrada em um ou mais de soro, escarro, muco (por exemplo, muco gástrico, muco nasal, muco bronquial), lavagem bron- coalveolar, homogenato pulmonar, extrato pulmonar, extrato pancreático, fluido gástrico, saliva ou lágrimas. Em uma modalidade, a protease é encontrada nos olhos e/ou lágrimas. Como discutido aqui, os peptídeos ou polipeptídeos resistentes a protease selecionados têm utilidade em terapia, profilaxia e diagnóstico de doença ou condi-ções em mamíferos, por exemplo, humanos. Em particular, os peptídeos e polipeptí-deos têm utilidade como a base de drogas que são prováveis de encontrar proteases quando administrados a um paciente, como um humano.
[0034]Por exemplo, quando administrado ao trato GI (por exemplo, oralmente, via sublingual, administrado via retal), em cujo caso o peptídeo ou polipeptídeo pode ser submetido a protease em um ou mais do trato GI superior, trato GI inferior, boca, estômago, intestino delgado e intestino grosso.
[0035]Uma modalidade, portanto, fornece um peptídeo ou polipeptídeo resis-tente a protease para ser administrado via oral, sublingual ou retal ao trato GI de um paciente para tratar e/ou prevenir uma doença ou condição no paciente.
[0036]Por exemplo, em uma modalidade a invenção refere-se a administração oral de um peptídeo ou polipeptídeo antagonista de TNF alfa selecionado ou selecio- nável pelo método da invenção, para o tratamento e/ou prevenção de uma condição ou doença mediada por TNF alfa como artrite (por exemplo, artrite reumatoide), IBD, psoríase ou doença de Chron. Nesta modalidade, o antagonista pode ser um domínio variável de cadeia simples de imunoglobulina anti-TNFR1 (dAb). Em outro exemplo, o peptídeo ou polipeptídeo é provável de encontrar protease quando administrado (por exemplo, por inalação ou intranasal) a tecido pulmonar (por exemplo, pulmão ou vias aéreas). Uma modalidade, portanto, fornece um peptídeo ou polipeptídeo resistente a protease para ser administrado por inalação, ou intranasal a tecido pulmonar de um paciente para tratar e/ou prevenir uma doença ou condição no paciente. Tal condição pode ser asma (por exemplo, asma alérgica), COPD, influenza ou qualquer outra doença pulmonar ou condição revelada em WO2006038027 (US2006002935), incorporada aqui como referência.
[0037]Em outro exemplo, o peptídeo ou polipeptídeo é provável de encontrar proteases no soro quando administrados via parenteral, por exemplo, através de injeção, por exemplo, via subcutânea. Uma modalidade, portanto, fornece um peptí-deo ou polipeptídeo resistente a protease para ser administrado por injeção e para tratar e/ou prevenir uma doença ou condição no paciente. Tal condição pode ser dia-betes. Em uma modalidade, a invenção fornece para administração parenteral de um agonista de receptor de peptídeo tipo 1 de glucagon como GLP-1 ou seu homólogo ou derivado, como exendina ou derivados do mesmo, selecionado ou selecionável pelo método da invenção para o tratamento e/ou prevenção do diabetes ou transtor-nos relacionados ao diabetes.
[0038]Os peptídeos e polipeptídeos de acordo com a invenção podem apre-sentar temperaturas de fusão melhorada ou relativamente alta (Tm) conferindo esta-bilidade melhorada. A ligação ao alvo de alta afinidade pode ainda ser uma caracte-rística dos peptídeos e polipeptídeos. Estas características, combinadas com resis-tência a protease, torna os peptídeos e polipeptídeos passíveis para uso como drogas em mamíferos, como humanos, onde as proteases são possíveis de serem encontradas, por exemplo, trato GI, tecido pulmonar ou administração parenteral.
[0039]Em outro exemplo, o peptídeo ou polipeptídeo (por exemplo, domínio variável ou antagonista) e possível de encontrar protease quando administrados (por exemplo, por injeção intraocular como colírios) ao olho de um paciente. Uma modali-dade, portanto, fornece para administração ocular do peptídeo, polipeptídeo, domínio variável simples de imunoglobulina, agonista ou antagonista resistente a protease a um paciente (por exemplo, a um humano) por tratar e/ou prevenir uma doença ou condição (por exemplo, uma doença ou condição do olho) no paciente. A administra-ção pode ser uma administração tópica para o olho, na forma de colírio ou por injeção no olho, por exemplo, no humor vítreo.
[0040]Em uma modalidade, a invenção fornece uma formulação pulmonar para liberação no pulmão, onde a formulação compreende um agonista, antagonista, peptídeo, polipeptídeo ou domínio variável da invenção com uma faixa de tamanho de partícula de menos do que 5 microns, por exemplo menos do que 4,5, 4, 3,5 ou 3 microns (por exemplo., quando em tampão Britton-Robinson, por exemplo em um pH de 6,5 a 8,0, por exemplo, em um pH de 7 a 7,5, por exemplo, em pH 7 ou em pH 7,5).
[0041]Em uma modalidade, as formulações e composições da invenção são fornecidas em um pH de 6,5 a 8,0, por exemplo, 7 a 7,5, por exemplo, 7, por exemplo, 7,5.
[0042]Peptídeo ou polipeptídeos (por exemplo, domínios variáveis), de acordo com qualquer aspecto da invenção pode ter uma Tm de pelo menos 50°C, ou pelo menos 55°C, ou pelo menos 60°C, ou pelo menos 65°C, ou pelo menos 70°C. Um agonista, antagonista, uso, método, composição, dispositivo ou formulação da invenção pode compreender tal peptídeo ou polipeptídeo. Em um aspecto da invenção, os peptídeos, polipeptídeos, domínios variáveis, agonistas, antagonistas, composições ou formulações da invenção são substancialmente estáveis após incubação (em uma concentração de polipeptídeo ou domínio variável de 1 mg/ml) a 37 a 50°C por 14 dias em tampão Britton-Robinson. Em uma modalidade, pelo menos 65, 70, 75, 80, 85, 86, 87, 88, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99% do peptídeo, polipeptídeo, agonistas, antagonista ou domínio variável permanecem não agregados após tal incubação a 37 graus C. Em uma modalidade, pelo menos 65, 70, 75, 80, 85, 86, 87, 88, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99% do peptídeo, polipeptídeo ou domínio variável permanece monomérico após tal incubação a 37 graus C. Em uma modalidade, pelo menos 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 86, 87, 88, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99% do peptídeo, polipeptídeo, agonista, antagonista ou domínio variável permanece não agregado após tal incubação a 50 graus C.
[0043]Em uma modalidade, pelo menos 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 86, 87, 88, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99% do peptí-deo, polipeptídeo ou domínio variável permanece monomérico após tal incubação a 50 graus C. Em uma modalidade, nenhuma agregação do peptídeo, polipeptídeo, domínio variável, agonistas, antagonistas é observado após qualquer uma das incu-bações. Em uma modalidade, o pI do peptídeo, polipeptídeo ou domínio variável per-manece inalterado ou substancialmente inalterado após a incubação a 37 graus C em uma concentração de polipeptídeo ou domínio variável de 1 mg/ml em tampão de Britton-Robinson.
[0044]Em um aspecto da invenção, o peptídeo, polipeptídeo, domínio variável, agonistas, antagonistas, composições ou formulações da invenção são substancialmente estáveis após incubação (em uma concentração de polipeptídeo ou domínio variável de 100 mg/ml) a 4°C por 7 dias em tampão Britton-Robinson em pH de 7 a 7,5 (por exemplo, pH7 ou pH 7,5). Em uma modalidade, pelo menos 95, 95,5, 96, 96,5, 97, 97,5, 98, 98,5, 99 ou 99,5% do peptídeo, polipeptídeo, agonista, antagonista ou domínio variável permanece não agregado após a incubação. Em uma modalidade, pelo menos 95, 95,5, 96, 96,5, 97, 97,5, 98, 98,5, 99 ou 99,5% do peptídeo, polipeptídeo ou domínio variável permanece monomérico após tal incubação. Em uma modalidade, nenhuma agregação do peptídeo, polipeptídeo, domínio variável, agonistas, antagonistas é observado após qualquer uma de tais incubações. Em um aspecto da invenção, o peptídeo, polipeptídeos, domínios variáveis, agonistas, antagonistas, composições ou formulações da invenção são substancialmente estáveis após nebu- lização (em uma concentração de polipeptídeo ou domínio variável de 40mg/ml) por exemplo, em temperatura ambiente, 20 graus C ou 37°C, por 1 hora, por exemplo em um nebulizador jet, por exemplo um Pari LC+ cup. Em uma modalidade, pelo menos 65, 70, 75, 80, 85, 86, 87, 88, 90, 91,92, 93, 94, 95, 95.5, 96, 96.5, 97, 97.5, 98, 98.5, 99 ou 99,5% do peptídeo, polipeptídeo, agonista, antagonista ou domínio variável permanecem não agregados após tal nebulização. Em uma modalidade, pelo menos 65, 70, 75, 80, 85, 86, 87, 88, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 95.5, 96, 96.5, 97, 97.5, 98, 98.5, 99 ou 99,5% do peptídeo, polipeptídeo, ou domínio variável permanecem monoméricos após tal nebulização. Em uma modalidade, nenhuma agregação do peptídeo, polipeptídeos, domínios variáveis, agonistas, antagonistas é observada após qualquer uma de tais nebulizações.
[0045]O peptídeo ou polipeptídeo pode ser isolado e/ou recombinante. De forma apropriada em uma modalidade de qualquer aspecto da invenção, o peptídeo ou polipeptídeo resistente a protease é selecionado a partir de um repertório de pep-tídeos ou polipeptídeos.
[0046]A invenção refere-se ainda a um peptídeo ou polipeptídeo resistente a protease (por exemplo, domínio variável simples de imunoglobulina resistente a trip- sina, elastase ou leucozima) selecionável ou selecionado pelos métodos descritos aqui para uso em medicina (por exemplo, para terapia ou diagnóstico). A invenção refere-se ainda ao uso de um peptídeo ou polipeptídeo resistente a protease (por exemplo, domínio variável simples de imunoglobulina resistente a tripsina, elastase ou leucozima) selecionáveis ou selecionados pelos métodos descritos aqui para a produção de um medicamento para o tratamento de doença. A invenção refere-se ainda a um método de tratar uma doença, compreendendo a administração a um sujeito que necessite do mesmo, uma quantidade efetiva de um peptídeo ou polipeptídeo resistente a protease (por exemplo, domínio variável simples de imunoglobulina resistente a tripsina, elastase ou leucozima) selecionável ou selecionado pelos métodos descritos aqui. Em uma modalidade de qualquer aspecto da invenção, o método compreende ainda combinar um segundo repertório de peptídeos ou polipeptídeos resistentes a protease sob condições apropriadas para atividade da segunda protease e recuperar pelo menos um peptídeo ou polipeptídeo que tem uma atividade biológica desejada, pelo qual pelo menos um peptídeo ou polipeptídeo que é resistente à segunda protease é selecionado. A primeira e a segunda proteases são diferentes. A segunda protease pode ser definida como acima. Em uma modalidade, a primeira ou segunda protease é endógena ao sistema de exposição do repertório.
[0047]A invenção fornece ainda um agonista de receptor de GLP-1 que compreende um peptídeo ou polipeptídeo, que é resistente a uma ou mais proteases mencionadas acima, quando incubados com a protease sob condições apropriadas para um método da invenção, por exemplo, uma condição de (i) cerca de 10μg/ml a cerca de 3mg/ml de protease, (ii) cerca de 200C a cerca de 400C e (iii) por pelo menos cerca de 30 minutos. (por exemplo, sob a condição de 100 μg/ml ou protease a 370C por pelo menos uma hora), para administração a um paciente para o tratamento e/ou prevenção de diabetes. O agonista pode ser usado para administração por injeção. Em uma modalidade dos métodos da invenção, o peptídeo ou polipeptídeo selecionado é ainda avaliado para resistência à uma segunda protease ou para a primeira protease mas sob um grupo de condições que diferem daquelas usadas no método de seleção.A segunda protease é diferente da primeira protease, mas de alguma forma pode ser qualquer protease descrita acima. Em uma modalidade, mais de um peptídeo ou polipeptídeo resistente a protease é selecionado nos métodos da invenção, seguido por uma outra etapa de determinação de quais destes peptídeos ou polipeptídeos apresenta resistência a uma segunda protease ou para a primeira protease sob um conjunto de condições que diferente de outras usadas no método de seleção. A segunda protease é diferente da primeira protease, mas de alguma forma pode ser qualquer protease descrita acima. Desta forma, um ou mais peptídeos ou polipeptídeos são conseguidos nos quais são resistentes a mais do que uma protease. Em uma modalidade, a primeira ou segunda protease é uma protease que é endogena- mente expressa no sistema de exposição do repertório.
[0048]Em uma modalidade dos métodos da invenção, um peptídeo ou poli- peptídeo monomérico resistente a protease (por exemplo, monômero de domínio va-riável simples de imunoglobulina) é selecionado. Os medicamentos, agonistas e an-tagonistas da invenção podem compreender uma região constante de anticorpo (por exemplo, um Fc) fundidos a dito peptídeo ou polipeptídeo.
[0049]Em uma modalidade, a invenção fornece o uso de peptídeo ou polipeptídeo resistente a protease na produção de um medicamento para a adminis-tração a um mamífero para fornecer um medicamento com uma PK melhorada. PK melhorada por ser uma AUC (área sob a curva) melhorada e/ou meia-vida melhorada. Em uma modalidade, peptídeo ou polipeptídeo resistente a protease é selecionado ou selecionável por um método da invenção. Em uma modalidade, o peptídeo ou polipeptídeo é um domínio variável simples de imunoglobulina. O medicamento pode compreender uma região constante de anticorpo fundida a dito peptídeo ou polipeptídeo, por exemplo, um Fc de anticorpo.
[0050]A invenção fornece um medicamento que compreende um peptídeo ou polipeptídeo resistente a protease para a administração a um mamífero (por exemplo, um humano) para fornecer um medicamento com uma PK melhorada. Em uma modalidade, peptídeo ou polipeptídeo resistente a protease é selecionado ou selecionável por um método da invenção. Em uma modalidade, o peptídeo ou polipeptídeo é um domínio variável simples de imunoglobulina. O medicamento pode compreender uma região constante de anticorpo (por exemplo, um Fc) fundida a dito peptídeo ou polipeptídeo.
BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS
Figura 1: Mostra sequências de fusão de GLP-1-AlbudAb variantes 1-10. Figura 2: Mostra um gel de fusão de GLP-1-AlbudAb variantes 6-10. Figura 3: Mostra um gel de fusão de GLP-1-AlbudAb variantes 6-10 (concentrado). Figura 4: Mostra um gel de fusão de GLP-1-AlbudAb variante 11. Figura 5: Mostra um gel de fusão de GLP-1-AlbudAb variantes 6-11. Figura 5a) mostra DMS7148 (Variante 6); (Nota de Análise: A massa medida atinge a massa esperada com um dissulfeto simples (15245.88); b) mostra DMS7149 (Variante 7)
[0051](Nota de Análise: Massa medida atinge os resíduos 24-142 (12860.56), 26-142 (12603.26) e 28-142 (12390.97), todos com dissulfeto simples. Cada pico tem um pico associado que é +42 Da - mais provavelmente acetilado.); c) mostra DMS7150 (Variante 8) (Nota de Análise A massa medida alcança os resíduos 26-142 com um dissulfeto simples (12603.26). ); d) mostra DMS7151 (Variante 9) (Nota de Análise: Não capaz de contar para 12960. 12890.5,12603 e 12391.50 são próximos aos resíduos 24-142, 26-142 e 28-142 respectivamente, cada um com um dissulfeto simples (12862.53, 12605.24 e 12392.94).
[0052]No entanto, the é uma discrepância de 2Da de massa entre as massas medidas e calculadas; e) mostra DMS7152 (Variante 10) (Nota de Análise: 12790.5 e 12320.5 coin-cide com os resíduos 24-142 e 28-142 respectivamente com dissulfetos simples (12790.42 e 12320.84).) f) mostra DMS7161 (Variante 11). Figura 6: Mostra os resultados de um ensaio de fusão de GLP-I -AlbudAb va-riante 6. Figura 7: Mostra os resultados de um ensaio de fusão de GLP-1-AlbudAb va-riante 11.
DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO
[0053]Dentro desta especificação, a invenção foi descrita, com referência à modalidades, de modo que permite uma especificação concisa e clara a ser escrita. É pretendido e deve ser apreciado que modalidades podem ser combinadas ou sepa-radas de várias formas sem se afastar da invenção.
[0054]Como usado aqui, “peptídeo” refere-se a cerca de dois a cerca de 50 aminoácidos que são unidos através de ligações de peptídeos.
[0055]Como usado aqui, “polipeptídeo” refere-se a pelo menos cerca de 50 aminoácidos que são unidos através de ligações de peptídeos. Polipeptídeos geral-mente compreendem estruturas terciárias e dobradas em domínios funcionais.
[0056]Como usado aqui, um peptídeo ou polipeptídeo (por exemplo um domí-nio anticorpo (dAb)) que é "resistente a degradação por protease" não é substancialmente degradado por uma protease quando incubado com a protease sob condições apropriadas para a atividade da protease. Um polipeptídeo (por exemplo, um dAb) não é substancialmente degradado quando não mais do que cerca de 25%, não mais do que cerca de 20%, não mais do que cerca de 15%, não mais do que cerca de 14%, não mais do que cerca de 13%, não mais do que cerca de 12%, não mais do que cerca de 11%, não mais do que cerca de 10%, não mais do que cerca de 9%, não mais do que cerca de 8%, não mais do que cerca de 7%, não mais do que cerca de 6%, não mais do que cerca de 5%, não mais do que cerca de 4%, não mais do que cerca de 3%, não mais do que cerca de 2%, não mais do que cerca de 1%, ou substancialmente nenhuma das proteínas é degrada por protease quando da incubação com a protease por cerca de uma hora em uma temperatura apropriada para a atividade da protease. Por exemplo, a 37 ou 50 graus C. A degradação da proteína pode ser avaliada usando qualquer método apropriado, por exemplo, por SDS-PAGE ou por ensaio funcional (por exemplo, ligação a ligante) como descrito aqui.
[0057]Como usado aqui, "sistema de exposição" refere-se a um sistema no qual uma coleção de polipeptídeos ou peptídeos estão acessíveis para seleção base-ado em uma característica desejada, como uma característica física, química ou fun-cional. O sistema de exibição pode ser um repertório apropriado de polipeptídeos ou peptídeos (por exemplo, em uma solução, imobilizado em um suporte apropriado). O sistema de exibição pode ainda ser um sistema bioquímico que emprega um sistema de expressão celular (por exemplo, expressão de uma biblioteca de ácidos nucleicos e, por exemplo, células transformadas, infectadas, transfectadas ou transduzidas e exibição dos polipeptídeos codificados na superfície das células) ou um sistema de expressão celular (por exemplo, compartimentalização de emulsão e exibição). Siste-mas preferenciais de exposição ligam a função que codificam de um ácido nucleico e as características físicas, químicas e/ou funcionais de um peptídeo ou polipeptídeo codificados pelo ácido nucléico. Quando tal sistema de exibição é empregado, polipeptídeos ou peptídeos que têm uma característica física, química e/ou funcional desejada podem ser selecionados e um ácido nucleico que codifica o peptídeo ou polipeptídeo selecionado pode ser prontamente isolado ou recuperado. Um número de sistemas de exibição que liga a função codificadora de um ácido nucleico e características físicas, químicas e/ou funcionais de um polipeptídeo ou peptídeo são conhecidos na técnica, por exemplo, exibição de bacteriófago (exibição de fago), exibição de ribossomo, compartimentalização e exibição de emulsão, exibição de levedura, exibição de puromicina, exibição bacteriana, exibição em plasmídeo, exibição covalente e semelhantes. (Vide, por exemplo, EP 0436597 (Dyax), Patente U.S. No. 6.172.197 (McCafferty et al), Patente U.S. No. 6.489.103 (Griffiths et al)).
[0058]Como usado aqui “repertório” refere-se a uma coleção de polipeptídeos ou peptídeos que são caracterizados por uma diversidade de sequência de aminoácidos. Os membros individuais de um repertório podem ter características comuns, como características estruturais comuns (por exemplo, uma estrutura central comum) e/ou características funcionais comuns (por exemplo, capacidade de se ligar a um ligante comum (por exemplo, um ligante genérico ou um ligante alvo)).
[0059]Como usado aqui, “funcional” descreve um polipeptídeo ou peptídeo que tem atividade biológica, como atividade de ligação específica. Por exemplo, o termo “polipeptídeo funcional” inclui um anticorpo ou fragmento de ligação ao mesmo que se liga a um antígeno alvo através de seu sítio de ligação ao antígeno, e uma enzima que liga seu(s) substrato(s). Como usado aqui “ligante genérico” refere-se a um ligante que se liga à porção substancial (por exemplo, substancialmente todos) dos membros funcionais de um dado repertório. Um ligante genérico (por exemplo, um ligante genérico comum) pode se ligar a muitos membros de um dado repertório mesmo que os membros não tem especificidade de ligação para um ligante alvo comum. Em geral, a presença de um sítio de ligação a ligante genérico em um polipeptídeo (como indicado pela capacidade de ligar um ligante genérico) indica que o polipeptídeo é corretamente dobrado e funcional. Exemplos apropriados de ligantes genéricos incluem superantígenos, anticorpos que se ligam a um epítopo expresso em uma porção substancial de membros funcionais de um repertório e semelhantes.
[0060]“Superantígeno” é um temo da técnica que refere-se a ligantes genéri-cos que interagem com membros da superfamília de imunoglobulina em um sítio que é distinto dos sítios de ligação do ligante alvo destas proteínas. Enterotoxinas de es- tafilococos são exemplos de superantígenos que interagem com receptores de células T. Superantígenos que se ligam a anticorpos incluem Proteína G, que se liga à região constante de IgG (Bjorck and Kronvall, J. Immunol, 133:969 (1984)); Proteína A que se liga à região constante de IgG e domínios VH (Forsgren and Sjoquist, J. Immunol., 97:822 (1966)); e Proteína L que se liga a domínios VL (Bjorck, J. Immunol, 140: 1194 (1988)).
[0061]Como usado aqui “ligante alvo” refere-se a um ligante que é específica ou seletivamente ligado a um polipeptídeo ou peptídeo. Por exemplo, quando um po-lipeptídeo é um anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, o ligante alvo pode ser qualquer antígeno ou epítopo desejado, e quando um polipeptídeo é uma enzima, o ligante alvo pode ser qualquer substrato desejado. A ligação ao antí-geno alvo é dependente do polipeptídeo ou peptídeo sendo funcional.
[0062]Como usado aqui “formato de anticorpo” refere-se a qualquer estrutura de polipeptídeo apropriada na qual um domínio variável de anticorpo pode ser incor-porado de modo a conferir especificidade de ligação para antígeno na estrutura. Uma variedade de formatos de anticorpos são conhecidos na técnica, como anticorpos quiméricos, anticorpos humanizados, anticorpos humanos, anticorpos de cadeia simples, anticorpos biespecíficos, cadeias pesadas de anticorpos, anticorpos de cadeia leve, homodímeros e heterodímeros de cadeias pesadas e/ou cadeias leves de anticorpos, fragmentos de ligação a antígenos de qualquer um dos anteriores (por exemplo, um fragmento Fv (por exemplo, Fv de cadeia simples (scFv), um Fv ligado a dissulfeto), um fragmento Fab, um fragmento Fab', um fragmento F(ab')2), um domínio variável de anticorpo simples (por exemplo, um dAb, VH, VHH, Vq, e versões modificadas de qualquer um dos anteriores (por exemplo, modificado por ligação covalente de polietileno- glicol ou outro polímero apropriado).
[0063]A frase “domínio variável de imunoglobulina simples” refere-se a um domínio variável de anticorpo (VH, VHH, VL) que se liga especificamente a um antígeno ou epítopo independentemente de outras regiões V ou domínios. Um domínio variável simples de imunoglobulina pode estar presente em um formato (por exemplo, homoou hetero-multimero) com outras regiões variáveis ou domínios variáveis onde as outras regiões ou domínios não são requeridos para a ligação ao antígeno pelo domínio variável de imunoglobulina simples (ou seja, onde o domínio variável de imunoglobulina simples se liga a antígeno independentemente dos domínios variáveis adicionais). Um “domínio de anticorpo” ou “dAb” é o mesmo que “domínio variável de imunoglobulina simples” como o termo é usado aqui. Um domínio variável de imunoglobulina simples é preferencialmente um domínio variável de anticorpo humano, mas também inclui domínios variáveis de anticorpo simples de outras espécies como roedores (por exemplo, como revelado em WO 00/29004 (US2002012909), os conteúdos dos quais estão incorporados aqui como referência em suas totalidades), tubarão e Camelid VHH dAbs. Camelid VHH são polipeptídeos domínio variável de imunoglobulina simples que são derivados de espécies incluindo camelos, lhamas, alpaca, dromedário e gua- naco, que produz anticorpos de cadeia pesada naturalmente desprovidos de anticorpos de cadeias leves.
[0064]Um “domínio” é uma estrutura de proteína dobrada que tem uma estru-tura terciária independente do resto da proteína. Geralmente, os domínios são res-ponsáveis por propriedades funcionais discretas de proteínas e, em muitos casos, pode ser adicionado, removido ou transferido para outras proteínas sem perda da função do restante da proteína e/ou do domínio. Um “domínio variável de anticorpo simples” é um domínio de polipeptídeo dobrado compreendendo características de sequências de domínios variáveis de anticorpo. Isto, portanto, inclui domínios variá-veis de anticorpo completo e domínios variáveis modificados, por exemplo, nos quais uma ou mais voltas foram substituídas por sequências que não são características de domínios variáveis de anticorpo, ou domínios variáveis de anticorpo que foram truncados ou compreendem extensões N ou C-terminal, bem como fragmentos dobrados de domínios variáveis que retêm pelo menos a atividade de ligação e especificidade do domínio de comprimento completo. O termo “biblioteca ” refere-se a uma mistura de polipeptídeos heterogêneos ou ácidos nucleicos. A biblioteca é composta de membros, cada um dos quais tem um polipeptídeo simples ou sequência de ácido nucleico. A esta extensão, “biblioteca ” é sinônimo a “repertório”. Diferenças de sequências entre membros de biblioteca s são responsáveis pela presente diversidade na biblioteca . A biblioteca pode ter a forma de uma mistura simples de polipeptídeos ou ácidos nucleicos, ou pode estar na forma de organismos ou células, por exemplo, bactérias, vírus, células de planta ou de animal e semelhantes, transformadas com um biblioteca de ácidos nucleicos. Preferencialmente, cada organismo individual ou célula contém um ou número limitado de membros de biblioteca . De forma vantajosa, os ácidos nucleicos são incorporados em vetores de expressão, para permitir a expressão de polipeptídeos codificados pelos ácidos nucleicos. Em um aspecto preferencial, portanto, uma biblioteca pode tomar a forma de uma população de organismos hospedeiros, cada organismo contendo uma ou mais cópias de um vetor de expressão contendo um membro único da biblioteca em ácido nucleico que pode ser expresso para produzir seu polipeptídeo membro correspondente. Assim, a população de organismos hospedeiro tem o potencial de codificar um grande repertório de polipeptídeos diversos. Um “estrutura universal” é uma sequência de estrutura de anticorpo que corresponde às regiões de um anticorpo conservado em sequência como definido por Kabat ("Sequências of Proteins of Immunological Interest", US Department of Health and Human Services, 1991) ou correspondente ao repertório de imunoglobulina ger- minativa humana ou estruturas como definida por Chothia e Lesk, (1987) J. MoI. Biol. 196:910- 917. A invenção fornece para o uso de uma estrutura simples, ou um con-junto de tais estruturas, que demonstraram permitir a derivação de virtualmente qual-quer especificidade de ligação através da variação em regiões hipervariáveis isoladas.
[0065]Alinhamentos e homologia, similaridade ou identidade de sequência de nucleotídeo e aminoácido, como definido aqui são preferencialmente preparados e determinados usando o algoritmo BLAST 2 Sequências, usando parâmetros padrões (Tatusova, T. A. et ah, FEMS Microbiol Lett, 774: 187-188 (1999)).
[0066]A invenção refere-se a um método de seleção de peptídeos e polipep-tídeos resistentes a proteases que têm uma atividade biológica desejada. Pelo menos duas pressões seletivas são usadas no método para produzir um processo eficiente para selecionar polipeptídeos que são altamente resistentes a degradação por proteases e que têm atividade biológica desejada. Como descrito aqui, peptídeos e polipeptídeos resistentes a protease geralmente retêm atividade biológica. Em contrasto, peptídeos e polipeptídeos sensíveis a protease são clivados ou digeridos por protease nos métodos descritos aqui e, portanto, perdem sua atividade biológica. Consequentemente, peptídeos ou polipeptídeos resistentes a protease são geralmente selecionados com base em sua atividade biológica, como atividade de ligação. Os métodos descritos aqui fornecem várias vantagens. Por exemplo, como descrito e exemplificado aqui, peptídeos ou polipeptídeos que são selecionados para resistência à degradação proteolítica por uma protease (por exemplo, tripsina) são também resistentes a degradação por outras proteases (por exemplo, elastase, leucozima). Em adição, resistência à protease se correlaciona com uma temperatura de fusão maior (Tm) do peptídeo ou polipeptídeo. Temperaturas de fusão maiores são indicativas de peptídeos e polipeptídeos mais estáveis. A resistência à degradação de protease também se correlaciona com alta afinidade de ligação aos ligantes alvos. Assim, os métodos descritos aqui fornecem um maneira eficiente para selecionar, isolar e/ou recuperar polipeptídeos que têm uma atividade biológica desejada e que são bem apropriados para usos in vivo terapêuticos e/ou diagnósticos porque são resistentes a protease e estáveis.
MÉTODOS DE SELEÇÃO
[0067]Em um aspecto, a invenção é um método para selecionar, isolar e/ou recuperar um peptídeo ou polipeptídeo a partir de uma biblioteca ou um repertório de peptídeos e polipeptídeos (por exemplo, um sistema de exibição) que é resistente a degradação por uma protease (por exemplo, uma ou mais proteases). Preferencial-mente, o método é um método para selecionar, isolar e/ou recuperar um peptídeo ou polipeptídeo ou um repertório de peptídeos e polipeptídeos (por exemplo, um sistema de exibição) que é resistente a degradação por uma protease (por exemplo, uma ou mais proteases). Geralmente, o método compreende fornecer uma biblioteca ou re-pertório de peptídeos ou polipeptídeos, incubar a biblioteca ou repertório na presença de uma protease (por exemplo, uma protease bacteriana ou uma protease adicionada exogenamente como tripsina, elastase, leucozima, pancreatina, escarro) sob condições apropriadas para atividade de protease, e selecionar, isolar e/ou recuperar um peptídeo ou polipeptídeo que é resistente à degradação pela protease e tem uma atividade biológica desejada. Peptídeos ou polipeptídeos que são degradados por uma protease geralmente têm uma atividade biológica reduzida ou perdem sua atividade biológica devido à atividade de protease. Consequentemente, peptídeos ou polipeptídeos que são resistentes à degradação de protease podem ser selecionados, isolados e/ou recuperados usando o método baseado em sua atividade biológica, como atividade de ligação (por exemplo, ligação a um ligante geral, ligação a um ligante específico, ligação a um substrato), atividade catalítica ou outra atividade biológica.
[0068]Como descrito e exemplificado aqui, dAbs resistentes a protease geral-mente se ligam ao ligante alvo com alta afinidade. Assim, em outro aspecto, a invenção é um método para selecionar, isolar e/ou recuperar um peptídeo ou polipeptídeo que se liga a um ligante, preferencialmente, um ligante alvo, com alta afinidade. Preferencialmente, o método é um método para selecionar, isolar e/ou recuperar um peptídeo ou polipeptídeo que se liga a um ligante, preferencialmente, um ligante alvo, com alta afinidade. Geralmente, o método compreende fornecer uma biblioteca ou repertório de peptídeos ou polipeptídeos, combinando a biblioteca ou repertório com uma protease (por exemplo, tripsina, elastase, leucozima, pancreatina, escarro) sob condições apropriadas para a atividade de protease, e selecionar, isolar e/ou recuperar um peptídeo ou polipeptídeo que se liga a um ligante (por exemplo, ligante alvo). Como descrito aqui, o método pode ainda compreender incubar a biblioteca ou repertório de peptídeos ou polipeptídeos sob condições apropriadas para atividade de uma protease que é endógena ao sistema de exibição como uma protease bacteriana (onde o sistema de exibição inclui a expressão em bactéria). Devido à biblioteca ou repertório ter sido exposto à protease sob condições onde peptídeos ou polipeptídeos sensíveis à protease serão digeridos, a atividade de protease pode eliminar os polipeptídeos menos estáveis que têm baixa afinidade, e assim, produzir uma coleção de peptídeos ou polipeptídeos de alta afinidade de ligação. Por exemplo, o peptídeo de polipeptídeo selecionado pode se ligar a seu ligante alvo com uma afinidade (KD; KD = Koff(kd)/Kon(ka) como determinado pela ressonância de plásmon de superfície) de 1 μM ou mais forte, preferencialmente cerca de 500 nM a cerca de 0,5 pM. Por exemplo, o peptídeo de polipeptídeo de alta afinidade pode se ligar ao ligante alvo com uma afinidade de cerca de 500 nM, cerca de 100 nM, cerca de 10 nM, cerca de 1 nM, cerca de 500 pM, cerca de 100 pM, cerca de 10 pM, cerca de 1 pM ou cerca de 0,5 pM. Acredita-se que peptídeos e polipeptídeos que são resistentes a proteases tenham uma entropia menor e/ou uma energia de estabilização maior. Assim, a correlação entre resistência à protease e ligação de alta afinidade pode estar relacionada à compacidade e estabilidade das superfícies dos peptídeos e polipeptídeos selecionados pelo método da invenção.
[0069]A biblioteca ou repertório de peptídeos ou polipeptídeos é combinada com uma protease (por exemplo, uma ou mais proteases) sob condições apropriadas para a atividade proteolítica da protease. Condições que são apropriadas para a ativi-dade proteolítica da protease, e preparações biológicas ou misturas que contêm ativi-dade proteolítica, são bem conhecidas na técnica e podem ser prontamente determi-nados por uma pessoa ou especialista na técnica. Se desejado, condições apropria-das podem ser identificadas ou otimizadas, por exemplo, ao avaliar a atividade de protease sob uma faixa de condições de pH, concentrações de protease, temperatu-ras e/ou ao variar a quantidade de tempo em que a biblioteca ou repertório e a pro-tease permitem reagir. Por exemplo, em algumas modalidades, a razão (em uma base de mol/mol) de protease, por exemplo tripsina, a peptídeo ou polipeptídeo (por exemplo, domínio variável) é 800 a 80.000 (por exemplo, 8.000 a 80.000) protease:peptídeo ou polipeptídeo, por exemplo quando 10 microgramas/ml de protease é usada, a razão é 800 a 80.000 protease :peptídeo ou polipeptídeo; ou quando 100 microgramas/ml de protease é usada, a razão é 8.000 a 80.000 protease:peptídeo ou polipeptídeo. Em uma modalidade a razão (em base de peso/peso, por exemplo micrograma/micro- grama) de protease (por exemplo, tripsina) a peptídeo ou polipeptídeo (por exemplo, domínio variável) é 1.600 a 160.000 (por exemplo, 16.000 a 160.000) protease:peptí- deo ou polipeptídeo por exemplo quando 10 microgramas/ml de protease são usadas, a razão é 1.600 a 160.000 protease: peptídeo ou polipeptídeo; ou quando 100 microgramas/ml de protease são usadas, a razão é 16.000 a 160.000 protease :peptídeo ou polipeptídeo. Em uma modalidade, a protease é usada em uma concentração de pelo menos 100 ou 1000 microgramas/ml e a razão protease: peptídeo (em mol/mol) de protease, por exemplo tripsina, a peptídeo ou polipeptídeo (por exemplo, domínio variável) é de 8.000 a 80.000 protease:peptídeo ou polipeptídeo. Em uma modalidade, a protease é usada em uma concentração de pelo menos 10 microgramas/ml e a razão de protease: peptídeo (mol/mol) de protease, por exemplo tripsina, a peptídeo ou polipeptídeo (por exemplo, domínio variável) e 800 a 80.000 protease:peptídeo ou polipeptídeo. Em uma modalidade a razão (em peso/peso, por exemplo micro- grama/micrograma) de protease (por exemplo, tripsina) a peptídeo ou polipeptídeo (por exemplo, domínio variável) é 1600 a 160.000 protease:peptídeo ou polipeptídeo por exemplo quando C é 10 microgramas/ml; ou quando C ou C’ é 100 microgra- mas/ml, a razão é 16.000 a 160.000 protease:peptídeo ou polipeptídeo. Em uma mo-dalidade, a concentração (c ou c') é pelo menos 100 ou 1000 microgramas/ml de pro-tease. Para testar um peptídeo ou polipeptídeo individual ou isolado (por exemplo, um domínio variável de imunoglobulina), por exemplo um que já tenha sido isolado a partir de um repertório ou biblioteca, uma protease pode ser adicionada à solução de peptídeo ou polipeptídeo em um tampão apropriado (por exemplo, PBS) para produzir uma solução de peptídeo ou polipeptídeo/protease, como uma solução de pelo menos cerca de 0,01% (p/p) protease/peptídeo ou polipeptídeo, cerca de 0,01% a cerca de 5% (p/p) protease/peptídeo ou polipeptídeo, cerca de 0,05% a cerca de 5% (p/p) protease/peptídeo ou polipeptídeo, cerca de 0,1% a cerca de 5% (p/p) protease/peptídeo ou polipeptídeo, cerca de 0,5% a cerca de 5% (p/p) protease/peptídeo ou polipeptídeo, cerca de 1% a cerca de 5% (p/p) protease/peptídeo ou polipeptídeo, pelo menos cerca de 0,01% (p/p) protease/peptídeo ou polipeptídeo, pelo menos cerca de 0,02% (p/p) protease/peptídeo ou polipeptídeo, pelo menos cerca de 0,03% (p/p) protease/peptí-deo ou polipeptídeo, pelo menos cerca de 0,04% (p/p) protease/peptídeo ou polipep- tídeo, pelo menos cerca de 0,05% (p/p) protease/peptídeo ou polipeptídeo, pelo me-nos cerca de 0,06% (p/p) protease/peptídeo ou polipeptídeo, pelo menos cerca de 0,07% (p/p) protease/peptídeo ou polipeptídeo, pelo menos cerca de 0,08% (p/p) pro-tease/peptídeo ou polipeptídeo, pelo menos cerca de 0,09% (p/p) protease/peptídeo ou polipeptídeo, pelo menos cerca de 0,1% (p/p) protease/peptídeo ou polipeptídeo, pelo menos cerca de 0,2% (p/p) protease/peptídeo ou polipeptídeo, pelo menos cerca de 0,3% (p/p) protease/peptídeo ou polipeptídeo, pelo menos cerca de 0,4% (p/p) pro- tease/peptídeo ou polipeptídeo, pelo menos cerca de 0,5% (p/p) protease/peptídeo ou polipeptídeo, pelo menos cerca de 0,6% (p/p) protease/peptídeo ou polipeptídeo, pelo menos cerca de 0,7% (p/p) protease/peptídeo ou polipeptídeo, pelo menos cerca de 0,8% (p/p) protease/peptídeo ou polipeptídeo, pelo menos cerca de 0,9% (p/p) pro-tease/peptídeo ou polipeptídeo, pelo menos cerca de 1% (p/p) protease/peptídeo ou polipeptídeo, pelo menos cerca de 2% (p/p) protease/peptídeo ou polipeptídeo, pelo menos cerca de 3% (p/p) protease/peptídeo ou polipeptídeo, pelo menos cerca de 4% (p/p) protease/peptídeo ou polipeptídeo, ou cerca de 5% (p/p) protease/peptídeo ou polipeptídeo. A mistura pode ser incubada em uma temperatura apropriada para a atividade de protease (por exemplo, temperatura ambiente, cerca de 37°C) e as amostras podem ser retiradas em intervalos de tempo (por exemplo, em 1 hora, 2 horas, 3 horas, etc.). As amostras podem ser analisadas para degradação de proteína usando qualquer método apropriado, como análise de SDS-PAGE ou ligação a ligante, e os resultados podem ser usados para estabelecer um curso de tempo de degradação. Qualquer protease ou proteases desejadas podem ser usadas nos métodos descritos aqui.
[0070]Por exemplo, uma protease simples, qualquer combinação desejada de diferentes proteases, ou qualquer preparação biológica, extrato biológico ou homoge- nato biológico que contenha atividade pode ser usado. Não é necessário que a identidade da protease ou proteases que são usadas seja conhecida. Exemplos apropriados de proteases que podem ser usadas isoladas ou em qualquer combinação desejada incluem serina protease, cisteína protease, aspartato proteases, tiol proteases, metaloprotease da matriz, carboxipeptidase (por exemplo, carboxipeptidase A, carboxipeptidase B), tripsina, quimotripsina, pepsina, papaína, elastase, leucozima, pancreatina, trombina, plasmina, catepsinas (por exemplo, catepsina G), proteínaase (por exemplo, proteínaase 1, proteínaase 2, proteínaase 3), termolisina, quimosina, enteropeptidase, caspase (por exemplo, caspase 1, caspase 2, caspase 4, caspase 5, caspase 9, caspase 12, caspase 13), calpaína, ficaína, clostripaína, actinidaína, bromelaína, separase, dipeptidil aminopeptidase IV e semelhantes. Extratos biológi-cos apropriados, homogenatos e preparações que contêm atividade proteolítica in-cluem soro, escarro, muco (por exemplo, muco gástrico, muco nasal, muco bronquial), lavagem broncoalveolar, homogenato pulmonar, extrato pulmonar, extrato gástrico, fluido gástrico, saliva, lágrimas e semelhantes. Em uma modalidade, a protease é encontrada nos olhos e/ou lágrimas. A protease é usada em uma quantidade apropriada para que a degradação proteolítica ocorra. Por exemplo, como descrito aqui, a protease pode ser usada em cerca de 0,01% a cerca de 5% (p/p, protease/peptídeo ou polipeptídeo). Quando a protease é combinada com um sistema de exibição que compreende o repertório de peptídeos ou polipeptídeos (por exemplo, um sistema de exibição de fago), por exemplo, a protease pode ser usada em uma concentração de cerca de 10 μg/ml a cerca de 3 mg/ml, cerca de 10 μg/ml, cerca de 20 μg/ml, cerca de 30 μg/ml, cerca de 40 μg/ml, cerca de 50 μg/ml, cerca de 60 μg/ml, cerca de 70 μg/ml, cerca de 80 μg/ml, cerca de 90 μg/ml, cerca de 100 μg/ml, cerca de 200 μg/ml, cerca de 300 μg/ml, cerca de 400 μg/ml, cerca de 500 μg/ml, cerca de 600 μg/ml, cerca de 700 μg/ml, cerca de 800 μg/ml, cerca de 900 μg/ml, cerca de 1000 μg/ml, cerca de 1,5 mg/ml, cerca de 2 mg/ml, cerca de 2,5 mg/ml ou cerca de 3 mg/ml. Concentrações apropriadas são cerca de 10 μg/ml a 1mg/ml, 10 μg/ml a 100, 90, 80, 70, 60, 50 ou 40 μg/ml, ou 10, 20, 30, 40 ou 50 μg/ml a 100, 90, 80, 70, 60 μg/ml.
[0071]A protease é incubada com a coleção de peptídeos ou polipeptídeos (biblioteca ou repertório) em uma temperatura que é apropriada para a atividade da protease. Por exemplo, the a protease e coleção de peptídeos ou polipeptídeos podem ser incubados em uma temperatura de cerca de 200C a cerca de 400C (por exemplo, em temperatura ambiente, cerca de 200C, cerca de 210C, cerca de 22°C, cerca de 23°C, cerca de 24°C, cerca de 25°C, cerca de 26°C, cerca de 27°C, cerca de 28°C, cerca de 29°C, cerca de 300C, cerca de 310C, cerca de 32°C, cerca de 33°C, cerca de 34°C, cerca de 35°C, cerca de 36°C, cerca de 37°C, cerca de 38°C, cerca de 39°C, cerca de 400C). A protease e a coleção de peptídeos ou polipeptídeos são incubados juntos por um período de tempo suficiente para que a degradação proteolítica ocorra. Por exemplo, uma coleção de peptídeos ou polipeptídeos pode ser incubada junta com a protease por cerca de 30 minutos a cerca de 24 ou cerca de 48 horas. Em alguns exemplos, a coleção de peptídeos ou polipeptídeos é incubada junta com a protease durante a noite, ou por pelo menos cerca de 30 minutos, cerca de 1 hora,1,5 hora, cerca de 2 horas, cerca de 3 horas, cerca de 4 horas, cerca de 5 horas, cerca de 6 horas, cerca de 7 horas, cerca de 8 horas, cerca de 9 horas, cerca de 10 horas, cerca de 11 horas, cerca de 12 horas, cerca de 13 horas, cerca de 14 horas, cerca de 15 horas, cerca de 16 horas, cerca de 17 horas, cerca de 18 horas, cerca de 19 horas, cerca de 20 horas, cerca de 21 horas, cerca de 22 horas, cerca de 23 horas, cerca de 24 horas, cerca de 48 horas, ou mais.
[0072]É geralmente desejável, pelo menos em rodadas iniciais de seleção (por exemplo, quando a um sistema de exibição é usado), que os resultados de pro-tease em uma redução no número de clones que têm atividade biológica desejada que é selecionado para pelo menos uma ordem de magnitude, em comparação a se-leções que não incluem incubação com protease. Exemplos particulares, a quantidade de protease e condições usadas nos métodos são suficientes para reduzir o número de clones recuperados em pelo menos cerca de um log (um fator de 10), pelo menos cerca de 2 logs (um fator de 100), pelo menos cerca de 3 logs (um fator de 1000) ou pelo menos cerca de 4 logs (um fator de 10.000). Quantidades apropriadas de protease condições de incubação que resultarão na redução desejada em clones recuperados podem ser facilmente determinadas usando métodos convencionais e/ou diretrizes fornecidas aqui.
[0073]A protease e coleção de peptídeos ou polipeptídeos pode ser combinada e incubada usando qualquer método apropriado (por exemplo, in vitro, in vivo ou ex vivo). Por exemplo, a protease e coleção de peptídeos ou polipeptídeos pode ser combinada em um recipiente apropriado e mantido estacionário, em agitação, agitado, espiralado ou semelhante, em uma temperatura apropriada para a atividade de protease. Se desejado, a protease e coleção de peptídeos ou polipeptídeos podem ser combinados em um sistema in vivo ou ex vivo, como pela introdução da coleção de polipeptídeos (por exemplo, uma biblioteca ou repertório de exibição de fagos) em um animal apropriado (por exemplo, um camundongo), e após tempo suficiente para a atividade de protease passar, recuperar a coleção de peptídeos ou polipeptídeos. Em outro exemplo, um órgão ou tecido é perfundido com a coleção de polipeptídeos (por exemplo, uma biblioteca ou repertório de exibição de fago), e após tempo suficiente para a atividade de protease ocorre, a coleção de polipeptídeos é recuperada.
[0074]Após a incubação, o peptídeo ou polipeptídeo resistente a protease po-dem ser selecionados com base na atividade biológica desejada, como a atividade de ligação. Se desejado, um inibidor de protease pode ser adicionado antes da seleção. Qualquer inibidor de protease (ou combinação de dois ou mais inibidores de protease) que não irão interferir substancialmente com o método de seleção podem ser usados. Exemplos de inibidores de protease apropriados incluem, α1-anti-tripsina, α2-macro- globulina, amastatina, antipaina, antitrombina III, aprotinina, cloridrato de 4-(2-amino- etil) benzenosulfonil fluoreto (AEBSF), (4-Amidino-fenil)-Metano- Sulfonil Fluoreto (APMSF), bestatina, benzamidina, quimostatina, 3,4- Dicloroisocoumarina, diisopropil fluorofosfato (DIFP), E-64, ácido etilenodiamina tetracético (EDTA), elastatinal, leu- peptina, N-Etilmaleimida, fenilmetilsulfonilfluoreto (PMSF), pepstatina, 1,10-fenantro- lina, fosforamidon, inibidores de serina protease, N-tosil-L-lisina-clorometil cetona (TLCK), Na-Tosil-Phe-clorometilcetona (TPCK) e semelhantes. Além disso, muitas preparações que contêm inibidores de várias classes de proteases estão comercialmente disponíveis (por exemplo, Roche Complete Protease Inhibitor Cocktail Tablets™ (Roche Diagnostics Corporation; Indianapolis, IN, USA), que con-tém quimotripsina, termolisina, papaína, pronase, extrato pancreático e tripsina).
[0075]Um peptídeo ou polipeptídeo pode ser selecionado usando um método de seleção de atividade biológica desejada, que permite que peptídeos e polipeptí-deos que têm atividade biológica desejada serem distinguidos e selecionados a partir de peptídeos e polipeptídeos que não têm a atividade biológica desejada. Geralmente, peptídeos ou polipeptídeos que foram digeridos ou clivados por protease perdem sua atividade biológica, enquanto peptídeos ou polipeptídeos resistentes a protease permanecem funcionais. Assim, ensaios apropriados para atividade biológica podem ser usados para selecionar peptídeos ou polipeptídeos resistentes a protease. Por exemplo, uma função de ligação comum (por exemplo, ligação a um ligante geral, ligação a um ligante específico, ou ligação de um substrato) pode ser avaliada usando um ensaio de ligação apropriado (por exemplo, ELISA, panning). Por exemplo, polipeptídeos que se ligam a ligante alvo ou a um ligante genérico, como proteína A, proteína L ou um anticorpo, podem ser selecionados, isolados e/ou recuperados por panning ou usando uma matriz de afinidade apropriada. Panning pode ser conseguido pela adição de uma solução de ligante (por exemplo, ligante genérico, ligante alvo) a um recipiente apropriado (por exemplo, tubo, placa de petri) e deixando que o ligante seja depositado nas paredes do recipiente. O ligante em excesso pode ser lavado e os polipeptídeos (por exemplo, uma biblioteca de exibição de fago) podem ser adicionados ao recipiente e este mantido sob condições apropriadas para que os polipeptídeos se liguem ao ligante imobilizado. O polipeptídeo não ligado pode ser lavado e os polipeptídeos ligados podem ser recuperados usando qualquer métodos apropriado, como raspagem ou diminuição do pH, por exemplo.
[0076]Quando um sistema de exibição de fago é usado, a ligação pode ser testada em um ELISA de fago.
[0077]ELISA de fago pode ser realizado de acordo com qualquer procedi-mento apropriado. Em um exemplo, populações de fagos produzidos em cada rodada de seleção podem ser triados para ligação por ELISA ao ligante alvo selecionado ou ligante genérico, para identificar o fago que exibe peptídeos ou polipeptídeos resistentes a protease. Se desejado, peptídeos e polipeptídeos solúveis podem ser testados para ligação ao ligante alvo ou ligante genérico, por exemplo por ELISA usando reagentes, por exemplo, contra um tag C- ou N-terminal (vide, por exemplo Winter et al. (1994) Ann. Rev. Immunology 12, 433-55 e referências citadas aqui). A diversidade do fago selecionado pode ser avaliada por eletroforese em gel de produtos PCR (Marks et al. 1991, supra; Nissim et al. 1994 supra), sonda (Tomlinson et al, 1992) J. MoI. Biol. 227, 116) ou por sequência de vetor de DNA.
[0078]Peptídeos e polipeptídeos resistentes a protease podem ainda ser se-lecionados, por exemplo, baseado na atividade catalítica, que pode ser medida usando um ensaio de atividade catalítica (por exemplo, ensaio de atividade proteolí- tica, ensaio de fosfotransferase, ensaio de fosfohidrolase, ensaio de atividade de po-limerase).
[0079]O peptídeo ou polipeptídeo resistente a protease (por exemplo, domínio variável de anticorpo simples) pode ter especificidade de ligação para um ligante ge-nérico ou qualquer ligante alvo desejado, de mono que as proteínas humanas ou animais, incluindo citocinas, fatores de crescimento, receptores de citocina, receptores de fator de crescimento, enzimas (por exemplo, proteases), co-fatores para enzimas, proteínas de ligação a DNA, lipídeos e carboidratos. Antígenos ligantes apropriados, incluindo citocinas, fatores de crescimento, receptores de citocina, receptores de fator de crescimento e outras proteínas são descritos aqui. Ficará evidente que está lista não é de forma alguma exaustiva.
[0080]Em algumas modalidades, o peptídeo ou polipeptídeo resistente a pro-tease se liga a um ligante no tecido pulmonar, como um ligante selecionado do grupo que consiste de TNFR1, IL-I, IL-IR, IL-4, IL-4R, IL-5, IL-6, IL-6R, IL-8, IL-8R, IL-9, IL- 9R, IL-10, IL-12 IL-12R, IL-13, IL-13Rα1, IL-13Ra2, IL-15, IL-15R, IL-16, IL-17R, IL- 17, IL- 18, IL-18R, IL-23 IL-23R, IL-25, CD2, CD4, CD11a, CD23, CD25, CD27, CD28, CD30, CD40, CD40L, CD56, CD138, ALK5, EGFR, FcERl, TGFb, CCL2, CCL18, CEA, CR8, CTGF, CXCL12 (SDF-1), quimase, FGF, Furina, Endotelina-1 , Eotaxinas (por exemplo, Eotaxina, Eotaxina-2, Eotaxina-3), GM-CSF, ICAM-1, ICOS, IgE, IFNa, 1309, integrinas, L-selectina, MIF, MIP4, MDC, MCP-1, MMPs, neutrofil elastase, oste- opontina, OX-40, PARC, PD-1, RANTES, SCF, SDF-1, siglec8, TARC, TGFb, Trom- bina, Tim-1, TNF, TRANCE, Triptase, VEGF, VLA-4, VCAM, α4β7, CCR2, CCR3, CCR4, CCR5, CCR7, CCR8, alfavbeta6, alfavbeta8, cMET, CD8, vWF, proteínas ami- loides (por exemplo, alfa amiloide), MMP12, PDK1, e IgE.
[0081]Quando um sistema de exibição (por exemplo, um sistema de exibição que se liga à função codificadora de um ácido nucleico e características funcionais do peptídeo ou polipeptídeo codificado pelo ácido nucleico) é usado nos métodos descritos aqui é frequentemente vantajoso amplificar ou aumentar o número de cópia dos ácidos nucleicos que codificam os peptídeos ou polipeptídeos selecionados. Isto fornece uma maneira eficiente de obter quantidades suficientes de ácidos nucleicos e/ou peptídeos ou polipeptídeos para rodadas adicionais de seleção, usando os métodos descritos aqui ou outros métodos apropriados, ou para preparar repertórios adicionais (por exemplo, repertórios de maturação de afinidade). Assim, em algumas modalidades, os métodos da invenção compreendem usar um sistema de exibição (por exemplo, que se liga à função codificante de um ácido nucleico e características funcionais do peptídeo ou polipeptídeo codificado pelo ácido nucleico, como uma exibição de fago) e ainda compreende amplificar ou aumentar o número de cópia de um ácido nucleico que codifica um peptídeo ou polipeptídeo selecionado. Ácidos nucleicos podem ser amplificados usando quaisquer métodos apropriados, como por amplificação de fago, crescimento celular, reação de cadeia de polimerase. Os métodos descritos aqui podem ser usados como parte de um programa para peptídeos ou polipeptídeos resistentes a protease isolada que compreendem, se desejado, outros métodos de seleção apropriados. Nestas situações, os métodos descritos aqui podem ser empre-gados em qualquer ponto desejado do programa, como antes ou após outros métodos de seleção serem usados. Os métodos descritos aqui podem ainda ser usados para fornecer duas ou mais rodadas de seleção, como descritos e exemplificados aqui.
[0082]Em outro aspecto, a invenção é um método de produzir um repertório de peptídeos ou polipeptídeos resistentes a protease. O método compreende fornecer um repertório de peptídeos ou polipeptídeos; combinar o repertório de peptídeos ou polipeptídeos e uma protease sob condições apropriadas para atividade de protease; e recuperar uma pluralidade de peptídeos ou polipeptídeos que têm uma atividade biológica desejada, por meio do qual um repertório de peptídeos ou polipeptídeos re-sistente a protease é produzido. Preferencialmente, a pluralidade de peptídeos ou polipeptídeos que têm uma atividade biológica desejada é recuperada com base na atividade de ligação, como ligação a um ligante genérico ou a um ligante alvo. Proteases, sistema de exibições, condições para atividade de protease, e métodos para selecionar peptídeos ou polipeptídeos que são apropriados para uso no método são descritos aqui com relação a outros métodos da invenção.
[0083]Em algumas modalidades, um sistema de exibição (por exemplo, um sistema de exibição que se liga à função codificante de um ácido nucleico e caracte-rísticas funcionais do peptídeo ou polipeptídeo codificado pelo ácido nucleico) que compreende um repertório de peptídeos ou polipeptídeos é usado e o método com-preende ainda amplificar ou aumentar o número de cópia de um ácido nucleico que codifica a pluralidade de peptídeos ou polipeptídeos selecionados. Ácidos nucleicos podem ser amplificados usando quaisquer métodos apropriados, como por amplifica-ção de fago, crescimento celular ou reação de cadeia de polimerase. Em uma moda-lidade, o sistema de exibição é exibição de bacteriófago e à amplificação é através da expressão em E. CoIi. Nesta modalidade, a expressão de protease em E.coli pode fornecer a protease para seleção de peptídeos ou polipeptídeos resistentes a pro-tease.
[0084]Em uma modalidade particular, a invenção é um método de produzir um repertório de polipeptídeos resistentes a protease que compreende dAbs. O método compreende fornecer um repertório de polipeptídeos que compreende dAbs; combinar o repertório de peptídeos ou polipeptídeos e uma protease (por exemplo, tripsina, elastase, leucozima) sob condições apropriadas para atividade de protease; e recuperar uma pluralidade de polipeptídeos que compreende dAbs que têm especificidade de ligação para um ligante genérico (por exemplo, proteína A, proteína G, proteína L) ou um ligante alvo. O método pode ser usado para produzir um repertório natural, ou um repertório que é tendencioso para uma especificidade de ligação desejada, como um repertório de maturação de afinidade baseado em uma dAb parenteral que tem especificidade de ligação para um ligante alvo desejado.
Sistema de Exibição de Polipeptídeos
[0085]Preferencialmente, o repertório ou biblioteca de peptídeos ou polipeptí-deos fornecido para uso nos métodos da invenção compreende um sistema de exibi-ção apropriado. O sistema de exibição preferencialmente resiste a degradação por protease (por exemplo, uma protease simples ou uma combinação de proteases, e qualquer extratos biológico, homogenatos ou preparações que contêm atividade pro- teolítica), por exemplo, soro, escarro, muco (por exemplo, muco gástrico, muco nasal, muco bronquial), lavagem broncoalveolar, homogenato pulmonar, extrato pulmonar, extrato gástrico, fluido gástrico, saliva, lágrimas e semelhantes. O sistema de exibição e semelhantes entre the o sistema de exibição e o polipeptídeo exposto é preferenci-almente pelo menos tão resistente a protease como os peptídeos ou polipeptídeos mais estáveis do repertório. Isto permite que um ácido nucleico que codifica um poli- peptídeo exposto selecionado seja facilmente isolado e/ou amplificado.
[0086]Em um exemplo, um peptídeo ou polipeptídeo resistente a protease pode ser selecionado, isolado e/ou recuperado a partir de um repertório de peptídeos ou polipeptídeos que estão em solução, ou covalente ou não covalentemente ligados a uma superfície apropriada, como plástico ou vidro (por exemplo, placa de microtitu- lação, arranjo de polipeptídeo como um microarranjo). Por exemplo, um arranjo de peptídeos em uma superfície de maneira que posicione cada membro de biblioteca distinta (por exemplo, sequência única de peptídeo) em um local discreto e pré-definido no arranjo pode ser usado. A identidade de cada membro da biblioteca em tal arranjo pode ser determinada por sua localização espacial no arranjo. As localizações no arranjo onde as interações de ligação entre um ligante alvo, por exemplo, e membros reativos da biblioteca ocorrem podem ser determinadas, identificando, assim, as sequências dos membros reativos com base na localização espacial. (Vide, por exemplo, Patente U.S. No. 5.143.854, WO 90/15070 e WO 92/10092.)
[0087]Preferencialmente, os métodos empregam um sistema de exibição que liga a função codificadora de um ácido nucleico e as características físicas, químicas e/ou funcionais de um peptídeo ou polipeptídeo codificados pelo ácido nucléico. Tal sistema de exibição pode compreender uma pluralidade de pacotes genéticos replicáveis, como bacteriófago ou células (bactéria). Preferencialmente, o sistema de exibição compreende uma biblioteca, como uma biblioteca de exibição de bacteriófago. A exibição de bacteriófago é um sistema de exibição particularmente preferencial. Um número de sistemas de exibição de bacteriófago apropriados (por exemplo, exibição sistema de exibição monovalente e multivalente) foi descrito. (Vide, por exemplo, Griffiths et al., Patente U.S. No. 6.555.313 B1 (incorporado aqui como referência); Johnson et al., Patente U.S. No. 5.733.743 (incorporado aqui como referência); McCafferty et al, Patente U.S. No. 5.969.108 (incorporado aqui como referência); Mulligan- Kehoe, Patente U.S. No. 5,702,892 (incorporado aqui como referência); Winter, G. et al, Annu. Rev. Immunol. 72:433-455 (1994); Soumillion, P. et al, Appl Biochem. Biotechnol 47(2-3): 175-189 (1994); Castagnoli, L. et al, Comb. Chem. High Throughput Screen, 4(2): 121-133 (2001).) Os peptídeos ou polipeptídeos expostos em um sistema de exibição de bacteriófago podem ser expostos em qualquer bacte- riófago, como fago filamentoso (por exemplo, fd, Ml 3, Fl), um fago lítico (por exemplo, T4, T7, lambda), ou um fago de RNA (por exemplo, MS2), por exemplo.Geralmente uma biblioteca de fago que expõe um repertório de peptídeos ou polipeptídeos de fago, como proteínas de fusão com uma proteína de revestimento de fago apropriado (por exemplo, proteína fdp III) é produzida ou fornecida. A proteína de fusão pode exibir os peptídeos ou polipeptídeos na ponta da proteína de revestimento do fago, ou se desejado, na posição interna. Por exemplo, o peptídeo ou polipeptídeo expostos pode estar presente em uma posição que é amino-terminal ao domínio 1 de pIII. (Domínio 1 de pIII é também referenciados como N1.) O polipeptídeo exposto pode ser diretamente fundido a pIII (por exemplo, N-terminação do domínio 1 de pIII) ou fundido a pIII usando um ligante. Se desejado, a fusão pode ainda compreender um tag (por exemplo, epítopo myc, tag de His). Bibliotecas podem compreender um repertório de peptídeos ou polipeptídeos que são exibidos como proteínas de fusão com uma proteína de revestimento de fago pode ser produzidos usando quaisquer métodos apropriados, como pela introdução de uma biblioteca de vetores de fago ou vetores de fagemídeo que codificam peptídeos ou polipeptídeos expostos em uma bactéria hospedeira apropriada, e cultivar a bactéria resultante para produzir fago (por exemplo, usando um fago helper apropriado ou complementando o plasmídeo, se desejado). Apropriadamente, em uma modalidade da invenção, condições apropriadas para a expressão de protease em bactéria são selecionadas. A biblioteca de fago pode ser recuperada a partir da cultura usando qualquer método apropriado, como precipitação e centrifugação.
[0088]O sistema de exibição pode compreender um repertório de peptídeos ou polipeptídeos que contém qualquer quantidade desejada de diversidade. Por exemplo, o repertório pode conter peptídeos ou polipeptídeos que têm sequências de aminoácidos que correspondem à polipeptídeos de ocorrência natural expressos por um organismo, grupo de organismos, tecido desejado ou célula desejada, ou pode conter peptídeos ou polipeptídeos que têm sequências de aminoácidos aleatórias ou randomizadas. Se desejado, os polipeptídeos podem ainda compartilhar um centro ou estrutura comum. Por exemplo, todos os polipeptídeos no repertório ou biblioteca podem ser baseados em uma estrutura selecionada da proteína A, proteína L, proteína G, um domínio de fibronectina, uma anticalina, CTLA4, uma enzima desejada (por exemplo, uma polimerase, uma celulase), ou um polipeptídeo da superfamília de imunoglobulina, como um anticorpo ou fragmento de anticorpo (por exemplo, um domínio variável de anticorpo). Os polipeptídeos de tal repertório ou biblioteca podem compreender regiões definidas de sequência de aminoácido aleatórias ou randomizadas e regiões de sequência comum de aminoácidos. Em certas modalidades, todos ou substancialmente todos os polipeptídeos em um repertório são do tipo desejado como uma enzima desejada (por exemplo, uma polimerase) ou um fragmento de ligação ao antígeno desejado de um anticorpo (por exemplo, VH ou VL humanos). Em modalidades preferenciais, o sistema de exibição de polipeptídeo compreende um repertório de polipeptídeos onde cada polipeptídeo compreende um domínio variável de anticorpo. Por exemplo, cada polipeptídeo no repertório pode conter um VH, um VL ou um Fv (por exemplo, uma cadeia Fv simples). Como descrito aqui, o repertório pode ser uma bi-blioteca de polipeptídeos baseado em moléculas parenterais como GLP-1 ou seus derivados como um derivado resistente a dipeptidil peptidase IV.
[0089]A diversidade de sequência de aminoácido pode ser introduzida em qualquer região desejada de um peptídeo ou polipeptídeo ou estrutura usando qual-quer método apropriado. Por exemplo, sequência de aminoácido pode ser introduzida em uma região ligante, como uma região determinante de complementariedade de um domínio variável de anticorpo ou um domínio hidrofóbico, ao preparar uma biblioteca de ácidos nucleicos que codificam os polipeptídeos diversificados usando qualquer método de mutagênese apropriado (por exemplo, PCR de baixa fidelidade, mutagê- nese direcionada para o sítio ou mediada por oligonucleotídeo, diversificação usando códons NNK) ou qualquer outro método apropriado. Se desejado, uma região de um polipeptídeo a ser diversificado pode ser randomizado.
[0090]O tamanho dos polipeptídeos que compõem o repertório é largamente uma questão de escolha e tamanho uniforme de polipeptídeo não é requerido. Preferencialmente, os polipeptídeos no repertório têm pelo menos estrutura terciária (formam pelo menos um domínio).
Seleção/Isolamento/Recuperação
[0091]Um peptídeo ou polipeptídeo resistente a protease (por exemplo, uma população de polipeptídeos resistentes a protease) pode ser selecionado, isolado e/ou recuperado a partir de um repertório ou biblioteca (por exemplo, em um sistema de exibição) usando qualquer método apropriado. Preferencialmente, um polipeptídeo resistente a protease é selecionado ou isolado com base em uma característica selecionável (por exemplo, características físicas, químicas, características funcionais). Características selecionáveis apropriadas incluem atividades biológicas dos peptídeos ou polipeptídeos no repertório, por exemplo, ligação a um ligante genérico (por exemplo, um superantígeno), ligação a um ligante alvo (por exemplo, um antígeno, um epítopo, um substrato), ligação a um anticorpo (por exemplo, através de um epítopo expresso em um peptídeo ou polipeptídeo), e atividade catalítica. (Vide , por exemplo, Tomlinson et al., WO 99/20749; WO 01/57065; WO 99/58655.)
[0092]Em algumas modalidades, o peptídeo ou polipeptídeo resistente a pro-tease é selecionado e/ou isolado de uma biblioteca ou repertório de peptídeos ou po-lipeptídeos nos quais substancialmente todos os peptídeos ou polipeptídeos resistentes a protease compartilham uma característica selecionável comum. Por exemplo, o peptídeo ou polipeptídeo resistente a protease pode ser selecionado a partir de uma biblioteca ou repertório no qual substancialmente todos peptídeos ou polipeptídeos resistentes a protease se ligam a um ligante genérico comum, s ligam a um ligante alvo comum, se ligam (ou são ligados por) um anticorpo comum, ou possuem uma atividade catalítica comum. Este tipo de seleção é particularmente útil para a prepara-ção de um repertório de peptídeos ou polipeptídeos resistentes a protease que são baseados em um peptídeo ou polipeptídeo parenteral que tem uma atividade biológica desejada, por exemplo, quando realizam uma maturação de afinidade de um domínio variável de imunoglobulina simples.
[0093]A seleção baseada na ligação a um ligante genérico comum pode gerar uma coleção ou população de peptídeos ou polipeptídeos que contém todos os substancialmente todos os peptídeos ou polipeptídeos resistentes a protease que foram componentes da biblioteca ou repertório original. Por exemplo, peptídeos ou polipeptídeos que se ligam a um ligante alvo ou a um ligante genérico, como proteína A, proteína L ou um anticorpo, podem ser selecionados, isolados e/ou recuperados por panning ou usando uma matriz de afinidade apropriada. Panning pode ser conseguido pela adição de uma solução de ligante (por exemplo, ligante genérico, ligante alvo) a um recipiente apropriado (por exemplo, tubo, placa de petri) e deixando que o ligante seja depositado nas paredes do recipiente. O ligante em excesso pode ser lavado e os peptídeos ou polipeptídeos (por exemplo, um repertório que foi incubado com protease) podem ser adicionados ao recipiente e este mantido sob condições apropriadas para que os polipeptídeos se liguem ao ligante imobilizado. Peptídeos ou polipeptídeos não ligados podem ser lavado e os peptídeos ou polipeptídeos ligados podem ser recuperados usando qualquer métodos apropriado, como raspagem ou diminuição do pH, por exemplo.
[0094]Matrizes de afinidade de ligantes apropriadas contêm um suporte sólido ou pérolas (por exemplo, agarose) ao qual um ligante é covalente ou não covalente- mente ligado. A matriz de afinidade pode ser combinada com peptídeos ou polipeptídeos (por exemplo, um repertório que foi incubado com protease) usando um processo de lote, um processo em coluna ou qualquer outro processo apropriado sob condições apropriadas para ligação de peptídeos ou polipeptídeos ao ligante na matriz. Peptídeos ou polipeptídeos que não se ligam à matriz de afinidade podem ser lavados e peptídeos ou polipeptídeos ligados podem ser eluídos e recuperados usando qualquer método apropriado, como eluição com um tampão de pH baixo, com um agente desnaturante suave (por exemplo, ureia), ou com um peptídeo que compete para a ligação ao ligante. Em um exemplo, um ligante alvo biotinilado é combinado com um repertório sob condições apropriadas para peptídeos ou polipeptídeos no repertório para ligar o ligante alvo. Peptídeos ou polipeptídeos ligados são recuperados usando avidina ou estreptovidina imobilizada (por exemplo, em uma pérola).
[0095]Em algumas modalidades, o ligante alvo ou genérico é um anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo. Anticorpos ou fragmentos de ligação ao antígeno que liga características estruturas de peptídeos ou polipeptídeos que são substancialmente conservadas nos peptídeos ou polipeptídeos de uma biblioteca ou repertório são particularmente úteis como ligantes genéricos. Anticorpos e fragmentos de ligação ao antígeno apropriados para uso como ligantes para isolamento, seleção e/ou recuperação de peptídeos ou polipeptídeos resistentes a protease podem ser monoclonal ou policlonal e podem ser preparados usando qualquer método apropriado.
BILBIOTECAS/REPERTÓRIOS
[0096]Em outros aspectos, a invenção refere-se à repertórios de peptídeos e polipeptídeos resistentes a protease, a bibliotecas que codificam peptídeos e polipep-tídeos resistentes a protease e a métodos para produzir tais bibliotecas e repertórios.
[0097]Bibliotecas que codificam e/ou contêm peptídeos e polipeptídeos resis-tentes a protease podem ser preparados ou obtidos usando qualquer método apropri-ado. A biblioteca da invenção pode ser desenhada para codificar peptídeos ou polipeptídeos resistentes a protease baseada em um peptídeo ou polipeptídeo de in-teresse (por exemplo, um peptídeo ou polipeptídeo selecionado a partir de uma bibli-oteca) ou podem ser selecionados a partir de outra biblioteca usando os métodos descritos aqui. Por exemplo, uma biblioteca enriquecida em polipeptídeo resistente a proteases pode ser preparada usando um sistema de exibição de polipeptídeo apropriado.
[0098]Em um exemplo, uma biblioteca de exibição de fago compreendendo um repertório de polipeptídeos expostos compreendendo domínios variáveis de imu-noglobulina simples (por exemplo, VH, Vk, VÀ) é combinado com uma protease sob condições apropriadas para atividade de protease, como descrito aqui. Polipeptídeo resistente a proteases é recuperado com base na atividade biológica desejada, como atividade de ligação (por exemplo, ligação a ligante genérico, ligação a ligante alvo) gerando, assim, uma biblioteca de exibição de fago enriquecida em polipeptídeo re-sistente a proteases.
[0099]Em outro exemplo, uma biblioteca de exibição de fago compreendendo um repertório de polipeptídeos expostos compreendendo domínios variáveis de imu-noglobulina simples (por exemplo, VH, VK, VÀ) é primeiro triado para identificar membros que têm especificidade de ligação para um antígeno ligante desejado. A coleção de polipeptídeos contendo a especificidade de ligação desejada é recuperada e a coleção é combinada com protease sob condições apropriadas para atividade proteolítica, como descrito aqui. A coleção de polipeptídeo resistente a proteases que tem especificidade de ligação a ligante desejada é recuperada, gerando uma biblioteca enriquecida em polipeptídeos resistente a protease e de alta afinidade. Como descrito aqui, resistência a protease neste método de seleção correlaciona-se com ligação de alta afinidade. Bibliotecas que codificam um repertório de um tipo desejado de polipeptídeos podem prontamente serem produzidas usando qualquer método apropriado. Por exemplo, uma sequência de ácido nucleico que codifica um tipo desejado de polipeptídeo (por exemplo, uma polimerase, domínio variável de imunoglobulina) pode ser obtida e uma coleção de ácidos nucleicos que contêm uma ou mais mutações pode ser preparada, por exemplo por amplificação de ácido nucleico usando um sistema de reação de cadeia de polimerase propensa a erro (PCR), por mutagênese química (Deng et al, J. Biol. Chem., 269:9533 (1994)) ou usando cepas mutadas de bactérias (Low et al, J. MoI. Biol, 260:359 (1996)).
[00100]Em outras modalidades, regiões particulares do ácido nucleico podem ser marcadas para diversificação. Métodos para mutar posições selecionadas são também bem conhecidas na técnica e incluem, por exemplo, o uso de oligonucleotí- deos com erros de pareamento ou oligonucleotídeos degenerados, com ou sem uso de PCR. Por exemplo, bibliotecas de anticorpos sintéticos foram criadas por marcações de mutações às alças de ligação de antígeno. Regiões H3 e L3 randômicas ou semi-randômicas de anticorpo foram ligadas à segmentos de gene V de imunoglobulina germinativa para produzir grandes bibliotecas com regiões de estrutura não mutadas (Hoogenboom and Winter (1992) supra; Nissim et al (1994) supra; Griffiths et al (1994) supra; DeKruif et al (1995) supra). Tal diversificação foi estendida para incluir algumas ou todas as outras alças de ligação de antígenos (Crameri et al. (1996) Nature Med., 2: 100; Riechmann et al. (1995) Bio/Technology, 13:475; Morphosys, WO 97/08320, supra). Em outras modalidades, regiões particulares do ácido nucleico podem ser marcadas para diversificação de, por exemplo, uma estratégia de PCR de duas etapas empregando o produto do primeiro PCR como um "mega-primer." (Vide, por exemplo, Landt, O. et al., Gene 96:125-128 (1990).) A marcação de diversificação pode ainda ser conseguida, por exemplo, por SOE PCR. (Vide, por exemplo, Horton, R.M. et ah, Gene 77:61-68 (1989).)
[00101]A diversidade de sequência em posições selecionadas podem ser conseguidas ao alterar a sequência de codificação que especifica a sequência do poli- peptídeo de modo que um número de aminoácidos possíveis (por exemplo, todos os 20 ou um subconjunto do mesmo) possa ser incorporado naquela posição. Usando a nomenclatura IUPAC, o códon mais versátil é NNK, que codifica todos os aminoácidos bem como o códon de parada TAG. O códon NNK é preferencialmente usado para introduzir a diversidade requerida. Outros códons que atingem as mesmas terminações são também usados, incluindo o códon NNN, que leva à produção dos códons de parada adicionais TGA e TAA. Tal abordagem de marcação pode permitir que um espaço completo de sequência em uma área de ligante seja explorada.
[00102]Bibliotecas preferenciais compreendem polipeptídeo resistente a pro-teases que são membros da superfamília de imunoglobulina (por exemplo, anticorpos ou porções dos mesmos). Por exemplo as bibliotecas podem compreender polipeptídeos de anticorpo resistentes a protease que têm uma conformação conhecida de cadeia principal. (Vide, por exemplo, Tomlinson et al., WO 99/20749.) Bibliotecas podem ser preparadas em um plasmídeo ou vetor apropriado. Como usado aqui, vetor refere-se a um elemento discreto que é usado para introduzir DNA heterólogo em células para expressão e/ou replicação do mesmo. Qualquer vetor apropriado pode ser usado, incluindo plasmídeos (por exemplo, plasmídeos bacterianos), vetores virais ou bacteriófagos, cromossomos artificiais e vetores epissomais. Tais vetores podem ser usados para clonagem e mutagênese simples, ou um vetor de expressão pode ser usado para dirigir a expressão da biblioteca. Os vetores e plasmídeos geralmente contêm um ou mais sítios de clonagem (por exemplo, um polilgante), uma origem de replicação e pelo menos um gene marcador selecionável. Vetores de expressão podem ainda conter elementos para dirigir a transcrição e tradução de um polipeptídeo, como um elemento facilitar, promotor, sinal de terminação de transcrição, sequências de sinal e semelhantes. Estes elementos podem ser arranjados de modo que sejam ligados de forma operacional a uma inserção clonada codificando um polipeptídeo, tal que o polipeptídeo seja expresso e produzido quando um vetor de expressão é mantido sob condições apropriadas para expressão (por exemplo, em uma célula hospedeira apropriada). Clonagem e vetores de expressão geralmente contêm se-quências de ácido nucleico que permitem que o vetor replique em uma ou mais células hospedeiras selecionadas.Tipicamente em vetores de clonagem, esta sequência é tal que permite que o vetor replique independentemente do DNA cromossomal hospedeiro e incluem origens de replicação ou sequências de replicação autonomamente. Tais sequências são bem conhecidas para uma variedade de bactérias, leveduras e vírus. A origem da replicação do plasmídeo pBR322 é apropriado para a maioria das bactérias Gram negativas, as 2 origens de plasmídeo de micron são apropriados para levedura, e várias origens virais (por exemplo SV40, adenovírus) são úteis para vetores de clonagem em células mamíferas. Geralmente, a origem de replicação não é necessária para vetores de expressão de mamíferos, salvo se estes são usados em células mamíferas capazes de replicar altos níveis de DNA, como células COS.
[00103]Clonagem ou vetores de expressão podem conter uma seleção de gene também referenciada como um marcador selecionável. Tais genes marcadores codificam uma proteína necessária para a sobrevivência ou crescimento de células hospedeiras transformadas que cresceram em um meio de cultura seletivo. Células hospedeiras não transformadas com o vetor contendo a seleção de gene irão, por-tanto, não sobreviver no meio de cultura. Seleções típicas de genes que codificam proteínas que conferem resistência a antibióticos e outras toxinas, por exemplo, am- picilina, neomicina, metotrexato ou tetraciclina, deficiências auxotróficas de comple-mento, ou suprimento de nutrientes críticos não disponíveis no meio de crescimento.
[00104]Vetores de expressão apropriados podem conter um número de com-ponentes, por exemplo, uma origem de replicação, um gene marcador selecionável, um ou mais elementos de controle de expressão, como um elemento de controle de transcrição (por exemplo, promotor, facilitador, terminador) e/ou um ou mais sinais de tradução, uma sequência de sinal ou sequência líder, e semelhantes. Elementos de controle de expressão e um sinal ou sequência líder, se presente, podem ser fornecidos pelo vetor ou outra fonte. Por exemplo, as sequências de controle de transcrição e/ou tradução de um ácido nucleico clonado que codifica uma cadeia de anticorpo podem ser usadas para expressão direta. Um promotor pode ser fornecido para expressão em uma célula hospedeira desejada. Promotores podem ser constitutivos ou induzíveis. Por exemplo, um promotor pode ser ligado de forma operacional a um a ácido nucleico que codifica um anticorpo, cadeia de anticorpo ou porção do mesmo, de modo que direcione a transcrição do ácido nucleico. Uma variedade de promotores adequados para células procarióticas (por exemplo,sistemas de β-lactamase e promotor de lactose, fosfatase alcalina, sistema de promotor de triptofano (trp), lac, tac, T3, promotores de T7 para E. coli) e eucarióticas (por exemplo, promotor precoce ou tardio de vírus símio 40, promotor repetido de terminal longo de vírus Rous sarcoma, promotor de citomegalovírus, promotor tardio de adenovírus, promotor de EG-1a) estão disponíveis.
[00105]Além disso, vetores de expressão tipicamente compreendem um mar-cador selecionável de células hospedeiras que conduzem o vetor e, no caso de um vetor de expressão replicável, uma origem de replicação. Genes que codificam pro-dutos que conferem resistência a antibiótico ou drogas são marcadores comuns selecionáveis e podem ser usados em células procarióticas (por exemplo, gene de β- lactamase (resistência a ampicilina), gene Tet para resistência a tetraciclina) e células eucarióticas (por exemplo, neomicina (G418 ou geneticina), gpt (ácido micofenólico), genes de resistência a ampicilina ou higromicina). Genes marcadores de dihidrofolato redutase permitem a seleção com metotrexato em uma variedade de hospedeiros. Genes que codificam o produto gene de marcadores auxotróficos do hospedeiro (por exemplo, LEU2, URA3, HIS3) são geralmente usados como marcadores selecionáveis em levedura. Uso de vetores virais (por exemplo, baculovirus) ou de fago, e vetores que são capazes de integrar bi genoma da célula hospedeira, como vetores retrovirais, estão também contemplados. Vetores de expressão apropriados para expressão em células procarióticas (por exemplo, células bacterianas como E. coli) ou mamíferas incluem, por exemplo, um vetor pET (por exemplo, pET-12a, pET-36, pET-37, pET- 39, pET-40, Novagen e outros), um vetor de fago (por exemplo, pCANTAB 5 E, Phar-macia), pRIT2T (vetor de fusão de Proteína A, Pharmacia), pCDM8, pCDNA1.1/amp, pcDNA3.1, pRc/RSV, pEF-1 (Invitrogen, Carlsbad, CA), pCMV- SCRIPT, pFB, pSG5, pXT1 (Stratagene, La Jolla, CA), pCDEF3 (Goldman, L.A., et al, Biotechniques, 27: 1013-1015 (1996)), pS VSPORT (GibcoBRL, Rockville, MD), pEF-Bos (Mizushima, S., et al, Ácidos nucleicos Res., 18:5322 (1990)) e semelhantes. Vetores de expressão são apropriados para uso em vários hospedeiros de expressão, como células proca-rióticas (E. coli), células de inseto (células Drosophila Schnieder S2, Sf9), levedura (P. methanolica, P. pastoris, S. cerevisiae e células mamíferas (por exemplo, células COS) estão disponíveis.
[00106]Vetores preferenciais são vetores de expressão que permitem a ex-pressão de uma sequência de nucleotídeo correspondente à um membro da biblioteca de polipeptídeo. Assim, a seleção com ligantes alvos e/ou genéricos pode ser realizada por propagação de separação e expressão de um único clone simples que expressão o membro polipeptídeo da biblioteca. Como descrito acima, o sistema de seleção preferencial de exibição é exibição de bacteriófago.Assim, um vetor de fato ou fagemídeo pode ser usado. Os vetores preferenciais são vetores fagemídeo que têm uma origem de replicação em E. coli (para replicação de fita dupla) e também uma origem de replicação de fago (para produção de DNA de fita simples). A manipulação e expressão de tais vetores é bem conhecida na técnica (Hoogenboom and Winter (1992) supra; Nissim et al. (1994) supra). Resumidamente, o vetor pode conter um gene β-lactamase para conferir seletividade no fagemídeo e um promotor lac montante de um cassete de expressão que contém uma sequência líder apropriada, um sítio de clonagem múltiplo, um ou mais tags de peptídeo, um ou mais códons de parada TAG e a proteína pIII do fago. Assim, usando várias cepas supressoras e não supressoras de E. coli e com a adição de glicose, isopropil tio- β-D-galactoside (IPTG) ou um fago helper, como VCS M13, o vetor é capaz de replicar como um plasmídeo sem expressão, produzir grandes quantidades do membro da biblioteca do peptídeo somente ou um produto do fago, alguns dos quais contêm pelo menos uma cópia do polipeptídeo de fusão pIII em sua superfície.
[00107]As bibliotecas e repertórios da invenção podem conter formatos de anticorpo. Por exemplo, o polipeptídeo combinado com as bibliotecas e repertórios podem ser anticorpos completos ou fragmentos dos mesmos, como fragmentos Fab, F(ab )2, Fv ou scFv, domínios VH ou VL separados, quaisquer um deles modificados ou não modificados, fragmentos scFv, bem como outros polipeptídeos de anticorpo, pode ser prontamente produzido usando qualquer método apropriado. Um número de métodos de engenharia de anticorpo apropriados é bem conhecido na técnica. Por exemplo, um scFv pode ser formado por ligação de ácidos nucleicos que codificam dois domínios variáveis com um oligonucleotídeo apropriado que codifica um peptídeo ligante apropriado como (GIy- Gly-Gly-Gly-Ser)3ou outros peptídeos ligantes apropriados. O ligante faz ponte com a extremidade C-terminal da primeira região V e a extremidade N-terminal da segunda região V. Técnicas semelhantes para a construção de outros formatos de anticorpos como fragmentos Fv, Fab e F(ab)2 podem ser usadas. Para fragmentos de formato Fab e F(ab)2 fragmentos, polipeptídeos VH e VL podem ser combinados com segmentos de região constante, que podem ser isolados a partir de genes rearranjados, genes C germinativos ou sintetizados a partir de dados de sequência de anticorpo. Uma biblioteca ou repertório de acordo com a invenção podem ser uma biblioteca ou repertório VH ou VL .
[00108]Os polipeptídeos que compreendem um domínio variável resistente a protease preferencialmente compreendem um sítio de ligação ao ligante alvo e/ou um sítio de ligação ao ligante genérico. Em certas modalidades, o sítio de ligação ao ligante genérico é um sítio de ligação para um superantígeno como
[00109]proteína A, proteína L ou proteína G. Os domínios variáveis podem ser baseados em qualquer domínio variável desejado, por exemplo um VH humano (por exemplo, VH 1a, VH 1b, VH 2, VH 3, VH 4, VH 5, VH 6), um VÀ humano (por exemplo, VÀl, VÀll, VÀlll, VÀlV, VÀV, VÀVI ou VK1) ou um VD humano (por exemplo, VK2, VK3, VK4, VK5, VH6, VK7, VK8, VK9 ou VK10).
ÁCIDOS NUCLEICOS, CÉLULAS HOSPEDEIRAS E MÉTODOS PARA PRODUZIR POLIPEPTÍDEO RESISTENTE A PROTEASE
[00110]A invenção refere-se ainda à ácidos nucleicos isolados e/ou recombi-nantes que codificam peptídeos ou polipeptídeos resistentes a protease, por exemplo, os que são selecionáveis ou selecionados pelos métodos descritos aqui.
[00111]Ácidos nucleicos referenciados aqui como "isolados" são ácidos nu-cleicos que foram separados de outro material (por exemplo, outros ácidos nucleicos como DNA genômico, cDNA e/ou RNA) em seu ambiente natural (por exemplo, em células ou em mistura de ácidos nucleicos como uma biblioteca). Um ácido nucleico isolado pode ser isolado como parte de um vetor (por exemplo, um plasmídeo).
[00112]Ácidos nucleicos referenciados aqui como "recombinantes" são ácidos nucleicos que foram produzidos por metodologia de DNA recombinante, incluindo métodos que se apoiam em recombinação artificial, como clonagem em um vetor ou cromossomo usando, por exemplo, enzimas de restrição, recombinação homóloga vírus e semelhantes, e ácidos nucleicos preparados usando reação de cadeia de polimerase (PCR).
[00113]A invenção refere-se ainda a uma célula hospedeira recombinante que compreende um (ou mais) ácido nucleico recombinante ou construto de expressão compreendendo um ácido nucleico que codifica um peptídeo ou polipeptídeo resistente a protease, por exemplo, um peptídeo ou polipeptídeo selecionável ou selecionado pelos métodos descritos aqui. A invenção inclui ainda um método para preparar um peptídeo ou polipeptídeo resistente a protease que compreende manter uma célula hospedeira recombinante da invenção sob condições apropriadas para expressão de um peptídeo ou polipeptídeo resistente a protease. O método pode ainda compreender a etapa de isolamento ou recuperação do peptídeo ou polipeptídeo resistente a prótese, se desejado.
[00114]Por exemplo, um ácido nucleico (ou seja, uma ou mais moléculas de ácido nucleico) que codifica um peptídeo ou polipeptídeo resistente a protease, ou um construto de expressão (ou seja, um ou mais construtos) que compreendem dita(s) molécula(s) de ácido nucleico, podem ser introduzidos em uma célula hospedeira apropriada para criar uma célula hospedeira recombinante usando qualquer método apropriado à célula hospedeira selecionada (por exemplo, transformação, transfec- ção, eletroporação, infecção), de modo que a(s) molécula(s) de ácido nucleico seja ligada de forma operacional a um ou mais elementos de controle de expressão (por exemplo, em um vetor, em um construtor criado por processos na célula, integrados no genoma da célula hospedeira). A célula hospedeira recombinante pode ser mantida sob condições apropriadas para expressão (por exemplo, na presença de um indutor, em um animal apropriado, em meio de cultura apropriado suplementado com sais apropriados, fatores crescimento, antibióticos, suplementos nutricionais, etc.), por meio do qual o peptídeo ou polipeptídeo codificado é produzido. Se desejado, o peptídeo ou polipeptídeo codificado pode ser isolado ou recuperado (por exemplo, a partir de animal, célula hospedeira, meio, leite). Este processo engloba a expressão em uma célula hospedeira de um animal transgênico (vide, por exemplo, WO 92/03918, Gen- Pharm International).
[00115]O peptídeo ou polipeptídeo resistente a protease selecionado pelo método descrito aqui pode ser ainda produzido em um sistema de expressão in vitro, por síntese química ou por qualquer outro método apropriado.
POLIPEPTÍDEOS, dAbs, AGONISTAAS, & ANTAGONISTAAS
[00116]Como descrito e exemplificado aqui, polipeptídeo resistente a protease, peptídeos ou dAbs da invenção geralmente se ligam ao seu ligante alvo com alta afinidade. Assim, em outro aspecto, é fornecido um método para selecionar, isolar e/ou recuperar um polipeptídeo ou dAb da invenção que se liga a um antígeno ligante com alta afinidade. Geralmente, o método compreende fornecer uma biblioteca ou repertório de peptídeos ou polipeptídeos (por exemplo, dAbs) combinando a biblioteca ou repertório com uma protease (por exemplo, tripsina, elastase, leucozima, pancrea- tina, escarro) sob condições apropriadas para a atividade de protease, e selecionar, isolar e/ou recuperar um peptídeo ou polipeptídeo que se liga a um ligante (por exemplo, ligante alvo). Devido à biblioteca ou repertório ter sido exposto à protease sob condições onde peptídeos ou polipeptídeos sensíveis à protease serão digeridos, a atividade de protease pode eliminar os polipeptídeos menos estáveis que têm baixa afinidade de ligação, e assim, produzir uma coleção de peptídeos ou polipeptídeos de alta afinidade de ligação. Por exemplo, o polipeptídeo ou dAb da invenção pode se ligar a um antígeno ligante uma afinidade (KD; KD = como determinado pela ressonância de plásmon de superfície) de 1 μM ou mais forte, preferencialmente cerca de 500 nM a cerca de 0,5 pM. Por exemplo, o polipeptídeo ou dAb da invenção pode se ligar ao ligante antígeno (por exemplo, TNFR1) com uma afinidade de cerca de 500 nM, cerca de 100 nM, cerca de 10 nM, cerca de 1 nM, cerca de 500 pM, cerca de 100 pM, cerca de 10 pM, cerca de 1 pM ou cerca de 0,5 pM. Embora não estejamos ligados a qualquer teoria particular, acredita-se que peptídeos e polipeptídeos que são resistentes a proteases tenham uma entropia menor e/ou uma energia de estabilização maior. Assim, a correlação entre resistência à protease e a ligação de alta afinidade podem estar relacionados à compacidade e estabilidade das superfícies dos peptídeos e polipeptídeos e dAbs selecionados pelo método descrito aqui.
[00117]O polipeptídeo, dAb, agonista ou antagonista podem ser expressos em E. coli ou em espécies de Pichia (por exemplo, P. pastoris). Em uma modalidade, o ligante ou monômero dAb é secretado em uma quantidade de pelo menos cerca de 0,5 mg/L quando expressos em E. coli ou em espécies de Pichia (por exemplo, P. pastoris). Entretanto, os ligantes e monômeros dAb descritos aqui possam ser secre- táveis quando expressos em E. coli ou em espécies de Pichia (por exemplo, P. pas-toris), eles podem ser produzidos usando qualquer método apropriado, como métodos de química sintética ou métodos de produção biológica que não empregam espécies de E. coli ou Pichia.
[00118]Em algumas modalidades, o polipeptídeo, dAb, agonista ou antago-nista não compreendem um domínio variável de imunoglobulina de camelídeos, ou uma ou mais estruturas de aminoácidos que são domínios variáveis únicos de imunoglobulina codificados por segmentos de gene de anticorpo germinativo de camelídeos, por exemplo na posição 108, 37, 44, 45 e/ou 47.
[00119]Agonistas ou antagonistas de acordo com a invenção podem ser mo-novalentes ou multivalentes. Em algumas modalidades, o agonista ou antagonista é monovalente e contém um sítio de ligação que interage com o antígeno ligante, o sítio de ligação fornecido por um polipeptídeo ou dAb da invenção. Agonistas ou antagonistas monovalentes se ligam a um antígeno ligante e podem não induzir ligação cruzada ou aglomeração do antígeno ligante (por exemplo, antígenos receptores) na superfície de células que podem levar à ativação do receptor e transdução do sinal.
[00120]Em outras modalidades, o agonista ou antagonista da invenção é multivalente. Agonistas ou antagonistas multivalentes podem conter duas ou mais cópias de um sítio de ligação particular para um antígeno ligante ou conter dois ou mais sítios de ligação diferentes que ligam o antígeno ligante, pelo menos um dos sítios de ligação sendo fornecido por um polipeptídeo ou dAb da invenção. Por exemplo, como descrito aqui o agonista ou antagonista pode ser um dímero, trímero ou multímero que compreende duas ou mais cópias de um polipeptídeo ou dAb particular da invenção que se liga a um antígeno, ou dois ou mais polipeptídeos diferentes ou dAbs da invenção que se ligam a um antígeno. Em uma modalidade, um antagonista multivalente se liga a um antígeno de receptor de superfície e não agoniza substancialmente antígeno (atua como um agonista do antígeno) em um ensaio padrão de célula.
[00121]Em certas modalidades, o agonista ou antagonista multivalente con-tém dois ou mais sítios de ligação para um epítopo ou domínio do antígeno ligante. Em outras modalidades, o polipeptídeo pode ser um agente insulinotrópico como um peptídeo derivado de GLP-1. Métodos apropriados para determinar a potência de um agente insulinotrópico, resistente a proteases como DPP-IV, meia-vida após a admi-nistração e efeitos in vivo são descritos, por exemplo em WO 2006/059106.
[00122]Em outras modalidades, o agonista ou antagonista multivalente con-tém dois ou mais sítios de ligação fornecidos por polipeptídeos ou dAbs da invenção que se ligam a diferentes epítopos ou domínios de antígeno ligante.
[00123]Em certas modalidades, o polipeptídeo, dAb, agonista ou antagonista da invenção são eficazes em modelos de doenças inflamatórias crônicas quando uma quantidade efetiva é administrada. Geralmente uma quantidade efetiva é de cerca de 1 mg/kg a cerca de 10 mg/kg (por exemplo, cerca de 1 mg/kg, cerca de 2 mg/kg, cerca de 3 mg/kg, cerca de 4 mg/kg, cerca de 5 mg/kg, cerca de 6 mg/kg, cerca de 7 mg/kg, cerca de 8 mg/kg, cerca de 9 mg/kg, ou cerca de 10 mg/kg). Os modelos de doença inflamatória crônica (vide aqueles descritos em WO2006038027) são reconhecidos pelos especialistas na técnica como sendo preditivo de eficácia terapêutica em humanos. Geralmente, os ligantes presentes (por exemplo, agonistas, antagonistas) serão utilizados na forma purificada juntos com carreadores farmacologicamente apropriados. Tipicamente, estes carreadores incluem soluções aquosas ou alcoólicas, emulsões ou suspensos,qualquer meio salina e/ou tamponado. Veículos parenterais incluem solução de cloreto de sódio, dextrose de Ringer, dextrose e cloreto de sódio e Ringer lactato. Adjuvantes fisiologicamente aceitáveis, se necessário, para manter o complexo de polipeptídeo em suspensão, podem ser escolhidos a partir de espessan- tes como carboximetilcelulose, polivinilpirrolidona, gelatina e alginatos.
[00124]Veículos intravenosos incluem melhoradores de fluido e nutrientes e melhoradores eletrolíticos, como os baseados em Ringer dextrose. Preservativos e outros aditivos, como antimicrobianos, antioxidantes, agentes quelantes e gases inertes podem ainda estar presentes (Mack (1982) Remington's Pharmaceutical Sciences, 16th Edition). Uma variedade de formulações apropriadas pode ser usada, incluindo formulações de liberação prolongada.
[00125]Os ligantes (por exemplo, antagonistas) da presente invenção podem ser usados como composições administradas separadamente ou em conjunto com outros agentes. Estes podem incluir várias drogas imunoterápicas, como ciclosporina, metotrexato, adriamicina ou cisplatina e imunotoxinas. Composições farmacêuticas podem incluir "coquetéis" de vários citotóxicos ou outros agentes em conjunto com os ligantes da presente invenção, ou mesmo combinações de ligantes de acordo com a presente invenção contendo diferentes especificidades, como ligantes selecionados usando diferentes antígenos ou epítopos ligantes, estejam ou não agrupados antes da administração.
[00126]A via de administração das composições farmacêuticas de acordo com a invenção podem ser qualquer um dos comumente conhecidos aos especialistas na técnica. Para terapia, incluindo sem limitação a imunoterapia, os ligantes selecionados do mesmo da invenção podem ser administrados a qualquer paciente de acordo com técnicas padrões. A administração pode ser por qualquer modo apropriado, incluindo parenteral, intravenoso, intramuscular, intraperitoneal, transdérmico, via pulmonar, ou ainda, apropriadamente, por infusão direta com um cateter. A dosagem e frequência de administração depende da idade, sexo e condição do paciente, administração concorrente de outras drogas, contra-indicações e outros parâmetros a serem levados em consideração pelo médico. A administração pode ser local (por exemplo, liberação local no pulmão pela administração pulmonar, por exemplo, administração intranasal) ou sistêmica como indicado.
[00127]Os ligantes desta invenção podem ser liofilizados para armazena-mento e reconstituídos em um carreador próprio antes do uso Esta técnica demons-trou ser efetiva com imunoglobulinas convencionais e liofilização conhecida na técnica e técnicas de reconstituição podem ser empregadas. Ficará claro para os especialistas na técnica que a liofilização e reconstituição podem levar a variados graus de perda de atividade do anticorpo (por exemplo com imunoglobulinas convencionais, anticorpos IgM tendem a ter maior perda de atividade do que anticorpos IgG) e os níveis de uso devem ser ajustados para cima para compensar. As composições contendo os ligantes presentes (por exemplo, agonistas, antagonistas) ou um coquetel dos mesmos podem ser administradas para tratamentos profiláticos e/ou terapêuticos. Em certas aplicações terapêuticas, uma quantidade adequada para conseguir pelo menos inibição parcial, supressão, modulação, morte ou alguns parâmetros medíveis, de uma população de células selecionadas é definido como “dose terapeuticamente efetiva”. Quantidades necessárias para conseguir a dosagem dependerão da severidade da doença e do estado geral do sistema imune do paciente, mas geralmente variam de 0,005 a 5,0 mg do ligante, por exemplo, dAb, agonista ou antagonista por quilograma de peso corporal, com doses de 0,05 a 2,0 mg/kg/dose sendo mais comu- mente usados. Para aplicações terapêuticas, composições contendo os ligantes presentes ou coquetéis dos mesmos podem ainda ser administrados em dosagens ligeiramente menores para prevenir ou retardar o início da doença (por exemplo, sustentar a remissão ou quiescência ou para prevenir a fase aguda). O clínico especialista estará apto a determinar o intervalo de dose apropriado para tratar, suprimir ou prevenir a doença. O tratamento ou terapia realizado usando as composições descritas aqui é considerado “efetivo” se um ou mais sintomas são reduzidos (por exemplo, em pelo menos 10% ou pelo menos um ponto em uma escala de avaliação clínica), em relação a tais sintomas presentes antes do tratamento, ou em relação aos sintomas em um indivíduo (modelo humano ou animal) não tratado com tal composição ou outro controle apropriado. Os sintomas irão obviamente variar dependendo da doença ou transtorno pretendido, mas podem ser medidos por um médico especialista ou técnico. Tais sintomas podem ser medidos como, por exemplo, pelo monitoramento do nível de um ou mais indicadores bioquímicos (por exemplo, níveis de uma enzima ou me- tabólito correlacionado com a doença, número de células afetadas, etc.), pelo monitoramento de manifestações físicas (por exemplo, inflamação, tamanho do tumor, etc.), ou por uma escala de avaliação clínica aceita, por exemplo, a Escala Expandida de Estado de Incapacidade (para esclerose múltipla), o Questionário de Doença Intestinal Inflamatório de Irvine (32 pontos de avaliação estimam a qualidade de vida com relação à função intestinal, sintomas sistêmicos, função social e estado emocional - o escore varia de 32 a 224, com escores maiores indicando melhor qualidade de vida), a Escala de Qualidade de Vida de Artrite Reumatoide, ou outra escala de avaliação clínica conhecida no campo. Uma redução sustentada (por exemplo, um dia ou mais, ou maior) na doença ou sintomas do transtorno em pelo menos 10% ou por um ou mais pontos em uma dada escala clínica é indicativo de tratamento “efetivo”. De forma semelhante, a profilaxia realizada usando uma composição como descrito aqui é “efetiva” se o início ou severidade de um ou mais sintomas é retardado, reduzido ou abolido em relação a tais sintomas em um indivíduo semelhante (modelo humano ou animal) não tratado com a composição.
[00128]Uma composição contendo um ligante (por exemplo, agonista, anta-gonista) ou coquetel do mesmo de acordo com a presente invenção pode ser utilizado em ambientes profiláticos e terapêuticos para auxiliar na alteração, inativação, morte ou remoção de uma população de célula ligante em um mamífero. Além disso, os repertórios selecionados de polipeptídeos descritos aqui podem ser usados de forma extracorporal ou in vitro seletivamente para matar, depletar ou de outra forma remover de forma efetiva uma população de célula ligante a partir de uma coleção heterogênea de células. Sangue de um mamífero pode ser combinado de forma extracorpórea com os ligantes, por meio do qual as células não desejadas são mortas ou de outra forma removidas do sangue para retornar ao mamífero de acordo com as técnicas padrões.
[00129]Uma composição contendo um ligante (por exemplo, agonista, anta-gonista) de acordo com a presente invenção pode ser utilizado em ambientes profilá-ticos e terapêuticos para auxiliar na alteração, inativação, morte ou remoção de uma população de célula ligante em um mamífero.
[00130]Os ligantes (por exemplo, antígeno antagonistas anti-ligante, agonis- tas, monômeros dAb) podem ser administrados e ou formulados juntos com um ou mais agentes ativos ou terapêuticos adicionais. Quando um ligante (por exemplo, um dAb) é administrado com um agente terapêutico adicional, o ligante pode ser administrado antes, simultaneamente com ou subsequente à administração do agente adicional. Geralmente, o ligante e agente adicional são administrados de maneira a fornecer uma sobreposição do efeito terapêutico.
[00131]Em uma modalidade preferencial da invenção, composições farma-cêuticas contendo uma droga GLP-1 ou análogo GLP-1 ou derivado, de acordo com a presente invenção, podem ser administradas parenteralmente a pacientes que ne-cessitam de tal tratamento. A administração parenteral pode ser realizada por injeção subcutânea, intramuscular ou intravenosa por meio de uma seringa, opcionalmente uma seringa tipo caneta. De forma alternativa, a administração parenteral pode ser realizada por meio de uma bomba de infusão. Uma outra opção é uma composição que pode ser em pó ou um líquido para a administração da droga GLP-1 ou análogo ou derivado de GLP-1 na forma de um spray nasal ou pulmonar. Ainda outra opção, a droga GLP-1 ou análogo ou derivado de GLP-1 da invenção pode ser administrada via transdérmica, por exemplo, a partir de um adesivo, opcionalmente um adesivo iontoforético ou transmucosa, por exemplo, bucal. Em outras modalidades, as composições são administrados via oral, por exemplo, como um comprimido, cápsula, bebida (por exemplo, comercializado como uma bebida para perda de peso para o tratamento de obesidade).
[00132]Uma composição para administração parenteral de compostos de GLP-1 podem, por exemplo, ser preparadas como descrito em WO 03/002136 (US2003119734) (incorporado aqui como referência). Em outra modalidade a pre-sente invenção refere-se ao uso de um composto, de acordo com a invenção, para a preparação de um medicamento para o tratamento de hiperglicemia, diabetes tipo 1, diabetes tipo 2 ou deficiência de célula β. Em modalidades específicas para estas indicações, a droga é selecionada a partir de um agente insulinotrópico, e incretina, um peptídeo glucagon tipo 1, um peptídeo GLP-1, um análogo de GLP-1, um derivado de GLP-1, PYY, um peptídeo PYY, um análogo PYY, um derivado PYY, Exendina-3, um peptídeo Exendina-3, um análogo Exendina-3, um derivado Exendina-3, Exen- dina-4, um peptídeo Exendina-4, um análogo Exendina-4, um derivado Exendina-4 ou uma combinação de dois ou mais destes tipos (por exemplo, peptídeo GLP-1 e um peptídeo PYY).
[00133]O tratamento com um composto de acordo com a presente invenção pode ainda ser combinado com uma segunda ou mais substâncias farmacologica- mente ativas que podem ou não serem partes do conjugado da droga ou fusão. Por exemplo, um ativo selecionado de agentes antidiabéticos, agentes antiobesidade, agentes reguladores do apetite, agentes anti-hipertensivos, agentes para o tratamento e/ou prevenção de complicações resultantes de ou associadas com diabetes e agentes para o tratamento e/ou prevenção de complicações e transtornos resultantes de ou associados com obesidade. No presente contexto, a expressão “agente antidiabé- tico” inclui compostos para o tratamento e/ou profilaxia de resistência a insulina e diminui onde a resistência a insulina é o mecanismo patofisiológico.
FORMATOS
[00134]Meia-vida aumentada é útil em aplicações in vivo de imunoglobulinas, especialmente anticorpos e mais especificamente fragmentos de anticorpos de tamanho pequeno. Tais fragmentos (Fvs, Fvs, Fabs ligados por ponte dissulfeto, scFvs, dAbs) sobre de clearance rápido no organismo; assim, enquanto são capazes de alcançar a maior parte do corpo rapidamente, e são rápidos de produzir e mais fáceis de se manipular, suas aplicações in vivo foram limitadas por sua breve persis-tência in vivo. Uma modalidade da invenção resolve este problema, ao fornecer meia- vida aumentada dos ligantes in vivo e consequentemente tempos de persistência maiores no organismo da atividade funcional do ligante.
[00135]Métodos para análise farmacocinética e determinação de meia-vida do ligante serão familiares aos especialistas na técnica. Detalhes podem ser encontrados em Kenneth, A et al: Chemical Stability of Pharmaceuticals: A Handbook for Pharmacists and in Peters et al, Pharmacokinetc analysis: A Practical Approach (1996). Também pode ser feita referência a "Pharmacokinetics", M Gibaldi & D Perron, publicado por Marcel Dekker, 2nd Rev. ex edition (1982), que descreve os parâmetros de farmacocinética como meias-vidas de t alfa e t beta e área sob a curva (AUC). Meias- vidas (t % alfa e t % beta) e AUC podem ser determinadas a parir de uma curva de concentração de soro do ligante contra o tempo. O pacote de análise WinNonlin (disponível de Pharsight Corp., Mountain View, CA94040, USA) pode ser usado, por exemplo, para modelar a curva. Em uma primeira fase (a fase alfa) o ligante é submetido principalmente à distribuição no paciente, com alguma eliminação. Uma segunda fase (fase beta) é a fase terminal quando o ligante foi distribuído e a concentração sérica está decrescendo conforme o ligante é eliminado do paciente. A meia-vida t alfa é a meia-vida da primeira fase e a meia-vida t beta é a meia-vida da segunda fase. Assim, em uma modalidade, a presente invenção fornece um ligante ou uma composição compreendendo um ligante de acordo com a invenção contendo uma meia-vida tα na faixa de 15 minutos ou mais. Em uma modalidade, a menor extremidade da faixa é 30 minutos, 45 minutos, 1 hora, 2 horas, 3 horas, 4 horas, 5 horas, 6 horas, 7 horas, 10 horas, 11 horas ou 12 horas. Adicionalmente ou de forma alternativa, um ligante ou composição, de acordo com a invenção, terá uma meia-vida tα na faixa de até e incluindo 12 horas. Em uma modalidade, a extremidade superior da faixa é de 11, 10, 9, 8, 7, 6 ou 5 horas. Um exemplo de uma faixa apropriada é 1 a 6 horas, 2 a 5 horas ou 3 a 4 horas. Em uma modalidade, a presente invenção fornece um ligante (poli-peptídeo, dAb, agonista ou antagonista) ou uma composição compreendendo um li-gante de acordo com a invenção contendo uma meia-vida tβ na faixa de 2,5 horas ou mais. Em uma modalidade, a menor extremidade da faixa é 3 horas, 4 horas, 5 horas, 6 horas, 7 horas, 10 horas, 11 horas ou 12 horas. Adicionalmente, ou de forma alter-nativa, um ligante ou composição de acordo com a invenção tem uma meia-vida tβ na faixa de até e incluindo 21 dias. Em uma modalidade, a extremidade superior da faixa é de 12 horas, 24 horas, 2 dias, 3 dias, 5 dias, 10 dias, 15 dias ou 20 dias. Em uma modalidade um ligante ou composição de acordo com a invenção terá uma meia-vida tβ na faixa de 12 a 60 horas. Em outra modalidade, ficará na faixa de 12 a 48 horas. Ainda em outra modalidade, ficará na faixa de 12 a 26 horas.
[00136]Adicionalmente, ou de forma alternativa aos critérios acima, a presente invenção fornece um ligante ou composição compreendendo um ligante de acordo com a invenção contendo um valor de AUC (área sob a curva) na faixa de 1 mg.min/ml ou mais. Em uma modalidade, a extremidade inferior da faixa é 5, 10, 15, 20, 30, 100, 200 ou 300 mg.min/ml. Adicionalmente, ou de forma alternativa, um ligante ou composição de acordo com a invenção tem uma AUC na faixa de até 600 mg.min/ml. Em uma modalidade, a extremidade inferior da faixa é 500, 400, 300, 200, 150, 100, 75 ou 50 mg.min/ml. Em uma modalidade um ligante de acordo com a invenção terá uma AUC na faixa selecionada do grupo que consiste do seguinte: 15 a 150 mg.min/ml, 15 a 100 mg.min/ml, 15 a 75 mg.min/ml, e 15 a 50mg.min/ml.
[00137]Polipeptídeos e dAbs da invenção e agonistas ou antagonistas com-preendendo estes podem ser formatados para ter um tamanho hidrodinâmico maior, por exemplo, ao ligarem-se ao grupo PEG, albumina sérica, transferrina, receptor de transferrina ou pelo menos a porção de ligação a transferrina do mesmo, uma região Fc do anticorpo, ou pela conjugação a um domínio de anticorpo. Por exemplo, poli-peptídeos, dAbs, agonistas, e antagonistas formatados têm um fragmento de ligação ao antígeno maior de um anticorpo ou como um anticorpo (pro exemplo, formatados como Fab, Fab', F(ab)2, F(ab')2, IgG, scFv).
[00138]Tamanho hidrodinâmico dos ligantes (por exemplo, monômeros dAb e multímeros) da invenção podem ser determinados usando métodos que são bem conhecidos na técnica. Por exemplo, cromatografia de filtração a gel pode ser usada para determinar o tamanho hidrodinâmico de um ligante. Matrizes de filtração em gel apropriadas para determinar os tamanhos hidrodinâmicos dos ligantes, como matrizes de agarose de ligações cruzadas são bem conhecidas e prontamente disponíveis.
[00139]O tamanho de um formato de ligante (por exemplo, o tamanho de uma fração PEG ligada ao monômero dAb) pode ser variado dependendo da aplicação desejada. Por exemplo, onde o ligante tem a intenção de deixar a circulação e entrar nos tecidos periféricos, é desejável manter o tamanho hidrodinâmico do ligante pequeno para facilitar o extravasamento a partir da corrente sanguínea. De forma alternativa, onde é desejado ter o ligante remanescente na circulação sistêmica por um período de tempo maior o tamanho do ligante pode ser aumentado, por exemplo, pela formatação como uma proteína tipo Ig.
[00140]Extensão da meia-vida por marcação de um antígeno ou epítopo que aumenta a meia-vida in vivo.
[00141]O tamanho hidrodinâmico de um ligante e sua meia-vida sérica pode ainda ser aumentado pela conjugação ou associação de um polipeptídeo de ligação ao antígeno ligante, dAb, agonista ou antagonista da invenção a um domínio de liga-ção (por exemplo, anticorpo ou fragmento de anticorpo) que se liga a um antígeno ou epítopo que aumenta a meia-vida in vivo, como descrito aqui. Por exemplo, o agente de ligação ao antígeno ligante (por exemplo, polipeptídeo) pode ser conjugado ou ligado a uma albumina sérica ou anticorpo de receptor Fc anti-neonatal ou fragmento de anticorpo, por exemplo um anti-SA ou anti-neonatal dAb de receptor de Fc, Fab, Fab' ou scFv, ou a um anticorpo anti-SA ou affibody receptor de Fc anti-neonatal ou avímero anti-SA, ou domínio de ligação anti-SA que compreende uma estrutura selecionada a partir de, mas preferencialmente não limitada ao, grupo que consiste de CTLA-4, lipocalina, SpA, um affibody, um avímero, GroEl e fibronectina (vide PCT/GB2008/000453 depositado em 8 de fevereiro de 2008 (WO2008096158; US2009259026) para revelação destes domínios de ligação, cujos domínios e suas sequências estão incorporados aqui para referência e formam parte da revelação do presente texto). Conjugação refere-se a uma composição compreendendo polipeptí- deo, dAb, agonista ou antagonista da invenção que é ligado (covalentemente ou não covalentemente) a um domínio de ligação que se liga a albumina sérica.
[00142]Polipeptídeos apropriados que aumenta a meia-vida sérica in vivo in-cluem, por exemplo, proteínas de fusão de agente neurofarmacêutico ligante especí-fico de receptor de transferrina (vide Patente U.S. No. 5.977.307, os ensinamentos dos quais estão aqui incorporados como referência), receptor de célula endotelial de capilar cerebral, transferrina, receptor de transferrina (por exemplo, receptor solúvel de transferrina), insulina, receptor de fator de crescimento tipo insulina 1 (IGF 1), re-ceptor de fator de crescimento tipo insulina 2 (IGF 2), receptor de insulina, fator de coagulação sanguínea X, Dl-antitripsina e FINF 1α. Polipeptídeos apropriados que aumentam a meia-vida sérica incluem alfa-1 glicoproteína (orosomucoide; AAG), alfa- 1 antiquimotripsina (ACT), alfa-1 microglobulina (proteína HC; AIM), antitrombina III (AT III), apolipoproteína A-1 (Apo A-1), apolipoproteína B (Apo B), ceruloplasmina (Cp), componente de complemento C3 (C3), componente de complemento C4 (C4), inibidor de C1 esterase (C1 INH), proteína C reativa (CRP), ferritina (FER), hemopexina (HPX), lipoproteína(a) (Lp(a)), proteína de ligação a manose (MBP), mioglobina (Myo), prealbumina (transtirretina; PAL), proteína de ligação a retinol (RBP), e fator de reumatoide (RF).
[00143]Proteínas apropriadas da matriz extracelular incluem, por exemplo, co- lágenos, lamininas, integrinas e fibronectina. Colágenos são as principais proteínas da matriz extracelular. Cerca de 15 tipos de moléculas de colágeno são atualmente conhecidas, encontradas em diferentes partes do organismo, por exemplo, colágeno tipo I (cerca de 90% do colágeno corporal) encontrado em osso, pele, tendão, ligamentos, córnea, órgãos internos ou colágeno tipo II encontrado na cartilagem, disco vertebral, notocorda e humor vítreo do olho.
[00144]Proteínas apropriadas do sangue incluem, por exemplo, proteínas do plasma (por exemplo, fibrina, α-2 macroglobulina, albumina sérica, fibrinogênio (por exemplo, fibrinogênio A, fibrinogênio B), proteína A amiloide sérica, haptoglobina, profilina, ubiquitina, uteroglobulina e β-2- microglobulina), enzimas e inibidores de enzimas (por exemplo, plasminogênio, lisozima, cistatina C, alfa-1-antitripsina e inibidor de tripsina pancreática), proteínas do sistema imune, como proteínas imunoglobulinas (por exemplo, IgA, IgD, IgE, IgG, IgM, cadeias leves de imunoglobulina (kapa/lambda)), proteínas de transporte (por exemplo, proteína de ligação a retinol, α- 1 microglobulina), defensinas (por exemplo, beta-defensina 1, neutrófilo defensina 1, neutrófilo defensina 2 e neutrófilo defensina 3) e semelhantes.
[00145]Proteínas apropriadas encontradas na barreira sanguínea ou no tecido neural incluem, por exemplo, receptor melanocortina, mielina, transportador de ascor- bato e semelhantes.. Polipeptídeos apropriados que melhoram a meia-vida sérica in vivo incluem proteínas localizadas no rim (por exemplo, policistina, colágeno tipo IV, transportador de anion orgânico K1, antígeno de Heymann), proteínas localizadas no fígado (por exemplo, álcool dehidrogenase, G250), proteínas localizadas no pulmão (por exemplo, componente secretório, que se liga a IgA), proteínas localizadas no coração (por exemplo, HSP 27, que está associada com cardiomiopatia dilatada), proteínas localizadas na pele (por exemplo, queratina), proteínas específicas do osso como proteínas morfogênicas (BMPs), que são um subconjunto do fator de crescimento transformante β da superfamília de proteínas que demonstram atividade osteogênica (por exemplo, BMP-2, BMP-4, BMP-5, BMP-6, BMP-7, BMP-8), proteínas específicas de tumor (por exemplo, antígeno de trofoblasto, receptor de herceptina, receptor de oestrogênio, catepsinas (por exemplo, catepsina B, que pode ser encontrada no fí-gado e no baço)).
[00146]Proteínas específicas de doenças apropriadas incluem, por exemplo, antígenos expressos somente em células T ativadas, incluindo LAG-3 (gene de ativação de linfócito), ligante de osteoprotegerina (OPGL; vide Nature 402, 304-309 (1999)), OX40 (um membro da família de receptor de TNF, expressa em células T ativadas e especificamente up-reguladas em células que produzem vírus tipo I de leucemia de célula T (HTLV-1); vide Immunol. 165 (l):263-70 (2000)). Proteínas específicas de doenças apropriadas também incluem, por exemplo, metaloproteases (associada com artrite/cânceres) incluindo Drosophila CG6512, paraplegina humana, FtsH humana, AFG3L2 humana, ftsH murina; e fatores de crescimento, incluindo fator de crescimento de fibroblasto (FGF-1), fator de crescimento de fibroblasto básico (FGF- 2), fator de crescimento endotelial vascular/fator de permeabilidade vascular (VEGF/VPF), fator de crescimento de transformação -α (TGF α), fator de necrose tumoral alfa (TNF-D), angiogenina, interleucina-3 (IL-3), interleucina-8 (IL-8), fator de crescimento endotelial derivado de plaqueta (PD-ECGF), fator de crescimento placen- tário (PlGF), fator de crescimento derivado de plaqueta midkine -BB (PDGF), e frac- talquino.
[00147]Polipeptídeos apropriados que aumentam a meia-vida sérica in vivo também incluem proteínas de estresse como proteínas de choque cardíaco (HSPs). HSPs são normalmente encontradas de forma intracelular. Quando são encontradas extracelularmente, é um indicador de que a célula morreu e liberou seu conteúdo. Esta morte celular não programada (necrose) ocorre quando resulta de um trauma, doença ou dano, HSPs extracelulares engatilham uma resposta do sistema imune. A ligação a HSP extracelular pode resultar na localização das composições da invenção ao um sítio enfermo.
[00148]Proteínas apropriadas envolvidas em um transporte Fc incluem, por exemplo, receptor de Brambell (também conhecido como FcRB). Este receptor Fc tem duas funções, ambas são potencialmente úteis para liberação. As funções são (1) transporte de IgG de mãe para filho através da placenta (2) proteção de IgG de de-gradação, prolongando, assim, sua meia-vida sérica. Acredita-se que o receptor reci-cle IgG de endossomas. (Vide, Holliger et al, Nat Biotechnol 15(7):632-6 (1997).)
dAbs que se ligam a Albuminas Séricas (AlbudAbs™)
[00149]A invenção em uma modalidade fornece um polipeptídeo, agonista ou antagonista (por exemplo, ligante específico dual compreendendo o antígeno dAb anti-ligante (um primeiro dAb)) que se liga ao antígeno ligante e um segundo dAb que se liga a albumina sérica (SA), o segundo dAb que se liga a SA com um KD como determinado por ressonância de plásmon de superfície de 1nM a 1, 2, 3, 4, 5, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 100, 200, 300, 400 ou 500 μ M (ou seja, x 10-9 a 5 x 10-4), ou 100 nM a 10 μ M, ou 1 a 5 μ M ou 3 a 70 nM ou 10nM a 1,2, 3, 4 ou 5μM. Por exemplo 30 a 70 nM como determinado por ressonância de plásmon de superfície. Em uma modalidade, a primeira dAb (ou um monômero dAb) se liga a SA (por exemplo, HSA) com um KD como determinado por ressonância de plásmon de superfície de aproximadamente 1, 50, 70, 100, 150, 200, 300 nM ou 1, 2 ou 3 μ M. Em uma modalidade, para um ligante específico dual compreendendo um primeiro dAb anti-SA e um segundo dAb ao antígeno ligante, a afinidade (por exemplo KD e/ou Koff como medido por ressonância de plásmon de superfície, por exemplo usando BiaCore) do segundo dAb para seu ligante é de 1 a 100000 vezes (por exemplo, 100 a 100000, ou 1000 a 100000, ou 10000 a 100000 vezes) a afinidade do primeiro dAb para SA. Em uma modalidade, a albumina sérica é uma albumina sérica humana (HSA). Por exemplo, o primeiro dAb se liga a SA com uma afinidade de aproximadamente 10 μM, enquanto a segunda dAb se liga a seu ligante com uma afinidade de 100 pM. Em uma modali-dade, a albumina sérica é uma albumina sérica humana (HSA). Em uma modalidade, a primeira dAb se liga a SA (por exemplo, HSA) com um KD de aproximadamente 50, por exemplo 70, 100, 150 ou 200 nM. Detalhes para ligantes específicos duais são encontrados em WO03002609, WO04003019 e WO04058821. Os ligantes da invenção podem em uma modalidade compreender um dAb que se liga a albumina sérica (SA) com um KD como determinado por ressonância de plásmon de superfície de 1nM a 1,2, 3, 4, 5, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 100, 200, 300, 400 ou 500 μ M (ou seja, x 109 a 5 x 10-4), ou 100 nM a 10 μM, ou 1 a 5 μM ou 3 a 70 nM ou 10nM a 1, 2, 3, 4 ou 5μM. Por exemplo 30 a 70 nM como determinado por ressonância de plásmon de superfície. Em uma modalidade, o primeiro dAb (ou um monômero dAb) se liga a SA (por exemplo, HSA) com um KD como determinado por ressonância de plásmon de superfície de aproximadamente 1,50, 70, 100, 150, 200, 300 nM ou 1,2 ou 3 μM. Em uma modalidade, primeiro e segundo dAbs são ligados por um ligante, por exemplo um ligante de 1 a 4 aminoácidos ou de 1 a 3 aminoácidos, ou maior do que aminoácidos ou maior do que 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15 ou 20 aminoácidos. Em uma modalidade, um ligante maior (maior do que 3 aminoácidos) é usado para melhorar a potência (KD de um ou ambos dAbs no agonista ou antagonista). Em uma modalidade, o ligante é um ligante helicoidal.
[00150]Em modalidades particulares dos ligantes, agonistas e antagonistas, dAb se liga a albumina sérica humana e compete para ligação a albumina com um dAb selecionado do grupo que consiste de MSA-16, MSA-26 (Vide WO04003019 (US2006106203) para revelação desta sequências, cujas sequências e seus ácido nucleico de contra parte estão incorporados aqui como referência e formam parte da revelação do presente texto), DOM7m-16 (SEQ ID NO: 473), DOM7m-12 (SEQ ID NO: 474), DOM7m-26 (SEQ ID NO: 475), DOM7r-l (SEQ ID NO: 476), DOM7r-3 (SEQ ID NO: 477), DOM7r-4 (SEQ ID NO: 478), DOM7r-5 (SEQ ID NO: 479), DOM7r-7 (SEQ ID NO: 480), DOM7r-8 (SEQ ID NO: 481), DOM7h-2 (SEQ ID NO: 482), DOM7h-3 (SEQ ID NO: 483), DOM7h-4 (SEQ ID NO: 484), DOM7h-6 (SEQ ID NO: 485), DOM7h-l (SEQ ID NO: 486), DOM7h-7 (SEQ ID NO: 487), DOM7h-22 (SEQ ID NO: 489), DOM7h-23 (SEQ ID NO: 490), DOM7h-24 (SEQ ID NO: 491), DOM7h-25 (SEQ ID NO: 492), DOM7h-26 (SEQ ID NO: 493), DOM7h-21 (SEQ ID NO: 494), DOM7h- 27 (SEQ ID NO: 495), DOM7h-8 (SEQ ID NO: 496), DOM7r-13 (SEQ ID NO: 497), DOM7r-14 (SEQ ID NO: 498), DOM7r-15 (SEQ ID NO: 499), DOM7r-16 (SEQ ID NO: 500), DOM7r-17 (SEQ ID NO: 501), DOM7r-18 (SEQ ID NO: 502), DOM7r-19 (SEQ ID NO: 503), DOM7r-20 (SEQ ID NO: 504), DOM7r-21 (SEQ ID NO: 505), DOM7r-22 (SEQ ID NO: 506), DOM7r-23 (SEQ ID NO: 507), DOM7r-24 (SEQ ID NO: 508), DOM7r-25 (SEQ ID NO: 509), DOM7r-26 (SEQ ID NO: 510), DOM7r-27 (SEQ ID NO: 511), DOM7r-28 (SEQ ID NO: 512), DOM7r-29 (SEQ ID NO: 513), DOM7r-30 (SEQ ID NO: 514), DOM7r-31 (SEQ ID NO: 515), DOM7r-32 (SEQ ID NO: 516), DOM7r-33 (SEQ ID NO: 517) (Vide WO2007080392 (US20070003549) para revelação destas sequências, cujas sequências e seus ácidos nucleicos de contra parte estão incorporados aqui como referência e formam parte da revelação do presente texto as SEQ ID Nos. neste parágrafo que aparecem em WO2007080392), dAb8 (dAblO), dAb 10, dAb36, dAb7r20 (DOM7r20), dAb7r21 (DOM7r21), dAb7r22 (DOM7r22), dAb7r23 (DOM7r23), dAb7r24 (DOM7r24), dAb7r25 (DOM7r25), dAb7r26 (DOM7r26), dAb7r27 (DOM7r27), dAb7r28 (DOM7r28), dAb7r29 (DOM7r29), dAb7r29 (DOM7r29), dAb7r31 (DOM7r31), dAb7r32 (DOM7r32), dAb7r33 (DOM7r33), dAb7r33 (DOM7r33), dAb7h22 (DOM7h22), dAb7h23 (DOM7h23), dAb7h24 (DOM7h24), dAb7h25 (DOM7h25), dAb7h26 (DOM7h26), dAb7h27 (DOM7h27), dAb7h30 (DOM7h30), dAb7h31 (DOM7h31), dAb2 (dAbs 4,7,41), dAb4, dAb7, dAbl l, dAbl2 (dAb7ml2), dAbl3 (dAb 15), dAbl5, dAb 16 (dAb21, dAb7ml6) , dAb 17, dAb 18, dAb 19, dAb21, dAb22, dAb23, dAb24, dAb25 ( dAb26, dAb7m26), dAb27, dAb30 (dAb35), dAb31, dAb33, dAb34, dAb35, dAb38 (dAb54), dAb41, dAb46 (dAbs 47, 52 and 56), dAb47, dAb52, dAb53, dAb54, dAb55, dAb56, dAb7ml2, dAb7ml6, dAb7m26, dAb7rl (DOM 7rl), dAb7r3 (DOM7r3), dAb7r4 (DOM7r4), dAb7r5 (DOM7r5), dAb7r7 (DOM7r7), dAb7r8 (DOM7r8), dAb7r13 (DOM7r13), dAb7r14 (DOM7r14), dAb7r15 (DOM7r15), dAb7r16 (DOM7r16), dAb7r17 (DOM7r17), dAb7r18 (DOM7r18), dAb7r19 (DOM7r19), dAb7h1 (DOM7h1), dAb7h2 (DOM7h2), dAb7h6 (DOM7h6), dAb7h7 (DOM7h7), dAb7h8 (DOM7h8), dAb7h9 (DOM7h9), dAb7h10 (DOM7M10), dAb7h11 (DOM7h11), dAb7h12 (DOM7M2), dAb7h13 (DOM7h13), dAb7h14 (DOM7h14), dAb7p1 (DOM7p1), e dAb7p2 (DOM7p2) (vide WO2008096158 (US2009259026) para revelação desta sequência e seus ácidos nucleicos de contra parte estão incorporados aqui como referência e formam parte da revelação do presente texto). De forma alternativa são mostrados entre parênteses após o dAb, por exemplo, dAb8 tem um nome alternativo que é dAb10, ou seja, dAb8 (dAb10).
[00151]Em certas modalidades, dAb se liga a albumina humana sérica e compreende uma sequência de aminoácido que tem pelo menos cerca de 80%, ou pelo menos cerca de 85%, ou pelo menos cerca de 90%, ou pelo menos cerca de 95%, ou pelo menos cerca de 96%, ou pelo menos cerca de 97%, ou pelo menos cerca de 98%, ou pelo menos cerca de 99% de identidade de sequência de aminoácido com a sequência de aminoácido de um dAb selecionado do grupo que consiste de MSA- 16, MSA-26, DOM7m-16 (SEQ ID NO: 473), DOM7m-12 (SEQ ID NO: 474), DOM7m-26 (SEQ ID NO: 475), DOM7r-l (SEQ ID NO: 476), DOM7r-3 (SEQ ID NO: 477), DOM7r- 4 (SEQ ID NO: 478), DOM7r-5 (SEQ ID NO: 479), DOM7r-7 (SEQ ID NO: 480), DOM7r-8 (SEQ ID NO: 481), DOM7h-2 (SEQ ID NO: 482), DOM7h-3 (SEQ ID NO: 483), DOM7h-4 (SEQ ID NO: 484), DOM7h-6 (SEQ ID NO: 485), DOM7h-l (SEQ ID NO: 486), DOM7h-7 (SEQ ID NO: 487), DOM7h-22 (SEQ ID NO: 489), DOM7h-23 (SEQ ID NO: 490), DOM7h-24 (SEQ ID NO: 491), DOM7h-25 (SEQ ID NO: 492), DOM7h-26 (SEQ ID NO: 493), DOM7h-21 (SEQ ID NO: 494), DOM7h-27 (SEQ ID NO: 495), DOM7h-8 (SEQ ID NO: 496), DOM7r-13 (SEQ ID NO: 497), DOM7r-14 (SEQ ID NO: 498), DOM7r-15 (SEQ ID NO: 499), DOM7r-16 (SEQ ID NO: 500), DOM7r-17 (SEQ ID NO: 501), DOM7r-18 (SEQ ID NO: 502), DOM7r-19 (SEQ ID NO: 503), DOM7r-20 (SEQ ID NO: 504), DOM7r-21 (SEQ ID NO: 505), DOM7r-22 (SEQ ID NO: 506), DOM7r-23 (SEQ ID NO: 507), DOM7r-24 (SEQ ID NO: 508), DOM7r-25 (SEQ ID NO: 509), DOM7r-26 (SEQ ID NO: 510), DOM7r-27 (SEQ ID NO: 511), DOM7r-28 (SEQ ID NO: 512), DOM7r-29 (SEQ ID NO: 513), DOM7r-30 (SEQ ID NO: 514), DOM7r-31 (SEQ ID NO: 515), DOM7r-32 (SEQ ID NO: 516), DOM7r-33 (SEQ ID NO: 517) (os No. da SEQ ID neste parágrafo são aqueles que aparecem em WO2007080392 ((US20070003549)), dAb8, dAb 10, dAb36, dAb7r20, dAb7r21, dAb7r22, dAb7r23, dAb7r24, dAb7r25, dAb7r26, dAb7r27, dAb7r28, dAb7r29, dAb7r30, dAb7r31, dAb7r32, dAb7r33, dAb7h21, dAb7h22, dAb7h23, Ab7h24, Ab7h25, Ab7h26, dAb7h27, dAb7h30, dAb7h31, dAb2, dAb4, dAb7, dAb11, dAb12, dAb13, dAb15, dAb16, dAb17, dAb18, dAb19, dAb21, dAb22, dAb23, dAb24, dAb25, dAb26, dAb27, dAb30, dAb31, dAb33, dAb34, dAb35, dAb38, dAb41, dAb46, dAb47, dAb52, dAb53, dAb54, dAb55, dAb56, dAb7m12, dAb7m16, dAb7ni26, dAb7r1, dAb7r3, dAb7r4, dAb7r5, dAb7r7, dAb7r8, dAb7r13, dAb7r14, dAb7r15, dAb7r16, dAb7r17, dAb7r18, dAb7r19, dAb7h1, dAb7h2, dAb7h6, dAb7h7, dAb7h8, dAb7h9, dAb7h10, dAb7h11, dAb7h12, dAb7h13, dAb7h14, dAb7pl, e dAb7p2..
[00152]Por exemplo, dAb que se liga a albumina sérica humana pode com-preender uma sequência de aminoácido que tem pelo menos cerca de 90%, ou pelo menos cerca de 95%, ou pelo menos cerca de 96%, ou pelo menos cerca de 97%, ou pelo menos cerca de 98%, ou pelo menos cerca de 99% de identidade de sequência de aminoácido com DOM7h-2 (SEQ ID NO:482), DOM7h-3 (SEQ ID NO:483), DOM7h-4 (SEQ ID NO:484), DOM7h-6 (SEQ ID NO:485), DOM7h-l (SEQ ID NO:486), DOM7h-7 (SEQ ID NO:487), DOM7h-8 (SEQ ID NO:496), DOM7r-13 (SEQ ID NO:497), DOM7r-14 (SEQ ID NO:498), DOM7h-22 (SEQ ID NO:489), DOM7h-23 (SEQ ID NO:490), DOM7h-24 (SEQ ID NO:491), DOM7h-25 (SEQ ID NO:492), DOM7h-26 (SEQ ID NO:493), DOM7h-21 (SEQ ID NO:494), DOM7h-27 (SEQ ID NO:495) (as SEQ ID Nos. neste parágrafo são aquelas que aparecem em WO2007080392 (US20070003549)), dAb8, dAb 10, dAb36, dAb7h21, dAb7h22, dAb7h23, Ab7h24, Ab7h25, Ab7h26, dAb7h27, dAb7h30, dAb7h31, dAb2, dAb4, dAb7, dAb11, dAb12, dAb13, dAb15, dAb16, dAb17, dAb18, dAb19, dAb21, dAb22, dAb23, dAb24, dAb25, dAb26, dAb27, dAb30, dAb31, dAb33, dAb34, dAb35, dAb38, dAb41, dAb46, dAb47, dAb52, dAb53, dAb54, dAb55, dAb56, dAb7h1, dAb7h2, dAb7h6, dAb7h7, dAb7h8, dAb7h9, dAb7h10, dAb7h11, dAb7h12, dAb7h13 e dAb7h14.
[00153]Em certas modalidades, dAb se liga a albumina humana sérica e compreende uma sequência de aminoácido que tem pelo menos cerca de 80%, ou pelo menos cerca de 85%, ou pelo menos cerca de 90%, ou pelo menos cerca de 95%, ou pelo menos cerca de 96%, ou pelo menos cerca de 97%, ou pelo menos cerca de 98%, ou pelo menos cerca de 99% de identidade de sequência de aminoácido com a sequência de aminoácido de um dAb selecionado do grupo que consiste de MSA- 16, MSA-26, DOM7h-2 (SEQ ID NO:482), DOM7h-6 (SEQ ID NO:485), DOM7h-1 (SEQ ID NO:486), DOM7h-7 (SEQ ID NO:487), DOM7h-8 (SEQ ID NO:496), DOM7h-22 (SEQ ID NO:489), DOM7h-23 (SEQ ID NO:490), DOM7h-24 (SEQ ID NO:491), DOM7h-25 (SEQ ID NO:492), DOM7h-26 (SEQ ID NO:493), DOM7h-21 (SEQ ID NO:494), DOM7h-27 (SEQ ID NO:495) (as SEQ ID Nos. neste parágrafo são aquelas que aparecem em WO2007080392 (US20070003549)), dAb7h21, dAb7h22, dAb7h23, Ab7h24, Ab7h25, Ab7h26, dAb7h27, dAb7h30, dAb7h31, dAb2, dAb4, dAb7, dAb38, dAM1, dAb7h1, dAb7h2, dAb7h6, dAb7h7, dAb7h8, dAb7h9, dAb7h10, dAb7h11, dAb7h12, dAb7h13 e dAb7h14. Em modalidades mais particulares, dAb é um VK dAb que se liga a albumina sérica humana e tem uma sequência de aminoácido selecionada do grupo que consiste de DOM7h-2 (SEQ ID NO:482), DOM7h-6 (SEQ ID NO:485), DOM7h-l (SEQ ID NO:486), DOM7h-7 (SEQ ID NO:487), DOM7h-8 (SEQ ID NO:496) (as SEQ ID Nos. neste parágrafo são aquelas que aparecem em WO2007080392 (US20070003549)), dAb2, dAb4, dAb7, dAb38, dAMl, dAb54, dAb7h1, dAb7h2, dAb7h6, dAb7h7, dAb7h8, dAb7h9, dAb7h10, dAb7h11, dAb7h12, dAb7h13 e dAb7h14.Em modalidades mais particulares, dAb é um Vg dAb que se liga a albumina sérica humana e tem uma sequência de aminoácido selecionada de dAb7h30 e dAb7h31.
[00154]Em modalidades mais particulares dAb é dAb7h11 ou dAb7h14. Em outras modalidades, dAb, ligante, agonista ou antagonista se liga a albumina sérica humana e compreende um, dois ou três de CDRs de dAb7h11 ou dAb7h14.
[00155]VHH camelid apropriada que se liga a albumina sérica incluem aquelas reveladas em WO2004/041862 (Ablynx N.V.) (US2009238829) e em WO2007080392 ((US20070003549) (cujas sequências VgH e seus ácido nucleico contra parte estão incorporados aqui como referência e formam parte da revelação do presente texto), como a Sequência A (SEQ ID NO:518), Sequência B (SEQ ID NO:519), Sequência C (SEQ ID NO: 520), Sequência D (SEQ ID NO:521), Sequência E (SEQ ID NO:522), Sequência F (SEQ ID NO:523), Sequência G (SEQ ID NO:524), Sequência H (SEQ ID NO:525), Sequência I (SEQ ID NO:526), Sequência J (SEQ ID NO:527), Sequência K (SEQ ID NO:528), Sequência L (SEQ ID NO:529), Sequência M (SEQ ID NO:530), Sequência N (SEQ ID NO:531), Sequência O (SEQ ID NO:532), Sequência P (SEQ ID NO:533), Sequência Q (SEQ ID NO:534), estes números de sequências correspondem àqueles citados em WO2007080392 ou WO 2004/041862 (Ablynx N.V.). Em certas modalidades, o VHH camelid se liga a albumina humana sérica e compreende uma sequência de aminoácido que tem pelo menos cerca de 80%, ou pelo menos cerca de 85%, ou pelo menos cerca de 90%, ou pelo menos cerca de 95%, ou pelo menos cerca de 96%, ou pelo menos cerca de 97%, ou pelo menos cerca de 98%, ou pelo menos cerca de 99% identidade de sequência de aminoácido com ALB1 revelada em WO2007080392 ou qualquer SEQ ID NOS:518-534, estes números de sequência correspondem aos citados em WO2007080392 ou WO 2004/041862.
[00156]Em algumas modalidades, o ligante, agonista ou antagonista compre-ende um dAb anti-albumina sérica que compete com qualquer dAb anti-albumina sérica revelado aqui para ligação à albumina sérica (por exemplo, albumina sérica humana).
[00157]Em uma modalidade alternativa, o agonista, antagonista ou ligante compreende uma fração de ligação específica para um antígeno ligante (por exemplo, TNFR1 humana), onde a fração compreende sequências não-imunoglobulina como descritas no pedido co-pendente PCT/GB2008/000453 depositada em 8 de fevereiro de 2008, a revelação destas frações de ligação, seus métodos de produção e seleção (por exemplo, a partir de diversas bibliotecas) e suas sequências estão incorporados aqui como referência como parte da revelação do presente texto)
Conjugação à uma fração de extensão de meia-vida (por exemplo, albumina)
[00158]Em uma modalidade, uma (ou mais) fração de extensão de meia-vida (por exemplo, albumina, transferrina e fragmentos e análogos dos mesmos) é conjugada ou associada com o ligante polipeptídeo ligante ao antígeno, dAb, agonista ou antagonista da invenção. Exemplos de albumina, fragmentos de albumina ou variantes de albumina apropriados para uso em um formato de ligante de ligação ao antígeno são descritos em WO 2005077042 (US2005186664), cuja revelação está incorporada aqui como referência e forma parte da revelação do presente texto. Em particular, os seguintes albumina, fragmentos de albumina ou variantes de albumina podem ser usados na presente invenção: • SEQ ID NO: 1 (como revelado em WO 2005077042, esta sequência sendo explicitamente incorporada na presente revelação como referência); • Fragmento de albumina ou variante compreendendo ou que consiste de aminoácidos 1-387 de SEQ ID NO: 1 em WO 2005077042; • Albumina, ou fragmento ou variante do mesmo, compreendendo uma sequência de aminoácido selecionada do grupo que consiste de: (a) aminoácidos 54 a 61 de SEQ ID NO:1 em WO 2005077042; (b) aminoácidos 76 a 89 de SEQ ID NO:1 em WO 2005077042; (c) ami-noácidos 92 a 100 de SEQ ID NO: 1 em WO 2005077042; (d) aminoácidos 170 a 176 de SEQ ID NO:1 em WO 2005077042; (e) aminoácidos 247 a 252 de SEQ ID NO: 1 em WO 2005077042; (f) aminoácidos 266 a 277 de SEQ ID NO: 1 em WO 2005077042; (g) aminoácidos 280 a 288 de SEQ ID NO:1 em WO 2005077042; (h) aminoácidos 362 a 368 de SEQ ID NO:1 em WO 2005077042; (i) aminoácidos 439 a 447 de SEQ ID NO: 1 em WO 2005077042 (j) aminoácidos 462 a 475 de SEQ ID NO:1 em WO 2005077042; (k) aminoácidos 478 a 486 de SEQ ID NO: 1 em WO 2005077042; e (1) aminoácidos 560 a 566 de SEQ ID NO: 1 em WO 2005077042.
[00159]Outros exemplos de albumina, fragmentos de albumina e análogos apropriados para uso em um formato de ligante de ligação ao antígeno são descritos em WO 03076567 (US2008108560), cuja revelação está incorporada aqui como refe-rência e forma parte da revelação do presente texto. Em particular, os seguintes albu-mina, fragmentos ou variantes podem ser usados na presente invenção: • Albumina sérica humana como descrita em WO 03076567, por exemplo, na figura 3 (esta informação de sequência sendo explicitamente incorporada à presente revelação como referência); • Albumina sérica humana (HA) consistindo de uma cadeia de polipeptídeo não glicosliada de 585 aminoácidos com um peso de fórmula molecular de 66.500 (Vide, Meloun, et al, FEBS Letters 55: 136 (1975); Behrens, et al, Fed. Proc. 34:591 (1975); Lawn, et al, Nucleic Acid Research 9: 6102-6114 (1981); Minghetti, et al., J. Biol. Chem. 261:6747 (1986)); • Uma variante polimórfica ou análogo de fragmento de albumina como descrito em Weitkamp, et al, Ann. Hum. Genet. 37:219 (1973); • Um fragmento de albumina ou variante como descrito em EP 322094, por exemplo, HA(1 -373., HA(1-388), HA(1-389), HA(1-369), and HA(1-419) e fragmentos entre 1- 369 e 1-419; • Um fragmento de albumina ou variante como descrito em EP 399666, por exemplo, HA(1-177) e HA(1 -200) e fragmentos entre HA(1-X), onde X é qualquer número entre 178 a 199.
[00160]Onde uma (ou mais) fração de extensão de meia-vida (por exemplo, albumina, transferrina e fragmentos e análogos dos mesmos) é usada para formatar os polipeptídeos de ligação ao antígeno ligante, dAbs, agonistas e antagonistas da invenção, pode ser conjugado usando qualquer método apropriado como por fusão direta à fração de ligação ao antígeno ligante (por exemplo, dAb anti-TNFR1), por exemplo ao usar um construto nucleotídeo simples que codifica uma proteína de fu-são, onde a proteína de fusão é codificada como uma cadeia simples de polipeptídeo com a fração de extensão da meia-vida ligada N ou C-terminalmente à fração de ligação ao antígeno ligante. De forma alternativa, a conjugação pode ser conseguida usando frações entre o peptídeo ligante, por exemplo, um peptídeo ligante como des-crito em WO 03076567 (US2008108560) ou WO 2004003019 (estes ligantes revela-dos sendo incorporados aqui como referência na presente revelação para fornecer exemplos para uso na presente invenção). Em uma modalidade, a conjugação pode ser através de um ligante helicoidal como o ligante helicoidal descrito aqui. Também será apreciado que outros ligantes que podem ser úteis para este propósito incluem aqueles como ligantes ricos em glicina-serina. Em uma modalidade, o ligante pode ser um ligante resistente a protease. Tipicamente, um polipeptídeo que melhora a meia-vida sérica in vivo é um polipeptídeo que ocorre naturalmente in vivo e que re-siste a degradação ou remoção por mecanismos endógenos que remove material não desejado a partir do organismo (por exemplo, humana). Por exemplo, um polipeptídeo que permite meia-vida sérica in vivo pode ser selecionado a partir das proteínas da matriz extracelular, proteínas encontradas no sangue, proteínas encontradas na bar-reira hematoencefálica ou no tecido neural, proteínas localizadas no rim, fígado, pul-mão, coração, pele ou osso, proteínas do estresse, proteínas específicas de doença, ou proteínas envolvidas no transporte de Fc.
[00161]Em modalidades da invenção descritas ao longo desta revelação, ao invés do uso de um antígeno "dAb" anti-ligante em um agonista, antagonista ou ligante da invenção, é contemplado que o especialista destinatário pode usar um polipeptídeo ou domínio que compreende um ou mais ou todos os 3 dos CDRs de um dAb da invenção que se liga ao antígeno ligante (por exemplo, CDRs enxertados em uma estrutura ou esqueleto apropriado de proteína, por exemplo um affibody, uma estrutura de SpA, um domínio de classe A de receptor de LDL ou um domínio EGF). A revelação como um todo deve ser interpretada para fornecer revelações de agonistas ou antagonistas usando tais domínios no lugar de um dAb. Com relação a isso, vide WO2008096158 (US2009259026), a revelação da qual está incorporada aqui como referência. Em uma modalidade, portanto, um agonista ou antagonista da invenção compreende um domínio variável de imunoglobulina simples ou domínio de anticorpo (dAb) que tem especificidade de ligação para antígeno ligante ou regiões determinantes de complementariedade como um dAb em um formato apropriado. O agonista ou antagonista pode ser um polipeptídeo que consiste em tal dAb, ou consiste essencialmente de tal dAb. O agonista ou antagonista pode ser um polipeptídeo que compreende um dAb (ou os CDRs de um dAb) em um formato apropriado, como um formato de anticorpo (por exemplo, formato tipo IgG, scFv, Fab, Fab', F(ab')2), ou um ligante específico dual que compreende um dAb que se liga ao antígeno ligante e um segundo dAb que se liga a outra proteína ligante, antígeno ou epítopo (por exemplo, albumina sérica).
[00162]Polipeptídeos, dAbs, agonistas e antagonistas de acordo com a invenção podem ser formatados como uma variedade de formatos de anticorpos apropriados que são conhecidos na técnica como formatos tipo IgG, anticorpos quiméricos, anticorpos humanizados, anticorpos humanos, anticorpos de cadeia simples, anticorpos biespecíficos, cadeias pesadas de anticorpos, cadeias leves de anticorpos, ho- modímeros e heterodímeros de cadeias pesadas e/ou leves de anticorpos, fragmentos de ligação ao antígeno de qualquer um dos anteriores (por exemplo, um fragmento Fv (por exemplo, Fv de cadeia simples (scFv), um Fv ligado por ponte dissulfeto), um fragmento Fab, um fragmento Fab', um fragmento F(ab')2), um domínio variável simples (por exemplo, VH, VL), um dAb, e versões modificadas de qualquer um dos anteriores (por exemplo, modificado por ligação covalente do polialquileno glicol (por exemplo, polietilenoglicol, polipropilenoglicol, polibutilenoglicol) ou outro polímero apropriado). Em algumas modalidades, a invenção fornece um ligante (por exemplo, um antagonista anti-TNFR1) que é um formato tipo IgG. Tais formatos têm estrutura convencional de quatro cadeias de uma molécula de IgG (2 cadeias pesadas e duas cadeias leves) nas quais uma ou mais regiões variáveis (VH e ou VL) foram substituídas com um dAb da invenção. Em uma modalidade, cada uma das regiões variáveis (2 regiões VH e 2 regiões VL) é substituída com um dAb ou domínio variável simples, pelo menos uma das quais é um antígeno dAb anti-ligante de acordo com a invenção. Os dAb(s) ou domínios variáveis simples que estão incluídos em um formato tipo IgG podem ter a mesma especificidade ou especificidades diferentes. Em algumas modalidades, o formato tipo IgG é tetravalente e pode ter um (somente antígeno anti-li- gante), dois (por exemplo, antígeno anti-ligante e anti-SA), três ou quatro especificidades. Por exemplo, o formato tipo IgG pode ser monoespecífico e compreende 4 dAbs que têm a mesma especificidade, biespecífico e compreende dAbs que têm a mesma especificidade e outro dAb que têm uma especificidade diferente; biespecífico e compreende dois dAbs que têm a mesma especificidade e dois dAbs que têm uma especificidade comum, mas diferente; triespecífico e compreende o primeiro e segundo dAbs que têm a mesma especificidade, um terceiro dAb com uma especificidade diferente e um quarto dAb com uma especificidade diferente do primeiro, segundo e terceiro dAbs; ou tetraespecífico e compreende quatro dAbs que têm uma especificidade diferente. Fragmentos de ligação ao antígeno de formatos tipo IgG (por exemplo, Fab, F(ab')2, Fab', Fv, scFv) podem ser preparados. Em uma modalidade, os formatos tipo IgG ou fragmentos de ligação ao antígeno do mesmo não fazem ligação cruzada ao antígeno ligante, por exemplo, o formato pode ser monovalente para o antígeno ligante. Se a função de ativação do complemento e/ou citotoxicidade celular dependente de anticorpo (ADCC) é desejada, o ligante pode estar em um formato tipo IgG1. Se desejado, o formato tipo IgG pode compreender uma região mutada constante (variante de região constante de cadeia pesada de IgG) para minimizar a ligação aos receptores de Fc e/ou capacidade de fixar o complemento, (vide por exemplo Winter et d., GB 2,209,757 B; Morrison et al, WO 89/07142; Morgan et al, WO 94/29351, December 22, 1994). Os ligantes da invenção (polipeptídeos, dAbs, ago- nistas e antagonistas) podem ser formatados por uma proteína de fusão que contém um primeiro domínio variável de imunoglobulina simples que é fundido diretamente a um segundo domínio variável de imunoglobulina simples. Se desejado tal formato pode ainda compreender uma fração que estende a meia-vida. Por exemplo, o ligante pode compreender um primeiro domínio variável de imunoglobulina simples que é fundido diretamente a um segundo domínio variável de imunoglobulina simples que é fundido diretamente a um domínio variável de imunoglobulina simples que se liga a albumina sérica.
[00163]Geralmente a orientação do domínio do polipeptídeo que tem um sítio de ligação com especificidade de ligação para um ligante, e se o ligante compreende um ligante, é uma questão de escolha. No entanto, algumas orientações, com ou sem ligantes, pode fornecer melhores características de ligação do outras orientações. Todas as orientações (por exemplo, ligante dAb1, ligante dAb2; dAb2-ligante-dAb1) estão incluídas na invenção e são ligantes que contêm uma orientação que fornece características de ligação desejadas que podem ser facilmente identificadas por tria-gem.
[00164]Polipeptídeos e dAbs, de acordo com a invenção, incluindo monôme- ros dAb, dímeros e trímeros, podem ser ligados a uma região Fc de anticorpo, com-preendendo um ou ambos os domínios CH2 e CH3, e opcionalmente uma região em dobradiça. Por exemplo, vetores que codificam ligantes ligados como uma única sequência de nucleotídeo a uma região Fc podem ser usados para preparar tais poli-peptídeos. A invenção fornece ainda dímeros, trímeros e polímeros dos monômeros dAb supra mencionados.
EXEMPLIFICAÇÃO Exemplo 1 Objetivo do estudo
[00165]O objetivo do estudo foi obter variantes resistentes a protease de fu-sões GLP-1 AlbudAb™ ao realizar seleção de fato em bibliotecas derivadas de uma variante de GLP-1 compreendendo GLP-1 resistente a DPP IV (referenciadas aqui como *GLP-1) em combinação com tratamento do fago com várias proteases (inclu-indo aquelas de ocorrência natural no hospedeiro de expressão). Como descrito aqui, um AlbudAb™ é um domínio variável de imunoglobulina simples que se liga especificamente a albumina sérica.
Receptor de GLP-1
[00166]O receptor de peptídeo 1 tipo glucagon (GLP-1R) pertence à família B1 de sete receptores transmembranas acoplados a proteína G. Interações de ligação entre o receptor e seu agonista natural o ligante GLP-1 são iniciadas pela ligação do ligante ao domínio N-terminal extracelular do receptor (ECD GLP-1R) e seguido pela interação com o núcleo da porção transmembrana (Al-Sabah et al, 2003; FEBS Lett; 553(3): 342-6). Foi demonstrado que a ligação de GLP-1 ao domínio N-terminal isolado é retida se o núcleo transmembrana é removido, embora a afinidade seja re-duzida (Lopez de Maturana et al, 2003; J. Biol. Chem; 278(12): 10195-200). Uma vez que o uso do receptor completo não é desejado para a seleção de fago em solução, devido à fraca solubilidade de receptores com domínios transmembrana em solução aquosa sem detergentes solubilizantes, o domínio extracelular isolado foi usado para captura do fago para simplificar o experimento e enriquecer as moléculas de exibição de fagos com afinidade para ECD GLP-1R.
[00167]As sequências de nucleotídeo e aminoácidos para este monômero Fc His marcado de ECD GLP-1 são as seguintes: Sequência de nucleotídeo (SEQ ID NO:1): ATGGCCGGCG CCCCCGGCCC GCTGCGCCTT GCGCTGCTGC TGCTCGGGAT GGTGGGCAGG GCCGGCCCCC GCCCCCAGGG TGCCACTGTG TCCCTCTGGG AGACGGTGCA GAAATGGCGA GAATACCGAC GCCAGTGCCA GCGCTCCCTG ACTGAGGATC CACCTCCTGC CACAGACTTG TTCTGCAACC GGACCTTCGA TGAATACGCC TGCTGGCCAG ATGGGGAGCC AGGCTCGTTC GTGAATGTCA GCTGCCCCTG GTACCTGCCC TGGGCCAGCA GTGTGCCGCA GGGCCACGTG TACCGGTTCT GCACAGCTGA AGGCCTCTGG CTGCAGAAGG ACAACTCCAG CCTGCCCTGG AGGGACTTGT CGGAGTGCGA GGAGTCCAAG CGAGGGGAGA GAAGCTCCCC GGAGGAGCAG CTCCTGTTCC TCAAGCTTGA GCCCAAATCG GCCGACAAAA CTCACACATC ACCACCGTCA CCAGCACCTG AACTCCTGGG GGGACCGTCA GTCTTCCTCT TCCCCCCAAA ACCCAAGGAC ACCCTCATGA TCTCCCGGAC CCCTGAGGTC ACATGCGTGG TGGTGGACGT GAGCCACGAA GACCCTGAGG TCAAGTTCAA CTGGTACGTG GACGGCGTGG AGGTGCATAA TGCCAAGACA AAGCCGCGGG AGGAGCAGTA CAACAGCACG TACCGGGTGG TCAGCGTCCT CACCGTCCTG CACCAGGACT GGCTGAATGG CAAGGAGTAC AAGTGCAAGG TCTCCAACAA AGCCCTCCCA GCCCCCATCG AGAAAACCAT CTCCAAAGCC AAAGGGCAGC CCCGAGAACC ACAGGTGTAC ACCCTGCCCC CATCCCGGGA TGAGCTGACC AAGAACCAGG TCAGCCTGAC CTGCCTGGTC AAAGGCTTCT ATCCCAGCGA CATCGCCGTG GAGTGGGAGA GCAATGGGCA GCCGGAGAAC AACTACAAGA CCACGCCTCC CGTGCTGGAC TCCGACGGCT CCTTCTTCCT CTACAGCAAG CTCACCGTGG ACAAGAGCAG GTGGCAGCAG GGGAACGTCT TCTCATGCTC CGTGATGCAT GAGGCTCTGC ACAACCACTA CACGCAGAAG AGCCTCTCCC TGTCTCCGGG TAAACATCAC CATCATCATC ACTGA Sequência de aminoácido (SEQ ID NO: 2): MAGAPGPLRL ALLLLGMVGR AGPRPQGATV SLWETVQKWR EYRRQCQRSL TEDPPPATDL FCNRTFDEYA CWPDGEPGSF VNVSCPWYLP WASSVPQGHV YRFCTAEGLW LQKDNSSLPW RDLSECEESK RGERSSPEEQ LLFLKLEPKS ADKTHTSPPS PAPELLGGPS VFLFPPKPKD TLMISRTPEV TCVWDVSHE DPEVKFNWYV DGVEVHNAKT KPREEQYNST YRWSVLTVL HQDWLNGKEY KCKVSNKALP APIEKTISKA KGQPREPQVY TLPPSRDELT KNQVSLTCLV KGFYPSDIAV EWESNGQPEN NYKTTPPVLD SDGSFFLYSK LTVDKSRWQQ GNVFSCSVMH EALHNHYTQK SLSLSPGKHH HHHH
[00168]O GLP-1R ECD foi também expresso com um tag de IgG Fc, que per-mitiu a purificação inicial da proteína em agarose de Proteína A. Durante a seleção de gato, o receptor solúvel pode então ser capturado usando pérolas revestidas de Proteína A.
[00169]Teste de seleção de fagos testes foram realizados para verificar que o domínio extracelular do Receptor de GLP-1 pode ser usado para seleções de biblio-teca de exibição de fago.
Vetor de fago
[00170]Um vetor de exibição de fago filamentoso (fd), pDOM34 (que é deri-vado de pDOM4) foi usado, que é baseado em vetor fd com um tag myc e onde a sequência de proteína pode ser clonada entre sítios de restrição para fornecer uma proteína de fusão de gene III.
[00171](pDOM4, como descrito em WO 2007/085815, é um derivado do vetor de fago Fd onde a sequência de peptídeo de sinal de gene III é substituída com o peptídeo sinal de proteína glicolipídica de superfície ancorada de levedura (GAS) (WO 2005/093074). Também contém um tag c-myc entre a sequência líder e o gene III, que coloca o gene III de volta na estrutura)
[00172]Modificações de pDOM4 que levam a pDOM34 incluem: 1.) Knock out do sítio Ncol na posição 7476nt de pDOM4 2.) Deleção do tag Myc fundido à N-termi- nação de cpIII 3.) Introdução do sítio de restrição NcoI para facilitar a clonagem reta após o peptídeo sinal. Os genes que codificam os repertórios de bibliotecas foram clonados como fragmentos NcoI/NotI.
[00173]O vetor foi propagado em células E. coli Machl, isoladas com o uso do kit Plasmid Mega Prep (Qiagen) e a fração super enrolada foi isolado por ultracentri- fugação gradiente com cloreto de césio usando técnicas padrões (Sambrook and Ma- niatis 1989). O vetor foi cortado com enzimas Ncol e Notl seguido por Pstl para reduzir a taxa de auto-ligação. Seguido por extração fenol/clorofórmio, o DNA foi precipitado com etanol e purificado a partir do fragmento de DNA “stuffer” não requerido entre os sítios NcoI e NotI em colunas Chromaspin TE-100 (Clontech). Após a purificação o vetor de DNA foi usado para testar ligações com fragmentos diversificados DAT-X DNA.
Construção de bibliotecas DAT-X
[00174]Dezoito repertórios foram construídos baseados na molécula parente-ral DAT-X compreendendo GLP-1 resistente a DPP IV, que será chamado de *GLP- 1. *GLP-1 (7-37): sequência de aminoácido HGEGTFTSDVSSYLEGQAAKEFIAWLVKGRG (SEQ ID NO:3) Sequência de nucleotídeo: CATGGTGAAGGGACCTTTACCAGTGATGTAAGTTCTTATTTGGAAGGCC AA GCTGCCAAGGAATTCATTGCTTGGCTGGTGAAAGGCCGAGGA (SEQ ID NO:4)
[00175]As moléculas parentais DAT-X compreendem ainda uma fusão com DOM7h-14 (um anticorpo de domínio (dAb) que se liga a albumina sérica (albudab; Albudab™)). DOM7h-14: Sequência de aminoácido: DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQWIGSQLSWYQQKPGKAPKLLIMW RSSL QSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCAQGAALPRTFGQGTKVE IKR (SEQ ID NO:5) Sequência de nucleotídeo: GACATCCAGATGACCCAGTCTCCATCCTCCCTGTCTGCATCTGTAGGAG ACC GTGTCACCATCACTTGCCGGGCAAGTCAGTGGATTGGGTCTCAGTTATCTTG GTACCAGCAGAAACCAGGGAAAGCCCCTAAGCTCCTGATCATGTGGCGTTC CTCGTTGCAAAGTGGGGTCCCATCACGTTTCAGTGGCAGTGGATCTGGGAC AGATTTCACTCTCACCATCAGCAGTCTGCAACCTGAAGATTTTGCTACGTAC TACTGTGCTCAGGGTGCGGCGTTGCCTAGGACGTTCGGCCAAGGGACCAAG GTGGAAATCAAACGG (SEQ ID NO: 6) *GLP-1 e DOM7h-14 na molécula parental DAT-X são conectados por um li-gante helicoidal: Ligante helicoidal: Sequência de aminoácido: KEAAAKEAAAKEAAAKELAAKEAAAKEAAAKEAAAKELAA (SEQ ID NO: 7) Sequência de nucleotídeo: AAAGAAGCGGCGGCGAAAGAAGCGGCGGCGAAAGAAGCGGCGGCGAA AG AATTGGCCGCAAAAGAAGCGGCGGCGAAAGAAGCGGCGGCGAAAGAAGCG GCGGCGAAAGAATTGGCCGCA (SEQ ID NO: 8)
[00176]Para cobrir a sequência completa de *GLP-1 (excluindo os sítios co-nhecidos como importantes para a ligação ao receptor (como descrito, por exemplo, em Sarrauste de Menthiere et al. Eur J Med Chem. 2004 Jun;39(6):473-80; Neidigh et al. Biochemistry. 2001 Nov 6;40(44): 13188-200; Hjorth et al. J Biol Chem. 1994 Dec 2;269(48):30121-4 and Gallwitz et al. Regul Pept. 1996 May 7;63(l):17-22)), 17 reper-tórios foram construídos usando um protocolo de PCR montado usando Phusion high fidelity Polymerase (NEB) em um volume de reação de 50 microlitros. Quatro nucleo- tídeos randomizados por biblioteca foram introduzidos por primers em PCRs primários e em seguida a montagem foi realizada com primers biotinilados. PCR propenso a erro usando kit Mutazyme (Stratagene), primers biotinilados e 5-50 pg de padrão para uma reação de 50 μl introduziu mutações aleatórias em *GLP-1.
[00177]Devido ao comprimento curto da sequência de nucleotídeo *GLP-1, PCR propenso a erro foi PCR duas vezes para aumentar a taxa de mutação.
[00178]Após a digestão com NcoI e NotI, as inserções foram purificados a partir de produtos não digeridos com pérolas revestidas com estreptavidina. A ligação foi realizada onde os produtos digeridos foram ligados em pDOM34 nos sítios corres-pondentes.
[00179]O sequenciamento do teste de clones de ligação confirmara a diversi-ficação esperada em todas as bibliotecas, portanto, a ligação da escala completa e da transformação das bibliotecas seguiu. A ligação foi realizada em um volume total de 500 microlitros, com 1 micrograma do vetor de digestão e a inserção em uma razão de 1:2 com T4 DNA ligase (NEB). Cada biblioteca foi transformada em dois tiros, 10 microlitros por 100 microlitros de células E. coli TB1 eletrocompetentes e após recu-peração, 100ml de meio por 1h a 37°C com agitação, as bibliotecas foram plaqueadas em placas grandes (22cm) quadradas contendo agar 2XTY Tet. As placas cresceram durante a noite e em seguidas raspadas em 5 ml de 2x TY com glicerol 15% para preparação de estoques. Os tamanhos das bibliotecas foram na faixa de 107-108 trans- formantes.
[00180]Para cada preparação de biblioteca de fago Fc um cultura de biblioteca foi iniciada por inoculação de 100 microlitros de estoque de glicerol em 200 mililitros de meio 2xTY contendo antibiótico de modo que a densidade final da cultura imediatamente após a inoculação não excedeu OD6OO=0,1. As bibliotecas foram cultivadas durante a noite por cerca de 18 horas a 37°C com agitação. A cultura foi plaqueada por centrifugação e as bibliotecas de fago foram preparadas por dupla precipitação com PEG e ressuspensas em PBS.
[00181]Vários clones de bibliotecas não selecionadas foram randomicamente escolhidos para sequenciamento para confirmar a construção de bibliotecas bem sucedidas e a primeira rodada de panning seguida por preparação da biblioteca de fago. Os métodos de panning, preparação de estoque de glicerol e amplificação de fago são como descritos abaixo salvo se notado de outra forma.
[00182]O domínio extracelular de receptor de GLP-1 foi usado para panning. 100 microlitros de bibliotecas de fago foram incubados com 2% Marvell PBS contendo 100nM GLP-1R. A incubação foi conduzida por 1h em temperatura ambiente e em seguida os fagos foram combinados com dynabeads de proteína A pré-bloqueadas (2% Marvell PBS,1h, temperatura ambiente) (Dynal). Após uma hora de incubação em um rotação e em temperatura ambiente, as pérolas foram lavadas em sistema de purificação KingFisher (Thermo Electron Corporation) oito vezes com 0,1% Tween PBS (o robô KingFisher automatiza o processo de lavagem usando uma sonda magnética para transferira as pérolas da solução de lavagem para a solução de lavagem) e os fagos específicos foram recuperados por eluição em 500 microlitros de 0,1M Glicina pH 2,0. Após a neutralização com 100 microlitros de 1M Tris-Cl pH 8,0, o fago foi usado para infecção de células E. coli TG1 em fase de log por 45min a 37°C. As células infectadas foram plaqueadas em placas Tet agar que cresceram durante a noite a 37°C. Os títulos das bibliotecas, entrada, saída e tamanho da biblioteca são apresentados na tabela abaixo.
Figure img0001
[00183]A primeira rodada de seleção produziu uma saída razoável para todasas bibliotecas.
[00184]Os estoques de glicerol foram preparados por raspagem de colônias a partir de placas de agar de 2 ml de meio 2XTY contendo glicerol 15% e aliquotados em frascos criogênicos.
[00185]As seguintes seleções foram realizadas no fago agrupado. O fago amplificado foi obtido por cultura combinada de E. coli glicerol contendo saídas da primeira seleção de todas as 18 bibliotecas. A cultura foi iniciada pela inoculação de 50 microlitros de cada estoque de glicerol de biblioteca panned em 1 litro de meio 2xTY com antibiótico. A cultura foi dividida em 21 frascos de agitação, meio litro em cada e cultivadas durante a noite a 37°C com agitação de 250rpm. O fago foi preparado após 18-20h de cultura por precipitação simples com PEG e ressuspenso em PBS.
Seleção de bibliotecas de exibição de fago DAT-X com protease
[00186]Fago amplificado da primeira seleção de saída foi usado para outras seleções com concentração constante de GLP-1R, 100 nM. Adicionalmente, antes da seleção com tripsina, um lote de fago da primeira saída de seleção foi subclonado com a mutação R1 08 W na sequência AlbudAb. Esta mutação gera o clone Vkappa AlbudAb mais resistente para o tratamento de tripsina quando exposto no fago. Isto é porque o resíduo de arginina na terminação carbóxi de dAb que liga o anticorpo de domínio à proteína pIII é sensível a tripsina. A mutação neste sítio remove o sítio de clivagem de tripsina e melhora a marcação das seleções de protease à região dese-jada do peptídeo ligante. Assim, dois lotes de fato, com ou sem a mutação R1 08 W em AlbudAb, foram usados prontamente na segunda rodada de seleção.
[00187]O fago foi tratado com proteases tripsina ou quimotripsina em diferentes concentrações ou deixados não tratados antes da incubação com o receptor por 1h em temperatura ambiente. Os títulos da segunda seleção (Φ/ml) são apresentados na tabela abaixo.
Figure img0002
[00188]As saídas de fago de cada seleção (0μg/ml- 10μg/ml) foram amplifica-das por inoculação de 50 microlitros de estoque glicerol em 50 mililitros de 2xTY com Tet e cultura durante a noite, 20h a 37°C com agitação. O fago purificado foi usado para a terceira rodada de seleção, com as mesmas condições de incubação.Os títulos da terceira seleção (Φ/ml) são apresentados nas tabelas abaixo.
Figure img0003
[00189]Devido à diversidade de clones já ter decrescido após a terceira ro-dada, como verificado por sequenciamento de colônia de um conjunto representativo de clones, alguns clones das seleções de saída foram expressos como proteínas so-lúveis como detalhado abaixo.
Saídas de seleção de bibliotecas de exibição de fago DAT-X
[00190]Várias variantes de *GLP-1 foram escolhidas para serem clonadas como um fusão dom AlbudAb mas ligantes alternativos como descrito abaixo, expressos, purificados e analisados em ensaio de receptor de GLP-1.Suas sequên-cias de aminoácidos são estabelecidas nas sequências 1-10 (vide Figura 1). Uma variante de sequência de *GLP-1 (Sequência 7) foi abundantemente presentes em saídas de seleções com ambos os tratamentos com quimotripsina e tripsina e como uma fusão é chamado DMS7149, dois foram presentes nas saídas quando a quimotripsina foi usada (DMS7150 (Sequência 8) e 51 (Sequência 9)), uma foi observada nas saídas onde somente proteases naturais foram atuantes nas células durante a expressão de fago e secreção e nenhum pré-tratamento com tripsina ou quimotripsina foi usado (DMS7148 (Sequência 6)) e um clonado para criar sítios de clivagem desprovidos de tripsina (DMS7152 (Sequência 10)).
[00191]As proteínas com sequências de aminoácido 1-4 (vide Figura 1) foram analisadas e mostraram baixa potência relativa para GLP-1 e variante DAT-X de controle. Sequenciamento Edman sugeriu que as proteínas foram fortemente processadas. A clonagem foi realizada pela introdução de mutações em clone DAT-Y que compreende *GLP-1 ligada a DOM7h-14 por um ligante alternativo contendo a sequência de aminoácido: PSS (SEQ ID NO: 9) e sequência de nucleotídeo: CCAAGCTCG (SEQ ID NO: 10).
[00192]Mutações escolhidas foram introduzidas na sequência de GLP-1 por primers em PCR primário e no PCR de montagem os sítios de digestão NcoI e BamH1 foram introduzidos nas terminações 5’ e 3’ respectivamente da sequência de fusão.
[00193]O PCR de montagem foi digerido com endonuc leases de restrição NcoI e BamH1. O vetor de expressão pDOM35 foi preparado para clonagem. O Vetor pDOM35 é um derivado de pET12a com modificações: • Os últimos três resíduos de peptídeo sinal OmpT são alterados de SFA para AWA que melhora o processamento no sítio correto pelo sinal de peptidase de E. coli. • O sítio Ncol foi introduzido para facilitar a direção da clonagem após o pep-tídeo sinal. • Um 'stuffer está presente entre o sítio Ncol e BamHI pDOM35 foi digerido com Ncol e BamHI e corte de PCRs de montagem foram ligados no vetor com o uso de kit Quick Ligation (NEB). 2 microlitros de ligação foram usados para a transforma-ção de células Machl e após a recuperação das células foram plaqueadas em placas agar contendo carbenicilina e cresceram durante a noite. As colônias foram sequen- ciadas e estas contendo sequência correta foram usadas para propagação de plasmídeo e seu isolamento (Plasmid Mini Prep kit, Qiagen). Células BL21 (DE3) foram transformadas com plasmídeo de DNA e as colônias resultantes foram usadas para inoculação de cultura de expressão.
[00194]E expressão foi realizada por inoculação de 50 microlitros de cultura de meio 2xTy suplementado com soluções de auto-indução Overnight Express ™ (1 mililitro de Solução 1 (No. de Cat. 71298), 2,5 mililitros de Solução 2 (Cat.No. 71299), 50 mililitros de Solução 3 (Cat.No 71304), Novagen) e 100 microgramas por mililitro de carbenicilina. A cultura foi conduzida durante a noite a 37° C, e em seguida o so- brenadante de cultura foi clarificado por centrifugação a 3700xg por 45minutos. A proteína expressão foi em seguida purificada a partir do sobrenadante clarificado usando proteína L-streamline (GE Healthcare, Cat.No. 28-4058-03, proteína L acoplada), e eluída da Proteína L usando 0,1M glicina pH 2,0, em seguida neutralizada usando 0,2 volumes de 1M Tris pH 8.0.
[00195]A porção variante de *GLP-1 de DMS7148 foram também clonadas como fusão DMS7161 (Sequência 11) com albudab de maior afinidade, DOM7h-14- 10, e conectada pela alternativa, ligante PSS linker, em pDOM35 como descrito ante-riormente. DOM7h-14-10 Sequência de aminoácido (SEQ ID NO:22): DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQWIGSQLSWYQQKPGKAPKLLIMW RSSL QSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCAQGLRHPKTFGQGTKVEIKR Sequência de nucleotídeo (SEQ ID NO:23): GACATCCAGATGACCCAGTCTCCATCCTCCCTGTCTGCATCTGTAGGAG ACC GTGTCACCATCACTTGCCGGGCAAGTCAGTGGATTGGGTCTCAGTTATCTTG GTACCAGCAGAAACCAGGGAAAGCCCCTAAGCTCCTGATCATGTGGCGTTC CTCGTTGCAAAGTGGGGTCCCATCACGTTTCAGTGGCAGTGGATCTGGGAC AGATTTCACTCTCACCATCAGCAGTCTGCAACCTGAAGATTTTGCTACGTAC TACTGTGCTCAGGGTTTGAGGCATCCTAAGACGTTCGGCCAAGGGACCAAG GTGGAAATCAAACGG
[00196]Após o plasmídeo DNA pDOM35 compreendendo sequência de DMS7161 ser transformado em BL21(DE3), o estoque glicerol foi preparado de colô-nias crescidas, por raspagem de colônias em meio mínimo com glicose e adição de glicerol, concentração final de aproximadamente 15%. A expressão de DMS7161 foi iniciada por inoculação do glicerol em 50 mililitros de meio mínimo (DMS7161 A) su-plementado em Extrato de Levedura para concentração final de 10g/litro (DMS7161 B) de modo a obter a densidade inicial da cultura de OD6OO=0,024. A cultura cresceu para OD600 de aproximadamente 1,4 a 300C, em seguida induzida pela adição de 0,1mM de isopropil-beta-d-tiogalactoside. A cultura continuou por mais 24 h a 23° C, e em seguida o sobrenadante de cultura foi clarificado por centrifugação a 3700xg por 45minutos. A proteína expressa foi em seguida purificada a partir do sobrenadante clarificado usando proteína L-streamline (GE Healthcare, Cat.No. 28-4058-03, proteína L acoplada) usando 0,1M glicina pH2,0, em seguida neutralizada usando 0,2 volumes de 1M Tris pH8,0.
Controle de qualidade de DMS7148-52
[00197]As proteínas DMS7148-52 foram expressas e visualizadas em SDS- PAGE não redutor, os clones DMS7148 e DMS7161 foram bem expressos em E.coli com a maior parte do material migrando em tamanho esperado (Figuras 2, 3 e 4). Espectrometria de Massa (Figura 5 a)) e análises de sequenciamento Edman confir-maram a integridade da sequência. Todas as outras proteínas foram degradadas e o sítio carboxila de 25-Triptofano (produtos 24-142 e 26-142 respectivamente) onde DMS7148 contém a mutação W25-D e ácido aspártico não criou o sítio de clivagem para a protease ativa atuante em células E. Coli (Figura 5 a) a f)). O produto de de-gradação 28-142 foi também observado nos clones remanescentes.
[00198]A proteína DMS7148 foi analisada para atividade em um ensaio de ligação ao receptor de GLP-1 de acordo com o seguinte protocolo: Antecedente: GLP-1R é um receptor acoplado a proteína 7TM G que é ex-presso em células CHO. A ativação do receptor por GLP-1 ou tais análogos, leva à conversão de ATO a cAMP por adenilato ciclase que é acoplada ao receptor. As cé-lulas CHO são transferidas com estabilidade com o gene repórter 6CRE/luc. Na pro-dução de cAMP após a ativação por GLP-1 do receptor, o gene promotor (contendo 6 cópias de elemento de resposta cAMP - 6CRE) dirige a expressão do gene repórter luciferase. Isto em seguida catalisa a reação com luciferina para produzir luz que pode ser medida em um luminômetro. Protocolo: Células CHO 6CRE GLP1R (células CHO K1 transfectadas com estabilidade com elemento de resposta 6 cAMP dirigindo o gene repórter luciferase e ainda com receptor humano de GLP-1) foram semeados a 2 x 105 células/ml em meio de suspensão. A cultura de suspensão foi mantida por quarenta e oito horas. As células foram em seguida diluídas em 15mM HEPES, 2mM L glutamina (2,5 x 10 células/ml) e dispensadas em placas de 384 poços contendo 10ul/poço do composto a ser avaliado. Após a adição dos controles do ensaio, as placas retornaram para o incubador por 2 h a 37°C e 5% de CO2. Após a incubação, o substrato em equilíbrio glo luciferase (Promega) foi adicionado aos poços como descrito no kit e as placas foram vedadas com vedação de placa auto-adesiva (Weber Marking Systems Inc. Cat. No. 607780). As placas foram posicionadas no leitor (Packard TopCount) e pré-incubadas por 5 minutos antes da leitura de fluorescência e plotagem dos resultados. O composto foi avaliado em uma faixa de curva de resposta de concentrações a ser ajustada a partir da qual pC50s foram calculados.
[00199]A Proteína DMS7148 demonstrou ser ativa, no entanto, menos ativa do que o peptídeo GLP-1 (Figura 6 e sumarizado abaixo) :
Figure img0004
DMS7161 foi avaliado para atividade em um ensaio de GLP-1 de acordo com o seguinte protocolo: Método
[00200]As células CHO 6CRE GLP1R foram rapidamente descongeladas em frascos em um banho-maria a 37°C, e os conteúdos dos frascos transferidos a um tubo falcon de 50ml e meio de ensaio 10ml RPM1 (fenol vermelho livre) (Sigma, cat# Rl 509) + 2mM L-glutamina (Gibco, cat # 25030) + 15mM HEPES (Sigma, cat # H0887) adicionado por frasco. Após contagem e centrifugação a 1200rpm por 5 minutos as células foram ressuspensas em um volume apropriado de meio de ensaio RPMI para gerar 1x106 células por ml e 50μl dispensados em cada poço de uma placa de tecido de cultura de 96 poços de fundo plano (placa de cultura de tecido Costar de 96 poços, branca estéril, cat # 3917). As células foram incubadas durante a noite a 37C/5%CO2. No dia seguinte, as células foram removidas após incubação e 50μl de controle/amos- tra previamente preparada foi adicionada aos poços e a placa retornou a incubadora por 3 horas 37°C e 5% CO2.
Preparando controle GLP-1(7-36) (Sigma, cat # G814)
[00201]Em uma placa de fundo V de 96 poços adicionou-se 2μl de 1mg/ml de GLP-1(7-36) a 18μl de meio de ensaio RPMI para gerar 30μM de solução. Adicionou- se 2μl de solução 30μM a 298μl de meio de ensaio RPMI para gerar uma solução de 200nM (para uma concentração final no ensaio de 100nM).
[00202]Diluição serial do controle 1:10 na placa (15μl de controle + 135μl de meio de ensaio RPMI) para gerar uma curva de 8 pontos.
Preparando controle Exendina-4 (Sigma, cat #E7144)
[00203]Em uma placa de fundo V de 96 poços adicionou-se 2μl de 1mg/ml de Exendin-4 a 198μl de meio de ensaio RPMI para gerar 2.39μM de solução. Adicionou- se 2μl de solução 2.39μM a 237μl de meio de ensaio RPMI para gerar uma solução de 200nM (para uma concentração final no ensaio de 100nM). Diluição serial do controle 1:10 na placa (15μl de controle + 135μl de meio de ensaio RPMI) para gerar uma curva de 8 pontos.
Preparação de amostras não conhecidas
[00204]Usar as mesmas diretrizes para preparação dos controles para a pre-paração de amostras não conhecidas. A concentração superior será duas vezes a concentração final do ensaio requerido e diluir 1:10 na placa.
Preparando a luciferase (Promega, cat # E2620)
[00205]Remover o número requerido de alíquotas de Bright-Glo luciferase do freezer e deixar descongelar em temperatura ambiente no escuro. Um frasco de 5ml é suficiente para uma placa de ensaio
[00206]Após o tempo de incubação 50μl de reagente Bright-Glo Luciferase foi adicionado aos poços e a placa foi incubada por 3 mins para permitir que ocorra a lise da célula. A luminescência (contagem por segundo) foi lida usando o leitor de micro- placa M5e, lendo cada poço por 0,1 segundo. CPS do fundo das placas contendo somente células foi subtraído de todos os outros poços. Os poços de controle (GLP- 1(7-36) ou Exendin-4) devem exibir estimulação máxima nas concentrações mais altas. As curvas de efeito e concentração das amostras não conhecidas são ajustadas a partir das quais EC50 é calculado com uso de software GraphPad Prism ou ExcelFit.
[00207]DMS7161 é potente com EC50 entre 1,6 e 3,4nM como mostrado na Figura 7 e sumarizado abaixo.
Sumário
[00208]A seleção de fago de fusão de peptídeo diversificado que tem naturalmente muita sensibilidade a proteases e degrada durante a expressão em E. coli permitiu a identidade de fusão com variante de *GLP-1 que é resistente a proteases bac- terianas naturais e a mesma é expressível em E. coli. Os sítios de protease que são desprovidos de neste clone são semelhantes aqueles reconhecidos por tripsina e quimotripsina, no entanto, esta sequência não estava presente nas saídas de seleções com tratamento adicional com tripsina ou quimotripsina.Tabela de sequências
Figure img0005

Claims (3)

1. Domínio variável único de imunoglobulina CARACTERIZADO pelo fato de que compreende: uma sequência de aminoácidos da CDR1 como apresentada nos resíduos 24 a 34 da SEQ ID NO: 22; uma sequência de aminoácidos da CDR2 como apresentada nos resíduos 49 a 56 da SEQ ID NO:22; e uma sequência de aminoácidos da CDR3 como apresentada nos resíduos 89 a 97 da SEQ ID NO: 22.
2. Polipeptídeo isolado CARACTERIZADO pelo fato de que compreende a sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 22.
3. Polipeptídeo isolado CARACTERIZADO pelo fato de que compreende a sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 21.
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