PT1564285E

PT1564285E - Processo para a obtenção de linhas de células de mieoloma de mamífero recombinantes adaptadas para crescer em meio isento de soro e de proteínas

Info

Publication number: PT1564285E
Application number: PT03757654T
Authority: PT
Inventors: Rolando Perez Rodriguez; Adolfo Castillo Vitlloch; Svieta Vitores Sarazola; Tammy Boggiano Ayo; Luis Rojas Del Calvo
Original assignee: Centro Inmunologia Molecular
Priority date: 2002-10-23
Filing date: 2003-10-22
Publication date: 2011-04-20
Also published as: WO2004038010A1; CA2503315A1; GEP20084444B; HRP20050760A2; UY28037A1; ECSP055740A; PE20040552A1; MY144088A; EP1564285B1; KR20050088403A; LT2005053A; JP4674087B2; DK1564285T3; DE60336415D1; ATE502103T1; EP2363418A2; EP2363418B1; LV13361B; US20100197011A1; KR101186048B1

Description

DESCRIÇÃO

PROCESSO PARA A OBTENÇÃO DE LINHAS DE CÉLULAS DE MIEOLOMA DE MAMÍFERO RECOMBINANTES ADAPTADAS PARA CRESCER EM MEIO ISENTO DE SORO E DE PROTEÍNAS

Domínio da invenção A presente invenção refere-se à biotecnologia, especificamente a um processo para a recuperação de clones de células estáveis adaptados a um meio isento de soro proteínas, por meio de um processo de adaptação em duas fases.

Antecedentes da invenção

Dado que o desenvolvimento da cultura in vitro de células de mamíferos aumentou a procura da produção em larga escala destas células devido ao potencial quer de diagnóstico quer terapêutico de muitos dos produtos que elas produzem. Estes agentes úteis incluem anticorpos monoclonais, hormona do crescimento humano, linfocinas, eritropoietina, factores de coagulação do sangue e activadores do plasminogénio dos tecidos. A utilização de anticorpos monoclonais recombinantes (Acmr) para a terapia e o diagnóstico in vivo de diferentes doenças implica, em muitos casos, a utilização de tratamentos com doses elevadas. Este facto torna necessária a produção de grande quantidade do Acmr de interesse, com uma pureza muito elevada. 1 Vários anticorpos monoclonais recombinantes com uma potencial utilização na terapia e no diagnóstico do cancro e de doenças autoimunes têm sido expressos em células de mieloma NSO no Center of Molecular Immunology. A patente norte-americana US 5.891.996 descreve a obtenção de anticorpos guiméricos e humanizados contra o receptor do factor do crescimento epidérmico (R-FCE), útil no diagnóstico e na terapia de tumores que expressam o referido receptor. A patente WO 97/19111 descreve anticorpos monoclonais anti-CD6 úteis no diagnóstico e na terapia de pacientes que sofrem de psoriase. Gavilondo et al. em Hybridoma 9 No.5, 1999 relataram um anticorpo monoclonal anti-CD3 designado por I0R-T3a.

Desenvolveram-se várias técnicas para condições de cultura isentas de proteínas. Assim, desenvolveram-se meios completos, isentos de proteínas, especificamente definidos, que permitem o crescimento das células em condições isentas de proteínas. A patente WO 97/05240 descreve a expressão de proteínas recombinantes em condições isentas de proteínas. A patente JP 2696001 descreve a utilização de um meio isento de proteína para a produção do factor VIII em células de OHC (ovário de hamster chinês), por meio da adição de um agente tensioactivo não iónico ou de ciclodextrina para aumentar a produtividade das células hospedeiras. Para aumentar a eficácia destes aditivos, recomenda-se, por exemplo, a adição de butirato e lítio. A patente WO 96/26266 descreve a cultura de células num meio que contém um hidrolisado de proteína contendo glutamina cujo teor em aminoácidos livres é inferior a 15 % do peso total da proteína e cujos péptidos têm um peso molecular inferior a 44 kD. Como meio de cultura, para as 2 culturas de células, utiliza-se um meio sintético minimo como o meio básico ao qual se adiciona, inter alia, soro bovino fetal, gentamicina e mercapto-etanol, para além do hidrolisado de proteína. A utilização deste meio contendo soro, para a produção recombinante de factores sanguíneos não foi mencionada. A patente norte-americana U.S. No. 5.393.668 A descreve superfícies sintéticas especiais que permitem o crescimento de células aderentes, em condições isentas de proteína.

Para estimular a proliferação de células, as células de OHC que sobre-expressam insulina humana foram multiplicadas num substrato artificial ao qual a insulina de liga por covalência (Ito et al. 1996 PNAS U.S.A. 93: 3598-3601).

Reiter et al. (1992. Cytotechnology 9: 247-253) descrevem a imobilização de células de OHC-r que cresceram primeiro em meio contendo soro com uma elevada densidade em veículos e a subsequente perfusão das células imobilizadas em meio isento de proteínas durante a fase de produção, em que se observou uma libertação contínua da proteína no sobrenadante da cultura de células. Depois, mantiveram-se as células em meio isento de proteína durante menos de 10 gerações. Já foram descritos antes processos para uma preparação bem sucedida de uma cultura de células em larga escala em condições isentas de proteínas, em particular para células VERO (WO 96/15231) . Depois, as células cresceram em condições isentas de soro e isentas de proteínas a partir 3 da ampola original até a uma larga escala técnica de 1200 litros.

Adaptar células que cresceram inicialmente em condições contendo soro até a um meio isento de proteínas é um processo bastante complicado que normalmente demora muito tempo; além disso, tem-se verificado, repetidamente, que o rendimento de proteína expressa e a produtividade de células recombinantes de OHC cai bastante após a adaptação em meio isento de proteínas quando se compara com condições contendo soro (Paterson et al. 1994. Appl. Microbiol. Biotechnol. 40: 691-658). Isto é a consequência de uma instabilidade ou de um crescimento reduzido dos clones recombinantes devido à alteração das condições de cultura. Apesar da utilização de um clone original estável, tendo em conta as condições de fermentação alteradas, repetidamente, uma grande porção de células torna-se em células com uma expressão reduzida, com um sobre-crescimento dos produtores do produto durante o processo de produção, em que a cultura do fermentador consiste, no final, em não produtores dessas células com uma baixa expressão.

Na presente invenção, os requerentes estabeleceram uma abordagem para desenvolver linhas de células estáveis adaptadas a um meio isento de soro e isento de proteínas. Seguindo esta abordagem, isolaram-se vários clones em meio isento de proteína.

Descrição detalhada da invenção

Adaptação, em duas etapas, de linhas de células, ao meio isento de proteínas. 4 células

Este processo compreende linhas de recombinantes de mieloma de mamífero, para as quais não é possível realizar directamente um procedimento de adaptação do meio complementado com soro ou isento de soro para um meio isento de proteína. 0 processo da presente invenção consiste num processo em duas etapas durante a adaptação das linhas de células a um meio isento de proteínas (MIP).

Primeira etapa, que é considerada como uma etapa não crítica: a redução do teor de proteína ocorre sem a perda da viabilidade da célula e não há nenhum decréscimo importante no tempo de duplicação da população em cada etapa de concentração de proteínas. A etapa não crítica observa-se normalmente entre 5 e 0,5 mg/mL da concentração total de proteína no meio de cultura e a cultura exibe quase a mesma taxa de crescimento que no meio de cultura inicial. A primeira etapa começa com a viabilidade da linha de células entre 80 e 100 % e as células crescem no meio de cultura com a consecutiva redução da concentração de proteínas até a uma concentração crítica das proteínas em que a viabilidade das células cai para 0 %. Esta concentração de proteínas é o ponto de partida para a etapa seguinte.

Segunda etapa, que é considerada como uma etapa crítica: nesta etapa, ocorre uma diminuição na viabilidade das células e o tempo de duplicação da população de células será maior para se adaptar de uma etapa de concentração de proteína para a outra. Existem concentrações críticas de proteína no meio de cultura, que não é possível ultrapassar 5 durante o processo de adaptação. Estas concentrações críticas da proteína são específicas para cada linha de células recombinantes, mas normalmente são inferiores a 0,6 mg/ml. Quando as células tiverem recuperado a viabilidade inicial e a taxa de crescimento, a estas concentrações críticas de proteína, é possível fazer uma subcultura, nas condições que se seguem, com concentrações mais baixas de proteína.

Uma vez fixada a concentração crítica das proteínas, considera-se que a concentração de proteínas mais elevada e mais próxima que suporta o crescimento das células é a concentração pré-crítica das proteínas. Começando na concentração pré-crítica das proteínas vai-se reduzindo lentamente até as células recuperarem a viabilidade inicial e a taxa de crescimento. A combinação das etapas seleccionadas para reduzir a concentração de proteínas no estádio crítico irá determinar o tempo total de adaptação neste estádio e a taxa de adaptação (Vadapt.), calculada como a relação:

Vadapt-=A Concentração de proteína ATadapt

Contudo, esta combinação de etapas não terá influência no tempo necessário para a adaptação de cada concentração de proteína, incluindo as concentrações críticas. 6

Para determinar o final da etapa não critica e as concentrações criticas de proteína, é necessário realizar uma adaptação passo a passo, por meio de diluições em série da cultura de células no meio desejado, isento de proteínas, reduzindo, de cada vez, duas vezes, a concentração de proteínas (quadro 1). Esta redução pode ser feita por meio da diminuição da concentração no soro ou complementando o meio de base com diferentes níveis do mesmo substituto do soro rico em proteínas.

Quadro 1: Redução, por etapas, da concentração de proteínas de modo a determinar as concentrações críticas partindo de um meio de cultura complementado com 5 mg/ml de proteina (equivalente a 10 % de soro de bovino fetal) . Número da etapa Concentração total de proteina mg/ml Concentração* equivalente de SBF, % v/v 1 5,000 o o o 2 2,500 5,00 3 1,250 2,50 4 0,625 1,25 5 0,312 o KD O 6 0,156 0,30 7 0,000 o o o LEGENDA: Soro bovino fetal - SBF Meio isento de proteína - MIP Meio contendo soro - MCS * Considera-se que o teor total de proteína do soro bovino fetal seja de cerca de 50 mg/ml.

Antes do processo de adaptação devem manter-se as células, com mais do que 80 % de viabilidade, em frascos T, em meio padrão normalmente utilizado para a cultura de células. O processo de adaptação realiza-se passo a passo seguindo as etapas descritas a seguir. 7 sobrenadante por meio fresco isento de proteína, obtendo-se assim uma concentração final de proteína que corresponde a 50 % da condição inicial. ii. De 48 em 48 horas o sobrenadante é completamente substituído por meio de cultura fresco com uma concentração de proteína que corresponde a 50 % da condição inicial. iii. As células cresceram até à confluência em meio com 50 % de concentração de proteína em relação à condição inicial. iv. Semeiam-se as células da etapa iii em pelo menos 3 poços a uma densidade no intervalo de 1 a 5 χ 105 células/ml em meio de cultura com uma concentração de proteína que corresponde a 50 % da concentração das condições iniciais. Passadas 48 horas, substitui-se metade do sobrenadante por meio fresco isento de proteína, obtendo-se uma concentração final de proteína que corresponde a 50 % da condição inicial. v. De 48 em 48 horas o sobrenadante é completamente substituído por meio de cultura fresco com uma concentração de proteína que corresponde a 50 % da condição inicial. vi. As células cresceram até à confluência no meio com 50 % da concentração anterior de proteína. vii. Repetiram-se as etapas de (iv) a (vi), durante cada ciclo a concentração de proteínas é reduzida para 50 % da concentração do ciclo anterior. Repete-se este procedimento até se atingir uma concentração de proteína que cause a morte das células. viii. Semearam-se as células de uma cultura de células com uma viabilidade de 80 % ou superior crescendo com a concentração pré-crítica de proteínas, em pelo menos 3 poços, a uma densidade num intervalo de 2 a 6 χ 105 células/ml. As células crescem numa concentração pré- crítica de proteínas e, passadas 48 horas, substitui-se 25 % do sobrenadante por meio fresco isento de proteínas, obtendo-se assim uma concentração final de proteína que representa 75 % da concentração pré-crítica de proteínas. ix. De 48 em 48 horas, o sobrenadante é completamente substituído por meio de cultura fresco com uma concentração de proteína que corresponde a 75% da concentração pré-crítica de proteínas. x. As células cresceram até à confluência no meio com 75 % da concentração pré-crítica de proteínas. xi. As linhas de células derivadas da etapa anterior são semeadas em pelo menos 3 poços a uma densidade que varia entre 2 e 6 χ 105 células/ml em meio contendo 75 % da concentração pré-crítica de proteínas e, passadas 48 horas, substitui-se 25 % do sobrenadante da cultura por meio fresco isento de proteínas, originando assim uma concentração final de proteínas que corresponde a 75 % da concentração anterior. xii. De 48 em 48 horas o sobrenadante é completamente substituído por meio de cultura fresco com uma concentração de proteína que corresponde a 75 % da concentração anterior. xiii. As células cresceram até à confluência no meio com 75 % da concentração anterior de proteína. xiv. Repetem-se as etapas (xi) a (xiii), reduzindo a concentração de proteínas de cada ciclo até 75 % da utilizada no ciclo anterior, atingindo uma concentração de proteína tal que quando as células são transferidas para uma concentração inferior crescem com uma viabilidade e um tempo de duplicação semelhantes aos originais, de modo que a subsequente diminuição da concentração de proteínas não afecta a viabilidade ou o tempo de duplicação. 9

No processo da presente invenção, o meio de cultura inicial contém entre 5 e 10 % de soro bovino fetal. A linha de células recombinantes de mamíferos adaptada ao crescimento em meio isento de proteína é de mieloma, particularmente células de NSO. A presente invenção também pode ser útil quando se utilizam linhas de células de NSO transfectadas com um polipéptido ou uma proteína recombinante, particularmente quando são transfectadas com uma sequência que codifica um anticorpo recombinante ou os seus fragmentos. Também se descrevem as linhas de células recombinantes de mieloma de mamíferos modificadas pelo processo da presente invenção que crescem em meio isento de proteína.

Está incluída na presente memória descritiva, mas não faz parte da presente invenção, qualquer linha de células recombinantes de mieloma de mamíferos que expressam um anticorpo humanizado ou quimérico seleccionado no grupo que consiste em anticorpos anti-receptor de FCE, hR3, anti-CD6, TlhT, anti-CD3, T3Q ou os seus fragmentos que crescem em meio isento de proteína e portanto os anticorpos segregados por estas linhas de células.

As linhas de células obtidas pelo processo da presente invenção cresceram de forma estável em meio isento de proteína durante pelo menos 40 gerações.

Exemplos

Exemplo 1: Adaptação da linha de células recombinante hR3 ao meio isento de proteínas. 10

Obteve-se a linha de células recombinante hR3 por transfecção da linha de células NSO de mieloma com as estruturas do vector para expressar as cadeias pesadas e leves do anticorpo monoclonal humanizado anti-receptor humano de FCE, hR3. A adaptação desta linha de células ao meio isento de proteína foi feita seguindo o processo descrito previamente, por meio de duas etapas de redução do teor de proteína do meio.

Fez-se a cultura destas células em meio RPMI-1640 complementado com SBF a 10 %. Substituiu-se o SBF adicionando o suplemento rico em proteína Nutridoma NS (Boheringer Manheinn) ao meio RPMI-1640 isento de proteína quando a concentração de proteína era de 0,15 mg/ml. A redução do teor de proteína no meio inicial foi feita por diluições sucessivas com meio PFHM-II isento de proteína (Gibco).

As fig. 1 e 2 mostram, respectivamente, os resultados do cálculo das concentrações críticas e das taxas de adaptação Vadapt.

Exemplo 2: Adaptação da linha de células recombinante Tlht ao meio isento de proteínas.

Obteve-se a linha de células recombinante Tlht por transfecção da linha de células NSO de mieloma com as estruturas do vector para expressar as cadeias pesadas e leves de um anticorpo monoclonal humanizado anti-CD6 humano pelo processo da supressão do epítope T. 11 A adaptação desta linha de células ao meio isento de proteína foi feita seguindo o processo descrito no ponto 2, por meio de duas etapas de redução do teor de proteína do meio.

Fez-se inicialmente a cultura destas células em meio RPMI-1640 complementado com SBF a 10 %. A redução do teor de proteína no meio inicial foi feita por diluições sucessivas do meio inicial com o meio PFHM-II isento de proteína da Gibco. Os resultados do cálculo das concentrações críticas e das taxas de adaptação Vadapt · estão ilustrados nas fig. 3 e 4 respectivamente.

Exemplo 3: Adaptação da linha de células recombinante T3Q ao meio isento de proteínas.

Obteve-se a linha de células recombinante T3Q por transfecção da linha de células NSO de mieloma com as estruturas do vector para expressar as cadeias pesadas e leves do anticorpo monoclonal humanizado T3Q que reconhece o receptor de CD3 em linfócitos humanos. A adaptação desta linha de células ao meio isento de proteína foi feita seguindo o processo descrito no ponto 2, por meio de duas etapas de redução do teor de proteína do meio.

Fez-se inicialmente a cultura destas células em meio RPMI-1640 complementado com SBF a 10 %. A redução do teor de proteína no meio inicial foi feita por diluições sucessivas no meio PFHM-II isento de proteína da Gibco. 12

Os resultados do cálculo das concentrações críticas e das taxas de adaptação vadapt. estão ilustrados nas fig. 5 e 6 respectivamente.

Beve descrição das figuras:

Figura 1: Correlação do tempo necessário para adaptar as células de hR3 a cada concentração de proteína (até à recuperação da viabilidade e do tempo de duplicação) com o logaritmo natural do inverso da concentração de proteína. Valores de concentrações críticas para a linha de células h-R3: -0,32 e 0,11 mg/ml da concentração total de proteína.

Figura 2: Correlação do tempo total desde o início do processo de adaptação, com o logaritmo natural do inverso da concentração de proteína para a linha de células h-R3. Valores das taxas de adaptação para a linha de células h-R3 durante a etapa crítica - 0,0053 mg/d.

Figura 3: Correlação do tempo necessário para adaptar as células TlhT a cada concentração de proteína (até à recuperação da viabilidade e do tempo de duplicação) com o logaritmo natural do inverso da concentração de proteína. Valores de concentrações críticas para a linha de células TlhT: -0,12 e 0,01 mg/ml da concentração total de proteína.

Figura 4: Correlação do tempo total desde o início do processo de adaptação, com o logaritmo natural do inverso da concentração de proteína para a linha de células TlhT. Valores das taxas de adaptação para a linha de células TlhT - 0,0014 mg/d.

Figura 5: Correlação do tempo necessário para adaptar as células de T3Q a cada concentração de proteína (depois da recuperação da viabilidade e do tempo de duplicação) 13 com o logaritmo natural do inverso da concentração de proteína. Valores de concentrações críticas para a linha de células T3Q: - 0,63 mg/ml da concentração total de proteína.

Figura 6: Correlação do tempo total desde o início do processo de adaptação, com o logaritmo natural do inverso da concentração de proteína para a linha de células T3Q. Valores das taxas de adaptação para a linha de células T3Q - 0,0172 mg/d.

Lisboa, 13 de Abril de 2011. 14

Claims

REIVINDICAÇÕES 1. Processo para a obtenção de uma linha de células recombinante de mieloma de mamífero, adaptada ao crescimento em meio isento de soro e isento de proteína, caracterizado pelo facto de compreender duas etapas: I. Uma primeira etapa em que a viabilidade da linha de células está entre 80 e 100 % e as células crescem no meio de cultura com a consecutiva redução da concentração de proteínas até a uma concentração crítica das proteínas em que a viabilidade das células cai para 0 %; e II. Uma segunda etapa em que desde que a concentração crítica tenha sido pré-determinada, então a concentração pré-crítica é fixada como uma concentração de proteína em que o crescimento celular é possível e é o ponto de partida para reduzir lentamente a concentração de proteínas até a cultura de células atingir a viabilidade celular inicial e se atingir o tempo de duplicação da população.
2. Processo, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo facto de a primeira etapa consistir nas etapas seguintes: i. Sementeira, em 3 poços, numa placa de cultura de seis poços com linha de células recombinante de mieloma de mamífero utilizando o meio padrão de cultura de células com a concentração inicial de proteínas, em que a densidade das células está no intervalo de 1 a 5 x 1 105 células/ml e, após 48 horas, substituição de metade do sobrenadante por meio fresco isento de proteína, originando assim uma concentração final de proteína que representa 50 % da concentração das condições iniciais; ii. Substituição completa do sobrenadante, de 48 em 48 horas, por meio fresco de cultura com uma concentração de proteína que corresponde a 50 % da concentração da condição inicial; iii. Crescimento das células até à confluência no meio com 50 % da concentração de proteína inicial; iv. Sementeira das células da etapa iii, em pelo menos 3 poços, a uma densidade no intervalo de 1 to 5 x 105 células/ml em meio de cultura com uma concentração de proteína que representa 50 % da concentração das condições iniciais, substituindo metade do sobrenadante, passadas 48 horas, por meio fresco isento de proteína, originando uma concentração final de proteína que é de 50 % da concentração da condição inicial; v. Substituição completa do sobrenadante, de 48 em 48 horas, por um meio fresco de cultura com uma concentração de proteína que representa 50 % da concentração da condição anterior; vi. Crescimento das células até à confluência no meio com 50 % de concentração anterior de proteína; e vii. Repetição das etapas (iv) a (vi), em que, durante cada ciclo, a concentração de proteína é reduzida para 50 % da concentração do ciclo anterior, até se atingir uma concentração de proteína que cause a morte da células. 2
3. Processo, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo facto de a segunda etapa consistir nas etapas seguintes: viii. Sementeira de células de mieloma de mamífero provenientes de uma cultura de células com uma viabilidade de 80 % ou superior, efectuada com uma concentração pré-crítica de proteína, em pelo menos 3 poços, com uma densidade variando de 2 a 6 x 105 células/ml, crescendo as células a uma concentração pré-crítica de proteínas e, passadas 48 horas, substituição de 25 % do sobrenadante por meio fresco isento de proteína, para se obter assim uma concentração final de proteínas de 75 % da concentração pré-crítica de proteínas; ix. Substituição completa do sobrenadante, de 48 em 48 horas, por um meio fresco de cultura com uma concentração de proteína igual a 75 % da concentração pré-crítica de proteínas; x. Crescimento das células até à confluência num meio contendo 75 % da concentração pré-crítica de proteínas; xi. Sementeira das linhas de células derivadas da etapa anterior, em pelo menos 3 poços, a uma densidade que varia entre 2 e 6 χ 105 células/ml em meio contendo 75 % da concentração pré-crítica de proteínas e, passadas 48 horas, substituição de 25 % do sobrenadante da cultura por meio fresco isento de proteínas, originando assim uma concentração final de proteínas que corresponde a 75 % da concentração anterior; xii. Substituição completa do sobrenadante, de 48 em 48 horas, por meio fresco de cultura com uma 3 concentração de proteína que corresponde a 75 % da concentração prévia; xiii. Crescimento das células até à confluência no meio com 75 % da concentração anterior de proteína; e xiv. Repetição das etapas (xi) a (xiii), reduzindo a concentração de proteínas de cada ciclo até 75 % da utilizada no ciclo anterior, atingindo uma concentração de proteína tal que, quando as células são transferidas para uma concentração inferior, crescem com uma viabilidade e um tempo de duplicação semelhantes aos originais, de modo que a subsequente diminuição da concentração de proteínas não afecta a viabilidade ou o tempo de duplicação.
4. Processo, de acordo com as reivindicações 1 a 3, caracterizado pelo facto de o meio contendo soro e proteína, em que as células foram inicialmente semeadas, compreender entre 5 % e 10 % do soro de bovino fetal.
5. Processo, de acordo com a reivindicação 4, caracterizado pelo facto de a linha de células recombinante de mieloma de mamífero ser a linha de células de NSO.
6. Processo, de acordo com a reivindicação 5, caracterizado pelo facto de a referida linha de células de NSO conter uma sequência que codifica um polipéptido recombinante ou uma proteína recombinante que codifica para um anticorpo recombinante ou um seu fragmento.
7. Processo, de acordo com a reivindicação 6, caracterizado pelo facto de a referida linha de células de NSO conter 4 uma sequência que codifica o anticorpo anti-receptor de FCE, hR3.
8. Utilização do processo de acordo com as reivindicações 1 a 6 caracterizada pelo facto de se destinar à obtenção de uma linha de células de mieloma de mamifero adaptada para crescer em meio isento de soro e de proteina. Lisboa, 13 de Abril de 2011. 5