ES2624279T3 - Procedimiento para obtener líneas celulares de mieloma de mamífero recombinantes adaptadas al crecimiento en medios sin suero ni proteínas - Google Patents

Procedimiento para obtener líneas celulares de mieloma de mamífero recombinantes adaptadas al crecimiento en medios sin suero ni proteínas Download PDF

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Abstract

Procedimiento para producir anticuerpo monoclonal humanizado hR3 dirigido contra el receptor de EGF o fragmentos de éste en medios sin suero ni proteínas que comprende adaptar una línea celular de mieloma de mamífero recombinante transfectada con una secuencia que codifica dicho anticuerpo monoclonal humanizado hR3 dirigido contra el receptor de EGF o fragmentos de éste, a un crecimiento en medio sin suero ni proteínas mediante un procedimiento que comprende: I. Una primera etapa en la que la viabilidad de la línea celular está entre el 80 y el 100% y las células se desarrollan en medios de cultivo con una reducción consecutiva de la concentración de proteína hasta alcanzar una concentración de proteína crítica a la que la viabilidad celular disminuye hasta el 0%; y II. una segunda etapa en la que, una vez que se ha predeterminado la concentración crítica, la concentración precrítica se fija como una concentración de proteína tal a la que es posible el crecimiento celular y es el punto de partida para reducir lentamente la concentración de proteína hasta que el cultivo celular alcanza la viabilidad celular y el tiempo de duplicación de la población iniciales.

Description

DESCRIPCION
Procedimiento para obtener ilneas celulares de mieloma de mamlfero recombinantes adaptadas al crecimiento en medios sin suero ni protelnas 5
Campo de la invencion:
[0001] La presente invencion se refiere a la biotecnologla, especlficamente a un procedimiento de obtencion de clones celulares estables adaptados a un medio sin suero ni protelnas en un proceso de adaptacion en dos
10 etapas.
Antecedentes de la invencion:
[0002] Desde el desarrollo del cultivo in vitro de celulas de mamlferos, la demanda de la produccion de estas 15 celulas a gran escala ha aumentado debido al potencial de diagnostico y terapeutico de muchos de los productos
obtenidos. Estos agentes utiles incluyen anticuerpos monoclonales, la hormona del crecimiento humana, linfocinas, eritropoyetina, factores de coagulacion sangulnea y activadores del plasminogeno tisular.
[0003] En muchos casos, el uso de anticuerpos monoclonales recombinantes (rMab) para el tratamiento y el 20 diagnostico in vivo de distintas enfermedades implica el uso de altas dosis. Este hecho hace necesaria la produccion
de una gran cantidad del rMab de interes con una gran pureza.
[0004] Varios anticuerpos monoclonales de uso potencial en el tratamiento y diagnostico del cancer y de enfermedades autoinmunitarias se han expresado en celulas de mieloma NSO en el Centro de inmunologla
25 Molecular. El documento US 5.891.996 describe la obtencion de los anticuerpos quimericos y humanizados dirigidos contra el receptor del factor de crecimiento epidermico (EGF-R) utiles para el diagnostico y el tratamiento de tumores que expresan dicho receptor. El documento WO 97/19111 describe anticuerpos monoclonales dirigidos contra CD6 utiles para el diagnostico y el tratamiento de pacientes con psoriasis. Gavilondo y col., describieron en Hybridoma 9, n° 5, 1999, un anticuerpo monoclonal dirigido contra CD3, denominado IOR-T3a.
30
[0005] Se han desarrollado diversas tecnicas para condiciones de cultivo en ausencia de protelnas. De este modo, definido especlficamente, se han desarrollado medios completos sin protelnas que permiten el crecimiento celular en condiciones de ausencia de protelnas. El documento Wo 97/05240 describe la expresion de protelnas recombinantes en condiciones de ausencia de protelnas.
35
[0006] El documento JP 2696001 describe el uso de un medio sin protelnas para la produccion del factor VIII en celulas CHO mediante la adicion de un agente tensioactivo no ionico o ciclodextrina para aumentar la productividad de las celulas huesped. Para aumentar la efectividad de estos aditivos se recomienda la adicion de butirato y litio, por ejemplo.
40
[0007] El documento WO 96/26266 describe el cultivo de celulas en un medio que contiene un hidrolizado de protelnas con glutamina, cuyo contenido de aminoacidos libres es inferior al 15% del peso total de la protelna y cuyos peptidos tienen un peso molecular inferior a 44 kDa. Como medio de cultivo para los cultivos celulares se usa un medio mlnimo sintetico como medio base al que se anaden, entre otros, suero bovino fetal, gentamicina y
45 mercaptoetanol, ademas del hidrolizado de protelnas. No se ha mencionado el uso de este medio que contiene suero para la produccion recombinante de factores sangulneos.
[0008] La patente de los EE. UU. n° 5.393.668 A describe superficies sinteticas especiales que permiten el crecimiento de celulas adherentes en condiciones de ausencia de protelnas.
50
[0009] Para estimular la proliferacion celular se han multiplicado celulas CHO que sobreexpresan la insulina humana en un sustrato artificial al que la insulina se une covalentemente (Ito y col. 1996, PNAS U.S.A. 93: 35983601).
55 [0010] Reiter y col. (1992, Cytotechnology 9: 247-253) describen la inmovilizacion de celulas r-CHO crecidas
primeramente a alta densidad sobre vehlculos en un medio con suero y la subsiguiente perfusion de las celulas inmovilizadas en un medio sin protelnas durante la fase de produccion, en lo que se encontro una liberacion continua de protelna en el sobrenadante del cultivo celular. En ese caso las celulas se mantuvieron durante menos de 10 generaciones en el medio sin protelnas.
60
[0011] Los procedimientos anteriores para la preparacion satisfactoria de un cultivo celular a gran escala en condiciones de ausencia de protelnas han sido descritos para llneas celulares continuas; en particular, las celulas VERO (documento WO 96/15231). En este caso, las celulas se cultivan en condiciones de ausencia de suero y protelnas a partir de la ampolla original hasta una gran escala tecnica de 1.200 litros.
65
[0012] La adaptacion de las celulas crecidas inicialmente en condiciones de presencia de suero a un medio
sin protelnas es un proceso bastante problematico que normalmente requiere largo tiempo; ademas, se ha encontrado repetidamente que el rendimiento de la protelna expresada y la productividad de las celulas CHO recombinantes disminuye en gran medida despues de la adaptacion en un medio sin protelnas, en comparacion con las condiciones de presencia de suero (Paterson y col., 1994, Appl. Microbiol. Biotechnol. 40: 691-658). Esto es 5 consecuencia de una inestabilidad o de un crecimiento reducido de los clones recombinantes debido al cambio en las condiciones de cultivo. A pesar del uso de un clon original estable, a causa de la alteracion de las condiciones de fermentacion, repetidamente una gran parte de las celulas pasan a ser celulas con expresion reducida o tambien no productoras, que superan en crecimiento a las productoras de producto durante el proceso de produccion, con lo que finalmente el cultivo del fermentador consta fundamentalmente de celulas no productoras o de celulas con una 10 expresion baja. En la presente invencion hemos establecido una estrategia para desarrollar llneas celulares estables adaptadas a medios sin suero ni protelnas. Siguiendo esta estrategia se han aislado varios clones en un medio sin protelnas.
Descripcion detallada de la invencion:
15
Adaptacion de las tineas celulares a un medio sin proteinas en dos etapas.
[0013] Este procedimiento comprende llneas celulares de mamlfero, para las que no es posible llevar a cabo un procedimiento de adaptacion directo desde un medio suplementado con suero o sin suero a un medio sin
20 protelnas.
[0014] El procedimiento de la presente invencion consta de un proceso en dos etapas durante la adaptacion de llneas celulares a un medio sin protelnas (PFM).
25 [0015] La primera etapa, que se considera una etapa no crltica: la reduccion del contenido de protelna tiene lugar sin perdidas de la viabilidad celular y no se produce una disminucion importante del tiempo de duplication de la poblacion en cada paso de concentration de protelna. La etapa no crltica se observa habitualmente para una concentration de protelna total en el medio de cultivo entre 5 y 0,5 mg/ml y el cultivo muestra practicamente la misma velocidad de crecimiento que en el medio de cultivo inicial.
30
[0016] Esta primera etapa comienza con una viabilidad de la llnea celular entre el 80 y el 100% y las celulas se crecen en medios de cultivo con una reduccion consecutiva de la concentracion de protelna hasta una concentracion de protelna crltica a la que la viabilidad celular decae hasta el 0%. Esta concentracion de protelna es el punto inicial de la etapa siguiente.
35
[0017] La segunda etapa, que se considera la etapa crltica: en esta etapa se produce una disminucion de la viabilidad celular y del tiempo de duplicacion de la poblacion de las celulas y se necesitara mas tiempo para la adaptacion desde un paso de concentracion de protelna a otro. Existen concentraciones de protelna crlticas en el medio de cultivo que no es posible evitar durante el proceso de adaptacion. Estas concentraciones de protelna
40 crlticas son especlficas para cada llnea celular recombinante, pero habitualmente estan por debajo de 0,6 mg/ml. Una vez que las celulas han recuperado la viabilidad y la velocidad de crecimiento iniciales a estas concentraciones de protelna crlticas es posible llevar a cabo el subcultivo a la condition siguiente con menor concentracion de protelna.
45 [0018] Despues que se ha fijado la concentracion de protelna crltica, la concentracion superior mas proxima que permite el crecimiento celular se considera como la concentracion de protelna precrltica. A partir de la concentracion precrltica, la concentracion de protelna se reduce lentamente hasta que las celulas recuperan la viabilidad y la velocidad de crecimiento iniciales.
50 [0019] La combination seleccionada de pasos para reducir la concentracion de protelna en la etapa crltica determinara el tiempo de adaptacion total en esta etapa y la velocidad de adaptacion (Vadapt), calculada como la relacion:
55
_ A Con centra don de protelna AT adapt
[0020] Sin embargo, esta combinacion de pasos no tendra influencia sobre el tiempo necesario para la adaptacion a cada concentracion de protelna, incluyendo las concentraciones crlticas.
[0021] Para determinar el final de la etapa no crltica y las concentraciones de protelna crlticas es necesario 60 llevar a cabo una adaptacion por pasos, mediante diluciones seriadas del cultivo celular en el medio sin protelnas deseado, reduciendo la concentracion de protelna cada vez a la mitad (tabla 1). Esta reduccion puede realizarse mediante la disminucion de la concentracion de suero o suplementando el medio base con concentraciones diferentes de algun sustitutivo de suero rico en protelnas.
65 Tabla 1: Reduccion por pasos de la concentracion de protelna para determinar las concentraciones crlticas a partir
de un medio de cultivo suplementado con 5 mg/ml de proteina (equivalente a suero bovino fetal al 10%).
Numero de paso
Concentracion de proteina total mg/ml Equivalente de concentracion de FBS*, % v/v
1
5,000 10,00
2
2,500 5,00
3
1,250 2,50
4
0,625 1,25
5
0,312 0,60
6
0,156 0,30
7
0,000 0,00
Leyenda: FBS - suero bovino fetal PFM - medio sin proteinas SCM - medio con suero * Se considera que el contenido total de proteinas del suero bovino fetal es aproximadamente de 50 mg/ml.
[0022] Antes de comenzar el procedimiento de adaptacion, las celulas deberan mantenerse con una viabilidad superior al 80% en frascos T en el medio estandar empleado habitualmente para cultivar las celulas.
5
[0023] El proceso de adaptacion se lleva a cabo paso a paso siguiendo las etapas descritas a continuacion.
i. Siembra de tres pocillos en la placa de cultivo de seis pocillos con la llnea celular recombinante de mieloma de mamlfero en el medio de cultivo celular estandar (con la concentracion de proteina inicial). La densidad celular debera estar en el intervalo de 1 a 5 x 105 celulas/ml. Despues de 48 horas se sustituye la mitad del
10 sobrenadante por medio fresco sin protelnas, lo que resulta en una concentracion final de proteina que es el 50% de la condicion de partida.
ii. Cada 48 horas se sustituye completamente el sobrenadante por medio de cultivo fresco con una concentracion de proteina que es el 50% de la condicion de partida.
iii. Las celulas se dejan crecer hasta confluencia en el medio con el 50% de la concentracion inicial de
15 proteina.
iv. Las celulas del paso iii se siembran en al menos tres pocillos a una densidad en el intervalo de 1 a 5 x 105 celulas/ml en un medio de cultivo con una concentracion de proteina que es el 50% de la condicion de partida. Despues de 48 horas se sustituye la mitad del sobrenadante por medio fresco sin proteinas, lo que resulta en una concentracion final de proteina que es el 50% de la condicion anterior.
20 v. Cada 48 horas se sustituye completamente el sobrenadante por medio de cultivo fresco con una
concentracion de proteina que es el 50% de la condicion anterior.
vi. Las celulas se dejan crecer hasta confluencia en el medio con el 50% de la concentracion de proteina anterior.
vii. Se repiten los pasos (iv) a (vi) y durante cada ciclo la concentracion de proteina se reduce al 50%
25 de la concentracion del ciclo anterior. Este procedimiento se repite hasta alcanzar una concentracion de proteina
que causa la muerte celular.
viii. Se siembran celulas de un cultivo celular con una viabilidad del 80% o superior que crece en la concentracion de proteina precritica en al menos tres pocillos a una densidad en el intervalo de 2 a 6 x 105 celulas/ml. Las celulas se crecen en la concentracion de proteina precritica y despues de 48 horas se sustituye el
30 25% del sobrenadante por medio fresco sin proteinas, lo que resulta en una concentracion final de proteina que es el 75% de la concentracion de proteina precritica.
ix. Cada 48 horas se sustituye completamente el sobrenadante por medio de cultivo fresco con una concentracion de proteina que es el 75% de la concentracion de proteina precritica.
x. Las celulas se dejan crecer hasta confluencia en el medio con el 75% de la concentracion de
35 proteina precritica.
xi. Una linea celular derivada del paso anterior se siembra en al menos tres pocillos a una densidad en el intervalo de 2 a 6 x 105 en un medio que contiene el 75% de la concentracion de proteina precritica y despues de 48 horas se sustituye el 25% del sobrenadante del cultivo por medio fresco sin proteinas, lo que resulta en una concentracion final de proteina que es el 75% de la concentracion anterior.
40 xii. Cada 48 horas se sustituye completamente el sobrenadante por medio de cultivo fresco con una
concentracion de proteina que es el 75% de la concentracion anterior.
xiii. Las celulas se dejan crecer hasta confluencia en el medio con el 75% de la concentracion de proteina anterior.
xiv. Se repiten los pasos (xi) a (xiii), reduciendo la concentracion de proteina en cada ciclo hasta el
45 75% de la concentracion usada en el ciclo anterior, hasta alcanzar una concentracion de proteina tal que cuando las
celulas se transfieren a una concentracion inferior, crecen con una viabilidad y tiempo de duplicacion similares a los originales, de modo que una disminucion posterior de la concentracion de proteina no afecta a la viabilidad ni al tiempo de duplicacion.
50 [0024] En el procedimiento de la presente invencion el medio de cultivo inicial contiene suero bovino fetal en el intervalo del 5 al 10%.
[0025] La ilnea celular de mamlfero adaptada al crecimiento en un medio sin protelnas es un mieloma, en particular celulas NSO.
5 [0026] La presente invencion podrla ser util tambien al usar una llnea celular NSO transfectada con un polipeptido o una protelna recombinante que codifica un anticuerpo monoclonal humanizado hR3 dirigido contra el receptor de EGF, en particular cuando la llnea celular se transfecta con una secuencia que codifica un anticuerpo recombinante o fragmentos de este. Tambien se dan a conocer llneas celulares de mamlfero modificadas por el procedimiento de la presente invencion que crecen en un medio sin protelnas.
10
[0027] En este documento se da a conocer una llnea celular de mieloma de mamlfero que expresa un anticuerpo humanizado o quimerico hR3, dirigido contra el receptor de EGF o fragmentos de este que crece en un medio sin protelnas, as! como los anticuerpos secretados por estas llneas celulares.
15 [0028] Las llneas celulares obtenidas por el procedimiento de la presente invencion crecen de manera estable en un medio sin protelnas durante al menos 40 generaciones.
Ejemplos:
20 Ejemplo 1: Adaptacion de la llnea celular recombinante hR3 a un medio sin protelnas.
[0029] La llnea recombinante hR3 se obtuvo por transfeccion de la llnea celular de mieloma NSO con las construcciones de vectores para expresar las cadenas ligera y pesada del anticuerpo monoclonal humanizado hR3 dirigido contra el receptor de EGF.
25
[0030] La adaptacion de esta llnea celular al medio sin protelnas se llevo a cabo siguiendo el procedimiento descrito anteriormente, mediante la reduccion del contenido de protelna del medio en dos etapas.
[0031] Las celulas se cultivaron en el medio RPMI-1640 suplementado con FBS al 10%. El FBS se sustituyo 30 por la adicion del suplemento rico en protelna Nutridoma NS (Boehringer Mannheim) al medio RPMI-1640 sin
protelnas cuando la concentracion de protelnas alcanzo 0,15 mg/ml. La reduccion del contenido de protelna en el medio inicial se realizo por diluciones sucesivas con el medio PFHM-II sin protelnas (Gibco).
[0032] Las figuras 1 y 2, respectivamente, muestran los resultados del calculo de las concentraciones crlticas 35 y las velocidades de adaptacion Vadapt.
Ejemplo de referenda 2: Adaptacion de la llnea recombinante T1hT a un medio sin protelnas.
[0033] La llnea celular recombinante T1hT se obtuvo por transfeccion de la llnea celular de mieloma NSO con 40 las construcciones de vectores que expresan las cadenas ligera y pesada de un anticuerpo monoclonal dirigido
contra CD6 humano, humanizado por el procedimiento de supresion de epltopos T.
[0034] La adaptacion de esta llnea celular al medio sin protelnas se realizo siguiendo el procedimiento descrito en el punto 2, por reduccion del contenido de protelna del medio en dos etapas.
45
[0035] Estas celulas se cultivaron inicialmente en el medio RPMI-1640 suplementado con FBS al 10%. La reduccion del contenido de protelna se realizo por dilucion sucesiva del medio inicial con el medio PFHM-II sin protelnas de Gibco. Los resultados del calculo de las concentraciones crlticas y las velocidades de adaptacion Vadapt. se muestran en las figuras 3 y 4, respectivamente.
50
Ejemplo de referenda 3: Adaptacion de la llnea celular recombinante T3Q a un medio sin protelnas.
[0036] La llnea celular recombinante T3Q se obtuvo por transfeccion de la llnea celular de mieloma NSO con las construcciones de vectores que expresan las cadenas ligera y pesada del anticuerpo monoclonal humanizado
55 T3Q que reconoce el receptor CD3 en linfocitos humanos.
[0037] La adaptacion de esta llnea celular al medio sin protelnas se realizo siguiendo el procedimiento descrito en el punto 2, por reduccion del contenido de protelna del medio en dos etapas.
60 [0038] Estas celulas se cultivaron inicialmente en el medio RPMI-1640 suplementado con FBS al 10%. La reduccion del contenido de protelna se realizo por dilucion sucesiva en el medio PFHM-II sin protelnas de Gibco.
[0039] Los resultados del calculo de las concentraciones crlticas y de las velocidades de adaptacion Vadapt. se muestran en las figuras 5 y 6, respectivamente.
Breve descripcion de las figuras:
[0040]
Figura 1: correlacion entre el tiempo necesario para adaptar las celulas hR3 a cada concentracion de protelna (hasta recuperar la viabilidad y el tiempo de duplicacion) y el logaritmo natural del inverso de la concentracion de 5 protelna. Valores de las concentraciones crlticas para la llnea celular hR3: -0,32 y 0,11 mg/ml de concentracion de protelna total.
Figura 2: correlacion entre el tiempo total desde el comienzo del procedimiento de adaptacion y el logaritmo natural del inverso de la concentracion de protelna para la llnea celular hR3. Valor de la velocidad de adaptacion para la llnea celular hR3 durante la etapa crltica -0,0053 mg/d.
10 Figura 3: correlacion entre el tiempo necesario para adaptar las celulas T1hT a cada concentracion de protelna (hasta recuperar la viabilidad y el tiempo de duplicacion) y el logaritmo natural del inverso de la concentracion de protelna. Valores de las concentraciones crlticas para la llnea celular T1hT: -0,12 y 0,01 mg/ml de concentracion de protelna total.
Figura 4: correlacion entre el tiempo total desde el comienzo del procedimiento de adaptacion y el logaritmo natural
15 del inverso de la concentracion de protelna para la llnea celular T1hT. Valor de la velocidad de adaptacion para la
llnea celular T1hT -0,0014 mg/d.
Figura 5: correlacion entre el tiempo necesario para adaptar las celulas T3Q a cada concentracion de protelna (hasta recuperar la viabilidad y el tiempo de duplicacion) y el logaritmo natural del inverso de la concentracion de protelna. Valor de la concentracion crltica para la llnea celular T3Q: -0,63 mg/ml de concentracion de protelna total.
20 Figura 6: correlacion entre el tiempo total desde el comienzo del procedimiento de adaptacion y el logaritmo natural
del inverso de la concentracion de protelna para la llnea celular T3Q. Valor de la velocidad de adaptacion para la llnea celular T3Q -0,0172 mg/d.
[0041] Los aspectos y caracterlsticas de la presente description se establecen en las siguientes clausulas 25 numeradas que contienen la materia de las reivindicaciones de la presente solicitud tal como se presento.
1. Un procedimiento para obtener una llnea celular de mamlfero adaptada al crecimiento en medios sin suero ni protelnas que comprende dos etapas:
1. Una primera etapa en la que la viabilidad de la llnea celular esta entre el 80 y el 100% y las celulas se desarrollan en medios de cultivo con una reduction consecutiva de la concentracion de protelna hasta alcanzar una
30 concentracion de protelna crltica a la que la viabilidad celular disminuye hasta el 0%.
II. Una segunda etapa en la que, una vez que se ha predeterminado la concentracion crltica, la concentracion precrltica se fija como una concentracion de protelna tal a la que es posible el crecimiento celular y es el punto de partida para reducir lentamente la concentracion de protelna hasta que el cultivo celular alcanza la viabilidad celular y el tiempo de duplicacion de la poblacion iniciales.
35
2. El procedimiento segun la clausula 1, en el que la primera etapa esta compuesta de las etapas siguientes:
i. La siembra de tres pocillos en la placa de cultivo de seis pocillos con la llnea celular recombinante utilizando el medio de cultivo celular estandar (con la concentracion de protelna inicial). La densidad celular debe estar en el intervalo de 1 a 5 x 105 celulas/ml. Despues de 48 horas, se sustituye una mitad del sobrenadante por medio fresco
40 sin protelnas, lo que resulta en una concentracion final de protelna que es el 50% de la condition de partida.
ii. Cada 48 horas se sustituye completamente el sobrenadante por medio de cultivo fresco con una concentracion de protelna que es el 50% de la condicion de partida.
iii. Las celulas crecen hasta una confluencia en el medio con el 50% de la concentracion inicial de protelna.
iv. Las celulas de la etapa iii se siembran en al menos 3 pocillos a una densidad en el intervalo de 1 a 5 x 105 45 celulas/ml en un medio de cultivo con una concentracion de protelna que es el 50% de la condicion de partida.
Despues de 48 horas se sustituye la mitad del sobrenadante por medio fresco sin protelnas, lo que resulta en una concentracion final de protelna que es el 50% de la condicion anterior.
v. Cada 48 horas se sustituye completamente el sobrenadante por medio de cultivo fresco con una concentracion de protelna que es el 50% de la condicion anterior.
50 vi. Las celulas se desarrollan hasta una confluencia en el medio que contiene el 50% de la concentracion de protelna anterior.
vii. Se repiten las etapas (iv) a (vi), en que durante cada ciclo la concentracion de protelna se reduce al 50% de la concentracion del ciclo anterior. Este procedimiento se repite hasta que se alcanza una concentracion de protelna que causa la muerte celular.
55
3. El procedimiento segun la clausula 1, en el que la segunda etapa esta compuesta de las etapas siguientes:
viii. Las celulas se siembran a partir de un cultivo celular con una viabilidad del 80% o superior que crece en la concentracion de protelna precrltica en al menos tres pocillos a una densidad en el intervalo de 2 a 6 x 105 celulas/ml. Las celulas se desarrollan en la concentracion de protelna precrltica y, despues de 48 horas el 25% del
60 sobrenadante se sustituye por medio fresco sin protelnas, lo que resulta en una concentracion final de protelna que es el 75% de la concentracion de protelna precrltica.
ix. Cada 48 horas se sustituye completamente el sobrenadante por medio de cultivo fresco con una concentracion de protelna que es el 75% de la concentracion de protelna precrltica.
x. Las celulas se desarrollan hasta una confluencia en el medio que contiene el 75% de la concentracion de protelna 65 previa.
xi. Se siembran llneas celulares derivadas de la etapa anterior en al menos tres pocillos a una densidad en el
intervalo de 2 a 6 x 105 celulas/ml en un medio que contiene el 75% de la concentracion de protelna precrltica y despues de 48 horas, el 25% del sobrenadante de cultivo se sustituye por medio fresco sin protelnas, lo que resulta en una concentracion final de protelna que es el 75% de la concentracion anterior.
xii. Cada 48 horas se sustituye completamente el sobrenadante por medio de cultivo fresco con una concentracion 5 de protelna que es el 75% de la anterior.
xiii. Las celulas se desarrollan hasta una confluencia en el medio que contiene el 75% de la concentracion de protelna previa.
xiv. Se repiten las etapas (xi) a (xiii), reduciendo la concentracion de protelna en cada ciclo hasta el 75% de la usada en el ciclo anterior, hasta alcanzar una concentracion de protelna tal que cuando las celulas se transfieren a una
10 concentracion inferior, crecen con una viabilidad y tiempo de duplicacion similares a los originales, de modo que una disminucion posterior de la concentracion de protelna no afecta ni a la viabilidad ni al tiempo de duplicacion.
4. El procedimiento segun las clausulas 1 a 3, en el que el medio que contiene suero y protelnas en el que las celulas se siembran inicialmente comprende entre el 5 y el 10% de suero bovino fetal.
15
5. El procedimiento segun las clausulas 1 a 4, en el que la llnea celular de mamlfero adaptada al crecimiento en un medio libre de suero y protelnas es un mieloma.
6. El procedimiento segun la clausula 5, en el que el mieloma es la llnea celular NSO.
20
7. El procedimiento segun la clausula 6, en el que dicha llnea celular NSO contiene una secuencia que codifica un polipeptido recombinante o una protelna recombinante.
8. El procedimiento segun la clausula 7, en el que la secuencia que codifica un polipeptido recombinante o una 25 protelna recombinante codifica un anticuerpo recombinante o un fragmento de este.
9. Una llnea celular de mamlfero obtenida mediante el procedimiento de la clausula 1 a 8, en la que dicha llnea celular esta adaptada al crecimiento en un medio libre de suero y protelnas.
30 10. Una llnea celular de mamlfero segun la clausula 9, en la que dicha llnea celular es un mieloma.
11. Una llnea celular de mamlfero segun la clausula 10, en la que dicha llnea celular es la llnea celular NSO.
12. Una llnea celular de mamlfero segun la clausula 11, en la que la llnea celular NSO contiene una secuencia que 35 codifica un polipeptido recombinante o una protelna recombinante.
13. Una llnea celular de mamlfero segun la clausula 12, en la que la secuencia que codifica un polipeptido recombinante o una protelna recombinante codifica un anticuerpo recombinante o un fragmento de este.
40 14. Una llnea celular de mamlfero segun la clausula 13, en la que la secuencia codifica el anticuerpo humanizado recombinante hR3 dirigido contra EGF-R o un fragmento de este.
15. Una llnea celular de mamlfero segun la clausula 13, en la que la secuencia codifica el anticuerpo humanizado recombinante T1hT dirigido contra CD6 o un fragmento de este.
45
16. Una llnea celular de mamlfero segun la clausula 13, en la que la secuencia codifica el anticuerpo quimerico recombinante T3Q dirigido contra CD3 o un fragmento de este.
17. Utilizacion del procedimiento segun las clausulas 1 a 8 para obtener una llnea celular de mamlfero adaptada al 50 crecimiento en un medio libre de suero y protelnas.
18. El anticuerpo monoclonal humanizado hR3 dirigido contra el receptor de EGF o fragmentos de este secretados por las llneas celulares obtenidas mediante el procedimiento de las clausulas 1 a 8.
55 19. El anticuerpo monoclonal humanizado T1hT dirigido contra el antlgeno CD6 o fragmentos de este secretados por las llneas celulares obtenidas mediante el procedimiento de las clausulas 1 a 8.
20. El anticuerpo monoclonal humanizado T3Q dirigido contra el antlgeno CD3 o fragmentos de este secretados por las llneas celulares obtenidas mediante el procedimiento de las clausulas 1 a 8.

Claims (3)

  1. REIVINDICACIONES
    1. Procedimiento para producir anticuerpo monoclonal humanizado hR3 dirigido contra el receptor de EGF o fragmentos de este en medios sin suero ni protelnas que comprende adaptar una llnea celular de mieloma de
    5 mamlfero recombinante transfectada con una secuencia que codifica dicho anticuerpo monoclonal humanizado hR3 dirigido contra el receptor de EGF o fragmentos de este, a un crecimiento en medio sin suero ni protelnas mediante un procedimiento que comprende:
    I. Una primera etapa en la que la viabilidad de la llnea celular esta entre el 80 y el 100% y las celulas se desarrollan en medios de cultivo con una reduccion consecutiva de la concentracion de protelna hasta alcanzar
    10 una concentracion de protelna crltica a la que la viabilidad celular disminuye hasta el 0%; y
    II. una segunda etapa en la que, una vez que se ha predeterminado la concentracion crltica, la concentracion precrltica se fija como una concentracion de protelna tal a la que es posible el crecimiento celular y es el punto de partida para reducir lentamente la concentracion de protelna hasta que el cultivo celular alcanza la viabilidad celular y el tiempo de duplicacion de la poblacion iniciales.
    15
  2. 2. Procedimiento, segun la reivindicacion 1, en el que la llnea celular de mieloma es la llnea celular NSO.
  3. 3. Procedimiento, segun la reivindicacion 1 o la reivindicacion 2, en el que el procedimiento para producir el anticuerpo monoclonal humanizado hR3 dirigido contra el receptor de eGf o fragmentos de este comprende
    20 ademas la etapa de obtener el anticuerpo monoclonal humanizado hR3 dirigido contra el receptor de EGF o fragmentos de este.
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