WO2004038010A1 - Método para la obtención de líneas celulares en medio libre de proteína y líneas celulares obtenidas por este método - Google Patents

Método para la obtención de líneas celulares en medio libre de proteína y líneas celulares obtenidas por este método Download PDF

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Adolfo Castillo Vitlloch
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Tammy Boggiano Ayo
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Definitions

  • the present invention relates to biotechnology, specifically with a method to obtain stable cell lines adapted to grow in serum-free and protein-free medium, by a two-stage adaptation process.
  • a protein-free medium For culture conditions in a protein-free medium, several techniques have been developed. Thus, specifically defined protein free media have been developed, which allow cell growth under these conditions.
  • WO 97/05240 describes the expression of recombinant proteins under conditions of a protein-free medium.
  • JP 2696001 describes the use of a protein-free medium for the production of HIV factor in CHO cells by adding a nonionic active tensing agent or cyclodextrin to increase the productivity of host cells. To increase the effectiveness of these additives, the addition of, for example, butyrate and lithium is recommended.
  • WO 96/26266 describes the culture of cells in a medium with protein hydrolyzate containing glutamine, whose free amino acid content is less than 15% of the total weight of the protein, and whose peptides have a molecular weight of less than 44 kD.
  • a synthetic minimum medium is used as the culture medium for the cells, as the basic medium to which are added in addition to the protein hydrolyzate, bovine fetal serum, gentamicin and mercapto-ethanol. The use of serum containing medium for the production of recombinant blood factors has not been mentioned.
  • US 5,393,668 A describes cell growth under conditions of protein-free medium of cells adhered to special synthetic surfaces. To stimulate cell proliferation, CHO cells that overexpress human insulin proliferate on an artificial substrate to which insulin has covalently bound (Ito et al. 1996 PNAS USA. 93: 3598-3601).
  • Reiter et al. (1992, Cytotechnology 9: 247-253) describe the immobilization of the first high-density r-CHO cells on carriers in serum-containing medium, and the subsequent perfusion of immobilized cells in the protein-free medium during the production phase , finding a continuous release of the protein in the culture supernatant. There, the cells were maintained for less than 10 generations in the medium without protein.
  • the culture of the fermenter consists of a larger population of non-producing cells or cells that have a low expression.
  • the present invention provides a strategy for developing stable cell lines adapted to grow in serum and protein free medium. Following the proposed strategy, different clones adapted to grow in a protein-free medium have been obtained.
  • Two-stage adaptation of cell lines to growth in a protein-free medium Two-stage adaptation of cell lines to growth in a protein-free medium.
  • This procedure encompasses the mammalian cell lines, for which it is not possible to perform a direct procedure of adaptation of the medium supplemented with serum to the medium free of serum and protein.
  • the method of the invention includes two steps in adapting the line to the protein-free medium (MLP).
  • MLP protein-free medium
  • the first stage considered noncritical, the reduction of the protein content of the medium occurs without the loss of cell viability and there is no significant decrease in the doubling time of the population at each step during the reduction of the protein concentration.
  • the non-critical stage is generally observed between 5 and 0.5 mg / mL of total protein in the culture medium and this almost shows the same growth rate as in the initial culture medium.
  • the previous concentration where there is still cell growth considered as a pre-critical concentration, and from it the protein concentration is slowly decreased until the cells recover viability and The original dubbing time.
  • the cells are seeded in at least 3 replicates a density of 1-5 x ios cells / ml in culture medium containing serum and proteins, after
  • the entire culture medium is replaced every 48 hours with the fresh medium with 50% of the initial protein concentration; iii.
  • the cells are allowed to grow in the medium with 50% of the initial protein concentration until the culture reaches the confluence; iv.
  • the cells obtained in the previous step (iii) are seeded in at least 3 replicates at a density of 1-5 x ios cells / ml in the medium containing 50% of the initial protein concentration and after 48 hours of growth, half of the culture supernatant is replaced with fresh protein-free medium, leaving the final protein concentration at
  • the entire medium is replaced every 48 hours with fresh medium containing 75% of the pre-critical concentration; x.
  • the cells are allowed to grow in the medium containing 75% of the pre-critical protein concentration until the culture reaches the confluence; xi.
  • the cell line derived from the previous step is seeded in at least 3 replicates at a density of 2-6 x ios cells / ml in the medium containing 75% of the pre-critical protein concentration and after 48 hours of growth, replaces 25% of the culture supernatant by means fresh protein-free, leaving the final protein concentration at 75% of the previous concentration; xii.
  • the entire medium is replaced every 48 hours with fresh medium containing 75% of the previous concentration; xiii.
  • the cells are allowed to grow in the medium containing 75% of the previous protein concentration until the culture reaches the confluence; xiv.
  • the procedure (xi) is repeated to (xiii) reducing in each cycle the concentration of the protein contained in the medium to 75% of that used in the previous cycle, until reaching a protein concentration such that when the cells are transferred to lower concentrations grow with a similar viability and with the original doubling time, so that the subsequent decrease in protein concentration does not affect the viability or the doubling time.
  • the culture medium in which the cells are initially planted comprises between 5% and 10% bovine fetal serum.
  • the mammalian cell line that adapts to grow in a protein-free medium is a myeloma, particularly NSO.
  • the invention can also be applied for the adaptation of NSO transfected with a sequence encoding a recombinant protein or polypeptide, particularly when the sequence encodes a recombinant antibody or its fragments, so it also includes mammalian cell lines adapted to grow in protein free medium.
  • mammalian cell lines that express any of the humanized or chimeric antibodies to EGF receptor I1R3, anti-CD6 TlhT, anti-CD3 T3Q or fragments thereof, adapted to grow by the method of invention in a protein-free medium, as well as the aforementioned antibodies obtained from said lines.
  • the lines adapted by the method of the invention grow steadily under conditions of serum and protein free medium for at least 40 generations. Examples of realization: Example i: Adaptation of the I1R3 recombinant cell line to protein-free medium.
  • the recombinant I1R3 cell line was obtained by transfecting the NSO myeloma cell line with the vector constructs for the expression of the light and heavy chains of the humanized I1R3 monoclonal antibody that recognizes the human EGF receptor.
  • the adaptation of this cell line to a protein-free medium was carried out following the procedure described previously, by means of a reduction of the protein content in two stages.
  • the cells were initially cultured in RPMI-1640 medium supplemented with 10% fetal bovine serum (SFB) and then from a protein concentration of 0.15 mg / mL the fetal serum was replaced by the protein-rich supplement, Nutridoma NS (Boheringer Manheinn) added to the basal medium RPMI-1640 (serum free medium).
  • the reduction in protein content was made by successive dilutions in PFHM-II medium (Gibco) of the protein content present in the initial medium.
  • Example 2 Adaptation of the recombinant TlhT cell line to protein-free medium.
  • the recombinant TlhT cell line was obtained by transfecting the NSO myeloma cell line with the constructs of the vectors for the expression of the light and heavy chains of the humanized TlhT monoclonal antibody by the T epitope suppression method and that recognizes the receptor CD6 of human T lymphocytes.
  • Example 3 Adaptation of the T3Q recombinant cell line to protein-free medium.
  • the T3Q recombinant cell line was obtained by transfection of the NSO myeloma cell line with the constructs of the vectors for the expression of the light and heavy chains of the T3Q monoclonal antibody humanized by the T epitope suppression method and that recognizes the receptor CD3 of human T lymphocytes.
  • the adaptation of this cell line to a protein-free medium was carried out following the procedure described in point 2, by means of a two-stage protein content reduction.
  • the cells were initially cultured in RPMI-1640 medium supplemented with 10% SFB.
  • the reduction in protein content was made by successive dilutions in PFHM-II medium (Gibco) of the protein content present in the initial medium.
  • Figure 1 Correlation of the time needed to adapt the I1R3 line to each protein concentration (until viability and doubling time is recovered) with the natural logarithm of the inverse of the protein concentration.
  • Critical protein concentration values for the I1R3 cell line are: - 0.32 and 0.11 mg / mL of the total protein concentration.
  • Figure 2 Correlation of the total time elapsed since the beginning of the adaptation procedure with the natural logarithm of the inverse of the protein concentration for the I1-R3 cell line. Value of the adaptation speed of this line in the critical phase: - 0.0053 mg / d.
  • Figure 3 Correlation of the time needed to adapt the TlhT line to each protein concentration (until viability and doubling time is recovered) with the natural logarithm of the inverse protein concentration.
  • the Critical protein concentration values for the TlhT cell line are: - 0.12 and 0.01 mg / mL of the total protein concentration.
  • Figure 4 Correlation of the total time elapsed since the start of the adaptation procedure with the natural logarithm of the inverse protein concentration for the TlhT cell line. Value of the speed of adaptation of this line in the critical phase: - 0.0014 mg / d.
  • Figure 5 Correlation of the time needed to adapt the T3Q line to each protein concentration (until viability and doubling time is recovered) with the natural logarithm of the inverse protein concentration.
  • the critical protein concentration value for the T3Q cell line is: - 0.63 mg / mL of the total protein concentration.
  • Figure 6 Correlation of the total time elapsed since the beginning of the adaptation procedure with the natural logarithm of the inverse protein concentration for the T3Q cell line. Value of the adaptation speed of this line in the critical phase: - 0.0172 mg / d.

Abstract

La presente invención se relaciona con un método de obtención de células de mamífero adaptadas a crecer en medio libre de suero y proteínas, el cual incluye un proceso en dos etapas de adaptación donde existe un intervalo crítico de concentración de proteína en el cual las células deben ganar la capacidad de sobrevivir en medio libre de proteínas. El intervalo crítico de la concentración de la proteína es específico para cada línea celular.La presente invención también revela líneas celulares de mamíferos que crecen establemente en condiciones de medio libre de suero y proteínas por al menos 40 generaciones. Adicionalmente, los clones revelados en la presente invención expresan los anticuerpos humanizados anti receptor de EGF hR3 y anti CD6 T1hT y el anticuerpo quimérico anti CD3 T3Q, además de los fragmentos de dichos anticuerpos.

Description

MÉTODO PARA LA OBTENCIÓN DE LÍNEAS CELULARES EN MEDIO UBRE DE PROTEÍNA Y LÍNEAS CELULARES OBTENIDAS POR ESTE MÉTODO.
Sector Técnico: La presente invención se relaciona con la biotecnología, específicamente con un método para obtener líneas celulares estables adaptadas a crecer en medio libre de suero y proteína, mediante un proceso en dos etapas de adaptación.
Técnica Anterior: A partir del desarrollo del cultivo in vitro de células de mamíferos, la demanda para la producción a gran escala de estas células ha aumentado debido al potencial diagnóstico y terapéutico de muchos de los productos obtenidos por esta vía. Estos agentes útiles incluyen anticuerpos monoclonales, la hormona humana del crecimiento, linfocinas, eritropoietina, factores de coagulación de la sangre y los activadores de plasminógeno del tejido.
El uso de los anticuerpos monoclonales recombinantes (AcMr) para la terapia y el diagnóstico in vivo de diversas enfermedades implica en muchos casos el uso de los tratamientos a altas dosis. Este hecho hace necesario la producción de AcMr específico en gran cantidad y con una alta pureza. Varios anticuerpos monoclonales recombinantes con uso potencial para la terapia y diagnóstico en cáncer y enfermedades auto inmunes se han expresado en las células de myeloma NSO, en el Centro de Inmunología Molecular. US 5,891,996 describe la obtención de anticuerpos quimérico y humanizado contra el receptor del Factor de Crecimiento Epidérmico, con valor en el diagnostico y la terapia de tumores que expresen dicho receptor. WO 97/19111 describe anticuerpos monoclonales que reconocen el antígeno CD6 para uso diagnóstico y terapéutico en pacientes con psoriasis. Gavilondo y col en Hybridoma 9 N0.5, 1999 reportó el anticuerpo IOR-T3a que reconoce el antígeno CD3. Para las condiciones de cultivo en medio libre de proteína, se han desarrollado varias técnicas. Así, se han desarrollado los medios libre proteína específicamente definidos, que permiten un crecimiento de la célula bajo estas condiciones. WO 97/05240 describe la expresión de proteínas recombinantes bajo condiciones de medio libre de proteínas. JP 2696001 describe el uso de un medio libre de proteína para la producción del factor VIH en células CHO agregando un agente tenso activo no iónico o ciclodextrina para aumentar la productividad de las células huésped. Para aumentar la eficacia de estos aditivos, se recomienda la adición de, por ejemplo, butirato y litio. WO 96/26266 describe el cultivo de células en un medio con hidrolizado de proteína que contiene glutamina, cuyo contenido de aminoácidos libres es menos del 15% del peso total de la proteína, y cuyos péptidos tienen un peso molecular menor de 44 kD. Como medio de cultivo para las células se utiliza un medio mínimo sintético, como el medio básico al cual se agregan además del hidrolizado de la proteína, suero fetal bovino, gentamicina y mercapto-etanol. No se ha mencionado el uso de medio conteniendo suero para la producción de los factores de la sangre recombinantes. U. S. 5.393.668 A, describe crecimiento celular bajo condiciones de medio libre de proteína de células adheridas a superficies sintéticas especiales. Para estimular la proliferación celular, células CHO que sobre-expresan la insulina humana proliferan sobre un substrato artificial al cual se ha unido covalentemente la insulina (Ito et al. 1996 PNAS LOS E.E.U.U.. 93:3598-3601).
Reiter y col. (1992, Cytotechnology 9:247-253) describen la inmovilización de las células r-CHO primero crecidas a alta densidad sobre portadores en medio que contiene suero, y la subsiguiente perfusión de las células inmovilizadas en el medio sin proteína durante la fase de producción, encontrándose una liberación continua de la proteína en el sobrenadante del cultivo. Allí, las células fueron mantenidas por menos de 10 generaciones en el medio sin proteína.
Los métodos anteriores para la preparación acertada de un cultivo de células a gran escala bajo condiciones de medio libre de proteína se han descrito para líneas celulares mantenidas en cultivo, en particular las células VERO (WO 96/15231). En el cual las células se crecen bajo condiciones de medio libre de suero y proteína desde el ampolla original hasta una gran escala técnica de 1200 litros.
Adaptar las células crecidas inicialmente bajo condiciones medio conteniendo suero al medio libre de proteína, es un proceso algo molesto que toma generalmente tiempo, además, se ha encontrado que la producción de proteína expresada y de la productividad de las células CHO recombinantes disminuye grandemente después de la adaptación al medio sin proteína con respecto al que contiene suero (Paterson et el al. 1994. Appl. Microbiología. Biotechnol. 40:691-658). Ésta es a consecuencia de la inestabilidad o la disminución del crecimiento del clon recombinante debido al cambio en las condiciones de cultivo. A pesar del uso de un clon original estable, a causa de las condiciones extremas en la fermentación, una porción grande de las células reduce o pierde totalmente su capacidad de expresión, las cuales crecen mucho mas que las células productoras durante el proceso de producción, por lo que finalmente el cultivo del fermentador consista en una mayor población de células no- productoras o de células que tienen una expresión baja.
La presente invención proporciona una estrategia para desarrollar líneas celulares estables adaptadas a crecer en medio libre de suero y proteína. Siguiendo la estrategia propuesta, se han obtenido diferentes clones adaptados a crecer en medio libre de proteína.
Descripción Detallada de la Invención:
Adaptación en dos etapas de líneas celulares al crecimiento en medio libre de proteínas.
Este procedimiento abarca las líneas de células de mamíferos, para las cuales no es posible realizar un procedimiento directo de adaptación del medio suplementado con suero al medio libre de suero y proteína. El método de la invención incluye dos etapas en la adaptación de la línea al medio libre de proteína (MLP). En la primera etapa, considerada no crítica, la reducción del contenido de proteínas del medio ocurre sin la pérdida de la viabilidad celular y no hay una disminución importante del tiempo de doblaje de la población en cada paso durante la reducción de la concentración de proteína. La etapa no crítica se observa generalmente entre 5 y 0,5 mg/mL de proteína total en el medio de cultivo y este casi muestra el mismo índice de crecimiento que en el medio de cultivo inicial.
Para iniciar esta primera etapa, se parte de una línea con una viabilidad celular entre 80 y 100%, y las células se crecen sucesivamente en medio de cultivo con concentraciones decrecientes de proteína hasta alcanzarse una concentración crítica donde la viabilidad cae a 0%, la que constituye el punto de partida para el inicio de la segunda etapa.
En esta segunda etapa considerada crítica, en la cual ocurre una disminución de la viabilidad y del tiempo de doblaje celular, las células requieren de más tiempo para adaptarse al pasar de un paso de la concentración de la proteína otro de menor concentración. Existen concentraciones críticas de proteína en el medio de cultivo, que no es posible pasar por alto durante el proceso de adaptación. Estas concentraciones críticas de proteína son específicas para cada línea celular, y generalmente están por debajo de 0,6 mg/mL. Una vez que las células hayan recuperado los índices iniciales de viabilidad y velocidad crecimiento en estas concentraciones críticas de proteína, es posible cultivar las células en la condición siguiente, con una concentración de proteína más baja.
Para llevar esta segunda etapa, una vez determinada la concentración crítica, se busca la concentración anterior donde aún existe crecimiento celular considerada como concentración pre-crítica, y a partir de la misma se disminuye lentamente dicha concentración de proteína hasta que las células recuperen la viabilidad y el tiempo de doblaje original.
La combinación de pasos para reducir la concentración de proteína en la etapa crítica determinará el tiempo total de adaptación en esta etapa y la velocidad de la adaptación (Vadapt), calculado como la relación:
V adapt. = Δ Concentración de Proteína
ΔT adapt.
Sin embargo esta combinación de pasos no tendrá influencia sobre el tiempo necesario para la adaptación a cada concentración de proteína, incluyendo las concentraciones críticas.
Es decir, para determinar el final de la etapa no crítica y de las concentraciones críticas es necesario llevar a cabo una adaptación paso a paso, esto se realiza mediante diluciones seriadas del cultivo celular en el medio sin proteína deseado, reduciendo a la mitad la concentración de proteína en cada paso (Tabla 1). Esta reducción se puede hacer tanto por la disminución de la concentración de suero o suplementando el medio básico con diferentes niveles de algunos sustitutos del suero ricos en proteínas. Tabla i: Reducción paso a paso de la concentración de proteína para determinar las concentraciones críticas, comenzando con un medio de cultivo suplementado con 5 mg/mL de proteína (equivalente a 10 % de suero fetal bovino).
Figure imgf000006_0001
Leyenda: SFB- Suero Fetal Bovino
MLP- Medio Libre de Proteína MCS- Medio Conteniendo Suero *E1 contenido total de proteína del suero fetal bovino se ha estimado alrededor de 50 mg/mL ^-
Antes de comenzar el procedimiento de adaptación las células se deben mantener con más de 80% de viabilidad en frascos-T en el medio estándar empleado generalmente para cultivar las células.
Para realizar la adaptación se llevan a cabo de forma consecutiva los siguientes pasos que transitan por las dos etapas previamente mencionadas: i. Las células se siembran en al menos 3 réplicas una densidad de 1 - 5 x ios células/ml en medio de cultivo conteniendo suero y proteínas, después de
48 horas la mitad del sobrenadante del cultivo se remplaza por medio fresco libre de proteína quedando la concentración final de proteína al 50% de la concentración inicial; ii. Se reemplaza todo el medio de cultivo cada 48 horas por el medio fresco con 50% de la concentración inicial de proteínas; iii. Se dejan crecer las células en el medio con 50% de la concentración inicial de proteínas hasta que el cultivo alcance la confluencia; iv. Se siembran las células obtenidas en el paso anterior (iii) en al menos 3 réplicas a una densidad de 1 - 5 x ios células/ml en el medio que contiene 50% de la concentración inicial de proteína y después de 48 horas de crecimiento, se reemplaza la mitad del sobrenadante del cultivo por medio fresco libre de proteína, quedando la concentración final de proteínas al
50% de la concentración anterior; v. Se reemplaza todo el medio cada 48 horas por medio fresco que contiene 50% de la concentración de proteína anterior; vi. Se dejan crecer las células en el medio que contiene el 50% de la concentración de proteína anterior hasta que el cultivo alcance la confluencia; vii. Se repite el procedimiento (iv) a (vi), reduciendo en cada ciclo la concentración de la proteína contenida en el medio hasta el 50% de la usada en el ciclo anterior, hasta alcanzar una concentración de proteína que provoque la muerte de celular, viii. A partir de un cultivo con más de 80% de viabilidad crecido en la concentración pre-crítica, las células se siembran en al menos 3 réplicas a una densidad de 2 - 6 x ios células/ml en medio de cultivo a la concentración pre-crítica, y después de 48 horas se reemplaza el 25% del sobrenadante del cultivo por medio fresco sin proteína quedando la concentración final de proteína al 75% de la concentración pre-crítica; ix. Se reemplaza todo el medio cada 48 horas por medio fresco que contiene 75% de la concentración pre-crítica; x. Se dejan crecer las células en el medio que contiene el 75% de la concentración pre-crítica de proteína hasta que el cultivo alcance la confluencia; xi. Se siembra la línea celular derivada del paso anterior en al menos 3 réplicas a una densidad de 2 - 6 x ios células/ml en el medio que contiene 75% de la concentración pre-crítica de proteína y después de 48 horas de crecimiento, se remplaza el 25% del sobrenadante del cultivo por medio fresco libre de proteína, quedando la concentración final de proteína al 75% de la concentración anterior; xii. Se reemplaza todo el medio cada 48 horas por medio fresco que contiene 75% de la concentración anterior; xiii. Se dejan crecer las células en el medio que contiene el 75% de la concentración anterior de proteína hasta que el cultivo alcance la confluencia; xiv. Se repite el procedimiento (xi) a (xiii) reduciendo en cada ciclo la concentración de la proteína contenida en el medio hasta el 75% de la usada en el ciclo anterior, hasta alcanzar una concentración de proteína tal que cuando las células se transfieren a una concentración más baja crecen con una viabilidad similar y con el tiempo de doblaje original, de manera que la disminución subsiguiente de la concentración de proteína no afecta la viabilidad ni el tiempo de doblaje. En el método de adaptación propuesto en la presente invención, el medio de cultivo en el cual inicialmente se siembran las células comprende entre el 5% y el 10% de suero fetal bovino.
En dicho método, la línea celular de mamífero que se adapta a crecer en medio libre de proteína es un mieloma, particularmente NSO. La invención también puede ser aplicada para la adaptación de NSO transfectada con una secuencia que codifica una proteína o polipéptido recombinante, particularmente cuando la secuencia codifica un anticuerpo recombinante o sus fragmentos, por lo que la misma también incluye las líneas celulares de mamífero adaptadas a crecer en medio libre de proteína. En diferentes materializaciones de la invención la misma proporciona líneas celulares de mamífero que expresan cualesquiera de los anticuerpos humanizados o quiméricos anti-receptor de EGF I1R3, anti-CD6 TlhT, anti-CD3 T3Q o sus fragmentos, adaptadas a crecer mediante el método de la invención en medio libre de proteína, así como los referidos anticuerpos obtenidos a partir de dichas líneas. Las líneas adaptadas por el método de la invención crecen establemente en condiciones de medio libre de suero y proteínas por al menos 40 generaciones. Ejemplos de Realización: Ejemplo i: Adaptación de la línea celular recombinante I1R3 a medio libre de proteínas.
La línea celular recombinante I1R3 fue obtenida por la transfección de la línea celular de mieloma NSO con las construcciones de los vectores para la expresión de las cadenas ligeras y pesadas del anticuerpo monoclonal humanizado I1R3 que reconoce el receptor del EGF humano.
La adaptación de esta línea celular a medio libre de proteínas se llevó a cabo siguiendo el procedimiento descrito previamente, por medio de una reducción del contenido de proteínas en dos etapas. Las células fueron inicialmente cultivadas en medio RPMI-1640 suplementado con un 10 % de suero fetal bovino (SFB) y luego a partir de una concentración de proteínas de 0.15 mg/mL el suero fetal fue reemplazado por el suplemento rico en proteínas, Nutridoma NS (Boheringer Manheinn) añadido al medio basal RPMI-1640 (medio libre de suero). La reducción en el contenido de proteínas se realizó por diluciones sucesivas en medio PFHM-II (Gibco) del contenido de proteínas presentes en el medio inicial.
Los resultados del cálculo de las concentraciones críticas y las velocidades de adaptación VadaPt para esta línea celular se muestran en las Fig. 1 y 2 respectivamente.
Ejemplo 2: Adaptación de la línea celular recombinante TlhT a medio libre de proteínas.
La línea celular recombinante TlhT fue obtenida por la transfección de la línea celular de mieloma NSO con las construcciones de los vectores para la expresión de las cadenas ligeras y pesadas del anticuerpo monoclonal TlhT humanizado por el método de supresión de epítopes T y que reconoce el receptor CD6 de linfocitos T humanos.
La adaptación de esta línea celular a medio libre de proteínas se llevó a cabo siguiendo el procedimiento descrito en el punto 2, por medio de una reducción del contenido de proteínas en dos etapas. Las células fueron inicialmente cultivadas en medio RPMI-1640 suplementado con un 10 % SFB. La reducción en el contenido de proteínas se realizó por diluciones sucesivas en medio PFHM-II (Gibco) del contenido de proteínas presentes en el medio inicial. Los resultados del cálculo de las concentraciones críticas y las velocidades de adaptación VadaPt para esta línea celular se muestran en las Fig. 3 y 4 respectivamente.
Ejemplo 3: Adaptación de la línea celular recombinante T3Q a medio libre de proteínas.
La línea celular recombinante T3Q fue obtenida por la transfección de la línea celular de mieloma NSO con las construcciones de los vectores para la expresión de las cadenas ligeras y pesadas del anticuerpo monoclonal T3Q humanizado por el método de supresión de epítopes T y que reconoce el receptor CD3 de linfocitos T humanos. La adaptación de esta línea celular a medio libre de proteínas se llevó a cabo siguiendo el procedimiento descrito en el punto 2, por medio de una reducción del contenido de proteínas en dos etapas.
Las células fueron inicialmente cultivadas en medio RPMI-1640 suplementado con un 10 % SFB. La reducción en el contenido de proteínas se realizó por diluciones sucesivas en medio PFHM-II (Gibco) del contenido de proteínas presentes en el medio inicial.
Los resultados del cálculo de las concentraciones críticas y las velocidades de adaptación Vadapt para esta línea celular se muestran en las Fig.5 y 6 respectivamente.
Breve descripción de las figuras:
Figura 1: Correlación de los tiempos necesarios para adaptar la línea I1R3 a cada concentración de proteínas (hasta que se recupere la viabilidad y el tiempo de doblaje) con el logaritmo natural del inverso de la concentración de proteínas. Los valores de concentraciones críticas de proteínas para la línea celular I1R3 son: - 0.32 y 0.11 mg/mL de la concentración de proteínas totales.
Figura 2: Correlación del tiempo total transcurrido desde el inicio del procedimiento de adaptación con al logaritmo natural del inverso de la concentración de proteínas para la línea celular I1-R3. Valor de la velocidad de adaptación de esta línea en la fase crítica: - 0.0053 mg/d.
Figura 3:: Correlación de los tiempos necesarios para adaptar la línea TlhT a cada concentración de proteínas (hasta que se recupere la viabilidad y el tiempo de doblaje) con el logaritmo natural del inverso de la concentración de proteínas. Los valores de concentraciones críticas de proteínas para la línea celular TlhT son: - 0.12 y 0.01 mg/mL de la concentración de proteínas totales.
Figura 4: Correlación del tiempo total transcurrido desde el inicio del procedimiento de adaptación con al logaritmo natural del inverso de la concentración de proteínas para la línea celular TlhT. Valor de la velocidad de adaptación de esta línea en la fase crítica: - 0.0014 mg/d.
Figura 5: Correlación de los tiempos necesarios para adaptar la línea T3Q a cada concentración de proteínas (hasta que se recupere la viabilidad y el tiempo de doblaje) con el logaritmo natural del inverso de la concentración de proteínas. El valor de concentración crítica de proteínas para la línea celular T3Q es de: - 0.63 mg/mL de la concentración de proteínas totales.
Figura 6: Correlación del tiempo total transcurrido desde el inicio del procedimiento de adaptación con al logaritmo natural del inverso de la concentración de proteínas para la línea celular T3Q. Valor de la velocidad de adaptación de esta línea en la fase crítica: - 0.0172 mg/d.

Claims

-^-VINDICACIONES
i.- Un método para obtener una línea celular de mamífero adaptada a crecer en medio libre de suero y proteína que comprende dos etapas: I. Una primera etapa en la cual a partir de una línea con una viabilidad celular entre 8o y ιoo%, las células se crecen sucesivamente en medio de cultivo con concentraciones decrecientes de proteína hasta alcanzarse una concentración crítica de proteína donde la viabilidad cae a o%; II. Una segunda etapa donde una vez determinada la concentración crítica, se busca la concentración anterior donde aún existe crecimiento celular considerada como concentración pre-crítica, y a partir de la misma se disminuye lentamente dicha concentración de proteína hasta que las células recuperen la viabilidad y el tiempo de doblaje original.
2.- Método según la reivindicación 1 caracterizado porque para ejecutar la primera etapa se efectúan los siguientes pasos: i Las células se siembran en al menos 3 réplicas a una densidad de 1 5 x ios células/ml en medio de cultivo conteniendo suero y proteínas, después de 48 horas la mitad del sobrenadante del cultivo se remplaza por medio fresco libre de proteína quedando la concentración final de proteína al 50% de la concentración inicial; ii Se reemplaza todo el medio de cultivo cada 48 horas por el medio fresco con 50% de la concentración inicial de proteínas; iii Se dejan crecer las células en el medio con 50% de la concentración inicial de proteínas hasta que el cultivo alcance la confluencia; iv Se siembran las células obtenidas en el paso anterior (üi) en al menos 3 réplicas a una densidad de 1 - 5 x ios células/ml en el medio que contiene 50% de la concentración inicial de proteína y después de 48 horas de crecimiento, se reemplaza la mitad del sobrenadante del cultivo por medio fresco libre de proteína, quedando la concentración final de proteínas al 50% de la concentración anterior; v Se reemplaza todo el medio cada 48 horas por medio fresco que contiene 50% de la concentración de proteína anterior; vi Se dejan crecer las células en el medio que contiene el 50% de la concentración de proteína anterior hasta que el cultivo alcance la confluencia; vii Se repite el procedimiento (iv) a (vi), reduciendo en cada ciclo la concentración de la proteína contenida en el medio hasta el 50% de la usada en el ciclo anterior, hasta alcanzar una concentración de proteína que provoque la muerte de celular.
5 3.- Método según la reivindicación 1 caracterizado porque para ejecutar la segunda etapa se efectúan los siguientes pasos: viii A partir de un cultivo con más de 80% de viabilidad crecido en la concentración pre- crítica, las células se siembran en al menos 3 réplicas a una densidad de 2 - 6 x ios células/ml en medio de cultivo a la concentración pre-crítica, y después de 48 horas se o reemplaza el 25% del sobrenadante del cultivo por medio fresco sin proteína quedando la concentración final de proteína al 75% de la concentración pre-crítica; ix Se reemplaza todo el medio cada 48 horas por medio fresco que contiene 75% de la concentración pre-crítica; x Se dejan crecer las células en el medio que contiene el 75% de la concentración pre- 5 crítica de proteína hasta que el cultivo alcance la confluencia; xi Se siembra la línea celular derivada del paso anterior en al menos 3 réplicas a una densidad de 2 - 6 x ios células/ml en el medio que contiene 75% de la concentración pre-crítica de proteína y después de 48 horas de crecimiento, se remplaza el 25% del sobrenadante del cultivo por medio fresco libre de proteína, quedando la 0 concentración final de proteína al 75% de la concentración anterior; xii Se reemplaza todo el medio cada 48 horas por medio fresco que contiene 75% de la concentración anterior; xüi Se dejan crecer las células en el medio que contiene el 75% de la concentración anterior de proteína hasta que el cultivo alcance la confluencia; 5 xiv Se repite el procedimiento (xi) a (xüi) reduciendo en cada ciclo la concentración de la proteína contenida en el medio hasta el 75% de la usada en el ciclo anterior, hasta alcanzar una concentración de proteína tal que cuando las células se transfieren a una concentración más baja crecen con una viabüidad similar y con el tiempo de doblaje original, de manera que la disminución subsiguiente de la concentración de proteína 0 no afecta la viabilidad ni el tiempo de doblaje.
4.- El método según las reivindicaciones 1 a la 3 caracterizado porque el medio en el cual inicialmente se siembran las células comprende entre el 5% y el 10% de suero fetal bovino.
5.- El método según las reivindicaciones de la 1 y 4 caracterizado porque la línea celular de mamífero adaptada a crecer en medio ubre de proteína es un mieloma.
6.- El método según la reivindicación 5 caracterizado porque el mieloma es NSO.
7.- El método según la reivindicación 6 caracterizado porque dicha línea celular es NSO transfectada con una secuencia que codifica una proteína o poüpéptido recombinante.
8.- El método según la reivindicación 7 caracterizado porque dicha secuencia codifica un anticuerpo recombinante o sus fragmentos.
9.- Una línea celular de mamífero obtenida según el método de las reivindicaciones de la 1 a la 8, caracterizada porque está adaptada a crecer en medio ubre de proteína.
10.- Una línea celular de mamífero según reivindicación 9 caracterizada porque es un mieloma.
11.- Una línea celular de mamífero según reivindicación 10 caracterizada porque el mieloma es NSO.
12.- Una línea celular de mamífero según reivindicación 11 caracterizada porque la línea NSO contiene una secuencia que codifica una proteína o poüpéptido recombinante.
13.- Una línea celular de mamífero según reivindicación 12 caracterizada porque la secuencia codifica un anticuerpo recombinante o sus fragmentos.
14.- Una línea celular de inamífero según reivindicación 13 caracterizada porque la secuencia codifica el anticuerpo humanizado contra el receptor de EGF I1R3 o sus fragmentos.
15.- Una línea celular de mamífero según reivindicación 13 caracterizada porque la secuencia codifica el anticuerpo humanizado contra el antígeno CD6 TihT o sus fragmentos.
16.- Una línea celular de mamífero según reivindicación 13 caracterizada porque la secuencia codifica el anticuerpo quimérico contra el antígeno CD3 T3Q o sus fragmentos.
17.- Uso del método de las reivindicaciones de la 1 a la 8 para la obtención de líneas celulares adaptadas a crecer en medio bre de proteínas.
18.- Un anticuerpo hurnanizado contra el receptor de EGF I1R3 o sus fragmentos, producidos por la línea celular obtenida por el método de las reivindicaciones de la 1 a la 8.
19.- Un anticuerpo humanizado contra el antígeno CD6 TlhT o sus fragmentos, producidos por la línea celular obtenida por el método de las reivindicaciones de la 1 a la 8.
20.- Un anticuerpo quimérico contra el antígeno CD3 T3Q o sus fragmentos, producidos por la línea celular obtenida por el método de las reivindicaciones de la 1 a la 8.
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