BR112019024333A2 - imunoglobulinas de ligação adamts - Google Patents

Abstract

A presente invenção refere-se a imunoglobulinas que ligam ADAMTS5 e mais em particular a polipeptídeos, que compreendem ou essencialmente consistem em uma ou mais das referidas imunoglobulinas (também referidas no presente documento como "imunoglobulina(s) da invenção" e "polipeptídeos da invenção", respectivamente). A invenção também se refere aos construtos compreendendo as referidas imunoglobulinas, tais como domínios variáveis únicos de imunoglobulina (ISVDs) ou polipeptídeos assim como ácidos nucleicos que codificam as referidas imunoglobulinas ou polipeptídeos (também referidos no presente documento como "ácidos nucleicos da invenção"; aos métodos para preparar as referidas imunoglobulinas, polipeptídeos e construtos; a células hospedeiras expressando ou capazes de expressar as referidas imunoglobulinas ou polipeptídeos; a composições, e em particular a composições farmacêuticas, que compreendem as referidas imunoglobulinas, polipeptídeos, construtos, ácidos nucleicos e/ou células hospedeiras; e aos usos de imunoglobulinas, polipeptídeos, construtos, ácidos nucleicos, células hospedeiras e/ou composições, em particular para finalidades profiláticas e/ou terapêuticas, tais como as finalidades profiláticas e/ou terapêuticas mencionadas no presente documento. Outros aspectos, modalidades, vantagens e aplicações da invenção se tornarão claros a partir da descrição adicional no presente documento.

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para "IMUNO- GLOBULINAS DE LIGAÇÃO ADAMTS".

1. CAMPO DA INVENÇÃO

[001] A presente invenção refere-se a imunoglobulinas que ligam ADAMTSS5 e mais em particular a polipeptídeos, que compreendem ou essencialmente consistem em uma ou mais das referidas imuno- globulinas (também referidas no presente documento como "imuno- globulina(s) da invenção", e "polipeptídeos da invenção", respectiva- mente). A invenção também se refere a construtos compreendendo as referidas imunoglobulinas, tais como domínios variáveis únicos de imunoglobulina (ISVDs) ou polipeptídeos assim como ácidos nucleicos que codificam as referidas imunoglobulinas ou polipeptídeos (também referidos no presente documento como "ácido(s) nucleico(s) da in- venção"; aos métodos para preparar as referidas imunoglobulinas, polipeptídeos e construtos; a células hospedeiras que expressam ou são capazes de expressar as referidas imunoglobulinas ou polipep- tídeos; às composições, e em particular às composições farmacêuti- cas, que compreendem as referidas imunoglobulinas, polipeptídeos, construtos, ácidos nucleicos e/ou células hospedeiras; e aos usos de imunoglobulinas, polipeptídeos, construtos, ácidos nucleicos, células hospedeiras e/ou composições, em particular para as finalidades pro- filáticas e/ou terapêuticas, tais como as finalidades profiláticas e/ou terapêuticas mencionadas no presente documento. Outros aspectos, modalidades, vantagens e aplicações da invenção se tornarão claros a partir da descrição adicional no presente documento.

2. ANTECEDENTE DA INVENÇÃO

[002] Osteoartrite (OA) é uma das causas mais comuns de inca- pacidade pelo mundo. Ela afeta 30 milhões de norte-americanos e é a doença articular mais comum. Estima-se que ela afete mais do que 20 por cento da população norte-americana até 2025. A doença é não sistêmica e geralmente restrita a poucas articulações. No entanto, a doença pode ocorrer em todas as articulações, mais frequentemente os joelhos, quadris, mãos, ombro, e coluna vertebral. OA é caracter- izada pela erosão progressiva de cartilagem articular (cartilagem que cobre os ossos) resultando em dor crônica e incapacidade. Even- tualmente, a doença leva à destruição total da cartilagem articular, esclerose do osso circundante, formação de osteófitos, etc., tudo levando à perda de movimento e dor. A osteoartrite pode ser definida como um grupo diverso de condições caracterizadas por uma com- binação de sintomas articulares, sinais resultantes de defeitos na carti- lagem articular e mudanças em tecidos adjacentes incluindo ossos, tendões e músculo. A dor é o sintoma mais proeminente de OA e mais frequentemente a razão pela qual os pacientes procuram ajuda médi- ca. Não existe cura para OA, isto é, os tratamentos atuais não inibem a deterioração estrutural da articulação com OA. O controle da doença é limitado a tratamentos que são paliativos na melhor das hipóteses e ajudam pouco a encontrar a causa da progressão da doença. Embora o início da doença possa ser multifatorial, a destruição da cartilagem parece ser um resultado de destruição proteolítica não controlada da matriz extracelular (ECM). Os componentes de ECM mais abundantes da cartilagem articular são colágeno (principalmente colágeno ||) e os proteoglicanos, principalmente agrecan (Kiani et a/. 2002 Cell Re- search 12:19-32).

[003] Agrecan é importante no funcionamento adequado da carti- lagem articular porque ele provê uma estrutura em gel hidratada que dota a cartilagem com propriedades de suporte de carga. Agrecan é uma molécula multimodular grande (2317 aminoácidos) expressada por condrócitos. A sua proteína nuclear é composta de três domínios globulares (G1, G2 e G3) e uma grande região estendida entre G2 e G3 para a ligação da cadeia glicosaminoglicana. Esta região estendida compreende dois domínios, um substituído com cadeias de sultato de queratana (domínio KS) e um com cadeias de sulfato de condroitina (domínio CS). O domínio CS tem 100-150 cadeias glicosaminoglicana (GAG) ligadas a ele. Agrecan forma grandes complexos com hialu- ronan nos quais 50-100 moléculas de agrecan interagem através do domínio G1 e proteína ligante com uma molécula de hialuronan. Medi- ante a captação de água (devido ao teor de GAG) esses complexos formam um gel reversivelmente deformável que resiste à compressão. A estrutura, retenção de fluidos e função da cartilagem articular são ligadas ao teor matriz de agrecan, e a quantidade de sulfato de condroitina ligado à proteína nuclear intacta. Estruturalmente, OA é caracterizada pela degradação de agrecan, progressivamente liberan- do domínios G3 e G2 (resultando em “deflação' da cartilagem) e even- tualmente liberação do domínio G1 e degradação de colágeno, irrever- sivelmente destruindo a estrutura da cartilagem. O sítio de clivagem de agrecan mais significativo para a patogênese de OA está localizado na sequência TEGE?”?|3”ARGS. Este sítio de clivagem está posicionado no domínio interglobular (IGD) de agrecan. Os anticorpos que reconhecem o neo-epítopo 3” ºARGS levaram à descoberta de agre- canase-1, a qual provou ser ADAMTS4 e agrecanase-2, que é ADAMTSS5. De forma subsequente, outras enzimas relacionadas a ADAMTS, incluindo ADAMTS1, -8, -9, -15 e -20, mostraram ter ativid- ade de agrecanase. ADAMTS16 e 18 também são agrecanases fra- cas. As ADAMTSs e metaloproteinases matriz (MMPs) compartilham um sítio de ligação à aggrecan que é muito similar tanto em sequência quanto na forma geral (El Bakali et al. 2014 Future Medicinal Chemis- try (Review) 6:1399).

[004] As enzimas ADAMTS (desintegrina A e metaloproteinase com motivos trombospondina) são secretadas, as metaloendopeptida- ses de zinco associadas à matriz multidomínio que têm diversos pa-

péis na morfogênese tecidual e remodelação patofisiológica, na infla- mação e na biologia vascular (Kelwick et al. 2015 Genome Biology 16:113). A família humana inclui 19 membros que podem ser sub- agrupados com base nos seus substratos conhecidos. As agrecanases ou proteoglicanases incluem ADAMTS1, -4, -5, -8, -9, -15 e -20, que podem clivar proteínas extracelulares da proteoglicana do sulfato de condroitina de ligação a hialuronan (CSPG), incluindo agrecan, versi- can, brevican e neurocan. Os dois sítios de clivagem mais preferidos no agrecan bovino estão em KEEE'%6” |166SG| GS, seguido por GELE1980 1481 GRGT. Deste modo, a clivagem ocorre em NI- TEGE?”?|3”4ARGS no IGD (no qual MMPs não separam), liberando o neo-epítopo mencionado antes, e em TAQE!”!|'!2AGEG e VSQE'871 [1872] GOR na região CS-2 (Fosang et a/. 2008 European Cells and Materials 15:11-26). Esses sítios de clivagem são altamente conservados em humanos, bovinos, camundongos e ratos.

[005] Várias linhas de evidência indicam que ADAMTS5 é uma enzima principal envolvida na patogênese da osteoartrite. ADAMTS5 é uma principal agrecanase presente na cartilagem. Em explantes de cartilagem humana e condrócitos, o khrockdown de ADAMTSS5 atenuou a ruptura de agrecan, sugerindo que esta enzima pode estar envolvida em tecidos humanos. A expressão da enzima é aumentada por citocinas tais como interleucina-1 e oncostatina-M, que provocam a ruptura de agrecan nos tecidos. Os fragmentos de aggrecan gerados por ADAMTSS5 são detectados no fluido sinovial e soro de pacientes com OA (Germaschewski et al., 2014 Osteoarthritis Cartilage 22:690— 697).

[006] ADAMTSS é primeiro sintetizada como uma proteína inati- va, incluindo um domínio protease no N-terminal e um domínio ancilar no C-terminal. O domínio protease consiste em um peptídeo de sinal, um prodomínio com uma sequência de reconhecimento furina e um domínio catalítico. O prodomínio é clivado por pro-proteína convert- ases de modo a produzir as enzimas ativas. ADAMTSS5 ainda contém domínios ancilares que participam ativamente no reconhecimento de substrato e modulam a afinidade da proteinase para os seus substra- to(s) ("exócitos"). O domínio do tipo desintegrina, repetição (TS) como | do tipo trombospondina central, domínio rico em cisteína, região es- paçadora e motivo TS adicional de ADAMTSS5 são domínios ancilares com potenciais funções de exócito. O domínio rico em cisteína parece ser essencial para a ligação e organização de ADAMTSS5 em glicosa- minoglicanas. A maior variabilidade nos membros ADAMTS é encon- trada nesses domínios ancilares (Kelwick et a/., 2015 Genome Biology 16:113).

[007] Os fármacos antiosteoartríticos modificadores de doença (DMOADs), que podem ser definidos como fármacos que inibem a progressão da doença estrutural e idealmente também melhoram sin- tomas e/ou funcionam são intensamente procurados. DMOADs são provavelmente para serem prescritos por longos períodos nesta doen- ça crônica de uma população idosa, demandando assim excelentes dados de segurança em uma população alvo com múltiplas comor- bididades e as potenciais interações fármaco-fármaco.

[008] Várias companhias farmacêuticas desenvolveram inibidores de molécula pequena de ADAMTSS5. Reivindica-se que alguns desses compostos sejam específicos para ADAMTSS5, enquanto que outros têm efeito contra outros membros de ADAMTS, ou ainda contra MMPs. Essas inibições cruzadas são consideradas como re- sponsáveis pela síndrome musculoesqueletal, um efeito colateral cau- sado por inibidores de amplo espectro e envolvendo artralgia, mialgia, rigidez articular e tendinite (Santamaria et al., 2015 Biochem J 471:391-401). O inibidor de agrecanase da Wyeth AGG-523 foi usado nos testes clínicos de fase | em indivíduos saudáveis e pacientes com

OA, porém não foi mais usado. Nem os outros inibidores de ADAMTS de molécula pequena entraram em algum outro desenvolvimento clí- nico como potencial DMOAD (Bondeson et al., 2015 Drug Discovery 10:5-14). Da mesma forma, apesar de vários testes clínicos recentes especificamente investigando DMOADs, nenhum dos referidos trata- mentos foi aprovado até agora (El Bakali et a/., 2014 Future Medicinal Chemistry (Review) 6:1399).

[009] Em vista do sucesso da terapia biológica direcionada usando anticorpos ("Abs"), houve interesse no desenvolvimento de estratégias terapêuticas similares para OA. Um estudo do anticorpo monoclonal Rottapharm (mAb) CRBO017, direcionado contra o domí- nio espaçador de ADAMTSS5, mostrou que em camundongos, a admin- istração intra-articular deste mAb previniu de forma significativa a pro- gressão da doença de uma forma dose-dependente (Chiusaroli et al., 2013 Osteoarthritis Cartilage 21:1807). Não houve comparação com a administração sistêmica, nem ela foi avaliada até que grau o mAb vazou do espaço sinovial. Um outro estudo usou a administração sis- têmica do mAb 12F4 em camundongos, que demostraram tanto modi- ficação estrutural da doença, quanto alívio do comportamento relativo à dor (Miller et al., 2014 Osteoarthritis Cartilage 22iii, S35). No entanto, uma única administração de mAb 12F4 em macaco cinomolgo causou hemorragia focal, uma pressão arterial media aumentada dose- dependente e anormalidades na condutância cardíaca (mais especifi- camente, elevações de ST e arritmias ventriculares no ECG) indicando isquemia cardíaca, que foram sustentados por até 8 meses depois da administração da única dose (Larkin et a/., 2014 Osteoarthritis Carti- lage 22iii, S483). Esses efeitos colaterais também paralisaram o desenvolvimento clínico de mAb 12F4.

[0010] WOZ2008/074840 no nome de Ablynx NV descreve a geração de Nanobodies& contra membros da família da desintegrina À e metaloproteinases (ADAM), incluindo ADAMTSS5.

[0011] As intervenções terapêuticas nas articulações também fo- ram impedidas pela dificuldade de direcionar fármacos na cartilagem articular. Já que a cartilagem articular é um tecido avascular e não lin- fático, as vias tradicionais de liberação de fármacos (oral, intravenosa, intramuscular) geralmente se sustenta na transferência transinovial de fármacos dos capilares sinoviais para a cartilagem através da difusão passiva. Isto agilizou o desenvolvimento da liberação intra-articular (IA) de medicamentos.

[0012] Por outro lado, a liberação IA de proteínas terapêuticas foi limitada pela rápida depuração do espaço articular e falta de retenção dentro da cartilagem; e restrição a articulações grandes. O tempo de residencia sinovial de um fármaco na articulação é de menos de 24 h (Edwards 2011 Vet J 190:15-21; Larsen et al. 2008 J Pham Sci 97:4622-4654). Devido à rápida depuração da maioria dos fármacos IA injetados, injeções frequentes seriam necessárias para manter uma concentração eficaz (Owen et al., 1994 Br J Clin Pharmacol 38:349- 355). Além do mais, a liberação IA de proteínas terapêuticas não é praticamente possível para pequenas articulações, o que dificulta o tratamento de por exemplo OA-dedos.

[0013] Permanece aí uma necessidade por DMOADs eficazes.

3. SUMÁRIO DA INVENÇÃO

[0014] A presente invenção visa fornecer polipeptídeos contra OA com propriedades profiláticas, terapêuticas e/ou farmacológicas, além de outras propriedades vantajosas (tais como, por exemplo, melhor facilidade de preparação, boa estabilidade, e/ou custos reduzidos dos insumos), compara com sequências de aminoácido e anticorpos da técnica anterior. Em particular, a presente invenção visa fornecer polipeptídeos que inibem ADAMTS e especialmente inibem ADAMTSS5.

[0015] As ADAMs, ADAMTSs e MMPs compartilham um sítio de ligação à agrecan que é muito similar tanto em sequência quanto no formato geral. Já que vários outros membros da família ADAM (inclu- indo TACE) e ADAMTS que têm diversos papéis na fisiologia estão fortemente associados com muitas condições patológicas comuns, in- cluindo asma, artrite, câncer, distúrbios do tecido conectivo ou púrpura trombocitopênica trombótica (El Bakali et al., supra), os inventores apreciaram a importância de preservar a seletividade. De modo a efetivamente silenciar apenas a atividade de ADAMTSS, direcionar o domínio catalítico pareceu ser a melhor opção. No entanto, os domí- nios catalíticos de ADAMTS4 e ADAMTSS5 compartilham um alto grau de similaridade sequencial (cf. El Bakali et al., supra). Além disso, as- sume-se que a alta conservação de sequência do domínio catalítico entre várias espécies prevê uma resposta imunológica robusta.

[0016] De forma surpreendente, os ISVDs da invenção satisfazem essas duas exigências aparentemente mutuamente exclusivas de in- ibição da atividade (enzimática) de ADAMTSSB5 por um lado, enquanto preserva a seletividade por outro lado.

[0017] Vários ISVDs monovalentes da presente invenção foram equipotentes ao anticorpo convencional bivalente mAb 12F4 H4LO em um ensaio enzimático AlphaLISA. Além disso, os ISVDs da presente invenção também foram equipotentes ao anticorpo convencional biva- lente mAb12F4 H4LO em alta ou ainda excessiva concentração do substrato agrecan, o qual é reminiscente das articulações. Por outro lado, em um ensaio de explante bovino ex vivo, que se assemelha a condições mais estreitamente fisiológicas, a maioria dos ISVDs mono- valentes teve um melhor ICso do que o mAb 12F4 H4LO comparador ("12F4") e MmAb CRBO0017 da Rottapharm. Em um ensaio de explante humano ex vivo, os ISVDs da presente invenção também foram subs- tancialmente melhores do que o anticorpo convencional da técnica an-

terior CRBOO017, conforme demonstrado por ICso.

[0018] Depois da engenharia adicional dos ISVDs em vista de vá- rias características diversas e favoráveis, incluindo estabilidade, afini- dade e atividade inibidora assim como minimizando a imunogenicida- de, esses ISVDs foram avaliados a seguir in vivo.

[0019] A administração sistêmica dos ISVDs da presente invenção demonstrou a potente inibição da atividade de agrecanase in vivo con- forme avaliado em macaco cinomolgo. Além disso, os ISVDs também foram seguros para usar, em contraste com o anticorpo 12F4 da téc- nica anterior. Além disso em um modelo de desestabilização meniscal mediano do camundongo in vivo (DMM), os ISVDs da presente inven- ção mostraram um benefício estrutural de até 50% para ambos o tra- tamento profilático ou terapêutico através da administração sistêmica. O tratamento precoce com os ISVDs da presente invenção causou um benefício sintomático dependente de dose, significativo e relevante durante a transecção e ressecção do ligamento cruzado anterior do menisco medial (ACLT + tMx) com AO induzida em ratos.

[0020] Os ISVDs são eventualmente destinados a inibir ADAMTS5 nas articulações e com isso precisarão resistir as condições de fluido sinovial nas articulações, que contêm várias proteases. Em seguida às características favoráveis acima, mostrou-se que os ISVDs isolados eram extremamente estáveis no fluido sinovial. Prevê-se que esta es- tabilidade permita um regime de dosagem menos frequente.

[0021] Consequentemente, a presente invenção se refere a um polipeptídeo compreendendo pelo menos um domínio variável único de imunoglobulina 1 (ISVD) ligando uma desintegrina A e metalopro- teinase com motivos trombospondina (ADAMTS), preferivelmente em que o referido ADAMTS é escolhido a partir do grupo consistindo em ADAMTS1 - ADAMTS19, preferiveimente ADAMTS5, ADAMTSA, ADAMTS1, ADAMTS8, ADAMTS9 e ADAMTS15 e ADAMTS?2O, ainda mais preferivelmente ADAMTS5. Em um aspecto, a invenção se refere a um polipeptídeo conforme descrito no presente documento, em que o referido ISVD ligando ADAMTS, preferivelmente ADAMTSS5 não liga ADAMTSA4 , MMP1 ou MMP14.

[0022] Em um aspecto ainda preferido, a invenção se refere a um polipeptídeo conforme descrito no presente documento, em que o refe- rido ISVD que liga especificamente ADAMTSS5 essencialmente consis- te em 4 regiões framework (FR1 a FRA, respectivamente) e 3 regiões determinantes de complementariedade (CDR1 a CDR3 respectiva- mente), nas quais (i) CDR1 é escolhida a partir do grupo consistindo na SEQ ID NOs: 21, 35, 20, 22, 25, 33, 28, 24, 23, 26, 27, 29, 30, 31, 32 e 34; e sequências de aminoácido que têm 1, 2 ou 3 diferença(s) do aminoácido com a SEQ ID NOs: 21, 35, 20, 22, 25, 33, 33, 28, 24, 23, 26, 27, 29, 30, 31, 32 e 34; (ii) CDR2 é escolhido a partir do grupo consistindo em SEQ ID NOs: 37, 53, 36, 40, 50, 51, 44, 45, 43, 39, 38, 41, 119, 42, 46, 47, 48, 49 e 52; e sequências de aminoácido que têm 1, 2 ou 3 diferença(s) do aminoácido com a SEQ ID NOs: 37, 53, 36, 40, 50, 51, 44, 45, 43, 39, 38, 41, 119, 42, 46, 47, 48, 49 e 52; e (il) CDR3 é escolhida a partir do grupo consistindo na SEQ ID NO: SEQ ID NOs: 55, 118, 71, 54, 58, 68, 69, 62, 63, 61, 57, 56, 59, 60, 64, 65, 66, 67 e 70; e sequências de aminoácido que têm 1, 2, 3 ou 4 diferen- ça(s) do aminoácido com SEQ ID NOs: 55, 118, 71, 54, 58, 68, 69, 62, 63, 61, 57, 56, 59, 60, 64, 65, 66, 67 e 70.

[0023] Em um aspecto ainda preferido, a invenção se refere a um polipeptídeo conforme descrito no presente documento, em que o refe- rido ISVD que liga especificamente ADAMTSS5 essencialmente consis- te em 4 regiões framework (FR1 a FRA, respectivamente) e 3 regiões determinantes de complementariedade (CDR1 a CDR3 respectiva- mente), nas quais (1) CDR1 é escolhida a partir do grupo consistindo em (a) SEQ ID NO: 22; e (b) sequência de aminoácido que tem 1,2,3,

4, 5 ou 6 diferença(s) do aminoácido com a SEQ ID NO: 22, em que na posição 2 o S foi alterado para R; na posição 3 o A foi alterado para T; na posição 4 o V foi alterado para F; na posição 6 o V foi alterado para S; na posição 7 o N foi alterado para Y; e/ou na posição 10 o A foi alterado para G; (ii) CDR2 é SEQ ID NO: 36; e (iii) CDR3 é SEQ ID NO: 54.

[0024] Em um aspecto ainda preferido, a invenção se refere a um polipeptídeo conforme descrito no presente documento, em que o refe- rido ISVD que liga especificamente ADAMTSSB5 essencialmente consis- te em 4 regiões framework (FR1 a FRA, respectivamente) e 3 regiões determinantes de complementariedade (CDR1 a CDR3 respectiva- mente), nas quais (i) CDR1 é SEQ ID NO: 33; (ii) CDR2 é escolhida a partir do grupo consistindo em (c) SEQ ID NO: 50; e (d) sequência de aminoácido que tem 1, 2 ou 3 diferença(s) do aminoácido com a SEQ ID NO: 50, em que na posição 8 o M foi alterado para |; na posição 9 o P foi alterado para T; e/ou na posição 10 o Y foi alterado para F; e (iii) CDR3 é escolhida a partir do grupo consistindo em (e) SEQ ID NO: 68; e (f) sequência de aminoácido que tem 1 ou 2 diferença(s) do aminoá- cido com a SEQ ID NO: 68, em que na posição 5 o F foi alterado para L; e/ou na posição 11 o D foi alterado para E.

[0025] Em um aspecto ainda preferido, a invenção se refere a um polipeptídeo conforme descrito no presente documento, em que o refe- rido ISVD que liga especificamente ADAMTSSB5 essencialmente consis- te em 4 regiões framework (FR1 a FRA, respectivamente) e 3 regiões determinantes de complementariedade (CDR1 a CDR3 respectiva- mente), nas quais (i) CDR1 é SEQ ID NO: 28; (ii) CDR2 é escolhida a partir do grupo consistindo em (c) SEQ ID NO: 44; e (d) sequência de aminoácido que tem 1, 2 ou 3 diferença(s) do aminoácido com a SEQ ID NO: 44, em que na posição 3 o S foi alterado para T; na posição 4 o R foi alterado para W; na posição 8 o T foi alterado para |; e/ou na po-

sição 9 o T foi alterado para L; e (iii) CDR3 é escolhido a partir do gru- po consistindo em (e) SEQ ID NO: 62; e (f) sequência de aminoácido que tem 1 ou 2 diferença(s) do aminoácido com a SEQ ID NO: 62, em que na posição 1 o G foi alterado para S; e/ou na posição 14 o D foi alterado para E.

[0026] Em modalidades preferidas de todos os aspectos da inven- ção um domínio variável único de imunoglobulina (ISVD) de acordo com a invenção preferivelmente consiste em ou essencialmente con- siste em 4 regiões framework (FR1 a FRA, respectivamente) e 3 regi- ões determinantes de complementariedade CDR1, CDR2 e CDR3 con- forme apresentadas no presente documento acima e abaixo. As se- quências framework preferidas são divulgadas por exemplo na tabela A-2 abaixo e pode ser usada em um ISVD da invenção. Preferivelmen- te, as CDRs apresentadas na Tabela A-2 correspondem às respecti- vas regiões framework do mesmo construto de ISVD.

[0027] Em um aspecto ainda preferido, a invenção se refere a um polipeptídeo conforme descrito no presente documento, em que o re- ferido ISVD é escolhido a partir do grupo de ISVDs, em que: CDR1 é escolhida a partir do grupo consistindo na SEQ ID NOs: 21, 35, 20, 22, 25, 33, 28, 24, 23, 26, 27, 29, 30, 31, 32 e 34; CDR?2 é escolhida a par- tir do grupo consistindo na SEQ ID NOs: 37, 53, 36, 40, 50, 51, 44, 45, 43, 39, 38, 41, 119, 42, 46, 47, 48, 49 e 52; e CDR3 é escolhida a par- tir do grupo consistindo na SEQ ID NOs: 55, 118, 71, 54, 58, 68, 69, 62, 63, 61, 57, 56, 59, 60, 64, 65, 66, 67 e 70.

[0028] Em um aspecto ainda preferido, a invenção se refere a um polipeptídeo conforme descrito no presente documento, em que o re- ferido ISVD é escolhido a partir do grupo de ISVDs, em que: CDR1 é SEQ ID NO: 21, CDR2 é SEQ ID NO: 37 e CDR3 é SEQ ID NO: 55; CDR1 é SEQ ID NO: 35, CDR2 é SEQ ID NO: 53 e CDR3 é

SEQ ID NO: 118;

CDR1 é SEQ ID NO: 35, CDR2 é SEQ ID NO: 53 e CDR3 é SEQ ID NO: 71;

CDR1 é SEQ ID NO: 20, CDR2 é SEQ ID NO: 36 e CDR3 é SEQ ID NO: 54;

CDR1 é SEQ ID NO: 22, CDR2 é SEQ ID NO: 36 e CDR3 é SEQ ID NO: 54;

CDR1 é SEQ ID NO: 25, CDR2 é SEQ ID NO: 40 e CDR3 é SEQ ID NO: 58;

CDR1 é SEQ ID NO: 33, CDR2 é SEQ ID NO: 50 e CDR3 é SEQ ID NO: 68;

CDR1 é SEQ ID NO: 33, CDR2 é SEQ ID NO: 51 e CDR3 é SEQ ID NO: 69;

CDR1 é SEQ ID NO: 28, CDR2 é SEQ ID NO: 44 e CDR3 é SEQ ID NO: 62;

CDR1 é SEQ ID NO: 28, CDR2 é SEQ ID NO: 45 e CDR3 é SEQ ID NO: 63;

CDR1 é SEQ ID NO: 28, CDR2 é SEQ ID NO: 43 e CDR3 é SEQ ID NO: 61;

CDR1 é SEQ ID NO: 24, CDR2 é SEQ ID NO: 39 e CDR3 é SEQ ID NO: 57;

CDR1 é SEQ ID NO: 23, CDR2 é SEQ ID NO: 38 e CDR3 é SEQ ID NO: 56;

CDR1 é SEQ ID NO: 26, CDR2 é SEQ ID NO: 41 e CDR3 é SEQ ID NO: 59;

CDR1 é SEQ ID NO: 27, CDR2 é SEQ ID NO: 119 e CDR3 é SEQ ID NO: 60;

CDR1 é SEQ ID NO: 27, CDR2 é SEQ ID NO: 42 e CDR3 é SEQ ID NO: 60;

CDR1 é SEQ ID NO: 29, CDR2 é SEQ ID NO: 46 e CDR3 é

SEQ ID NO: 64; CDR1 é SEQ ID NO: 30, CDR2 é SEQ ID NO: 47 e CDR3 é SEQ ID NO: 65; CDR1 é SEQ ID NO: 31, CDR2 é SEQ ID NO: 48 e CDR3 é SEQ ID NO: 66; CDR1 é SEQ ID NO: 32, CDR2 é SEQ ID NO: 49 e CDR3 é SEQ ID NO: 67; e CDR1 é SEQ ID NO: 34, CDR2 é SEQ ID NO: 52 e CDR3 é SEQ ID NO: 70.

[0029] Em um aspecto ainda preferido, a invenção se refere a um polipeptídeo conforme descrito no presente documento, no qual CDR1 é SEQ ID NO: 21, CDR2 é SEQ ID NO: 37 e CDR3 é SEQ ID NO: 55.

[0030] Em um aspecto ainda preferido, a invenção se refere a um polipeptídeo conforme descrito no presente documento, no qual o refe- rido ISVD é escolhido a partir do grupo consistindo em SEQ ID NO:s 2, 116, 19, 1, 3, 6, 16, 17, 10, 11, 9, 5, 4, 7, 8, 117, 12, 13, 14, 15 e 18.

[0031] Em um aspecto ainda preferido, a invenção se refere a um polipeptídeo conforme descrito no presente documento, em que o refe- rido polipeptídeo se liga a ADAMTS5 com um Kp entre 11º M e 1573 M, tal como entre 15º M e 165? M, preferivelmente no máximo 1Eº7 M, preferivelmente menor do que 1Eº8 M ou 16º M, ou ainda menor do que 1Eº M, tal como 5E** M, 4E* M, 3E M, 2E M, 1.7E" M, 1E! M, ou ainda 5E? M, 4E2? M, 3E? M, 152 M, por exemplo con- forme determinado por KinExA, ou alternadamente por Gyrolab.

[0032] Em um aspecto ainda preferido, a invenção se refere a um polipeptídeo conforme descrito no presente documento, em que o refe- rido polipeptídeo inibe uma atividade de ADAMTS5 com um ICrso entre 1Eº M e 1E? M, tal como entre 15º M e 15º M, por exemplo con- forme determinado pelo ensaio FRET humano ou AIlphaLISA humano.

[0033] Em um aspecto ainda preferido, a invenção se refere a um polipeptídeo conforme descrito no presente documento, em que o refe- rido polipeptídeo inibe uma atividade (enzimática) de ADAMTS5 com um IC5o de no máximo 16º M, preferivelmente 1Eºº M, 5Eº M, ou 4Eº M, 3Eº M, 2Eº M, tal como 165º M.

[0034] Em um aspecto ainda preferido, a invenção se refere a um polipeptídeo conforme descrito no presente documento, em que o refe- rido polipeptídeo modula ADAMTS5 com um ECs, entre 11º M e 1E? M, tal como entre 11º M e 1E7! M, por exemplo conforme determina- do pelo ELISA de ligação.

[0035] Em um aspecto ainda preferido, a invenção se refere a um polipeptídeo conforme descrito no presente documento, em que o refe- rido polipeptídeo se liga a ADAMTS5 com uma constante de dissocia- ção de menos do que 16º s, por exemplo conforme determinado por SPR.

[0036] Em um aspecto ainda preferido, a invenção se refere a um polipeptídeo conforme descrito no presente documento, em que o refe- rido ADAMTS5 é ADAMTS5 humano (SEQ ID NO: 149), ADAMTS5 bovino (SEQ ID NO: 150), ADAMTS5 de rato (SEQ ID NO: 151), ADAMTSS5 de porquinho da índia (SEQ ID NO: 152), ADAMTS5 de camundongo, (SEQ ID NO: 153) ou ADAMTSS5 de cinomolgo, (SEQ ID NO: 154), preferivelmente ADAMTS5 humano, ainda mais preferivel- mente SEQ ID NO: 149.

[0037] Em um aspecto ainda preferido, a invenção se refere a um polipeptídeo conforme descrito no presente documento, em que o refe- rido polipeptídeo antagoniza uma atividade de ADAMTSS5, tal como uma atividade de protease, tal como clivagem de agrecan, versican, brevican, neurocan, decorin, e/ou biglican, preferivelmente clivagem de agrecan; preferivelmente antagoniza a atividade de agrecanase de ADAMTSS5.

[0038] Em um aspecto ainda preferido, a invenção se refere a um polipeptídeo conforme descrito no presente documento, em que o refe- rido polipeptídeo bloqueia a ligação de ADAMTSS5 a agrecan em pelo menos 20%, tal como pelo menos 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95% ou ainda mais, por exemplo conforme determinado por FRET, AIplaLISA ou ELISA.

[0039] Em um aspecto ainda preferido, a invenção se refere a um polipeptídeo conforme descrito no presente documento, em que o refe- rido polipeptídeo inibe a atividade da protease de ADAMTSS, tal como inibe a proteólise de um substrato, tal como agrecan, versican, brevi- can, neurocan, decorin, e/ou biglican, preferivelmente agrecan.

[0040] Em um aspecto ainda preferido, a invenção se refere a um polipeptídeo conforme descrito no presente documento, compreen- dendo pelo menos 2 ISVDs, em que pelo menos 1 ISVD especifica- mente liga ADAMTS, preferivelmente ADAMTSSB, preferivelmente es- colhido a partir do grupo consistindo na SEQ ID NO:s 2, 116, 19, 1,3, 6, 16, 17, 10, 11, 9, 5, 4, 7, 117, 8, 12, 13, 14, 15 e 18, preferivelmente em que os referidos pelo menos 2 ISVDs especificamente ligam ADAMTS, preferivelmente ADAMTSSB5.

[0041] Em um aspecto ainda preferido, a invenção se refere a um polipeptídeo compreendendo dois ou mais ISVDs que especificamente ligam ADAMTSS5, em que (a) pelo menos um "primeiro" ISVD especifi- camente liga um primeiro determinante antigênico, epítopo, parte, domínio, subunidade ou conformação de ADAMTSS5; e em que (b) pelo menos a "segundo" ISVD especificamente liga um segundo deter- minante antigênico, epítopo, parte, domínio, subunidade ou con- formação de ADAMTSS, diferente do primeiro determinante antigênico, epítopo, parte, domínio, subunidade ou conformação, respectivamen- te, preferivelmente em que o referido "primeiro" ISVD que liga especifi- camente ADAMTSS é escolhido a partir do grupo consistindo na SEQ ID NO:s 2, 1, 3, 6, 16, 17, 10, 11, 9, 5, 4, 7, 8, 117, 12, 13, 14, 15 e 18,

preferivelmente em que o referido "segundo" ISVD que liga especifi- camente ADAMTS5 é SEQ ID NO: 118 ou 19, ainda mais preferivel- mente o referido polipeptídeo é escolhido a partir do grupo consistindo na SEQ ID NO: 127 (clone 130 049-093-Alb), SEQ ID NO: 126 (clone 129 2F3-093-Alb), SEQ ID NO: 127 (clone 130 049-093-Alb) e SEQ ID NO: 128 (clone 131 9D3-093-Alb).

[0042] Em um aspecto ainda preferido, a invenção se refere a um polipeptídeo conforme descrito no presente documento, compreen- dendo ainda um ISVD que liga albumina do soro, preferivelmente em que o referido ISVD que liga albumina do soro essencialmente consis- te em 4 regiões framework (FR1 a FRA, respectivamente) e 3 regiões determinantes de complementariedade (CDR1 a CDR3 respectiva- mente), nas quais CDR1 é SEQ ID NO: 146, CDR2 é SEQ ID NO: 147, e CDR3 é SEQ ID NO: 148, ainda mais preferivelmente em que o refe- rido ISVD que liga albumina do soro é escolhido a partir do grupo con- sistindo em ALB8 (SEQ ID NO: 131), ALB23 (SEQ ID NO: 132), ALB129 (SEQ ID NO: 133), ALB132 (SEQ ID NO: 134), ALB11 (SEQ ID NO: 135), ALB11 (S112K)-A (SEQ ID NO: 136), ALB82 (SEQ |D NO: 137), ALB82-A (SEQ ID NO: 138), ALB82-AA (SEQ ID NO: 139), ALB82-AAA (SEQ ID NO: 140), ALB82-G (SEQ ID NO: 141), ALB82- GG (SEQ ID NO: 142), ALB82-GGG (SEQ ID NO: 143), ALB92 (SEQ ID NO: 144) e ALB223 (SEQ ID NO: 145), ainda mais preferivelmente em que o referido polipeptídeo é escolhido a partir do grupo consistin- do na SEQ ID NO: 129 (clone 577 2F35º-Alb), SEQ ID NO: 130 (clone 579 2F3 $º-093-AIb), SEQ ID NO: 120 (clone 4 2A12-Alb), SEQ ID NO: 121 (clone 5 2D7-Alb), SEQ ID NO: 122 (clone 6 2F3-Alb), SEQ ID NO: 123 (clone 69 049-Alb), SEQ ID NO: 124 (clone 70 9D3-Alb), SEQ ID NO: 125 (clone 71 3B2-Alb), SEQ ID NO: 126 (clone 129 2F3-093- Alb), SEQ ID NO: 127 (clone 130 049-093-Alb) e SEQ ID NO: 128 (clone 131 9D3-093-Alb).

[0043] Em um aspecto ainda preferido, a invenção se refere a um polipeptídeo conforme descrito no presente documento, compreen- dendo ainda pelo menos um ISVD que liga especificamente agrecan, preferivelmente escolhido a partir do grupo consistindo na SEQ ID NO: 156 (Nanocorpo 00745 PEA114F08) e SEQ ID NO: 157 (Nanocorpo 00747 PEA6O4FO02).

[0044] Em um aspecto ainda preferido, a invenção se refere a um polipeptídeo conforme descrito no presente documento, compreen- dendo pelo menos 2 ISVDs especificamente ligando agrecan, em que o referido pelo menos 2 ISVDs especificamente ligando agrecan pode ser o mesmo ou diferente, preferivelmente em que os referidos pelo menos 2 ISVDs especificamente ligando agrecan são independente- mente escolhidos a partir do grupo consistindo na SEQ ID NOs: 156 e 157, ainda mais preferivelmente em que o referido ISVD que liga es- pecificamente agrecan, especificamente liga a agrecan hunano [SEQ ID NO: 155]. Preferivelmente, o referido ISVD que liga especificamente agrecan, especificamente liga agrecan de cachorro (vide também a tabela 2), agrecan bovino, agrecan de rato; agrecan de porco; agrecan de camundongo, agrecan de coelho; agrecan de cinomolgo e/ou agre- can de reso. Preferivelmente, o referido ISVD que liga especificamente agrecan preferivelmente se liga ao tecido cartilaginoso tal como carti- lagem e/ou menisco.

[0045] Em um aspecto ainda preferido, a invenção se refere a um polipeptídeo conforme descrito no presente documento, em que o refe- rido polipeptídeo tem uma estabilidade de pelo menos 7 dias, tal como 14 dias, 21 dias, 1 mês, 2 meses ou ainda 3 meses em fluido sinovial (SF) a 37 ºC.

[0046] Em um aspecto ainda preferido, a invenção se refere a um polipeptídeo conforme descrito no presente documento, em que os re- feridos pelo menos dois ISVDs são diretamente ligados um ao outro ou são ligados através de um ligante, preferivelmente o referido ligante é escolhido a partir do grupo consistindo na SEQ ID NOs: 158 a 174 (is- to é SEQ ID NO: 158, 159, 160, 161, 162, 163, 164, 165, 166, 167, 168, 169, 170, 171, 172, 173 e 174), preferivelmente SEQ ID NO: 169.

[0047] Em um aspecto ainda preferido, a invenção se refere a um polipeptídeo conforme descrito no presente documento, compreen- dendo ainda uma extensão C-terminal, preferivelmente em que a refe- rida extensão C-terminal é uma extensão C-terminal (X)n , na qual n é 1a 10, preferivelmente 1 a 5, tal como 1, 2, 3, 4 ou 5 (e preferivelmen- te 1 ou 2, tal como 1); e cada X é um resíduo de aminoácido (preferiv- elmente de ocorrência natural) que é independentemente escolhido, e preferivelmente independentemente escolhido a partir do grupo con- sistindo em alanina (A), glicina (G), valina (V), leucina (L) ou isoleucina (1).

[0048] Em um aspecto ainda preferido, a invenção se refere a um polipeptídeo conforme descrito no presente documento, em que o refe- rido polipeptídeo tem pelo menos 80%, 90%, 95% ou 100% de identi- dade sequencial com qualquer uma das SEQ ID NOs: 1-19 (isto é, SEQ ID NO: 1, 2, 3,4,5,6,7,8,9,10, 11,12, 13, 14, 15, 16, 17, 18 e 19), 116-117 ou 120-130 (isto é, SEQ ID NOs: 120, 121, 122, 123, 124, 125, 126, 127, 128, 129 e 130).

[0049] Em um aspecto ainda preferido, a invenção se refere a um método de tratamento e/ou prevenção de doenças ou distúrbios em um indivíduo, por exemplo no qual a atividade de ADAMTSS5 está en- volvida, o método compreendendo administrar o polipeptídeo de acor- do com qualquer uma das reivindicações 1 a 43 ao referido indivíduo em uma quantidade eficaz para tratar ou prevenir um sintoma da refe- rida doença ou distúrbio, preferivelmente em que as referidas doenças ou distúrbios são escolhidos a partir do grupo consistindo em artropa- tias e condrodistrofias, doença artrítica, tais como osteoartrite, artrite reumatoide, artrite gotosa, artrite psoriática, ruptura ou desligamento traumático, acondroplasia, costocondrite, displasia espondiloepimeta- fisária, hernia de disco espinhal, doença degenerativa do disco lombar, doença degenerativa das articulações e policondrite recidivante, oste- ocondrite dissecante e agrecanopatias. Mais preferivelmente, a referi- da doença ou distúrbio é ainda mais preferivelmente osteoartrite.

[0050] Em um aspecto ainda preferido, a invenção se refere a um polipeptídeo conforme descrito no presente documento, para uso co- mo um medicamento.

[0051] Em um aspecto ainda preferido, a invenção se refere a um polipeptídeo conforme descrito no presente documento, para uso no tratamento ou prevenção de um sintoma de uma doença associada com ADAMTSS, tal como por exemplo artropatias e condrodistrofias, doença artrítica, tais como osteoartrite, artrite reumatoide, artrite goto- sa, artrite psoriática, ruptura ou desligamento traumático, acondropla- sia, costocondrite, displasia espondiloepimetafisária, hernia de disco espinhal, doença degenerativa do disco lombar, doença degenerativa das articulações e policondrite recidivante, osteocondrite dissecante e agrecanopatias. Mais preferivelmente, a referida doença é uma doen- ça artrítica e ainda mais preferivelmente osteoartrite.

[0052] Em um aspecto ainda preferido, a invenção se refere a um polipeptídeo conforme descrito no presente documento, em que o re- ferido polipeptídeo bloqueia de forma cruzada a ligação ao ADAMTS5 de pelo menos um dos polipeptídeos representados por qualquer uma das SEQ ID NO:s 2, 116, 19, 1, 3, 6, 16, 17, 10, 11, 9, 5, 4, 7, 117,8, 12, 13, 14, 15 e 18, e/ou é bloqueado de forma cruzada a partir da li- gação ao ADAMTSS5 por pelo menos um polipeptídeo representado por qualquer uma das SEQ ID NO:s 2, 116, 19, 1, 3, 6, 16, 17, 10, 11,9,5, 4,7, 117, 8, 12,13, 14, 15 e 18.

[0053] Em um aspecto ainda preferido, a invenção se refere a um polipeptídeo bloqueando de forma cruzada a ligação ao ADAMTSS5 por um polipeptídeo representado por qualquer uma das SEQ ID NO:s 2, 116, 19, 1, 3, 6, 16, 17, 10, 11, 9, 5, 4, 7, 117, 8, 12, 13, 14, 15 e 18, e/ou é bloqueado de forma cruzada a partir da ligação ao ADAMTS5 por pelo menos um polipeptídeo representado por qualquer uma das SEQ ID NO:s 2, 116, 19, 1, 3, 6, 16, 17, 10, 11, 9, 5, 4, 7, 117, 8, 12, 13, 14, 15 e 18, em que o referido polipeptídeo compreende pelo me- nos um VH, VL, dAb, domínio variável único de imunoglobulina (ISVD) especificamente se ligando ao ADAMTS5, em que a ligação ao ADAMTSS5 modula uma atividade de ADAMTSS.

[0054] Outros aspectos, vantagens, aplicações e usos dos polipep- tídeos e composições se tornarão claros a partir da divulgação adicio- nal no presente documento. Vários documentos são citados ao longo do texto deste relatório descritivo. Cada um dos documentos citados no presente documento (incluindo todas as patentes, pedidos de pa- tente, publicações científicas, especificações de fabricante, instruções, etc.), seja supra ou infra, são aqui incorporadas a título de referência em sua totalidade. Nada no presente documento deve ser interpretado como uma aceitação de que a invenção não está autorizada a anteci- par a referida divulgação em virtude da invenção anterior.

4. LEGENDAS DAS FIGURAS Figura 1: ISVDs que ligam ADAMTSSB5 não inibem a ativida- de de MMP1 (A) ou MMP14 (B).

Figura 2: ISVDs que ligam ADAMTSS5 não inibem a ativida- de de ADAMTS4 Figura 3: os níveis de ligação do anticorpo preexistente (preAb) ao construto de nanocorpo 581 (A) e construto de nanocorpo 579 (B) a partir de 3 conjuntos de amostra de doadores derivados a partir de: indivíduos saudáveis, indivíduos com osteoartrite e doadores com ligação do preAb residual.

Figura 4: Construto de nanocorpo 581 ("C011400581") não se liga a ADAMTS1 humana (A), e não se liga a ADAMTS4 humana ou ADAMTS15 humana (B).

Figura 5: Potência no sistema de explante humano. O acúmulo de GAG no sobrenadante depois de 7 dias é mostrado.

Figura 6: A) Decurso do tempo da liberação de GAG no sobrenadante no sistema de cocultura bovino.

B) Cálculo da área sob a curva (AUC) da liberação de GAG com o tempo (7-28 dias). O número de réplicas n=4. Os dados são mostrados em formato Box &Whiskers com min ao max.

C) Os dados mostram o teor de GAG [ng/mg cartilagem] depois da digestão da papaína. O número de réplicas n=4. Os dados são mostrados em formato Box &Whiskers com min ao max.

Figura 7: Cálculo da área sob a curva (AUC) da liberação de exAGNx1 com o tempo (7-28 dias). O número de réplicas n=4. Os dados são mostrados em formato Box &Whiskers com min ao max.

Figura 8: Cálculo da área sob a curva (AUC) da liberação de C2M com o tempo (7-28 dias). O número de réplicas n=4. Os dados são mostrados em formato Box &Whiskers com min ao max.

Figura 9: Cálculo da área sob a curva (AUC) da liberação de C3M com o tempo (7-28 dias). O número de réplicas n=4. Os dados são mostrados em formato Box &Whiskers com min ao max.

Figura 10: Inibição da atividade da agrecanase em NHP.

Figura 11: Inibição da degeneração da cartilagem. A soma da degeneração média da cartilagem é mostrada no tratamento profilá- tico (A) e terapêutico (B) em um modelo de camundongo DMM.

Figura 12: Comportamento sintomático em um modelo ci- rúrgico de OA em rato.

Figura 13: largura da degeneração da cartilagem tibial me- diana.

Figura 14: O efeito do nanocorpo anti-ADAMTS-5 na de- gradação de agrecan derivada de agrecanase em culturas ex vivo de cartilagem (A, B, C) e coculturas de cartilagem e membrana sinovial (D, E). As concentrações listadas são a concentração do nanocorpo. À análise estatística foi realizada com ANOVA de uma via ou ANOVA de duas vias comum. A significação estatística foi considerada, quando p<0,05.

5. DESCRIÇÃO DETALHADA

[0055] Permanece uma necessidade por medicamentos seguros e eficazes para OA, em particular DMOADs. Esses medicamentos de- vem atender a várias e frequentemente exigências opostas, especial- mente quando um formato amplamente aplicável é pretendido. Assim sendo, o formato deve preferivelmente ser útil em uma ampla gama de pacientes. O formato deve preferivelmente ser seguro e não induzir infecções devido à administração frequente. Além disso, o formato deve preferivelmente ser acessível ao paciente, tal como, o formato deve permitir um regime de dosagem e forma de administração con- venientes, por exemplo administração sistêmica. Por exemplo, prefere- se que o formato não seja removido instantaneamente da circulação mediante a administração. No entanto, a extensão da meia-vida não deve preferivelmente introduzir atividade fora do alvo e efeitos colate- rais ou limitar a eficácia.

[0056] A presente invenção cumpre pelo menos uma dessas ex- igências.

[0057] Com base nas estratégias de rastreamento, caracterização e estratégias combinatórias não convencionais, os presentes invento- res observaram de forma surpreendente que os domínios variáveis únicos da imunoglobulina (ISVDs) funcionaram excepcionalmente bem em experimentos in vitro e in vivo.

[0058] Além do mais, os presentes inventores foram capazes de reengenheirar os ISVDs superando ainda fármacos de comparação na melhora de OA. Além disso, os ISVDs da invenção também demons- traram ser significativamente mais seguros dos que os compostos da técnica anterior.

[0059] A presente invenção pretende prover polipeptídeos que an- tagonizam ADAMTSs em particular ADAMTSS5 com propriedades profi- láticas, terapêuticas e/ou farmacológicas melhoradas incluindo um per- fil mais seguro, comparado às sequências de aminoácido e anticorpos da técnica anterior.

[0060] Consequentemente, a presente invenção se refere a ISVDs e polipeptídeos que são direcionados contra/e ou que especificamente se ligar (conforme definido no presente documento) a ADAMTSS5.

[0061] Consequentemente, a presente invenção se refere a ISVDs e polipeptídeos que são direcionados contra/e ou que especificamente se ligar (conforme definido no presente documento) a ADAMTSs e modular a atividade dos mesmos, em particular um polipeptídeo com- preendendo pelo menos um ISVD que liga especificamente ADAMTSS5, em que a ligação a ADAMTS5 modula uma atividade de ADAMTSS5.

[0062] A menos que indicado ou definido de outra forma, todos os termos usados têm o seu significado comum na técnica, o qual será claro para o versado na técnica. A referência é feita por exemplo aos manuais padrão, tais como Sambrook et al. (Molecular Cloning: A La- boratory Manual (2"º Ed.) Vols. 1-3, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989), F. Ausubel et al. (Current protocols in molecular biology, Green Publishing and Wiley Interscience, New York, 1987), Lewin (Genes |l, John Wiley & Sons, New York, N.Y., 1985), Old et al. (Prin- ciples of Gene Manipulation: An Introduction to Genetic Engineering (2nd edition) University of California Press, Berkeley, CA, 1981); Roitt et al. (Immunology (6" Ed.) Mosby/Elsevier, Edinburgh, 2001), Roitt et al. (Roitt's Essential Imnmunology (10" Ed.) Blackwell Publishing, UK,

2001), and Janeway et al. (Immunobiology (6"" Ed.) Garland Science Publishing/Churchill Livingstone, New York, 2005), assim como toda a técnica antecedente geral citada no presente documento.

[0063] A menos que indicado de outra forma, todos os métodos, etapas, técnicas e manipulações que não são especificamente descri- tas em detalhes podem ser realizados e foram realizados de uma maneira conhecida per se, como ficará claro para o versado na téc- nica. A referência é feita por exemplo aos manuais padrão e a técnica antecedente geral citada no presente documento e às referências adi- cionais citadas no presente documento; assim como por exemplo, as revisões que seguem Presta (Adv. Drug Deliv. Rev. 58 (5-6): 640-56, 2006), Levin and Weiss (Mol. Biosyst. 2(1): 49-57, 2006), Irving et al. (J. Immunol. Methods 248(1-2): 31-45, 2001), Schmitz et al. (Placenta 21 Suppl. A: S106-12, 2000), Gonzales et al. (Tumour Biol. 26(1): 31- 43, 2005), que descrevem técnicas para engenharia das proteínas, tal como maturação por afinidade e outras técnicas para melhorar a es- pecificidade e outras propriedades desejadas das proteínas tais como imunoglobulinas.

[0064] Deve se notar que conforme usado no presente documento, as formas singulares "um", "uma" e "a/o", incluem referências no plural a menos que o contexto claramente indique o contrário. Sendo assim, por exemplo, a referência a "um reagente" inclui um ou mais dos refer- idos diferentes reagentes e a referência ao "método" inclui referência a etapas e métodos equivalentes conhecidos daqueles versados na téc- nica que poderiam ser modificados ou substituídos para os métodos descritos no presente documento.

[0065] A menos que indicado de outra forma, o termo "pelo menos" precedendo uma série de elementos deve ser compreendido por se referir a cada elemento na série. Os versados na técnica reconhecerão, ou serão capazes de determinar a utilização de não mais do que experimentação rotineira, muitos equivalentes às modali- dades específicas da invenção descritas no presente documento. Os referidos equivalentes pretendem estar abrangidos pela presente in- venção.

[0066] O termo "e/ou" quando usado no presente documento inclui o significado de "e", "ou" e "toda ou qualquer outra combinação dos elementos conectados pelo referido termo".

[0067] O termo "cerca de" ou "aproximadamente" conforme usado no presente documento significa dentro de 20%, preferivelmente den- tro de 15%, mais preferivelmente dentro de 10%, e ainda mais pre- ferivelmente dentro de 5% de um dado valor ou faixa.

[0068] Ao longo deste relatório descritivo ou das reivindicações que seguem, a menos que o contexto solicite de outra forma, a palavra "compreendem", e variações tais como "compreende" e "com- preendendo", serão entendidas por implicar na inclusão de qualquer outro número inteiro ou etapa ou grupo de números inteiros ou etapas, mas não a inclusão de qualquer outro número inteiro ou etapa ou grupo ou grupo de inteiros ou etapas. Quando usado no presente doc- umento, o termo "compreendendo" pode ser substituído com o termo "contendo" ou "incluiindo" ou algumas vezes quando usado no presente documento com o termo "tendo".

[0069] O termo "sequência" conforme usado no presente docu- mento (por exemplo em termos como "sequência de imunoglobulina", "sequência de anticorpo", "sequência de domínio variável", "sequência VnHH" ou "sequência de proteínas"), deve em geral ser entendido por incluir tanto a sequência de aminoácidos relevante como as sequênci- as de ácidos nucleicos ou sequências nucleotídicas codificando a mesma, a menos que o contexto necessite de uma interpretação mais limitada.

[0070] Sequências de aminoácido são interpretadas para significar um único aminoácido ou uma sequência não ramificada de dois ou mais aminoácidos, dependendo do contexto. As sequências nucle- otídicas são interpretadas para significar uma sequência não ramiífica- da de 3 ou mais nucleotídeos.

[0071] Aminoácidos são aqueles L-aminoácidos comumente en- contrados em proteínas que ocorrem naturalmente. Resíduos de ami- noácido serão indicados de acordo com o códido de aminoácido pa- drão de três letras ou uma letra. A referência é feita por exemplo à tabela A-2 na página 48 da publicação internacional WO 08/020079. Aquelas sequências de aminoácido contendo D-aminoácidos não devem ser abrangidas por esta definição. Qualquer sequência de ami- noácido que contém aminoácidos modificados pós-translacionalmente pode ser descrita como a sequência de aminoácido que é inicialmente traduzida usando os símbolos mostrados nesta tabela A-2 com as posições modificadas; por exemplo, hidroxilações e glicosilações, po- rém estas modificações não devem ser mostradas explicitamente na sequência de aminoácido. Qualquer peptídeo ou proteína que pode ser expressado como uma ligação modificada na sequência, reticu- lações e caps terminais, ligações non-peptidila, etc., está incluído por esta definição, tudo conforme conhecido na técnica.

[0072] Os termos "proteína", "peptídeo", "proteína/peptídeo" e "polipeptídeo" são usados de forma intercambiável ao longo da divul- gação e cada um tem o mesmo significado para as finalidades desta divulgação. Cada termo se refere a um composto orgânico feito de uma cadeia linear de dois ou mais aminoácidos. O composto pode ter dez ou mais aminoácidos; vinte e cinco ou mais aminoácidos; cinquen- ta ou mais aminoácidos; cem ou mais aminoácidos, duzentos ou mais aminoácidos, e ainda trezentos ou mais aminoácidos. O versado na técnica irá compreender que os polipeptídeos geralmente com- preendem menos aminoácidos do que proteínas, embora não haja ponto de demarcação reconhecido na técnica do número de aminoáci- dos que distingue um polipeptídeo e uma proteína; que polipeptídeos podem ser feitos através da síntese química ou métodos recom- binantes; e que as proteínas são geralmente feitas in vitro ou in vivo através de métodos recombinantes conforme conhecidos na técnica. Por convenção, a ligação amida na estrutura primária dos polipeptíde- os está na ordem de que os aminoácidos são escritos, na qual o ter- minal amina (N-terminal) de um polipeptídeo está sempre no lado es- querdo, enquanto a extremidade ácida (C-terminal) está no lado direito.

[0073] Um ácido nucleico ou sequência de aminoácido é consider- ado como sendo "(forma) (não) (essencialmente) isolada" - por exem- plo, comparado ao meio de reação ou meio de cultivo a partir do qual ele foi obtido — quando ele foi separado de pelo menos um outro com- ponente com o qual ele está geralmente associado na referida fonte ou meio, tal como um outro ácido nucleico, uma outra proteína/ polipep- tídeo, um outro componente biológico ou macromolécula ou pelo menos um contaminante, impureza ou componente menor. Em particu- lar, um ácido nucleico ou sequência de aminoácidois considerado "(essencialmente) isolado" quando ele foi purificado pelo menos 2 vezes, em particular pelo menos 10 vezes, mais em particular pelo menos 100 vezes, e até 1000 vezes ou mais. Um ácido nucleico ou aminoácido que é "forma não (essencialmente) isolada" é preferivel- mente essencialmente homogênea, conforme determinado usando uma técnica adequada, tal como uma técnica cromatográfica ade- quada, tal como eletroforese em gel poliacrilamida.

[0074] Quando a sequência nucleotídica ou sequência de ami- noácido é dita "compreender" uma outra sequência nucleotídica ou sequência de aminoácidos, respectivamente, ou "essencialmente con- sistir em" uma outra sequência nucleotídica ou sequência de ami-

noácidos, isto pode significar que a última sequência nucleotídica ou sequência de aminoácido foi incorporada na primeira sequência nucle- otídica ou sequência de aminoácidos mencionada, respectivamente, porém mais frequentemente isto significa em geral que a primeira se- quência nucleotídica ou sequência de aminoácido mencionada com- preende dentro da sua sequência um trecho de nucleotídeos ou resíduos de aminoácido, respectivamente, que têm a mesma sequên- cia nucleotídica ou sequência de aminoácidos, respectivamente, como a última sequência, independente de como a primeira sequência men- cionada foi de fato gerada ou obtida (o que pode por exemplo ser atra- vés de qualquer método adequado descrito no presente documento). Por meio de um exemplo não limitativo, quando um polipeptídeo da invenção é dito compreender um domínio variável único de imuno- globulina ("ISVD"), isto pode significar que a referida sequência de domínio variável único de imunoglobulina foi incorporada na sequência do polipeptídeo da invenção, porém mais frequentemente isto significa em geral que o polipeptídeo da invenção contém dentro de sua se- quência a sequência dos domínios variáveis únicos de imunoglobulina independente de como o referido polipeptídeo da invenção foi gerado ou obtido.

Além disso, quando uma sequência de ácido nucleico ou sequência nucleotídica é dita compreender uma outra sequência nu- cleotídica, a primeira sequência de ácido nucleico ou sequência nucle- otídica mencionada é preferivelmente tal que, quando ela é expressa- da em um produto de expressão (por exemplo um polipeptídeo), a se- quência de aminoácido codificada pela última sequência nucleotídica forma parte do referido produto de expressão (em outras palavras, que a última sequência nucleotídica está na mesma fase de leitura que a primeira sequência de ácido nucleico ou sequência nucleotídica maior mencionada). Além disso, quando um construto da invenção é dito compreender um polipeptídeo ou ISVD, isto pode significar que o refer-

ido construto pelo menos abranja o referido polipeptídeo ou ISVD, re- spectivamente, porém mais frequentemente isto significa que o refer- ido construto abranja grupos, resíduos (por exemplo resíduos de ami- noácido), porções e/ou unidades de ligação além do referido polipep- tídeo ou ISVD, independente de como o referido polipeptídeo ou ISVD esteja conectado aos referidos grupos, resíduos (por exemplo resíduos de aminoácido), porções e/ou unidades de ligação e independente de como o referido construto foi gerado ou obtido.

[0075] Entende-se por "essencialmente consistir em " que o ISVD usado na invenção tanto é exatamente o mesmo que o ISVD da in- venção ou corresponde a um ISVD da invenção, tendo um número lim- itado de resíduos de aminoácido, tal como 1-20 resíduos de ami- noácido, por exemplo 1-10 resíduos de aminoácido e preferivelmente 1-6 resíduos de aminoácido, tal como 1, 2, 3, 4, 5 ou 6 resíduos de aminoácido, adicionados à extremidade amino terminal, na ex tremidade carbóxi terminal ou em ambas a extremidade amino terminal e carbóxi terminal do ISVD.

[0076] Para finalidades de comparação de duas ou mais sequên- cias nucleotídicas, a porcentagem de "identidade sequencial" entre a primeira sequência nucleotídica e uma segunda sequência nucleotídi- ca pode ser calculada ao se dividir [o número de nucleotídeos na primeira sequência nucleotídica que são idênticos aos nucleotídeos nas posições correspondentes na segunda sequência nucleotídica] pelo [número total de nucleotídeos na primeira sequência nucleotídica] e multiplicá-los por [100%], em que cada deleção, inserção, substitui- ção ou adição de um nucleotídeo na segunda sequência nucleotídica — comparado com a primeira sequência nucleotídica - é considerado como uma diferença em um único nucleotídeo (posição). Alternada- mente, o grau de identidade sequential entre duas ou mais sequências nucleotídicas pode ser calculado usando um algoritmo de computador para alinhamento de sequências tal como NCBI Blast v2.0, usando configurações padrão. Algumas outras técnicas, algoritmos de compu- tador e configurações para determinar o grau de identidade sequencial são por exemplo descritos nos Pedidos de patente publicados WO 04/037999, EP 0967284, EP 1085089, WO 00/55318, WO 00/78972, WO 98/49185 e GB 2357768. Em geral, para a finalidade da determi- nação da porcentagem de "identidade sequencial" entre duas sequên- cias nucleotídicas de acordo com o método de cálculo apresentado acima, a sequência nucleotídica com o maior número de nucleotídeos será tomada como a "primeira" sequência nucleotídica, e a outra se- quência nucleotídica será tomada como a "segunda" sequência nucleo- tídica.

[0077] Para a finalidade de comparação entre duas ou mais se- quências de aminoácido, a porcentagem de "identidade sequencial" entre a primeira sequência de aminoácido e uma segunda sequência de aminoácido (também referida no presente document como "iden- tidade do aminoácido") pode ser calculada ao se dividir [o número de resíduos de aminoácido na primeira sequência de aminoácido que são idênticos aos resíduos de aminoácido nas posições correspondentes na segunda sequência de aminoácido] pelo [número total de resíduos de aminoácido na primeira sequência de aminoácido] e multiplicá-los por [100%], em que cada deleção, inserção, substituição ou adição de um resíduo de aminoácido na segunda sequência de aminoácido- comparado com a primeira sequência de aminoácido- é considerado como uma diferença em um único resíduo de aminoácido (posição), isto é, como uma "diferença de aminoácido" conforme definido no presente documento. Alternadamente, o grau de identidade sequencial entre duas sequências de aminoácido pode ser calculado usando um algoritmo de computador conhecido, tal como aqueles mencionados acima para determinar o grau de identidade sequential para sequênci-

as nucleotídicas, novamente usando configurações padrão. Em geral, para a finalidade de determinação da porcentagem de "identidade se- quencial" entre duas sequências de aminoácido de acordo com o método de cálculo apresentado acima, a sequência de aminoácido com o maior número de resíduos de aminoácido será tomada como a "primeira" sequência de aminoácido, e a outra sequência de ami- noácido será tomada como a "segunda" sequência de aminoácido.

[0078] Além disso, na determinação do grau de identidade se- quencial entre duas sequências de aminoácido, o versado na técnica pode levar em conta as assim chamadas substituições de aminoácido "conservadoras", as quais podem geralmente ser descritas como sub- stituições de aminoácido nas quais um resíduo de aminoácido é sub- stituído com um outro resíduo de aminoácido de estrutura química sim- ilar e que tem pouca ou essencialmente nenhuma influência na função, atividade ou outras propriedades biológicas do polipeptídeo. As refer- idas substituições de aminoácido conservadoras são bem conhecidas na técnica, por exemplo a partir dos pedidos WO 04/037999, GB 335768, WO 98/49185, WO 00/46383 e WO 01/09300; e tipos (prefer- idos) e/ou combinações das referidas substituições podem ser se- lecionados com base nos ensinamentos pertinentes da publicação in- ternacional WO 04/037999 assim como da publicação internacional WO 98/49185 e a partir das referências adicionais citadas nelas.

[0079] As referidas substituições conservadoras são preferivel- mente substituições nas quais um aminoácido dentro dos grupos que seguem (a) - (e) é substituído por um outro resíduo de aminoácido dentro do mesmo grupo: (a) resíduos alifáticos, não polares ou levemente polares pequenos: Ala, Ser, Thr, Pro e Gly; (b) resíduos po- lares, negativamente carregados e suas amidas (não carregadas): Asp, Asn, Glu e Gln; (c) resíduos polares, positivamente carregados: His, Arg e Lys; (d) resíduos não polares, alifáticos grandes: Met, Leu,

Ile, Val e Cys; e (e) resíduos aromáticos: Phe, Tyr e Trp. As substitui- ções conservadoras particularmente preferidas são como a seguir: Ala em Gly ou em Ser; Arg em Lys; Asn em Glh ou em His; Asp em Glu; Cys em Ser; Glh em Asn; Glu em Asp; Gly em Ala ou em Pro; His em Asn ou em Gln; Ile em Leu ou em Val; Leu em lle ou em Val; Lys em Arg, em Glh ou em Glu; Met em Leu, em Tyr ou em lle; Phe em Met, em Leu ou em Tyr; Ser em Thr; Thr em Ser; Trp em Tyr; Tyr em Trp; e/ou Phe em Val, em Ile ou em Leu.

[0080] Qualquer substituição de aminoácido aplicada aos polipep- tídeos descritos no presente documento também pode estar baseada na análise das frequências das variações de aminoácido entre proteínas homológas de diferentes espécies desenvolvidas por Schulz et al. ("Principles of Protein Structure", Springer-Verlag, 1978), nas análises dos potenciais de formação de estrutura desenvolvidos por Chou and Fasman (Biochemistry 13: 211, 1974; Adv. Enzymol., 47: 45- 149, 1978), e na análise dos padrões de hidrofobicidade em proteínas desenvolvidos por Eisenberg et al. (Proc. Natl. Acad Sci. USA 81: 140- 144, 1984), Kyte and Doolittle (J. Molec. Biol. 157: 105-132, 1981), and Goldman et al. (Ann. Rev. Biophys. Chem. 15: 321-353, 1986), todos incorporados no presente documento em sua totalidade a título de referência. A informação sobre a estrutura primária, secundária e terciária dos nanocorpos é dada na descrição no presente document e na técnica antecedente geral citada acima. Além disso, para esta final- idade, a estrutura cristal de um domínio Va de uma lhama é dado por exemplo por Desmyter et a/. (Nature Structural Biology, 3: 803, 1996), Spinelli et a/. (Natural Structural Biology, 3: 752-757, 1996) e Decanni- ere et al. (Structure, 7 (4): 361, 1999). Informação adicional sobre al- guns dos resíduos de aminoácido que em domínios Vx convencionais formam a interface V4/V. e potenciais substituições camelídeas nessas posições podem ser encontradas na técnica anterior citada acima.

[0081] Sequências de aminoácido e sequências de ácido nucleico são ditas como sendo "exatamente as mesmas" caso elas tenham 100% de identidade sequencial (conforme definido no presente docu- mento) sobre o comprimento total.

[0082] Quando se compara duas sequências de aminoácido, o termo "diferença de aminoácido(s)" se refere a uma inserção, deleção ou substituição de um único resíduo de aminoácido em uma posição da primeira sequência, comparado com a segunda sequência; sendo compreendido que as duas sequências de aminoácido podem conter uma, duas ou mais das referidas diferenças de aminoácidos. Mais par- ticularmente, nos ISVDs e/ou polipeptídeos da presente invenção, o termo "amino acid(s) difference" se refere a uma inserção, deleção ou substituição de um único resíduo de aminoácido em uma posição da sequência CDR especificada em b), d) ou f), comparado à sequência CDR de respectivamente a), c) ou e); sendo entendido que a sequên- cia CDR de b), d) e f) pode conter uma, duas, três, quatro ou no máxi- mo cinco das referidas diferenças de aminoácido comparado à se- quência CDR de respectivamente a), c) ou e).

[0083] A "diferença do(s) aminoácido(s)" pode ser qualquer uma, duas, três, quatro ou no máximo cinco substituições, deleções ou in- serções, ou qualquer combinação das mesmas, que tanto melhore as propriedades do aglutinante ADAMTS5 da invenção, tal como o polipeptídeo da invenção ou que pelo menos diminua muito das pro- priedades desejadas ou a partir do equilíbrio ou combinação das pro- priedades desejadas do aglutinante ADAMTSS5 da invenção, tal como o polipeptídeo da invenção. Com relação a isso, o aglutinante ADAMTSSB5 resultante da invenção, tal como o polipeptídeo da in- venção deve pelo menos ligar ADAMTS5 com a mesma, cerca da mesma ou uma afinidade maior comparada com o polipeptídeo com- preendendo uma ou mais sequências CDR sem uma, duas, três,

quatro ou no máximo cinco substituições, deleções ou inserções. À afinidade pode ser medida por qualquer método adequado conhecido na técnica, porém é preferivelmente medido por um método conforme descrito na seção de exemplos.

[0084] Com relação a isso, a sequência de aminoácido das CDRs de acordo com b), d) e/ou f) conforme indicada abaixo, pode ser uma sequência de aminoácido que é derivada de uma sequência de ami- noácido de acordo com a), c) e/ou e) respectivamente por meio de uma maturação de afinidade usando uma ou mais técnicas de matura- ção de afinidade conhecidas per se ou conforme descritas nos Exem- plos. Por exemplo, e dependendo do organism hospedeiro usado para expressar o polipeptídeo da invenção, as referidas deleções e/ou sub- stituições podem ser designadas de uma tal forma que um ou mais sítios para modificação pós-translacional (tal como um ou mais sítios de glicosilação) sejam removidos, conforme estará dentro da capaci- dade do versado na técnica (cf. Exemplos).

[0085] Uma "família de nanocorpo”", "família Vu" ou "família" con- forme usadas no presente relatório descritivo se refere a um grupo de nanocorpos e/ou sequências VH: que têm comprimentos idênticos (isto é, eles têm o mesmo número de aminoácidos dentro da sua sequên- cia) e da qual a sequência de aminoácido entre posição 8 e posição 106 (de acordo com a numeração Kabat) tem uma identidade da se- quência de aminoácido de 89% ou mais.

[0086] Os termos "epítopo" e "determinante antigênico", que pode ser usado de forma intercambiável, se referem à parte de uma macro- molécula, tal como um polipeptídeo ou proteína que é reconhecida pe- las moléculas de ligação ao antígeno, tais como imunoglobulinas, anti- corpos convencionais, domínios variáveis únicos de imunoglobulina e/ou polipeptídeos da invenção, e mais particularmente pelo sítio de ligação ao antígeno das referidas moléculas. Os epítopos definem o sítio de ligação mínimo para uma imunoglobulina, e assim represen- tam o alvo de especificidade de uma imunoglobulina.

[0087] A parte de uma molécula de ligação ao antígeno (tal como uma imunoglobulina, um anticorpo convencional, um domínio variável único de imunoglobulina e/ou um polipeptídeo da invenção) que reconhece o epítopo é chamado um "paratopo".

[0088] Uma sequência de aminoácido (tal como um domínio variá- vel único de imunoglobulina, um anticorpo, um polipeptídeo da inven- ção, ou geralmente uma proteína de ligação ao antígeno ou polipeptí- deo ou um fragmento do mesmo) que pode se "ligar a" ou "especifica- mente se ligar a", que "tem afinidade por" e/ou que "tem especificidade por" um certo epítopo, antígeno ou proteína (ou por pelo menos uma parte, fragmento ou epítopo do mesmo) é dita ser "contra" ou "direcio- nada contra" o referido epítopo, antígeno ou proteína ou é uma molé- cula de "ligação" com relação ao referido epítopo, antígeno ou proteí- na, ou é dita ser "anti"-epítopo, "anti"-antígeno ou "anti"-proteína (por exemplo, "anti"- ADAMTSS5).

[0089] A afinidade denota a resistência ou estabilidade de uma interação molecular. A afinidade é comumente dada como a Kp, ou constante de dissociação, que tem unidades de mol/litro (ou M). A afi- nidade também pode ser expressada como uma constante de associ- ação, Ka, a qual equivale a 1/Kp e tem unidades de (mol/litro)* (ou M' 1). No presente relatório descritivo, a estabilidade da interação entre duas moléculas será principalmente expressada em termos do valor de Kp da sua interação; sendo claro para o versado na técnica que em vista da relação Ka =1/Kp, especificando a força da interação molecu- lar pelo seu valor de Kp também pode ser usado para calcular o valor de Ka correspondente. O valor de Kp caracteriza a força de uma intera- ção molecular também em um sentido termodinâmico uma vez que ele está relacionado à mudança de energia livre (DG) de ligação pela rela-

ção DG=RT.In(Ko) bem conhecida (equivalentemente DG=-RT.In(Ka)), onde R equivale à constante de gás, T equivale à temperatura absolu- ta e In denota o logaritmo natural.

[0090] O Kp para interações biológicas os quais são considerados significativos (por exemplo, específicos) estão tipicamente na faixa de 102 M (0,001 nM) a 10º M (10000 nM). Quanto mais forte é uma inte- ração, menor é a sua Ko.

[0091] A Kp também pode ser expressada como a razão da cons- tante de dissociação de um complexo, denotado como kor, até a faixa de sua associação, denotada kKkon (de forma que Kp =kot/Kon E Ka = Kon/Kotr). A taxa de dissociação kor tem unidades s* (onde s é a notação de segundo da unidade SI). A taxa de associação kon tem unidades M' 181, A taxa de associação pode variar entre 10º Ms até cerca de 107 Ms”, aproximação da constante da taxa de associação limitada por difusão para interações bimoleculares. A taxa de dissociação está re- lacionada à meia-vida de uma dada interação molecular pela relação tin=In(2)/Kotr . A taxa de dissociação pode variar entre 108 s (próximo do complexo irreversível com um t12 de múltiplos dias) a 1 s (ti2=0,69 s).

[0092] A ligação específica de uma proteína de ligação ao antíge- no, tal como um ISVD, a um antígeno ou determinante antigênico pode ser determinada de qualquer maneira conhecida per se, incluindo, por exemplo, ensaios de ligação à saturação e/ou ensaios de ligação competitivos, tais como radioimunoensaios (RIA), imunoensaios enzi- máticos (EIA) e ensaios de competição sanduichados, e as diferentes variantes das mesmas conhecidas per se na técnica; assim como as outras técnicas mencionadas no presente documento.

[0093] A afinidade de uma interação molecular entre duas molécu- las pode ser medida através de diferentes técnicas conhecidas per se, tais como a técnica biossensorial de ressonância plasmônica de super- fície (SPR) bem conhecida (vide por exemplo Ober et al. 2001, Intern.

Immunology 13: 1551-1559) onde uma molécula é imobilizada no chip biossensor e a outra molécula é passada pela molécula imobilizada sob as condições de fluxo rendendo medições Kon, Kos € com isso valo- res Kp (ou Ka). Isto pode por exemplo ser realizado usando os instru- mentos BIACOREG bem conhecidos (Pharmacia Biosensor AB, Upp- sala, Sweden). O ensaio de exclusão cinética (KINEXAG) (Drake et al. 2004, Analytical Biochemistry 328: 35-43) mede os eventos de ligação em solução sem a marcação dos parceiros de ligação e é baseado na exclusão de forma cinética da dissociação de um complexo. A análise de afinidade em solução também pode ser realizada usando o sistema de imunoensaio GYROLABO, o qual provê uma plataforma para bioa- nálise automatizada e rápida recuperação da amostra (Fraley et al. 2013, Bioanalysis 5: 1765-74), ou ELISA.

[0094] Também ficará claro para o versado na técnica que o Ko medido pode corresponder ao Kp aparente caso o processo de medi- ção influencie de alguma forma a afinidade de ligação intrínseca das moléculas implicadas por exemplo por artefatos relacionados ao reves- timento no biossensor de uma molécula. Além disso, um Kp aparente pode ser medido caso uma molécula contenha mais de um sítio de re- conhecimento para a outra molécula. Na referida situação, a afinidade medida pode ser afetada pela avidez da interação pelas duas molécu- las. Em particular, a medição precisa de Kp pode ser bem trabalhosa e como uma consequência, frequentemente valores de Kp aparentes são determinados para avaliar a força de ligação de duas moléculas. Deve ser notado que à medida que todas as medições são feitas de uma forma consistente (por exemplo, mantendo as condições do ensaio não modificadas) aparentes medições de Kp podem ser usadas como uma aproximação do verdadeiro Kp e assim no presente documento Kp e Kp aparente devem ser tratados com igual importância ou rele- vância.

[0095] O termo "especificidade" se refere ao número de diferentes tipos de antígenos ou determinantes antigênicos aos quais uma molécula de ligação ao antígeno ou proteína de ligação ao antígeno específica (tal como um ISVD ou polipeptídeo da invenção) possa |i- gar. A especificidade de uma proteína de ligação ao antígeno pode ser determinada com base na afinidade e/ou avidez, por exemplo, con- forme descrito nas páginas 53-56 da publicação internacional WO 08/020079 (incorporada no presente documento a título de referência), a qual também descreve algumas técnicas preferidas para medir a ligação entre uma molécula de ligação ao antígeno (tal como um polipeptídeo ou ISVD da invenção) e o antígeno pertinente. Tipicamen- te, as proteínas de ligação ao antígeno (tais como os ISVDs e/ou polipeptídeos da invenção) se ligarão ao seu antígeno com uma con- stante de dissociação (Kp) de 10º a 10? moles/litro ou menos, e pre- ferivelimente 107 a 10? moles/litro ou menos e mais preferivelmente 108 a 10? moles/litro (isto é, com uma constante de associação (Ka) de 10º a 10? litro/ moles ou mais, e preferivelmente 107 a 10"? |li- tro/moles ou mais e mais preferivelmente 108º a 10? litro/moles). Qualquer valor de Ko maior do que 10º mol/litro (ou qualquer valor de Ka menor do que 10º litro/mol) é geralmente considerado para indicar a ligação não específica. Preferivelmente, um ISVC monovalente da in- venção se ligará ao antígeno desejado com uma afinidade de menos de 500 nM, preferivelmente menos de 200 nM, mais preferivelmente menos de 10 nM, tal como menos de 500 pM, tal como por exemplo, entre 10 e 5 pM ou menos. A referência também é feita ao parágrafo n) nas páginas 53-56 da publicação internacional WO 08/020079.

[0096] Um ISVD e/ou polipeptídeo é dito ser "específico para" um (primeiro) alvo ou antígeno comparado a um outro (segundo) alvo ou antígeno quando ele se liga ao primeiro antígeno com uma afinidade (conforme descrita acima, e adequadamente expressada como um valor Kp, valor Ka, taxa Kor e/ou taxa Kon) que é pelo menos 10 vezes, tal como pelo menos 100 vezes, e preferivelmente pelo menos 1000 vezes ou mais do que a afinidade com a qual os ISVD e/ou polipep- tídeo se liga ao segundo alvo ou antígeno. Por exemplo, o ISVD e/ou polipeptídeo pode se ligar ao primeiro alvo ou antígeno com um valor Kp que é pelo menos 10 vezes menor, tal como pelo menos 100 vezes menor, e preferivelmente pelo menos 1000 vezes menor ou ainda menor do que aquele, do que a Kp com a qual o referido ISVD e/ou polipeptídeo se liga ao segundo alvo ou antígeno. Preferivelmente, quando um ISVD e/ou polipeptídeo é "específico para" um primeiro alvo ou antígeno comparado com um segundo alvo ou antígeno, ele é direcionado contra (conforme definido no presente documento) o refer- ido primeiro alvo ou antígeno, porém não direcionado contra o referido segundo alvo ou antígeno.

[0097] A ligação específica de uma proteína de ligação ao antígeno a um antígeno ou determinante antigênico pode ser determi- nada em qualquer maneira adequada conhecida per se, incluindo, por exemplo, ensaios de ligação e/ou ensaios de ligação competitivos, tais como radioimunoensaios (RIA), imunoensaios enzimáticos (EIA) e as diferentes variantes dos mesmos conhecidas na técnica; assim como outras técnicas mencionadas no presente documento.

[0098] Uma abordagem preferida que pode ser usada para avaliar a afinidade é o procedimento ELISA em duas etapas (ensaio imunoab- sorvente ligado à enzima) de Friguet et a/. 1985 (J. Imnmunol. Methods 77: 305-19). Este método estabelece uma medição de equilíbrio de ligação de fase sólida e evita possíveis artefatos em relação à adsor- ção de uma ou mais moléculas em um suporte tal como plástico. Co- mo ficará claro para o versado na técnica, a constante de dissociação pode ser a constante de dissociação real ou aparente. Os métodos para determinar a constante de dissociação ficarão claros para o ver-

sado na técnica, e por exemplo incluem as técnicas mencionadas nas páginas 53-56 da publicação internacional WO 08/020079.

[0099] Finalmente, deve ser notado que em muitas situações o cientista experiente pode julgar ser conveniente determinar a afinidade de ligação relativa a alguma molécula de referência. Por exemplo, para avaliar a força de ligação entre moléculas A e B, pode-se por exemplo usar uma molécula de referência C que é conhecida por se ligara Be que é adequadamente marcada com um grupo fluoróforo ou cromóforo ou outra porção química, tal como biotina para fácil detecção em um ELISA ou FACS (classificação celular ativada fluorescente) ou outro formato (fluoróforo para detecção de fluorescência, o cromóforo para detecção de absorção da luz, a biotina para a detecção ELISA medi- ada por estreptavidina). Tipicamente, a molécula de referência C é mantida em uma concentração fixada e a concentração de A é variada para uma dada concentração ou quantidade de B. Como um resultado, um valor de ICs5o é obtido correspondendo à concentração de A na qual o sinal medido para C na ausência de A é dividido pela metade. Con- tanto que Kp ret, a Ko da molécula de referência, seja mostrada, assim como a concentração total cre: da molécula de referência, a Ko aparente para a interação A-B pode ser obtida a partir da formula que segue: Kp =ICso/(1+Cret/ Korer). Observar que se Cret << Kp ret, Ko = IC5o. Contanto que a medição do ICso seja realizada em uma forma con- sistente (por exemplo, mantendo o cre: fixado) para os aglutinantes que são comparados, a diferença em força ou estabilidade de uma in- teração molecular pode ser avaliada pela comparação do ICso e esta medição é julgada como equivalente a Kp ou a Kp aparente ao longo deste texto.

[00100] A concentração inibidora máxima média (ICs5o) também pode ser uma medida da eficácia de um composto na inibição de uma função biológica ou bioquímica, por exemplo um efeito farmacológico.

Esta medida quantitativa indica quanto do polipeptídeo ou ISVD (por exemplo, um nanocorpo) é necessário para inibir um dado processo biológico (ou componente de um processo, isto é uma enzima, célula, receptor cellular, quimiotaxia, anaplasia, metástase, invasividade, etc.) pela metade. Em outras palavras, ela é a concentração inibidora (IC) máxima média (50%) de uma substância (50% de IC, ou IC5so). Os valores de ICso podem ser calculados para um dado antagonista tal como o polipeptídeo ou ISVD (por exemplo, um nanocorpo) da in- venção ao determinar a concentração necessária para inibir metade da resposta biológica máxima do agonista. A Kp de um fármaco pode ser determinada ao se construir uma curva de dose-resposta e examinar o efeito de diferentes concentrações de antagonista tal como o polipep- tídeo ou ISVD (por exemplo um nanocorpo) da invenção na reversão da atividade agonista.

[00101] O termo concentração eficaz máxima média (ECso) se refere à concentração de um composto que inclui uma resposta no meio entre a linha de base e o máximo depois de um tempo de ex- posição especificado. No presente contexto, ele é usado como uma medida de um polipeptídeo, ISVD (por exemplo, um nanocorpo) da sua potência. O ECso de uma curva de dose resposta graduada repre- senta a concentração de um composto onde 50% do seu efeito máxi- mo é observado. A concentração é preferivelmente expressada em unidades molares.

[00102] Nos sistemas biológicos, pequenas mudanças na concen- tração do ligante tipicamente resultam em mudanças rápidas na re- sposta, seguindo uma função sigmoidal. O ponto de inflecção no qual o aumento na resposta com concentração crescente do ligante começa a diminuir é o ECs5o. Isto pode ser determinado matematica- mente pela derivação da linha melhor ajustada. Confiar em um gráfico para estimativa é conveniente na maior parte dos casos. Caso o EC50o seja provido na seção de exemplos, os experimentos foram designa- dos para refletir a Ko mais precisa possível. Em outras palavras, os valores de EC5o podem ser então considerados como valores de Kr. O termo "Kp médio" se refere ao valor de Ko médio obtido em pelo menos 1, mas preferivelmente mais do que 1, tal como pelo menos 2 experimentos. O termo "médio" se refere ao termo matemático "média" (soma de dados dividida pelo número de itens nos dados).

[00103] Também se refere ao IC5so o qual é uma medida de um composto e sua inibição (50% de inibição). Para ensaios de ligação em competição e ensaios antagonistas funcionais IC5o é a medida de resumo mais comum da curva de dose-resposta. Para os ensaios de agonista/estimulador, a medida de resumo mais comum é o ECro.

[00104] A constante de inibição (Ki) é uma indicação de quão po- tente um inibidor é; ela é a concentração necessária para produzir metade da inibição máxima. Diferente de ICso, que pode mudar de- pendendo das condições experimentais, Ki é um valor absoluto e é frequentemente referido como a constante de inibição de um fármaco. A constante de inibição Ki pode ser calculada ao usar a equação Cheng-Prusoff: Km Es na qual [L] é a concentração fixada do ligante.

[00105] O termo "potência" de um polipeptídeo e/ou ISVD da in- venção, conforme usado no presente documento, é uma função da quantidade de polipeptídeo e/ou ISVD da invenção necessário para o seu efeito específico ocorrer. Ele se refere à capacidade do referido polipeptídeo e/ou ISVD da invenção em modular e/ou parcialmente ou totalmente inibir uma atividade de ADAMTSS5. Mais particularmente, ele pode se referir à capacidade do referido polipeptídeo e/ou ISVD em reduzir ou ainda totalmente inibir uma atividade de ADAMTSS5 con-

forme definido no presente documento. Como tal, ele pode se referir à capacidade do referido polipeptídeo e/ou ISVD em inibir uma atividade de ADAMTSS, tal como uma atividade enzimática, tal como proteólise, por exemplo a atividade da protease e/ou atividades da endopepti- dase, assim como uma ligação de um substrato, incluindo porém sem se limitar a agrecan, versican, brevican, neurocan, decorin, e/ou bigli- can, preferivelmente clivagem de agrecan. O referido polipeptídeo e/ou ISVD preferivelmente antagoniza a atividade da agrecanase de ADAMTSSB. A potência pode ser medida por qualquer ensaio adequado conhecido na técnica ou descrito no presente documento. Conforme usado no presente documento, a "atividade da agrecanase" é definida como a clivagem proteolítica de agrecan.

[00106] A "eficácia" do polipeptídeo da invenção mede a força má- xima do efeito em si, em concentrações de saturação do polipeptídeo. A eficácia indica a resposta máxima que pode ser alcançada a partir do polipeptídeo da invenção. Ela se refere à capacidade de um poli- peptídeo em produzir o efeito (terapêutico) desejado.

[00107] Em um aspecto a invenção se refere a um polipeptídeo conforme descrito no presente documento, em que o referido polipep- tídeo se liga a ADAMTS5 com uma Kp entre 1Eº M e 153 M, tal co- mo entre 11º M e 15? M, preferivelmente no máximo 1Eº M, prefe- riveimente menor do que 16º M ou 165º M, ou ainda menor do que 1E*º M, tal como 5E M, 4E? M, 38E! M, 2E M, 1.7E M, (EM, ou ainda 5E? M, 4E2? M, 3E 2? M, 165? M, por exemplo conforme de- terminado por Gyrolab ou KinExA.

[00108] Em um aspecto a invenção se refere a um polipeptídeo conforme descrito no presente documento, em que o referido polipep- tídeo modula ADAMTS5 com um ECso entre 15º” M e 15? M, tal co- mo entre 15º M e 1E M, por exemplo conforme determinado pela ELISA de ligação.

[00109] Em um aspecto a invenção se refere a um polipeptídeo conforme descrito no presente documento, em que o referido polipep- tídeo se liga a ADAMTS5 com uma taxa de dissociação de menos do que 5Eº s!, tal como menos do que 1Eº s* ou 5Eº s, ou ainda menos do que 1Eº s!, por exemplo conforme determinado por SPR.

[00110] Em um aspecto a invenção se refere a um polipeptídeo conforme descrito no presente documento, em que o referido polipep- tídeo inibe uma atividade de ADAMTSS5 com um ICrso entre 11Eº M e 1E 2? M, tal como entre 115º M e 165º M, por exemplo conforme de- terminado pelo ensaio FRET humano ou AlphaLISA humano.

[00111] Em um aspecto a invenção se refere a um polipeptídeo conforme descrito no presente documento, em que o referido polipep- tídeo inibe uma atividade enzimática de ADAMTS5 com um ICso de no máximo 1Eº M, preferivelmente 1Eº8 M, 5Eº M, ou 4Eº M, 3Eº M, 2Eº M, tal como 1Eº M.

[00112] Uma sequência de aminoácido, tal como um ISVD ou polipeptídeo, é dita ser "reativa de forma cruzada" para dois antígenos ou determinantes antigênicos diferentes (tal como, por exemplo, ADAMTSS a partir de diferentes espécies de mamífero , tal como por exemplo, ADAMTS5 humana, ADAMTSS5 bovina, ADAMTSSB5 de rato, ADAMTSS5 de porquinho da índia, ADAMTS5 de camundongo ou ADAMTSS5 de cinomolgo) caso ela seja específica para (conforme definido no presente documento) esses diferentes antígenos ou de- terminantes antigênicos. Será compreendido que um ISVD ou polipep- tídeo pode ser considerado como reativo de forma cruzada embora a sua afinidade de ligação pelos dois diferentes antígenos possa diferir, tal como por um fator, 2, 5, 10, 50, 100 ou ainda mais contanto que seja específica para (conforme definido no presente documento) esses diferentes antígenos ou determinantes antigênicos.

[00113] ADAMTSS5 também é conhecida como ADAMTS11, ADMP-

2 ou Agrecanase-2.

[00114] A informação estrutural relevante para ADAMTSB5 pode ser encontrada, por exemplo, nos números de acesso UniProt conforme apresentados na Tabela 1 abaixo (cf. Tabela B). Tabela 1 Q9UNAO ADAMTS5 H.sapiens 149 QgITT92 ADAMTS5 B.taurus 150 QE6TY19 ADAMTS5 R.norvegicus 151 HOVFPO ADAMTS5 Cavia Porcellus 152 Q9R001 ADAMTS5 M.musculus 153 F6Z3S6 ADAMTS5 M.mulatta 154

[00115] "ADAMTS5 humana" se refere a ADAMTS5 com- preendendo a sequência de aminoácido da SEQ ID NO: 149. Em um aspecto, o polipeptídeo da invenção especificamente liga ADAMTS5 de Human sapiens, Mus musculus, Cavia Porcellus, Bos taurus, Macaca mulatta e/ou Rattus norvegicus, preferivelmente ADAMTS5 humana, preferivelmente SEQ ID NO: 149.

[00116] Os termos "bloqueiam (de forma cruzada)", "bloqueado (de forma cruzada)", "bloqueio (de forma cruzada)", "ligação competitiva", "competem (de forma cruzada)", "competindo (de forma cruzada)" e "competição (de forma cruzada)" são usados de forma intercambiável no presente documento para significar a capacidade de uma imuno- globulina, anticorpo, ISVD, polipeptídeo ou outro agente de ligação a interferir com a ligação de outras imunoglobulinas, anticorpos, ISVDs, polipeptídeos ou agentes de ligação a um dado alvo. A extensão a qual a imunoglobulina, anticorpo, ISVD, polipeptídeo ou outro agente de ligação é capaz de interferir com a ligação de um outro ao alvo, e deste modo se ela puder ser dita a bloquear de forma cruzada de acordo com a invenção, pode ser determinada usando ensaios de ligação de competição, que são comuns na técnica, tais como, por ex- emplo, rastreamento de ISVDs purificados contra ISVDs exibidos em fago em um ELISA de competição. Os ensaios de bloqueio quantita- tivos de forma cruzada incluem ELISA.

[00117] Outros métodos para determinar se uma imunoglobulina, anticorpo, ISVD, polipeptídeo ou outro agente de ligação direcionado contra um alvo bloqueia (de forma cruzada), é capaz de bloqueio (de forma cruzada), se liga competitivamente ou é competitivo (de forma cruzada) conforme definido no presente documento, podem ser avaliados por um "ensaio sanduíche" baseado em SPR, tal como por exemplo descrito na seção de exemplos. Outros métodos adequados são descritos em Xiao-Chi Jia et al. (Journal of Immunological Methods 288: 91-98, 2004), Miller et a/. (Journal of Immunological Methods 365: 118—125, 2011).

[00118] Consequentemente, a presente invenção se refere a um polipeptídeo conforme descrito no presente documento, tal como rep- resentado pelas SEQ ID NO:s 2, 116, 19, 1, 3, 6, 16, 17, 10, 11,9, 5, 4, 7, 117, 8, 12, 13, 14, 15 ou 18 (cf. Tabela A-1), em que o referido polipeptídeo compete com um polipeptídeo de bloqueio cruzado, por exemplo conforme determinado pelo ELISA de competição.

[00119] A presente invenção se refere a um método para determi- nar competidores, tal como polipeptídeos, competindo com um polipeptídeo conforme descrito no presente documento, tal como rep- resentado por qualquer uma das SEQ ID NO:s 2, 116, 19, 1, 3, 6, 16, 17, 10, 11, 9, 5, 4, 7, 117, 8, 12, 13, 14, 15 ou 18, em que o polipep- tídeo conforme descrito no presente documento compete com ou bloqueia de forma cruzada o competidor, tal como um polipeptídeo, para ligação a ADAMTSS, tal como, por exemplo ADAMTS5 humana (SEQ ID NO: 149), em que a ligação a ADAMTS5 do competidor é re- duzida em pelo menos 5%, tal como 10%, 20%, 30%, 40%, 50% ou ainda mais, tal como 80%, 90% ou ainda 100% (isto é virtualmente in- detectável em um dado ensaio) na presença de um polipeptídeo da invenção, comparado com a ligação a ADAMTS5 do competidor na ausência do polipeptídeo da invenção. A competição e bloqueio cruza- do podem ser determinados por qualquer meio conhecido na técnica, tal como, por exemplo, ELISA de competição ou ensaio FACS. Em um aspecto, a presente invenção se refere a um polipeptídeo da invenção, em que o referido polipeptídeo bloqueia de forma cruzada a ligação a ADAMTSS5 de pelo menos um dos polipeptídeos representados pelas SEQ ID NO:s 2, 116, 19, 1, 3, 6, 16, 17, 10, 11, 9, 5, 4, 7, 117, 8, 12, 13, 14, 15 ou 18 e/ou é bloqueado de forma cruzada a partir da ligação a ADAMTSS5 em pelo menos um dos polipeptídeos representados pe- las SEQ ID NO:s 2, 116, 19, 1, 3, 6, 16, 17, 10, 11, 9, 5, 4, 7, 117,8, 12,13, 14, 15 ou 18.

[00120] A presente invenção também se refere a competidores competindo com um polipeptídeo conforme descrito no presente doc- umento, tal como SEQ ID NO:s 2, 116, 19, 1, 3, 6, 16, 17, 10, 11,9, 5, 4, 7, 117, 8, 12, 13, 14, 15 ou 18, em que o competidor compete com ou bloqueia de forma cruzada o polipeptídeo conforme descrito no presente documento para ligação a ADAMTS5, em que a ligação a ADAMTSS do polipeptídeo da invenção é reduzida em pelo menos 5%, tal como 10%, 20%, 30%, 40%, 50% ou ainda mais, tal como 80%, ou ainda mais tal como pelo menos 90% ou ainda 100% (isto é, vir- tualmente indetectável em um dado ensaio) na presença do referido competidor, comparado com a ligação a ADAMTSS5 pelo polipeptídeo da invenção na ausência de referido competidor. Em um aspecto, a presente invenção se refere a um polipeptídeo bloqueando de forma cruzada a ligação a ADAMTS5 por um polipeptídeo da invenção tal como uma das SEQ ID NO:s 2, 116, 19, 1, 3, 6, 16, 17, 10, 11,9, 5,4, 7, 117, 8, 12, 13, 14, 15 ou 18 e/ou é bloqueado de forma cruzada a partir da ligação a ADAMTSS5 em pelo menos uma das SEQ ID NO:s 2, 116, 19, 1, 3, 6, 16, 17, 10, 11, 9, 5, 4, 7, 117, 8, 12, 13, 14, 15 ou 18,

preferivelmente em que o referido polipeptídeo compreende pelo me- nos um VH, VL, dAb, ou ISVD que liga especificamenteto ADAMTSS5, em que a ligação a ADAMTS5 modula uma atividade de ADAMTSS5.

[00121] As "atividades da ADAMTSS5" e "atividades de ADAMTSS5" (esses termos são usados de forma intercambiável no presente docu- mento) incluem, porém não se limitam a atividades enzimáticas, tal como proteólise, por exemplo atividade da protease (também chamada atividade da proteinase ou peptidase), e atividades da endopeptidase, por um lado, e as atividades pelos exósitos, tal como por exemplo reconhecendo e/ou ligando o substrato, por exemplo pelo domínio do tipo desintegrina, repetição (TS) do tipo | como trombospondina cen- tral, domínio rico em cisteína, região espaçadora e/ou motivos TS adi- cionais. As atividades de ADAMTSS5 incluem a ligação e/ou proteólise de substratos tais como proteínas extracelulares de proteoglicana de sulfato de condroitina de ligação a hialuronana (CSPG), tais como agrecan, versican, brevican, neurocan, decorin e biglican. Conforme usado no presente documento, a proteólise é a quebra de proteínas em polipeptídeos ou aminoácidos menores através de hidrólise das ligações peptídicas que ligam aminoácidos juntos em uma cadeia de polipeptídeos.

[00122] No contexto da presente invenção, "modulando" ou "modu- lar" geralmente significa alterar uma atividade através de ADAMTSS5, conforme medido usando um ensaio adequado in vitro, celular ou in vivo (tal como aqueles mencionados no presente documento). Em par- ticular, "modulando" ou "modular" pode signififcar tanto reduzir quanto inibir uma atividade de, ou alternadamente aumentar uma atividade de ADAMTSSB5, conforme medida usando um ensaio adequado in vitro, celular ou in vivo (por exemplo, tal como aquele mencionado no presente documento), em pelo menos 1%, preferivelmente pelo menos 5%, tal como pelo menos 10% ou pelo menos 25%, por exemplo em pelo menos 50%, pelo menos 60%, pelo menos 70%, pelo menos 80%, ou 90% ou mais, comparado à atividade de ADAMTSS5 no mes- mo ensaio sob as mesmas condições porém sem a presença do ISVD ou polipeptídeo da invenção.

[00123] Consequentemente, a presente invenção se refere a um polipeptídeo conforme descrito no presente documento, em que o refe- rido polipeptídeo modula uma atividade de ADAMTSS, preferivelmente inibindo uma atividade de ADAMTSS5.

[00124] Consequentemente, a presente invenção se refere a um polipeptídeo conforme descrito no presente documento, em que o refe- rido polipeptídeo inibe a atividade da protease deADAMTSS, tal como inibe a proteólise de um substrato, tal como agrecan, versican, brevi- can, neurocan, decorin, e/ou biglican.

[00125] Consequentemente, a presente invenção se refere a um polipeptídeo conforme descrito no presente documento, em que o refe- rido polipeptídeo bloqueia a ligação de ADAMTS5 a um substrato, tal como agrecan, versican, brevican, neurocan, decorin, e/ou biglican, em que o referido substrato é preferivelmente agrecan.

[00126] Em um aspecto, a invenção se refere a um polipeptídeo conforme descrito no presente documento, em que o referido polipep- tídeo bloqueia a ligação de ADAMTSS5 a agrecan em pelo menos 20%, tal como pelo menos 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95% ou ainda mais, por exemplo conforme determinado por ELISA.

[00127] Em um aspecto, a invenção se refere a um polipeptídeo conforme descrito no presente documento, em que o referido polipep- tídeo antagoniza ou inibe uma atividade de ADAMTSS, tal como (i) uma atividade de protease, preferivelmente clivagem de agrecan, ver- sican, brevican, neurocan, decorin, e/ou biglican, preferivelmente cli- vagem de agrecan; preferivelmente antagoniza a atividade da agreca- nase de ADAMTSS; (ii) ligação de um substrato a ADAMTSSB5, tal como um exósito de ADAMTSS5, por exemplo o domínio do tipo desintegrina, a repetição (TS) do tipo | como trombospondina central, o domínio rico em cisteína, a região espaçadora ou o motivo TS adicional.

[00128] Consequentemente, a presente invenção se refere a um polipeptídeo conforme descrito no presente documento, em que o refe- rido polipeptídeo inibe a atividade da protease de ADAMTSS, preferi- velmente em pelo menos 5%, tal como 10%, 20%, 30%, 40%, 50% ou ainda mais, tal como pelo menos 60%, 70%, 80%, 90%, 95% ou ainda mais, conforme determinado por qualquer método conhecido na técni- ca, tal como por exemplo por ensaios de inibição enzimática ou con- forme descrito na seção de exemplos.

[00129] “Embora ADAMs, ADAMTSs e MMPs compartilhem um sítio de ligação a agrecan que é muito similar tanto em sequência quanto na forma geral, por exemplo, os domínios catalíticos de ADAMTS4 e ADAMTSS5 compartilham um alto grau de similaridade sequencial, os inventores foram capazes de identificar ISVDs que eram específicos do alvo, conforme demonstrado nos exemplos. A especificidade do alvo também evitaria ou pelo menos limitaria a síndrome musculo- esqueletal, que é um efeito collateral causado por inibidores de amplo espectro.

[00130] Em um aspecto, a invenção se refere a um aglutinante de ADAMTSS tal como um ISVD e polipeptídeo da invenção, em que o referido aglutinante ADAMTS5 não liga ADAMTS4, ADAMTS1, ADAMTS15, MMP1 e/ou MMP14 (tipo de membrana). Preferivelmente, a presente invenção se refere a um polipeptídeo conforme definido no presente documento, em que o referido ISVD que liga ADAMTSS5 não liga ADAMTSA4, MMP1 ou MMP14.

[00131] A menos que indicado de outra forma, os termos "imuno- globulina" e "sequência de imunoglobulina' — sejam usados no presente documento para se referir a um anticorpo de cadeia pesada ou a um anticorpo convencional de 4 cadeias, - são usados como um termo geral para incluir ambos o anticorpo de tamanho total, as cadeias individuais das mesmas, assim como todas as partes, domí- nios ou fragmentos dos mesmos (incluindo porém sem se limitar aos domínios de ligação ao antígeno ou fragmentos tais como domínios VHH ou domínios VH/V., respectivamente).

[00132] termo "domínio" (de um polipeptídeo ou proteína) conforme usado no presente documento se refere a uma estrutura de proteína dobrada que tem a capacidade de reter a sua estrutura terciária inde- pendentemente do resto da proteína. Em geral, domínios são re- sponsáveis pelas propriedades funcionais discretas das proteínas, e em muitos casos podem ser adicionadas, removidas ou transferidas a outras proteínas sem perda de função do restante da proteína e/ou do domínio.

[00133] O termo "domínio de imunoglobulina" conforme usado no presente documento se refere a uma região globular de uma cadeia de anticorpo (tal como por exemplo, uma cadeia de um anticorpo conven- cional de 4 cadeias ou de um anticorpo de cadeia pesada), ou a um polipeptídeo que essencialmente consiste em uma referida região glo- bular. Os domínios de imunoglobulina são caracterizados de forma que eles retenham a característica de dobra da imunoglobulina das moléculas de anticorpo, a qual consiste em um sanduíche de duas camadas de cerca de sete beta-filamentos antiparalelos dispostos em duas beta-folhas, opcionalmente estabilizadas por uma ligação dissul- feto consevada.

[00134] O termo "domínio variável de imunoglobulina" conforme usado no presente documento significa um domínio de imunoglobulina essencialmente consistindo em quatro "regiões framework" que são referidas na técnica e no presente documento abaixo como "região framework 1" ou "FR1"; como "região framework 2" ou "FR2"; como

"região framework 3" ou "FR3"; e como "região framework 4" ou "FR4", respectivamente; cujas regiões framework são interrompidas por três "regiões determinantes de complementariedade" ou "CDRs", que são referidas na técnica e abaixo no presente documento como "região de- terminante de complementariedade 1" ou "CDR1"; como "região de- terminante de complementariedade 2" ou "CDR2"; e como "região de- terminante de complementariedade 3" ou "CDR3", respectivamente. Sendo assim, a estrutura ou sequência geral de um domínio variável de imunoglobulina pode ser indicada como a seguir: FR1 - CDR1 - FR2 - CDR2 - FR3 - CDR3 - FRA4. Ele é o domínio variável de imuno- globulina(s) que confere especificidade a um anticorpo para o antígeno ao carregar o sítio de ligação ao antígeno.

[00135] O termo "domínio variável único de imunoglobulina" (abre- viado no presente documento como "ISVD" ou "ISV"), e usado de for- ma intercambiável com "domínio variável único", define moléculas em que o sítio de ligação ao antígeno está presente em, e formado por um único domínio de imunoglobulina. Isto define os domínios variáveis únicos de imunoglobulina a parte das imunoglobulinas "convencionais" ou seus fragmentos, em que dois domínios de imunoglobulinas, em particular dois domínios variáveis, interagem para formar um sítio de ligação ao antígeno. Tipicamente, em imunoglobulinas convencionais, um domínio variável de cadeia pesada (Vx) e um domínio variável de cadeia leve (V.) interage para formar um sítio de ligação ao antígeno. No último caso, as regiões determinantes de complementariedade (CDRs) de ambos V+r e V. contribuirão para o sítio de ligação ao antí- geno, isto é um total de 6 CDRs estarão envolvidas na formação do sítio de ligação ao antígeno.

[00136] Em vista da definição acima, o domínio de ligação ao antí- geno de um anticorpo de 4 cadeias convencional (tal como uma molé- cula de IgG, IgM, IgA, IgD ou IgE; conhecida na técnica) ou de um fra-

gmento Fab, um fragmento F(ab')2, um fragmento Fv tal como um fra- gmento Fv ou scFv ligado a dissulfeto ou um diacorpo (todos conheci- dos na técnica) derivados do referido anticorpo de 4 cadeias convenci- onal, não seria normalmente referida como um domínio variável único de imunoglobulina, já que, nesses casos, a ligação ao respectivo epí- topo de um antígeno não ocorreria normalmente por um (único) domí- nio de imunoglobulina, mas por um par de (associação) de domínios de imunoglobulina tal como domínios variáveis de cadeia leve e pesa- da, isto é, por um par V4-V.L de domínio de imunoglobulina, o qual se liga de forma conjunta a um epítopo do respectivo antígeno.

[00137] Em contraste, ISVDs são capazes de se ligar especifica- mente a um epítopo do antígeno sem parear com um domínio variável de imunoglobulina adicional. O sítio de ligação de um ISVD é formado por um único domínio VHH, Vx ou Vi. Consequentemente, o sítio de ligação ao antígeno de um ISVD é formado por não mais do que três CDRs.

[00138] Como tal, o domínio variável único pode ser uma sequência do domínio variável de cadeia leve (por exemplo, uma sequência V.) ou um fragmento adequado do mesmo; ou uma sequência do domínio variável de cadeia pesada (por exemplo, uma sequência Vu ou se- quência VHH) ou um fragmento adequado do mesmo; à medida que ela seja capaz de formar uma única unidade de ligação ao antígeno (isto é, uma unidade de ligação funcional ao antígeno que essencialmente consiste do domínio variável único, de forma que o único domínio de ligação ao antígeno não precise interagir com um outro domínio variá- vel para formar uma unidade de ligação ao antígeno funcional).

[00139] Em uma modalidade da invenção, os ISVDs são sequên- cias do domínio variável de cadeia pesada (por exemplo, uma sequên- cia Vx); mais especificamente, os ISVDs podem ser sequências do domínio variável de cadeia pesada que são derivadas de um anticorpo convencional de quatro cadeias ou sequências do domínio variável de cadeia pesada que são derivados de um anticorpo de cadeia pesada.

[00140] Por exemplo, o ISVD pode ser um anticorpo de domínio (único) (ou um aminoácido que é adequado para uso como um anti- corpo de domínio (único)), um "dAb" ou dAb (ou um aminoácido que é adequado para uso como um dAb) ou um nanocorpo (conforme defini- do no presente documento, e incluindo porém não limitado a um VHH); outros domínios variáveis únicos, ou qualquer fragmento adequado de qualquer um dos mesmos.

[00141] Em particular, o ISVD pode ser um NanobodyO (conforme definido no presente documento) ou um fragmento adequado do mes- mo. [Nota: NanobodyO, Nanobodies& e NanocloneO& são marcas reg- istradas de Ablynx N.V.] Para uma descrição geral de Nanocorpos, é feita referência à descrição adicional abaixo, assim como à técnica an- terior citada no presente documento, tal como por exemplo descrita na publicação internacional WO 08/020079 (página 16).

[00142] "Domínios VHr", também conhecidos como VHHs, domínios VHH, fragmentos de anticorpo VHH e anticorpos VHH, foram original- mente descritos como o domínio (variável) da imunoglobulina de ligação ao antígeno de "anticorpos de cadeia pesada" (isto é, de "anti- corpos desprovidos de cadeias leves"; Hamers-Casterman et a/. 1993 Nature 363: 446-448). O termo "domínio Vnn" foi escolhido de modo a distinguir esses domínios variáveis dos domínios variáveis de cadeia pesada que estão presentes em anticorpos convencionais de 4 cadeias (que são referidos no presente documento como "domínios VH" ou "domínios VH") e a partir dos domínios variáveis de cadeia leve que estão presentes em anticorpos convencionais de 4 cadeias (que são referidos no presente documento como "domínios V." ou "domí- nios VL"). Para uma descrição adicional de VHH's e nanocorpo, é feita referência ao artigo da revista por Muyldermans (Reviews in Molecular

Biotechnology 74: 277-302, 2001), assim como aos seguintes pedidos de patente, que são mencionados como técnica antecedente geral: WO 94/04678, WO 95/04079 e WO 96/34103 da Vrije Universiteit Brussel; WO 94/25591, WO 99/37681, WO 00/40968, WO 00/43507, WO 00/65057, WO 01/40310, WO 01/44301, EP 1134231 e WO 02/48193 da Unilever; WO 97/49805, WO 01/21817, WO 03/035694, WO 03/054016 e WO 03/055527 da Vlaams Instituut voor Biotechno- logie (VIB); WO 03/050531 de Algonomics N.V. e Ablynx N.V.; WO 01/90190 pelo National Research Council of Canada; WO 03/025020 (= EP 1433793) pelo Institute of Antibodies; assim como WO 04/041867, WO 04/041862, WO 04/041865, WO 04/041863, WO 04/062551, WO 05/044858, WO 06/40153, WO 06/079372, WO 06/122786, WO 06/122787 e WO 06/122825, por Ablynx N.V. e os pe- didos de patente publicados adicionais por Ablynx N.V.

Também é fei- ta referência à técnica anterior mencionada nestes pedidos, e em par- ticular à lista de referências mencionadas nas páginas 41-43 do Pedi- do Internacional WO 06/040153, cuja lista e referências são incorpora- das no presente documento a título de referência.

Conforme descrito nessas referências, nanocorpos (em particular, sequências VHH e na- nocorpos parcialmente humanizados) podem em particular ser carac- terizados pela presença de um ou mais "resíduos Hallmark" em uma ou mais das sequências framework.

Uma descrição adicional dos na- nocorpos, incluindo humanização e/ou camelização de nanocorpos, assim como outras modificações, partes ou fragmentos, derivados ou "fusões nanocorpo", construtos multivalentes (incluindo alguns exem- plos não limitantes de sequências ligantes) e diferentes modificações para aumentar a meia-vida dos nanocorpos e suas preparações po- dem ser encontradas por exemplo na publicação internacional WO 08/101985 e WO 08/142164. Para uma descrição geral adicional de nanocorpos, é feita referência à técnica anterior citada no presente documento, tal como por exemplo descrita na publicação internacional WO 08/020079 (página 16).

[00143] Em particular, as sequências framework presentes nos ag- lutinantes ADAMTSS5 da invenção, tal como os ISVDs e/ou polipeptí- deos da invenção, podem conter um ou mais dos resíduos Hallmark (por exemplo, conforme descrito na publicação internacional WO 08/020079 (Tabelas A-3 a A-8)), de forma que o aglutinante ADAMTS5 da invenção seja um nanocorpo. Alguns exemplos preferidos, porém não limitantes de (combinações adequadas das) referidas sequências framework se tornarão claras a partir da divulgação adicional no presente documento (vide por exemplo, Tabela A-2). Em geral, nano- corpos (em particular sequências Vu e nanocorpos parcialmente hu- manizados) podem ser em particular caracterizados pela presença de um ou mais "resíduos Hallmark" em uma ou mais das sequências framework (conforme por exemplo, ainda descrito na publicação inter- nacional WO 08/020079, página 61, linha 24 até página 98, linha 3).

[00144] Mais em particular, a invenção provê aglutinantes ADAMTSS5 compreendendo pelo menos um domínio variável único de imunoglobulina que é uma sequência de aminoácido com a estrutura (geral) FR1 - CDR1 - FR2 - CDR2 - FR3 - CDR3 - FR4 na qual FR1 a FR4 se referem a regiões framework 1 a 4, respectiva- mente, e na qual CDR1 a CDR3 se referem a regiões determinantes de complementariedade 1 a 3, respectivamente, e a qual: i) tem pelo menos 80%, mais preferivelmente 90%, ainda mais preferivelmente 95% de identidade ao aminoácido com pelo menos uma das sequências de aminoácido das SEQ ID NO:s 2, 116, 19, 1, 3, 6, 16, 17, 10, 11, 9, 5, 4, 7, 117, 8, 12, 13, 14, 15 ou 18 (vide Tabela A-1), na qual para as finalidades de determinação do grau de identidade com o aminoácido, os resíduos de aminoácido que formam as sequências de CDR são desconsideradas. Com relação a isso, também é feita referência à Tabela A-2, que lista as sequências framework 1 (SEQ ID NOs: 72-84), sequências framework 2 (SEQ ID NOs: 85-94), sequências framework 3 (SEQ ID NOs: 95-113) e se- quências framework 4 (SEQ ID NOs: 114-115) dos domínios variáveis únicos de imunoglobulina das SEQ ID NOs: 2, 116, 19, 1, 3, 6, 16, 17, 10, 11,9, 5,4,7, 117,8, 12,13, 14, 156 18; ou ii) combinações de sequências framework conforme apersentadas na Tabela A-2; e na qual: iii) preferiveeimente um ou mais dos resíduos de ami- noácido nas posições 11, 37, 44, 45, 47, 83, 84, 103, 104 e 108 de acordo com a numeração Kabat são escolhidos a partir dos resíduos Hallmark tal como mencionados na Tabela A-3 a Tabela A-8 da publi- cação internacional WO 08/020079.

[00145] Os aglutinantes ADAMTSS5 da invenção, tal como os ISVDs e/ou polipeptídeos da invenção, também podem conter as mu- tações/resíduos de aminoácido específicos descritos nos pedidos pro- visórios Norte-americanos copendentes, todos intitulados "Domínio variável melhorado de imunoglobulinas": US 61/994552 depositado em 16 de maio de 2014; US 61/014.015 depositado em 18 de junho de 2014; US 62/040.167 depositado em 21 de agosto de 2014; e US 62/047 .560, depositado em 8 de setembro de 2014 (todos cedidos pa- ra Ablynx N.V.).

[00146] Em particular, os aglutinantes ADAMTSB5 da invenção, tal como os ISVDs e/ou polipeptídeos da invenção, podem adequada- mente conter (i) um K ou Q na posição 112; ou (ii) um K ou Q na posição 110 em combinação com um V na posição 11; ou (iii) um T na posição 89; ou (iv) um L na posição 89 com um K ou Q na posição 110; ou (v) um V na posição 11 e um L na posição 89; ou qualquer combinação adequada de (i) a (v).

[00147] Ainda conforme descrito nos referidos pedidos de patente Norte-americanos provisórios copendentes, quando o aglutinante ADAMTSS da invenção, tal como o ISVD e/ou polipeptídeo da inven- ção, contém as mutações de acordo com uma de (i) a (v) acima (ou uma combinação adequada da mesma): - oresíduo de aminoácido na posição 11 é preferivelmente escolhido a partir L, V ou K (e é ainda mais preferivelmente V); e/ou - oresíduo de aminoácido na posição 14 é preferivelmente escolhido a partir de A ou P; e/ou - oresíduo de aminoácido na posição 41 é preferivelmente escolhido a partir de A ou P; e/ou - oresíduo de aminoácido na posição 89 é preferivelmente escolhido a partir de T, V ou L; e/ou - oresíduo de aminoácido na posição 108 é preferivelmen- te escolhido a partir de Q ou L; e/ou - oresíduo de aminoácido na posição 110 é preferivelmen- te escolhido a partir de T, K ou Q; e/ou - oresíduo de aminoácido na posição 112 é preferivelmen- te escolhido a partir de S, Kou Q.

[00148] Conforme mencionado nos referidos pedidos Norte- americanos provisórios copendentes, as referidas mutações são efica- zes na prevenção ou redução da ligação dos assim chamados "anti- corpos preexistentes" às imunoglobulinas e compostos da invenção. Para esta finalidade, os aglutinantes ADAMTSSB5 da invenção, tal como os ISVDs e/ou polipeptídeos da invenção, também podem conter (op- cionalmente em combinação com as referidas mutações) uma exten- são C-terminal (X)n (na qual n é 1 a 10, preferivelmente 1 a 5, de for- ma que 1, 2, 3, 4 ou 5 (e preferivelmente 1 ou 2, tal como 1); e cada X é um resíduo de aminoácodo (preferivelmente de ocorrência natural)

que é independentemente escolhido e preferivelmente independente- mente escolhido a partir do grupo consistindo em alanina (A), glicina (G), valina (V), leucina (L) ou isoleucina (1)), vide por exemplo pedidos norte-americanos provisórios assim como a publicação internacional WO 12/175741. Em particular, um aglutinante ADAMTSS5 da invenção, tal como um ISVD e/ou polipeptídeo da invenção, pode conter uma referida extensão C-terminal quando ela forma a extremidade C- terminal de uma proteína, polipeptídeo ou outro composto ou construto compreendendo o mesmo (vide por exemplo os referidos pedidos pro- visórios Norte-americanos assim como a publicação internacional WO 12/175741).

[00149] Um aglutinante ADAMTSSB5 da invenção pode ser uma imu- noglobulina, tal como um domínio variável único de imunoglobulina, derivado em qualquer maneira adequada e a partir de qualquer fonte adequada, e pode por exemplo ser de sequências VxH que ocorrem naturalmente (isto é, a partir de uma espécie adequada de camelídeo) ou de sequências de aminoácido sintéticas ou semi-sintéticas, inclu- indo porém sem se limitar a nanocorpos ou sequências VAH "humani- zadas" (conforme definido no presente documento), sequências de imunoglobulina "camelizadas" (conforme definido no presente docu- mento) (e em particular sequências camelizadas do domínio variável de cadeia pesada), assim como nanocorpos que foram obtidos por técnicas tais como maturação de afinidade (por exemplo, iniciando a partir das sequências de imunoglobulina sintéticas, aleatórias ou que ocorrem naturalmente), enxerto de CDR, veneering, combinação de fragmentos derivados de diferentes sequências de imunoglobulina, montage de PCR usando iniciadores sobrepostos, e técnicas similares para as engenharia das sequências de imunoglobulina bem conhecid- as do versado na técnica; ou qualquer outra combinação adequada de qualquer uma das anteriores adicionalmente descritas no presente documento. Além disso, quando uma imunoglobulina compreende uma sequência VHn, a referida imunoglobulina pode ser adequadamente humanizada, conforme adicionalmente descrito no presente documen- to, de modo a prover uma ou mais imunoglobulinas adicionais (parci- almente ou totalmente) humanizadas da invenção. Similarmente, quando uma imunoglobulina compreende uma sequência sintética ou semi-sintética (tal como uma sequência parcialmente humanizada), a referida imunoglobulina pode opcionalmente ser adicionalmente ade- quadamente humanizada, novamente conforme descrito no presente documento, novamente de forma a prover uma ou mais imunoglobuli- nas adicionais (parcialmente ou totalmente) humanizadas da invenção.

[00150] “Anticorpos de domínio", também conhecidos como "Dab'"s, "anticorpos de domínio" e "dAbs" (os termos "anticorpos de domínio" e "dAbs" sendo usados como marcas pela grupo de empresas da Gla- xoSmithKline) foram descritos em por exemplo, EP 0368684, Ward et al. (Nature 341: 544-546, 1989), Holt et al. (Tends in Biotechnology 21: 484-490, 2003) e publicação internacional WO 03/002609 assim como por exemplo WO 04/068820, WO 06/030220, WO 06/003388 e outros pedidos de patente publicados da Domantis Ltd. Os anticorpos de do- mínio essencialmente correspondem aos domínios VH ou VL de ma- míferos não camelídeos, em particular anticorpos humanos de 4 ca- deias. De modo a ligar um epítopo como um domínio de ligação ao antígeno único, isto é, sem ser pareado com um domínio VL ou VH, respectivamente, a seleção específica para as referidas propriedades de ligação ao antígeno é necessária, por exemplo ao usar bibliotecas de sequências de domínio VH ou VL humano único. Os anticorpos de domínio têm, como VHHs, um peso molecular de aproximadamente 13 a aproximadamente 16 kDa e, caso derivados de sequências totalmen- te humanas, não necessitam de humanização para por exemplo uso terapêutico em humanos.

[00151] Deve se notar que, embora menos preferido no contexto da presente invenção já que eles não são de origem mamiífera, os domí- nios variáveis únicos podem ser derivados de certas espécies de tuba- rão (por exemplo, os assim chamados "domínios IQNAR", vide por exemplo WO 05/18629).

[00152] A presente invenção se refere particularmente a ISVDs, em que os referidos ISVDs são escolhidos a partir do grupo consistindo em VHHs, VHHs humanizados e VHs camelizados.

[00153] Os resíduos de aminoácido de um domínio VHH são nume- rados de acordo com a numeração geral para domínios Vu dados por Kabat et al. ("(Sequence of proteins of immunological interest", US Pu- blic Health Services, NIH Bethesda, MD, Publication No. 91), conforme aplicado aos domínios VHH de camelídeos, conforme mostrado por exemplo, na Figura 2 de Riechmann and Muyldermans (J. Immunol. Methods 231: 25-38, 1999), todos conforme conhecidos na técnica. Métodos alternativos para numerar os resíduos de aminoácido dos domínios Vn, cujos métodos também podem ser aplicados em uma forma análoga aos domínios VHH, são conhecidos na técnica. No en- tanto, na presente descrição, reivindicações e figuras, a numeração de acordo com Kabat aplicada aos domínios VHH conforme descrito aci- ma será seguida, a menos que indicado de outra forma.

[00154] Deve-se notar que — como é bem conhecido na técnica pa- ra os domínios Vx e domínios VHH — o número total de resíduos de aminoácido em cada uma das CDRs pode variar e pode não corres- ponder ao número total de resíduos de aminoácido indicado pela nu- meração Kabat (isto é, uma ou mais posições de acordo com a nume- ração Kabat pode não ser ocupada na sequência real ou a sequência real pode conter mais resíduos de aminoácido do que o número permi- tido pela numeração Kabat). Isto significa que, em geral, a numeração de acordo com Kabat pode ou não corresponder à numeração real dos resíduos de aminoácido na sequência real. O número total de resíduos de aminoácido em um domínio VH e um domínio VHH estará geral- mente na faixa de 110 a 120, frequentemente entre 112 e 115. No en- tanto deve-se notar que sequências menores e mais longas também podem ser adequadas para as finalidades descritas no presente do- cumento.

[00155] Com relaçãoàsCDRs, como é bem conhecido na técnica, existem múltiplas convenções para definir e descrever as CDRs de um fragmento VH ou VHH, tal como a definição Kabat (que é baseada na variabilidade da sequência e é mais comumente usada) e a definição Chothia (que é baseada na localização das regiões de loop estrutural). A referência também é feita por exemplo ao website http://www .bioinf.org.uk/abs/. Para as finalidades do presente relatório descritivo e reivindicações, as CDRs são ainda mais preferivelmente definidas com base na definição Abm (que é baseada no software de modelagem de anticorpo Oxford Molecular's ADM), como este é consi- derado como um compromisso ideal entre as definições Kabat e Chothia (cf. http://www .bioinf.org.uk/abs/). Conforme usado no presen- te documento, FR1 compreende os resíduos de aminoácido nas posi- ções 1-25, CDR1 compreende os resíduos de aminoácido nas posi- ções 26-35, FR2 compreende os aminoácidos nas posições 36-49, CDR2 compreende os resíduos de aminoácido nas posições 50-58, FR3 compreende os resíduos de aminoácido nas posições 59-94, CDR3 compreende os resíduos de aminoácido nas posições 95-102, e FR4 compreende os resíduos de aminoácido nas posições 103-113.

[00156] No significado da presente invenção, o termo "domínio vari- ável único de imunoglobulina" ou "domínio variável único" compreende polipeptídeos que são derivados de uma fonte não humana, preferi- velmente um camelídeo, preferivelmente um anticorpo de cadeia pe- sada de camelídeo. Eles podem ser humanizados, conforme descrito no presente documento. Além do mais, o termo compreende polipeptí- deos derivados de fontes não camelídeas, por exemplo camundongo ou humano, que foram "camelizados", conforme descrito no presente documento.

[00157] —Consequentemente, ISVDs tais como anticorpos de domí- nio e nanocorpos (incluindo domínios VHH) podem ser submetidos à humanização. Em particular, ISVDs humanizados, tais como Nanocor- pos (incluindo domínios VHH) podem ser ISVDs que são geralmente definidos no presente document, mas em que pelo menos um resíduo de aminoácido está presente (e em particular, em pelo menos um dos resíduos framework) que é e/ou que corresponde a uma substituição humanizadora (conforme definido no presente documento). As substi- tuições potencialmente úteis podem ser determinadas pela com- paração da sequência das regiões framework de uma sequência Vrr de ocorrência natural com a sequência framework correspondente de uma ou mais sequências Vx humanas estreitamente relacionadas, de- pois da qual uma ou mais das substituições humanizadores potencial- mente úteis (ou combinações das mesmas) assim determinadas po- dem ser introduzidas na referida sequência VHH (em qualquer maneira conhecida per se, conforme adicionalmente descrito no presente doc- umento) e as sequências Vu humanizadas resultantes podem ser testadas quanto à afinidade pelo alvo, estabilidade, facilidade e níveis de expressão, e/ou para outras propriedades desejadas. Desta forma, por meio de um grau limitado de tentativa e erro, outras substituições humanizadoras adequadas (ou combinações adequadas das mesmas) podem ser determinadas pelo versado na técnica com base na divul- gação no presente documento. Além disso, com base no antecedente, (as regiões framework de) um ISVD, tal como um nanocorpo (incluindo domínios VHH) podem ser parcialmente humanizadas ou totalmente humanizadas.

[00158] Uma outra classe particularmente preferida de ISVDs da invenção compreende ISVDs com uma sequência de aminoácido que corresponde à sequência de aminoácido de um domínio VH que ocor- re naturalmente, mas que foi "camelizada”", isto é através da substitui- ção de um ou mais resíduos de aminoácido na sequência de ami- noácido de um domínio VH que ocorre naturalmente a partir de um an- ticorpo convencional de 4 cadeias por um ou mais dos resíduos de aminoácido que ocorrem nas posições correspondents em um domínio VHH de um anticorpo de cadeia pesada. Isto pode ser realizado de uma maneira conhecida per se, o que ficará claro para o versado na téc- nica, por exemplo com base na descrição no presente documento. As referidas substituições "camelizadoras" são preferivelmente inseridas nas posições de aminoácido que formam e/ou estão presentes na in- terface Vu-V., e/ou nos assim chamados resíduos hallmark Camelidae, conforme definido no presente documento (vide também por exemplo WO 94/04678 e Davies and Riechmann (1994 and 1996)). Preferivel- mente, a sequência Vu que é usada como um material de partida ou ponto de partida para gerar ou designer o domínio variável único camelizado de imunoglobulinas é preferivelmente uma sequência Vn de um mamífero, mais preferivelmente a sequência Vx de um ser hu- mano, tal como uma sequência Vx3. No entanto, deve se notar que o referido domínio variável único camelizado de imunoglobulinas da in- venção pode ser obtido em qualquer maneira adequada conhecida per se e assim não são estritamente limitadas aos polipeptídeos que foram obtidos usando um polipeptídeo que compreende um domínio Vx que ocorre naturalmente como um material de partida. A referência é feita a Davies and Riechmann (FEBS 339: 285-290, 1994; Biotechnol. 13: 475-479, 1995; Prot. Eng. 9: 531-537, 1996) e Riechmann and Muyl- dermans (J. Immunol. Methods 231: 25-38, 1999).

[00159] Por exemplo, novamente conforme adicionalmente descrito no presente documento, ambas "humanização" e "camelização" po- dem ser realizadas ao se prover a sequência nucleotídica que codifica um domínio VHH ou domínio VH que ocorre naturalmente, respec- tivamente, e depois mudando, de uma maneira conhecida per se, um ou mais codons na referida sequência nucleotídica de tal forma que a nova sequência nucleotídica codifique um ISVD "humanizado" ou "camelizado" da invenção, respectivamente. Este ácido nucleico pode ser então expressado de uma maneira conhecida per se, de modo a prover os ISVDs desejados da invenção. Alternadamente, com base na sequência de aminoácido de um domínio VHH ou domínio VH que ocorre naturalmente, respectivamente, a sequência de aminoácido dos ISVDs humanizados ou camelizados desejados da invenção, respec- tivamente, podem ser designados e depois sintetizados de novo usando técnicas para síntese peptídica conhecidas per se. Além disso, com base na sequência de aminoácido ou sequência nucleotídica de um domínio VHH ou domínio VH que ocorre naturalmente, respec- tivamente, a sequência nucleotídica codificando os ISVDs humaniza- dos ou camelizados desejados da invenção, respectivamente, podem ser designados e depois sintetizados de novo usando técnicas para a síntese de ácido nucleico conhecidas per se, depois da qual o ácido nucleico assim obtido pode ser expressado de uma maneira conhecida per se, de modo a prover os ISVDs desejados da invenção.

[00160] ISVDs tais como anticorpos de domínio e nanocorpos (in- cluindo domínios VHH e domínios VHH humanizados), também podem ser submetidos à maturação por afinidade ao introduzir uma ou mais alterações na sequência de aminoácido de uma ou mais CDRs, cujas alterações resultam em uma afinidade melhorada do ISVD resultante para o seu respectivo antígeno, conforme comparado com a respectiva molécula parental. As moléculas de ISVD da invenção maturadas por afinidade podem ser preparadas por métodos conhecidos na técnica,

por exemplo, conforme descrito por Marks et al. (Biotechnology 10:779-783, 1992), Barbas, et al. (Proc. Nat. Acad. Sci, USA 91: 3809- 3813, 1994), Shier et al. (Gene 169: 147-155, 1995), Yelton et al. (Immunol. 155: 1994-2004, 1995), Jackson et al. (J. Immunol. 154: 3310-9, 1995), Hawkins et a/. (J. Mol. Biol. 226: 889 896, 1992), John- son and Hawkins (Afinidade maturation of antibodies using phage dis- play, Oxford University Press, 1996).

[00161] O processo de designação/seleção e/ou preparação de um polipeptídeo, começando a partir de um ISVD tal como um anticorpo do domínio VH, V., VHH, ou um nanocorpo, também é referido como "formatação" do referido ISVD; e um ISVD que é parte de um polipep- tídeo é dito ser "formatado" ou estar "no formato do" referido polipep- tídeo. Os exemplos de formas nas quais um ISVD pode ser formatado e exemplos dos referidos formatos ficarão claros ao versado na téc- nica com base na divulgação no presente documento; e os referidos domínios variáveis únicos de imunoglobulina formatados formam um aspecto adicional da invenção.

[00162] —CDRs preferidas são apresentadas na Tabela A-2.

[00163] Em particular, a presente invenção se refere a um ISVD conforme descrito no presente documento, em que o referido ISVD que liga especificamente ADAMTSSB5 essencialmente consiste em 4 re- giões framework (FR1 a FRA, respectivamente) e 3 regiões determi- nantes de complementariedade (CDR1 a CDR3 respectivamente), na qual

[00164] CDRI1 é escolhida a partir do grupo consistindo na SEQ ID NOs: 21, 35, 20, 22, 25, 33, 28, 24, 23, 26, 27, 29, 30, 31, 32e€ 34; e (i) sequências de aminoácido que têm 1, 2 ou 3 diferen- ça(s) do aminoácido com SEQ ID NOs: 21, 35, 20, 22, 25, 33, 33, 28, 24, 23, 26, 27, 29, 30, 31, 32 e 34; (i)) CDR2 é escolhida a partir do grupo consistindo na

SEQ ID NOs: 37, 53, 36, 40, 50, 51, 44, 45, 43, 39, 38, 41, 119, 42, 46, 47,48,49e0 52; e sequências de aminoácido que têm 1, 2 ou 3 diferença(s) do aminoácido com SEQ ID NOs: 37, 53, 36, 40, 50, 51, 44, 45, 43, 39, 38, 41, 119, 42, 46, 47, 48, 49 6 52; e (iii) CDR3 é escolhida a partir do grupo consistindo em SEQ ID NO: SEQ ID NOs: 55, 118, 71, 54, 58, 68, 69, 62, 63, 61, 57, 56, 59, 60, 64, 65, 66, 67 e 70; e sequências de aminoácido que têm 1, 2, 3 ou 4 diferença(s) do aminoácido com SEQ ID NOs: 55, 118, 71, 54, 58, 68, 69, 62, 63, 61, 57, 56, 59, 60, 64, 65, 66, 67 e 70.

[00165] Em particular, a presente invenção se refere a um ISVD conforme descrito no presente documento, em que o referido ISVD que liga especificamente ADAMTSSB5 essencialmente consiste em 4 re- giões framework (FR1 a FRA, respectivamente) e 3 regiões determi- nantes de complementariedade (CDR1 a CDR3 respectivamente), na qual (i), CDR1 é escolhida a partir do grupo consistindo em (a) SEQIDNO:22;e (b) sequência de aminoácido que tem 1, 2, 3, 4, 5 ou 6 di- ferença(s) do aminoácido com a SEQ ID NO: 22, em que - na posição 2 o S foi alterado para R; - na posição 3 o A foi alterado para T; - na posição 4 o V foi alterado para F; - na posição 6 o V foi alterado para S; - na posição 7 o N foi alterado para Y; e/ou - na posição 10 o A foi alterado para G; (ii) CDR2 é SEQ ID NO: 36; e (iii) CDR3 é SEQ ID NO: 54.

[00166] Em particular, a presente invenção se refere a um ISVD conforme descrito no presente documento, em que o referido ISVD que liga especificamente ADAMTSSB5 essencialmente consiste em 4 re- giões framework (FR1 a FRA4, respectivamente) e 3 regiões determi- nantes de complementariedade (CDR1 a CDR3 respectivamente), na qual (), CDR1 é SEQ ID NO: 33; (ii) CDR2 é escolhida a partir do grupo consistindo em (c) SEQIDNO:50;e (d) sequência de aminoácido que tem 1, 2 ou 3 diferen- ça(s) do aminoácido com a SEQ ID NO: 50, em que - na posição 8 o M foi alterado para |; - na posição 9 o P foi alterado para T; e/ou - na posição 10 o Y foi alterado para F; e (iii) CDR3 é escolhida a partir do grupo consistindo em (e) SEQIDNO: 68; e (f) sequência de aminoácido que tem 1 ou 2 diferença(s) do aminoácido com a SEQ ID NO: 68, em que - na posição 5 o F foi alterado para L; e/ou - na posição 11 o D foi alterado para E.

[00167] Em particular, a presente invenção se refere a um ISVD conforme descrito no presente documento, em que o referido ISVD que liga especificamente ADAMTSS5 essencialmente consiste em 4 re- giões framework (FR1 a FRA, respectivamente) e 3 regiões determi- nantes de complementariedade (CDR1 a CDR3 respectivamente), na qual (i), CDR1 é SEQ ID NO: 28; (ii), CDR2 é escolhida a partir do grupo consistindo em (c) SEQIDNO: 44;e (d) sequência de aminoácido que tem 1, 2 ou 3 diferen- ça(s) do aminoácido com a SEQ ID NO: 44, em que

- na posição 3 o S foi alterado para T; - na posição 4 o R foi alterado para W; - na posição 8 o T foi alterado para |; e/ou - na posição 9 o T foi alterado para L; e (iii) CDR3 é escolhida a partir do grupo consistindo em (e) SEQIDNO:62;e (f) sequência de aminoácido que tem 1 ou 2 diferença(s) do aminoácido com a SEQ ID NO: 62, em que - na posição 1 o G foi alterado para S; e/ou - na posição 14 o D foi alterado para E.

[00168] Em particular, a presente invenção se refere a um ISVD conforme descrito no presente documento, em que o referido ISVD especificamente liga ADAMTSSB5 e essencialmente consiste em 4 regi- ões framework (FR1 a FRA, respectivamente) e 3 regiões determinan- tes de complementariedade (CDR1 a CDR3 respectivamente), na qual - —“CDRI1 é escolhida a partir do grupo consistindo na SEQ ID NOs: 21, 35, 20, 22, 25, 33, 28, 24, 23, 26, 27, 29, 30, 31, 32 e 34; - CDR2 é escolhida a partir do grupo consistindo na SEQ ID NOs: 37, 53, 36, 40, 50, 51, 44, 45, 43, 39, 38, 41, 119, 42, 46, 47, 48,490 52; e - CDR3é escolhida a partir do grupo consistindo na SEQ ID NOs: 55, 118, 71, 54, 58, 68, 69, 62, 63, 61, 57, 56, 59, 60, 64, 65, 66, 67 e 70.

[00169] Em particular, a presente invenção se refere a um ISVD conforme descrito no presente documento, em que o referido ISVD especificamente liga ADAMTSS5 e essencialmente consiste em 4 regi- ões framework (FR1 a FRA4, respectivamente) e 3 regiões determinan- tes de complementariedade (CDR1 a CDR3 respectivamente), na qual o referido ISVD é escolhido a partir do grupo de ISVDs, em que: CDR1 é SEQ ID NO: 21, CDR2 é SEQ ID NO: 37 e CDR3 é

SEQ ID NO: 55;

CDR1 é SEQ ID NO: 35, CDR2 é SEQ ID NO: 53 e CDR3 é SEQ ID NO: 118;

CDR1 é SEQ ID NO: 35, CDR2 é SEQ ID NO: 53 e CDR3 é SEQ ID NO: 71;

CDR1 é SEQ ID NO: 20, CDR2 é SEQ ID NO: 36 e CDR3 é SEQ ID NO: 54;

CDR1 é SEQ ID NO: 22, CDR2 é SEQ ID NO: 36 e CDR3 é SEQ ID NO: 54;

CDR1 é SEQ ID NO: 25, CDR2 é SEQ ID NO: 40 e CDR3 é SEQ ID NO: 58;

CDR1 é SEQ ID NO: 33, CDR2 é SEQ ID NO: 50 e CDR3 é SEQ ID NO: 68;

CDR1 é SEQ ID NO: 33, CDR2 é SEQ ID NO: 51 e CDR3 é SEQ ID NO: 69;

CDR1 é SEQ ID NO: 28, CDR2 é SEQ ID NO: 44 e CDR3 é SEQ ID NO: 62;

CDR1 é SEQ ID NO: 28, CDR2 é SEQ ID NO: 45 e CDR3 é SEQ ID NO: 63;

CDR1 é SEQ ID NO: 28, CDR2 é SEQ ID NO: 43 e CDR3 é SEQ ID NO: 61;

CDR1 é SEQ ID NO: 24, CDR2 é SEQ ID NO: 39 e CDR3 é SEQ ID NO: 57;

CDR1 é SEQ ID NO: 23, CDR2 é SEQ ID NO: 38 e CDR3 é SEQ ID NO: 56;

CDR1 é SEQ ID NO: 26, CDR2 é SEQ ID NO: 41 e CDR3 é SEQ ID NO: 59;

CDR1 é SEQ ID NO: 27, CDR2 é SEQ ID NO: 119 e CDR3 é SEQ ID NO: 60;

CDR1 é SEQ ID NO: 27, CDR2 é SEQ ID NO: 42 e CDR3 é

SEQ ID NO: 60; CDR1 é SEQ ID NO: 29, CDR2 é SEQ ID NO: 46 e CDR3 é SEQ ID NO: 64; CDR1 é SEQ ID NO: 30, CDR2 é SEQ ID NO: 47 e CDR3 é SEQ ID NO: 65; CDR1 é SEQ ID NO: 31, CDR2 é SEQ ID NO: 48 e CDR3 é SEQ ID NO: 66; CDR1 é SEQ ID NO: 32, CDR2 é SEQ ID NO: 49 e CDR3 é SEQ ID NO: 67; e CDR1 é SEQ ID NO: 34, CDR2 é SEQ ID NO: 52 e CDR3 é SEQ ID NO: 70.

[00170] Em um aspecto preferido específico, a presente invenção se refere a um ISVD conforme descrito no presente documento, em que o referido ISVD especificamente liga ADAMTSS5 e essencialmente consiste em 4 regiões framework (FR1 a FRA4, respectivamente) e 3 regiões determinantes de complementariedade (CDR1 a CDR3 res- pectivamente), nas quais CDR1 é ou compreende SEQ ID NO: 21, CDR?2 é SEQ ID NO: 37 e CDR3 é SEQ ID NO: 55.

[00171] Em particular, a presente invenção se refere a um ISVD conforme descrito no presente documento, em que o referido ISVD especificamente liga ADAMTSS5 e essencialmente consiste em 4 regi- ões framework (FR1 a FRA, respectivamente) e 3 regiões determinan- tes de complementariedade (CDR1 a CDR3 respectivamente), nas quais o referido ISVD é escolhido a partir do grupo consistindo na SEQ ID NO:s 2, 116, 19, 1, 3, 6, 16, 17, 10, 11, 9, 5, 4, 7, 8, 117, 12,13, 14,

15618.

[00172] Será compreendido que, sem limitação, os domínios variáveis únicos de imunoglobulina da presente invenção podem ser usados como um "bloco de construção" para a preparação de um polipeptídeo, que pode opcionalmente conter um ou mais domínios variáveis únicos de imunoglobulina adicionais que podem server como um bloco de construção (isto é, contra o mesmo ou um outro epítopo em ADAMTSS5 e/ou contra um ou mais outros antígenos, proteínas ou alvos diferentes de ADAMTSS5).

[00173] O polipeptídeo da invenção (também indicado no presente document como "construto de nanocorpo") compreende pelo menos um ISVD que liga uma ADAMTS, preferivelmente ADAMTSS, tal como dois ISVDs que ligam ADAMTSS, e preferivelmente também um ISVD que liga albumina. Em um polipeptídeo da invenção, os ISVDs podem ser diretamente ligados ou ligados através de um ligante. Ainda mais preferivelmente, o polipeptídeo da invenção compreende uma exten- são C-terminal. Conforme será detalhado no presente documento, a extensão C-terminal essencialmente previne/remove a ligação dos an- ticorpos/fatores preexistentes na maioria das amostras de indivíduos humanos/pacientes. A extensão C-terminal está presente de forma C- terminal do ultimo resíduo de aminoácido (geralmente um resíduo de serina) do ultimo (localizado mais C-terminalmente) ISVD.

[00174] Conforme adicionalmente elaborado infra, os ISVDs podem ser derivados de um domínio VHn, Vu ou V., no entanto, os ISVDs são escolhidos de forma que eles não formem pares complementares de domínios Vx e V. nos polipeptídeos da invenção. O nanocorpo, VHr, e VHH humanizado são incomuns porque eles são derivados de anticor- pos camelídeos naturais que não têm nenhuma cadeia leve, e assim esses domínios são incapazes de se associar com cadeias leves de camelídeo para formar pares Vu e V. complementares. Sendo assim, os polipeptídeos da presente invenção não compreendem ISVDs com- plementares e/ou formam pares de ISVD complementares, tal como, por exemplo, pares Vx / V. complementares.

[00175] Em geral, polipeptídeos ou construtos que compreendem ou essencialmente consistem em um único bloco de construção, ISVD único ou nanocorpo único serão referidos no presente document como polipeptídeos "monovalentes" e "construtos monovalentes", respec- tivamente. Polipeptídeos ou construtos que compreendem dois ou mais blocos de construção (tais como por exemplo, ISVDs) também serão referidos no presente documento como polipeptídeos ou con- strutos "multivalentes", e os blocos de construção/ISVDs presentes nos referidos polipeptídeos ou construtos também serão referidos no presente document como estando em um "formato multivalente". Por exemplo, um polipeptídeo "bivalente" pode compreender dois ISVDs, opcionalmente ligados através de uma sequência ligante, enquanto um polipeptídeo "trivalente" pode compreender três ISVDs, opcionalmente ligados através de duas sequências ligantes; enquanto um polipep- tídeo "tetravalente" pode compreender quatro ISVDs, opcionalmente ligados através de três sequências ligantes, etc.

[00176] Em um polipeptídeo multivalente, dois ou mais ISVDs po- dem ser os mesmos ou diferentes, e podem ser direcionados contra o mesmo antígeno ou determinante antigênico (por exemplo contra as mesmas partes ou epítopos ou contra diferentes partes ou epítopos) ou podem alternadamente ser direcionados contra diferentes antí- genos ou determinantes antigênicos; ou qualquer combinação ade- quada da mesma. Polipeptídeos e construtos que contêm pelo menos dois blocos de construção (tal como por exemplo, ISVDs) na qual pelo menos um bloco de construção é direcionado contra um primeiro antígeno (isto é, ADAMTS5) e pelo menos um bloco de construção é direcionado contra um segundo antígeno (isto é, diferente de ADAMTSS5) também será referido como polipeptídeos e construtos "multiespecíficos", e os blocos de construção (tal como por exemplo, ISVDs) presentes nos referidos polipeptídeos e construtos também serão referidos no presente documento como estando em um "formato multiespecífico"”. Sendo assim, por exemplo, um polipeptídeo

"biespecífico" da invenção é um polipeptídeo que compreende pelo menos um ISVD direcionado contra um primeiro antígeno (isto é, ADAMTSS5) e pelo menos um ISVD adicional direcionado contra um segundo antígeno (isto é, diferente de ADAMTSS5), enquanto um polipeptídeo "triespecífico" da invenção é um polipeptídeo que com- preende pelo menos um ISVD direcionado contra um primeiro antígeno (isto é, ADAMTSS5), pelo menos um ISVD adicional direcio- nado contra um segundo antígeno (isto é, diferente de ADAMTSS5) e pelo menos um ISVD adicional direcionado contra um terceiro antígeno (isto é, diferente de ambos ADAMTSSB e o segundo antígeno); etc.

[00177] Em um aspecto, a presente invenção se refere a um polipeptídeo, compreendendo pelo menos 2 ISVDs, em que pelo me- nos 1 ISVD especificamente liga ADAMTS, preferivelmente ADAMTSS5, mais preferivelmente escolhido a partir do grupo consistindo na SEQ ID NO:s 2, 116, 19, 1, 3, 6, 16, 17, 10, 11, 9, 5, 4, 7, 117, 8, 12,13, 14, 15e18.

[00178] Em um aspecto, a presente invenção se refere a um polipeptídeo compreendendo pelo menos 2 ISVDs, em que os referi- dos pelo menos 2 ISVDs especificamente ligam ADAMTS, preferivel- mente ADAMTSS5, mais preferivelmente cada ISVD dos referidos 2 ISVDs é escolhido independentemente do grupo consistindo na SEQ ID NO:s 2, 116, 19, 1, 3, 6, 16, 17, 10, 11, 9, 5, 4, 7, 117, 8, 12,13, 14, 15e18.

[00179] Os polipeptídeos "multiparatópicos" e construtos "mul- tiparatópicos", tais como por exemplo, polipeptídeos ou construtos "biparatópicos" e polipeptídeos ou construtos "triparatópicos", com- preendem ou essencialmente consistem em dois ou mais blocos de construção no qual cada um tem um diferente paratopo.

[00180] Consequentemente, os ISVDs da invenção que ligam

ADAMTSS5 podem estar em forma essencialmente isolada (conforme definido no presente documento), ou eles podem fazer parte de um construto ou polipeptídeo, que pode compreender ou essencialmente consistir em um ou mais ISVD(s) que ligam ADAMTS5 e que podem opcionalmente compreender ainda uma ou mais sequências de ami- noácido adicionais (todos opcionalmente ligados através de um ou mais ligantes adequados). A presente invenção se refere a um polipeptídeo ou construto que compreende ou essencialmente consiste em pelo menos um ISVD de acordo com a invenção, tal como um ou mais ISVDs da invenção (ou fragmentos adequados dos mesmos), ligando ADAMTSS5.

[00181] Um ou mais ISVDs da invenção podem ser usados como um bloco de construção no referido polipeptídeo ou construto, de mo- do a prover um polipeptídeo ou construto da invenção monovalente, multivante ou multiparatópico, respectivamente, todos conforme descritos no presente documento. A presente invenção assim também se refere a um polipeptídeo que é um construto monovalente com- preendendo ou essencialmente consistindo em um polipeptídeo mono- valente ou ISVD da invenção.

[00182] A presente invenção assim também se refere a um polipep- tídeo ou construto que é um polipeptídeo multivalente ou construto multivalente, respectivamente, tal como por exemplo, um polipeptídeo ou construto bivalente ou trivalente compreendendo ou essencialmen- te consistindo em dois ou mais ISVDs da invenção (para polipeptídeos multivalentes e multiespecíficos contendo um ou mais domínios VAHH e a sua preparação, a referência também é feita a Conrath et a/. (J. Biol. Chem. 276: 7346-7350, 2001), assim como a por exemplo, publica- ções internacionais WO 96/34103, WO 99/23221 e WO 2010/115998).

[00183] Em um aspecto, na sua forma mais simples, o polipeptídeo ou construto da invenção multivalente é um polipeptídeo ou construto da invenção bivalente compreendendo um primeiro ISVD, tal como um nanocorpo, direcionado contra ADAMTSS5, e um Segundo ISVD idênti- co, tal como um nanocorpo, direcionado contra ADAMTS5, em que o referido primeira e o referido segundo ISVDs, tais como nanocorpos, podem ser opcionalmente ligados através de uma sequência ligante (conforme definido no presente documento). Em uma outra forma, um polipeptídeo ou construto da invenção multivalente pode ser um polipeptídeo ou construto da invenção trivalente, compreendendo um primeiro ISVD, tal como nanocorpo, direcionado contra ADAMTS5, um segundo ISVD idêntico, tal como nanocorpo, direcionado contra ADAMTSS5 e um terceiro ISVD idêntico, tal como um nanocorpo, di- recionado contra ADAMTSS5, na qual os referidos primeiro, segundo e terceiro ISVDs, tais como nanocorpos, podem ser opcionalmente liga- dos através de uma ou mais, e em particular duas, sequências ligantes. Em um aspecto, a invenção se refere a um polipeptídeo ou construto que compreende ou essencialmente consiste em pelo menos dois ISVDs de acordo com a invenção, tal como 2, 3 ou 4 ISVDs (ou fragmentos adequados dos mesmos), ligando ADAMTS5. Dois ou mais ISVDs podem ser opcionalmente ligados através de um ou mais ligantes peptídicos.

[00184] Em um outro aspecto, o polipeptídeo ou construto da in- venção multivalente pode ser um polipeptídeo ou construto da in- venção biespecífico, compreendendo um primeiro ISVD, tal como um nanocorpo, direcionado contra ADAMTSS5, e um segundo ISVD, tal como um nanocorpo, direcionado contra um segundo antígeno, tal como, por exemplo, agrecan, na qual os referidos primeiro e segundo ISVDs, tais como nanocorpos, podem ser opcionalmente ligados atra- vés de uma sequência ligante (conforme definido no presente docu- mento); enquanto um polipeptídeo ou construto da invenção multiva- lente também pode ser um polipeptídeo ou construto da invenção triespecífico, compreendendo um primeiro ISVD, tal como um nano- corpo, direcionado contra ADAMTS5, um segundo ISVD, tal como um nanocorpo, direcionado contra um segundo antígeno, tal como por ex- emplo agrecan, e um terceiro ISVD, tal como um nanocorpo, direcio- nado contra um terceiro antígeno, no qual o referido primeiro, segundo e terceiro ISVDs, tais como nanocorpos, podem ser opcionalmente lig- ados através de uma ou mais, e em particular duas, sequências ligantes.

[00185] A invenção ainda se refere a um polipeptídeo multivalente que compreende ou (essencialmente) consiste em pelo menos um ISVD (ou fragmentos adequados dos mesmos) ligando ADAMTSS5, preferivelmente ADAMTSS5 humana, e um ISVD adicional, tal como um ISVD ligando agrecan.

[00186] Polipeptídeos ou construtos bivalentes, biespecíficos par- ticularmente preferidos de acordo com a invenção são aqueles mostrados nos Exemplos descritos no presente documento e na Tabela A-1 (cf. SEQ ID NO:s 120-130 (isto é SEQ ID NO: 120, 121, 122, 123, 124, 125, 126, 127, 128, 129 e 130), ainda mais preferivel- mente SEQ ID NO:s 129 e 130).

[00187] Em um aspecto preferido, o polipeptídeo ou construto da invenção compreende ou essencialmente consiste em pelo menos dois ISVDs, em que os referidos pelo menos dois ISVDs podem ser os mesmos ou diferentes, porém dos quais pelo menos um ISVD é di- recionado contra ADAMTSS5, preferivelmente o referido ISVD ligando ADAMTSS5 é escolhido a partir do grupo consistindo na SEQ ID NO:s 2, 116, 19, 1, 3, 6, 16, 17, 10, 11, 9, 5, 4, 7, 117, 8, 12, 13, 14, 15 e 18.

[00188] Doisoumais!SVDs presentes no polipeptídeo ou construto da invenção multivalente podem consistir em uma sequência de domí- nio variável de cadeia leve (por exemplo, uma sequência V.) ou de uma sequência de domínio variável de cadeia pesada (por exemplo,

uma sequência Vy); eles podem consistir em uma sequência de domí- nio variável de cadeia pesada que é derivada de um anticorpo conven- cional de quatro cadeias ou de uma sequência de domínio variável de cadeia pesada que é derivada de anticorpo de cadeia pesada. Em um aspecto preferido, eles consistem em um anticorpo de domínio (ou um aminoácido que é adequado para uso como um anticorpo de domínio), de um único anticorpo de domínio (ou um aminoácido que é adequado para uso como um único anticorpo de domínio), de um "dAb" (ou um aminoácido que é adequado para uso como um dAb), de um Nano- body&O (incluindo, mas não limitado a Vu), de uma sequência de Vrr humanizada, de uma sequência de Vx camelizada; ou de uma se- quência de VnHn que foi obtida pela maturação da afinidade. Dois ou mais domínios variáveis únicos de imunoglobulina podem consistir em um nanocorpo parcialmente ou totalmente humanizado ou de um VHH totalmente humanizado.

[00189] Em um aspecto da invenção, o primeiro ISVD e o segundo ISVD presentes no polipeptídeo ou construto da invenção mul- tiparatópico (preferivelmente biparatópico ou triparatópico) não com- petem (de forma cruzada) um com o outro pela ligação a ADAMTSS5 e, como tal, pertencem a diferentes famílias. Consequentemente, a presente invenção se refere a um polipeptídeo ou construto mul- tiparatópico (preferivelmente biparatópico) compreendendo dois ou mais ISVDs em que cada ISVD pretence a uma família diferente. Em um aspecto, o primeiro ISVD deste polipeptídeo ou construto da in- venção multiparatópico (preferivelmente biparatópico) não bloqueia de forma cruzada a ligação a ADAMTSS5 do segundo ISVD deste polipep- tídeo ou construto da invenção multiparatópico (preferivelmente biparatópico) e/ou o primeiro ISVD não está bloqueado de forma cru- zada da ligação a ADAMTSS5 pelo segundo ISVD. Em um outro aspec- to, o primeiro ISVD de um polipeptídeo ou construto da invenção mul-

tiparatópico (preferivelmente biparatópico) bloqueia de forma cruzada a ligação a ADAMTS5 do segundo ISVD deste polipeptídeo ou con- struto da invenção multiparatópico (preferivelmente biparatópico) e/ou o primeiro ISVD é bloqueado de forma cruzada da ligação a ADAMTS5 pelo segundo ISVD.

[00190] Em um aspecto particularmente preferido, o polipeptídeo ou construto da invenção compreende or essencialmente consiste em três ou mais ISVDs, dos quais pelo menos dois ISVDs são direcionados contra ADAMTS5. Será compreendido que os referidos pelo menos dois ISVDs direcionados contra ADAMTS5 podem ser os mesmos ou diferentes, podem ser direcionados contra o mesmo epítopo ou epítopos diferentes de ADAMTSS5, podem pertencer ao mesmo com- partimento de epítopo ou a diferentes compartimentos de epítopo, e/ou podem se ligar aos mesmos ou diferentes domínios de ADAMTSSB5.

[00191] As afinidades relativas podem depender da localização dos ISVDs no polipeptídeo. Será compreendido que a ordem dos ISVDs em um polipeptídeo da invenção (orientação) pode ser escolhida de acordo com as necessidades do versado na técnica. A ordem dos ISVDs individuais assim como se o polipeptídeo compreende um ligan- te é uma questão de escolha do design. Algumas orientações, com ou sem ligantes, podem prover características de ligação preferidas em comparação com outras orientações. Por exemplo, a ordem de um primeiro ISVD (por exemplo ISVD 1) e um segundo ISVD (por exemplo ISVD 2) no polipeptídeo da invenção pode ser (do N-terminal ao C- terminal): (i) ISVD 1 (por exemplo Nanocorpo 1) - [ligante] - ISVD 2 (por exemplo Nanocorpo 2) - [extensão C-terminal]; ou (ii) ISVD 2 (por exemplo Nanocorpo 2) - [ligante]- ISVD 1 (por exemplo Nanocorpo 1) - [extensão C-terminal]l; (em que as porções entre os colchetes, isto é ligante e extensão C-terminal, são opcionais). Todas as orientações estão abrangidas pela invenção. Polipeptídeos que contêm uma orien-

tação de ISVDs que provê as características de ligação desejadas po- dem ser facilmente identificados pelo rastreamento de rotina, por exemplo conforme exemplificado na seção de exemplos. Uma ordem preferida é de N-terminal a C-terminal: ISVD que liga ADAMTSS5 - [ligante]- ISVD que liga albumina ou agrecan - [extensão C-terminal], em que as porções entre os colchetes são opcionais.

[00192] Em um aspecto, a presente invenção se refere a um polipeptídeo compreendendo dois ou mais ISVDs que especificamente ligam ADAMTSS5, em que a) pelo menos um "primeiro" ISVD especificamente liga um primeiro determinante antigênico, epítopo, parte, domínio, subunidade ou conformação de ADAMTSS, preferivelmente o referido "primeiro" ISVD que liga especificamente ADAMTSSB é escolhido a partir do grupo consistindo na SEQ ID NO:s 2, 1, 3, 6, 16, 17, 10, 11, 9, 5, 4, 7, 8, 117, 12,13, 14, 15e 18; e b) pelo menos um "segundo" ISVD especificamente liga um segundo determinante antigênico, epítopo, parte, domínio, subuni- dade ou conformação de ADAMTSS, diferente do primeiro epítopo de- terminante antigênico, parte, domínio, subunidade ou conformação, respectivamente, preferivelmente o referido "segundo" ISVD que liga especificamente ADAMTS5 é SEQ ID NO: 116 ou 19.

[00193] Em um aspecto preferido, o polipeptídeo ou construto da invenção compreende ou essencialmente consiste em pelo menos dois ISVDs que ligam ADAMTSS5, em que os referidos pelo menos dois ISVDs podem ser os mesmos ou diferentes, os quais são independen- temente escolhidos a partir do grupo consistindo na SEQ ID NO:s 2, 116, 19, 1, 3, 6, 16, 17, 10, 11, 9, 5,4, 7, 117, 8, 12, 13, 14, 15 e 18.

[00194] Em um aspecto adicional, a invenção se refere a um polipeptídeo ou construto multiparatópico (preferivelmente biparatópi- co) compreendendo dois ou mais ISVDs direcionados contra

ADAMTSS5 que ligam os mesmos epítopo(s) conforme são ligados por qualquer uma das SEQ ID NO:s 2, 116, 19, 1, 3, 6, 16, 17, 10, 11,9,5, 4,7, 117, 8, 12,13, 14, 15 e 18.

[00195] Em um aspecto adicional, a invenção se refere a um polipeptídeo conforme descrito no presente documento, em que o re- ferido polipeptídeo tem pelo menos 80%, 90%, 95% ou 100% de iden- tidade sequencial com qualquer uma das SEQ ID NO:s 1-19 (isto é SEQ ID NO: 1, 2, 3,4,5,6,7,8,9,10, 11,12, 13, 14, 15, 16, 17, 18 e 19), 116-117 ou 120-130 (isto é SEQ ID NOs: 120, 121, 122, 123, 124, 125, 126, 127, 128, 129 e 130).

[00196] Em um aspecto, a presente invenção se refere a um polipeptídeo conforme descrito no presente documento, que é escolhi- do a partir do grupo consistindo na SEQ ID NO: 127 (clone 130 049- 093-Alb), SEQ ID NO: 126 (clone 129 2F3-093-Alb), SEQ ID NO: 127 (clone 130 049-093-Alb) e SEQ ID NO: 128 (clone 131 9D3-093-Alb).

[00197] A técnica precisa de terapias mais eficazes para distúrbios que afetam a cartilagem nas articulações, tal como osteoartrite. Espe- cialmente quando administradas sistematicamente, o tempo de resi- dencia da maior parte dos fármacos é insuficiente. Os presentes inven- tores hipotetizaram que a eficácia de um fármaco terapêutico, tal como um construto, polipeptídeo e ISVD da invenção, poderia ser aumen- tada significativamente pelo acoplamento do fármaco terapêutico a uma porção que estende a meia-vida do fármaco e consequentemente aumenta a retenção do fármaco, mas que não interrompe a eficácia do referido fármaco terapêutico.

[00198] Em um aspecto específico da invenção, um construto ou polipeptídeo da invenção pode ter uma porção conferindo uma meia- vida aumentada, comparado ao construto ou polipeptídeo correspon- dente da invenção sem a referida porção. Alguns exemplos preferidos, mas não limitantes dos referidos construtos e polipeptídeos da inven-

ção se tornarão claros ao versado na técnica com base na divulgação adicional no presente documento, e por exemplo compreendem ISVDs ou polipeptídeos da invenção que foram quimicamente modificados para aumentar a meia-vida dos mesmos (por exemplo, por meio de peguilação); aglutinantes ADAMTSS5 da invenção, tais como ISVDs e/ou polipeptídeos da invenção que compreendem pelo menos um sí- tio de ligação adicional a uma proteína do soro (tal como albumina do soro); ou polipeptídeos da invenção que compreendem pelo menos um ISVD da invenção que é ligado a pelo menos uma porção (e em parti- cular pelo menos uma sequência de aminoácido) que aumenta a meia- vida da sequência de aminoácido da invenção.

Os exemplos de con- strutos da invenção, tais como polipeptídeos da invenção, os quais compreendem as referidas porções ou ISVDs que estendem a meia- vida se tornarão claros ao versado na técnica com base na divulgação adicional no presente documento; e por exemplo incluem, sem lim- itação, polipeptídeos nos quais um ou mais ISVDs da invenção são adequamente ligados a uma ou mais proteínas do soro ou fragmentos dos mesmos (tais como albumina do soro (humano) ou fragmentos adequados dos mesmos) ou a uma ou mais unidades de ligação que podem se ligar a proteínas do soro (tais como, por exemplo, anticorpos de domínio, domínios variáveis únicos de imunoglobulina que são adequados para uso como um anticorpo de domínio, anticorpos de domínio único, domínios variáveis únicos de imunoglobulina que são adequados para uso como um único anticorpo de domínio, dAbs, do- mínios variáveis únicos de imunoglobulina que são adequados para uso como um dAb, ou nanocorpos que podem se ligar a proteínas do soro tal como albumina do soro (tal como albumina do soro humano), imunoglobulinas do soro tal como IgG, ou transferrina; a referência é feita à descrição e referências adicionais mencionadas no presente documento); polipeptídeos nos quais uma sequência de aminoácido da invenção é ligada a uma porção Fc (tal como um Fc humano) ou uma parte ou fragmento adequado do mesmo; ou polipeptídeos nos quais um ou mais domínios variáveis únicos de imunoglobulina da invenção são ligados de forma adequada a uma ou mais proteínas ou peptídeos pequenos que se ligam a proteínas do soro, tal como, sem limitação, as proteínas e peptídeos descritos na publicação internacional WO 91/01743, WO 01/45746/, WO 02/076489, WOZ2008/068280, WO?2009/127691 e pedido PCT/EP2011/051559.

[00199] Em um aspecto, a presente invenção provê um construto da invenção ou um polipeptídeo, em que o referido construto ou refer- ido polipeptídeo ainda compreende a porção de ligação à proteína do soro ou uma proteína do soro. Preferivelmente, a referida porção de ligação à proteína do soro liga albumina do soro, tal como albumina do soro humano.

[00200] Em um aspecto, a presente invenção se refere a um poli- peptídeo conforme descrito no presente documento, compreendendo um ISVD que liga albumina do soro.

[00201] Em geral, os construtos ou polipeptídeos da invenção com meia-vida aumentada têm uma meia-vida que é pelo menos 1,5 vezes, preferivelmente pelo menos 2 vezes, tal como pelo menos 5 vezes, por exemplo pelo menos 10 vezes ou mais do que 20 vezes, maior do que a meia-vida dos construtos ou polipeptídeos correspondentes da in- venção per se, isto é sem a porção conferindo a meia-vida aumentada. Por exemplo, os construtos ou polipeptídeos da invenção com meia- vida aumentada podem ter uma meia-vida por exemplo, em humanos que é aumentada com mais do que 1 hora, preferivelmente mais do que 2 horas, mais preferivelmente mais do que 6 horas, tal como mais do que 12 horas, ou ainda mais do que 24, 48 ou 72 horas, comparado aos construtos ou polipeptídeos correspondentes da invenção per se, isto é sem a porção conferindo a meia-vida aumentada.

[00202] Em um aspecto preferido, mas não limitante da invenção, os construtos da invenção e polipeptídeos da invenção, têm uma meia- vida de soro, por exemplo em humanos que é aumentada com mais do que 1 hora, preferivelmente mais do que 2 horas, mais preferivelmente mais do que 6 horas, tal como mais do que 12 horas, ou ainda mais do que 24, 48 ou 72 horas, comparado aos construtos ou polipeptídeos correspondentes da invenção per se, isto é sem a porção conferindo a meia-vida aumentada.

[00203] Em um outro aspecto preferido, mas não limitante da in- venção, os referidos construtos da invenção, tal como polipeptídeos da invenção, exibem uma meia-vida de soro em humanos de pelo menos cerca de 12 horas, preferivelmente pelo menos 24 horas, mais pre- ferivelmente pelo menos 48 horas, ainda mais preferivelmente pelo menos 72 horas ou mais. Por exemplo, os construtos ou polipeptídeos da invenção podem ter uma meia-vida de pelo menos 5 dias (tal como cerca de 5 a 10 dias), preferivelmente pelo menos 9 dias (tal como cerca de 9 a 14 dias), mais preferivelmente pelo menos cerca de 10 dias (tal como cerca de 10 a 15 dias), ou pelo menos cerca de 11 dias (tal como cerca de 11 a 16 dias), mais preferivelmente pelo menos cerca de 12 dias (tal como cerca de 12 a 18 dias ou mais), ou mais do que 14 dias (tal como cerca de 14 a 19 dias).

[00204] Em um aspecto particularmente preferido, mas não limitan- te da invenção, a invenção provê um construto da invenção e um polipeptídeo da invenção, compreendendo além de um ou mais blocos de construção que ligam ADAMTSS5 pelo menos um bloco de con- strução que liga albumina do soro, tal como um ISVD que liga albumi- na do soro, tal como albumina do soro humano conforme descrito no presente documento. Preferivelmente, o referido ISVD que liga albu- mina do soro compreende ou essencialmente consiste em 4 regiões framework (FR1 a FRA, respectivamente) e 3 regiões determinantes de complementariedade (CDR1 a CDR3 respectivamente), na qual CDR1 é SFGMS, CDR2 é SISGSGSDTLYADSVKG e CDR3 é GGS- LSR. Preferivelmente, o referido ISVD que liga albumina do soro hu- mano é escolhido a partir do grupo consistindo em AIlb8, Alb23, Alb129, Alb132, Alb11, Alb11 (S112K)-A, AIb82, AIb82-A, AIb82-AA, AIDb82-AAA, AIb82-G, AIb82-GG, Alb82-GGG, Alb92 ou Alb223 (cf. Tabela D).

[00205] Em um aspecto, a presente invenção se refere a um polipeptídeo — conforme descrito no presente documento, com- preendendo pelo menos um ISVD que liga ADAMTSS5 e um ISVD que liga albumina do soro, preferivelmente escolhido a partir do grupo con- sistindo na SEQ ID NO: 129 (clone 577 2F3*-Alb), SEQ ID NO: 130 (clone 579 2F3*-093-Alb), SEQ ID NO: 120 (clone 4 2A12-Alb), SEQ ID NO: 121 (clone 5 2D7-Alb), SEQ ID NO: 122 (clone 6 2F3-Alb), SEQ ID NO: 123 (clone 69 049-Alb), SEQ ID NO: 124 (clone 70 9D3- Alb), SEQ ID NO: 125 (clone 71 3B2-Alb), SEQ ID NO: 126 (clone 129 2F3-093-Alb), SEQ ID NO: 127 (clone 130 049-093-Alb) e SEQ ID NO: 128 (clone 131 9D3-093-Alb)(cf. Tabela A-1).

[00206] Em uma modalidade, a presente invenção se refere um construto da invenção, tal como um polipeptídeo compreendendo a porção de ligação à proteína do soro, em que a referida porção de |i- gação à proteína do soro é um polipeptídeo baseado em não anticor- po.

[00207] A técnica precisa de terapias mais eficazes para distúrbios que afetam a cartilagem nas articulações, tal como osteoartrite. Mes- mo quando administrados de forma intra-articular, o tempo de residen- cia de maior parte dos fármacos para tartar a cartilagem afetada é in- suficiente. Os presentes inventores hipotetizaram que a eficácia de um fármaco terapêutico, tal como um construto, polipeptídeo e ISVD da invenção, pode ser modulada pelo acoplamento do fármaco terapêuti-

co a uma porção que "ancoraria" o fármaco na articulação e conse- quentemente aumentaria a retenção do fármaco, mas que não inter- romperia a eficácia do referido fármaco terapêutico (esta porção é também indicada no presente documento como "proteína de ancor- agem na cartilagem" ou "CAP"). Este conceito de ancoragem poderia não apenas modular a eficácia de um fármaco, mas também a especi- ficidade operacional para uma articulação doente ao diminuir a tox- icidade e os efeitos colaterais, ampliando assim o número de possíveis fármacos úteis.

[00208] Foi anticipado que um formato de uma molécula para uso clínico compreende um ou dois blocos de construção, tais como |IS- VDs, que ligam ADAMTSS5 e um ou mais blocos de construção, por exemplo ISVDs, com um referido modo de retenção da ação, e pos- sivelmente porções adicionais. No pedido copendente, demonstra-se que os referidos formatos retêm ambos efeitos de ligação da ADAMTSS5 e um efeito terapêutico, por exemplo atividade inibidora, assim com as propriedades de retenção. Um ou mais blocos de con- strução, tais como ISVDs, com um modo de retenção da ação podem ser qualquer bloco de construção tendo um efeito de retenção ("bloco de construção CAP") em doenças nas quais ADAMTSS5 está envolvida, tal como doença artrítica, osteoartrite, displasia espondiloepimeta- fisária, hernia de disco espinhal, doença degenerativa do disco lombar, doença degenerativa das articulações e policondrite recidivante, oste- ocondrite dissecante e agrecanopatias

[00209] Um "bloco de construção CAP" é usado para direcionar, ancorar e/ou reter outros blocos de construção, por exemplo blocos de construção terapêuticos, tais como ISVDs que ligam ADAMTS5 em um sítio desejado, tal como por exemplo em uma articulação, na qual o referido outro bloco de construção, por exemplo bloco de construção terapêutico é para exercer o seu efeito, por exemplo ligando e/ou ini-

bindo ADAMTSSB.

[00210] Os presentes inventores também hipotetizaram que os ag- lutinantes agrecan, tais como ISVD(s) que ligam agrecan devem po- tencialmente funcionar como uma referida âncora, embora agrecan seja altamente glicosilado e degradado em vários distúrbios que afetam a cartilagem nas articulações. Além do mais, em vista dos cus- tos e extensivos testes em vários modelos animais que necessitaram antes um fármaco podem entrar na clínica, tais como aglutinantes agrecan devem preferencialmente ter uma ampla reatividade cruzada, por exemplo os aglutinantes agrecan devem se ligar a agrecan de várias espécies.

[00211] Usando vários métodos de imunização, rastreio e caracter- ização ingeniosos, os presentes inventores foram capazes de identi- ficar vários aglutinantes agrecan com características de seletividade, estabilidade e especificidade superiores, as quais possibilitaram re- tenção prolongada e atividade na articulação (cf. pedido copendente).

[00212] Emum aspecto, a presente invenção se refere a um méto- do para reduzir e/ou inibir o efluxo da composição, um polipeptídeo ou um construto a partir de uma articulação, em que o referido método compreende administrar uma quantidade farmaceuticamente ativa de pelo menos um polipeptídeo de acordo com a invenção, um construto de acordo com a invenção, ou uma composição de acordo com a in- venção a uma pessoa que necessita do mesmo.

[00213] Na presente invenção o termo "reduzir e/ou inibir o efluxo" significa reduzir e/ou inibir o fluxo de saída da composição, polipep- tídeo ou construto de dentro de uma articulação para fora. Preferivel- mente, o efluxo é reduzido e/ou inibido em pelo menos 10% tal como pelo menos 20%, 30%, 40% ou 50% ou ainda mais tal como pelo menos 60%, 70%, 80%, 90% ou ainda 100%, comparado ao efluxo da composição, polipeptídeo ou construto mencionados acima em uma articulação sob as mesmas condições, mas sem a presença do ag- lutinante agrecan da invenção, por exemplo ISVD(s) que ligam agre- can.

[00214] Além das doenças nais quais ADAMTSS5 está envolvida, tal como doença artrítica, osteoartrite, displasia espondiloepimetafísarea, doença degenerativa do disco lombar disk, doença degenerativa das articulações, artrite reumatoide, osteocondrite dissecante e agrecano- patias, antecipa-se que os aglutinantes de agrecan da invenção tam- bém podem ser usados em várias outras doenças que afetam a carti- lagem, tal como artropatias e condrodistrofias, doença artrítica(tal co- mo osteoartrite, artrite reumatoide, artrite gotosa, artrite psoriática, rup- tura ou desligamento traumático), acondroplasia, costocondrite, displa- sia espondiloepimetafisária, hernia de disco espinhal, doença degen- erativa do disco lombar, doença degenerativa das articulações e policondrite recidivante, osteocondrite dissecante e agrecanopatias (comumente indicadas no presente documento como "doenças asso- ciadas à agrecan").

[00215] O referido bloco de construção CAP, por exemplo ISVD(s) que ligam agrecan, preferivelmente se liga ao tecido cartilaginoso tal como cartilagem e/ou menisco. Em um aspecto preferido, o bloco de construção CAP é reativo de forma cruzada para outras espécies e especificamente liga uma ou mais de agrecan humana (SEQ ID NO: 155), agrecan de cachorro, agrecan bovino, agrecan de rato; agrecan de porco; agrecan de camundongo, agrecan de coelho; agrecan de cinomolgo e/ou agrecan de reso. A informação estrutural relevanta pa- ra agrecan pode ser encontrada, por exemplo, nos números de acesso (UniProt) conforme apresentados na Tabela 2 abaixo.

[00216] Um bloco de construção CAP preferido é um ISVD que liga agrecan, preferivelmente agrecan humana, preferivelmente represen- tados pela SEQ ID NO: 155 conforme apresentado na Tabela B.

Tabela 2

[00217] A presente invenção pertence assim a um polipeptídeo ou construto de acordo com a invenção, compreendendo ainda pelo me- nos um bloco de construção CAP.

[00218] A presente invenção pertence assim a um polipeptídeo ou construto de acordo com a invenção, compreendendo ainda pelo me- nos um ISVD que liga especificamente agrecan, preferivelmente esco- lhido a partir dos ISVDs representados pela SEQ ID NO:s 156 e 157.

[00219] Em um aspecto, a presente invenção se refere a um polipeptídeo — conforme descrito no presente documento, com- preendendo pelo menos 2 ISVDs que especificamente ligam agrecan.

[00220] Em um aspecto, a presente invenção se refere a um polipeptídeo conforme descrito no presente documento, compre- endendo pelo menos 2 ISVDs que especificamente ligam Agrecan, em que os referidos pelo menos 2 ISVDs que especificamente ligam Agre- can podem ser os mesmos ou diferentes.

[00221] Em um aspecto, a presente invenção se refere a um polipeptídeo conforme descrito no presente documento, compreen- dendo pelo menos 2 ISVDs que especificamente ligam Agrecan, em que os referidos pelo menos 2 ISVDs que especificamente ligam Agre- can são independentemente escolhidos a partir do grupo consistindo na SEQ ID NOs: 156-157.

[00222] Em um aspecto, a presente invenção se refere a um polipeptídeo conforme descrito no presente documento, compreen-

dendo pelo menos 2 ISVDs que especificamente ligam Agrecan, em que os referidos pelo menos 2 ISVDs que especificamente ligam Agre- can são representados pela SEQ ID NO:s 156-157.

[00223] Em um aspecto a presente invenção se refere a um polipeptídeo conforme descrito no presente documento, com- preendendo um ISVD que liga especificamente Agrecan, em que o re- ferido ISVD que liga especificamente Agrecan, especificamente se liga a Agrecan humana [SEQ ID NO: 155].

[00224] Em um aspecto a presente invenção se refere a um polipeptídeo conforme descrito no presente documento, em que o refe- rido ISVD que liga especificamente Agrecan, especificamente Agrecan humana (SEQ ID NO: 155), Agrecan de cachorro, Agrecan bovino, Agrecan de rato; Agrecan de porco; Agrecan de camundongo, Agrecan de coelho; Agrecan de cinomolgo e/ou Agrecan de reso.

[00225] Em um aspecto a presente invenção se refere a um polipeptídeo conforme descrito no presente documento, em que o refe- rido ISVD que liga especificamente agrecan preferivelmente se liga ao tecido cartilaginoso tal como cartilagem e/ou menisco.

[00226] Será compreendido que o ISVD, polipeptídeo e construto da invenção são preferivelmente estáveis. A estabilidade de um polipeptídeo, construto ou ISVD da invenção pode ser medida por ensaios de rotina conhecidos do versado na técnica. Os ensaios típi- cos incluem (sem ser limitantes) ensaios nos quais a atividade do re- ferido polipeptídeo, construto ou ISVD é determinada, seguido pela incubação no fluido sinovial por um período de tempo desejado, depois do qual a atividade é determinada novamente.

[00227] Em um aspecto a presente invenção se refere a um ISVD, polipeptídeo ou construto da invenção tendo uma estabilidade de pelo menos 7 dias, tal como pelo menos 14 dias, 21 dias, 1 mês, 2 meses ou mesmo 3 meses no fluido sinovial (SF) a 37ºC.

[00228] A atividade desejada do bloco de construção terapêutico, por exemplo ISVD que liga ADAMTSS5 no polipeptídeo ou construto da invenção multivalente pode ser medida pelos ensaios de rotina conhe- cidos do versado na técnica.

[00229] Em um aspecto, a presente invenção se refere a um con- struto conforme descrito no presente documento compreendendo pelo menos um ISVD ou polipeptídeo e um ou mais outros grupos, resídu- os, porções ou unidades de ligação. Um ou mais outros grupos, resíduos, porções ou unidades de ligação são preferivelmente escolhi- dos a partir do grupo consistindo em uma molécula de polietileno glicol, proteínas do soro ou fragmentos dos mesmos, unidades de ligação que podem se ligar a proteínas do soro, uma porção Fc e proteínas ou peptídeos pequenos que podem se ligar a proteínas do soro, ainda resíduos de aminoácido, marcadores ou outras porções funcionais, por exemplo, toxinas, marcadores, radioquímicos, etc.

[00230] Em uma modalidade, conforme mencionado infra, a presen- te invenção se refere a um construto da invenção, tal como um poli- peptídeo compreendendo uma porção conferindo extensão da meia- vida, em que a referida porção é um PEG. Consequentemente, a pre- sente invenção também se refere a um construto ou polipeptídeo da invenção compreendendo PEG.

[00231] Os resíduos de aminoácido adicionais podem ou não mudar, alterar ou de outra forma influenciar outras propriedades (bio- lógicas) do polipeptídeo da invenção e podem ou não adicionar mais funcionalidade ao polipeptídeo da invenção. Por exemplo, os referidos resíduos de aminoácido: a) podem compreender um resíduo Met N-terminal, por ex- emplo como resultado da expressão em uma célula hospedeira het- eróloga ou organismo hospedeiro.

b) podem formar uma sequência de sinal ou sequência líder que direciona a secreção do polipeptídeo da célula hospedeira medi- ante síntese (por exemplo para prover uma pré-, pró- ou prepro- forma do polipeptídeo da invenção, dependendo da célula hospedeira usada para expressar o polipeptídeo da invenção). Os peptídeos líderes secretadores adequados serão claros para o versado na técnica e po- dem ser conforme adicionalmente descritos no presente documento. Em geral, uma referida sequência líder será ligada ao N-terminal do polipeptídeo, embora a invenção em seu sentido mais amplo não es- teja limitada a isso; c) podem formar um "marcador", por exemplo uma sequên- cia de aminoácido ou resíduo que permite ou facilite a purificação do polipeptídeo, por exemplo usando técnicas de afinidade direcionadas contra a referida sequência ou resíduo. Depois disso, a referida se- quência ou resíduo podem ser removidos (por exemplo, através da clivagem química ou enzimática) para prover o polipeptídeo (para esta finalidade, o marcador pode ser opcionalmente ligado à sequência de aminoácido ou sequência polipeptídica através da sequência ligante clivável ou contém um motive clivável). Alguns exemplos preferidos, mas não limitantes dos referidos resíduos são resíduos de histidina múltiplos, resíduos de glutadiona e um marcador myc tal como AAAEQKLISEEDLNGAA; d) podem ser um ou mais resíduos de aminoácido que foram funcionalizados e/ou que podem servir como um sítio para ligação de grupos funcionais. Os resíduos de aminoácido e grupos funcionais adequados ficarão claros para o versado na técnica e in- cluem, porém não se limitam aos resíduos de aminoácidos e grupos funcionais mencionados no presente documento para os derivados dos polipeptídeos da invenção.

[00232] Também abrangidos na presente invenção estão os cons- trutos compreendendo um polipeptídeo e/ou ISVD da invenção, que ainda compreendem outras porções funcionais, por exemplo, toxinas, marcadores, radioquímicos, etc.

[00233] Os outros grupos, resíduos, porções ou unidades de liga- ção podem ser por exemplo grupos químicos, resíduos, porções, que podem ou não por si só serem biologicamente e/ou farmacologicamen- te ativas. Por exemplo, e sem limitação, os referidos grupos podem ser ligados a um ou mais ISVDs ou polipeptídeos da invenção de modo a prover um "derivado" do polipeptídeo ou construto da invenção.

[00234] Consequentemente, a invenção em seu sentido mais amplo também compreende construtos e/ou polipeptídeos que são derivados dos construtos e/ou polipeptídeos da invenção. Os referidos derivados podem ser geralmente obtidos por modificação, e em particular por modificação química e/ou biológica (por exemplo, enzimática) dos construtos e/ou polipeptídeos da invenção e/ou de um ou mais dos resíduos de aminoácidos que formam um polipeptídeo da invenção.

[00235] Exemplos de referidas modificações, assim como exemplos de resíduos de aminoácidos dentro das sequências de polipeptídeo que podem ser modificadas de uma tal forma (isto é, seja na estrutura principal da proteína, mas preferivelmente em uma cadeia lateral), métodos e técnicas que podem ser usados para introduzir as referidas modificações e os potenciais usos e vantagens das referidas modifi- cações ficarão claros para o versado na técnica (vide também Zangi et al., Nat Biotechnol 31(10):898-907, 2013).

[00236] Por exemplo, uma referida modificação pode envolver a in- trodução (por exemplo, através da ligação covalente ou de qualquer outra maneira) de um ou mais grupos (funcionais), resíduos ou por- ções em ou no polipeptídeo da invenção, e em particular de um ou mais grupos funcionais, resíduos ou porções que conferem uma ou mais propriedades ou funcionalidades desejadas ao construto e/ou polipeptídeo da invenção. Exemplos dos referidos grupos funcionais ficarão claros para o versado na técnica.

[00237] Por exemplo, a referida modificação pode compreender a introdução (por exemplo, através da ligação covalente ou de qualquer outra maneira adequada) de uma ou mais porções funcionais que au- mentam a meia-vida, a solubilidade e/ou a absorção do construto ou polipeptídeo da invenção, que reduzem a imunogenicidade e/ou a tox- icidade do construto ou polipeptídeo da invenção, que eliminam ou atenuam qualquer efeito colateral indesejável do construto ou polipep- tídeo da invenção, e/ou que conferem outras propriedades vantajosas a e/ou reduzem as propriedades indesejadas do construto ou polipep- tídeo da invenção; ou qualquer combinação de dois ou mais dos ante- cedentes. Exemplos das referidas porções funcionais e de técnicas para introdução delas ficarão claros ao versado na técnica, e podem geralmente compreender todas as porções funcionais e técnicas men- cionadas na técnica antecedente geral citada acima assim como as porções funcionais e técnicas conhecidas per se para a modificação de proteínas farmacêuticas, e em particular para a modificação de an- ticorpos ou fragmentos de anticorpo (incluindo ScFv's e anticorpos de domínio único), para os quais a referência é feita por exemplo ao Re- mington (Pharmaceutical Sciences, 16th ed., Mack Publishing Co., Easton, PA, 1980). As referidas porções funcionais podem, por exem- plo, estar ligadas diretamente (por exemplo, de forma covalente) a um polipeptídeo da invenção, ou opcionalmente através de um ligante ou espaçador adequado, conforme ficará novamente claro ao versado na técnica.

[00238] Um exemplo específico é um polipeptídeo ou construto da invenção derivado em que o polipeptídeo ou construto da invenção foi quimicamente modificado para aumentar a meia-vida do mesmo (por exemplo, por meio de peguilação). Esta é uma das técnicas mais am- plamente usadas para aumentar a meia-vida e/ou reduzir a imuno-

genicidade de proteínas farmacêuticas e compreende a ligação de um polímero farmacologicamente aceitável adequado, tal como poli(etile- noglicol) (PEG) ou derivados dos mesmos (tal como metoxipo- lifetilenoglicol) ou mPEG). Em geral, qualquer forma adequada de pe- guilação pode ser usada, tal como a peguilação usada na técnica para os anticorpos e fragmentos de anticorpo (incluindo, porém sem se limi- tar a anticorpos de domínio (único) e ScFv's); a referência é feita a, por exemplo, Chapman (Nat. Biotechnol. 54: 531-545, 2002), Veronese and Harris (Adv. Drug Deliv. Rev. 54: 453-456, 2003), Harris and Chess (Nat. Rev. Drug. Discov. 2: 214-221, 2003) e publicação inter- nacional WO 04/060965. Vários reagentes para peguilação de proteínas também estão disponíveis comercialmente, por exemplo a partir de Nektar Therapeutics, USA.

[00239] Preferivelmente, a peguilação sítio-direcionada é usada, em particular através de um resíduo de cisteína (vide por exemplo Yang et al. (Protein Engineering 16: 761-770, 2003). Por exemplo, para esta finalidade, PEG pode ser ligado a um resíduo de cisteína que ocorre naturalmente em um polipeptídeo da invenção, um construto ou polipeptídeo da invenção pode ser modificado de forma a introduzir um ou mais resíduos de cisteína para ligação de PEG, ou uma sequência de aminoácidos compreendendo um ou mais resíduos de cisteína para ligação de PEG podem ser fundidos ao N- e/ou C-terminal de um con- struto ou polipeptídeo da invenção, todos usando técnicas de engen- haria de proteínas conhecidas per se pelo versado na técnica.

[00240] — Preferivelmente, para os construtos ou polipeptídeos da in- venção, um PEG é usado com um peso molecular de mais do que 5000, tal como mais do que 10,000 e menos do que 200,000, tal como menos do que 100,000; por exemplo na faixa de 20,000-80,000.

[00241] Uma outra modificação geralmente menos preferida com- preende a glicosilação ligada a N ou ligada a O, geralmente como parte da modificação cotranslacional e/ou pós-translacional, de- pendendo da célula hospedeira usada para expressar o polipeptídeo da invenção.

[00242] Ainda uma outra modificação pode compreender a intro- dução de um ou mais marcadores detectáveis ou outros grupos ou porções geradores de sinal, dependendo do uso pretendido do polipeptídeo ou construto da invenção. Os marcadores adequados e técnicas para ligação, usando e detectando-os ficarão claros para o versado na técnica, e por exemplo incluirão, porém sem se limitar a, marcadores fluorescentes (tal como fluoresceína, isotiocianato, roda- mina, ficoeritrina, ficocianina, aloficocianina, o-ftaldeído e fluorescami- na e metais fluorescents tais como !ºº2Eu ou outros metais a partir da série lantanida), marcadores fosforescentes, marcadores quimiolumi- nescentes ou marcadores bioluminescentes (tais como luminal, isoluminol, éster de acridínio teromático, imidazol, sais de acridínio, éster de oxalato, dioxetano ou GFP e seus análogos), radio-isótopos (tais como ?H, 1291, 32P, 358, 14C, 5tCr, PCI, "Co, Co, *º*Fe e Se), me- tais, quelatos de metal ou cations metálicos (por exemplo, cátions me- tálicos tais como *Tc, 1231, Mn, 13, Ru, Cu, Ga e Ga ou out- ros metais ou cátions metálicos que são particularmente adequados para uso in vivo, in vitro ou diagnóstico in situ e produção de imagens, tais como (**"Gd, *Mn, 16ºDy, SºCr e *Fe)), assim como cromóforos e enzimas (tais como malato desidrogenase, nuclease estafilocócica, isomerase delta-V-esteroide, álcool desidrogenase de levedura, alfa- glicerofosfato desidrogenase, triose fosfato isomerase, biotinavidina peroxidase, peroxidase de rábano silvestre, fosfatase alcalina, aspara- ginase, glucose oxidase, B-galactosidase, ribonuclease, urease, cata- lase, glucose-Vl-fosfato desidrogenase, glucoamilase e acetilcolina esterase). Outros marcadores adequados ficarão claros para o ver- sado na técnica, e por exemplo incluirão porções que podem ser de-

tectadas usando NMR ou espectroscopia ESR.

[00243] Os referidos polipeptídeos marcados e construtos da in- venção podem, por exemplo, ser usados para ensaios in vitro, in vivo ou in situ (incluindo imunoensaios conhecidos per se tais como ELISA, RIA, EIA e outros "ensaios em sanduíche", etc.) assim como para final- idades de diagnóstico e imagens in vivo, dependendo da escolha do marcador específico.

[00244] “Como ficará claro para o versado na técnica, uma outra modificação pode envolver a introdução de um grupo quelante, por ex- emplo para quelar um dos metais ou cátions metálicos referidos acima. Os grupos quelantes adequados, por exemplo incluem, sem limitação, ácido dietil-enotriaminepentaacético (DTPA) ou ácido etileno- diaminatetraacético (EDTA).

[00245] Ainda uma outra modificação pode compreender a intro- dução de uma porção functional que é uma parte de um par de ligação específico, tal como o par de ligação biotin-(strept)avidina. Uma refer- ida porção functional pode ser usada para ligar o polipeptídeo da in- venção a uma outra proteína, polipeptídeo ou composto químico que é ligado a outra metade do par de ligação, isto é, através da formação do par de ligação. Por exemplo, um construto ou polipeptídeo da in- venção pode ser conjugado à biotina, e ligado a uma outra proteína, polipeptídeo, composto ou carreador conjugado à avidina ou estreptav- idina. Por exemplo, um referido construto conjugado ou polipeptídeo da invenção pode ser usado como um repórter, por exemplo em um sistema diagnóstico onde um agente produtor de sinal detectável é conjugado à avidina ou estreptavidina. Os referidos pares de ligação podem também por exemplo ser usados para ligar o construto ou polipeptídeo da invenção a um carreador, incluindo carreadores ade- quados para finalidades farmacêuticas. Um exemplo não limitante é o de formulações lipossomais descritas por Cao and Suresh (Journal of

Drug Targeting 8: 257, 2000). Os referidos pares de ligação também podem ser usados para ligar um agente terapeuticamente ativo ao polipeptídeo da invenção.

[00246] Outras modificações químicas e enzimáticas potenciais fi- carão claras ao versado na técnica. As referidas modificações também podem ser introduzidas para finalidades de pesquisa (por exemplo pa- ra estudar as relações de função-atividade). A referência é feita, por exemplo, a Lundblad and Bradshaw (Biotechnol. Appl. Biochem. 26: 143-151, 1997).

[00247] Preferivelmente, os construtos, polipeptídeos e/ou deriva- dos são tais que eles se ligam a ADAMTSS5, com uma afinidade (ade- quadmente medida e/ou expressada como um valor Kp (real ou aparente), um valor Ka (real ou aparente), uma taxa kKon ou taxa de as- sociação e/ou Kor ou taxa de dissociação, ou alternadamente como um valor ICs5o, conforme adicionalmente descrito no presente documento) que é definido no presente documento (por exemplo, conforme definido para os polipeptídeos da invenção).

[00248] Os referidos construtos e/ou polipeptídeos da invenção e derivados dos mesmos também podem estar em forma essencialmen- te isolada (conforme definido no presente documento).

[00249] Em um aspecto, a presente invenção se refere a um cons- truto da invenção, que compreende ou essencialmente consiste em um ISVD de acordo com a invenção ou um polipeptídeo de acordo com a invenção, e que ainda compreende um ou mais outros grupos, resíduos, porções ou unidades de ligação, que são opcionalmente |i- gadas através de um ou mais ligantes peptídicos.

[00250] Em um aspecto, a presente invenção se refere a um cons- truto da invenção, na qual um ou mais outros grupos, resíduos, por- ções ou unidades de ligação são escolhidos a partir do grupo consis- tindo em uma molécula de polietileno glicol, proteínas do soro ou fra-

gmentos das mesmas, unidades de ligação que podem se ligar a pro- teínas do soro, uma porção Fc e pequenas proteínas ou peptídeos que podem se ligar a proteínas do soro.

[00251] Nos construtos da invenção, tais como os polipeptídeos da invenção, dois ou mais blocos de construção, tais como por exemplo ISVDs, e opcionalmente um ou mais outros grupos, fármacos, agentes, resíduos, porções ou unidades de ligação podem ser direta- mente ligados um ao outro (conforme por exemplo descrito na publi- cação internacional WO 99/23221) e/ou podem ser ligados um ao out- ro através de um ou mais espaçadores ou ligantes adequados, ou qualquer combinação dos mesmos. Os espaçadores ou ligantes ade- quados para uso em polipeptídeos multivalentes e multiespecíficos fi- carão claros para o versado na técnica, e podem em geral ser qualquer ligante ou espaçador usado na técnica para ligar sequências de aminoácido. Preferivelmente, o referido ligante ou espaçador é ad- equado para uso na construção de construtos, proteínas ou polipep- tídeos que são para uso farmacêutico.

[00252] Por exemplo, o polipeptídeo da invenção pode, por exem- plo, ser um polipeptídeo trivalente, triespecífico, compreendendo um bloco de construção, tal como um ISVD que liga ADAMTS5, um ISVD que liga albumina, e potencialmente um outro bloco de construção, tal como um terceiro ISVD, no qual o referido primeiro, segundo e terceiro blocos de construção, tais como ISVDs, podem ser opcionalmente lig- ados através de uma ou mais, e em particular 2, sequências ligantes. Além disso, a presente invenção provê um construto ou polipeptídeo da invenção compreendendo um primeiro ISVD ligando ADAMTSS5 e possivelmente um segundo ISVD ligando albumina e/ou possivelmente um terceiro ISVD e/ou possivelmente um quarto ISVD, em que o refe- rido primeiro ISVD e/ou referido segundo ISVD e/ou possivelmente re- ferido terceiro ISVD e/ou possivelmente referido quarto ISVD são liga-

dos através de ligantes, em particular 3 ligantes.

[00253] Alguns ligantes particularmente preferidos incluem os ligantes que são usados na técnica para ligar fragmentos de anticorpo ou domínios de anticorpo. Esses incluem os ligantes mencionados na técnica antecedente geral citada acima, assim como por exemplo ligantes que são usados na técnica para construir diacorpos ou frag- mentos de ScFv (em relação a isso, no entanto, deve ser notado que, enquanto em diacorpos e fragmentos ScFv, a sequência ligante usada deve ter um comprimento, um grau de flexibilidade e outras proprie- dades que permitam que os domínios Vx e V. pertinentes fiquem jun- tos para formar o completo sítio de ligação ao antígeno, não há lim- itação específica no comprimento ou na flexibilidade do ligante usado no polipeptídeo da invenção, uma vez que cada ISVD, tais como nanocorpos, sozinhos formam um completo sítio de ligação ao antígeno).

[00254] Por exemplo, um ligante pode ser uma sequência de ami- noácido adequada, e em particular sequências de aminoácido dentre 1 e 50, preferivelmente entre 1 e 30, tal como entre 1 e 10 resíduos de aminoácidos. Alguns exemplos preferidos das referidas sequências de aminoácido incluem ligantes gly-ser, por exemplo do tipo (alyxsery),2, tal como (por exemplo (glyaser)3 ou (glyaser2)3, conforme descrito na pub- licação internacional WO 99/42077 e os ligantes GS30, GS15, GS9 e GS7 descritos nos pedidos por Ablynx mencionados no presente doc- umento (vide por exemplo as publicações WO 06/040153 e WO 06/122825), assim como as regiões do tipo dobradiça, tais como as regiões de dobradiça de anticorpos de cadeia pesada que ocorrem naturalmente ou sequências similares (tais como descritas na publi- cação internacionall WO 94/04678). Os ligantes preferidos são apresentados na Tabela C.

[00255] Alguns outros ligantes particularmente preferidos são poli-

alanina (tal como AAA), assim como os ligantes GS30 (vide também SEQ ID NO: 85 na publicação internacional WO 06/122825) e GS9 (vi- de também SEQ ID NO: 84 na publicação internacional WO 06/122825).

[00256] Outros ligantes adequados geralmente compreendem com- postos orgânicos ou polímeros, em particular aqueles adequados para uso em proteínas para uso farmacêutico. Por exemplo, as porções de poli(etilenoglicol) foram usadas para ligar os domínios de anticorpo, vide por exemplo a publicação internacional WO 04/081026.

[00257] Está abrangido dentro do escopo da invenção que o com- primento, o grau de flexibilidade e/ou outras propriedades do(s) ligante(s) usados (embora não crucial, como geralmente é para os ligantes usados em fragmentos de ScFv) pode ter alguma influência nas propriedades do construto da invenção final, tal como o polipep- tídeo da invenção, incluindo porém sem se limitar a uma afinidade, es- pecificidade ou avidez por uma quimiocina, ou por um ou mais dos out- ros antígenos. Com base na divulgação no presente documento, o versado na técnica será capaz de determinar o(s) ligante(s) ideal(ais) para uso em um construto específico da invenção, tal como o polipep- tídeo da invenção, opcionalmente depois de alguns experimentos lim- itados de rotina.

[00258] Por exemplo, em polipeptídeos multivalentes da invenção que compreendem blocos de construção, ISVDs ou nanocorpos di- recionados contra ADAMTSB5 e um outro alvo, o comprimento e a flexi- bilidade do ligante são preferivelmente aquelas que permitem que ca- da bloco de construção, tal como um ISVD, da invenção presente no polipeptídeo se ligue ao seu alvo cognato, por exemplo o determinante antigênico em cada um dos alvos. Novamente, com base na divul- gação no presente documento, o versado na técnica será capaz de determinar os ligantes ideais para uso em um construto específico da invenção, tal como um polipeptídeoda invenção, opcionalmente depois de alguns experimentos limitados de rotina.

[00259] “Também está dentro do escopo da invenção que o(s) ligante(s) usados conferem uma ou mais outras propriedades favorá- veis ou funcionalidade aos construtos da invenção, tais como os polipeptídeos da invenção, e/ou proveem um ou mais sítios para a formação de derivados e/ou para a ligação de grupos funcionais (por exemplo conforme descrito no presente documento para os derivados dos ISVDs da invenção). Por exemplo, ligantes contendo um ou mais resíduos carregados de aminoácidos podem prover propriedades hi- drofílicas melhoradas, enquanto os ligantes que formam ou contêm pequenos epítopos ou marcadores podem ser usados para finalidades de detecção, identificação e/ou purificação. Novamente, com base na divulgação no presente documento, o versado na técnica será capaz de determinar os ligantes ideais para uso em um específico polipep- tídeo da invenção, opcionalmente depois de alguns experimentos lim- itados de rotina.

[00260] Finalmente, quando dois ou mais ligantes são usados nos construtos tais como polipeptídeos da invenção, esses ligantes podem ser os mesmos ou diferentes. Novamente, com base na divulgação no presente documento, o versado na técnica será capaz de determinar os ligantes ideais para uso em um específico construto ou polipeptídeo da invenção, opcionalmente depois de alguns experimentos limitados de rotina.

[00261] Em geral, para facilidade de expressão e produção, um construto da invenção, tal como um polipeptídeo da invenção, será um polipeptídeo linear. No entanto, a invenção em seu sentido mais amplo não está limitada a ela. Por exemplo, quando um construto da in- venção, tal como um polipeptídeo da invenção, compreende três de mais blocos de construção, ISVDs ou nanocorpos, é possível ligá-los com o uso de um ligante com três ou mais "braços", com cada "braço" sendo ligado a um bloco de construção, ISVD ou nanocorpo, de modo a prover um construto "em forma de estrela". Também é possível, em- bora menos preferido, usar construtos circulares.

[00262] “Consequentemente, a presente invenção se refere a um construto da invenção, tal como um polipeptídeo da invenção, em que os referidos ISVDs são diretamente ligados um ao outro ou são ligados através de um ligante.

[00263] Consequentemente, a presente invenção se refere a um construto da invenção, tal como um polipeptídeo da invenção, em que um primeiro ISVD e/ou um segundo ISVD e/ou possivelmente um ISVD que liga albumina do soro são ligados através de um ligante.

[00264] Consequentemente, a presente invenção se refere a um construto da invenção, tal como um polipeptídeo da invenção, em que o referido ligante é escolhido a partir do grupo consistindo em ligantes de3A, 5GS, 7GS, 9GS, 10GS, 15GS, 18GS, 20GS, 25GS, 30GS, 35GS, poli-A, 8GS, 40GS, dobradiça G1, dobradiça 9GS-G1, região dobradiça longa superior da lhama e dobradiça G3, tal como por ex- emplo apresentadas na Tabela C (SEQ ID NO:s 158-174).

[00265] Consequentemente, a presente invenção se refere a um construto da invenção, tal como um polipeptídeo da invenção, em que o referido polipeptídeo é escolhido a partir do grupo consistindo na SEQ ID NOs: 120-130.

[00266] A invenção ainda se refere um métodos para preparar os construtos, polipeptídeos, ISVDs, ácidos nucleicos, células hospedei- ras e composições descritas no presente documento.

[00267] Os polipeptídeos multivalentes da invenção podem ser geralmente preparados por um método que compreende pelo menos a etapa de adequadamente ligar o ISVD e/ou polipeptídeo monovalente da invenção a um ou mais adicionais ISVDs, opcionalmente através de um ou mais ligantes adequados, de modo a prover o polipeptídeo mul- tivalente da invenção. Polipeptídeos da invenção também podem ser preparados por um método que geralmente compreende pelo menos as etapas de prover um ácido nucleico que codifica um polipeptídeo da invenção, expressando o referido ácido nucleico de uma maneira ade- quada, e recuperando o polipeptídeo expressado da invenção. Os re- feridos métodos podem ser realizados de uma maneira conhecida per se, o que ficará claro para o versado na técnica, por exemplo com base nos métodos e técnicas adicionalmente descritos no presente documento.

[00268] Um método para preparar polipeptídeos multivalentes da invenção pode compreender pelo menos as etapas de ligar dois ou mais ISVDs da invenção e por exemplo um ou mais ligantes juntos de uma maneira adequada. Os ISVDs da invenção (e ligantes) podem ser acoplados por qualquer método conhecido na técnica e conforme adi- cionalmente descrito no presente documento. As técnicas preferidas incluem a ligação das sequências de ácido nucleico que codificam os ISVDs da invenção (e ligantes) para preparar um construto genético que expressa o polipeptídeo multivalente. As técnicas para ligar ami- noácidos ou ácidos nucleicos ficarão claras para o versado na técnica, e a referência é feita novamente aos manuais padrão, tal como Sam- brook et al. and Ausubel et al., mencionado acima, assim como os Ex- emplos abaixo.

[00269] “Consequentemente, a presente invenção também se refere ao uso de um ISVD da invenção na preparação de um polipeptídeo multivalente da invenção. O método para preparar um polipeptídeo multivalente compreenderá a ligação de um ISVD da invenção a pelo menos um ISVD adicional da invenção, opcionalmente através de um ou mais ligantes. O ISVD da invenção é então usado como um domí- nio de ligação ou bloco de construção provendo e/ou preparando o polipeptídeo multivalente compreendendo 2 (por exemplo, em um polipeptídeo bivalente), 3 (por exemplo, em um polipeptídeo trivalente), 4 (por exemplo, em um tetravalente) ou mais (por exemplo, em um polipeptídeo multivalente) blocos de construção. Com relação a isso, o ISVD da invenção pode ser usado como um dominio de ligação ou un- idade de ligação provendo e/ou preparando um multivalente, tal como bivalente, trivalente ou tetravalente polipeptídeo da invenção com- preendendo 2, 3, 4 ou mais blocos de construção.

[00270] Consequentemente, a presente invenção também se refere ao uso de um ISVD polipeptídeo da invenção (conforme descrito no presente documento) na preparação de um polipeptídeo multivalente. O método para a preparação do polipeptídeo multivalente com- preenderá a ligação do ISVD da invenção a pelo menos um ISVD adi- cional da invenção, opcionalmente através de um ou mais ligantes.

[00271] Os polipeptídeos e ácidos nucleicos da invenção podem ser preparados de uma maneira conhecida per se, como ficará claro ao versado na técnica a partir da descrição adicional no presente docu- mento. Por exemplo, os polipeptídeos da invenção podem ser prepar- ados de qualquer maneira conhecida per se para a preparação de an- ticorpos e em particular para a preparação de fragmentos de anticorpo (incluindo, porém sem se limitar a anticorpos (únicos) de domínio e fragmentos de ScFv). Alguns métodos preferidos, porém não limitantes para preparar os polipeptídeos e ácidos nucleicos incluem os métodos e técnicas descritos no presente documento.

[00272] O método para produzir um polipeptídeo da invenção pode compreender as seguintes etapas: a expressão, em uma célula hospedeira ou organismo hospedeiro adequados (também referido no presente documento como um "hospedeiro da invenção") ou em um outro sistema de expressão adequado de um ácido nucleico que codi- fica o referido polipeptídeo da invenção (também referido no presente documento como um "ácido nucleico da invenção"); opcionalmente seguido pelo isolamento e/ou purificação do polipeptídeo da invenção assim obtido.

[00273] Em particular, um referido método pode compreender as etapas de: cultivar e/ou manter um hospedeiro da invenção sob as condições que são aquelas que o referido hospedeiro da invenção ex- pressa e/ou produz pelo menos um polipeptídeo da invenção; opcion- almente seguido pelo isolamento e/ou purificação do polipeptídeo da invenção assim obtido.

[00274] Consequentemente, a presente invenção também se refere a um ácido nucleico ou sequência nucleotídica que codifica um polipeptídeo, ISVD ou construto da invenção (também referido como "ácido nucleico da invenção").

[00275] Um ácido nucleico da invenção pode estar na forma de um DNA ou RNA de filamento único ou duplo. De acordo com uma modal- idade da invenção, o ácido nucleico da invenção está em uma forma essencialmente isolada, conforme definido no presente documento. O ácido nucleico da invenção também pode estar na forma de, estar presente em e/ou fazer parte de um vetor, por exemplo vetor de ex- pressão, tal como por exemplo um plasmídeo, cosmídeo ou YAC, o qual novamente pode estar na forma essencialmente isolada. Conse- quentemente, a presente invenção também se refere a um vetor de expressão compreendendo um ácido nucleico ou sequência nucle- otídica da invenção.

[00276] Os ácidos nucleicos da invenção podem ser preparados ou obtidos de uma maneira conhecida per se, com base na informação sobre os polipeptídeos da invenção dada no presente documento, e/ou podem ser isolados a partir de uma fonte natural adequada. Além dis- so, como ficará claro ao versado na técnica, para preparar um ácido nucleico da invenção, também várias sequências nucleotídicas, tais como pelo menos dois ácido nucleicos codificando ISVDs da invenção e por exemplo ácido nucleicos codificando um ou mais ligantes podem ser ligados juntos em uma maneira adequada. As técnicas para gerar os ácidos nucleicos da invenção ficarão claras para o versado na téc- nica e podem por exemplo incluir, porém sem se limitar a, síntese de DNA automatizada; mutagênese sítio-direcionada; combinação de du- as ou mais sequências de ocorrência natural e/ou sequências sin- téticas (ou duas ou mais partes das mesmas), introdução de mutações que levam à expressão de um produto de expressão truncado; intro- dução de um ou mais sítios de restrição (por exemplo para criar cas- setes e/ou regiões que podem ser facilmente digeridas e/ou ligadas usando enzimas de restrição adequadas), e/ou a introdução de mu- tações por meio de uma reação PCR usando um ou mais iniciadores "incompatíveis". Essas e outras técnicas ficarão claras para o versado na técnica, e é feita novamente a referência aos manuais padrão, tal como Sambrook et al. and Ausubel et a/., mencionados acima, assim como aos Exemplos abaixo.

[00277] Emuma modalidade preferida, mas não limitante, um cons- truto genético da invenção compreende a) pelo menos um ácido nucleico da invenção; b) operacionalmente conectado a um ou mais elementos reguladores, tais como um promotor e opcionalmente um terminador adequado; e opcionalmente também c) um ou mais elementos adicionais de construtos genéti- cos conhecidos per se; na qual os termos "elemento regulador", "promotor", "terminador" e "operacionalmente conectado" têm o seu significado comum na téc- nica.

[00278] Os construtos genéticos da invenção podem em geral ser providos pela ligação adequada da(s) sequência(s) nucleotídica(s) da invenção a um ou mais elementos adicionais descritos acima, por ex- emplo usando as técnicas descritas nos manuais gerais tal como Sambrook et al. and Ausubel et al., mencionado acima.

[00279] Os ácidos nucleicos da invenção e/ou os construtos genéti- cos da invenção podem ser usados para transformar a célula hospedeira ou organismo hospedeiro, isto é, para expressão e/ou produção do polipeptídeo da invenção. Os hospedeiros ou células hospedeiras adequadas ficarão claros ao versado na técnica, e podem por exemplo ser qualquer célula fúngica, procariótica ou eucariótica ou linhagem celular ou qualquer organismo fúngico, procariótico ou eu- cariótico (não humano) adequado assim como outras células hospedeiras ou hospedeiros (não humanos) conhecidos per se para a expressão e produção de anticorpos e fragmentos de anticorpo (inclu- indo, porém não limitados aos anticorpos de domínio (único) e frag- mentos de ScFv), que ficarão claros para o versado na técnica. À referência também é feita à técnica antecedente geral citada acima, assim como, por exemplo, às publicações WO 94/29457; WO 96/34103; WO 99/42077; Frenken et al. (Res Immunol. 149: 589-99, 1998); Riechmann and Muyldermans (1999), supra; van der Linden (J. Biotechnol. 80: 261-70, 2000); Joosten et al. (Microb. Cell Fact. 2: 1, 2003); Joosten et al. (Appl. Microbiol. Biotechnol. 66: 384-92, 2005); e as referências adicionais citadas no presente documento. Além disso, os polipeptídeos da invenção também podem ser expressados e/ou produzidos em sistemas de expressão livres de célula, e exemplos ad- equados dos referidos sistemas ficarão claros para o versado na téc- nica. As técnicas adequadas para transformar um hospedeiro ou célula hospedeira da invenção ficarão claras para o versado na técnica e po- dem depender da célula hospedeira/organismo hospedeiro pretendi- dos e do construto genético a ser usado. A referência é feita novamen- te aos manuais e pedidos de patente mencionados acima. A célula hospedeira transformada (que pode estar na forma ou uma linhagem cellular estável) ou organismos hospedeiros (que podem estar na for- ma de uma linhagem ou cepa mutante estável) formam aspectos adi- cionais da presente invenção. Consequentemente, a presente in- venção se refere a um hospedeiro ou célula hospedeira compreen- dendo um ácido nucleico de acordo com a invenção, ou um vetor de expressão de acordo com a invenção. Preferivelmente, essas células hospedeiras ou organismos hospedeiros são aqueles que elas expres- sam, ou são (pelo menos) capazes de expressar (por exemplo, sob condições adequadas), um polipeptídeo da invenção (e no caso de um organismo hospedeiro: em pelo menos uma célula, parte, tecido ou órgão do mesmo). A invenção também inclui gerações adicionais, progênie e/ou descendência da célula hospedeira ou organismo hospedeiro da invenção, que pode por exemplo ser obtido pela divisão cellular ou por reprodução sexual ou assexual.

[00280] Para produzir/obter a expressão dos polipeptídeos da in- venção, a célula hospedeira transformada ou organismo hospedeiro transformado pode ser geralmente guardada, mantida e/ou cultivada sob condições de forma que o polipeptídeo da invenção (desejado) seja expressado/produzido. As condições adequadas ficarão claras para o versado na técnica e geralmente dependerão da célula hospedeira/organismo hospedeiro usado, assim como dos elementos reguladores que controlam a expressão da sequência nucleotídica (relevante) da invenção. Novamente, a referência é feita aos manuais e pedidos de patente mencionados acima nos parágrafos nos constru- tos genéticos da invenção.

[00281] O polipeptídeo da invenção pode então ser isolado da célu- la hospedeira/organismo hospedeiro e/ou do meio no qual a referida célula hospedeira ou organismo hospedeiro foi cultivado, usando téc- nicas de isolamento de proteína e/ou purificação conhecidas per se, tal como técnicas de cromatografia (preparativa) e/ou eletroforese, téc- nicas de precipitação diferencial, técnicas de afinidade (por exemplo, usando uma sequência de aminoácido específica, clivável, fundida ao polipeptídeo da invenção) e/ou técnicas imunológicas preparativas (is- to é , usando anticorpos contra o polipeptídeo a ser isolado).

[00282] Em um aspecto a invenção se refere um método para produzir um construto, polipeptídeo ou ISVD de acordo com a in- venção compreendendo pelo menos as etapas de: (a) expressar, em uma célula hospedeira ou organismo hospedeiro adequado ou em um outro sistema de expressão adequado, uma sequência de ácido nucle- ico de acordo com a invenção; opcionalmente seguida ao (b) isolar e/ou purificar o construto, polipeptídeo ISVD de acordo com a in- venção.

[00283] Em um aspecto a invenção se refere a uma composição compreendendo um construto, polipeptídeo, ISVD ou ácido nucleico de acordo com a invenção.

[00284] “Conforme mencionado supra, permanece uma necessidade por medicamentos para OA seguros e eficazes. Com base nas estra- tégias combinatórias, de rastreamento, caracterização não convencio- nais, os presentes inventores identificaram ISVDs ligando e inibindo ADAMTSSB. Esses aglutinantes de ADAMTSS5 funcionaram excepcio- nalmente bem nos experimentos in vitro e in vivo. Além do mais, os ISVDs da invenção também demonstraram ser significativamente mais eficazes do que os compostos da técnica anterior. A presente inven- ção provê assim ISVDs e polipeptídeos antagonizando ADAMTSs, em particular ADAMTSS5, com propriedades profiláticas, terapêuticas e/ou farmacológicas melhoradas, incluindo um perfil mais seguro, compara- do com as sequências de aminoácido e anticorpos da técnica anterior. Além disso, esses aglutinantes de ADAMTSB5 quando ligados a ISVDs que ligam albumina tiveram uma retenção aumentada em um indiví-

duo, poderiam ser administrados sistematicamente enquanto retém atividade.

[00285] Em um aspecto a presente invenção se refere a um método de tratamento ou prevenção de doenças ou distúrbios em um indiví- duo, por exemplo no qual a atividade de ADAMTSS5 está envolvida, o método compreendendo administrar um ISVD ou polipeptídeo de acordo com a invenção ao referido indivíduo em uma quantidade efi- caz para tratar ou prevenir um sintoma da referida doença ou distúrbio.

[00286] Em um aspecto a presente invenção se refere a uma com- posição de acordo com a invenção, um ISVD de acordo com a inven- ção, um polipeptídeo de acordo com a invenção, e/ou um construto de acordo com a invenção para uso como um medicamento.

[00287] Em um outro aspecto, a invenção se refere ao uso de um ISVD, polipeptídeo e/ou construto da invenção na preparação de uma composição farmacêutica para a prevenção e/ou tratamento de pelo menos uma doença associada a ADAMTSSB5; e/ou para uso em um ou mais dos métodos de tratamento mencionados no presente documen- to.

[00288] A invenção também se refere ao uso de um ISVD, polipep- tídeo e/ou construto da invenção na preparação de uma composição farmacêutica para a prevenção e/ou tratamento de pelo menos uma doença ou distúrbio que pode ser prevenido e/ou tratado pela modu- lação da atividade de um ADAMTS, preferivelmente ADAMTS5 por exemplo inibindo a degradação de agrecan.

[00289] A invenção também se refere ao uso de um ISVD, polipep- tídeo, composto e/ou construto da invenção na preparação de uma composição farmacêutica para a prevenção e/ou tratamento de pelo menos uma doença, distúrbio ou condição que pode ser prevenido e/ou tratado pela administração de um ISVD, polipeptídeo, composto e/ou construto da invenção a um paciente.

[00290] A invenção ainda se refere a um ISVD, polipeptídeo, com- posto e/ou construto da invenção ou uma composição farmacêutica compreendendo os mesmos para uso na prevenção e/ou tratamento de pelo menos uma doença associada a ADAMTSSB5.

[00291] —Antecipa-se que os aglutinantes de ADAMTSS5 da invenção podem ser usados em várias doenças afetando a cartilagem, tais co- mo artropatias e condrodistrofias, doença artrítica, tal como osteoartri- te, artrite reumatoide, artrite gotosa, artrite psoriática, ruptura ou desli- gamento traumático, acondroplasia, costocondrite, displasia espondi- loepimetafisária, hernia de disco espinhal, doença degenerativa do disco lombar, doença degenerativa das articulações e policondrite re- cidivante, osteocondrite dissecante e agrecanopatias e esteato- hepatite não alcoólica (NASH) (comumente indicada no presente do- cumento como "doenças associadas a ADAMTSS5")

[00292] Em um aspecto a presente invenção se refere a uma com- posição, um ISVD, um polipeptídeo e/ou um construto de acordo com a invenção para uso no tratamento ou prevenção de um sintoma de uma doença associada a ADAMTSS, tal como por exemplo artropatias e condrodistrofias, doença artrítica, tal como osteoartrite, artrite reuma- toide, artrite gotosa, artrite psoriática, ruptura ou desligamento traumá- tico, acondroplasia, costocondrite, displasia espondiloepimetafisária, hernia de disco espinhal, doença degenerativa do disco lombar, doen- ça degenerativa das articulações e policondrite recidivante, osteocon- drite dissecante e agrecanopatias e NASH.

[00293] Em um aspecto a presente invenção se refere a um método para prevenir ou tratar artropatias e condrodistrofias, doença artrítica, tal como osteoartrite, artrite reumatoide, artrite gotosa, artrite psoriáti- ca, ruptura ou desligamento traumático, acondroplasia, costocondrite, displasia espondiloepimetafisária, hernia de disco espinhal, doença degenerativa do disco lombar, doença degenerativa das articulações e policondrite recidivante e NASH em que o referido método com- preende administrar, a um indivíduo que necessita do mesmo, uma quantidade farmaceuticamente eficaz de pelo menos uma composição, imunoglobulina, polipeptídeo, ou construto de acordo com a invenção a uma pessoa que necessita do mesmo.

[00294] Em um aspecto a presente invenção se refere ao uso de um ISVD, polipeptídeo, composição ou construto de acordo com a in- venção, na preparação de uma composição farmacêutica para tartar ou prevenir tal como artropatias e condrodistrofias, doença artrítica, tal como osteoartrite, artrite reumatoide, artrite gotosa, artrite psoriática, ruptura ou desligamento traumático, acondroplasia, costocondrite, dis- plasia espondiloepimetafisária, hernia de disco espinhal, doença de- generativa do disco lombar, doença degenerativa das articulações e policondrite recidivante, osteocondrite dissecante e agrecanopatias e NASH.

[00295] “Também se espera que ao se ligar a agrecan, os construtos e/ou polipeptídeos da invenção podem reduzir ou inibir uma atividade de um membro da família da protease serina, catepsinas, metalo- proteinases matriz (MMPs), tal como por exemplo MMP20, mas tam- bém ADAMTSA (Agrecanase-1) e/ou ADAMTS11 na degradação de agrecan.

[00296] No contexto da presente invenção, o termo "prevenção e/ou tratamento" não apenas compreende prevenir e/ou tratar a doença, mas também geralmente compreende prevenir o início da doença, re- tardando ou revertendo o progresso da doença, prevenindo ou dimi- nuindo o início de um ou mais sintomas associados com a doença, re- duzindo e/ou aliviando um ou mais sintomas associados com a doen- ça, reduzindo a gravidade e/ou a duração da doença e/ou de quais- quer sintomas associados com ela e/ou prevenindo um aumento adici- onal na gravidade da doença e/ou de quaisquer sintomas associados com ela, prevenindo, reduzindo ou revertendo qualquer dano fisiológi- co causado pela doença, e geralmente qualquer ação farmacológica que é benéfica ao paciente sendo tratado.

[00297] O regime de dosagem será determinado pelo médico atendente e fatores clínicos, Como é bem conhecido na medicina, a dosagem para qualquer paciente depende de muitos fatores, incluindo o tamanho do paciente, peso, área de superfície corporal, idade, do composto específico a ser administrado, da atividade do polipeptídeo empregado (incluindo anticorpos), tempo e via de administração, saúde geral, e combinação com outras terapias ou tratamentos. A ma- téria farmaceuticamente proteinácea pode estar presente em quan- tidades entre 1 g e 100 mg/kg de peso corporal por dose; no entanto, doses abaixo ou acima desta faixa exemplificadora também serão pre- vistas. Caso o regime seja uma infusão continua, ele pode estar na faixa de 1 pg a 100 mg por Kkilograma de peso corporal por minuto.

[00298] Um ISVD, polipeptídeo ou construto da invenção pode ser empregado em uma concentração de, por exemplo, 0,01; 0,1; 0,5; 1, 2, 5, 10, 20 ou 50 pg/ml de modo a inibir e/ou neutralizar uma função bio- lógica de ADAMTS5 em pelo menos cerca de 50%, preferivelmente 75%, mais preferivelmente 90%, 95% ou até 99%, e ainda mais pre- ferivelmente aproximadamente 100% (essencialmente completamente) conforme ensaiado pelos métodos bem conhecidos na técnica.

[00299] Em geral, o regime de tratamento compreenderá a adminis- tração de um ou mais ISVDs, polipeptídeos e/ou construtos da inven- ção, ou de uma ou mais composições compreendendo as mesmas, em uma ou mais quantidades ou doses farmaceuticamente eficazes. As quantidades ou doses específicas a serem administradas podem ser determinadas pelo clínico, novamente com base nos fatores cita- dos acima. As dosagens úteis dos construtos, polipeptídeos, e/ou ISVDs da invenção podem ser determinadas pela comparação da sua atividade in vitro, e atividade in vivo em modelos animais. Os métodos para a extrapolação das dosagens eficazes em camundongos e outros animais, aos humanos são conhecidos na técnica; por exemplo, vide Patente Norte-Americana US 4.938.949.

[00300] Em geral, dependendo da doença, distúrbio ou condição específico a ser tratado, a potência do ISVD, polipeptídeo e/ou cons- truto específico da invenção a ser usado, a via de administração espe- cífica e a formulação farmacêutica ou composição específica usada, o clínico será capaz de determinar um regime de dosagem adequado.

[00301] A quantidade dos construtos, polipeptídeos, e/ou ISVDs da invenção necessários para uso no tratamento irão variar não apenas com a imunoglobulina, polipeptídeo, composto e/ou construto especiífi- cos selecionados, mas também com a via de administração, a nature- za da condição sendo tratada e a idade e condição do paciente e terá por fim a discrição do médico ou clínico. Além disso a dosagem dos construtos, polipeptídeos, e/ou ISVDs da invenção varia dependendo da célula alvo, do tumor, do tecido, do enxerto ou do órgão.

[00302] A dose desejada pode convenientemente ser apresentada em uma única dose ou como doses divididas administradas em inter- valos apropriados, por exemplo, como duas, três, quatro ou mais sub- doses por dia. A subdose pode ser ainda dividida, por exemplo, em um número de administrações discretas frouxamente espaçadas.

[00303] Um regime de administração poderia incluir tratamento a longo prazo, diário. Entende-se por "a longo prazo" pelo menos duas semanas e preferivelmente, várias semanas, meses, ou anos de dura- ção. Modificações necessárias nesta faixa de dosagem podem ser de- terminadas por um versado na técnica usando apenas experimentação de rotina dados os ensinamentos no presente documento. Vid Reming- ton's Pharmaceutical Sciences (Martin, EW., ed. 4), Mack Publishing Co., Easton, PA. A dosagem também pode ser ajustada pelo médico individual no evento de alguma complicação.

[00304] Em geral, no método acima, um ISVD, polipeptídeo e/ou construto da invenção será usado. Está no entanto dentro do escopo da invenção usar dois ou mais ISVDs, polipeptídeos e/ou construtos da invenção em combinação.

[00305] Os |ISVDs, polipeptídeos e/ou construtos da invenção po- dem ser usados em combinação com um ou mais compostos ou prin- cípios farmaceuticamente ativos adicionais, isto é, como um regime de tratamento combinado, o que pode ou não levar a um efeito sinergísti- Co.

[00306] A composição farmacêutica também pode compreender pelo menos um agente ativo adicional, por exemplo um ou mais anti- corpos ou fragmentos de ligação ao antígeno adicionais dos mesmos, peptídeos, proteínas, ácidos nucleicos, moléculas orgânicas e in- orgânicas.

[00307] Novamente, o clínico será capaz de selecionar os referidos compostos ou princípios adicionais, assim como um regime de trata- mento combinado adequado, com base nos fatores citados acima e no seu julgamento profissional.

[00308] Em particular, os ISVDs, polipeptídeos e/ou construtos da invenção podem ser usados em combinação com outros compostos ou princípios farmaceuticamente ativos que são ou podem ser usados pa- ra a prevenção e/ou tratamento de doenças, distúrbios e condições citadas no presente documento, como um resultado se um efeito si- nergístico pode ou não ser obtido. Exemplos dos referidos compostos e princípios, assim como vias, métodos e formulações farmacêuticas ou composições para administrá-los ficarão claros para o clínico.

[00309] “Quando duas ou mais substâncias ou princípios são para ser usados como parte de um regime de tratamento combinado, eles podem ser administrados através da mesma via de administração ou através de diferentes vias de administração, em essencialmente o mesmo tempo ou em diferentes vezes (por exemplo essencialmente de forma simultânea, consecutiva ou de acordo com um regime alter- nado). Quando as substâncias ou princípios são para ser administra- dos de forma simultânea através da mesma via de administração, eles podem ser administrados como formulações ou composições far- macêuticas diferentes ou como parte de uma formulação ou com- posição farmacêutica combinada, conforme ficará claro para o versado na técnica.

[00310] Além disso, quando duas ou mais substâncias ativas ou princípios são para ser usados como parte de um regime de tratamen- to combinado, cada uma das substâncias ou princípios podem ser ad- ministrados na mesma quantidade e de acordo com o mesmo regime conforme usado quando o composto ou princípio é usado sozinho, e o referido uso combinado pode ou não levar a um efeito sinergístico. No entanto, quando o uso combinado das duas ou mais substâncias ati- vas ou princípios leva a um efeito sinergístico, também pode ser possível reduzir a quantidade de uma, mais ou todas as substâncias ou princípios a serem administrados, enquanto ainda alcança a ação terapêutica desejada. Isto pode ser útil, por exemplo, para evitar, limi- tar ou reduzir qualquer efeito colateral que está associado com o uso de uma ou mais das substâncias ou princípios quando eles são usa- dos nas suas quantidades usuais, enquanto ainda obtém o desejado efeito farmacêutico ou terapêutico.

[00311] A eficácia do regime de tratamento usado de acordo com a invenção pode ser determinada e/ou seguida em qualquer maneira conhecida per se para a doença, distúrbio ou condição envolvidos, conforme ficará claro para o clínico. O clínico também será capaz, on- de apropriado e em uma base caso a caso, de mudar ou modificar um regime de tratamento específico, de modo a alcançar o efeito terapêu-

tico desejado, para evitar, limitar ou reduzir efeitos colaterais indeseja- dos, e/ou para alcançar um equilíbrio apropriado entre alcançar o efei- to terapêutico por um lado e evitar, limitar ou reduzir efeitos colaterais indesejados por outro lado.

[00312] Em geral, o regime de tratamento será seguido até que o efeito terapêutico desejado seja alcançado e/ou à medida que efeito terapêutico desejado seja mantido. Novamente, isto pode ser determi- nado pelo clínico.

[00313] Sendo assim, em um aspecto adicional, a invenção se refe- re a uma composição farmacêutica que contém pelo menos um cons- truto da invenção, pelo menos um polipeptídeo da invenção, pelo me- nos um ISVD da invenção, ou pelo menos um ácido nucleico da inven- ção e pelo menos um carreador, diluente ou excipiente adequado (isto é, adequado para uso farmacêutico), e opcionalmente um ou mais substâncias ativas adicionais. Em um aspecto específico, a invenção se refere a uma composição farmacêutica que compreende um cons- truto, polipeptídeo, ISVD ou ácido nucleico de acordo com a invenção, preferivelmente pelo menos uma das SEQ ID NOs: OOO e pelo menos um carreador, diluente ou excipiente adequado (isto é, adequado para uso farmacêutico), e opcionalmente uma ou mais substâncias ativas adicionais.

[00314] O indivíduo a ser tratado pode ser qualquer animal de san- gue quente, porém é em particular um mamífero, e mais em particular um ser humano. Nas aplicações veterinárias, o indivíduo a ser tratado inclui qualquer animal criado para finalidades comerciais ou mantido como um animal doméstico. Como ficará claro para o versado na téc- nica, o indivíduo a ser tratado será em particular uma pessoa que sofre de, ou está em risco de doenças, distúrbios e condições mencionados no presente documento. Consequentemente, em uma modalidade pre- ferida da invenção, as composições farmacêuticas compreendendo um polipeptídeo da invenção são para uso na medicina ou diagnóstico. Preferivelmente, as composições farmacêuticas são para uso na me- dicina humana, mas eles também podem ser usados para finalidades veterinárias.

[00315] “Novamente, em uma referida composição farmacêutica, uma ou mais imunoglobulinas, polipeptídeos, compostos e/ou constru- tos da invenção, ou nucleotídeos codificando os mesmos e/ou a com- posição farmacêutica compreendendo os mesmos, também podem ser adequadamente combinados com um ou mais outros princípios ativos, tais como aqueles mencionados no presente documento.

[00316] Ainvenção também se refere a uma composição (tal como, sem limitação, a composição ou preparação farmacêutica conforme adicionalmente descrito no presente documento) para uso, seja in vitro (por exemplo em um ensaio in vitro ou ensaio celular) ou in vivo (por exemplo em um organismo de célula única ou organismo multicelular, e em particular em um mamífero, e mais em particular em um ser hu- mano, tal como em um ser humano que está em risco de ou sofre da doença, distúrbio ou condição da invenção).

[00317] Deve ser entendido que a referência ao tratamento inclui ambos o tratamento de sintomas estabelecidos e tratamento profiláti- co, a menos que declarado explicitamente de outra forma.

[00318] Em geral, para uso farmacêutico, os construtos, polipeptí- deos e/ou ISVDs da invenção podem ser formulados como a prepara- ção ou composição farmacêutica compreendendo pelo menos um construto, polipeptídeo e/ou ISVD da invenção e pelo menos um car- reador, diluente ou excipiente farmaceuticamente aceitável e/ou adju- vante, e opcionalmente um ou mais polipeptídeos e/ou compostos farmaceuticamente ativos. Por meio de exemplos não limitantes, uma referida formulação pode estar em uma forma adequada para adminis- tração oral, para administração parenteral (tal como através de injeção intravenosa, intramuscular ou subcutânea ou infusão intravenosa), pa- ra administração tópica, para administração através de inalação, com um adesivo para a pele, um implante, um supositório, etc., em que a administração parenteral é preferida. As referidas formas de adminis- tração adequadas — que podem ser sólidas, semi-sólidas ou líquidas, dependendo da maneira de administração — assim como os métodos e carreadores para uso na preparação dos mesmos, ficarão claras para o versado na técnica, e são adicionalmente descritas no presente do- cumento. Uma referida preparação ou composição farmacêutica será em geral referida no presente documento como a "composição farma- cêutica".

[00319] Como excipientes adequados, desintegradores, agluti- nantes, cargas e lubrificantes podem ser mencionados. Exemplos de desintegradores incluem agar-agar, alginas, carbonato de cálcio, celu- lose, dióxido de silício coloidal, gomas, aluminossilicato de magnésio, metilcelulose e amido. Exemplos de aglutinantes incluem celulose mi- crocristalina, hidroximetil celulose, hidroxipropilcelulose e polivinilpirrol- idona. Exemplos de cargas incluem carbonato de cálcio, fosfato de cálcio, sulfato de cálcio tribásico, carboximetilcelulose de cálcio, celu- lose, dextrina, dextrose, frutose, lactitol, lactose, carbonato de mag- nésio, óxido de magnésio, maltitol, maltodextrinas, maltose, sorbitol, amido, sacarose, açúcar e xilitol. Exemplos de lubrificantes incluem agar, oleato de etila, laureato de etila, glicerina, palmitoestearato de glicerila, óleo vegetal hidrogenado, óxido de magnésio, estearatos, manitol, poloxâmero, glicóis, benzoato de sódio, lauril sulfato de sódio, estearil de sódio, sorbitol e talco. Os estabilizadores, conservantes, agentes umectantes e emulsificantes, agentes intensificadores de con- sistência, agentes melhoradores de sabor, sais para variar a pressão osmótica, substâncias tampão, solubilizadores, diluentes, emolientes, corantes e agentes mascaradores e antioxidants usuais aparecem em consideração como adjuvantes farmacêuticos.

[00320] Os carreadores adequados incluem, porém não se limitam a carbonato de magnésio, estearato de magnésio, talco, açúcar, lac- tose, pectina, dextrina, amido, gelatina, tragacanta, metilcelulose, car- boximetil-celulose de sódio, uma cera de baixo ponto de fusão, man- teiga de cacau, água, álcoois, polióis, glicerol, óleos vegetais e simi- lares.

[00321] Em geral, os construtos, polipeptídeos, e/ou ISVDs da in- venção podem ser formulados e administrados de qualquer maneira adequada conhecida per se. A referência é feita, por exemplo, à técni- ca antecedente geral citada acima (e em particular a publicação inter- nacional WO 04/041862, WO 04/041863, WO 04/041865, WO 04/041867 e WO 08/020079) assim como aos manuais padrão, tal como Remington's Pharmaceutical Sciences, 18º" Ed., Mack Publishing Company, USA (1990), Remington, the Science and Practice of Phar- macy, 21st Edition, Lippincott Williams and Wilkins (2005); or the Han- dbook of Therapeutic Antibodies (S. Dubel, Ed.), Wiley, Weinheim, 2007 (vide por exemplo páginas 252-255).

[00322] Em um aspecto específico, a invenção se refere a uma composição farmacêutica que compreende um construto, polipeptídeo, ISVD ou ácido nucleico de acordo com a invenção, e que ainda com- preende pelo menos um carreador, diluente ou excipiente farmaceuti- camente aceitável e/ou adjuvante, e opcionalmente compreende um ou mais polipeptídeos e/ou compostos farmaceuticamente ativos adi- cionais.

[00323] Os construtos, polipeptídeos, e/ou ISVDs da invenção po- dem ser formulados e administrados em qualquer maneira conhecida per se para anticorpos convencionais e fragmentos de anticorpo (inclu- indo ScFv's e diacorpos) e outras proteínas farmaceuticamente ativas. As referidas formulações e métodos para preparar os mesmos ficarão claros para o versado na técnica, e por exemplo incluem preparações preferíveis e adequadas para aministração parenteral (por exemplo, administração intravenosa, intraperitoneal, subcutânea, intramuscular, intraluminal, intra-arterial, intratecal intranasal ou intrabronquial) mas também para administração tópica (isto é, transdérmica ou intradérmi- ca).

[00324] Preparações para a administração parenteral podem ser por exemplo soluções estéreis, suspensões, dispersões ou emulsões que são adequadas para infusão ou injeção. Os carreadores ou diluen- tes adequados para as referidas preparações incluem, por exemplo, sem limitação, aqueles mencionados na página 143 da publicação in- ternacional WO 08/020079. Em geral, as soluções ou suspensões aquosas serão preferidas.

[00325] Os construtos, polipeptídeos, e/ou ISVDs da invenção tam- bém podem ser administrados usando métodos de liberação conheci- dos a partir da terapia genética, vide, por exemplo, Patente Norte- americana No. 5.399.346, que é incorporada a título de referência para os seus métodos de liberação de terapia genética. Usando um método de liberação de terapia genética, as células primárias transfectadas com o gene codificando um construto, polipeptídeo, e/ou ISVD da in- venção podem ser adicionalmente transfectadas com promotores es- pecíficos de tecido para direcionar órgãos específicos, tecido, enxer- tos, tumores ou células e podem ser adicionalmente transfectados com sequências de sinal e estabilização para expressão localizada subce- lularmente.

[00326] De acordo com aspectos adicionais da invenção, o polipep- tídeo da invenção pode ser usado em aplicações adicionais in vivo e in vitro. Por exemplo, polipeptídeos da invenção podem ser empregados para finalidades diagnósticas, por exemplo em ensaios designados para detector e/ou quantificar a presença de ADAMTSSB5 e/ou purificar

ADAMTSS5. Polipeptídeos também podem ser testados em modelos animais de doenças específicas e para conduzir estudos de toxicolo- gia, segurança e dosagem.

[00327] Finalmente, a invenção se refere a um kit compreendendo pelo menos um polipeptídeo de acordo com a invenção, pelo menos uma sequência de ácido nucleico codificando os referidos componen- tes, o vetor ou sistema vetor da invenção, e/ou a célula hospedeira de acordo com a invenção. Contempla-se que o kit pode ser oferecido em diferentes formas, por exemplo, com um kit diagnóstico.

[00328] A invenção será agora descrita por meio dos aspectos não limitantes preferidos, exemplos e figuras que seguem.

[00329] O total conteúdo de todas as referências (incluindo referên- cias na literatura, patentes emitidas, pedidos de patente publicados e pedidos de patente copendentes) citados ao longo deste pedido são aqui expressamente incorporados a título de referência, em particular para o ensinamento que é referenciado acima.

[00330] Sequências são divulgadas no corpo principal da descrição e em uma listagem de sequências separada de acordo com WIPO standard ST.25. Uma SEQ |D especificada com um número específico deve ser a mesma no corpo principal da descrição e na listagem de sequências separada. A título de exemplo, SEQ ID no.: 1 deve definir a mesma sequência em ambos, o corpo principal da descrição e na listagem de sequências separada. Caso haja uma discrepância entre a definição na sequência no corpo principal da descrição e na listagem de sequências separada (caso por exemplo SEQ ID no.: 1 no corpo principal da descrição erroneamente corresponde a SEQ ID no.: 2 na listagem de sequências separada) então uma referência a uma se- quência específica no pedido, em particular de modalidades especiífi- cas, deve ser compreendido como uma referência à sequência no cor- po principal da pedido e não na listagem de sequências separada. Em outras palavras, uma discrepância entre uma definição/designação da sequência no corpo principal da descrição e a listagem de sequências separada deve ser resolvida ao se corrigir a listagem de sequências separada das sequências e da sua designação divulgada no corpo principal do pedido que inclui a descrição, exemplos, figuras e reivindi- cações.

EXEMPLOS Exemplo 1 Geração de proteína recombinante de ADAMTSS5 a par- tir de diferentes espécies

[00331] Vários formatos de proteína recombinante de ADAMTS5 de bovino, rato, porquinho da índia, camundongo e macaco cinomolgo foram geradas no laboratório através do sistema de expressão HEK293 Flp-ln'Y usando o reagente de transfecção FUGENEG HD (Promega). Dois dias depois da transfecção, o meio de seleção con- tendo 100ug/ml de HigromicinaB foi adicionado às células para seleci- onar células que se expressam de forma estável.

[00332] As células que se expressam de forma estável foram ex- pandidas. O meio condicionado contendo ADAMTSSB5 secretado foi co- letado todo dia das células, purificado por cromatografia HisTrap e se- guido por uma troca de tampão em 50 mM tampão Hepes pH 7,5. À pureza da proteína foi confirmada por SDS-PAGE. Exemplo 2 Imunização de lhamas com proteína de ADAMTSS5, clo- nagem dos repertórios do fragmento de anticorpo apenas de ca- deia pesada e preparação de fago

2.1 Imunizações

[00333] Depois da aprovação pelo comitê ético da faculdade de medicina veterinária (University Ghent, Belgium), 3 lhamas foram imu- nizadas com proteína recombinante de ADAMTS5 humana (R&D Sys- tems, Minneapolis, US; cat 4 2198-AD).

2.2 clonagem dos repertórios do fragmento de anticorpo apenas de cadeia pesada e preparação de fago

[00334] Em seguida à injeção final de imunógeno, amostras de sangue foram coletadas. Destas amostras de sangue, células mono- nucleares de sangue periférico (PBMCs) foram preparadas usando Ficoll-Hypaque de acordo com as instruções do fabricante (Amersham Biosciences, Piscataway, NJ, US). A partir das PBMCs, RNA total foi extraído e usado como material de partida para RT-PCR para amplifi- car os segmentos de DNA que codificam VHH/Nanocorpo, essencial- mente conforme descrito na publicação internacional WO 05/044858. De forma subsequente, os fagos foram preparados de acordo com pro- tocolos padrão (vide por exemplo, a técnica anterior e pedidos deposi- tados por Ablynx N.V. citados no presente documento.) e armazenado depois da esterilização em filtro a 4ºC para uso adicional. Exemplo 3 Seleção de VHHs específicos de ADAMTS5 humana através da exibição de fagos

[00335] Os repertórios de VHH obtidos de todas as lhamas e clona- dos em bibliotecas de fagos foram usados para nanocorpos de ligação a ADAMTSS5 humana. A proteína recombinante de ADAMTS5 humana (R&D Systems, Minneapolis, US; cat %& 2198-AD) foi imobilizada em 5 pg/ml em uma placa Maxisorp (Nunc, Wiesbaden, Germany), próximo a um controle de O ug/ml de antígeno. Seguindo a incubação com as bibliotecas de fagos e extensiva lavagem, os fagos ligados são eluídos com tripsina (1 mg/mL), e usados para infectar células com E. coli. As células infectadas com E. coli foram usadas tanto para preparar fagos para a próxima rodada de seleção quanto colocadas em placas de ágar para análise. Além disso, as bibliotecas sintéticas foram usadas em três rodadas de seleção consecutivas.

[00336] Os resultados de todas as rodadas de seleção foram anali- sados quanto ao fator de enriquecimento, o qual é o número de fagos presentes em eluato relativo aos controles. As melhores condições de seleção foram escolhidas para análise adicional.

[00337] De modo a rastrear um resultado de seleção para agluti- nantes específicos, as colônias únicas foram retiradas das placas de ágar e desenvolvidas em placas de 96 poços fundos com 1 mL. A ex- pressão de VHH controlada por LacZ foi induzida pela adição de IPTG. Extratos periplásmicos foram preparados de acordo com protocolos padrão (vide por exemplo a técnica anterior e pedidos depositados por Ablynx N.V. citados no presente documento.) Exemplo 4 Rastreamento de extratos periplásmicos para nano- corpos de bloqueio funcional

[00338] Em uma primeira etapa, extratos periplásmicos foram tes- tados quanto à ligação a ADAMTSS5 humana recombinante através de ELISA de ligação. Em resumo, ADAMTS5 humana recombinante (R&D Systems, Minneapolis, US; cat % 2198-AD) em uma concentração de 1 upg/ml foi revestida em placas de 384 poços MaxiSorp (Nunc, Wiesba- den, Germany). Os poços foram bloqueados com uma solução de ca- seína (1%). Depois da adição de uma diluição de 10 vezes dos extra- tos periplásmicos, a ligação ao nanocorpo foi detectada usando um conjugado de anti-Flag-HRP de camundongo (Sigma, St. Louis, US) e uma subsequente reação enzimática na presença do substrato esTMB (3,3',5,5'-tetramentilbenzidina) (SDT, Brussels, Belgium). Clones mos- trando sinais ELISA maiores do que a soma do sinal médio dos contro- les irrelevantes de nanocorpo e 3 vezes o desvio padrão dos controles irrelevantes de nanocorpo foram considerados codificar nanocorpos de ligação a ADAMTSS5 humana positiva.

[00339] Para identificar nanocorpos que são capazes de prevenir a clivagem de agrecan mediada por ADAMTSSB, clones foram testados em um ensaio enzimático de ADAMTS5 humana com base em FRET, usando 50mM HEPES (pH 7.5), 100mM NaCl, SMM CaCl2*2H20, 0.1% CHAPS, 5% glicerol como tampão do ensaio. Em resumo, os extratos periplásmicos contendo nanocorpos de ligação a ADAMTSS5 foram in- cubados em uma placa de 384 poços OptiPlate (PerkinElmer, Wal- tham, MA, US) com 10 ul de 25 uM de substrato de peptídeo humano fluorogênico (Abz- TEGEARGSVI-Dap(Dnp)-KK-NH2, Anaspec, Serain Belgium, cattt 60431-1) e 10 ul de 25 nM de ADAMTSS5 humana (R&D Systems, Minneapolis, US; cat %& 2198-AD). A capacidade dos nano- corpos em prevenir a clivagem mediada por ADAMTSS5 foi monitorada a cada minuto por 2 horas em uma leitora de placas Tecan Infinite M1000. Os dados foram analisados com software Graphpad Prism. À partir da curva de progressão da enzima, a velocidade inicial para o controle negativo (vo) foi determinada, assim como a velocidade para cada clone de nanocorpo na placa (vi) e o sinal antecedente (S.). Usando a fórmula 100*(1 - (vi - Sr) /( vo- S»)), a inibição de porcent- agem foi calculada.

[00340] Extrato periplásmico contendo nanocorpo irrelevante foi usado como controle negativo. Extratos periplásmicos contendo nano- corpos de ADAMTSSB5 foram capazes de diminuir o sinal de fluorescên- cia com mais do que 50% relativo ao sinal do controle negativo e fo- ram considerados como nanocorpos inibidores. A sequência de DNA dos clones positivos foi subsequentemente determinada.

[00341] Um sumário dos dados de rastreamento do extrato peri- plásmico é dado na Tabela 4.1. As sequências de aminoácido dos na- nocorpos anti-ADAMTSS5 são mostradas na Tabela A-1. Tabela 4.1 Resultados de rastreamento dos extratos periplásmicos contendo nanocorpos anti-ADAMTS5 Beto | 167 | 2 [| es | 22 | 1354 | 2 [| &s | as Ba oa

MBM | oa | 2 | es | eo ND | o | 1 | 13802 [| ND | o | gs | Br4 | 2685 | 19 [| 8 |

[00342] “Depois da clonagem e sequenciamento, várias famílias fo- ram identificadas, as quais consistiam de clones com diferenças nas CDRs, mas que mostraram características similares de ligação e inibi- ção.

[00343] Depois da clonagem e sequenciamento, Nanocorpo 02A12 foi identificado como um membro da família do clone 09D03 (cf. Tabe- las A-1 e A-2). A variabilidade sequencial das regiões CDR é apresen- tada nas Tabelas 4.1A, 4.1B e 4.1C abaixo. As sequências de aminoá- cido das CDRs do clone 09D03 foram usadas como referência contra a qual as CDRs dos membros da família foram comparados (CDR1 inicia na posição Kabat 26, CDR1 inicia na posição Kabat 50, e CDR3 inicia na posição Kabat 95). Tabela 4.1A (09D03 CDR1) tipo selvagem RT F Ss Y G * Até 6 mutações CDR1 em um clone (SEQ ID NO: 22) Tabela 4.1B (09D03 CDR21) tipo selvagem * Até O mutações CDR2 em um clone (SEQ ID NO: 36)

Tabela 4.1C (09D03 CDR3) Numeração o o absoluta sequência do tipo selvagem |, . . À * Até O mutações CDR em um clone (SEQ ID NO: 54)

[00344] Depois da clonagem e sequenciamento Clone 09A05 foi identificado como um membro da família de clone 03B02 (cf. Tabelas A-1 e A-2). A variabilidade da sequência das regiões CDR é apresen- tada nas Tabelas 4.1D, 4.1EÉ e 4.1F abaixo. As sequências de aminoá- cido das CDRs de clone 03B02 foram usadas como referência contra a qual as CDRs dos membros de família foram comparados (CDR1 ini- cia na posição Kabat 26, CDR1 inicia na posição Kabat 50, e CDR3 inicia na posição Kabat 95). Tabela 4.1D (03B02 CDR1) Kabat absoluta sequência do tipo selvagem * Até O mutações CDR1 em um clone (SEQ ID NO: 33) Tabela 4.1E (03B02 CDR2) Kabat absoluta sequência do tipo selvagem 1 T F * Até 3 mutações CDR2 em um clone (SEQ ID NO: 50) Tabela 4.1F (03B02 CDR3) Kabat o o o o o = = sequência do tipo selvagem

L E * Até 2 mutações CDR em um clone (SEQ ID NO: 68)

[00345] Depois da clonagem e sequenciamento clones 03D02 e

02C10 foram identificados como membros da família de clone 03D01 (cf. Tabelas A-1 e A-2). A variabilidade da sequência das regiões CDR é apresentada nas Tabelas 4.1G, 4.1H e 4.1l abaixo. As sequências de aminoácido das CDRs de clone 03D01 foram usadas como uma referência contra a qual as CDRs dos membros da família foram com- paradas (CDR1 inicia na posição Kabat 26, CDR1 inicia na posição Kabat 50, e CDR3 inicia na posição Kabat 95). Tabela 4.1G (03D01 CDR1) Kabat absoluta sequência do tipo selvagem * Até O CDR1 mutations em um clone (SEQ ID NO: 28) Tabela 4.1H (03D01 CDR2) sequência do tipo selvagem T Ww 1 L * Até 3 mutações CDR2 em um clone (SEQ ID NO: 44) Tabela 4.11 (08D01 CDR3) Kabat 8 8 3 83 $8 2 2 absoluta sequência do tipo selvagem | S AR AR E * Até 1 mutação CDR em um clone (SEQ ID NO: 62)

[00346] Os resultados acima demonstram que alguma variação no aminoácido é permissível, enquanto retém as características de liga- ção e inibição. Notavelmente, a ligação a ADAMTSS5 não é um indica- dor para inibição de ADAMTSS5. Por exemplo, o clone 3F04 é um ligan- te potente, mas um inibidor fraco. Exemplo 5 Caracterização de nanocorpos de ADAMTS5 monova- lentes purificados

[00347] Clones selecionados a partir do rastreamento descritos no

Exemplo 4 foram adicionalmente caracterizados. Mediante a transfor- mação em E. coli (TG-1) dos nanocorpos selecionados, a expressão foi induzida pela adição de 1 mM IPTG e deixada continuar por 4 horas a 37'C. Depois da agitação das culturas celulares, os extratos peri- plásmicos foram preparados pelo congelamento-descongelamento dos péletes seguido pela centrifugação. Esses extratos foram então usa- dos como material de partida para purificação através de IMAC em co- lunas de 1MI de HisTrap FF bruto (GE healthcare, Buckinghamshire, United Kingdom) seguido pela dessanilização através das colunas Ze- ba spin (Pierce, Rockford, IL, USA) resultando em pelo menos 95% de pureza conforme avaliado através de SDS-PAGE.

5.1 Avaliação de ADAMTSS5 bloqueando nanocorpos em ensaios de ADAMTSS5 enzimática

[00348] A capacidade dos nanocorpos em prevenir a clivagem de agrecan mediada por ADAMTSS foi confirmada em um ensaio enzimá- tico baseado em FRET, essencialmente conforme descrito no Exemplo

4. Os dados foram analisados com software Graphpad Prism. A partir da curva de progressão da enzima, a velocidade inicial foi determina- da(vi) e esses valores foram classificados como uma função das con- centrações inibidoras e os valores de ICso foram calculados. Em es- sência, o ensaio FRET humano com nanocorpos purificados confirmou os resultados descritos no Exemplo 4 com os extratos periplásmicos. Os IC5os variaram entre 1.8E-09 M a 3.7E-08 M. Notavelmente, embo- ra o MAb 12F4 convencional tivesse de alguma forma um ICso melhor de 1.0E-09 M do que os nanocorpos monovalentes, todos os nanocor- pos mostraram melhor eficácia (dados não mostrados).

[00349] Em seguida ao ensaio baseado em FRET, um ensaio de ADAMTSS5 humana baseado em AIphaLISA (Perkin Elmer, Waltham, MA, US) com um oligopeptídeo agrecan 43-mer biotinilado como subs- trato foi realizado. Mediante a clivagem com ADAMTSS5 deste substra-

to, um produto neo-epítopo de ARGSV biotinilado é liberado, o qual pode ser detectado por esferas doadores de estreptavidina- AlphaScreen e um anticorpo do epítopo anti-neo ('ARGSV") capturado nas esferas aceptoras anticamundongo revestidas com IgG AlphaL!- SA, resultando na geração de um sinal de luminescência AlphaScreen mediante a excitação com laser.

[00350] Para determinar o potencial inibidor dos nanocorpos, as di- luições seriais de nanocorpos purificados (junto com um controle posi- tivo e um controle negativo irrelevante de nanocorpo) foram incubadas com ADAMTSS5 humana (R&D Systems, Minneapolis, US; cat t 2198- AD) por 15 minutos em temperatura ambiente em uma placa de 384 poços Optiplate (Perkin Elmer, Waltham, MA, US). Em seguida à adi- ção de um substrato de oligopeptídeo de agrecan 43-mer biotinilado (Biosyntan, Berlin, Germany) e incubação de 3 horas a 37ºC a reação foi parada. A primeira etapa de detecção foi realizada pela adição de 5 ul da solução de detecção 1 compreendendo o anticorpo agrecan con- tra o neo-epítopo "ARGSV", BC3 mAb de camundongo (MDBiopro- ducts, Egg, Switzerland) e esferas doadoras de estreptavidina AlphaS- creen (Perkin Elmer). Depois de 1 h de incubação em temperatura ambiente, 5 ul de uma segunda solução de detecção foram adiciona- dos, compreendendo as esferas aceptoras anticamundongo AlphaL|I- SA (Perkin Elmer). As placas foram incubadas por 2 horas em tempe- ratura ambiente no escuro. A medição foi realizada através da leitura das placas na leitora de placas Envision Multi label (Perkin Elmer, Wal- tham, MA, US).

[00351] Para determinar a capacidade dos nanocorpos em prevenir a clivagem mediada de ADAMTSSB5 do substrato, a diminuição no sinal foi analisada em função da concentração de nanocorpo e valores de IC5o foram calculados.

[00352] Os resultados são sumarizados na Tabela 5.1.

Tabela 5.1 Potência (IC5o) e % de Inibição da ADAMTSS5 para nano- corpos e compostos de referência no ensaio enzimático humano Al- PhaLISA.

Composto ID AIphaLISA humano 1C50 [NM] % de inibição mAb 12F4 H4LO0 6,5E-11 2F03 11B06 1,0E-10 9D03 1,1E-10 2812 1,5E-10 1,9E-10 3D02 2,2E-10 3B02 3,0E-10 9A05 3,2E-10 3D01 3,9E-10 | e&e | 2010 4,5E-10 rhTIMP3 6,1E-10 2D12 6,9E-10 oo 9,7E-10 13E02 2,2E-09 9D09 2,6E-09 7B11 3,6E-09 2A02 4,3E-09 | e | 3B03 1,2E-08 MSC2310852A 1,4E-07 = 9

[00353] No ensaio AIphaLISA, pelo menos três nanocorpos mono- valentes (2F03, 11B06 e 9D03) mostram valores ICs5o similares do que o mMAb 12F4 convencional, enquanto o restante tem valores maiores. No entanto, todos os nanocorpos mostram perto de 100 % de inibição. Notavelmente, o nanocorpo 3B03, que tem um valor de IC5so de pelo menos um fator 100 maior do que mAb 12F04 ainda tem 100 % de in- ibição.

5.2 Avaliação de ADAMTSS5 bloqueando nanocorpos no ensaio de ex- plante bovino

[00354] Avaliação da capacidade dos nanocorpos em bloquear a degradação da cartilagem em um ensaio ex vivo, no qual o substrato é apresentado em uma condição mais próxima da condição fisiológica comparada com os ensaios bioquímicos, um ensaio de explante bovi- no foi realizado. Em resumo, um ensaio de explante foi realizado. Em resumo, chips do explante de cartilagem bovina (diâmetro 4 mm) fo-

ram preparados recém retirados das articulações dos joelhos das va- cas e incubados em placas de 96 poços na presença de IL-1a para induzir a degradação da cartilagem. Como uma medida da degradação de cartilagem/agrecan, a liberação de GAG foi detectada no sobrena- dante depois de 5 dias de incubação (37 ºC, 7.5 % CO>z) com o corante metacromático 1,9 azul de dimetilmetileno (emissão a 633 nm). O sul- fato de condroitina foi incluído como padrão do ensaio. A eficácia foi definida por meio dos controles induzidos por IL-1a sem composto (0 %) e na presença de MSC2310852A (100 % de efeito).

[00355] Os resultados são sumarizados na Tabela 5.2. Tabela 5.2 Valores ICso dos nanocorpos monovalentes no ensaio de explante bovino. a EE * resultados podem apenas ser comparados dentro de 1 ensaio usan- do o mesmo explante, com experimento ID idêntico

5.3 Armazenamento de epítopo

[00356] Um "ensaio sanduíche" baseado em SPR em um instru- mento Biacore T100 foi realizado para agrupar os nanocorpos de ADAMTSS5 em diferentes reservatórios de epítopo. Com esta finali- dade, cada nanocorpo anti-ADAMTSSB foi imobilizado em um chip sen- sor CM5 através do acoplamento com amina usando química de EDC e NHS. Depois de uma etapa de captura de 100 nM ADAMTSS5, nano- corpos purificados em uma concentração de 1 uM foram injetados, ca- da em um ciclo único e sem a regeneração, com um tempo de contato em superfície de 120 segundos e uma taxa de vazão de 45 ul/minuto. As curvas foram processadas com software de avaliação Biacore T100 e avaliadas quanto à ligação adicional à ADAMTSSB5 capturada (diferen- te reservatório) ou não (mesmo reservatório).

[00357] —“Nanocorpos poderiam ser divididos em dois grupos: um re- servatório grande ("reservatório 1"), que compreende todos os nano- corpos inibidores que têm epítopos similares ou sobrepostos, e um se- gundo grupo compreendendo a ligação, nanocorpo 3F04 não funcional que reconhece um epítopo diferente em ADAMTSS5 ("reservatório 2").

[00358] Tabela 5.3 sumariza os epítopos de ligação dos nanocor- pos testados. Tabela 5.3 reservatórios de epítopo dos nanocorpos anti-ADAMTS5

5.4 Reatividade cruzada de espécies

[00359] A reatividade cruzada de espécies foi inicialmente avaliada através da análise da taxa de dissociação baseada em SPR em um instrumento Biacore T100. Nanocorpos foram testados quanto à liga- ção a ADAMTS5 humana, de macaco cinomolgo ("cyno"), porquinho da índia, camundongo e bovina. Com esta finalidade, ADAMTSSB5 re- combinante foi imobilizada em um chip CM5 através do acoplamento com amina usando EDC e NHS. Nanocorpos purificados foram injeta- dos por 2 minutos em uma concentração de 100 nM e deixados disso- ciar por 15 min em uma taxa de vazão de 45 ul/min. A taxa de dissoci- ação para cada nanocorpo individual Nanocorpo foi determinada pelo ajuste de um modelo de interação 1:1 (modelo Langmuir) nas curvas de dissociação individuais usando o software de avaliação BIA. Como uma referência, as taxas de dissociação em ADAMTS5 humana foram determinadas em cada experimento.

[00360] Os resultados estão sumarizados na Tabela 5.44.

Tabela 5.4A Visão geral dos dados de reatividade cruzada de espécies dos nanocorpos monovalentes anti-ADAMTS5 Nanocorpo ID | Expermentot | Experimento? | Experimento3 | Cino Porquinho camundongo Bovina [emana | Emo | Pardo | Memena |emundengo | Humana | ousa |

[00361] Para cada nanocorpo testado, taxas de dissociação simila- res foram observadas para todas as espécies testadas.

[00362] Além disso, a reatividade cruzada para ADAMTS5 de ma- caco cinomolgo e porquinho da índia também foi direcionada pela de- terminação de potência usando AIphaLISA, essencialmente conforme descrito no Exemplo 5.1, mas usando um substrato de oligopeptídeo 43-agrecan de cinomolgo biotinilado e um substrato de oligopeptídeo 43-agrecan de porquinho da índia biotinilado. Para determinar a capa- cidade dos nanocorpos em prevenir a clivagem mediada por ADAMTSSB do substrato, a diminuição no sinal foi analisada em função da concentração de nanocorpo e os valores de ICs5o foram calculados.

[00363] As potências resultantes são sumarizadas na Tabela 5.4B. Tabela 5.4B Visão geral dos dados de reatividade cruzada dos nano- corpos monovalentes anti-ADAMTS5 Nanocorpo ID Potência (IC50, M) AIPhaLISA | Humana | Cino | Porquinhoda índia 2F03 7,5E-11 8,1E-11 3,0E-10 11B06 1,0E-10 1,2E-10 3,5E-10 9DO3 1,1E-10 1,2E-10 1,3E-10 2A12 1,5E-10 1,9E-10 5,3E-10 2DO7 1,9E-10 1,5E-10 3,6E-10 3B02 3,0E-10 1,9E-10 4,6E-10 3D01 3,9E-10 2,2E-10 3,5E-10

[00364] Todos os nanocorpos e os compostos de controle bloquea- ram ADAMTS5 humana e de cino com potências similares. No Alpha-

LISA de porquinho da índia, os nanocorpos mais potentes mostraram potências levemente menores do que as no AIlphaLISA humano, po- rém este é mais provavelmente o resultado de menor sensitividade ao ensaio devido à concentração aumentada da enzima.

[00365] A reatividade cruzada de ratos dos nanocorpos 2A12, 2F03, 093 e 049 foi avaliada por meio de uma determinação de afinidade ba- seada em SPR usando Biacore T100. Para referência, a afinidade por ADAMTSS5 humana também foi determinada. Deste modo, ADAMTS5 de rato e humana foi imobilizada em um chip CM5 através do acopla- mento de amina, usando química de EDC e NHS. Os nanocorpos puri- ficados foram injetados por 2 minutos em diferentes concentrações (entre 1 e 1000 nM) e deixadas dissociar por 25 min em uma taxa de vazão de 45 ul/min. As constantes cinéticas foram calculadas a partir dos sensorgramas usando o software BIAEvaluation (interação 1:1).

[00366] “Conforme apresentado na Tabela 5.4C, afinidades similares em ADAMTS5 humana e ADAMTSS5 de rato foram obtidas para todos os nanocorpos testados. A afinidade do meia-vida estendida do Nano- corpo 069 (cf. infra) era similar à afinidade da sua contraparte monova- lente (que é o nanocorpo 049), indicando que a adição de ALB11 no C-terminal não teve nenhum efeito na afinidade. A afinidade de meia- vida estendida do nanocorpo 130 biparatópico era maior em ambas as espécies (15 vezes em ADAMTS5 humana e 10 vezes em ADAMTS5 de rato) comparado com a afinidade da meia-vida estendida do nano- corpo 069 (Tabela 5.4C). Tabela 5.4C visão geral das afinidades em ADAMTS5 humana e ADAMTSS de rato e ese AR Ass rumans | ADANTSS derato | Bos A a A

5.5 Inibição da atividade de MMP-1 e MMP-14

[00367] Para confimar a seletividade dos nanocorpos para ADAMTSS, a inibição da atividade da enzima de MMP-1 e MMP-14 foi avaliada com ensaios com base em FRET com as respectivas enzi- mas. Em resumo, a MMP-1 ou MMP-14 humana ativada foi incubada por 30 minutos em temperatura ambiente com 10 ul de série de dilui- ção de nanocorpo. Depois da incubação, 20 ul de respectivamente 5 UM ou 2.5 uM de substrato de peptídeo fluorogênico (substrato MMP fluorogênico Mca-PLGL-Dpa-AR-NH2 (R&D Systems cat tES001)) fo- ram adicionados. A capacidade dos nanocorpos em prevenir a cliva- gem mediada por MMP-1 e MMP-14 foi monitorada a cada minuto por 2 horas a 37ºC em uma leitora de placas Tecan Infinite M1000.

[00368] As curvas de titulação resultantes são mostradas na Figura

1.

[00369] Enquanto os inibidores naturais TIMP2 e TIMP3 inibiram a atividade de MMP-1 e MMP-14, nenhum dos nanocorpos testados mostrou inibição.

5.6 Inibição da atividade de ADAMTS4 humana

[00370] Para avaliar a inibição da ADAMTS4 humana, um ensaio similar ao ADAMTSS5 AIlphaLISA humano foi realizado, essencialmente como descrito no Exemplo 5.1, mas usando ADAMTS4 humana (R&D Systems, Minneapolis, US; cat % 4307-AD). Para determinar a capaci- dade dos nanocorpos em prevenir a clivagem mediada por ADAMTS4 humana do substrato, a diminuição no sinal foi analisada em função da concentração do nanocorpo e os valores de ICs5o foram calculados.

[00371] Os resultados são mostrados na Figura 2.

[00372] Enquanto a atividade de ADAMTS4 humana inibida por MSC2310852A de molécula pequena, nenhum dos nanocorpos testa- dos ou mAb 12F4 mostraram atividade inibidora (vide Erro! Fonte de referência não encontrada.). O anticorpo monoclonal 12F4 (H4L0) foi descrito como seletivo sobre ADAMTSA4 na publicação internacional WO 2011/002968. Exemplo 6 Formatação de nanocorpos

6.1 Knock out dos motivos de N-glicosilação

[00373] Os motivos de N-glicosilação presentes no nanocorpo 11B06 (posição N52) e nanocorpo 3FO04 (posição N110f) foram inati- vados "knocked out" antes da formatação. Os sítios foram randomiza- dos por meio de uma biblioteca de codons NNK. Uma vez que essas posições estão localizadas nas CDRs, a mutação do motive pode po- tencialmente influenciar as características de ligação. Conse- quentemente, as bibliotecas foram rastreadas quanto a possíveis sub- stituições que não afetaram a propriedade de ligação através da análise da taxa de dissociação baseada em SPR em ADAMTSS5 hu- mana usando um instrumento Biacore T100, essencialmente conforme descrito no Exemplo 5.4.

[00374] De forma surpreendente, substituir aminoácido N52 por serina no nanocorpo 11B06 e aminoácido N100r por glutamina no nanocorpo 3F04 não afetou a ligação (dados não mostrados).

[00375] Deste modo, os blocos de construção para formatação adi- cional, os nanocorpos 049 (=11B06 (N52S)) e 093 (3FO4 (N100-Q)) foram usados para representar nanocorpos 11B06 e 3F04, respec- tivamente (vide Tabela A-1).

6.2 Geração de nanocorpos formatados

[00376] Paraa geração de construtos de nanocorpo de meia-vida estendida os quais bloqueiam a atividade da agrecanase de ADAMTSS5 humana, os nanocorpos 2A12, 2D07, 2F03, 049, 9D03 e 3B02 foram fundidos a um nanocorpo ALB1 da albumina do soro anti- humano (vide Tabela 6.3). Além disso, os construtos de meia-vida es- tendida de ALB1 também foram gerados a partir de uma combinação de dois nanocorpos a partir de diferentes epítopos de ligação (uma combinação de um membro do reservatório 1 e um membro do res- ervatório 2). Os construtos de nanocorpo formatados foram expressa- dos em Pichia pastoris, secretados no meio de cultivo e afinidade pu- rificada em estedas de proteína A Poros MabCaptureA (Applied Bio- systems, Bleiswijk, Netherlands cat & 4374729). A integridade dos construtos de nanocorpo foi confirmada.

6.3 Potência em AlphaLISA na ausência e presença de HSA

[00377] Os construtos de nanocorpos formatados foram testados no AIphaLISA, conforme descroto no Exemplo 5.1. Adicionalmente, a in- fluência da ligação ao HSA na potência do nanocorpo foi direcionada pela realização do experimento na presença de um excesso de HSA (4.2 UM de concentração final).

[00378] Os valores de ICso de todos os construtos de nanocorpos de meia-vida estendida são listados na Tabela 6.3. Tabela 6.3. Potências dos construtos de nanocorpos formatados (+/- HSA) conforme determinado no AlphaLISA [oos —[2FosasemsALBIT 70611 Jo2EN | [jose ——lJomssesa.BIT = eo [os | [12 ——|[2F0335GS-093-35GS-ALBIT —[116E10 |ND [130 —[o18"35Gs-09335asALBIT —Jo7E1 |ND | [131 —|9Do335Gs-09335Gs-ALBIT —J81te1 |ND | ND = não determinado ; 093* = 3FO4 (N100;Q); 049º?* = 11B06 (N52S)

[00379] Os resultados indicam que nem a formatação de ALB11 nem a ligação a HSA afetam a potência dos construtos de nanocorpos.

6.4 Ligação a HSA

[00380] A afinidade do nanocorpo ALB11 a HSA foi determinada através de SPR em um Biacore T100. Com esta finalidade, HSA foi immobilizado em um chip CM5 através do acoplamento com amina e processado essencialmente conforme descrito no Exemplo 5.3. Como uma referência, a afinidade de ALB11 monovalente também foi deter-

minada, a qual foi de 3.2 nM.

[00381] Os resultados estão sumarizados na Tabela 6.4. Tabela 6.4 Afinidade do construto HLE de nanocorpos para HSA ALB1I1 12H08 “| 4 | 6 | ss | oe a, | 68 | a || ND = não determinado; *FNb = nanocorpo funcional; 049º* = 11B06 (N52S); 093** = 3FO4 (N100;Q)

[00382] Todos os construtos de nanocorpos de ADAMTS5 com meia-vida estendida tinham afinidades similares (vide Tabela 6.4), a qual era menor do que a afinidade de ALB11 monovalente para HSA.

6.5 Determinação da afinidade para ADAMTSS humana com KinExA

[00383] A afinidade do construto de nanocorpo formatado 069 (049- 35GS-ALB11) e construto de nanocorpo 130 (049-35GS-093- ALB11)(vide também Tabela 6.5) foi determinada em solução com um ensaio de exclusão cinética em um instrumento KinExA3S000 (Sapi- dyne, Boise, USA). Para esta finalidade, ADAMTS5 humana foi acoplada a esferas de PMMA de acordo com as instruções do fabri- cante, descrito em detalhes por Darling and Brault (2004 Assay Drug Dev Technol. 2:647-57). Uma concentração fixada do construto de nanocorpo (50 pM construto de nanocorpo 069 ou 5 pM construto de nanocorpo 130) foi adicionada a uma série de diluição de ADAMTS5 humana variando de 2 nM - 0.2 pM e incubada em temperatura ambi- ente por 16 horas até que o equilíbrio fosse alcançado. De forma sub- sequente, as misturas foram injetadas através do autoamostrador KinExXA sobre uma coluna acondicionada com esferas de PMMA con- jugadas a ADAMTS5 humana para capturar o construto de nanocorpo livre nas esferas com HAS marcado com Alexa647. O percentual livre de construto de nanocorpo foi classificado como uma função de ADAMTSS5 humana titulada e ajustado usando o software KinExA Pro v3.2.6.

[00384] Os resultados são mostrados na Tabela 6.5.

Tabela 6.5 Afinidades de 2 construtos de nanocorpos para ligação à ADAMTSS5 humana conforme determinado através de KinEXxXA [ Nanocorpo [Descrição —————JKp(bm) | 049* = 11B06 ( N52S); 093?* = 3FO4 (N100:Q)

[00385] “Uma afinidade cerca de 20 vezes maior é observada para o construto de nanocorpo 130 comparado ao construto de nanocorpo

069. Esses dados confirmam a ávida ligação em ADAMTS5 humana do construto de nanocorpo 130.

Exemplo 7 Otimização da sequência (SO) de nanocorpos

[00386] “Nanocorpo 2F03, Nanocorpo 049 (11B06 (N52S)) e Nano- corpo 093 exemplificador (3FO4 (N100,Q)) foi submetido a um proces- so de otimização de sequências. A otimização da sequência é um pro- cesso no qual uma sequência parental de nanocorpo é mutada e este processo cobre a humanização (i) do nanocorpo e "inativa" knocks-out as modificações pós-translacionais (ii) assim como epítopos para po- tenciais anticorpos preexistentes (iii). Nanocorpo ALB11 também foi mutado para inativar "knock out" epítopos para potenciais anticorpos preexistentes.

(i) para finalidades de humanização a sequência parental do nanocorpo é mutada para render uma sequência de nanocorpo que é mais idêntica do que a sequência consenso da linha germinativa IGHV3-IGHJ humana. Os aminoácidos específicos nas regiões frame- work (com a exceção dos assim chamados resíduos hallmark) que diferem entre o nanocorpo e a sequência consenso da linha germinati- va IGHV3-IGHJ humana são alterados na contraparte humana de tal forma que a estrutura, atividade e estabilidade da proteína são manti- das intactas. Um punhado de resíduos hallmark é conhecido como crucial para a estabilidade, atividade e afinidade do nanocorpo e são deste modo não mutados.

(ii) os aminoácidos presentes nas CDRs e para os quais há uma evidência experimental de que eles são sensíveis a modificações pós-translacionais (PTM) são alterados de tal forma que o sítio de PTM é inativado enquanto a estrutura, atividade e estabilidade da proteína é mantida intacta.

(iii) a sequência do nanocorpo é otimizada, sem afetar a es- trutura, atividade e estabilidade da proteína, para minimizar a ligação de anticorpos preexistentes de ocorrência natural e reduzir o potencial para evovcar uma resposta da imunogenicidade emergente ao trata- mento.

[00387] Paraa geração da sequência otimizada formatada do con- struto de nanocorpo 581 e construto de nanocorpo 579, respectivos blocos de construção foram conectados através de ligantes 35GS. Isso resultou em construto de nanocorpo 581 (2F35º-35GS ligante-Alb11) e construto de nanocorpo 579 (2F3$º-35GS ligante-093%º-35GS ligante- Alb11), respectivamente (cf. Tabela A-1). Os construtos foram produzidos em Pichia pastoris com proteínas sem marcadores e purifi- cados através da cromatografia de afinidade da proteína A, seguido por dessanilização. A integridade do construto de nanocorpos foi con- firmada.

7.1 Afinidade por ADAMTS5 humana

[00388] Afinidade do construto de nanocorpo 581 (2F3$º-35GS ligante-Alb11) foi determinada usando KiInExA, conforme descrito no Exemplo 6.5 com umas poucas menores adaptações ao protocolo descrito. Uma concentração fixada de 20 pM de construto de nanocor- po 581 foi incubada junto com uma série de diluição de ADAMTS5 humana (2,2 vezes de diluições seriais que variam entre 20 nM e 0.32 PM e um vazio sem ADAMTSS5). Para testar quanto à interferência de albumina, HSA foi adicionado a esta pré-incubação em experimentos selecionados com ADAMTS5 humana, em uma concentração de 100 vezes o seu KD para o construto de nanocorpo 581. As misturas foram incubadas e deixadas alcançar equilíbrio por 24 horas antes da injeção através do autoamostrador KinExXA sobre uma coluna cheia com es- feras de PMMA conjugadas a ADAMTS5 humana. O construto de nanocorpo capturado 581 foi detectado usando uma ferramenta anti- nanocorpo marcada com AF647 reconhecendo o construto de nano- corpo 581 (gerado por Ablynx).

[00389] Resultados são apresentados na Tabela 7.1. Tabela 7.1 Afinidade do construto de nanocorpo 581 por ADAMTS5 humana com e sem HSA

[00390] Os resultados mostram que a afinidade do construto de nanocorpo 581 por ADAMTS5 humana é de 3,65pM sem HSA e 4,84 PM com HSA.

7.2 Afinidade por albumina do soro

[00391] Afinidade do bloco de construção ALB11 no construto de nanocorpo 581 (2F35º-35GS ligante-Alb11) para ligação à albumina do soro (SA) humano, de macaco cinomolgo, porquinho da índia e rato foi determinada usando SPR conforme descrito no Exemplo 5.3.

[00392] Resultados são mostrados na Tabela 7.2. Tabela 7.2 Afinidade (Kp, nM) do construto de nanocorpo 581 para li- gação à albumina do soro humano, de macaco cinomolgo, porquinho da índia e rato * taxa de dissociação está fora do limite de detecção: > 5.0E-01 (1/s)

7.3 Ligação pre-Ab

[00393] Construto de nanocorpo 581 (2F35º-35GS ligante-Alb11) e construto de nanocorpo 579 (2F3$º-35GS ligante-093%º-35GS ligante-

Alb11) foram rastreados quanto à ligação ao anticorpo preexistente (pre-Ab) a partir de 3 conjuntos de amostra de soro do doador relevan- te (amostras de indivíduos saudáveis, amostras de OA e um conjunto tendencioso de amostras com ligação residual pre-Ab conhecida a ou- tros nanocorpos) através da tecnologia SPR em um instrumento Pro- teOn XPR36. As amostras de sangue foram analisadas quanto à liga- ção aos construtos de nanocorpo anti-ADAMTSS5, que foram captura- dos em HSA. Os níveis de ligação ao anticorpo preexistente foram de- terminados depois de referência dupla dos sensorgramas ao ajustar os relatórios em 125 segundos (5 segundos depois do final da associa- ção). A análise foi realizada com ProteOn manager 3.1 (Bio-Rad Labo- ratories, Inc.).

[00394] Os resultados são mostrados na Figura 3.

[00395] Ambos os construtos de nanocorpos tinham baixos níveis de ligação pre-Ab residual, com o construto de nanocorpo 581 mos- trando claramente a ligação pre-Ab menos residual (cf. Erro! Fonte de referência não encontrada.).

7.4 Funcionalidade em AlphaLISA humano

[00396] “Um AIphaLISA foi realizado com o construto de nanocorpo 581 (2F35º-35GS ligante-Alb11) usando ADAMTS5 humana essenci- almente conforme descrito no Exemplo 5.1.

[00397] — Os resultados são mostrados na Tabela 7.4. Tabela 7.4 Potência (DM) do construto de nanocorpo 581 conforme determinado por AlphaLISA.

[00398] Os resultados mostram que a potência do construto de nanocorpo 581 é 188 pM.

7.5 criação do perfil de imunogenicidade no ensaio de célula dendríti- ca- célula T

[00399] A imunogenicidade relativa foi determinada em um ensaio de proliferação de célula dendrítica- célula T. Em essência, os nano- corpos foram testados novamente em um conjunto de 50 amostras de célula de doador saudável contendo os alelos de classe |l de HLA mais abundantes, como tais representando a maioria da população global. A resposta imune foi avaliada usando a proliferação de célula T como um marcador substituto para a formação de anticorpo anti- fármaco. A hemocianina de lapa (KLH) foi usada como um controle positivo. A KLD do controle positivo levou a uma resposta positiva em todos os 50 doadores. Nenhum dos doadores testou positivo para construto de nanocorpo 581 (2F35$º-35GS ligante-Alb11). O construto de nanocorpo 579 (2F35%º-35GS ligante-093%º-35GS ligante-Alb11) levou a uma resposta positiva em três doadores, ou 6%. Na condição vazia (média apenas), 2 dos 50 doadores, ou 4 %, mostraram respon- der positivo. Esses resultados foram usados para acertar um limite de resposta total de mais do que 3 dos 50 doadores correspondendo a um limite de resposta total de > 6%. O potencial imunogênico total pa- ra os nanocorpos testados foi considerado baixo já que a porcentagem de respostas significativas, positivas foi de < 6% (vide Tabela 7.5). Tabela 7.5 resultado da criação do perfil de imunogenicidade conforme determinado em um ensaio de célula DC-T

7.6 Ligação a ADAMTS1 humana

[00400] A ligaçãoaADAMTS1 humana foi testada em um ELISA de ligação (vide Erro! Fonte de referência não encontrada.A). Em re- sumo, 18,5 nM de ADAMTS1 humana (R&D Systems, Minneapolis, US; cat % 2197-AD) e ADAMTS5 humana ;(R&D Systems, Minneapo-

lis, US; cat %& 2198-AD) foram revestidos em placas MaxiSorp de 384 poços (Nunc, Wiesbaden, Germany). Os poços foram bloqueados com uma solução de caseína (1%) e série de diluição do construto de na- nocorpo 581 (2F35º-35GS ligante-Alb11) e mAb ADAMTS1 anti- humano (R&D Systems, Minneapolis, US; cat % MAB2197) foram tes- tados quanto à ligação em ambas as proteínas revestidas. Depois da detecção com uma ferramenta anti-nanocorpo conjugada com HRP reconhecendo construto de nanocorpo 581 (gerado por Ablynx) e um anticorpo anticamundongo conjugado com HRP (Abcam, Cambridge, UK) respectivamente, e uma reação enzimática subsequente na pre- sença do substrato esTMB (3,3',5,5'-tetramentilbenzidina) (SDT, Brus- sels, Belgium), OD450 nm foi medida.

[00401] “Uma curva de dose resposta foi observada para o construto de nanocorpo 581 em ADAMTSS5 humana e para mAb ADAMTS1 anti- humano em ADAMTS1 humana, mostrando que o construto de nano- corpo 581 não se liga a ADAMTS1 humana.

7.7 Ligação a ADAMTS4 e ADAMTS15 humanas

[00402] A ligação a ADAMTS4 e ADAMTS15 humanas foi testada em um ELISA de ligação (vide Figura 4B). Em resumo, 1 pg/ml de ADAMTSA4 humana (R&D Systems, Minneapolis, US; cat tt 4307-AD) ou ADAMTS15 humana (R&D Systems, Minneapolis, US; cat %& 5149- AD) foi revestido de um dia para o outro em 1 ug/mL em placas Max- isorp ELISA de 96 poços (Nunc, Wiesbaden, Germany). Depois do bloqueio das placas com SuperBlock T20 (PBS) (Thermo Scientific Pierce; cat %& 37516) uma curva da dose resposta do construto de nanocorpo 581 ("C011400581") ou do mAb anti-ADAMTSA de controle positivo (R&D Systems, Minneapolis, US; cat tt MAB4307) ou o mAb anti-ADAMTS15 de controle positivo (R&D Systems, Minneapolis, US; cat tt MABS5149) foi aplicado na placa revestida iniciando em 1 uM e incubado por 1 hora em temperatura ambiente. O nanocorpo ligado

CO011400581 foi detectado com uma ferramenta anti-nanocorpo bio- tinilada reconhecendo o construto de nanocorpo 581 (gerado por Ablynx), enquanto os mAb's de controle positive com um pAb de de cabra anti-camunodongo biotinilado (Jackson Immuno Research; cat t 115-065-062). Para ambos estreptavidina-HRP foi usada uma ferra- menta de detecção secundária (Thermo Scientific Pierce; cat tt 21126). As placas foram então visualizadas com a adição de sSTMB ) (SDT, Brussels, Belgium). Todas as ferramentas de diluição e detecção foram preparadas em diluente de ensaio (= PBS + 10% Superblock +

0.05% Tween20). A reação de coloração foi parada depois de 2,5 minutos com a adição de HCl IM. A densidade ótica foi medida em 450 nm com 620 nm como comprimento de onda de referência.

7.8 Reatividade cruzada de espécie através da determinação de afini- dade KinEXA

[00403] Afinidade do construto de nanocorpo 581 (2F35º-35GS ligante-Alb11) em direção a várias ADAMTSS5 de espécies conforme determinada usando KinExA, conforme descrito no Exemplo 7.1 Para todas as espécies, as esferas de PMMA conjugadas a ADAMTSS5 hu- mana foram preparadas e o uso para captura do construto de nano- corpo 581 livre conforme descrito acima. O construto de nanocorpo 581 capturado foi detectado usando uma ferramenta de anti- nanocorpo marcada com AF647 reconhecendo o construto de nano- corpo 581 (gerado por Ablynx). Os resultados são mostrados na Tabe- la 7.7 Tabela 7.7 Afinidade do construto de nanocorpo 581 para ADAMTS5 de macaco cinomolgo, rato, camundongo e bovino [Rato(nst) lay [148 507 =>) Exemplo 8 Potência no ensaio de explante humano

[00404] “Construto de nanocorpo 581 (2F3$º-35GS ligante-Alb11) foi avaliado quanto à capacidade de bloquear a degradação da cartilage em um ensaio ex vivo, essencialmente conforme descrito no Exemplo

5.2, mas agora em um ensaio de explante humano. Em resumo, chips do explante de cartilagem humana (diâmetro 4 mm) foram preparados recém retirados das articulações de joelhos humanos e incubados em placas de 96 poços na presença de 10 ng/ml IL-1a para induzir a degradação da cartilagem). Como uma medida da degradação de car- tilagem/agrecan, a liberação de GAG foi detectada no sobrenadanete depois de 7 dias de incubação (37 ºC, 7.5 % CO>z) com o corante met- acromático azul de 1,9 dimetilmetileno (emissão a 633 nm). O sulfato de condroitina foi incluído no ensaio padrão. A eficácia foi definida por meio dos controles induzidos IL-18 e OSM sem o composto e na presença de MSC2310852A. CRBOO017 é um mAb anti-ADAMTSS5 que é usado em um teste clínico de fase | (Rottapharm).

[00405] Os resultados são sumarizados na Figura 5 e Tabela 8. Tabela 8 Composto Ensaio 1IC50 GAG [uM] 581 Humano 0,0025-0,0079 581 Bovino 0,035 CRBO0017 Bovino 0,33

[00406] “Nanocorpos demonstram alta potência e 100% de degradação da inibição da cartilagem (perda de GAG) em ensaio de explante humano. Conforme mostrado na Tabela 8, os nanocorpos são pelo menos 10 vezes melhores do que CRBO0017 no ensaio de ex- plante bovino. Exemplo 9 Modulação de C2M, C3M e exAGNX1 em um modelo de cocultura bovina

[00407] O efeito do construto de nanocorpo 581 ("581" nas figuras)

na liberação e conteúdo de GAG, C2M (marcador da degradação de colágeno Il), C3M (marcador da degradação de colágeno |1ll) e exA- GNx1 (marcador para a degradação de agrecan caracterizado pelo neo-epítopo TEGE) em um sistema de cocultura bovina foi investiga- do. Nestes sistemas de cocultura, os explantes de cartilagem de um joelho bovino foram incubados junto com a membrana sinovial a partir do mesmo animal por 28 dias. A maior liberação de GAG foi detectada depois de 7 dias em cultura (Figura 6A). O construto de nanocorpo 581 foi testado em três concentrações: 1 nM, 10 nM, 100 nM. Incubação dos explantes de cartilagem com sinóvio resultaram na liberação de GAG aumentada. O construto de nanocorpo 581 inibiu a liberação de GAG (Figura 6B).

[00408] Em linha coma liberação de GAG, a análise do conteúdo restante de GAG do explante de cartilagem (depois da digestão de pa- paína) revelou um conteúdo de GAG reduzido depois da coincubação de explantes com sinóvio comparado aos explantes sozinhos (Figura 6C).

[00409] Paralelo à análise da liberação de GAG, a liberação de exAGNxX1 como um marcador específico para a degradação de agre- can foi medida. A área sob a análise da curva (AUC) mostrou uma in- dução robusta da liberação de exAGNx1 quando explantes de cartila- gem e sinóvio foram incubados juntos. Além disso, o construto de na- nocorpo 581 inibiu a liberação de exAGNx1 em uma maneira de con- centração dependente com a inibição completa a 100 nM 581 (Figura 7).

[00410] Para determinar o efeito do construto de nanocorpo 581 na rede de colágeno da cartilagem no sistema de cocultura, C2M, como um marcador para a degradação do colágeno |l foi determinado. Em contraste com os marcadores para a degradação da rede de agrecan (GAG e exAGNx1), C2M começou a aumentar entre os dias 146 21.A incubação do construto de nanocorpo 581 no sistema de cocultura ini- biu a liberação de C2M (Figura 8).

[00411] Como marcador adicional para a inflamação sinovial, C3GM (isto é, um marcador de degradação de colágeno do tipo Ill) foi deter- minado. Uma análise do decurso de tempo da liberação de C3M indi- cou que o C3M começou a aumentar depois de 14 dias, chegando ao pico em torno do dia 21. O tratamento com o construto de nanocorpo 581 inibiu C3M em todas as três concentrações (Figura 9). Exemplo 10 Inibição da atividade da agrecanaseina NHP

[00412] A capacidade do construto de nanocorpo 581 (2F35º-35GS ligante-Alb11; "C011400581") em inibir a atividade da agrecanase in vivo foi avaliada em modelo de primate não humano (NHP), macaco cinomolgo. Em resumo, o construto de nanocorpo 581 foi dado aos grupos de 3 machos e 3 fêmeas de macaco cinomolgo uma vez por semana através da administração subcutânea (s.c.) em níveis de dose de 6, 30 ou 150 mg/kg por 4 semanas. Um grupo de controle concomi- tante foi tratado com o veículo, isto é 20 mM Histidina, 8% de sacarose, 0,01% de Tween 20 pH 6,0.

[00413] A inibição da atividade da agrecanase foi medida em amostras de soro coletadas em vários momentos determinando o nível de fragmentos de degradação de agrecan caracterizado pela presença do neo-epítopo ARGS no soro. Todos os animais tratados com o con- struto de nanocorpo 581 mostraram um perfil similar, isto é níveis de ARGS reduzidos mediante a primeira dosagem e alcançaram níveis muito baixos em torno de ou abaixo do menor limite da faixa de medição (LLMR) do ensaio (0,08 nM) entre 48 horas e 120 horas. De forma subsequente, os níveis de ARGS mostraram uma redução máx- ima sustentada em torno ou abaixo do LLMR e não retornaram à linha de base ao final do estudo em 4 semanas.

[00414] Uma visão geral dos resultados é mostrada na Figura 10.

[00415] Em conclusão, os nanocorpos específicos de ADAMTS5 engatam o alvo seguindo a administração sistêmica e modulam poten- cialmete os níveis do neo-epítopo ARGS in vivo em todos os níveis de dose testados. Além do mais, em contraste com os mAbs da técnica anterior, se observou que nenhum item de teste relatou arritmias pato- lógicas. Além disso, não houve evidência de qualquer elevação de ST relacionada ao teste nos macacos machos e fêmeas tratados com os nanocorpos em qualquer nível de dose testado. Exemplo 11 Inibição da degeneração da cartilagem

[00416] De modo a adicionalmente avaliar a capacidade dos nano- corpos e construtos de nanocorpos em inibir a degeneração da carti- lagem in vivo, um modelo de DMM (desestabilização do menisco me- dial) em camundongo foi usado. Em resumo, o menisco medial foi desestabilizado cirurgicamente. O construto de nanocorpo 581 exem- plificador (2F38º-35GS ligante-Alb11) foi administrado de forma sub- cutânea 3 dias antes da indução da DMM (profilática) ou administrado 3 dias depois da indução da DMM (terapêutica) em várias concen- trações. Depois de 8 semanas de tratamento, os animais foram sacrifi- cados e os joelhos foram removidos. Os joelhos foram embutidos em blocos de parafina, seccionados e corados com azul de toluidina. De forma subsequente, as seções foram classificadas quanto a vários parâmetros, incluindo a soma da degeneração da cartilagem medial.

[00417] Os resultados são mostrados na Figura 11.

[00418] Os resultados mostram que há um benefício estrutural de até 50% para ambos o tratamento profilático e terapêutico (s.c.) com nanocorpos no modelo de DMM do camundongo. Exemplo 12 benefício sintomático no modelo cirúrgico de OA em rato

[00419] De modo a avaliar a capacidade dos nanocorpos em es- tabelecer um benefício sintomático, um modelo cirúrgico de OA em rato foi usado. Em resumo, os ratos foram tratados com cirurgia ACLt e tMx para induzir OA no dia 0. No modelo cirúrgico de ACLt e tMx (transsecção do ligamento cruzado anterior extendida com uma me- niscectomia medial), o construto de nanocorpo 581 foi administrado s.c. em dias alternados a partir do dia 3 em diante. Em uma base semanal, o benefício sintomático através da análise da marcha (em um CatWalk) assim como redução no diâmetro da articulação foi de- terminado.

[00420] Os resultados são mostrados na Figura 12.

[00421] A osteoartrite foi induzida (no dia 0) em ratos machos adul- tos (Lister Hooded; peso corporal médio de 346 + 20 g) através da ci- rurgia de transecção do ligamento cruzado anterior (ACLT) + res- secção do menisco medial (tMx) na articulação do joelho direito. O tratamento com veículo ou item de teste (sc) iniciou no dia 3 depois da cirurgia e continuous a cada segundo dia até o dia 42. O grupo de con- trole saudável não teve nenhuma intervenção cirúrgica, mas recebeu veículo sc nos mesmos intervalos de tempo que os grupos de dos- agem. A perturbação da marcha (A) com o tempo calculado como "% de benefício sobre o veículo". Média do grupo "saudável + placebo" = 100 % de benefício. Média do grupo "ACLT tMx + veículo" = 0 % de benefício. (B) Média do "benefício sobre o veículo" em todos os inter- valos de tempo investigados depois do início do tratamento. É mostra- do=a a média + SEM de 14-15 ratos/grupo. *= p<0,05 calculado com ANOVA de 1 via e Dunnett's.

[00422] O tratamento precoce com nanocorpos causou um benefí- cio dose-dependente, significativo e relevante durante OA induzida por ACLT + tMx. Exemplo 13 Estudos de toxicidade em macacos cinomolgos

[00423] Um estudo de toxicidade subcrônica de 4 semanas em ma- cacos cinomolgos foi conduzido para obter a informação na toxicidade sistêmica, tolerabilidade local e segurança na farmacologia dos nano- corpos. O construto de nanocorpo 581 exemplificador (2F3$º-35GS ligante-Alb11) foi dado s.c. aos grupos de 3 machos e 3 fêmeas de macacos cinomolgos (Macaca fascicularis) (uma vez por semana atra- vés da administração subcutânea na região dorsal em doses de 6, 30 ou 150 mg/kg por 4 semanas. Um grupo de controle concomitante foi tratado com o veículo, 20 mM de Histidina, 8% de sacarose, 0,01% de Tween 20 pH 6,0.

[00424] Nenhum sinal de intolerância local relacionado ao item de teste foi notado em qualquer um dos níveis de dose testados. Nenhum efeito relacionado ao item de teste foi notado no comportamento, peso corporal, consumo de alimentos, parâmetros hematológicos e bioquíi- micos, tipagem dos linfócitos, níveis de CRP, parâmetros de urinálise, funções oftalmológicas e auditivas e pesos dos órgãos de qualquer um dos animais em qualquer nível de dose (dados não mostrados). Nem a inspeção macroscópica na necropsia nem o exame histopatológico revelaram qualquer modificação local ou sistêmica nos órgãos que es- tavam relacionados ao tratamento com o item de teste em nenhum dos animais examinados em qualquer um dos níveis de dose testados.

[00425] Já que foireportado que mAb 12F4 demonstrou hemorragia focal endocárdica, um aumento dose-dependente na pressão sanguí- nea com nenhuma evidência de reversibilidade assim como anormali- dades na condutância cardíaca (elevação de ST e arritmias ventricula- res) (Larkin, et al., The highs and lows of translational drug deve- lopment: Antibody-mediated Inibhition of ADAMTS-5 for osteoarthritis disease modification, OARSI conference 2014: Paris; Renninger et al., Identification of Altered Cardiovascular Function Produced by a Novel Biologic Compound in a Stand Alone Safety Pharmacology Primate Study, in SPS meeting, 2013), a telemetria extensiva não invasiva em- pregando o sistema EMKA foi realizada nos animais.

[00426] Nenhuma influência relacionada ao item de teste foi notada em qualquer um dos parâmetros telemétricos (empregando o sistema EMKA não invasivo) de qualquer um dos animais em qualquer nível de dose. Em particular, nenhuma arritmia patológica foi observada e não houve evidência para elevação de ST relacionada ao item de teste em macacos machos e fêmeas tratados com os nanocorpos em qualquer um dos níveis de dose testados (dados não mostrados).

[00427] Esses estudos confirmam que nanocorpos específicos de ADAMTSS5 podem ser considerados seguros. Exemplo 14 Estudo DMOAD do modelo MMT de rato in vivo

[00428] De modo a demonstrar a eficácia in vivo dos inibidores de ADAMTSS5 fundidos a um aglutinante CAP da invenção, um modelo induzido cirurgicamente de lesão meniscal medial (MMT) em ratos foi usado. Em resumo, um nanocorpo anti-ADAMTSS5 foi acoplado a um aglutinante CAP (indicado como construto de nanocorpo C010100954 ou construto de nanocorpo 954). Ratos foram operados em um joelho para induzir sintomas parecidos com OA. O tratamento iniciou 3 dias após a cirurgia com injeção IA. A histopatologia foi realizada no dia 42 pós-cirurgia. As amostras do soro internas e terminais foram tomadas para análise exploratória do biomarcador. A largura da degeneração da cartilagem substancial medial e total foi determinada, assim como a redução da porcentagem da degeneração da cartilagem. 20 animais foram usados por grupo.

[00429] O defeito da subcartilagem na tíbia medial é mostrado na Figura 13.

[00430] Os resultados demonstram que a largura da cartilagem foi substancialmente reduzida pelo construto ADAMTS5-CAP depois de 42 dias comparado com o veículo. Esses resultados sugerem que a porção CAP não tem nenhum efeito negativo na atividade do nanocorpo anti-ADAMTSS5;

a porção CAP permite a retenção do nanocorpo anti- ADAMTSS5; e o nanocorpo anti-ADAMTSS5 tem um efeito positivo na lar- gura da cartilagem, mesmo quando acoplado a uma porção CAP. Exemplo 15

[00431] Métodos: Explantes de cartilagem bovina de quatro animais (BEX), assim como explantes de cartilagem humana de oito articulações de joelho cirurgicamente substituídas (HEX) e de uma articulação de joelho humano saudável (hHEX), foram cultivados por até 21 dias no meio sozinho (w/o), na presença de citocinas pró- inflamatórias (oncostatina M [10 ng/mL] + TNFa [20 ng/mL] (O+T)) ou O+T com construto de nanocorpo 581 exemplificador (2F3$º-35GS ligante-Alb11) [1 uM-1 nM]. Cartilagem e sinóvio de vacas (bCC) e de 4 articulações de joelho humano osteoartrítico substituídas (hCC) foram cocultivadas ex vivo por até 28 dias em meio sozinho (w/o), com O+T or O+T mais construto de nanocorpo 581 exemplificador (2F35$º- 35GS ligante-Alb11) [1 uM-0,6 nM]. A cartilagem foi cortada em explantes de tamanho igual usando uma agulha de biópsia. As membranads sinoviais foram cortadas em explantes de tamanhos iguais (380 mg [3 mg]) com bisturi. A atividade metabólica dos explantes foi avaliada por Alamar Blue. O retorno do tecido da cartilagem foi avaliado usando um ensaio imunoabsorvente ligado à enzima (ELISA) para medir biomarcadores bem caracterizados de degradação (huARGS, exAGNxI, C2M) e formação (ProC2) no meio condicionado. ProC2 e C2M são metabólitos de formação e degradação do colágeno do tipo |l, respectivamente, enquanto exAGNxX| e huARGS são metabólitos de agrecan degradado com ADAMTS-5. Os valores médios e erro padrão da média (SEM) são reportados. A análise estatística foi feita usando análise de variância de uma via (ANOVA) com teste de comparações múltiplas de Dunn ou

ANOVA de duas vias com teste de comparações múltiplas de Dunnett assumindo a distribuição normal.

[00432] Resultados: Atividade metabólica de BEX, HEX e bCC ficou estável ao longo do período de cultura, enquanto a atividade metabólica em hCC e hHEX caiu significativamente do dia 14 em condições tratadas com O+T comparado com w/o. Em culturas estimuladas com O+T, os metabólitos de ADAMTS-5 degradaram agrecan em pico dentro da primeira semana de cultura, exceto para hHEX na qual huARGS e exAGNxI aumentaram levemente mais tarde. A degradação do colágeno do tipo Il, C2M, by O+T aumentou depois do dia 19. A formação do colágeno do tipo Il, Pro-C2, permaneceu relativamente estável ao longo das culturas, comparado com o w/o controle.

[00433] Tratamento com construto de nanocorpo 581 exemplifi- cador (2F3$º-35GS ligante-Alb11) em combinação com dose O+T dependentemente diminuída huARGS no dia 5 em BEX (dose mais alta: 8% de O+T), HEX (dose mais alta: 40% de O+T), bCC (dose mais alta: 10% de O+T), hCC (dose mais alta: 40% de O+T), e hHEX (dose mais alta: 24% de O+T) (Figura 14). O IC50 do construto de nanocorpo 581 exemplificador (2F35º-35GS ligante-Alb11) baseado na redução de huARGS variou de 300NM em BEX a <15nM HEX, hHEX, bCcC e hcc (Figura 14). O efeito do construto de nanocorpo 581 exemplificador (2F38º-35GS ligante-Alb11) em exAGNxI foi similar ao huARGS nas culturas testadas. O construto de nanocorpo 581 exem- plificador (2F3$º-35GS ligante-Alb11) também reduziu C2M (marcador para degradação do colágeno do tipo 1!) significativamente e depen- dente da dose, apesar do efeito ser menor do que para os marcadores de degradação de agrecan. O construto de nanocorpo 581 exem- plificador (2F3%º-35GS ligante-Alb11) não mostrou nenhum efeito na formação do metabólito Pro-C2 do colágeno do tipo Il ollagen forma-

tion em qualquer uma das condições testadas.

[00434] Conclusões: Aqui, mostramos que o construto de nanocorpo 581 exemplificador (2F39º-35GS ligante-Alb11) tem efeitos protetores da cartilagem devido a sua inibição da degradação de agrecan mediada por ADAMTS-5 dose-dependente e degradação do colágeno do tipo Il mediado por MMP em condições pró-inflamatórias das culturas de cartilagem de bovino e humana ex vivo e em coculturas de cartilagem e sinóvio. 2F35º-35GS ligante-Alb (SEQ ID NO: 129) é uma das modalidades preferidas da invenção. Exemplo 16 os construtos de nanocorpo atuais superam os nano- corpos da técnica anterior

[00435] Na publicação internacional WO2008/074840 vários nano- corpos ADAMTSB5 foram descritos. No presente experimento, uma comparação foi feita entre os 26 nanocorpos descritos na publicação internacional WO2008/074840 versus os nanocorpos da presente in- venção representados pelo nanocorpo 2F3*º exemplificador (2F3”*).

[00436] Todos os construtos foram testados no ensaio AIlphaLISA, conforme descrito no Exemplo 5.1. Nanocorpo 2F3*% (2F3*) é o bloco de construção monovalente de ligação a ADAMTS5 de C011400581 (SEQ ID NO: 129). Como um controle negativo, o nanocorpo irrelevan- te IRRO0028 foi usado.

[00437] Primeiro a atividade dos nanocorpos da técnica anterior foi determinada no AIphaLISA. Os resultados são mostrados na Tabela

16.1. Tabela 16.1 Atividade dos nanocorpos da técnica anterior em AlphaL!-

SA No [Nome — IComprimentolComprimento de CDR3 — Resultados de AlphalLisa = >| 1 [3601 149 17 Bloqueio 2 — |36A06 147 15 intensificador 4 Bspos Se K Bloqueio — |36EO1 147 hs Intensificador 6 Ís6Fo 149 17 Bloqueio 7 187B01 146 15 Intesificador

8 —[37B06 145 13 Bloqueio o 37B12 151 16 Intensificador |[37C06 150 18 Intensificador 11 B7C12 150 18 Intensificador 12 [37D06 146 hs Intensificador 13 [37E06 151 16 Sem atividade 14 |[37F01 146 15 Intensificador |37F12 150 18 Intensificador 16 [B7G01 150 8 Bloqueio 17 |[37GO06 146 15 Intensificador 18 4007 151 16 Sem atividade 19 J40B08 146 15 Sem atividade [40DO7 146 14 [Sem atividade 21 [40E08 147 15 Sem atividade 22 —J4oFO7 146 14 Bloqueio 23 [40FO8B 151 19 [Sem atividade 24 J40GO7 146 14 Bloqueio 40GO8 151 16 Sem atividade la6 —JaoHo7 146 14 [Sem atividade

[00438] Os resultados demonstram que apenas 7 nanocorpos da técnica anterior têm uma atividade de bloqueio. O restante dos nano- corpos da técnica anterior não teve nenhuma atividade ou intensificou a atividade.

[00439] Em uma segunda fase deste experimento comparativo, os nanocorpos de bloqueio foram comparados vis-à-vis com o nanocorpo monovalente exemplificador 2F3% (2F3*).

[00440] Os valores de ICso dos construtos de nanocorpo são lista- dos na Tabela 16.2. A diferença em razão de aumento de tamanho com o nanocorpo monovalente exemplificador 2F3*% (2F3*) também é indicada para facilidade de comparação. Tabela 16.2 Potências dos construtos de nanocorpo da técnica anteri- or vis-à-vis 2F3ºº de nanocorpo (2F3*) conforme determinado em Al- phaLISA 1 2F3º (2F3*) 2,0E-10 [1,2E-10; 3,1E-10] - 36DO06 1,4E-09 [8,5E-10; 3,6E-09] 7x 36FO1 7,0E-09 [2,3E-09] 35x 36B06 2,2E-09 [1,4E-09; 3,7E-09] Mx 2 2F3º (2F3*) 2,7E-10 [2,2E-10; 3,4E-10] -

37G01 7,3E-09 [5,2E-09; 1,2E-08] 27X 3 2F3* (2F3") 1,9E-10 [1,5E-10; 2,3E-10] - 40F07 1,9E-09 [1,4E-09; 2,8E-09] 10x 40G07 1,7E-09 [1,2E-09; 2,4E-09] gx 4 2F3º (2F3*) 4,4E-10 [3,6E-10; 5,3E-10] C011400581 3,5E-10 [2,8E-10; 4,4E-10] 36A01 Inibição parcial

[00441] Pode ser concluído que os construtos de nanocorpo da presente invenção superaram os nanocorpos de ADAMTSSB5 da técnica anterior. Tabela A-1 Nome e descrição curta ("ID"), SEQ ID NO:s ("SEQ") e se- quências de aminoácido de nanocorpos anti-ADAMTS5 monovalentes e multivalentes [e sea fee EVOLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASRRTFSSYVMAWFRQAPGKEREFVAAIS- 2A02 5 RSGDSTYYYDSLEGRFTISRDNAKNTVHLQMNSLKPEDTAVYICAASRAPSFRT|-

DAINYYDYWGQGTLVTVSS EVOLVESGGGLVQAGGSLRLSCAASGRTFSSYAMGWFRQAPGKERDFVAGISR- 2A12 1 SAGRTYYVDSVKGRFTISRDSAKNTVYLQMNRLKPEDTAVYYCAADLDPNRIFSR-

DEAAYWGQGTLVTVSS EVOLVESGGGLVOQAGGSLRLSCATSGFTFSPYYMGWFRQAPGKERDFVAAITRS- 2C10 RGTTYYLDSTEGRFTISRDNAKNTMYLQMNSLNPEDTAVYYCAAGRSPGDPS-

RTYLYEYWGQGTLVTVSS EVOLVESGGGLVOAGGSLRLSCSFSGPGRTFARYAMGWFRQAPGKNRDFITGIS- 2D07 GSGDSTYYVYPMKDRFTISRDNAKNMVYLQMNALKPEDTAVYYCAADREINRI|-

ANDKELDFWGQGTLVTVSS EVOLVESGGGLVOAGDSLRLSCAASGRTFSTYFVGWFRQAPGKERDFVAAISRN- 2D12 GARTYYYDSVAGLFTISRDNAKNTVYLQMSSLKPEDTAVYYCAAARISPSDPSNED-

GYDYWGQGTLVTVSS EVOLVESGGGLVOAGGSLRLSCAASGRTVSSYAMGWFRLAPGKEREFVAGISR- 2F03 2 SAERTYYVDSLKGRFTISRDSAKNTVYLHMNRLKPEDTAVYYCAADLDPNRIFS-

REEYAYWGQOGTLVTVSS EVOLVESGGGLVOAGGSLRLSCAASGRTTFSSYAMGWFRQAPGKERAFVATI- 2G01 7 WSGGLTVYADSAKGRFTISRDNAKNTVYLQMNSLRPEDTAVYYCAAEAVGTYYTP-

DGWTYWGQGTLVTVSS

EVOLVESGGGFVOAGGSLRLSCVASRRTISSSTMGWFROAPGKEREFVAAIR- 3B02 16 WSSGMPYYLDSVMDRFTISRDNAKNTVSLQMNSLQPEDTAVYYCAADRSAFRD-

PSFDVNYEYWGRGTLVTVSS EVOLVESGGDLVOPGGSLRLSCAASGSDVVVNDMGWYRQAPGKQRELVA- 3B03 13 DITTGGRTNYADSVKGRFTISRDNVKNTVYLQMNSLKPEDTAVYYCNAQVGDS-

DDDVWYAYWGOQOGTLVTVSS EVOLVESGGGLVQAGGSLRLSCAPSGFTFSPYYMGWFRQAPGKERDFVAAISRS- 3DO01 10 RGTTYYLDSTEGRFTISRDNANDTVYLQMNSLNPEDTAVYYCAAGRSPGDPS-

RTYLYDYWGQGTLVTVSS EVOLVESGGGLVQAGASLRLSCATSGFTFSPYYMGWFRQAPGKERDFVAAISWS- 3D02 nn RGILYYTDSTEGRFTISRDNAKNTMYLQMDNLNPEDTAVYYCAASRSPGDPS-

RTYLYDYWGQOGTLVTVSS EVOLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGSIFSINVMGWYRQAPGKQRELVAAIIS- 7B11 14 GGRTNYADSVKGRFTISRDNSKNTVYLQMNSLRPEDTAVYYCNAEVDAGI|-

YAYGYWGQGTLVTVSS EVOLVESGGGFVOAGGSLRLSCAASRRTISSGTMGWFROAPGKEREFVAAIR- 9A05 7 WSSGITFYPDSVEGRFTISGDNAKNTVSLOMNSLKPEDTAVYYCAADRSALRDPS-

FEVNYEYWGRGTLVTVSS EVOLVESGGGLVOSGGSLRLSCAASGSAVSVNAMAWYRQAPGKQRDFVAGISR- 9DO03 3 SAGRTYYTDSVKDRFTIARDSAKNTVYLQMNRLKPEDTAVYYCAADLDPNRIFSR-

DEAAYWGQGTLVTVSS EVOLVESGGGLVQAGGSLRLSCAASGLTFSSYTMGWFRQAPGQERE- 9DO09 15 FVSAISWNTFTTYYVDSVKDRFTVSRDNAKNTLYLRMNSLKPEDTA-

VYYCAAAGGSPRQHEPYEYRVWGOGTLVTVSS EVOLVESGGGLVOQAGGSLRLSCAASGRALSSSIMGWFRQAPGKERE- 9D10 12 FVAAITWSGGRAYYADVSDFEKGRFTISRDNGKNTVNLOMKGLKPEDTA-

VYYCAAALAIPVTMSPHEYPYWGQGTLVTVSS EVOLVESGGGLVQAGGSLRLSCAASGLTFRRNAMGWFRQAPGKERELLA- 11B06 GINWSGGTTYYVDSVKGRFTISRDNAKNTVDLQMISPKPEDTAVYYCAADGDIG-

TLVNDENPRYWGOQGTLVTVSS EVOLVESGGGLVOAGGSLRLSCVASGSIFSIDAMGWYRQAPGKERELVAS- 13E02 18 VTTGASPNYGDSVTGRFTASRDRAKNALYLQMNSLKPEDTAVYYCNLIM-

TIPGGSQIMYWGQGTLVTVSS EVOLVESGGGSVOAGGSLRLSCVASGRYPMAWFROAPGKERE- 3FO4 19 FVAGVSWGGDRTYYADSVOGRFTVSRDYAKNTLYLQMNSLKPEDAAVYYCAGD-

PWGRLFRVKDNYSDWGQGTLVTVSS construto 049 EVOLVESGGGLVOAGGSLRLSCAASGLTFRRNAMGWFRQOAPGKERELLA- 11B06:N52 1117 GISWSGGTTYYVDSVKGRFTISRDNAKNTVDLQMISPKPEDTAVYYCAADGDIG-

TLVNDENPRYWGOGTLVTVSS constructog93 EVOLVESGGGSVOAGGSLRLSCVASGRYPMAWFROAPGKERE- 3FO4:N100fQ 116 FVAGVSWGGDRTYYADSVOGRFTVSRDYAKNTLYLQMNSLKPEDAAVYYCAGD-

PWGRLFRVKDOYSDWGQGTLVTVSS construto 004 120 EVOLVESGGGLVOAGGSLRLSCAASGRTFSSYAMGWFRQAPGKERDFVAGISR- 2A12-Alb SAGRTYYVDSVKGRFTISRDSAKNTVYLQMNRLKPEDTAVYYCAADLDPNRIFSR- DEAAYWGQG- TLVTIVSSGGGGSCSGESCSGESCEGESCSGGSCGGGSGGGGSEVALVES- GGGLVQPGNSLRLSCAASGFTFSSFGMSWVRQAPGKGLEWVSSISGSGS- DTLYADSVKGRFTISRDNAKTTLYLQMNSLRPEDTAVYYCTIGGSLSRSSOG-

TLVTVSS construto 005 121 EVOLVESGGGLVOAGGSLRLSCSFSGPGRTFARYAMGWFROQAPGKNRDFITGIS- 2D7-Alb GSGDSTYYVYPMKDRFTISRDNAKNMVYLQMNALKPEDTAVYYCAADREINRI- ANDKELDFWGOQG- TLVTIVSSGGGGSGEGESCEGESCEGESGEGESGEGESGGGGSEVALVES- GGGLVQPGNSLRLSCAASGFTFSSFGMSWVRQAPGKGLEWVSSISGSGS- DTLYADSVKGRFTISRDNAKTTLYLQMNSLRPEDTAVYYCTIGGSLSRSSOG-

TLVTVSS construto 006 122 EVOLVESGGGLVOAGGSLRLSCAASGRTVSSYAMGWFRLAPGKEREFVAGISR- 2F3-Alb SAERTYYVDSLKGRFTISRDSAKNTVYLHMNRLKPEDTAVYYCAADLDPNRIFS- REEYAYWGOQG- TLVTIVSSGGGGSGEGESCEGESCEGESGEGESGEGESGGGGSEVALVES- GGGLVQPGNSLRLSCAASGFTFSSFGMSWVRQAPGKGLEWVSSISGSGS- DTLYADSVKGRFTISRDNAKTTLYLQMNSLRPEDTAVYYCTIGGSLSRSSOG-

TLVTVSS construto 069 123 EVOLVESGGGLVOAGGSLRLSCAASGLTFRRNAMGWFRQOAPGKERELLA- 049-Alb GISWSGGTTYYVDSVKGRFTISRDNAKNTVDLQMISPKPEDTAVYYCAADGDIG- TLVNDENPRYWGQG- TLVTVSSGGGESGEGESCEGESCEGESCEGESGCEGESGGGESEVALVES- GGGLVOPGNSLRLSCAASGFTFSSFGMSWVRQAPGKGLEWVSSISGSGS- DTLYADSVKGRFTISRDNAKTTLYLOMNSLRPEDTAVYYCTIGGSLSRSSOG-

TLVTVSS construto 070 124 EVOLVESGGGLVOSGGSLRLSCAASGSAVSVNAMAWYRQAPGKQRDFVAGISR- 9D3-Alb SAGRTYYTDSVKDRFTIARDSAKNTVYLQMNRLKPEDTAVYYCAADLDPNRIFSR- DEAAYWGOQG- TLVTIVSSGGGESGEGESCEGESCEGESCEGESCEGESGEGESEVALVES- GGGLVQPGNSLRLSCAASGFTFSSFGMSWVRQAPGKGLEWVSSISGSGS- DTLYADSVKGRFTISRDNAKTTLYLQMNSLRPEDTAVYYCTIGGSLSRSSOG-

TLVTVSS construto 071 125 EVOLVESGGGFVOAGGSLRLSCVASRRTISSGTMGWFROAPGKEREFVAAIR- 3B2-Alb WSSGMPYYLDSVMDRFTISRDNAKNTVSLQMNSLQPEDTAVYYCAADRSAFRD- PSFDVNYEYWGRG- TLVTIVSSGGGGSCSGESCSGESCEGESCSGGSGGGGSGGGGSEVALVES- GGGLVQPGNSLRLSCAASGFTFSSFGMSWVRQAPGKGLEWVSSISGSGS- DTLYADSVKGRFTISRDNAKTTLYLQMNSLRPEDTAVYYCTIGGSLSRSSOG-

TLVTVSS construto 129 126 EVOLVESGGGLVOAGGSLRLSCAASGRTVSSYAMGWFRLAPGKEREFVAGISR- 2F3-093-Alb SAERTYYVDSLKGRFTISRDSAKNTVYLHMNRLKPEDTAVYYCAADLDPNRIFS- REEYAYWGQOG- TLVTIVSSGGGGSGEGESCEGESCEGESGEGESGEGESGGGGSEVALVES- GGGSVOAGGSLRLSCVASGRYPMAWFRQAPGKERE- FVAGVSWGGDRTYYADSVOQGRFTVSRDYAKNTLYLQMNSLKPEDAAVYYCAGD- PWGRLFRVKDOYSDWGQOG- TLVTIVSSGGGESGEGESGCEGESCEGESCEGESCEGESGEGESEVALVES- GGGLVQPGNSLRLSCAASGFTFSSFGMSWVRQAPGKGLEWVSSISGSGS- DTLYADSVKGRFTISRDNAKTTLYLQMNSLRPEDTAVYYCTIGGSLSRSSOG-

TLVTVSS construto 130 127 EVOLVESGGGLVOAGGSLRLSCAASGLTFRRNAMGWFRQOAPGKERELLA- 049-093-Alb GISWSGGTTYYVDSVKGRFTISRDNAKNTVDLQMISPKPEDTAVYYCAADGDIG- TLVNDENPRYWGOQG- TLVTIVSSGGGGSCSGESCSGESCSGESCSGGSCGGGGSGGGGSEVALVES- GGGSVOAGGSLRLSCVASGRYPMAWFRQAPGKERE- FVAGVSWGGDRTYYADSVOGRFTVSRDYAKNTLYLQMNSLKPEDAAVYYCAGD- PWGRLFRVKDQOYSDWGQG- TLVTIVSSGGGESGEGESCEGESCEGESCEGESGCEGESGEGESEVALVES- GGGLVOPGNSLRLSCAASGFTFSSFGMSWVRQAPGKGLEWVSSISGSGS- DTLYADSVKGRFTISRDNAKTTLYLQMNSLRPEDTAVYYCTIGGSLSRSSOG-

TLVTVSS construto 131 128 EVOLVESGGGLVOSGGSLRLSCAASGSAVSVNAMAWYRQAPGKQRDFVAGISR- 9D3-093-Alb SAGRTYYTDSVKDRFTIARDSAKNTVYLQMNRLKPEDTAVYYCAADLDPNRIFSR- DEAAYWGOQG- TLVTIVSSGGGESGCEGESCEGESCEGESCEGESGCEGESGEGESEVALVES- GGGSVOAGGSLRLSCVASGRYPMAWFROAPGKERE- FVAGVSWGGDRTYYADSVOGRFTVSRDYAKNTLYLQMNSLKPEDAAVYYCAGD- PWGRLFRVKDOYSDWGQOG- TLVTVSSGGGESGEGESCEGESCEGESCEGESGCEGESGGGESEVALVES- GGGLVOPGNSLRLSCAASGFTFSSFGMSWVRQAPGKGLEWVSSISGSGS- DTLYADSVKGRFTISRDNAKTTLYLQMNSLRPEDTAVYYCTIGGSLSRSSOG-

E | construto 577= 129 DVQLVESGGGVVQPGGSLRLSCAASGRTVSSYAMGWFRQAPGKEREFVAGISR- 581 2F3*-Alb SAERTYYVDSLKGRFTISRDNSKNTVYLQMNSLRPEDTALYYCAADLDPNRIFS- REEYAYWGOG- TLVTIVSSGGGESCGEGESCEGESCEGESGEGESGEGESGGGESEVALVES- GGGVVOQPGNSLRLSCAASGFTFSSFGMSWVRQAPGKGLEWVSSISGSGS- DTLYADSVKGRFTISRDNAKTTLYLOQMNSLRPEDTALYYCTIGGSLSRSSQG-

TLVTVSSA construto 579 130 DVQLVESGGGVVQPGGSLRLSCAASGRTVSSYAMGWFRQAPGKEREFVAGISR- 2F3*-093*-Alb SAERTYYVDSLKGRFTISRDNSKNTVYLQMNSLRPEDTALYYCAADLDPNRIFS- REEYAYWGOG- TLVTIVSSGGGGSCSGEGESCSGESCSGESCSGGSCGSGGSGGGGSEVALVES-

GGGVVAPGGSLRLSCAASGRYPMAWFRQAPGKEREFVAGVSWGGDRTYYAD SVKGRFTISRDYSKNTLYLQMNSLRPEDTALYYCAGDPFGRLFRVKDQYSDWG QOGTLVTVSSGGGGSGEGESGCEGESGEGESGEGESGEGESGGGGSEVALVES- GGGVVAQPGNSLRLSCAASGFTFSSFGMSWVROAPGKGLEWVSSISGSGSDTLYA

DSVKGRFTISRDNAKTTLYLQMNSLRPEDTALYYCTIGGSLSRSSAGTLVTVSSA * versão SO (sequência otimizada) Tabela A-2: Sequências para CDRs e frameworks, mais combinações preferidas conforme provido na fórmula |, a saber FR1I-CDR1-FR2- CDR2-FR3-CDR3-FR4 (os termos que seguem: "ID" se refere à dada SEQ ID NO) MD Nanocorpo RD FR DB ER BF N100fO) Continuação

EFE DT ER FE PER RB É DR O ER

Tabela B Várias sequências de aminoácido: Nome e descrição curta ("ID"), SEQ ID NO:s ("SEQ") e sequências de aminoácido ("sequên- cias") ADAM-TS5 149 MLLGWASLLLCAFRLPLAA- Q9UNAO-1 VGPAATPAQDKAGQPPTAAAAAQPRRRQOGEEVOQERAEPPGHPHPLAQRR humana RSKGLVONIDOQLYSGGGKVGYLVYAGGRRFLLDLERDGSVGIAG- FVPAGGGTSAPWRHRSHCFYRGTVDGSPRSLAVFDLCGGLDGFFAV- KHARYTLKPLLRGPWAEEEKGRVYGDGSARILHVYTREGFSFEALPPRAS- CETPASTPEAHEHAPAHSNPSGRAALASQLLDOSAL- SPAGGSGPQAOTWWRRRRRSISRARQVELLLVADASMARLYGR- GLQHYLLTLASIANRLYSHASIENHIRLAV- VKVVVLGDKDKSLEVSKNAATTLKNFCKWQHQOHNQLGDDHEE- HYDAAILFTREDLCGHHSCDTLGMADVGTICSPERSCAVIEDDGLHAAFT- VAHEIGHLLGLSHDDSKFCEETFG- STEDKRLMSSILTSIDASKPWSKCTSATITEFLDDGHGN- CLLDLPRKQILGPEELPGQTYDATAQCNLTFGPEYSVCPGMDVCARL- WCAVVRAGAMVCLTKKLPAVEGTPCGKGRICLOGKCVDKTKK- KYYSTSSHGNWGSWGSWGQCSRSCEGGVAFAYRHCNNPAPRNNGRYC- TGKRAIYRSCSLMPCPPNGKSFRHEQCEAK- NGYQSDAKGVKTFVEWVPKYAGVLPADVCKLTCRAKGTGYYVVF- SPKVTDGTECRLYSNSVCVRGKCVRTGCDG!IGSKLQYDKCGVCGG- DNSSCTKIVGTFNKKSKGYTDVVRIPEGATHIKVRQFKAKDOQTRFTAYL- ALKKKNGEYLINGKYMISTSETIIDINGTVMNYSGWSHRDDFLHGMGY- SATKEILIVOILATDPTKPLDVRYS- FFVPKKSTPKVNSVTSHGSNKVGSHTSQPQWVTGPW-

LACSRTCDTGWHTRTVACADGNRKLAKGCPLSQRPSAFKQCLLKKC bovivo 150 MLLGWAALMLCALRLPPVAAGPTAAPAQDKAGQPRAAAVAAAAQPRGRR- (Resíduos GEEAQEPAEPPGHPHPLAPORGSRGLVOQNIDQLYS- AA 1-626) GGGKVGYLVYAGGRRFLLDLERDDSVGAAGLVPAGGG- PNATRRHRGHCFYRGTVDGSPRSLAVFDLCGGLDGFFAVKRARYTLOPLL- RGPWAEAEGDARVYGDESARILHVYTREGFSFEALPPRTSCETHASPPGA- RERPPAPSRPDGRWALAPQQLPGOSAPSSDGSQAGPRTWWRRRRRSIS- RARQVELLLVADASMARMYGRGLQHYLLTLASI/ANKLYSHAS/ENHIR- LVVVKVVVLGDKDKSLEVSKNAATTLKNFCKWQHQHNQL- GDDHEEHYDAAILFTREDLCGHHSCDTLGMADVGTICSPERSCAVIEDD- GLHAAFTVAHEI/GHLLGLSHDDSKFCEENFGSTEDKRLMSSILTSIDASK- PWSKCTSATITEFLDDGHGNCLLDLPRKQIPGPEELPGQTYDASQQCNLTF- GPEYSVCPGMDVCARLWCAVVRQOGQMVCLTKKLPAVEGTPCGKGRI- CLAGKCVDKTKKKYYSTSSHGNWGSWGSWGQCSRSCGGGVAQFAYRHC-

NNPAPRNNGRYCTGKRAIYRSCSVTPCPHHHHHHHHHH rato 151 MRLEWASLLLLLLLLCASCLALAADNPAAAPAQDKTRQPRAAAAAAQPD- (Resíduos AA QRQWEETAERGHPOPLARQRRSSGLVONIDALYS- 1-619) GGGKVGYLVYAGGRRFLLDLERDDTVGAAGGIVTAGGLSAS- SGHRGHCFYRGTVDGSPRSLAVFDLCGGLDGFFAVKHARYTLKPLL- RGSWAESERVYGDGSSRILHVYTREGFSFEALPPRTSCETPASPSGAQES- PSVHSSSRRRTELAPQLLDHSAFSPAGNAGPQOTWWRRRRRSISRAR- QVELLLVADSSMAKMYGRGLQHYLLTLASIANRLYSHASIENHIR- LAVVKVVVLTDKSLEVSKNAATTLKNFCKWQHQHNAL- GDDHEEHYDAAILFTREDLCGHHSCDTLGMADVGTICSPERSCAVIEDD- GLHAAFTVAHEIGHLLGLSHDDSKFCEENFGSTEDKRLMSSILTSIDASK- PWSKCTSATITEFLDDGHGNCLLDVPRKQILGPEELPGQTYDATQQCNLTF- GPEYSVCPGMDVCARLWCAVVROGQMVCLTKKLPAVEGTPCGKGRI- CLAGKCVDKTKKKYYSTSSHGNWGSWGPWGQCSRSCGGGVAQFAYRHC-

NNPAPRNSGRYCTGKRAIYRSCSVIPCPHHHHHHHHHH Porquinho da 152 MLLGWASLLLCAFRLPQAAASAAAAPAQDKAGQPRAAAAAPQPRRR- Índia (Resíduos QGEHAPLRVEPPGHPHALAPORRGRGLLOSIDRLYS- AA 1-622) GGGKVGYLVYAGGRRFLLDLERDGSVGAAGLFPAGGGLSAPRRHRS- HCFYRGTVDGSPRSLAVFDLCGGLRGFFAVKHARYTVKPLLRGPWAE- ADTPRVYGDESARIPHVYTREGFSFEALPPRASCETPASQPGPHER- PPAHNSPGRHSTVDPOQLPELSALSPAGDPGQQIWWRRRRRSISRAR- QVELLLVADGSMAKMYGRGLQHYLLTLASI/ANRLYSHASIENHIR- LAVVKVVVLGDKDKSLEVSKNAATTLKNFCKWQHQHNQAL- GDDHEEHYDAAILFTREDLCGHHSCDTLGMADVGTICSPERSCAVIEDD- GLHAAFTVAHEIGHLLGLSHDDSKFCEENFGLTEDKRLMSSILTSIDASK- PWSKCTSATMTEFLDDGHGNCLLDVPRKQIPSPEELPGQOTYDATQQCNLT- FGPEYSVCPGMDVCARLWCAVVRQOGQOMVCLTKKLPAVEGTPCGKGRI- CLAGKCVDKTKKKYYSTSSHGNWGSWGPWGQCSRSCGGGVAFAYRHC-

NNPAPRNSGRYCTGKRAIYRSCSVTPCPHHHHHHHHHH camundongo 153 MRLEWAPLLLLLLLLSASCLSLAADSPAAAPAQDKTRQPQAAAAAAEPDQP (Resíduos AA QGEETRERGHLOPLAGORRSGGLVONIDOLYSGGGKVGYLVYAGGRRF 1-622) LLDLERDDTVGAAGSIVTAGGGLSASSGHRGHCFYRGTVDGSPRSLAV

FDLCGGLDGFFAVKHARYTLKPLLRGSWAEYERIYGDGSSRILHVYNREG

FSFEALPPRASCETPASPSGPQESPSVHSRSRRRSALAPQLLDHSAFSPS GNAGPQTWWRRRRRSISRARQVELLLVADSSMARMYGRGLQHYLLTLAS|-

ANRLYSHASIENHIRLAVVKVVVLTDKDTSLEVSKNAATTLKNFCKWQHQHN QLGDDHEEHYDAAILFTREDLCGHHSCDTLGMADVGTICSPERSCAVIEDD- GLHAAFTVAHE!GHLLGLSHDDSKFCEENFGTTEDKRLMSSILTSIDASKPW SKCTSATITEFLDDGHGNCLLDLPRKQILGPEELPGQTYDATQQCNLTFGP EYSVCPGMDVCARLWCAVVRQGQMVCLTKKLPAVEGTPCGKGRVCLOG KCVDKTKKKYYSTSSHGNWGSWGPWGQCSRSCGGGVQFAYRHCNNPAP

RNSGRYCTGKRAIYRSCSVTPCPHHHHHHHHHH Macaco cinomolgo 154 MLLGWASLLLCAFRLPLAAAGPAAAPAQDKAGQPATAAAAAQPRRROGE (Resíduos AA EVOERTEPPGHPHPLAQRRSSKGLVOQNIDOLYSGGGKVGYLVYAGGRRF 1-622) LLDLERDGSVGTAGFVPTEGGTSAPWRHRSHCFYRGTVDGSPRSLAVF

DLCGGLDGFFAVKHARYTLKPLLRGPWAEEETRRVYGDGSARILHVYTRE GFSFEALQPRASCETPASTPEPHERPPAHSNPGGRAALASQLLDOSAVSP AGGPGPQTWWRRRRRSISRARQVELLLVADASMARLYGRGLQHYLLTLA SIANRLYSHASIENHIRLAVVKVVVLGDKDKSLEVSKNAATTLKNFCKWQH QHNQLGDDHEEHYDAAILFTREDLCGHHSCDTLGMADVGTICSPERSCA VIEDDGLHAAFTVAHE!/GHLLGLSHDDSKFCEETFGSTEDKRLMSSILTS!- DASKPWSKCTSATITEFLDDGHGNCLLDQPRKQILGPEELPGQTYDATQQ CNLTFGPEYSVCPGMDVCARLWCAVVRQGQMVCLTKKLPAVEGTPCGK GRICLAOGKCVDKTKKKYYSTSSHGNWGSWGSWGQCSRSCGGGVAF

AYRHCNNPAPRNNGRYCTGKRAIYRSCGLMPCPHHHHHHHHHH agrecan humana 155 MTTLLWVFVTLRVITAAVTVETSDHDNSLSVSIPQPSPLRVLLGTSLTIPCYF IDPMHPVTTAPSTAPLAPRIKWSRVSKEKEVVLLVATEGRVRVNSAYQD- KVSLPNYPAIPSDATLEVOSLRSNDSGVYRCEVMHGIEDSEATLEVVVKGI- VFHYRAISTRYTLDFDRAQRACLOQNSAI/IATPEQLOAAYEDGFHQCDA- GWLADQTVRYPIHTPREGCYGDKDEFPGVRTYGIRDTNETYDVYCFAEE- MEGEVFYATSPEKFTFQEAANECRRLGARLATTGHVYLAWQAGMDMCSA- GWLADRSVRYPISKARPNCGGNLLGVRTVYVHANQTGYPDPSSRYDA!- CYTGEDFVDIPENFFGVGGEEDITVATVTWPDMELPLPRNITEGEARGS- VILTVKPIFEVSPSPLEPEEPFTFAPEIGATAFAEVENETGEATRPWG- FPTPGLGPATAFTSEDLVVQVTAVPGQPHLPGGVVFHYRPGPTRYSLT- FEEAQQACPGTGAVIASPEQLOAAYEAGYEQCDAGWLRDOTVRYPI- VSPRTPCVGDKDSSPGVRTYGVRPSTETYDVYCFVDRLEGEVFFATRLE- QFTFQEALEFCESHNATATTGQLYAAWSRGLDKCYAGWLADGSLRYP!- VTPRPACGGDKPGVRTVYLYPNQTGLPDPLSRHHAFCFRGISAVPSPGEE-

EGGTPTSPSGVEEWIVTQVVPGVAAVPVEEETTAVPSGETTAILEFTTEP ENQTEWEPAYTPVGTSPLPGILPTWPPTGAETEESTEGPSATEVPSASE EPSPSEVPFPSEEPSPSEEPFPSVRPFPSVELFPSEEPFPSKEPSPSEEPS ASEEPYTPSPPEPSWTELPSSGEESGAPDVSGDFTGSGDVSGHLDFSGQ LSGDRASGLPSGDLDSSGLTSTVGSGLTVESGLPSGDEERIEWPSTPT VGELPSGAEILEGSASGVGDLSGLPSGEVLETSASGVGDLSGLPSGE VLETTAPGVEDISGLPSGEVLETTAPGVEDISGLPSGEVLETTAPGVEDIS- GLPSGEVLETTAPGVEDISGLPSGEVLETTAPGVEDISGLPSGEVLETAA PGVEDISGLPSGEVLETAAPGVEDISGLPSGEVLETAAPGVEDISGLPSGE VLETAAPGVEDISGLPSGEVLETAAPGVEDISGLPSGEVLETAAPGVEDIS- GLPSGEVLETAAPGVEDISGLPSGEVLETAAPGVEDISGLPSGEVLETAAP GVEDISGLPSGEVLETAAPGVEDISGLPSGEVLETAAPGVEDISGLPSG EVLETTAPGVEEISGLPSGEVLETTAPGVDEISGLPSGEVLETTAPGVEEIS- GLPSGEVLETSTSAVGDLSGLPSGGEVLEISVSGVEDISGLPSGEVVET SASGIEDVSELPSGEGLETSASGVEDLSRLPSGEEVLEISASGFGDLSGVP SGGEGLETSASEVGTDLSGLPSGREGLETSASGAEDLSGLPSGKEDLV GSASGDLDLGKLPSGTLGSGQAPETSGLPSGFSGEYSGVDLGSGPPSGL- PDFSGLPSGFPTVSLVDSTLVEVVTASTASELEGRGTIGISGAGE/SGLPS- SELDISGRASGLPSGTELSGQASGSPDVSGEI/PGLFGVSGQPSGFPDTS GETSGVTELSGLSSGQPGVSGEASGVLYGTSQPFGITDLSGETSGVPDLS GQPSGLPGFSGATSGVPDLVSGTTSGSGESSGITFVDTSLVEVAPTTFKE EEGLGSVELSGLPSGEADLSGKSGMVDVSGQFSGTVDSSGFTSQTPE- FSGLPSGIAEVSGESSRAEI/GSSLPSGAYYGSGTPSSFPTVSLVDRTLVES- VTOAPTAQEAGEGPSGILELSGAHSGAPDMSGEHSGFLDLSGLOSGLIE- PSGEPPGTPYFSGDFASTTNVSGESSVAMGTSGEASGLPEVTLITSEF VEGVTEPTISQELGQRPPVTHTPOQLFESSGKVSTAGDISGATPVLPGSGVEV SSVPESSSETSAYPEAGFGASAAPEASREDSGSPDLSETTSAFHEAN- LERSSGLGVSGSTLTFQEGEASAAPEVSGESTTTSDVGTEAPGLPSATP- TASGDRTEISGDLSGHTSQLGVVISTSIPESEWTQQTARPAETHLEIESSS- LLYSGEETHTVETATSPTDASIPASPEWKRESESTAAAPARSCAEEPCGAG- TCKETEGHVICLCPPGYTGEHCNIDOEVCEEGWNKYQGHCYRHFPDRET WVDAERRCREQOSHLSSIVTPEEQEFVNNNAQDY QWIGLNDRTIEGDFR- WSDGHPMQFENWRPNQPDNFFAAGEDCVVMIWHEKGEWNDVPCNYHL- PFTCKKGTVACGEPPVVEHARTFGQKKDRYEINSLVRYQCTEGFVQRHMP-

se ESSENTIAL SSRARASPSTA 00745 PEA114FO08 156 EVOLVESGGGVVAQPGGSLRLSCAASGSTFIINVVRWYRRAPGKQRELVATI

SSGGNANYVDSVRGRFTISRDNSKNTVYLQMNSLRPEDTALYYCNVPTTHY

GGVYYGPYWGQGTLVTVSSA 00747 PEA6O4FO2 157 EVOLVESGGGVVQPGGSLRLSCAASGRTFSSYTMGWFRQAPGKEREFVAA

ISWSGGRTYYADSVKGRFTISRDNSKNTVYLQMNSLRPEDTALYYCAAYRR

RRASSNRGLWDYWGQOGTLVTVSSA Tabela C: Várias sequências de ligante ("ID" se refere à SEQ ID NO conforme usada no presente documento) [Nome “Tp — Sequência deamineácido

GEGGES SEGSCES

GEGESCEES Ligante 10GS GEGGESCESEEGS

GECESCEGESCESEES Ligante 18GS GECGESCECESCSECEEGESGS

GEGESCEGESCEGESCEGESEEEES Ligante 30GS GEECESCECESCEEESCEGESCEECESCEGES

GEGESCEGESCEGESECEGESCEGESCEGESEEEES Ligante 40GS GEGESCEGESCEEESCEGESCEEESCEGESCEGESSE

GGGS Dobradiça G1 EPKSCDKTHTCPPCP Dobradiça 9GS-G1 GGGEGSCEGEGSEPKSCDKTHTCPPCP Região dobradiça longa 173 EPKTPKPQPAAA superior da lhama Dobradiça G3 174 ELKTPLGDTTHTCPRCPEPKSCDTPPPCPRCPEPKSCDTPP

PCPRCPEPKSCDTPPPCPRCP Tabela D: Sequências de ISVD que se ligam a albumina do soro ("ID" se refere à SEQ ID NO conforme usada no presente documento), in- cluindo as sequências de CDR er TS Tea ar CS Alb8 131 | EVOLVESGGGLVOPGNSLRLSCAASGFTFSSFGMSWVRQOAPGKGLEWV

SSISGSGSDTLYADSVKGRFTISRDNAKTTLYLQMNSLRPEDTAVYYCTIG

GSLSRSSQGTLVTVSS Alb23 132 | EVOLLESGGGLVOPGGSLRLSCAASGFTFRSFGMSWVRQAPGKGPEW

VSSISGSGSDTLYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRPEDTAVYYCTI

GGSLSRSSAOGTLVTVSS Alb129 133 | EVOLVESGGGVVOQPGNSLRLSCAASGFTFSSFGMSWVRQOAPGKGLEW

VSSISGSGSDTLYADSVKGRFTISRDNAKTTLYLQMNSLRPEDTATYYCTI

GGSLSRSSAOGTLVTVSSA Alb132 134 | EVOLVESGGGVVOPGGSLRLSCAASGFTFRSFGMSWVRQAPGKGPEW

VSSISGSGSDTLYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRPEDTATYYCTI GGSLSRSSAOGTLVTVSSA EVOLVESGGGLVOPGNSLRLSCAASGFTFSSFGMSWVRQAPGKGLEWV

SSISGSGSDTLYADSVKGRFTISRDNAKTTLYLQMNSLRPEDTAVYYCTIG 2 Q 2 eseresaees “ “SS Alb11 136 EVOLVESGGGLVOPGNSLRLSCAASGFTFSSFGMSWVRQAPGKGLEWV (S112K)-A SSISGSGSDTLYADSVKGRFTISRDNAKTTLYLQMNSLRPEDTAVYYCTIG

GSLSRSSQOGTLVKVSSA Alb82 137 EVOLVESGGGVVQPGNSLRLSCAASGFTFSSFGMSWVRQAPGKGLEW

VSSISGSGSDTLYADSVKGRFTISRDNAKTTLYLQMNSLRPEDTALYYCTI

GGSLSRSSQGTLVTVSS AIb82-A 138 EVOLVESGGGVVQPGNSLRLSCAASGFTFSSFGMSWVRQAPGKGLEW

VSSISGSGSDTLYADSVKGRFTISRDNAKTTLYLQMNSLRPEDTALYYCTI

GGSLSRSSQGTLVTVSSA AIb82-AA 139 EVOLVESGGGVVQPGNSLRLSCAASGFTFSSFGMSWVRQAPGKGLEW

VSSISGSGSDTLYADSVKGRFTISRDNAKTTLYLQMNSLRPEDTALYYCTI

GGSLSRSSQGTLVTVSSAA AIb82-AAA 140 EVOLVESGGGVVQPGNSLRLSCAASGFTFSSFGMSWVRQAPGKGLEW

VSSISGSGSDTLYADSVKGRFTISRDNAKTTLYLQMNSLRPEDTALYYCTI

GGSLSRSSQGTLVTVSSAAA Alb82-G 141 EVOLVESGGGVVQPGNSLRLSCAASGFTFSSFGMSWVRQAPGKGLEW

VSSISGSGSDTLYADSVKGRFTISRDNAKTTLYLQMNSLRPEDTALYYCTI

GGSLSRSSQGTLVTVSSG Alb82-GG 142 EVOLVESGGGVVQPGNSLRLSCAASGFTFSSFGMSWVRQAPGKGLEW

VSSISGSGSDTLYADSVKGRFTISRDNAKTTLYLQMNSLRPEDTALYYCTI

GGSLSRSSQGTLVTVSSGG Alb82-GGG 143 EVOLVESGGGVVQPGNSLRLSCAASGFTFSSFGMSWVRQAPGKGLEW

VSSISGSGSDTLYADSVKGRFTISRDNAKTTLYLQMNSLRPEDTALYYCTI

GGSLSRSSQGTLVTVSSGGG Alb92 144 EVOLVESGGGVVQPGGSLRLSCAASGFTFRSFGMSWVRQAPGKGPEW

VSSISGSGSDTLYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRPEDTALYYCTI

GGSLSRSSQGTLVTVSS Alb223 145 EVOLVESGGGVVQPGGSLRLSCAASGFTFRSFGMSWVRQAPGKGPEW

VSSISGSGSDTLYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRPEDTALYYCTI GGSLSRSSQGTLVTVSSA

Claims (51)

REIVINDICAÇÕES

1. Polipeptídeo caracterizado pelo fato de compreender pe- lo menos 1 domínio variável único de imunoglobulina (ISVD) ligando uma desintegrina A e metaloproteinase com motivos de trombospondi- na (ADAMTS).

2. Polipeptídeo de acordo com a reivindicação 1, caracter- izado pelo fato de que o referido ADAMTS é escolhido a partir do grupo consistindo em ADAMTS1 - ADAMTS19, preferivelmente ADAMTS5, ADAMTS4, ADAMTS1, ADAMTS8, ADAMTS9 e ADAMTS15 e ADAMTS?2O, mais preferivelmente ADAMTSSB5.

3. Polipeptídeo de acordo com a reivindicação 2, caracter- izado pelo fato de que o referido ISVD ligando ADAMTS, preferivel- mente ADAMTSS5 não liga ADAMTSA4, MMP1 ou MMP14.

4. Polipeptídeo de acordo com a reivindicação 3, caracter- izado pelo fato de que o referido ISVD ligando ADAMTS5 compreende 3 regiões determinantes de complementariedade (CDR1 a CDR3 re- spectivamente), nas quais (i)! CDR1 é escolhido a partir do grupo consistindo em SEQ ID NOs: 21, 35, 20, 22, 25, 33, 28, 24, 23, 26, 27, 29, 30, 31, 32 e 34; e sequências de aminoácido que têm 1, 2 ou 3 diferença(s) de aminoácido com SEQ ID NOs: 21, 35, 20, 22, 25, 33, 33, 28, 24, 23, 26, 27, 29, 30, 31, 32 e 34; (ii) CDR2 é escolhido a partir do grupo consistindo em SEQ ID NOs: 37, 53, 36, 40, 50, 51, 44, 45, 43, 39, 38, 41, 119, 42, 46, 47,48,490 52; e sequências de aminoácido que têm 1, 2 ou 3 diferença(s) de aminoácido com SEQ ID NOs: 37, 53, 36, 40, 50, 51, 44, 45, 43, 39, 38, 41, 119, 42, 46, 47, 48, 49 e 52; e

(iii) CDR3 é escolhido a partir do grupo consistindo em SEQ ID NO: SEQ ID NOs: 55, 118, 71, 54, 58, 68, 69, 62, 63, 61, 57, 56, 59, 60, 64, 65, 66, 67 e 70; e sequências de aminoácido que têm 1, 2, 3 ou 4 diferença(s) de aminoácido com SEQ ID NOs: 55, 118, 71, 54, 58, 68, 69, 62, 63, 61, 57, 56, 59, 60, 64, 65, 66, 67 e 70.

5. Polipeptídeo de acordo com a reivindicação 3, caracter- izado pelo fato de que o referido ISVD especificamente ligando ADAMTS5 compreende 3 regiões determinantes de complemen- tariedade (CDR1 a CDR3 respectivamente), nas quais (i), CDR1 é escolhido a partir do grupo consistindo em (a) SEQIDNO:22;e (b) sequência de aminoácido que tem 1, 2, 3,4, 50u6 diferença(s) de aminoácido com SEQ ID NO: 22, em que a(s) diferen- ça(s) de aminoácido são definidas como a seguir: - —naposição2oS foi alterado para R; e/ou - —naposição3o A foi alterado para T; e/ou - —naposição4 o V foi alterado para F; e/ou - —naposição6 o V foi alterado para S; e/ou - —naposição7 o N foi alterado para Y; e/ou - —naposição10o0oA foi alterado para G; (ii) CDR2 é SEQ ID NO: 36; e (iii) CDR3 é SEQ ID NO: 54.

6. Polipeptídeo de acordo com a reivindicação 3, caracter- izado pelo fato de que o referido ISVD especificamente ligando ADAMTS5 compreende 3 regiões determinantes de complemen- tariedade (CDR1 a CDR3 respectivamente), nas quais (), CDR1 é SEQ ID NO: 33; (ii) CDR2 é escolhido a partir do grupo consistindo em (c) SEQIDNO:50;e

(d) sequência de aminoácido que tem 1, 2, ou 3 diferen- ça(s) de aminoácido com SEQ ID NO: 50, em quen a(s) diferença(s) de aminoácido são definidas como a seguir: - na posição 8 o M foi alterado para |; e/ou - na posição 9 o P foi alterado para T; e/ou - na posição 10 o Y foi alterado para F; e (iii) CDR3 é escolhido a partir do grupo consistindo em (e) SEQIDNO:68;e (f) sequência de aminoácido que tem 1 ou 2 diferença(s) de aminoácido com SEQ ID NO: 68, em que a(s) diferença(s) de ami- noácido são definidas como a seguir: - na posição 5 o F foi alterado para L; e/ou - na posição 11 o D foi alterado para E.

7. Polipeptídeo de acordo com a reivindicação 3, caracter- izado pelo fato de que o referido ISVD especificamente ligando ADAMTS5 compreende 3 regiões determinantes de complemen- tariedade (CDR1 a CDR3 respectivamente), nas quais (i), CDR1 é SEQ ID NO: 28; (ii) CDR2 é escolhido a partir do grupo consistindo em (c) SEQIDNO: 44;e (d) sequência de aminoácido que tem 1, 2, ou 3 diferen- ça(s) de aminoácido com SEQ ID NO: 44, em que a(s) diferença(s) de aminoácido são definidas como a seguir: - na posição 3 o S foi alterado para T; e/ou - na posição 4 o R foi alterado para W; e/ou - na posição 8 o T foi alterado para |; e/ou - na posição 9 o T foi alterado para L; e (iii) CDR3 é escolhido a partir do grupo consistindo em

(e) SEQIDNO:62;e (f) sequência de aminoácido que tem 1 ou 2 diferença(s) de aminoácido com SEQ ID NO: 62, em que a(s) diferença(s) de ami- noácidosão são definidas como a seguir: - —na posição 1 o (G foi alterado para S; e/ou - —na posição 140 bD foi alterado para E.

8. Polipeptídeo de acordo com qualquer uma das reivindi- cações 1 a 7, caracterizado pelo fato de que: - —“CDRI1 é escolhido a partir do grupo consistindo em SEQ ID NOs: 21, 35, 20, 22, 25, 33, 28, 24, 23, 26, 27, 29, 30, 31, 32 e 34; - “CDR2é escolhido a partir do grupo consistindo em SEQ ID NOs: 37, 53, 36, 40, 50, 51, 44, 45, 43, 39, 38, 41, 119, 42, 46, 47, 48,490 52; e - “CDR3é escolhido a partir do grupo consistindo em SEQ ID NOs: 55, 118, 71, 54, 58, 68, 69, 62, 63, 61, 57, 56, 59, 60, 64, 65, 66, 67 e 70.

9. Polipeptídeo de acordo com qualquer uma das reivindi- cações 1 a 7, caracterizado pelo fato de que o referido ISVD com- preende uma combinação de CDR1, CDR2 e CDR3 que é escolhida a partir do grupo consistindo em: CDR1 é SEQ ID NO: 21, CDR2 é SEQ ID NO: 37 e CDR3 é SEQ ID NO: 55; CDR1 é SEQ ID NO: 35, CDR2 é SEQ ID NO: 53 e CDR3 é SEQ ID NO: 118; CDR1 é SEQ ID NO: 35, CDR2 é SEQ ID NO: 53 e CDR3 é SEQ ID NO: 71; CDR1 é SEQ ID NO: 20, CDR2 é SEQ ID NO: 36 e CDR3 é SEQ ID NO: 54; CDR1 é SEQ ID NO: 22, CDR2 é SEQ ID NO: 36 e CDR3 é SEQ ID NO: 54;

CDR1 é SEQ ID NO: 25, CDR2 é SEQ ID NO: 40 e CDR3 é SEQ ID NO: 58;

CDR1 é SEQ ID NO: 33, CDR2 é SEQ ID NO: 50 e CDR3 é SEQ ID NO: 68;

CDR1 é SEQ ID NO: 33, CDR2 é SEQ ID NO: 51 e CDR3 é SEQ ID NO: 69;

CDR1 é SEQ ID NO: 28, CDR2 é SEQ ID NO: 44 e CDR3 é SEQ ID NO: 62;

CDR1 é SEQ ID NO: 28, CDR2 é SEQ ID NO: 45 e CDR3 é SEQ ID NO: 63;

CDR1 é SEQ ID NO: 28, CDR2 é SEQ ID NO: 43 e CDR3 é SEQ ID NO: 61;

CDR1 é SEQ ID NO: 24, CDR2 é SEQ ID NO: 39 e CDR3 é SEQ ID NO: 57;

CDR1 é SEQ ID NO: 23, CDR2 é SEQ ID NO: 38 e CDR3 é SEQ ID NO: 56;

CDR1 é SEQ ID NO: 26, CDR2 é SEQ ID NO: 41 e CDR3 é SEQ ID NO: 59;

CDR1 é SEQ ID NO: 27, CDR2 é SEQ ID NO: 119 e CDR3 é SEQ ID NO: 60;

CDR1 é SEQ ID NO: 27, CDR2 é SEQ ID NO: 42 e CDR3 é SEQ ID NO: 60;

CDR1 é SEQ ID NO: 29, CDR2 é SEQ ID NO: 46 e CDR3 é SEQ ID NO: 64;

CDR1 é SEQ ID NO: 30, CDR2 é SEQ ID NO: 47 e CDR3 é SEQ ID NO: 65;

CDR1 é SEQ ID NO: 31, CDR2 é SEQ ID NO: 48 e CDR3 é SEQ ID NO: 66;

CDR1 é SEQ ID NO: 32, CDR2 é SEQ ID NO: 49 e CDR3 é SEQ ID NO: 67; e

CDR1 é SEQ ID NO: 34, CDR2 é SEQ ID NO: 52 e CDR3 é SEQ ID NO: 70.

10. Polipeptídeo de acordo com qualquer uma das reivindi- cações precedentes, caracterizado pelo fato de que o referido ISVD consiste em ou essencialmente consiste em 4 regiões framework (FR1 a FRA4, respectivamente) e as referidas 3 regiões determinantes de complementariedade CDR1, CDR2 e CDR3.

11. Polipeptídeo de acordo com qualquer uma das reivindi- cações precedentes, caracterizado pelo fato de que o referido polipep- tídeo é SEQ ID NO: 129 ou 130 ou um polipeptídeo que tem pelo menos 95% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 129 ou

130.

12. Polipeptídeo de acordo com qualquer uma das reivindi- cações 4, 8 e 9, caracterizado pelo fato de que CDR1 é SEQ ID NO: 21, CDR2 é SEQ ID NO: 37 e CDR3 é SEQ ID NO: 55.

13. Polipeptídeo de acordo com qualquer uma das reivindi- cações 4 a 12, caracterizado pelo fato de que o referido ISVD é es- colhido a partir do grupo consistindo em SEQ ID NO:s 2, 116, 19, 1,3, 6, 16, 17, 10, 11, 9, 5, 4, 7, 8, 117, 12, 13, 14, 15 e 18.

14. Polipeptídeo de acordo com qualquer uma das reivindi- cações 1 a 13, caracterizado pelo fato de que o referido polipeptídeo se liga a ADAMTS5 com um Kp entre 16º M e 1E3 M, tal como entre 1Eº M e 1E? M, preferivelmente no máximo 1Eº M, preferivelmente menor do que 1Eº M ou 165º M, ou ainda menor do que 1Eº M, tal como 5E** M, 4E** M, 3E!! M, 2E! M, 1,7E M, 1Eº M, ou ainda 5E? M, 42? M, 3E 2? M, 152 M, por exemplo conforme determinado por KinExA, ou alternadamente por Gyrolab.

15. Polipeptídeo de acordo com qualquer uma das reivindi- cações 1 a 14, caracterizado pelo fato de que o referido polipeptídeo inibe uma atividade de ADAMTS5 com um ICs5o entre 1Eº M e 15?

M, tal como entre 11º M e 1E7! M, por exemplo conforme determina- do pelo ensaio FRET humano ou AlphaLISA humano.

16. Polipeptídeo de acordo com a reivindicação 15, carac- terizado pelo fato de que o referido polipeptídeo inibe uma atividade (enzimática) de ADAMTS5 com um ICso de no máximo 1E” M, pre- ferivelmente 16º M, 52º M, ou 4Eº M, 3Eº M, 2Eº M, tal como 1Eº M.

17. Polipeptídeo de acordo com qualquer uma das reivindi- cações 1 a 16, caracterizado pelo fato de que o referido polipeptídeo modula ADAMTS5 com um ECso entre 11º M e 16? M, tal como en- tre 11º M e 1E! M, por exemplo conforme determinado pela ligação ELISA.

18. Polipeptídeo de acordo com qualquer uma das reivindi- cações 1 a 14, caracterizado pelo fato de que o referido polipeptídeo se liga a ADAMTS5 com uma dissociação de menos do que 16º s, por exemplo conforme determinado por SPR.

19. Polipeptídeo de acordo com qualquer uma das reivindi- cações 1 a 18, caracterizado pelo fato de que o referido ADAMTSS5 é ADAMTSS5 humano (SEQ ID NO: 149), ADAMTSS5 bovino (SEQ ID NO: 150), ADAMTSSB5 de rato (SEQ ID NO: 151), ADAMTS5 de porquinho da índia (SEQ ID NO: 152), ADAMTS5 de camundongo (SEQ ID NO: 153) ou ADAMTSS5 de cinomolgo (SEQ ID NO: 154), preferivelmente ADAMTSS5 humano, mais preferivelmente SEQ ID NO: 149.

20. Polipeptídeo de acordo com qualquer uma das reivindi- cações 1 a 19, caracterizado pelo fato de que o referido polipeptídeo antagoniza uma atividade de ADAMTSS5, tal como uma atividade da protease, tal como clivagem de agrecan, versican, brevican, neurocan, decorin, e/ou biglican, preferivelmente clivagem de agrecan; preferiv- elmente antagoniza a atividade agrecanase de ADAMTSS5.

21. Polipeptídeo de acordo com qualquer uma das reivindi-

cações 1 a 19, caracterizado pelo fato de que o referido polipeptídeo bloqueia a ligação de ADAMTSS5 a aggrecan de pelo menos 20%, tal como pelo menos 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95% ou ainda mais, por exemplo conforme determinado por FRET, AlphaLISA ou ELISA.

22. Polipeptídeo de acordo com qualquer uma das reivindi- cações 1 a 20, caracterizado pelo fato de que o referido polipeptídeo inibe a atividade de protease de ADAMTSS, tal como inibe a proteólise de um substrato, tal como agrecan, versican, brevican, neurocan, decorin, e/ou biglican, preferivelmente agrecan.

23. Polipeptídeo de acordo com qualquer uma das reivindi- cações 1 a 22, caracterizado pelo fato de que compreende pelo menos 2 ISVDs, em que pelo menos 1 ISVD especificamente liga ADAMTS, preferivelmente ADAMTSS, preferivelmente escolhido a partir do grupo consistindo em SEQ ID NO:s 2, 116, 19, 1, 3, 6, 16, 17, 10, 11,9, 5,4, 7, 117, 8, 12, 13, 14, 15 e 18.

24. Polipeptídeo de acordo com a reivindicação 23, carac- terizado pelo fato de que os referidos pelo menos 2 ISVDs especifica- mente ligam ADAMTS, preferivelmente ADAMTSS5.

25. Polipeptídeo caracterizado pelo fato de que com- preende dois ou mais ISVDs os quais cada individualmente especifi- camente liga ADAMTS5, em que a) pelo menos um "primeiro" ISVD especificamente liga um primeiro determinante antigênico, epítopo, parte, domínio, subunidade ou conformação de ADAMTSS5; e em que, b) pelo menos um "segundo" ISVD especificamente liga um segundo determinante antigênico, epítopo, parte, domínio, subuni- dade ou conformação de ADAMTSS, diferente do primeiro epítopo de- terminante antigênico, parte, domínio, subunidade ou conformação, respectivamente.

26. Polipeptídeo de acordo com a reivindicação 25, carac- terizado pelo fato de que o referido "primeiro" ISVD especificamente ligando ADAMTSSB5 é escolhido a partir do grupo consistindo em SEQ ID NO:s 2, 1, 3, 6, 16, 17, 10, 11, 9, 5, 4, 7, 8, 117, 12, 13, 14, 15 e 18.

27. Polipeptídeo de acordo com a reivindicação 25 ou 26, caracterizado pelo fato de que o referido "segundo" ISVD especifica- mente ligando ADAMTSS5 é SEQ ID NO: 118 ou 19.

28. Polipeptídeo de acordo com qualquer uma das reivindi- cações 25 a 27, caracterizado pelo fato de que o polipeptídeo com- preende um polipeptídeo escolhido a partir do grupo consistindo em SEQ ID NO: 126 (clone 129 2F3-093-AIlb), SEQ ID NO: 127 (clone 130 049-093-Alb) e SEQ ID NO: 128 (clone 131 9D3-093-Alb) ou um polipeptídeo que tem uma identidade da sequência de aminoácido de pelo menos 95% com a SEQ ID NO: 126, 127, 128, 130 ou 131.

29. Polipeptídeo de acordo com qualquer uma das reivindi- cações 1 a 28, caracterizado pelo fato de que ainda compreende um ISVD ligando albumina do soro.

30. Polipeptídeo de acordo com a reivindicação 29, carac- terizado pelo fato de que o referido ISVD ligando albumina do soro es- sencialmente consiste em 4 regiões framework (FR1 a FRA4, respec- tivamente) e 3 regiões determinantes de complementariedade (CDR1 a CDR3 respectivamente), nas quais CDR1 é SEQ ID NO: 146, CDR2 é SEQ ID NO: 147, e CDR3 é SEQ ID NO: 148.

31. Polipeptídeo de acordo com a reivindicação 30, carac- terizado pelo fato de que o referido ISVD ligando albumina do soro é escolhido a partir do grupo consistindo em ALB8 (SEQ ID NO: 131), ALB23 (SEQ ID NO: 132), ALB129 (SEQ ID NO: 133), ALB132 (SEQ ID NO: 134), ALB11 (SEQ ID NO: 135), ALB11 (S112K)-A (SEQ |D NO: 136), ALB82 (SEQ ID NO: 137), ALB82-A (SEQ ID NO: 138), ALB82-AA (SEQ ID NO: 139), ALB82-AAA (SEQ ID NO: 140), ALB82-

G (SEQ ID NO: 141), ALB82-GG (SEQ ID NO: 142), ALB82-GGG (SEQ ID NO: 143), ALB92 (SEQ ID NO: 144) e ALB223 (SEQ ID NO: 145).

32. Polipeptídeo de acordo com a reivindicação 31, carac- terizado pelo fato de que é escolhido a partir do grupo consistindo em SEQ ID NO: 129 (clone 577 2F35º-Alb), SEQ ID NO: 130 (clone 579 2F3$º-093-Alb), SEQ ID NO: 120 (clone 4 2A12-Alb), SEQ ID NO: 121 (clone 5 2D7-AIb), SEQ ID NO: 122 (clone 6 2F3-Alb), SEQ ID NO: 123 (clone 69 049-Alb), SEQ ID NO: 124 (clone 70 9D3-Alb), SEQ ID NO: 125 (clone 71 3B2-Alb), SEQ ID NO: 126 (clone 129 2F3-093-Alb), SEQ ID NO: 127 (clone 130 049-093-Alb), e SEQ ID NO: 128 (clone 131 9D3-093-AlIb).

33. Polipeptídeo de acordo com qualquer uma das reivindi- cações 1 a 32, caracterizado pelo fato de que ainda compreende pelo menos um ISVD especificamente ligando agrecan, preferivelmente es- colhido a partir do grupo consistindo em SEQ ID NO: 156 (Nanocorpo 00745 PEA114F08) e SEQ ID NO: 157 (Nanocorpo 00747 PEAG6O4F02).

34. Polipeptídeo de acordo com qualquer uma das reivin- dicações 1 a 32, caracterizado pelo fato de que compreende pelo menos 2 ISVDs especificamente ligando agrecan.

35. Polipeptídeo de acordo com a reivindicação 34, carac- terizado pelo fato de que os referidos pelo menos 2 ISVDs que es- pecificamente ligam agrecan podem ser os mesmos ou diferentes.

36. Polipeptídeo de acordo com a reivindicação 34 ou 35, caracterizado pelo fato de que os referidos pelo menos 2 ISVDs que especificamente ligam agrecan são independentemente escolhidos a partir do grupo consistindo em SEQ ID NOs: 156 e 157.

37. Polipeptídeo de acordo com qualquer uma das reivin- dicações 33 a 36, caracterizado pelo fato de que o referido ISVD que especificamente liga agrecan, especificamente liga a aggrecan hu- mano [SEQ |D NO: 155].

38. Polipeptídeo de acordo com qualquer uma das reivin- dicações 33 a 37, caracterizado pelo fato de que o referido ISVD que especificamente liga agrecan, especificamente liga agrecan canino, agrecan bovino, agrecan de rato; agrecan de porco; agrecan de ca- mundongo, agrecan de coelho; agrecan de cinomolgo e/ou agrecan de reso.

39. Polipeptídeo de acordo com qualquer uma das reivin- dicações 33 a 38, caracterizado pelo fato de que o referido ISVD que especificamente liga agrecan preferivelmente se liga a tecido cartilagi- noso tal como cartilagem e/ou menisco.

40. Polipeptídeo de acordo com qualquer uma das reivin- dicações 1 a 39, caracterizado pelo fato de que o referido polipeptídeo tem uma estabilidade de pelo menos 7 dias, tal como 14 dias, 21 dias, 1 mês, 2 meses ou ainda 3 meses em fluido sinovial (SF) a 37 ºC.

41. Polipeptídeo de acordo com qualquer uma das reivin- dicações 23 a 40, caracterizado pelo fato de que os referidos pelo menos dois ISVDs são diretamente ligados um ao outro ou são ligados através de um ligante.

42. Polipeptídeo de acordo com a reivindicação 41, carac- terizado pelo fato de que o referido ligante é escolhido a partir do grupo consistindo em SEQ ID NOs: 158 a 174, preferivelmente SEQ ID NO: 169.

43. Polipeptídeo de acordo com qualquer uma das reivin- dicações 1 a 42, caracterizado pelo fato de que ainda compreende uma extensão C-terminal.

44. Polipeptídeo de acordo com a reivindicação 43, carac- terizado pelo fato de que a referida extensão C-terminal é uma exten- são C-terminal (X)n , na qual n é 1 a 10, preferivelmente 1 a 5, tal co- mo 1, 2, 3, 4 ou 5 (e preferivelmente 1 ou 2, tal como 1); e cada XK é um resíduo de aminoácido (preferivelmente que ocorre naturalmente) que é escolhido independentemente, e preferivelmente independente- mente escolhido a partir do grupo consistindo em alanina (A), glicina (G), valina (V), leucina (L) ou isoleucina (1).

45. Polipeptídeo de acordo com qualquer uma das reivin- dicações 1 a 44, caracterizado pelo fato de que o referido polipeptídeo tem pelo menos 80%, 90%, 95% ou 100% de identidade de sequência com qualquer uma das SEQ ID NO:s 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 116, 117, 120, 121, 122, 123, 124, 125, 126, 127, 128, 129 ou 130.

46. Método de tratamento e/ou prevenção de doenças ou distúrbios em um indivíduo, por exemplo no qual a atividade de ADAMTSSB está envolvida, sendo o método caracterizado pelo fato de compreender administrar o polipeptídeo como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 45 ao referido indivíduo em uma quan- tidade eficaz para tratar ou prevenir um sintoma da referida doença ou distúrbio.

47. Método de acordo com a reivindicação 46, caracter- izado pelo fato de que as referidas doenças ou distúrbios são escolhi- dos a partir do grupo consistindo em artropatias e condrodistrofias, doença artrítica, tais como osteoartrite, artrite reumatoide, artrite gotosa, artrite psoriática, ruptura ou desligamento traumático, acondroplasia, costocondrite, displasia espondiloepimetafisária, hernia de disco espinhal, doença degenerativa do disco lombar, doença de- generativa das articulações e policondrite recidivante, osteocondrite dissecante e agrecanopatias.

48. Polipeptídeo de acordo com qualquer uma das reivin- dicações 1 a 45, caracterizado pelo fato de que é para uso como um medicamento.

49. Polipeptídeo de acordo com qualquer uma das reivin- dicações 1 a 45, caracterizado pelo fato de que é para uso no trata- mento ou prevenção de um sintoma de doença associada a ADAMTSS, tal como por exemplo, artropatias e condrodistrofias, doen- ça artrítica, tais como osteoartrite, artrite reumatoide, artrite gotosa, artrite psoriática, ruptura ou desligamento traumático, acondroplasia, costocondrite, displasia espondiloepimetafisária, hernia de disco es- pinhal, doença degenerativa do disco lombar, doença degenerativa das articulações e policondrite recidivante, osteocondrite dissecante e agrecanopatias.

50. Polipeptídeo de acordo com qualquer uma das reivin- dicações 1 a 45, caracterizado pelo fato de que o referido polipeptídeo bloqueia de forma cruzada a ligação a ADAMTSS5 de pelo menos um dos polipeptídeos representados por qualquer uma das SEQ ID NO:s 2, 116,19, 1, 3, 6, 16, 17, 10, 11, 9, 5, 4, 7, 117, 8, 12, 13, 14, 15 e 18, e/ou é bloqueado de forma cruzada a partir da ligação a ADAMTSS5 por pelo menos um polipeptídeo representado por qualquer uma das SEQ ID NO:s 2, 116, 19, 1, 3, 6, 16, 17, 10, 11, 9, 5, 4, 7, 117, 8, 12,13, 14, 15e18.

51. Polipeptídeo que bloqueia de forma cruzada a ligação a ADAMTSS5 por um polipeptídeo representado por qualquer uma das SEQ ID NO:s 2, 116, 19, 1, 3, 6, 16, 17, 10, 11, 9, 5, 4, 7, 117, 8, 12, 13, 14, 15 e 18, e/ou é bloqueado de forma cruzada a partir da ligação a ADAMTS5 por pelo menos um polipeptídeo representado por qualquer uma das SEQ ID NO:s 2, 116, 19, 1, 3, 6, 16, 17, 10, 11,9, 5, 4,7, 117, 8, 12, 13, 14, 15 e 18, caracterizado pelo fato de que o refer-

ido polipeptídeo compreende pelo menos um VH, VL, dAb, domínio variável único da imunoglobulina (ISVD) especificamente se ligam a ADAMTSS5, em que a ligação a ADAMTS5 modula uma atividade de ADAMTSS5.