ES2715279T3 - Dominios variables individuales inmunoglobulínicos anti-receptor de manosa de macrófagos para elegir como diana y obtener imágenes in vivo de macrófagos asociados a tumores - Google Patents

Abstract

Un dominio variable individual inmunoglobulínico que se une específicamente a receptor de manosa de macrófagos humano (SEQ ID NO: 1), en donde el dominio variable individual inmunoglobulínico comprende una secuencia de aminoácidos que comprende 4 regiones marco (FR) y 3 regiones determinantes de la complementariedad (CDR) según la siguiente fórmula (1): FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4 (1); y en donde CDR1 consiste en SEQ ID NO: 67, CDR2 consiste en SEQ ID NO: 127 y CDR3 consiste en SEQ ID NO: 187; y en donde las regiones marco (FRs) tienen una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 37 (FR1), SEQ ID NO: 97 (FR2), SEQ ID NO: 157 (FR3), SEQ ID NO: 217 (FR4).

Description

DESCRIPCION

Dominios variables individuals inmunoglobuKnicos anti-receptor de manosa de macrofagos para elegir como diana y obtener imagenes in vivo de macrofagos asociados a tumores

Campo de la invencion

La presente invencion se refiere a dominios variables individuals inmunoglobulmicos dirigidos contra receptor de manosa de macrofagos humano (MMR) y sus usos en el campo de la oncologfa. Mas espedficamente, trata de dominios variables individuales inmunoglobulmicos, incluyendo nanocuerpos, contra MMR humano y su uso en la eleccion como diana y la obtencion de imagenes in vivo de macrofagos asociados a tumores, con aplicaciones en el campo del diagnostico y el tratamiento del cancer y el seguimiento de la enfermedad.

Antecedentes

La obtencion de imagenes molecular no invasiva es una tecnica potente destinada a rastrear episodios celulares y moleculares en su ambiente natural en el sujeto vivo intacto. En su sentido mas amplio, la obtencion de imagenes molecular implica la administracion de una molecula rastreadora etiquetada con un reactivo de contraste para la visualizacion. Ante todo, se usan rastreadores etiquetados radiactivamente en combinacion con tomograffa de emision positronica (PET) o tecnicas de obtencion de imagenes basadas en tomograffa digital de emision monofotonica (SPECT) (Pysz y cols. 2010, Clin Radiol 65: 500-16). En el entorno clmico, actualmente, la mayona de la obtencion de imagenes del cancer todavfa se realiza basandose en la deteccion de un aumento del metabolismo en celulas cancerosas usando desoxiglucosa radioetiquetada con 18F (Coenen y cols. 2010, Nucl Med Biol 37: 727­ 40), mientras que se usa albumina serica humana etiquetada con 99mTc para la cartograffa linfoescintigrafica de los nodulos linfaticos drenantes en el cancer (Kim y cols. 2001, Int J Oncol 19: 991-6). Aunque utiles, estos rastreadores no eligen como diana una molecula o un receptor espedficos sobre la superficie de las celulas implicadas en el proceso patologico. Por lo tanto, existe una necesidad de sondas que permitan una caracterizacion molecular mas espedfica de tejido inflamado o enfermo usando antfgenos membranarios relacionados con la enfermedad. Estos marcadores espedficos pueden ayudar a definir el fenotipo de una enfermedad y pueden ser elegidos como diana por agentes espedficos como anticuerpos monoclonales (MAbs). En este contexto, la eleccion de los marcadores moleculares elegidos como diana sera un factor cntico para determinar si es posible adquirir una informacion molecular profunda sobre el proceso patologico subyacente.

Varios MAbs aprobados por la FDA dirigidos contra antfgenos asociados a tumores (TAAs) sobre celulas malignas se estan aplicando para el diagnostico y el tratamiento del cancer, siendo unos pocos de los MAbs mas comunmente usados trastuzumab espedfico para el receptor 2 del factor de crecimiento epidermico humano (HER2) (Dijkers y cols. 2010, Clin Pharmacol Ther 87: 586-92), arcitumomab espedfico para antfgeno carcinoembrionario (CEA) (Hong y cols. 2008, Biomark Insights, 3: 435-451) y capromab espedfico para antfgeno membranario espedfico de la prostata (PSMA) (Aparici y cols. 2012, Am J Nucl Med Mol Imaging, 2: 48-54). No obstante, aunque la eleccion directa como diana de restos de anticuerpo para TAAs sobre celulas malignas es una potente herramienta que ha alcanzado su madurez clfnica, las celulas no transformadas presentes dentro del microambiente tumoral tambien pueden proporcionar biomarcadores utiles para la obtencion de imagenes molecular, como una alternativa o un complemento a marcadores sobre las celulas transformadas geneticamente inestables de forma inherente. En efecto, los tumores se deben considerar estructuras pseudoorganicas que realizan una interaccion bidireccional compleja entre celulas transformadas (cancer) y no transformadas (estromaticas), con lo que las celulas estromaticas pueden contribuir cnticamente al inicio, el crecimiento y la metastasis tumorales. De ad que elegir como diana estas celulas estromaticas asociadas a tumores para obtencion de imagenes pueda proporcionar informacion adicional sobre el estado del tumor o la respuesta a la terapia.

En particular, los macrofagos asociados a tumores (TAMs) son un componente importante del estroma tumoral, tanto en modelos con muridos como en pacientes humanos (Pollard 2004, Nat Rev Cancer 4: 71-8). Los TAMs pueden promover el crecimiento tumoral al afectar a la angiogenesis, la supresion inmunitaria y la invasion y la metastasis (Lin y cols. 2006, Cancer Res 66: 11238-46). La plasticidad de los macrofagos ofrece perspectivas para usarlos como sensores in vivo para el microambiente tumoral al que estan expuestos. De hecho, en la zona del tumor, estas celulas estan confrontadas con diferentes microambientes tumorales, conduciendo a diferentes subgrupos de TAM con funciones especializadas y distintos perfiles moleculares (Laoui y cols. 2011, Int. J. Dev. Biol., 55: 861-867). Por ejemplo, en tumores mamarios, se han descrito al menos dos subpoblaciones distintas de TAM, basadas en una expresion diferente de marcadores tales como el receptor de manosa de macrofagos (MMR o MHC II), diferencias en las propiedades proangiogenicas o inmunosupresoras y la localizacion intratumoral (areas tumorales normoxicas/perivasculares frente a regiones hipoxicas). En particular, la asociacion de TAMs con alto contenido de MMR con regiones hipoxicas en el tumor (Movahedi y cols. 2010, Cancer Res, 70: 5728-5739) ofrece perspectivas para radioterapia guiada por imagenes.

Los MAbs de tamano completo tienen un numero de desventajas que hasta ahora han limitado su uso eficaz en el entorno clmico. Los MAbs son macromoleculas con una penetracion relativamente pobre en tejidos solidos y aislados tales como tumores (Hughes y cols. 2000, J. Clin. Oncol., 18: 363-370). Ademas, los MAbs completos presentan un tiempo de permanencia prolongado en el cuerpo y un incremento potencial en senales de fondo debido a la union a receptores de Fc sobre celulas no elegidas como diana, haciendolos menos adecuados para aplicaciones de obtencion de imagenes molecular. En efecto, para la obtencion de imagenes, las propiedades mas importantes de un rastreador son: interaccion rapida con la diana, depuracion rapida de moleculas no unidas del cuerpo y baja acumulacion inespedfica, especialmente alrededor de la zona de interes. Estos requisitos han conducido al desarrollo de un gran numero de formatos de sondas derivadas de anticuerpos, como Fabs y scFvs, que tratan de combinar especificidad con un tamano pequeno para una farmacocinetica favorable (Kaur y cols. 2012, Cancer Lett., 315: 97-111).

Un nuevo enfoque para generar restos que se unen a antigenos con alta afinidad se centra en el uso de fragmentos de anticuerpo de VHH de un solo dominio, llamados nanocuerpos, derivados de los anticuerpos solo de cadena pesada encontrados en especies de camelidos (Hamers-Casterman y cols. 2003, Nature 363: 446-448). A modo de ejemplo, el documento US2012301394 divulga dominios variables individuales inmunoglobulmicos contra marcadores de TAMs y metodos para la obtencion de imagenes in vivo de celulas tumorales, asf como el diagnostico y el tratamiento del cancer. Ademas, Dangaj y cols., (2011. PLoS One. 6(12):e28386) revelaron scFv anti-CRD4-MR capaz de bloquear interacciones anclaje de GPI antigenico tumoral/CD206, para prevenir la polarizacion de TAM inducida por tumores. Los nanocuerpos, convenientemente etiquetados con 99mTc en su cola de hexahistidina carboxiterminal, tienen por ahora un solido registro de rastreo para obtencion de imagenes molecular basada en SPECT en modelos preclmicos con animales (revisado en: Vaneycken y cols. 2011, Curr Opin Biotechnol 22: 877­ 881), con una rapida depuracion sangumea de sondas no unidas y altas relaciones de senal a ruido tan pronto como una pocas horas despues de la inoculacion. En particular, el documento US20110262348 demuestra la utilidad de nanocuerpos anti-MMR espedficos de raton etiquetados con 99mTc para elegir como diana TAMs positivos a MMR en modelos con ratones que desarrollan espontaneamente carcinomas. Estos resultados ofrecen perspectivas para aplicaciones de nanocuerpos anti-MMR en radioterapia guiada por imagenes, con lo que la distribucion de la radiacion se adapta en funcion de factores de riesgo localizados tales como hipoxia (Bentzen 2005, Lancet Oncol, 6: 112-117). Por otra parte, como se ha documentado para nanocuerpos que eligen como diana el antfgeno tumoral HER2, los nanocuerpos que exhiben eleccion como diana de tumores eficaz se pueden convertir de una sonda de obtencion de imagenes en un compuesto radioinmunoterapeutico al acoplarla al radionuclido terapeutico (D'Huyvetter y cols. 2012, Contrast Media Mol. Imaging, 7: 254-264).

Sin embargo, sigue existiendo una necesidad de sondas espedficas que se puedan usar en modelos con animales tanto clmicos como preclmicos, con aplicaciones que incluyan mejora de diagnostico, pronostico, tratamiento y seguimiento de la terapia.

Sumario de la invencion

Los solicitantes han encontrado que se pueden detectar TAMs positivos a MMR en zonas hipoxicas intratumorales de muestras humanas, segun se ilustra en muestras de cancer de mama, demostrando la importancia clmica de elegir como diana subpoblaciones de TAM positivas a MMR en el estroma tumoral. Por lo tanto, se generaron dominios variables individuales inmunoglobulmicos, en particular nanocuerpos, que reconocen espedficamente MMR humano. Se encontro que varios de estos nanocuerpos son reactivos cruzadamente con MMR de raton, lo que es beneficioso para el desarrollo diagnostico y/o terapeutico, puesto que permite que el mismo dominio variable individual inmunoglobulmico se pruebe en modelos patologicos preclmicos asf como en entornos clmicos.

La presente invencion proporciona asf dominios variables individuales inmunoglobulmicos, incluyendo nanocuerpos, dirigidos contra el receptor de manosa de macrofagos humano, y su utilidad para la eleccion como diana in vivo selectiva y la obtencion de imagenes de subpoblaciones de tAm positivas a MMR en el estroma tumoral. Se proporciona evidencia de que los TAMs positivos a MMR se pueden elegir como diana eficazmente in vivo usando estos dominios variables individuales inmunoglobulmicos anti-MMR en modelos preclmicos con animales, segun se ilustra en modelos con muridos.

Segun esto, un primer aspecto de la invencion se refiere a un dominio variable individual inmunoglobulmico que se une espedficamente a receptor de manosa de macrofagos humano (SEQ ID NO: 1), en donde el dominio variable individual inmunoglobulmico comprende una secuencia de aminoácidos que comprende 4 regiones marco (FR) y 3 regiones determinantes de la complementariedad (CDR) segun la siguiente formula (1):

FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4 (1);

y

en donde CDR1 consiste en SEQ ID NO: 67, CDR2 consiste en SEQ ID NO: 127, y CDR3 consiste en SEQ ID NO: y en donde las regiones marco (FRs) tienen una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 37 (FR1), SEQ ID NO: 97 (FR2), SEQ ID NO: 157 (FR3), SEQ ID NO: 217 (FR4).

Segun una realizacion preferida, el dominio variable individual inmunoglobuKnico es un Nanobody con SEQ ID NO: 7.

Se preve particularmente que los dominios variables individuales inmunoglobulmicos que se describen anteriormente esten fusionados a una etiqueta detectable, tal como un radionuclido. El dominio variable individual inmunoglobulmico que se describe anteriormente tambien puede estar fusionado a un resto funcional, preferiblemente un agente terapeuticamente activo.

Tambien se abarcan polipeptidos que comprenden uno o mas de cualquiera de los dominios variables individuales inmunoglobulmicos descritos anteriormente, asf como ácidos nucleicos que codifican un dominio variable individual inmunoglobulmico o un polipeptido como el descrito anteriormente.

Segun otro aspecto, la invencion se refiere a una composicion farmaceutica que comprende un dominio variable individual inmunoglobulmico como el descrito anteriormente, o un polipeptido como el descrito anteriormente, y opcionalmente al menos un portador, adyuvante o diluyente farmaceuticamente aceptable.

Aspectos adicionales de la invencion se refieren a un dominio variable individual inmunoglobulmico como el descrito anteriormente o un polipeptido como el descrito anteriormente para el uso en la obtencion de imagenes medica in vivo no invasiva; para el uso en el diagnostico, el pronostico y/o el tratamiento del cancer; para el uso en el seguimiento de la eficacia de la terapia del cancer. Los dominios variables individuales inmunoglobulmicos y los usos que se describen se basan en la caractenstica de que estos dominios variables individuales inmunoglobulmicos eligen como diana espedficamente macrofagos asociados a tumores (TAMs) positivos a MMR dentro de un tumor. Entonces, tambien se preve un metodo para producir un dominio variable individual inmunoglobulmico como el descrito anteriormente o un polipeptido como el descrito anteriormente, comprendiendo dicho metodo las etapas de:

- expresar, en una celula hospedadora adecuada o un sistema de expresion adecuado, una secuencia de ácido nucleico que codifica un dominio variable individual inmunoglobulmico o un polipeptido como el descrito anteriormente; y opcionalmente

- aislar y/o purificar el dominio variable individual inmunoglobulmico o el polipeptido.

Los objetivos de la presente invencion estaran claros a partir de la descripcion que sigue.

Breve descripcion de los dibujos

Figura 1. PE-ELISA sobre MMR humano. Sumario de los clones Nb anti-MMR humano seleccionados. Un clon se seleccionaba cuando la OD405nm era al menos 3 veces superior sobre el antfgeno espedfico en comparacion con las protemas de bloqueo lacteas irrelevantes.

Figura 2. PE-ELISA sobre MMR humano. Sumario de los clones Nb reactivos cruzadamente anti-MMR de ser humano/raton seleccionados. Un clon se seleccionaba cuando la OD405 nm era al menos 3 veces superior sobre el antfgeno espedfico en comparacion con las protemas de bloqueo lacteas irrelevantes.

Figura 3. PE-ELISA sobre MMR de raton. Sumario de los clones Nb reactivos cruzadamente anti-MMR de ser humano/raton seleccionados. Un clon se seleccionaba cuando la OD405nm era al menos 2 veces superior sobre el antfgeno espedfico en comparacion con las protemas de bloqueo lacteas irrelevantes.

Figura 4. Purificacion de un numero de clones Nb seleccionados. A. Gel de SDS-PAGE al 12% tenido con Coomassie cargado con fracciones protefnicas despues de la purificacion por IMAC de extracto periplasmico de NbhmMMRm5.38. Carril 1, flujo pasante de la columna, carril 2, fraccion de lavado, carril 3 y 4, fracciones de elucion, M indica una escala de peso molecular. B. Cromatograma de muestras de Nb5.38 purificadas por IMAC pasadas por una columna de filtracion en gel S75 en PBS. La lmea solida representa la OD280 nm, la lmea de puntos representa la conductividad, la lmea discontinua representa el pH. Solo las fracciones del pico de Nb principal alrededor de la fraccion 30 se retuvieron para experimentos adicionales. C. Gel de SDS-PAGE al 12% tenido con Coomassie cargado con fracciones protefnicas despues de la filtracion en gel de NbhmMMRm3.1 (carril 1), NbhmMMRm14.4 (carril 2), NbhmMMRm5.38 (carril 3), NbhmMMRm26.70 (carril 4) y NbhmMMRm3.49 (carril 5). M indica una escala de peso molecular. Se confirmo que todos los Nbs eran >95% puros y teman tamanos de 13-15 kDa.

Figura 5. Sensogramas de resonancia plasmonica superficial de NbhmMMRm3.49 que se une a MMR de ser humano y raton recombinante. Se inyecto NbhmMMRm3.49 en multiples concentraciones en 30 pl/min sobre un chip sensor CM5 revestido con 3500RU de MMR de ser humano (A) o raton (B) recombinante. Los sonogramas representan la fase de asociacion y disociacion a lo largo de un penodo de 800 s.

Figura 6: Nbs espedficos de MMR se unen a MMR de raton expresado sobre macrofagos aislados ex vivo. Se indujeron tumores 3LL-R al inyectar 3x106 celulas cancerosas subcutaneamente en ratones C57BI/6. Despues de 15 dfas de crecimiento de los tumores, los tumores se aislaron y se prepararon suspensiones monocelulares para ser analizadas mediante citometna de flujo. Los macrofagos asociados a tumor (TAM) CD11b+Ly6G- se regularon adicionalmente sobre la expresion de MHCII. Los histogramas representan la expresion de MMR segun se define por la union a Nb en TAMs MHCIIbajo y MHCIIalto. Los histogramas sombreados representan la union del control negativo Nb BCII10. El clon 1 de Nanobody anti-MMR de raton (SEQ ID NO: 247) se uso como un control positivo.

Figura 7: Nbs espedficos de MMR se unen a MMR humano expresado sobre celulas dendnticas inducidas. Los Nbs anti-hMMR se unen a los subgrupos CD11c+ en suspensiones monocelulares de iDC humanas. Los histogramas sombreados representan la union del control negativo Nb BCII10. Como se esperaba, el clon 1 de Nanobody anti-MMR de raton (SEQ ID NO: 247) no se une a MMR humano.

Figura 8: Distribucion tisular de Nbs de MMR en ratones C57/bl6 WT frente a inactivados para MMR. Los Nbs anti-MMR se etiquetaron con 99mTc y se inyectaron en la vena caudal de ratones C57/bl6 (n=3). Despues de 3 h, los ratones se disecaron y se midio la radiactividad en los organos principales. Los valores de captacion para el control negativo Nb cAbBcII10 sernan como una medida para la distribucion de Nb inespedfica general. El clon 1 de Nanobody anti-MMR de raton (SEQ ID NO: 247) se uso como un control positivo.

Figura 9: Distribucion tisular de Nbs de MMR en ratones C57/bl6 portadores de tumores 3LL. Se indujeron tumores 3LL-R al inyectar 3x106 celulas cancerosas subcutaneamente en ratones C57BI/6. Los Nbs anti-MMR se etiquetaron con 99mTc y se inyectaron en la vena caudal de los ratones (n=3). Despues de 3 h, los ratones se disecaron y se midio la radiactividad en los organos principales. Los valores de captacion para el control negativo Nb cAbBcII10 sernan como una medida para la distribucion de Nb inespedfica general. El clon 1 de Nanobody anti-MMR de raton (SEQ ID NO: 247) se uso como un control positivo.

Figura 10: Eleccion como diana del tumor de Nbs de MMR en ratones C57/bl6 portadores de tumores 3LL. Se indujeron tumores 3LL-R al inyectar 3x106 celulas cancerosas subcutaneamente en ratones C57BI/6. Los Nbs anti-MMR se etiquetaron con 99mTc y se inyectaron en la vena caudal de los ratones (n=3). Despues de 3 h, los ratones se disecaron y se midio la radiactividad del tumor disecado. Los valores de captacion para el control negativo Nb cAbBcII10 sernan como una medida para la distribucion de Nb inespedfica general. El clon 1 de Nanobody anti-MMR de raton (SEQ ID NO: 247) se uso como un control positivo.

Descripcion detallada

La presente solicitud describe realizaciones particulares y se refiere a ciertos dibujos, pero la invencion no se limita a los mismos sino solamente por las reivindicaciones. No se debe considerar que ningun signo de referencia en las reivindicaciones limite el alcance. Los dibujos descritos solamente son esquematicos y no son limitativos. En los dibujos, el tamano de algunos de los elementos puede estar exagerado y no trazado a escala con propositos ilustrativos. Cuando se use el termino "que comprende" en la presente descripcion y las reivindicaciones, no excluye otros elementos o etapas. Cuando se use un artfculo indefinido o definido cuando se haga referencia a un nombre singular, p. ej. "un" o "uno/a", "el/la", este incluye un plural de ese nombre a menos que se indique espedficamente otra cosa. Por otra parte, los terminos primer, segundo y tercero y similares en la descripcion y en las reivindicaciones se usan para distinguir entre elementos similares y no necesariamente para describir un orden secuencial o cronologico. Se ha de entender que los terminos asf usados son intercambiables bajo circunstancias apropiadas y que las realizaciones de la invencion descritas en la presente son capaces de funcionar en otras secuencias distintas a las descritas o ilustradas en la presente.

A menos que se defina otra cosa en la presente, los terminos y las expresiones cientfficos y tecnicos usados en relacion con la materia descrita en la presente tendran los significados que son entendidos comunmente por los expertos normales en la especialidad. Generalmente, las nomenclaturas usadas en relacion con, y las tecnicas de biologfa molecular y celular, biologfa estructural, bioffsica, farmacologfa, genetica y qrnmica de protemas y ácidos nucleicos de la presente son la bien conocidas y usadas comunmente en la especialidad. Los metodos y las tecnicas de la memoria descriptiva se realizan generalmente y segun metodos convencionales bien conocidos en la especialidad y segun se describen en diversas referencias generales y mas espedficas que se citan y analizan a lo largo de la presente memoria descriptiva a menos que se indique otra cosa. Veanse, por ejemplo, Sambrook y cols. Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3a ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (2001); Ausubel y cols., Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Associates (1992, y Suplementos a 2002); Rup, Biomolecular crystallography: principles, Practice and Applications to Structural Biology, 1a edicion, Garland Science, Taylor & Francis Group, LLC, an informa Business, N.Y. (2009); Limbird, Cell Surface Receptors, 3a ed., Springer (2004).

Segun se usan en la presente, los terminos "polipeptido", "protema", "peptido" se usan intercambiablemente en la presente, y se refieren a una forma polimerica de aminoácidos de cualquier longitud, que puede incluir aminoácidos codificados y no codificados, aminoácidos qmmicamente o bioqmmicamente modificados o derivados y polipeptidos que tienen esqueletos peptidicos modificados.

Segun se usan en la presente, los terminos "molecula de ácido nucleico", "polinucleotido", "poli(ácido nucleico)", "ácido nucleico" se usan intercambiablemente y se refieren a una forma polimerica de nucleotidos de cualquier longitud, bien desoxirribonucleotidos o bien ribonucleotidos, o analogos de los mismos. Los polinucleotidos pueden tener cualquier estructura tridimensional, y puede realizar cualquier funcion, conocida o desconocida. Ejemplos no limitativos de polinucleotidos incluyen un gen, un fragmento genico, exones, intrones, ARN mensajero (ARNm), ARN de transferencia, ARN ribosomico, ribozimas, ADNc, polinucleotidos recombinantes, polinucleotidos ramificados, plasmidos, vectores, ADN aislado de cualquier secuencia, regiones de control, ARN aislado de cualquier secuencia, sondas de ácido nucleico y cebadores. La molecula de ácido nucleico puede ser lineal o circular.

El termino "identidad de secuencia", segun se usa en la presente, se refiere al grado en el que las secuencias son identicas sobre una base de nucleotido por nucleotido o una base de aminoácido por aminoácido a lo largo de un intervalo de comparacion. Asf, un "porcentaje de identidad de secuencia" se calcula al comparar dos secuencias optimamente alineadas a lo largo del intervalo de comparacion, determinar el numero de posiciones en las que la base de ácido nucleico (p.ej., A, T, C, G, I) identica o el residuo de aminoácido (p.ej., Ala, Pro, Ser, Thr, Gly, Val, Leu, Ile, Phe, Tyr, Trp, Lys, Arg, His, Asp, Glu, Asn, Gln, Cys y Met) identico se presente en ambas secuencias para dar el numero de posiciones coincidentes, dividir el numero de posiciones coincidentes por el numero total de posiciones del intervalo de comparacion (es decir, el tamano del intervalo) y multiplicar el resultado por 100 para dar el porcentaje de identidad de secuencia. La determinacion del porcentaje de identidad de secuencia se puede realizar manualmente, o al hacer uso de programas informaticos que estan disponibles en la especialidad. Ejemplos de algoritmos utiles son PILEUP (Higgins & Sharp, CABIOS 5:151 (1989), BLAST y BLAST 2.0 (Altschul y cols. J. Mol. Biol. 215: 403 (1990). Un software para realizar analisis por BLAST esta disponible publicamente a traves de the National Center for Biotechnology Information (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/).

Una "eliminacion" se define aqrn como un cambio en cualquier secuencia de aminoácidos o nucleotidos en el que uno o mas residuos de aminoácido o nucleotido, respectivamente, estan ausentes en comparacion con una secuencia de aminoácidos o secuencia de nucleotidos de un polipeptido o ácido nucleico parental. Dentro del contexto de una protema, una eliminacion puede implicar la eliminacion de aproximadamente 2, aproximadamente 5, aproximadamente 10, hasta aproximadamente 20, hasta aproximadamente 30 o hasta aproximadamente 50 o mas aminoácidos. Una protema o un fragmento de la misma puede contener mas de una eliminacion.

Una "insercion" o "adicion" es aquel cambio en una secuencia de aminoácidos o nucleotidos que ha dado como resultado la adicion de uno o mas residuos de aminoácido o nucleotido, respectivamente, en comparacion con una secuencia de aminoácidos o una secuencia de nucleotidos de una protema parental. "Insercion" se refiere generalmente a la adicion a uno o mas residuos de aminoácido dentro de una secuencia de aminoácidos de un polipeptido, mientras que la "adicion" puede ser una insercion o referirse a residuos de aminoácido anadidos a un extremo N o C, o ambos extremos. Dentro del contexto de una protema o un fragmento de la misma, una insercion o adicion es habitualmente de aproximadamente 1, aproximadamente 3, aproximadamente 5, aproximadamente 10, hasta aproximadamente 20, hasta aproximadamente 30 o hasta aproximadamente 50 o mas aminoácidos. Una protema o un fragmento de la misma puede contener mas de una insercion.

Una "sustitucion", segun se usa en la presente, resulta del reemplazo de uno o mas aminoácidos o nucleotidos por aminoácidos o nucleotidos diferentes, respectivamente, en comparacion con una secuencia de aminoácidos o una secuencia de nucleotidos de una protema parental o un fragmento de la misma. Se entiende que una protema o un fragmento de la misma puede tener sustituciones de aminoácidos conservativas que sustancialmente no tienen efecto sobre la actividad de la protema. Por sustituciones conservativas se entiende combinaciones tales como gly, ala; val, ile, leu, met; asp, glu; asn, gln; ser, thr; lys, arg; cys, met; y phe, tyr, trp.

Un primer aspecto de la invencion se refiere a un dominio variable individual inmunoglobulmico que se dirige contra y/o se une espedficamente a receptor de manosa de macrofagos humano (SEQ ID NO: 1).

El termino "receptor de manosa de macrofagos" (MMR), segun se usa en la presente, se conoce en la especialidad y se refiere a una protema transmembranaria tipo I, identificada en primer lugar en macrofagos de tejido de marnffero y mas tarde en celulas dendnticas y una variedad de celulas endoteliales y epiteliales. Los macrofagos son actores principales de las respuestas inmunitarias innatas y adaptivas. Estan diseminados a traves de la mayona de los organos para proteger contra la entrada de agentes infecciosos al internalizarlos y, la mayona de las veces, destruirlos. Entre los receptores superficiales presentes sobre macrofagos, el receptor de manosa reconoce una variedad de patrones moleculares genericos para microorganismos. El MMR esta compuesto por una sola subunidad con glicosilaciones conectadas por N y O y consiste en cinco dominios: una region rica en cistema N-terminal, que reconoce residuos sacaricos sulfatados terminales; un dominio de fibronectina tipo II con funcion poco clara; una serie de ochos dominios de reconocimiento de carbohidrato (CRDs) lectmicos de tipo C implicados en el reconocimiento dependiente de Ca2+ de residuos de manosa, fucosa o A/-acetilglucosamina sobre la envuelta de patogenos o sobre glicoprotemas endogenas, mostrando los CRDs 4-8 afinidad por ligandos comparable con la de MR intacto; un dominio transmembranario individual; y una cola citoplasmica de 45 residuos de largo que contiene motivos crfticos para la endocitosis y la clasificacion mediadas por MR en endosomas (Chieppa y cols. 2003, J Immunol 171:4552-60). En particular, el receptor de manosa de macrofagos humano se conoce como Mrc1 o CD206 (secuencia de nucleotidos numero de registro: NM_002438.2; secuencia protemica numero de registro: NP_002429.1 y como en SEQ ID NO: 1).

La memoria descriptiva en su sentido mas amplio no se limita particularmente a o se define por un determinante antigenico, epftopo, parte, dominio, subunidad o conformacion espedficos de MMR humano (SEQ ID NO: 1) contra los que se dirigen los dominios variables individuales inmunoglobulmicos descritos. Se espera que los dominios variables individuales inmunoglobulmicos segun la memoria descriptiva se unan generalmente a todos los analogos, variantes, mutantes, alelos presentes en la naturaleza o sinteticos de los MMRs mencionados en la presente.

El receptor de manosa de macrofagos humano, segun se menciona en la presente memoria descriptiva, incluye fragmentos de la protema de MMR humano de longitud completa. Un ejemplo no limitativo de un fragmento de la protema de MMR de longitud completa incluye el ectodominio de un MMR particular. El "ectodominio", segun se usa en la presente, se refiere a un fragmento del MMR que contiene un extremo N que es rico en cistema, seguido por un dominio de fibronectina tipo II y ocho dominios de reconocimiento de carbohidrato (CRDs). Los ocho CRDs estan particularmente bien conservados, especialmente CRD4. El ectodominio del receptor de manosa de macrofagos humano se define como el fragmento AA 19 - AA 1383 (SEQ ID NO: 5) de la correspondiente secuencia de aminoácidos de MMR de raton de longitud completa que se define en NP_002429.1 (SEQ ID NO: 1), vease ademas la Tabla 7. Asf, la memoria descriptiva describe dominios variables individuales inmunoglobulmicos que se unen espedficamente al ectodominio del receptor de manosa de macrofagos humano (SEQ ID NO: 5).

Segun se usa en la presente, el termino "que reconoce espedficamente" o "que se une espedficamente a" o simplemente "espedfico para" se refiere a la capacidad de un dominio variable individual inmunoglobulmico para unirse preferentemente a un antfgeno particular que esta presente en una mezcla homogenea de diferentes antfgenos y no implica necesariamente alta afinidad (segun se define adicionalmente en la presente). La memoria descriptiva describe una interaccion de union espedfica que discriminara entre antfgenos deseables e indeseables en una muestra, y la memoria descriptiva describe que la interaccion de union espedfica de mas de aproximadamente 10 a 100 veces o mas (p.ej., mas de aproximadamente 1000 o 10.000 veces). Los terminos "se unen espedficamente", "se unen selectivamente", "se unen preferentemente" y equivalentes gramaticales de los mismos se usan intercambiablemente en la presente.

El termino "afinidad", segun se usa en la presente, se refiere al grado en el que un dominio variable individual inmunoglobulmico se une a un antfgeno a fin de desplazar el equilibrio de antfgeno y dominio variable individual inmunoglobulmico hacia la presencia de un complejo formado por su union. Asf, por ejemplo, cuando un antfgeno y un (fragmento de) anticuerpo se combinan en una concentracion relativamente igual, un (fragmento de) anticuerpo de alta afinidad se unira al antfgeno disponible a fin de desplazar el equilibrio hacia una alta concentracion del complejo resultante. La constante de disociacion se usa comunmente para describir la afinidad entre el (fragmento de) anticuerpo y la diana antigenica. Tfpicamente, la constante de disociacion es menor de 10-5 M. Preferiblemente, la constante de disociacion es menor de 10-6 M, mas preferiblemente menor de 10-7 M. Lo mas preferiblemente, la constante de disociacion es menor de 10-8 M.

Se dice que un dominio variable individual inmunoglobulmico que se puede unir espedficamente a y/o que tiene afinidad para un antfgeno o determinante antigenico espedfico (p. ej., un epftopo) esta "contra" o "dirigido contra" dicho antfgeno o determinante antigenico. Se dice que un dominio variable individual inmunoglobulmico, segun se describe en la presente, es "reactivo cruzadamente" para dos antfgenos o determinantes antigenicos diferentes (tales como receptor de manosa de macrofagos procedente de dos especies diferentes de mamfero, tal como MMR humano y MMR de raton) si es espedfico para ambos antfgenos o determinantes antigenicos diferentes.

Se apreciara que, segun se describe en la presente, los dominios variables individuales inmunoglobulmicos que estan dirigidos contra el receptor de manosa de macrofagos humano procedentes de una especie pueden mostrar o no reactividad cruzada con el receptor de manosa de macrofagos de otra especie. Por ejemplo, los dominios variables individuales inmunoglobulmicos dirigidos contra MMR humano, en particular MMR humano (SEQ ID NO: 1), pueden mostrar o no reactividad cruzada con MMR procedente de una o mas especies de animales distintas que a menudo se usan en modelos con animales para enfermedades (por ejemplo, raton, rata, conejo, cerdo o perro). Estara claro para el experto que esta reactividad cruzada, cuando esta presente, puede tener ventajas para el desarrollo diagnostico y/o terapeutico, puesto que permite que los dominios variables individuales inmunoglobulmicos se prueben en estos modelos patologicos.

Un ejemplo no limitativo de un MMR no humano incluye el MMR de raton (sinonimos: MRC1 o CD206; secuencia de nucleotidos numero de registro: NM_008625.2; secuencia protemica numero de registro: NP_032651.2 y como en SEQ ID NO: 3). Ademas, un ejemplo no limitativo de un fragmento de un MMR no humano incluye el ectodominio del receptor de manosa de macrofagos de raton, que se define como el fragmento AA 19 - AA 1388 (SEQ ID NO: 6) de la correspondiente secuencia de aminoácidos de MMR de raton de longitud completa segun se define en NP_032651.2 (SEQ ID NO: 3). La secuencia de aminoácidos deducida de receptor de manosa de raton tiene una homologfa global de 82% con el receptor de manosa humano, como se puede medir facilmente en un alineamiento BLASTp (Altschul y cols. 1990, J Mol Biol 215: 403-10).

El termino "dominio variable individual inmunoglobulmico" define moleculas en las que el sitio de union antigenica esta presente sobre, y formado por, un dominio inmunoglobulmico individual (que es diferente de inmunoglobulinas convencionales o sus fragmentos, en donde tfpicamente dos dominios variables inmunoglobulmicos interactuan para formar un sitio de union antigenica). Sin embargo, debe estar claro que el termino "dominio variable individual inmunoglobulmico" comprende fragmentos de inmunoglobulinas convencionales en los que el sitio de union antigenica esta formado por un dominio variable individual.

Generalmente, un dominio variable individual inmunoglobulmico tendra una secuencia de aminoácidos que comprende 4 regiones marco (FR1 a FR4) y 3 regiones determinantes de la complementariedad (CDR1 a CDR3), preferiblemente segun la siguiente formula (1): FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4 (1), o cualquier fragmento adecuado de la misma (que entonces contendra habitualmente al menos algunos de los residuos de aminoácido que forman al menos una de las regiones determinantes de la complementariedad).

Los dominios variables individuales inmunoglobulmicos que comprenden 4 FRs y 3 CDRs son conocidos por el experto en la especialidad y se han descrito, como un ejemplo no limitativo, en Wesolowski y cols. 2009, Med Microbiol Immunol 198: 157-174.

Se describen de modo tfpico, pero no limitativo, ejemplos de dominios variables individuales inmunoglobulmicos que incluyen secuencias de dominio variable de cadena ligera (p.ej. una secuencia del dominio VL) o un fragmento adecuado de las mismas, o secuencias de dominio variable de cadena pesada (p.ej. una secuencia del dominio VH o secuencia del dominio VHH) o un fragmento adecuado de las mismas, con la condicion de que sea capaz de formar una unidad de union antigenica individual. Asf, la memoria descriptiva describe un dominio variable individual inmunoglobulmico que es una secuencia del dominio variable de cadena ligera (p.ej. una secuencia del dominio VL) o una secuencia del dominio variable de cadena pesada (p.ej. una secuencia del dominio VH); mas espedficamente, siendo el dominio variable individual inmunoglobulmico una secuencia del dominio variable de cadena pesada que se deriva de un anticuerpo de cuatro cadenas convencional que se deriva de un anticuerpo de cadena pesada. El dominio variable individual inmunoglobulmico puede ser un anticuerpo del dominio, o un anticuerpo de un solo dominio, o un "dAB" o dAb, o un Nanobody (segun se define en la presente), u otro dominio variable individual inmunoglobulmico, o cualquier fragmento adecuado de uno cualquiera de los mismos. Para una descripcion general de anticuerpos de un solo dominio, se hace referencia al siguiente libro: "Single domain antibodies", Methods in Molecular Biology, Eds. Saerens y Muyldermans, 2012, Vol 911. Los dominios variables individuales inmunoglobulmicos comprenden generalmente una sola cadena de aminoácidos que se puede considerar que comprende 4 "secuencias marco" o FR's y 3 "regiones determinantes de la complementariedad" o CDR's (segun se definen anteriormente en la presente). Debe estar claro que las regiones marco de dominios variables individuales inmunoglobulmicos tambien pueden contribuir a la union de sus antfgenos (Desmyter y cols 2002, J Biol Chem 277: 23645-50; Korotkov y cols. 2009, Structure 17: 255-65). La delineacion de las secuencias de CDR (y asf tambien las secuencias de FR) se puede basar en el sistema de numeracion unico IMGT para dominios V y dominios de tipo V (Lefranc y cols. 2003, Develop Comparat Immunol 27: 55-77). Alternativamente, la delineacion de las secuencias de FR y CDR se puede realizar al usar el sistema de numeracion de Kabat que se aplica a dominios de VHH procedentes de camelidos en el artmulo de Riechmann y Muyldermans 2000, J Immunol Methods 240: 185-195.

Se debe apuntar que los dominios variables individuales inmunoglobulmicos como resto de dominio de union en su sentido mas amplio no se limitan a una fuente biologica espedfica o a un metodo de preparacion espedfico. El termino "dominio variable individual inmunoglobulmico" abarca dominios variables de diferente origen, que comprenden dominios variables de raton, rata, conejo, burro, ser humano, tiburon, camelido. Segun la memoria descriptiva, los dominios variables individuales inmunoglobulmicos se derivan de anticuerpos de tiburon (los llamados nuevos receptores antigenicos inmunoglobulmicos o IgNARs), mas espedficamente de anticuerpos de tiburon de cadena pesada presentes en la naturaleza, carentes de cadenas ligeras, y se conocen como secuencias de dominios VNA^r . Preferiblemente, se describe en la presente que los dominios variables individuales inmunoglobulmicos se derivan de anticuerpos de camelido. Mas preferiblemente, los dominios variables individuales inmunoglobulmicos se derivan de anticuerpos de camelido de cadena pesada presentes en la naturaleza, carentes de cadenas ligeras, y se conocen como secuencias de dominios VHH o Nanobodies.

El termino "Nanobody" (Nb), segun se usa en la presente, es un fragmento de union antigenica de un solo dominio. Particularmente, se refiere a un dominio variable individual derivado de anticuerpos de cadena pesada presentes en la naturaleza y es conocido por el experto en la especialidad. Los Nanobodies se derivan habitualmente de anticuerpos solo de cadena pesada (carentes de cadenas ligeras) observados en camelidos (Hamers-Casterman y cols. 1993, Nature 363: 446-448; Desmyter y cols. 1996, Nat Struct Biol 803-811) y por consiguiente a menudo se denominan anticuerpo VHH o secuencia VHH. Los camelidos comprenden los camelidos del viejo mundo (Camelus bactrianus y Camelus dromedarius) y los camelidos del nuevo mundo (por ejemplo Lama paccos, Lama glama, Lama guanicoe y Lama vicugna). Nanobody® y Nanobodies® son marcas registradas de Ablynx N.V. (Belgica). Para una descripcion adicional de VHH's o Nanobodies, se hace referencia al libro "Single domain antibodies", Methods in Molecular Biology, Eds. Saerens y Muyldermans, 2012, Vol 911, en particular al Capftulo de Vincke y Muyldermans (2012), asf como a una lista no limitativa de solicitudes de patente, que se mencionan como especialidad anterior general, e incluyen: WO 94/04678, WO 95/04079, WO 96/34103 de la Vrije Universiteit Brussel; WO 94/25591, WO 99/37681, WO 00/40968, WO 00/43507, WO 00/65057, WO 01/40310, WO 01/44301, EP 1134231 y WO 02/48193 de Unilever; WO 97/49805, WO 01/21817, WO 03/035694, WO 03/054016 y WO 03/055527 de el Vlaams Instituut voor Biotechnologie (VIB); WO 04/041867, WO 04/041862, WO 04/041865, WO 04/041863, WO 04/062551, WO 05/044858, WO 06/40153, WO 06/079372, WO 06/122786, WO 06/122787 y WO 06/122825, de Ablynx N.V. y las solicitudes de patente publicadas adicionales de Ablynx N.V. El pequeno tamano y las propiedades bioffsicas unicas de los Nbs aventajan a los fragmentos de anticuerpo convencionales para el reconocimiento de epttopos poco comunes u ocultos y para la union en cavidades o sitios activos de dianas protemicas. Ademas, los Nbs se pueden disenar como anticuerpos multiespedficos y multivalentes (segun se definen adicionalmente en la presente) o ligar a moleculas indicadoras (Conrath y cols. 2011, Antimicrob Agents Chemother 45: 2807-2812). Los Nbs son estables, sobreviven al sistema gastrointestinal y se pueden fabricar facilmente. Por lo tanto, los Nbs se pueden usar en muchas aplicaciones incluyendo el descubrimiento de farmacos y la terapia, pero tambien como una herramienta versatil y valiosa para la purificacion, el estudio funcional y la cristalizacion de protemas (Saerens y cols. 2008, Curr Opin Pharmacol 8: 600-608).

Los Nanobodies descritos en la presente comprenden generalmente una cadena de aminoácidos individual que se puede considerar que comprende 4 "regiones marco" o FR's y 3 "regiones determinantes de la complementariedad" o CDR's, segun la formula (1) (segun se definen anteriormente). El termino "region determinante de la complementariedad" o "CDR" se refiere a regiones variables en nanocuerpos y contiene las secuencias de aminoácidos capaces de unirse espedficamente a dianas antigenicas. Estas regiones CDR explican la especificidad basica del Nanobody para una estructura de determinante antigenico particular. Estas regiones tambien se denominan "regiones hipervariables". Los nanocuerpos tienen 3 regiones CDR, cada una no contigua con las otras (denominadas CDR1, CDR2, CDR3). La delineacion de las secuencias de FR y CDR se basa a menudo en el sistema de numeracion unico IMGT para dominios V y dominios tipo V (Lefranc y cols. 2003, Develop Comparat Immunol 27: 55-77). Alternativamente, la delineacion de las secuencias de FR y CDR se puede realizar al usar el sistema de numeracion de Kabat segun se aplica a dominios V^hH procedentes de camelidos en el artfculo de Riechmann y Muyldermans 2000, J Immunol Methods 240: 185-195. Como sera conocido por el experto en la especialidad, los nanocuerpos se pueden caracterizar en particular por la presencia de uno o mas residuos distintivos de camelido en una o mas de las secuencias marco (segun la numeracion de Kabat), segun se describe, por ejemplo, en el documento WO 08/020079, en la pagina 75, Tabla A-3.

La memoria descriptiva describe un dominio variable individual inmunoglobulfnico dominio variable individual inmunoglobulfnico que se dirige contra y/o que se une espedficamente a receptor de manosa de macrofagos humano (SEQ ID NO: 1), en donde el dominio variable individual inmunoglobulfnico comprende una secuencia de aminoácidos que comprende 4 regiones marco (FR) y 3 regiones determinantes de la complementariedad (CDR) segun la siguiente formula (1):

FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4 (1),

y en donde CDR1 se elige del grupo que consiste en:

a. SEQ ID NOs: 67-96,

b. Polipeptidos que tienen una identidad de aminoácidos de al menos 80% con SEQ ID NOs: 67-96,

c. Polipeptidos que tienen una diferencia de 1, 2 o 3 aminoácidos con SEQ ID NOs: 67-96,

y en donde CDR2 se elige del grupo que consiste en:

a. SEQ ID NOs: 127-156,

b. Polipeptidos que tienen una identidad de aminoácidos de al menos 80% con SEQ ID NOs: 127-156,

c. Polipeptidos que tienen una diferencia de 1, 2 o 3 aminoácidos con SEQ ID NOs: 127-156,

y en donde CDR3 se elige del grupo que consiste en:

a. SEQ ID NOs: 187-216,

b. Polipeptidos que tienen una identidad de aminoácidos de al menos 80% con SEQ ID NOs: 187-216,

c. Polipeptidos que tienen una diferencia de 1, 2 o 3 aminoácidos con SEQ ID NOs: 187-216,

Mas espedficamente, las regiones marco (FRs) de los dominios variables individuales inmunoglobulmicos que se describen anteriormente en la presente tienen una identidad de secuencia de aminoácidos de mas de 80% con las FRs de SEQ ID Nos: 37-66 (FR1), SEQ ID Nos: 97-126 (FR2), SEQ ID Nos: 157-186 (FR3), SEQ ID Nos: 217-246 (FR4).

Ejemplos no limitativos de dominios variables individuales inmunoglobulmicos son como los descritos en la presente e incluyen nanocuerpos anti-MMR humano y anti-MMR humano/anti-MMR de raton reactivos cruzadamente, por ejemplo en la Tabla 1, en particular SEQ ID Nos: 8, 10-29; en la Tabla 2, en particular SEQ ID NOs: 7, 9, 20-36. La memoria descriptiva tambien describe los nanocuerpos que pueden comprender al menos una de las regiones determinantes de la complementariedad (CDRs) que se describen en la presente, por ejemplo CDRs con una secuencia de aminoácidos seleccionada de SEQ ID NOs: 67-96, 127-156, 187-216 (vease la Tabla 6). Preferiblemente, los nanocuerpos que se describen en la presente comprenden una CDR1, una CDR2 y una CDR3 seleccionadas del grupo que consiste en SEQ ID NOs: 67-96, 127-156, 187-216, segun la formula (1) descrita anteriormente. Preferiblemente, se proporciona un nanocuerpo que comprende una secuencia de aminoácidos segun la formula (1) con una CDR1 que consiste en SEQ ID N^o : 67, una CDR2 que consiste en SEQ ID NO: 127, una CDR3 que consiste en SEQ ID NO: 187, o con polipeptidos que tienen una identidad de aminoácidos de al menos 80% con SEQ ID NO: 67, SEQ ID NO: 127, S^eQ ⁱD NO: 187. Mas espedficamente, los nanocuerpos se pueden seleccionar del grupo que comprende SEQ ID NOs: 7-36, o un fragmento funcional de las mismas. Un "fragmento funcional" o un "fragmento adecuado", segun se usa en la presente, puede comprender por ejemplo uno de los bucles de CDR. Preferiblemente, dicho fragmento funcional comprende CDR3. Mas espedficamente, se describe en la presente que dichos nanocuerpos consisten en cualquiera de SEQ ID NOs: 7-36, preferiblemente SEQ ID NOs: 7, 8, 9, 10, lo mas preferiblemente SEQ ID NO: 7.

Se debe entender que el termino Nanobody segun se usa en la presente en su sentido mas amplio no se limita a una fuente biologica espedfica o a un metodo de preparacion espedfico. Por ejemplo, los nanocuerpos descritos en la presente se pueden obtener generalmente: (1) al aislar el dominio VhH de un anticuerpo de cadena pesada presente en la naturaleza; (2) mediante la expresion de una secuencia de nucleotidos que codifica un dominio VhH presente en la naturaleza; (3) mediante la "humanizacion" de un dominio V^hH presente en la naturaleza o mediante la expresion de un ácido nucleico que codifica este dominio V^hH humanizado; (4) mediante la "camelizacion" de un dominio VH presente en la naturaleza procedente de cualquier especie de animal, y en particular de una especie de mairnfero, tal como de un ser humano, o mediante la expresion de un ácido nucleico que codifica este dominio VH camelizado; (5) mediante la "camelizacion" de un "anticuerpo del dominio" o "Dab" segun se describe en la especialidad, o mediante la expresion de un ácido nucleico que codifica este dominio VH camelizado; (6) al usar tecnicas sinteticas o semisinteticas para preparar protemas, polipeptidos u otras secuencias de aminoácidos conocidas de por sf; (7) al preparar un ácido nucleico que codifica un Nanobody usando tecnicas para la smtesis de ácidos nucleicos conocidas de por sf, seguido por la expresion del ácido nucleico asf obtenido; y/o (8) mediante cualquier combinacion de uno o mas de los precedentes.

Una clase de nanocuerpos descrita corresponde a los dominios V^hH de anticuerpos de cadena pesada presentes en la naturaleza dirigidos contra un receptor de manosa de macrofagos, preferiblemente contra un receptor de manosa de macrofagos humano. Como se describe adicionalmente en la presente, estas secuencias de VhH se pueden generar u obtener generalmente al inmunizar adecuadamente a una especie de camelido con un MMR deseado (es decir a fin de producir una respuesta inmunitaria y/o anticuerpos de cadena pesada dirigidos contra un MMR deseado), al obtener una muestra biologica adecuada de dicho camelido (tal como una muestra de sangre o cualquier muestra de celulas B), y al generar secuencias de V^hH dirigidas contra el MMR, partiendo de dicha muestra, usando cualquier tecnica adecuada conocida de por sf. Estas tecnicas estaran claras para el experto. Alternativamente, estos dominios V^hH presentes en la naturaleza contra MMR se pueden obtener de bibliotecas sin tratamiento de secuencias de V^hH de camelido, por ejemplo al cribar esta biblioteca usando MMR o al menos una parte, fragmento, determinante antigenico o epttopo del mismo usando una o mas tecnicas de cribado conocidas de por sf. Estas bibliotecas y tecnicas se describen por ejemplo en los documentos WO9937681, WO0190190, WO03025020 y WO03035694. Alternativamente, se pueden usar bibliotecas sinteticas o semisinteticas mejoradas derivadas de bibliotecas de VhH sin tratamiento, tales como bibliotecas de VhH obtenidas de bibliotecas de VhH sin tratamiento mediante tecnicas tales como mutagenesis aleatoria y/o intercambio de CDR, como se describe por ejemplo en el documento WO0043507. Otra tecnica mas para obtener secuencias de VhH dirigidas contra un MMR deseado implica inmunizar adecuadamente un mamffero transgenico que es capaz de expresar anticuerpos de cadena pesada (es decir a fin de provocar una respuesta inmunitaria y/o anticuerpos de cadena pesada dirigidos contra un MMR), obtener una muestra biologica adecuada de dicho mamffero transgenico (tal como una muestra de sangre o cualquier muestra de celulas B) y a continuacion generar secuencias de VhH dirigidas contra el MMR partiendo de dicha muestra, usando cualquier tecnica adecuada conocida de por sf. Por ejemplo, con este proposito, se pueden usar los ratones que expresan anticuerpos de cadena pesada y los metodos y las tecnicas adicionales descritos en los documented WO02085945 y WO04049794.

Segun esto, la memoria descriptiva abarca metodos para generar dominios variables individuales inmunoglobu^nicos como los descritos en la presente. Como un ejemplo no limitativo, se proporciona un metodo para generar nanocuerpos dirigidos contra o que se unen espedficamente al receptor de manosa de macrofagos humano (segun se describe en la presente), que comprende

(i) inmunizar a un animal con un MMR, en particular un MMR humano (p.ej. SEQ ID NOs: 1 o 2), o un fragmento del mismo (p.ej. SEQ ID NO: 5); y

(ii) cribar con respecto a nanocuerpos que se unen espedficamente a MMR humano.

Para la inmunizacion de un animal con un MMR, el MMR se puede producir y purificar usando metodos convencionales que pueden emplear la expresion de una forma recombinante del MMR en una celula hospedadora y la purificacion del MMR usando cromatograffa de afinidad y/o metodos basados en anticuerpos. Cualquier animal adecuado, p.ej., un animal de sangre caliente, en particular un mairnfero tal como un conejo, un raton, una rata, un camello, una oveja, una vaca, un tiburon o un cerdo o un ave tal como un pollo o un pavo, se puede inmunizar usando cualquiera de las tecnicas bien conocidas en la especialidad adecuadas para generar una respuesta inmunitaria. El cribado de nanocuerpos, como un ejemplo no limitativo, que se unen espedficamente a un MMR se puede realizar, por ejemplo, mediante el cribado de un conjunto, una coleccion o una biblioteca de celulas que expresan anticuerpos de cadena pesada sobre su superficie (p. ej. celulas B obtenidas de un camelido adecuadamente inmunizado), o bacteriofagos que exhiben una fusion de genlll y Nanobody en su superficie, mediante el cribado de una biblioteca (virgen o inmunitaria) de secuencias de VhH o secuencias de Nanobody, o mediante el cribado de una biblioteca (virgen o inmunitaria) de secuencias de ácido nucleico que codifican secuencias de VHH o secuencias de Nanobody, que se pueden realizar todos de un modo conocido de por sf, y metodo que puede comprender ademas opcionalmente una o mas de otras etapas adecuadas, tales como, por ejemplo y sin limitacion, una etapa de maduracion por afinidad, una etapa de expresion de la secuencia de aminoácidos deseada, una etapa de cribado para la union y/o para la actividad contra el antfgeno deseado (en este caso, el MMR), una etapa para determinar la secuencia de aminoácidos o secuencia de nucleotidos deseada, una etapa para introducir una o mas sustituciones humanizantes, una etapa de formateo en un formato multivalente y/o muitiespedfico adecuado, una etapa de cribado con respecto a las propiedades biologicas y/o fisiologicas deseadas (es decir usando un ensayo adecuado conocido en la especialidad), y/o cualquier combinacion de una o mas de estas etapas, en cualquier orden adecuado.

Una clase particularmente preferida de dominios variables individuales inmunoglobulfnicos descritos en la presente comprende nanocuerpos con una secuencia de aminoácidos que corresponde a la secuencia de aminoácidos de un dominio VhH presente en la naturaleza, pero que se haya "humanizado", es decir al reemplazar uno o mas residuos de aminoácido en la secuencia de aminoácidos de dicha secuencia de VhH presente en la naturaleza (y en particular en las secuencias marco) por uno o mas de los residuos de aminoácido que se presentan en la posicion o las posiciones correspondientes en un dominio VH procedente de un anticuerpo de 4 cadenas convencional procedente de un ser humano. Esto se puede realizar de un modo conocido de por sf, que estara claro para el experto, basandose en la descripcion adicional de la presente y la especialidad anterior sobre la humanizacion. De nuevo, se debe apuntar que estos nanocuerpos humanizados que se describen en la presente se pueden obtener de cualquier modo adecuado conocido de por sf (es decir, segun se indica bajo los puntos (1) - (8) anteriores) y asf no estan estrictamente limitados a polipeptidos que se han obtenido usando un polipeptido que comprende un dominio VhH presente en la naturaleza como materia prima. Los nanocuerpos humanizados pueden tener varias ventajas, tales como una inmunogenicidad reducida, en comparacion con los correspondientes dominios V^hH presentes en la naturaleza. Esta humanizacion implica generalmente reemplazar uno o mas residuos de aminoácido de la secuencia de un V^hH presente en la naturaleza por los residuos de aminoácido que se presentan en la misma posicion en un dominio VH humano, tal como un dominio VH3 humano. Las sustituciones humanizantes se deben elegir de modo que los nanocuerpos humanizados resultantes retengan todavfa las propiedades favorables de los nanocuerpos que se definen en la presente. El experto sera capaz de seleccionar sustituciones humanizantes o combinaciones adecuadas de sustituciones humanizantes que optimicen o alcancen un equilibrio deseado o adecuado entre las propiedades favorables proporcionadas por las sustituciones humanizantes por una parte y las propiedades favorables de dominios V^hH presentes en la naturaleza por otra parte.

Otra clase particularmente preferida de los dominios variables individuales inmunoglobulfnicos que se describen en la presente comprende nanocuerpos con una secuencia de aminoácidos que corresponde a la secuencia de aminoácidos de un dominio VH presente en la naturaleza, pero que se ha "camelizado", es decir al reemplazar uno o mas residuos de aminoácido de la secuencia de aminoácidos de un dominio VH presente en la naturaleza procedente de un anticuerpo de 4 cadenas convencional por uno o mas de los residuos de aminoácido que se presentan en la posicion o las posiciones correspondientes en un dominio VHH de un anticuerpo de cadena pesada. Estas sustituciones "camelizantes" se insertan preferiblemente en posiciones de aminoácidos que forman y/o estan presentes en la interfase VH-VL, y/o en los llamados residuos distintivos de camelidos, segun se definen en la presente (veanse, por ejemplo, los documentos WO 9404678, WO 08/020079). Preferiblemente, la secuencia de VH que se usa como materia prima o punto de partida para generar o disenar el Nanobody camelizado es preferiblemente una secuencia de VH procedente de un mairnfero, mas preferiblemente la secuencia de VH de un ser humano, tal como una secuencia de VH3. Sin embargo, se debe apuntar que estos nanocuerpos camelizados que se describen en la presente se pueden obtener de cualquier modo conocido de por sf (es decir, segun se indica bajo los puntos (1) - (8) anteriormente) y asf no estan estrictamente limitados a polipeptidos que se han obtenido usando un polipeptido que comprende un dominio VH presente en la naturaleza como una materia prima.

Por ejemplo, tanto la "humanizacion" como la "camelizacion" se pueden realizar al proporcionar una secuencia de nucleotidos que codifica un dominio V^h H o un dominio VH presentes en la naturaleza, respectivamente, y a continuacion cambiar, de un modo conocido de por sf, uno o mas codones de dicha secuencia de nucleotidos de tal modo que la nueva secuencia de nucleotidos codifique un Nanobody "humanizado" o "camelizado" segun se describe en la presente, respectivamente. Este ácido nucleico se puede expresar a continuacion de un modo conocido de por sf, a fin de proporcionar el Nanobody deseado segun se describe en la presente. Alternativamente, basandose en la secuencia de aminoácidos de un dominio VHH o un dominio VH presentes en la naturaleza, respectivamente, la secuencia de aminoácidos del Nanobody humanizado o camelizado que se describe en la presente, respectivamente, se puede disenar y a continuacion sintetizar de novo usando tecnicas para smtesis de peptidos conocidas de por sf. Ademas, basandose en la secuencia de aminoácidos o la secuencia de nucleotidos de un dominio V^h H o un dominio VH presentes en la naturaleza, respectivamente, una secuencia de nucleotidos que codifica el Nanobody humanizado o camelizado deseado que se describe en la presente, respectivamente, se puede disenar y a continuacion sintetizar de novo usando tecnicas para la smtesis de ácidos nucleicos conocidas de por sf, despues de lo cual el ácido nucleico asf obtenido se puede expresar de un modo conocido de por sf a fin de proporcionar el Nanobody deseado que se describe en la presente. Otros metodos y tecnicas adecuados para obtener los nanocuerpos que se divulgan en esta memoria descriptiva y/o ácidos nucleicos que codifican los mismos, partiendo de secuencias de VH o preferiblemente secuencias de VHH presentes en la naturaleza, estaran claros para el experto y, por ejemplo, pueden comprenden una o mas partes de una o mas secuencias de VH presentes en la naturaleza (tales como una o mas secuencias de FR y/o secuencias de CDR), una o mas partes de una o mas secuencias de V^h H presentes en la naturaleza (tales como una o mas secuencias de FR o secuencias de CDR), y/o una o mas secuencias sinteticas o semisinteticas, de un modo adecuado, a fin de proporcionar un Nanobody segun se describe en la presente o una secuencia de nucleotidos o un ácido nucleico que codifica la misma.

Tambien se proporcionan en la presente analogos, mutantes, variantes, alelos, homologos y ortologos (en la presente denominados colectivamente "variantes") naturales o sinteticos de los dominios variables individuales inmunoglobulmicos que se divulgan en la presente. Se describen en la presente algunos ejemplos particularmente preferidos, pero no limitativos, de dominios variables individuales inmunoglobulmicos, asf como combinaciones de secuencias de CDR se mencionan en la Tabla 6, que lista las secuencias de CDR que estan presentes en un numero de dominios variables individuales inmunoglobulmicos preferidos, pero no limitativos, como los divulgados en la presente. Asf, la memoria descriptiva describe que el termino "dominio variable individual inmunoglobulmico como el divulgado en la presente" en su sentido mas amplio tambien cubre estas variantes, en particular variantes de los nanocuerpos de SEQ ID NOs: 7-36 (veanse la Tabla 1, la Tabla 2). Generalmente, en estas variantes, uno o mas residuos de aminoácido pueden haberse reemplazado, eliminado y/o anadido, en comparacion con los nanocuerpos que se definen en la presente. Estas sustituciones, inserciones o eliminaciones se pueden realizar en una o mas de las regiones marco y/o en una o mas de las CDR's, y en particular variantes de los CDR's de los nanocuerpos de SEQ ID NOs: 7-36, correspondiendo dichas CDR's a SEQ ID NOs: 67-96 (CDR1), SEQ ID Nos: 127-156, SEQ ID Nos: 187-216 (CDR3) (Tabla 6). Las variantes, segun se usan en la presente, son secuencias en las que cada una o cualquiera de las regiones marco y cada una o cualquiera de las regiones determinantes de la complementariedad muestra al menos 80% de identidad, preferiblemente al menos 85% de identidad, mas preferiblemente 90% de identidad, aun mas preferiblemente 95% de identidad o todavfa mas preferiblemente 99% de identidad con la region correspondiente de la secuencia de referencia (es decir FR1_variante frente a FR1_referencia, CDR1_variante frente a CDR1_referencia, FR2_variante frente a FR2_referencia, CDR2_variante frente a CDR2_referencia, FR3_variante frente a FR3_referencia, CDR3_variante frente a CDR3_referencia, FR4_variante frente a FR4_referencia), segun se puede medir electronicamente al hacer uso de algoritmos tales como PILEUP y BLAST (Altschul y cols. 1990, J Mol Biol 215: 403; Higgins & Sharp 1989, CABIOS 5: 151). El software para realizar analisis BLAST esta disponible publicamente a traves de the National Center for Biotechnology Information (http://www/ncbi.nlm.nih.gov/). Estas variantes de dominios variables individuales inmunoglobulmicos pueden ser particularmente ventajosas ya que pueden tener una potencia mejorada y otras propiedades deseadas.

A modo de ejemplos no limitativos, una sustitucion puede ser, por ejemplo, una sustitucion conservativa (segun se describe en la presente) y/o un residuo de aminoácido se puede reemplazar por otro residuo de aminoácido que esta presente en la naturaleza en la misma posicion en otro dominio V^h H. Asf, se incluyen dentro de la memoria descriptiva que se describe en la presente una cualquiera o mas sustituciones, eliminaciones o inserciones, o cualquier combinacion de las mismas, que bien mejoren las propiedades del Nanobody que se divulga en la presente o bien que al menos no resten demasiado valor a las propiedades deseadas o el equilibrio o la combinacion de propiedades deseadas del Nanobody que se divulga en la presente (es decir hasta el punto de que el Nanobody ya no sea adecuado para su uso pretendido). Un experto generalmente sera capaz de determinar y seleccionar sustituciones, eliminaciones o inserciones adecuadas, o combinaciones adecuadas de las mismas, basandose en la divulgacion de la presente y opcionalmente despues de un grado limitado de experimentacion habitual, que, por ejemplo, puede implicar introducir un numero limitado de posibles sustituciones y determinar su influencia sobre las propiedades de los nanocuerpos asf obtenidos.

La memoria descriptiva describe ademas variantes de los dominios variables individuales inmunoglobulmicos, en particular los nanocuerpos que se divulgan en la presente pueden tener una sustitucion, eliminacion o insercion de 1, 2 o 3 aminoácidos en uno, dos o tres de las CDRs, mas espedficamente (i) en CDR1 o CDR2 o CDR3; (ii) en CDR1 y CDR2, o en CDR1 y CDR3, o en CDR2 y CDR3; (iii) en Cd R1 y CDR2 y CDR3, segun se lista en la Tabla 6. Mas preferiblemente, las variantes de los dominios variables individuales inmunoglobulmicos, en particular los nanocuerpos, que se describen en la presente, pueden tener una sustitucion conservativa (segun se define en la presente) de 1, 2 o 3 aminoácidos en uno, dos o tres de las CDRs, mas espedficamente (i) en CDR1 o CDR2 o CDR3; (ii) en CDR1 y CDR2, o en CDR1 y CDR3, o en CDR2 y CDR3; (iii) en CDR1 y CDR2 y CDR3, segun se lista en la Tabla 6.

Ademas, dependiendo del organismo hospedador usado para expresar el dominio variable individual inmunoglobulfnico que se divulga en la presente, estas eliminaciones y/o sustituciones se pueden disenar de tal modo que se retiren uno o mas sitios para la modificacion postraduccional (tal como uno o mas sitios de glicosilacion), como estara dentro de la capacidad del experto en la especialidad. Alternativamente, las sustituciones o inserciones se pueden disenar a fin de introducir uno o mas sitios para la ligazon de grupos funcionales (segun se describen en la presente), por ejemplo para permitir la pegilacion espedfica.

Ejemplos de modificaciones, asf como ejemplos de residuos de aminoácido dentro del dominio variable individual inmunoglobulfnico, preferiblemente la secuencia del Nanobody, que se pueden modificar (es decir sobre el esqueleto protefnico pero preferiblemente sobre una cadena lateral), metodos y tecnicas que se pueden usar para introducir estas modificaciones y los usos y las ventajas potenciales de estas modificaciones estaran claros para el experto. Por ejemplo, esta modificacion puede implicar la introduccion (p.ej. mediante conexion covalente o de otro modo adecuado) de uno o mas grupos funcionales, residuos o restos en o sobre el dominio variable individual inmunoglobulfnico que se describe en la presente, y en particular de uno o mas grupos funcionales, residuos o restos que confieren una o mas propiedades o funcionalidades deseadas al dominio variable individual inmunogiobulfnico divulgado en la presente. Ejemplos de estos grupos funcionales y de tecnicas para introducirlos estaran claros para el experto, y pueden comprender generalmente todos los grupos funcionales y las tecnicas mencionados en la especialidad anterior general citada anteriormente en la presente asf como los grupos funcionales y las tecnicas conocidos de por sf para la modificacion de protemas farmaceuticas, y en particular para la modificacion de anticuerpos o fragmentos de anticuerpo (incluyendo ScFv's y anticuerpos de un solo dominio) para lo cual se hace referencia, por ejemplo, a Remington's Pharmaceutical Sciences, l6 a ed., Mack Publishing Co., Easton, PA (1980). Estos grupos funcionales, por ejemplo, pueden estar conectados directamente (por ejemplo covalentemente) a un dominio variable individual inmunoglobulfnico divulgado en la presente, u opcionalmente a traves de un conector o espaciador adecuado, como de nuevo estara claro para el experto. Una de las tecnicas mas ampliamente usadas para incrementar la semivida y/o reducir la inmunogenicidad de protemas farmaceuticas comprende la ligazon de un polfmero farmacologicamente aceptable adecuado, tal como poli(etilenglicol) (PEG) o derivados del mismo (tales como metoxipoli(etilenglicol) o mPEG). Generalmente, se puede usar cualquier forma de pegilacion, tal como la pegilacion usada en la especialidad para anticuerpos y fragmentos de anticuerpo (incluyendo, pero no limitados a, anticuerpos de (un solo) dominio y ScFv's); se hace referencia, por ejemplo, a Chapman, Nat. Biotechnol., 54, 531-545 (20O2); de Veronese y Harris, Adv. Drug Deliv. Rev. 54, 453-456 (2003), de Harris y Chess, Nat. Rev. Drug. Discov., 2, (2003) y en el documento WO04060965. Diversos reactivos para la pegilacion de protemas tambien estan disponibles comercialmente, por ejemplo de Nektar Therapeutics, EE. UU. de A. Preferiblemente, se usa pegilacion dirigida localmente, en particular a traves de un residuo de cistema (vease, por ejemplo, Yang y cols., Protein Engineering, 16, 10, 761-770 (2003)). Por ejemplo, con este proposito, el PEG se puede ligar a un residuo de cistema que esta presente en la naturaleza en un Nanobody como el divulgado en la presente, un Nanobody como el definido en la presente se puede modificar a fin de introducir adecuadamente uno o mas residuos de cistema para la ligazon de PEG, o una secuencia de aminoácidos que comprende uno o mas residuos de cistema para la ligazon de PEG se puede fusionar al extremo N y/o C de un Nanobody como el descrito en la memoria descriptiva, todos usando tecnicas de manipulacion de protemas conocidas de por sf para el experto. Preferiblemente, para los dominios variables individuales inmunoglobulfnicos y las protemas que se describen en la presente, se usa un PEG con un peso molecular de mas de 5000, tal como mas de 10.000 y menos de 200.000, tal como menos de 100.000; por ejemplo en el intervalo de 20.000-80.000. Otra modificacion habitualmente menos preferida comprende la glicosilacion conectada a N o conectada a O, habitualmente como parte de una modificacion cotraduccional y/o postraduccional, dependiendo de la celula hospedadora usada para expresar el dominio variable individual inmunoglobulfnico o el polipeptido que se divulga en la presente. Otra tecnica para incrementar la semivida de un dominio variable individual inmunoglobulfnico puede comprender la manipulacion en construcciones bifuncionales (por ejemplo, un Nanobody contra el MMR diana y uno contra una protema serica tal como albumina) o en fusiones de dominios variables individuales inmunoglobulfnicos con peptidos (por ejemplo, un peptido contra una protema serica tal como albumina).

Otra modificacion mas puede comprender la introduccion de una o mas etiquetas detectables u otros grupos o restos generadores de senales, dependiendo del uso pretendido del Nanobody etiquetado. Etiquetas y tecnicas adecuadas para ligarlos, usarlos y detectarlos estaran claros para el experto y, por ejemplo, incluyen, pero no se limitan a, etiquetas fluorescentes (tales como IRDye800, VivoTag800, fluorescema, isotiocianato, rodamina, ficoeritrina, ficocianina, aloficocianina, o-ftaldehudo y fluorescamina y metales fluorescentes tales como Eu u otros metales de la serie de los lantanidos), etiquetas fosforescentes, etiquetas quimioluminiscentes o etiquetas bioluminescentes (tales como luminal, isoluminol, ester de acridinio teromatico, imidazol, sales de acridinio, ester de oxalato, dioxetano o GFP y sus analogos ), radioisotopos, metales, quelatos metalicos o cationes metalicos u otros metales o cationes metalicos que son particularmente adecuados para el uso en el diagnostico y la obtencion de imagenes in vivo, in vitro o in situ, asf como cromoforos y enzimas (tales como malato deshidrogenasa, nucleasa estafilococica, delta-V-esteroide isomerasa, alcohol deshidrogenasa de levadura, alfa-glicerofosfato deshidrogenasa, fosfato de triosa isomerasa, biotinavidina peroxidasa, peroxidasa de rabano picante, fosfatasa alcalina, asparaginasa, glucosa oxidasa, beta-galactosidasa, ribonucleasa, ureasa, catalasa, glucosa-VI-fosfato deshidrogenasa, glucoamilasa y acetilcolina esterasa). Otras etiquetas adecuadas estaran claras para el experto y, por ejemplo, incluyen restos que se pueden detectar usando espectroscopfa NMR o ESR. Estos Nanobodies y polipeptidos etiquetados que se divulgan en la presente se pueden usar, por ejemplo, para ensayos in vitro, in vivo o in situ (incluyendo inmunoensayos conocidos de por sf tales como ELISA, RIA, EIA y otros "ensayos de tipo sandwich", etc.) asf como con propositos de diagnostico y obtencion de imagenes in vivo, dependiendo de la eleccion de la etiqueta espedfica. Como estara claro para el experto, otra modificacion puede implicar la introduccion de un grupo quelante, por ejemplo para quelar uno de los metales o iones metalicos mencionados anteriormente. Grupos quelantes adecuados incluyen, por ejemplo, sin limitacion, ácido 2,2',2"-(10-(2-((2,5-dioxopirrolidin-1-il)oxi)-2-oxoetil)-1,4,7,10-tetraazaciclododecano-1,4,7-triil)triacetico (DOTA), ácido 2,2'-(7-(2-((2,5-dioxopirrolidin-1-il)oxi)-2-oxoetil)-1,4,7-triazonano-1,4-diil)diacetico (NOTA), ácido dietilentriaminopentaacetico (DTPA) o ácido etilendiaminotetraacetico (EDTA). Otra modificacion mas puede comprender la introduccion de un grupo funcional que es una parte de un par de union espedfico, tal como el par de union biotina-(estrept)avidina. Este grupo funcional se puede usar para conectar el Nanobody que se describe en la presente a otra protema, polipeptido o compuesto qrnmico que esta unido a la otra mitad del par de union, es decir a traves de la formacion del par de union. Por ejemplo, un Nanobody como el divulgado en la presente se puede conjugar a biotina, y conectar a otra protema, polipeptido, compuesto o portador conjugado a avidina o estreptavidina. Por ejemplo, este Nanobody conjugado se puede usar como un indicador, por ejemplo en un sistema de diagnostico en el que un agente productor de senales detectables se conjuga a avidina o estreptavidina. Estos pares de union, por ejemplo, tambien se pueden usar para unir el Nanobody que se divulga en la presente a un portador, incluyendo portadores adecuados con propositos farmaceuticos. Un ejemplo no limitativo son las formulaciones liposomicas descritas por Cao y Suresh, Journal of Drug Targetting, 8, 4, 257 (2000). Estos pares de union tambien se pueden usar para conectar un agente terapeuticamente activo al Nanobody que se divulga en la presente.

Asf, segun una realizacion preferida, el dominio variable individual inmunoglobulmico segun se usa en la presente invencion esta acoplado o fusionado a una etiqueta detectable, bien directamente o bien a traves de un conector. Preferiblemente, la etiqueta detectable es un radioisotopo, en particular un rastreador radiactivo adecuado para aplicaciones medicas, tal como en la obtencion de imagenes nuclear in vivo. Ejemplos incluyen, sin el proposito de ser limitativos, tecnecio 99m (99mTc), yodo 123 (123I), circonio 89 (89Zr), yodo 125 (125I), indio 111 (111In), fluor 18 (18F), cobre 64 (64Cu), galio 67 (67Ga), galio 68 (68Ga), y cualquier otro radioisotopo que se pueda usar en animales, en particular raton, conejo o ser humano. La memoria descriptiva tambien describe que la etiqueta detectable es 99mTc.

En otra realizacion preferida, el dominio variable individual inmunoglobulmico que se usa en la presente invencion esta acoplado a o fusionado a un resto funcional, en particular un agente terapeuticamente activo, bien directamente o bien a traves de un conector. Segun se usa en la presente, un "agente terapeuticamente activo" significa cualquier molecula que tenga o pueda tener un efecto terapeutico (es decir un efecto curativo o estabilizante) en el contexto del tratamiento de una enfermedad (segun se describe adicionalmente en la presente).

La memoria descriptiva describe ademas que un agente terapeuticamente activo es un agente modificador de la enfermedad, que puede ser un agente citotoxico, tal como una toxina, o un farmaco citotoxico o una enzima capaz de convertir un profarmaco en un farmaco, o un radionuclido, o una celula citotoxica, o que puede ser un agente no citotoxico. Aun mas preferiblemente, un agente terapeuticamente activo tiene un efecto curativo sobre la enfermedad. Ejemplos espedficos, pero no limitativos, de estos restos se describen en la seccion de Ejemplos. La memoria descriptiva describe alternativamente que el agente terapeuticamente activo no es un agente citotoxico.

Segun se usa en la presente, las "moleculas conectoras" o los "conectores" son peptidos de 1 a 200 aminoácidos de longitud, y, tfpicamente, pero no necesariamente, se eligen o se disenan para ser desestructurados y flexibles. Por ejemplo, se pueden elegir aminoácidos que no forman una estructura secundaria particular. O los aminoácidos se pueden elegir de modo que no formen una estructura terciaria estable. O los conectores de aminoácidos pueden formar una helice aleatoria. Estos conectores incluyen, pero no se limitan a, peptidos sinteticos ricos en Gly, Ser, Thr, Gln, Glu o aminoácidos adicionales que frecuentemente estan asociados con regiones desestructuradas en protemas naturales (Dosztanyi, Z., Csizmok, V., Tompa, P., & Simon, I. (2005). lUPred: web server for the prediction of intrinsically unstructured regions of proteins based on estimated energy content. Bioinformatics (Oxford, Inglaterra), 21(16), 3433-4.).

Asf, segun realizaciones espedficas, la secuencia conectora de aminoácidos (AA) es un peptido de entre 0 y 200 AA, entre 0 y 150 AA, entre 0 y 100 AA, entre 0 t 90 AA, entre 0 y 80 AA, entre 0 y 70 AA, entre 0 y 60 AA, entre 0 y 50 AA, entre 0 y 40 AA, entre 0 y 30 aminoácidos, entre 0 y 20 AA, entre 0 y 10 aminoácidos, entre 0 y 5 aminoácidos. Ejemplos no limitativos de secuencias conectoras adecuadas incluyen los conectores (GS)5 (GSGSGSGSGS; SEQ ID NO: 248), (GS)i0 (GSGSGSGSGSGSGSGSGSGS; SEQ ID NO: 249), (G4S)a (GGGGSGGGGSGGGGS; SEQ ID NO: 250), bisagra de IgG2 de llama (AHHSEDPSSKAPKAPMA; SEQ ID NO: 251) o bisagra de IgA humana (SPSTPPTPSPSTPPAS; SEQ ID NO: 252). Ejemplos de secuencias de conectores cortos incluyen, pero no se limitan a, PPP, PP o GS.

Para ciertas aplicaciones, puede ser ventajoso que la molecula conectora comprenda o consista en uno o mas motivos de secuencia particulares. Por ejemplo, se puede introducir en la molecula conectora un sitio de escision proteolftica de modo que se pueda liberar la etiqueta o el motivo detectable. Sitios de escision utiles son conocidos en la especialidad e incluyen un sitio de escision de proteasa tal como un sitio de escision de Factor Xa que tiene la secuencia IEGR (SEQ ID NO: 253), el sitio de escision de trombina que tiene la secuencia LVPR (SEQ ID NO: 254), el sitio de escision de enterocinasa que tiene la secuencia DDDDK (SEQ ID NO: 255) o el sitio de escision PreScission LEVLFQGP (SEQ ID NO: 256).

Alternativamente, en caso de que el dominio variable individual inmunoglobulmico se conecte a una etiqueta o un resto detectable usando metodos quimioenzimaticos para la modificacion de protemas, puede existir el resto conector de entidades qmmicas diferentes, dependiendo de las enzimas o la qmmica sintetica que se use para producir la molecula acoplada covalentemente in vivo o in vitro (revisado en: Rabuka 2010, Curr Opin Chem Biol 14: 790-796).

La memoria descriptiva describe ademas que los dominios variables individuales inmunoglobulmicos divulgados en la presente estan en una forma "multivalente" y se forman al unir, qmmicamente o mediante tecnicas de ADN recombinante, entre sf dos o mas dominios variables individuales inmunoglobulmicos monovalentes. Ejemplos no limitativos de construcciones multivalentes incluyen construcciones "bivalentes", construcciones "trivalentes", construcciones "tetravalentes", etc. Los dominios variables individuales inmunoglobulmicos comprendidos dentro de una construccion multivalente pueden ser identicos o diferentes. La memoria descriptiva describe dominios variables individuales inmunoglobulmicos como los divulgados en la presente que estan en una forma "multiespedfica" y se forman al unir entre sf dos o mas dominios variables individuales inmunoglobulfnicos, de los que al menos uno con una especificidad diferente. Ejemplos no limitativos de construcciones multiespedficas incluyen construcciones "biespedficas", construcciones "triespedficas", construcciones "tetraespedficas", etc. Para ilustrar esto adicionalmente, cualquier dominio variable individual inmunoglobulfnico multivalente o multiespedfico (segun se define en la presente) divulgado en la presente se puede dirigir adecuadamente contra dos o mas epftopos diferentes sobre el mismo antfgeno, por ejemplo contra dos o mas partes diferentes del ectodominio de MMR; o se puede dirigir contra dos o mas antfgenos diferentes, por ejemplo contra MMR y uno o mas de otros marcadores. Preferiblemente, un dominio variable individual inmunoglobulfnico monovalente como el divulgado en la presente es tal que se unira al MMR (segun se describe en la presente) con una afinidad menor de 500 nM, preferiblemente menor de 200 nM, mas preferiblemente menor de 10 nM, tal como menor de 500 pM. Los dominios variables individuales inmunoglobulfnicos multivalentes o multiespedficos divulgados en la presente tambien pueden tener (o se manipulados y/o seleccionados para) una avidez incrementada y/o una selectividad mejorada para el MMR deseado, y/o para cualquier otra propiedad deseada o combinacion de propiedades deseadas que se puedan obtener mediante el uso de estos dominios variables individuales inmunoglobulfnicos multivalentes o multiespedficos.

En un aspecto adicional, la memoria descriptiva proporciona un polipeptido que comprende cualquiera de los dominios variables individuales inmunoglobulfnicos divulgados en la presente, en una forma bien monovalente, bien multivalente o bien multiespedfica. Asf, los polipeptidos que comprenden nanocuerpos monovalentes, multivalentes o multiespedficos se incluyen en la presente como ejemplos no limitativos.

Otro aspecto de la memoria descriptiva se refiere a una secuencia de ácido nucleico que codifica un dominio variable individual inmunoglobulfnico, en particular un Nanobody, o un polipeptido, segun se describe anteriormente en la presente. Ademas, la memoria descriptiva tambien preve vectores de expresion que comprenden secuencias de ácido nucleico que codifican cualquiera de los dominios variables individuales inmunoglobulfnicos o polipeptidos anteriores, asf como celulas hospedadoras que expresan estos vectores de expresion. Sistemas de expresion adecuados incluyen sistemas de expresion constitutivos e inducibles en bacterias o levaduras, sistemas de expresion virales, tales como baculovirus, virus del bosque Semliki y lentivirus, o transfeccion transitoria en celulas de insecto o mairnfero. Celulas hospedadoras adecuadas incluyen E. coli, Lactococcus lactis, Saccharomyces cerevisiae, Schizosaccharomyces pombe, Pichia pastoris y similares. Celulas hospedadoras animales adecuadas incluyen HEK 293, COS, S2, CHO, NSO, DT40 y similares. La clonacion, la expresion y/o la purificacion de los nanocuerpos se pueden realizar segun tecnicas conocidas por los expertos en la especialidad.

La memoria descriptiva se refiere ademas a una composicion farmaceutica que comprende un dominio variable individual inmunoglobulfnico como el divulgado en la presente y al menos uno del portador, adyuvante o diluyente farmaceuticamente aceptable. Preferiblemente, la composicion farmaceutica comprende una cantidad terapeuticamente eficaz de un dominio variable individual inmunoglobulmico divulgado en la presente y al menos uno de un portador, adyuvante o diluyente farmaceuticamente aceptable.

Un 'portador' o 'adyuvante', en particular un 'portador farmaceuticamente aceptable' o 'adyuvante farmaceuticamente aceptable' es cualquier excipiente, diluyente, portador y/o adyuvante adecuado que, por sf mismo, no induzca la produccion de anticuerpos nocivos para el individuo que reciba la composicion ni provoque proteccion. Asf, los portadores farmaceuticamente aceptables son inherentemente atoxicos y aterapeuticos, y son conocidos por los expertos en la especialidad. Los portadores o adyuvantes adecuados comprenden tipicamente uno o mas de los compuestos incluidos en la siguiente lista no exhaustiva: macromoleculas metabolizadas lentamente grandes tales como protemas, polisacaridos, poli(ácidos lacticos), poli(ácidos glicolico), aminoácidos polimericos, copolfmeros de aminoácidos y partmulas virales inactivas. Los portadores o adyuvantes pueden ser, como un ejemplo no limitativo, solucion de Ringer, solucion de dextrosa o solucion de Hank. Tambien se pueden usar soluciones no acuosas tales como aceites fijos y oleato de etilo. Un excipiente preferido es dextrosa al 5% en solucion salina. El excipiente puede contener pequenas cantidades de aditivos tales como sustancias que potencien la isotonicidad y la estabilidad qrnmica, incluyendo tampones y conservantes.

Segun se usan en la presente, los terminos "cantidad terapeuticamente eficaz", "dosis terapeuticamente eficaz" y "dosis eficaz" significan la cantidad necesaria para alcanzar el resultado o los resultados deseados. Segun se usa en la presente, "farmaceuticamente aceptable" significa un material que no sea biologicamente o de otro modo indeseable, es decir, el material se puede administrar a un individuo junto con el compuesto sin provocar efectos biologicos indeseables o interactuar de un modo perjudicial con cualquiera de los otros componentes de la composicion farmaceutica en la que esta contenido.

Ciertos de los dominios variables individuales inmunoglobulmicos descritos anteriormente pueden tener utilidad de diagnostico, pronostico y/o terapeutica. Mas espedficamente, la memoria descriptiva tambien preve dominios variables individuales inmunoglobulmicos como los divulgados en la presente para el uso en el diagnostico, el pronostico, la prevencion y/o el tratamiento del cancer, asf como para verificar o valorar el impacto de una terapia. Segun se usa en la presente, el termino "diagnosticar" o una terminologfa gramaticalmente equivalente significa determinar si un sujeto sufre o no una enfermedad o trastorno particular. Segun se usa en la presente, "pronosticar" o una terminologfa gramaticalmente equivalente significa determinar si un sujeto tiene riesgo o no de desarrollar una enfermedad o trastorno particular.

Segun se usa en la presente, el termino "prevenir el cancer" significa inhibir o invertir el comienzo de la enfermedad, inhibir o invertir los signos iniciales de la enfermedad, inhibir la aparicion de smtomas clmicos de la enfermedad. Segun se usa en la presente, "tratar el cancer" o "tratar a un sujeto o individuo que tiene cancer" incluye inhibir sustancialmente la enfermedad, frenar o invertir sustancialmente la progresion de la enfermedad, mejorar sustancialmente los smtomas clmicos de la enfermedad o prevenir sustancialmente la aparicion de smtomas clmicos de la enfermedad. En particular, incluye la inhibicion de la replicacion de celulas cancerosas, la inhibicion de la extension del cancer, la reduccion en el tamano del tumor, la disminucion o la reduccion del numero de celulas cancerosas del cuerpo y/o la mejora o el alivio de los smtomas del cancer. Un tratamiento se considera terapeutico si hay una disminucion en la mortalidad y/o la morbidez, y se puede realizar profilacticamente o terapeuticamente. Se puede tratar una variedad de sujetos o individuos. Generalmente, los "sujetos" son mairnferos, termino que se usa ampliamente para describir organismos que estan dentro de la clase mammalia, incluyendo los ordenes carmvoros (p.ej., perros y gatos), roedores (p.ej., ratones, cobayas y ratas) y primates (p.ej., seres humanos, chimpances y monos). En muchas realizaciones, los sujetos seran seres humanos.

Segun se usa en la presente, el termino "cancer" se refiere a cualquier trastorno neoplastico, incluyendo trastornos celulares tales como, por ejemplo, cancer de celulas renales, sarcoma de Kaposi, leucemia cronica, cancer de mama, sarcoma, carcinoma ovarico, cancer rectal, cancer de garganta, melanoma, cancer de colon, cancer de vejiga urinaria, mastocitoma, cancer de pulmon, adenocarcinoma mamario, carcinoma de celulas escamosas farmgeo y cancer gastrointestinal o de estomago.

Segun esto, la memoria descriptiva proporciona un metodo para prevenir y/o tratar el cancer, que comprende administrar una cantidad farmaceuticamente eficaz de un dominio variable individual inmunoglobulmico como el divulgado en la presente o una composicion farmaceutica derivada del mismo a un sujeto que lo necesite.

Espedficamente, la memoria descriptiva proporciona un metodo para inhibir el crecimiento tumoral o metastasis tumorales en un sujeto que lo necesite, que comprende elegir como diana selectivamente subpoblaciones de TAM ligadas a diferentes regiones intratumorales, tales como regiones hipoxicas o normoxicas de un tumor solido. La memoria descriptiva tambien describe el metodo anterior que comprende administrar a dicho sujeto una cantidad farmaceuticamente eficaz de un dominio variable individual inmunoglobulmico o una composicion farmaceutica o un polipeptido como los divulgados en la presente, en particular un dominio variable individual inmunoglobulmico fusionado a una toxina, o a un farmaco citotoxico, o a una enzima capaz de convertir un profarmaco en un farmaco citotoxico, o a un radionuclido, o acoplado a una celula citotoxica, y similares (vease ademas la seccion de Ejemplos).

Segun se usa en la presente, "subpoblaciones de TAM" se refiere a distintos subgrupos de macrofagos asociados a tumores (TAMs) que estan presentes en un ambiente tumoral, que se caracterizan por la expresion diferencial de marcadores moleculares, segun se lista en la Tabla 1 en la p. 5733 de Movahedi y cols. 2010, Cancer Res 70: 5728­ 39. Por ejemplo, el receptor de manosa de macrofagos (MMR) es uno de los marcadores moleculares que se expresa espedficamente en una subpoblacion de TAM que reside predominantemente en las regiones hipoxicas de un tumor. La memoria descriptiva describe que una subpoblacion de TAM se puede definir como MHC II bajo o MHC II alto y, preferiblemente, la subpoblacion de TAM se define como MHC II bajo. Aun mas preferiblemente, una subpoblacion de TAM se define como una subpoblacion de TAM positiva a MMR. El termino "TAMs positivos a MMR" significa macrofagos asociados a tumores que expresan el receptor de manosa de macrofagos en una alta cantidad sobre su superficie y residen predominantemente en la region hipoxica de un tumor, en contraste con "TAMs negativos a MMR", que no expresan o solo lo hacen escasamente el receptor de manosa de macrofagos y residen principalmente en las regiones normoxicas de un tumor (vease ademas Movahedi y cols. 2010, Cancer Res 70: 5728-39).

El dominio variable individual inmunoglobulmico y/o la composicion farmaceutica se pueden administrar mediante cualquier metodo adecuado dentro del conocimiento del experto. La administracion de un dominio variable individual inmunoglobulmico segun se describe anteriormente o una sal farmaceuticamente aceptable del mismo puede ser por medio de administracion oral, inhalada o parenteral. Particularmente, el dominio variable individual inmunoglobulmico se aporta a traves de administracion intratecal o intracerebroventricular. El compuesto activo se puede administrar solo o preferiblemente formulado como una composicion farmaceutica. Una cantidad eficaz para tratar una cierta enfermedad o trastorno que exprese el antfgeno reconocido por el dominio variable individual inmunoglobulmico depende de los factores habituales tales como la naturaleza y la gravedad del trastorno que se trate y el peso del mairnfero. Sin embargo, una dosis unitaria estara normalmente en el intervalo de 0,01 a 50 mg, por ejemplo de 0,01 a 10 mg, o de 0,05 a 2 mg de dominio variable individual inmunoglobulmico o una sal farmaceuticamente aceptable del mismo. Las dosis unitarias se administraran normalmente una vez o mas de una vez al dfa, por ejemplo 2, 3 o 4 veces al dfa, mas habitualmente de 1 a 3 veces al dfa, de modo que la dosis diaria total este normalmente en el intervalo de 0,0001 a 1 mg/kg; asf, una dosis diaria total adecuada para un adulto de 70 kg es de 0,01 a 50 mg, por ejemplo de 0,01 a 10 mg o mas habitualmente de 0,05 a 10 mg. Se prefiere mucho que el dominio variable individual inmunoglobulmico o una sal farmaceuticamente aceptable del mismo se administre en la forma de una composicion de dosis unitaria, tal como una composicion de dosis unitaria oral, parenteral o inhalada. Estas composiciones se preparan mediante mezcladura y estan adaptadas adecuadamente para la administracion oral, inhalada o parenteral, y como tales pueden estar en la forma de comprimidos, capsulas, preparaciones lfquidas orales, polvos, granulos, pastillas para chupar, polvos reconstituibles, soluciones o suspensiones inyectables e infundibles o supositorios o aerosoles. Los comprimidos y las capsulas para administracion oral se presentan habitualmente en una dosis unitaria, y contienen excipientes convencionales tales como agentes aglutinantes, cargas, diluyentes, agentes de compresion, lubricantes, desintegrantes, colorantes, saborizantes y agentes humectantes. Los comprimidos se pueden revestir segun metodos muy conocidos en la especialidad. Cargas adecuadas para el uso incluyen celulosa, manitol, lactosa y otros agentes similares. Desintegrantes adecuados incluyen almidon, polivinilpirrolidona y derivados de almidon tales como almidon glicolato sodico. Lubricantes adecuados incluyen, por ejemplo, estearato magnesico. Agentes humectantes farmaceuticamente aceptables adecuados incluyen laurilsulfato sodico. Estas composiciones orales solidas se pueden preparar mediante metodos convencionales de combinacion, carga, compresion o similares. Se pueden usar operaciones de combinacion repetidas para distribuir el agente activo a traves de esas composiciones empleando grandes cantidades de cargas. Por supuesto, estas operaciones son convencionales en la especialidad. Las preparaciones lfquidas orales pueden estar en la forma, por ejemplo, de suspensiones, soluciones, emulsiones, jarabes o elixires acuosos u oleosos, o se pueden presentar como un producto seco para reconstitucion con agua u otro vehmulo adecuado antes del uso. Estas preparaciones lfquidas pueden contener aditivos convencionales tales como agentes de suspension, por ejemplo sorbitol, jarabe, metilcelulosa, gelatina, hidroxietilcelulosa, carboximetilcelulosa, gel de estearato de aluminio o grasas comestibles hidrogenadas, agentes emulsionantes, por ejemplo lecitina, monooleato de sorbitano o goma arabiga; veldculos no acuosos (que pueden incluir aceites comestibles), por ejemplo, aceite de almendra, aceite de coco fraccionado, esteres oleosos tales como esteres de glicerina, propilenglicol o alcohol etflico; conservantes, por ejemplo p-hidroxibenzoato de metilo o propilo o ácido sorbico, y, si se desea, agentes saborizantes o colorantes convencionales. Las formulaciones orales tambien incluyen formulaciones de liberacion sostenida convencionales, tales como comprimidos o granulos que tienen un revestimiento enterico. Preferiblemente, las composiciones para inhalacion se presentan para la administracion al tracto respiratorio como un polvo para aspirar o un aerosol o una solucion para un nebulizador, o como un polvo microfino para insuflacion, solo o en combinacion con un portador inerte tal como lactosa. En este caso, las partmulas de compuesto activo tienen adecuadamente diametros de menos de 50 micras, preferiblemente menos de 10 micras, por ejemplo entre 1 y 5 micras, tal como entre 2 y 5 micras. Una dosis inhalada favorable estara en el intervalo de 0,05 a 2 mg, por ejemplo de 0,05 a 0,5 mg, de 0,1 a 1 mg o de 0,5 a 2 mg. Para la administracion parenteral, se preparan formas de dosificacion unitaria fluidas que contienen un compuesto como el descrito en la presente y un vedculo esteril. El compuesto activo, dependiendo del vedculo y la concentracion, bien se puede suspender o bien su puede disolver. Las soluciones parenterales se preparan normalmente al disolver el compuesto en un vedculo y esterilizar por filtracion antes de cargar en un vial o una ampolla adecuados y sellar. Ventajosamente, tambien se disuelven en el vedculo adyuvantes tales como anestesicos locales, conservantes y agentes tamponadores. Para mejorar la estabilidad, la composicion se puede congelar despues de cargarla en el vial y el agua se puede retirar bajo vado. Las suspensiones parenterales se preparan sustancialmente del mismo modo excepto que el compuesto se suspende en el vehmulo en lugar de disolverse y esterilizarse mediante la exposicion a oxido de etileno antes de suspenderse en el vehmulo esteril. Ventajosamente, se incluye en la composicion un tensioactivo o agente humectante para facilitar la distribucion uniforme del compuesto activo. Cuando sea apropiado, se pueden incluir pequenas cantidades de broncodilatadores, por ejemplo aminas simpatomimeticas tales como isoprenalina, isoetarina, salbutamol, fenilefrina y efedrina; derivados de xantina tales como teofilina y aminofilina y corticosteroides tales como prednisolona y estimulantes suprarrenales tales como ACTH. Como es la practica comun, las composiciones estaran acompanadas habitualmente por directrices escritas o impresas para el uso en el tratamiento medico en cuestion. Todos estos medicamentos pueden estar destinados a uso humano o veterinario.

La eficacia de los dominios variables individuales inmunoglobulmicos que se divulgan en la presente y de las composiciones que comprenden los mismos se puede probar usando cualquier ensayo in vitro, ensayo basado en celulas, ensayo in vivo y/o modelo en animales adecuado conocido de por sf, o cualquier combinacion de los mismos, dependiendo de la enfermedad o el trastorno espedficos implicados.

Espedficamente, debe estar claro que el metodo terapeutico proporcionado en la memoria descriptiva tambien se puede usar en combinacion con cualquier otra terapia para el cancer conocida en la especialidad tal como irradiacion, quimioterapia o cirugfa.

Rastreadores de hipoxia fiables que se puedan usar para la obtencion de imagenes tumoral actualmente no estan disponibles o son limitados. La disponibilidad de estos rastreadores representana un avance significativo en el campo de la radioterapia, ya que permitinan al radioterapeuta adaptar la dosis de radiacion, dependiendo de la region tumoral elegida como diana (hipoxica frente a normoxica). La identificacion de subgrupos de macrofagos asociados a tumores (TAM) que estan situados en ambientes hipoxicos/normoxicos permite la identificacion de biomarcadores espedficos de macrofagos que se pueden usar para la obtencion de imagenes no invasiva de zonas hipoxicas/normoxicas en tumores. Por ejemplo, MMR representa tal marcador, puesto que preferentemente se expresa sobre los TAMs de MHC IIbajo hipoxicos. Debido a su pequeno tamano y alta penetracion tumoral, los dominios variables individuales inmunoglobulmicos, en particular Nanobodies, son el formato ideal para la obtencion de imagenes no invasiva. Los dominios variables individuales inmunoglobulmicos producidos contra marcadores que se expresan preferentemente sobre los TAMs de MHC IIbajo hipoxicos se pueden usar para la obtencion de imagenes de hipoxia en tumores. Los dominios variables individuales inmunoglobulmicos contra MMR humano (o reactivos cruzadamente contra MMR humano/de raton) se pueden usar a este respecto.

Otras aplicaciones de dominios variables individuales inmunoglobulmicos espedficos de subgrupos de TAM, acoplados a rastreadores para obtencion de imagenes (por ejemplo rastreadores fluorescentes del infrarrojo proximo o NIRF), incluyen, pero no se limitan a (i) cuantificar precisamente la cantidad de TAM o subgrupos de TAM dentro de cualquier tumor dado, lo que puede ser valioso para pronostico, (ii) valorar el impacto de la terapia - incluyendo terapias dirigidas a TAM como las actualmente reivindicadas - sobre la cantidad y/o el estado de activacion de TAM, (iii) visualizar regiones hipoxicas/normoxicas dentro del tumor.

Segun esto, en un aspecto adicional, la presente invencion proporciona dominios variables individuales inmunoglobulmicos para el uso como agente de contraste en la obtencion de imagenes medica in vivo no invasiva. Preferiblemente, la obtencion de imagenes nuclear se preve usando los dominios variables individuales inmunoglobulmicos que se divulgan en la presente, con lo que macrofagos asociados a tumores positivos a MMR se eligen como diana dentro de un tumor. La memoria descriptiva tambien proporciona dominios variables individuales inmunoglobulmicos para el uso en el seguimiento del porcentaje relativo de TAMs positivos a MMR y/o la evolucion en funcion del tiempo del porcentaje relativo de TAMs positivos a MMR.

Segun se usa en la presente, el termino "obtencion de imagenes medica" se refiere a la tecnica y el procedimiento que se usa para visualizar el interior de un cuerpo de un organismo (o partes y/o funciones del mismo), con propositos clmicos (p. ej. seguimiento del diagnostico, el pronostico o la terapia de una enfermedad) o ciencia medica (p. ej., estudio de la anatoirna y la fisiologfa). Ejemplos de metodos de obtencion de imagenes medica incluyen tecnicas invasivas, tales como ultrasonidos intravasculares (IVUS), asf como tecnicas no invasivas, tales como obtencion de imagenes por resonancia magnetica (MRI), ultrasonidos (US) y obtencion de imagenes nuclear. Ejemplos de obtencion de imagenes nuclear incluyen tomograffa de emision positronica (PET) y tomograffa digital de emision monofotonica (SPECT).

La memoria descriptiva tambien abarca un metodo de obtencion de imagenes in vivo de celulas tumorales en un sujeto, comprendiendo el metodo la etapa de:

administrar al sujeto un dominio variable individual inmunoglobulmico como el divulgado en la presente fusionado a una etiqueta detectable.

Segun se usa en la presente, "celulas tumorales" o simplemente "tumor" se refiere al tejido tumoral como un todo, incluyendo diferentes tipos de celulas que estan presentes en un ambiente tumoral. Las celulas tumorales incluyen celulas cancerosas pero tambien celulas hospedadoras no transformadas o celulas estromaticas asociadas a tumores. Ejemplos de celulas estromaticas asociadas a tumores incluyen celulas mieloides, en particular macrofagos asociados a tumores.

Preferiblemente, el metodo descrito anteriormente puede comprender ademas una o mas de las siguientes etapas de:

elegir como diana y/o visualizar selectivamente TAMs positivos a MMR relacionados con una region hipoxica de un tumor solido;

determinar un porcentaje relativo de los TAMs positivos a MMR, y opcionalmente valorar el impacto de una terapia para el cancer sobre el porcentaje relativo de los TAMs positivos a MMR,

Ademas, en otro aspecto mas, la memoria descriptiva describe un metodo para diagnosticar cancer o pronosticar la agresividad del cancer en un sujeto que sufre o se sospecha que sufre cancer, que comprende las etapas de:

administrar al sujeto un dominio variable individual inmunoglobulmico como el divulgado en la presente, y determinar la presencia y/o el porcentaje relativo de TAMs positivos a MMR en el sujeto, y

diagnosticar cancer o pronosticar la agresividad del cancer en el sujeto segun el porcentaje relativo de los TAMs positivos a MMR.

Particularmente, dicho metodo comprende las etapas de (i) proporcionar una muestra de dicho individuo que comprende celulas cancerosas o se sospecha que comprende celulas cancerosas; (ii) determinar en dicha muestra la presencia y/o el porcentaje relativo de TAMs positivos a MMR; (iii) clasificar a dicho individuo por tener un buen pronostico o diagnosticar que dicho individuo tiene cancer segun los resultados de la etapa (ii).

Una muestra puede comprender cualquier muestra de tejido clmicamente pertinente, tal como una biopsia tumoral o un aspirado con aguja fina, o una muestra de fluido corporal, tal como sangre, plasma, suero, linfa, fluido asdtico, fluido qrnstico, orina o exudado de pezon. La muestra se puede tomar de un ser humano, o, en un contexto veterinario, de animales no humanos tales como rumiantes, caballos, cerdos u ovejas, o de animales de compama domesticos tales como felinos y caninos. La muestra tambien puede ser secciones tisulares embebidas en parafina. Se entiende que el tejido canceroso incluye el tejido tumoral primario asf como un tejido metastasico espedfico de un organo o espedfico de un tejido.

En el contexto de la memoria descriptiva que se usa en la presente, pronosticar a un individuo que sufre o se sospecha que sufre cancer se refiere a una prediccion de la probabilidad de supervivencia del individuo que tiene cancer o riesgo de recafda que esta relacionado con el comportamiento invasivo o metastasico (es decir progresion maligna) de tejido o celulas tumorales. Segun se usa en la presente, "buen pronostico" significa un resultado deseado. Por ejemplo, en el contexto del cancer, un buen pronostico puede ser una expectativa de ausencia de recafdas o metastasis en dos, tres, cuatro, cinco o mas afos desde el diagnostico inicial del cancer. "Mal pronostico" significa un resultado no deseado. Por ejemplo, en el contexto del cancer, un mal pronostico puede ser una expectativa de una recafda o metastasis en dos, tres, cuatro o cinco afos desde el diagnostico inicial del cancer. Un mal pronostico del cancer puede indicar que un tumor es relativamente agresivo, mientras que un buen pronostico puede indicar que un tumor es relativamente docil.

Segun se usan en la presente, los terminos "determinar", "medir", "valorar" y "ensayar" se usan intercambiablemente e incluyen determinaciones tanto cuantitativas como cualitativas. En particular, modos de determinar la presencia y/o el porcentaje relativo de subpoblaciones de TAM, en particular TAMs positivos a MMR, son conocidos por el experto en la especialidad, por ejemplo al usar citometna de flujo, y se ilustra con mas detalle, pero sin el proposito de que sea limitativo, p.ej. en el documento US20110262348 y en Movahedi y cols. 2010, Cancer Res 70: 5728-39).

Despues, se sabe comunmente que encontrar marcadores espedficos de tumores para la eleccion de diana basada en anticuerpos sigue siendo una tarea diffcil. Esto es esencialmente cierto cuando se elige como diana el estroma tumoral, ya que los antfgenos estromaticos tfpicamente no estan restringidos a tumores. Esto puede dificultar la utilidad de estas herramientas para aplicaciones tanto diagnosticas como terapeuticas. Por lo tanto, a menudo se desea bloquear sitios de union extratumorales sin competir con sitios de union libres del tumor.

La memoria descriptiva proporciona ademas cualquiera de los metodos descritos anteriormente para obtencion de imagenes in vivo, diagnostico/pronostico o tratamiento del cancer que comprende una etapa adicional de coadministracion de un dominio variable individual inmunoglobulmico etiquetado monovalente como el divulgado en la presente y una forma bivalente no etiquetada de un dominio variable individual inmunoglobulmico dirigida contra la misma diana (receptor de manosa de macrofagos) para bloquear los sitios de union extratumorales. Preferiblemente, la forma bivalente no etiquetada del dominio variable individual inmunoglobulmico anti-MMR puede comprender dos dominios variables individuales inmunoglobulmicos identicos o dos diferentes, con la condicion de que al menos uno de los dominios variables individuales inmunoglobulmicos se dirija contra la misma diana (receptor de manosa de macrofagos). Segun se usa en la presente, "no etiquetado" se refiere a la ausencia de una etiqueta detectable, en particular un rastreador radioisotopico o radiactivo como el definido anteriormente en la presente. Debe estar claro que esto no excluye la ausencia de otra modificacion (segun se define anteriormente en la presente memoria). Un aspecto adicional de la invencion se refiere a un metodo para producir un dominio variable individual inmunoglobulmico como el divulgado en la presente o un polipeptido que comprende un dominio variable individual inmunoglobulmico como el divulgado en la presente, comprendiendo dicho metodo las etapas de:

expresar, en una celula hospedadora o un sistema de expresion adecuados, una secuencia de ácido nucleico que codifica un dominio variable individual inmunoglobulmico o un polipeptido que comprende un dominio variable individual inmunoglobulmico como el divulgado en la presente; y opcionalmente

aislar y/o purificar dicho dominio variable individual inmunoglobulmico o dicho polipeptido.

Sistemas de expresion adecuados incluyen sistemas de expresion constitutivos e inducibles en bacterias o levaduras, sistemas de expresion virales, tales como baculovirus, virus del bosque Semliki y lentivirus, o transfeccion transitoria en celulas de insecto o mairnfero. Celulas hospedadoras adecuadas incluyen E. coli, Lactococcus lactis, Saccharomyces cerevisiae, Schizosaccharomyces pombe, Pichia pastoris y similares. Celulas hospedadoras animales adecuadas incluyen HEK 293, COS, S2, CHO, NSO, DT40 y similares. La clonacion, la expresion y/o la purificacion de los dominios variables individuales inmunoglobulmicos se pueden realizar segun tecnicas conocidas por los expertos en la especialidad.

Los siguientes ejemplos ilustran mas a fondo caractensticas preferidas de la memoria descriptiva, pero no se pretende que limiten de ningun modo la invencion. Los que tengan una experiencia normal en la especialidad y acceso a las ensenanzas de la presente identificaran modificaciones y realizaciones adicionales dentro del alcance de la misma. Por lo tanto, la presente invencion esta limitada solamente por las reivindicaciones adjuntas a la presente. Todas las materias primas y los reactivos divulgados posteriormente son conocidos por los expertos en la especialidad y estan disponibles comercialmente o se pueden preparar usando tecnicas muy conocidas.

Ejemplos

Material y metodos para los Ejemplos

Ratones y lmeas celulares

Se adquirieron de Harlan ratones Balb/c y C57BL/6 hembra para experimentos de biodistribucion en animales sin tratamiento. Ratones deficientes C57BL/6 MMR" fueron proporcionados por Etienne Pays (Universite Libre de Bruxelles). Todos los estudios en animales fueron aprobados por y realizados segun las normas de la junta de revision institucional. El clon 3LL-R del carcinoma pulmonar de Lewis C57BL/6 se inyecto subcutaneamente (sc) en el costado (3x106 celulas). 12-14 dfas despues de la inoculacion, se obtuvieron imagenes de los ratones que portaban tumores 3LL-R.

Generacion de Nanobodies anti-MMR humano y reactivos cruzadamente anti-MMR humano/de raton.

Los nanocuerpos (Nbs) anti-receptor de manosa de macrofagos humano (MMR) y reactivos cruzadamente anti-MMR humano/de raton se aislaron de una biblioteca de fagos inmunitarios de un modo similar al descrito anteriormente (Saerens y cols. 2008, Current Opin Pharmacol 8: 600-608; Saerens y cols. 2004, J Biol Chem 279: 51965-72; Saerens y cols. 2008, Immunol Methods 329: 138-50). Sin embargo, a fin de generar Nbs reactivos cruzadamente, se llevo a cabo un esquema de inmunizacion alternativo. Una alpaca (Vicugna pacos) fue inmunizada con 100 |jg de MMR humano (R&D Systems #2534) seguido por 100 jg de ^m M^r de raton (R&D Systems #2535) una semana mas tarde. Este esquema alternativo se mantuvo durante un total de 6 semanas y ambas protemas se mezclaron con el adyuvante de Gerbu antes de la inyeccion. Despues de la inmunizacion, se recogio sangre y los linfocitos de sangre periferica se aislaron. Se extrajo ARNm de estas celulas usando TRIzol (Invitrogen) y se transcribio inversamente con oligo(dT) y SuperScript II RT (Invitrogen), siguiendo las instrucciones del fabricante. Las secuencias genicas que codificaban los dominios variables (VHHs) se amplificaron por PCR, con los cebadores CALL001 (5'-GTC CTG GCT CTC TTC TAC AAG G-3'; SEQ ID NO: 257) espedfico de la secuencia lfder y CALL002 (5'-GGT ACG TGC TGT TGA ACT GTT CC-3'; SEQ ID NO: 258) espedfico del exon CH2. Despues de la separacion en gel de agarosa al 1%, el fragmento de VHH-CH2 de 600 pb se aislo del gel y se reamplifico usando los cebadores internos A6E (5'-GAT GTG CAG CTG CAG GAG TCT GGR GGA GG-3'; SEQ ID NO: 259) y PMCF (5'- CTA GTG CGG CCG CTG AGG AGA CGG TGA CCT GGG T -3'; SEQ ID NO: 260) espedficos para las regiones marco-1 y marco-4, respectivamente. Estos fragmentos de PCR se ligaron en el vector fageirudico pMECS, una variante de pHEN4 (Arbabi Ghahroudi y cols. 1997, FEBS Lett 414: 521-6), despues de la digestion con las enzimas de restriccion Pstl y Notl. Los pMECS difieren del pHEN4 en la codificacion de una fusion de etiquetas de HA (YPYDVPDYGS; SEQ iD NO: 261) y 6xhistidina en el extremo C del Nb en lugar de una fusion solamente de etiqueta de HA. El material ligado se transformo en celulas TG1 de E. coli recientemente preparadas y se sembro en placas LB con ampicilina. Las colonias se rasparon de las placas, se lavaron y se almacenaron a -80°C en el medio LB complementado con glicerol (concentracion final 50%). Usando la infeccion con fago cooperador M13VCS, la biblioteca de VHH se expreso sobre fagos. Nanobody-fagos espedficos se enriquecieron mediante varias rondas consecutivas de seleccion in vitro sobre antfgeno revestido a pocillos de placas de microvaloracion (Nunc). Para el aislamiento de Nbs reactivos cruzadamente con MMR humano/de raton, se realizo un cribado usando MMR humano y de raton alternativamente. Las partmulas de fago unidas se eluyeron con trietilamina 100 mM (pH 11,0), inmediatamente neutralizada con Tris-HCI 1 M (pH 7,4) y se usaron para infectar celulas TG1 de E. coli. Se recogieron colonias individuales y la expresion de Nanobody-protema III de M13 recombinante mediante la adicion de isopropil-p-D-tiogalactopiranosido (IPTG) 1 mM. El extracto periplasmico de cada clon se probo posteriormente en ELISA para el reconocimiento de MMR humano con pocillos revestidos con antfgeno no espedfico como un control negativo. Los Nbs reactivos cruzadamente con MMR humano/de raton tambien se cribaron de un modo similar contra MMR de raton, solamente los clones reactivos con antfgenos humanos y de raton se retuvieron como Nbs cruzadamente reactivos. Cada ELISA se realizo en placas revestidas con 1 pg/ml de MMR en tampon de NaHCO3100 mM pH = 8,8. Despues del revestimiento, las placas se lavaron con PBS Tween-20 (PBST) al 0,05% y se bloquearon durante 2 h con PBS Tween-20 al 0,05% leche en polvo desnatada (Nestle) (PBs M) al 2%. A continuacion, los extractos de PE se incuban durante 1 h sobre la placa y a continuacion se lavaron con PBST seguido por 1 h de incubacion de 0,5 pg/ml de anticuerpo anti-(etiqueta de HA) de raton (16B12, Covance) en PBSM. Despues de lavar con PBST, se anaden a la placa durante 1 h 1,5 pg/ml de anti(anticuerpo de raton) conjugado a fosfatasa alcalina (Sigma) en PBSM seguido por lavado con PBST. Finalmente, el ELISA se desarrolla usando 2 mg/ml de sustrato de fosfatasa alcalina (Sigma) en tampon de AP (NaCl 100 mM, MgCh 50 mM, Tris 100 mM pH=9,5) y se mide la senal de densidad optica a 405 nm.

Expresion y purificacion de Nanobodies anti-MMR humano y reactivos cruzadamente anti-MMR humano/de raton.

Los plasmidos pMECS-Nb de los clones que puntuaban positivos en ELISA se transformaron en celulas WK6 de E. coli. Estas celulas detienen la traduccion en el codon TAG y por lo tanto expresan los Nbs sin una fusion de protema de fago. La produccion de VHH recombinante se realizo en matraces agitadores al hacer crecer las bacterias en Terrific Broth complementado con 0,1% de glucosa y ampicilina hasta que se alcanzaba una absorbancia a 600 nm entre 0,6 y 0,9. A continuacion, la expresion de VHH se indujo con IPT^g 1 mM durante 16 h a 28°C. Despues de nodulizar las celulas, las protemas periplasmicas se extrajeron mediante choque osmotico. Este extracto periplasmico se cargo sobre mquel-ácido nitrilotriacetico (Thermo Scientific) y, despues del lavado, las protemas unidas se eluyeron en PBS con imidazol 500 mM. La fraccion eluida se dializo hasta concentradores centnfugos Vivaspin 2 (Sartorius). La pureza final de la protema se comprobo mediante SDS-PAGE. El rendimiento final se determino a partir de la absorcion UV a 280 nm usando un coeficiente de extincion teorico calculado del VHH.

Una etiqueta de HA es util para la deteccion de Nanobodies a traves de citometna de flujo, pero se ha mostrado que interfiere con el etiquetado con 99mTc sobre etiquetas de His adyacentes. Por lo tanto, para pruebas experimentales que implican etiquetado con 99mTc, los Nanobodies se reclonaron al vector pHEN6c. Esto retira la etiqueta de HA y solo se fusiona una etiqueta de 6xHis en el extremo C del Nanobody. Ademas, despues de la expresion periplasmica y la purificacion por ⁱM^a C, los Nanobodies que se iban a usar en experimentos que implicaban etiquetado con 99mTc se sometieron a una etapa de purificacion adicional a traves de cromatograffa de exclusion por tamano (SEC) en Superdex 75 HR 10/30 (Pharmacia, Gaithersburg, MD) en solucion salina tamponada con fosfato pH 7,4 (PBS) (Figura 4B y 4C).

Resonancia plasmonica superficial

El analisis de afinidad se realizo usando un BIAcore T100 (GE Healthcare) con tampon de recorrido de solucion salina tamponada con HEPES (HEPES 10 mM con NaCl 0,15 M, EDTA 3,4 mM y 0,005% de tensioactivo P20 a pH 7,4). El MRR se inmovilizo sobre un chip CM5 en tampon de acetato 50 mM (pH 5,0), dando como resultado 2100 RU de MMR revestidos sobre el chip. Un segundo canal en el mismo chip se activo/desactivo de un modo similar y sema como un control negativo. Los Nanobodies de MMR se usaron como analitos a 11 concentraciones diferentes, que variaban de 1 a 2000 nM, a un caudal de 10 ml/min. Se uso HCl de glicina 50 mM (pH 2,0) para la elucion. Los valores de los parametros cineticos y de equilibrio (kd, ka y K^d ) se calcularon a partir del sensograma combinado de todas las concentraciones usando el software de evaluacion BIAcore T1002.02 (GE Healthcare).

Preparacion celular y citometna de flujo

Los Nanobodies usados para la tincion de citometna de flujo se produjeron a partir del vector fagico pMECS original y por lo tanto cada Nanobody posee una etiqueta de HA y 6xHis C-terminales.

Para examinar la union de los Nanobodies anti-MMR a MMR de raton, se indujeron tumores 3LL-R al inyectar 3E6 celulas cancerosas subcutaneamente en ratones C57BI/6. Despues de 15 dfas de crecimiento tumoral, los tumores se aislaron, se cortaron y se incubaron durante 25 minutos (37°C) con 10 U/ml de colagenasa tipo I, 400 U/ml de colagenasa tipo IV y 30 U/ml de DNAsel (Worthington). Se usaron gradientes de densidad (Axis-Shield) para retirar residuo celular y celulas muertas. Se anadieron Nanobodies en 10 pg/ml a 1E6 celulas por tubo. Despues de al menos una hora de incubacion con Nanobody anti-MMR o Nanobody de control, las celulas se lavaron dos veces con solucion salina tamponada de Hank enfriada con hielo (HBSS) (que contema 0,74 g/l de EDTA y 0,5% (v/v) de suero de ternero fetal termoinactivado) y se incubaron con 0,5 pg/ml de anticuerpo monoclonal anti-etiqueta de HA conjugado a Alexa fluor 488 (clon 16B12, Invitrogen). Los anticuerpos comerciales usados para las tinciones de la superficie celular eran anticuerpo monoclonal anti-Ly6C de raton (clon ER-MP20, AbD Serotec) conjugado a Alexa Fluor 647, anticuerpo monoclonal anti-MHCII de raton (clon M5/114.15.2, Biolegend) conjugado a PerCPCy5.5, anticuerpo monoclonal anti Ly6G de raton (clon 1A8, BD Biosciences) conjugado a ficoeritrina. Para las medidas de la citometna de flujo, macrofagos asociados a tumor CD11b+Ly6G- se regularon adicionalmente en la expresion de MHCII, ya que los TAMs MHCII^bajo expresan MMR en un grado alto. Se registraron los perfiles de union de Nanobodies anti-MMR.

A fin de examinar la union de los Nanobodies a MMR humano, se usaron celulas dendnticas inmaduras humanas. Las celulas dendnticas inmaduras crioconservadas derivadas de monocitos de donantes humanos sanos eran un amable obsequio del Dr. Karine Breckpot (Vrije Universiteit Brussel, Jette, Belgica). Para preparar las celulas dendnticas inmaduras, celulas mononucleares de sangre periferica se retiraron de la sangre a traves de leucaferesis y los monocitos se separaron mediante adherencia a platos de Nunclon (Nunc, Biotech Line, Slangerup, Dinamarca). Despues de la retirada de las celulas no adherentes, las celulas dendnticas inmaduras se generaron in vitro durante una diferenciacion de seis dfas de monocitos en medio RPMI 1640 complementado con 500 U/ml de IL-4 (Invitrogen) y 1000 U/ml de GM-CSF (Gentaur). Las celulas se recogieron el dfa 6, se contaron y se dividieron en partes alfcuotas en 1E7 celulas/vial. Las celulas se crioconservaron en suero autologo al 85%, DMSO (Sigma-Aldrich) al 10% y Glucosteril 40% (Fresenius, Albertslund, Dinamarca) al 5%. Para el analisis por citometna de flujo, las celulas se descongelaron sobre hielo y se incubaron durante mas de una hora a temperatura ambiente con medio RPMI 1640 preenfriado complementado con 500 U/ml de IL-4 (Invitrogen) y 1000 U/ml de GM-CSF (Gentaur). A continuacion, se añadió suero de conejo normal al 10% para prevenir la union de anticuerpos inespedfica mediada por Fc. Despues de media hora, los Nanobodies se anadieron en 10 pg/ml a 2E5 celulas por tubo. Despues de al menos una hora de incubacion con Nanobody anti-MMR o Nanobody de control, las celulas se lavaron dos veces con tampon de HBSS enfriado con hielo complementado con suero de conejo normal (centnfuga Eppendorf 5810-R, 8 minutos, 1400 rpm, 4°C) al 1% y se incubaron con 0,5 pg/ml de anticuerpo monoclonal anti-etiqueta de HA (clone 16B12, Invitrogen) conjugado a Alexa fluor 488. Se uso anticuerpo monoclonal anti-CD11c humano (clone B-ly6, BD Biosciences) conjugado a aloficocianina (APC) para la tincion de CD11c. Las celulas tenidas se lavaron una vez mas con tampon de HBSS enfriado con hielo complementado con suero de conejo normal (centnfuga Eppendorf 5810-R, 8 minutos, 1400 rpm, 4°C) al 1% y se analizaron mediante citometna de flujo.

Etiquetado de Nanobodies y caracterizacion in vitro de Nanobodies etiquetados con ^99mTc

Los Nanobodies se etiquetaron con ^99mTc en su cola de hexahistidina. Para el etiquetado, se sintetizo [^99mTc(H²0)³(CO)^a]⁺ al anadir 1 ml de ^99mTcO4^‘ (0,74-3,7 GBq) a un estuche Isolink (Mallinckrodt Medical BV) que contema 4,5 mg de boranocarbonato sodico, 2,85 mg de tetraborato sodico.10H²O, 8,5 mg de tartrato sodico.2H²O y 7,15 mg de carbonato sodico, pH 10,5. El vial se incubo a 100°C en un bano a ebullicion durante 20 min. El [^99mTc(H²O)³(CO)³]⁺ recientemente preparado se dejo enfriar a temperatura ambiente durante 5 min y se neutralizo con 125 pl de HCl 1 M hasta pH 7-8. El [^99mTc(H²O)³(CO)³ ]⁺ se añadió a 50 pl de 1 mg/ml de Nanobody monovalente o 2 mg/ml de Nanobody bivalente, junto con 50 pl de tampon de carbonato, pH 8. La mezcla se incubo durante 90 min a 52°C en un bano de agua. La eficacia de etiquetado se determino mediante cromatograffa en capa fina instantanea en acetona como fase movil y se analizo usando un escaner de cromatoqramas radiometrico (VCS-201; Veenstra). Cuando el rendimiento del etiquetado era menor de 90%, la solucion de ^99mTc-Nanobody se purificaba en una columna NAP-5 (GE Healthcare) preequilibrada con solucion salina tamponada con fosfato (PBS) y se hacfa pasar a traves de un filtro Millipore de 0,22 pm para eliminar posibles agregados.

Procedimiento de obtencion de imagenes de SPECT de agujero estenopeico-microCT

Los ratones fueron inyectados intravenosamente con 100-200 pl de 45-155 MBq (aproximadamente 5-10 pg) de ^99mTc-Nanobody, con o sin un exceso de Nanobody no etiquetado monovalente o bivalente concentrado. Los ratones fueron anestesiados con una mezcla de 18,75 mg/kg de hidrocloruro de ketamina (Ketamine 1000®, CEVA, Bruselas, Belgica) y 0,5 mg/kg de hidrocloruro de medetomidina (Domitor®, Pfizer, Bruselas, Belgica) 10-15 min antes de la adquisicion de SPECT de agujero estenopeico.

La obtencion de imagenes por MicroCT fue seguida por SPECT de agujero estenopeico en sistemas de obtencion de imagenes separados. MicroCT se realizo usando un escaner CT de doble fuente (Skyscan 1178, Skyscan, Aartselaar, Belgica) con 60 kV y 615 mA a una resolucion de 83 pm. El tiempo de escaneo de todo el cuerpo era 2 minutos. La reconstruccion de imagenes se realizo usando retroproyeccion filtrada (Nrecon, Skyscan, Aartselaar, Belgica). La SPECT de agujero estenopeico de todo el cuerpo se realizo a los 60 min o 180 min despues de la inyeccion (p.i.) usando una camara gamma de doble cabezal (e.cam180 Siemens Medical Solutions, IL, Ee . UU. de A.), montada con dos colimadores de multiples agujeros estenopeicos (3 agujeros estenopeicos de 1,5 mm en cada colimador, longitud focal 200 mm, radio de rotacion 80 mm). Las imagenes se adquirieron sobre 360 grados en 64 proyecciones de 10 s en matrices de 128 x 128 dando como resultado un tiempo de obtencion de imagenes total de 14 min. Las imagenes de SPECT se reconstruyeron usando un algoritmo de reconstruccion iterativo (OSEM) modificado para la geometna de tres agujeros estenopeicos y se reorientaron automaticamente para la fusion con CT reorientada basada en seis marcas de referencia de 57Co.

Analisis de imagenes

El visionado y la cuantificacion de las imagenes se realizo usando el software AMIDE Medical Image Data Examiner. Se trazaron regiones elipsoidales de interes (ROIs) alrededor del tumor y los organos principales. La captacion se calculo como los recuentos en el tejido divididos por los recuentos de actividad inyectada y normalizados para el tamano de la ROI (% de IA/cm3). Se generaron reconstrucciones tridimensionales de imagenes de alta resolucion usando el software OsiriX Imaging.

Analisis de biodistribucion

30 min despues de la adquisicion de microCT/SPECT, los ratones fueron sacrificados con una dosis letal de pentobarbital (Nembutal; ^c E^vA). El tumor, los rinones, el tugado, los pulmones, el musculo, el bazo, los nodulos linfaticos, el hueso, el corazon y la sangre se retiraron y se pesaron, y la radiactividad se midio usando un contador y automatizado (Cobra II Inspector 5003; Canberra-Packard). La captacion en tejidos y organos se calculo como porcentaje de actividad inyectada por gramo de tejido (% IA/g), corregido para la desintegracion.

Estadfstica

La significacion estadfstica se determino mediante la prueba de la t de Student, usando software Microsoft Excel o GraphPad Prism 4.0. Las diferencias se consideraban significativas cuando P < 0,05. Las medias geometricas y los intervalos de confianza se determinaron usando Microsoft Excel.

Cuando se hacen multiples comparaciones (9-10 organos diferentes), los valores de p de la prueba de la t de Student se ajustaron mediante el procedimiento de Holm (Holm 1979, Scand J Stat 6: 65-70). Se usaron el entorno R (Ihaka y Gentleman 1996, J Comput Graph Stat 5: 299-314) y el paquete de prueba multiple (Pollard y cols. 2011, disponible de [citado; Disponible de: http://CRAN.Rproject.org/package=multtest) para los analisis estadfsticos y las figuras. La significacion de las pruebas de la t de Student y las correcciones para una prueba multiple se fijan a 0,05.

Ejemplo 1. Importancia de MMR como un marcador para TAMs promotores de tumores en tumores humanos.

A fin de probar la importancia de MMR como un marcador para TAMs promotores de tumores en tumores humanos, se valoro la expresion de MMR y CD68 (como marcador de macrofagos humanos) en secciones embebidas en parafina de muestras de cancer de mama humano (VUB-UZ Bruselas). Usando inmunohistoqmmica sobre portaobjetos consecutivos del mismo especimen y una tincion doble sobre un solo portaobjetos, se podfa demostrar la presencia de macrofagos positivos a CD68 en focos tanto tumorales como fibroticos dentro de la region tumoral. La inmunotincion para MMR muestra claramente que los macrofagos encontrados en focos fibroticos coexpresan MMR (datos no mostrados). Puesto que se sabe que los focos fibroticos dentro de la region tumoral son un marcador de hipoxia y peor pronostico (Colpaert y cols. 2003, Breast Cancer Res Treat 81: 137-47), la presencia de macrofagos MMR+ tambien podna funcionar como un indicador de hipoxia grave en tumores humanos, similar a lo que se mostro anteriormente para tumores en ratones (US20110262348). En conclusion, estos estudios muestran que en muestras de cancer de mama humano se detectan claramente TAMS MMR+ y estan enriquecidos en focos fibroticos que se sabe que son un marcador para la hipoxia intratumoral y se correlacionan con un mal pronostico.

Ejemplo 2. Seleccion de Nbs anti-MMR humano

Se generaron nanocuerpos anti-MMR humano (vease la seccion Material y metodo). Despues de 4 rondas de seleccion por afinidad de un banco de fagos anti-MMR humano/de raton sobre MMR humano, se observaron enriquecimientos de hasta 100 veces para fagos reactivos con hMMR por ronda de seleccion por afinidad. Por lo tanto, 188 colonias de todas las rondas se seleccionaron con respecto a la expresion de PE. Estos extractos de PE se usaron en PE-ELISAs para determinar que clones reaccionan eficazmente con hMMR. En total, se seleccionaron 100 clones basandose en estos resultados (Figura 1). Adicionalmente, se determino la secuencia de ADN y protemica de los clones seleccionados (Tabla 1) y se descartaron los clones dobles o los clones con detencion prematura.

Ejemplo 3. Seleccion de Nbs reactivos cruzadamente con anti-MMR humano/de raton

Posteriormente, se generaron nanocuerpos reactivos cruzadamente anti-MMR humano/de raton (vease tambien la seccion Material y metodo). El banco de fagos anti-MMR humano/de raton se cribo alternativamente sobre MMR humano y de raton durante un total de 4 rondas, dando como resultado enriquecimientos de hasta 100 veces para fagos reactivos con hMMR/mMMR procedentes de la segunda ronda de seleccion por afinidad. Por lo tanto, 188 colonias procedentes de las rondas segunda y tercera se seleccionaron con respecto a la expresion de PE. Estos extractos de PE se usaron en PE-ELISAs para determinar que clones reaccionan eficazmente con MMR, los clones se seleccionaron despues del ELISA sobre hMMR (Figura 2). A continuacion, estos se cribaron con respecto a la union sobre MMR de raton (Figura 3). Solo los clones (42) que reaccionaban con ambos antfgenos se retuvieron como Nbs cruzadamente reactivos autenticos. Estos clones se secuenciaron (Tabla 2) y se dividieron en familias basandose en sus regiones CDR3.

Ejemplo 4. Produccion de un grupo representativo de Nbs anti-MMR humano o anti-MMR humano/de raton

Se selecciono un grupo de clones representativos con respecto a la produccion de Nb en E. Coli: (1) Nbs contra ser humano: NbhMMRm1.33, NbhMMRm10.19, NbhMMRm23.30, NbhMMRm2.15, NbhMMRm3.1, NbhMMRm5.38, NbhMMRm12.6, NbhMMRm11.5, NbhMMRm15.43, NbhMMRm16.95; (2) anti-human/mouse Nbs: NbhmMMRm14.4, NbhmMMRm6.71, NbhmMMRm24.31, NbhmMMRm20.52, NbhmMMRm3.49, NbhmMMRm22.84, NbhmMMRm19.52, NbhMMRm21.22, NbhmMMRm14.93, NbhmMMRm15.49, NbhmMMRm17.72, NbhmMMRm10.79, NbhmMMRm7.67, NbhMMRm4.83 Cada clon se hizo crecer en un cultivo de dos litros. Despues de la expresion y el choque osmotico, el extracto resultante se purifico sobre 1 ml de resina Ni-NTA. Los 5 ml resultantes de Nb eluido se dializaron hasta PBS, despues de lo cual se determino la concentracion usando un dispositivo Nanodrop y la pureza se valoro sobre geles de SDS-PAGE tenidos con Coomassie. Los nanocuerpos se produdan todos entre 0,7 y 9 mg de cultivo de E. coli Nb/I (Tabla 3).

Ejemplo 5. Determinacion de las constantes de velocidad cineticas de un grupo representativo de Nbs anti-MMR humano o anti-MMR humano/de raton a traves de resonancia plasmonica superficial (SPR)

Las caractensticas de union y la afinidad de Nbs seleccionados hacia el antfgeno de hMMR recombinante y el antfgeno de mMMR recombinante se examino con mas detalle usando resonancia plasmonica superficial. Se registro un sensograma combinado para cada Nb (ejemplo, para NbhmMMRm3.49 en la Figura 5) y se calcularon los valores de los parametros cineticos y de equilibrio (kd, ka y KD) (Tabla 4 y Tabla 5). La mayona pero no todos los resultados sobre la union a rMMR de raton o humano obtenidos a traves de este analisis de SPR esta de acuerdo con los resultados obtenidos mediante PE-ELISA.

Basandose en los valores de los parametros cineticos y de equilibrio (kd, ka y KD), se seleccionaron cinco entre los Nbs anti-hmMMR reactivos cruzadamente para un analisis adicional (indicado en negrita en la Tabla 4 y la Tabla 5). Estos cinco Nbs (NbhmMMRm3.1, NbhmMMRm14.4, NbhmMMRm5.38, NbhmMMRm26.70 y NbhmMMRm3.49) exhibfan constantes de velocidad de disociacion bastante bajas, lo que los hace adecuados para la obtencion de imagenes in vivo. Los valores de KD correspondientes para estos Nanobodies variaban de 68 nM a 2 nM. Se puede observar claramente a partir de los datos de la Tabla 4 y 5 que los Nbs tienen un antfgeno de MMR preferido: NbhmMMRm3.1, NbhmMMRm14.4, NbhmMMRm5.38 y NbhmMMRm3.49 tienen una afinidad superior para el Ag de hMMR en comparacion con el Ag de mMMR. En contraste, NbhmMMRm26.70 se une mejor al Ag de mMMR en comparacion con Ag de hMMR, aunque las primeras rondas de inmunizacion y seleccion por afinidad se realicen usando el antfgeno de hMMR.

Ejemplo 6. Determinacion de la union de un grupo representativo de Nbs anti-MMR humano o anti-MMR humano/de raton sobre MMR expresado en celulas a traves de citometna de flujo

A fin de confirmar la especificidad de union de los 5 Nbs seleccionados a MMR expresado en celulas, se realizo analisis citometrico de flujo.

La union a MMR de raton expresado en celulas se determino sobre macrofagos asociados a tumores derivados de un modelo de tumor de raton preclmico, haciendo uso del hallazgo previamente documentado de que los TAMs contienen subgrupos molecular y funcionalmente distintos que difieren en la expresion de MMR: MMR se expresa altamente sobre TAMs MHC Mbaj° mientras que la expresion de MMR es inferior para TAMs MHC Nalt° (Movahedi y cols., 2010). Segun se muestra en la Figura 6, se podfan detectar desplazamientos claros en la intensidad de fluorescencia, comparables al desplazamiento del clon 1 de Nb anti-mMMR, sobre TAMs MHCNbajo para NbhMMRm3.1, NbhmMMRm14.4, NbhmMMRm26.70 y NbhMMRm3.49. Notablemente, no se podfa detectar la union de NbhmMMRm5.38 a TAMs.

A fin de investigar la especificidad de union de los Nbs seleccionados a MMR humano, se generaron celulas dendnticas derivadas de monocitos inmaduros humanos y se regularon sobre celulas CD11c+. Segun se muestra en la Figura 7, la union de NbhMMRm3.1, NbhmMMRm14.4, NbhmMMRm5.38 y NbhmMMRm3.49 a hMMR expresado sobre celulas dendnticas inmaduras se detectaba claramente, mientras que no se podfa detectar un desplazamiento significativo en la intensidad de fluorescencia para NbhmMMRm26.70.

En general, el analisis por citometna de flujo indica que NbhmMMRm5.38 se une sobre MMR humano expresado en celulas, pero no MMR de raton. En contraste, NbhmMMRm26.70 tiene un patron de union similar al clon 1 anti-MMR de raton original y se une a MMR de raton pero no humano. NbhMMRm3.1, NbhmMMRm14.4 y NbhMMRm3.49 se unen a MMR tanto de raton como humano expresado sobre celulas.

Ejemplo 7. Experimentos de distribucion tisular con un grupo representativo de nanocuerpos anti-MMR human o anti-MMR humano/de raton en ratones que soportan tumores 3LL.

En una etapa posterior, se quiso valorar si los Nbs anti-MMR humano seleccionados se podfan usar para la eleccion de dianas in vivo de celulas que expresan MMR. Puesto que el analisis por citometna de flujo sobre celulas dendnticas inmaduras humanas habfa revelado que NbhmMMRm26.70 no se une a MMR humano, no se analizo en este momento. Puesto que NbhmMMRm3.1 y NbhmMMRm3.49 comparten el mismo bucle de CDR3, pero NbhmMMRm3.49 tiene mejor afinidad para MMR recombinante en comparacion con NbhmMMRm3.1, entre estos dos Nanobodies, se selecciono NbhmMMRm3.49 para la eleccion de diana in vivo. Ademas, NbhmMMRm14.4 y NbhmMMRm5.38 se incluyeron en la seleccion que se iba a usar para este ejemplo. Puesto que el ultimo no se urna a MMR de raton segun el analisis citometrico de flujo, se podfa usar para excluir la union y la acumulacion inespedficas en tejidos.

Los Nanobodies seleccionados se etiquetaron con 99mTc y se inyectaron intravenosamente en ratones C57BL/6 que soportaban tumores 3LL. 3 horas despues de la inyeccion, los ratones se disecaron y la radiactividad se midio en los organos principales. Segun se muestra en la Figura 8, NbhmMMRm14.4 y NbhmMMRm3.49 exhibfan un patron similar de distribucion tisular que el control positivo clon 1 de Nanobody anti-MMR de raton (SEQ ID NO: 247), con alta captacion en organos tales como pulmones, bazo e tugado. De ese modo, NbhmMMRm14.4 exhibfa una captacion aun superior en estos organos en comparacion con NbhmMMRm3.49 y el clon 1 de Nanobody anti-MMR de raton. En contraste, los controles negativos NbhmMMRm5.38 y Nb cAbBcII10 mostraban principalmente una alta captacion de rastreador en los rinones, indicativa de depuracion renal. Los nanocuerpos de MMR tambien se inocularon en ratones con inactivacion de MMR en los que la captacion en el tugado y el bazo cafa por debajo de 1% de lA/g (Figura 8). Estos datos indican que la acumulacion de NbhmMMRm14.4, NbhmMMRm3.49 y el clon 1 de Nanobody anti-MMR de raton en organos tales como el tugado y el bazo esta relacionada con la expresion de MMR y por lo tanto refleja la eleccion de diana espedfica a MMR endogeno expresado en estos organos.

Como se muestra en las Figuras 9 y 10, NbhmMMRm3.49 tiene un potencial de eleccion de dianas tumorales similar al control positivo clon 1 de Nanobody anti-MMR de raton (SEQ ID NO: 247). Notablemente, el potencial de eleccion de dianas tumorales de NbhmMMRm14.4, que mostraba una eleccion de diana potenciada a MMR endogeno en organos tales como el dgado y el bazo, era inferior en comparacion con NbhmMMRm3.49 o el clon 1 de Nanobody anti-MMR de raton.

Tabla 1. Nbs anti-MMR humano seleccionados despues de ELISA sobre MMR humano de extractos de PE procedentes de clones de Nb individuales aislados a partir de exhibicion en fagos. Ademas de la secuencia de Nb en sentido estricto representada en la presente, todos los clones tambien soportan una extension C-terminal que contiene una etiqueta de HA y 6xHis (AAAYPYDVPDYGSHHHHHH; SEQ ID NO: 262). FRs y CDRs se listan separadamente en la Tabla 6.

Tabla 2. Nbs reactivos cruzadamente con anti-MMR humano/de raton seleccionados despues de ELISA sobre MMR humano y MMR de raton de extractos de PE procedentes de clones de Nb individuals aislados a partir de exhibicion en fagos. Ademas de la secuencia de Nb en sentido estricto representada en la presente, todos los clones tambien soportan una extension C-terminal que contiene una etiqueta de HA y 6xHis (AAAYPYDVPDYGSHHHHHH; SEQ ID NO: 262). FRs y CDRs se listan separadamente en la Tabla 6.

Tabla 3. Rendimientos de produccion y caractensticas fisicoqmmicas de los Nbs anti-MMR humano y reactivos cruzadamente anti-MMR humano/de raton. Todos los Nbs producen entre 0,7 y 9 mg/l de cultivo de E coli. A. D.: a determinar. El numero de aminoácidos (A.A.) y los pesos moleculares (PM) indicados en la tabla incluyen la etiqueta de HA y 6xHis.

Tabla 4. Cinetica y parametros de equilibrio de SPR para Nanobodies anti-MMR sobre MMR de raton. Nb: Nanobody; SE: error estandar; NB: sin union.

Tabla 5. Cinetica y parametros de equilibrio de SPR para Nanobodies anti-MMR sobre MMR humano. Nb: Nanobody; SE: error estandar; NB: sin union.

Tabla 6. CDRs de nanocuerpos espedficos de MMR

Tabla 7. Secuencias de aminoácidos de receptor de manosa de macrofagos humano y de raton

Claims (15)

REIVINDICACIONES

1. Un dominio variable individual inmunoglobu^nico que se une espedficamente a receptor de manosa de macrofagos humano (SEQ ID NO: 1), en donde el dominio variable individual inmunoglobulmico comprende una secuencia de aminoácidos que comprende 4 regiones marco (FR) y 3 regiones determinantes de la complementariedad (CDR) segun la siguiente formula (1):

FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4 (1);

y en donde CDR1 consiste en SEQ ID NO: 67, CDR2 consiste en SEQ ID NO: 127 y CDR3 consiste en SEQ ID NO: 187;

y en donde las regiones marco (FRs) tienen una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 37 (FR1), SEQ ID NO: 97 (FR2), SEQ ID NO: 157 (FR3), SEQ ID NO: 217 (FR4).

2. El dominio variable individual inmunoglobulmico segun la reivindicacion 1, en donde el dominio variable individual inmunoglobulmico consiste en una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 7.

3. El dominio variable individual inmunoglobulmico segun cualquiera de las reivindicaciones 1 a 2, en donde dicho dominio variable individual inmunoglobulmico esta fusionado a una etiqueta detectable.

4. El dominio variable individual inmunoglobulmico segun la reivindicacion 3, en el que dicha etiqueta detectable es un radionuclido.

5. El dominio variable individual inmunoglobulmico segun cualquiera de las reivindicaciones 1 o 2, en donde dicho dominio variable individual inmunoglobulmico esta fusionado a un resto funcional.

6. El dominio variable individual inmunoglobulmico segun la reivindicacion 5, en el que dicho resto funcional es un agente terapeuticamente activo.

7. Un polipeptido que comprende un dominio variable individual inmunoglobulmico segun cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6.

8. Una secuencia de ácido nucleico que codifica un dominio variable individual inmunoglobulmico segun cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, o un polipeptido segun la reivindicacion 7.

9. Una composicion farmaceutica que comprende el dominio variable individual inmunoglobulmico segun cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, o el polipeptido segun la reivindicacion 7, y opcionalmente al menos uno de un portador, adyuvante o diluyente farmaceuticamente aceptable.

10. El dominio variable individual inmunoglobulmico segun cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, o el polipeptido segun la reivindicacion 7, para el uso como un agente de contraste en la obtencion de imagenes medica in vivo no invasiva.

11. El dominio variable individual inmunoglobulmico segun cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, o el polipeptido segun la reivindicacion 7, para el uso en el diagnostico y el pronostico del cancer.

12. El dominio variable individual inmunoglobulmico segun cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, o el polipeptido segun la reivindicacion 7, para el uso en el tratamiento del cancer.

13. El dominio variable individual inmunoglobulmico segun cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, o el polipeptido segun la reivindicacion 7, para el uso en el seguimiento de la terapia del cancer.

14. El dominio variable individual inmunoglobulmico segun cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, o el polipeptido segun la reivindicacion 7, en donde el dominio variable individual inmunoglobulmico elige como diana espedficamente macrofagos asociados a tumores (TAMs) positivos a MMR dentro de un tumor.

15. Un metodo para producir un dominio variable individual inmunoglobulfnico segun cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6 o un polipeptido segun la reivindicacion 7, comprendiendo dicho metodo la etapa o las etapas de:

i) expresar, en una celula hospedadora adecuada o un sistema de expresion adecuado, una secuencia de ácido nucleico segun la reivindicacion 8; y opcionalmente

ii) aislar y/o purificar el dominio variable individual inmunoglobulmico segun cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6 o un a polipeptido segun la reivindicacion 7.