JP7122672B2

JP7122672B2 - Ｖｈｈ抗体

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Publication number: JP7122672B2
Application number: JP2018110552A
Authority: JP
Inventors: 江美奈池内; 仁村岡
Original assignee: Panasonic Intellectual Property Management Co Ltd
Current assignee: Panasonic Intellectual Property Management Co Ltd
Priority date: 2018-06-08
Filing date: 2018-06-08
Publication date: 2022-08-22
Anticipated expiration: 2038-06-08
Also published as: JP2019210267A; US10941192B2; US20190375824A1

Description

特許法第３０条第２項適用平成３０年２月２０日にＢＰＳ２０１８（６２ｎｄＡｎｎｕａｌＭｅｅｔｉｎｇＢｉｏｐｈｙｓｉｃａｌＳｏｃｉｅｔｙ）にて公開した

本開示は、熱安定性ＶＨＨ抗体に関する。

ＶＨＨ抗体は、軽鎖を持たない特殊な抗体であり、主に偶蹄目、ラクダ科動物（フタコブラクダ、ヒトコブラクダ、ラマ、アルパカ、ビクーニャ、グアナコ）の血清中に見出されることが知られている。ＶＨＨ抗体は、抗原に結合できる免疫グロブリンフラグメントとしては最も低分子量であること（約１２～約１５ｋＤａ）、大腸菌等での産生が比較的容易であること、熱安定性が比較的高いことから、その利用を目指した研究が進められている。

ＶＨＨ抗体は熱安定性が比較的高いものの、さらなる熱安定化が求められる。特許文献１には、ラクダ科動物抗体の５７位、８２位、９２位に相当する位置のアミノ酸を置換して熱安定性を向上させる技術が開示されている。しかしながら、より多様な熱安定性ＶＨＨ抗体が求められている。

特開２０１４－４２５１５号公報

本開示における目的の一つは、熱安定性ＶＨＨ抗体を提供することである。

本発明者は、本開示のＶＨＨ抗体として、配列番号：１で示されるＶＨＨ抗体を作出した。さらに検討した結果、このＶＨＨ抗体の特定の位置のアミノ酸を置換することにより、より熱安定化した抗体が得られることを見出した。

本開示は、配列番号：１で示されるアミノ酸配列を有するＶＨＨ抗体、およびＩＭＧＴ表記に基づいて、配列番号：１で示されるアミノ酸配列の３６位のグリシン、５０位のアルギニンおよび７８位のグリシンのうちの少なくとも一つが他のアミノ酸に置換された配列を含む、ＶＨＨ抗体、に関する。

本開示は、熱安定性ＶＨＨ抗体を提供する。

図１は、配列番号：１のアミノ酸配列を示す図である。図２は、配列番号：１のＶＨＨ抗体および変異を１個導入したＶＨＨ抗体の耐熱性の比較を示す図である。図３は、配列番号：１のＶＨＨ抗体および変異を２個導入したＶＨＨ抗体の耐熱性の比較を示す図である。

本明細書において、「ＶＨＨ抗体」とは、重鎖抗体の可変領域ドメインをいう。ＶＨＨ抗体は、通常１００～１５０アミノ酸残基、より具体的には１１５～１３５アミノ酸残基からなる。

本明細書において「含む」とは、「からなる」と、「本質的にからなる」とを包含する。

本明細書において、塩基やアミノ酸等を略号で表示する場合、基本的にＩＵＰＡＣにより標準化された略号または当該分野における慣用略号に基づく。

本開示では、ある態様において、配列番号：１で示されるアミノ酸配列を含む、またはからなるＶＨＨ抗体を提供する。

抗体のアミノ酸の番号付けの方法としてＩＭＧＴ（ＩｍＭｕｎｏＧｅｎｅＴｉｃｓＤａｔａｂａｓｅ）表記とＫａｂａｔ表記の２種類が存在し、本明細書では特に言及しない限りＩＭＧＴ表記を用いる。配列番号：１の配列をＩＭＧＴ表記に合わせると、表１のとおりとなる。

本開示では、他の態様において、ＩＭＧＴ表記に基づいて、配列番号：１で示されるアミノ酸配列の３６位のグリシン、５０位のアルギニンおよび７８位のグリシンのうちの少なくとも一つが他のアミノ酸で置換された配列を含む、またはからなるＶＨＨ抗体、に関する。ある実施形態において、本開示のアミノ酸配列はさらに１１６位のセリンが他のアミノ酸で置換される。

なお、Ｍ．Ｍ．Ｈａｒｍｓｅｎｅｔａｌ．：ＭｏｌｅｃｕｌａｒＩｍｍｕｎｏｌｏｇｙ３７（２０００）５７９－５９０に記載の表記に従った場合、上記の位置はそれぞれ３２位、５０位、７８位および１３３位となる。

ある実施形態において、３６位のグリシンは、例えば、アスパラギン酸、グルタミン酸、アルギニン、リジン、ヒスチジン、アスパラギン、グルタミン等の酸性または塩基性アミノ酸で置換される。より具体的な例として、アスパラギン酸、グルタミン酸、アスパラギン、グルタミン等の酸性アミノ酸；アルギニン、リジン、ヒスチジンなどの塩基性アミノ酸；またはアスパラギン酸、が挙げられる。どのような原理でこの置換により熱安定性が向上するかは不明であるが、酸性または塩基性アミノ酸により、他の位置にあるアミノ酸と静電相互作用を生じて構造が安定化した可能性がある。

ある実施形態において、５０位のアルギニンは、例えば、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン、システイン、セリン、トレオニン、アスパラギン、グルタミン、チロシン等の非極性アミノ酸または無電荷アミノ酸で置換される。より具体的な例として、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン、システイン等の非極性アミノ酸；バリン、ロイシン、イソロイシン等の脂肪族側鎖を有するアミノ酸；またはロイシン、が挙げられる。どのような原理でこの置換により熱安定性が向上するかは不明であるが、アルギニンにより生じる空隙が、非極性または無電荷アミノ酸に置換されることにより埋められた可能性がある。

ある実施形態において、７８位のグリシンは、例えば、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン、システイン、アスパラギン酸、グルタミン酸、アルギニン、リジン、ヒスチジン、セリン、トレオニン、アスパラギン、グルタミン、チロシン等のグリシンよりかさ高いアミノ酸で置換される。より具体的な例として、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン、システイン、セリン、トレオニン、アスパラギン、グルタミン、チロシン等の非極性アミノ酸または無電荷アミノ酸；アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン、システイン等の非極性アミノ酸；バリン、ロイシン、イソロイシン等の脂肪族側鎖を有するアミノ酸；またはアラニン、が挙げられる。どのような原理でこの置換により熱安定性が向上するかは不明であるが、グリシンでは埋められない空隙が、よりかさ高いアミノ酸に置換されることにより埋められた可能性がある。

ある実施形態において、１１６位のセリンは、例えば、アスパラギン酸、グルタミン酸、アルギニン、リジン、ヒスチジン、アスパラギン、グルタミン等の酸性または塩基性アミノ酸で置換される。より具体的な例として、アスパラギン酸、グルタミン酸、アスパラギン、グルタミン等の酸性アミノ酸；アルギニン、リジン、ヒスチジンなどの塩基性アミノ酸；またはアルギニン、が挙げられる。どのような原理でこの置換により熱安定性が向上するかは不明であるが、酸性または塩基性アミノ酸により、他の位置にあるアミノ酸と静電相互作用を生じて構造が安定化した可能性がある。また、３６位のアミノ酸と静電相互作用を生じる可能性がある。したがって、ある実施形態において、３６位のグリシンが塩基性アミノ酸で置換され、１１６位のセリンが酸性アミノ酸で置換される。また他の実施形態において、３６位のグリシンが酸性アミノ酸で置換され、１１６位のセリンが塩基性アミノ酸で置換される。

ある実施形態において、本態様のＶＨＨ抗体は、配列番号：１で示されるＶＨＨ抗体よりも高い熱安定性を有する。より具体的には、抗体に溶媒としてＰＢＳ（ｐＨ７．４）を加え、６０μＭに希釈し、示差走査型カロリメトリー（ＤＳＣ）により測定した変性中点温度Ｔｍ（℃）が、配列番号：１で示されるＶＨＨ抗体よりも高い値、例えば１℃以上、２℃以上、３℃以上、４℃以上、５℃以上、６℃以上、７℃以上、８℃以上、９℃以上、または１０℃以上高い値を示す。ある実施形態において、本態様の熱安定性ＶＨＨ抗体は、５０℃以上のＴｍ、例えば、５５℃以上、５７℃以上、５９℃以上、６１℃以上、６３℃以上、６５℃以上のＴｍを示す。

ＶＨＨ抗体の特定のアミノ酸を置換する方法としては、例えば部位特異的変異導入［ＭｅｔｈｏｄｓｉｎＥｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，１５４，３５０，３６７－３８２（１９８７）；同１００，４６８（１９８３）；ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓＲｅｓ．，１２，９４４１（１９８４）；続生化学実験講座１「遺伝子研究法ＩＩ」、日本生化学会編，ｐ１０５（１９８６）］などの遺伝子工学的手法、リン酸トリエステル法やリン酸アミダイト法などの化学合成手段［Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，８９，４８０１（１９６７）；同９１，３３５０（１９６９）；Ｓｃｉｅｎｃｅ，１５０，１７８（１９６８）；ＴｅｔｒａｈｅｄｒｏｎＬｅｔｔ．，２２，１８５９（１９８１）；同２４，２４５（１９８３）］およびそれらの組合せ方法などが例示できる。より具体的には、ＤＮＡの合成は、ホスホルアミダイト法またはトリエステル法による化学合成によることもでき、市販されている自動オリゴヌクレオチド合成装置上で行うこともできる。二本鎖断片は、相補鎖を合成し、適当な条件下で該鎖を共にアニーリングさせるか、または適当なプライマー配列と共にＤＮＡポリメラーゼを用い相補鎖を付加するかによって、化学合成した一本鎖生成物から得ることもできる。

本開示では、より具体的な態様において、配列番号：３～１２のいずれか１つで示されるアミノ酸配列を含む、またはからなるＶＨＨ抗体に関する。

本開示の抗体は、そのアミノ酸配列に基づいて、公知の方法に従ってまたは準じて、例えば化学合成、動物細胞または組織からの精製、抗体をコードするポリヌクレオチドを含有する形質転換体からの生成、等によって得ることができる。形質転換体としては、抗体をコードするポリヌクレオチドから抗体を発現させることができる細胞である限り特に限定されず、大腸菌などの細菌、酵母、真菌、昆虫細胞、哺乳類細胞等の種々の細胞を利用することができる。

本開示の抗体は、抗体医薬、免疫学的診断薬、免疫学的検出方法、実験用試薬、抗体ハイブリッド材料、アフィニティークロマトグラフィー、ドラッグデリバリーシステムなどにおいて用いられ得る。この場合、本開示の抗体は、他の物質と結合した複合体、例えば、担体または標識物質に結合した複合体の状態で用いられてもよい。

固相担体は、抗原抗体反応の反応系における溶媒に不溶な担体であれば、その形状及び材質は特に制限されない。固相担体の形状としては、例えば、プレート、ビーズ、ディスク、チューブ、フィルター、薄膜などが挙げられる。固相担体の材質としては、例えば、ポリエチレンテレフタレート、酢酸セルロース、ポリカーボネート、ポリスチレン、ポリメチルメタクリレート等のポリマー、金、銀、アルミニウム等の金属、ガラスなどが挙げられる。抗体を固相担体へ結合させる方法としては、物理的吸着法、共有結合法、イオン結合法、架橋法などの公知の方法が使用される。

標識物質としては、例えば、蛍光物質、発光物質、色素、酵素、放射性物質などが使用される。抗体を標識物質へ結合させる方法としては、物理的吸着法、共有結合法、イオン結合法、架橋法などの公知の方法が使用される。

本開示の抗体を用いた検出方法では、当該抗体を含む複合体と被分析物とが接触させられ、被分析物中の被検出物質と、複合体中の抗体との抗原抗体反応に基づく物理量の変化が検出される。当該物理量としては、例えば、発光強度、色度、光透過度、濁度、吸光度、放射線量などが挙げられる。検出方法の具体例としては、酵素免疫測定法、イムノクロマト法、ラテックス凝集法、放射免疫測定法、蛍光免疫測定法、表面プラズモン共鳴測定法などの公知の方法が挙げられる。

本開示の抗体を用いた検出装置は、抗原抗体反応に基づき変化する上記物理量のいずれかを検出するための検出部を含む。検出部は、各種光度計、分光器、線量計など公知の装置で構成される。

本開示の抗体は、他の物質と結合した複合体の他、本開示の抗体を含む組成物、または本開示の抗体を含むキットとしても用いられ得る。

他の態様において、本開示は、配列番号：１で示されるＶＨＨ抗体の熱安定性を向上させる方法に関する。より具体的には、本態様は、配列番号：１で示されるＶＨＨ抗体の、ＩＭＧＴ表記に基づいて、３６位のグリシン、５０位のアルギニンおよび７８位のグリシンのうちの少なくとも一つを他のアミノ酸に置換することを含む方法を提供する。本態様は、ある実施形態において、さらに１１６位のセリンを他のアミノ酸に置換することを含む。

本態様における、置換されるアミノ酸の具体例は、上記ＶＨＨ抗体の態様で説明したとおりである。

ある実施形態において、本態様の方法により、配列番号：１で示されるＶＨＨ抗体よりも高い熱安定性を有するＶＨＨ抗体が得られる。より具体的には、抗体に溶媒としてＰＢＳ（ｐＨ７．４）を加え、６０μＭに希釈し、示差走査型カロリメトリー（ＤＳＣ）により測定した変性中点温度Ｔｍ（℃）が、配列番号：１で示されるＶＨＨ抗体よりも高い値、例えば１℃以上、２℃以上、３℃以上、４℃以上、５℃以上、６℃以上、７℃以上、８℃以上、９℃以上、または１０℃以上高い値を示す。ある実施形態において、本態様の方法により熱安定性が向上したＶＨＨ抗体は、５０℃以上のＴｍ、例えば、５５℃以上、５７℃以上、５９℃以上、６１℃以上、６３℃以上、６５℃以上のＴｍを示す。

実施例１：熱安定性ＶＨＨ抗体のスクリーニング
ファージライブラリより、熱安定性ＶＨＨ抗体として、配列番号：１および配列番号：１２のＶＨＨ抗体を単離した。配列番号：１のＴｍは５１．２℃、配列番号：１２のＴｍは６０．３℃を示した。より熱安定性の高いＶＨＨ抗体を得るため、両者の配列を比較し、配列番号：１のアミノ酸置換を検討した。

実施例２：アミノ酸置換の導入１
配列番号：１の３６位のグリシンをアスパラギンに置換したもの（配列番号：３）、５０位のアルギニンをロイシンに置換したもの（配列番号：４）、７８位のグリシンをアラニンに置換したもの（配列番号：５）、１１６位のセリンをアルギニンに置換したもの（配列番号：６）をそれぞれ作成した。これらの抗体は、表２に記載のプライマーを用いてポリヌクレオチドを増幅し、これを導入したベクターにより大腸菌を形質転換し、産生させた。なお、表２における、例えばＧ３６Ｄなる表記は、３６位のグリシンをアスパラギン酸に置換したことを示す。これらのＶＨＨ抗体の熱安定性を、上記の方法に従って測定した。配列番号３～６のＶＨＨ抗体について、配列番号１のＶＨＨ抗体のＴｍとの差（ΔＴｍ）を表３に示す。

表３に示すとおり、３６位、５０位、７８位のアミノ酸を置換したものは、ΔＴｍが正の値を示した。１１６位のアミノ酸を置換したものは、ΔＴｍが負の値となったが、５０℃以上は維持していた。

実施例３：アミノ酸置換の導入２
配列番号：１の３６位のグリシンをアスパラギン、１１６位のセリンをアルギニンに置換したもの（配列番号：７）、５０位のアルギニンをロイシン、７８位のグリシンをアラニンに置換したもの（配列番号：８）、３６位のグリシンをアスパラギン、５０位のアルギニンをロイシン、１１６位のセリンをアルギニンに置換したもの（配列番号：９）、３６位のグリシンをアスパラギン、７８位のグリシンをアラニン、１１６位のセリンをアルギニンに置換したもの（配列番号：１０）、３６位のグリシンをアスパラギン、５０位のアルギニンをロイシン、７８位のグリシンをアラニン、１１６位のセリンをアルギニンに置換したもの（配列番号：１１）をそれぞれ作成した。これらのＶＨＨ抗体の熱安定性を、上記の方法に従って測定した。結果を表４に示す。

表４に示すとおり、２個以上の置換を導入すると、さらに熱安定性が向上した。４個の置換を導入したものが最もよい結果を示した。

図２に、配列番号：１のＶＨＨ抗体および変異を１個導入したＶＨＨ抗体の耐熱性の比較を示した。また、図３に、配列番号：１のＶＨＨ抗体および変異を２個導入したＶＨＨ抗体の耐熱性の比較を示した。

実施例４：ＶＨＨ抗体の親和性確認
得られたＶＨＨ抗体のヒト血清アルブミンに対する結合親和性を表面プラズモン共鳴を用いて測定した。結果を表５に示す。

表５に示すとおり、アミノ酸置換を導入した配列番号：３～１１のＶＨＨ抗体は、配列番号：１のＶＨＨ抗体と同等またはそれ以上の結合親和性を示した。これにより、アミノ酸置換後も抗体としての機能が維持されていることが確認された。

本開示は、新規な熱安定ＶＨＨ抗体を提供する。

Claims

配列番号：３で示されるアミノ酸配列を含む、ＶＨＨ抗体。
配列番号：４で示されるアミノ酸配列を含む、ＶＨＨ抗体。
配列番号：７で示されるアミノ酸配列を含む、ＶＨＨ抗体。
配列番号：９で示されるアミノ酸配列を含む、ＶＨＨ抗体。
配列番号：１０で示されるアミノ酸配列を含む、ＶＨＨ抗体。
配列番号：１１で示されるアミノ酸配列を含む、ＶＨＨ抗体。
配列番号：１２で示されるアミノ酸配列を含む、ＶＨＨ抗体。