EA007465B1 - Процедура получения клеточных линий в безбелковых средах и клеточные линии, полученные этим способом - Google Patents
Процедура получения клеточных линий в безбелковых средах и клеточные линии, полученные этим способом Download PDFInfo
- Publication number
- EA007465B1 EA007465B1 EA200500695A EA200500695A EA007465B1 EA 007465 B1 EA007465 B1 EA 007465B1 EA 200500695 A EA200500695 A EA 200500695A EA 200500695 A EA200500695 A EA 200500695A EA 007465 B1 EA007465 B1 EA 007465B1
- Authority
- EA
- Eurasian Patent Office
- Prior art keywords
- protein
- cells
- concentration
- cell line
- protein concentration
- Prior art date
Links
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 50
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims abstract description 89
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims abstract description 89
- 230000003833 cell viability Effects 0.000 claims abstract description 11
- 239000012634 fragment Substances 0.000 claims abstract description 11
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 claims abstract description 10
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims description 123
- 239000002609 medium Substances 0.000 claims description 55
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 claims description 20
- 210000004962 mammalian cell Anatomy 0.000 claims description 17
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 claims description 17
- 230000012010 growth Effects 0.000 claims description 11
- 239000004017 serum-free culture medium Substances 0.000 claims description 9
- 230000035899 viability Effects 0.000 claims description 9
- 206010035226 Plasma cell myeloma Diseases 0.000 claims description 8
- 201000000050 myeloid neoplasm Diseases 0.000 claims description 8
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 claims description 6
- 102000007056 Recombinant Fusion Proteins Human genes 0.000 claims description 6
- 108010008281 Recombinant Fusion Proteins Proteins 0.000 claims description 6
- 239000012894 fetal calf serum Substances 0.000 claims description 6
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 claims description 6
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 claims description 6
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 claims description 5
- 239000006143 cell culture medium Substances 0.000 claims description 3
- 230000030833 cell death Effects 0.000 claims description 2
- 230000010261 cell growth Effects 0.000 claims description 2
- 230000004927 fusion Effects 0.000 claims 4
- 239000000427 antigen Substances 0.000 claims 2
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 claims 2
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 claims 2
- 230000006978 adaptation Effects 0.000 abstract description 29
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 abstract description 8
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 abstract 2
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 5
- 102000005962 receptors Human genes 0.000 description 4
- 108020003175 receptors Proteins 0.000 description 4
- 210000004978 chinese hamster ovary cell Anatomy 0.000 description 3
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 description 3
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 3
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 3
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 2
- 239000000654 additive Substances 0.000 description 2
- NOESYZHRGYRDHS-UHFFFAOYSA-N insulin Chemical compound N1C(=O)C(NC(=O)C(CCC(N)=O)NC(=O)C(CCC(O)=O)NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(NC(=O)CN)C(C)CC)CSSCC(C(NC(CO)C(=O)NC(CC(C)C)C(=O)NC(CC=2C=CC(O)=CC=2)C(=O)NC(CCC(N)=O)C(=O)NC(CC(C)C)C(=O)NC(CCC(O)=O)C(=O)NC(CC(N)=O)C(=O)NC(CC=2C=CC(O)=CC=2)C(=O)NC(CSSCC(NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(CC=2C=CC(O)=CC=2)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(C)NC(=O)C(CCC(O)=O)NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(CC=2NC=NC=2)NC(=O)C(CO)NC(=O)CNC2=O)C(=O)NCC(=O)NC(CCC(O)=O)C(=O)NC(CCCNC(N)=N)C(=O)NCC(=O)NC(CC=3C=CC=CC=3)C(=O)NC(CC=3C=CC=CC=3)C(=O)NC(CC=3C=CC(O)=CC=3)C(=O)NC(C(C)O)C(=O)N3C(CCC3)C(=O)NC(CCCCN)C(=O)NC(C)C(O)=O)C(=O)NC(CC(N)=O)C(O)=O)=O)NC(=O)C(C(C)CC)NC(=O)C(CO)NC(=O)C(C(C)O)NC(=O)C1CSSCC2NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(NC(=O)C(CCC(N)=O)NC(=O)C(CC(N)=O)NC(=O)C(NC(=O)C(N)CC=1C=CC=CC=1)C(C)C)CC1=CN=CN1 NOESYZHRGYRDHS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000011031 large-scale manufacturing process Methods 0.000 description 2
- 239000000047 product Substances 0.000 description 2
- 239000003531 protein hydrolysate Substances 0.000 description 2
- 208000023275 Autoimmune disease Diseases 0.000 description 1
- 101000914947 Bungarus multicinctus Long neurotoxin homolog TA-bm16 Proteins 0.000 description 1
- FERIUCNNQQJTOY-UHFFFAOYSA-M Butyrate Chemical compound CCCC([O-])=O FERIUCNNQQJTOY-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- FERIUCNNQQJTOY-UHFFFAOYSA-N Butyric acid Natural products CCCC(O)=O FERIUCNNQQJTOY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229920000858 Cyclodextrin Polymers 0.000 description 1
- 102000001301 EGF receptor Human genes 0.000 description 1
- 108060006698 EGF receptor Proteins 0.000 description 1
- 102000003951 Erythropoietin Human genes 0.000 description 1
- 108090000394 Erythropoietin Proteins 0.000 description 1
- 102000001690 Factor VIII Human genes 0.000 description 1
- 108010054218 Factor VIII Proteins 0.000 description 1
- CEAZRRDELHUEMR-URQXQFDESA-N Gentamicin Chemical compound O1[C@H](C(C)NC)CC[C@@H](N)[C@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O[C@@H]2[C@@H]([C@@H](NC)[C@@](C)(O)CO2)O)[C@H](N)C[C@@H]1N CEAZRRDELHUEMR-URQXQFDESA-N 0.000 description 1
- 229930182566 Gentamicin Natural products 0.000 description 1
- 101000976075 Homo sapiens Insulin Proteins 0.000 description 1
- 102000002265 Human Growth Hormone Human genes 0.000 description 1
- 108010000521 Human Growth Hormone Proteins 0.000 description 1
- 239000000854 Human Growth Hormone Substances 0.000 description 1
- 102000004877 Insulin Human genes 0.000 description 1
- 108090001061 Insulin Proteins 0.000 description 1
- WHXSMMKQMYFTQS-UHFFFAOYSA-N Lithium Chemical compound [Li] WHXSMMKQMYFTQS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000008072 Lymphokines Human genes 0.000 description 1
- 108010074338 Lymphokines Proteins 0.000 description 1
- 102000001938 Plasminogen Activators Human genes 0.000 description 1
- 108010001014 Plasminogen Activators Proteins 0.000 description 1
- 201000004681 Psoriasis Diseases 0.000 description 1
- 239000005862 Whey Substances 0.000 description 1
- 102000007544 Whey Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010046377 Whey Proteins Proteins 0.000 description 1
- 230000000996 additive effect Effects 0.000 description 1
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 1
- 239000003708 ampul Substances 0.000 description 1
- 239000007640 basal medium Substances 0.000 description 1
- 239000003114 blood coagulation factor Substances 0.000 description 1
- 229960000182 blood factors Drugs 0.000 description 1
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 description 1
- 239000000969 carrier Substances 0.000 description 1
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 1
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 1
- 229940105423 erythropoietin Drugs 0.000 description 1
- DNJIEGIFACGWOD-UHFFFAOYSA-N ethyl mercaptane Natural products CCS DNJIEGIFACGWOD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960000301 factor viii Drugs 0.000 description 1
- 229960002518 gentamicin Drugs 0.000 description 1
- ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N glutamine Natural products OC(=O)C(N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 210000001822 immobilized cell Anatomy 0.000 description 1
- 229940125396 insulin Drugs 0.000 description 1
- PBGKTOXHQIOBKM-FHFVDXKLSA-N insulin (human) Chemical compound C([C@@H](C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H]1CSSC[C@H]2C(=O)N[C@H](C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@H](C(=O)N[C@H](C(N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CC=3C=CC(O)=CC=3)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC=3C=CC(O)=CC=3)C(=O)N[C@@H](CSSC[C@H](NC(=O)[C@H](C(C)C)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CC=3C=CC(O)=CC=3)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H](C(C)C)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CC=3NC=NC=3)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)CNC1=O)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CC=1C=CC=CC=1)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC=CC=1)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(O)=O)=O)CSSC[C@@H](C(N2)=O)NC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H](C(C)C)NC(=O)[C@@H](NC(=O)CN)[C@@H](C)CC)[C@@H](C)CC)[C@@H](C)O)NC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)[C@H](CC(N)=O)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C(C)C)C1=CN=CN1 PBGKTOXHQIOBKM-FHFVDXKLSA-N 0.000 description 1
- 229910052744 lithium Inorganic materials 0.000 description 1
- 210000004698 lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- 239000002736 nonionic surfactant Substances 0.000 description 1
- 230000010412 perfusion Effects 0.000 description 1
- 229940127126 plasminogen activator Drugs 0.000 description 1
- OXCMYAYHXIHQOA-UHFFFAOYSA-N potassium;[2-butyl-5-chloro-3-[[4-[2-(1,2,4-triaza-3-azanidacyclopenta-1,4-dien-5-yl)phenyl]phenyl]methyl]imidazol-4-yl]methanol Chemical compound [K+].CCCCC1=NC(Cl)=C(CO)N1CC1=CC=C(C=2C(=CC=CC=2)C2=N[N-]N=N2)C=C1 OXCMYAYHXIHQOA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000035755 proliferation Effects 0.000 description 1
- 230000000644 propagated effect Effects 0.000 description 1
- 238000010188 recombinant method Methods 0.000 description 1
- HFHDHCJBZVLPGP-UHFFFAOYSA-N schardinger α-dextrin Chemical compound O1C(C(C2O)O)C(CO)OC2OC(C(C2O)O)C(CO)OC2OC(C(C2O)O)C(CO)OC2OC(C(O)C2O)C(CO)OC2OC(C(C2O)O)C(CO)OC2OC2C(O)C(O)C1OC2CO HFHDHCJBZVLPGP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000013207 serial dilution Methods 0.000 description 1
- 239000012679 serum free medium Substances 0.000 description 1
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 1
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 1
- 239000013589 supplement Substances 0.000 description 1
- 230000001502 supplementing effect Effects 0.000 description 1
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 1
- 238000001890 transfection Methods 0.000 description 1
- DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N β‐Mercaptoethanol Chemical compound OCCS DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
- C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
- C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
- C07K16/2803—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the immunoglobulin superfamily
- C07K16/2809—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the immunoglobulin superfamily against the T-cell receptor (TcR)-CD3 complex
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
- C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
- C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
- C07K16/2863—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against receptors for growth factors, growth regulators
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
- C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
- C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
- C07K16/2896—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against molecules with a "CD"-designation, not provided for elsewhere
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
- C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
- C12N5/0602—Vertebrate cells
- C12N5/0693—Tumour cells; Cancer cells
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
- C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
- C12N5/0602—Vertebrate cells
- C12N5/0693—Tumour cells; Cancer cells
- C12N5/0694—Cells of blood, e.g. leukemia cells, myeloma cells
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P21/00—Preparation of peptides or proteins
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/20—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin
- C07K2317/24—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin containing regions, domains or residues from different species, e.g. chimeric, humanized or veneered
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2500/00—Specific components of cell culture medium
- C12N2500/90—Serum-free medium, which may still contain naturally-sourced components
- C12N2500/95—Protein-free medium and culture conditions
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2510/00—Genetically modified cells
- C12N2510/02—Cells for production
Abstract
Настоящее изобретение относится к способу получения клонов клеток млекопитающих, адаптированных для роста в бессывороточных и безбелковых средах, где используемая процедура включает двустадийный процесс адаптации к росту в таких условиях. Настоящее изобретение относится к интервалу критических концентраций белка, в котором клетки должны выращиваться, с тем чтобы они сохранили способность выживать в бессывороточных и безбелковых условиях, так что в случае клеток, растущих в таком интервале критических концентраций, дальнейшее снижение концентрации не будет сказываться отрицательно ни на жизнеспособности, ни на времени удвоения клеток. Такой интервал критических концентраций является специфичным для конкретной клеточной линии. Кроме того, в настоящем изобретении описаны клоны клеток млекопитающих, которые сохраняют стабильность в бессывороточных и безбелковых средах в течение по меньшей мере 40 генераций; дополнительно, описанные в настоящем изобретении клоны экспрессируют рекомбинантный продукт. Клоны клеток, описанные в настоящем изобретении, продуцируют гуманизированные анти-EGF-R антитела hR3, гуманизированные анти-CD6 антитела T1hT, химерные анти-CD3 антитела T3Q или их фрагменты.
Description
Настоящее изобретение относится к биотехнологии, конкретно к способу получения стабильных клеточных клонов, адаптированных к бессывороточной и безбелковой среде в ходе двустадийного процесса адаптации.
Предпосылки создания изобретения
С момента начала внедрения методов культивирования клеток млекопитающих ίη νίΐτο выросла потребность в крупномасштабном производстве таких клеток в связи с тем, что многие получаемые при этом продукты имеют диагностическое и терапевтическое применение. Указанные полезные продукты включают моноклональные антитела, гормон роста человека, лимфокины, эритропоэтин, факторы свертывания крови и тканевые активаторы плазминогена.
Использование рекомбинантных моноклональных антител (гМаЬ) при лечении и диагностике ίη νίνο разных заболеваний включает во многих случаях применение для лечения высоких доз. Этот факт подводит к необходимости производства больших количеств необходимых гМаЬ с очень высокой степенью чистоты.
Некоторые рекомбинантные моноклональные антитела, которые имеют потенциал, позволяющий использовать их при лечении и диагностике рака и аутоиммунных заболеваний, экспрессируются в клетках миеломы N80, получаемых в Центре молекулярной иммунологии (Сеп1ег о£ Мо1еси1аг 1ттипо1оду). В патенте США 5891996 описывается получение химерных и гуманизированных антител против рецептора эпидермального фактора роста (ЕСЕ-К), применяемых при диагностике и лечении опухолей, экспрессирующих указанный рецептор. В \У0 97/19111 описываются анти-СЭ6 моноклональные антитела, применяемые для диагностики и лечения псориаза у пациентов. СамПопйо е1 а1. ίη НуЬпйота 9, Νο. 5, 1999 описали анти-СЭ3 моноклональные антитела, названные 10К-Т3а.
Для культивирования в безбелковой среде были разработаны различные методики. Так, в одном конкретном случае, были разработаны полностью безбелковые среды, которые позволяют осуществлять выращивание клеток в безбелковых условиях.
В \У0 97/05240 описывается экспрессия рекомбинантных белков в безбелковых условиях.
В 1Р 2696001 описывается использование безбелковой среды для получения фактора VIII в СНО клетках при добавлении неионного поверхностно-активного вещества или циклодекстрина для повышения продуктивной способности хозяйских клеток. Для повышения эффективности указанных добавок рекомендуется внесение, например, бутирата и лития.
В \У0 96/26266 описывается культивирование клеток в среде, которая включает глутаминсодержащий белковый гидролизат, в котором содержание свободных аминокислот составляет менее 15% от всего веса белка и в котором пептиды имеют вес менее 44 кДа. В качестве культуральной среды для культивирования клеточных культур используют синтетическую минимальную среду в качестве базовой среды, к которой, в дополнение к белковому гидролизату, добавляют, в том числе, фетальную сыворотку теленка, гентамицин и меркаптоэтанол. Использование среды, включающей сыворотку, для получения рекомбинантными методами факторов крови в указанном документе не рассматривается.
В патенте США № 5393668 А описываются специальные синтетические поверхности, которые позволяют растить прикрепляющиеся клетки в условиях безбелковой среды.
Для стимуляции пролиферации клеток СНО клетки, которые осуществляют суперэкспрессию человеческого инсулина, размножают на искусственном субстрате, с которым ковалентно связывается инсулин (Ιΐο е1 а1., 1996 ΡΝΑ8 И.8.Л.. 93:3598-3601).
Кейег е1 а1. (1992, Су1о1есйпо1оду 9:247-253) описывают иммобилизацию Г-СН0 клеток, выращенных в бессывороточной среде с высокой плотностью, на носителях с последующей перфузией через иммобилизованные клетки безбелковой среды в ходе фазы продукции, при которой происходит непрерывное высвобождение белка в клеточный супернатант. Таким образом, клетки могут поддерживаться в течение менее 10 генераций в безбелковой среде.
Способы, успешно применявшиеся ранее для крупномасштабного получения клеточных культур в безбелковых условиях, описаны применительно к клеточным линиям; в частности для νΕΚ0 клеток (\У0 96/15231). Таким образом, клетки могут расти в бессывороточных и безбелковых условиях, начиная с исходной ампулы до крупного технического процесса масштабом до 1200 л.
Процесс адаптации клеток, которые вначале выращивались в условиях, включающих сыворотку, к безбелковой среде представляет собой трудную задачу, требующую обычно много времени; кроме того, неоднократно было показано, что выход экспрессированного белка и производительность рекомбинантных СНО клеток существенно снижаются при адаптации к безбелковым условиям в сравнении с условиями, включающими сыворотку (Ра1ег8оп е1 а1., 1994, Лрр1. М1сгоЬю1. Вю1ес11по1. 40:691-658). Указанное явление представляет собой следствие нестабильности или сниженного роста рекомбинантных клонов в измененных условиях культивирования. Несмотря на использование стабильных исходных клонов, большая часть клеток снова становится клетками со сниженной экспрессией или даже непродуцентами, которые обгоняют в росте клеткипродуценты в ходе процесса продуцирования, за счет чего культура в ферментере в итоге полностью становится культурой непродуцирующих клеток или таких клеток, которые характеризуются низким уровнем экспрессии.
В настоящем изобретении авторы предлагают подход для разработки стабильных клеточных линий,
- 1 007465 адаптированных к бессывороточным и безбелковым средам. В соответствии с этим подходом выделяют несколько клонов в безбелковой среде.
Подробное описание изобретения
Две стадии адаптации клеточных линий к безбелковой среде
Эта процедура включает использование линий клеток млекопитающих, в отношении которых не представляется возможным осуществить процедуру непосредственной адаптации из среды, включающей сыворотку, или из бессывороточной среды к безбелковой среде.
Способ по настоящему изобретению состоит из двустадийного процесса, в ходе которого осуществляется адаптация клеточных линий к безбелковой среде (РЕМ).
Первая стадия, которая рассматривается как некритическая стадия, представляет собой снижение содержания белка без потери жизнеспособности клеток, в ходе которой не отмечается важного для популяции снижения времени удвоения клеток на каждой стадии при изменении концентрации белка. Некритическая стадия обычно имеет место при общей концентрации белка от 5 до 0,5 мг/мл в культуральной среде, и при этом культура демонстрирует практически те же ростовые характеристики, что и в исходной культуральной среде.
Эта первая стадия начинается с уровня жизнеспособности клеточной линии, характеризующейся показателями от 80 до 100%, и клетки растут в культуральных средах при последовательном снижении концентрации белка вплоть до критической концентрации, при которой жизнеспособность клеток падает до 0%. Указанная концентрация белка представляет собой исходную точку для следующей стадии.
Вторая стадия, которая рассматривается как критическая: на данной стадии происходит снижение жизнеспособности клеток и показателя времени удвоения клеток, а также может потребоваться больше времени для их адаптации при переходе с одной стадии на другую стадию, определяемой по концентрации белка. Существуют критические концентрации белка в культуральной среде, которую невозможно миновать в ходе адаптационного процесса. Указанные критические концентрации белка являются специфичными для каждой рекомбинантной клеточной линии, но обычно они ниже 0,6 мг/мл. Как только клетки восстанавливают свои исходные показатели жизнеспособности и скорости роста при данных критических концентрациях белка, создается возможность для их субкультивирования в следующих условиях со сниженной концентрацией белка.
Когда критическая концентрация белка имеет фиксированное значение, ближайшая повышенная концентрация белка, которая поддерживает рост клеток, рассматривается как предкритическая концентрация белка. Начиная с предкритической концентрации белка, указанную концентрацию медленно снижают до восстановления клетками исходных показателей жизнеспособности и скорости роста.
Выбранное сочетание стадий, применяемое для снижения концентрации белка на критической стадии, будет определять общее время адаптации на данной стадии, и скорость адаптации (Уадапт.) вычисляется по следующему уравнению:
Уядяпт = Δ Концентрация белка/ΔΤ.
Однако это сочетание стадий не будет влиять на время, необходимое для адаптации к каждой из взятых концентраций белка, включая критические концентрации. Для определения конечной точки некритической стадии и критических концентраций белка необходимо осуществлять постадийную адаптацию, при проведении серийного разбавления клеточной культуры желательной безбелковой средой, при котором каждый раз концентрацию белка снижают в 2 раза (см. таблицу). Указанное снижение может быть осуществлено путем снижения содержания сыворотки или добавки основной среды с разными уровнями некоторых обогащенных белками заменителей сыворотки.
Постадийное снижение концентрации белка для определения критических концентраций, начиная с использования культуральной среды, содержащей в качестве добавок 5 мг/мл белка (эквивалентно 10% фетальной сыворотки теленка)
Пояснение к таблице
ЕВ8 - фетальная сыворотка теленка
РЕМ - безбелковая среда
8СМ - среда, содержащая сыворотку * Общее содержание белка в фетальной сыворотке теленка принимается равным примерно 50 мг/мл
- 2 007465
Перед началом процедуры адаптации клетки поддерживают в Т-бутылях при показателях жизнеспособности не ниже 80% с использованием стандартной среды, обычно используемой для культивирования клеток.
Процесс адаптации осуществляют постадийно, выполняя описанные ниже стадии.
ί. Высеивают в 3 ячейки в шестиячеечном планшете для культивирования клеток рекомбинантную клеточную линию с использованием стандартной культуральной среды для культивирования клеток (с исходной концентрацией белка). Плотность клеток должна составлять 1-5 х 105 клеток/мл. Через 48 ч половину супернатанта заменяют свежей безбелковой средой, что приводит к достижению конечной концентрации белка, составляющей 50% от ее значения в исходных условиях.
ίί. Каждые 48 ч супернатант полностью заменяют свежей культуральной средой, в которой концентрация белка составляет 50% от исходных условий.
ίίί. Клетки растят до слияния при данной белковой концентрации.
ίν. Клетки со стадии ίίί высеивают по меньшей мере в 3 ячейки с плотностью в диапазоне 1-5 х 105 клеток/мл в культуральной среде, в которой содержание белка составляет 50% от его концентрации в исходных условиях. Через 48 ч половину супернатанта заменяют свежей безбелковой средой, что приводит к достижению конечной концентрации белка, составляющей 50% от ее значения в предыдущих условиях.
ν. Каждые 48 ч супернатант полностью заменяют свежей культуральной средой, в которой концентрация белка составляет 50% от исходных условий.
νί. Клетки растят до слияния при данной белковой концентрации.
νίί. Стадии (ίν)-(νί) повторяют, при этом в ходе каждого цикла концентрацию белка снижают до 50% относительно концентрации в предыдущем цикле. Процедуру повторяют до достижения концентрации белка, которая вызывает гибель клеток.
νίίί. Клетки из клеточной культуры с показателями жизнеспособности 80% или выше высеивают с использованием предкритической концентрации белка по меньшей мере в 3 ячейки с плотностью в диапазоне 2-6 х 105 клеток/мл. Клетки растят при предкритической концентрации белка и через 48 ч 25% супернатанта заменяют свежей безбелковой средой, с достижением при этом конечной концентрации белка, которая составляет 75% от предкритической концентрации белка.
ΐχ. Каждые 48 ч супернатант полностью заменяют свежей культуральной средой, в которой концентрация белка составляет 75% от предкритической концентрации белка.
х. Клетки растят до слияния при данной белковой концентрации.
χί. Клетки со стадии (х) высеивают по меньшей мере в 3 ячейки с плотностью 2-6 х 105 клеток/мл в культуральной среде, в которой содержание белка составляет 75% от предкритической концентрации белка. Через 48 ч 25% супернатанта заменяют свежей безбелковой средой, с достижением при этом конечной концентрации белка, которая составляет 75% от концентрации на предыдущей стадии.
χίί. Каждые 48 ч супернатант полностью заменяют свежей культуральной средой, в которой концентрация белка составляет 75% от концентрации на стадии (х).
χίίί. Клетки растят до слияния при данной белковой концентрации.
χίν. Стадии (χί)-(χίίί) повторяют, при этом в ходе каждого цикла концентрацию белка снижают до 75% относительно концентрации в предыдущем цикле и далее процедуру повторяют до достижения концентрации белка, которая не вызывает потери жизнеспособности клеток и снижения времени удвоения клеток в популяции. Когда клетки переносят в среду со сниженной концентрацией белка и они способны расти без потери жизнеспособности клеток и снижения времени удвоения клеток в популяции перед первым субкультивированием, авторы считают, что такие клетки достигли снова некритической стадии, и высеивают их непосредственно в безбелковой среде (концентрация белка 0 мг/мл).
В процедуре осуществления настоящего изобретения исходная культуральная среда содержит фетальную сыворотку теленка в количестве от 5 до 10%.
Линия клеток млекопитающих, адаптированная для роста в безбелковой среде, представляет собой миеломную линию, в частности N80 клетки.
Настоящее изобретение также может быть полезно в том случае, когда используют линию клеток N80, трансфицированных полипептидом или рекомбинантным белком, в частности, когда осуществляется трансфекция последовательностью, кодирующей рекомбинантное антитело или его фрагменты. Описываются также линии клеток млекопитающих, модифицированные в соответствии с процедурой по настоящему изобретению, которые растут в безбелковой среде.
Другой вариант настоящего изобретения относится к любой линии клеток млекопитающих, экспрессирующих гуманизированные или химерные антитела, выбранные из группы, состоящей из антител против рецептора ЕСР 11Р3. анти-СЭ6 Т1ЙТ, анти-СЭЗ Т3С или их фрагментов, растущих в безбелковой среде, так что эти антитела могут секретироваться этими клеточными линиями.
Клеточные линии, получаемые способом согласно изобретению, поддерживают стабильный рост в безбелковой среде в течение по меньшей мере 40 генераций.
Примеры
Пример 1. Адаптация рекомбинантной клеточной линии 11Р3 к безбелковой среде.
Рекомбинантную клеточную линию 11Р3 получают путем трансфекции миеломной клеточной линии
- 3 007465
N80 векторными конструкциями для достижения экспрессии легкой и тяжелой цепей гуманизированного моноклонального антитела против рецептора человеческого БОЕ 11Κ3. Адаптацию этой клеточной линии к безбелковой среде осуществляют по описанной ранее процедуре, в процессе двустадийного снижения содержания белка в среде.
Указанные клетки вначале культивируют в среде ΚΡΜΙ-1640 с добавкой 10% БВ8. Замещение БВ8 осуществляют за счет внесения обогащенной белком добавки МЦпйоша N8 (Воейппдег Μαηΐιοίιη) к безбелковой среде ΚΡΜΙ-1640, когда концентрация белка достигнет 0,15 мг/мл. Снижение содержания белка в исходной среде осуществляют путем последовательных разбавлений с использованием безбелковой среды РБНМ-ΙΙ (О1Ьео).
На фиг. 1 и 2, соответственно, показаны результаты вычисления критических концентраций и скоростей адаптации Уадапт..
Пример 2. Адаптация рекомбинантной клеточной линии Т111Т к безбелковой среде.
Рекомбинантную клеточную линию Т111Т получают путем трансфекции миеломной клеточной линии N80 векторными конструкциями для достижения экспрессии легкой и тяжелой цепей гуманизированного по методу Т-супрессии эпитопа моноклональными антителами против человеческого СЭ6.
Адаптацию этой клеточной линии к безбелковой среде осуществляют по процедуре, описанной в п.2, в ходе двустадийного процесса снижения содержания белка в среде.
Указанные клетки культивируют в среде ΚΡΜΙ-1640 с добавкой 10% БВ8. Снижение содержания белка в исходной среде осуществляют путем последовательных разбавлений с использованием безбелковой среды РБНМ-ΙΙ (О1Ьео).
Результаты вычисления критических концентраций и скоростей адаптации Уадапт. показаны на фиг. 3 и 4, соответственно.
Пример 3. Адаптация рекомбинантной клеточной линии Т30 к безбелковой среде.
Рекомбинантную клеточную линию Т30 получают путем трансфекции миеломной клеточной линии N80 векторными конструкциями для достижения экспрессии легкой и тяжелой цепей гуманизированного моноклонального антитела Т30. который распознает рецептор СЭ3 на человеческих лимфоцитах.
Адаптацию этой клеточной линии к безбелковой среде проводят по процедуре, описанной в п.2, в ходе двустадийного процесса снижения содержания белка в среде.
Указанные клетки культивируют в среде ΚΡΜΙ-1640 с добавкой 10% БВ8. Снижение содержания белка в исходной среде осуществляют путем последовательных разбавлений с использованием безбелковой среды ΡΕΗΜ-ΙΙ (О1Ьео).
Результаты вычисления критических концентраций и скоростей адаптации Уадапт. показаны на фиг. 5 и 6, соответственно.
Краткое описание чертежей
Фиг. 1. Корреляция времени, необходимого для адаптации 11-Κ3 клеток к каждой из исследуемых концентраций (до восстановления жизнеспособности и показателя времени удвоения клеток), и натурального логарифма величины, обратной концентрации белка. Значения критических концентраций для линии клеток 11-Κ3 составляют 0,32 и 0,11 мг/мл применительно к общей концентрации белка.
Фиг. 2. Корреляция суммарного периода времени от момента начала процесса адаптации по используемой процедуре и натурального логарифма величины, обратной концентрации белка, для линии клеток 11-Κ3. Показатели скоростей адаптации для линии клеток Η-Κ3 составляют 0,0053 мг/день.
Фиг. 3. Корреляция времени, необходимого для адаптации Т111Т клеток к каждой из исследуемых концентраций (до восстановления жизнеспособности и показателя времени удвоения клеток), и натурального логарифма величины, обратной концентрации белка. Значения критических концентраций для линии клеток Т111Т составляют 0,12 и 0,01 мг/мл применительно к общей концентрации белка.
Фиг. 4. Корреляция суммарного периода времени от момента начала процесса адаптации по используемой процедуре и натурального логарифма величины, обратной концентрации белка, для линии клеток Т1Ы. Показатели скоростей адаптации для линии клеток Т1Н1 составляют 0,0014 мг/день.
Фиг. 5. Корреляция времени, необходимого для адаптации Т30 клеток к каждой из исследуемых концентраций (до восстановления жизнеспособности и показателя времени удвоения клеток), и натурального логарифма величины, обратной концентрации белка. Значения критических концентраций для линии клеток Т30 составляют 0,63 мг/мл применительно к общей концентрации белка.
Фиг. 6. Корреляция суммарного периода времени от момента начала процесса адаптации по используемой процедуре и натурального логарифма величины, обратной концентрации белка, для линии клеток Т30. Показатели скоростей адаптации для линии клеток Т30 составляют 0,0172 мг/день.
Claims (20)
- ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ1. Способ получения линии клеток млекопитающих, адаптированных к росту в бессывороточных и безбелковых средах, который включает две стадии:Ι) первую стадию, в ходе которой показатели жизнеспособности клеток в клеточной линии состав- 4 007465 ляют от 80 до 100% и клетки выращивают в культуральных средах, в которых последовательно снижают содержание белка до критической концентрации белка, при которой жизнеспособность клеток падает до 0%;II) вторую стадию, в ходе которой, на основе уже определенной критической концентрации белка, поддерживают предкритическую концентрацию как такую концентрацию белка, при которой клеточный рост возможен, фиксируя ее как исходную точку для дальнейшего медленного снижения концентрации белка до момента, когда клеточная культура достигнет исходных показателей жизнеспособности клеток и времени удвоения клеток в популяции.
- 2. Способ по п.1, отличающийся тем, что первая стадия состоит из следующих стадий:ί) высеивают в 3 ячейки в шестиячеечном планшете для культивирования клеток рекомбинантную клеточную линию с использованием стандартной культуральной среды для культивирования клеток (с исходной концентрацией белка); плотность клеток должна составлять 1-5 х 105 клеток/мл; через 48 ч половину супернатанта заменяют свежей безбелковой средой, что приводит к достижению конечной концентрации белка, составляющей 50% от ее значения в исходных условиях;ίί) каждые 48 ч супернатант полностью заменяют свежей культуральной средой, в которой концентрация белка составляет 50% от исходных условий;ϊϊΐ) клетки растят до слияния при данной белковой концентрации;ίν) клетки со стадии ш высеивают по меньшей мере в 3 ячейки с плотностью в диапазоне 1-5 х 105 клеток/мл в культуральной среде, в которой содержание белка составляет 50% от его концентрации в исходных условиях; через 48 ч половину супернатанта заменяют свежей безбелковой средой, что приводит к достижению конечной концентрации белка, составляющей 50% от ее предыдущего значения;ν) каждые 48 ч супернатант полностью заменяют свежей культуральной средой, в которой концентрация белка составляет 50% от ее предыдущего значения;νί) клетки растят до слияния при данной белковой концентрации;νίί) стадии (ίν)-(νί) повторяют, при этом в ходе каждого цикла концентрацию белка снижают до 50% относительно концентрации в предыдущем цикле; процедуру повторяют до достижения концентрации белка, которая вызывает гибель клеток.
- 3. Способ по п.1, отличающийся тем, что вторая стадия состоит из следующих стадий:νίίί) клетки из клеточной культуры с показателями жизнеспособности 80% или выше высеивают с использованием предкритической концентрации белка по меньшей мере в 3 ячейки с плотностью в диапазоне 2-6 х 105 клеток/мл; клетки растят при предкритической концентрации белка и через 48 ч 25% супернатанта заменяют свежей безбелковой средой, с достижением при этом конечной концентрации белка, которая составляет 75% от предкритической концентрации белка;ίχ) каждые 48 ч супернатант полностью заменяют свежей культуральной средой, в которой концентрация белка составляет 75% от предкритической концентрации белка;х) клетки растят до слияния при данной белковой концентрации;χί) клетки со стадии (х) высеивают по меньшей мере в 3 ячейки с плотностью 2-6 х 105 клеток/мл в культуральной среде, в которой содержание белка составляет 75% от предкритической концентрации белка; через 48 ч 25% супернатанта заменяют свежей безбелковой средой, с достижением при этом конечной концентрации белка, которая составляет 75% от концентрации на предыдущей стадии;χίί) каждые 48 ч супернатант полностью заменяют свежей культуральной средой, в которой концентрация белка составляет 75% от концентрации на стадии (х);χίίί) клетки растят до слияния при данной белковой концентрации;χίν) стадии (χί)-(χίίί) повторяют, при этом в ходе каждого цикла концентрацию белка снижают до 75% относительно концентрации в предыдущем цикле и далее процедуру повторяют до достижения концентрации белка, которая не вызывает потери жизнеспособности клеток и снижения времени удвоения клеток в популяции; когда клетки переносят в среду со сниженной концентрацией белка и они способны расти без потери жизнеспособности клеток и без снижения времени удвоения клеток в популяции перед первым субкультивированием, авторы считают, что такие клетки достигли снова некритической стадии, и высеивают их непосредственно в безбелковой среде (концентрация белка 0 мг/мл).
- 4. Способ по пп.1-3, где бессывороточная и безбелковая среда, в которую клетки первоначально высеивают, включает от 5 до 10% фетальной сыворотки теленка.
- 5. Способ по пп.1-4, где линия клеток млекопитающих, адаптированных для роста в бессывороточных и безбелковых средах, представляет собой миеломную линию.
- 6. Способ по п.5, где миеломная линия представляет собой клеточную линию N80.
- 7. Способ по п.6, где указанная клеточная линия N80 содержит последовательность, кодирующую рекомбинантный полипептид или рекомбинантный белок.
- 8. Способ по п.7, где последовательность, кодирующая рекомбинантный полипептид или рекомбинантный белок, кодирует рекомбинантное антитело или его фрагмент.
- 9. Линия клеток млекопитающих, полученная способом по пп.1-8, где указанная клеточная линия адаптирована для роста в бессывороточных и безбелковых средах.
- 10. Линия клеток млекопитающих по п.9, где указанная линия клеток млекопитающих представляет- 5 007465 собой миеломную линию.
- 11. Линия клеток млекопитающих по п.10, где указанная клеточная линия представляет собой клеточную линию N80.
- 12. Линия клеток млекопитающих по п.11, где клеточная линия N80 содержит последовательность, кодирующую рекомбинантный полипептид или рекомбинантный белок.
- 13. Линия клеток млекопитающих по п.12, где последовательность, кодирующая рекомбинантный полипептид или рекомбинантный белок, кодирует рекомбинантное антитело или его фрагмент.
- 14. Линия клеток млекопитающих по п.13, где последовательность кодирует гуманизированное рекомбинантное анти-ΕΘΕ-Κ ΙτΚ3 антитело или его фрагмент.
- 15. Линия клеток млекопитающих по п.13, где последовательность кодирует гуманизированное рекомбинантное анти-СЭ6 Т1НТ антитело или его фрагмент.
- 16. Линия клеток млекопитающих по п.13, где последовательность кодирует химерное рекомбинантное анти-СЭ3 Т3^ антитело или его фрагмент.
- 17. Применение способа по пп.1-8 для получения линии клеток млекопитающих, адаптированных для роста в бессывороточной и безбелковой среде.
- 18. Гуманизированное моноклональное антитело к ΕΘΕ-Κ ΙτΚ3 или его фрагменты, секретируемое клетками, полученными способом по пп.1-8.
- 19. Гуманизированное моноклональное антитело против антигена СЭ6 Т1НТ или его фрагменты, секретируемое клетками, полученными способом по пп.1-8.
- 20. Химерное моноклональное антитело против антигена СЭ3 Т3^ или его фрагменты, секретируемое клетками, полученными способом по пп.1-8.
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CU20020239A CU23097A1 (es) | 2002-10-23 | 2002-10-23 | Método para la obtención de líneas celulares en medio libre de proteína y líneas celulares obtenidas por este método |
| PCT/CU2003/000012 WO2004038010A1 (es) | 2002-10-23 | 2003-10-22 | Método para la obtención de líneas celulares en medio libre de proteína y líneas celulares obtenidas por este método |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| EA200500695A1 EA200500695A1 (ru) | 2005-10-27 |
| EA007465B1 true EA007465B1 (ru) | 2006-10-27 |
Family
ID=40134843
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| EA200500695A EA007465B1 (ru) | 2002-10-23 | 2003-10-22 | Процедура получения клеточных линий в безбелковых средах и клеточные линии, полученные этим способом |
Country Status (27)
| Country | Link |
|---|---|
| US (2) | US20060036082A1 (ru) |
| EP (2) | EP2363418B1 (ru) |
| JP (1) | JP4674087B2 (ru) |
| KR (1) | KR101186048B1 (ru) |
| CN (1) | CN1714147B (ru) |
| AR (1) | AR041645A1 (ru) |
| AT (1) | ATE502103T1 (ru) |
| AU (1) | AU2003273727B2 (ru) |
| CA (1) | CA2503315C (ru) |
| CU (1) | CU23097A1 (ru) |
| DE (1) | DE60336415D1 (ru) |
| DK (1) | DK1564285T3 (ru) |
| EA (1) | EA007465B1 (ru) |
| EC (1) | ECSP055740A (ru) |
| ES (2) | ES2624279T3 (ru) |
| GE (1) | GEP20084444B (ru) |
| HK (1) | HK1084414A1 (ru) |
| HR (1) | HRP20050760A2 (ru) |
| LT (1) | LT5354B (ru) |
| LV (1) | LV13361B (ru) |
| MY (1) | MY144088A (ru) |
| NZ (1) | NZ540171A (ru) |
| PE (1) | PE20040552A1 (ru) |
| PT (1) | PT1564285E (ru) |
| TN (1) | TNSN05116A1 (ru) |
| UY (1) | UY28037A1 (ru) |
| WO (1) | WO2004038010A1 (ru) |
Families Citing this family (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN104673754B (zh) * | 2015-02-14 | 2018-03-02 | 百泰生物药业有限公司 | 重组骨髓瘤细胞克隆的筛选方法及由此获得的抗体分子 |
| CN104651314B (zh) * | 2015-02-14 | 2018-06-19 | 百泰生物药业有限公司 | 获得高产稳定表达细胞克隆的方法及由此获得的抗体分子 |
Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| AU2986484A (en) * | 1983-06-27 | 1985-01-03 | Monash University | Leptospira strains grown in protein free medium |
| US6100061A (en) * | 1997-06-20 | 2000-08-08 | Immuno Aktiengesellschaft | Recombinant cell clone having increased stability in serum- and protein-free medium and a method of recovering the stable cell clone and the production of recombinant proteins by using a stable cell clone |
Family Cites Families (17)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US3694263A (en) * | 1970-10-23 | 1972-09-26 | Joseph J Korn Sr | Swimming pool cleaning methods and apparatus therefor |
| CU22545A1 (es) * | 1994-11-18 | 1999-03-31 | Centro Inmunologia Molecular | Obtención de un anticuerpo quimérico y humanizado contra el receptor del factor de crecimiento epidérmico para uso diagnóstico y terapéutico |
| US3886616A (en) * | 1972-12-06 | 1975-06-03 | Fay A Hayes | Hand propelled swimming pool cleaner |
| US4275474A (en) * | 1979-04-30 | 1981-06-30 | Woodard Randle C | Vacuum head for swimming pool cleaning system |
| US4240174A (en) * | 1979-07-30 | 1980-12-23 | Scott Jeffrey L | Self-contained mobile pool cleaning apparatus |
| US4430214A (en) * | 1982-09-15 | 1984-02-07 | Baker Marvin E | Strainer mill for swimming pool pump intake |
| US4558479A (en) * | 1984-01-26 | 1985-12-17 | Alopex Industries, Inc. | Pool cleaner |
| US4683599A (en) * | 1984-03-30 | 1987-08-04 | Fahet Nv | Automatic pool cleaner fitting |
| US4581075A (en) * | 1985-03-15 | 1986-04-08 | Maxi-Sweep, Inc. | Self-propelled water borne pool cleaner |
| AU6291090A (en) | 1989-09-29 | 1991-04-28 | Atomic Energy Of Canada Limited | Infrared-based gas detector |
| JP2696001B2 (ja) | 1991-04-15 | 1998-01-14 | 財団法人化学及血清療法研究所 | 組換え蛋白質産生用培地 |
| EP0531562A1 (de) | 1991-09-11 | 1993-03-17 | Doerr, Hans-Wilhelm, Prof. Dr. med. | Kultivierung von Säugetierzellen |
| PT784684E (pt) * | 1994-09-16 | 2007-11-23 | Cancer Res Fund Of Contra Cost | ''péptidos recontinantes derivados do anticorpo mc3 anti-ba46, métodos para a sua utilização e métodos de hmnanização de péptidos do anticorpo'' |
| JP3158157B2 (ja) | 1994-11-10 | 2001-04-23 | バクスター・アクチエンゲゼルシャフト | 無蛋白培養における生物製剤の製造法 |
| AU703484B2 (en) | 1995-02-23 | 1999-03-25 | Quest International Services B.V. | Peptides for tissue and cell culture media |
| AUPN442295A0 (en) | 1995-07-26 | 1995-08-17 | Commonwealth Scientific And Industrial Research Organisation | Regulated autocrine growth of mammalian cells |
| CU22584A1 (es) | 1995-11-17 | 1999-11-03 | Centro Inmunologia Molecular | Composiciones farmacéuticas que contienen un anticuerpo monoclonal que reconoce el antígeno de diferenciación leucocitario humano cd6 y sus usos para el diagnóstico y tratamiento de la psoriasis |
-
2002
- 2002-10-23 CU CU20020239A patent/CU23097A1/es unknown
-
2003
- 2003-10-10 PE PE2003001035A patent/PE20040552A1/es not_active Application Discontinuation
- 2003-10-16 AR ARP030103776A patent/AR041645A1/es active IP Right Grant
- 2003-10-17 MY MYPI20033959A patent/MY144088A/en unknown
- 2003-10-22 CA CA2503315A patent/CA2503315C/en not_active Expired - Lifetime
- 2003-10-22 DE DE60336415T patent/DE60336415D1/de not_active Expired - Lifetime
- 2003-10-22 EP EP11155076.0A patent/EP2363418B1/en not_active Expired - Lifetime
- 2003-10-22 GE GEAP20038815A patent/GEP20084444B/en unknown
- 2003-10-22 AT AT03757654T patent/ATE502103T1/de active
- 2003-10-22 ES ES11155076.0T patent/ES2624279T3/es not_active Expired - Lifetime
- 2003-10-22 NZ NZ540171A patent/NZ540171A/en not_active IP Right Cessation
- 2003-10-22 EP EP03757654A patent/EP1564285B1/en not_active Expired - Lifetime
- 2003-10-22 PT PT03757654T patent/PT1564285E/pt unknown
- 2003-10-22 ES ES03757654T patent/ES2360049T3/es not_active Expired - Lifetime
- 2003-10-22 WO PCT/CU2003/000012 patent/WO2004038010A1/es active IP Right Grant
- 2003-10-22 CN CN2003801036918A patent/CN1714147B/zh not_active Expired - Lifetime
- 2003-10-22 DK DK03757654.3T patent/DK1564285T3/da active
- 2003-10-22 AU AU2003273727A patent/AU2003273727B2/en not_active Expired
- 2003-10-22 KR KR1020057006995A patent/KR101186048B1/ko active IP Right Grant
- 2003-10-22 US US10/532,269 patent/US20060036082A1/en not_active Abandoned
- 2003-10-22 JP JP2004545689A patent/JP4674087B2/ja not_active Expired - Lifetime
- 2003-10-22 EA EA200500695A patent/EA007465B1/ru not_active IP Right Cessation
- 2003-10-23 UY UY28037A patent/UY28037A1/es not_active Application Discontinuation
-
2005
- 2005-04-22 EC EC2005005740A patent/ECSP055740A/es unknown
- 2005-04-22 TN TNP2005000116A patent/TNSN05116A1/en unknown
- 2005-05-19 LT LT2005053A patent/LT5354B/lt not_active IP Right Cessation
- 2005-05-23 LV LVP-05-61A patent/LV13361B/en unknown
- 2005-09-02 HR HR20050760A patent/HRP20050760A2/xx not_active Application Discontinuation
-
2006
- 2006-04-13 HK HK06104515.2A patent/HK1084414A1/xx not_active IP Right Cessation
-
2010
- 2010-04-13 US US12/759,208 patent/US20100197011A1/en not_active Abandoned
Patent Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| AU2986484A (en) * | 1983-06-27 | 1985-01-03 | Monash University | Leptospira strains grown in protein free medium |
| US6100061A (en) * | 1997-06-20 | 2000-08-08 | Immuno Aktiengesellschaft | Recombinant cell clone having increased stability in serum- and protein-free medium and a method of recovering the stable cell clone and the production of recombinant proteins by using a stable cell clone |
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| Hybridoma-SFM: Serum-Free and Protein-Free Media for Hybridoma Culture. Data sheet from GIBCO INVITRON CORPORATION, August 2002 [retrieved on 8 January 2003 (08.01.03)]. Retrieved from the Internet: <URL: http://invitrogen.com/content/sfs/manuals/3913.pdf, the whole data sheet. * |
Also Published As
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| EP0043718B1 (en) | Improvements in or relating to cell lines | |
| KR101591671B1 (ko) | 항체의 이질성을 감소시키는 방법 및 그 항체의 제조방법 | |
| RU2592680C2 (ru) | Способ снижения накопления лактата при культивировании и способ получения антитела | |
| JP2017532046A (ja) | タンパク質産物の等電性プロファイルをシフトさせる方法およびその使用 | |
| Borrebaeck | In vitro immunization for production of murine and human monoclonal antibodies: present status | |
| JP2017516484A (ja) | タンパク質生産のための細胞培養工程 | |
| JPS63503273A (ja) | 細胞培養による蛋白質の製造 | |
| JP2003506077A5 (ru) | ||
| JPH04228066A (ja) | 外来遺伝子発現用培養細胞 | |
| EA007465B1 (ru) | Процедура получения клеточных линий в безбелковых средах и клеточные линии, полученные этим способом | |
| CN101451151A (zh) | 一种利用肿瘤细胞生产生物活性产物的方法 | |
| CN103539859B (zh) | 用于制备避孕疫苗的自组装多肽纳米 | |
| Damerdji et al. | Utilization of whey fractions as a substitute for fetal calf serum in culture media | |
| EP0251107A2 (en) | Improved fusion products | |
| EP0251106A2 (en) | Improved fusion method | |
| JPS60204727A (ja) | 抗ヒトｖ型コラ−ゲン抗体 | |
| BRPI0315565B1 (pt) | Método para se obter uma linhagem celular de mieloma nso que contém uma sequência que codifica um polipeptídeo recombinante ou uma proteína recombinante adaptada para crescer em meio livre de soro e proteína, e, uso do método | |
| CN117986356A (zh) | 一种制备抗体的方法 | |
| JPS60137284A (ja) | 抗体産生細胞の取得方法、及びそれを用いた抗体の製造方法 | |
| JPS61271987A (ja) | ウロキナ−ゼ前駆体の製造方法 | |
| JPH089968A (ja) | ｎ−酪酸を含有することを特徴とする動物細胞培養用培地及び培養方法 | |
| JPS62285780A (ja) | 動物細胞増殖用組成物および増殖方法 | |
| JPH05123167A (ja) | 無血清培養用培地 | |
| JPH03160989A (ja) | ヒト血漿性フィブロネクチン産生細胞株と生産法 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| MM4A | Lapse of a eurasian patent due to non-payment of renewal fees within the time limit in the following designated state(s) |
Designated state(s): AM AZ MD TM |
|
| MM4A | Lapse of a eurasian patent due to non-payment of renewal fees within the time limit in the following designated state(s) |
Designated state(s): TJ |