KR101945877B1 - 인간 mcp 및 인간 tbm 발현용 유전자 구조체 및 이를 포함하는 벡터 - Google Patents
인간 mcp 및 인간 tbm 발현용 유전자 구조체 및 이를 포함하는 벡터 Download PDFInfo
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Abstract
본 발명은 돼지 유래 5' UTR 및 인간 유래 MCP(membrane cofactor protein) 염기서열로 이루어진 인간 MCP 발현용 유전자 구조체 및 인간유래 TBM(thrombomodulin)염기서열로 이루어진 인간 TBM 발현용 유전자 구조체를 포함하는 유전자 발현 벡터, 이를 포함하는 알파-1,3 갈락토실트렌스퍼레이즈(alpha-1,3 galactosyltransferase) 넉아웃 세포주 및 형질전환 복제동물에 관한 것이다.
Description
본 발명은 인간 MCP 및 인간 TBM 발현용 유전자 구조체 및 이를 포함하는 벡터에 관한 것이다. 보다 구체적으로 본 발명은 MCP 및 TBM 유전자를 동시에 발현하여, 돼지의 장기 및 조직을 영장류에 이식 시 발생하는 초급성 및 급성 혈관성 거부 반응을 억제시킬 수 있는 돼지를 생산할 수 있고, 이종이식 후 생존 기간을 연장시킬 수 있어 이종 장기 이식의 실용화를 촉진할 수 있는, 인간 MCP 및 인간 TBM 발현용 유전자 구조체 및 이를 포함하는 벡터에 관한 것이다.
현재의 생명공학은 인간복지를 최종목표로 식량, 환경, 건강 문제에 대한 새로운 해결책의 가능성을 제시하고 있다. 최근까지도 인간의 난치병 치료를 위해 장기이식이나 유전자 치료 등이 제시되고 있으나, 면역거부 문제, 인간의 공급 장기 부족, 벡터개발의 미흡 및 질환유전자에 대한 지식부족으로 효율적인 실용화가 미진하였다.
또한, 성인병의 증가 및 사회의 고령화로 인해 국내외적으로 장기 이식의 수요는 급증하고 있으나, 충족되는 인간의 장기는 턱없이 부족한 실정이다.
인간의 공급 장기의 부족을 해결하기 위한 일환으로, 이종이식을 이용한 장기공급 방법이 제안되었다. 이종이식(xenotransplantation)이란 동물로부터 얻어진 세포, 조직, 장기 등을 치료 목적으로 인간에게 이식하는 것을 의미하며, 인간의 몸 밖에서 동물과 접촉한 적이 있는 인간의 체액, 세포, 조직, 장기를 다시 인간에게 이식, 착상, 주입하는 시술도 넓은 의미의 이종이식에 포함된다.
동물의 장기를 이용할 경우, 인간 장기에 비해 공급원이 풍부하고, 환자 맞춤형 장기 생산이 가능한 추가적인 이점이 있다.
한편, 돼지의 장기는 생리적으로 인간과 상당히 흡사하므로, 현재 인간에게 이식하기 위해 많은 노력이 시행되고 있다. 그러나 돼지의 장기를 인간에게 이식 시 일어나는 거부반응이 이종이식에 큰 걸림돌이었다. 이러한 문제는 최근 거부반응에 관여하는 돼지 유전자를 제거함(Lai et al., Science, 295: 1089-1092, 2002; Dai et al., Nat. Biotechnol., 20: 251-255, 2002)과 동시에 면역거부반응에 관여하는 세포들 및 단백질 발현을 억제함으로써 이종이식은 한층 실현 가능성이 커졌다.
이와 관련한 선행기술로는 미국 공개특허 2007-0264269에 장기 이식 면역 부작용을 방지하기 위해 CD73을 발현하는 세포를 포함하는 약학적 조성물이 공개되어 있다.
이러한 기술적 배경하에서, 본 발명자들은 본 발명을 완성하기에 이르렀다.
본 발명의 목적은 이종이식에서 발생하는 초급성 거부 반응 및 급성 체액성 거부반응을 억제하기 위한 고효율 발현 MCP 및 TBM 유전자 발현 벡터, 이를 포함하는 알파-1,3 갈락토실트렌스퍼레이즈(alpha-1,3 galactosyltransferase) 넉아웃 세포주 및 형질전환 복제동물을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 형질전환 복제동물을 제조하는 방법을 제공하는데 있다.
본 발명의 다른 목적 및 이점은 하기의 발명의 상세한 설명, 청구범위 및 도면에 의해 더욱 명확하게 된다.
본 발명의 일 측면에 따르면, 돼지 유래 MCP mRNA의 5' UTR 및 인간 유래 MCP(membrane cofactor protein) 염기서열로 이루어진 인간 MCP 발현용 유전자 구조체가 제공된다.
본 발명의 일 실시예에 따르면, 상기 유전자는 서열번호 1로 표시되는 염기서열을 가질 수 있다.
본 발명의 다른 측면에 따르면, 서열번호 2로 표시되는 염기서열을 가진 인간 유래 TBM(thrombomodulin) 염기서열로 이루어진 인간 TBM 발현용 유전자 구조체가 제공된다.
본 발명의 또 다른 측면에 따르면, 상기 두 유전자 구조체를 포함하는 벡터가 제공된다.
본 발명의 일 실시예에 따르면, 상기 벡터는 프로모터를 더 포함할 수 있다.
본 발명의 일 실시예에 따르면, 상기 프로모터는 전 조직에서 발현을 유도하는 프로모터일 수 있다.
본 발명의 일 실시예에 따르면, 상기 프로모터는 혈관내피세포에서 발현을 유도하는 프로모터일 수 있다.
본 발명의 일 실시예에 따르면, 상기 벡터는 상기 인간 MCP 유전자 구조체와 상기 인간 TBM 유전자 구조체는 역방향으로 연결될 수 있다.
본 발명의 또 다른 측면에 따르면, 상기 벡터를 포함하는 형질전환 세포주가 제공된다.
본 발명의 일 실시예에 따르면, 상기 형질전환 세포주는 GalT-/- 또는 GalT-MCP/-MCP일 수 있다.
본 발명의 또 다른 측면에 따르면, 상기 형질전환 세포주를 핵이식하여 제조하는 단계를 포함하는 형질전환 복제 난자를 생산하는 방법이 제공된다.
본 발명의 또 다른 측면에 따르면, 상기 형질전환 세포주를 핵이식하여 제조된 인간 유래 MCP 및 TBM 단백질을 발현하는 형질전환 복제 돼지가 제공된다.
본 발명의 또 다른 측면에 따르면, 상기 형질전환 복제 돼지를 사육하여 장기를 적출하거나, 이들의 생식세포 또는 체세포를 이용하여 장기를 생산하는 것을 포함하는 이식용 이종 장기의 생산 방법이 제공된다.
본 발명의 일 실시예에 따르면, 장기 및 조직을 영장류에 이식 시 발생하는 초급성 및 급성 혈관성 거부 반응을 억제시킬 수 있는 장기 및 조직을 생산할 수 있다.
또한, 본 발명의 일 실시예에 따르면, 본 발명에 따른 유전자 구조체 및 벡터를 이용하여 상기 장기 및 조직을 이식하면, 생존 기간이 연장되어 이종 장기이식의 실용화에 크게 기여할 수 있다.
도 1은 본 발명의 일 실시예에 따른 인간 MCP유전자를 세포 및 동물에서 고효율로 발현시키기 위해 돼지 MCP mRNA의 5' 비번역부위의 염기서열로 교체하여 변형시킨 서열번호 1의 염기서열을 나타낸 것이다. 도 1 내의 소문자 염기서열은 돼지 MCP의 5’UTR을 나타낸다.
도 2는 본 발명의 일 실시예에 따른 인간 TBM 유전자를 세포 및 동물에서 고효율로 발현시키기 위해 변형시킨 서열번호 2의 염기서열을 나타낸 것이다. 도 2 내의 소문자 염기서열은 인간 TBM의 5’UTR을 나타낸다.
도 3은 본 발명의 일 실시예에 따른 CAG - pmMCP -2A- mTBM 벡터(A)와 CAG -pmMCP-pI2-TBM-R 벡터(B), CAG - pmMCP - pI2 - mTBM -R 벡터의 구조(C)를 나타낸 것이다.
도 4는 본 발명의 일 실시예에 따른 염기서열의 변경으로 MCP와 TBM 발현의 증가양상을 살펴보기 위하여, NIH3T3 세포에 MCP와 TBM 동시 발현 벡터 도입 후 RT-PCR 방법으로 확인한 MCP와 TBM 발현 분석 결과를 나타낸 것이다((A). 1. 대조군, 2. CAG - hMCP -2A- TBM 3. CAG - hMCP - pI2 - TBM -R. (B). 1. 대조군, 2. CAG - pmMCP -2A-mTBM 3. CAG - pmMCP - pI2 - mTBM -R)
도 5는 본 발명의 일 실시예에 따른 NIH3T3 세포에 MCP와 TBM 동시 발현 벡터 도입 후 유세포 분석 방법으로 확인한 MCP 발현 수준 분석 결과를 나타낸 것이다.
도 6은 본 발명의 일 실시예에 따른 NIH3T3 세포에 MCP와 TBM 동시 발현 벡터의 도입 후 유세포 분석 방법으로 확인한 TBM 발현 수준 분석 결과를 나타낸 것이다.
도 7은 본 발명의 일 실시예에 따른 돼지 섬유아세포에 MCP와 TBM 동시 발현 벡터 도입 후 유세포 분석 방법으로 확인한 TBM 발현 수준 분석 결과를 나타낸 것이다.
도 8은 본 발명의 일 실시예에 따른 240번, 242번 및 23-4 돼지에서 분리한 세포의 유전자형 분석결과를 나타낸 것이다.
도 9는 본 발명의 일 실시예에 따른 240번, 242번, 23-4 돼지에서 분리한 섬유아세포에서 Gal 항원 발현 분석결과를 나타낸 것이다.
도 10은 본 발명의 일 실시예에 따른 유전자형이 GalT-/-인 240번 돼지에서 분리한 섬유아세포에서 MCP 및 TBM의 단백질 발현 분석 결과를 나타낸 것이다.
도 11은 본 발명의 일 실시예에 따른 유전자형이 GalT-/-인 242번 돼지에서 분리한 섬유아세포에서 MCP 및 TBM의 단백질 발현 분석 결과를 나타낸 것이다.
도 12는 본 발명의 일 실시예에 따른 유전자형이 GalT- MCP /- MCP인 23-4번 돼지에서 분리한 섬유아세포에서 MCP 및 TBM의 단백질 발현 분석 결과를 나타낸 것이다.
도 13은 본 발명의 일 실시예에 따른 유전자형이 GalT-/-인 242번 돼지에서 분리한 섬유아세포에서 CAG - pmMCP -2A- mTBM 벡터 도입 후 선별한 단일 클론에서 MCP 발현 분석 결과를 나타낸 것이다.
도 14는 본 발명의 일 실시예에 따른 유전자형이 GalT-/-인 242번 돼지에서 분리한 섬유아세포에서 CAG - pmMCP - pI2 - TBM -R 벡터 도입 후 선별한 단일 클론에서 MCP 발현 분석 결과를 나타낸 것이다.
도 15는 본 발명의 일 실시예에 따른 유전자형이 GalT- MCP /- MCP인 23-4번 돼지의 섬유아세포에 CAG - pmMCP -2A- mTBM 벡터를 도입 및 2회 선별 후 단일 클론 중에서 MCP 발현 수준과 TBM 발현 수준의 비교 분석 결과를 나타낸 것이다.
도 2는 본 발명의 일 실시예에 따른 인간 TBM 유전자를 세포 및 동물에서 고효율로 발현시키기 위해 변형시킨 서열번호 2의 염기서열을 나타낸 것이다. 도 2 내의 소문자 염기서열은 인간 TBM의 5’UTR을 나타낸다.
도 3은 본 발명의 일 실시예에 따른 CAG - pmMCP -2A- mTBM 벡터(A)와 CAG -pmMCP-pI2-TBM-R 벡터(B), CAG - pmMCP - pI2 - mTBM -R 벡터의 구조(C)를 나타낸 것이다.
도 4는 본 발명의 일 실시예에 따른 염기서열의 변경으로 MCP와 TBM 발현의 증가양상을 살펴보기 위하여, NIH3T3 세포에 MCP와 TBM 동시 발현 벡터 도입 후 RT-PCR 방법으로 확인한 MCP와 TBM 발현 분석 결과를 나타낸 것이다((A). 1. 대조군, 2. CAG - hMCP -2A- TBM 3. CAG - hMCP - pI2 - TBM -R. (B). 1. 대조군, 2. CAG - pmMCP -2A-mTBM 3. CAG - pmMCP - pI2 - mTBM -R)
도 5는 본 발명의 일 실시예에 따른 NIH3T3 세포에 MCP와 TBM 동시 발현 벡터 도입 후 유세포 분석 방법으로 확인한 MCP 발현 수준 분석 결과를 나타낸 것이다.
도 6은 본 발명의 일 실시예에 따른 NIH3T3 세포에 MCP와 TBM 동시 발현 벡터의 도입 후 유세포 분석 방법으로 확인한 TBM 발현 수준 분석 결과를 나타낸 것이다.
도 7은 본 발명의 일 실시예에 따른 돼지 섬유아세포에 MCP와 TBM 동시 발현 벡터 도입 후 유세포 분석 방법으로 확인한 TBM 발현 수준 분석 결과를 나타낸 것이다.
도 8은 본 발명의 일 실시예에 따른 240번, 242번 및 23-4 돼지에서 분리한 세포의 유전자형 분석결과를 나타낸 것이다.
도 9는 본 발명의 일 실시예에 따른 240번, 242번, 23-4 돼지에서 분리한 섬유아세포에서 Gal 항원 발현 분석결과를 나타낸 것이다.
도 10은 본 발명의 일 실시예에 따른 유전자형이 GalT-/-인 240번 돼지에서 분리한 섬유아세포에서 MCP 및 TBM의 단백질 발현 분석 결과를 나타낸 것이다.
도 11은 본 발명의 일 실시예에 따른 유전자형이 GalT-/-인 242번 돼지에서 분리한 섬유아세포에서 MCP 및 TBM의 단백질 발현 분석 결과를 나타낸 것이다.
도 12는 본 발명의 일 실시예에 따른 유전자형이 GalT- MCP /- MCP인 23-4번 돼지에서 분리한 섬유아세포에서 MCP 및 TBM의 단백질 발현 분석 결과를 나타낸 것이다.
도 13은 본 발명의 일 실시예에 따른 유전자형이 GalT-/-인 242번 돼지에서 분리한 섬유아세포에서 CAG - pmMCP -2A- mTBM 벡터 도입 후 선별한 단일 클론에서 MCP 발현 분석 결과를 나타낸 것이다.
도 14는 본 발명의 일 실시예에 따른 유전자형이 GalT-/-인 242번 돼지에서 분리한 섬유아세포에서 CAG - pmMCP - pI2 - TBM -R 벡터 도입 후 선별한 단일 클론에서 MCP 발현 분석 결과를 나타낸 것이다.
도 15는 본 발명의 일 실시예에 따른 유전자형이 GalT- MCP /- MCP인 23-4번 돼지의 섬유아세포에 CAG - pmMCP -2A- mTBM 벡터를 도입 및 2회 선별 후 단일 클론 중에서 MCP 발현 수준과 TBM 발현 수준의 비교 분석 결과를 나타낸 것이다.
본 발명을 더 쉽게 이해하기 위해 편의상 특정 용어를 본원에 정의한다. 본원에서 달리 정의하지 않는 한, 본 발명에 사용된 과학 용어 및 기술 용어들은 해당 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자에 의해 일반적으로 이해되는 의미를 가질 것이다. 또한, 문맥상 특별히 지정하지 않는 한, 단수 형태의 용어는 그것의 복수 형태도 포함하는 것이며, 복수 형태의 용어는 그것의 단수 형태도 포함하는 것으로 이해되어야 한다.
이하, 본 발명을 보다 상세하게 설명한다.
본 발명의 일 측면에 따르면, 돼지 유래 MCP mRNA의 5' UTR 및 인간 유래 MCP(membrane cofactor protein) 염기서열로 이루어진 인간 MCP 발현용 유전자 구조체가 제공된다.
MCP(membrane cofactor protein)는 표면막당단백질로 성숙단백질은 350아미노산잔기로 구성하며, SDS-폴리아크릴아미드 겔전기영동법을 통해 겉보기 영동도가 분자량 45,000~70,000인 폭넓은 밴드를 나타낸다. 상기 MCP는 표면막 상에서 보체활성화 성분의 C3b나 C4b에 결합하여, 보조인자로서 작용하여, C3b나 C4b의 분해실활(deactivation)을 촉진한다.
상기 MCP는 막상에서의 보체활성화를 억제하며, 구조는 N 말단측을 세포외에 노출하고 C 말단측은 세포질에 있는 막관통형 단백질이다. 세포외에는 4개의 SCR(single coding region) 반복구조를 하고, 계속적으로 O-글리코시드결합당사슬을 복수결합한 도메인이 있다. 보조인자활성은 SCR부위에 있다. 전체적인 구조는 붕괴촉진인자(DAF, CD55)와 유사하다.
본 발명의 일 실시예에 따르면, 상기 유전자는 서열번호 1로 표시되는 염기서열을 가질 수 있다.
본 발명에 따른 서열번호 1은 합성된 mRNA에서 단백질로 번역되는 효율을 증가시키기 위하여 인간의 5' 비번역부위(untranslated region, UTR) 염기서열을 돼지의 5' 비번역부위(untranslated region, UTR)로 교체하였고, 단백질로 번역되는 염기서열을 치환하여 원래의 염기서열의 27.4%를 변경하였으며, 상기 염기서열을 이용하면, MCP 단백질이 고효율로 번역되어, 단백질의 발현량이 증가되는 것을 확인하였다.
또한, 인간 MCP의 경우, 이에 한정하는 것은 아니나, cDNA 염기서열(pmMCP) 염기서열이 사용될 수 있다.
본 발명의 다른 측면에 따르면, 인간 유래 5' UTR 및 인간 유래 TBM(thrombomodulin) 염기서열로 이루어진 인간 TBM 발현용 유전자 구조체가 제공된다.
장기간의 이종 이식 생존기간을 증가시키기 위해서는 알파-1,3 갈락토실트렌스퍼레이즈(alpha-1,3 galactosyltransferase)의 넉아웃(GT-KO) 돼지의 도입 및 초급성 거부반응(hyperacute rejection, HAR)의 예방에 따른 혈액응고 문제가 여전히 극복되어야 한다. TBM(thrombomodulin)은 항응고제 및 항염증제의 역할이 많은 연구자들에 의해 밝혀졌으며, 2015년 TBM이 이원성 자극에 대한 반응으로부터 보체 활성화 및 혈액응고를 조절할 수 있음이 밝혀졌다.
또한, 인간 TBM의 경우, 이에 한정하는 것은 아니나, cDNA 염기서열(mTBM) 염기서열이 사용될 수 있다.
본 발명의 일 실시예에 따르면, 상기 유전자는 서열번호 2로 표시되는 염기서열을 가질 수 있다.
상기 서열번호 2는 인간 TBM cDNA에서 합성된 mRNA로부터 단백질로 번역되는 효율을 증가시키기 위해 염기서열을 치환하여 원래의 염기서열의 15%를 변경하였으며, 상기 염기서열을 이용하면 TBM 단백질이 고효율로 번역되어 단백질의 발현량이 증가함을 확인하였다.
본 발명의 또 다른 측면에 따르면, 상기 두 유전자 구조체를 포함하는 벡터가 제공된다.
상기 기재된 벡터는 상기 기재된 염기서열을 모두 포함하여 동시에 발현되도록 고안된 발현 벡터로서, 이에 한정된 것은 아니나, 인간 MCP는 전 조직에서, 인간 TBM은 전 조직 또는 혈관내피세포에서 동시에 발현될 수 있다.
이에 한정하는 것은 아니나, 상기 벡터는 도 3에 기재된 바와 같을 수 있고, 염기서열은 인간 MCP 유전자 또는 변형된 MCP 유전자 및 인간 TBM 유전자 또는 변형된 TBM 유전자의 조합일 수 있다.
또한, 인간 MCP 유전자 구조체(Construct) 및 인간 TBM 유전자 구조체는 순차적으로 정방향 또는 역방향으로 연결될 수 있다.
본 발명의 일 실시예에 따르면, 상기 벡터는 프로모터를 더 포함할 수 있다.
본 발명에 사용된 용어 ‘프로모터’는 일반적으로 전사를 조절할 대상이 되는 유전자의 유전정보를 지니고 있는 DNA 염기서열 앞부분에 위치하며, 전사시작지점으로부터 바로 앞쪽으로 수백 염기쌍(base pair) 이내에 위치한다. 진핵생물에서는 전사조절인자(transcription factor)라고 하는 단백질들이 프로모터부분에 결합함으로써 RNA 중합효소의 결합에 관여한다.
본 발명의 일 실시예에 따르면, 상기 프로모터는 전 조직에서 발현을 유도하는 프로모터일 수 있다.
CAG 프로모터는 포유류의 발현벡터에서 높은 수준의 유전자 발현을 유도하기 위해 도입되는 프로모터로서, 상기 프로모터는 CAG 프로모터 일 수 있으나, 이에 한정하는 것은 아니며, 통상의 기술자로부터 CAG 프로모터와 동등하다고 여겨지는 프로모터는 모두 이용될 수 있다.
본 발명의 일 실시예에 따르면, 상기 프로모터는 혈관내피세포에서 발현을 유도하는 프로모터일 수 있다.
상기 프로모터는 이에 한정하는 것은 아니나, 돼지 혈관내피세포에서 발현되는 Icam 2 프로모터일 수 있다.
본 발명의 일 실시예에 따르면, 상기 벡터는 상기 인간 MCP 유전자구조체와 상기 TBM 유전자 구조체는 역방향으로 연결될 수 있다.
본 발명의 또 다른 측면에 따르면, 상기 벡터를 포함하는 형질전환 세포주가 제공된다.
이에 한정된 것은 아니나, 상기 세포주는 발현 벡터가 도입된 세포주 또는 클론 세포주일 수 있고, 이를 이용하면, 유전자의 삽입부위가 동일한 세포주를 얻을 수 있다. 상기 세포는 이에 한정하는 것은 아니나, 돼지 세포인 것이 바람직하다.
본 발명의 일 실시예에 따르면, 상기 세포주는 GalT-/- 또는 GalT- MCP /- MCP일 수 있다.
본 발명의 또 다른 측면에 따르면, 상기 형질전환 세포주를 핵이식하여 제조하는 단계를 포함하는 형질전환 복제 난자를 생산하는 방법이 제공된다.
본 발명의 또 다른 측면에 따르면, 상기 형질전환 세포주를 핵이식하여 제조된 인간유래 MCP 및 TBM 단백질을 발현하는 형질전환 복제 돼지가 제공된다.
본 발명의 또 다른 측면에 따르면, 상기 형질전환 복제 돼지를 사육하여 장기를 적출하거나, 이들의 생식세포 또는 체세포를 이용하여 장기를 생산하는 것을 포함하는 이식용 이종 장기의 생산 방법이 제공된다.
상기 형질전환 복제 난자, 복제 돼지의 생산 및 이식용 이종 장기의 생산 방법은 공지의 기술을 이용할 수 있으며, 구체적인 방법은 하기 실시예에 기재되어 있다.
실시예
인간
MCP와
TBM
유전자가 고효율로 단백질로 발현되는 염기서열 제작
1. 돼지와 사람
MCP
융합 고효율 발현 유도 cDNA 합성(
1,213bp
)
인간 MCP(hMCP) mRNA 염기서열의 번역개시 코돈(atg)의 앞쪽 5‘비번역부위(untranslated region)에 atg 염기서열이 존재하여 번역과정 중 혼선이 생길 가능성이 크므로, 돼지 MCP mRNA의 5' 비번역부위의 염기서열로 교체하였다(도 1). 또한, 합성된 mRNA에서 단백질로 번역되는 효율을 증가시키기 위해 염기서열의 27.4%를 치환하여 변경하였다.
2. 인간
TBM
고효율 발현 유도 cDNA 합성(
1,888bp
)
인간 TBM cDNA에서 합성된 mRNA로부터 단백질로 번역되는 효율을 증가시키기 위해 염기서열을 치환하여 원래의 염기서열의 15%를 변경하였다(도 2).
MCP와
TBM
동시 발현 벡터 제작
1. 유전자 도입된 동물의 전 조직에서
MCP와
TBM
동시 발현 벡터
도 1의 MCP cDNA 염기서열(pmMCP)을 FMDV(foot-and-mouth disease virus) 2A의 5' 쪽에 연결하고, 도 2의 TBM cDNA(mTBM) 염기서열을 FMDV 2A의 3‘쪽에 연결한 후 CAG 프로모터를 MCP 염기서열의 5’쪽에 연결하여 CAG - pmMCP -2A- mTBM 벡터를 제작하였다(도 3의 A).
2. 유전자 도입된 동물의 전 조직에서
MCP를
혈관내피세포에서
TBM을
동시 발현 벡터
도 1의 cDNA 염기서열(pmMCP)을 CAG 프로모터에 연결한 MCP 발현 구조체(Construct)에 TBM cDNA 염기서열을 변경하지 않은 것(TBM)과 도 2의 염기서열로 변경한 것(mTBM)을 돼지 혈관내피세포에서 발현되는 Icam 2 프로모터에 연결한 TBM 발현 구조체에 역방향으로 연결한 CAG - pmMCP - pI2 - mTBM -R 벡터와 CAG -pmMCP-pI2-TBM-R 벡터를 제작하였다(도 3의 B).
3.
MCP와
TBM
동시 발현 대조군 벡터
도 3과 같이 염기서열을 치환하여 변경하면 이 벡터가 도입된 동물 또는 동물 세포에서 도입하면 그 발현 수준이 증가하는 지 알아보기 위하여 대조군으로 MCP와 TBM 염기서열을 치환하지 않았지만 구조는 동일한 전 조직 동시 MCP 및 TBM 발현 벡터 CAG - hMCP -2A- TBM 벡터와 MCP는 전 조직에서 TBM은 혈관내피세포에서 특이적으로 동시에 발현되도록 설계된 CAG - hMCP - pI2 - TBM -R 벡터를 제작하였다.
염기서열의 변경으로
MCP와
TBM
발현의 확인 결과
도 3과 같이 제작한 벡터와 대조군 벡터에서 MCP와 TBM이 발현하는 지를 분석하고자 생쥐 유래 NIH3T3 세포에 도입하였다. NIH3T3 세포는 TBM 발현을 위해 사용한 Icam 2 유전자를 발현하기 때문에 선택하였다. 4종의 발현 벡터를 NIH3T3 세포에 도입한 후 mRNA로 전사되는 발현 수준을 분석하였다. 염기서열이 변경되었기 때문에 변경하지 않은 벡터와 변경한 벡터가 도입된 세포를 각각 RT-PCR 분석을 실시하였다. 도 4의 A와 B에서 보이는 것과 같이 염기 서열의 변경에 관계없이 MCP와 TBM의 mRNA 발현 수준이 증가하였다.
또한, 단백질로 번역되는 발현 수준을 알아보기 위하여 유세포분석기(Flowcytometry)로 분석하였다. 그 결과 mRNA 전사체로 발현 수준이 증가하였던 대조군에서의 발현은 Isotype control 및 유전자를 도입하지 않은 Wild type와 유사한 수준으로 매우 낮았지만, 염기서열을 변경한 CAG - pmMCP -2A- mTBM 벡터와 CAG -pmMCP-pI2-mTBM-R 벡터가 도입된 세포의 경우 약 17%로 증가하였다(도 5).
한편, TBM의 단백질 발현은 전 조직에서 MCP와 TBM이 발현되도록 설계된 CAG-hMCP-2A-TBM 벡터에서만 발현되지 않았고, CAG - pmMCP -2A- mTBM , CAG - pmMCP - pI2 - TBM -R 벡터와 대조군의 CAG - hMCP - pI2 - TBM -R 벡터에서 단백질 발현이 증가하여 염기서열 변경의 효과는 적은 것을 알 수 있었다(도 6).
결과적으로 MCP cDNA는 mRNA로 전사되는 발현 수준은 높지만, 단백질로 번역되는 수준이 매우 낮았으므로, 본 출원인은 염기서열 변경을 통해 MCP와 이에 연결된 TBM이 단백질로 번역되는 수준을 향상시킬 수 있었다.
나아가, 출원인은 돼지 세포에서도 MCP와 TBM cDNA의 염기서열을 변경할 경우 단백질로 번역되는 발현 수준이 증가하는 지 알아보기 위하여 돼지의 귀조직에서 추출한 섬유아세포(Fibroblast)에 CAG - pmMCP -2A-mTBM 벡터와 CAG - pmMCP - pI2 - mTBM -R 벡터 및 대조군으로 CAG - hMCP -2A- TBM 벡터와 CAG - hMCP - pI2 - TBM -R 벡터를 도입한 후, 유세포분석기로 MCP의 발현을 분석하였다.
그 결과, 도 7에 나타난 바와 같이, 대조군에서의 발현은 Isotype control과 유전자를 도입하지 않은 Wild type 수준으로 매우 낮았지만, 염기서열을 변경한 CAG-pmMCP-2A-mTBM 벡터 및 CAG - pmMCP - pI2 - TBM -R 벡터에서는 MCP의 발현이 크게 증가하여, NIH3T3 세포에서와 마찬가지로, 염기서열을 변경을 통해 MCP가 단백질로 번역되는 수준을 향상시킬 수 있었다.
고 효율로
MCP와
TBM을
발현하는
GalT
-/-
및
GalT
-
MCP
/-
MCP
세포주 제작
돼지의 장기를 영장류에 이식하면 발생하는 초급성 거부반응의 원인 유전자인 알파-1,3 갈락토실트렌스퍼레이즈(alpha-1,3 galactosyltransferase)의 기능이 제거(GalT-/- 및 GalT- MCP /- MCP)된 240번 암컷 돼지와 242번 수컷 돼지(GalT-/-)와 23-4번 암컷 돼지(GalT- MCP /- MCP)의 귀조직에서 섬유아세포를 분리한 후 실제로 GalT 유전자가 knock-out이 되었는지를 확인하기 위해 유전자 분석을 실시하였다. 그 결과, 도 8에 나타난 바와 같이, 240번과 242번 돼지는 모두 GalT-/-이며, 23-4번 돼지는 GalT-MCP/-MCP라는 것을 확인하였다.
또한, 240번, 242번, 23-4번 돼지 모두 GalT 유전자가 knock-out 되어 실제로 Gal 항원을 발현하지 않는지 유세포 분석 방법으로 분석을 실시하였다. 도 9에 나타난 바와 같이 정상 돼지(GalT+/+)에서는 Gal 항원 발현이 관찰되지만, 240번, 242번, 23-4번 돼지에서는 그 발현이 확인되지 않아, GalT 유전자의 기능이 제거된 돼지라는 것을 확인하였다.
유전자형이 GalT-/-인 240번, 242번 돼지와 GalT- MCP /- MCP인 23-4번 돼지에서 추출한 섬유아세포에 CAG - pmMCP -2A- mTBM 벡터와 CAG - pmMCP - pI2 - TBM -R 벡터를 각각 도입한 후 Anti-FITC MicroBead와 FITC-conjugated MCP 항체를 사용하여 과발현하는 세포의 선별 과정을 2회 실시하였다. 그 결과 240번, 242번, 23-4번 돼지에서 추출한 섬유아세포에서 CAG - pmMCP -2A- mTBM 벡터와 CAG - pmMCP - pI2 - TBM -R 벡터의 도입으로 MCP와 TBM이 고 수준에서 과발현하고 혈관내피세포 특이적 프로모터인 돼지 Icam2에 연결된 TBM은 낮은 수준에서 발현하여 프로모터가 특이적으로 작용하는 것을 알 수 있었다(도 10, 도 11, 및 도 12).
세포에 도입된 발현 벡터는 염색체에 무작위로 도입되기 때문에, 도입된 위치에 따라 발현 수준이 다르게 표현되는 위치효과(position effect)를 받게 된다. 따라서 cDNA의 염기서열을 변경시킨 MCP와 TBM이 고 효율로 발현이 되는지 알아보기 위하여 CAG - pmMCP -2A- mTBM 벡터와 CAG - pmMCP - pI2 - TBM -R 벡터를 242번, 23-4번 돼지 유래 섬유아세포에 도입 후 Anti-FITC MicroBead와 FITC-conjugated MCP 항체를 사용하여 과발현하는 세포의 선별 과정을 2회 실시하였고, 선별된 단일 세포를 96-well 접시에서 배양하여 단일 클론을 확보한 후 배양하였다. MCP와 TBM의 단백질로 번역되는 발현을 분석하였다.
도 13과 도 14에 보이는 것처럼, CAG - pmMCP -2A- mTBM 벡터(도 13)와 CAG -pmMCP-pI2-TBM-R 벡터(도 14)가 도입된 세포에서 MCP의 발현 수준이 클론에 따라 다르지만, 거의 100% 수준에서 발현하고 있어 도 1에서와 같이 염기서열의 변경으로 고효율로 MCP가 발현된다는 것으로 보여주고 있다.
MCP cDNA의 염기서열을 변경하면 FMDV 2A 염기서열을 매개로 연결된 TBM의 발현 수준이 MCP의 발현 수준에 영향을 받는지 알아보기 위하여 유전자형이 GalT-MCP/-MCP인 23-4번 돼지의 섬유아세포에 CAG - pmMCP -2A- mTBM 벡터를 도입 및 2회 선별 후 단일 클론 중에서 MCP를 높은 수준에서 발현하는 클론과 낮은 수준에서 발현하는 클론을 선택하여 TBM의 발현을 분석하였다(도 15). 그 결과 MCP 발현 수준과 TBM의 발현 수준은 상관관계가 있는 것으로 판명되었다.
결론적으로 MCP cDNA를 사용한 발현벡터를 동물 세포에서 도입하면, 효율적으로 mRNA로 전사되지만, 단백질로 발현되는 수준이 낮은 문제점이 있다. 본 발명에서와 같이 염기서열을 도 1과 같이 변경하면 고 효율로 mRNA로 전사되고, 단백질로 발현되며, 이를 통해 TBM의 발현 수준도 증가시킬 수 있다.
세포주를 이용한 복제난자 생산
40 ~ 44시간 동안 체외성숙이 완성된 돼지 난자의 핵을 제거한 다음 동결융해 후 3일 정도의 추가 배양없이 배양기에서 1시간 정도만 안정화를 시킨 유전자가 도입된 형질전환 체세포를 핵이 제거된 난자의 위란강에 넣어 세포질과 밀착을 시킨다. 30분 동안 안정화가 끝난 재구축 난자를 250 μm 폭의 전기선으로 구성된 융합 챔버(fusion chamber, BLS Fusion Electrode, Budapest, Hungary)에 0.3 M mannitol, 0.1 mM MgSO4과 1.0 mM CaCl2 및 0.5 mM Hepes가 첨가된 용액으로 침지한 다음, 1초 간격으로 30 μsec 동안 1.2 kV/cm 전압의 DC 전극을 2회 LF101 Electro Cell Fusion Generator (NepaGene Co., Ltd., Japan) 장비로 통전 실시하였다.
복제 돼지
생산
전기융합이 확인된 재구축 복제난자는 2시간 이내에 발정기 대리모의 자궁에 이식하였다. 이는 복제난자의 체외노출 시간을 최소화함으로서 부적절한 배양환경에 노출되는 것을 막고자 함이다.
이상으로 본 발명을 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서, 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시 양태일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.
<110> RURAL DEVELOPMENT ADMINISTRATION
<120> Gene constructs for expression of hMCP and hTBM and vector
comprising the same
<130> NPF30772
<160> 2
<170> PatentIn version 3.2
<210> 1
<211> 1213
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 1
ggaactcgga gaggtctccg ctaggctggt gtcgggttac ctgctcatct tcccgaccat 60
ggaaccccct gggcggagag agtgcccatt ccccagttgg agattccccg gcctcctgct 120
ggccgccatg gtgctgctgc tgtacagctt cagcgacgct tgcgaggaac cccccacctt 180
cgaggccatg gaactgatcg gcaagcccaa gccctactac gagatcggcg agcgggtgga 240
ctacaagtgc aagaagggct acttctacat cccccccctg gccacccaca ccatctgcga 300
cagaaaccac acctggctgc ccgtgtccga cgacgcctgc tacagagaga catgccccta 360
catccgggac cccctgaacg gacaggccgt gcccgccaac ggcacctacg agttcggcta 420
ccagatgcac ttcatctgca acgagggcta ctacctgatc ggcgaagaga tcctgtactg 480
cgagctgaag ggcagcgtgg ccatttggag cggcaagccc cccatctgcg agaaggtgct 540
gtgcaccccc ccacccaaga tcaagaacgg caagcacacc ttcagcgagg tggaagtgtt 600
cgagtacctg gacgccgtga cctacagctg cgaccctgcc cctggccccg accctttcag 660
cctgatcgga gagagcacca tctactgcgg cgacaacagc gtgtggtcca gagccgcccc 720
tgagtgcaag gtggtgaaat gccggttccc cgtggtggaa aatggcaagc agatcagcgg 780
cttcggcaag aagttctact acaaggccac cgtgatgttc gagtgcgaca agggcttcta 840
cctggacggc agcgacacca tcgtgtgcga cagcaacagc acctgggacc ctcccgtgcc 900
caagtgcctg aaggtgtcca ccagctccac caccaagagc cccgccagca gcgccagcgg 960
ccccagacca acatacaagc cccccgtgtc caactacccc ggctacccca agcccgagga 1020
aggcatcctg gacagcctgg acgtgtgggt gatcgccgtg atcgtgatcg ccatcgtggt 1080
cggagtggcc gtgatctgcg tggtgcccta cagatacctg cagcggcgga agaagaaggg 1140
caaggccgac ggcggagccg agtacgccac ctaccagacc aagagcacca cccctgccga 1200
gcagcggggc tga 1213
<210> 2
<211> 1888
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 2
ggctgcctcg caggggctgc gcgcagcggc aagaagtgtc tgggctggga cggacaggag 60
aggctgtcgc catcggcgtc ctgtgcccct ctgctccggc acggccctgt cgcagtgccc 120
gcgctttccc cggcgcctgc acgcggcgcg cctgggtaac atgctgggcg tgctggtgct 180
gggagccctg gctctggccg gcctgggatt tcctgcccct gctgaacctc agcctggcgg 240
cagccagtgc gtggaacacg actgctttgc cctgtacccc ggacccgcca ccttcctgaa 300
cgccagccag atctgcgacg gcctgcgggg ccatctgatg accgtgcgaa gcagcgtggc 360
cgccgacgtg atcagcctgc tgctgaatgg cgacggcggc gtgggacggc ggagactgtg 420
gattggactg cagctccctc caggctgcgg cgaccctaag agactgggcc ccctgagagg 480
cttccagtgg gtcaccggcg acaacaacac cagctacagc agatgggcca gactggacct 540
gaatggcgcc cctctgtgcg gccctctgtg tgtggctgtg tctgcagccg aggccaccgt 600
gcctagcgag cccatttggg aggaacagca gtgcgaagtg aaggccgacg gcttcctgtg 660
cgagttccac ttccccgcta cctgtcggcc tctggctgtg gaacctggcg ctgctgccgc 720
tgccgtgtct atcacctacg gcaccccctt tgccgccaga ggcgccgatt ttcaggccct 780
gcctgtgggc agctctgccg ccgtggctcc tctgggcctg cagctgatgt gtacagcccc 840
tcctggcgcc gtgcagggcc attgggctag agaagcccct ggagcctggg actgctccgt 900
ggaaaatggc ggctgcgagc acgcctgcaa cgccatccct ggagccccta gatgccagtg 960
tcctgccggc gctgctctgc aggccgatgg caggtcttgt accgccagcg ccacacagag 1020
ctgcaacgac ctgtgcgagc acttctgcgt gcccaacccc gaccagcccg gcagctacag 1080
ctgcatgtgc gagacaggct accggctcgc cgccgatcag cacagatgcg aggacgtgga 1140
cgactgcatc ctggaaccca gcccctgccc ccagagatgc gtgaacaccc agggcggctt 1200
cgagtgccac tgctacccca actacgacct ggtggacggc gagtgtgtgg aacccgtgga 1260
cccctgcttc cgggccaact gcgagtacca gtgccagccc ctgaaccaga ccagctacct 1320
gtgcgtgtgc gccgagggct tcgcccccat tccccacgag ccccaccggt gccagatgtt 1380
ctgcaaccag accgcctgcc ctgccgactg cgaccccaat acccaggcca gctgcgaatg 1440
ccctgagggc tacatcctgg acgacggctt catctgcacc gacatcgacg agtgcgagaa 1500
cggcggcttc tgcagcggcg tgtgccacaa cctgcccggc accttcgagt gcatctgcgg 1560
ccctgatagc gccctggcca gacacatcgg caccgactgc gatagcggca aggtggacgg 1620
gggcgattct ggcagcggag agcctcctcc tagccccacc cctggcagca cactgacacc 1680
tccagccgtg ggcctggtgc actctggcct gctcatcggc atctctatcg ccagcctgtg 1740
cctggtggtg gccctgctgg ctctgctgtg ccacctgaga aagaagcagg gcgctgccag 1800
agccaagatg gagtacaagt gtgccgcccc tagcaaagag gtggtcctgc agcacgtgcg 1860
gaccgagaga accccccagc ggctgtga 1888
Claims (13)
- 서열번호 1로 표시되는 염기서열을 갖는 인간 MCP 발현용 유전자; 및
서열번호 2로 표시되는 염기서열을 갖는 인간 TBM(thrombomodulin) 발현용 유전자를 포함하는, 유전자 구조체.
- 삭제
- 삭제
- 제1항에 따른 유전자 구조체를 포함하는 벡터.
- 제4항에 있어서, 상기 벡터는 프로모터를 더 포함하는 벡터.
- 제5항에 있어서, 상기 프로모터는 전 조직에서 발현을 유도하는 프로모터인 벡터.
- 제5항에 있어서, 상기 프로모터는 혈관내피세포에서 발현을 유도하는 프로모터를 더 포함하는 벡터.
- 제4항에 있어서, 상기 벡터는 상기 인간 MCP 발현용 유전자와 상기 인간 TBM(thrombomodulin) 발현용 유전자가 역방향으로 연결된 벡터.
- 제4항에 따른 벡터를 포함하는 형질전환 세포주.
- 제9항에 있어서, 상기 세포주는 GalT-/- 또는 GalT- MCP /- MCP인 형질전환 세포주.
- 제9항에 따른 형질전환 세포주를 핵이식하여 제조하는 단계를 포함하는 인간 제외 동물의 형질전환 복제 난자를 생산하는 방법.
- 제9항에 따른 형질전환 세포주를 핵이식하여 제조된 인간 유래 MCP 및 TBM 단백질을 발현하는 형질전환 복제 돼지.
- 제12항에 따른 형질전환 복제 돼지를 사육하여 장기를 적출하거나, 이들의 생식세포 또는 체세포를 이용하여 장기를 생산하는 것을 포함하는 이식용 이종 장기의 생산 방법.
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-
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Non-Patent Citations (3)
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| GenBank: AF495471.1 |
| J. Emb. Trans. (2013) Vol. 28, No. 3, p. 289～295 |
| Wuensch A. et al, Transplantation 97(2):pp.138~147. (2014. 1.27.). |
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