CN1714147A - 无蛋白培养基中获得细胞系的方法以及用此方法获得的细胞系 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种获得适应无血清和蛋白的培养基的哺乳动物细胞的方法。本发明方法包括由两个适应步骤组成的过程，包括临界蛋白浓度间隔，其中细胞必须获得在无蛋白质的培养基中存活的能力。对于每一细胞系有特定的临界蛋白浓度间隔。而且，本发明中也公开了哺乳动物细胞系，其在无血清和蛋白的培养基中至少稳定生长40代。本发明进一步涉及克隆，所述克隆表达抗－CD6 T1hT和EGFhR3抗受体人源化的抗体和抗－CD3T3Q嵌合抗体以及所述抗体的片段。
Description
发明领域
本发明涉及生物技术，尤其涉及一种通过两阶段适应过程重获适应无血清和蛋白的培养基的稳定细胞克隆的方法。
发明背景
由于哺乳动物细胞产生的许多产物具有诊断和治疗潜能，所以自从开发出了哺乳动物细胞体外培养，大规模生产这些细胞的需求已经增加。这些有用的因子包括单克隆抗体、人生长激素、淋巴因子、***、凝血因子和组织纤溶酶原激活物。
重组单克隆抗体(rMab)用于各种疾病的治疗和体内诊断意味着在许多病例中使用高剂量治疗。这一事实使得大量生产高纯度目的rMab成为必然。
几个在癌症以及自身免疫疾病的诊断和治疗中具有潜在用途的重组单克隆抗体已经由分子免疫学中心(Center of MolecularImmunology)在NSO骨髓瘤细胞中进行了表达。US 5,891,996描述了获得嵌合的和人源化的针对表皮生长因子受体(EGF-R)的抗体，在对表达所述受体的肿瘤的诊断和治疗中很有用处。WO 97/19111描述了在诊断和治疗牛皮癣患者中有用处的抗-CD6单克隆抗体。Gavilondo等人在Hybridoma 9 No.5，1999报道了称为IOR-T3a的抗CD3单克隆抗体。对于无蛋白质的培养条件，已经开发了多种技术。因此开发了无蛋白质的明确定义的完全培养基，其允许细胞在无蛋白质的条件下生长。WO 97/05240描述了在无蛋白条件下表达重组蛋白。
JP 2696001描述了使用无蛋白培养基在CHO细胞中产生因子VIII，通过加入非离子表面活性剂或者环糊精来提高宿主细胞的生产力。为了提高这些添加剂的效力，推荐加入，例如，丁酸盐和锂。
WO 96/26266描述了在一种含有含谷氨酰胺蛋白水解产物的培养基中培养细胞，其中水解产物的游离氨基酸含量少于蛋白质总重量的15％，其中肽分子量小于44kD。作为细胞培养用的培养基，合成的基本培养基用作基本培养基，除其它因素外，还加入胎牛血清、庆大霉素、巯基乙醇和蛋白水解产物。尚无人提到用该含血清培养基重组生产血液因子。
U.S.Pat.No.5,393,668A描述了允许贴壁细胞在无蛋白条件下生长的特殊合成表面。
为了刺激细胞增殖，过表达人胰岛素的CHO细胞在一种共价结合胰岛素的人造基质上增殖(Ito等人.1996 PNAS U.S.A.93：3598-3601)。
Reiter等(1992.Cytotechnology9：247-253)描述了将起初在含血清的培养基中高密度生长的r-CHO细胞固定在载体上，随后在生产期间将固定的细胞灌流到不合蛋白质的培养基中，其中发现蛋白质连续释放到细胞培养上清中。其中细胞在无蛋白培养基中保存了不到10代。
前面在无蛋白条件下成功制备连续细胞系大规模细胞培养物的方法已有人描述了；尤其是VERO细胞(WO 96/15231)。其中细胞在无血清和蛋白的条件下培养，从最初的安瓿生长到1200升的大工业规模。
使最初生长在含有血清的条件下的细胞适应没有蛋白的培养基通常是一个要花费很多时间相当麻烦的过程；此外，有人重复发现在适应了无蛋白培养基之后，重组CHO细胞表达蛋白的得率和生产力比在含血清条件下下降很多(Paterson等人.1994.Appl.Microbiol.Biotechnol.40：691-658)。这是重组克隆因改变了培养条件而不稳定或者减缓生长的结果。尽管使用了稳定的初始克隆，由于改变了发酵条件，不断有大部分细胞变成表达降低细胞或者非生产者，它们在生产过程中的生长超过了产物生产者，藉此发酵罐培养物最终主要由非生产者或者低水平表达的此类细胞组成。
我们在本发明中建立了培育适应无血清和蛋白培养基的稳定细胞系的方法。
发明详述
细胞系对无蛋白培养基的两阶段适应
这一过程包括哺乳动物细胞系，不能对它采取从补充血清或者无血清的培养基到无蛋白培养基的直接一步适应。
本发明的方法包括细胞系适应无蛋白血清(PFM)期间的一个两阶段过程。
被视作非临界阶段的第一步：降低蛋白含量而不损失细胞活力，在每一步蛋白浓度下群体倍增时间没有显著下降。此非临界阶段常常在培养基总蛋白浓度5到0.5mg/ml时观察到，培养物显示了与在初始培养基中几乎相同的生长速率。
第一阶段开始用活力介于80和100％的细胞系，且细胞培养基蛋白浓度连续降低直到某一临界蛋白浓度，此时细胞活力降至0％。这个蛋白浓度作为下一阶段的起始点。
被视作临界阶段的第二步：在此阶段细胞活力和群体倍增时间都会下降，从一步蛋白浓度适应另一步蛋白浓度需要更多的时间。培养基有多个临界蛋白浓度，在适应过程中不能绕过它们。这些临界蛋白浓度对每一重组细胞系特异，但一般低于0.6mg/ml。一旦细胞在这些临界蛋白浓度恢复了初始活力和生长速率，就可以在后面更低蛋白浓度条件下继代培养。
一旦临界蛋白浓度确定下来，其界定的支持细胞生长的较高蛋白浓度即被视为临界前蛋白浓度。从临界前蛋白浓度开始慢慢降低蛋白浓度直到细胞恢复初始活力和生长速率。
选定的降低临界阶段蛋白浓度的步骤组合将决定这一阶段的总适应时间和适应速率(Vadapt.)，它们的关系由下式计算：
但是这一步骤组合对每一蛋白浓度(包括临界浓度)所需的适应时间没有影响。
为确定非临界阶段何时结束以及临界蛋白浓度，有必要进行逐步适应，在想要的无蛋白培养基中系列稀释细胞培养物，每次把蛋白浓度降低两倍(表1)。降低可以通过降低血清浓度或者补加含有不同水平富含蛋白质血清替代物的基础培养基来完成。
表1：从补加5mg/ml蛋白质(等同于10％胎牛血清)的培养基开始逐步降低蛋白浓度以确定临界浓度。
| 步骤数 | 总蛋白浓度mg/ml | 等同的FBS浓度*％V/V |
| 1 | 5.000 | 10.00 |
| 2 | 2.500 | 5.00 |
| 3 | 1.250 | 2.50 |
| 4 | 0.625 | 1.25 |
| 5 | 0.312 | 0.60 |
| 6 | 0.156 | 0.30 |
| 7 | 0.000 | 0.00 |
图例：FBS-胎牛血清
PFM-无蛋白培养基
SCM-含血清培养基
*胎牛血清总蛋白含量视为约50mg/ml。
在起始适应过程前，细胞应保存在T-烧瓶中的细胞培养常用标准培养基里，活力超过80％。
在下述阶段，适应步骤一步一步进行。
i.使用标准细胞培养基(以初始蛋白浓度)，在六孔培养板的3孔中接种重组细胞系。细胞浓度应介于1到5×105细胞/ml之间。48小时后，一半上清液用新鲜的无蛋白培养基替换，这样得到为初始条件50％的蛋白终浓度。
ii.每48小时上清液用蛋白浓度为起始条件50％的新鲜培养基彻底置换。
iii.在此蛋白浓度下细胞长至汇合。
iv.步骤iii的细胞接种到至少3孔蛋白浓度为起始条件50％的培养基中，浓度介于1到5×105细胞/ml之间。48小时后，一半上清液用新鲜的无蛋白培养基替换，这样制成为前一条件50％的蛋白终浓度。
v.每48小时上清液用蛋白浓度为前一条件50％的新鲜培养基彻底置换。
vi.在此蛋白浓度下细胞长至汇合。
vii.重复步骤(iv)到(vi)，每个循环中蛋白浓度降至前一个循环浓度的50％。重复这一过程直至达到引起细胞死亡的蛋白质浓度。
viii.把在临界前蛋白浓度中生长的活力80％或者更高的细胞培养物中的细胞接种到至少3孔中，浓度在2到6×105细胞/ml。在临界前蛋白浓度中培养细胞，48小时后，25％的上清液用新鲜的无蛋白培养基替换，这样制成为所述临界前蛋白浓度75％的蛋白终浓度。
ix.每48小时上清液用蛋白浓度为所述临界前蛋白浓度75％的新鲜培养基彻底置换。
x.在此蛋白浓度下细胞长至汇合。
xi.步骤(x)的细胞接种到至少3孔蛋白浓度为所述临界前蛋白浓度75％的培养基中，浓度介于2到6×105细胞/ml之间。48小时后，25％上清液用新鲜的无蛋白培养基替换，这样制成为前一步骤浓度75％的蛋白终浓度。
xii.每48小时上清液用蛋白浓度为步骤(x)中浓度的75％的新鲜培养基彻底置换。
xiii.在此蛋白浓度下细胞长至汇合。
xiv.重复步骤(xi)到(xiii)，每个循环中蛋白浓度降至前一个循环浓度的75％。重复这一过程直至达到一个不造成细胞活力丢失或者倍增时间下降的蛋白质浓度。
如果在第一次继代培养之前把细胞转移到低蛋白浓度培养基而它们能够生长，并且细胞活力不丢失，倍增时间不下降，则我们可以认为细胞已经又一次达到非临界阶段并把它直接接种到无蛋白培养基中(蛋白浓度0mg/ml)。
在本发明的过程中，起始培养基含有5到10％的胎牛血清。
已在无蛋白培养基中适应生长的哺乳动物细胞系为骨髓瘤细胞，尤其是NSO细胞。
本发明也可能在使用多肽或者重组蛋白转染的，尤其是用编码重组抗体或者其片段的序列转染的NSO细胞系的时候有用。在无蛋白培养基中培养的用本发明的过程修饰了的哺乳动物细胞系也被公开。
在本发明不同的实施例中，公开了任何生长于无蛋白培养基并且表达选自抗EGF受体hR3、抗-CD6 T1hT、抗CD3 T3Q抗体或者它们的片段的人源化或者嵌合抗体的哺乳动物细胞系，以及被此细胞系分泌的抗体。
本发明方法获得的细胞系能在无蛋白培养基中稳定生长至少40代。
实施例：
实施例1：使重组细胞系hR3适应无蛋白培养基。
用表达人源化抗EGF人类受体hR3单克隆抗体轻链和重链的载体构建体转化骨髓瘤NSO细胞系得到重组细胞系hR3。按前述过程，通过两阶段降低培养基蛋白含量进行此细胞系对无蛋白培养基的适应。在添加了10％FBS的RPMI-1640培养基中培养这些细胞。当蛋白浓度为0.15mg/ml时，通过向RPMI-1640无蛋白培养基中加入蛋白补料Nutridoma NS(Boheringer Manheinn)替换FBS。用PFHM-II无蛋白培养基(Gibco)连续稀释来降低起始培养基的蛋白浓度。
图.1和2分别表示临界浓度和适应速率Vadapt.的计算结果。
实施例2：使重组细胞系T1hT适应无蛋白培养基。
通过表位T抑制方法用表达人源化抗人CD6单克隆抗体轻链和重链的载体构建体转化骨髓瘤NSO细胞系得到重组细胞系T1hT。按第2点描述的过程，通过两阶段降低培养基蛋白含量进行此细胞系对无蛋白培养基的适应。在添加了10％FBS的RPMI-1640培养基中培养这些细胞。用Gibco的PFHM-II无蛋白培养基连续稀释初始培养基来降低蛋白含量。
临界浓度和适应速率Vadapt.的计算结果分别示于图3和4。
实施例3：使重组细胞系T3Q适应无蛋白培养基。
用表达人源化单克隆抗体T3Q轻链和重链的载体构建体转化骨髓瘤NSO细胞系得到重组细胞系T3Q，其中所述单克隆抗体T3Q能够识别人类淋巴细胞上的CD3受体。按第2点描述的过程，通过两阶段降低培养基蛋白含量进行此细胞系对无蛋白培养基的适应。最初在添加了10％FBS的RPMI-1640培养基中培养这些细胞。用Gibco的PFHM-II无蛋白培养基连续稀释来降低蛋白含量。
临界浓度和适应速率Vadapt.的计算结果分别示于图5和6。
附图简述
图1：hR3细胞适应每个蛋白浓度所需的时间(直到恢复了活力和倍增时间)与蛋白质浓度倒数的自然对数之间的相关性。h-R3细胞系的临界浓度值：-0.32和0.11mg/ml总蛋白浓度。
图2：从适应过程开始算起的总时间与针对h-R3细胞系的蛋白质浓度倒数的自然对数之间的相关性。h-R3细胞系在临界阶段的适应速率值-0.0053mg/d。
图3：T1hT细胞适应每个蛋白浓度所需的时间(直到恢复了活力和倍增时间)与蛋白质浓度倒数的自然对数之间的相关性。针对T1hT细胞系的临界浓度值：-0.12和0.01mg/ml总蛋白浓度。
图4：从适应过程开始算起的总时间与针对T1hT细胞系的蛋白质浓度倒数的自然对数之间的相关性。T1hT细胞系的适应速率值-0.0014mg/d。
图5：T3Q细胞适应每个蛋白浓度所需的时间(直到恢复了活力和倍增时间)与蛋白质浓度倒数的自然对数之间的相关性。T3Q细胞系的临界浓度值：-0.63mg/ml总蛋白浓度。
图6：从适应过程开始算起的总时间与T3Q细胞系的蛋白质浓度倒数的自然对数之间的相关性。T3Q细胞系的适应速率值-0.0172mg/d。
Claims (20)
1.一种获取适应在无血清和蛋白质的培养基中生长的哺乳动物细胞系的方法，它包括两个阶段：
I.第一阶段，其中细胞系活力介于80和100％之间，并且细胞生长在蛋白浓度连续降低的培养基中，其中该蛋白浓度一直降至某一临界蛋白浓度，在该临界蛋白浓度时细胞活力降至0％，
II.第二阶段，其中临界蛋白浓度一旦预先确定下来，则确定临界前浓度为细胞能在其中生长的蛋白浓度，并将它作为缓慢降低蛋白浓度直到细胞培养物达到初始细胞活力和倍增时间的起始点。
2.权利要求1的方法，其中第一阶段包括下列步骤：
i.使用标准细胞培养基(以初始蛋白浓度)，在六孔培养板的3孔中接种重组细胞系，细胞浓度应介于1到5×105细胞/ml之间，48小时后，一半上清液用新鲜的无蛋白培养基替换，这样制成为初始条件50％的蛋白终浓度；
ii.每48小时，上清液用蛋白浓度为起始条件50％的新鲜培养基彻底置换；
iii.在此蛋白浓度下细胞生长至汇合；
iv.步骤iii的细胞接种到至少3孔蛋白浓度为起始条件50％的培养基中，浓度介于1到5×105细胞/ml之间，48小时后，一半上清液用新鲜的无蛋白培养基替换，这样制成为前一条件50％的蛋白终浓度；
v.每48小时，上清液用蛋白浓度为前一条件50％的新鲜培养基彻底置换；
vi.在此蛋白浓度下细胞生长至汇合；
vii.重复步骤(iv)到(vi)，每个循环中蛋白浓度降至前一个循环浓度的50％，重复这一过程直至达到引起细胞死亡的蛋白质浓度。
3.权利要求1中的方法，其中第二阶段包括下列步骤：
viii.把在临界前蛋白浓度中生长的活力80％或者更高的细胞培养物中的细胞接种到至少3孔中，浓度在2到6×105细胞/ml，在临界前蛋白浓度中培养细胞，48小时后，25％的上清液用新鲜的无蛋白培养基替换，这样制成为临界前蛋白浓度75％的蛋白终浓度；
ix.每48小时，上清液用蛋白浓度为所述临界前蛋白浓度75％的新鲜培养基彻底置换；
x.在此蛋白浓度下细胞生长至汇合；
xi.将步骤(x)的细胞接种在至少3孔蛋白浓度为所述临界前蛋白浓度的75％的培养基中，浓度为2-6×105细胞/mL，48小时后，用新鲜的无蛋白培养基替换25％上清液，从而得到为前一步浓度75％的蛋白终浓度；
xii.每48小时，上清液用蛋白浓度为步骤(x)中浓度75％的新鲜培养基彻底置换；
xiii.在此蛋白浓度下细胞生长至汇合；
xiv.重复步骤(xi)到(xiii)，每个循环中蛋白浓度降至前一个循环浓度的75％，重复这一过程直至达到不造成任何细胞活力丢失或者倍增时间下降的蛋白质浓度，当在第1次继代培养前，所述细胞转移到蛋白浓度更低的培养基中，并且它们能够生长而不丢失任何细胞活力，并且群体倍增时间也不减少，则我们认为细胞再次达到了非临界阶段，并将其直接接种在无蛋白培养基(0mg/mL蛋白浓度)。
4.权利要求1至3中的方法，其中细胞最初接种的含有血清和蛋白的培养基含有5％到10％的胎牛血清。
5.权利要求1至4中的方法，其中适合在无血清和蛋白的培养基中生长的哺乳动物细胞系为骨髓瘤细胞。
6.权利要求5中的方法，其中的骨髓瘤细胞为NSO细胞系。
7.权利要求6中的方法，其中所述的NSO细胞系包含重组多肽或者重组蛋白的编码序列。
8.权利要求7中的方法，其中所述重组多肽或者重组蛋白的编码序列编码重组抗体或其片段。
9.权利要求1到8中的方法获取的哺乳动物细胞系，其中所述细胞系适应在无血清和蛋白的培养基中生长。
10.权利要求9中的哺乳动物细胞系，其中所述的细胞系为骨髓瘤细胞。
11.权利要求10中的哺乳动物细胞系，其中所述的细胞系为NSO细胞系。
12.权利要求11中的哺乳动物细胞系，其中所述NSO细胞系包含重组多肽或者重组蛋白的编码序列。
13.权利要求12中的哺乳动物细胞系，其中所述重组多肽或者重组蛋白的编码序列编码重组抗体或其片段。
14.权利要求13中的哺乳动物细胞系，其中所述序列编码人源化重组抗体抗EGF-R hR3或其片段。
15.权利要求13中的哺乳动物细胞系，其中所述序列编码人源化重组抗CD6抗体T1hT或其片段。
16.权利要求13中的哺乳动物细胞系，其中所述序列编码嵌合重组抗CD3抗体T3Q或其片段。
17.权利要求1至8中的方法在获得适应在无血清和蛋白的培养基中生长的哺乳动物细胞系中的应用。
18.权利要求1至8的方法获得的细胞系分泌的抗EGF-R hR3的人源化单克隆抗体或其片段。
19.权利要求1至8的方法获得的细胞系分泌的抗CD6抗原T1hT的人源化单克隆抗体或其片段。
20.权利要求1至8的方法获得的细胞系分泌的抗CD3抗原T3Q的嵌合单克隆抗体或其片段。
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