KR20050088403A

KR20050088403A - 무단백질 배지에서 세포주의 수득 방법 및 수득된 세포주

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Publication number: KR20050088403A
Application number: KR1020057006995A
Authority: KR
Inventors: 롤란도 페레즈 로드리구에즈; 아돌포 카스틸로 비틀로치; 스비에타 비토레스 사라졸라; 타미 보기아노 아요; 루이스 로자스 델 칼보
Original assignee: 센트로 데 인무노로지아 몰레큘라
Priority date: 2002-10-23
Filing date: 2003-10-22
Publication date: 2005-09-06
Also published as: EP2363418A2; BR0315565B1; AR041645A1; EP1564285B1; PT1564285E; ES2360049T3; KR101186048B1; ECSP055740A; HRP20050760A2; HK1084414A1; AU2003273727A1; LV13361B; BR0315565A; LT5354B; CN1714147A; AU2003273727B2; US20060036082A1; CN1714147B; EP2363418A3; ES2624279T3

Abstract

본 발명은 무혈청 무단백질 배지에 적응시킨 포유류 세포 클론의 회수 방법에 관한 것인데, 본 절차는 상기 조건에서의 배양을 위한 2단계 적응 공정을 포함한다. 본 발명은 세포를 일단 임계 간격의 농도에서 배양하면 세포는 무혈청 무단백질 조건 하에 생존하는 능력을 획득하기 위하여 성장하여야 하는 임계 단백질 농도 간격을 개시하는데, 그 후의 이 농도의 감소는 생존력에도 영향을 주지 않으며 세포 배가 시간에도 영향을 주지 않는다. 임계 단백질 농도 간격은 세포주에 특이적이다. 또한, 본 발명에 있어서 40세대 이상 동안 무혈청 무단백질 배지에서 안정한 포유류 세포 클론이 개시되는데, 추가로 본 발명에 개시된 클론은 재조합 산물을 발현한다. 본 발명에 개시된 세포 클론은 인간화된 항-EGF-R 항체 hR3, 인간화된 항-CD6 항체 T1hT, 키메라 항-CD3 항체 T3Q, 또는 그의 단편을 생산한다.

Description

무단백질 배지에서 세포주의 수득 방법 및 수득된 세포주{METHOD OF OBTAINING CELL LINES IN A PROTEIN-FREE MEDIUM AND CELL LINES TITUS OBTAINED}

본 발명은 생물 공학, 구체적으로는 2단계 적응 공정으로 무혈청 무단백질 배지에 적응시킨 안정한 세포 클론의 회수 방법에 관한 것이다.

포유류 세포의 시험관내 배양법의 발달 때문에 이러한 세포의 대규모 생산법에 대한 요구가 상기 세포가 생산하는 다수의 산물의 진단 및 치료적 잠재력으로 인하여 증가하였다. 이러한 유용한 제제(agent)는 단일클론 항체, 인간 성장 호르몬, 림포카인, 에리쓰로포이에틴, 혈액 응고 인자 및 조직 플라스미노겐 활성자를 포함한다.

상이한 질환의 치료 및 생체내 진단용의 재조합 단일클론 항체(rMab)의 사용에는 다수의 경우에 있어서 높은 용량의 치료의 이용이 따른다. 이러한 사실은 매우 높은 순도를 갖는 다량의 목적 rMab의 생산이 필요하게 한다.

암 및 자가면역 질환의 치료 및 진단에 있어서 잠재적인 용도를 갖는 여러 재조합 단일클론 항체가 Center of Molecular Immunology에서 NSO 골수종 세포에서 발현되었다. 미국 특허 제5,891,996호에는 표피 성장 인자 수용체(EGF-R)를 발현하는 종양의 진단 및 치료에 유용한 상기 수용체에 대한 키메라 및 인간화 항체의 수득이 기술되어 있다. WO 97/19111에는 건선을 앓고 있는 환자에 있어서 진단 및 치료에 유용한 항-CD6 단일클론 항체가 기술되어 있다. 문헌[Gavilondo 등, Hybridoma 9 No. 5, 1999]에는 IOR-T3a라 불리우는 항-CD3 단일클론 항체가 보고되어 있다.

무단백질 배양 조건에 있어서 다양한 기술이 개발되었다. 따라서, 구체적으로 정의하자면 무단백질 조건 하에서 세포가 성장하게 하는 무단백질 완전 배지가 개발되었다.

WO 97/05240에는 무단백질 조건 하에서의 재조합 단백질의 발현이 기술되어 있다.

JP 2696001에는 비이온성 계면활성제 또는 사이클로덱스트린을 첨가하여 숙주 세포의 생산성을 증가시킴으로써 CHO 세포에 있어서 인자 VIII를 생성하는 데에 무단백질 배지를 사용하는 것이 기술되어 있다. 이러한 첨가제의 효율성의 증가를 위하여, 예를 들어 부티레이트 및 리튬의 첨가가 권고된다.

WO 96/26266에는 자유 아미노산의 함량이 단백질의 총 중량의 15% 미만이며, 펩티드의 분자량이 44 kD 미만인 글루타민 함유 단백질 가수분해물을 함유하는 배지에서 세포를 배양하는 것이 기술되어 있다. 세포 배양용 배양 배지로서 합성 최소 배지를 기본 배지로 사용하는데 여기에는 특히 단백질 가수분해물 외에도 송아지 태아 혈청, 젠타마이신 및 메르캅토-에탄올이 첨가된다. 재조합적 혈액 인자 생성용의 이러한 혈청 함유 배지의 사용은 언급되지 않았다.

미국 특허 제5,393,668 A호에는 무단백질 조건 하에서 유착 세포의 성장을 가능하게 하는 특수 합성 표면이 기술되어 있다.

세포 증식의 촉진을 위하여 인간 인슐린을 과다 발현하는 CHO 세포는 인슐린이 공유 결합되어 있는 인공 기재 상에서 조작되었다(Ito 등, 1996 PNAS U.S.A. 93: 3598-3601).

문헌[Reiter 등, 1992. Cytotechnology 9: 247-253]에는 담체 상에 고밀도로 혈청 함유 배지에서 먼저 배양한 r-CHO 세포를 고정화하고, 그 후 생산기 동안 무단백질 배지에서 이 고정화 세포를 관류하는 것이 기술되어 있는데, 여기서 단백질의 세포 배양 상청액 내로의 연속적인 유리가 발견되었다. 그곳에서 세포는 무단백질 배지에서 10 미만의 세대 동안 유지되었다.

무단백질 조건 하에서의 대규모 세포 배양물의 이전의 성공적인 제조 방법이 연속 세포주, 특히 VERO 세포에 대하여 기술되었다(WO 96/15231). 그곳에서 세포는 원래의 앰풀로부터 1200 리터의 큰 기술적 규모까지 무혈청 무단백질 조건 하에서 배양된다.

혈청 함유 조건 하에서 처음에 배양한 세포를 무단백질 배지에 적응시키는 것은 일반적으로 오랜 시간이 걸리는 다소 성가신 공정이며, 또한 발현 단백질의 수율 및 재조합 CHO 세포의 생산성은 혈청 함유 조건에 비하여 무단백질 배지에서의 적응 후 크게 강하된다는 것이 반복적으로 밝혀졌었다(Paterson 등, 1994. Appl. Microbiol. Biotechnol. 40: 691-658). 이는 배양 조건의 변화로 인한 상기 재조합 클론의 불안정성 또는 성장 감소의 결과이다. 원래의 안정한 클론의 사용에도 불구하고 발현 조건의 변경 때문에 상기 세포의 대부분은 반복적으로 발현이 감소된 세포 또는 비-생산체이기도 한 세포로 되며, 이는 생산 공정 동안 생성물 생산체를 과다 성장시키고, 그럼으로써 발효기의 배양물은 최종적으로 대부분이 비-생산체로 구성되거나 발현이 낮은 세포로 구성되게 된다.

본 발명에 있어서 본 발명자들은 무혈청 무단백질 배지에 적응시킨 안정한 세포주의 개발을 위한 접근법을 확립하였다. 이러한 접근법에 따라 여러 클론을 무단백질 배지에서 단리하였다.

도 1: hR3 세포를 각각의 단백질 농도에 적응시키는 데에 필요한 시간(생존률 및 배가 시간의 회복까지)과 역의 단백질 농도의 자연 로그의 상관 관계. h-R3 세포주에 있어서의 임계 농도의 값: - 0.32 및 0.11 mg/mL의 총 단백질 농도.

도 2: h-R3 세포주에 있어서 적응 절차 출발점으로부터의 총 시간과 역의 단백질 농도의 자연 로그의 상관 관계. 임계 단계 동안 h-R3 세포주의 적응 속도의 값 - 0.0053 mg/d.

도 3: T1hT 세포를 각각의 단백질 농도에 적응시키는 데에 필요한 시간(생존률 및 배가 시간의 회복까지)과 역의 단백질 농도의 자연 로그의 상관 관계. T1hT 세포주에 있어서의 임계 농도의 값: - 0.12 및 0.01 mg/mL의 총 단백질 농도.

도 4: T1hT 세포주에 있어서 적응 절차 출발점으로부터의 총 시간과 역의 단백질 농도의 자연 로그의 상관 관계. T1hT 세포주의 적응 속도의 값 - 0.0014 mg/d.

도 5: T3Q 세포를 각각의 단백질 농도에 적응시키는 데에 필요한 시간(생존률 및 배가 시간의 회복까지)과 역의 단백질 농도의 자연 로그의 상관 관계. T3Q 세포주에 있어서의 임계 농도의 값: - 0.63 mg/mL의 총 단백질 농도.

도 6: T3Q 세포주에 있어서 적응 절차 출발점으로부터의 총 시간과 역의 단백질 농도의 자연 로그의 상관 관계. T3Q 세포주의 적응 속도의 값 - 0.0172 mg/d.

무단백질 배지에 대한 세포주의 2단계 적응

본 절차는 포유류 세포주를 포함하는데, 혈청 보충 또는 무혈청 배지로부터의 무단백질 배지로의 직접적인 적응 절차는 실시될 수 없다.

본 발명의 방법은 무단백질 배지(protein-free medium, PFM)로의 세포주의 적응 동안의 2단계 공정으로 구성된다.

비임계 단계로 여겨지는 제1 단계: 단백질 함량의 감소는 세포 생존성의 손실 없이 일어나며 각각의 단계의 단백질 농도에서 두드러진 모집단 배가 시간의 감소는 없다. 비임계 단계는 배양 배지에 있어서 5 내지 0.5 mg/mL 사이의 총 단백질 농도 사이에서 일반적으로 관찰되며 배양물은 초기 배양 배지에서의 성장 속도와 거의 동일한 성장 속도를 나타낸다.

이러한 제1 단계는 80 내지 100% 사이의 세포주 생존률로 출발하며 세포는 세포 생존률이 0%로 강하되는 임계 단백질 농도까지 연속적으로 단백질의 농도를 감소시킨 배양 배지에서 배양한다. 이러한 단백질 농도는 다음 단계의 출발 지점이다.

임계 단계로 간주되는 제2 단계: 본 단계에서 세포 생존률 감소 및 세포 모집단 배가 시간의 감소가 일어나며 하나의 단계의 단백질 농도로부터의 다른 것으로의 적응 시간은 더욱 오래 걸릴 것이다. 적응 공정 동안 우회할 수 없는 배양 배지에 있어서의 임계 단백질 농도가 존재한다. 이러한 임계 단백질 농도는 각각의 재조합 세포주에 특이적이지만, 일반적으로 0.6 mg/mL 미만이다. 일단 세포가 상기 임계 단백질 농도에서 초기 생존률 및 성장 속도를 회복하면 단백질 농도가 보다 낮은 하기 조건으로 2차 배양(subculture)하는 것이 가능하다.

임계 단백질 농도가 일단 고정되면, 세포 성장을 지지하는 그의 가까운 보다 높은 단백질 농도가 전-임계(pre-critical) 단백질 농도로 간주된다. 이는, 전-임계 단백질 농도로부터 출발하여 세포가 초기 생존률 및 성장 속도를 회복할 때까지 서서히 감소된다.

임계 단계에서의 단백질 농도의 감소 단계의 선택된 조합은 이 단계에서의 총 적응 시간 및 적응 속도(V_적응.)를 결정하는데, 이는 하기 관계식으로 계산된다:

V_적응. = Δ단백질 농도 / ΔT_적응.

그러나 이러한 단계의 조합은 임계 농도를 비롯한 각각의 단백질 농도에 대한 적응에 필요한 시간에 영향을 주지 않는다. 비임계 단계의 마지막 및 임계 단백질 농도의 결정을 위해서는 원하는 무단백질 배지에서의 세포 배양물을 매번 단백질의 농도를 2배 감소시키면서 연속적으로 희석시킴으로써 점차적 적응을 실시하는 것이 필요하다(표 1). 이러한 감소는 혈청 농도의 감소에 의해 또는 단백질이 풍부한 일부의 상이한 수준의 혈청 치환물을 포함하는 기본 배지의 보충에 의해 행해질 수 있다.

[표 1]: 5 mg/mL의 단백질(10%의 소 태아 혈청에 상응함)이 보충된 배양 배지로부터 출발하여 임계 농도를 결정하기 위한 단백질 농도의 단계적 감소

단계의 수	총 단백질 농도(mg/mL)	상응하는 FBS 농도*(%(v/v))
1	5.000	10.00
2	2.500	5.00
3	1.250	2.50
4	0.625	1.25
5	0.312	0.60
6	0.156	0.30
7	0.000	0.00
설명:	FBS - 소 태아 혈청PFM - 무단백질 배지SCM - 혈청 함유 배지
* 소 태아 혈청의 총 단백질 함량은 약 50 mg/mL로 여겨짐.

적응 절차의 시작 전에 세포는 일반적으로 세포의 배양에 이용되는 표준 배지에서 T-플라스크에서 80% 초과의 생존률로 유지되어야 한다.

적응 공정은 이하에 기술되어 있는 하기 단계에 따라 단계적으로 실시한다.

i. 표준 세포 배양 배지(초기 단백질 농도를 가짐)를 이용하여 재조합 세포주를 6-웰 배양 플레이트의 3개의 웰에 접종한다. 세포 밀도는 1 내지 5 x 10⁵개의 세포/mL의 범위이어야 한다. 48시간 후 상청액 중 절반을 새로운 무단백질 배지로 대체함으로써 최종 단백질 농도가 출발 조건의 50%가 되게 한다.

ii. 48시간 마다 상청액을 단백질 농도가 출발 조건의 50%인 새로운 배양 배지로 완전히 대체한다.

iii. 세포를 상기 단백질 농도 하에 융합 상태(confluence)로 배양한다.

iv. 단계 (iii)으로부터의 세포를 단백질 농도가 출발 조건의 50%인 배양 배지 중에 1 내지 5 x 10⁵개의 세포/mL의 범위의 밀도로 3개 이상의 웰에 접종한다. 48시간 후 상청액 중 절반을 새로운 무단백질 배지로 대체하여 최종 단백질 농도가 이전의 조건의 50%가 되게 한다.

v. 48시간 마다 상청액을 단백질 농도가 이전의 조건의 50%인 새로운 배양 배지로 완전히 대체한다.

vi. 세포를 상기 단백질 농도 하에 융합 상태로 배양한다.

vii. (iv) 내지 (vi)의 단계를 반복하는데, 각각의 사이클 동안 단백질 농도는 이전 사이클의 농도의 50%로 감소시킨다. 본 절차는 세포 사멸을 야기하는 단백질 농도에 도달될 때까지 반복한다.

viii. 전-임계 농도에서 배양한 80% 이상의 생존률의 세포 배양물로부터 유래된 세포를 3개 이상의 웰에 2 내지 6 x 10⁵개의 세포/mL 범위의 밀도로 접종한다. 세포를 전-임계 단백질 농도에서 배양하고 48시간 후 상청액 중 25%를 새로운 무단백질 배지로 대체하여 최종 단백질 농도가 전-임계 단백질 농도의 75%가 되게 한다.

ix. 48시간 마다 상청액을 단백질 농도가 전-임계 단백질 농도의 75%인 새로운 배양 배지로 완전히 대체한다.

x. 세포를 상기 단백질 농도 하에 융합 상태로 배양한다.

xi. 단계 (x)로부터의 세포를 단백질 농도가 전-임계 단백질 농도의 75%인 배양 배지 중에 2 내지 6 x 10⁵개의 세포/mL 범위의 밀도로 3개 이상의 웰에 접종한다. 48시간 후 상청액 중 25%를 새로운 무단백질 배지로 대체하여 최종 단백질 농도가 이전 단계의 농도의 75%가 되게 한다.

xii. 48시간 마다 상청액을 단백질 농도가 단계 (x)의 농도의 75%의 농도인 새로운 배양 배지로 완전히 대체한다.

xiii. 세포를 상기 단백질 농도 하에 융합 상태로 배양한다.

xiv. (xi) 내지 (xiii)의 단계를 반복하는데, 각각의 사이클 동안 단백질 농도는 이전 사이클의 농도의 75%로 감소시키며, 이어서 본 절차를 세포 생존성의 손실 및 모집단 배가 시간의 감소를 전혀 야기하지 않는 단백질 농도에 도달될 때까지 반복한다. 세포를 단백질 농도가 보다 낮은 배지로 옮기고 세포가 첫번째의 2차 배양 전에 세포 생존성의 손실 및 모집단 배가 시간의 감소 없이 성장할 수 있을 경우, 본 발명자들은 세포가 비임계 단계에 다시 도달했다고 여겨 이를 무단백질 배지(0 mg/mL의 단백질 농도)에 직접 접종할 수 있었다.

본 발명의 절차에 있어서 초기 배양 배지는 5 내지 10% 범위의 소 태아 혈청을 함유한다.

무단백질 배지에서 성장하도록 적응시키는 포유류 세포주는 골수종, 특히 NSO 세포이다.

본 발명은 또한 폴리펩티드 또는 재조합 단백질로 트랜스펙션된 NSO 세포주를 사용할 경우, 특히, 이들이 재조합 항체 또는 그의 단편을 코딩하는 서열로 트랜스펙션될 경우 유용할 수 있다. 무단백질 배지에서 성장하는 본 발명의 절차로 변경된 포유류 세포주도 개시된다.

본 발명의 다른 실시 형태에 있어서 무단백질 배지에서 성장하며, 그럼으로써 상기 세포주에 의해 분비되는, 항-EGF 수용체 hR3, 항-CD6 T1hT, 항-CD3 T3Q 항체 또는 그의 단편으로 구성된 군으로부터 선택되는 인간화 또는 키메릭 항체를 발현하는 임의의 포유류 세포주가 개시된다.

본 발명의 방법으로 수득되는 세포주는 무단백질 배지에서 40세대 이상 동안 안정하게 성장한다.

실시예 1: 재조합 세포주 hR3의 무단백질 배지에의 적응.

재조합 세포주 hR3은 골수종 NSO 세포주를 인간화 항-EGF 인간 수용체 hR3 단일클론 항체의 경쇄 및 중쇄를 발현하는 벡터 제작물로 트랜스펙션하여 수득하였다. 이 세포주의 무단백질 배지에의 적응은 배지의 단백질 함량의 2단계 감소에 의해 전술한 절차에 따라 실시하였다.

상기 세포를 10%의 FBS가 보충된 RPMI-1640 배지에서 배양하였다. FBS는 단백질 농도가 0.15 mg/mL인 경우 단백질 풍부 보충물인 Nutridoma NS(Boheringer Manheinn)을 RPMI-1640 무단백질 배지에 첨가함으로써 대체하였다. 초기 배지에 있어서의 단백질 함량의 감소는 PFHM-II 무단백질 배지(Gibco)로 연속적으로 희석시킴으로써 행하였다.

도 1 및 2는 임계 농도 및 적응 속도 V_적응.의 계산 결과를 각각 도시한다.

실시예 2: 재조합 세포주 T1hT의 무단백질 배지에의 적응.

재조합 세포주 T1hT는 골수종 NSO 세포주를 에피토프 T 억제 방법에 의해 인간화한 항-인간 CD6 단일클론 항체의 경쇄 및 중쇄를 발현하는 벡터 제작물로 트랜스펙션하여 수득하였다.

이 세포주의 무단백질 배지에의 적응은 배지의 단백질 함량의 2단계 감소에 의해 포인트 2에서 기술한 절차에 따라 실시하였다.

상기 세포는 처음에 10%의 FBS가 보충된 RPMI-1640 배지에서 배양하였다. 단백질 함량의 감소는 Gibco제의 PFHM-II 무단백질 배지로 초기 배지를 연속적으로 희석시킴으로써 행하였다.

임계 농도 및 적응 속도 V_적응.의 계산 결과는 도 3 및 4에 각각 도시되어 있다.

실시예 3: 재조합 세포주 T3Q의 무단백질 배지에의 적응.

재조합 세포주 T3Q는 골수종 NSO 세포주를 인간 림프구 상의 CD3 수용체를 인식하는 인간화 단일클론 항체 T3Q의 경쇄 및 중쇄를 발현하는 벡터 제작물로 트랜스펙션하여 수득하였다.

임계 농도 및 적응 속도 V_적응.의 계산 결과는 도 5 및 6에 각각 도시되어 있다.

Claims

무혈청 무단백질 배지에서의 배양에 적응된 포유류 세포주의 수득 방법으로서, 하기의 2 단계를 포함하는 것인 방법:

I. 세포주 생존률이 80 내지 100% 사이이며, 세포는 세포 생존률이 0%로 강하되는 임계 단백질 농도까지 단백질 농도를 연속적으로 감소시킨 배양 배지에서 배양하는 제1 단계;

II. 일단 임계 농도가 미리 결정되면, 세포 성장이 가능하며 세포 배양물이 초기의 세포 생존률 및 모집단 배가 시간에 도달될 때까지 단백질 농도를 서서히 감소시키기 위한 시작 지점인 단백질 농도로 전-임계 농도를 고정시키는 제2 단계.
제1항에 있어서, 제1 단계가 하기 단계로 이루어지는 것인 방법:

i. 표준 세포 배양 배지(초기 단백질 농도를 가짐)를 이용하여 재조합 세포주를 6-웰 배양 플레이트의 3개의 웰에 접종하고, 세포 밀도는 1 내지 5 x 10⁵개의 세포/mL의 범위이어야 하며, 48시간 후 상청액 중 절반을 새로운 무단백질 배지로 대체함으로써 최종 단백질 농도가 출발 조건의 50%가 되게 하는 단계;

ii. 48시간 마다 상청액을 단백질 농도가 출발 조건의 50%인 새로운 배양 배지로 완전히 대체하는 단계;

iii. 세포를 상기 단백질 농도 하에 융합 상태(confluence)로 배양하는 단계;

iv. 단계 (iii)으로부터의 세포를 단백질 농도가 출발 조건의 50%인 배양 배지 중에 1 내지 5 x 10⁵개의 세포/mL의 범위의 밀도로 3개 이상의 웰에 접종하고, 48시간 후 상청액 중 절반을 새로운 무단백질 배지로 대체하여 최종 단백질 농도가 이전의 조건의 50%가 되게 하는 단계;

v. 48시간 마다 상청액을 단백질 농도가 이전의 조건의 50%인 새로운 배양 배지로 완전히 대체하는 단계;

vi. 세포를 상기 단백질 농도 하에 융합 상태로 배양하는 단계;

vii. (iv) 내지 (vi)의 단계를 반복하는데, 각각의 사이클 동안 단백질 농도는 이전 사이클의 농도의 50%로 감소시키며, 본 절차를 세포 사멸을 야기하는 단백질 농도에 도달될 때까지 반복하는 단계.
제1항에 있어서, 제2 단계가 하기 단계로 이루어지는 것인 방법:

viii. 전-임계 농도에서 배양한 80% 이상의 생존률의 세포 배양물로부터 유래된 세포를 3개 이상의 웰에 2 내지 6 x 10⁵개의 세포/mL 범위의 밀도로 접종하고, 세포를 전-임계 단백질 농도에서 배양하고 48시간 후 상청액 중 25%를 새로운 무단백질 배지로 대체하여 최종 단백질 농도가 전-임계 단백질 농도의 75%가 되게 하는 단계;

ix. 48시간 마다 상청액을 단백질 농도가 전-임계 단백질 농도의 75%인 새로운 배양 배지로 완전히 대체하는 단계;

x. 세포를 상기 단백질 농도 하에 융합 상태로 배양하는 단계;

xi. 단계 (x)로부터의 세포를 단백질 농도가 전-임계 단백질 농도의 75%인 배양 배지 중에 2 내지 6 x 10⁵개의 세포/mL 범위의 밀도로 3개 이상의 웰에 접종하고, 48시간 후 상청액 중 25%를 새로운 무단백질 배지로 대체하여 최종 단백질 농도가 이전 단계의 농도의 75%가 되게 하는 단계;

xii. 48시간 마다 상청액을 단백질 농도가 단계 (x)의 농도의 75%의 농도인 새로운 배양 배지로 완전히 대체하는 단계;

xiii. 세포를 상기 단백질 농도 하에 융합 상태로 배양하는 단계;

xiv. (xi) 내지 (xiii)의 단계를 반복하는데, 각각의 사이클 동안 단백질 농도는 이전 사이클의 농도의 75%로 감소시키며, 본 절차를 세포 생존성의 손실 및 모집단 배가 시간의 감소를 전혀 야기하지 않는 단백질 농도에 도달될 때까지 반복하고, 세포를 단백질 농도가 보다 낮은 배지로 옮기고 세포가 첫번째의 2차 배양 전에 세포 생존성의 손실 및 모집단 배가 시간의 감소 없이 성장할 수 있을 경우, 세포가 비임계 단계에 다시 도달했다고 여겨 이를 무단백질 배지(0 mg/mL의 단백질 농도)에 직접 접종하는 단계.
제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 세포를 처음에 접종하는 혈청 및 단백질 함유 배지가 5% 내지 10% 사이의 소 태아 혈청을 포함하는 것인 방법.
제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 무혈청 무단백질 배지에서의 배양에 적응되는 포유류 세포주가 골수종 세포주인 것인 방법.
제5항에 있어서, 골수종 세포주가 NSO 세포주인 것인 방법.
제6항에 있어서, NSO 세포주가 재조합 폴리펩티드 또는 재조합 단백질을 코딩하는 서열을 포함하는 것인 방법.
제7항에 있어서, 재조합 폴리펩티드 또는 재조합 단백질을 코딩하는 서열이 재조합 항체 또는 그의 단편을 코딩하는 것인 방법.
무혈청 무단백질 배지에서의 배양에 적응된, 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항의 방법으로 수득되는 포유류 세포주.
제9항에 있어서, 골수종 세포주인 것인 포유류 세포주.
제10항에 있어서, NSO 세포주인 것인 포유류 세포주.
제11항에 있어서, NSO 세포주가 재조합 폴리펩티드 또는 재조합 단백질을 코딩하는 서열을 포함하는 것인 포유류 세포주.
제12항에 있어서, 재조합 폴리펩티드 또는 재조합 단백질을 코딩하는 서열이 재조합 항체 또는 그의 단편을 코딩하는 것인 포유류 세포주.
제13항에 있어서, 서열이 인간화된 재조합 항체 항-EGF-R hR3 또는 그의 단편을 코딩하는 것인 포유류 세포주.
제13항에 있어서, 서열이 인간화된 재조합 항-CD6 항체 T1hT 또는 그의 단편을 코딩하는 것인 포유류 세포주.
제13항에 있어서, 서열이 키메라 재조합 항-CD3 항체 T3Q 또는 그의 단편을 코딩하는 것인 포유류 세포주.
무혈청 무단백질 배지에서의 배양에 적응된 포유류 세포주의 수득에 있어서의 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 따른 방법의 용도.
제1항 내지 제8항 중 어느 한 항의 방법으로 수득되는 세포주에 의해 분비되는 EGF-R hR3 또는 그의 단편에 대한 인간화된 단일클론 항체.
제1항 내지 제8항 중 어느 한 항의 방법으로 수득되는 세포주에 의해 분비되는 CD6 항원 T1hT 또는 그의 단편에 대한 인간화된 단일클론 항체.
제1항 내지 제8항 중 어느 한 항의 방법으로 수득되는 세포주에 의해 분비되는 CD3 항원 T3Q 또는 그의 단편에 대한 키메라 단일클론 항체.