BR112012002151A2 - Métodos para expressar uma desintegrina e metaloproteinase com proteína de motivo trombospondina, para produzir uma composição de desintegrina e metaloproteinase com proteína de motivo trombospondina, para produzir uma composição de desintegrina e metaloproteinase com proteína de motivo trombospondina,e, composição de proteína de desintegrina e metaloproteinase com proteína de motivo trombospondina. - Google Patents

Abstract

métodospara expressar uma desintegrina e met aloproteinase com proteína de motivo trombospondina, para produzir uma composição de desintegrina e metaloproteinase com proteína de motivo trombospondina, e, composição de proteína de desintegrina e metaloproteinase com proteína de motivo trombospondina a presente invenção fornece meios de cultura que são úteis para a expressão de proteínas adamts, tal como adamts13. métodos para a expressão e a purificação de proteínas adamts também são fornecidos. em algumas modalidades, os meios e os métodos da invenção são úteis para a expressão de proteínas adamts tendo altas atividades específicas. também são fornecidas adamts, por exemplo, adamts 13, composições de proteína com altas atividades específicas que são expressas e purificadas de acordo com os métodos fornecidos neste documento.

Description

“MÉTODOS PARA EXPRESSAR UMA PROTEÍNA DESINTEGRINA E METALOPROTEINASE COM MOTIVO TROMBOSPONDINA, PARA PRODUZIR UMA COMPOSIÇÃO DE PROTEÍNA DESINTEGRINA E METALOPROTEINASE COM MOTIVO TROMBOSPONDINA, E, COMPOSIÇÃO DE PROTEÍNA DESINTEGRINA E METALOPROTEINASE COM MOTIVO TROMBOSPONDINA.”

REFERÊNCIA CRUZADA A PEDIDOS RELACIONADO

O presente pedido reivindica o benefício do Pedido Provisório US 61/230.477 depositado em 31 de julho de 2009, que é expressamente incorporado neste documento por referência na sua totalidade para todos os fins.

DECLARAÇÃO QUANTO AOS DIREITOS ÀS INVENÇÕES REALIZADAS MEDIANTE PESQUISA OU DESENVOLVIMENTO PATROCINADO PELO GOVERNO FEDERAL

NÃO APLICÁVEL

REFERÊNCIA A UMA LISTAGEM DE SEQUÊNCIAS, UMA TABELA A, OU UM APÊNDICE DE LISTAGEM DE PROGRAMA DE COMPUTADOR APRESENTADO EM UM DISCO COMPACTO

NÃO APLICÁVEL

FUNDAMENTOS DA INVENÇÃO

As proteínas ADAMTS (uma desintegrina e metaloproteinase com motivos de trombospondina tipo I) são uma família de metaloproteinases que contêm uma série de domínios conservados, incluindo um domínio catalítico dependente de zinco, um domínio rico em cisteína, um domínio tipo desintegrina, e pelo menos um, e na maioria dos casos, múltiplas repetições de trombospondina tipo I (para revisão, ver Nicholson et al., BMC Evol Biol. 2005 Feb 4;5(1):11). Estas proteínas, que são evolutivamente relacionadas com as famílias ADAM e MMP de metaloproteinases (Jones GC, Curr Pharm

B no» Km, O <i<» enz*m,\ -mmemdjx q.e ím im ligadas a «a número de doenças e condições incluindo púrpura trom'bocitoj>êffi'ea trombotieu 0'1 P) (\loakc .Π , Κ·ηηη HcmatoL 2U04 Lm:4h 1 >.4-l-U, distúrbios do tecido οο0ηηύνο, câncer. inflamação 5 (Nichofeou -eí fo.) e malária grave por P/awodfom (Larkin e/ a/.,

FLoS Pmhog. 2òu9 Mar;5(3):c 1000349). Devido a estas associações, as enzimas de Α1ΗΜΓ5 lem sulo reconhccLLs emnc aLo\ tempculLo·^ potenmam para um número de patologias (Jones GQ Cum Pbarm BiotechnuL 2006 ΚΑ'ιΠ^'-ηί W'm a·- mctodos ca moduçào oe cor des

1.() rendimentos: de proteínas AOAMTS tendo elevadas atividades espeuírieas, que são livres de comamfoantes, tais como vírus, BSE. e paiògcnus tipo hactcn * x únv/'-' awa. mx\ x^nuv

Para a cultura de células, particuLmrnme células cumirioiicas, e mais ospc.u tieamcme edmss de mamdero, exLte um i mxesMdadc 15 constante de usar meios de cultura especiais fornecendo substânctas nutrientes gue são necessárias para o crnsoímento- eficiente de células e para a produção de produtos biológicos, especialmente biofirmacos, tais como, por exemplo, proteínas recomhinames. anoeorpos. viras, tmügmms x irais, e punmdas ripo vírus, Para a p-udueào cheieme de tais produtos biológicos, e importante 20 alcançar uma densidade de células ótima, bem como um aumento da exptvymo da pmtemu em d. a fon d·' ubtero semãmvmo máximo do produto

As formulações de meios de cultura, de células foram \upkmemadm' xom uma mixa de adurio rndumdo eompoaeme iadetlnufos ppo ore feuil de \ àelo (FCSL pmlemas derhudus de sarios ammam e ou 25 hídrolisados de proteínas de origem bovina, bem como hidrolisados de proiemas derix advs de plantas «m de kn edar.i, *· Em geral, as substâncias derivadas de soro ou soro, tais como.

per exemplo, albumiua, transferriua ou insuHtta, pedem compreender agentes indesejadus que podem contaminar os cultivos_: de células e os produtos ¥

''I ^,s eku <.<>-> cfo on mrom \km< wo adbro-» denudes de rooH u\v>* turn de ser testados para todos os virus conhnnidos, inefoindo os virus_: da hepatite c do HIV. que podem: ser transmitidos através de soro. Além disso, ό soro bovino e produtos derivados de mesmo correm o risco de uoirtantimçúo 5 por BSE. Além disso, todos os produtos derivados do soro podem ser mm rnmad<^ pot xuhstàmna^ oeuonheckku Quando se uro \oro ou wIoa de proteínas derivados de fontes humanas ou animais em cultura de células, avistem numerosos problemas (por exemplo, a qualidade variavel na composição de diferentes lotes e o risco de cumminação com mieoplasma, ” 10 vírus ou BSE), particulamieute se as células sao usadas na fabricação de medicamentos ou vacinas para .administração humana.

Portanto, muitas tentativas têm sido feitas para fornecer sistemas hospedeiros eficientes e condiçoes de cultura, que nao requerem soro ou ouírox e«»mp,»sto‘- de proteína de unimal.

Tais meios livres de soro foram desemroivldos com base de extratos de proteínas derivados de plantas ou leveduras. Por exemplo, os fodroWados de soja: são conhecidos por serem úteis para os processos de fermentação e podem intensificar o crescimento de muitos organismos, leveduras e fungos exigentes. G WG W2b2ú6 descreve que di gestos: de 20 papaíc de ferinha de soja são uma fonte de carboldmto e nitrogênio e muitos dos cíimpóoentes podem ser usados em cultura de- tecidos. Pranek er (Bíou chaokma Prognro foPOPl fo desero.em o crere.menm c a produiividade promovendo os eleitos da soja dellnidos e as trações pepiidicas de hidroíisado de trigo.

O WO 96/15231 descreve um meio isento de soro composto \ por um meio rninímo Mnict'co essencial e um extrato de levedura para a propagação de células de vertebrados e um processo de prtxluçdo de vírus, Uma formulação de meio composta por um meio de cultura de células basais emnprevVxkndo nm pcpoqeo de unw e um extrato de lexecura e um J'gesto enzitftãiieo cto mesmo, β/W- W Üpideo planta para p vreseimentu de células aniitidh '' Jíc uie.uto er·' \\ Ο o^ ι se Π l n> ”ν>ο eompmo' dendv htmetojèo de wja purificado para o cultivo de células .mcombituamcx v divuleado cm WO 01/23527. O WO 00/03000 ·.divulga. um meio que compreende um 5 aid'díadi‘ de va e um estrato de lexedum. mas também tequer a pre>vmu de íbrns.s te.vmbmanies de proteínas animais. tais como fatores de crescimeuíoΟ 0Ρ-Λ-0 481 descreve urn meio de cukura bioqui*' fe.ammtu dcHmdo para a cukunx de eéhòas CHO projetadas, que e 10 'se*úo de pmt-ur.i, iipuleo. e carboiJratn i^<*lad‘> a partir de mua fonte acimak compuerdendo ainda uma msfema axombmaak· auatopo de ^!n<edma. pepiona de soja e putresema digeridas em papafea a 1% a 0.025 % p/v. O WO u$ 0s^lf'4 descreve um eultho de eefefes eneanidcíb isento de soro Lvmpn.ender.Jn pepudco*' de sníu hidrolisada ü 10o0 mg I \ 0,0 i a 1 ην 1 15 de nuUeseha e uma xartedade de eompouemes de~txadn> de araman, incluindo albumina. fetutua, x .iricw hormônios e ouuus pnaieinas. Mesro eçmexM deve-se mtar que a. putreseina também, é eunhedda jw ser eousttoída em meios padrões tipo DMhM Ham’s F12 em uma eoueenuuçan de 0_;0S mg/L.

A ulanta e/ou htdroltsadoa e levedura, w -entauM sãt> misturas x ...... ' ’ .· .;.· fhdeSífidM de <dígepeptfdeòs e outros eompoueutes t ecmtamma.ntes desconhecidos. Hem di*so. a qualidade em Wteládas disponiveis somercialmente de hidrolisados varia exíremameme. Como msnaaJo_? existem grandes variações, na produção de preteínas recçmbmames ou prudums vírais

2.5 (uma variação de até um fator de três) cutno uma fimçãu dos lates dé hidrolisados asados Çfearfeção em batelada a hste inconveniente .tfeia a proliter.K.iM das celufex. bent emno a expressão Ja prntemo de eada eetoki O 1 h ?0O7 (Ό0 de^rne vários tuefes de euhum quimicamente defmklo-v hx res de protema e Ihren de oligopepudco de anittsais, que slo meis para a produção em grande escala de produto bkh'mmacvulko'' de proteína rec<?mbina?ue.

Dm membro da família de ADAMTS, a AD AM 1SI A diva o fator de von Willebrand (vWF) entre as resíduos de Tyr 1405 e Met 1406, 5 uma fimçãu responsável pela degradação de multímeros de vWF grandes m vmx A perda de atividade de ADAMES 1:3 tem sido associada a certo numero de conJtçòcx. lai- ω!η·> i 1 p AUke .11 . Sema Hciuand 20u4 MnAMb»14), inflamação aguda, e crônica (Chauhan et M, J Exp Med. 200b Sep 1:205(9):2065-74) _e, mais recentemenfe, malaria por .Plasmodium felcipamm. 10 grave (Larkin, eí <, PLoS Wlbog. 2009 Mar 5 í 3 l; c 109i 8 4 9 r

A. purpura trombocitopênica tmmbòtma ΕΓΤΡ) e um dístórbío caracterizado por rmeroangiopatia fmmbátíça., tromhvncpenm e trombose mierovaseular que pode causar vários graus de isquemia teeidual e iatmto. ChrJcanmnU·. paemukv u>íh Π P sim dmgimvkvumu por 4umma> tafe T5 como riombocitopenia, esquizôcítos (feagmcntos de eritrócitos) e níveis elevados de lactato desídrogenase (Moake J L, Thrombotic microangíopatiiias. N Engl J Med. 2002; 347:589-000: J U vou

Willebrand, factor, ADÁMTSI3, e thrombotic thrtvm.bocytopemc purpura. Semin HemaMk 2004; 41:4-14: Sadler J E, Moake J U XhyaLi T, George J R 20 Recent arhcnees in thrombotic thrombocytopenic purpura. Hematology (Am Sue Hematol Ldue Program.). 2()04-. )07..423: Sadler J E. New concepts in von WiHebrand disease. Amm Rev Med. 2005; 56:1.73-191).

Em 1982, Moake et al verificaram invulgarmente grandes muitímeros de fetor de von Willebrand -.(UL-vWF) no plasma dos pacientes 25 cum IIP de reincidem ia crè‘ne.b Aloake J I. Ruds C k, I m2 J Ik Weinstein .M J. Cukmmno N M. Azacar J, Seder R ll. Hong S L, DeMin D, I nusumly large pl.oma fetor \ ΙΠλοη Abk'bnmd fator muhimem Its chronic unapx ng tmumbom thmMxxxtopeme mnpam Engl J Med 1982; 0⁷ N32~M?5í A bgaçào tu;rv j I I 4\W e ΠΡ ganhou suporte com a^ xeniKtçAes fedçpendmúro par Jferlan M e Tsal c I ian que a maioria dos pacientes que sofrem. de TTF sáo deficientes em uma metaloprotesse de ruusm.u agour ωιιΜ'ΐώ’ coam ^endo AH \M I SI \ <jue Una a \ \\ Γ tl'ul;m M> Robles R, Sedemhaler M» Wassmer M, Sandoz P, Laemnde B. Deficient 5 amity of von 'Willebraró iàtor-d caving protease in chrome rofepUng thrombotic thrombocytopenic purpura. Blood. 1997; 89:3(19/-3103: Fsai II Sussman, I k IX I aul-dwf lb S:w J J Nagel R I PtciouAtm cleavage of recombinant type 2A von Willebrand fâtor mutants RS34W e R834Q: inhibition by doxycycline e by monoclonal antibody ¥F-L Blood, 10 1997; 89:1954-1962; Tsai H M_? Liao B C Antibodies to von Willebrand fetor-cleaving protease in acute íhrombuue íhromboeyíc^oiç purpura. N l-rml J Med. Nog; 339,\5&5-.594i.

A prouxwe ADAMI'S 13 _e uma pratenu glicosilada de 190 kDa produzida prodominaotemcàte pelo figado (Levy G G. Nichols W C_s .15 Lian I C» Foroud If McClmfick. J N, McGee B M, Vang A V, Sienncniak D R, Stark K R, Gruppo R. Strode 1<_X Shurm S B, Ghundrasekamn \ . Slab'vr S P₅ Sabin H, Bouhassira E E, Upshaw J D, Jr., Ginsburg. D, Tsai Η M. Miuatious in a nivnibej oi (he MAAMIS gene fmiux cause faromhotic thrombocytopenic purpura. Nature. 2091; 413:-488-494: Fujikawa K, Suzuki 20 lb McMullen B, Chung 1λ Purification of human von Willebrand fatorcleaving protease e Its identitleation as a new member of the metalloproteinase family. Blood. 2001; 98:1662-.1666: Zheng X. Chung D. Takayama T K. Majerus E M. Sadler J 12 Fujikawa K. Structure of von Willebrand iaior-deaving protease (ADAM VS 13), a metal loprotease involved 25 in (hrmnbvtio (hromboc>tupenlc purpura. .1 Biol Chem, 2001; 27(:-:4105941d(>0 Seejima K, Mimura N\ Ifiradinna M, Maeda Ik I hm.mmro L Nskagaki Ί. No/aki C. \ novel hunuu mctuHnprotcase wntlw^i/ed in the liver e secreted Into the blood: possibly, the von \\ die brand taba'-cleac ing groieaw. J Biociicm (lol}oi. 20Μ< I M4'^s lS^fn Gcrr-twa H b. Roble? K, anrt'L· IV I urlan M. PutiJ ammeaud ^queues of pm med >on VnlleHmd feõm-cleavmg protease, Blood. 2001; 98:1654-1661).

As mutações no gene AD AMTS 13 têm mostrado causar ΙΊΡ (Levs·· G G. Nichols A C Lian F C, bemud Γ. McCImlick J N. McGee B M, S Yang A ¥, Siemieniak D R. Stark K R, Gruppo R, Sarode R._f Shurin S B, Chrmdmsekaran V, Stabler b I\ S;fem H. Houhassim L Γ. I sMmv, J IT Jr., G insburg D_ft Tsai Η M. Mutations in a member of the ADAMTS gene family cause thrombotie thrombocytopenic purpura. Nature. 2001; 413:488-494). A TIP ídmpâtiua, muitas vezes causada por atmmmictapos que inibem, a IQ. atividade de ADA.M'TS-13, é um distúrbio mais cornam: que. ocorre em admtO''' e eú.ax^s mam sdhas v podem mcmrm em uttet valos reg danw cm 1 1% a m% do^ pacientes t Isal Η Μ. I am 1' l . Wibodics to um Wdkbmnd fator-deavmg protease in acute thrombotic thrmnbooytopenie purpura. N I «η J Mee Pa) 1 Gm hr' Μ. I ammk B iVuaenm of von '<χ.· ;·. .-. *

IS. Willebrand fetor-cleaving protease in familial e acquired thrombotic ihrombuuympcmc purpura. Badheres CHπ Haematol. 190$, 11:5ü9~5p.|\

Os autoanticorpos nho neutralizautes podem também inibir a atividade de ADAMTS13 pela indução da depuraçao da circulação (Scheiffinger F_s feiabl P< Trattner B, Piaimauer B, Mohr G, Doekal M., 20 Dornvr F, Rieger M. NomieutmHAng IgM e IgG antibodies to \nn A íHebratid tamrchvn me. protease (XDAMISJM in a patient with thrombotic· thrombocytoperrie purpura. Blood. 2003; 102:3241 -3243 i. A atividade de ADAM (Sit dn Plasma em adultos saudavais vmía de 5(Fa a l?8% (Muake J I..., Thrombotic thrombocytopenic purpura, e the hemolytic uremic syndrome. 25 Arch Pathol Lah Med. 2002; 1260430-1433y Na matorta dos pueienk-v e«»m Π P familiar ou ndqtm'ida. a utix idade de \DAM I'Sl ' do pi wna e<a uawnk ou é mentis do qua 5% da atividade normal. Sem tratamento, a taxa de mortalidade para. TTP exccdc 90%, mas a terapia de plasma tedu. u a mortalidade para cerca tie 2025 (Moake J 1.. Thrombotic thrombocytopenic purpura e the hemolytic uremic syndrome. Arch Pathol Lab Med. 2002; .126:143 0-1433),.

O \ Al· smtetUado cm meganariochos c cehílas enduteliais ê mnazenadu em plaquetes de α grânulos e corpus de Weiltel-Palade, 5 i< gxxth mnenm. como \ A'l ultra grande (Il \VU ) (Xlo.Ae I I Racy Γ k. Troll J H, Weinstein M' J, (.clannino N M, X/oear J. Sadrs R ll. I long S L, Deylcm D. Unusually large plasma fetor Vlllmon Willebrand fetor multimem in chronic relapsing thrombotic dtrombovx topcnic purpura. N f.ngl J Med. 1982; 307:1432-143 5; Wagner D D, Olmsted J B,. Marder V J.

Immmioloc.uMfeen of von Willebrand protein in WmbeLFalade bodies of human endothelial cells. J Cell BioL 1982; 95:355-3604 Waynes D D, B^nf.mts R. \on Aihebnind fetor c the endmhdium. \h\u CHn Proc. 1^!T)|; ntmCI-O??; Spurn L .Λ. Xlaider X' J, Wagner Ο I) \on Ailfebr.md fetor released from A'vibel-Pafedc bodies hinds more avidls to vXtiacellular matrix :\in that secreted ^onstm-ttseh Blood, NS; tW’^v U Ί?>4; Imi ll XL Nagel R I , llaieher V IL Sussmam I L Endothelial cell-derived high molecular ueigfe van Adicbrtmd later m converted into the plasma mdmuer pattern by granulocyte proteases. Blochcm Biophya Res Commum 1989; I 58:980-985; Tsai I t M, Nagel R .1 _s tkneher X Ik Xussrnam I L Multimeric composition of endoihelial cell-derived von Willebrand fetor. Blood. 1989: 73:2074-2070] I ma vez -secreutda a partir de células endotelkns» tuts mullimero', de I I -x A E sac vhxad*>s par \1)ΛΜ 1X15 em eircukieào em uma serie de nmhmtcrus menores em. sítios de clivagem específicos no interior da molécula de vWF (Tsai H XL Nagel R 1.., Iktmher V B, Sussman. I L

Endothelial cell-derived high molecular weight von Wdlebiand fetor is converted into the phi ana muHimer pattern b\ ^.ranulocxte ptote^es. Btochcm Bivphx s Res Uotumun, I .'teCtM-WA: Deni J A. < laihu-era XL Rugpcri / XL HvterC'geneiix of plasma xmi Willebrand fetor multmtcrs resulting from proteuNsfe of the constituent subunit. .1 Clin Invest.

bè ' '1 -fob I mUn XL Rebl^ R. Afh-ici IX Xkow D. BatHod F, I ummie B h’pM arae'urc ot \«>n VmlkTomd tah^- rmlects prnteohiic dccradatiun of hich m<>kx.ular weight maltiuKas, F’roc NLfo Acad Sei I SA, foL75d?7507),

5. AD AMTS 13 diva na liígaçlo Tyfo.12 ADtSda no dominio A?

central da subunldade vWF madura e requer zinco ou vãltlo para a sth idade (Dent J A, Berkowitz S IX Ware 3, Kasper C K, Ruggeri Z M Ideniifcaticn of a cleavage site dlreting the immunochemieal detection of molecular abnormalities in type HA von Willebrand factor, Proc A'atl Acad Sci USA, 10 1990; 87:6306-6310). vWF existe :na forma de ^ffodaufe~IW^! e hiamentosa vista par microscopic eUtivmiea (Slayter H,· Loscalzo J,. Bockcnsiedt P» Hat dm R 1 \au\c creformanor. ot hurea con A dlebrand protein Xnnly ό by vknten microscopy e quasi e^!a<>k heir reiuumm J Biol ('ben.

260-.8559-8^03) Além disso, a microscopia de força atômica confirma que

1.5 vWF saí em uma eonformacào globular em condieões estáticas e um estado Πlamentoso desdobrado apôs a exposição à tensão de eísalhamento (Síedlecki Ç A, Lestim B X Kottkç-Áferchánf K. K, Bppell S J, Wilson D Lj Marchrmt R E, Shear-dependent changes in the three-dimensional structure of human von Willebrand tutor. Blood. 1996; SS.foHo.yiftH Isso pode ocorrer também m 20 vhe\ quando uma extremidade do filamento de vWF e ancorado a oma superfície..

< >s trombus de padeulc^ tom I IT νοπο·4οηι cm pouca fibrmu u ponc'pa'nivntc cm v\\ 1' u pLiqaeta-. >ueci ado a ae-egaeào de plaqi.-ctas mediada per xAl· cornu unu causa de trarr.h^r I XxicU V, Sumis θ'-ui X, 25 Hayashi '1, Suzumisa ,L Kakvtuni K himmnoIfotoJiemisn-y of uisenbr lesion in thrombotic thranibocytepenic purpura,· -a hh -peeial reference u> fator \ Hl re atec amfoen Huornb Re\, |9S5; ΆΗρ^ι>- (w doentes ieni I IP reincidente têm um.ume os uUra-grandes no plasma. Os niulttmeros UL-vW.F se acumulam ao longo do nm.ipn, porque a persistência do inibidor (AntiXDAMISH Act d'm'mtti a jthidadc de \DAMVSlm th muilitftcros I'LvWF são Imperatives e desdobram como resuhado da tensão de cisalhamento: e a: <mdo a agreeaçao de plaquetas, resultando em trombose intravascular (Tsai Μ M Von Willebrand faton A0AMTS13,. e thrombotic 5 tmombocx'upemc nutp nu J Mol Mea 2002, SO,0'0 ofc torn ll M. iklvmare ot \HAMIVH >n drvmboiu e ihoanSvsiopeaic purptrj J Ttawb Haemost 2003; E2Ô3O04Ü; discussion, 204 0-2()3 5).

Acredita-se que a. presença de muhimeros UL-vWl· híperreafivos áò plasmá, devido à defictêneíá de ADAMTSI3 podería estar 10 uSMxUda. com um ris» aumentado de trombose arterial assueiada â doença carduea coronárià,

Asdm como prurem,'^ ADAMI'S tom sido implicadas γτ. várias doenças: e -condi.ç&s, há uma necessidade na técnica de mctodos de predííçâo <m bom escala de psotcinss \D\MES -eennvamantcs tendo 15 afividades específicas elevadas, que sau adequadas para a tòrmalaçà» e a adininistração fermàeêútica. A present® invenção fiamece métodos que satisfaçem estas e otMras necessidades na. tecntõa. para á produção e purificação de pn«temas ΑΠΛΜ l S.

BREVE SUMÁRIO OA iNVENÇÂO

I _{Πί U}nt aspecRc a pttstme imeuçàu fiancee método·» de expres.íàu de uma proteína desíategrina e metaloproíeinase com motivos tnmúmqmndma ( \DAMFSt Em ecda> mcdJídade>, o^ metodo^ torneJdvs ttCx^te documento xaniajosameme resultant ent níveis de exprw^ào aumemados e nu produção de preceimts ADAMI'S eom au\k\tdes 25 sub^Lsuciahttcttlc me'Jmradas, I sLt¹' prupriedades mclhomdus pmiem ser alcançadas, em um esemplu, pelo suplemento do meio de cultura usado para a expressão de proteínas ADAMI’S com níveis aumentados de vários ecmponmme^ tal·» como xJcio, cinca, ou nieoònan» da tMumttna Β3Ϊ Etii uma modahdade prei'endm u proteína ADAMTS ê uma proteína AhAMTSl m fim nutro a. i_;nvw.çSo te fere λο a métodos para aumente a ex ec^ao efeu os níveis de atividade de uma proteína ADAMTS pela eultusa de <ch»\ís me^ml-iuautes qve afirmam tm> ar ato m.eUuco çuc codifica uma proteína ADAMI’S em meios químicamente definidos e livres de protem» animal sob condições de cultura de células em halehdm bardada u’imeutada contínua, Em algumas modalidades. este- métodos compreendem o uso de cultivo de células em batelada, batíada alimentada, perfosão, ou qmoãoslato que pode ser realizado em qualquer suspensão de células ou modos aderentes de células- Em uma modalidade preferida, a 10· proteína ADAMTS é uma proteína ADAMTS13, l m cuíre uspemo, a presume weikfe fornece métodos :xtm reduzir a quantidade de perda de atividade durante a purificação de anua proteína ADAMTS, Em. certas modalidades, os método* compreendem mmpèm de pntifiea\âo de supksueamçà» <.om uiveis adicionai-> de efeeio c nu de zinco, Em uma modalidade específica, os métodos referem-se à esíafiíli.mçào da aíumtde de uma proteína ADAM IS durante as etapas de ültrafiltraçao e/ou diafiltraçõo usadas durante a putíficéçdo. Em uma modxlidade preferida, a proteína AD.AMIS è uma proieíua .ADAM TS) 3.

Em amria outro aspecto, a presente invenção refere-se a 2Ô métodos de produção de uma proteína .ADAMI'S com mivtdade aumentada pmu mo na prep, de uma cmnposíçuu tom a*,duties ím ccttos modalidades, estes métodos compreendem o uso de meios de cultura quimicarnente definidos e/ou livres de proteína animal sob condições adequadas para expressão aumentada de uma proteína ADAMTS tendo 25 moíitodc^ aumentadas. Em uma modalidade pretoiida, a pfotema ADAMIS è uma proteína ADAMTS 13.

bm um a-qxvto retoemrmdo, a presume mveueào fernece meios livres de proteína animal, livres de ofigopeptídeos e qmanicmnente definidos que sao úteis para a expressão de proteínas ADXMÍX tendo elevadas atividades específicas, Em uma modalidade preferida, a proteína XI )\\1ÍS e uina ptmerna ΛΠΑΜ l S H,

BREVE DESCRIÇÃO DOS DFSFM1OS

Figura I, Produtividade volumétrica de Frets-vWF73 de

AÍ)\\nSP> tecombinunt^ humana exptema eus <cluhs (Ί IO uJtim.du' em meio isento de proteína animal sob variações de temperatura e condições de pH. Os R'uhad*^ nos experimentos de euhura de cdulas de vfe mostrados como representações de t A) ploiagem de contorno e (B) plotagem. de 'Uperfic-.e de ntoduín idade xolumetfiea nomuli/ada de ΑΠΑΧΗ SI 5 10 FRETS-VWF'73 como uma função da temperatura da cultura e do p,H.

Figura 2, O pixel·* de mh idade esrwdka t FRb I b \ V F?

antígeno por H ISA) de celuLu» ill·) qin e\pie^:ini XHAMfSm vecombinante humana cultivadas em- meio isento de proteína animal sob diferentes condições de temperatura e oil. (A resultados dos xano'* 15 experimentos de cuattra de célula* slfe apresentada mmo representações de (A t pkaagem de eonmnm e i 1D pdnageta ee ^upes fieie de atix idade e^pes. ? Tea vOme un-a função do pH e tempera mm da eu hum, DESCRIÇÃO DETAl Jl A D A DA INVENÇÃO

E Introdução

A$ proteinas ADAMTS (isto e. ADAMTS-l a \H \MfS-SO) são uma família de mctaloprofeínases: de ataco secretadas que parfi’ham uma orgaumaçao de domínio 'modular comum (pars rex isao, ver, Flannery C.R., Fu m” ?OttoJau'JI s-p; mo I vda protoma XH WH S eompattoha uma arquítectura de domínio de núcleo comum, consistindo em um pepttdeo 25 de sinaL segpido pçr um prótoonrimm um domínio catalítica de melaloproteinase dependente de z.inco, mu dormníe tipo dcsmtogrmm mua repetição de uuffibospondsn.í tipo L um dammm rua em ci^cma, e um domínio espaçador domain {Arm S.S., j Bid Chenu 2itoQ bum b»h‘) owe todox emeto XPXMlR— coetrin | em menos mais um domínio .de repebçãò: de tronibospondma típo I, e muitas da protetea \ DA MTS comém um ou mais domínios auxiliares adicionais. Notn Jiuvnie, tem sido relatado que todas as proteínas ADAMIS aparentam, conter pelo menos um sín** de ligação do <. Jciu e pem menos mn saio de 5 lavçàu de /ma oroh, «do (knlro do do mmo cat f'ueo d< nukdapuxe viv (Andrcini έ'ί u/.. <Z ZVo/eo/ne item, 200-5., 4 (3), pp 88I--8S8).

Os papéis biologies para as proteínas ADAMIS têm sido relatados para diversas doenças e cnateçuev inchando, Aní/mgiugenesM fibrose htersticial renal, remodelação óssea, folieulogênese ovaria®, 1.0 aterosvkiose, desenvolví atento mogemud e crescimento remodelação tumoral (AIM MI'S-D; sfedrome de Ehler-Danlos tipo 7C e dermatopraxis bovino íADAMTSDa artrite, aterosclerose e teudínopalia tARXMIS-Ak artrite egl i oblastoma í A DA .MIS -5); artrite (ADA MTS- 7): Xt t t ktagm^ene<<.

mallgnidade. cerebral, artrite' e aterosclerose·. (ADAMTS-8), artrite 15 (ADAMIS *), D'K purpura iroH;bocuopénjca ttomboúca g\D\MlS-Hx é Antitrombose / acidente vascular cerebral (ADAMI’S 18* (pum revMp, ver, Lin e Liu, ,/cçeo MewteZçÃagv ZtearrwE e Review 2009:1 121.™131)

A ADAMTS13 (Ai 3) recombínante fot expressa antes em eéiulas de mamífero, no entMto, a atividade específica varia amplamente 20 dependente das condições de cultura de eeluhs. Vvrifeem-sv que muitos meios de cultura, disponíveis comurcialmente não são suficientes para a expressão de A13 com e-tevadas atividades específicas, expressas .como a raeâo de atividade, medidas por ensaio de FRETS-VWF73, para teor de antígeno, tal como determinado por IÍIS\. Fm um asp^cnc as método^ 25 íbmecidos neste documento são baseados em várias verificações vantajosas que permitem a expressão da cultura de células: de Al3 tendo níveis aumentados de atividade total e específica.

1K estudos deser ío^ nctee ikvamenm demonOmm uma determinada cunscntraçso mínima de cálcio no meio dc euhur.u ccrea de 0,5 φΜ,-a cerca de 1,5 ,mM_y é necessária para a expressas à AH ativa. Além disso, verifieott-se que, s^Iemententfo o niw' de cultura: nem revets, aumentados de,zh», apmteína. A13 expressa resuhante' teve um idades totós e espèci&as superiores. For exemplo*. em. culturas suplementadas cem zinco: 5 adiuienal de 2 a 3 vezes a concentração normal, em von pmaçàu com concentrações encontradas nos meios padrões dednidos cmmucximente, tais como mems basctóo'⁵· em DMfcM/1 12. a atividade espeahea de Ala u>t sígnifkurismttente aumentada. Alèm. d sso, «,m x..ment<> adscm'ai aa eouiadu umeedKa d„ Λ‘3 poe.e set a'cancado aumenhimlo a eom.\mmtóm 10 de mtómmmiída (vitamina B3) de cerca de 2 mg.l., tal como nos meios baseados em DMBM/F12 padrão, a cerca de 7 mg/L. Pelo cultivo de células de HPKiM eu CHO rccumbiname em meio-' suplementado < com cJckx zinco c ou nkvMmamlda adicionai, a.s atividades especíricas de pelo menos cerca de 500 mUfog, 1000 mU/gg, a cerca de 2000 mlJ/pg podaria ser 15 xfe.mçado em culturas de expressão de larga escala de Al 3 humana.

:cComtókHU' tto' m\eb> de idade espce rica para pfotcrus \to mudmmtó de tó'ma tveom.br ame nào tora⁵ mlamdo'» antmmnncnm X' mtaíosamente, e'»^ no eu aumentadas de uri v Idade A13 foram alcançados cm mc:a quunkmrunn. dcftódo isento de vompommLu dernado de tasmam 20 permitindo a expressão eonsistotue e renrodmoei X prtoemm .ΑΠ W IS em grande escala adequada para a produção de proteínas pora a Ivruukiçao fornueeiukm Além disso, estes meios .são ainda livres de proteínas recombinant es, por exemplo, insulina, resultando cm produtos que podem ser usados de forma mais segura em fomwlações farmaeSuticas para 25 administração.

A presente divulgação também fornece métodos que impedem a p<r>ls òe ais idade c .tris aurne espeertóa durante uhra dufdtmçte padmo / outra etapas de purilleação. X antejusumcme, vuritlcumse cue pela suplementação corn tampão usado para a díafuuaçãn cmn cálcio e de zinco ammonal, ume redt<çan sigmlkatixa na perdu de dis Made de \l,n tai cnnu< medida por am ensmo de FR.ETS-VWF73, podería ser ah arçuda.

Cmn\x)uememeaN. deside á rektçâo de esLmturmtimçào emnp.uhHnMs en re a fanaha de \H \M IS de metuloprotema^s seuva.-d;^ 5 os métodos Fornecidos pela presente ins emrio permitem a expressão de todas a< rrrncma< \l)AM I S em u;lmm de cehdas e n reuqmraçào a panir de m,em celular,

IL IMfíeições ( íjxi asado aqui, >* tetnrns Sikaniua BV\ Bicmhumida''.

^Wniacimwida% MacinaE e ’Wldo mcntinimF ptxiem ser usadosintercambiavelmente para se referir a qualquer membro da família de vimminas R3 As>im, qualquer membm desta família pode ser mmdo para suplementar o meio usado nos memdos da presente invenção.

Tal eomo usado neste documento, uma ^f!protema ÁPAMW* 15 refere-se a um i^dipeptuico de desintegrina e metaloproteinase com família de mm o os membuspondina tipo 1 de metaloprotcinases. Os membros desta Pendí» ladeem prcmma^ hmnaua^ \D\MfSl (\M odmpSSf ADXMfS? (NM 014244; NMjniâW ADAMI S3 (KM „014243 X ADAMTS4 (NM , 005099). ADÁMTS5 s\M, 007038). AD.ÁMTS6 ÍNM 0M273).

ADAMTS7 (NM 0142727), ADA.MTS8 (NMJ07037), ADAM1S9 (NM M2O2O. \\1 lS292h \M OACXr ADAMTSIO (NM OMal^A. ÁIMMTSU (NMJM0955X ADAMTSB (NMJ. 39025; NM 139026: NM.J39027: NM J 39028), ADAMTSI4 (NM J39155; NM 080722). ADAMTS15 (NMJ39055), ADAMTS16 (NMJ39056K ADAMTSP (NMJ39O57K ADAMTSJ8 (NMJ99358; NMJ39054), ADAMFSIO (NM J.33638}, e ADAMTS20 (NM 025003, NM J75851). Ab prntemus KDWHS 'ac nem umto ptmemas de <omptmmuh> eomplem quanm polipeptideos parciais que exibem pelo menos atividade biológica paretaL por cseneplo, pelo menos 10%, 20%, 30%, 40%, 5034, 60%. 70'%, 80%, 90% , ou mais da atixídudá demonstrada pel.1 proteína de comprimento completo. em parP.calar. a ato idade de ptokaoe demostrada pela prote.n.t de comprimento completo. i'm certos easov mea prciema \DAMTS sem põ‘ iranshcionalmmfe modi geada m vw ou m wim, por eaemplo, per meias 5 cnzmmtmos oa qmrnuos, Intenac se que a' piotemas MIAMI'S da presente imençào incluem as isofocrnas unidas alternativamente, proteínas mod tocada couserv ^unvote. pitotefoas sntetáncfâlmeme idênticas^, homólogos. e semelhantes.

No contexto da presente invenção, uma proteína ADAMTS 10 engloba qualquer membro da família ADAMTS a nartirde, por exemplo, um mamdvru tal como mn prmntta. hiunaito. m.ujco. coelho, poteo. toedvr. camundongo, rato, hamster, gerbil, cuninos. felin«>s. v derivado^ bmlocaeamcnte mivo« do* mesmos. As proícmas mutante? c variantes de ADAMTS tendo atividade são também abrangidas, tal como são os 15 fragmentos funcionais e proteínas de fusão das proteínas ADAMIS. Além disso, a^ urotettev- ΛΙΤΑ MI'S da invenção pudem .dnda comp? vender up.'que facilitam a punhc.içào. a deíeeçâo. ou ambos. As proteínas ADAMTS dcscutas neste docuvnmto poocm .linda scr moddAudus όπι nua fração ummèHtma ou um nuagenmcnto adequado da fuçào m woo nu m ohn

Tal como usado nede documento, unu ’'proteína

AD\M 1 SI 3' '•efete-c a qualeptu ptotema eu pohpepndeo eotn auxidade de ADAMTS 13, particubrmeuú a capacidade para: elivar a ligação peptídieá eutre os restduos d. hr-S-C e Met-S-D \ \VT Tm uma utodabdadc exAmplag uma proteína ADAMTS 13 refèrOè a um pólipeptídeç 25 compreendendo uma sequênda de «nnoacido que c aitamente semelhante a de NP blTM-í tDeforma 1 de ADAMÍSM. prè prà protem.H ou aminoacidos 75 α 1427 de NP 620594 (Isoforma 1 de ADAMTS 13. nohpepudao nusdmOt. Pm otürj .modalidade, uma protetna ADAMTS 15 refere-se a um pulipeptídeo compreendendo uma sequência de anunofeido que é dtaueme mmelh mte a dr \'P ¢^05% çmofmmu 2 de ADAMI SB, pré-pré-proteína) ou. anürmáeides 7S a 1371 de NF j52U5^4 iwlontu 2 de \D XM iv. < >o- p'pmko madmol l m unida o;m t mceaudade, ai pioDuna*'' .ADAMISB mcLem polipepiidee< q <e <.empreendem uma sequeecia de 5 amínoauídos akamente semdhanR a de \P BiM? (ísofoura ? de ADA.MTSI3, pru-pB-proteína) oú aminaácidos 75 a 1 >40 de NP tO'e-45 (isofornta. 1 de ADAMTSI3, polipsptídeu maduro),. Como usado neste documento, uma proteína ADAMTSl 3 inclui variantes naturais com aíh idade de elhagem de vWF e constditos arti&iâis com umidade de divagem de 10 vWfu Tal corno usado n-a presente invenção, A1MMTS13 engloba quaisquer variantes naturais, sequências: alternativas, isufbrmas ou proteínas mntantus· que retêm Jmima .nividade hv.ml. PAemplos de mutações de ADAM IS 1.3 eneomrada^ na popuBçào humana ínchtem, sem línmaçàe, R-W, V8S4L IWR. Rlü2<\ Rm. ÍWl. H2UQ, V?0V. R.RBP, U WA IWH.

1.5 O-lbk Q456IL P457L. C5O8Y, R528G, POISA, R625R I673F, R692C \'W S^OM , OWA, CO''Rí. C 1024b, WD3Í, KIOVW

RI123C, C1213Y». T1.226I, GI239V, R1336W, muitas das quais foram enconimdas assomadas com pórpum teumbodtopêmca. íroxrhol <u 11 ΙΡ^χ As proteínas ADAÀ1TSÍ3 tanibém, incluem poHpepikieos que coutem 20 tuodifteaçõe.' pos-transbekmaB Por exemplo. ADAM PS B moxtimi ser modibeada per \ jeetdgmeosammu Rde\ \c) no*' resíduo' 014, ut>T, e I 'V, e previu, que os resíduos 142, 146, 552, 579, 707, 828, e 1235 podem também ser modificados desia forma.

As ADAMIS 13 resombinantes proteobtícumeme ativas 25 podem, ser preparadas >rtntve< de expressão em culturas de células de :io:íiituvx. ml eoine dcsctite em Plain navr et nL Rop2, Blood 1 \. loin Κο:'η?ο-'Ά e l^sS 2oü? 02G*528, cujas descòçòes que sào incorporadas neste documento por referência na sua tokd idade para todos o*' fm<. Os método-» de cuhma mvomldmmte ee ,e uLs que espremam Al) kM I SP' Mo divulgado^ em PDimatu? Ik Seaedlingct I. (Semin Hemaiul 2001 Jmi:4i (.1):.34-33, cuja. divtdgaçãa e inçorparada neste documento por mferêtmia na sua. totalidade para todos as fins).

Tâl como usado nesto ducunwnto, orna tmidado de ato tdaae 5 de ADAMTS’* é definida enrno a quantidade de atividade em I ml... dc plasma tomvum normal ,agrupado (pooled t. independentememe d^ ensaíu a ser usado Por exemplo, quando a proiema .ADAMTS è ADAMTS 13. uma unidade de xjduijüc ADAXHSH IRbíS \ \\ E7? e a u* mrtouk de toxidade -£.

necessária para divar a mesma quantidade de -.ubtoarn ERE PSA A b ' > 10 (Kokame ez to. IT I ILienustol. 'Od? \pr. 1 ?*-\ I 1 OCR na medida em que é elivada por um mL de pluMua humano normal agrupado. Comenientemente, a atividade ADAMTS 13 pode ser determinada por ensaios funcionais, tais como ensaios fuucmnuís que empregam pept atoes de fatores de \on Willebrand modificados como substrato pura ADA.MIS13 (Tripodi ,.y u/ ./

1.5 píecmó ?/ue/»m.a 2ÍW Scptopto 15 MM D. I'm meu>do preferido de deíerntn tc.L» do .toxidade de MIAMI 81' aumana reomnhíuaito esta detorito em (itHisea et a^s. g\ssa> **''χοη WiPcbund facto ιχ \VFoelcaxme protease baaed on decreased, collagen binding aflimtx of degraded v\\F: a .ord o” me dt> * o* uomuoto th on hx. vtopemt uu.puta U lib

Tiiromb Haemost 1999; 82: 1386- 138*·*?. Em uma modalidade, para ger considerada camo uma pnttofna AD IMIS’' coma dot? aide atimiq um podpep'tideo uu puecma date (er ado meu.oc I⁰., da rax idade de dívaccm de vWF de ADA1MTS1J .nativa. Em outras modalidades, uma proteína .ADAMTSΠ irá coutei pelo rnenos 10% da atix idade de ADAM ISIS neiAu.

Em ainda outras mad.didades, uma proteína ADAMTS 13 irá comer pelo menos 5%, 10%, 2^*%.. 30%_s· 40%, 50%, 60%, 70%, .80%, 90% ou 100% dá .nix made de \DAM ISIS milAa. A qmtmídude de uma proteína ADAM ES I ' pode também ser determinada pela medição de um .utogeim de ADA.MTSI 3.

por exemplo, usando o método ELISA descrito em Rieger < p/,> (2006, 2006 95(2):212- 20).

Tal corns usado· neste docuntentn, ”pg: de ADAMTSI3⁰ ou \i_c de ..mijem cc VHMlX’^' “’\f>'.t «ην q j’lAA'Jr \DWHSI' > que ibmeee o mesmo nível de proteína deteeíávei por ensaio de H IS X, tal como 1 mL de plasma humano normal agrupada. Isto e baseado um estimativas publicadas de 1 mg de ADAM I'S 13 estando presente em 1 ml,· de uiasma sumam s uonmd >, e. port.v m., nu weda apoxmudu

Tal como usado neste docnmphto, o termo ’derivado 10 biologicamente ati\quando usado no vomexto de uma proteína ΛΙΧΑΑ·1Γ3. também engloba, polipeptídeos obtidos através de tecnologia. de D1MA reeumbinante* Isto pode incluir qualquer método conhecido na técnica p na «J) a produção de DNA reconibinante por engenhada getteüea. por exemplo, airí\* de transcribe imersa do RX.A c'ou .imphfteaçãn de ΠΧΆ. uh a 15 introdução de ITS A recombinante em células procat lótícas ou eucarióucas por iransfecçâo, rsto é, através de eletroporaçâo ou micrteujeçào, (ui) euhho de dmv, amido trans Lu rnadiu, por exempkx de mn ^ndo continua ou cm batelada, (iv) opressão de uma proteína XDAVIS, por exemplo,, ecmstitutivamente ou mediante indução, e (v) isolamento de dita proteína

ADAMI'S, por exemplo, a pmlu do mulo do cultura c.s pela colheita das células transformadas, de forma a (vi) obter protoma AIWMTS recomhuiame substauctalmente: purificada, por exemplo, através de cromatografia de troca tônica, crumatografia de exclusão por kunanho, comiamgrjtki. de alhadade, cromatograím de Interação hidrofôbíca, e semelhantes, O termo ‘'derivado biologicamente ativo⁵’ inclui também mokvmlas quimericus, eomu, por exeumlo um? psmeaia ADXMIX, cu òapmetun funcional da me-ma. em combinação com um secundo um pniipcptideo, por exemplo, um domínio Fc de imunoglubulina nu domínio de albumina, a fim de melhorar as propr.cdade Limop c.v, tunn.ieoíómco mi te'?w ρτ exemplo a me· i \Ma da proteína ADAMTS an sistema de eiieulaçào de uíu mamífero,, particularmapte tim httmano.

I :d conto asado nesle documento. o toara Aütrafthraçào’ engfoba uma variedade de métodos de filtraqSa per membranas ® que a 5 pressag bidroMátm. força um líquido contra, uma: membrana scan permeável.

Ôs sõlidos e sufotos suspensos. de elevado peso molecular sào red dos, ghííunlo o-x rabies de baixo peso nanecuisi e «uma passam alturas da membrana. Este processo ds 'sepuação e ntuiut^ razes usado para purificar e concentrar soluções macromolecularcs (lOMfT Da), espedchnente soluções 10 de proteína. Um certo númeto de membranas de ullrsullraçào e-Ua di->porawh dependendo do tamanho da-χ mokvnu:^ que retem. .A uhrabhraçüo é íipiecmerde caracterizada por um tamanho de poro da membrana vníre ? nm e 0,0S gm e pressões de operação entra 1 e 10 bar e é partieularmente útil para, a separação de eolóidcs conto proteínas a partir de moléculas pequenas tipo

1.5 açúcares e saís. Em cemra-te. a nanollhração é um outro mémdo de tlhraçào conduzido <ob prasufo uoruudm.ente caracterizado por um tamanho de poro de membrana emre 0.5 e 2 nm e pressões de operação entre 5 e 40 bar. A nanobltração é fraquemcménte usada para alcançar uma separação entre os açucares, ouír.íx mobvulas otpânicas e sus muhndentes, pm um lado e o\ 20 sais mpnwàlentes e água, por çforo. Geraimentrç a uhrarih ração pode ser reabzada em qualquer um dos modos de fdtração sem sauia tdead-end) uu modo de fHiraçao de fluxo langencíal ΓΠ Τ ).

Tal. como usado neste documento, a ^diafotraçào'* refere-se a tm ou\<> mcuxfo de Γ travão gw ncmoia pot ra.es raraarâm conn» 25 tihraçao de Huvo tangvncLd (ΤΓΓ\ cm qoc o hqnido e bcmbvndo rangencifomente ao longo da superfície: de ma menrbwa de ultrafotragao. 1 irdcamcntv. hqtudo rerido e ddoido κθ^' tampão de drafíhraçao, depos de passar airara* da membrana e, subscquettiememe, retorna para a membrana cm tun ptMCC'>s»> de ’lu\o xonunuo (.ran meme, a Jrafdttmra pude <er realizada. em. qualquer em dos modas de fetraçãó sem saída oü modo de tiltraçào de fluxo tungcneial (ΓΓΓ'». <'omo tal. um nmeo .dstema pane <r usado lauto para as kfpemçèos de ulíraubraçâo quanto para as de díafferaçun. por exemplo. a primeira concerno, a nmuora m<ndo dmdlhraçào e então 5 realiza, troca de tampão por diafl: u a\ llu.

Tal como usado neste toxmmento, o termo poliam!na referese a qualquer de um grupo de compostos orgânicas compostos de carbono, nitrogênio e hidrogênio, e comendo dot' ou nuís grupos amino. Por exemplo, o termo engloba mfeéeuias selecionadas dentre b grupo consistindo em 10 cadavnrina, ptoresema. agmatiua, ®i»lina_t espermiua e espermldinm

Em certas modal idades do meio de cultura químicarnente definido usado para a expressão de uma proteína ADAMTS, a concentração da poliamina. está presente em uma concentração que varia de cerca de 0.5 mg/L a. cerca de 30 mg/fe bU de cerca. de 0,5 mg/L a cerca-de Jí nig 1.. m, de cerca de í),5 mgfe a cerca de 10 mg/L, ou de cerca de 1 mgZL a cerca de 10 rn.g/L. ou de cerca de 2 mg/1. a cerca de 10 mg/L. ou de cerca dc ? mg l a koum èc S mg I . ou de ccrc i dc ? ”p I α cc?ca de s | no mc'.o I m. uma modalidade e^nemfuxu a políamuu c a putuxiuj, a ama eoneentração dc cerca de 2 mg/L a cerca de B mg/L

Tal como usado neste documento, o termo meio qulmiemuente defender’ refere-se a um. meto de crescimento sintético em que a ufeulidade e a eoncvmruçàe de tadn, os componvulV'· sàu c»mhvvula% Meios quimlcamem.e deilnid^·, nàv contem exumou hacier am, de levedura, animal, »m de plantas, embora eles podara ou nau irduit emiqamente' deriv.uh de 25 animais ou de planta individual (por exemplo, puateinas, polipcptideos, etc.) L.xcmpios uào hmtiames de meios qaimicamtnte deimido? comercial mente disponíveis incluem, vários meios EX-CELlfe (SAFC Bioscíences, InoJ. vários meio de bugie ntodíGcado po*· Dulheueo (DME) (Sigma-.Aldrich Cot SAÍ'( Híoscienees. Inch mistura de nutriente de Hum tSigma -.Akhich Cm

S \1 C Bío^ienccx lack c mmoduntos Mcuxfes de piefxaa^âo de me.O' de cultura quimieamente^ definidos são ermheeidos; no tecmca, pur exemplo, nas pannk* I 5 !)ίί:νηύλ π l/l M? e 111. WO 200 ’ p ','g |; c xn Publicações de Pedido de Patente US números ?ond 000^040 e 5 2007/0212770, cujas descrições sao incorporadas neste -documento por referencia na sua totalidade para todos os efeitos.

Tal como usado neste documento, o termo meio de enfiara mento de oheopeptidco'' reíem-se a um meio isento de prraemas que nau cmuptcendc clicopepudcus. tais como, por exemplo, oligopcptídcos 10 cercados a panír de um hidrolisado de proteína. Fan uma modalidade, o mein nào compreende olie^pcpt’dccs lendo vinte ou m;ns ammuacídus. Em anu nmdJiiEde da prexmie m\e.nç;\n o meie mio compreende ebg^peptxieex tendo quinze ou mais ammuácidos. Em outra modalidade da invenção, o meio nüo compreende oíigapepiídeos tendo dez ou mais mmrmáddus. Em uma 15 nuxtdidade o meio tiào compreende oheopepttd^os tendo sete «xj mate amunvetdo-' Im e.in mmndukfee o meto n«o eompteeude eln mx'ulteeos tendo cinco ou mais aminoãcidos. Em ainda erntra modal idade o meio não compreende uligopepudeus lendo ₀u mais aminoacidos- De acordo com uma outra modalidade da presente invenção, o meio não compreende 20 olígopeptideos tendo dois ou mais aminoacidos. Métodos dc preparação de meios de cultura isentos de olígopeptideos são conhecidos na leenteu, por exemplo, nas patented US números-4T 71.825 e O3Õ.441, WO 2007.·077217. e nas Publicações do Pedidos de Patente ÜS números de; 2000/0000040 ç 2007/0212770, cujas descrições sau incorporadas neste documento per 25 mtex κ * ^m. mtahcUcx pat t «ncos o- k

T&l oomó usado neste documento, o termo Tneio dc cultura isento de som'⁵ refere-se a um meio de cultura que não é suplementado com um soro dv ummd. I mbora muitos w.A'<- os meios bxmto* de son* sejam mums quinremnente definidos, os meios isentos de soro podem, ser suplementados earn animate discretos ou protemas vegetais ou frações pruteica’'. Os métodos- de preparação- de meio de cultura isento: sora são conhecidos na técnica. pm cwmplo. nas patente l'S numero', 0,171,Κ2^ς é 6.936.44 L WO 2607/077217, e n-y< Publicações de Pedido de Patente US 5 nónteros 2003/6609040: e 2()07/0212770,. cujas descrições são incorporadas: neste documento por referencia na sua totalidade pura todos os fins.

Tal. como usada neste documento, o termo ^í!mefo de cultura iscma de proteína animal retere-sc a um meio de cultura que nào é suplementado com um sorô, proteína, ou fração de proteína de animal.

1 mbor;3 taltíàtíàS vezes os meios de cultura isentos de animais sejam meÍA, q àm u m-nte dvbmdoa, »>s muuv de c-dtura tset'tc* de protema ammal podem conter hidrolisados de plantas ou leveduras. Qs métodos de preparação de meia de cultura: isentos de proteínas animais saa conhecidos tia técnica, por exempfo, nas Patentes US 6.171,825 e 03041, WO 2007/077217. e nas 15 P”b teuçòes dc IkdOs d.-- Pmente I h dOdOOptoMO e 2up” 0212 Ό. ciO divulgações são incorporadas, neste documento por referência nu ^ua totalidade pura todos os tins,

Um ^vetor de expressão é um coustruto de ácido nucleíco, gerado de iorma twombinante ou sintética, com uma série de elementos de 20 áudos nucleicO'⁴ eípcrilk<xkn que penulte a transcrição de um acido nucleico partícul, r etn rena eck' i ''oqreJeau (7 uto' de evptesGo pudv ct pane de um piasmídeOx viras, ou fragmento de ácido nudeieu. Tipicamente, a vetor de expressão inclui um ácido nuclei ca para ser transcrito ligado operam ameutu a um promotor.

O termo ''hcteròlogo qtemdu usado com referência a pnrçôv>

de mu ido mtelvieo ndiia que o aeido nudeteo compreende duas ou trate suhscquèncias que não são encontradas na mesma relação entre si na natureza. Por exemple, x’ leído unelcuo e tipicamente predna-do de toeuj re<eaub'nanic, 'cm o êua< «m mam ^eqkuexo, Pe aenes uktepeml.n.trs arranjadas para lazer um novo ácido auuleicc funcional por exemplo, um promotor de uma fonte e uma região de codificação dmoutra fonte. Do mesmo muda, uma proteína heterologu indica, que a protvma compreende duas ou mais sufisequências que não são encontradâs act n m-ma rduçào entre si na 5 natureza (por exempla, uma proteína de fusão).

Um ’’promoter” é definido coma uma matriz de sequências de cnútrote de ácidos nucleieos qüe dirigà á transcrição Re um ácido mídeítex Tal como usado neste documenta, um promotor inclui sequências de ácidos rmclekvs mate^s-nÚR proxuuas do mio de partida da tmmsençam mis como, no ea-.o de um promotor do tipo pohmemse M. uns demento Τ.ΑΓΑ. Um promotor também matai opciunalmetae elementos mtensitkmdures õü repressures distais, que podem ser focalizados tanto quanto vírfos milharas de pares de bases a pariu do -sítio de partida: da transcrição, Um promotor ’'constitutivo’' e um promotor que c^ta nhu na mdona d.r* cxmdjçòe⁴* la ambientais e de desenvolvimento. Um promotor ’dmiuzíveP’ é um promotor que está ativo sob regulação ambiental ou de desenvolvimento. O termo ópertaivámçnte ligado” refere-se a tuna lirngáo funcfonal entre uma Oquèmia de contam' de cxpiessà»» de aec’o auclaso (tal mu promotor* ou uma matriz de sítios de ligação dr tutor de transe?iç,k>) c unia segunda 2Ô sequência de ácído nuçleíeo, èài que a sequência de controle de expressão dirige a tonscri çau. do ác ido n u c 1 e i eo cows pendente à_: segmi da sc q t r ênc i a d e,

Tal como usado neste documente, o tcrm.u ’’cerca de” denote uma faixa aptoximuda Je mais ou mmaux 10’* j panír de um sabe especificado. Itor exemplo, a linguagem ’’cerca de 2Ô%” engloba uma faixa de 25 IS a 22%.

11L Expressão de Froteína ADAMTS l m um mqvuo. í pi escute cvmmçrta fmneee metodo> de expressão de uma proteína desinlegrina e mteuh>pro?eina<e com motivos trnmhospondma (ADAMTS) possuindo stevada atividade específica. Em um jnmio'.alude. o método compreende o culthu d,? uma ^elula que ubtipa um uckm nudeleo que cudifien nmu piotuma THEMES em meto de culture suplememado evm pelo meno^ um <ompp^!-eme rehxnomtdo dentre cálcio, zinco, e mcatmamaia txitatnina B3)„ I m uma modalidade especifica, uma 5 prcrema WAMES e expressa em um men> suplementado com pelo meno^ dois componentes selecionados a pamr de zinco, cálcio, e nicotinamida (vitamina B3t. Em ainda outra modalidade, o meio de cultura ê suplementado Com zinco, cálcio, e nicoimaunda t\amorna B3)< Em certas modalidades, o meio de culture usado pura α expresso ue retia prmema TP\MIS pode 'rts compreender reu meio isente· de proa mu animal, Isento de olígopepude»x ou q irémeamenle de Π nido t^;m um uxpccto, as métodos são Imaeeidos para a produção de amap’ntera \P\M|S I m ,ana mvdulíd^oc, <>s *' atodo eomoreenoc,' as etòpas de cultura, de uma célula que abriga um âcído nudeico que codifica 13 uma proteína ADAMTS cm nm meto de cultura suplementado com pelo menos um de zinco, cálcio e nientimmiida; remoção de urna traçào do sobretmdante da cultura; realização de uma etapa de eemrifogaçãò ou. uma lutração paru lemmer quaisquer eelnlas reddnius: realização de uru etap.í de tonaídit span para conee'dret a ptoteína U> \\l I M e re,A > içno A uma ctup í 20 de dnífijpuçào con: um tarapào <ompre<nJenao pelo monos caleu» on ztuco. Em algumas rucdulidadex. a «.oncenuuçào de caldo pode ser pelo menus cerca de 0,1 mXL 0,3 uAl, 0,r üAL 0,’^ς r,M I nt\l, 1,5 m\t, 2 mM, ü mM, 5 mM ou mais de 5 mM de cálcio. Em outras ntodalidadu·', a ^»..»ncentração de zinco poríe ser de pelo menos cerca de 0,5 μΜ, I μΜ, 2 pNÍ > μΜ, 5 μΜ, 10 μ Μ 25 ou mais de h) ,,M do /meo. I m tuna delcnnin^d;. modahdado da ^oJadtm os sobrenadantes isentos de eebakis ou o tampào de dimfikrução contém as c ombinações ale cálcio e de zinco ms coneeniraç ões acima menckmadas ,. Em uma certa modalidade os corte das membranas de ultra e/ou d infiltração uodem -rer, pc· exemplo, emea de led kD ere l?^ kH oti kl) on kP »»u kD 0ii. 30 kD ou 10 k'D on menus do qua .10 kD. Em uma certa modalidade, a proteína ADAMTS ê ADAMI’S 13 ou um derivado biologicamente ativo da mesma. Em uma modalidade espeafica, a proteína ADAMTSI3 é uma proteína AI1AMTS13: humana ou derivado 5 biologicamente ativo da mesma. Em certas modalidades, o meio de cultura usado no método pode sèr um meio isento de proteína animal. iscmn de oligopeptídeo, ou quimicamente definida

Em uma modalidade, o método compreende ainda uma etapa de purificação selecionada do grupo que consiste em cromatograria de troca 10 íônica. cromatografia de exclusão por tamanho, cromatografia de afinidade, e cromaíugrafla de interação hídrofõbica.

Fm ainda outra modalidade, a suplemcntaçao de zinco pude ^r tonuvida por adição de mn em, o contendo prepamçtó de prvtema ou polipeptídeo. Por exemplo, as preparações típicas de insulina contêm zinco 15 em concentrações tais que a supkmenlaçilo de melo com entre cerca de 1 mg/L e cerca de 10 mg/E de insulina nimbem resulta em suplementaçâo de cerca de 0,03 μΜ a cerca de 1,5 μ.Μ de zinco, tal como calculado a partir da monografia detalhada para. Novolín N Inno.L.ct SubQ, insulina humana recembínante, que poda ser encontrado no servidór Mcdseape. 20 ( pn,ccncmovnte. ,m ma modabdude o €<.> uc > Jíuia u\.,do pma a expressão de uma proteína ADAMIS pode ser suplementado c» uma preparaçãò de insulina contendo zinca

O meie basal, que é suplementado cúm rinccç cálcio, arou niçotinsmidà (vitamina B3), tal como divulgado neste documento, escolhido 25 pare a cultiua de linhagem de cel na hospedeira aèo e enrico para a presente invenção e pode ser qualquer um. de, ou combinação de, aqueles conhecidos na técnica que são adequados para a cultura de células de matmmmm Meio tal como Meio de Fegle modificado por Dulkcuo, melo ΓΊ2 de I te. Meio Mínimo Essencial de Eagle e meio RPMMÓ40 e semelhantes estão enmerciulmente disponíveis. A adição dó fatores de crescimento tais como insulina. recombinarftc © cpeíopal.

Em uma modalidade, o meio basal usado para o cultivo de uma. célula que expressa uma prnteína ADAMIS (por exemplo, ADAMTS13) 5 pede compreender uma mistura de um ou mab meies: qmmicamente definidos eemercialmente dApuancri. por exemplo, meio Eagle modificado por Dulbecco (DMEM) e meio F~I2 de Ham, que fei suplementado com um. ou mais componentes diferentes de zinca, cálcio, e nicofinamída. (vitamina B3). Exemplos não limitantes: de componentes que podem ser usados para 10 suplementar um meio comercíalmeute disponível incluem, amlnodcidos essenciais (por exemplo. glutamlna), sur&etantes não iõnicus (por exemplo, Synperouie), amíma primariás (por mxmphx etãnoiamma), poliammas (por exemplo, putre-eínag metais de traços (por exemplo. ferro), e agentes tamponantes (por exemplo, bicarbonate do sódio). Em uma modalidade 15 especulem o meio è um meio de Ri. S. tal como Ibmeenio na Eibela l fim outra modalidade especifica. o mem ê um meio RACD, por exemplo, meio BACD-A13.

Tabela 1. Composição de .Meia de RCS de Cuhura de Cèlulax

<3?mpo;XtUe____________________ toGkaamma xyripemme	(toneemr&çâo RVkte —. .................. 1.00
IMaoluminií	0,00153
Puhesema 2HCÍ	0.0036
K'SO4.7H2O	U.tetoo
Mri ÍC iv	2.0

Historicamente, as células animais têm sido cultivadas em meio- contendo soro animal. No entanto. tais meios são incompleiamente dtemidox c carregam o riseo de múvçào Aqueles J»> estado da teunea, portanto, cnncebertim os meios ’'isentos de proteína’ que são ecmpletamon’e ? meto- Ue qualqiut p;otem« ou pelo ? 'eno- , -tão isento- de eualqnc' areiem i çue nàu e modu/ida s.e lunna rece-mmarr.e A a humiaa de soro ¹ um mo e wlgarmente usada como uni suplemento de cultura isento de soro para a produção de proteínas recombinteUes. Os meios preferidos incluem os divulgadas nas Patentes US O7I.S25 e 036.441, WQ 2007/077217, e nas Publfeações de Fedidas rè Paknti ls mcuenw 2üübG0090lH e 5 2007/0212770.

Qpcionulmente, um agente ativo - surfectanto não tônico tal como um polipropileno glieol (por exemplo, Pluromre F-6I , Pluronicm F~68, Pluromc^' F~71, Pluronkv' F-IOS ou um Synperoníc^) pode sei aduaotiadn ao meio como um. agente antiespumanto. Este agente é gerelmeáte aplicado para proteger as células contra os efeitos negativos de aeraçao. (pulvcrizaçãa*’), A. qmutídade de agente ativo - suriactaute nau íônico pode variar entre 0,05 e 10 g/L, preferencialmente, entre 0,1 e 5 g/L

O meio do ( S n?)h>.44l e parocularmente bem udequade pare o cultivo de células CHO, mas pode ser usado com outms células também, lã iJm meto mais adequado é o .meio isento de ullgopeptideo dtxulgadn na PeJafo de Patente I 8 .toO 'ng' 270 ^Baxter International lac.. Baxter Healthcare SA).

Tabdn 2. Concentrações exemplares de zmeo, ctoere, e eotteCíiiíaçàu de nícotínamida (vitamina B3) que pode ser usada para suplementar meios de reduea ute's pare í eroressàu de uma prorema WAXHS

Pdo menus μΜ de Zinco	2 I Var.	ΡιΛ' rerem d ' mV d» cálcio	Var,	Pek> menus 2 mg/L i ver.
de ricmrwmda.	j.A.....
.Pelo .menus	5	Var.	Pelo means L5 mM de	Vau	Pelo menos 7 me L	Var.
μΜ de Zimm	..........íâ,.......	eákío	5	nleoòaamàla	!«
Eiure 2 e 12	uM	Vor.	Eutre 0,5 e L5 ntM de	Vau	Entre 2 e 7 mg/L de	Var.
de Zinco		/7	câiaie	8	nicohuamida	9
Entre 5 |>M e	U	Van	Pelo menos 0,6 mM. (i.,7	Vrer	Pek.> menus 3 mg. L, 4	Var..
gM d e Zinco		Hi	?:AL U.S ;nM, «yo !r\; PU mM. LI m\l Lã íAL L' mM. Li oAí, Ite mAL Ire nAL L7 mM, L8 mM, 1,9 mM, ,\U m.M. 2,25 mM. drè riM. ,',\5 mM, 3,9 mM, 3,5 mM, 4,0 m,M. 4,5 mM, .5,0 mM, ou mais	11	m?1, 5 mg 1. 6 nq? 1 . 7 mg I , 8 mg/L, 9 m.g/L, 10 mg/l... 15 mg/L, 29 mg/i,, ou mais uirotiremmh	12

	Mkw
1 IMo manes 3 μΜ, 4 μΜ 5 μΜ, 6 pM, 7 gM, 8 μΜ, 4 UM. U) H uW α μΜ, D uM, 14 μΜ 15 uM. 20 μΜ. 25 μΜ, .30 μ,Μ, qu mais zinco	X 4\ E3		................

*'Var, - Variação

Em mna modalidade, a. presente :t n\ cnçâo fornece um método para expressar uma proteína desmtegdna e metafopmtemase com motivos trombospondma (ADAMTS), o método eompreemfemfo o cultivo de uma 5 cvad ? que Jskm up a^ído n Deu o que <oe:ifum uma píowum ADAM Γ% <m um meio de cultura compreendendo pelo menos um. de zinco a uma concentração de pefo menos cerca de 2 p'M ou cálcio a uma coneemmç«\v de pelo menos cerca de 0.5 mM. Em uma modalidade, a proteína AEHMFS é ADAMTS 1, Em uma outra, modalidade, a proteína ADAMTS é ADAMTSX 10 Em. outra modalidade, a proteína ADAMTS é ADÁMTS3. Em outra, modalidade, a proteína ADAMTS é ADAMTS4. Em outra modalidade, a proteína ADAMTS e A.DAMTS5, Em outra modalidade, á proteína ADAMTS é ADAMTSB Em outra modalidade, a promt na. ADAMTS 4 ADAMTS7. Em outra modalidade. a proteína ADAMTS é ADAMTST Em 15 ouiru modalidade, a proteína ADAMTS é ADAMTS9, Em outra mmiJuüde. a pjotvúm XDXMIS c APWSA hn wma modalidade, a proteína ADAMTS é ADAMTS 1E Em outra modalidade, a protema ADAMTS é ADAMTS 12. Em omm modalidade, a proteína ADA.MTS é ADAMTS13. Em <?mm modalidade, a proteína ADAMTS é ADAMTS 14, Em 20 earn umè. Eduoe <. once <\i \D\\DS . \D\MISD’ fm outia modalidade, a proteína ADAMTS é ADAMTS 16< Em outra modalidade, a poucínc KDAMÍS é XDAMTSIT Em ouua modalidade, a proteína ADAMTS ê ADAMTS 18. Em outra modalidade, a proteína ADAMTS é m <mna modmm.toe, stWiiic \Ml'S e ΛΠΑΛΠ SM im modalidade preferida, a proteína ADAMTS â ADAMTS1A,

Em uma modalidade, 0 meio de cultura contém pelo menus cerca de 2 μΜ de zinca Em outra modalidade, o melo de cultura, contém 5 entre cerca de 2 μ,Μ n cerca de i 2 μΜ de zinco. Em ainda outra modalidade, o meio de kulíura cantem pelo menos cerca de 3 μΜ de zinco l m uma modalidade, 0 meio de cultura contém entre cerca de 5 μΜ a cerca de .12 μΜ' un Smm fm outra mouuhJmkv o mmo J? cdmm umterc peM menos cerca de 0,5 m.M de cálcio. Em ainda outra modalidade. o meio de cultura contém 1-0 entre cerca de (15 mM. e cerca de 1,5 mM de cálcio. Em uma modalidade, o meio de cultura contém pelo menos cerca de 2 μΜ de zinco e pelo menus cerca -de 0,5mM de cálcio.

Em ainda outras modalidades, .cnfco .-se que a adição de meotínamida (vitamina B3) íntensi&a ainda mais a expressão e atividade 15 cspecUsca de proteínas V)AM l S na cultura de cduko l m uma modalidade, o íueio de cuhura compjeer.de ainda pelo menos eerca de 2 mg 1 de nicotinamída (vitamina B3). Em outra modalidade, o melo de cultura, compreende ainda. pelo menos cerca de 7 mg/L de nkm marrada (vitamina B3), Em ainda outra modalidade, 0 meio de cultura- contem entre cerca de 2 20 mg/L e -cerca de 10 mg/L de rk'oiuRiuudd (vitamina B3)<

Em certas modalidades, 0 melo do cultura é um. meio dé cultura isento de proteína animal. Em outra, modalidade, o meio de cultura: é um meio qmmicamente deftnidó. Em certas modaliduties. o melo de cultura pode compreender uma ou mais pullaminas. Em uma modalidade particular, a 25 puEamina é a putrescína, por exemplo, a uma ccneentràção de pelo ntonò-s 0,5 mg/L. Em uma modalidade espeeífíea, o meio de cultura contém entra cerca, de 2 mg/L e cerca de S m-g/L putrescine.

Em certas modalidades, □ linhagem de células ou célula usada no vultívo é uma célula haeteriana, uma válida de levedura, uma célula de inseto, «ma célula aviária, ou m célula de mamífero. Em uma modalidade específica, a linhagem, de células é éma linhagem de células humana, uma linhagem de células ds hamster, ou uma Imhagem dc células de murines. Em uma modalidade mais específica, a linhagem de células é uma linhagem de 5 células ÇHO, BHK_$ ou HEíL Em uma modalidade preterida, a linhagem de eehd u é uma anhagcni de células (ΉΟ.

Em certas modalidades, o ácido nueteieo que codifica a pomma W\MIS eompnemk' u^sa mquêmuí de controle operafix a:r ente ligada à xcquenciu tie nudeondoos qnc codifica a proteína ADXMfk. Em Ifi uma modalidade, a. sequência de controle é um promotor, Em certas modalidades, o promotor é um promotor constitutivo. Em outras modalidades, o promotor é um promotor mdutivet

Em certas modalidades, os métodos fornecidos neste documento compreendem o uso da um sistema de cultivo contínuo de células 15 (isto à, cultivo contínuo de células). Em uma modalidade, o sistema de uultix o contínuo éum sistema de cultivo em quimióstato (isto é, cultivo de células em quimlostato). Em. uma outra .modalidade, o sistema de cultivo contínuo é um sistema de cultivo em turbidosuiv (isto e. culto o de adulas em íurbidostaro). l-us umda outra modalidade, o sustema de euhho couuííoo e um tiucma de 20 cultivo de perfusão (isto é, cultivo de células com perfusão). Em certas modalidades, o soiema dç cultivo continuo pode ser operado sob wn modo de su^peuxàv». bm muras modaad aks. o ÒAuma de cultivo uxmmio pude ser operado sob mu modo aderente. Em certas modalidades,, o mudo aderente vompicenek'' o usa de mu mícrutranspurtador, por exemplo, um 25 nueminnmmmdoi pmmo

Em certas mo<iahd^dv^_ os métodos fornecidos neste dvcumoito compro.,nOes? o u>o co um sjslema ee cultivo de eehitt^ em buiehúa (rXo e, crmíxo de celu\r> em haeladaL l.m uma modalidade, o sistema de ciHtixo ern batelada é um sistema de cultivo em batelada único (i sto é, cultivo de célula em. batelada única ) , Em. tom modalidade, o: si stema de'cultivo em batelada é um sistema de culfivó em bãlelàda .alimentada (isto é, cultivo de célula em batelada ahmcntaJa). Em ainda outra. modalidade, o sistema de cultivo em batelada é um sistema de cultiva em bainlada-mpetida t j xto e. cultivo de células em batelada repetida). Em certas modalidades, o de cultixo cm batdada male ^er uperrab* sob um modo de sirpes.m. Em outras modalidades, o sistema de cultivo em. batelada. pode ser operado sub um modo aderente. Em certas modalidades, o modo aderente compreende o axe de um micro mm qp^rtadur. pvrexempfo. um micTtormuprnmdor poroso.

Em certas modalidades, a cultura será mantida a uma temperatura entre evrea de 35°C e cerca de 37⁹C. Em outras modalidades, a. cultura será mantida a um pH entra cerca de b,9 e cerca da 7,X Em uma modalidade espeedleu. a cultura ira se” mar.nda a u~n pH entre cerca ce 7.0? e cerca de 7.15,

Em certas modalidades, os métodos fornecidos neste documento rrão producir proteínas APAMTS.13 ao melo de. cultura. (Isto é,

A.I3AMTS13 expressa) com atividades especificas de, pelo menos, bfiOII por mg de proteína ADAMTSI3. Em outras modalidades, a atividade específica, será de pelo menos SOOU por mg de proteína ADAMTS13, Em outras 20 moda lidado, u atividade espeeuka sem de pelo meno.> 100**1, por nrn de proteína AÍMMTS13. Em outras modalidades, a ato idade espeefka será de pelo menos 1.500Ü' por mg de proteína ADAMTS13. Em outras modalidades, á atividade especifica será de pelo menos 2000IJ por mg de proteína ADAMTS13.

Em outras modalidades, os método» fornecem culturas que produzem, pelo mono». 4001 de .sumdedc de ADAMTS13 por E de cultura pm dia (E ! D) Em mua mudadcade, hx métodos fonn-eem cinturas que moe.uvm *vfo mcnux. bOfo Jv s.limdadc de \U \M *. Si ' m i de < dta por dia (UZL/D),

A. ADAMTS13

Em um aspecto, a preseme invenção frniieca métodos para expressar uma proteína ADAMTS 13 tendo atividade espeedlea e/ou total aumentada, Vámajosamente, verificou-se que, pela M^Iementação de w 5 meio de urescimento com o cálcio,: zinco, e/ou meotmamida (vitamina S3), os polipeptídaos da ADAMTS 13 com elevada atividade específica puderam ser expressos de forma recombinante e. recuperados a partir de cultura de células.

Os métodos para a expressão de A D A MI'S 13 são fornecidos em WO 2009/066309, cqrç divulgação é incorporada neste documento por 10 referencia na sua totalidade para todos os fim, Esta referência dcra.vra métodos adequados e condições de cultm que podem ser mantidas durante toda a duração da cultura. Como descrito neste documento, os cuitix cs de células usadas para a expressão de proteínas AD \M ΓΜ 3 irão geralmcnte ser mantidas a uma temperatura de ou entre cerca de 34®C e 37^ÔC e um pH de ou 15 entre cerca õ,S e 7,3<

As formas de mõnitoração da temperatura e do pH da cultura, sãó bem conhecidas na téemca e geralmente dependem de sondas que são inseridas nu bioreator, ou incluídas em loops através dos quais o meio de cultura é circulado, ou inserido em amostras extraídas do meio de cultura.

Sensores de p.H em linha (ín-line) adequados incluem o sensor Mettler Toledo IcPro ⁵00 135 Ptlfto (Mettler- loledo hmukt Inc,, Bedford, M \) \s toonas de alteração do parâmetro expeuifíeado, a fim de manter o mesmo no nível predelmido são lambem bem conhecidas. Por exemplo, a manutenção da temperatura ccnsmme gcmlmente envolve o aquecimento ou resfriamento do 25 hioreutor ou do meio de araneaiação sse for cm processo cundnuo ou de bmefeda JímtntmLh a monutençao do pH von^arav g<rahuvniv mnobc a esco&ã e fornecimento suficiente de um tampão apropriado (tipicamente bkmmonuto' c ad'çio de atuiu, ml tx-mo ac ckmdum>, raa alcjií, uu cuino hídiomdo de sódw ^sxnhonato de odio ou uw.a amtura d»>s mesmos, para meio de alimentação, eonibrme necessário. É pomívd que a uali bmção de uma sonda da pH em linha possa deslocar-se ao longo do tempo, tal . como ao longo de períodos de dias ou semanas, durante o qual as células são cultivadas, Nesse caso, pode ser benéfico redefinir a sonda em linha usando 5 medições obtidas a partir de uma sonda calibrada rncentetóente fb.ra de linha (offfiíue),

Em uma modalidade, os métodos compreendem ç çultivo de uma célula que abriga um ácido nucleka que codifica tuna proteína AIMMTS13 em melo de cultura suplementado com pelo menos um 10 componente selecionado dentre cálcio, zíneç, e niçotmamlda (vitamina B3), Em uma modalidade específica, uma proteína ADAMTS é expressa, em. um meio suplementado com pelo menos dois componentes selecionados a partir de zinco, cálcio, e niçotinamida (\ itumina B31 Em ainda, outra modalidade, o meto de cultura é suplementado com zinco, cálcio, e nieotinamida (vitamina. 15 B' k Em algumas modalidades, o meio de cultura pode ser um. melo de cultura «sento, de proteína animal, íscnto dé ofigopcptídeu ou quimicamente definida, I, Suplementação com Zinco

Vantajosamente. \ entram se que a atividade euzimatiea de ADAMIS 13 aumentada e a atividade específica podem ser recuperadas a 20 ρ.,τΗ' de um cultuo m células ercvmms cm meio mplemeuindo com cinco. Por exempla, o bxempio 1, demonstra que a proteína ADAMTS 13 expressa cm meio de euhnm contende \·Β2 mg 1 de ZnSífi · 711 O i5 uM de zinco) tem ume uumdade e^pecdxnt Ce 40% a 100’' ma ot do eme a rnotmu» ADAMTS13 expressa ern meio de cultura contendo apenas 0,432 mg/L de 2S ^?H4%L5 pM de zinc<4 {e<>mpautí. Is\.b :P e ÍjbeU 11). Mem dt>o. esse emito e reprodutod. voam mosirude no l xentpio 2 mompsmçào, a Tabela 13 e Tabela 1.4); Exemplo 4 (Tabela. 16 à Tabela 19), e Exemplo 5 11 »bela 20 e Tabela 21).

Consequentemente, em um aspecto, a presente invenção fornece métodos para expressar umâ proteína ADAMI’S (por exemplo, AIMMTSI3) tendo uma atividade específica aumentada pelo cultivo de uma célula que abriga um ácido nseleico que codifica uma proteína ADAMTS 5 (por exemplo, ADAMTS13) em um meio de cultura suplementado com zinco, por exemplo, contendo pelo menus .2 μΜ de zinco. Do mesmo mudo, a preserue invenção também fornece métodos para a preparação de uma composição. de proteína ADAMTS (por exemplo, uma composição de ADAM'Í^?S13) tendo atividade total ôu ati vidade específica aumentada. pelo .10 cultivo de uma célula que abriga um ácido nudeíco que codifica uma proteína

ADA.MTS (por exemplo, ADAMTS 13) cm um meio de cultura suplementado com vinco, por exemplo, comendo pelo menos 2 μΜ de zinco.

fim uma modalidade, um méiodd para cxpi casar lima proteína desíntegrmá e. metalnprateínase cqm motivos trombospondina 13 .15 (ADAMI'S 1.3) ê fornecido, o método compreendendo o cultivo de uma célula que abriga um. ácido nucleívo que codifica uma proteína ADAMTS13. em um. meio de cultteó compreendendo pelo menos ou cerca de 2 μΜ. de zinco, fim outra modalidade, o método compreende o cultivo de uma célula que abriga um ácido rmdeico que codifica uma proteína ADAMTS 13 em um meio de 20 cultura compreendendo pelo menos de ou cerca de 5 μΜ de zinco. Em uma. modalidade, o meio de c uh ura contem de ou cerca dentre 2. μΜ e 12 μΜ de zmeo. fim outra modalidade, o meio de cultura contém de ou cerca, dentre 5 μΜ e 1.2 μΜ de zinco. Em amda outras modalidades. o nteso de cultura pode comer pelo menos de ou cerca de 2 μΜ ou pelo menos ou cerca de 3 ΊΜ, 4 25 μΜ, 5 μΜ, 6 μΜ, 7 μΜ, g μΜ, 9 μΜ, ΙΟμΜ. 'J μΜ, 12 μΜ, 13 μΜ, 14 μΜ, 15 μΜ, 20 μ.Μ, 25 μΜ, 30 μΜ., ou mais /me«> baixas de c(>nuentração de zinco adequadas são geralmeute determinadas por toxicklades de cultura de vd das que pmkm aeon cs na pm^cma d, cem < atuam-> de zn\o.

pm exemplo, cm eoikciKixòes mJarmq<m f? μ\Ε ?< μΜ. 3o _UM, ap _μ\ρ_χ e semelhantes, Como, será entendido, pélo versado na. teemea, a extensão em que as çoneentrações de zinco são imbídoms para um. sistema de cultivo panic àar sem. aitamente. dependente, entre outros fetores, <fo tipo de célula usada para expressar uma proteína ADAMTS, dos componentes do :mei.o dte 5 cdiíím usadm e do modo opcmthu usado pma a cuhum tpur cxemphs batelada vs eontímm; suspensão vs aderente; quimiostato vs perfosão; ete<) Em. certos casos, as concentrações mais elevadas de zinm podem ser necessárias onde os componentes do maio de cultura podem sequestrar zúnco a partir dá solução, por exemplò, nos casos em que o meio de cultura contam 1.0 albumína. Consequentemente., as faixas de concentração adequadas de zinco são geràlmente determinadas pela identidade das células cultivadas, do medio e mode operativo empregada, Uma pessoa versada na técnica, será prontàmente capaz dc deícnnmur os limites superiores adequados para o uso de suplemeniaçâo de zinco baseado no sistema de cultivo Individual IS empregado.

Em uma. modalidade, é fornecido um métodá parà expressar üma proteína: dõsfotégrma e metafoprofeinase com motivos trombospondina 13 (ADAM l S l D, compreendendo o cultivo de uma célula que abriga, um ácido uueleico que codifica uma proteína AIMMTS13 em um meio de 2h cultura isento de poüpeptídeo e/ou proteína animal compreendendo pelo menos ou ocrua. de 2 μ,Μ zinco, Em urna eui’» moJahdadc. o método empreende o umtEo dr uma celu a que ahopa um ãudo mfoeice que eoddica uma proteína ADAMTSB em um meio dc cultura isento de pobpepiídeo efou. proteína animal compreendendo pelo menos ou cerca de 5 25 μΜ dc zimxç Em uma modalidade, a meio de cultura isento de polipeptídeo e uí prote u.a ammal cmrum tk ma cerna dvure ? uM v : ? μ\1 de aimu. I m uma outra ntodalídade, o meio de cubara isento de polipeptídco c cm próteím animal eompreerafe de ou entre cerca de 5 μΜ c 12 μΜ de zinco, bm ainda outras modalidades, o meio de cultura isento de polípeptídeo e/ou proteína animal pode conter pelo menus de ou cerca de 2 μΜ, ou pefo menus de ou eerca de 3 μΜ. 4 uM_: 5 gM, 6 μ.Μ, 7 μ.Μ, 8 μ Μ, 9 μΜ_; Η) μΜ_; 11 μ.Μ_; 12 μΜ, 13 μ Μ, .1,4 μΜ,. 15 μΜ, 20 μ.Μ,. 25 μΜ, 30 μΜ, ou mais de Em ama modalidade, o meio de cultura compreende aluda uma pouamina de ou 5 entre cerca de 0,5 mg/L è 10 irx 1 . Em outra modalidade, o meio de cultura compreende ainda uma poliamma de ou entre cerca de 2 mg/L e 8 mg/L, Em uma modal Idade específica, a. poEami.ua ê a putrcscína.

Em outra modalidade, um método é fornecido para, expressar ema proteína dcsintegri.ua e meteloprotemase coin motivos trombospondina 10 13 iADAMIS 13μ compreendendo o cultivo de urna célula que abriga um ácido nuclei co que codifica uma proteína ADA MTS13 em um meio de cultura qutmtcamenle definido contendo pelo menos mi cerca de 2 .μΜ. de zinco. Em outra modalidade, o método compreende o cultivo de t.tma célula que abriga um ácido nucleico que codifica uma proteína ADAMI'S 13 em um 15 meio de cultura químíeamente definido que compreende peto menos ou cerca de 5 μΜ de zíuco. Em uma modalidade, o meio de cultura quiiiiicametite defendo contém de ou entre cerca de 2 μΜ e 12 g.M de zinco. Em outra modalidade, o meio de cultura, quinuc unvntv definido- contém de ou entre verca de ^ς uM c 12 nM de zm.o i'm aíadu oulr«s medaud.idcs, u mvio de 20 cultura iremo de rolipepudeo e e>.: piolema mimai rmde conter pele nKnos cerca de 2 μ,Μ, ou peto menos v ou cerca de 3 μ.Μ', 4 μ.Μ, 5 μΜ, 6 μΜ„ 7 μΜ, 8 μΜ, 9 μΜ, 10 μΜ, 11 μΜ, 12 μΜ. 13 η Μ... 14 μΜ. 15 μΜ. 20 μΜ. 25 μΜ. .30 μΜ ou mais de zinco. Fm cernis modalidades, o meiu qmmteamente definido estará isento de polípeptídees e/ou proteínas derivadas de animais. 23 Em uma modalidade, o meio de uDura compremidc amdu uma políamina dc on entic emea de me I c '0 mg l l outra moda* dade e meio de eiiúur;.; compreende aiuua utnu puimmiua dc ou entre cerca de 2 mg l. e 8 mg/L, Em uma modalidade especifica, a polismina é a putresnina..

Em uma mudalidade, to metade para expressar uma proteína desmtegrma e metaloprotrinase com motiva trombospondma 1.3 (ADAMTS13) ó lòmecukx o método compreendendo o cultivo de uma célula de mamífero que abriga um árido nucíeíco que codifica uma proteína 5 A0AMTS13 em um meio de cultura .que compreende pelo menos ou. cerca de 2 μΜ de zinco. Em. uma outra modalidade, o mriodo rompreende q cultivo de uma célula de mamífero que abriga, um ácido rmdeico que codifica uma proteína ADAM ΓΜ * em. ,um melo de cultura. compreendendo pelo menus ou cerca de 5 μΜ dc zinco. Em uma modalidade, o método compreende o cultivo IO de uma célula de mamífero que abriga um ãei<fe nudcico que codifica uma proteína ADAMI'S 13 em um melo de cultura compreendendo de ou entre cerca de 2 uM e 12 uM de , meo I'm ouua ^odthd;nl. o meufeo comprounde o Cultivo de uma cêluía de mamífero que abriga um ácido nuclrico que codifica uma proteína ADAMTS13 em ym meio de cultura 15 compreendendo de ou entre cerca de 5 μΜ e 12 μΜ de zinco. Em ainda outras modafidadesj. o método compreende o cultivo de. uma célula de: mamífero que abriga um ácido nnrieiuó que codifica uma proteína ADÁ.MTS 13 em um meio de cultura, compreendendo pelo menos ou cerca de 2 μΜ, ou pelo menos: cerca de 3 μΜ. 4 μΜ, 5 μΜ, 6 μΜ, 7 μΜ, 8 μΜ, 9 μΜ. 10 μΜ. 11 μΜ. 12 20 μ Μ. !' μΜ, 14 μΜ, 15 μΜ, 20 μ.Μ_? 25 μΜ, 30 μΜ, όη mats zinco. Em modalidades particulares, a célula de mamífero é uma célula du ban sien humana, ou de murino. Em uma modalidade egrecd'Ea, a cehda é uma Unkmem du celul.w t'110. uuu linhagem ee celubs HFK 2^'\ ou uma linhagem de eèlulas BHK. Em outra, modalidade, a célula de mamífero é 25 cukMida em um mekf de cultura faxUo de polipvptuico uou protemu arcmri.

Em aitidi mura romElàiade, a wl .la de mamífero v cuhixad.i em s;m meio cri cultura sintético, que pode ou não estar Isento de pdipuptidms u proteínas animais. Em uma modalidade, o meto de cultura compreende ainda uma poliamma de ou entre cerca da 0,5 mg/L e 30 mgZL. Bm outra modalidade, o meio de cultura compreende ainda uma palíamina de ou entre cerca de 2 mg/L e 8 m.g/1, Em uma modalidade específica, a políamina é a pmrescína.

Em uma modalidade, um método para expressar uma proteína, desintegrina e metaloproteinaae_: com motivos trombospondina 13 5 (ADAMTS 13) é fornecido, u método compreendendo π cultivo de uma. célula, qnc abnga um ácido nuderev que eoddlea mmi pivtema \D \MFS1 > em um meio de cultura compreendendo pelo menos ou. cerna, de 2 _;μΜ de zinco, sob condições de cultura continua ou batelada alimentada. Em uma outra moda'fejfe’. método eompreuuk o eultóo de uma cchdu Je m.uurcu» que 10 abriga um acído ntíeleieo que codifica uma proteína ADAMTSI3 em um meio de cultura, compreendendo pelo menos ou cerca de 5 μΜ de zinco, sob condições de culture contínua ou batelada alimentada, Em uma modafidade, o método compreende o cultivo de -mm cehf.a de mamífèrò qtie abriga, um ácido nucleico que codifica uma proteína ADAMTS 13 em um meio de 15' cultura compreendendo de ou entre ceres, de 2 μΜ e 12 μΜ· de zinco, sob condições de culwre contmuã ou. batelada alimentada. Em outra modalidade, o método compreende o cultivo de uma. célula de mamífero que abriga um. ácido nudeico que codifica uma pretema ADAMTS 13 em um. meio de cultura compreendendo de ou entre cerca de 5 μΜ e 12 μΜ de zinco, sob 29 vondgòe^ e.c eubrea vreutmta ou bmJada ahmintada hi autdtt outras modahdukre o método compreende o cuhíxo dv uma cdub de mmudero que abreu um acído uucieieo que codifica um s grotetna VDAMISH em nm meio de cultura compreendendo pdo menos ou cerca de 2 μΜ. ou pelo menos ou cerca de 3 μΜ, 4 μΜ, 5 μΜ, 6 μΜ, 7 μ.Μ, 8 μΜ, 9 μ.Μ, 10 μΜ, 11 μ Μ, 12 25 ΐιΜ. I > μ Μ, 14 uM. Μ μΜ. ?d μΜ. ?' _}.Μ, 9) μ Μ on euus de dmo, rob condições de cuitura eontmua de bat, lada alimentada. Em uma modalidade ehpevífej. a condição de euhura conUtmu ê uma condição de cminra utemíostàtica. Em outra, modalidade específica, a condição de culture contmua è um t condição de culture de perfusào. bm utnu modalidade, a célula, que abriga o ácido nuçfeico que codifica uma proteína ADAMTS 13 é uma célula de mamífero. Em. modalidades particulares, a célula de mamífero é uma célula de :h.mister, humana, ou de murtuo. Em uma modalidade específica* a célula é uma linhagem de células ©H©, uma linhagem du células 5 Hl K 293. ^u ₅,ma Imhagem de células HHk. Lm <mita ’ocafeüde. a colma de mamífero é cultivada em um melo de cultura isento de< polipepfideo. e/ou proteína animat Em ainda outra modalidade, a célula de mamífero é cultivada em um meio de cultura sintético que pode ou não estar iscam de polipèptideos e proteínas animaim Em uma modalidade, o meio de cultura compreende 10 ainda uma. poliamína de ou entre cerca de 0,5 mgZL e 30 mg/L. Em: outra.

modalidade, o meio de cultura compreende ainda uma polfemion de ou entre cerca de 2 mg l c 8 mg I Fm uma modahd'u\’ c^peeiLua. _;j p_$Hamiiia e a puuescina

Lm outra. mmiTld.ide. um método pum expressar ir.a prokòu 15 dssmtegrina e metaloproteiuase com motivos tembõspándma 13 í Al) \M 1 SI D e fornecido, o metodn compreendendo u vuhixo de uma célula que abriga um ácido nucleico que codifica uma proteína ADAMTS 13 em um meio de cultura compreendendo pelo menos ou earca de 2 p:M de zinco, em que o cultivo é mantido a ou entre cerca de 35^C c 37°C. Em outra 20 modalidade, o método compreende o cultivo de uma célula do mumtfen* que abriga um ácido nm.dcico que codifica uma proteína ADAMI SM cm um mmo <.L eudlura compreendendo pelo 'menos ou <erca de o μΜ de ;γ,κο. c rr que o cultivo é mantido a ou entre cerca de 35 X' e 37%' , Em uma modalidade, o método compreende o cultivo de uma célula de mamífero que 25 almgu mu ácido 'mJNeo que e.-rillxj mau prommu \PA\IISB em um mem de euhura eomgrvuadcmk^ de «>u enfie e^rea du 2 μΜ e I 2 μΜ de /nxo, em. que o cultivo é mantido a ou entre cerca ds 35*C e 37^0. Em outra, modalidade, o método eompreende o cultivo de uma „e1»4a de nxumdem que abriga mu aeido mieleien que codifica uma prmema ADAMTS >3 em um mefo-de outturn,compreendendo de ou entre cerca de 5 μΜ e 12 μΜ de zinca, em que o cultiva é mantido a ou eptrc cerca de 35^fÇ e .37®C, Em ainda nairas modalidades, o método compreende o cultivo de unra célula de mamífera que abriga um ácido nucleíco que codifica uma. prcgema ADAMTS13 em um 5 meia de cultura compreendendo pelo menos ou cerca de 2 μΜ_? ou pelo menos ou cerca de 3 μΜ, 4 μΜ. 5 μΜ, 6 μΜ,_; 7 μΜ, 8: μΜ, 9 μΜ, 10 μΜ, 11 μΜ, Ϊ2 μΜ, 13 μΜ, Μ μΜ, 15: μΜ, 20 μΜ, 25 μΜ, 30 μΜ, ou. mais de zineu, em que o caíiivo é mantido a ou entre cerra da 35®C e37^C, Em uma modalidade especifica, o eultreu é mantido a„ ou cerca de 36®C, Em uma modalidade, a 10 temperatura do cultivo é mantido por pelo manos 7 dias. Em uma modalidade, s método é realizado sob condições de cultura continua ou batelada alimentada, Em uma mudai idade repccifira. a condição de cultura contínua é uma condição de cultura quimio-mmea, llm outra modal idade específica, a condição de cultura eçminua é uma condição de cultura de perfuram Em. uma. 15 modalidade, a eclula que abriga o ácido nucleico que codifica uma protenia

ADA.MIS13 é uma célula de mauufero. Em modilidades pankularcx a célula de mamífero é uma célula de. hamster, humana, ou de murino. Em uma nradahdudc especifica. a célula e uma linhagem de cJiilas Cll<\ uma linhagem òc vchilas Ilf K 2R au anu linhagem de eclul ιχ BHK. bm o^sni 20 modalidadç, a célula de mamífero é cultivada em um melo de cuhura isento -de polipepfideo· eáw proteína animal Em ainda outra modalidade, a célula de mamífero e cultivada un uni meia de cultura ranêtico quv pode ou n.lo estar isenta de pobpepireeos e prmem.u amm.iis Em uma luodalitLdc. o meio de cultura compreende afo.de uma pnfiamma de ou entre cerca de 0,5 mg L e 30 25 mg/L. Em outra modalidade, o meio de cultura compreende arada uma poliamma de ou entre: cerca de 2 mg/L e S mg/L, Em uma modalidade x <.x< i’a.? 'viu, uma v <.♦ murescma fui outra modalidade, .m mhivd<> paia expressai uma pükm,i

Oesiuieprina e metal oproteinase eom motivos trambospondina 13 (ADAMTS.13) ά íomccído, o método compreendendo o cultivo de uma célula que uhH-a um acuio nuclm.tto que codifUa uma puncraa ADAM lSl ' em um meio de cultura compreendendo pelo menus ou cerca, de 2 gM de zinco, cm que o pH do cultivo ê mantido a ou entre cerca de 6,9 e 73. Bm uma outra 5 modalidade, o método compreende o cultivo de uma célula de mamífero que abriga um ácido nueleico que codifica uma proteína ADAMTS13 em um meio de çultura. compreendendé pelo menos ou cerca, de 5 pM de zinco, em que o pH do eukivo e mantido a ou entre cerca de 6.9 e 7,3. Em uma modalidade. o metudo cumprecn.de e> euhíso de uma célula de nutmfero q-m 10 ah ga u’ cciao tomvc q , eod fica uma ritoeme. \D\MISB eu rau meio de cultura compreendendo de o u. entre cerca de 2 pM e 12 pM de zinco, em que o pH do cultivo é mantido a ou entre cerca de 6,9 e 73. Bm outra, modalidade, o método compreende o cultivo de uma célula de mamífero que: abriga um ácido rateleicó que codifica uma proteína ADAMTS 13 em um

1.5 meio de cultura, compreendendo de ou entre cerea de 5 pM e 12 g.M de zinco, em que e pH do eu^bi\o v craúdo _} on ente, cuíca de 63 c \v 1 m ainda outras modalidades, o método cumpraende o cultivo de uma célula, de m mm lera que abriga, um ácido nucleieo que codifica uma. protema. \D\M ISI3 cm um meio de cultura compreendendo pelo menus nu cerca do 20 2 pM, ou pelo meno-> ou veteu de 2 uM, ou pela menos cerca 3 μΜ, 4 g.M, 5 gM, 6 pM, ” !i\l S pM, *) uM. 10 μΜ. 11 μΜ, 12. μΜ, 13 pM, 14 pM, 15 μ\1. 20 pM. 2? μΜ. M uAl ou mais de since, em que o píl do cubivo é mantido a ou entre cerca de 6,9 e 7,3. Em uma nuxhdidude, o cultivo é mantido a ou entre cerca de 35®€ e 37*0. Em uma modalidade especifica, o 25 enltixo é manti Jo a úu cerca de B_m uma modalidade, a. temperatura e/ou pH do <nhi\u e mantido por pelo menos 7 dias. Em uma modalidade, o m naco e teab/ado << ib condeneχ ue cultura contínua ou imicUda abmenmdru Em uma modalidade especifica, a toudiçào de cultura contínua é uma condição de cultura quinuo-vauca. Em outra modalidade especifica, a condição de cultura contínua é uma condição de cultura de perfusSo, Em uma. modahduk. a ral Li que <rârat>> o acido nudme>> que codifica un\i nmtema AIMMTS13 e umà célula de mamífero. Em modalidades particulares, a célula de mamífero é uma. célula, de hamster, humana, ou de nwrmo. Em uma 5 modalidade especifica, a. célula é uma linhagem de células CH0, umg linhagem de células Ul K 293, op uma linhagem de células BHK. Em. uma outra modalidade, a célula de mamífero é cultivada em um meio de cultura isento de polincntufeo e/ou proteína animal. Em ainda outra modalidade, a célula de mamífero é cultivada em um meio de cultura sintético que pode ou.

11) nào estar isento de polipepndeos e proteínas animais. Em uma modalidade, q meie de cultura compreende ainda uma políam.ina de ou entre cerca de 0,5 ntg/L e 30 mg/L. Em outra modalidade, o meio de cultura compreende ainda uma políamma de on entre cerca de 2 mg/1... e δ mg.· 1.. f.m uma modalidade especifica, a poliaminu c a pe.lreseina.

Em nina moUahdadc. o mmo de euhum usado para a expressão de num proteína ADWIfS pode sup-ememado e»>m zinco a uma concentração final, de pelo menos cerca de 2 μΜ a pelo menos cerca de 12 μΜ. Em certas modahdades, o meio de cultura pode ser suplementado com zinco a uma. concentração final de pelo menos cerca de 2 μΜ, oü pelo menos 20 cerca de 3uM, 4pM, 5μΜ. βρΜ, 7μΜ_:, 8μΜ, 9μΜ, IUuM. ΠμΜ, Ι2μΜ> Ι3μΜ,· 14μΜ 15μΜ, 20μΜ« 25μ.Μ, 30μΜ> ou níveis mais elevados de zinco. Geralmeme, qualquer sal de zíncu pode ser usado paru suplementar os meios da invenção, exemplos não limitanteç de sais aceitáveis induern, AtSO, ΊΕθ/-νθ, ΗΛη HãM/u, JEíXZnEr, x'-Rr fJLO.Zi.Cl·, 25 Ζπ (ΝίΕ,Ε'ΤΗτΟ, Ζη (HçPCqE ΙΕΟ, e semelhantes. Em certas modalidades, um sal tarmaceutícam.ente aceitável de zinco é usado para suplementar os raeín\ de udtura da invenção

2. Suplemeniáçiò enm ( afeio

Variüijcsam&Me, verificou-se que a atividade- enzimátíca e a m vhbue , fi< i ae \l)\MÍS 3 ,»_Ume nxl· > :n\ m c: icuncada¹. a partir de um mvsdmvato de cultura. de células em meio suplementada earn cálcio. Meias de cultura de células tradicionais, por exemplo, DMS^'B13_f 5 tipicamente continham cerca de I mM de cálcio. Historicamente. esles uiveis elevados de cálcio foram, introduzidos no meto para auxiliar os cultivos de células- aderentes. Hoje em dia, na entanto, meios comercitomente disponíveis designados para eulteras em suspensão contêm níveis de cálcio significativamente mferiares, por exemplo, cerca, de 0,1 mM de cálcio. Tais IO níveis mais: baixos dê cálcio são invocados para evitar a agreguçto de células cultivadas por meio de métodos de suspensão. Sabe-se q tm m\en de cálcio inferiores são suficientes para a propagação da células em suspensão e expressão de proteínas recombinantes, no entente,, os inventores verificaram que cae-, m\ms Kuxo^ de cTcjo tom mmfiemnv pan; a exp^stoto dsx 15 proteínas ADAMTS (pur exempfo. ADAMTS13).

Cónscquentemente, em um aspecto, a presente invenção torvee método'' p»m cxpraxsm uma ptommí M)\MIS _xpo? exemplo. ADAMTS13) tendo uma atividade específica aumentada pelo cultivo de uma célula que abriga um. ácido nucleiçe que codifica uma proteína ADAMTS 20 (por exempte, ADAM Γ8Ι 3) em um meu.? de euh.úra. suplememado com cale·??, pos exemplo. xo;ueudo pelo merms Π.5 m\1 de adem. Po ηκχίπο modo, a presente invenção também, fornece métodos para a prépàração de uma composição de pvoíema \P\M1X spm exemplo, uma k.orapoxÈçào de .ADAMTS 13) tendo ati\idade total ou atividade específica aumcr*to peba 25 cultuo de uma célula que abng t um a,Mo nucmko que eoàilkní uma pmtema Al> \M PS (per exemplo. \l > \M í KI ban um íí?ck> de , ubem .Msplcmcntsdo com o , aá λ» got exe^pm m'teem'u peto sncro fi.e '^f M Jecu'cm

Em. uma modalidade, um método para expressão de uma proteína desíntegrina e metaloproteina.se cam motivos tromfeospandma 13 (Al >ΛΜ IM fie tomecidm o metodu cnmpmeniicndu o tmhhn de un-.t <.e⁵ute q <e abrum an ucna* u\< h\,u çne < odtma ana ptolcma WAM I S^; < at am m.ei«> de cultura comprenndendo pelo menos ou cerca de 0,5 mM de cálcio. Em aaia outra modalidade, o método compreende o cultivo d© uma célula que 5 abriga um ácido nudeico que codifica uma prolcinu XDWLSl* cm um meio de cultura compreendendo pelo menos ou cerca de lâ nM de cálcio. Em uma modalidade, o meio de eidtura. contém de ou entre cerca de 0,5 mM e

1,5 mM de cálcio. Ea ainda outras mudai idades, o meio de cultura pode conter pelo menos ou nema de 0,5 mM, ou pelo menos ou cerca de 0,6 mM, 10 0,7 mM, 0,8 :aM, 0,9 mM, 1,0 mM, 1,1 mM, 13 mM, 1,3 »M, 1,4 mM, 1,5 mM, 1,6 mM, 1,7 mM, 13 mM, 1,9 mM', 2,0 mM, 2,25 ®M, 2,5 mM* 2*75 mM, 10 'tól, \5 mM, 4.0 ttiXL 4p mM. \(i nAL m. mau de catem.

Em. uma. modalidade,, é fomeudo um método para wpresxjr uma proteína desmtegrma e metaioproteínase com; motivos trombospondma 15 .13 (ADAM.TS13), compreendendo o cultivo de uma relate que abriga um uculo nucleate qm codifica uma prote.au WAMÍSM em em me^:o de cultura, isento de |x>lÍpeptMeo. e/ou proteína animal compreendendo pelo ou cerna dc (<,? rcAI de enteio, bm uma omu modtdmadc. o mentea compreende o euhivo de nma célula que abriga um ácido nudemo que 20 podiftca uma proteína A DAMTS13 em um melu de cultura isento de pólipeptídeo e/ou proteína animal compreendendo pelo menos ou cerna de 1,5 mM de cálcio, b.m uma mudalid.ukn o mem dc cuhnm isento dc polipcpudco e/on proteína animal contém de ou entre cerca de 0,5 mM e 1,5 mM de catem Em ainda outras modalidades, o meio de cultura isento de pólipeptídeo term 25 proteína animal pode conter pelo tnenos ou cerca de 0,5 niM. ou pelo menos ou cerca de 0,6 mML 0,7 mM 0,8 mM, 0,9 mM, 1,0 mM, LI mM, 1,2 m.M,

1,3 mM* 1,4 rnM, 1,5 mKC 1,0 mM, 1,7 mM, 1,8 mM, 1,9 mM* 2,0 mM, 2,25 mM, 2,5 m.M, 2,75 mM., 3,0 mM., 3,5 mM, 4.0 m\L 4.8 mM. 5,0 mM, ou mais de cáleíà Em uma modalidade, o meio de cultura compreende ainda uma pultemina de ou entre cerca de 0,5 mg/L e 30 mg/L. Em outra modalidade, o melo de cultura caiupreende ainda urna pofiamina de ou entre cerca de 2 mg/1. e S mg/L. Em ama modalidade específica, a poliamina é a putrescina.

Em outra modalidade, é íbmecido um método. para expressar uma proteína desintegrma e meíaloproíeitwe com motivos trombospondina 13 (ADAMTS 13), compreendendo o cultivo de uma célula que. abriga um ácido mmleico que codifica uma proteína ADAM I SB em um meio de cultura qtônrícamente definido contendo pelo menos ou cerca. de_: 0,5 mM de .10 cálcio. Em outra modalidade, o método compreende o cultivo de uma célula que abriga um ácido nudeico que codifica uma proteína ADAMTS 1.3 em um mcm d< c; 3 mt quHmc.tmvíUe defin.uo que com.gtceraic peto menu- uh cerca de 1,5 mM de cálcio. Em uma modalidade, o melo de cultura quimícamente definido contém de enkc cerca de 0,5 mM c 15 mM A eá=cio. Em ainda 15 outras modalidades, o meio de cultura Isento de polipeptidvo etou proteína ammal pode conter pelo menos ou cerca de 0,5 mM., ou pelo menos ou cerca de 0,6 mM, 0.7 mM, 0,8 mM, 0,0 mM, 1,0 m.M, 1,1 mM, 1.2 mM, 1,3 mM,

1,4 mM, 1,5 mM, 1,6 mM, 1,7 mM, 1A mM, 1,9 mM, 2,0 mM. 2,25 mM. 2,5 mM. 2,75 mM. 3.0 mM. L5 mM, Mu mM. 4? mM. mo ^:nM, ou mui> de 20 eàk k>. Em certas modalidades, o meio quinvej mente definido estará isento de oeluxpuGcu\ vou pnmrmm de* a ada > ac ,m ma 0 1 . «m« Hmdafiuade, o meio de cultura compreende ainda uma poliamina de ou entre cerca de 0,5 mgd. e '0 mgl . Em outra modalidade, o meio dc enhura eraupreende ainda uma pollamma de ou entre cerca de 2 mg/L e 8 mgÃ. Em uma modalidade 25 específica, a poliamma é a putreseina.

Em uma modalidade, um método pura espve-mr uma proteína destntegnna e metaloprotemase com motivos trombospnndina 13 (ADAM ESI M Mraecido, o ntoxia co:nprec:tdendo o erJitxo dc :mm eeluh de mamd.ui cue abngs um adde muleíco que Asfiüca uma pmtema

ADAMTS 13 em um meio de cultura que compreende pelo menos ou cerca de 0,5 mM. de cálcio. Em uma outra modalidade, o método, compreende o cultivo de uma célula de maun tora que abríga um ácido nucfeíco que codiftea uma proteína ADAMI'S 1.3 em. um meio de cultura cumpreendencfe peto menos ou 5 cerca de 1,5 mM de es feto. Em uma modal idade, o método compreende o culto o de uma cchala de mmutoro qm. abdga um .undo nnclcieo que codifica uma proteína ADAMTS 13 em um meio de cultura compreendendo de ou entre cerca de 0,5 mM e 1,5 m.M de cálcio. Em ainda outras modalidades, o método compreende o cultivo de uma célula de mamífero que abriga um 10 ácido nuclei co que codifica wna proteína ADAMTSI3 em um melo de cultura compreendendo pelo menos ou. cerca de 0,5 m.M, ou pelo menos ou k.erea do 0,n mM, d, ’ mM, úfe aALto¹ ;-;M _v feO >-\L :J nAl, fe? *M, 1,3 mM, 1,4 mM, 1,5 mM, 1,6 mM, .1,7 mM, 1,8 mM, 1,E mM, 2,0 mM, 2,25 mM, 2,5 mM, 2,75 mM, 3,0 mM, 3,5 mM. 4,0 mM, 4,5 mM, 5,0 mM. ou 15 mais de cálcio. Em. modalidades particulares, a célula de mamífero é uma célula de hamster, humana, ou. da murino. Em uma modalidade espeu Kxí, a célula é. uma linhagem de células CHO, uma linhagem: de células H.BK 2H3, ou uma Hnhugem de eduim BHK. Em nutra mou.didtoe. a eeiul.t ce mamífera é cuhixada em um meio de cultura isento de polipepddao e/ou 20 protcsna animal. Em ainda outra mmldidade, a célula de mamrtero è cultivada em um mera do «'uhuta dntcttCí' cue pnfe ou run esfir recato dt pohpcptídeo e proteínas animais. Em uma modalidade* o meio de euhura compreende aíadu unta pouamma de ou entre cores de ^ϊ!,\ mg l c 30 mg L, Em ourra modalidade, o melo de çuitura compreende ainda uma poliamina de ou entre 25 cerca de 2 1 e S mg/L. Bm uma modalidade específica, a poliumina é a putreseina.

I m mu.1 modahtetov. um rnètodv para esprereut nata pratema desintegrina e metaloprtJi.einast· com motivos trontoospondma .13 í Μ) \M IM fie Γοοη-eteo o meu alo kOmptcere.cndo o cuhreo de '.una rehfa que abriga um ácido nuckàco que codifica. uma proteína ADAMTS13 em um. meio de adturâ uomprcepdendo pelo menus ou cerca d© 0,5 mM de cálcio, sob cond>çòos· de adiara contínua ou batelada alimentada. Em outra modalidades o método compreende o unifico de uma célula de mamífero que 5 abriga um ácido uucleíCO que codifica Uma proteína. ADAMI'S! 1 em um meio de cultura compreendendo pelo menos ou cerca de 1,5 de cálcio, sob condições de cultura, contínua ou batelada alimentada. Em uma modalidade, o método compreende 0 cultivo de uma célula de mamíferò que abriga um ácido, nucleieo que codifica uma proteína ADAMTS13 em um 10 meio de cultura compreendendo de ou entre cerna de 0,5 isM e 1,5 mM de eâlcio, sub condições de cultura contínua ou batelada alimentada. Em ainda, outras modalidades, o método compreende o cultivo de uma célula de mamífero que abriga um ácido nuclefco que codifica uma proteína ADAM'fS 13 em um meio de cultura compreendendo pelo menos ou cerca de 15 i\? mM. ou pelo im>s ou cerna de G.n mM, uAL 03 nAt 0?> axM . '.fo mM. 1,1 mM, 1,2 mM, 1,3 mM, 1,4 mM, 1,5 mM, 1,6 IJ mM, LS mM,

1,9 mM, 2,0 mM, 2,25 mM, 2,5 mM, 2,75 mM, 3,0 mM, 3,5 mM, 4,0 mM, íuM, >j) iu\1. ou ma-s tie caiem sob coue'vVs de culnmi comúrca u·.

batelada alimentada. Ém. uma. modalidade específica, a condição de cultura 20 contínua é uma condição de cultura quimfosaikcr Em outra modalidade cq'uefi'k\u >í eomfieào Jt cuhum amtmua e ama coudjçào de eukurn de perfosão. Em uma modalidade, a célula que abriga o ácido rmciemo que eedibca u^-K'a piuiema WAMTSH e uma eehda de aumumux Im modalidades particulares, a célula de mamífero é uma célula, de hamster, 25 huáumá, ou de murino. Em uma modalidade especifica, a célula é uma 'Mc.nem dc ce.ukrc ( Ht h mna unuaee^. de ceada- III k 3^ru o,, uma linhagem de células BHK. Em urna outra modalidade, a célula de mamífero é ,m't Uid« em am me <s ue viihum born d< nohpepl de»⁴ e e-: puáema >m used Em ainda outra modafidáde, a célula de mamífero é cultivada em um meio de cultura sintético que pode ou não estar isento de pofipeptídeos e proteínas ammms fim uma modalidade. n meio de eultma eimspnxmde ainda mnu poli moina de ou entre cerca de 0,5 mgZL e 30 rng/L. Em outra modalidade^ o meio de cultura compreende ainda uma poliamina de ou ente cttea de 2 5 mmL e 8 mg/L. Em uma modalidade específica, apoliamina é a putrescina,

Lm outra tnodalidadé, um método para expressar uma proteína desintegrma e metalçproteinase_: com motivos trombospondina 13 í \1 > XM.TSI3) é fornecido, o ♦»<. <>do compreendendo o cultivo de uma célula que abriga um ácido nuclefco que codifica uma proteína ADAMI’S 13 em um 10 meio de cuhura compreendendo pelo menos ou cerca de 0,5 mM da cálcio, ©m que o cultivo é mantido a ou entre cerca de 3MC e 37^ÔC. Em outra modalidade, o método compreende o cultivo de uma célula de mamífero que abriga um ácido nudeico que codifica m^a protemu ADAMTS13 em. um meio de cultura compreendendo pelo menos ou cerca de 1,5 de cálcio, 15 em que o cultivo é mantido a ou entre cerca de 35C e 37°C. Em uma modalidade, o método compreende õ cultivo de uma célula de mamífero que abriga um ácido nucleino que codifica uma proteína ADAMTSI3 em um meio de cultura compreendendo de ou entre cerca de 0,5 mM. e 1,5 mM de cálcio, em qua o cultivo é mantido a ou entre cerna de 35% e 37%2 Em ainda 20 euims modalidades. o método cmupreeuue o eultiso de uma adula de mamífero que abriga um. ácido nucleiço que codifica uma proteína ADAM IS 13 em uns meio de auburn cumpreendeudo pelo menos ou cerca de 9 - mM. o,. peà> menu- ou ecum de u.o uAI. m ’ -*>\L p.$ p_s9 nAl , fefi mM, 1,1 m.M, 1,3 mM, 1,3 mM, 1,4 mM, 1,5 mM, 1,6 m.M, 1,7 mM 1,8 mM. 25 1,9 m.M, 2,0 mM, 2,25 mM, 2,5 mM, 2,75 mM, 3,0 mM, 3,5 mM, 4,9 mM, ^ς mM \f» mM m: mfex de cálcio, em que o eeJtní' u cufedo a enuc ecu í de '? C e >< t 1 m uma modahuade eMccstliu. o euhiso e mautído a ou cerna de M'C. l-m uma modufidade, a temper itara do cultivo é mantido por pelo menos 7 dias. Em uma modalidade, o método é realizado sob condições de cultura contínua ou batetada ahmeatada. Em uma modalidade específica, a coíídiçâo de u.úmra contínua é uma condição de cultura qiumíestática. Fm outra modalidade e^pecHhvg. a condição de cultura contínua é urna condição de cultura de perfusão. Em uma. modalidade, a. 5 vca’a quu abig^ o ucsdo mo km o que eodilkv un« p otema ΑΠΑΛΗ Sl ϊ c uma célula de mamifern. Em modalidades particulates, a céfeta de mamífero é uma célula de hamster, humana, ou. de murine.. Em. ama modalidade especifica, a cétala é uma linhagem de células CHQ, uma linhagem de células HEK. 293, ou uma linhagem de ceUdas BHK. Em uma outra modalidade, á 10 célula de mamífero é cultivada em. um meio de cultura, isento de polipeptídeu e/ou. proteína animal. Em ainda outra modalidade. a_: célula. de mamífero é cultivada em um meto de cultura sintético que pode ou não estar isento de pofipepude*o e proteínas animais. l'm mmi nsodafidade, n meio de cuhuni compreende ainda uma poliamina. de ou entre cerca de 0,5 mg/L e 30 mg/L..

Em outra modalidade, o meio de eifuura compreende ainda uma poliamina de ou euire cerca de 2 mg l e K mg l . hão ema modalidade específica, a poíummu. e a putre^ina

Em outra modalidade, um método para expressar uma proteína desintegrina e nietaloprotuinase com motives irombnspondi.ua 13 20 ΙΑΠΑΛ! I SI He forjOcata. o mclodu eempKX ndendo o todthu de uma eelula que abiiga urn audo m\'leuv> que emp km uma. pioteuia ADAM Ibm cm mu inch» de cahura cmnpreemkmdo pelo menos ou cerca de Oto mM de ealcux em que o pH do cultivo é mantido a ou entre cerca de 6,9 e 7,3. Em omra modalidade, o método compreende o cultivo de uma célula de mamífero que 25 abriga, um ácido nuclefco que codifica uma proteína AD.AMTS13 cm um meio de cultura compreendendo pelo menos ou cerca de 1,5 mfef de cálcio, em que o pH do culiívu e mamido a ou entre cerca de 6*9 e 7.3. Eat uma ctothlhife,. v método cum.prcvmk' o cuhko d, una cJala d*' mí.mifmo que ahríga uni ácido nudeico que codifica uma proteína ADAMTS13 em um meio, de cultura, compreendendo de ou entre ceres de 0,5 mM é 1,5 mM de cálcio, em que o pH do cultiva é mantido a ou., entre cerca de 6,9 e '7,3 , Em aínda entras modalfeades, q. método compreenda o cultivo de uma célula de mamífero que abriga um ácido nudeico que codifica, uma proteína 5 ADAMTS13 em um meio de cultura compreendendo pelo menos ou cerca de 0,5 mM, ou pelo menos ou cerca de 0,6 mM» 0(7 mM, 0,8 mM, 0,9 .mM , 1,0 mM, .1,1 mM, 1,2 mM, 1,3 mM, 1,4 mM, 1,5 m.M, 1,6 mM, 1,7 mM, 1,8 m.M, L° mM. 2.0 mM, 2.2^ mM. 2.5 mM. 2. >5 mM, 3.0 mM. V mM. 4.0 mM.

4.5 raM. M* mM. ou mms de ^axlo. em que o pl l do euhiso e manr.do a ou 10 entre cerca de 6,9 e 7,3, Era uma modalidade, o cultivo e mantido a. ou entre

'.'cjca de 3? V <. 3 'W I m ursa mudahJaJe espucitien, o cultor u mantido a 0'a ceua Ju >nV 1 m umi mndJmadr. ... temperatura u ou oH d_<} euhivo é mamidn por pdo mcno> dh-'. Fm ru moJahdade. o método c reaarado sob condições de cultura coutm.ua. ou batelada alimentada, Em uma 15 modalidade cspecdlc.i. a condição de cultura contínua é uma condição de cultura químiostutíca. Fm outra modalidade e^pecdle^ a condição da cultura continua é uma condição de cultura de perfusão. Em uma modalidade, a: célula que abriga o ácido nucicten que codifica uma proteína ADAMTS13' é uma célula de mamífero. Em. modalidades particulares, a célula, de mamífera 20 é uma. célula de .hamster, birmana, ou de murinu. Em uma modahdace específica, a célula á uma linhagem de células GHO, uma linhagem de evmlas HFK ou mea linhagem de células UÜK, ton imu ouir,. mrauhdade, a célula de mamífero é cultivada em um meio de cultura isento de polipeptídeo e/ou pmtema animal, Em ainda outra modalidade, a célula de mamífero é .25 euittvada. etn ttm meio de cnUura sintético que pode ou não estar feento dá polipuptídeos e pmtómas animais, Em uma modalidade, á mélu de cultura compreende ainda uma pofiamína de ou entre cerca dè 0.5 mg/L c 30 mg/L. Fm oram sraxfelidade, o meio de cultura compreende .urda uma po^amna de ou ente cerca de 2 mg/L e 8 mg/L. Em uma modalidade específica, a pufianima é á putrescma.

Em outra, modalidade, um método para .expressar uma proteína desmtegrína -e .metaloproteinase com motivos· tembospõndiúa 13 5 (ADAMTSI3): é fornecido, p método compreendendo. o cultivo de uma célula que abriga um arado nucleico que codifica uma proteína ADAMI'S 13 cm um me v de cultura omnnee cieteu pelo uuws ou de Um mM de uttoue pelo menos ou cerca de 2 μΜ de zinco. Em uma modalidade relacionada, ô meio de cultura compreende pelo menos ou cerca de 0,5 mM de cálcio e pelo 10 menos ou cerca, de 5 μΜ de zinco. Em uma outra modalidade relacionada, o meio de cultura compreende pelo menos ou cerca de 0,5 mM de cálcio e peto menos de ou entre .cerca de 2 μΜ de zinco e 12 gM de zinco. Em ainda, outra modalidade relacionada, o meio de cultura compreende pelo menus ou cerca de 0,5 mM de eátoio e pelo menos de ou entre cerca de 5 μΜ de zinco e 1.2 15 uM de nu o l m uivdteMafera a mem de cidmm cempreenJe pelo menos ou cerca de 0.5 mM de cálcio e pelo íiieno^ eu eerea de 2 u M. ou nulo menus ou cerca, de 3 μΜ, 4 μΜ, 5 μΜ, 6 μΜ, 7 μΜ, 8 μΜ, 9 μ.Μ, 10 μΜ, 11 μΜ., 12 μΜ, 13 μ.Μ, 14 μ.Μ, 15 uM. Ό μΜ. 25 μΜ, 30 μΜ ou mais zinco. Em uma modalidade, o cultivo é mantido a ou entre cerca de 35^Í!C e 37®C. 20 Em uma modalidade específica. o cultivo é mantido a ou cerca de 3MC. Em uma modandude, a temperatura e/ou pH do culto a c mantido por pelo menos 7 dias. Ern uma. modalidade, o método é realizado sob condições de cultura xonnnua oj baldada ahraenudu. Lm uma modatoiade especifica, a cmiJiçào de cultura, contínua, é uma condição de cultura quimíostática. Em outra. 25 modiuicLíde espedfiea. a condíçJo dc eiriura continue e uma eundiçàe de tmc ec pertvdo t a “a \alabi\ « <dn^!rape' tom ⁴ ο κ do. sa’ano que codifica unia proteína ADAM IS 13 c uma célula de mamífero. Em modalidades particulares, a célula de mannfvu» é uma célula de hamster, humana, ou de wurüte Hn uma ajodulidude especifica, u céluCí e uma linhagem de células ÇHO, uma linhagem de células ΗΡΚ. 293, ou uma. hnhjgvín ce ce.u' Bi Ik Pm uma O'Uu 'Jted.thd.ule. a cctula d< mamnxo e cultivada em um meio de cultura isento de polipeptíden e/eu proteína animal. Em ainda. outra modalidade, a célula. de mamífero é cultivada em um meio de 5 <_uhum S'meueo que pode nu uào csua mento de poHpcptukOs c mommas animais. Em uma modalidade, o meio de unhara compreende ainda uma poliamina deott entre cerca de 0,5 mg/L e 30 rngJL Em outra modalidude, o mmo de ruhira compreende ainda unw poliamina cL uu euue eou de 2 mg l c δ mg 1 . l'm utj mod.thdude especifica. a neliamina c s nmreseinj

Em outra modalidade, am método para expressar uma proteína desimegrina e metaloproteinase com moinas uomboq^^Jina 13 ( \l JAM IS; De fornecí do o melado compreendendo o a±iu< de urns cdula que abnea urn ncido nuvUlcu quo comiKa um í ponente Al JAM IS.' e;n tun meio de cultura compreendendo pda menos ou cerca de 1.5 mM de cálcio e pefo menus an cerca de 2 μΜ zfoco, Em uma modalidade relacionada, o meio de cultura, compreende pelo menos ou cerca de 1,5 mM de cálcio e pelo menos, mi cerca, de 5 μΜ de zinco. Em urna outra modalidade relacionada, o mela de cultura compreende pelo menos ou cerca de 1,5 .mM de cálcio e pelo menus de ou entre cerca de 2 μΜ de zinco e 1.2. μΜ de zinco.. Em ainda outra 2:0 modalidade relacionada, o meio de cultura compreende pelo menos ou cerca de 1,5 mM de cálcio e pelo menos do. ou entre cerca de 5 μΜ de zinco e 12 μΜ de zinco. Em. certas modalidades, o meio de cultura compreende pelo nu nos ou cerca c.e ’> mM de cálcio e pelo ou curcj. de ã uM, ou pelo menos ou cerca de: 3. μΜ, 4 μΜ, 5 μΜ 6 μΜ, 7 μΜ, '8 μΜ, 9 μΜ, 10 gM_s 11 25 μΜ 12 μ Μ, 13 μΜ, 14 μΜ. 1.5 μ Μ, 20 μΑΕ 25 μΜ, 30 μΜ, ou mais emeu.

Ere mna pmd didade, o cu’luo c mau uo a an emre ,erea Jc AV _e

Em uma. modalidade específica, u cultivo é mantido a ou cerca de 36*C. Em uma modalidade, a temperatura emu pH do cultivo é mantido por pelo rm?no^ dk'.^ * m umt mad/ídaA', o memdo é seah/ada rob coud\'aos de cuhurc contínua ©u tatelada alimentada, Em uma modalidade especd'iea, a condição de cultura contínua $ uma condição de cultura quimiustáliça. Em outra modalidade específica, a çondíçãu de cultura contínua é uma condição de cu ltura de perfusao. Em uma modalidade, a célula que abriga o ác ido nueleico o que vOditíca urra proremn \DWtlSl' e mmi em da de mameém. bm modalidades particulares. a célula de mmmfern e anu célula du hamster, humana, ou de mmíno, Em uma modalidade especifica. a célula é uma Imhapcm de células CHO, uma linhagem de células- HEK 293, ou uma hrcm.cn- dc ev'tdas Bilk I. m uma omm nmAdukJe a ve: Ja dc mamk.no è .1.0 eu hi veda cm um meio de cultúm Isento de polipeptídeo efou proteína animal

Em alada ouha modalidade, a cémla de mam Esc e r.Utix uh am mem de cultura sintético que pode ou não estar isento de polipeptídeos e proteínas animais. Em uma modalidade, o mem de cultura compreende ainda uma poliamina de rm entre cerca de 0,5 rngZL e 30 mg/L. Em. outra modalidade, o .15 meio de cultura. compreende ainda uma poliamina de ou entre oeren de 2 mg/L e 8 mg/L, Em uma modalidade espeeílka. a pplíaruma é a putrexclaa.

Em outra modalidade um método para. expressar uma proteína: dc-amcgrma e metaiopnstoinase eem motivos tmmbospondina 13 t \11\ΜΓ813) ê fornecido, o método compreendendo o cultivo de uma célula 20 que abriga um áçido nudeico que codifica uma proteína ADAMTS l3: em: » meio de cultura compreendendo pelo menos, de ou entre cerca de 0,5 mM e

1,5 fflM de cálcio e pelo menos nu cerca de 2 μVI dc ziucu. lm uma moe‘hvLde m ummuia. o nvr cubam emtnnce dc nele mem>\ ck ou enEe cerca de 0,5- mM e 1,5 mMl de cálcio e pelo menos ou cama de 5 μΜ. de .2:0 zinco. Em outra modalidade relacionada, o meio da cul tura ctxmpreende pelo menos de ou entre eerca de 0,5 mM. e L< mM de còlcio e pelo menos de ou entre cerca de 2 μΜ de zinco e 12 μΜ de zinco. Em ainda outra modalidade umuuomdt o me o dc cJt m commuv.dc p_vle r.Krm' éc «m erue dc 0 mXÍ v Lé m\I de calem e pe.o mem^ de ou eav.e ceres de 5 uM dc z.acv ç .12 μΜ de zinco. Em ccrtas modalidades, o mein de culture, compreende pels menus de ou outre cercà. de 0,5 mM e 1,5 mM de cálcio e pclo menos ou cerca de 2. μΜ, ou pelo ine?»^ on eerea de 3 μΜ 4 μΜ, 5 μΜ, 6 μΜ, 7 μΜ, 8 μΜ, 9 μΜ, 10 μΜ, Η μΜ, 12 μΜ, 13 μΜ, 14 μΜ, 15 μΜ, 20 μΜ. 25 μ.Μ, 30 μΜ, man de /meo. Ora ama modalidade. o euliivo c mantido a <hi crore cerca de 35'Έ e 37C. Em urns modalidade especifica, o cuhívo é mantido a ou cerca de 36^WC. Em uma modalidade, a temperatura: e/ou pH do .cultivo é mantido par pdo menos 7 dias. Em uma modalidade. u método é realizado sob condições de cultura, contínua ou batelada alimentada:. Em uma 10 modalidade esnecitlca, a condição de euliura contmua è uma condição de cultura quimiercalna. Em outra modalidade especifica. a condição de cultura continua é uma condição de cultura, de perfesão. Em. uma modalidade, a célula que abriga. o ácido nucleicu que codifica uma. proteína ADAMTS 13 é uma vclula de m-smneux. Em mcdJrcades parncnlmm, a colida de ra.umieto 15 é uma célula de hamster, humana, ou de munno. Em uma. modahuade· especifica, a célula é uma. linhagem de células CHO, uma linhagem de células HE'K 293, ou uma .linhagem de células BHK* Em uma outra modalidade, a célula de mamífero é cultivada em um meio de eu hunt isento de pofipaptídeo e/ou proteínt animal. Em ainda outra modalidade, a célula de mamífero é '2d cultivada em um meio de cultura smtéucu que pode ou não estar isento de pOiipeptideos e proteínas animais. Em uma rnodalídade, o meio dè cultura compreende ainda uma puliamina· de ou entre cerca de 0,5 mg/L e 30 mg/L, hm outra modalidade, o meia dc cultura compreende ainda uma poliaroi.ua.de ou entre cerca_: dé 2 :mg/L e 8 mg/L. Em uma modalidade específica, a 25 poliamma é a putrescina.

Lm outra modalidade, uní método pw. expressar uma proteína desintegrina e metaloproteinase com motivos trombospondina 13 t ADAM TS13) é tbrnecido. o método .'ompreendendri o euhixn de unia célula que abriga um ácido nucleico que codifica uma proteína ADAMTS 13 em um meio, de cultura compreendendo pelo menos ou cerca de 0,5 mM, ou peto menos ou eerça de 0,6 mM, 0,7 mM, 0,8 mM, 0,9 mM, 1,0 mM, 1,1 mM„ 1,2 mM, 1,3 mM, 1,4 mM, 1,5 rnM 16 mM, 1,7 mM, 1,8 mM, 1,9 mM , 2,0 mM. 2,25 mM, 2.5 mM, 2,75 mM, 3,0 mM^ 3,5 mM. 4,0 mM, 4,5 mM, 5.0 5 mM, ou mais de câtóo e pelo menos ou cerca de 2 pM de zinco. Em uma. modalidade relacionada, o meio de cultura compreende de ou cerca de 0,5 m.M_s ou pelo menos ou cerca de 0,6 mM, 0,7 mM,_: 0,8 m.M, 0,9 mM. 1,0 mM,

1,1 mM', 1,2 mM, 13 mM, 1,4 mM, 15 nril. 1.6 mM, 1,7 mM, 1,8 mM, 1,9 mM, 2,0 mM, 2.25 m.M, 2,5 mM, 2,75 mM, 3,0 mM, 3,5 mM, 4,0 mM, 4,5 mM, 5,0 mM, ou mais de caldo e peto menos qu.Cerca de. 5 pM de zinco. Em uma outra modalidade icbcmcMa, o meto de cultura.compreende de mi cercade 6.5 mM. <m pel·.* menos ou cerca de O.n mM. 0.7 mM. n.x atM. 0,9 mM. 1,0 mM, 1J mM, 1,2 mM, .1,3 mM. 1,4 mM. 1,5 m.M , 1,6 mM, 1,7 mM, 1,8 mM, 1,9 mM, 2,0 mM, 2,25 mM, 2,5 mM, 2,75 mM, 3,0 mM, 3,5 mM, 4,0 15 mM, 4,5 mM, 5,0 -mM, ou mais de cálcio e peto menos de ou entre cerca de 2 pM z^:ueu e 12 μΜ de rm.eo. Em ainda uutus modalidade retoetonuda. o meio de cultura compreende de o u cerca de <1,5 mM, uu pelo menus ou cerca de 0,6 mM, 0,7 mM, mM, 0,9 mM, 1,0 mM, 1,1 mM, 1,2 mM, l .3 mM, 1,4 mM,

1,5 mM, 1,6 mM, 1,7 mM, 1,8 mM, 1,9 mM, 2,0 mM, 2,25 mM, 2,5 mM, 20 2,75 mM, 3,0 mM, 3,5 m.M, 4,0 mM, 4/ mM. 5,0 m.M, ou mais de cálcio e pulo munro de e-a ercre r\R>, de uM de zinco c 12 nM dc zrè eu, I m vedas modaluhd^. o mera de cultura uoatprctndc de ou cerca de 0.5 mM, ou peto menus ma, coma de 0,o mM, ο/' rAL p> mM. ü.m mM. 1.0 mM, I.l mM, L2 mM, 1,3 mM, 1,4 mM, 1,5 mM, 1,6 niM, 1,7 mM, 1,8 mM, 1,9 mM, 2,9 mM, 25 2,25 mM. 2,5 m.M, 2.75 mM, 3,0 nuM, 3.5 m.M, 4.0 mM. -l.A mM. 5,0 mM, ou uíuI, dv calca» e pelo mono ou cerca Je .1 pM. uu peto meno^ on eerea do ' pM, 4 pM_f 5 p.M, 6 pM, 7 pM, 8 pM, 9 μΜ, 10 μΜ, i 1 pM, 1.2 pM, 13 μΜ. 14 μΜ, 15 μΜ, 20 μΜ, 25 pM, 30 μΜ, ou reais de emeu. Em urns modalidade, o cultivo é mantido a ou entre cerca de 35-°C e ..TFC. Em uma modalidade especifica, o cultivo é niaotldo a ou çerca de Itétél Em uma mudalídade, a temperatura e/ou pH do cultivo é._: mantido por pelo menos. 7 dias. Em urna modalidade, o método é realizado sob condições de cultura: contínua ou. batelada alimentada. Em uma modalidade específica, a condição.

de cuhtnu eonlmua é uma kondapm de cultura qumuostaUea. Em mura modalidade específica, a condição de cultura contínua é uma condição de cultura de çeriusàs». Em uma modalidade. acelum que .dnapa n uekte nucknco que codtíka uma proterea WXXU’SB e uma célula de muuutéru Em modalidades particulares, a célula de mamitéro é uma célula do hamster.

humana., ou de murino. Em uma modalidade específica, a célula é uma Hrè.igmn de cela ClhX uma té Lage*'* de cJulas HÍK 2°! m uma Imautem de cetélas BHk. I m a..ua modalidade a celuté dc mstnntero é euhoada em um meio de cultura isento de pohpeptídeo e/ou proteína animal. Em ainda outra modalidade, a célula de mamífero é cultivada em um meio de 15 cultura, sintético que pode ou não estar isento de polipeptídeus e proteínas animais. Em uma modalidade, ç main de cultura compreende ainda uma poliámina de ou entre cerca de 0,5 mg/L e 30 mg/L< Em outra modalidade, o meio de cultura compreende ainda uma puliamtéa. de nu entre cerca de 2 re.g I c s mp. I Em nma modalidade opetéhca. <i poli muna c i pumcacma.

Geralmente, qualquer sal de cálcio pode ser usado para suplementar os meios da presente invenção. Exemplos não limitantes de sais aceitas eis incluem CaCk CaCE. í2aFPO_?-?H?O. Cal>. GaBr _;. (Cà EOÈ-Ca, té Ί iO-té í \ç t C_? JI ?O₆)>Ca > (QHd >' ),_;Ca ρ e semelhantes. 'Em certas modalidades, um sal iarmaceutícameate aceitável de cálcio é usado pára 25 suplementar os meios de cultura da iu\ ençâu.

3, Suplementaçio m>m Nièntinnm-íéa (Vitamina B3)

Vantajosamente, verificou-se que a atividade enzimâtica e atixnladc especulo i dc <\PAMISI'' .remontadas podem se*' recipe?..d,.s a partir de um cultivo de células cultivadas em meio suplementado com nícotinamída (vitamina B3). Por exemplo,, o Exemplo 2, demonstra que Protema ADAMTS13 expressa em. meio de cultura, contendo 7 ms/L de nicotinamida. (\itamina B3) tem uma atividade especifica 60% maior do que proiema ADAMIS 13 expressa .-em. meio de cultura contendo apenas 2 mg/L 5 dc nieoUnamida (Tabela 13; comparar dias 4 e 7 com o dia 11).

^xutputeiideutememe Mraíoto' snujko o>w ? 'UrènieiMuo de ruo. a medida em que a expressão de ADAM.IS13 cm meio contendo 7 mg/L de mcotmmmda (vitamina B3)e 5 μΜ de zinco resulta em um aumento de 200% a 300% na atividade específica de proteína ADAMIS 13 (comparar Tabela 14 10 du 11 o>ri α I anela I ' Jau 4 c %

Conseqitentemente, em um -operam a presente i»neaçàe forem c métodos para expressar rans prate r.e ADAMIS (por exemplo. ADAMTS 13) tendo uma ato idade esnemlira aumentada pelo cultivo- de uma célula que abriga um ácido nudcico que codifica uma proteína ADAMTS 15 tpra exemph?. .ADAMN'S to) nieí« Jc euhuta sup-ememadu com mcetínumidu tvnamma Btp pm exemplo. «.omeudn pelo menos 2 mg l de nicotinamida (vitamina. B3). Do mesmo medo, a presente invenção também fornece métodos para a preparação de uma composição -de proteína ADAMTS (por exemplo, uma composição de ADA.MTSI.3) tendo o aumento da 20 iXan to ; ai at v dada ^λχι reu p<. o ». < toa Pe >ru < 'k’? q v nvi , um ácido nucleico que codifica uma proteína ADAMTS (por exemplo, \D\M1SLD em tm meio de cMfnt.i rapkmcatada ^om aieoVfvmtoa iMiamma B’k por exemplo, comendo pela men<'.^ 2 mg I de mecteiamuD (vitamina. B3).

Fm uma modalidàde,. «®. método para, expressar uma proteína:

dcsmtegvi.ua e mvta'opratemase com motivos trombospondina 13 (ADAMTS 13) é fornecido, o método compreendendo o cultivo de uma célula que abriga um ácido mnxAco ene codilku uma proteína ADAMTS 13 em um meio de cultura compreendendo pelo menos ou cerca de 2 mg/L de mcvlmmuiih ^iramma ΪΓί Em uma omra moc.didaJo. o mcnvto compreende: o cultivo de urna célula que abriga_: um ácido nuciewq que cothlua uma proteína. ADAMTS 13 em um. melo da cultura compreendendo pelo menus ou cerca de 7 mg/L de mcotinamída (vitamina B3). Em umà 5 modalidade. o meío de eulium omlem de mu entre cerca de ? amd c lu [ de raconramtidu (xitammu B9. Em mmiu outras modalidades. o meio de cultura pode conter pelo menos ou cerca de 2 mg/L, 3 mg/L, 4 mg/L, S mg/L, õ mg/L, 7 mg/L, 8 mg/L, 9 mg/L, 10 mg/L, 15 mg/L, 20 mg/L, ou concentrações mais elevadas de nicotinamida (vitamina B3). As faixas de 10 concentração de .nicotinamide, (vitamins. B6) adequadas são geraímente determinadas por toxicidades de cultura, de células que podem ocorrer na mvsença de kO.X'cnuaçòcs eknadL-H ek ímrrjv.hb (uhmuna BA pa exemplo em voucemraçòm. m.norav que H -ml . ?^{» me l . .A ηψ l , 10 m.g.íL, e semelhantes. Como será entendido pelo versado na técnica, a

1.5 cxteskCiO em que as eommmraçve^ de nicotinamida (\hamma B3) <õn 'Hbiduras para um sistema de ernmu nmtieed n >cmc altumente dependentes, entre outros fatores, do tipo de célula, usada para, expressar uma protema ADAMTS, os componentes do meio de cultura usados, e o modo opetamo usada para a cultura (por exemplo, batelada vx contmuo; suspensão vs 2d aderente; qmmfostato vs perâpão; etc.) Em certos casos, concentrações <fe meotínamída (vitamina B3) mais elevadas podem ser necessárias onde os componentes do meio de cultura podem sequestrar nicotinamida (vitamina Bh a pmt' Ja xohspto t ouscquen cmcxtk. Is \.o de kome íf„xOe dc uieoimumlda (vitamina B5) adequadas são geralmente determinadas pela 25 identidade das células cultivadas, o modo opermh o c uediu empregados. Um versado na técnica será pmntamente capaz de determinar os limites superiores apropriados para o uso de supiementaçáo com nínotlnamida (vitamina B3) baseado no sistema de cultivo individual empregado.

.Em uma modalidade, é fornecido um método para expressar uma proteína desintàgrma e metaloprqtetnase com motivos tronibospondma 13 (AIMMrS.13), compreendendo o cultivo de uma célula que abriga um ácido nucfeico que codifica uma proteína A.DAMTS13 em um meio dé mrèura Hcuto de prcfouptuk-o coa proictaj uniam! compnvuuenJo pcre menos on ceres de .2 mg/L de mcolmamida (vitamina B3). Em outra mmülidade, o método compreende u eul'i\n d,· atua cdub que abogi um amdo auJeíco que codifies man pjotema W XMLS'3 em um ramo de euhura istmo de polipepfideo e ou pmtema animal compreendendo pelo 10 menos ou cerca de 7 mg/L de mcotlnamida bòamiaa 133). Em uma modalidade, o meio de cultura isento d.e polipepndeo e ou proteína animal contém de ou entre cerca de 2 mg/L e 10 mg/L de nicotinamide (vitamina B>). Em ainda outras modalidades. o meio de cultura mento de mdipeptidvo e/ou proteína animal pode conter pelo menos ou cerca de 2 mg/L, 3 mg/L, 4 15 mg Ϊ , 5 mg l . 6 mg l . 7 mg/L. 8 mg/L, 9 mg/L. 10 mg/L, lo mg/L. 2u mgd., ou eonoi nu ações mais elevadas de meolmamirb {vitamina B3). Em uma modalidade, o mein de culture compreende ainda uma poliamina de ou entre cerca de 6,5 mg/L « 30 mg/L., Em outra modalidade, o meio de cultura compreende ainda uma polramina de ou entre cerca de 2 mg/L e 8 mg/L, Em 20 Wk moda.rc.Kk' < 'pecifuv.. poh anota v. v 'auuercm.i

Em outra modalidade:, é fornecido um método para expressar uma proteína desíntegrina c metaloprotetnase com motivos trumbospondina. 13 (ADAMTS OL compreendendo u cultivo de uma célula que abriga, um ácido nucleieo que codifica uma proteína AD.AMTS13 em. um meio de 25 cultura q vnncamnnte definido contendo pelo menos on cerca, de 2 mg/L de ukOhnatmn /vitamina B3). Em outra modaae.ide, o método compreende o cultivo de uma célula que abriga um ácido nucíeíço que codifica uma proteína \D WrSI em mdo de culatra qummmucntc definido que compoa pelo nrcno'> ou cerca e.e ⁷ mg I de mvOiinumida ^harama BB. Em uKt modalidade, o meio de cultura quimicamente definido contém de ou entre cerca de ? mg I e 14 mg l de ricowurto uítmrune BD í »n ; inda m turn modabdjdra, o meto· de cultora isento de polipepudeo e/ou proteína animai pode conter pelo menos ou çerca de 2 mg/L, 3 mg/E, 4 mg/L, 5 mg/L, 6 5 mg/.L> 7 mgíL, S mg/L, 9 mg/L, 10 mgZL, 15 rng/L, 20 mg/L, ou concentrações mais elevadas de nicotinamida (vitamina B3). Em certas modalidades, o meio qtomfcamente definido estará, isento de polipeptídeos e/ou pmiemas derivadas de animais. Bm uma modalidade.;, o meio de cultura·. çompreçúde ainda uma políarnma de ou enire cerca de 0,5 mg/L e_: 30 mg/L. 10 Era outra modalidade, o meto de cultura compreenda ainda, uma poliamína de ou entre cerca de 2 mg/L e B mg/L. Em uma modalidade eapeenlca, a poliamina é a putrescina..

Em uma modalidade, um método para expressar uma proteína desintegrina. e metaloproteinase com motivos trombospondina 13

1.5 t ‘>D \M PS EM c fornecido. u método eomprcemicmm o c dmo de uma célula de mamífero que abriga um ácido nucleico que codifica uma proteína ADAMTS 13 em um meto de culena que compreende pelo menos ou cerca de 2 mg'L de mcvlmamimi n mínima B3). Em outra modalidade, o método compreenda o cultivo de uma célula de mamífero que abriga um ácido 20 nucleieo que endillea uma proteína ADAMTS 13 em um meio de cuhura msmpíeenJemfe pelo menos ou cerna de 7 mg/L de nfeotinamida (vitamina l m u\i modalidade, n memdo compiev-de o cuario de mna cchib de mamífero que abriga um ácido miclcíeo que codíilca unu proteína ADAM ESI ’ em am mem de euhura »miupivendendo de ου cone ocrea dt 2 25 mg/L s 10 mg/b de meotmaniida (vitaml.ua B3). Em. ainda outras modalidades, o método compreende o cultivo de uma célufe de mamífero que ahign um addo nralemo que eodiòes uma ptoieína ADXAllM^ era um meia de cultura compreendendo polo menos ou cerca de 2 nig/L, 3 mg/l.. 4 me l., 5 mg I... O me l., 7 mw b. 8 me/E. 9 rns/l., 10 nw/L, 15 mu L, 20 mg'l._x ou coneentrações mais elevadas de nícotínamlda. (vitamina B3), Em modalidades partícidares, a célula, de mamífero é uma célula de hamster, humana, ou de murino. Em uma modalidade específica, a célula é uma linhagem de células CHÔ, uma linhagem, de células ΉΒΚ. 293, ou uma 5 linhagem de células BHk. Em outra modalidade, a célula de murai fero é cultivada em nm meio de cufiura isento de pollpcpüduu e/ou proteína. animal. Em alada outra modalidade, a célula de mamífero é cultivada em um meio de cultura xinem-a que pradt uj nlo estar isento de pohpcrUdeus e proieúta* animais. Em. uma modalidade, o meio de cultura compreende ainda uma 10 pnliamitra de ou entre cerca de 0,5 feg/L ® 30 mg/L Em outra modalidade, o meio de cultura compreende ainda uma. polrarnma de ou. entre cerca de 2 mg/L e 8 mg/L. Em uma modalidade èspecífioa, a poliamiua é a puirascma.

Em umn modalidade, utu método para expressar uma pvotema deMmcgritxi c metalopraMiurae com motivos trombospondína 1.3 15 (ADA.M’l S131 é torneddo. o método compreendendo o cultivo de uma célula que abriga um adde nucleko que codifica uma proteína ADAMTS13 em um meio de cultura compreendendo pelo menos ou cerca de 2 mg/l. de meotmamida (vitamina B3 k sob condições de cultura contínua ou bateladá alimentada. Em uma outra modalidade, o método compreende o cultivo de 20 umi cèKb de ma micro que abriga um ácido midden que eoddtca eras proteína ADAM l'S13 em em meio de cnhura compreendendo pelo memx ou cerca de 7 mg/L de nicohnamida (vitamina B3), sob condições de cultura contínua ou alimentadosdote. Em uma modalidade, o método compreende o udtho de kiu.i eehdíi de mamífero que abuga um ’irado auclcieo cue raubtic.i 25 uma proteina ADAMTS 13 em um meio de cultura ccmpieraadendo de on c'l'i »\'hdcc ' > I eT'vl »fi*'\n*'ih''kbhf*r * i B _Mra - < Itu contínua ou batelada alimentada condições. Em ainda outras modalidades, o método compreende o cultivo de num célula de nuratfem que abriga um ac do nudeico que raxhtica una pimenta WAMISl? ran um indo de cultura compreendendo pelo .menos ou cerca de 2 mg/L,. 3 mg/L, 4 mg/L, 5 mg/L, 6 mg/L, 7 mg/L, 8 mg/L, 9 mg/L, 10 mg/L, 15 mg/1..., 20 mg/L, ou eoucenirações .mais elevadas de. nicotinamída (vitamina. B3), sob condíçoes de cultura de batelada alimentada e eoatínua.· Em uma modalidade específica, a 5 condição de aultara contínua é uma condição de cultura, qumfiostátiea» Em outra, modalidade específica, a condição de cultura eontínua é ama. condição de cultura de perfusao. Em uma modalidade, a célula que abriga o ácido nucteíeo que codifica uma proteína ADAMTS1 3 é: uma célula de mamífero. Em modalidades particulares, a célula, de mamífero é uma célula de hamster, 10 humana, ou de murino. Em uma. modalidade específica, a célula é uma hnhagem. de .células CHQ, uma. linhagem ,d.e células HEK. 2^3, ou uma linhagem, de células BHK. Em uma outra modalidade, a célula de mamífero é cultivada cm. um meio de cultura isento de pohrcptutoo e/ou proteína animal. Em ainda, outra modalidade, a célula de mamífero é cultivada, em um meio de 15 cultura >iusetieo une pude ou nào e\tar isento do pubpeprideos e proteinv* animats,. Em. uma piodalidade, o meio de cultura compreende ainda uma políamma de ou entre cerca de 0,5 mg/L e 3.0 mg/L. Em outra, modalidade, o meio de cultura compreende ainda uma poliamma de ou entre cerca de 2 mg/.L c 8 mg/1... Em uma modalidade especifica, a pobamina é a putrescina.

I< 'f nutra modalidade, ara metodn para expnssar uma prom-ma desintegrma e nietaloproteinase com motivos uxuubospondmd 13 t ADAM l SI 5) c fonnxndo, o método eompieeudeudo o cuhixo de uma célula que abriga um ácido nucleico que codifica uma proteína ADAMTSi? em um meio de cultura compreendendo pelo menos ou. cerca de 2 mg/L de 25 naonsurfia (\nami^!a cm que v aãtívc e maufido a ou euuc de (A· C Pjh um.» nutra uiudalidade, o método coníprevnde o euhlso de uma célula de mamífero que abriga um ávido uucleico que codifica uma proteína ADAM'TS I3 em um meio de cultura compreendendo pelo menos ou eere í dv 7 mg I dc unolmamida {siiamma HM. em que o vulròo e mantico a · onto ν' ícj uc ί*C : F't ί m .jna nawihJude, ο ',χ\> compro- ace o cultivo de urria célula de mamífero que abriga am. ácido nucleico que codifica proteína ADAMI'S 13 em um mein de cultura comprcendendo de on entre cerca de 2 mg/E e IQ mg/L de nícotínamída. em que o cultivo é-.mantido 5 a ou entro cerea de 35*0 e 37®C< Em ainda outras modalidades, o método comproende ó cultivo de umà. eéhda de mamífero que abriga um ácido ue eieo que codifica üiíu pteteiua ADAM 1 SP em um muro ue culuua compreendendo pelo menos ou cerca de 2 mg/L, 3 mg/L, 4 mg/L, 5 mg/L, 6 mg/L, 7 rng/I..., 8 rng/L, 9 mg/.L, 10 mg/L. 15 mgd,. 20 mg/l.., ou 10 concentrações mais elevadas de .mcoli namida (vitamina. B3), em que o cultivo é mantido de ou entre cerca de 35*C c 37XL Em uma. modalidade espedtka, o cultivo é mantido a ou cerca de 36*C. Em urna modalidade. a temperatura do cbròo é mantido por pelo inesius ~ dias, b.m uma modalidade, o meroJo é reu fiado rob condições de cultura contínua ou batelada alimentada. Em uma 1 S umdJidade espccdkci. a eandiçàu de uulturu contínua c uma condição de efotnra >qumn<>sluu<u. Ida ounv nmduhdude ropecmuu. a condição de cultura conUhuu v uma condemn de cultura de perfuscu. hm uma anubdidade. a célula que abriga: o ácido nucleíco que codifica uma proteína. ADAMTS.13 é uma célula de mamífero. Em modalidades particuiaros, a célula de mamífero 20 è ©ma eelula de hamster, humana, ou de murino. Em uma modalidade cxpcmfica. a cehda u uma linhagem de células Cl II). uma linhagem de células Hbk ou uma bnhagem de culuLo BHK. hm uma unira modalidade, a célula de mamr.eio ê cultivada cm um meio de cultura isento de pulipcpt-dco e/ou porteina animal. Em ainda outra modalidade, a célula de mimntero e 25 eultivadà em um meio cie cultura sintético que pode ou não estar isento de pohpuplideos e proteínas animais. Em uma modalidade, o meio de cultura comprovado amé.» uma pdíaucna de »>u emrc vena de 0.5 mg'l u ?*» mod I m ojiJ rcodròè jfiu. e nc'.o de tua i eu 'pxxmec a udu .©a pu um t dc vu jitic re’uv de *'J v δ I l n uma modalidade e-pre Tun:. a poliamma é a pwesema.

Em 'uma outra. ntodalidade, um método para expressar ama proteína: dcsmtegrma e metatoproteínase^ com motivos trombospondína 13 5 (ADAMTSI3) c furuvddo, o método compreendendo o cultivo de ama célula que-abriga um acído uucidea que codifica, uma proteína ADAMTS13 em um meio de cultura compreendendo pelo menos ou cerca de 2 mg/L de ntcotinamtda. (vitamina B3K em que o pH do cultivo é mantido a ou. entre cerca de 6,9 e 7,3. Etn uma outra modalidade, o método compreende o cultivo .10 de uma célula de mamífero que abriga: ym. ácido nucleíeo que codifica uma pruLuna AIIWfl 8 ^;3 em um. meio de cultura compreendendo pelo menos ou cerca de 7 mg/L de mcotmamidâ (vitamina B3), em que o pH do cultivo é mantida a ou. sobre entre 6,9 e 7'3« Em uma modalidade, o método compreende o cultivo de uma célula de mamífero que abriga um ácido 15 imcleico que codifica uma proteína ADAMTSI3 em. um meio de cultura compreendendo de. ou. enfie carça de 2 mg/I, e 19 mg/L de nicotinamida (vitamina S3), em que o p.H do cultivo é mantido a ou entre cerca de 6,9 e 73- Em. ainda outras modalidades, o método comprcvadv o cultiva de uma echun de mumnero que abrnus um áeuto nueU-ra· <ue codifica tr.m proteína 20 ADAM IS 13 em um meio de cultura empreendendo pelo menos ou cerca de 2 mg ’ * ' mg I . 4 mg I , nw I . o mg k '' mg 1 .Hin-J A mg 1. fin mg l. 15 mg I , 20 mg 1 . ou cnnceíítuuòcs mare clesud.ís dc merairam-ída t> itumuuí K fi, em que o pl I do cubara c mantida u ou cutrc cerca de n.9 υ 13. Em umu modalidade, o cultivo é mantida s ou entre cerca de 35“C e 37^CC, Em uma 25 modalidade especílku. u cuitEo e duende j «m cco,; de fing | m uma modalidade, a temperatura, e/ou pH dó cultivo é mantido por pelo menos 7 dias. Em. uma modalidade, o método é realizado sob enudíçoe- dc eduna contínua-ou butekulu alimentada. Em uma modalidade ^pceífum í ccraiaxfe de cultura contínua é uma condição de cultura químiostátíca. Em outra modalidade especifica, a condição de cultura contínua é uma cõndíção de cultura de pertusap. Em uma modalidade, a célula que abriga o ácido nuclciec que codifica uma proteína ADAMTSI3 é uma célula de mamífero. Em modalidades particulares, a célula de mamífero é uma célula de hamster, 5 humuna. ou de nmrino. bm uma modalidade ropemlka. a célula c ama linhagem de células CHO, uma linhagem de células HbK 293. ou uma nnhagem de eclukm BHK. bm uma ouuu modalidade, a cduía dc mamífero é culto ada em um mem de euhura isento de polipepLídeo e/ou proteína animal. Em ainda outra modalidade, a célula de mamífero é cultivada em um meio de 10 cultura sintético que pode ou não estar isento de pofipeptídeos e proteínas animais. F.m uma modalidade, o meio de cultura compreende ainda uma noiiamina de ou enuc cere.; de U.5 mg 1 e >0 mg L hn ouira modalidade, o meio de cuhuut compreende andi .mm po’. manta de ou emre ceiro dt 2. mg/L e 8 mg/L.. Em uma modalidade especifica, a poiiamma é a putresdna,

Em outra modalidade, um método para exptessar uma protemu desintegrina e metatoprofemase eom motivos trombospondina 13 I ADAM I S H) e tomecido. o nu tudo compreemiendo o eulrò.o de uma celm.i que abriga um ácido nucleico que codifica uma proteína. ADAMTS13 em um. meio de culture compreendendo peto menos ou cerca de 2 mg/I... de 2Ô mt\v i nmnida (vitamina B3) e pelo menos ou cerca de 2 pM de zinco. Em uma modd'dade relacionada, o meio de cultura compreenda pelo menos ou cerca de 2 mg/L de nicotinamida (vhamína B3} e pelo menos ou cerca de 5 pM de zmeo. Em outra modalidade relacionada, o meio de cultara compreende pelo menos ou cerca de 2 mg/L de níeotmamida (vitamina. B3) e pelo menos dé ou 25 entre cerea de 2 μΜ de zinco e 12 μΑΙ de zinco. Em ainda oüita modalidade relacionada, o meio de cultura, compreende pelo menos ou cerca de 2 mg/L de nicotinamida (vitamina B3) e pelo menos de ou entro cerca de 5 μΜ de zinco e 12 μΜ de zinco, km curtas nu'dahJ. Je-, o rneio de cultura compreende pelo menus ou cen'.t dc 2 mg I de mcnUnamida p. humin.i Rt) u pelo menos ou cerca de .2 μ Μ, ou pelo menos ou cerca de 3 μΜ, 4 μΜ, 5 μΜ, 6 μΜ, 7 μΜ, 8 μΜ, 9 μΜ, 10 μ Μ.. 11 μ Μ, 12 μΜ, 13 μ Μ,. 14 μΜ, 15 μΜ, 20 μΜ, 25 μΜ, 30 μΜ, ou. mais zinco. Em uma: modalidade, o cultivo é mantido a ou entre cerca de 35^<SC e 37*C. Em- uma modalidade especifica, o cultivo é mantido a ou cerca de 36*0. Em. unia modalidade. a temperatura ciou p.H do cultivo é mantido por peto menos 7 dias. Em uma modalidade, o método é realizado sob coitoíçoes de cultura, contínua ou batelada alimentada. Em uma modãhdade específica, a condição de cultura, contínua é uma: condição de cultura qramMumca l ra outra modalidade u.-mceMea. a condição de eahura enntr'.ua. é uma. condição de cultura de purfeao.. Em. uma modalidade, a k\ lub que abriga o ácido nueleico que codifica uma proteína ADAMTS13 é uma célula de mamífero. Em modalidades particulares, a célula de mamífero é uma célula de hamster, humana, ou de muríno. Em uma. modalidade especifica, a célula é uma. linhagem de células CHO, uma. linhagem de células F1EK 293, ou uma linhagem de células BHK. Em outra modalidade, a célula de manriern e cuhuada em um meio de u.Hura Demo dv pohpcpudco eo>; proteína, animal. Em arada outra modalidade, .a célula de mamífero é culti vada em um mero de cultura sintético que pode ou rfeo estar isento de pnfipeptídeos e proteínas animais. Em uma modalidade, ó meio de cultura compreende ainda uma puhamiua de ou entre eerca de 0,5 e 3Õ m,g/L. Em. outra modaUUade, o meio de cultura compreende ainda uma pcdiamma de ou em.ru cerca de 2 mg 1 e 8 mg/L. Em uma modalidade específica., a políam-na é a putresdna.

Em outra modalidade, um .método pua expressar uma proteína desintegrina e meialoproteinase com moux^ UOmlwpondma 13 (ADAMTS13) é femectd.^ o método compreendendo o cultivo de uma célula que abnga um ,a.râb nuekúco que euddus s.-ma prntema ADAM I S l ⁱ cm um meto de cultura compreendendo pelo menos ou cerca dc 7 mg l de nvamarncb ixham *ηι HD e prac 'nuu^ m. reus de 2 l.M de zmeo Fm modalidade relacionada, o meio de cultura compreende pelo menos do cerca Jc ~ mg'í de uknOuamkt; (utenin.i B'i e pelo menos uu ceica de ^s u\f da zinco,. Em outra modte Idade rehdonada, o meio de cultura compreende pelo menos ou cerca. de 7 mg/L de nicotinamí da (vitamina: B3) e pele menos de ou 5 entre cerca de 2 μΜ. de zinco è 12 μΜ do zmco. Em ainda, outra modalidade relacionada, 0 meio da cultura compreende pelo menos ou cerca de 7 mg/L de nícutínamida (vitamina B3j e pelo menos de ou entre cerca de 5 μΜ de zinco e 12 μΜ. de zinco. Em certas modalidades, o meio de cultura compreende pelo mero cerca dc ' ^Tg 1 ue Huourjmvj rcramma HU e nela nono. << W cerca de 2 μΜ, ou pelo menos ou cerca de 3 μΜ, 4 μΜ, § μΜ, 6 μΜ, 7 μΜ, 8 μΜ, 9 μΜ, 10 μΜ, 11 μΜ. 12 μΜ. 13 μΜ, 14 μΜ, 15 μΜ, 20 μΜ. 25 μΜ, 30 μΜ, ou mais zinco. Em uma modalidade, d cultivo é mantido a ou entre cerca de 35'C e 3 »'Q Em uma modalidade especoica. o cultivo e mamido a. ou cerca de 3õ^vC<. Em uma modalidade, a temperatura e/ou pH do cultivo é 15 mantido por pelo menos 7 dias. Em uma modalidade, o metodu é realizado sob condições de cultura continua ou batelada ahnvmada. Em uma modalidade especifica, a condição de cultura contínua é uma condíçào de cultura quimiostática. Em outra modalidade especifica, a condiçuo de cultura continua é uma condição de cultura de perfusao. Em. uma modalidade, a 20 célula que abriga o ácido nuelerco que codihca mna proteína ADAMI'S 13 è uma célula demanuàuo. Fm modal idades parúc alares, a célula de mamífero é uma célula, de hamster, humana, ou dc murino. Em uma. modalidade especulem a et lula c u-na linhagem de células C.HO. uma linhagem de células lit K ?9.p ,_s.„, _vUfía ifelugem de celubs BHK Fm num ouíra mudakdade, a 2c célula dc uuemlero e culto ada em um tueio de cultura -renío de 'oolírertídeo e/uu proiema animal. Em ainda, outra modalidade, a célula de mamífero é cultivada em um meio de cultura síntéúco que pude ou não estar isento de polipeptídeos e proteínas animais. Em uma modalidade, o me>o de cultura xOnmreeteC a d. u ^tia ήΊη m de o or e rerca de 0 ' um l e Μ η l ) m outra moJahdadv. o meio de miluirj cvmpwnje ainda uma polianuna de óu entre cerca de '2 mg/L e 8 mg/L. Em uma modalidade espedfiea, a pel· nnma * >. putescma.

Em outra modalidade, um método para expressar uma proteína desintegrina e metaloproteinase eom metises temtespondinn 13 (ADAMTS13) é fornecido, o método compreendendo o cultivo de uma célula que abriga um ácido nudeieo que codifica uma proteína .ADAMTM3 em um meio de cultura compreendendo pelo menos de ou entre cerca de 2 mg/L e 10 mg/L de nioutmarruda (Mtamma 83). e pelo menos ou cereà de 2 μΜ de zinco. Em. uma modalidade relacionada, o meio de cultura compreende pelo menos de ou entre cerna de 2 mg/L e 1.0 mg/L- de nicotinamide (vitamina 83) e pelo menos ou cerca dc 5uM de cinco, bm nma oulni modalidade relacionada. o meio de cultura comp.reendé pelo menos de ou entre cerca de 2 mg/L e 10 mg/L de nicotinumida (vitamina B3) e pelo menos de ou ente eerea de 2 μΜ de zinco e 1.2 μΜ de zinco. Em ainda outra modalidade relacionada, o meio de cultura compreende pelo menos de ou ente eerea de 2 mg/L e 10 mg/L de 'uemmmn'da t\ njinms B' i c pelo n e* os dc ou c?üc a de uM dc < \\> e 12 μΜ de zinco. Em certas modalidades, o meio.de cultura compreende pelo menus de ou entre cerca de 2 mg/L e 10 mg/L de nicoíinamida (vitamina 83) e pelo menos ou cerca de 2 μΜ, ou pelo metes ou cerca de 3 μΜ, 4 μΜ, 5. μΜ, 6 ρΜ, 7 μΜ* 8 μΜ* 9 μΜ, 10 μΜ. 11 μ Μ 12 μΜ* 13: μΜ, 14 μ Μ, 15 μΜ, .10 μΜ, 35 μΜ. 3d μΜ. ou mate dc /meo. bm uma m^daridade, o cultixo c mantido a ou entre cerca de 35% e 37'A.l Em uma modalidade especifica* o cultívo é mantido a ou cerca de 36^C. Em. uma modalidade* a temperatara e ou pH do cultivo e manado '\v p<..u mm os * dic\ ¹ m uma modahJade. o método é realizado Moh ecmdiçôcs de cultura conunua ou batei ada alimentada, Em uma modalidade específica* a condição de cultura continua é uma condição de cultura químiostátlça. Em outra modalidade especifica, a condição de cultura continua é uma condição de cultura de perlusâo. Em uma modalidade, a ..célula. que abriga o ácido nuçleicó. que codifica uma proteína ADAMTS13 é uma célula de mamífero. Em modalidades particulares, a < chua ek m ímdbro e >;nu reluta de finuleí, human u ou de ηιιιπ u* í cs mtt» modalidade e^peafica, a célula é uma linhagem de çélulas ÒK), uma a linhagem ne eeiuh, Ih-K. ..M3, ou uma Lnhagvm da células BEIK, Bm uma oulra nuxididade. a célula de mamífero é cultivada em um melo de cultura isento de polipeptídco e/ou proteína ammal. Em .ainda, outra modalidade:, a célula de mamífero é cultivada em um melo de cultura sintético que pode ou nio estar isento de polípeptídeos e proteínas animais. Em uma modalidade, o 10 meio de cultura compreende ainda uma poliamina de ou entre, cerca de 0,S mg/E e 30 mg/L, Em outra modalidade, o melo de cultura compreende ainda uma. poliamina de ou entre cerca de 2 mg/L e 8 mg/L, Em uma modalidade especifica, a poliamina é a putrescma.

Em uma. outra modalidade, um método para expressar uma 15 proteína desinteerma e sneíaloprotuínuse com motivos trombuspoudína 13 ΙΛΠΛΜ 1 SI ^?ta Lmicctau, o rteutao tetoqacendendo o cultrvo de uuni cvluhi quo abnga um mfeo nucleate que cmh fea uma ptmema .ADAMIS'.' ,m um meio de cultura compteendeudo pelo menos ou cerca de 2 mgd.·, 3 mg/L, 4 me l , 5 mg 1 , o mg l . mu l * S mg l m \ 1 1 o | a 15 mg/L, 20 mg/L, 20 ou superfor <eneenlmçòe-> de nkonnarmda (vitamina B31 e pelo menos ou eetua dc 2 pM zinco, l.-.m uma modalidade ruhteioitada, o meio de cultura compreende pelo menus ou cerca de 2 mg.L, 3 mg/fe 4 mg L, 5 mg/L, 6 mg/l , 7 mg/L, 8 mg/L, 9 mg/L * 10 mg--L, 15 mg L, 20 mg/L ou eoncenfeações mais elevadas de mcotmamida (vitamina B3) e pelo menos ou 25 cerca de 5 u.M de /meo. Em uma oun a modabdade relacionada* o .meio da cultum compreende de ou c<iea de .2 mg 1 . ' mg 1 , 4 me. I . 5 mg l . n mg L. ^; üç 1 . x η n l ) m l . 0 u,l to me 1 , o }n> í <si e^exenOd^/ms m^ \ elevadas de nicotmanu da (s hamma B3) e pelo menos de ou entre cerca de 2 uM de teteo e 12 uta de zocu I '< amda ouua mvdahdade mhxnonada, 0 mew .de cultura compreeude·· de ou cerca de 2 mg/L, 3 mg/L, 4 mg/L, 5 mg/L, O r_sg l . ^v mg l . S mg l .m/J . 10 rag I . I ,uc l , Ό .amentia., O, mg 1 , ou Mipenores de i cotmamn^ (vitamina B3) e pelo menus de ou entre cerca de 5 μΜ de zinco e 12 μΜ .de zinco. Em certas modalidades, o meio de 5 cultura compreende de ou cerca de 2 mg/L, 3 mg/L, 4 mg/L, 5 mg/L, fi mg/L, ~ mg I , b mg I , 9 mg i .10 ηκ l . 1 > mg i , 2U rag, l , ou eunucnu.vècs mais elevadas de níeotínamida (vitamina B3) e pelo menos ou cerca de 2 p.M, ou pelo memv' »>u cmu de μΜ, l ιΔΙ. pM. u u\l pM. 8 .AL '^f μΜ. 10 μΜ, 11 pM 12 μΜ. 13 μΜ. 14 μΜ, 15 μΜ, 20 μΜ. 25 μΜ, 30 μΜ, ou mais 10 de zinco. Em uma modalidade, o cultivo ê mantido a ou entre cerca, de 35^:0C e

37®C. l-m uma modalidade especifica, o cultivo é mantido a ou cerca de 36^C. Em uma modalidade, a temperatura e/ou pH do éultivo é mantido pôr pulo tuutuv Js.u. Lm um . 'nodalid ick, o mutedo e tuahzadu s<te cvaéàçòes de cultura continua ou batelada. alimentada. Em uma modalidade específica, a 15 uondiçào de cultura contmua u uiua cnudsçào de cultura quimiosiaUva. Era outra modalidade especifica, a eçndiçúo de cultura continua é uma condição de cultura de perfosãu. Em. uma modalidade, a célula que abriga, o ácido accknea que codifica um« pom-m?. \DXM1S13 e usna célula de murauéuz í m modalidades part-culareg a celu.a de mauíiàm> u urns eelulu de hamster, 20 uían.uu. ou de murmo Lm ama uíraLdidrde especifica, t eelma c uma hnhuura de ,u!hLj> CHtp uma 'è.hmera c.<. eehila^ III k ?9p ou Jiiu linhagem de células BHK. Em outra modalidade, a célula. d.e mamífero é cultivada em um meio de cultura isento de pohpvpndea e ou proteína animal, bm ainda e-utra modalidade, i ceada d< mamncju u culíkada um »ra meu> de 25 cultu m suuei leu q <e pralv ou Mus uU.r. huiiIo de pulípeptuicos e proieiuau enmv fira meu modalidade. meto de cultura eorqvvvndu amda uma pohamina de ou entre cerca de 0,5 mg/L e 30 mg/L. Em outra modalidade, o íneiu du e Jlura compreende .mula amt poliamma de entra uerac- de 2 mg I e b mg I , Era uma medalidadv uspuedica. u poliumimt e apulruseina.

Em uma outra modalidade ttm método para expressar uma proteína desmtcgrína e metaloprotemase com motivos irombmptmdina. 13 (Ai XAM í S l De fornecí Ji% o método compreendendo o cultivo de uma célula que abriga um ácido nucleíco que codifca uma proteína ADAMTS 1.3 em tim 5 meio de cultura compreendendo pelo menos pu cerca de 2 mg/L de nlcotmamida (vitamina B? i c pelo means ou cerca de 0,5 m'M. de cálcio.. Em. uma modalidade relacionada, o meio de cultura compreende pelo menos ou cxnca Jc 3 mg 1 de meoínmnudn n h nu ca BD e pe'a menva ou <cn a de mM de cáleío. Em outra modalidade relacionada, o meio de cultura 10 compreende pelo menos ou cerna de 2 mg/L de meotmamtda (vitamina B3) a pelo menos de ou entre cerca de G,5 mM. e 1,5 mM do eâlcfo. Em certas n od-daiudes. a men; de cJuea e»mvm vende nc.u menos e; ^cra de p i de nícotinamida (vitamina B >) e pelo menos eu cerca de 0,5 mM, ou pelo menos ou cerca de 0,0 mM, 0 _? 7 mM , 0,8 mM, 0,9 mM, 1,0 mM 1,1 mM, 1,2 15 mM 1,3 mM, 1.4 mM', M mM I .<> mM, 1,7 mM, 1,8 mM. 1,9 mM, 2,0 mM

2,25 mM. 2,5 mM, 2,75 mM 3.0 mM 3.5 mM, 4.0 mM. 4,5 m.M. 5,0 mM ou mau de calem. Fm uma mvd.díd.Me. o <rohr.<> e mantido ,í ou entre ecrca de M^V'C c ..M( . Em uma modalidade espeenlea. o cuhivo é mantido a ou cerca de '(»'(.. Em. uma modalidade, a temperatura e/ou p.H do cultivo é mantido 20 por pelo menos. 7 dias. Em uma modalidade, o método é realizado sob condiçôe-' de culturc c»»ntuma ou hatelaJc alhreniada, I ve. ama modhhdadc e-giCc-lx-u. a condição dc cultura contínua é uma condição de cultura qv-nmortut’ea I m a.,tia modalidade e->pemfea. a ^oudíçào de unhara continua é uma condição de cultura de perfusM Em uma modalidade, a 25 célula que uboga o acico iudeuo quv codoVa uiiu prote'na AD ΧΜΊ Sl ? é uma célula de mamderu. Lm moJahdades parn.culares, a célula de mamhéra é uma célula de hamster, humana, ou de muri.no. Em uma modalidade cqkxafka, a cvlula e uma imha.gem tie <\-hiM Cl K). uma línhiecm dc cehuas BLK 29D ou uma hnhagem. de células BHK, Em outra modalidade:, a célula.

3 de mamífero é cultivada em um. meio de cultura isento de: polipeptídeo e/ou proteína animal. Em ainda outra modalidade, a célula de mamífero é cultivada çm um meio de cultura sintéiíço que pode ou não estar isento de puíipeptídeos e proteínas animais. Em uma modalidade, o meio de cultura compreende 5 ainda uma poliamina de ou entre cerca de 0,5 mg/L c 30 mg/L, Em outra modalidade, o meio de cultura compreende ainda uma: puliamma de ou entre cerca de 2. mg/L e 8 mg/L, Em um modalidade específica, a pol íarnma é a putresema.

Em outra modalidade, um método para expressar uma proteína 10 desímegrma e .méteuronuemase com metis os trombospondma 13 (ADAMTS. 13) e fixrneuido, o método compreendendo o cultivo de uma célula que abriga um ácido nudei.ua que codifica uma proleuu ADAMTS13 em um meio de cultura, compreendendo pelo meno*> ou cerca de 7 mg/L de mcotinamída (vitamina B3) e pelo menos ou cerca, de 0,5 mM de caldo. Em l à uma modalidade relacionada, o meio de cultura compreende pelo menos ou kcrcj de 7 med de mcorctamida (xitumina HM e pelo meims w cerca de L? m.M de cálcio. Em outra mudãlidade relacionada, o meio de cultura compreende pelo menos ou cerca de 7 mg/L de nicolinamida (vitamina BM e pelo menos de ou entre cerca, de 0,5 mM e 1,5 mM de cálcio. Em eetus 20 modalidades, o meio de cultura compreende pelo menoá ou cerca de 7 mg/L de nicot inamida (vitamina B3) e pelo menos ou: cerca de 0,5 mM, ou pelo menos ou cerca de 0,6 mM, 0,7 mM» Ofe mM, 0,9 mM', 1,0 mM, 1J mM, 1,2 mM, 1,3 mM, 1,4 mM, 1,5 mM, 1,6 mM, 1,7 mM, 1,8 mM, 1,9 mM, 2,0 mM,

2,25 mM, 2,5 mM, 2,75 mM, 3,0 mM, 3,5 mM, 4,0 mM, 4,5 mM, 5,0 mM, ou 25 mais de eàlcio. Em uma modalidade, o cultivo é mantido a ou entre cerca, de t x ^x ( I ^rt niOdabíUuc/'pCkTei o<id⁺’\\ , 'x.hudo a raro de 36%;. Em uma. modalidade, a temperatura e/ou pH do cultivo é mantido por pelo menos 7 dias. Em uma modalidade, o método è realizado sob condições de dultura contínua ou. batelada alimentada. Em uma modalidade específica, a condição de cultum contínua é uma condição de cultura quimiostática.. Em outra modalidade específica, ã. condição de cultura continua é uma condição de cultura de perfuMo. Lm uma modalidade, a célula que abriga o ácido nueleico que codifica uma proteína .ADAMTS13 é 5 uma célula de mamífera Em modalidades particulares, a célula de mamífero é uma célula de hamster, humana, ou de murino. Em. uma modalidade específica, a célula é uma linhagem de células CHO, uma linhagem de células HEK 293, ou uma linhagem de células Bfflfe Em. outra modalidade, a çélula de mamífero è cultivada em. um meio, de cultura isento de polipeptídeo e/ou 10 proteína animal. Em ainda outra modalidade, a célula de mamífero é culti vada em um meio de cultura sintético que pude ou nau estar isento de polípeptídeos e proteínas àniumís. Em uma modalidade, o ateio de cultura compreende mnda uma políamina de ou entre cerca de 0,5 mg/L e 30 mg/L. Em. outra modalidade, o meio de cultura compreende aluda uma puliamína de ou entre 15 cerca da 2 mg/L e 8 mg/L. Em uma modalidade especifica, a políamma é a puteesd.ua.

Em outra .modalidade, um. método para expressar uma proteína desmtegrina e metaloproteinasc com motivos trombospondina 13 eVUMlMlh' toraeeasu e r erode compreendendo o eu¹ five de uma colida 20 que abrige um ac ido nueleico que codifica urna proteína ADAMTS13 eur u.m melo dc* cultura compreendendo pelo menos de ou entre cerca de 2 mg/L e 10 mg/L de nieotmamída (vitamina B31 e pelo menus ou cerca de 0,5 mM de cálcio. Lm uma modalidade relacionada. ο meio de cultura compreende pdo menos de ou come rorro de 2 mgL e 10 mg L de nkotbumida ivhamina 83) 25 e pelo menos ou cerca de 1,5 mM de caldo. Em outra modalidade .tooku„J„, o eu? oe cJura ve pra\n<\ uelo mono' m cube <ena de 2 mg/L e 1.0 mg/L de nicctmamida (vitamina B3) e pelo menos ou entre cerca de 0,5 mM e 1,5 mM de eáteío. Em cenas modalidades, o meio de cultura, oompreende pelo menos ou entre cerca de 2 mg/L e 10 :mg/L de nicotmamida (vitamina B3) e pelo cerca de 0,5 mM, ou pelo menos ou cerca de

Ô,6 Λ, 0,7 mM, 0,8 m.M, 0,9 mM, 1,0 mM, 1,1 mM, 1,2 mM, 1,3 mM, 1,4 mM, L5 mM, 1.6 mM. 1,7 mM, 1,8 mM, 1.9 mM, 2,0 mM, 2,25 m.M, 2.5 mM, 2,75 mM, 3,0 mM, 3,5 m'M, 4,0 mM, 4,5 mM, 5,0 mM, ομ mais de

c.ikío bm uma moe.alidadc. o cuhno e mmrndo a ou entre eeu.i <k* 55V e fifi. Em uma modalidade cspemfiea. o eulüvo é mantido a ou cerca de 36®C. Em uma modalidade, a temperatura e/ou pH do cultivo é mantido por pelo menus 7 dias. Em uma modalidade, o método é realizado sob condições de cultura contínua ou batelada alimentada., Em uma modalidade específica, a 10 rewúào de cuhura eonunua é unu condição dc cultura qu mronmmu Em outra modalidade específica, a. condição de cnltara contínua, é uma condição de cuhura de perfusão. Em uma modalidade, a célula que abriga o ácido nudeíco que codifica uma proteína ADA.MTS13 é uma refina de mamífero. Em modalidades particulares, a. célula de mamífero é uma célula de hamster, 15 humana, ou de morino·. Em uma modalidade específica, a edula c uma linhagem de células CHO, uma linhagem de células HEK 293. ou uma linhagem de células BHK. Em outra modalidade, a célula de mamífero é cultivada em u® meia de cultura isento de polipcpudeo e/ou proteína animal. Em ainda nutra modalidade, a célula de mamífero é cultivada. em um meio de 20 cultura sintético que pede çm não estar isento de pofipeptídeos e proteínas animais. Em uma modalidade, o meio de cultura compreende ainda uma poliamína tie ou entre cerca de 0,5 mg/L e 3 0 mg/L. Em outra modalidade, o meio de cultura compreende ainda mna políamma de ou entre cerca de 2 mg/I.. e 8 mg/L. Em. uma. modalidade específica, a poliamma é a. putrescína.

Em outra, modalidade, um método para expressar uma prates r_sa desintegrína e metal oproteínase com. motivos trttmbosprmdina. 13 lo'wfi,· o POt.aa» cvp ee slemaj v ca us»» de .ana ec «Ία que abriga um. ácido nuefeico que codifica, uma portema. ÀDAMTS13 em um Híeio de cuhura compreendendo pelo menos ou eerea de 2 mg I . 3 mg l . 4 /0 _tg I . 5 uu. 1 . u p'.g I . njg ’ . s me I . ^u mg ’ . 10 mg I . I mg L. 20 rag I , ou concentrações ma is elevadas de nieotiaamida (vitamina B3) e pelo menos on cerca. de 9,5: mM de? cálcio. Em uma modalidade relacionada, o meio de cultura compreende pelo menos on cerca. de2 mg/L, 3 m:g/L, 4 mg/L, 5 mg/L,

6 mgl.:, 7 mg/L.. 8 mg/L. 9 mg/L, 10 mg/L, 15 mg/L, 2:0 mg/L, ou ccmçentrações mais elevadas de nieotmamida. (vitamina B3) e pelo menos uu cores de 15 mM de refcíu Fm uma outra modulando redaciouada. o rauio de cultura compreende de ou cerca de 2. mg/L, 3 mg/L, 4 mg/L, 5 mg/L, 6 mu/L, 7' mg/L, 8_: mg/L, 9 mg/L, 10 mg/L, 15 mg/L, 20 mg/L ou eoneentraçoes mais 1.0 elevadas de mcutínamida (vitamina B3) e pelo menos ou entre cerca de 0,5 mM e feS mM de cálcio. Em cenas modalidades, o mala de cultura compreende de ou cerca de 2 ud .3 mg/L,. 4 mg/L, 5 mg/L, 6 mg/L, 7 mg/L, 8 mg/L, 9.mg/L, 10 mg/L, 15 are 1 , 20 mg/L, ou eoneenkações mais elevadas de nicotinamida (vitamina B3) e pelo menos ou cerca de 0,5 mM, ou pelo 15 menos ou cerca de 0,6 rnM, 0,7 mM, 0,8 mM, 0,9 mM, 1,0 mM, 1,1 mM, 12 mM, 1,3 mM, 14 mM, 1,5 mM, 1,6 mM, 17 mM, 18 mM, 1,9 mM, 2,0 mM, '2,25 mM, 2,5 mM 175 mM, 3,0 mM, 3,5 mM, 4,0 mM\ 4A ttAL M) ntM. uu. mais de cálcio, rm uma modalidade, o uultixu è mantido a eu unhe cerca de M 3 u L' 7 . Lm uras .modalidade e^peeuiea. e „ ulto.o u manudu a eu cerca 20 de >o\ . Lm uma muddíJade, a tenavratura e uu pH do cuhreo o mantido por pelo menos 7 dias. Em uma modalidade, o método e realizado sob condones de cultura contínua ou batelada alimentada. Em uma modalidade cxpvetficx a condição de cultura continua e uma condição de cultura químiostátíea. Em outra modalidade específica, a comilão de cultura 25 centinua ê uma eumhçãu de cultura de períusãu. Em uma modalidade, a célula q ue abri ga o àe idu nucleico que cedí fica uma proteína ADAMTS13 é uma célula, de mamífero. Em modalidades puniktdme^ a célula de mamífero é uma célula de hamster, humana, ou dé rsurfeo. Em uma modalidade especifica, a célula: é uma. linhagem de células CHO, uma linhagem de células

HEK. 293, ou m linhagem de células BHK. Em uma nutra, modal Made, a. célula de mamífero é cultivada em um meio de cultura isento de polípeptideo e/ou proteína, animal.. Em ainda outra modalidade, a célula de mamífero é cultivada em um. meio de cultum sintético que pode ou não estar isento de 5 podpcpudco*'' v nh'ts'.t.n ,mira?to ém uma modalidade, o meio de cultura compreende tenda uma pohmnina Je ou emrv ecren de 0.5 me l e >0 mg I . Em outra modalidade, o meto de cultura compreende ainda uma poliamina de ou entre cerca de 2. mg/L e 8 mg/L. Em uma modalidade éspeulh.t, a poliamina e a pui resuma,

Fm uma modalidade, um método para expressar uma proteína de^miegniu e mctalopivteiuasv com motivos trcmbospondma ( \b \MISl.L» c fornecido. o meiudo contptcenmtufo o cuhiso de uma célula >|ue abriga um ácido uucleieo que codifica uma proteína ADAMTS 13 em um meio de cultura compreendendo cálcio, zinco c nicotinamide (vitamina B3).

Em certa$ modalidades, o zinco está presente rio meio de cuitura a uma. OHkvna.iun de pmo ηκηοχ ou ceu.. uc ^s uM. > μΜ. uute 2 nM e 1.’ μΜ, entre 5 μΜ e 12 μΜ:, ou peto menos 3 μΜ, 4 μΜ, 5 uM, 6 μΜ, 7 μΜ, 8 μΜ, 9 μΜ:, 10 μΜ, 11 μΜ, 12 μΜ, 13 μΜ, 14. μΜ, 15 μΜ* 20 μ Μ , 25 μΜ, 30 μΜ., ou mais. Em certas modalidades, o cálcio está presente no meio de 20 cultura a urna concentração de pelo menos ou cerca de 0,5 tnMi, 4,5 m.M, entre 0,5 e 1,5, ou pelo menos 0,0 mM, 0,7 mM, 0,8 :mM, 0,9 mM, 1,0 niM, 1,1. mH. 1,2 mM, 13 m.M, 1,4 mM. 1,5 mM, 1,6 mM, 1,7 mM', 1,3 níM, 1,9 mM, 2,0 mM. 2,25 mM. 2,5 mM, 2,75 mM, 3,0 mM, 3,5 mM, 4,0 mM, 4,5 mM, 5,0 mM. ou mais. Em evrias modalidades, ntcolmamida (vitamina B3) está 25 presente no meto de cultura a txm.a com er.traçjo de pelo ou ercu de 2 me l . ⁷ u«g 1 . entee 2 ;n>. I < dv 7 rag l . ou. pelo memo a <m cerca de 3 mg/L, 4 mg/L, 5 mg/L, 6 mg/L, 7 mg/E, 8 mg/L, 0 mg/L, 10 mg/L, T5 mg/L, 20 mg/I,, on mais.

Tal. como expressamente divulgadas huxl·? documento, e fornecidas como Var, 14 a Van 93 (Tabela .3 a Tabela 6), qualquer combinação de couevniracxW dos três eomprmentes (isto é, o zinco, cálcio, e oiçoiloamida (Vitamina. B3)) é contemplada paro uso nos métodos da mxciiçao. Em cmn moU.md.ícc, o cnhise c mantido u eram ccica de M^sC e 37'C Em uma modalidade espeeitíem o cultivo é mauridn a nu cerca de 3(ç(.\ Em uma modalidade, a temperatura efou pli do cultivo é mantido por pelo monos 7 dias. Em uma modalidade, o método é realizado sob condições de cultura contínua ou batelada. alimentada. Em uma. modalidade específica, a.

uwlkào de culmra contínua u raro couàçào de cuHura quimiostmica Em outra modalidade especifica, a condição de cultura, continua é uma condição de cuhura- de perfesâtx Em uma modalidade, a célula que abriga o ácido nuelvico que codifica uma proteína \DAMFS1 é uma célula de mamífero. Em modalidades particulares, a célula de mamífero é uma célula, de hamster, humana, ou de nmri.no... Em uma modalidade específica, a célula é uma linhagem de células CEIO, uma linhagem de células .HEK 293, ou uma linhagem de células BHK, Em uma outra, modalidade, a célula de mamífero é cmró ada cr um nu ro dc etikura isento de pAipepudeo c m: pum >na _vmm,d Em ainda outra modalidade, a célula de mamífero é culth ade em um meio de cultura sintético que pode ou não estar isento de polipcptídeos e proteínas animais. Em uma modalidade, o meio de cultura compreende ainda uma poliamina de ou entre cerca de 93 mg/L e 30 mg/L, Em outra modal idade, o meio de cultura compreende ainda uma pídiamínu de au entre cerca de 2 mg/L e 8 mg/L. Em uma modalidade usped&a, a políamma é a putreseina.

Tabela X Modalidades exemplarás de mèíos de cultura que contêm pelo menus ? mg I. de mco’.mamma prò.mròm BA, que úteis para ;s expmssào de uma proiema Al lAM í S I L

Frio	Pdu	hmrn 0.5
manas	mems	mM e 1,5
0,5 mM	1 x m\1	mM de
de cálcio	de c.tk χ·>	cálcio

Γ. k> f'>e'i'V '' o n\l, 0 cAL i 0,8 mM, 0,9 mM, 1,0 mM, ( IJ rnM. L2 soM. L? nhl > i 1 in\1. L? n\L _fu\l.

	i		Var .16	i L7 mM 1.8 mM. L9 mM, 2UmM, 2Ύ'πΜ ' ' mM ' ' η V ' ' r\ ' ' ϊV I a ,ηΜ. 4 ς íuM. \o η M. : ou mais cákàu lVaM7 '
Cela num >s 2 μΜ de Zinco	Van 14	Var. 15
Pelo 5- μΜ de Zinco	Van IX	Vac B	Van 20	............................. Var. 21
1 otre .’. μΜ c 12 μΜ de Z.i we	Ver. 22	Van 23	Va.r. 24	V,tr. 25
1 stw 5 μΜ e 12 μΜ de Zinco	Va·. 26	Var	Var. 28	Var. 29
i Pelo menos 3 μΜ 4 : uM, 5 μΜ 6 μΜ. 7 : μΜ, 8 μΜ, 9 μΜ, 10 üM. H AL 12 u.M : B μΜ 14 μΜ. is μΜ 20 μΜ 25 μΜ, 20 μΜ, <?υ mais zinco	Var. 30	Von M ..............................	Var. 32	Var 3'
*Var. ·™ Variação Tabela 2». Modalidades exemplares de meies de cultura. conteúdo peto menos 7 mg/L de nicotinamida (vitamina B3), que são úteis para a expressão dte uma proteína ADAMTS 13.
	Pdn ?/’ mM de »aei>	Pelo menus 1.5 mM <fe cálcio	Entre 0.5 mM c 1.? nuM de cálcio	Pelo menos 0.6 mM, 0,7 m.Mf 0A mM, 0,9 rn.M 1,0 m.M, 1,1 mM, 1,2 rn.M, 1,3 mM, 1J m.M 1.5 mM. .ο ηϊ\ρ 1.7 m.M. 1 3 mM, mM. 7.0 mM 2.2.5 mM, 2.5 m.M. .\5 rnM. ?\U mM. 3.5 mXL A·,’ mM. M :nM. *'.u mM, i oumaiscákuo :
Pelo menos 2 μΜ dc Zínee	Var. 34	Van 35	Var. 36	Vm 57
Pelo menos 5 μΜ de Zuvo ;--------------------------------------	Ver. 38	Var. B	Var. 40	\· ar. 41
mree 2 AL· 1' ·ιΜ dc Zinco	Van 42	Mr. 43	Var. 44	Ver. 45
Entre 5 u.M ?.· 12 μΜ Ue / meu	Vau 46	Var. 47	Ver. 48 Va.r.52	Var. 49 1
PeM ιόμκ ' μΜ. 4 uM ' AL o >SM. 7 AIS μΜ e AL 'to uM. 11 kM. 12 μΜ. B μΜ. 14 μΜ. 15 μΜ M AL 2S μΜ. 30 μΜ. ou maís zinc··	Var. S0	Var. 51.	Ver. 53 1 ....................................................................... j

War. — Variação

Tabeb & Modalidades exemplaras de meios de cülturá contendo entre 2 e 7 out L nicotinamidà (vitamina B3)_s que são úteis para, a expressão de uma proteína ADAMTS 13.

Tabela Modalidades exemplares de meios de cultura contendo pelo menos 3 mg/L, 4 mg/L, 5 mg/L, 6 mg/L, 7 mg/L, 8 mg/L, 9 mg/L, .1:0 mg/1... 15 mg/L, 20 mg/L, ou mais aicotmamida (vitamina B3), que são úteis para a expressão de uma proteína .ADAMTS 13.

Pelo mefx'iy. 5 pXi de Zinco	Ver. 78	Var. 79	Var. 80	Var. 81
Eune 2 μΜ e 12 μΜ A* 7lr.<m	V ar. S2	Var. 83	Var. 84	Var. 85
l nue x i.M e aM / J'C\'	teu . 86	Var. 87	Vrir 88	Var. 89
l\’ :’.'v x \ * h\L 4 μ\Χ u (At, 7 μΜ, S uM.uM. to uM. 'ri uM, ri PXb H u.\l, 14 .At.’ ts 1 V 20 f Μ X | M ri μΜ c, i /’ílc	Var. 90	Vsr. 91	Var. 92	Var. 9a

* VM Variação

B, Veiares e Células Hospedeiras

As proteinas recombinantes ADAMTS' podem ser produzidas por expievmo em qualquer sistema hospedeiro procariotico ou eucari.àttc.o 5 adequado. Exemplos de células eucariótiças inchem, sem limitação, as células de mamíferos, tais como a< célula* CUO_S COS. HI.iK 293, BHK, SKIT P e IkpG?. vc’uLo ce mrelov pm exemplo, íretolm. Μ v _kCl> cr v\ células S2, e células High Five; e células de levedura, por exemplo, células dc âjaAromjw xm áuMJmu... λ. Fm urna modalidade, as proteínas.

WASH'S podem rer express em cchsku bc.cterumas, célula* de Medora, células de insetos, células de a\ex as células de mamíferos, e semelhantes. Por exemplo, em uma linhagem de cutelas humana, uma linhagem de células de hamster, ou uma linhagem de células de murinos. Fm uma modalidade pariículat, a linhagem de células é uma linhagem de célula* t H(h Bllk, eu 15 HEK I m umi umddaiade pretenda, a 1 in¹ agem de rx lulas < uma linhagem de células CHO.

Em uma. modalidade, as células podem ser qualquer célula de mamífera que podem ser cultivadas, preferencialmente, em um processo de fabricação (isto é, pelo menos l para produzir uma proteína ADAMTS 20 derejauu, tal comn \P\MISL\ Exemplos indtrem a ímhugem (’VI de rim de macaco transformada por SV40 iCOS-7, A ICC CRI. 1651 f, linhagem de um embnonáno I mmmo reeluW 3^J' ou mbdumuLre paru ercresmenlo em cultura em suspensão, Graham M <Z Gen FréM, 36:59 (1977)); células de rím de hamster filhote (BHK. ATÇC CCL 10); células de ovário de kit-Mer chinês: Z-DHFR, tais como o subçlone DUKX-BÍ l (CHQ, Griaub e Chasiu, ZCem AW AmZ &£ 054, 77:4216 (I9B0))t células de camumlongo 5 Senoli ( ΓΜ4, Mathcr, Zlfo/. Rc/W. 23:243-251 (19X00.. células de rim de marexo {C\ I Af(C ( Cl Mk cc'nlax de um de macaco \erde africanos Λ I RO~~tx AR ( t Kl-M87K echuuí» dc* carcmoinu humano eemcal UIFIA. ATCl CC1 2F. célula de rimcm uno (MDCK. ATCC CCl Mp células de figado de rato búfalo (BRL 3 A. ATCC CRI... 1.442); células 10 pulmonares humanas (WI38, A1CC CCl 75: ); células hepatieas hmrawsa diep G2. BB éOMc rasísos raamanu de re.mssndnago AIM * feqBnX A ICC 1, C. I.,cl K células 1RI (Mather et m., ..4m?o7.'< A. F, .4co<.Z <Scí,. 383:44-68 (1982)); células M.RC 5; células FS4: e linhagem de hepatoma humano (Hep (J2). Pfcferuncàulmenke. ü linhagem do células é uma linhagem de células de 15 roedores, especialmente uma linhagem de célula de namsk r. nis como CI K) ou BHK.

Uma: ampla variedade de vetores pode ser usada, para a mprevrao de uma pioasnu ADAM l S (no: exemplo. \U\MWCe pode .-rer selecionada a partir de vetares de. expressão euoarióticos e procariólluos. Em 20 u'lkj modalidades, um vetor de plasmídeo é contemplado paro uso na vs pressão de uma proteína ADAMIS (par exempla, ADAMIS 13). Em geral, os xtuacx pLxmutnoc comendo srepMicko de raphcou e de conlrole que são dc-rivudus de ospeexre compatíveis com a. célula hospedeira sau usados em conexão com estes hospedeiros:. 0 vetor pode transportar um sítio dc 2a replícação, bem como a marcação sequências que são capazes de fornecer stuxrê raspa??, em cchd.re uarefouuada., O pl.i\nude_t» enmpreecedvra uma sequência de nucleotídeos que codifica uma protema Á.DAMTS (por exemplo. ADAMIM.fo operarei ligada u ssma suais st?quèneía> de vcnU'oh\ por exemplo, uíu puvuuum

Um. método preferido de preparação de clones de células CHO cteocre q.x expo's- r” uma cw” „ \l > \M I S rexonvrâcrdo e uUn rereae Uma linhagem de células DIJO-BU de CH() deficiente em DHFR. é uuiMécl.íiij tom um \ctor ee expre-sào de ΠΗΓΕ para pcrmmr í expressou 5 da proteína reconlbinante relevante, essencial memo como descrito na Patente dos US número 5.250.421 (Kaufman era/.. Genetics Lrvaituíe, Inc.-). A seleção e realizada pelo crescimento, em meios isentos de hipoxantina/timidina. (HT) e amplificado da região relevante que codifica a expressão da proteína ADAMTS reeombmante e gene DHFK é conseguido através da propagação 10 das células em mnçentraçdes crescentes de metoirexato. Quando apropriado, as linhagens de células CHQ pedem ser adaptadas para o crescimento em meio isento de soro e/ou protemus. c-^cmmdmeme como descrito no US

6.100.061 Uiciterct al, immuno AMivngerelK hafik

Em cmtra. modalidade preferida, as células HEK.203 estáveis 15 são preparadas pela transfecçáo com um. cousInUo contendo um marcador ^Jeeiomnd de bigmmicmu e xeteçao de transtbnnantes por reAaènda aos amubraticcro .A capacidade de certos vírus para infectar as células ou a entrar nas células através de endocitose mediada por receptor e, para integrar 2.0 no genoma da célula hospedeira e genes virais expressos de forma estável e eficiente os toma candidatos atrativos para a transferencia de nucteícos esmmhas cm o.hihv-j qmr exemplo, edfeas de mamíferos) \sshm vm cenas raodalidcdvs. um \ctor xind e urado pura lnto>duzu uma sequência de nucteotíderis que codifica uma proteína ADAMTS (por exemplo, 25 ADAMl'S 13) em uma <dula hospedeira para a expressão. O xcinr Gral ira xomprcunoeí uma ^oucada Jc {usdetoíden¹' qu< rodífiea um.e prorem.s ΜΉΧ1Ι8 (por exemplo, ADAM TS 1.3) operável ligada a uma. ou mais MXgfeauas de controle, por exemplo, um promotor. Altematívamente, o vetor x irai pode rato contei' uma sequènda ce controle c cm xcz dí>\o* dependera de timà. sequência de controle dentro da célula hospedeira para dirigir a expressão da proteína ADAMI'S- Exemplos não limitaates de vetores de virus que podem ser usados para distribuir um ácido nucfeíco incluem vetores adenovirais, vetores de AAV, e vetores mtrovirais.

Lm iimámodalidade, um vetor de expressão Adenovirus inclui aqueles que pontem contratos de sequências de adenovirus sufieientes para suportar empacotamento do eonstrate e para finalmente expressar um construto de ADAM IS que tenha sido clonado nò mesmo. Vetores adenovirais permdem a introdução de sequências da estranhos até 7 kb 10 (Grunhaus et.ah, Seminar in Virology, 200(2):535-546, 1002) r

Em omn rm>d_)}jdudm um utus adenu asroraudo (Λ \\'l pode ser usado para, introduzir uma sequência de nucleoudeos que codifica uma proteína ADAMTS (por exemplo, ADAMTS 13) em uma célula hospedeira para a. expressão. Sistemas de AAV foram descritos anteriormente c são 15 geralmente bem conhecidos na técnica (Kelleher and Vos, BròretTnrqnes, 17(6):1110-7, 1994; Cotten et ul., /W Mid .dead N; ( b'd, 89(13):6094Oo2 (\n eu \a,^f />>>'>>> >t; ò ’ ⁴ <>q l^OL Murocda. í\>» hy< \lK'rnbk>/ bnmutioi.. 1:)8:97-129, 1992), Os detalhes com relação a geração e uso de vetores rAAV são descritos, por exemplo, nas Patentes OS 5,139,941 e 20 4,797,.368, cada uma incorporada. neste dnemnento por referência na sua totalidade para todos os fins,

Em uma modalidade, um vetor de expressão retroviral pode ser usado para mrruduzir uma sequência de audemídeos que codifica uma n vema VUWUS evi rvqdo \D\M,3 A. mu»' 'ouunkma para a expoosao bMc^ MMvmus foram dcmritos .mteriof mento e '-2o geralmame bem conhecidos na técnica (Mann te ai, 04/, 33:153-159, 1983; Mentes c Rubinsnnn, hi: Veters: A survey of umLmuhr v Ιοοϊη ' vetoes e their uses, Rodrtguez e Denhardt, ed.s,, Stoneham: Bunenxorth, pp, 494-513, 1988; Temin, In: Gene Transfer, Kuchefiapati (ed.). New York: Flenum Press, pp.

149-1 88, 1986). Em uma modalidade espe-urca, o vetor retroviral é um vetor lend viral (ver. por roemp/o, Naldirü mud.. AV/umv, 272.(5259):263-267, 19%; Zufferey dí n/., Mu .Bróróuèno/, 15(9):871--875, 1997; Blomur aí nZ, ,/ EK7, 71(9):6641-6649, .1997; Pat U.S. Nos. 6.913.516 e 5.994.136)

Exemplos não Iimitant.es: de vetores para a exprcssào procarioilea incluem plasnildeos tais como pRSET, PET, pBAD, etc., em que os promotores usadas em vetores de expressão procarioticos incluem lae, tre, trp, reeA, AraBAD, ete». Exemplos de vetores para a expressão eucariotica inuluem. : (1) para a. expressão em levedura, vetores làís como pAO, pPIC, 10 pYES, pMET, usando promotores, tais como AOX1, GAP, GALI, AUGL etc>, (ü) para a expressão em células de inseto, vetores tais como pMT, pAc5, pIB, pMlB, pBAC, eúrç usando promotores, tais como PH, plO, MT, AcS. OpIE2, gp64, poíh, dte«, e (üí) para a expressão em células de mamíferos, tais como vetores de pSVL, pÇMV, pRc/RSV, peDNA3, pBPV. etc., e vetores 15 derivados formam sistemas virais, tais como o vírus vaceifon, vírus adenoassociado, virus do herpes, retrovirus, ele., usando promotores, tais como CM V. SV4ÍL ΕΓ·· I, UbC RSV. A DV, BFV, e β-actma..

Em certas modalidades, os métodos de cuJróo de eèhdas da ímcnção puA'iv numpseende o iso de um rucmiran^portedm A presente 20 in\e:\ào fornece, entre outro aspeUu, os métodos de expressão da proteína ΑΠ \M l S em grande cs-a'a. I m u'gumas modfeidadus. o*- udtoos de ceadas das modalidades podem ser rcmizadas em biouv.aores grundux sob condições adequada^ pura fornecer eau>.-d>o .uvas de superfície de euhura c^pced'ca ' c -sue p.r. i aknx.a exj X p crema c kcrvMdes -eh. mes c'e-a<a25 Um ,cjo |\n luiucim m-re. >, ,υη< m\v ee - rounxmo c u uro de mkroa.mq on.aimro para csdtma de céhd.o uu braneatoie^ de ΐηηψη agsadu. Ejn outra modalidade, estes requisitos de ciescimcnto s:k> atendidos através do uso de um cultivo de células cm suspensão.

€. Métodos de Cultivo

Επί certas modalidades, as métodos da presente invenção, podem compreender n usu du am -à-tenu de cuhno Jc ^Julax operado ron um modo de operação contiituó ou em batelada, Por exemplo, quando os cultivos de células cm batelada são usados, eles podem ser operados sob 5 modo.de batelada. única, batelada. alimentada, ou ba?elmià repetida. Da mesma toimu. o- cu.mo'i ce eJuhs emUmuo. p« Jem <' ope <.do- -<»R pu* cwmpnx modo de perfusão, turbidostato, ou quimiostato. O cultivo uoutínuo de células ou em batelada pode ser realizado sob quaisquer condiçõe- de aderência ou suspensão, Quandò operado sob condições de suspensão, as células serão 10 livremente suspensas e misturadas dentro do meio de cultura,.

Alternativameate, sob condições de aderência, as células serão ligadas a uma fase solida, por exemplo, um mícrotrarspprtadoi. um microton jspormdor poro-o. trait spur amor de dmuo. car.ucho de <eramica fibra o„ a, íolh,.> pí.mm matri z de gel, e semelhantes.

Um cultivo em batelada é tipicamente um culm o de células em lares escala em que um inoculo u uJula e eubróado ale ume dun-ulade bu\_;·:? am uni Ianque uu fenmniaJoi. e cubado e ptocc-^de ,onp >.mu batelada única. Um cultivo em batelada alimentada é tipicamente um cultivo em batelada que ê fornecido tanto com nutrientes frescas (por exempla, 20 -uhsiratos hmíumte- de eiescuuuulu) eu aàhtios (par uxumplu, precumores de produtos). .A ^oluçâo de alimentação é cvmbnente altamente concentrada para m, it.ir s dihdçau do bioreuhir bm um cultixu em batelada repetida, as eehdas são colocadas em um meio de cultura e crescidas até uma densidade de eJu.es desejaecu Pam exíuir o imeio de uma fase de decbmia e morte kchdar. 2x5 o cultiva é então diluído com meio de cresemianta complete antes das células atingirem a sua. concentração máxima. A quantidade e a frequência da diluição variam amplamente e dependem das caructeristicas de crescimento da linhagem: de células e conveniência do pux^s^o culumi. O processo pode ser repetido quantas vezes forem necessárias e, a menos que as células e o meio sejam descartadas em subeultura, o volume de cultivo irá aumentar graduaímènle à medida: em que cada diluição é feita. O aumento de volume pode ser mánuseado tendo um reator de tamanho suficiente para permitir as diluições mo interior do vaso ou dividindo a cultura diluída, em vários vasos... A 5 ra/no desta tipo de cultura c manter as célnliss em um estado em crescimento de forma exponeneial. A, snbeuh.ura de serie é caracterizada pelo feto de o volume de cultiva ser sempre crescente gradualmente, pode haver colheitas múltiplas* as eêlulas .continuam a. crescer e 0 processo pode continuar por tanto quanto desejado,. Em certas modalidades, uma proteína ADAMTS (por 10 exemplo, ADAMTSI3) pode ser recuperada apus a colheita, do sobrenadante de um. cultivo em batelada.

I'm cuhi>o continuo pode ser uir cuitho em suqxnuio que é continuamente fornecido com nutrientes pelo influxo de meio fresco, em. que o volume de cultivo é geralmente mantido constante pela remoção lò concomitante de meio gasto, Nos métodos de quimiostuto c mrbúfomrax o meio extraído contém células. Assim, as células restantes no vaso dc cultivo de células devem crescer para manter um estado estacionário. No rnélodo de qmmtostato* a taxa, de ereschnemo < tipuameme controlada por control e da rasa ce ddwçtev isto e* a ta\u à qual e adiciraxido ran rnefe town. ,Λ taxa dv 20 crescimento das células na cultura pode >ci controlada* por exemplo, a uma taxa de crescimento submàxíma, por ahcra_s ào da taxa de diluição. Em cumrart*’. no meu via <k lurtodortuto. a taxa dc d.lmção c *áustmla pura permitir a taxa de crescimento máxima que as células podem alcançar em determinadas condições de funcionamento, como o pM e a temperatura,

Em um cultivo de perfosão, ó meio extra ido è empobrecido de cc'ulas, uie sào tenda ao \a->v de *.uht\o* po> *\*-mpux po? fihiaçào ou por métodos centrífugos que levam à reíntroduçãn das células na cultura. No entanto, as membranas tipicamente usadas paia de fihruçào nòo retêm 100% das células, e assim unia proporção é removida quando o meio é extraído.

Não pode ser crucial operar os cultivos de perfosao em taxas de crescimento muito elevadas, na medida em que a maioria das células é retida no vaso de c ultix o

i) sistema de reator de tanque agitado pode ser usado para 5 cultives de células· contínuos ou em bateiada operados em modos de suspensão ou aderentes. Géralmente, o sistema d.o reator de tanque: agitado pode ser operada coma qualquer reator de tanque agitado convencional com qualquer tipo de agitador, tal eumo um tipo Rushton, hidrofólio, de lâmina, aguda, ou marinho,

Os métodos. da invenção: podem compreender o uso de cultivo de células em batelada alimentada ou cultivo continuo: de células, tais coma o cultivo de células por perfusão ou quimiastáüeo, para, a expressão de uma proteína ADAMTS. I m certas modalidades, verificou-se que os meios de cultura de batelada alimentada suplemen.tados_: com zinco em concentrações de 15 ate pelo menos cerca de 12 μΜ forneceram a expressão de uma protoma ADAMTS com atividades especificas aumentada (Tabela 20). Notavelmente, em Culturas de batelada alimentada suplementadas com zinco a uma concemraçào final de l? uM, as Lixa··- de mvscrmmto e^pemlko de cclula> e atividade total não foram afetadas, enquanto que as atividades especificas das 20 '?rntama< \D\MISH e\[nv>vb ecu tem ara-- α aumentai h>to esra em contraste com o que foi observado em experimentos que empregam cultivo de células quimiustático,. Nestes experimentos, a suplemeataçã.o do meio de euluna con? /men a ume ecmxmtraeào final de 5 μM rreulton um jui aumento da atividade especifica de ADAMTS 13 no sobrenadante (Tabela 21). No 25 entanto, a níveis mais elevados de suplememaçãu. 8,5 μΜ e 12 μΜ. as taxas especificas de crescimento de células e rendimentos totais de proteínas \P\MB ' foram diminuídas, apesar da atividade específica de AlTAXnSl 3 no sobrenadante da vultura ler pemrmecido elevada.

Consequentemente em uma .modalidade dos métodos dá invenção compreendem o uso de cultura de células em. batelada. alimentada com um meio compreendendo zinco a uma concentração de pelo menos eu cerca de 2 μΜ, pelo menos, ou cerca de 5 μΜ, de ou entre cerca de 2 μΜ n 12 5 μΜ, ou entre <erca de 2 μ.Μ e 5 μΜ, ou entre: cerca de 5 μΜ e 12 μΜ, ou pelo menos ou cerca de 3 uM, 4 μΜ, 5 μΜ 6 μΜ, 7 μΜ. 8 μ.Μ, 9 μΜ, 10 μΜ. 11 μΜ, 12 μΜ, 13 μΜ, 14 μΜ, 15 μΜ, 20 μΜ, 25 μΜ. 30 μΜ, ou mais de zinco. 'Em algumas modalidades, a concentração de Anuo pode ser de pelo: menos eerca de 5 μΜ a pelo menos cerca de 12 μΜ. Em certas modalidades, I ti o meio pode ser um meio isento de proteína animal, isento de olígopeptídeu, ou qmmieamerrte definido.

L Cultivo Cuntímio \ murao^raente, a presente invenção fornece métodos para expressar uma proteína ADAM.TS, por exemplo* ADAMTS13, com elevada: 15 atividade específica de um cultivo contínuo. Estes método* permitem a expressão^ e purificação continuada de uma proteína ADAMTS de uma única cuhura ac longo de períodos de tempo prolongados. Especificamente. vgrificour.se que níveis elevados de atividade específica e expressão dó prmema \D\MIM3 podefoo ser m.mtido< per pelo meno« 53 dfeis era um 20 biorreator qumtiustau> du 101... sob condições previstas pela presente invenção (Exemplo 3. seu latida Ifo. tim umu modalidade ptefeiida. s pmtema ADAM I'S é ADAMI'S 13.

Consequentemente, em uma modalidade, a presente invenção fornece murados praa csprcraat uma protema ADAMIS tpvt cxemnhx 25 \Π\ΜΓΝΙΜ \c;n .die especificidade por um permea de tempo ptafougado. Em certas modalidades, ó cultivo é mantido por pelo menos ou cerca de 7 dias, uí! rein memo ca mu de 14 di.js, 2! dij>. 28 ecus, nu pelo memra nu cerca de S semanas, 6 semanas, 7 semanas, ou. pelo menos em ou eerea de 2 meses, ou 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18 meses ou mais.

Em algumas destas modalidades, o nível de οχρηνώπ, atividade, ou atividade específica de proteína .ADA.MTS total é. mantido na cultura durante um. período prolongado de tempo. Em outras modalidades,.a Taxa de crescimento específico, densidade de células» e semelhantes são mantidas na cultura 5 durante um período prolongado de tempo. Em -algumas modalidades, o meio d'e euhura. pode ser suplementado com pelo menos um de cálcio, zínco, ou ni.cotinam.ida (vitamina. B3), por exemplo, a uma concentração de acordo com qualquer uma de Van 1 a Van 149 < labe la 2 a Tabela. 9). Em uma modalidade particular, o método compreende o uso de cultivo de células em 1.0 quimiostato; Em. uma outra .modalidade, o método compreende o uso de cultivo de células em turbícfostáta Em ainda outra, modalidade, o método compreende o uso de cultivo de células por perfiisão, Em certas modalidades, o melo pode ser um meio isento de proteína animal, isento de ofigopepfideo, ou quim.icam.ente definido. Em uma modalidade preferida, a proteína 15 ADAMTS é ADA.MTS B.

Em uma modalidade, uma técnica de cultivo continuo de células pode ser usada para expressar uma proteína ADAMTS- (por exemplo, ADAMTS LE em um cultivo de células contendo zinco, cálcio, e ou nicotmamida (vitamina B3) a uma concentração de acordo com qualquer uma 20 do, X a; I a X ai. I to LmeM ? ,< 1 shuia 9) p_Of p<M _r>vry_t,> '' firas Em outra mudJídace, uma lecivea de cultuo comurao de células pode sei csada para expressar uma proteína ADAMTS (por example. ADAM ES 13) em um cultivo ue celuias contendo zinco, cãleio, e ou meufinainida i \ iumiina B3) a uma concentração de acordo com qualquer uma de Var. 1 a Van 149 (Tabela 25 2 a Tabela 9) por pelo menos 14 dias. Em outra modalidade, uma técnica de cultivo confirmo de células pode ser usada para expressar uma. proteína ADAM I S (por exemplo, ADAMTS13) em um cuhivo de células contendo zmeo. c;jl,?ix\ e ou mcofinjnaidi ixiuimma H.M a nms couevmraçào de acorCu com qualquer urna de Var. 1 a Van 149 (Tabelâ 2 a Tabela 9) por pelo menos

I di.ra I m urodahdeJe. U'-xs Ue*ea o.e o òac erarrmo de cdulas prate ser usada para expressar umà proteína ADAMTS (por uxumplu, ADAMI'S Mi em um cul ti vo de células contendo zinco, cálcio, eteu nicotinamida (vitamina B3) a urna concentração de aeordo çòm.qualquer uma. 5 de Var. I a Var. 149 (Tabela 2 a Tabela 9) por pelo menos 1 tmS, Em outra modalidade, uma técnica de cultivo contínuo de células pode ser usada para expressar uma proteína .ADAMTS (por exemplo, ADAMTS 13) em um cultivo de células contendo zinco, cálcio, e-ou mctemamida (vitamina B3) a uma concentração de acordo com. qualquer uma de Var. 1 a Var. 149 (Tabela 10 2 a Tabela »)t por pelo menos 2 meses. Em outra modalidade, uma técnica de cultivo continuo- de células pode ser usada para expressar uma proteína ADWD'S pxv exemn'.o, ADAMIM D era um eulu\o de cAnlas comendo zinco, cálcio, e/ou. nicotmanuda (suam^ra B3) a uma concentração de acordo com qualquer uma de Var. I a Vãr. 149 (Tabela 2 a Tabela 9), por pelo 15 menos» 3,4, 5,6, 7, 8,9, 10, 11,12, 13, 14,15, lb, 17,18, ou mais meses. Em uma modalidade preferida, a. proteína ADAMTS ê ADAMTS 13.

Em certas modalidades, os. métodos de Expressão de proteína. ADAM I S (por exemplo, ADAMIS 13) podem compreender o uso de cultivo contínuo de células com um. meio cumprcauífende zinco a uma cramentraçao 20 de pvlo numes ou cerca de d μ\1 de zireo, pelo monos ou cerca de 5 μΜ de zinco, ou entra· cerca de 2 pM e 12 pM de ziuco, rai enirc ra-raa de 2pM e 5 uM d, /'loco de <>u entre eerca de ' u\1 e > uM rce ora ο. ο i entre eetea ue 5 uM e λ2 pM Je / meo. ou pelo merco os ecras de ' pM 4 uM, 5 uM, o .DL 7 p.M. 8 pM. 9 pM, 10 pM, 11. uM, 1.2 pM, 13 p.M... 1.4 uM, 15 μΜ, 20 μΜ, 25 35 uM. >0 u\p ou m.d·^ de /meo nor p, lo mem*s ' dm l ra .mm mvdahdade particular, o método compreende o uso de cultivo de células em quimiostaio. Em outra modalidade, o método compreende o uso de cultivo de células em turbidoxt-no. Fm umda outra modalidade, o método compreende u uso de culto, o dv celul is poi pcrhvxiu i :n <.ml raodalidrairo. o mein pode ser ora meio isento de proteína animal, isento de olígopeptídeo, ou qulmicmnente défínidô. Em umà nmdMidade preferida, a proteína ADAMTS é ADAMTS 13.

Em. unia modalidade, um método para a expressão de uma proteína ADAM TS compreende o cultivo, sob condições de cultura contínua, 5 de uma célula que abriga um ácida nucleku que codifica uma proauna ADAMTS (por exemplo, ADAMTS 13) em um meio de cultura contendo pelo menós ou cerca de 2 μΜ de zineo por pelo: menos 7 dias. Em outras modalidades, o meio de cultura. irá conter pelo menos cerca de 3: μΜ de zinco. Em outra: modalidade, o meio de cultura ira conter pelo menos cerca de 5 μΜ 10 de zinco. Em outra modalidade, o meio de cultura irá conter de ou entre cerca de 2 μΜ de zinco e 5 μΜ de zinco. Em outra modalidade, o meio de cultura irá conter de ou entre cerca de 3: μΜ de zírtco e 5 .μΜ de zinco.. Em outra modalidade, o melo de cultura. irá conter de ôu entre cerca de 2 μΜ da zinco e 12 μΜ de zinco. Em. outra modalidade, o meio de cultura irá conter da ou 15 entre cerca de 3 μΜ de zinco c 1.2. μΜ de zinco. Em outra modalidade, o meio de cultura irá. conter de ou entre cerca de 5 μΜ de zinco e 12 μΜ de zinco. Em outra modalidade, o meio de cultura irá conter pelo menos ou cerca de 3 μΜ, 4 μΜ, 5 μΜ, 6 μΜ. 7 μΜ, 8 μΜ. 9 μ.Μ, 10 μΜ. 11 μ Μ 12 η Μ, 13 μΜ,

1.4 μΜ, 13 μΜ, 20 μΜ, 25 μΜ, 30 μΜ_? ou mais. Em certas modalidades, o 20 xidme e m.uudo pre pek« ' e· dias. wí peto rvnos 14 dms. 21 di n. 28 dias, ou pelo menos 5 semanas, 6 semanas, 7 semanas, ou pelo menos 2 meses, ou 3, 4, 5 , ti, 7, 8, 9, 10, 11, 12, .13, 14, 15, lõ, 17,1.8 mv^ ou raids. I m uma modalidade puricmr.r. o mctoda compreende o uso de euhrio cc células um quimlostato. Em uma outra modalidade, o método compreende o 25 uso de cultivo de células em rarbidomao. Em aínda outra modalidade, o método compreende o uso de cultivo de células por perfosao. Em certas modalidades, o meio pode ser um meio isento de proteína anímsl, isento de uiigopcpnA'O. nu qusmíeamcme dcriuico 1 m uma modalidade preferfea. a proteína ADAMTS é ADAMTS 13.

Em uma modalidade, um método .para a expressão de uma proteína ADAMTS compreende q edil vo_s. sob condições de cultura contínua, de umá cekda que abriga um ácido nucteíco que codifica, uma proteína. ADAMTS (por exemplo, ADAMTS 13) em um meio de cultura conteúdo pelo 5 menos ou cerca, de 0% mM cálcio por pelo menos 7 dias. Em outras modahdaecrc _M mroo dc utltun. n í <Oter pelo rcv·' de mM A cálcio. Em outra modalidade, o meio de cultura, irá conter pelo menos cerca de 1,5 mM de cálcio, Em -outra modalidade, o main de culture ira conter de ou entre cerca de 0,5 mM e 1,5 mM de cálcio. Em outra, modalidade, o meto de: 1.0 cultura Irá conter de ou entra cerca de 1,0 mM e 1,5 mM de cálcio.. Em. outra modalidade, o meio de cultura irá conter pelo menos ou cerca de 0,6 mM, 0,7 mM, 0,8 mM, 0,9 mM. 1,0 mM. 1,1 mM, 1,2 mM, 1,3 mM, 1,4 mM, 1,5 mM,

1,6 mM, 1,7 mM, 1,8 mM, 1,9 .mM, 2,0 mM. 2.2.5 mM, 2.5 mM, 2,75 mM, E0 mM. 3,5 mM, 4.0 mM. 4.5 m.M. 5.0 m.M, ou nuas de cálcio. Em certas 15 modalidades, o cultivo é maraato por pelo menos 7 dias, ou pelo menos 14 dias, 21 dias, 28 dias, oá peto menos 5 semanas, 6 semanas, 7 semanas, ou pelo menos 2 meses, ou 3, 4, 5,6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18 meses ou mais. Em uma modalidade particular, o método compreende o uso de euhivo de células em quimiostato. Em unia outra modalidade, o método 20 compreende o uso de edroo de células em turbidostaio. I m ainda oulra modalidade, o método compreende c uso de euhivo de células por per&são. Em certas modal idades, o meio prole ser um meio iremo de protema animal, uremu de nlieopeptídtS'. ou qramiramente deltnido. I m uma m^JaJdade preferida, a proteína ADAMTS é ADAMTS] 3, l'm uma modalidade, um mú*do pata a expressão dc uma prraema ADAMTS compreende o cultivo, sob condições de cultura contínua, cv η*’. xC a J v!P <.»,%·' ’nu eco q.K raxhuc? xHOte na .ADAMTS (por exemplo, ADA.MTS13) em. um mrao de cultura contendo pelo menos ou. cerca de 2 mg/L de meotinamída (vitamina B3) por pelo menos 7 dias. Em outras modalidades, o meio de cultura irá conter pelo menos cerca de 5 mg/L de nicotinamida ( vitamina B3)< Em outra modalidadg, o meio de > ulfi ra uj u>n.er pc o meros . <·' ca e.e me l <.? ura j md j ixü eu _t>a B '} Em outra_; modalidade, o meío de cultura irá coutar de ou entre cerca de 2 5 mg l o de 7 mg'L de mtotm.imída mramma BD, Fm orara modalid ide. o meio de cultura irá comer de ou entre oerua de 5 mg/L e 7 mg/L de meotinuumia qiuniind 8>c im o ara mod;u\Lak\ o meio de cultura irá conter pelo menos ou. cerca de 3 mg/L, 4 mg/L, 5 mg/L, 6 mg/L, 7 mg L, 8 mg/L, 9 mg/L, 10 mg/L, 15 mg/L, 20 mg/L, bu mais nicutm&mida (vitamina .1.0 B?). Em certas modal idades, o cuhivd é mantido por pelo menos 7 dias, ou pelo menos 14 duro 21 dias, 28 dias, ou pelo menos 5 semanas, fi semanas, 7 semanas, ou pelo menos 2 meses, ou. 3, 4,5,6, 7, 8, 9,10, LI, 12, 13, 14, 15, ie I le 'esc'» nu meas, fm uma mnde.hdadc particular. o método compreende o uso de cultivo de células em quimiosfato. Em uma outra 13 mmiálidade, o método compreende o uso de cultivo de células em iurbidosuuo. Em ainda outra modalidade, o mésodo compreende o uso de cultivo de células por per&sao. Em certas modalidades, o meio pode ser um meio isento de protema animal, isento de oligopeptideo, ou qunrncamente definido. Em uma modalidade preferida, a proteína ADAMTS é ÁIMMTS13.

Em uma modalidade, um método para a expressão de ume protema ADAMI'S compreende o cuhívo, sob canédçòcs de cultura contínua, de uma célula que abriga um ueido nudeíeo que codifica uma proicma ADAMTS (por exemplo, ADAMTS 13) em um meio de cultura suplementado com zinco e cálcio por pelo menos 7 dias. Em certas modalidades, as 25 enueentragues de zinco c .a\io podem ser quaisquei das descritas neste documento. Em ccr.a* modal nudes, às caneentragoes de zinco e cálcio serão uma de Van 94 a Var. 113 (Tabela 7), Em certas modalidades, o cultivo é mantido por pelo menos 7 dias, ou pelo menos 14 dias, 21. dias, 28 dias, ou peto menos 5 semanas, 6 semanas, 7 semanas, ou pelo menos 2 meses, ou 3,

4, 5 , 6,.7, 8, 9, 10, II, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18 meses ou mais. Em uma mudalidade particular, o método compreende o uso de cultivo de células em quimíostaio. Em uma outra modalidade, o método compreende o uso de cultivo de células em turbidostato. Em. ainda nutra modalidade, o métodõ 5 compreende o uso de cuhlw de células por perfusãò. Em certas modalidades, o meto pode ser um meio isento de proteína animal, isento de olígopeptídeo, ou quimícamente definido. Em uma modalidade preferida, a proteína ADAMIS é ADAMTM 3.

Em uma modalidade, um método para a expressão de u.ma 10 proteína ADAM IS compreende o cultivo, sob condições de cultura continua, de uma célula que abriga um ácido audeico que codifica uma proteína AD \M IS too’ exemplo. U) Χ\11M > > cm um ramo de cubara re.p-ememcdo com zmco e mcotmamlda (vitamina B3) por pelo menos 7 dias. Em cenas modaucade^. a> concern rações dt rimo <. ukoúumuda u&smhu BM pod^m 15 ser quaisquer dás descritas neste documento. Em certas modalidades, as coneraatraçòvs de /meo c mcorèumuda (v.mmraa BM rerão uma de \ ar. H 4 a Var. 133 (Tabela 8). Em certas modalidades, o cultivo é mantido por pelo merara 7 dias, ou pelo menos 14 ihas. 21 dias. 2á dire. ou pelo menos 5 semanas, 6 semanas. 7 semanas, ou pelo menos 2 meses, ou 3. 4, 5 6, 7, 8. 9, 20 Br H, 1.2, B. U. M. Io. p. |g meses ou nuas, bm uma modahdsde parhcular. o meredo compreende o are c.e cuhiso dv células em químiostato. Hn .m>i rama modahdade. o meiodo compreende uso de cuhAo d^ céhu.re em :urbxbstato. 1 m finde otora modalidade, o método cmr.preende c uso de cultivo de células por pcrfusSo. Em certas modalidades, o meio pode ser um 25 meie isento de proteína animal, isento de oligopeptídeo, ou químicamente deònkhx Em uma modafidade preterida, a proteína .ADAMIS é ADAM I'S! 3.

Em uma modalidade, um método pau« α expressão de uma pu4Cií\i ADAM IS compreende c cu-iixo, sob candíçòc'·' de , altura rommre, de ama celuh que abog.i um arado uudeico ore cc-mfkxi s.-ma pmte.na

ADAMTS (por exemplo, ΛΙ) \MTS13) em um meio de cultura suplementado com caldo e mcotinamída (vitamina B3) por pelo menos 7 dias. Em certas modalidades, as concentragoe de cálcio e mcotinamiua i\ hamina B3) podam ser .quaisquer das descritas neste documento. Em certas modalidades, as 5 conuentraçõe de cálcio e nicotinamide (vitamina B3) sento uma de 'Var. 134 a Vár. 149 (Tabela 9). Em. certas modalidades, o cultivo é mantido por pelo menos 7 dias, ou pelo menos 14 dias, 21 dias, 28 dias, ou pelo menos 5 semanas, 6 semanas, 7 semanas, nu pelo menus 2 meses, ou 3, 4, 5,6, 7, 8,9, 10, H, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18 meses ou mais. Em uma modalidade 10 particular, o método compreende o uso de cultivo de células em quimlosiato.

Em uma. outra modalidade, o método compreende α uso de cultivo de células em turbidostato.. Em ainda outra modalidade, o método compreende o uso de cultivo de células por per fusão. Em certas moduli dudes, o meio pode ser um meio isento de proteína animal, isento de oligopeptídeo, ou quimicamente 15 definido. Em urna modalidade preferida, a proteína ADAMTS c ADAM ISIS.

Em uma modalidade, um método para. a. expressão de uma preteres. XD 3ΑΓ S rempieemc o ctul \<x sou rood Je udltr - comnan de uma célula que abriga um ácido uucleico que codifica uma proteína ADAM I S «por exemplo. ADAMTS I 3» em um meio de _x altura rapfememadu 20 cora zinco, cálcio e nicotinamide (\ilumina B3) por pelo menos 7 dia·-. Em certas modalidades. as concentrações de zinco, cálcio e mcctlnanuda mirares 133} pudem ser quorapicr das descritas m.ste documento, bm cenas modalidades, as cônccátrações de xmeo, cálcio e nieotinamida (vitamina B3) serão uma. de Var. 14 a Var, 93 (Tabela 3 com a Tabela 6). Em certas 25 modalidades, o cuhívo è mantido por pelo menos 7 dias, ou pelo nremos 14 dras. .3 dito. .16 xlias. ou pelo meia^ ^ς ^iiiüi.sS. 6 .renttmas. ’’ 'vitu.nus. ou pelo mcnv^ 2 mexra. oa 3. 4. . o. 7. 8. % AL U. 12. I \ 1 t. I \ Jo. 17. 18 meses ou. mats. fem. uma modalidade particular, ó método compreende o uso Jc c.iltixo de célula⁴- uu qirmiotedto í-m *mtra modrAdade. o método compreende o uso de cultivo de células: em turbídostaM Em ainda outra modalidade, o método compreende o uso de cultivo de células: por purfusão. Em certas modallda^des, o meio pude ser um meio isento de proteína animais isento de oligopepudeo, eu quimicamente defímdu. Em uma modalidade: 5 preferida, a piuíema Al )AM 1S e ADAM l S i ?>,

Em uma modalidade. o caltréu é mantido a urna densidade de células entre cerca de 0,5x10*^s e 4x10' células/mE por um período de tempo prokmgado. Em outras modalidades, a densidade de células ê mántida a uma concentração entre cerca, de? Ι,ΟχΚΕ e cerca de 1,ΟχΙΙΓ ceMas/mL por um 10 período de tempo prolongado. Em outras modalidades, a densidade de «. ebàas é mantida a uma. concentração entre cerca de I.OxlfL e cerca de 4,0x1 (7’ cêitdas/tnL por um período de tempo prolongado. Em outras modalidades, a üeuraLde du ecluh> e numtida a uma Kuucemraçào entre cerca d<. l,0\10^v e cerca de 4,0x10'· eélute/mL por u.m período de tempo prolongado. Em ainda 15 outras mudai idades, a densidade de células podem, ser mantidos a uma concentração entre cerca de 2,0xlÓ^t! e cerca de 4,0xlfE, ou entre cerca de 1,0x10' e cerca de 2.ΈΗΛ ou emre xeius de LoxHl e cerca de x.ãxUf, ou qualquer outra Iraxa senielbame, por um período de tempo prolongado. À densidade de cch.Jas na qural um uthtx u de celnl.ss e mantido para a produção 20 de ranu ptraema \DAM 1S recomhmanm (por exemplo. KDWHSM) dependerá das condições de cultura e do meio usado para a expressão da proteína, Γ-m serrado nu teemea sera promameme espuz de determinar a densidade de células ótima para um cultivo de células produtoras de uma pio'emt XDWDS l m modaaeu\o rauAO s ramnnM pm pelo 25 menos 7 dias, ou pe o ihen»\ 14 dias, 21 dias, 28 dias, ou pelo menos .5 semanas, 6 semanas, 7 semanas, ou pelo menos 2 meses, ou 3,4, 5,6, 7. 8, 9, 10:, II, 12, 13, 14, 15, 15, 1.7, 18 meses ou mais. Em uma modalidade particular, o método compreende o uso de cullríu de células cm químiostato. í'm uma outra modalidade, o tumoCu compreende o uso de eultixu de células em turbidostato. Em ainda outra modalidade, o método compreende o uso de cultivo de células por perfeão. Em certas modalidades, o meio pode ser um meio isenfo de proteína animal, isento dc: oligopeptídeo, ou qutmicamente definido,. Em. uma modalidade preferida, a proteína ADAMTS é ADAMTS 13*

Em. outras modalidades, os métodos de expressão de .ADAMTS .13 permitem a produção de pelo menos ou cerca de 500 unidades de atividade de ADAMTS 13 por litro de cultura por dia (300 WL/D), por exemplo, l.hüdades de atividade de Π<Μ'5-\Α\Ί·'73, com uma atividade específica de pelo menos ou cerca de 500 LJ/mg de A13, Em outras .10 modalidades, os morado^ de expressão de ADAMTS-13 permitem a produção de pelo menos ou cerca de 000IMZD. Em outras .modalidades, os métodos de expressão de ADAMTS 13 permitem: a produção de pelo means <m tctu dv “Ό0 I Ί 1), fm outran modalidades. o^ método^ de exptwMo do \D ΧΜΓΜ3 permitem a produção de pelo menus ou cerca de S00 U/L/D. Em outras 15 modalidades, os métodos de expressão de ADAMTSI3 permitem a produção de pelo menus ou cerca de 900 U/LZD, Em outras modalidades, us métodos de expressão de ADAMTS 13 permitem a produção de pelo menos ou cerca de 1000 U/L/D. Em outras modalidades, os métodos de expressão de WVdAB pmcvtem $ puxrèção de pelo v. ,.m.i de ⁵ |up ( l D 20 Em outras modalidade.^. os mebxlus de exptesAto de ADAMTS 13 permitem a poídiuân de pdo ate-tos ou cerca de l ?0ò l 1 D but oturas modalidade:-. o>> método·> de exprc-Mm de \D Wil'S 13 permitem a pioduçàu dc pelo snenns ou cerca de I>00 1'1 d) I'm outra- modalidades, o- melodm- de expressão de ADAMTS 13 permitem, a produção de pelo menos ou eerca de 1400 IJ/L/D.

Em outras modalidades, os métodos de expressão de ADAMFS13 permitem a produção de pelo menüs ou cerca de 1500 U/E/D, Em ainda outras modahdmics. o- m-todos Je cxprcssM de ?\DW1 IM ' permitem a piodttcão de pelo menus ou eetea de .MOO l 1 D. t m um,, modalidade p;sliud>;r, o método compreende o uso de cultivo de células em quimlostato. Em uma ou·',. modalidade n método <ou pteeude o t>o de etdhvu ec veTkn era turbldostato.. Em ain da outra m odal idad e, o .método co m preende o uso de cultivo de células por perfusao. Em certas moueJ dades, o meio pode. ser um meio ísemo de protema .mimai. oento du Amopeptotoc <»u quimíeír.nvulc 5 definido.. Em uma modalidade preferida, a proteína AD \\1 Γ$ é ADAMTS 13.

Em. outra modaiuluie, os métodos permitem a expressão prolongada de proteína; ADAMTS 13 com elevadas; atividades específicas, por uxcmpkt, uma aovidude .vpvcdica ck peT menus cesea ac 6001 me de proteína Al 3, ou pelo menos cerca de 700, 809,900, 1000, 1100, 1200,1300, .10 1400, 1500, 1000, 1700, 1800, 1900, 2000, ou «xtis U/mg de proteína Al3 por um período prolongado de tempo. Em certas modalidades, o cultivo é mantido por peto menos 7 dias, ou pelo menos 14 dias, 21 dias, 28 dias, oü pelo menos 5 semanas, 0 semanas, 7 semanas, ou pelo menos 2 meses, ou 3,

4. 5 , 6. 7, 8, A Kg ) L 12, 13, 14, 15. 16. 17. 18 meses ou mais. Em uma 15 modalidade particular, o^: método cumpteende o uso de cultivo de células em quu-'o^mo Γ uma <»uUe vuhuie o rateodu . nmoroc.dc o ran do cultivo de células em turbidostato. Em ainda outra modalidade, o método eomptcuídc o rou de cultivo de cduL^ por perfumo, i'm cenas modalidade*-, o mJo pode ste' um meio iseum de psotema ammaL Dento râ ídigopepodet».

ou quimicumente definido Em uma modalidade picferidu. a proteína XDANHSeΑΠΑΜΓΜ3

2. Cultivo em Batelada bm um outro aspecto, a preseme lnxc->eào fmuect meludm para, expressar uma proteína ADAMTS, por exemplo, ADAMTS 13, com 25 elevada utíxidade espeeuiea em um cultivo em batelada. Im aleumas modalidades, o meio de cultura pode ser suplementado com pelo menos um de zinco, cálcio, ou nícotlnamida (vitamina B3), por exemplo, a uma ..ouecjraaçào de rox-uo ^om qmtluk'«* uma de \ j* I a \ a I Μ í I ..bcki 2 a labe.d M 1 m umi mraITidade n.ntiuda. o n\?mdu cemccnde o uro de cultivo de células em baldada única:, Em outm modalidade, ó método compreende o uso de cultura de células em batel&da alimentada. Em ainda outra modalidade, o método compreende o usu de cultivo de células em batelada repetida. Em. algumas modalidades, os cultivas podem ser 'realizados ωηιο udthu* cm bateladu çm· ^uspen^ào. Fm oumis uradutoLdes. v,> euliivos podem ser ieulízados como cultnes em bateladas aderentes.. Em cenas modalidades, o meio poda ser um meio isento de proteína animal isento de oiigopcptídvo. ou qtrémcameme definido. Em uma modalidade preferida. a proteína ADAM TS é ADAMTS 13.

.10 Em uma modalidade. uma técnica de cultivo de células em

Kadadí rege’ab ou. Knebda alimvmad.t pode rer usada para vsmessra rena pwn VlWfiS (poi e\cmpb>. \IH\IISH) em um <.uln\o de cdulv contendo zinco, cálcio. e ou nicaiinamida (vitamina B3)_:, a uma concentração de acordo com qualquer uma de Var. I a Var, 149 (Tabela 2 a Tabela 9) por

1.5 pelo menus 7 dias. Em uma outra modalidade, uma técnica de cultivo de células em bateíada repetida ou bardada alimentada pode ser usada para, expressar uma proteína. ADAMTS (por exemplo. ADAMTS13) em um cultivo de células contendo zinco* cálcio, e/ou nícoimamída (vuamina S3) a uma concentração de acordo com qualquer uma das Var.. I a Var. 149 ( Tabela 20 2 a Tabela 9) por pelo menos 14 dias. Em. uma nutra modahdadc. uma técnica de euhho de células era bradada ?t'p.nida ou batdaua anmuntmb. pode ser usada para expressar urna proteína ADAMTS (.por exemplo. ADAMTS13) em um cultivo de células contendo zinco, cálcio, e/ou nieminámlda (vitamina. B3) a uma concentração de acordo com qualquer uma das Var< l a Var. 149 25 (Tabela 2 a Tabela 9) por.pelo. menos 21 dias. Em uma outra modalidade, uma técnica dé cultivó de células em Kuelada repetida ou batelada alimentada, pode ser usada para, expressar uma protema ADAMTS (por exemplo, WAAMSID cm ιγ <ramv<? Je xc\' comendo caMô ecu memmaarâh nhamína B3) a uma concent?atom de acordo com qij.dquc?· urns

101 das Var. 1 a Mar, 149 (Tabela 2 a Tahda M porpefo menos 1 mês. i-.m umq outra modalidade, uma técnica da cultivo dé células em batelato repetida ou baldada alimentada pode ser usada para expressar uma proteína ADAMTS (por exemplo, ADAMTS 13) em um cultivo de células conteúdo zinco, tolcfo, 5 e/ou mcotmamida (vitamina B3) a uma. concentração de acordo com qmdpuur uma das Var. I a Van 149 (Tabela 2 á Tabela 9) por pelo menos 2 meses. Em outra modalidade, uma técnica de cultivo de células em batebda repetida ou baieiada alimentada pode ser usada pára expressar uma. proteína ADAMTS (por exemnlo \IH\Í IS l D em um culm o d» células e«ratcnd<> cinco, cak o. 1Q e,ra ntéotmamida (vitamina B3) a uma concentração de acordo qualquer cm í das Van 1 a Var. 149 (Tabela 2 a Tabela 9), por peto menos, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, IS, ou mais meses. Em algumas modalidades, os cultivos podem ser realizados como cultivos em batelada com *mpenxâ>> l'm outras modalidade'', os <ahiws podem ser realçados 13 como cultivos em bateladas aderentes. Em certas .modalidades, o melo pode ser um meio isuniu de prmema ammab isento de <4k;opuptídeu, ou qnnnicau-rarae deémda. Em aura modalidade pretérida. ,$ ptoiema XDAMlS e AD \MISI A

Em certas modalidades, os métodos de expressão de proteína 20 \l i \M I S s par exemplo, \l) \,M ISl >) podem compreender n dc c.ftuo du adulas em baldada repetuto v„. baldada alimentada com um meto .compreendendo zinco a uma concentogão dc pelo menos ou cerca de 2 μΜ de zinco, pelo menos ou cerca de 5 pAl dc ramra de ou emrc ceres dc 2 μΜ e 12 μΜ de zinco, ou entre cerca de 2 μΜ v 5 μΜ de zinco, ou entre cerca de 3 25 ,μΜ e 5 μΜ de zinco, ou entre cerca de 5 μΜ e 12 μΜ de zinco, ou pelo e:n ao oe ’ > Μ, 1 uM ' aM η ₍ M ₍ M. x u\L 4 nV μ «Μ i μΜ, 12 μΜ, 13 uM, 14 μΜ, 15 μΜ, 20 μΜ', 25 μΜ, 30 μΜ.» ou mais de zinco por pelo menos 7 dias. Em algumas modalidades, os cultivos podem ser realizados como cultivos em bmeLuia eran suspentoo. Em outras

102 modalidades, os cultivos podem ser realizados como cultivos em bateladas aderentes. Em certas modalidades, o meio pode ser um meio isento de proteína animal, isento de oligopeptídeo, ou quimicamente -deferido. Em uma modalidade preferida, a proteína ADAMTS é ADAMTS 13.

ã Em uma modalidade, um método para a expressão de uma proteína ADAMTS compreende o cultivo, sob condições de cultivo em batelada alimentada ou batelada repetida, de uma célula que abriga um ácido nucleico que codifica uma proteína ADAMTSfepor exemplo. ADAMTS 13) em um main de 'catará contendo pelo menos ou cerca de 0,5 mM de cálcio

10. por pelo menos 7 dias. Em outras meda,aludes, o meto de cultura irá conter pelo menos cerca de 1,0 m.M de cate to l m outra modalidade, o meio de .cultura ira conter pelo menos cerca de 1,5 mM de caldo. Em outra modalidade, o meio de cultura irá conter de ou entre cerca de 0,5 ,mM e 1,5 mM: de cálcio. Em outra nrodalidade, o meio de cultura ira conter de ou entra 15 cerca de 1,0 m.M ç 1,5 mM de cálcio. Em outra modalidade, o meio de cultura ira conter pelo menos ou cerca de 0,6 m.M, 0,7 mM, 0,8 mM, 0,9 mM, 1,0 mM, 1,1 mM, 1,:2 mM, 1,3 mM, 1,4 mM. 15 mM, 1.6 mM, 1,7 mM, 1,8 mM,

1,9 mM, 2.0 mM. 25^ mM, 2,5 mM. 2.75 mM 3,0 mM. 3,5 mM, M mM 45 uAl. raO mM. mt nros de canto, l-m certa»- modalidade^ o cuknu é 20 mamtdo por pelo nte?u^ ' d-a*. ou polo trono* 1 i dias. 2i dias, 28 dia*, ou pelo menos 5 romanas, 6 semanas, 7 semanas, ou peto menos .2 meses, ou 3,

4. 5,6. 7. 8, 9, Ht. H. 12. 13. 14. 15, lo. 17. 18 meses ou aros Fm algumas nmdíd dudes, os culibos podem ser rcxdi.recos romo cmlnos em batdroa c<.>m sropvnròo 1 «t* rou.w mod.ufe.Mro o⁴' ctotteo pode tt rer realizado25 como culhvos em baldadas aderente*. Em cenas modalidades, o meio pode ser um meio Mmo de proteína animal, isento de oHgopepddeo, ou quimíuamente definido. Em uma modalidade preferida, a proteína ADAMTS é ADAMTS13..

1()3 'Em « modalidade,. um método para a expressão de uma proteína ADAMIS compreende u cultiva, sob condições de cultivo em batelada alimentada ou batelada_: repetida., de uma célula que abriga um ácido nudeico que codifica uma proteína ADAMI'S (por exemplo, ADAMTS13) S em um mdo de cultura contendo pelo menos ou cerca de 2 mg/L de nicotinamide, (vitamina. B3) por pelo menos 7 dias. Em outras modalidades, o .meio de cultura ira conter peto menos cerca de 5 mg/L de nieutinamida (vitamina B3). Em outra modalidade, o meio de cultura irá conter pelo menos cerca du ’ mg l de nferamamida m namma B3) Bm outra modalidade, u meio de cultura irá conter de ou entre cerca de 2. mg/L e de 7 mg/L de meotmamida (vitamina B3), Em outra modalidade, o meio de cultura irá. conter de ou entre cerca, de 5' mg/L e 7 mg/L de meotirtamída (vitamina ,B3). Em outra, modalidade, o melo de- cultura Irá conter pelo menos ou cerca de 3 mg/L, 4 mg/L, 5 mg/L, õ mg/L, 7 mg/L, S mg/L, 9 rng/L, 10 mg/L, 15 mg/L, 20 mg/L,.

ou mais nicotínamida (vitamina B3). Em certas modalidades, o cultivo é mantido por pelo menos 7 dias, ou peh» menos 14 dias. 21 dias. 28 dias, ou pelo menos 5 semanas, 6 semanas, 7 semanas, ou pelo menos 2 meses, ou 3, 4, 5 , ô, 7, 8, 9, .10, 11, 12, 13, 14, 15, 16,17, 18 meses ou mais. Lm algumas mcJabdades, cs uduxos podem sm uMíawh como cnhao- em batelada 20 com suspensão. Em outras modalidades, os cultivos podem ser realizados como cultivos em bateladas aderentes. Em certas modalidades, o melo pode ser um meio isento de proteína animal, isento de digupepuden. ou qdmuramuite dcfmdo. bm uma rramsbdaJc proferida, α píolcmu ADAMI S é ADAMTS 13.

Em uma. modalidade, um método para a esgrv.-Mo de uma pnrav.-a ADAMTS «.ompaucude <> euhuo. Mu condições de culliso em batelada alimentada, ou batelada repetida, de uma célula que abriga um ácido nucleico que codifica uma proteína \D\MVS tp»a exemplo, ADAMI SB) cm um meto dc cultor,j suplementado com --meo e calem, pra pu:o menos 7

104 dias. Em certas modalidades,· as concentrações de zinco e cálcio podem ser quaisquer das descritas neste doeumento, Em certas modalidades, as éoncentraçoes de zinco e cálcio serão uma de Var. 94 a Van 11.3 (Tabela 7). Em certas modalidades* o cultivo é mantido por pelo menos 7 dias, ou pelo 5 menos 14 dias* 21 dias* 28 dias* ou pelo menos 5 semanas, fi semanas, 7 semanas* ou pelo menos 2 meses, ou 3* 4* 5,6* 7* 9* 10, 11, .12, 13,14* 15, 16, 17, 18 mexes ou mais. Em algumas modalidades, os eukivns podem ser realizados corno .cultivos em T.rcKuh cmii *o''»pens,lo Em outras muduhdadm, <>' i'h'u\o^ tedrar rai uaVundo-'» *.omu s.nh ,o\ em K.itedcs 10 idcreete I oita imn^!da_?de o nem pode ,m *ve o sento Ce prokana. animal* isento de oligopeptídeo, rra químioamente definido*. Em uma. mude Teme preferida, _α pretera,; MMMIS e W\MIM l

Em uma mod.md uà\ um método para: a expressão de uma proteína ADAMTS compreende o cultivo* sob condições de cultivo em 15 batelada alimentada ou batelada repetida, de uma célula que abriga um ácido nuelçico que codifica uma proteína ADAMI’S (por exemplo* ADAMTSI3) em um meio de cultura suplementado com zinco e nicotinamída (vitamina BS) por pelo menos 7 dias. Em. vertas modalidades* as concentrações de zinco e niccriuamídu Biiamina B3) podem ser quaisquer das descolas neste 20 documemo. Em cerias modalidades* ás conccutracões de zinco e nkiotmamida Atomura BE serac uma de \,r 114 a \ ar IB foaMa 8Λ Em ccoa^ moíL}líd,u1e$, o cuhAo v mauiico pur pe:n meuox ~ dias, vn pelo mcnu\ 1 t dias. 2d dias. 28 dias, ou pelo menos 5 semanas. 6 semanas, ⁷ semanas, ou pelo me’-os 2 mese^. ou 3, 4, 5 , 0, , 8, 9, 10, M, 12, 13, TE 15, lu, 17, hx 25 muras ou nuas, bm uu',uma< modalidades, vs euhí\O'> podem sej rcub’uk^ como cultivos em. batelada com suspensão. Em outras modalidades* os *u.tncs podem rai icJraafim como cubrto'» em batoUtl·' aderente 1 m certas modalidades, o meio pode ser um meio isento dc proteeu animal.

105 isente de olijtopeptídeo* ou quimMm-cnte definido, firn nmn modalidade preterida, a proteína .ADAMTS é ADAMTS 1 T l m uma .nod.dhbdv. -an memdo p-ua a o.pu.vAio de uma proteína. ADAMTS compreende: o cultivo* sob condições de cultivo em 5 bateteda alimentada ou batclada repetida, de uma célula que abriga wn ácido rmdeteo rate cndulea uma pmtmm-í ADEMIS cxcmpm. VAMI\d em um. meio de cultura suplementado com cálcio e mcotínamida (vitamma B3) por pelo menos. 7 dias. Em certas modalidades* as concentiaçèe de cálcio e nicotinamida (vitamina B3) podem ser quaisquer das descritas neste

10. documento.. Em cepas .modalidades, as concentrate de. cálcio_: e nicotinamida (vitamina. B3) serão uma de Vau 134 a Var. 149 (Tabela 9). Em. cartas modalidades, o cultivo é mantido por pelo menos 7 dias, os pelo menos 14 dias, 21 dias, 28 dias, ou pelo menos 5 semanas, 6 semanas* ' ou pelo menos 2 meses, ou X 4, 5 , õ, 7, 8, 2, 10, I I, 12, 13, 14, 15, Id. 17, 18 15 meses ou mais. Em algumas modalidades, os cultivos podern ser realizados come euluxos cm haíelada com uspenrèo. Em outras nmdalídades. os cultivos podem ser realizados como cultivos em bateladas aderentes. Em. certas modalidades, o meio pode ser mn meio isento de proteína annual, «stnto de ohgopcptuteo* u-ι çmmvmteme râramda Ira un.i modto prcfesida. a prate mt ADAM FS e M >AM IS B.

Em uma modalidade, um mctodn para a expressão dc uma proteína ADAMTS compreende o culto o. sob condições de cultixu em batelada alimentada ou baielada repetida, de uma <eínla que abúça um amuo nucleico que codifica uma proteins ADAMIS (por exemplo* ADAM ISID 25 em um meio de cultura suplementado com zinco, calda, nieotínamída e oC.mmx HP oo: pe\> mmO> ^v dur Im vert, \ noaamMim. ds caaeemraçòes Λ /nuo, x^cie c a.couamtraa nramma IV) podem vi quaisquer das descritas neste documento. Em certas modalidades, as c<invent'.açòc- dv /mm, vdem e iré.vmmuràò.u ixuamin.a BD senm uiu de

106

Van 14 a Van 93 (Tabela. 3 com a Eiheb 6). Em. certas modalidades, o cultivo é mantido pôr pólo menos 7 dias, ou pelo menos 14 dias, 21 dias, 28 dias, ou pelo .menos 5 ^semanas, 6 semanas, 7 semanas, ou pelo menos 2 meses, ou 3, 4, 5,6, 7, 8, 9, 10, 11,12, 13^ 14, 15,16,1.7, 18 meses ou mais. 5 l m algo.\is mods’aimies. os cuhi\o<. podem se? realizados como cuhhos em batsíãda com. suspensão. Em outras modalidades, os cultivos podem ser realizadas como cultivas em bateladas aderentes. Em certas modalidades, o meio pode ser um meio isento de proteína. animal, isento de olígopeptídeo, ou químkameme defmido. Em uma modalidade preferida, a proteína ADAMTS 10 éADAMTSIJ.

Em. uma. modalidade, o cultiva é mantido a uma. densidade de células entre cerca de 0,5xl(E e 4x1(1 células/mL por um período de tempo prolongado. Em outras modalidades. a densidade de adula? e anoda a uma <.oncculra\do entre rena de 1.0x10 e cerca de ’toxM celubs ml por um 15 pcniído de tempo prolongado Fm ontra> modalidades, a densidade de células é mantida a uma concentração entre cerca de 1,0x10'· e cerca de 4,0x1 (F células/mL por um periodo de tempo prolongado. Em. outras modalidades, a densidade de células é mantida a urna concentração entre cerca de 1,0x10* e cerre de AOxlO ccbras ml por ran permd.o d< u mpo prolongado ton amua 20 outras modalidades, a densidade de células podem ser mantidas a uma concern ração entre cerca de 2.0x10 e cerca de 4.0xl<)'\ ou entre cerca de Ι,ΟχΚΕ e cerca de 2,5x10^, ou entre cerca, de 1.5x10'· e cerca de 3,5x102 ou qualquer outra faixa semelhante, por um período de tempo prolongado. A densidade de células na qual um cultivo de células é mantido para a produção 25 de uma proteína ADAMIS- recombinaute (por exemplo, ADAMTS13) dependerá das condições de cultura e dó meio usado para a expressão da proteína. l.Jm versado na técnica será prentamente capaz de defôrnimar a. densidade de células ótima para um cultivo de células produtoras de uma proteína ADAMTS. Em certas modalidades, o cultivo é mantida par pelo

107 menos 7 dias, ou pelo menos 14 dias, 21 dias, 28 dias, ou pelo, menos 5 semanas, 6 semanas, 7 semanas, ou pelo menos 2 meses, ou 3,4, 5 , 6, 7, 8, 9, 10, 1L 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18 meses ou mais. Em- algumas modalidades, os cultivos podem ser realizados como cultivos em baielada com suspensão. Em 5 outras modalidades, os cultivos podem ser rcaHrados como cultivos em bcUcLOvix adera nkro í m ceara raadahdadra c mesa poro sm um arou \eu^fa dc píotchkí animal, isento de oOgopvpUdeo, ou qremraurome definido Em tinia modalidade preferida, a protema \DAMTS é ADAMTS13.

Em. outras modalidades, os: métodos de expressão de 10 ADAM ES 1 x permitem a produção de pelo menos ou cerca de 500 unidades de att\ uiade de àDAMT^:SÍ3 por litro de cultura, por dia (5QQ UZI.7D), por exemplo, unidades de atividade de FRETS-S^WF?^, com. uma atividade especifica de peto menos ou. cerca, de 500 U/mg de Al 1 Em outras modalidades, os métodos de expressão de ADAMTS13 permitem, a produção 15 de pelo menos ou. eerea de 600 U/1.7D. Em outras: modalidades, os métodos de expressão de ADAMI'S 13 permitem a. produção de pelo menos ou cerca de 700 UZI./D, Em outras modalidades, os métodos de expressão de ADAMTS.13 permeem a produção de ;k!o nsenos uu «.erei dv BOu 1' I D. Fm nutras re.ud d'.dades, n> métodos de expressão de \DAM I S í ' peunhem a produção 20 dc pelo menos ou eerca de 900 U/L/D. Em outras nuto,didaroro ns métodos de expícraàe de ΜΉΜ ISl' penrmem a prouuçân de pelo menos ou cerca ue 1000 U3....11 Fm oraras modalidades. os méhxios de expressão de ADAMTS13 permitem a produção de pelo menos ou cerca de IIU0 V l./D. Em outras modalidades, os métodos de expressão de ADAMTS13 pennitem a .Es produção de roto mran»s ou cerca de 1200 1.11../1). F.m nutras modalidades, os métodos de expressão de ADA.MTSI3 pcrrnhem α produção de peto menos nu cerca de 1 300 U/L/D>. Em outras modalidades, os métodos de expressão de ADAMIS 1.3 permitem a produção de pelo meros ou eerea de >400 l.M.ri). Fm ram.-r modalidades, o< mentora de vxpressão de XDAM ISH permitem a χ·

108 produção de pelo menos ou cerca de 1500 l.M.4). Em ainda outras modalidades, ps métodos de expressão de ADAMTS13 permitem a produção de pelo menos ou cerca, de 20001M./D. Em algumas modalidades, os. cultivos podem ser realizados como cultivos em batelada com suspensão. Em outras > modalidades, os cultivos podem ser realizados como cultivos em bateladas aderentes. Em certas modalidades, o meio pode ser um meio isento de proteína, animal, isento de olígopeptídeo, ou químicawvnte definido. Em uma modal-dade preferida, a proteína ADAMTS é ADAMTS 1 3.

Em outra modalidade, os métodos permitem a expressão 10 protongada de proteína ALMMTSO asm elevadas ath idades e\pec ificas, por exemp-.o, >.ma mh idade especifica de rolo menue cerct de udol mg de uruiema M3, ou pelo menos cerca de MO, 8t>0, 9p<,\ IpOA 1 hXi. 1 ?υθ, 1300, 1490, 1500, 1600,. 1700, 1800, 1900, 2000, ou mais IJ/mg de proteína. ΛΕ3 por um período prolongado de tempo. Em certas modalidades, o .cultivo é E5 mantido por pelo menos 7 dias, ou pelo menus 14 dias, 21 dias, 28 dias, ou pelo menos 5 semanas. 6 semanas, 7 semanas, ou pelo menus 2 meses, ou 3, 4, o , 6, 7, 8,9, 10, II, 12, 13, 14,15, 16, 17, 18 meses ou mais. Em algumas modalidades, os cultivos podem, ser realizados como ctiltivos em batelada eom suspensão. Em outras modalidades, os cultivos podem ser realizados 20 como cultivos em batelndas aderentes. Em certas modalidades, o meio pode ser um meio isento de proteína, animal, isento de óljgQpeptídéo, ou quindeamentu definam l'm uma modahdade preferida, a pnrumu XDXMTS é ADAM Í'S 13.

3. Condições de Cultivo

Surpreendéntumentc, também foi \ eii L. ueo que as s de células e as atividades de ADAM.T&13 podem ser aumentadas por pequenás variações na temperatura e pH da cultura de cêltd&s. Como pode ser visto na í cura A u c'is.dadv espccuica Jc \DA\H'S;3 tspreraa e yranOee.huue mteHsMcada quamk· ,v celaDs que abrigam um nudeotídeo cue codifica uma

109 proteína. ADAMTS 13 são cultivadas a um pH abaixo de cerca de 7,30. A iempcratma, embora on mvnor eras, e tambvm u:n Lua qua ,ofW'ibui para a au\ A ' <. >,x\ in,' <, VMM I SI' \·Λ ert dm I\ me row mode, veníkou-se que a produtividade volumétrica de AM (medida por FRETS5 V WF7.3) nos sobranadantes de culturas erase idas a nm pH entre cerca de 6,80 e eerca de 7,3 foi grandemente aumentada em comparação com. os idveig de pH acima e abaixo dessa faixa.. A produtividade de ADAMTS 13 também foi afetada pela temperatura da. cultura. A atividade máxima foi. verificada em culturas crescidas a uma temperatura entre cerca de 34^C e cerca, de 37^eC.

W Em outras modalidades, os métodos d© expressão de proteína

ADAMTS compreendem uma etapa, de manter a temperatura, do meio de cultura a uma temperatura de cerca de 34% e cerca de 37%?. Em. certas modalidades o meio de cultura pode ser mantido a uma temperatura. de 36,5% ou menos, 36,0 %? ou. menos, 33,5 % ou menos, ou menos que 35,0 15 C. Em ama modalidade especifica, a temperatura v mantida a uma temperatura de cerca de 36%; Em uma modalidade específica, o cultivo é mantido a uma combinação de feixas de temperatura e pH acima memmnadax pos exemplo. .foto '( ca menos e nm pl 1 de. por exemplo, ^.15 ou menus. Em uma modalidade preferida, o cultivo é mantido a uma 20 temperatura de 3o.0 % e um pH de 7,10.

Assim sendo, um algmu.rc modalidade. O mctoOos de expressão de proteína. ADAMTS compreendem uma etapa, de manter o pH do meia de cultura a um pH entre cerca de 6,S c 7,3. fm certas modalidades, o pl l ρ»Ά.' lsuu e.mrc cerca de T0 c cerca <k 23? ou entee cere i de fens _e cerca 25 de 7,15. Em certas modalidades o pH pode ser mantido a um pH de 7.20 ou u cees. 7,15 ou menos, 7,10 ou menos ou 7,05 ou menos. Em uma modalidade especifica, u pH do meio de cultura è mantido a um pH de cerca de 7,1, no

Em uma modalidade, a invenção fornece um método para a cvoou eb irra pa-bo a kh\\llS q<.,e vO.npneraie o cuh,\o e.x ui célula que: abrigo um ácido nucleíco que codifica uma proteína ADAMTS (por exemplo, ADAMTS 13) a uma temperatura de w entre cerca de 34*C e 5 cerca de 37’''C a um pH de ou entre cerca de 08 e 7,3* Em outra tnodalhiude. a.

temperatura da. cultura, será de ou entre cerca de 3 5 °C e cerca de 3 Αχ.: e o pH sem de òu entre cerca de 6,8 e 7,3, Em outra modalidade, a temperatura da cultura, sera, de ou entre cerca de 35,5 ^f>C e cerca de 36,5 C e o pH será, de ou cnee xcua ec o 3 e Ά 1 m oir a mcoulíÀ de, a tenrera n -u t de ou cerca de 30°Ç e o pH será de óu entre cerca de 6,8 e 7,3, Em uma modalidade, o meio de cultura sera suplementado com zinco. Em outra modalidade específica, o meio de cultura sera suplementado com cálcio. Em. outra modalidade específica, o meio de cultura será suplementado com nicotinumida (vitamina B3). Em uma modalidade, o meio de cultura será 15 suplementado com nnco e ca,Ao i m uma. modahdndc. a^ remxetnraçòes de zmco e cálcio serão uma de Van 94 a Var. 113 ( Fabela 7). Em outra modalidade, o melo de cultura será suplementado com zinco e mcraiuamida (vitamina B3). Em uma modalidade as concentrações de zinco e mvotmamida (vitamina B3) serão uma de Van M4 a Var. 133 (Tabela 8). fim outra 2() modalidade, o mao de cuhura sera suplementado com cálcio e nícotinamlda teitamma R3). Fm uma modalidade. a< comeutraçõc de caUo e meotmamida íxhamma R3j sreão uma A- Vsr B4 a Van EM Jabela 9) bm anula ouiru modalidade, o meio de euhura será omeerarado com zinco·, cálcio, e muutmamída (vitamina B3). Em uma modalidade, as noncentraçoes de zinco, 25 cálcio e nicutinamida (vitamina B3) serão uma de Var. 14 a Van 9.3 (Tabela 3 com a Tabela 6).

Em outra modalidade, a invenção fornece um método para a expressão de uma proteína ADAMTS que compreende o cultivo de uma <.elul.i que afirigu um acidt» n.aíeico que codifica uma protcccra ADWtFS πι (por exempla, ADAMTSl 3) a uma temperatura de ou entre cerca de 34^ÔC e ce?ca de ' 7' C a um pl l de ou e?rre cesea de o.9 ,_x< \2?. Em ouíra srefi duEde, a lempeuítota da cultura, será de ou entre cerca de 3MC e cerca de ,37^VG e o pH será de ou entre cerca de 6,9 e 7,25, Em outra modalidade, a temperatura 5 da cultura será de ou entre cerca do 35.5 e cvsca de 30.5 C v n pH serú de ou entre cerca de 6,9 e 7.25. Em outra madaudade, a temperatura da cultura será de ou cerca de 3foC u o pH será, de ou entre cerca de 6,9 e 7,25. Em uma. modalidade, o meio de cultura será suplementado com zinco. Em outra modalidade específica, o meia de cultura será. suplementado com cálcio. Em 10 »v.:?a mujjrèdado especifica, o meio de eahtna sera raplemernado c<*m nuorèremdu ran.unma R3 i Em uma modalidade, o meu» de cubara revi suplementada com zinca e cálcio. Em uma modalidade, as concentrações de /meo e eakno seiàv uuu de \ ar. '•H a Var, D' (Efoek; 1 Em atou modalidade, o meio de cuhura será suplemeniado com zinco e mcoünamida 15 nbarama B3E l ni uma niudandade is romx-nnjçòe^ de ziiuo c nicntauamoa (vitamina B3) seção uma de Var, 114 a Vut 133 (labeh Em outra, modalidade, o meio de cultura, será suplementado com cálcio e nieotinamidã (vitamina. B3). Em. uma modalidade, as conceutmçõe de eakío e mcannamida (vitamina B3) serão aíM de V$r. 134 a Var. 1.4:9 (Tabela 9), Em ainda outra 20 modalidade, α meio de cultura será, concentrado com zimxg cáleio, e àiéàtínamida n itamina. B3), Em. uma modalidade, as ctmeentrações de zinco, cálcio c mcoimamida (situmma Bb rerno urns de Vau M a V.ir. ui ( Eah'h ' com a Tabela 6).

Em outra modalidade, a invenção fornece um. método para a 25 expressão de uma proteína .ADAMI'S que. compreende o cultivo de uma n j cue abtua aerere civ »v»dUiC ' s nnee ⁽.i \D\V>\ (por exemplo, ADAMI'S 13) a uma temperatura de ou entre cerca de 34°€ e cerca de 3'?'C a um pH de ou mure cerca de Eu c -2u. Em omra modalidade,

a. temperatura da cultura será de ou entre ccrea. de 35*C c cerca de 37^GC e o

112 pH será de ou entre cerca de 7,0 e 7,20. Em outra modalidade, a temperatura d ra ultu’d sem de uu eulre cerca du t' c reset dv M.5 VrOpHsende ou entre cerca de 7,0 e 7,20. Em. outra modalidade, a temperatura da cultura será de ou cerca. de 3MC e u pH será de ou entre cerca de 7,0 u 7,20, Em uma nrodabJade. <» mera uc eu una seia xe.plcmcntado vosss /^ν:\ν 1 m o«iu modandadc e^pecdka, <- meio de cultura era vaplu;reatado mm ealcfo Em outra modalidade específica, o meio de cultura será suplementado com nicotlnamida (vitamina. B3). Em uma modalidade, o meio de cultura será suplementado com zinco e cálcio. Em uma modalidade, as concentrações de 10 zinco e cálcio serão uma de Var. 94 a Vau 113 (Tabela 7). Em outra modalidade, o meio de cultura sem suplementado com zinco e nicotinamide (vitamina B3). Em uma modalidade as concentrações de amuo e nicotinamide V-stamina Has serão uma de \ar. 114 a Xar 1'3 HalMa b). Em oura modalidade, o meio de cultura será suplementado eom cálcio e nicotlnamida 15 (vitamina B3). Em. uma modalidade, as concentraçoe de cálcio e mcotmamida s\ lamina B3..S serâo uma de Var. 134 a Var. EH (labela 9). Em ainda ouua modalidade, o meio de cultura será concentrado com zinco, cálcio, e .nicotmamída (vitamina B3). Em uma moJalulaue, as concentrações de zinco, cálcio e nieotinamida (vitamina '83) serão uma de Var. 14 a Var. 93 (I ubeia 3 20 com a labda 61

O conceito de crescimento celular cm miesastransporiadores foi primeiro descrito por Wezel (van Wezcl AI. , bhiure 1967 Oct ⁷:2hgãl 10s;u4-5) e perante α fi\aça«» de <ehròi< tui supesfide de pequenapmiKubs xMsds' em ao ssan-' 3. CdUíisssoiW s >k\ muocos fornecem, elevadas razões.de superfície para volume e, assim, permitem o uso cfkiente de nutrientes. Além disw para a expressão de proteínas secretadas eus ficharam ue cJulaa cucaraaka. a rarèo de -uperikh. paia 'ro-ume aumentada permite níveis nwis eievidus de s.nneeao e, assim, tendimento·- de

113 proteína mais elevados no sobrenadante da cultura. Fmalmsnte, estes métodos, permitem a fault ampliação de culturas de expressão eucaríóticas..

As células que espumam uma proteína ADAMTS podem ser ligadas a um microtransp<«rljdcr es jerico ou poroso durante o crescimento do '5 cultivo de células. ü microiránsportador pode ser um. miçrotransporiador selecionado dentre o grupo de míerotransportadores· baseados em dextrano, cutógeno, plástico, gelatina e celulose e outros, tal como descrito em Butler (1988. In: Spier & Griffiths, Animal cell Biotechnology 3:283-393). Portanto, de acordo com uma modalidade da invenção as células que expressam uma 10 proteína ADAMTS- são eultreadas cm ancrotransportadores esféricos. De acordo com: outra modalidade células que expressam uma proteína ADAMTS da invenção sàu ^nhixadas em mkrotrrmspniiado-ms poroso.. lambem é possível crescer as eéhdas para ama biomassa em microtranspoPadores esféricos e subcultivar as células quando elas tiverem atingido a blomassa do 15 fermentador final e antes da produção da proteína expressa èm um microiransponadur poroso ou vice-versa. Mícrotranspurtader esféricos são aqueles selecionados dentre o grupo de super&fé lisa, tais como Cytodex™ 1, Gytodex™ 3, e Cytodex™ 3 (GE Healthcare) e mierutranspunadores' maeroporosos, tais como Cytopnre™ 1, Cytopore'™ 2, Cytoline™ 1, e 20 Cytoline^r'^M 2 (Gl· Henlòvarch

IV. Meios de (uh ura

Em um aspeeio, a pnraenu* invenção fornece meios de vuhurn: que são uteis para a expre-sào dv proraimv ADAMTS tendo elevadas atividades específicas. Vantaíosamente, verificou-se que pela suplememaçüo 2ç de ran meio de vuhura com vurios componentes, tuis como combíaacòre dc ro.rao. caféux c imurâuumda raíl.mròra B>). uuc a-' am «Antes de e.vínus de \DAMIS (pm e\en'p’.o ADXMISl D expressas e«u céhjko' euhriadas no melo sao grandemente intend ficadas, embora as enzimas sejam expressas em

Μ 4 níveis tão elevados, se não mais elevados, que as células cultivadas em meios não suplementados.

Os métodos de preparação de meios de cultura isentos de proteína animal e quimicamente definidos são conhecidos na técnica, por 5 exemplo, nas Patentes US 6.171,825 e 6,936,441, W0 2007/077217. e nas Publicações de Pedidos de Patente US numeres 2008/0009040 e 2007/0212770, cujas descrições são incorporadas neste documento por referência: na sua totalidade para todos os fins. Em uma *m>d.didmfe, o meio de cultura usado nus métodos descritos neste documento é meio isento de Ui proteína animal ou isento de olígopeptídeo. Em. certas modalidades, o moto de cultura pude ser quimicamente definido,. Em certas modalidades, mens meios de cultura podem, conter peto menos uma poiiamma com. uma concentração de cerca de P.5 mg 1 α cerca de 10 mg L,

Consequentemente, em uma modalidade, um meio de cultura ê ló tomcc'do <> qu.d e mplemernado co’ ,aleio. zmem ecu xiiamiua Rt udicsmal, Em certas modalidades, <> meio pode <mr um meio isento de preteina animal, isento de ófigopeptídeo, ou químicameute definido. Em certas modalidades, o meio isento de proteína animal cm isento de ohgopcptídco v preparado 1.4 lonw uísmadu sm Pmeraro ES o EU e 20 6.936.44 L WO 2007/077217. e nas Publicações de Pedidos de Patente US

2008/0009040 e 200//0212770, troras ώ,χϊΚ'Οο sito mcorporadàs neste documento po r referência na sua totalidade para todos os hns, ambas as quais sendo incorporadas neste documento por referência na sua totalidade para todox Γ.. s. e suplementado com c.fcio, zinco, e ou x earn ca B3 Mlemud, 25 fcm uma modalidade especifica, o meio de cultura quinúcamente definido mulo <'olh,.me co l spE modit'c.iuo poi Ailtoxc JAU \1k q, ? fen raifle\tado >rom cakáo, emeu, c ou χ lamina PC .to’cmnul. a fim dc aumentar a atividade específica de uma protema ADAMTS expressa em uma célula cultivada, no meiá Em ainda outras modalidades, o meio de cultura é

115 isento de cumpuncnte uni mat Em outra. modalidade, o meio de cultura compreende protcma, pur ewmpkn ptotema animal a pan Jr de soro. I’d crane spro fetal de vitelo, Em ouira modalidade, a cultura tem proteínas recombiuantes exugenamente adicionadas. Em outra modalidade, as proteínas .5. são de· um animal isento de patôgeno certificado.

Em rctUs modahaaucx, os meios dc etdima ωηΚτ.μ pexmenos, uma poliamma com uma concentração de ou entre cerca de 0,5 mg/L e 30 mg/L.·. Em outra medahd.uhv o meio dé cultura contém, pelo menos, uma poliamma de ou. entre cerca dé 0,5 mg/L e 10 mg/L. Em. uma modalidade, o ,1Ü meio de cultura contém, pelo menos, uma poliamina de ou entre cerca de 2 mg/L e 8 mg/L. Em certas modalidades: a poliamma. é a partir do grupo de ornitina, putrescina, espermina ou espennidína, ou semelhantes. Em uma modalidade preterida. a poliamína é a putrescina. Em uma modalidade específica, o meio de cultura contém de ou entre cerca de 2 mg/L e 8 mg/L dé 15 putrescina.

Em uma modalidade, um meio de cultura, é fornecido para a expressão de uma proteína ADAMTS (por exemplo, ADAMTS 13) comendo pelo menos ou cerca de 2 μΜ. de zinco. Em outra modalidade:, o meio de cultura contém pelo menos ou cerca de 5 uM. de zinco. Em. uma modalidade, 20 o meio de cultura contém de ou entre cerca de 2 μΜ u 1.2. μΜ de zinco. Em outra modalidade, o meio de cultura contém de ou entre cerca, de 5 μΜ e 12 μΜ de z.mco. b.nt ainda outras tmaíalidade?,, O meio de cultura pode conter pelo menos ou cerca du 2 μΜ. ou pela menos ou cerca de 3 μΜ. 4 μΜ. 5 μ Μ. 6 μ.Μ', 7 μΜ, 8 μ Μ, 9 μΜ, 1. 0 μΜ, 1.1 μ Μ. 12 μ.Μ, 13 μΜ, 14 μΜ.. 15 μΜ, 20 25 μΜ, 25 μΜ, 30 μΜί, ou mais de zinco.

Gnralmenie, qualquer sal de zinco pode ser usado para suplementar os meios da invenção, exemplos nâo fimíiames de sais aceitáveis induem, ZnSOp7H?A ZnS0..-?H-O, feLHAEiM-m 2ILf>. ZnBr> ZnBrv2H₂O, ZnCk Ζπ (M hn 61LO, Zn tHfeO<}·· H?O_? (C dLOrtM?v2H₂O,

116 e semelhantes;. Em certas ttiodalidades, um sal farmaceütícâtneíite aceitável de * zinco é usado para suplementar os meios de cultura da invenção. Em outras modalidades, nm. pcpudco couteridu zinco ou preparação de proteína, por exemplo, insulina, pode ser usada, para o suplemento da eultora fornecida 5 nesfê documento.

Em outra modalidade, um meio de cultura é fornecido para a expressão de uma proteína ADAMTS (por exemplo, ADAMTS13) contendo pelo menos nu cerca de 0,5 mM de cálcio. Em outra modalidade, o meio de cultura contêm peto menos ou cerca de 1,5 mM de cálcio. Em uma 1.0 modalidade, o_: meio de cultura contém de ou entre cerca de 0,5 mM e 1,5 mM de cálctó., Em amda outras modalidades, o meio de cultura pode conter pulo menos un vurca de 9.5 mM ou nela raeuo^ ou cerca de 0.0 mM 0,7 mM AS mM. 0o _ΓΛΙ, \6 πΛΙ, M mM, IJ mM, 1.3 mM, 1.4 mM . -Λ mM. Lu « mM, L? mM, 1,8 mM, 1,9 mM, 2,0 mM, 2.25 mM, 2,5 mM, .2,75 mM, 3.0 15 mM 3,5 mM, 4.0 mM,. 4,5 mM. 5,0 mM. ou mais de cá lei n.

Geralrneme, qualquer sal de caldo pode ser usado para xuplememar os meios da presente invençào. exemplos não dmítantu·,·. de sais aceitáveis incluem Catfo, .CaCli, CaFPOySHAX Câ-h.,. CáBr·?. (CELCELCa, (CH( HCj, (CMigQffoGa, (ÍMLMMM*2HA), e semelhantes. Em certas 20 modalidades, um sal famraeeuueamente aceitável de cálcio é usada para suplementaras meios de cultura da im cação.

Em outra modalidade, um meio de cultura é iorneddo para a e\p'.e<sào de uma piou nu Al) AM ÍS cvr exemplo. W \Ml SI B contundo pelo menos ou cerca de 2 mg/L de nieotlnamida (vitamina B3). Em outra 25 modalidade, o melo de eu aura enatum pelo mero*-, ou cures de 7 mg I de nieotinaauda (v.Umiau fon anui modalidade, o meio de eulmra romern de ou entre cerca du 2 mg/L e 10 mg/L de nicotinamida (vitamina BS). Em. ainda? outras modalidades, o meio de cultura pode conter pelo menos ou cerca de .1 mg l . 1 me l , 4 u»a, l , 5 ma I , o me 1 . me I . x me l . o me, l . 10 mgZL, 15 :mgZt₃ 20 mgZL* ou concern rações- mais elevadas de muotinamida (xituminu B.A

Vart ηοΜηνηκ' vcridccm-se que pela suplementaçao de um nu\n de uiPrara com /jvn c cario i auricade cqwufma da 'W na 5 ADAMTS 13 expira nu meio dc cultura é grandemente aumentada. (,'onsequentememe. cm uma modalidade. os meias de cultura fornecidos neste documento para a expressão de uma proteína ADAMTS (por exemplo, ADAMTS 13) pode ser suplementado com zinco e cálcio. Por exemplo, um meio de cultura pode ser suplementado com zinco e cálcio em níveis

10. ibmemjus nu lauda ~. uu e. a Ute ndel de acurou cuz qualquer um oc \'ar.

a Van 1 EE

Tabela 7« Modalidades exemplares de meios de euhura suplementados com zinco e cálcio, que são úteis para a exprcsMo de uiua protema ADAMTS 13,

.....	Pelo menos 0,5 S'; Μ de cálcio	Pelo menos 1 ' Al u< C.di iU	l',mre O.s r 1.5 e?M Se rak'í<>	IVs- n-enos Ü,6 mM, 0.? u.S mM, 0.9 mM. L0 IJ mXI, 6? nsM, L3 16 suM, L5 mM. 1 u 1.7 mM. LS is\f g>> 2.0 ?nM. 22V mM. 2.? _'D s.sM. Eu hV, ' TU mXt -Eê ralL ou .mais cálcio	•oM, O:M. mM. mM. mM :n\t mM. 'h\í.
Pelo menus 2 μ:Μ de Zi oco	V;«. 94	V.n es	| Van. 96	Var., 97
Pelo menoí 5 μΜ de Ztecu	Ver, 98	Ver, W | Van UM)	Var. 101
Entre 2 μΜ e 1.2 «M de Zinco	Ver. 102	Van IM	1 Ver. 104	Vau 105
l.-ntre 5 μΜ e 12 μΜ de Zinco	Van 106	V.n I07	| Vau lOg	Vur. 109
Pelo racnro ; μΜ, a μΜ. 5 μΜ. (> μΜ. 7 μΜ. 8 uVL 9 μΜ. 10 μΜ. Η u.M. 12 uM. 13 μΜ, 14 μΜ, 15 μΜ, 20 μΜ, 25 μΜ, 30 μΜ. ou mais zinco	Van D0	Ver. 11 í	j Van 112	Van 113

“Var.^r Variação

Do mesmo modo, verificou-se que pela suplememação de um. meio de cultura com zinco e nieptínamída (vitamina B3), a atividade euvcule s da prme na \P\M1SH cxpvxu ao meio de cultura é smei:gicamente aumentada. Por exemplo, este efeito pode ser visto np 5 l xenrVo 2 (comparar Tabela 14 dia II com a Tabela 13 dias 4 e 7).

Craiwqaentemaffle, em uma,modalidade, os meios decutóra fornecidos neste documento para a expressão de uma protéfoa ADAMTS (por exemplo, ADÀ.MTS.13) podem, ser suplementados com zinco e niuotiuannda (vitamina B3). Por exemplo, um. meio de cultura pode ser suplementado com zinco e 10 n^ol, í' da α n uu ? a Bra uh nneo aprucnt,do^ na HccLí 8 nn? ,« m nível de acordo com qualquer um de Var. 114 a Van 133.

Tabela 8« Modalidades, exemplares de meios de cultura suplementados com zinco e nicotinanuda (vitamma B?l que são úteis para a expressão rle uma proteína ADAMTS 13.

	Pole menus 2 mg/L de mcotmamida	Pelo menos 7 nig/L de nicotinamida	1 .C 0 ? rp L e i ikig/L de mcratamida	Pale mews 3 mg/L, 4 .mg/L. 5 mg/L, 4 mg/L, 7 mg/L, 8 mg/L, 9 mg/L,. 1.0 mg. i . '5 mg.'L' 2(’ mg 1 . uu nnr··; feeotmamida
Pelo menus 2 μΜ Je ZMíiv	Van. 114	Vm. 115	Var. 116	ir
Pcfo jutiu'S 6 μΜ dc Zèmo	Van 118	for MV	Vau. 120	Vac 121.
reme Ύ s.M e 12 μ M de Zinco	Var, 122	fou I.”	foii !.M	vai·. 125
unue 5 sAÍ e '2 μΜ de Zinco	Van 1.26	Wf 12 '	Var. 1:28	for. 129
Pele.1 ? Al. «M. a μΜ, o uM, 7 At P μΜ, !> AL Μ ,ΛΙ Η Al Γ μΜ, 13 μΜ, 14 μΜ. 15 μΜ, 20 μ Μ, 23 <AL U) '.Μ 'Ίί.	Var. 130	Var. 13)	\ ou 132	Vac 133

Van ^: Variação

Vuniajosamtnte* venfícou-se que suplementando um meie de udtraa ter; meof nau «da v cakio. a .unmade e*p<xn\ ? da proteína. AIMAlFsn expressa no meio de culwra é grandemeufc aumentada. Por cowegpimm em uma modalidade, os meios de: cultura flimeeidos neste documento para a. expressão de rena proteína ADAMTS (por exemplo, UHVKl 1} pedem ser sup’emeuiados com nicotina rada (xiumina BD e cálcio. Por exemplo, um meio de cultura pode ser suplementado eom mcotmumídu Mamina Bh e cálcio cm mwis fornecidos na labeh 9. isto é, a um nível de aççrdo com qualquer um de Var. 134 a Var. 149.

a bela 9, Modalidades exemplares de meios de cultura suplementados com raeurè .re ?du (uoimma BD v asseio, cue s.lo ukn< paru a expressàn de uma puucma \|> \XTIS* *

s l Pele nK'ih'.s	Pete menus	Píítre	Peh? menos 3
	2 mgd, de	7 mg/L de	2 rig 1 .	r\: l
j	mectinamida	rkxvhuvnidã	7 mg/L de niretinaivida	4 Uív 1 . ς' ηη. ? . «s Cíg i , nv 1 8 mg L. < n .u·. 1. 10 mgrl, 15 mgZL, 20 mg/1.., OU Síi,H\ uieoúaamma
| Feio mreos 0,5 mM . e e 'k so	Var, 134	W D?	Var, 136	Var. 13 ?
| Pala menos 1,5. Λ [de váldo	Ve i A	Var. 139	Var. 140	Vau ; 41
' n>rc 9 > <. ' p>X1 J.	Var, 142	Var. 143	Var. 144	Var U5
?\Ή n?eras tOj ~nXí, u, mM. v.8 o»ML Έ9 ί'ΛΧ uu mM, U uAk 1.2 srV·, g* :rh M Mi. 1.5 :vV, ‘.6 nAL L7 | mM, IA >rA1 1,9 | mM, 2,0 m\L 2.25 i <Λ1 . ,A| ' 5 M ri) nAl. 'O ?M 4,Q n»M. 4,5 Aí 5,0 ròt eu rnaís	Vrr. 146	Var. 147	Var 14S	Var. 149

Var.^:::: Variação

Em algumas .modalidades* o melo de cultura fornecido pela invenção pode ser fornecido em. um liquido ou uma forma seca ou em pó. O meio pode ser pré~aliquoladu cm uma quantidade adequada para, o uso único, ou fornecido em uma maior quantidade que pode ser usada para mais de um 5 eulfiso de cduhv». Geralmente, o meio da irnençào raui rèrmxtoo de uma forma estéril. Consequentemente* a presente invenção também fornece kits para a expressão ou produção de uma proteína ADAMTS13* os kits uompreenden.do um meio de cultura adequado para a exprc^re de unia, proteína AD.AMTS tendo elevada atividade específica,

IÜ Em. um. aspecto, a presente invenção fornece meios de cultura úteis para a expressão da proteína ADAMTS (por exemplo* ADAMTSI3) com elevadas atividades específicas. Em uma modalidade*, o meio de cultura, contém pelo menos cerca de 2 μΜ. de zinco. Em outra modalidade, o meio de cultura contém entre cerca de 2 μΜ. a cerca «te 12 μΜ de zinco. Em. ainda 15 outra modalidade* o meio de cultura contem pelo menos cerca de 5 μΜ de zinco,: Em uma modalidade* o meio de cultura, content entra cerca de 5 ,μ.Μ a_: cerca de 12 μΜ de zinco. Em outra modalidade* o meio de cultura contém pelo menos cerca de 0*5 mM/de cálcio. Em. ainda outra, modalidade* o meio de cultura, contém entre cerca de 0*5 mM e cerca de .1*5 mM dê cálcio. Em uma 2U mraite Jm.,\ o mere ac eul hu. comem pe <> ete cerei de * >.A1 re / oco e pelo menos cerca de 0.5 mM de cálcio.

m ainua oraras mudabd.rdes, ver· ficou-re qut a 4ci\ãn de nuotimumda (súamíua intensifica ainda mais a expressão e atividade especifica dc proteínas APA.MTS na cultura dc células. Em uma modalidade, 25 o meio dc cultura, compreende ainda pelo menos cerca de 2 mg/L de srèoiiuaunJa {vitamina BM. |>t outra modalidade, o m* ia de crdtara compreende ainda pelo menoc cerca de me, l de nicotinamida outam na B3). Em ainda nutra modalidade, o meio de cultura conténi entre cerea d.e 2 mg c cerca dc 10 mg 1 ce mcetocamde ra Mm jRO.

Em certas modalidades. o meio de cultura e um meio de cultura isento de proteína animal. Em outra modalidade, o meio de cultura e um meio quimreamonte definido. Em certas modalidades, o meio de cultura pode compreender uma ou mais poliaminas. Em uma modalidade particular, a 5 puliamina é a putrescina, por exemplo* com uma concentração de pelo menos u ^s mg I l ia'·'? modmdade c- kt Lm. n roem de „ teni ».o⁴ tem e >0? cerca de 2 mg/L e cerca de 8 mg/L de putresema.

L Meios de -Coitam Isentos de Proteína $001 j Em. certos aspectos, a presente invenção fornece meios 10 de cultura. pàrá a. expressão de uma proteína ADAMTS (por exemplo, ADAAfTSlA), que estão isentos de proteína adicionada exogenamente. ^$íMeÍ.o de cultura isento de proteína e termos relacionados refere-se ao meio, de

i. uh ura que nào apresenta prorema que é da uma fonte exógena ou diferente das células na eufixtra, que naturalmente acolhem proteínas durante o 15 crescimento, Em uma modalidade, um meio de cultura, é fornerado para ã expressão de uma protema ADAMTS (por exemplo, ADAMTS13), que é isento de proteínas' adicionadas exogenameute (isto é, isento: de proteínas) e ê suplementado com. zinco, cálcio, e/ou nicotinamide (vitamina B3). Em certas modalidades, a. meio de cultura, isento de proteína contem, uma poliamina., Por 20 rapto, a uma concentração de pelo menos 2 mgd., ou de ou entro cerca de mg/l. e 30 mg/L, ou de ou entre cerca de 2 mg/L e 8 mg/L. Em uma modalidade eroecrora, a políamina é a putrescimu Exemplos de meios de cultura de ptomnrc b\rv\ sào enduados rats Parente·* 15 6 I ^?:,b/r a 6.936.441, WO 2007/077217, e nas Pufcliçações de Pedidos de Patente LJS 25 números 2008-0009040 e 2007/0212770, cujas descrições são incorporadas neste doeumemo por referência na sua totalidade para todos os fias..

Em uma modalidade, um meio de cultura isento de proteínas que é fornecido para a expressão de uma protema ADAMTS' (por exemplo, ADAM l S > .>) contem pelo menos ou eerca de 2 μΜ de ζιγκό pelo menos ou eej c»í de 5 ,μ.Μ de zinco, de ou cute eerca de 2: μΜ e 12 μΜ de zinco, ou de ou entre cerca de 5 μΜ e 12 μΜ. de zineo. Em ai nda outras modalidades, um írcbi de cuhma M>n> de nreteinas e 'omueiJo para a nxpre^rao de nmi ptetvma ADXMI8 (per vwmp'u, AD \M 18 IB comendo pelo menos on 5 cerca de 3 μΜ, 4 μ.Μ, 5 μΜ, 6 μ.Μ, 7 μΜ, 8 μΜ, 9 μΜ, 10 μΜ, 11 μΜ. 12 μΜ, 13 μΜ, 14 μΜ, 15 μΜ 20 μΜ, 25 μΜ, 30 μΜ, ou mais zinco.

Em outra modalidade, um meio de cultura, isento de proteíuasque é fornecido para a expressão de uma proteína ADAMTS (por exemplo, ADÁMTS13) contêm pelo menos ou cerca de 0,5. mM de cálcio,

10. pelo menos ou cerca de 1,5 mM: de cálcio, ou de ou entre cerca de 0,5 e 1,5 mM. de cálcio, Em ainda, outras modalidades, um meio de eu h ura isento de proteínas d fornecido para a expressão de uma proteína AIMMTS (por exemplo, \D\MT8l ra comem.o pdo menus cerra de Π.6 mM, 0.⁷ mM. 0,8 mM, 0,9 mM, 1,0 mM, 1,1 mM, 1,2. mM, 1,3 mM, 1,4 mM. L5 mM. 1,6 15 mM, 1,7 mM, 1,8 mM. 1.9 mM, 2,0 mM, 2,25 mM, 2,5 mM. 2,75 mM, 3,0 mM, 3,5 4,9 mM. 4,5 mM, 5,0 mM, ou. mais de caldo.

Em ainda outra modalidade, um mefo de cultura isento de proteínas que é fornecido para a expressão de uma proteína ADAMTS (por exemplo, ADAMTS13) contém, pdo menos ou. cerca de 2 mg/L de 20 mconrmrmda (vitamina BSk pelo menos ou cerca de 7 mg/L de uicotinaunde (vhamína B3). cm dc ou entre cerca de 2 mg/L de mculmamida (vitamina B3 r Lm ainda nutras modalidades, um meio dc eduira Mmto de proteínas é foinceufo para ,i exprcsrao da uma pteieini AD\MIS qua exemplo. ADAMTSB) contendo pelo menos ou cerca de 3 mg/L. 4 mg/L. 5 mg/L. 6 25 mg/L . 7 mgd g mg/L. 9 mg/1 . 10 mgd.. 15 aicolinamída mg 1 . 20 mg-L, ou mais (vímnúna B3).

2. Meios de Cultura Isentos de Oligopeptideus

Em certos aspectos, ã presente invenção fornece meios de cultura para a expressão dr uma proteína ADAMTS (por exemplo.

123

ADAMTS13), que são isentas de uligopeptídeos rtolutonados exogenamente. Em uma modalidade, um meia de cultura é fornecido para, a expressão de uma proteína ADAMTS (por exemplo, ADAMTS13), que é isenta de uíigopeptídeos adicionados exogcnamnnte (isto é_s isenta de polípeptídeo) e é 5 '>upk'meíimUa cam .anuo, <èleiu. u ou urcaiinanOda (Mamtou Bb. hn certas mudai idades, o meio de cultura. íseutú de olígopeptídeo contem uma poliamma, Por exemplo, a ama concentração de, pelo menos, 2 mg/L, ou de ou entre cerca de 2 mg/L e .30 mg/L, nu de w entre cerca de 2 mg/L e 8 mg/L. Em uma modalidade específica, a poltamínã é á putrascma. Exemplos: de 10 meios de cultura isentos de ulignpepikleas são ensinados nas Patentes IJS

Números 6.171.825 e 036.44 k WO 2007/077217, e nas F,:bhcaçfe. dá Pedidos de Patente ÜS números 2008/0009040 e 2007/0212770, cujas. de<u\.òus são incorporadas nu^tc documento por referencia na sua totalidade para todos os fins.

Em uma modalidade, um meio de cultura isento de oiigopepudeu que 4 fbrneeidú para a expressão de umá proteína ADAMTS (por exemplo. \D \M 1'5'31 confera pelo munes ou cerca de 2 uM de /irrao. peto menos, ou cerca de 5 μΜ de zinco, ou entre cerca de 2 μΜ e 12 μΜ de zinco, ou de ou entre cerca de 5 μΜ. e 12 ,μΜ de zinco. Em ainda outras modalidades, um meio de euhura Iseteo de ohgupeptídeo e fornueído paru a exprcrcsàu de uma proteína \DAM1S (por exemplo. XDAMlMd) eanteudu pelo munes ou eerca de ' μΜ. 4 μΜ. 5 μΜ. Ο μΜ, 7 ιΛΕ 8 μΜ. 4 _μΜ, ](1 μ.Μ, 11 μΜ, 12 μ.Μ, 13 μΜ, 14 μΜ, 15 μΜ, 20 μΜ, 25 μ.Μ, 30 μΜ, ou mats zinco.

Em outra modalidade, um melo de culmra isento dc ol'uupepuJea cue e toueraue pars a e\p;es<u> Λ -ma noter.'.a \D\MIS (por exemplo, ADAMIS 13) eontém pelo menos ou cerca de 0,5 mM de ,akio. peto mexas ou uraea de i.5 mM de laleun o>, de au entre cerca de 4À e I te mM de caivio. I m amda nutra* modahdades. um mera do cultura Lento dv nlrçopepudeo v formxddo para a cxprcxxlo de w proteína ADAMTS ρχα- exemplo. XDTMlSl B eontcndo pete ’^etO^ on .eov. no no mM, ^fL' nA I. 0*8 mM, 0/) m.M, L0 .fflM, 1.,1 mM. 1.,2 mM , 1,3 mM, 1,4 mM, 1,5 mM, 13 mM, 1,7 mM, 1,8 mM, 1,9 mM, 2,0 mM, 2,25 mM, 2,5 mM, 2,75 5 mM, 3,0 mM, 3,5 mM, 4.() m.M, 4.5 mM. 5,0 mM, ou .mais cálcio..

Em ainda outra modalidade, am mein de cultura isento de ohgopepddeo que é fornecido para, a expressão de uma. protema ADAMTS (por exemplo, ADAM ISM) contem pelo menos ou cerca de 2 mg/L de mcotinamida. (vitamina Bh. pelo menos ou cerca de 7 mg/L de nícotinamida :10 (vitamina. B3), úu de ou entre cerca, de 2 mg/L de nieotínamida (vitamina B3).

Em ainda, outras modalidades, um. meio de cultura Isenta de aligopeptídeo é fornecido para a expressão de uma proteína ADAMTS (por exemplo, ADAM IS1 D contendo pela r.enr., na cerca ee mg I . -t mg 1 * ^s mg 1 . ê m.g/L, 7 m.g/L, 8 mg/L, 9 mg/L, 10 mg/L, 15 mg/L, 20 mg/L, ou mais 15 niçoilnamida. (vitamina B.3),

A Mefos dé Cultura Isentos de Sôro

Em. certos aspectos, a presente invenção fornece meios. de cultura para a expressão de uma protema ADAMI'S (por exemplo. ADAMI'S13.n que são isentos de soro. Em uma modalidade, um meio de 20 echura e fornecido para a expressão de uma proteína ADAMI'S (por excmphs \DAMIM D* o qual e mente d<' rem ache mudo exog.cnatnente ijsm é, isento de aato e o sn-plemcniado com zinco, cálcio, e/ou meotinamida ívmunma B3). Em cenas moualidadcs. *> meio de cultura isento de soro contém uma. poliamma. Por exemplo, a uma concentração de, pelo menos, 2 25 m.g./L, ou de ou entre cerca, de 2 mg/L e 30 mgl, ou de ou entre cerra de 2 ing/.l... e 8 mg/L. Em uma modalidade especifica, a poliamina é a putrefoma. í \cup.m de Cíox dc en^l _e ,}_}ι?α_οχ pj<_n I s

0.1 71,825 c 0,930.44 L WO 20()7O'⁷?217, e na^ Pubueaçoes de Pedidòs de

Patente US ,2008·Ό(Κ)9040 e 2007/0212770, cujas descrições são incorporadas neste documento por referenda .na sua totalidade para todas os fins,

Em uma modalidade, um meio de cultura isento. de: soro que é fornecida para a_: expressão de urna proteína ADAMTS (por exemplo, 5 ro'km pelo mettvx ro ui-j i: 2 uM '\\\) rolo “ cro\ o' cerca de 5 μΜ de zinco, no ou entre cerca de 2 μΜ e 12 μΜ de zinco, ou de ou entre eerca. de 5 μΜ e 12 μΜ. de zinco. Em ainda outras modalidades, um. meio de cultura isento de soro ç fornecida para a expressão de uma prurem r ADAMIS (por exemplo. MIAMI'S 13) contendo pelo meros ou cerca do 3 10 μΜ, 4 μΜ, 5 μ Μ, 6 μΜ, 7 μΜ. 8 μ Μ, 9 μΜ, 10 μΜ, 11 μΜ, 12 μ.Μ. 13 μΜ, 14 μΜ, 15 μΜ, 20 μΜ, 25 μΜ, 30 μΜ, ou mais zinco.

Fm outra moduhdude. ura meio dt cultura isenm de soro <. < <. < fornecido para a expressão de uma proteína ADAMTS (por exemplo, ADAMTS13) contém pelo menos ou cerca de 0,5 mM de cálcio, pelo menos 15 ou cerca de 1,5 mM de caldo, ou de ou entre cerca de 0.5 e 1.5 mM. de cálcio.

I tn fenda outra* credulidades, um mere de culatra Acato de soro e rèttrecnia pata a vxprcusào de utrat rrotema ADWIIS (put excmpfo. \D\MIMD contends pvlo arenas ou cerca dv 0/> mM, 0,? mM. mtS mM. 0,u ,;AI. 1,0 mM, 1,1 m.M, 1,2 mM, 1,3 mM, 1,4 mM, 1,5 mM, 1,6 mM, 1,7 mM, 1,8 mM, 20 1,9 mM, 2.0 mM, 2,25 mM, 2,5 mM. 2.75 mM. 3,0 mM. 3,5 mMI, 4,0 mM,

4,5 mM,. 5,0 mM, ou mais de cálcio.

Em ainda outra modalidade, um meio de eulíura isento de soro que é fornecido para a expressão de urna protelou ADAMf^ tpor exemplo. ADAMTS .13) cóntóm. pelo menus au cerca de 2 mg/L de .ninei mamída 25 (vitamin < Β>κ rolo menos eu cerca de 7 mg/p de nteotinamida (vitamina B3). cê <.» e >t , cc.'-t d- 2 utg I <\ ro*. '»'uda (\ iratrex, OU ( — . q. outras modalidades, um me,io dc .cultura, isento de soro é fornecida para a expre.-fefo de uma protema \D \\1 i'x (pot exemp m Al > \M IS l ' t , eracmto

126 pelo menos ou cerca de 3 mg/L, 4 mg/L, 5 íhg/L, 6 mg<. , 7 mg/L, 8 mg/L, 9 mg/L, .10 mg/L, 15 mcntlnamida mg/L, 20 mg/L, ou mais (vitamina.B3).

4x Meios de Cultura Isentos de Proteína Animal

Em certos aspectos, a presente invenção fornece meios de 5 caleira para a expressão de uma proteína ADAMTS (por exemplo, ADAMTS13), que são isentos de proteína animal Em uma modalidade, um meio de cultura é fornecido para a: expressão de uma proteína ADAMTS (por exemplo, ADAM ISBt que a isenta padpeptídeos ou proteínas animais exogeftamente adicionádos (isto e, isenta de protema animal) e é .10 suplementada com zinco, caldo, edm nicotmamida. (vitamina B3). Em. certas modalidades, o meio de cultura Isento de proteína animal eontóm. uma políamina. Por exemplo, uma concentração de, pelo menos, 2 mg/L, ou de ou entre cerca, de 2 mg/L e 30 mg/L, ou de ou entre cerca de 2 mg/L e 8 mg/L. Em uma modalidade específica, a poliamma é a putreseina. Gs meios de 15 cultura isentos de proteínas animais são ensinados nas Patentes US 6.1,71.823 e 6.936.441, WO 2007/077217, e nas Publicações de Pedidas de Patente US 2Ô08/00()9Ü40 e 2007/0212770, cujas descrições sao incorporada neste documento por referência na sua totalidade para todos o.«> fins.

Em uma modalidade, um meia de cultura isento de proteína 20 animal que è fornecido para á expressão de uma proteína ADAMTS (por exemplo. ADAMI SI H contem pulo menos ou cerca de 2 μΜ dc zinco peh> menos ou cerca de 5 μΜ de zinco, nu ou entre cerca de 2 pM e 12 pM de zinco, ou de ou entre cerca de 5 μΜ. e 1.2 μΜ zinco. Em ainda outras modalidades., um meio de cultura isento de proteína animai d fornecido para a 25 e\pre>Mo de umu. proteína .ADAMIS (pm exemplo. A1)AMIS131 contendo pelo menos ou cerca de 3 p\l 4 μΜ, 5 μΜ, 6 μΜ, 7 μΜ, 8 μΜ, 9 μΜ, .1.0 μ.Μ, 11 μΜ, 12 μΜ, 13 μΜ. 14 μΜ, 15 μΜ, 20 μΜ, 25 μΜ, 30 μΜ, arais zinco.

·7·7 .1 Α· ?

Em outra modalidade, um meio de cultura isentó de proteína animal que é fornecido para a expressão de uma proteína ADAMTS (por c\v'rapra, ADAMTS13) contém pelo menos ou cerca de 0,5 mM de cákM pelo menos ou cerca de 1,5 mM de cálcio, ou de ou entre cerca de 0,5 e L5 5 mM de cálcio. Em arada oraras niodalídades, um meio dc cultura isento de_: prorcraa animal è fornecido para í expressão de uma nroscma \DAMTS (por exemplo, ADAMTS13) contendo pelo menos ou cerca de 0.6 mM, 0,7 mM, 0,8 mM, 0.9 mM, 1,0 mM, 1,1 mM, 1,2 mM, 1,3 mM. 1,4 mM, 1.5 mM, 1,6 mM, 1,7 mM, 1,8 mM, 1,9 mM, 2,0 mM, 2,25 mM, 2,5 mM, 2,75 mM, 3,0 10 mM, 3,5 mM, 4,0 mM. 4,5 mM, 5,0 mM, ou mais de cálcio.

Em amda outra modalidade, um meio de cultura isento de proteína animal que é fornecido para a. expressão de uma proteína ADAMTS rpar exemplo. ADXMfSLM comeu; pJo ineuox ou cerca de 2 '?’g l de mcutínamidá (vitamina B3), pelo menos ou cerca de 7 mgZL de mcotinamida 15 ra ilumina S3), ou de ou entre cerca de 2 mg/i. de nivoúnannda t \ itamina B3). Em ainda outras modalidades, um melo de cultura isento de proteína animal é tòmccido para a expressão de. uma proteína ADAMTS ípor exemplo. AD.AMTSIM contendo pelo menos ou cerca de 3 mg/L, 4 mg/L, 5 mg L, 6 mg/L, 7 mg/L, 8 mg/L, 9 mg/L, 10 rngZL, 15 mcutinamida mg/L, 20 mg/L, ou 20 arais i\ itranina 133 r

V. Purificação de Proteína ADAMTS

AD.A.M Í SI3 é seeretada no plasma ò? m^s<>, onde ela funciona para regular u aüvidade de eoagulação por divagem de muitiineros grandes de vWE. A capacidade das células de mamíferos para, secretar .ADAMTS 13 25 apax expressão podv sra explorada dm.mte a pioduçào c puHfkdçào de composições de ADAMI'S 13 em. cultura de células. Por exemplo, pela expressão de AD.ÁK4TS13 recombinante em culturas de células de mamiíenx as compodçòx*' de ADAMI'S 1.3 podem, ser prontamente recuperadas direi.unenu' a parnr do Sabreuadume do eulmra, rem a necessidade de colher e

128 lísar as células. Isto permite o mo de técnicas tais cerno a cultivo çtmímno de tanta (pos exemplo uãtura de tanta pinuoAm ou perfosta) para puxhom grandes quantidades da proteína sem períodos de recuperação: e retards.> de cultura múltipla. Em um aspecto da invenção, são fornecidos 5 métodos para a purificação de protemaa ADAMTS tendo etaada -urathde específica a partir da catara de células.

Consequentemente, em uma modalidade, as proteínas ADAMTS..13 são expressas em. cultura e recuperadas dsrommerae a. partir do subrenadante da cultura. Desta maneira,. Pus proteínas ADAMTS13 são 10 recuperadas através da remoção de uma fração da cultura e purificação de ADA.MTS13 longe dos outros componentes do sobrenadante. Çeralmente,. isto envolve a separação de quaisquer células que são recuperadas juntamente com o sobrenadante pela filtraçào ou cem ri fugação e submetendo o subrenadame a uma ou mai> etapas de purificação de \DA\1 f S13.

I S X Publicação dc Pedhio de Patente ita l $ Btatotatêãn e

Zheng er η/., 0)01, ./tara./, 98:1662-1 uObi, vuias dix uht.dçoe são incorporadas neste documento por referência na sua totalidade para todos os fins, fornece métecta exemplares para a purificação de ADAMTS13, ADAMI'S LI purificada ps me ser formulada de acordo com o> métodos 20 convencionais e usada terapcuticamerüe, por exemplo, para tratar TTP.

Em um uspecie, u presente invenção fornece métodos para produzir uma composição do protema ADXMIS tpor exemplo, uma composição de ADAMTS13). Em uma primeira modalidade, o método compreende as etapas de: (a) cultivar uma célula que abriga um ácido 25 nudeico que codifica uma proteína ADAMTS em ura meio de cultura isento ue ptosema animal, tb) raimoeí am>.> k-çào do sohxmadarae d,i cterara. pD realizar unia etapa, de filtraçào ou centrifiigação para remover quaisquer Células oteduaM (d) realizar uma etapa Je ullrafiltraçao para concentrar a proteína ÁDAMTS, e (e) realizar uma etapa de diafiltração com um tampão

129 compreendendo peto menos cerca de 0,5 μΜ de zmco e peto menos cerca de 0J mM de eátoo: p?cp,mmdo assim uma o<>mp<.uiçào de ADAM I S.

Em eertas modalidades, a etapa de cultivo de célula de mm célula compreende o cultivo de células em batelada. Em. outras modalidades, 5 u etapa de eulró o dv uma <v'uU compreende o λ. ulUx <5 continuo de cehras.

Fm cena> modalidades. o meio de cultura comem cálcio. Fm uma modalidade específica, o meio de ciíltura contém, peto menos, 0,5 mM de cálcio. Em outras modahdadro. o meio de cultura contém zinco. Em uma modalidade específica, o meio de cultura contém, pela menos, 2 pM de zinco.

l m ainda outras mndshdudcs, o meio de euhuia comem ntcotm.muda uEurina BQ. Fm uma trod,díd,tot V'proHlro, »· turno rò ,iiimra comenv pelo menos ' mg l de mcotmamida (\itammu BE. I m cenas modalidades, o tampão de diafiitração contem pelo meros cerca de 5 μΜ de zinco e pelo menos cerca de 2 mM de cálcio.

1.5 Em certas modalidades, menos que cerca de 20% da atividade e [iu k ' de ADAM 1 SI 3- é perdida entre p final da empa (c) e o fetal da etapa (e). Em outras modalidades, menos que cerca. de 10% da atividade específica, de ADAMT813 é perdida entre o finai da etapa (c) e o final da eteot era. 1 m muda omn>> mod.didudcs a composição de ADAMI Si' tem 20 uma atividade específica de pelo menos cerca de 1000 ll/mg. Em outra modalidade, a composição de ADAM ISH tem uma afivtdade específica de pelo menos èerca de 15Ô0 'Ü/mg.

A. Troca dc Tampão

Tipicamente, ao purificar uma proteína, secretada a partir de 25 uni aobrenadante de cultura, a primeira, etapa, do processo de purificação envolve a troça da meio de cuhura para uma solução tamprmada, o que facilita a purificação adicional da proteína de interesse. Existem várias opções para a troca de melo de cultura por um tampão, incluindo, sem limitação, técnicas de diaflltraçao, diálíse, trocas de: tampão, filtraçãu em gel, uromatografia, e semelhàtíteq,:

Wrifieourae que as composições de proteína ADÁ.MTS13 perderam uma fração significativa da sua atividade específica durante as tais 5 otep.ro de punòcaçàv ran n'qmacm. a introdução de *ímos rampdxra p<x exemplo, etapas de diafiltração, díálrse, troca de tampão, cromatografia e semelhantes, independentemente da duração do tempo entre a colheita do sobrenadante da cultura e da etapa de .punfieução Vantaiosamente, no entanto, os presentes inventores verificaram que, mctoíúdo zinco e cálcio no 1.0 tampão a ser intouluzidu no sistema, tal como nas euqvro de diafiltração, diálise, troca de tampão, filtraçao em gel, e cromaug ra m us, as atividades específicas elevadas da composição de ADAMTS 1.3 são mantidas. Como exidèneia disto. o Exemplo 6 demonstra que a díaühração de uma composição de ADAMTS13 eom um tampão sem uálufo e zinco resulta falta 15 em uma perda média de cerca de 25% da atividade especifica da composição, embora, à mcluròu de cálcio e de zinco quase inteiramente evite esta perda (Tabela 22). Consequentemente, a presente invenção fornece métodos para ícduzü a perda de atis idade para composições de proteraa \D\MIS .rpo^ Jtefdiraçào. ou métodos ^meluntes. por cwmpU». duuiro. ‘tou de tae pão, 20 ennnatografía, pela inclusão de zinco e cálefo no sistema tampão.

Em uma modalidade, é fornecido um método para a purificação ue uma composição de proteína ADAMF^ qua exemplo, ADAMI'S 13), o método compreendendo as etapas de (a) cultivar uma célula que abriga um. ácido nudeico que codifica uma proteína ADAMTS (por 25 exemplo, M) \M I S13) em um meu* òe <. uhura, t b} ix-eupvrar uma poiçâo Uo soheuaJante de meio de cultura comando umy pivtcma \DVMiS tpur exemplo, ADAM I'S]3), e (c) trocar o sobrenadaute do meio de cultura por '.mn '>x‘hjç.)o famp<díia contendo zimo e <Ecio, preparando ra-ram rans composição de proteína .ADAMTS (por exemplo, ADAMTS 13). Em uma modalidade, o meio de cultura contém cálcio, zinco e, opcionalmente, nicotinamide (vitmnma B3). Em num modalidade preferida, a etapa de cultivar uma célula compreende um. cultivo .contínuo (por exemplo, cultura químiostâtlca. nu perfusão). Em outra: modalidade preferida, o cultivo é 5 ouinudo a umu tcmpviatuui ecoe '1 '(.' c > (\ Em arada rama moddidude proferida, o euhixo imunído a pl l entre e V*>

Em uma modalidade específica, a eutpa de <nws do snbrenadante do meio de cultura com uma solução tamponadu compreende o uso de um tampan contendo, pelo menos, ou cerca de 0,5 mM dc cálcio e pelo 10 menos ou cerca de 0,5 pM de zinco. Em noutra modalidade, o tampão cordém pelo menos ou ,ena de 2 mM' de calcic e pelo menos ou cerca de 5 μΜ de zinco. Iim certas modalidades, a concentração de cálcio pode ser pelo menus cerca de 0,1 mM, 0,3 mM, 0,5 mM, 0,75 mM, 1 mM, 1,5 mM» 2 mM, 3 mM, 5 mM ou. mais de cálcio.. Em certas modalidades, a concentração de zinco 15 pode ser de pelo menoa cerca de 0,5 μΜ, 1 pM, 2 pM, 3 pM, 5 μΜ, 10 μΜ nu mais de zinco. Geralmente. qualquer combinação das oaaeentraçaes acima e adequada paro us<.> raw prerenic - nu rodoEm uma modalidade, é fornecido um rectovo para a troca de tampas de uma composição de proteína ADAMTS (por exemplo, 20 AOWHSl '1 p'du eab/uçào da troca de I na pão (pro exemplo, dia 'do ação diálíse, filiração em gel, etc.), com um tampão contendo cakio e zinco. Em uma modalidade específica, o método compreende o uso de um tampão contendo pelo menos ou cerca de 0,5 mM. de cálcio e pelo menos ou cerca de 0,5 μΜ de zinco. Em outra modalidade, o tampão contém pelo menos ou 25 cerna de I mM de cálcio e pelo menos nu cerca de 1 pM. de zinco. Em uma modalidade, o tampão contém, pelo menos ou cerca de 2 mM de cálcio e pelo menos ou cerca de 2 μ.Μ de zinco. Em outra modalidade, o tampan contém pelo menos ou cerca de 2 mM de cálcio e pelo menos nu cerca de 5 pM de zinco. Em. ainda outras modalidades, o tampan contém entra 0,5 mM e 5 .mM de cálcio e entre 0,5 μΜ e 5 μΜ de zinco. Em certas modalidades, á concentração de cálcio pode ser pelo menos cerca de 0,1 .mM, 0,3 mM, 0,5 mM, 0,75 mM, 1. mM, 15 mM, 2 mM, 3 mM 5 mM nu mais cálcio. Em certas modahdades^ a. concentração de zinca pode ser de pelo menus cerca de 5 0,5 p.M, 1 μΜ, 2 μΜ, 3 μΜ, 5 μΜ, 10 pM. ou mais dv /«.vu. Γ'.η uma modalidade determinada, da. uolhcim. o sobrenadante isento de edukis ou o tampão de díafihraçàu contém as combinaçòvs de cálcio e zinco nas concernmçòss acima mencionadas.

Em outra modalidade, nm melado é foniraído para a 1.0 estabilização da aioidade ea/imraíc.i de mus ptxuema ADAMIS urnr exemplo. ADAM i S P i apee expressão em raJiura de erécbs compreendendo supleinentação da célula contendo a colheita, o sóbrenadante isento de células ou um tampão de diafdtraçuo usado para concentrar ou para trocar tampão de uma solução de ADAMIS com cálcio e zinco. Em uma modalidade .15 específica, o método compreende n uso de um tampão contendo, pelo menos, ou cerca de 0.5 mM de cálcio e pelo menos ou cerca de 0,5 μΜ de zinco. Em outra modalidade, o tampão contém pelo menos ou cerca de 2 mM de câfcio e pelo menos ou cerca de 5 pM de ztre» Em kvrrv mo»k kkarax a concentração de cálcio pode ser peiò menos eereã de 0, l mM, 0,3 mM, (05 20 m.M, 0,75 mM, 1 mM, 1.5 mM. 2 mM, 3 m.M, 5 mM ou mais de eálcio. Em cerras modalidades, a concentração de zinco pode ser de pelo menos cerca de 0,5 μΜ, 1 p.M, 2 μΜ, 3 pM, 5 pM, 10 μΜ. ou mais: de zinco.. Em uma modalidade: determinada da colheita, o sobrenadante. isento de células ou o tampão de díafiltração contém as eombinaçoes de cálcio e zinco nas 25 concentrações acima, mencionadas.

Em outras modalidades, os métodos fornecidos neste documento resultam: ern uma perda de menos que 15% da mividadc específica presente durante qualquer etapa individual l-.m uma. modalidade preferida, os mvuxfes tonraeidos orate documento rreuram em unu perda de menos ene

J 33

10% da atividade espec-ifiea após, presente durante qualquer etapa individual. Em uma modalidade particular,., menos que 15% da atividade específica presente no sobrenadante da. culíura recuperada é perdida durante uma etapa inicial de troca de tampão (por exemplo, diafiltraçãn ou díáfise). Em uma 5 modalidade preferida, menos que 10% da atividade específica presente no robrenadante da cultura recuperado é perdida durante uma etapa inicial de troca de tampão (por exemplo, diafíltração ou de diáiise).

B. Cramatografia

Em certas modalidades, a composição de proteína ADAMTS 10 (por exemplo. ADAMTS13) é adicionalmente enriquecida por uma ou mais etapas crornatográficas. Em uma modalidade, é fornecido um método para fornecer uma composição de proteína. ADAMTS enriquecida (por exemplo, ADAMTS.13), o método eompreendendo· as. etapas de (a.) euhJvar uma célula que afeita um arado nmScko que codifica unw protema ADAMTS (por 15 exemplo, ADAMTS 13) em um. meio, de cultura ri?) recuperar uma porção do sobrenadante do meio de cultura contendo uma proteína ADAMTS (por exemplo, ADAMTS13), (c) trocar o sobrenadame do meio de cultura com uma solução tamponade contendo zinco e cálcio, para formar uma primeira composição de proteína ADAMTS (por exemplo, ADAMTS 13), e (d) enriquecei ainda m.u >. a proema \I JAM 1S «por ex empire \ΙΉΜ lS A? cvm uma etapa, de uosmatografia, fornecendo assim uma composição de \D AXÍ l\ enriqueçais (por exemplo. ADXMl'SBP I m <mra moda'udadc. «> mem de cultura contém cálcio, zinco e, opcíonalmentc, nicotinamide (vitamina B3)< Em nma. modalidade preferida, a etapa de cultivo de uma célula compreende um. cultivo contínuo (por exemplo, cultura, quimioslátiea ou per fusão). Em outra modalidade preferida, o cultivo é mantido a uma temperatura entre 3-V C e x (' I m anfea o,are modal Cade pretenda o eu riu< u '^f-amidc a um pH emre 6,9 c 7.2.

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Em ama modalidade especifica, a etapa de troca do sobrenadaníe do meio de cultura com uma solução iamponadá efou a etapa cro-nata*·? jficu «'ompievnde o oro de Ltn tampão komerdo. pelo mean,, on cerca de 0*5 mM de cálcio e pelo menos ou cerca de 0,5 pM de zinco. Em 5 uma modalidade preferida, ambas as etapas < empreendem o uso de tampões que contêm pelo menos ou cerca de 0,5 mM de euleio e pelo menos ou cerca, de 0,5 uM de zinco. Em. uma outra modalidade, o tampão contém: pelo menos ou cerca de 2 mM de cálcio e pelo menos ou cerca de 5 pM. de zmeo. Em certas modalidades, a eoneentraçao de cálcio pode ser pelo menos: cerca de 10 0..I mM. IV rAl. (q5 mM. 0.75 mM, 1 mM, 1,3 mM, 2 m.M, 3 m M. 5 mM ou mais de c òc;o 1 m certas modalidades, a concentração de zinco pode ser de pelo menos cerca, de 0,5 μΜ, I μΜ, 2 uM. 3 pM, 5 pM, 10 pM ou mais de zinco. Gsralmente, qualquer combinação das < ozccnttações acima é adequada paro uso nos presentes métodos,

Em uma modalidade, é fornecido um método para a matiutençao da atividade específica de uma composição de proteína AI) \M IS rpor exemplo. .-W.AM 131 M durauie uma mapa de comum'prafut, suplementando eus) tampão(ões) usado na etapa de cromatografia, com zinco e e.ucm·. I m um.t tnodaudade trap mfica. o mel· toa compreende u uso de um 20 tampão contendo p<lo nanas ou xcrea de U 5 mM de cukiu c neh> menoK ou cerca de 05 μΜ zinco.. E:m outra modalidade, o tampão contêm pelo menos ou cerca de 2 mM de cálcio e pelo menos ou cerca de 5 pM da zinco. Em cenas modabdjdv.x. a concentração de eeklo pode ^er pefo munas evtea du 0,1 mM, 0,3 mM, 0,5 mM, 0,75 mM, 1 mM, 1,5 mM, 2 mM_:* 3 mM, 5 mM ou 25 mais de cálcio.. Em certas modalidades, .a concentração de zinco pode ser de pelo menos cerca de 0,5 μΜ, I pM, 2. μΜ, 3 μΜ, S pM, 10 μΜ ou mais de zinco. Gcràlmcnte. quaknns cumumaç.lu das concemmçòes a<inra c adequada paro uso nos presentes melados.

Exemplos nào íimramtus técnicas cromalogrâ ficas que pxcem \cí '. Mtos f.ec pumu.u uma eompo< uso de p'.otepn \D\M IS (pos exemplo, uma eompus^ào de ADXMISCÀ incluem eromatografh de tona amòmca iALO. eromakganfia de troca eatíóe e í k I Cl trumamprafia de 5' troça h;dr< dbNca (HICK eromarom afia de hidroxiapMita (HAF), eromatogrefía de imtmoafimdade, cromatografia. de exclusão de tamanho (isto é, fíltraçào em gel), eu outra etapa cromatográSca, adequada. As etapas eroniatograficus podem ser realizadas em modo de bãteladauu de colima. Em certas modalidades, os tamppes usados para realizar qualquer uma destas 10 técnicas cromatogràficas irão induír zinco e cálcio. Em uma. modalidade: específica, o método compreende o uso de um tampão contendo, pelo menos, o·: cerca de ü,5 mM de caldo e pem meno^ ou cerca de 0 5 p.M de cinco Em outra modalidade, o tampão contem pdo menos ou cctca de 5 mM de cakto e peto m_nu< ou ccret de 5 uM d< zinco im certas modalidades. a 15 concentração de cálcio pode ser pelo menos cerca de 0,1 mM, 0,3 m.M, 0,5 mM, 0,75 mM, 1 raM. 1.5 mM, 2 mM, 3 mM, 5 mM ou mais de cálcio. Em certas modalidades, a concentração de zinco pode ser de pelo menos cerca de 0,5 μ.Μ, 1 p,M, 2 μΜ, 3 μΜ, 5 μΜ, 10 μΜ ou mais de zinco. Geralmente, qualquer combinação das concentraçòes acima é adequada paro uso nos 20 'xescutes métodos.

Qualquer resina de troca auíonlea adequada pode ser usada nos métodos fornecidos nc^te ducunicnto, bxempio« ano límhantes du resinas de troca aniòjüea adequadas para uso incluem, resinas de díetilaminoetil (DEAE), am.iúóetí.1 quaternário (QAE) e arnõnio quaternário (Q),

Qwnquvi icsma de troca c.niômca udequadLs pode <er usada nos métodos fornecidos neste documento. Exemplos não limltantes de resinas de iroro <. luoraca ..dequ idus p«t t um mJuem rcmU de cmboM - eul d Ml Nulfopiupdo {SPr metd eadlmuo (SI

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QuaMict 'vntv uc noes i\' htdfoxiapauu adequada u\ outre leGua Inreenda em cáteto podu sre* usudu mu mutoxios torneredo^ ncue documento. I xcmples njn limitantes? de resiuas adequadas incluem resmas de hidroxlapatita, resinas: de fluorapstita, resinas flnnrhidroxiapatita, e 5 semelhantes,.

tfojqtict resina de eromatçgrafe de interação: hidrofóhiea adequada pode ser usada nos métodos fornecidos neste documento. Exemples não hmítantes de resinas adequadas incluem resinas femliuss, resinas metídcas. resines butílícas. resinas octíHcss. e semelhantes.

Fm cenas modalidades, uma proteína ADAMTM3 (por exemplo, AH AMIME pode ser adicionalrnente enriquecida por cromatografia de imunoafeidade, por exemplo, com. resinas conjugadas a um anticorpo, aptâmero, ou outras moléculas de ligação altamente espeeíleaa para a. proteína ADAM.TS13 {por exemplo, ADAMTS13).

Em uma modalidade, o método para, reduzir a perda de atixidade de ADAMIS resulta cm uma perda líquida de menus que 20%' durante qualquer etapa individual incluindo, mas não limitada a, troca de uunpao, dmhitraejo. diálísc. uitraçào em gel, troe. avrau crum.-augratia. ernruamçratre de uiinídude. ramubhraçâv. uhroOhiaçutk filuaçàu esterih e 20 remelhames. Fm «mtras modalidades, os métodos toiuccídus ncue documento resultam em uma perda, de menos que 15% da atividade uspçcí&a presente dm rate qadqee: et. pu rahx u kJ I m .i ^x<a muAdídud? ptefet d>u 0' lueteuus foniecidos neste documento resultam em uma perda de menos que 1036 da attxuhdv espcculca epos ptuwnte durante qualquer empa iadú idu.il. I m uma 2n modalidade particular, menos que 15% da atividade especifica presente no \<>b resma tc d' re * > . n\ pre.ca c rcu' < ι <«r v rc a et | ? » » i.d do troca de tampão (por exemplo, dtafíkração ou diàlíse). Em uma modalidade preterida, mreios que 10% da atividade específica presente no :sobrenadante da cultura recuperado é perdida durante uma etapa inicial de troca. de tampão (por exemplo, diariltração ou diãiise),

C Imrôvaçãò e/ou Remoção Viral

Em. certas modalidades, os métodos fornecidos neste documento para a preparação de ema composição de MWMIS ípoi exemplo, \PA\11 SBi rao ataco .onda uvlo íhor» uma ctap.> de m,aoa\ào ou remoção viral,. Em certas modalidades, os métodos fornecidos neste documento incluirão pelo menos duax ou pólo menos três, etapas de . ntueçàa oe remoção x ’ I xenipto mo temta de etapa\ de matou; ao 10 ou remoção viral que pódem ser empregados com os métodos fornecidos neste documento incluem tratamento com detergente solvente (Horowitz to ta, Bfoori twgfo Ffouritorau 1994 (5 Supp! 3ES2DS28 e Kreil to to., 7 reu/ma-n 2D»> (dHPdm prefo divulgações dos quais sendo expressamente incorporadas neste documento por referência em sua totalidade 15 para todos os fms), nanufetração (Haniamoto to ta, Fox foreg 1989 (56)23023o e Yuasa ez to ..7 Den Jrito P‘H t /2 <pi 80:2021 -2024. e-Jas Jesraíçòes too exnrcssameme mcre.praaeku :x^e doca:-emo pre references πα eua totalidade para todos os uns). Em. uma modalidade preferida, a presente mvençâo fornece xnctoüos para a preparação de uma composição de 20 APXM IS ipor cxcmpbv ADAMTS 1 3) compreendendo d tratamento com dcturvculc whente e de nannHItraçào,

Em uma modalidade, è fornecido um atando para fornecer uma composição de proteína ADAMIS viralrneme segura (por exempkv AD'WirSLM, <> método compreendendo as vt.rpas de (ai euhixar uma retold .25 que abriga am ácido nndeíco que .codiGea uma proteína ADAMTS (por exemplo, ADAMTS 13} cm um meio de cultura; (b) recuperar anta porção do sobrenadante do meio de cultura comendo uma proteína .ADAMTS ipor exemplo, A.DÀ.MVSLH, íc) trocar o sobrenadaate d:o meio de cultura comuma sMutao temporada contendo smeo e vralei-c para forma- umu primeira compouçào de proteína ADAMIS tpo? exewnku a. \DMHSr-ri. Ari opeionalmentc. enriquecer ainda a proteína ADAMTS (por exemplo, ADAM'1 Siri com uma etapa de cromaíografía, e (e) realizar peto menos uma etapa de imtiv&çfe ou remoção viral fernecendo assim uma composição de 5 \l· Wlk Mralraemc seg ra tpe; cv.mpk», ADXMfSl >1 l a? am><

ngrilai made. o meio de cultua, címk-m culcn*. Gave e opcionabne??tc. mcotáumklí Pvnamína B3) Γ??? rena modalidade preferida, a mapa de euhoo da tinu célula compreende em radiou craumuo tpor exemplo. c??h?\o quimiostático <m periusãM, Em outra modalidade preferida, o cultivo é 10 mantido a uma temperatura entre 34^C>C e 37°C. Em ainda outra modalidade preferida, o echo o é ntantido a um pH entre O e 7,2. Em uma modalidade, a etapa de remoção de virus é nanollllração.

L JTrufemento com Solvente Detergente (S/D)

A rim de ínaMar vários comanrinantcs víraís que podem estar 15 presentes na cultura de ADAMTS, uma ou mais soluçõe\ intermediárias de ADAMTS (por exemplo, ADAM IM ri podem ser submetidas a um tratmneiito com solvente detergente (S/D)> Métodos para o tratamento còm detergente de soluções sfio bem conhecidos na técnica (para, revisão ver, Pelletier JF et ul, ferí few .fes C& /feamufe 2006;! 9(1 E205M2, a 2E dhulgaçào do qual sendo expressa? nenle incorporada neste d<reuemnto por referência na sua totalidade para todos os rins). Geralmente, qualquer tratamento S/D padstão pode ser usado èm οόη)ηηίο eom. os métodos, fornecidos neste documento. For exemplo, um protocolo exemplar para um tratamento SZD é fenecido abaixo.

Em. uma modalidade, Trium X-100, Twecn-20, e tri (nfeutli) fefeo { Γ\ΒΜ são .tekréniaUus a ???n ? \ofeâo rnt, m?efeü?a XDAMIS gvr cxcmplx \D\M1M D eni ^urecnu.jçòex fmres ec ou coca Λ ',0' u. 0 > ri e dfe \ ’c^pcei rare ?te \ n v ra rauão .gvxxl a uma e^poraor? <.v nj entre cerca de ?S' c ? v c pm pelo recuos cende rena hora.

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2, Naôófiitraçio e UMra/DiaffltraeSo

A fím de reduzir a carga viral de uma composição de: proteína ADAMIS (pre exemplo, AIMMTS13) fornecida neste doeumento, a composição pode ser nanofiltrada usando um dispositivo de naúofíltração 5 adequado. Em certas modalidades, o dispositivo de nasudiltmçno terá um tamanho de poro médio ds ou entre cerca de. 15 n® e 200 um. Exemplos .de uanofiltrus adequados para, esto uso incluem, sem limitação, DVD, DV 50, DV 20 (Pali), Viresolve NFP* Vlrcsohc NbR^k (Millipore), Planová* W, 2”V c 7S\' (Pka₅o\d) 1 m una nmròródaJc c^pcertEa, o uauofJtro 10 pode ter um tamanho de poro médio de ou entre cerca de 15 e 72 um, ou. de ou entre cerca de 19 e 35 um, ou de ou. cerca de 15 um, 19 nm, 20 um, 35 a®, ou 72 nm. Em uma modalidade preferida, o nano filtro terá um tamanho médio de poro de ou cerca de 19 nm, 20 a®, ou 35 um, tais como um filtro Asahi PI ΧΝΌΧ'Λ 20X ou PI A\ü\.\' D \oi. um seu rouhakmtc.

Subsequcmtc a nanollitração. o filtrado pode, opcíonalmente, ser cojKvUUado pur uhradhraçào e mi a c^uquroçàu C.o templo j|H,audd pot dijnhnuão. Em certas mndahduckò. a ultraiiln içao e mnrqwiada em um cassete com uma teia de canal aberto e a membrana de uluaiiltiaçâo tem um. puro molécula? ítommal de corte AMWEO) de rncims que e<, <ercd ue Π5 20 kDa ou menos quv de ou eerea de 170. 160. 150. 140, 130, 120, 110, 100 mg 7?\ w?, ?o_A 4?a *0. ou menor kDa. Em uma umduhdadr ptefcnua a membrana de ultrailhração tem um NMWCO de nau nsaE que 30 kDa Em out? a modalidade profunda, a membrana de uhratihracào tem um SMWlX) de não mais que 30 kl>a.

3» Tratamento Térmkm e Liofílízaçâo

Em ainda outras modalidades, a atividade viral de uma <.-ompn\içâ<.> de proteína ADAMTS 13 iiofilízada (por exemplo, ADAMTS 13), que pode ter sido previamente submetuii a ciaras etapas de ircfovação ou. remoção viral, tais como nanofikração, pode ser ainda reais reduzida pelo

140 tratamento térmico da composição liufilinada, Os tratamentos térmicòs para a reativação de cargas vírais nos fatores de sangue são bent conhecidos na tccreca (por exemplo, ver, Piszkiewícz te o£, Thrwti? fen 1987 Jul 15:'*~a2):235-41; Piszkíewicz te «/., Carr Stud Zfe/naréd Bfoori Transfos.

:1989;(S6P44«^4: Epstem e Fríçke, rirefi /fofool £u6 Mcd» 1900

MmJ I4i 3MforeO}.

VI_t Composições de ADAMTS

Vantajosamente,. verificou-se que as proteínas AD XM IS. tais como ADAMIS 13, expressas em culturas de células suplementadas com 10 zinco, cálcio, e/ou nicotinaatida (vitamina B3) tiveram as atividades ©spec uivas inesperadamente elevadas. Tal como fornecido neste documento, foram desenvolvidos métodos para a recuperação e expressão ermtínua de tais proteínas ADAMTS com elevadas <ní\idades específicas. Por exemplo, os métodos de cultura de células contínuas fornecidos neste documento 15 permitem a expressão de maís que 1 mg de ADAMTS 13 por litro por dia, cem atividade*' específicas de mais que HMD 1 mg para mais de uma semana ou mais, Do mesmo modo, os métodos para reduzir a perda de atividade tipicamente encontrada durante a purificação de proteína de ADAM TS13 são também fivrneeidos neste documento, ( Tmscquenk-m<nte, em um aspecto, a presente invenção toruecc composições Je prateara \D\Ml'S ipra example, composições de \DAM IS! G expressas cm cuhma de células de acordo <om os métodos fornecidos neste documento. Por exemplo, as composições de proteínas .ADAMIS sào fornecidas, cm que a prouína e ex-vosa pelo cultiva de nma 25 célula que abriga um ácido nucleíco que codifica uma proteína ADAMIS em meio de euhura suplementado com pulo menos um componente selecionado UentiO cu.m* ^f\m c nnotmnmda u^nrin ía ’’bem sàu ’oinukfo composições dc protema ADAMTS (por exemplo, composições de ADAMTS 13) que são purificadas de acordo com um método fornecido neste

1.41 documenta Por exemplo, as composições de proteínas ADAMTS são fomeeidas as quais foram purificadas de acordo com um método compreendendo uma etapa de troca de tampão, em que a troca de tampão inclui -.zinco e cálcio. Em modalidades preferidas da invençlp* a composição 5 dc proteína ADAM I S é uma composição de ADAMTS I 3.

Em. outro aspéeto, a. presente invenção fornece composi ções de proteína. ADAMTS (por exemplo, composições de ADAMI'S! 3) que são preparadas por um. método compreendendo, a expressão da proteína ADAMTS em um cultivo de células de acordo com qualquer método 10 fornecido neste documento,.. Em uma modalidade preferida* a proteína AD A MAS é A D A M TS 13.

Em um aspecto relacionado, á presente invenção fornece composições de taotema ADAMIS (por exemplo, composições de ADAMTS 13.) que são preparadas por um método compreendendo a. inclusão 15 de tautode zinco quanto de cálcio, em pelo menos um. tampão durante a purificação da proteína .ADAMTS a partir de um meio dc cultura,. Em Mma modalidade preferida, a proteína ADAMTS é ADAMTS13.

A presente invenção fornece eranpusições de protema ADAMIS (por exemplo, composições de ADAMTS 13) preparadas par um .20 méiodo fornecido neste documento. Em uma modalidade, u enmposiçlo de ADAMTS (par exemplo, composição de ADAMTSI3) é preparada pelo cult ri o dc uma célula que abriga um ácido nudeico que codifico uma proteína ADAMIS em mefo de cultura suplememado _Kv>m pelo menos um componente selecionado: dentre cálcio, zinco, e nicotinamida (vitamina B3). 25 1 m uma moduudade especifica, uma CAmpusíçào tk M)AMIS e preparada pelo vulik'0 de uma célula que abriga um áddo rradeico que codifica uma puxe na ADXMIS em meio de cu raia uplemertado *om pjn u;euvs drís componentes selecionados a partir de zinco, cálcio* e nicotmamida (vitamina HD. Fm ainda unha modalidade, o mmo <1v cultura c suplementado eran zinco, cálcio, e mrotitramida (vitamina B3). Em algemas modalidades., o meio de cultura: pode ser um. meio de cultura. Isento de proteína -animal, isento de cipopcplteco ou quimicamente definido. Em uma modalidade preferida, a proteína ADAMTS é ADAMT8Ó,

Em uma modalidade, uma composição de proteína. ADAMTS (por exemplo, composição de ADAMTS 13) é preparada pelo cultivo de uma célula, que abriga um ácido wcfeico que codifica uma proteína ADAMTS em um meio de cultura eumpreendend.o pelo menos ou cerca_: de 2 μΜ de zinco. Em outra modalidade, a composição é preparada através do cultivo de uma 10 célula de mamífero que abriga um ácido nucleico que codifica uma proteína ADAM í S em. um meio de cultura compreendendo pelo menos ou cerca de .5 μΜ de zinco, Em uma modalidade, a composição é preparada através do cultivo de uma célula de mamífero que auriga um ácido nuefeico que codifica uma proteína ADAMTS em um meio de cultura compreendendo de ou entre 15 cerca de 2 μΜ e 12 μΜ de zinco. Em outra modalidade, a. composição é preparada, através do cultivo dç uma. célula de mamífero que abriga um ácido nueleico que codifica · uma proteína ADAMTS em um. meio de cultura camprcxmdendo de ou entie cerro de 5 μΜ e 1 2 uM de raneu. Fm ainda uniras modalidades, a composição é preparada através do cultivo de uma célula de 20 mamífero que abriga um âento nueletco que codifica uma proteína ADAMTS em um meio de cultura compreendendo pelo menos ou cerca cie 2 μΜ, ou. pelo menos ou cerca de 3 u.M, 4 μΜ, 5 μΜ. 6 μΜ, 7 μΜ. 8 μΜ, 9 uM. 10 μΜ. 11 μΜ. 12 μ Μ, 13 μΜ, 14 μΜ, .1.5 μ.Μ, 20 μΜ, 25 μΜ, 30 μΜ, ou mais de zinco. Em.uma modalidade, o cultivo é mantido a ou entre cerca. de 35®C e 25 '7'C. Fm um.s mmhHdade e.-pceulea, o cultixo c mantido a ou cerca de

36'T’. Em outra modalidade, o pH do cultivo é mantido a ou entre cerca, de e λ> l m ama '>aMa?,dudc, a temperatura e eu pH do cuhi>o e mranfeto por pelo menos 7 dias. Em uma modaarorâ o método é realizado sob condteòus de cuhtua contmua. Em akuaro- modas dues ropccTros, o método

143 é realizado sob condições de cultura em químiostãto, turbidostáto, ou pérfeãu Operada no modo de suspensão, Em. outras modalidades específicas, o método e realizado sob condições de cultivo em quimiostato, turbídostato, ou perfusão operada no mudo aderente, fim outra modalidade, o método é realizada sob eondaprò,·, de udúxv em batelada, Em mudai idade·-» ropcra fi. as. o método é realizado <»b condições de cultura em batelada. única, batelada repetida, ou em batelada alimentada operada no modo de suspensão. Em outras mouahdades espera toras. o método e rcuhzadu sob condições de cultura em batelada única, batelada. repetida, ou batelada alimentada operada no modo 10 aderente. b.m uma modalidade, a célula que abriga o ácido mrelereo que cuíhluj nm.í prereraa ABAM IS e uma evlula du mamífero. Ha nmdtomaròs particulares, a cdula de mamífero e uma kclnra de hamsrer. humana. ou de marine, Em uma modaüdade especifica, a célula é uma linhagem de células

C.HO, uma linhagem de células HEK 293, ou uma linhagem de células BHK.

Em orara modalidade, a ceado de mamuero e euhixada em tuu meio de cultura isento de puhpepfiki.eo e ou proteína animal. Em ainda outra modalídaue, a célula de mamífero é cultivada em um meio de <, idtura síntétíed qtie noce eu rào . u.i. iromo de pfi 'vmideo* e poxeiaas a mna \ l π .una modalidade, o meio de cultura compreende ainda uma palíamina de ou entre 20 cerca de 0,5 mg/E e 30 mg/L. Em outra modalidade, o meio de cultura compreende ainda uma pofiamína de ou entre ceroa de 2 mg/L e 8 mg/L. Em uma modalidade especifica, á poliamina é a putresclna,. Em uma modalidade preira.ida <. nrom re> VA \M % c \l) \M 1S H

Em uma modalidade de uma composição de proteína 25 ADAMTS (por exemplo, eomproíçàu de ADAMISEE. meio de cultura usado para a expressão da proteína ADAM I S pode ser suplementado com zmeo a uma concentração finai de pelo: menos cerna de 2 pM para pelo menos cerca de 12 pM. Em certas modalidades, o meio de cultura pode ser suplementado eum zinco a uma concentração final de pelo menos cerca de 2

144 μΜ, ou pelo menos cerca de 3μΜ, 4μΜ, 5μΜ_Ϋ 6μΜ, 7μΜ._? 8μ.Μ, 9μΜ, ΙΟμΜ, ΙϊμΜ, Ι2μΜ, 13μΜ, Ι4μΜ, 1'5μΜ, 2ί)μΜ, 25μ:Μ, 30μΜ, pu níveis mais elevados de zinco.. Geralmeate, qualquer sal. de zinco pode ser usado para suplementar os meios da invenção, exemptos não íimitàntes de sais 5 aceitáveis incluem, ZnSOr7IbO. ZnSOj ΊΙ.Ό. (C»H O Wu_; 2111), ZnBr>, ZnB:rz2H₃QZ^ ((LlLG_?)Mrc2H₂O.

e semelhantes. Em certas modalidades, am sal farmaceutícsmente aceitável de zinco é usado para suplementar os meios de cultura da invenção. Em uma modalidade preferida, a. proteína. ADAMTS é.ADAMTS 13.

Em nutra modalidade, uma composição de proteína ADAMTS (por exemplo, composição da ADAMTS 13) é preparada pelo cultivo de uma cchda que atinge um ac do nuckuea que cadiuea u-a pioteuia \DAM I 5 em um meio dé cultura compreendendo peto menos ou cerca de 0,5 m'M de cálcio. Em outra mndaiidade, uma composição de ADAMTS :é preparada pelo .15 cultivo de uma cehda de mamífero que abriga um ac ido uucleico que codifíca uma proteína ADAMTS em um melo de cultura comp:reend.endu pelo menos ou cerca de 1,5 mM de cálcio. Em uma modalidade, uma composição de ADAMTS ê preparada pelo çuldxu de uma célula de mamífero que abriga um. .ierco nucktoo que codifica raras prc'cma \DAM1S um um niv o de vidrara 20 compreendendo d< ou entre cerca de 6.5 mM e Le mM de calma, fim ainda outras modalidades, urna composição de ADAMI'S é preparada pelo cultivo de um,$ célula de mamuerc uuc ubrim um amuo muleico ran codifica uma protema ADAΜΓ5 em um., meio de cultura compreendendo pelo menus ou cerca., de 0,5 mM, ou pelo menos ou cerca de 0,6 i:uM, 0,7 mM. O.é mM, 0,9 25 mM, 1,0 mM, . l mM, 1,2 mM, 1,3 mM, 1,4 mM, 1,5 mM, 1.6 mM, 1,7 mM,

1,8 mM, 1,9 m.M, 2,0 mM, 2,25 mM,. 2,5 mM2 2.75 mM, 3,0 mM, 3,5 mM, 4,0 m\1. 4.5 mM, ?Ài mM, ou mm* de c dem, tins uma modalidade, n c Jrao e mantido a ou entre cerca de 35^VC e 37^(2. Em. um.a niodaluDdu especifica, o cultivo é mantido a ou cerca de 36^θ(2 Em urna outra modalidade, o p.H do

145 cultivo ê mantido a mi entre cerca de 6,9 e 7,3, Em uma modalidade, a temperatura emi pll do Amo v tautido pro pelo menos '' dias l m imu modalidade, o método é realizado sob cotidições de cultivo continuo. Em algumas modalidaes específicas, o método é realizado sob condições de 5 cultura em quimiostoxo, turbidostato, ou peimoto operada no modo de suspensão. Em outras modalidades específicas, o método é realizado sob condições: de cultura em químiostato, turbidcstato, ou perfoslo operada no modo aderente. Em outra modalidade, o método é realizado sob condições de cultivo em batelada. Em. modalidades específicas, o método é realizado sob l(i^: condições de cultura em batelada umca, batelada roncada, ou batelada alimentada, operada no modo de suspensão. .Em outras modal idades espncíficas, o método é realizado sob; contig ôvs dc cultura em batelada union, batelada repetida, ou batelada aumenrada operada no modo de. aderente. Em uma modalidade, a célula que abriga o ácido nuclelco que eoddtea uma 15 proteína ADAMTS é urna célula de mamífero. Em modalidades particulares.

;i célula de mamífero é ιιηκι célula de hamster, humana, ou de murine. Em uma modalidade específica, a célula é uma. linhagem de células CHO, uma linhagem: de células HEK 293, nu uma linhagem de células BHK. Em outra, modalidade, a célula de mamífero é cultivada em um íneiu de cultura isento 20 de polípeptldeo e/ou proteína animal, h.m ainda outra modalidade, a célula de mamífero e Cultirada em um meio de cufioia smretien «uc pode ou nào estai isento de polipeptideos e proteínas animais, Lm unra modal idade, o meio de cultura compreende ainda urna poliamma de ou entre cerca de 0,5 mg/L e 3Q nuc 1 . Fm outtu modalidade, o meio de cultura compreende ainda -mm 25 pçliamma de ou entre cerca, de 2 mg l e 8 mg/L. Em uma modal idade especifica, a pnhamina e » puirnsDna Lm uma modahd.uk preterida, a protema AD.AMTS é ADAMTS l

Geralmente, qualquer sal de cálcio pode ser usado para, suplementar os meios da presente invenção. Exemplos não limitantes de saís .1 ·46 aceitáveis incluem CaCL, CaCfi, EidtiOpSHD, <Ms CaBra, (CAWrMM (CHO^hCa, (Ç^H-tO^C^ (CAMgQ^CagãH/X e semelhantes. Em certas modalidades, um sal femiaceuticamente aceitável de cálcio é usado para suplementar os meios de cultura da mvenç&c

Em outra modalidade, uma compera_vm de proteína ADAMTS (por exemplo, composição de ADAMTS 13) é preparada pelo cultivo de uma adula que abriga um ácido nucklra que codifica uma protema ADAMIS em um meio de cultura eompreenden.de pelo menos cm cerca de 2 mg/L de nicotinamida (vitamina B3)., Em outra modalidade, uma composição de 10 ADAMTS é preparada, pelo cultivo de uma. célula de mamífero que abriga um ácido nucldcn que codifica: uma proteína ADAMTS em um meio de cultura compreendendo: pelo menos ou cerca de? 7 mg/L de nlcotínàmida (vitamina B3). Em uma modalidade, uma composiçáo de ADAMTS é preparada pelo cultivo de uma. célula de mamífero que abriga um ácido nucleico que codifica 15 uma proteína ADAMTS em um meio de cultura comprqendendô- de ou entre cerca de 2 fog/L e 10 mg/L de nicotinamida (vitamina B3). Em ainda outras modalidades, uma composição de ADAM ES é preparada pelo cultivo de uma cehda de manufero que auHga um .uuio nucleten que codifica uma pie-icma .ADAMI'S em um meio de cukura compreendendo pelo monos ou cerca de 2 20 mg/L. 3 mg/L, 4 mg/L, 5 mg/L, 6 mg/L, 7 mg/L, 8 mg/L, 9 mg/L, 10 mg/L, mg/L., 20 mg/L, uu concentrações mais elevadas de nicotinamida (vitamina B3), Em uma mod;didude, o cultivo é mantido a ou. entro cerca._: de 35*C e 37*Q Em uuu modalidade espetífea, o cultivo é mantido a eu cerca de 36'C, Em uma outra modalidade, o pH do cultivo c mantido a ou entre cerca 25 de CD e 7.3. Em uma modalidade, a temperatura e ou pl I ue mUu\o e muatide por pelo menos 7 dias. Em uma modal Made, o método é realizado sob condições dc cultisa continuo. L.m algumas modalidaes específicas, o método c raa'.icado O^ eravfieoc'·, de cuhraa etu qmmurc no. turhíJoUato. ou mnhvâo operada no made de suspctrcào. Lm outra\ modalidades especificas. c método e refevado \op condições dc euhura em qmmi<realv, tmb'Coxiato on peifiisào operada no modo aderente. Em. outra modalidade, o método é realizado sob caedupVs òe enluso <m balcknli I m modahuadro cqrevrkas, o > elodo é realizado sob condições de cultura em batefeda única, baldada repetida, on batekida alimentada operada no moda de >uzpem<K>. Lm outras modalidade cspccdicas, o método e realizado sob condições de cultura em batelada única, baldada repetida, ou baldada. alimentada. operada no modo de aderente. Em: W modalidade, a célula que abriga ó ácido, nucleièo qué codifica uma nroteína WAMIS e uma ecluL dc mmufeio. bm modalidades paitkalmre 1:0 a célula de mamífero é uma célula de hamster, humana, eu de murine, Em uma modalidade específica, a célula: é :uma. linhagem de células CHO, uma: linhagem de células FÍEK 293, õu. umá hrdiagcm de células BHK. Em uma outra mtxlalidade, -a célula de mamífero é cultivada gm um meio de cultura isente da pollpeptídeo e/ou proteína animal Em ainda outra: modalidade, a 15 célula de mamí fero è cultivada em um meio de cultura sintético que pode ou nào V'tar Lento de polipcpüdeos v proteínas animara Fm uma mcdalioade. o melo de cultura compreende ainda uma poliamma de ou. entre cerca de 0,5 mg 1 e 3^{í mg'l . íàn outra modalidade, o mero de cubara compreendo tiada uma polfemina de ou emre vereu de 2 mg b e K rngL. Fm uma modalidade 20 específica, a políamma é a putresema. Fm uma modalidade preferida, a proteína ADAMTS é ADAMTS 13.

Fm uma modalidade, uma composição de ADAMIS é preparada pelo cultivo de uma célula que abriga um ácído mjcleico que codifica uma proiema ADAM PS tpoi exemplo. ADAM FS1 31 um um meio de 25 cuiiura suplementado com zinco e cálcio. Em eenax modalidades, as concentrações de zinco c cálcio podem ser quaisquer das descritas neste documento. Em certas modalidades, ss eemeentrações de zinco e cálcio serão uma dc Var. 94 a Var. IB (hthJa 71 Em certas modalidades, o cultivo é m.Eiiido por pvlo mer.o*' ⁷ dias, ou pulo menos 14 dras. 2i dias, 2è diaro i\i

148 pelo menos 5 semanas, 6 semanas, 7 semanas, ou pelo menos 2 meses, ou 3, 4, 5 ,6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18 meses ou mais. Em uma modalidade, o cultivo é m cultíw. de perfosão. Em nutra modalidade, o cultixo é um cultivo quiunosratieo. tira omras modalidades. o cultivo e um 5 cultivo era batclada sbmentafia ou haralada repelida, Im tram modalidade preferidà, a proteína ADA Al ΓΒ é \D AM '1' S13.

Em uma modalidade, uma composição de ADAMTS é preparada pelo cultivo de uma célula que abriga um ácído nudeico que codifica uma. proteína ADAMTS (por exemplo, ADAMTS 13) em um meio de 10 cultura suplementado com zinco e nieotinamída (vitamina B3), Em certas modalidades, as concentrações de zinco e nieotinamida (vitamina B3) podem ser quaisquer das descritas neste documento. Em certas modalidades, as concemrações de zinco e meotinamida (vitamina B3) serão uma de Var. 114 a Var. 133 (Tabela: S). Em certas modalidades, o cultivo é mantido por pelo 15 menos 7 dias, ou pelo menos 14 dias. 21 dias, 28 dias, oit pelo menos 5 semanas, 6 semanas, 7 semanas, õu pelo menos 2 meses, ou 3, 4, 5,6, 7, 8, 9, Hk IL I.?. 13, 14. 15, In. I?, 18 mesc< ou mais. Em ranu modalidade, o cultivo é urn cultivo de perfusão. Em outra modalidade, o cultivo è um eukivn qmmiurtatico. fm mitras modalidades, o cultivo e um udtho em batclada 20 alimentada ou bmelraia repetida. Em uma modalidade prater da, a proteína ADA.MTSéÁDA\nSi3.

Ira uras mudahdade. uma cmnpraMçàe dc ADAMfS é preparada pelo culto o de uma célula que abriga um ácido nueleíeu que eoditicu uma proteína ADAM FS {por exemplo, .AD AM l'S 1 31 em um meio de 25 eukura suplementado cora cálcio e uicodnamida (vitamina B3). Fin vcrura ntodalnlades, as concentras òe de vJcíu v nieotinamida tekauüna B.M podem ser quaisquer das descritas neste documento. Em. certas modalidades, as concentraçòe d< ealcra e rrâ'<mnjmaia ι v íkimimi Bãl serão uma de Vau .134 a Var. 149 f.labeis 9). Em certas modalidades, o cultivo è mantido por pelo

149 menos 7 dias_s ou peio menos 14 dias, 21 dias, 28 dias, ou pdo menos 5 semanas, 6 semanas, 7 semanas, ou. pelo menos 2 meses, ou„3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, II, 12, E3, 14, '15, 16, 17, 18 meses ou mais. Em uma modalidade, o cultivo é um cultivo de períusão. Em outra modalidade, o cultivo é um cultivo 5 e.mmioqromv l m ouuxro modalidade^ o uüUxm é em euítixu era baldada aumentada ou oatdada repetida. Em uma modalidade preferida, a proteína ADAMTS é ADAMTS 13.

Em uma modalidade, uma cumpotiçào de X D AM ES é preparada pelo cultivo de uma célula que abriga um ácido nucleíco que 10 codifica uma protema ADAMTS (por exemplo, ADAMTS 13) em um meio de unhara mplememado com zmeo. cálcio. e mcoiiiramida (xitamina B3i. Em certas modalidades, as concentrações de zinco, cálcio e nieotinamida. ^vkamíua B') podem rer q.roroqucr das deserdas neste documento. Fm cerras modalidades, os <onecatraçõe de -ãnco. ealeio e mcvtíuamída f vitumina Bèl 15 reran uma tEro variações \ ₄r |4 j \';>i ui U abriu ' com a i abeta eu. Em eerlas modalidades, o enfi.xn e 'mintído poi pelv 'r.cno* ^? dias. ou pelo mean*

1.4 dias, 21 días, 28 dias, ou peto menos 5 semanas, 6 semanas, 7 semanas, ou peto menos 2 meses, ou. 3. 4* 5,6, 7, 8, 9, 10, 1.1, 12,, 13, 1.4, 15, 16. 17, 18 un na <-· l « u u mod.vcaA. o ^.ab w ' u tuh vo <4 q - i, 1 outra modalidade, o cultivo é um cultivo quimròstâttoo. Em outras modalidades, o cultivo é um ciihixo em batelada alimentada, ou batélada. repetida. Fm cms modalidade preferida, a prokma ADAM I S c AD XM l S B

Em outra modalidade, as comp^sígõe>. de ADAM IS 13 são fontecidas com elevadas atividades especificas, por exemplo, uma atividade25 específica de pelo menos 600 ü/mg de proteína A13. Em outra modalidade, a composição de AD XM ISI ' tem uma atividade cxtwitica de pe.o menus '00 U/mg. Em outra modalidade, a composição de ADAMTS 13 tem uma m rodada eawrkn» do pe o uenos x00 l mg hn ej*.. moda rauic. a competição de XDAM VS 11 tem unia mix idade especifica de pelo meraro Opo

150

U/mgx Em outra .modalidade, a composição de ADAMTS 13 tem uma j'n o ice v'teuhi. oo pete e e\ ’OOp ( ί> I i_n u. ira mudnhdeJe, a composição de ADAMTS 13 tem uma. atividade específica de pelo menos IMO I mg. bm outra modahdadc, a compoAxiu de XT) \M 1SI Em uma 5 arokkide especifica d« pJu menus 1200 |'_Πψ } _{i;i iHi};_!a modmutrac. a composição de ADAMI'S IS tem uma atividade específica de pelo menos 1300 ÜZmg. Em outra modalidade, a rOmpusiçàu de .ADAM I'SB tem uma ato idade esp^Citlea de pelu menus 140B I' me hn outra modalidade, a composM de \D\MISB ;em sna abxidade cspcediea de pdu menus .10 1500 U/mg. Em outra modalidade, a composição de ADAMI'SU tern uma atixidade esperafrea ue pein menus luOC? I me, Fm outra modalidade. a composição de ADAMTS13 tem uma atividade especifica de pelu names 1700 U/mg.< Em outra, .modalidade, a composição de ADAMTS 13 tern uma auvidade específica de pelu menus lxt)O t. mg, Inn outra modahdadc. a 15 composição de ADAMTS 13 rem uma atividade específica de pelo menus 1900 LI /mg. Em outra modalidade, a oompusiçãò de ADAMTS 13 tem uma. atividade· especifica de pelo menos '2000 U/mg. Em outra modalidade, a composição do ADAMTS 13 tern uma nth idade espeeffiea de pelo menos 3100 Iféíg, fim umra mudalidade, a composição de ADAMTS13 rem uma 29 stisidade cspedfiea de pelo means 2290 V.mg. fim ouira modalidade, a composição du ADAM I SB tem uma atividade especifica de pein menu¹' 2300 U/mg.. Em outra modalidade, a. composição de ADAMTS 13 tem W atividade c^pccOca de pelo menos 2490 Wmg, Em outra .modalidade^ a composição de ADAMTS 13 tem. uma .atividade específica de pelo menos 25 2500 U/mg.

VI1. Exemplos

Exemplo 1 to experimemus em barelada ahmcntada turam scali. ados usando culturas de bioreatores da linhagem de células HEO93 recranbmaute

1020/1 013-2 expressando ADAMIS 13 hümaâa em. meio BACD-AI3 ^mmteameme deUmdo (1 efeuu de sup'emem.uao efe moo ee cuLuta eottt zinco udicíomi.1 foi investigado.

As MsiL· HI k?‘D iccumb-i-ames eue express rr 5 ADAMIS 13 humana town vuInvadas por cultivo de células cm bate i ada. alimentada em btorreatores de 1,5 L com impulsares dfe. lâmina sob um pH controlado em linha de 7,20 a 37°C com uma concentração de oxigênio dissolvido de 20% de saturação do ar. A suspensão de células foi transferida para 2 biorrefeores idênticos éontendo um meio de cultura quimicamente 10 definido com base.em DMEM/F12 (BACD-A.13; Tabela 12). Q§ dois cultivos foram crescidos em meios BACD-AB preparados quer com 0.4'2 mg/L ZuSth 7Hu\ como em DMEM El 2. ou com um sumcmento mhru-nJ de 1. mg/L de ZnSOç7H₃O para uma concentração final de 1,432 mg/L. Os dois cultivos em batelada alimentada foram, de outro mudo, tratados da mesma: 15 forma e, assim, podem; ser comparados diramatente um com. ó outro.

A atividade de A13 em sobrenudantes de cultura foi: medida, por ensaio de FRETS-VWF73 apôs a centrifogação ou filtraçao dos <obrenad;mtcs para remoter eeiuft' redduao \ q »a* t dade total de \13 foi medida por ELISA, usando um anticorpo especifico para Al 3-(Tabela 10). O 20 sobrenadauíe da eclusa empregando meio BACD-ΑΠ com uma cniuentraçâo de zinco DMl Μ 1 12 padrão kxe anu ato idade de Μ 1 de /28 e X26 mV ml nus dias 3 e o. t expectív.mente. As ati\ idades espera ficas para os cmpxus leram 482 r>l a' e 5'^!0 mlTug de A' ή rc^perturanente Fm ovttuOic. es se''s<.n id.mtcs ce uiTxís com suplemento aAraonaí ek Zn. 25 embora tendo rendimento^ apena> figciramenie melhorados do expressão de Al 11 % e l^M% ntaior mo dxo ' e b. n\<pra''i\amantec nresiraram. atriidtdc¹' totais c específicas dramaticamente melhoradas de atividades de Al3 (Tabela 11). Como pode ser visto comparando os resultados na Tabela 10 e Tabela H, a atíxidade l-ret^VWl 73 de Ala luiai foi l Ixra mais elevada (15$9 -_vs 728) no dia 3 e 61%. mais devada (1381 vs 728) no dia 6 para as culturas crescidas na presença de 1,432 mgZL de ZuSCATHdl* em comparação com .os cultivos obtidos em 0,432 mg/L de ZnSOr7Il;O. Do mesmo modo, a atividade específica da proteína A13 nos cultivos suplementados foi 104% mais elevada S (981 vs 482 mü/pg) no dia 3 e 42% m<vx elevada (739 vs 526 ml bpg) no dia

6.

As amostras dos biomateres foram tomadas e analisadas para XH p»»r ELISA, a atividade de Al 3 foi medida por ensaio de FRETS\ \M '' η As contagens dé células foram determinadas por tecnologia.

'^udeocoupter. As taxas de diluição. fbram medidas e usadas para o cálculo das taxas de crescimento e produtivídades volumétricas.

Tabela 10. Dados de fermentação para baíelada alimentada dâ cultura 1 realizada, cm um bíorreator de 1JL com meio BACD-A13 sem suplementação de zinco.

Usacks	1 de CÇhdss	Tsas SSpíUtO: d·:? eiCwCèteskí	Ai 3 ; RIAS	A13 Kt	AC vida de fôqxes .tka	Reto:· wrto dfe 1 R£ rs	Rsôdiwerre teAÍS
Riteestetate
cnlhirfo	(! 0 CéhjlaVmt]	IMl		tesúpl	IMV^J	c-n	A
s				1,51	RS2	w	R.4i
s		03? $6	fed	1J7	5Só	m	aA?

Tabda 11. Dados de fermentação para experimento de batelada alimentada realizado em_: um bloreeator de 1,5L com meio BACD-AI3 com suplementarão de zinco.

Dís te Stereretests ecteisfe	ra':X.VRk>'Kte<.S te ítefete	T;u-i espsxifka te eresciswíte	......................... AIS RRE7S	AI3 BLISA	— Ateitete ewOfeã	.fesdimcídá <fe nU3SUS	tetelmeíte | te A. O 1
pÀ Cèkmtelj		[íteitel]	l..»3...	MÉW		h?teU8l l
3	IZA.	títe»	1M9		SIS	(W 1
A__________	j,;p	8, n	itei	LS7	7SV	2<O	tw ΐ

Tabefe 5. Corapo^çào do melo de eukura de eehda^ BA( D \B quan ícamvnk· deô¹ ado.

154

i sjsniíu Ht 1	2.170
X U-nneiíi Kl 2	0.680
raraelhad	1........................................................
Π 6 arose	ãotMKuo
i Xado hurahiro	0.047
XraUv líp<Mi..<	0.105
Purararò ia ?Ü( =	3,681
1 ’! Udi'U	0,365
l hpoxarUiw \a.	2.390
Pina ,αυ de .radio	55.000
	nsfÇL
l.-Ghikaniro	Ϊ 000.0600
Phròraro Vb8	1006,0000
Vk'.p0hmun	LMíív
xto hraCil Ρ?υ, ai\'i <c	1,5000
Exemplo 2

Os experimentos de atelada alimentada foram realizados usando culturas de biureatores da. linhagem de células CHO racombiname # Ato expressando .ADAMTS 13 humana em meto BACD-AI3 quimkamcn.te 5 dethufo. O efeito de suplementarão, do meio de cultura com zinco e/ou x B3 adicional foi investigado.

As células CHO recombinantes expressando ADAMÍSB humana foram adaptadas a um meio de BCS químlcámente detimdo (meio de BCS) O doou < Banco de Células dt Frabalhu de IXxtaoUm'.cnta 4 10 01 fJJWCB - Ol) foi descongelado e mxralo celular foi preparado em meio de BCS. As células foram transferida** 'xav. dois biorreamres de 1,5 L com impulsores de lâmina e cultivadas sob cultura de células em batelada alimentada un meio B.ACD-A: ' de propriedade com um pH eontuAido cm linha de 7.20 a 37°(.\ com uma concentração de oxigênio dissolvido de 20% 15 de cv a** <6 dois eu Uxro fora” etesrados em Me o-s B \CU- M3 preparados quer com 0,452 mg/L de Z.nSí )_;·7Η?Ο, como em DMEM/FI2. ou com uma suptementação adfetonal. de 1 mg/L de ZnSO^TFLO para uma concentração final de 1,432 mg/L. Qs dois cultivos em batelada alimentada foram, de outro modo, tratados da mesma, forma e, assim, podem ser 20 eump irados direrameute u;r> com u rastro, (k sulucuadauíra íbram coibidos

155 nos dias 4 e 7 e ensaiados quanto aos níveis de atividade e proteína Al 3. Apos a colheita. no dia 7, ambos us cultivos foram suplementados com 5 mg/1. de uktoimumda txnamma BN adicionuL pma urm vOuccnUatçãu final de \B? mg I . c Ci'hBado-x rob condições idê^!,l^:ca> por um penodo adsc’.onal de 4 5 dias. Os sobrenadantes foram mu raneme colhidos nos dias II e os níveis de atividade eproteína. AI3 foram eu soados.

Na primeira, cultura, crescimento sem. suplementarão, de zlneo, os níveis dc atividade de Al3 no sobreuadjnte colhido foram de M2 e 488 mlJ/ml aos dias 4 e 7, respeetivamente (Tabela 13). As atividades específicas 10 para estes sobr< nadamos foram 371 e 273 mlJ/ug nos dtas 4 e 7, respectivamente, Como visto autertonnente no exemplo I, as atividades específicas e totais de Al3 no sobrenadanle de cultura suplementado com zinco adidonal foram si.gmhcal.ivamem.e aumentadas (comparar 'Fabela 13 e Tabela 14 nus dias 4 e 7 da colheita). Como ames, a A13 total produzida em. .15 ambas os cultivos foi semelhante, nu entanto, Al 3 a partir do sobrenadante do segundo cultivo, suplementado corn zinco adicional, teve 40% e 104% de atividade total maior nus dias 4 e 7, respectivamente, bem como 78 % e 75% de aiBidadc específica maior nus dias 4 e 7 t Tabela 14 vs Tabela 13). Outros purameuos. indumdo o rendimento de A13 total c a ia\a de cresramento 20 veiukn uparemaram mm rcr afetados pela suplcmenlaçào cem zinco adicional.

Apos a colheita dos sobrenadantes.no dia 7, ambos us cultivos finam ainda mplememadus com um advicnal de 5 nigd. ue mcoünamida (vitamina B3) e cultivados sob condiçdes tdénhcas por um período adicional de 4 dias. Os subienadantes foram colhidos como antes no dia 11, A 25 suplementaçáo com x.mmina BS resultou em um aumemo na anx idade de ^:Rl A \\\| i μ _{a a xUX} ). _ue , P/ '”cvUtoda nus sob;..nadamos de n\ cuífixus (fabvla 13 e Tubda 14. eàa II).

Notavelmente, estes valores aproximadamente dobraram em ambos os cultivos. No dia 11, o sobrenadante da cultura 2, suplementado com adição de

156 zinco e vitamina B3, demonstrou n atividade total quase 20036 maior (2366 vs 791 mU/mi) e atividade específica 17436 maior (1189 vs 432 mL7pg) do que demonstrou n sohrenadante colhido a partir de euhura L

A supiementaçãu do meio com nicotinamida individualmente 5 rcaihuu em um aumento de cerca de o0% na unidade total (NI ml· ml vs 488 mlJ/mk comparar Tabela 13 nos dias 7 e 1l) e atividade específica (432 mU/pg vs 273 mlJ/pg: comparar Tabela 13 nos dias 7 e 11) de .Al3. Do mesmo modo, a xuplemcntação do meio com ataco individualmente. resultou em aumentos entre cerca de 70% e 8096 na .atividade total e atividade 10 expcmhea dc 3% (comp.nm lahda l) e Libera 14 nus dra-> 1 e % Surpreendentemente, a suplemeutação do meio de cultura com nicotinamida e zinco, resultou em um aumento sinérgico entre cerca de 300% a 400% de xtavidadetotal ícomparar label· 14 dia 11 com a Tabela 1.3 dias 4 e 7) eentre cerca de 200% a 300% de espetífca atividade (comparar Tabela 1'4 dia .1.1 15 com a Tabela 13 dtux 4 e 7) de AI 3» demonstrando uma íntercçào sinergiea. íwsperadà entre os estatos de zinco- e de nicuttaamida..

Tabela 6, Dados de fermentação para, experimento em batelada CP. 07/18 M04: h.A 13 CHO íCton #985/1 938 DWCB#0L

Oss StoóM'	ÇorçéS·' SÚSÇííÔ i.fe Céfeh	: <·ΐί: EvpeeHka de CrcsOmenKf	Art: FRETS	At3 FUSA	V.>M, ' t J< 'R í	i Reufil : de i FREIS	| de- 1 Art
«tal Cvíhidí)	BC UéO.Oraj	J.LL______________________	jutoq		[to-togl	|....................... i prt :·;}	(
JÁ	çja	sots	Ort	1?3	.371	I rt*	| tert
F	L'R	S.V)7	488	i%	27>	1 rtO	1 tert
rf?;...,...	ΪΛ'	οχ n_____	741	1S3		| P3	j tei’

BAV~CD»A13; 0,432 mg/L de ZnSÜ^MW; 2 mg/L de nicottaamida

B \\ C D \ ' 0 -E |₍^| IBo %ra' %'ravurarama

Tabda 14. Dados de fermuntoçàu para experimento cm batelada de CP 07/18 M07: hAI3 CHOKlon W85/I 985 DW€B#0L.

OU de	Conten-			T------------------------		Rendí	total
Sobreis»'	iraçSe	I'^set Uto» de	A.Í3	i Art	Ath4d&fe	aww A	WW A
danie	de Oéhde	Cresciti'ef'te	} at rs	s ELIS A	Espetífíce	ten ra	Ate
Colhuks	(|01' COtetesJ	.IW__________	(írIArII	1	tou/gp	AL 41
rt	V’d	0s52.7		: 1,31	66G	223	tort
________________	gw______	g5A$	996	.............	479

i Η ' I LM I I 236$ i 1.99 j ΠΜ ί 53.(1* | Q 4 |

BAV~CD-A13; 1,432 mg/L de ·7.Ι·Β0; 2 mgZL de niuotmamlda B\\ CD \H. MV me l de/\S0 11 (Λ - v! de nunpuamida Exemplo 3

Uma cultura, de: células em químiostato de linbagw de células 3 C.T1O rsconibínante # 640-2 expressando ADAMTS .13 humana foi cultivada, em meio BACD-AO quimicamente deímicfo suplementado com zinco adicional e vitamina B3, A cultura de 10L foi mantida durante 53 dias e a ptodaçào de aíix idade e prolema A13 foí monitorada no longo do tempo.

As células CHO reeonfoinantes que expressam ADAMTS 13 10 humana foram adaptadas a um mere quimicamente definido de prepriedade (meio de BCSt Um fraseo de few de células foi descongelado e o iuóculo de células toi preparado em meio de BC2L As células propagadas a partir do clone de expressão Al3 # 640-2 foram transferidas para um. biorreaíor de I0L com irnpulsores de tipo Rushton e cultivadas em cultivos em batelada 15 repetidas com wio BAUD-Al3 de propriedade sob um p'H controlado de em linha de 7,15-7.20 a 37X2 com uma uon.çentração de oxigênio .dissolvido de 20¼ de saturação dò ar. Apda 2 bateladas as culturas foram, crescidas para, o volume de trabalho final, de TOL, u bioreator foi mudado para alimentaçau em mc>ô contmuô nu dra e operado pre nm pcuode jcjcíou d de 48 dias era um 20 medo qirèmo.uaus.

As amostras de subrm?adante dos biorreaíores foram tomadas <\enkui.dmmue e amdixufe para u prratraàn de prottma A13 por HIS\ e auxuladc de Λ13 pm cnse:o de IRblS-VVU 73. ^Ara coteagens de células foram determinadas por tecnologia Nudeocmmter. As uivas de diluição foram medidas e usadas para o cálculo das taxas de crescimento e produtivkbdes rate.melra as.

Sob condiçOes de euH\o enntnmo u>anefo meio B.AUD-AH qnuni came me dcfimdo suplementado corn zinco e nicotinamida a uma concentração final de 1,432 mg/L de ZnSOfefeO e 7,02 mg/L de mcotmamidm os níveis elevados de produção de pmtefaa AIA cntre 0,9 e 1*3 mg/L / D, e atividades específicas* entre cerca de 800 e 1100 m'U/pg de A13* foram alcançados. (Tabela LH Estes resultados foram consistentes com as atividades, específicas e a produção de proteína alcançadas com o clone # 938 5 C13O tai coma no exemplo 2* Notavelmente* as produtívldádes especificas e volUmétricas de célula aumentaram ao longo do tempo na cultura de longo prazo, provavelmente devido ao aumento do crescimento e taxas de diluição ao- longo do tempo, A elevada atividade especifica de A13 expressa pode ser* pelo menos* mantida a um nível constantemente elevado por pelo menos 7 W: semanas inteiras que a cultura, foi crescida sob condições quimiostáfiea. Na verdade, a atividade específica de Al3 produzida na cultura realmente aumentou de cerca da 800 mlfoxg de A 1,3 na. semana. 2 para cerca de ..I.I0Ô ml· pg de A l > na semana 7,.

Tabela 15. Dados de fermentação para experimento em cultivo contínuo de 15 CP030 JT2: bAI3 C.HO Klon #987/1 640-2.

N». íU srósss	efe (çèííjlíí	I» tSfSxOtetX COeáSsííiSí		Al 3 FREIS	xni cosa.	AííOdssfe E3p<<,j;E«s.	RívU- ÍWSO de IWTS	e v AI '
4« U>S:h;s ms qwOíOms	hL casmmq	.J1M________	JM______	sí M	..LiÇte	[te-iõs]	«!	tetetol
	Í.O	a»	ÒM	umi	w		713	U Si
3	L3S	0.0	0.4:·	3254	3.33	w	9:3	t 1
4	Í:X	ops	ora·	'044	2,41	031	W	0,95
5	USX	0.43	0,33	2514		473	teSS	24
	ira	ora	0.40	3737	ZA			2'
·>?·	ira	0.53	ore	AL.......... .....................	era		rau	J. '! S

Exemplo 4

Experimentos cultivo de células em batelada alimentada s qumáostalo foram realizados usando culturas de hforemme^ da linhagem de «lulas CHU reconibí names r <ra0~2 que expressam ΑΠ \M Γ8Η humana cm 20 inesi B ΗΉ- X13 çuimromran.e dcfimdc D vrèuo de ramlenmungâo do rraio de cultura com diferentes níveis de zinco foi investigado.

As células C.H0 recombínantes que expressam ADA.MTS13 humana formr adapsaua* a um meio de BCS quimicamenie dotinuln de peropricrhde eni modo de bateludn alimentada. Resumidamente. D\\l B ~ ^Í!S

159 foi descongelado e o môuulo de cdulas foi preparado em_; meio de BCS, As células foram, transferidas para um bforaeator 1,5 1 çom impçlsores de lâmina, e meio B ACD-A.I3 de propriedade suplementado com meotínanilda a uma concentração final, de 7 mg/L, mas sem .suptementação de zinco sub um pH 5 controlado em linha de 7.20 u LC, com uma concentração dc ox.gerao dissolvido de 20^« de saturação do ar. A suspensão de celfeas em batelada foi então dividida em três biorreatores idênticos contendo meio BACD~A,13 supkímentadu com nicotinamida a uma concentração final de 7 mg/L com diferentes suplementações de Zn (0 mg/L; 0,5 mg/L e 1,0 mg/L de 0 ZnSO^TFLO para uma concentração final de 0,432 mg/L; 0,932 mg/L, e l .432 mg/L de ZnSOrobLO).

Ds mviO' BALD- \I > redraram 0.412 mg I de Zu8O$ ’ILO m>m mi sem roplemeniacào adicionai de zinco. Caso contrário, os cultivos e os meios foram os mesmos e, assim, puderam ser comparados direiameule um 5 com outro. Os cultivos foram crescidos em modo de batelada alimentada por cerca de uma semana, e o sobrenadantc foi ensaiado para a. produção de. proteína AI 3 e atividade de FRLTS-VWF73, Todos, os três hforreatores foram então mudados para o modo de cultura em qwnnostato e ope onnmte cerca de 2 semanas sob condições de cultivo continuo usando os meios com. Ü diferentes suplementaçoes de zinco, oomo dascrtto acima,

Sob condições de catara de batdada al:imentada,_: consistente com os resultados observados nos exemplos 1 e 2, a suplementação do meio com 0,5 mg/L ou 1_SG mg/L de ZnSO.r7lLD aumentou signíficatívamenle a atividade especifica da proteína A13 no sobrenadarta (785 m.U/gg, e 87b 5 mU/pg, respectivamente), em cnmparaçàO com meio não suplementado com. zinco adiçional (437 mlJ/pg) (I aKda I b). Gomo antes, outros parâmetros, mclumdo a produção de proteína A13 total e crescimento celular específico, na.o foram, afetados pela suplemeniação com. zinco adicional..

Tabela 7« Dados de Fermentação para experimente® de batelada alimentada de exprcvrèo de A 1 * himrana em meio com ou -rem suplementaçào de /ίικο adicional.

	ç<wra“ ItsçS* de tekfe	: .: i sp.\ I - Horde \ ..Si'V'ao	A® ERÉTS	ÀI3 1 1 ®-x	Arèiréik t^pcváfca	Seiid; mentí? te t'RKI s	íteisdí ifeèdte de A13
Ziacís Aíhckmíü	ÍHC CSMWto]	,1MI____________________	(ajUSsíts	..ISpíní]	jmUpp	fl' l. d.5	[sng/Uál
0	5,44	Ô,420	Stop	1,953		ZWA
Ô,S	í,?x		tSS7.7	Ζ131	7S5	4W	ÁSSS
t,C? TOg/l	í .44		t.W,3	W-4	5?6	4SO	0.473

Depras Je ntuda*' o, Soo cram e* para o rcodn de qmmiost.no o>s roh'Xix- toran creremo* uoo eondkòe* de eJiro» corhnuo durante eurea de uma semana (wmmra 2) usando os meiob eran diferentes suptancntaçròs de zinco, cítmo descrito acima. As amostras do sobrenadame dos biorreatores leram tomadas semanahneme e analisadas pura a produção de proreiria .A 13 por F.LISA e atuídade de .AI3 por ensmo de FRFTS-VWfi’ç Similar aos 10 resultados observados pars os cultivos crescidos sob modo de batelada alimentada, a suplememaeão do meio de crescimento usado para o crescimento, de cultivo contmuo com zinco adictonal resultou na melhoria substancial de atividades específicas de A13 oto? ml -pg. e 7to gg p_Or 0,5 mg/L u 1,0 mg/L de ZnSO.p7M_?O de .suplementaçfex respect® amente) 15 após uma. semana, em comparação com nenhuma suptementação (553 mU/u.g) (Tabela 17, Tabela 18 e Tabela 19).

Frevíamsnte, fbí observado que a atividade específica. de A13 expressa, em cultivo contínuo de células realmente melhorou durante ttm periodo prolongado de u mpo μ er. exemplo D. Fure ms estrear se ra-te 20 resultado podería ser ou não repetido, os cultivos crescidos em meio suplementado com zinco adicional forauí continuados por mats uma semana. Como se vê ná Tabela. 18 e Tabela 19, a. atividade específica de Al 3 nos sobreuadantes de ambos, os cultivos nav&mente aumentou ao longo do tempo. A mix idade específica de A13 encontrada no sobrenadante do meio 25 suplementado eom 0,5 mg/L de ZaSO^TILO aumentou de 697 mU/mg na

161 semana 2. para 759 mlj/mg na. semana 3 (Tabela 18). Do mesmo modo, a atividade específica de Al 3 encontrada no sobremdante do meio suplementado com 1,1) nr L de ZnSOv'/lEO aumentou de 729 mü/mg na semana 2 para 812 mlj/mg na semana 3 (Tabela 19). Como antes, o crescimento da cêlukt específica não foi afetado pela suplementação com zinco adicional. Notavelmente, no entanto, a produção de proteína Al3 aparentou, aumentar em ambos os cultivos suplementados com zinco adicional, tal como comparado com a produção em culturas não suplementadas cum zinco.

Tabela S.,Dados de Fertuentação para experimentos de cultivo de células sem supiementação adicional de zinco.

i wro Ϊ Óí	di? ÍÍLíUls	T»» E;p<'<. X? ¢. ix.af:WsUy	O.xíi ste OOfote	AH mós	Al·? atu	AavOaíb í E -·ϊΧΆ:'.'.ι i	.WiUii íSé smrrs	roso <fe Λί?
i Çafeaams	for cosíseist)	...UM__________________	JJ.M............	ísiU/tní]	fosOM	mv ro s	[us.,ra	fogt.to
l 2	1.25	tíÕ4é	tuss	wra	roo	rs; l	.2B1..........	Ç6SS

'Tabela 9, Dadas de Fermentação para experimentos de cultivo de células cota

0.5 mg I de suplementação adicionai de zinco.

1 V s. X: seswst	Ci.’.Ki'sstfsp. de <Ό.'Α·.	ϊ Tb>.íi i ;S j Cretosscísl·:!	Tsxa d:·? f S!;?; çàí í	At 3 FRETS	AB EUSA:	srajraç EiSpeUtra	V mcrs	p.«m· A: Λ H
| áç iSUÍÍWXX | «síSíiwiws'	Vr ' UfiiíUs s-l·?	.. S ............	JJ.A..........	raurati			(ró.ra	i
	toS	e	oro	uras	;?< v>	ra?	5XM	0.TH
	j A?	Jiv'	afos	um.·?	A>m	7S9		GSO

Tabela 10, Dados du Fermentação para experimentos de cultivo de células com 1,0 mg/l,. implementação adsdonal de zinco.

: MT th : 3£·1Νίί?& d>2 i O&kw mí : <.μ!·ί;ΐίΕ·>ϊ·ί;;!<'>	(EíiKCri-KíS': >:> <fe UtOss	ísxa Esped fa <fe	J·.' Drogo	AT3 t'RETS	Aí 3 ELISA	.arooró .......... .	arosroo? <s? raras	líífiih' Í-S<Sío &A;<
pte COUsÇfH]	...IIT1.................		git '.Till i	krosj	(ròpra	(Ü/IAÍl	1
tgi	0.3Z'	u		.: ?=n	7?9	S7LZ	o.ao S,823
li......................	..IA___________________	0.939	...IW......1.AV1_____	M2	WX9

Exemplo 5

Experimentos de cultivo de células em batelada alimentada e qtam instalo foram realizados usando culturas de bioreatores de linhagem de células CHO nc^titon'antes # F6 expressando ADAMTS 13 humana, em. meio

162

BACD-A13 qmmfcamente definido. O e feito de stipiementaçãò do maio de cultura com nivefe mais elevados de zinco foi hn c-fogado.

As cehi'a^ CHO recombinaates que. expressam ADAMTS 13 humana foram, adaptadas a um meio químicamente definido de propriedade, 5 meio de BCS, em modo de batdada alimentada. As populações adaptadas foram suhclonada^. e um clone # F6 foi derivado das mesmas.

Resumidamente, DWCB # 19 foi descongelado e o inóculo de células foi preparado em meio de Bí 'S \s células foram transferidas para três buuívuiorts du L51 com impulsorera de lâmina e em mera BA('D· XI3 de 10 propriedade suplementado com 1,0 mg/L. 2.0 mg/L, e 3,0 mg/L de ZnSO^-HLO para concentrações finais de 1,4 '2 mg/L, 2,432 mg/L, e 3,432 I de / '80₁ 7ll>O relvei \amcle O\ c,;h loram cmtn Dos <ob um pH controlado em linha de 7J.5 a. 36X2, com uma conccalraçào dç oxigênio dissolvido de 20% de saluração do ar, (k eufovos foram crescido^ em modo de baiektda repetida 11 batektdasi por cerca de uma semana e u sobrenadante foi ensaiado para a predufoo de p'.olema à.' e afoúlade de Π\ΓΙ8~ν\\Γ3. lodo'; -re uês biorreatores foram então mudados para o modo de cultura de- quimiosiato e operados durante 1Õ dias sob condições de cultivo contmuo usando diferentes 20 meios cnut suplemenlaçòe' de /nuo, como < erarho u.nma l m erefofox.·· de euhura cm knelidu a'⁴ metada a suplenientacào dos meios de cultura min quantidades crescentes de zinco aumentou ainda mats a atividade especifica de AI3 scvretada w sobrenadante dc cultura. Consistente com os resultados anteriores relatados acima, a 25 suplcmentação do meio com um adicional de L0 mg/L de ZaSO.c7IbO resultou em uma elevada aliwdade esperança de 806 mlj/pg. Aumentos aua mm \ \ cokku.i' de ^v me, , to < j '-nplc^remeào u\k 2 n l e Lu mg I , resultou em nnea ainda mais ekoudos de aòxidade espeeit-ea de .Al ' (380 ml e 880 _ug_x req'eedxameutel babeui 20'i, «.'orno antes.

outros parâmetros, incluindo a produção de proteína A13 total e crescimento específico de células, não finam afetados pela suplementação com zinco adicional.

Tabela 1L Dados de Fermentação para experimentos em batelada with 5 suplementação adicional de zinco (media, de dados de 3 baldadas).

	:............................................................ C»í!eeRlraçàí> ífe tóalás	1b\u de cspraSeo	AO raras	AO siraa í	Ativsdsds ί:.φίί>:;&:(	Κ·ίηΟ:·ί;·..'>'α» íkí-REIS	raxo.
aCUwsJ	(WAXÒizára	Jtoi.............	UfiiraJ:	JíM.	,:faaUpL	pram)	tWLtáf
,í .<:· mg/Ç	;.?S	gw	:í>Aí;J	2/174	Wf.	ra/.s	éra?
2 ,δ ίΏχ0···	ÇÁ		ISWi	rara	«ra	rat &	rara
JO fíígl.	s,55	ora		rara	sra	rara	raro

Depois de mudar os bforreatorcs para o modo de quirniusíato.

os euhivos foram crescidos sub condições de cultivo contínuo, durante 10 Ji ro usando o< meios com diferentes supleinentações de rmeo, <romu descrito acima. Ás amostras do sobrenadimte dos biorreatores foram analisadas para a 10 produção de proteína A13 por ELISA e atividade de A13 por ensaio de IRMSAWl Ao contrario dos re^uhados obseixadus para tw cninvus crescidos sob modo de batelada alimentada, a suplememação do meio de crescimento usado para o erexcimemo de ea’roo rommuo ,ο'π ηήeri mais elevados de zinco re-ralara era uma dimlraàç.to da taxa de crerairaemo 15 especifico e viabilidade celular totnL A e-raura de qidmfostato cultivada cm meio supfememado com um adicional de 1,0 mg-L de ZmSO_r7H_:O coniíiumu a exibir a. viabilidade ee Infer elevaria (88,6%) e uma Taxa de crescimento especifico <0,2>ti pur dml (rebela 2Π eousísieme c»>m <w remhadro anteriores desertion aeima.

Em contraste, os cultivos crescidos em meios suplementados com níveis mais elevados de :^nSO._r7H_?O_? 2,0 mg/L e 3,0 mg/L, exibiram, rcdueõe^ significativas. nos mverc de viabilidade celular (72,1% a 80,433, respectivameufe) e taxas específicas de crescimento (0,091 e 0,134 por dia, respectsvamente). Notavelmente, no entanto, a atividade especifica do A13 25 nos dois sobrenadamvs de cultura peunuicceu elevada (btD mlf/ug, e 771 mUrçg. respectivamcntc) ( Tabela 21).

164

Tabela IX Dados de fermentação para experimentos de eultlvo de eéhüus em qfemios&to com supfementação adicional de zmeo

Exemplo õ

A proteína humana A.13 foi expressa na linhagem de células 5 CHO .recombiname # 640-2, em um .meio BACD-AI3 quimicamente definido suplementado com zinco adicional e mcotfeamida em: biorreatores de 50 L, Lp<\\ a colheita do·» sfevenadautes dos cuhixos. a cumpm içâu dm» etapas de ultra / diallliraçto ôuklh usando tampões com e sem zinco e cálcio foi realizada, \s célula¹» CIO) iroombmsaUes que expie» sare ADAM I Sl * humana foram adaptadas a um mero químicamente definido de propriedade, meio de BCS. Resumidameufe, um l.)W(, B foi descongelado e o inóefeo de células foi preparado em. meio de BCS> As células foram transferidas via um biorreator de 101, para um biorreator de 501, com Impfesores do tipo Rushton 15 e cultivadas em modo de quimioslato em meio BACD-A13 de propriedade '»oh um ρΗ eomrfeudu do em linha de 7.15.7,20 c »7'C, com uma concernração de oxigênio dissolvido de '20% de saturação do ar,

O.» 'robreuadanro' dos hirarcarorus foram Mirado⁴» e as colheitas isentas de células foram fetrafiltradas usando ums membrana PES 20 de 50 kl) i later de concern ração de aproximadamente l.hB u então diafihradus com 5 volumes de um tampão euntendo 50 mM de \a('l c 20 mM de TRIS em pH V, D tampão de diafiltração com ou sem 2 mM de Ca e 5 μΜ de Zn foi comparado para determinar o efeito sobre a perda de ativída entre a-diaflRraçâo e a purificação cromatngrãfica.

As atividades especificas, registradas com»? mV de FREISVWF73 pm pg de A13 detectado por ELISA, foram (ieterminadas

Íã5 imedialamente apés. a diafiltração e logo antes de carregar a amostra para purificação adicional. As amostras: foram armazenadas entro cerca de 2 e 8 *C durante um tempo máximo de 3 dias (cerca de menos .que 80 horas). Quando as amostras foram armazenadas por longos períodos de tempo, foram 5 mantidas a menos que -15 entre o final da diatihração e o início da cromatqgmfía. As amostras foram medidas e comparadas imcdiatamente após diafiliraçãp e logo antes de carregar a coluna eromatogrâfica,

Apesar do tempo de manutenção rekao emente curto entre as etapas de ultra / diafiltração e as etapas de purificação adicionais, uma perda. 10 signifemiva. de atividade especifica de A13 (2>.3%ι ocorreu quando o tampão de .diaiiitração não apresentou zinco e cálcio. Em contraste, quando o tampão de diafiltraçao contendo 2mM de Ca e 5 μΜ' de An foi usado, a perda dc atividade especí fica, de A15 B. D foi grandementa reduzida (Tabela 22), Tabefe. IX. Resultados- de experimentos de diafifeção usando tampão de 15 diafiltraçâo eom e sem cálcio c zinco

Arnosaa	Diafd tração	Ate idade Especifica apõs a .tefo-lrx k'	Atividade Específica na crava de purifkacâe	% de Perda ra ate idade
	sem CmZo		DO	2nu
Λ	sem CteZn	..................... 924	734	?!to
media	sem A. /u		737	' 2'
Desv. Padrão	sem ( a zh	53	4.2.	\ Λ
3	com CúvZn	849	335	l.c
	ctsm tZPZ.n	as|	985	' M'
5	cvm Ea/Za		877
<>	eum CcvZn	................. 1131	S44	?'>.4
Media	rori C; Λ,	965	835
Desv, Padrão .................	,-eum CteZa	119		X \

Exemplo 7

IK uietodro de culto o de cehua< commno em qmum^tek» e pu fusão torani comparados para dctermium a produção reLuEra e as específicas de A13 expressas em, várias linhagens de celulares CHO 20 recombinantcs.

Resumidamente, diferentes clones de células CHQ reeombinantes expressando A13 recombmante humana foram adaptados a. um meo q.'imu'rmcrnv deãmdu de pivpucdadc (BCsp que k<» U'ud<> p<na a prcparaçao de ínócuíos. As células foram ainda cultivadas em culturas de 5 bforeàtores em meio BACD-AI3· de propriedade suplementado com zinco c meotinamídaem concentrações finais do 1,432 mg/L de ZnSO^TH^O e 7,02 mg/L de meotinamidm Os inóculos a partir de cada clone de células foram então transferidos para dois biurreatores, dos quais um foi cultivado sob condições quimíostátíca (ÇST) e a outro. sob perlusão, como indicado na. 1(1 Tabela 23. As células foram cultivadas a uma densidade entre cerca: de 2x1 fo e 4x1 fo céluIas/mL em micrçtranspurtadores Cytopore ™ II (GE Biosciences),

Os cultivos;: foram crescidos sob condições de cultivo continuo durante 3 a 4 semanas a as amostras do sobrenadante a partir dos btonvatores

1.5 foram analisadas periodicamente para, a produção de proteína ,A13 por ELISA e ahx idade de \13 por vns.no de ΕΚΓ ISA \\ F⁷s Vmnre« indicado^ na Tabela 23 representam, médias para o período da semana 3 a 4. Consistente cnm os resultado vbudo¹- nos exe-uphis l a 0 miam. **s cultivo^ crescidas Oh qmmtortátfea produziram cerca de 1 mg/L/d a cerca de 2 mg /1.../4 de proteína 20 de A.I3 tendo elevadas atividades especificas de cerca de 70Ô mU/pg a cerca de 1000 rntVfig ( Tabela 23r Surproendenlememe, os cultivos crescidos sob condições de vultho de perfusà»» venfotentemente demonstraram mvei> de atividade é produção de proteína Al3 mais elevados no snbrenadanfe de cultura do que os clones idênticos crescidos em condições quimiostáticaSv As 25 atividades especificas para .Al3 produzida nos cultivos de perfurâo foram muito elevadas., com trás dos quatro clones demonstrando pelo menos ttrca de 1000 mUára.

Tabela 14. Retaliadas de ev.penm<-ntus comparando cultivo de célula' em quim instate e por perto silo.

167

Clone	: Vehene	:Mçdu	M mW, l spvCiÍK	Rendimento de xos	Rendimento .de A13
	i - í		[mb/ggl	[UZL/d]	hugXdj
1'6	ra a	ί'Ν Γ	800	800	L0
F6 ....................	16,0	Pe; fu m	IW0	1600	i .6
IM	13	( Sl	690	000	L3
1)6	1,5	riu \\u	860	1700	L9
XI	C5	1 s»	1040	XO	23
XI	1,5	Períusâo	1000	2600 :	2,6
E2	Μ	1	X)	500	0,7
E2	1,5	Perfusíin	1000	1600 ί
Exemplo 8

A :fim. de determinar o efeito da temperatura: e do pH sobre a: produção de proteína ADAMTS'l3 recombmante humana crescida em cultura de eelulas eucariotieas usando um mere de cultura isento de proteína animal 5 quimicamente definido, os cultivos foram. crescidos a temperaturas entre 35,0 Te X. a pH entre 7,05 e 730.

Resumidamente, as células C.HO recrmfoinantes que: expressam Al3 humana foram rnmXeridtra pára biorreatores de 1,5 I com impulsores de Lmnv-a. cm meio de BACDA1 - du propriedade Os ctfhho* 10 furam crcxeidm mh plí remebdu em Imha e entre ~ 05 e 730 a temperaturas sariando entre 35.0 '( s fo.O A\ imm uma concentração de oMgemu drasohfoo de 2^fJA de ramraçào du ar. tfo experimentes furam designados e executado* umiuIu a uburdagem de *upeuKàe de resposta. A tnalrie cstan^Uux* Ira tetta us.mdu o pacute de mfoxare escuram o XbnhxbT 15 15X0.

As amostras dos bforreamrcs foram tomadas e analisadas para Al3 por ELISA, a. atividade AI3 foi medida nnr itrauio de FR.ETS-A'WF73; As contagem du eehd.ra toram determmada* pur kvnofo.ua Xucleoeoupte». As taxas de diluição foram medidas e usadas para o cálculo das taxas de 20 ue*<. imentu v prodmA idade > \ nlumutrR m.

168

Como pode ser visto nas figuras 1 e 2, mnbas as temperatura, e pH u>eram mn cfeUo Mwskmrâil taue a praiuuxidade xohimcuka de ΛΙ 3 (medida por FRETS-AWl·'?}, Fig. 1), e atividade especifica (atividade da VW-.F73 / antigen© por-.ELISA,· .Fig, 2). Especificamente, a prodtoividade 5 volumétrlca de FRETS maxima foi. alcançada em culturas crescidas em uma iaixa menor de pH entre cerca de 7,05 e 7,2, especialmente cerca de 7,10 e temperaturas entre cerna, de 35,0 e 37,0 ®C, especialmente, cerca de 36®Ç. Especificamente, a atividade específica máxima (FRETS~V\VF73 para antígeno por ELISA) íòi alcançada em. culturas crescidas em txma faixa de p'B 10 menor entra cerca de 7,05 e 7,2, especialmente, abaixo de 7,10 e temperaturas entre cerca de 35,(FC e 37,0®C, especialmente abaixa de 36®C. Espaçificamente, às condições õtimas pára a produção de Al 3 foram alcançadas. com uma. combinação de uma temperatura de cerca: de 36®C e um pH de cerca de 7,10 em termos de qualidade do produto e rendimento ótimo.

Entende-se que os exemplos e modalidades descritos neste documento são apemis para fins iUratrarvos e que várias modificações ou mudanças a luz dos mesmos serão sugeridas por pessoas versadas na técnica e devem ser ínckwhs kkrato do espirito e aiesran do [negate peJfoo o tias reivmdicações anexas. Todas as publicações, patentes, e pedidos de 20 pakmle citados neste documento são incorporados neste documento por referência nasua-lolaluhde para todos os fins.

Claims (30)

1. REIVINDICAÇÕES

   1. Método para expressar uma proteína desintegrina e metaloproteinase com proteína de motivo trombospondina (ADAMTS), caracterizado pelo fato de que compreende cultivar uma célula albergando um ácido nucleico codificando uma proteína ADAMTS em um meio de cultura compreendendo pelo menos 3 μΜ de zinco.
2. 2. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o meio de cultura contém zinco entre cerca de 3 μΜ e cerca de 12 μΜ.
3. 3. Método, de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizado pelo fato de que o meio de cultura contém pelo menos cerca de 5 μΜ de zinco.
4. 4. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a

   3, caracterizado pelo fato de que o meio de cultura contém zinco entre cerca de 5 μ M e cerca de 12 μ M.
5. 5. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a

   4, caracterizado pelo fato de que o meio de cultura contém pelo menos cerca de 0,5 mM de cálcio.
6. 6. Método, de acordo com a reivindicação 5, caracterizado pelo fato de que o meio de cultura contém entre cerca de 0,5 mM e cerca de

   1,5 mM de cálcio.
7. 7. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 6, caracterizado pelo fato de que o meio de cultura ainda compreende pelo menos cerca de 2 mg/L de nicotinamida (vitamina B3).
8. 8. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 6, caracterizado pelo fato de que o meio de cultura ainda compreende pelo menos cerca de 7 mg/L de nicotinamida (vitamina B3).
9. 9. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 8, caracterizado pelo fato de que o meio de cultura contém entre cerca de 2 mg/L e cerca de 10 mg/L de nicotinamida (vitamina B3).
10. 10. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 9, caracterizado pelo fato de que o meio de cultura ainda compreende pelo menos cerca de 0,5 mg/L de poliamina.
11. 11. Método, de acordo com a reivindicação 10, caracterizado pelo fato de que a poliamina é putrescina.
12. 12. Método, de acordo com a reivindicação 11, caracterizado pelo fato de que o meio de cultura contém entre cerca de 2 mg/L e cerca de 8 mg/L de putrescina.
13. 13. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 12, caracterizado pelo fato de que o meio de cultura é isento de proteína animal ou é quimicamente definido.
14. 14. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 13, caracterizado pelo fato de que a célula é selecionada do grupo consistindo em uma célula bacteriana, uma célula de levedura, uma célula de inseto, uma célula aviária e uma célula de mamífero.
15. 15. Método, de acordo com a reivindicação 14, caracterizado pelo fato de que a célula de mamífero é uma linhagem de célula selecionada do grupo consistindo em uma linhagem de célula humana, uma linhagem de célula de hamster e uma linhagem de célula murina.
16. 16. Método, de acordo com a reivindicação 15, caracterizado pelo fato de que a linhagem de célula é selecionada do grupo consistindo em uma linhagem de célula CHO, uma linhagem de célula BHK e uma linhagem de célula HEK.
17. 17. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 16, caracterizado pelo fato de que o método compreende cultivo de célula em batelada.
18. 18. Método, de acordo com a reivindicação 17, caracterizado pelo fato de que o cultivo de célula em batelada é cultivo de célula em batelada repetida ou cultivo de célula em batelada alimentada.
19. 19. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 16 e 18, caracterizado pelo fato de que o método compreende cultivo de célula contínuo.
20. 20. Método, de acordo com a reivindicação 19, caracterizado pelo fato de que cultivo de célula contínuo compreende cultivo de célula em suspensão contínua ou cultivo de célula aderente contínuo.
21. 21. Método, de acordo com a reivindicação 20, caracterizado pelo fato de que o cultivo é realizado em modo quimiostato ou em modo perfusão.
22. 22. Método, de acordo com a reivindicação 20 ou 21, caracterizado pelo fato de que um microtransportador, preferivelmente um microtransportador poroso, é usado para cultivar a célula.
23. 23. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 18 a 22, caracterizado pelo fato de que a cultura é mantida por pelo menos 7 dias, pelo menos um mês, ou pelo menos dois meses.
24. 24. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 23, caracterizado pelo fato de que a cultura é mantida a uma temperatura entre cerca de 35°C e cerca de 37°C.
25. 25. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 24, caracterizado pelo fato de que a cultura é mantida a um pH entre cerca de 6,9 e cerca de 7,3, ou a um pH entre cerca de 7,05 e cerca de 7,15.
26. 26. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 25, caracterizado pelo fato de que a proteína ADAMTS é ADAMTS 13.
27. 27. Método, de acordo com a reivindicação 26, caracterizado pelo fato de que a atividade específica da proteína ADAMTS 13 no meio de cultura é de pelo menos cerca de 600U por mg de proteína ADAMTS 13, preferivelmente pelo menos cerca de 800U por mg de proteína ADAMTS 13.
28. 28. Método, de acordo com a reivindicação 26 ou 27, caracterizado pelo fato de que a cultura rende pelo menos cerca de 400U de atividade de ADAMTS 13 por L de cultura por dia (U/L/D), preferivelmente pelo menos cerca de 800U de atividade de ADAMTS 13 por L de cultura por dia (U/L/D).
29. 29. Método para produzir uma composição de ADAMTS, caracterizado pelo fato de que compreende as etapas de:

    (a) cultivar uma célula albergando um ácido nucleico codificando uma proteína ADAMTS em um meio de cultura isento de proteína animal;

    (b) remover uma fração do sobrenadante da cultura;

    (c) realizar uma etapa de filtração ou centrifugação para remover quaisquer células residuais;

    (d) realizar uma etapa de ultrafiltração para concentrar a proteína ADAMTS; e (e) realizar uma etapa de diafiltração com um tampão compreendendo pelo menos cerca de 0,5 μΜ de zinco e pelo menos cerca de 0,1 mM de cálcio; dessa forma preparando uma composição de ADAMTS.
30. 30. Composição de proteína ADAMTS, caracterizada pelo fato de que é preparada por um método compreendendo expressar a proteína ADAMTS em uma cultura de célula do método como definido nas reivindicações 1 a 28.