DE3883041T2 - Stabile Genamplifizierung in prokaryotischer chromosonaler DNA. - Google Patents
Stabile Genamplifizierung in prokaryotischer chromosonaler DNA.Info
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Description
- Das Gebiet dieser Erfindung bezieht sich auf prokaryotische Zellen, in denen stabile Genamplifikation durch verstreuten Einbau von wenigstens zwei Kopien einer definierten DNA-Sequenz ohne Tandembildung in das Chromosom der genannten prakaryotischen Zelle erhalten wird.
- Bacilli wurden in grossem Umfang verwendet für die Erzeugung von industriell wichtigen Enzymen, wie alpha-Amylase, neutrale Protease und alkalische oder Serin-Proteasen (vgl. Debabov, "The Industrial Use of Bacilli", in: The Molecular Biology of Bacilli, Acad. Press, New York, 1982). Eine Verbesserung der Erzeugung von Bacillus-Enzymen kann sowohl durch klassische genetische Methoden, wie Mutation und anschliessende Selektion, als auch durch moderne molekularbiologische Methoden erzielt werden. Im letzeren Falle sind mehrere Wege zum Erhalten von hohen Expressionsstärken von homologen und heterologen Genen in bestimmten prokaryotischen und eukaryotischen Mikroorganismen durch Gentechnologie gut dokumentiert worden.
- Eine der Vorgehensweisen zur Erzielung hoher Produktionsspiegel eines Gens besteht darin, das Gen mit effizienten Regulationssequenzen zu versehen. Eine andere Vorgehensweise, die oft in Kombination mit der ersten Vorgehensweise angewandt wird, besteht darin, die Kopienzahl des betreffenden Gens zu erhöhen. Eine Amplifikation wird in erster Linie erzielt durch Inserieren des Gens in ein Multikopien bildendes extrachromosamales DNA-Molekül, wie ein Plasmid. Ein signifikanter Nachteil der Verwendung von Plasmiden als Vektoren zum Exprimieren und Amplifizieren von genetischer Information war jedoch deren Instabilität. Für die Verwendung in grossem Massstab ist die Stabilität des amplifizierten Gens eine Vorbedingung für die Aufrechterhaltung hoher Produktionsspiegel des Expressionsproduktes, für das das amplifizierte Gen codiert, da viele Zellteilungen stattfinden müssen, ehe genügend Biomasse gebildet wird, um eine wesentliche Produktbildung zu erhalten.
- Die Instabilität tritt in zwei Formen auf: Segregationsinstabilität, wobei ein Verlust an Plasmid während der Kultivierung eintritt; und strukturelle Instabilität, wobei ein Teil des Plasmids verlorengeht. Segregationsinstabilität kann zum Beispiel auftreten, wenn eine Wirtszelle einen Vektor enthält, der ein Gen trägt, das überexprimiert wird. Im allgemeinen besteht ein Selektionsvorteil für Zellen, in denen das Gen nicht mehr überexprimiert wird, da Ueberexpression eine ungünstige Eigenschaft für die transformierte Wirtszelle ist. Eine grosse Menge an Stoffwechselenergie wird für das überexprimierte Genprodukt aufgewendet, was die Konkurrenzfähigkeit (Wachstumsgeschwindigkeit) der Zellen mit Wirtszellen, die nicht in gleicher Weise überexprimieren, negativ beeinflusst.
- Eine Methode, die angewandt wird, um der Segregationsinstabilität entgegenzuwirken, besteht darin, auf Zellen zu selektionieren, die Multikopien bildende Plasmide enthalten, die Gene tragen, die der das Plasmid enthaltenden Zelle einen Vorteil verleihen, zum Beispiel Resistenz gegen ein Antibiotikum verleihen, und dann das relevonte Antibiotikum zu der Fermentationsbrühe zuzusetzen. Jedoch sind Antibiotika im allgemeinen infolge der Bestimmungen betreffend die Genehmigung des Fermentationsprozesses oder des Produktes selbst keine nützlichen Selektionsmittel in kommerziellen Produktionsprozessen in grossem Massstab.
- Eine andere Methode, die angewandt wird, um den Plasmidverlust infolge Segregationsinstabilität zu minimieren, besteht darin, ein Gen, das in funktioneller Hinsicht für die Wirtszelle unentbehrlich ist, in das Vektormolekül zu inserieren [Ferrari et al., Biotechnology 3 (1985) 1003-1007]. Jedoch gewährleistet diese Methode nicht die strukturelle Stabilität des Vektors.
- Methoden, die angewandt werden, um das Problem der strukturellen Plasmidinstabilität zu lösen, umfassten das Vermeiden der Expression des Gens während der Phase des exponentiellen Wachstums, zum Beispiel durch Verwendung von Regulationssequenzen, wie temperaturempfindlichen Regulationssequenzen, und die Integration von exogener DNA in das Wirtszellenchromosom. Andere Methoden, die angewandt wurden, umfassten die Vermeidung der Verwendung von autonom replizierenden Vektormolekülen und statt dessen die Verwendung von Methoden, die die Integration der eingeführten DNA in das Wirtszellenchromosom begünstigen.
- Die Methoden zur Erzielung von Integration von Fremd-DNA in das Wirtzellenchromosom umfassten die homologe Rekombination und die illegitime Rekombination. Es gibt zwei Wege zum Inserieren von DNA-Sequenzen in spezifische Stellen auf einem Chromosom durch homologe Rekombination: die homologe Rekombination vom Campbell- Typ und die Integration via doppelter reziproker Rekombination, die in den Figuren 1A bzw. 1B gezeigt sind. Ein dritter Weg zum Einführen von DNA-Sequenzen in das Chromosom, wobei diese Methode einen zweistufigen Ersetzungsmechanismus anwendet, ist in Figur 1C gezeigt. Im Prinzip wird eine Rekombination vom Campbell-Typ angewandt, aber das Endergebnis ist eine Chromosomenanordnung, die keine Duplikationen und somit keine amplifizierbare Einheit in dem rekombinierten Teil des Chromosoms enthält. Sie ähnelt daher einer doppelten reziproken Rekombination.
- Abgesehen von der Anwendung der homologen Rekombination für die Integration von Fremd-DNA in das Chromosom ist es auch möglich, DNA durch illegitime Rekombination zu integrieren. Auf integrierte Vektormoleküle kann unter Bedingungen selektioniert werden, die die autonome Replikation von nichtintegrierten Vektormolekülen hemmen. Die Anwendung der illegitimen Rekombination für die Integration ist in Figur 1D dargestellt. Die Abwesenheit von einander folgenden Duplikationen in der erhaltenen Anordnung chromosomaler Sequenzen sorgt dafür, dass die in den Figuren 1B, C und D gezeigten Wege für die stabile Einführung von DNA-Sequenzen in das Genom bevorzugt werden. Die ins Chromosom eingebauten Gene umfassten sowohl homologe als auch heterolage Gene, wobei die Amplifikation der ins Chromosom eingebauten DNA hintereinander angeordnet war. Es wurde berichtet, das diese im Chromosom mehrfach auftretenden Sequenzen instabil waren, obgleich in manchen Fällen über Stabilität berichtet wurde. Es ist daher erwünscht, Methoden zu entwickeln, durch die in das Chromosom integrierte DNA stabil in der Zelle manifestiert und an die Nachkommen weitergegeben wird.
- Die Integration von exogener DNA durch homologe Rekombination in das Chromosom von Bacillus subtilis wurde beschrieben von Duncan et al, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 75 (1978) 3664-3668 und für Anacystis nidulans von Williams und Szalay, Gene 24 (1983) 37-51 und in der internationalen Patentanmeldung WO 84/00 381. Die Integration durch homologe Rekombination eines heterologen Gens, das in der Zelle nicht stabil manifestiert und an die Nachkommen weitergegeben werden kann, wenn es auf einem Plasmidvektor getragen wird, in das Chromosom eines Mikroorganismus ist in der EP-A-0 127 328 beschrieben.
- Die EP-A-0 124 374 offenbart ein Verfahren zur Erzeugung von Staphylococcus aureus-Protein A in grampositiven Mikroorganismen, die es normalerweise nicht erzeugen, durch Einführen von Protein A-Gen enthaltendem E. coli-Plasmid in den Wirt. Das Plasmid repliziert in dem Wirt nicht und wird anschliessend durch homologe Rekombination in das Chromosom eingebaut.
- Die Amplifikatian von ins Chromosom eingebauten Genen, sowohl homolog als auch heterolog, wurde dokumentiert. Siehe zum Beispiel: Saito et al., Proceedings of the Fourth International Symposium an Genetics of Industrial Microorganisms, Kyoto, Japan, 1982, S. 1251; Young, J. Gen. Microbiol. 130 (1984) 1613-1621; Jannière et al., Gene 40 (1985) 47-55; Sargent und Bennett, J. Bacteriol. 161 (1985) 589-595; Gutterson und Koshland, Prac. Natl. Acad. Sci. USA 80 (1983) 4894-4898; Hashiguchi et al., Agric. Biol. Chem. 49 (1985) 545-550; Wilson und Morgan, J. Bacteriol. 163 (1985) 445-453; französische Patentanmeldung No. 84.06 701; und EP-A-0 134 048. Ueber spontane Amplifikatian in prokaryotischen Zellen wurde berichtet, und darauf kann selektioniert werden. Siehe zum Beispiel die Uebersicht von Andersan und Roth, Ann. Rev. Microbiol. 31 (1977) 473-505.
- In allen oben erwähnten Fällen erfolgte die Amplifikation von ins Chromosom eingebauter DNA hintereinander angeordnet. Es wurde berichtet, dass dieser Typ von mehrfach auftretenden Sequenzen im Chromosom instabil war, obgleich in manchen Fällen eine ziemlich gute Stabilität gefunden wurde, wie von Jannière et al., Gene 40 (1985) 47-55 diskutiert.
- Ueber die Stabilisierung von natürlich vorkommenden amplifizierten prokaryotischen Genen infolge des Vorhandenseins von anderen unentbehrlichen Genen zwischen diesen amplifizierten Sequenzen wurde berichtet. Zum Beispiel waren von den 9 bis 10 Kopien der ribosomalen RNA-Gengruppen, die in dem B. subtilis-Chromosom vorkommen, zwei hintereinander gelegene Gruppen getrennt durch eine Gruppe von tRNA-Genen [Wawrousek und Hansen, J. Biol. Chem. 258 (1983) 291-298]. In anderen Fällen gingen natürlich vorkommende hintereinander gelegene ribosomale RNA-Operons verloren, sowohl in E. coli als auch in B. subtilis, mit wenig Wirkung auf die phänotypischen Eigenschaften des Organismus: Ellwood und Momura, J. Bacteriol. 143 (1980) 1077-1080 bzw. Loughney et al., J. Bacteriol. 154 (1983) 529-532.
- Die Integration von Plasmiden in das Chromosom von B. subtilis durch illegitime Rekombination unter Verwendung des Vektars pE194 wurde beschrieben von Hofemeister et al., Mol. Gen. Genet. 189 (1983) 58-68 und Prorozov et al., Gene 34 (1985) 39-46.
- Mehrere Gene für extrazelluläre Enzyme von Bacilli wurden mit Erfolg kloniert, wie die alpha-Amylasegene von B. amyloliquefaciens [Palva et al., Gene 15 (1981) 43-51], B. licheniformis [Ortlepp, Gene 23 (1983) 267], B. stearothermophilus [Mielenz et al., Proc. Acad. Sci. USA 80 (1983) 5975-5979; EP-A-0 057 976] und B. subtilis [Yang et al., Nucleic Acids Res. 11 (1983) 237],; das Levonsaccharasegen von B. subtilis [Gay et al., J. Bacteriol. 153 (1983) 1424]; die für neutrale Protease codierenden Gene von B. stearathermophilus [Fuji etal., J. Bacteriol. 156 (1983) 831], B. amyloliquifaciens [Hanjo et al., J. Biotech. 1 (1984) 165] und von B. subtilis [Yang et al., J. Bacteriol, 160 (1984) 115]; die für Serin- oder alkalische Protease codierenden Gene von B. subtilis [Wong et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81 (1984) 1184], B. licheniformis [Jacobs et al., Nucleic Acids Res. 13 (1985) 8913] und B. amyloliquefaciens [Wells et al., Nucleic Acids Res. 11 (1983) 7911].
- Ueber die Protoplastentransformation wurde für mehrere Spezies von grampositiven Mikroorganismen berichtet. Für B. subtilis wurde ein Protokoll für die Protoplastentransformation beschrieben von Chang und Cohen [Mol. Gen. Genet. 168 (1979) 111-115], das in grossem Umfang verwendet wurde. Aehnliche erfolgreiche Protokolle wurden beschrieben für die Transformation von B. megaterium-Protoplasten [Vorobjeva et al., FEMS Microbiol. Letters 7 (1980) 261-263], B. amyloliquefaciens-Protoplasten [Smith et al., Appl. and Env. Microbiol. 51 (1986) 634], B. thuringiensis-Protoplasten [Fisher et al., Arch. Microbiol. 139 (1981) 213-217], B. sphaericus-Protoplasten [McDonald, J. Gen. Microbiol. 130 (1984) 203] und B. larvae-Protoplasten [Bakhiet et al., Appl. and Env. Microbiol. 49 (1985) 577]; in der gleichen Publikation wurde berichtet über nicht erfolgreiche Resultate für B. popillae. Das Protokoll war erfolgreich für B. polymyxa, B. licheniformis, B. macerans und B. laterosporus, aber nicht für B. coagulans, B. cereus und B. pumilus, abwohl gute Protoplastenbildung beobachtet wurde [Mann et al., Current Microbiol. 13 (1989) 131-135].
- Andere Methoden zur Einführung von DNA in Protoplasten umfassen die Fusion mit DNA enthaltenden Liposomen [Holubova, Folia Microbiol. 30 (1985) 97] oder die Protoplastenfusion unter Verwendung eines leicht transformierbaren Organismus als intermediäre Wirtszelle (EP-A-0 134 048). Die letztere Literaturstelle offenbart auch eine Methode für die Fusion von industriellen Wirtsstämmen von einzelligen Mikroorganismen mit einzelligen Spendermikroorganismen, bei denen nicht replizierende Plasmide in das Chromosom durch homologe Rekombination eingebaut sind. Heterologe Gene können in das Chromosom des Spendermikroorganismus cointegriert werden.
- Prokaryotische Wirtszellen, die mindestens zwei Kopien einer DNA-Sequenz, die für ein interessierendes Polypeptid codiert, stabil in das Wirtszellenchromosom integriert enthalten, und Methoden für deren Herstellung werden zur Verfügung gestellt. Die stabile Manifestierung in der Zelle und Weitergabe an die Nachkommen der exogenen DNA-Sequenz wird erhalten durch Integrieren von zwei oder mehr Kapien der Sequenz in das Wirtszellenchromosom, in dem die Kopien durch endogene chromosomale DNA getrennt sind, die für die Wirtszelle lebenswichtig ist.
- Die Figuren 1A bis D sind schematische Darstellungen von vier Wegen zur Integration von extrachromosomalen DNA-Sequenzen in das Chromosom von prokaryotischen Mikroorganismen.
- T ist die Zielsequenz, das heisst, DNA-Sequenzen, die auf Chromosom und Plasmid vorhanden sind, zwischen denen homologe Rekombination stattfinden kann.
- S steht für die in das Chromosom einzubauende DNA-Sequenz.
- M steht für eine Markergensequenz, die für die Selektion von rekombinanten Stämmen verwendet wird.
- Die Figuren 2A und 2B sind schematische Darstellungen von zwei Wegen, um stabile Genamplifikation in einem prokaryotischen Chromosom zu erhalten.
- Figur 3 zeigt die Resultate einer Histidin/MOPS- Gelelektrophorese, die mit dem Ueberstand von Kulturen von B. subtilis DB104, der pUB110 bzw. pM58 enthielt, ausgeführt wurde, verglichen mit mehreren Subtilisinen:
- Bahn 1: Carlsberg-Subtilisin
- Bahn 2: Bacillus PB92-Protease
- Bahn 3: Bacillus subtilis-Subtilisin
- Bahn 4: Bacillus subtilis DB104 (pM58)
- Bahn 5: Bacillus subtilis DB104 (pUB110)
- Figur 4 zeigt die Restriktionskarte von Plasmid pM58. Ferner wird die Sequenzierstrategie im oberen Teil der Figur gezeigt. Die mit Pfeilen versehenen ausgezogenen Linien stellen die Fragmente dar, die in den M13-Phagen-Vektoren mp10, mp11 und mp18 kloniert wurden. Der untere Teil der Figur zeigt die Sequenzierstrategie unter Verwendung von zehn Oligonucleotiden, die in regelmässigen Abständen auf dem Proteasegen lokalisiert waren.
- Figur 5 zeigt die Nukleotidsequenz des codierenden Stranges, der mit der Aminosäuresequenz von Bacillus PB92-Serin-Protease übereinstimmt. Die Promotoren (P&sub1;, P&sub2;), Ribosomen-Bindungsstelle (rbs) und Terminationsregionen (term) der DNA-Sequenz sind ebenfalls dargestellt. Die numerierten ausgezogenen Linien stellen die Lokalisierung der zehn Oligonucleotide dar, die für die Sequenzierung verwendet wurden.
- Figur 6A zeigt die Konstruktion von Plasmid pE194neo.
- Figur 6B zeigt die Konstruktion von Plasmid pMAX-4.
- Figur 7A: Mit HindIII hergestellte Spaltungen von chromosomaler DNA der Stämme PB92, PBT109 und PBT108 wurden der Elektrophorese auf einem 0,5%-igen Agarosegel unterworfen, wie von Southern beschrieben auf Nitrocellulose transferiert und mit mit ³²p markierter Nick-translatierter pM58-DNA hybridisiert. Die Figur zeigt ein Autoradiogramm.
- Die Figuren 7B und 7C erläutern die Einbauwege, die im Falle von homologer (B) Rekombination und illegitimer (C) Rekombination zwischen pMAX-4 und dem Bacillus PB92-Chromosom vorkommen.
- Figur 8 zeigt die Konstruktion des Einbauvektors pElatB.
- Figur 9A erläutert die Integration von Plasmid pElatB in das Chromosom von B. licheniformis Stamm T9, die zu B. licheniformis Stamm TB13 führt.
- Figur 9B erläutert die chromosomale Rekombination der B. licheniformis-Stämme TB13 und T5 nach Protoplastenfusion dieser Stämme, die zu B. licheniformis Stamm T13F führt.
- Figur 10 zeigt eine chromosomale Analyse von neun verschiedenen Kolonien, die aus einer Fermentation von Stamm T13F wie in Beispiel 11 beschrieben isoliert wurden. Die isolierte chromosomale DNA wurde mit EcoRI gespalten, auf 0,8%-igen Agarosegelen getrennt und auf Nitrocellulose geblottet. Die Hybridisierung des Blots wurde ausgeführt mit mit ³²P markierter Nick-translatierter pElatB-DNA. Die Figur zeigt ein Autoradiogramm. Der obere Pfeil zeigt die Stellung an, wo ein EcoRI- DNA-Fragment von ca. 15kb wandert, das die gesamte pElatB-Sequenz enthält, die in das Chromosom an einer Stelle integriert wurde, die nicht dem ursprünglichen alpha-Amylasegen benachbart ist, wie für Stamm TB13 in Figur 9A dargestellt. Der untere Pfeil zeigt die Stellung an, wo ein EcoRI-DNA-Fragment von ca. 3,3kb wandert, das das gesamte alpha-Amylasegen enthält, das ursprünglich in B. licheniformis Stamm T5 vorhanden war (siehe auch Figur 9B). Die folgenden DNA-Proben wurden analysiert:
- Bahn 1: Bacillus licheniformis-T5-DNA
- Bahn 2: Bacillus licheniformis-TB13-DNA
- Bahn 3: Bacillus licheniformis-T390-DNA
- Bahn 4: DNA aus einem neomycinempfindlichen Derivat von Bacillus licheniformis T390, isoliert nach Fermentation, wie in Beispiel 12 beschrieben.
- Bahn 5: Bacillus licheniformis T13F-DNA
- Bahnen 6 bis 14: DNA aus 9 verschiedenen Kolonien, isoliert aus einer Fermentation von Stamm T13F, wie in Beispiel 12 beschrieben.
- Gemäss der vorliegenden Erfindung werden prokaryotische Zellen, in denen zwei oder mehr Kopien einer DNA-Sequenz stabil in das Chromosöm integriert sind, und Verfahren zu deren Herstellung zur Verfügung gestellt. Eine Wirtszelle, die eine DNA-Sequenz enthält, die für ein interessierendes Polypeptid codiert, wird mit einem DNA-Konstrukt, das die genannte DNA-Sequenz enthält, transformiert. Dann wird auf transformierte Zellen selektioniert, in denen die integrierten DNA- Sequenzen durch endogene chromosomale Sequenzen von dem zu amplifizierenden Gen getrennt sind. Die endogenen dazwischenliegenden Sequenzen sind im allgemeinen lebenswichtig für die Wirtszelle. Der Verlust von amplifizierten Sequenzen durch homologe Rekombination ist tödlich für die Wirtszelle. Somit gibt es einen Selektionsvorteil für Zellen, die die amplifizierten Sequenzen tragen, ohne dass es nötig ist, Antibiotika oder ähnliche Selektionsmittel zu verwenden. Die Integration kann entweder durch homologe Rekombination oder durch illegitime Rekombination erzielt werden. Methoden, die angewandt werden können, um die gewünschten Zellen zu erhalten, sind wie in den Figuren 2A bzw. 2B gezeigt.
- Wenn die homologe Rekombination angewandt wird, können mehrere Stücke von DNA-Sequenzen in den Vektormolekülen vorhanden sein, die im bezug auf das Wirtszellenchromosom homolog sind, insbesondere dann, wenn eine oder mehrere Kopien des zu amplifizierenden Gens bereits in die Wirtszelle eingeführt worden sind. Das Vektormolekül kann somit eine interessierende DNA-Sequenz; eine Ziel-DNA-Sequenz; und eine Marker-DNA-Sequenz einschliessen.
- Man muss aufpassen, dass nur auf die gewünschten rekombinierten chromosomalen Anordnungen selektioniert wird. Dies kann erzielt werden, indem man lineare DNA- Moleküle für die Rekombination verwendet. Das zu integrierende zirkuläre Vektormolekül wird mit einem Restriktionsenzym in der Region geschnitten, die in bezug auf die Zielsequenz homolog ist. Auf diese Weise können Rekombination und Integration bevorzugt an dieser spezifischen Stelle eintreten. Ausser in dem Vektormolekül kann die interessierende DNA-Sequenz auch in dem Wirtszellenchromosom vorhanden sein. Die DNA-Sequenz kann eine DNA-Sequenz sein, die für ein beliebiges Strukturgen codiert, das man zu amplifizieren wünscht. Die DNA- Sequenz kann in bezug auf den Wirtsorganismus endogen sein oder kann in einer vorhergehenden Transformationsstufe in das Wirtschromosom inseriert worden sein.
- Zielsequenzen für nicht mehrfach hintereinanderliegende Gensequenzen werden vorzugsweise aus nicht unentbehrlichen Genen gewählt; zum Beispiel können im Falle von Bacilli als Wirtsorganismen die Gene, die für extrazelluläre Enzyme codieren, oder Gene, die bei der Sporulation eine Rolle spielen, als Zielsequenzen verwendet werden. Die Integration von DNA-Sequenzen in diese Gene inaktiviert das Gen im allgemeinen. Der Verlust der Expression des Gens kann dann überwacht und für die Selektion der gewünschten rekombinanten Stämme verwendet werden.
- Wenn die illegitime Rekombination für die chromosomale Genamplifikation angewandt wird, wie in den Figuren 1D und 2A dargestellt, werden Bedingungen für die Integration und Selektion bevorzugt, bei denen die homologe Rekombination nicht gegenüber der illegitimen Rekombination überwiegt. Ein bevorzugtes Mittel zum Vermeiden von homologer Rekombination besteht darin, erste und zweite Wirtszellen, denen das interessierende Strukturgen fehlt, mit einem Vektor, der eine DNA-Sequenz aufweist, die für ein interessierendes Polypeptid und ein Markergen codiert, zu transformieren. Erste und zweite Wirtszellen, in denen die DNA-Sequenz an verschiedenen Stellen vorhanden ist, können dann selektioniert und unter Fusionierungsbedingungen vereinigt werden, um eine transformierte Zelle mit mindestens zwei Kopien der DNA-Sequenz, die für das interessierende Strukturgen codiert, an verstreuten Orten in dem zweiten Wirtsgenom zu ergeben. Zur leichteren Selektion kann der erste Wirt vor der Fusion abgetötet werden.
- Das interessierende Gen oder die interessierenden Gene können beliebige prokaryotische oder eukaryotische Gene sein. Diese Gene können bakterielle Gene, Gene von einzelligen Mikroorganismen, Säugergene oder dergleichen umfassen. Die Strukturgene können auf eine Vielzahl von Weisen hergestellt werden, einschliesslich Synthese, Isolierung aus genomischer DNA, Herstellung aus cDNA oder Kombinationen davon. Die verschiedenen Methoden der Manipulierung von Genen sind wohlbekannt und umfassen die Restriktion, die Verdauung, das Herausschneiden, die Ligasierung, die in vitro-Mutagenese, die Primerreparatur, die Verwendung von Linkern und Adaptoren und dergleichen. Somit können aus einem Wirt erhaltene DNA-Sequenzen in einer Vielzahl von Weisen in Abhängikeit von den Anforderungen der DNA- Konstruktion manipuliert werden. Siehe Maniatis et al., Molekular Cloning, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY, 1982.
- Die Strukturgene können eine Vielfalt von Polypeptiden oder Proteinen, wie Enzyme, Hormone, Lymphokine, Oberflächenproteine, Blutproteine, Strukturproteine, Immunglobuline oder dergleichen, aus Säugern, einzelligen Mikroorganismen, zum Beispiel Bakterien, Pilzen, wie Hefe, oder Fadenpilzen, Algen, Protozoen usw., Pflanzen oder anderen DNA-Quellen exprimieren. Von besonderem Interesse sind Enzyme, insbesondere Proteasen und Amylasen. Beispiele von derartigen Enzymen sind Serin- und Nicht-Serin-Proteasen, einschliesslich hochalkalischer Serin-Proteasen, alpha- und beta-Amylase und dergleichen. Eine bevorzugte Quelle für eine Serin-Protease ist Bacillus novo species PB92 und fur eine alpha-Amylase ist B. licheniformis Stamm T5 sowie Mutanten und Varianten dieser Stämme.
- Das Gen, das Bestandteil des geeigneten Vektors ist, kann mittels Methoden erhalten werden, die auf dem Fachgebiet allgemein bekannt sind. Im allgemeinen umfasst die Methode die Herstellung einer genomischen Bibliothek aus dem Organismus, der das interessierende Protein oder Polypeptid exprimiert. Die genomische Bibliothek wird zweckmässig zum Beispiel hergestellt durch Ligasieren von DNA-Fragmenten des Spenderstammes in einen geeigneten Vektor.
- Mit dem Ausdruck "geeigneter Vektor" wird ein DNA-Konstrukt gemeint, das ein Strukturgen aufweist, das für ein interessierendes Protein oder Polypeptid codiert. Das Strukturgen ist in der geeigneten Orientierung verbunden mit Kontrollregionen, wie einer Promotorsequenz, einer Sequenz, die die Ribosomenbindungsstelle bildet, und Sequenzen, die die Termination der Transkription und Translation des Strukturgens kontrollieren, welche Kontrollregionen in der Wirtszelle funktionstüchtig sind. Wenn die Wirtszelle Transformations- und Integrationsfrequenzen hat, die zu niedrig sind, um eine direkte Selektion auf Integration ohne intermediäre Isolierung von plasmidhaltigen Zellen zu erlauben, wie industrielle Bacillus-Stämme, kann der Vektor zusätzlich einen Replikationsstart aufweisen, der in der Wirtszelle autonom zu replizieren vermag.
- Wenn das Gen aus einer Spenderzelle erhalten wird, die Transkriptions/Translations-Signale und -Terminatoren hat, die von den prokaryotischen Zellen des Wirtsstammes erkannt werden, ist es gewöhnlich zweckmässig, die ursprünglichen Regulationssequenzen des Strukturgens beizubehalten. Zusätzlich kann die Initiationsregion für die Transkription für eine dauernde oder auslösbare Expressian sorgen, so dass der Wirt in entsprechenden Situationen bis zu einer hohen Zelldichte wachsen kann, ehe hohe Expressionsstärken der interessierenden Strukturgene erhalten werden.
- Wenn das Strukturgen aus einer Quelle stammt, deren Regulationssignale durch die Wirtszelle nicht erkannt werden, ist es erforderlich, regulatorische Elemente zu erhalten, die von der Wirtszelle erkannt werden, und das Strukturgen zwischen die regulatorischen Initiations- und Terminationssignale zu inserieren. In manchen Fällen kann das exogene Strukturgen mit seinem bzw. seinen eigenen Stopcodon(s) im Leseraster hinter den N-Terminus-Codons eines endogenen Strukturgens inseriert werden, das seine natürlichen Regulationssignale beibehält.
- Es ist erwünscht, dass das Expressionsprodukt sekretiert wird. Wenn das Expressionsprodukt natürlich sekretiert wird und die Startsignale und das bzw. die Prozessierungssignal(e) durch die Wirtszelle erkannt werden, bringt dies keine Schwierigkeiten mit sich. Wenn jedoch das Produkt nicht sekretiert wird, weil die Wirtszelle die Startsignale für die Sekretion und/oder das oder die Prozessierungssignal(e) nicht erkennt oder die Signale in der Wirtszelle nicht in einem befriedigenden Grade funktionsfähig sind, dann kann es erforderlich sein, DNA-Sequenzen zu isolieren oder synthetisieren, die für die Startsignale für die Sekretion und das oder die Prozessierungssignal(e) eines Wirtszellenpolypeptids codieren, und sie im richtigen Leseraster mit dem 5'-Ende des Strukturgens zu verbinden.
- Der Vektor kann zusätzlich ein Markergen einschliessen, das Resistenz gegen ein Antibiotikum verleiht, gegen das der Wirtsstamm empfindlich ist. Wenn das Markergen zum chromosomalen Einbau des Vektors verwendet wird, muss es die Anforderung erfüllen, dass eine Selektion nach überlebenden Zellen möglich ist, selbst wenn nur eine Kopie oder einige Kopien des Markergens in dem Wirtsstamm vorhanden sind. Unter Marker wird ein Strukturgen verstanden, das zur Expression in einem Wirt befähigt ist, das eine Selektion nach überlebenden Zellen ermöglicht. Unter "Selektion nach überlebenden Zellen" wird das Verleihen von Prototrophie an einen auxotrophen Wirt, Biozid- oder Virusresistenz verstanden. Für die Prototrophie können verschiedene Gene verwendet werden, wie leu, his, trp oder dergleichen. Für die Biozidresistenz kann dies Resistenz gegen Antibiotika umfassen, zum Beispiel neo, cam, tet, tun, kan oder dergleichen. Andere Marker umfassen Resistenz gegen Schwermetalle, Immunität und dergleichen. Die verschiedenen DNA-Sequenzen können von verschiedenen Quellen abgeleitet und miteinander verbunden sein, um einen Vektar zu ergeben, der eine oder mehrere günstige, vorzugsweise nur einmal vorhandene, Restriktionsschnittstellen enthält, um die Insertian oder Substitution der Strukturgene an derartigen Schnittstellen oder anstelle der verlorenen Fragmente zu ermöglichen, um das Plasmidkonstrukt zur Verfügung zu stellen.
- Die Selektion auf Integration ins Chromosom kann unterstützt werden durch Verwendung eines Plasmids mit einem Replikationsstart mit einer Mutation, die sein Funktionieren in der Wirtszelle temperaturempfindlich macht. Siehe zum Beispiel Ehrlich, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 75 (1978) 1433.
- Wenn das Plasmidkonstrukt einmal hergestellt worden ist, kann es nun in einem geeigneten Klonierungswirt kloniert werden. Jeder beliebige Wirt kann verwendet werden, der günstig ist, leicht transformierbar ist und die Replikation des Plasmidkonstrukts und den Transfer in die Wirtszelle ermöglicht. Es steht eine grosse Anzahl von Stämmen zur Verfügung, die eine hohe Transformationseffizienz haben und gewöhnlich auxotroph und/oder antibiotikumempfindlich sind. Wenn die Wirtszelle ein industrieller Bacillus-Stamm ist, hat die Verwendung des gleichen Organismus als Wirtszelle für die Klonierung des Plasmidkonstrukts viele Vorteile, indem sie die Verwendung eines einzigen Replikationssystems sowie des gleichen Markers für eine Selektion nach überlebenden Zellen sowohl in dem Klonierungswirt als auch in dem Wirtsstamm gestattet. Siehe zum Beispiel die europäische Patentanmeldung EP-A-O 134 048, welche Offenbarung durch Hinweis in diese Patentschrift eingefügt wird.
- Das Plasmidkonstrukt kann gemäss herkömmlichen Methoden in den Klonierungswirt eingeführt werden, wie Transformation unter Verwendung von mit Calcium ausgefällter DNA, Konjugation oder einer anderen günstigen Methode. Der Klonierungswirt kann dann in einem geeigneten Nährmedium ünter selektiven Bedingungen kultiviert werden, um auf einen Wirt zu selektionieren, der das Plasmidkanstrukt enthält. Für auxatrophe Wirte fehlt dem Nährmedium der erforderliche Nährstoff, während für Biozidresistenz, zum Beispiel Antibiotikumresistenz, eine cytotoxische Menge an Biozid oder Bioziden in dem Nährmedium verwendet wird.
- Verschiedene Wirtszellen können verwendet werden. Dazu gehören E. cali, Bacillus-Stämme, insbesondere Bacillus subtilis, Pseudomonas und Streptomyces. Bei der Wahl einer Wirtszelle werden verschiedene Faktoren berücksichtigt, einschliesslich Faktoren, die die Expression des zu amplifizierenden Gens und die Produktion des gewünschten Produktes ungünstig beeinflussen können. Somit ist es erwünscht, eine Wirtszelle zu verwenden, bei der Erkennung von Regulationssignalen; Leichtigkeit der Sekretion; verringerter Abbau des gewunschten Produktes usw. vorhanden sind. Eine bevorzugte Wirtszelle erzeugt bereits das interessierende Polypeptid und kann entweder ein Wildtyp-Organismus oder ein Mutantenorganismus sein. Die Wirtszelle kann auch eine Mutante eines Organismus sein, der das interessierende Polypeptid erzeuqt, die jedoch selbst ein Nichterzeuger ist. Wenn das interessierende Polypeptid eine Protease oder eine Amylase ist, umfassen bevorzugte Stämme Bacillus novo species PB92 bzw. Bacillus licheniformis Stamm T5 sowie Mutanten und Varianten dieser Stämme.
- Ausserdem können industrielle Stämme verwendet werden, die die erwünschten Merkmale eines industriellen Stammes haben. Beispiele von Stämmen, die verwendet werden können, umfassen Stämme, die für die industrielle Produktion von Enzymen verwendet werden, wie beispielsweise B. licheniformis B. amyloliquefaciens und alkalophile Bacilli. Die industriellen Stämme werden aus Organismen gewählt, die aus dem Erdboden isoliert werden können oder von Hinterlegungsstelien oder anderen Quellen erhältlich sind oder durch Modifizierung derartiger Stämme erhalten werden. Die industriellen Stämme sind äusserst robust und stabil. Ferner sind die genannten Stämme resistent gegen Phageninfektion und gegen genetischen Austausch, das heisst, Einführung von DNA durch herkömmliche Transformationsprozeduren. Die herkömmlichen industriellen Stämme sind auch prototroph, um den Zusatz von teuren Aminosäuren zu dem Nährmedium zu vermeiden. Andere Charakteristika von industriellen Stämmen sind ihre hohe Produktivität bis zum Ende der Formentierung, die so lange wie eine Woche dauern kann, stabile Zellkonzentration nach Erschöpfung der Nährlösung und hohe Produktivität, gewöhnlich mindestens 5 g/l (0,5% Gew./Vol.) eines spezifischen sekretierten Proteins.
- Es können Transformanten mit Genen entweder in hintereinanderliegender Anordnung oder verstreut in dem Chromosom erhalten werden. Im allgemeinen ist es möglich, Transformanten, die verstreute Gene enthalten, aus Gemischen der beiden erwähnten Typen von Transformanten zu selektionieren, indem man chromosomale DNA aus jedem individuellen Transformanten isoliert, die genannte DNA anschliessend in bezug auf die relativen Lokalisierungen der genannte Gene analysiert, beispielsweise mittels der Methode von Southern, J. Mol. Biol. 98 (1975) 503-517 oder anderen Mitteln, die dem Fachmann bekannt sind, wodurch man den verstreuten Einbau der genannten Gene identifiziert.
- Mittel zum Erhalten von Transformanten mit verstreuten Genen unter Vermeidung von hintereinanderliegendem Einbau umfassen bei Anwendung des Einbaus via doppelter reziproker Rekombination, wie er in den Figuren 1B und 2B erläutert ist, die Verwendung von linearisierten DNA-Konstrukten, die die zu amplifizierende DNA-Sequenz, ein Markergen und Zielsequenzen für die Rekombination aufweisen.
- Ferner umfassen spezifische Mittel zum Erhalten von Transformanten mit verstreuten Genen die Verwendung der illegitimen Rekombination, wie sie in Figur 2A erläutert ist, wobei die Isolierung von Transformanten mit hintereinanderliegenden Genen vermieden werden kann durch Selektion unter Verwendung der unterschiedlichen Expression eines Markergens, zum Beispiel eines Gens, das für Antibiotikumresistenz codiert, wenn die Empfindlichkeit gegen das Antibiotikum in Stämmen mit hintereinanderliegendem Einbau des Gens verschieden ist von derjenigen bei Stämmen min Einbau ohne Tandembildung. Im allgemeinen beträgt die Länge der dazwischenliegenden endogenen DNA-Sequenzen weniger als 10 kbp.
- Ausserdem umfassen Mittel zum Erhalten von Transformanten mit verstreuten Genen unter Vermeidung von aufeinanderfolgenden Duplikaten die Verwendung von abgetöteten Protoplasten eines homologen Spenderstammes, der ein DNA-Konstrukt trägt, das das Strukturgen und ein Markergen aufweist, wobei das Strukturgen in die chromosomale DNA an einer anderen Stelle in bezug auf den Empfängerstamm eingebaut ist.
- Die Transformation der Wirtszellen umfasst vorzugsweise die Verwendung von Protoplasten, die aus dem Wirtsstamm hergestellt sind. Protoplasten werden im allgemeinen aus den Zellen gemäss herkömmlichen Methoden hergestellt, zum Beispiel Lysozym- oder Zymolyase- Behandlung, und die Protoplasten werden sorgfältig in einem geeigneten Medium mit geeigneten Osmolalitäten für die Aufrechterhaltung der Unversehrtheit des Protoplasten suspendiert. Für industrielle Bacillus-Stämme werden Methoden zur Herstellung von Protoplasten beschrieben in der EP-A-0 134 048, welche Offenbarung in dieses Patent durdh Hinweis eingefügt wird. Wenn der Wirtsstamm ein alkalophiler Bacillus-Stamm ist, können Protoplasten in herkömmlicher Weise bei alkalischem pH, vorzugsweise bei ca. pH = 8,0, hergestellt werden. Diese Verfahrensweise ist in der europäischen Patentanmeldung No. EP-A-87 20 0358.7 offenbart, welche Offenbarung in dieses Patent durch Hinweis eingefügt wird.
- Die Wirtszelle kann transformiert werden, indem man das Plasmidkonstrukt oder einen Klonierungswirt- Protoplasten mit dem Wirtszell-Protoplasten in Gegenwart eines geeigneten Fusionshelfers kombiniert. Jeder beliebige Fusionshelfer kann verwendet werden, der den gewünschten Effizienzgrad ergibt; zum grössten Teil wird gefunden, dass Polyethylenglycol eine hohe Fusionseffizienz mit grosser Annehmlichkeit zur Verfügung stellt. Nach einer kurzen Zeit wird das Fusionshelfergemisch durch ein geeignetes Nährmedium ersetzt und werden die Zellen in einem Selektionsmedium regeneriert, zweckmässig durch Ausplattieren auf einer Agarplatte.
- Transformanten, die durch Kombinieren einer Wirtszelle mit einem geeigneten DNA-Konstrukt erhalten sind, können das genannte DNA-Konstrukt oder einen Teil davon entweder direkt als integrierenden Bestandteil ihres Chromosoms enthalten oder als freie Vektormoleküle, wenn die DNA-Konstrukte einen Replikationsstart enthalten, der in der genannten Wirtszelle funktionstüchtig ist.
- Ein Mittel zum Selektionieren auf Transformanten, in denen das DNA-Konstrukt in das Chromosom integriert ist, besteht darin, ein Plasmid zu verwenden, das einen temperaturempfindlichen Replikationsstart enthält. Die Transformanten werden in einem Selektionsmedium bei der permissiven Temperatur kultiviert, dann wird zu einer nichtpermissiven Temperatur gewechselt. Kolonien, die das Markergen bei der nichtpermissiven Temperatur exprimieren, werden dann isoliert und in Selektionsmedium bei der permissiven Temperatur kultiviert. Die Abwesenheit von Plasmid kann zum Beispiel verifiziert werden, indem man die gesamte DNA aus den Kolonien isoliert und auf einem Agarosegel elektrophoretisiert oder indem man das Fehlen der Fähigkeit der Transformanten zum Transformieren aufnahmefähiger Zellen beweist. Die Bestimmung der Weise, in der die Integration in das Chromosom stattgefunden hat, kann aus der Analyse der chromosomalen DNA mittels beispielsweise der Methode von Southern, J. Mol. Biol. 98 (1975) 503-517 oder anderen Mitteln bestehen, die dem Fachmann bekannt sind.
- Wenn eine unterschiedliche Empfindlichkeit gegen das Selektionsmittel besteht zwischen Transformanten, die zusätzliche Kopien des Markergens hintereinander angeordnet enthalten, verglichen mit denjenigen, in denen das Markergen an verstreuten Orten in dem Wirtsgenom eingebaut ist, können die Transformanten zweckmässig in Medium kultiviert werden, das die geeignete Konzentration an Selektionsmittel enthält, um auf Transformanten mit nicht hintereinanderliegendem Einbau zu selektionieren.
- Ein anderes Mittel zum Erhalten von Transformanten mit verstreutem Einbau von Kopien der interessierenden DNA-Sequenz besteht darin, einen Protoplasten zu verwenden, der aus einer homologen Spenderzelle hergestellt ist, die mindestens eine Kopie der interessierenden DNA-Sequenz an einer Stelle auf ihrem Chromosom enthält, die verschieden von derjenigen der Empfängerwirtszelle ist. Die homologe Spenderzelle kann zum Beispiel hergestellt werden, indem man eine Zelle, die nicht das interessierende Strukturgen enthält, mit einem Vektor transformiert, der das Strukturgen enthält. Die Integration der DNA-Sequenz in das Spenderzellenchromosom kann erleichtert werden durch Verwendung eines Plasmids, das einen temperaturempfindlichen Replikationsstart enthält, und Kultivieren von Transformanten unter Selektionsbedingungen zuerst bei der permissiven Temperatur und dann bei der nichtpermissiven Temperatur, wie oben beschrieben, worauf man Kolonien isoliert, die das Markergen exprimieren.
- Nach Verifizieren der Abwesenheit von Plasmid- DNA kann die chromosomale DNA gemäss der Methode von Southern oben isoliert und analysiert werden, indem man mit einer Sonde hybridisiert, die zum Beispiel mit ³²P markiert ist oder mit biotinylierten Nucleotiden. Die Sonde kann cDNA sein, die für das interessierende Polypeptid oder Fragmente davon codiert, sowie DNA-Konstrukte oder Fragmente davon, die die interessierende DNA-Sequenz aufweisen, zum Beispiel ein Vektor. Transformanten, die das interessierende Gen an einer anderen Stelle enthalten als der Genspenderstamm können dann als homologe Spenderzelle verwendet werden. Der Empfängerwirtsstamm ist vorzugsweise der gleiche wie der Stamm, der als Quelle für die interessierende DNA-Sequenz verwendet wurde, oder ein Stamm, in dem die interessierende DNA-Sequenz in einer anderen Region des Chromosoms angeordnet ist als in der transformierten Spenderzelle.
- Um die Selektion zu unterstützen, wird die Spenderzelle vorzugsweise vor oder während der Protoplastenbildung mit einem cytotoxischen Mittel abgetötet. Verschiedene Mittel können verwendet werden, um die Spenderzelle abzutöten, einschliesslich Antibiotika, aber Iodacetamid hat sich als günstig und effizient erwiesen und stört die anschliessende Fusion nicht. Wenn tote Klonierungswirt-Protoplasten verwendet werden, beträgt das Verhältnis von toten Protoplasten zu Empfängerwirtszelle vorzugsweise mindestens ca. 1:1, und ein Ueberschuss der toten Protoplasten kann verwendet werden.
- Nach der Fusion der toten Spenderzell-Protoplasten und der Empfängerwirtszell-Protoplasten können Transformanten mit Hilfe des Markergens selektioniert werden. Dann kann DNA wie oben beschrieben isoliert und analysiert werden, um Transformanten zu identifizieren, in denen mehr als eine Kopie des interessierenden Gens in das Genom eingebaut worden ist und die Kopien durch endogene chromosomale Sequenzen getrennt sind.
- Zwei Gene verstreut enthaltende Transformanten werden dann in geeigneten Weisen für den Nachweis der erhöhten Expression des interessierenden Polypeptids durchgetestet. Verschieden Methoden können angewandt werden, insbesondere wenn Enzyme eine Rolle spielen, die gut eingeführte Nachweismethoden haben. Wenn Enzyme keine Rolle spielen oder kein Nachweissystem zur Verfügung steht, können alternativ biochemische Analysen, Antikörper oder die DNA- oder RNA-Hybridisierung verwendet werden, um die Klone durchzutesten, um das Vorhandensein des Plasmidkonstrukts und die Expression des interessierenden Strukturgens zu bestimmen.
- Die Wirtszelle, die die ins Chromosom eingebauten Plasmidkonstrukte oder Fragmente davon enthält, wird dann in einem Nährmedium unter herkömmlichen Fermentierungsbedingungen kultiviert. Die Fermentierung kann fortgesetzt werden, bis die Nährlösung erschöpft ist. Wenn das Produkt sektretiert worden ist, kann das Produkt aus der Brühe durch herkömmliche Methoden, zum Beispiel Extraktion, Chromatographie, Elektrophorese oder dergleichen, isoliert werden. Wenn das Produkt in dem Cytoplasma zurückgehalten wird, können die Zellen durch Zentrifugieren, Filtration usw. gesammelt, durch mechanische Scherflüssigkeits-, Lysozym- oder andere Methoden lysiert und das Produkt wie weiter oben beschrieben isoliert werden. Durch Anwendung des vorliegenden Verfahrens kann die stabile Integration von mindestens zwei Kopien einer DNA-Sequenz als Mittel der Genamplifikation erzielt werden.
- Die folgenden Beispiele werden zur Erläuterung und nicht zur Einschränkung gegeben.
- Chromosomale DNA, isoliert aus Bacillus novo sp. PB92 (hinterlegt unter No. OR-60 beim Laboratorium voor Microbiologie, Technische Universität Delft, Niederlande, s. U.S.-Patent No. Re. 30,602) gemäss der von Saito-Miuva, Biochim. Biophys. Acta 72 (1963) 619-632, beschriebenen Verfahrensweise, wurde mit dem Restriktionsenzym Sau3A teilweise gespalten und in die BamHI- Schnittstelle von Plasmid pUB110 ligasiert [Gryczan et al., J. Bacteriol. 134 (1978) 318-329]. pUB110-Plasmid- DNA wurde hergestellt wie beschrieben von Birnboim und Doly [Nucl. Acids Res. 7 (1979) 1513-1523].
- Das Ligasierungsgemisch wurde in B. subtilis 1A40 (Bacillus Genetic Stock Centre) gemäss der Methode von Spizizen et al., J. Bacteriol. 81 (1961) 741-746, transformiert unter Verwendung von 0,6 bis 1 ug DNA pro ml aufnahmefähiger Zellen. Zellen aus dem Transformationsgemisch wurden ausplattiert auf Minimalplatten, enthaltend: 2,8% K&sub2;HPO&sub4;, 1,2% KH&sub2;PO&sub4;, 0,4% (NH&sub4;)&sub2;SO&sub4;, 0,2% Tri-Na-citrat.2H&sub2;O, 0,04% MgSO&sub4;.7H&sub2;O, 0,00005% MnSO&sub4;.4H&sub2;O, 0,4% L-Glutaminsäure, 0,5% Glucose, 0,02% Casamino Acids, 50 ug/ml Tryptophan, 20 ug/ml Methionin, 20 ug/ml Lysin, 20 ug/ml Neomycin, 0,4% Casein und 1,5% Agar. Nach Inkubieren der Platten über Nacht bei 37ºC zeigte eine aus 50 000 neomycinresistenten Kolonien erhöhte Proteaseproduktion, bestimmt durch erhöhte Ausfällung eines Halos von Caseinspaltungsprodukten um die Kolonie in der Agarplatte herum. Plasmid-DNA wurde aus dieser Kolonie gemäss der von Birnboim und Doly, Nucleic Acids Res. 7 (1979) 1513-1523, beschriebenen Methode isoliert und pM58 genannt.
- Bacillus subtilis 1A40, enthaltend pM58, würde kultiviert in Minimalmedium [Spizizen et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 44 (1958) 1072-1078)], dem 0,02% Casamino Acids, 50 ug/ml Tryptophan, 20 ug/ml Methionin, 20 ug/ml Lysin und 20 ug/ml Neomycin zugesetzt worden waren. Nach 24 Stunden wurde die Kultur zentrifugiert und der Ueberstand unter Verwendung von Dimethylcasein als Substrat auf Proteaseaktivität analysiert [Lin et al., J. Biol. Chem. 244 (1969) 789-793]. Eine Kultur von B. subtilis 1A40, enthaltend das Plasmid pUB110, die als Kontrolle verwendet wurde, zeigte weniger als 1/60 der Proteaseaktivität, die von der mit pM58 transformierten Kultur gezeigt wurde. Die Proteaseaktivität wurde vollständig gehemmt durch Behandlung mit 1-millimolarem Phenylsulfonylfluorid (PMSF), aber nicht durch Behandlung mit 20 millimolarem EDTA.
- Aliquote Teile der oben beschriebenen Ueberstände wurden gemäss der Methode von Laemmli, Nature 227 (1970) 680 auf Proteingel analysiert. Proben für die Analyse auf diesen Gelen wurden hergestellt durch Behandlung der Ueberstände mit 5%-iger Trichloressigsäure (TCA). Nach Zentrifugieren der Probe wurde der Niederschlag von ausgefälltem Protein zweimal mit Aceton gewaschen, dann durch Kochen während 10 Minuten gelöst in 40 ul Probenpuffer (0,5-molares Tris/HCl pH 7,5, 10 vol.%-iges 2-Mercaptoethanol, 50 vol.%-iges Glycerin und 0,05%-iges Bromphenolblau). Nach Elektrophorese wurden die Gele unter Verwendung von Coomassie Brillantblau angefärbt. Proben des Kulturüberstandes wurden dann durch Elektrophorese analysiert. Drei verschiedene B. substilis 1A40-Stämme wurden verwendet; ein Stamm enthaltend pUB110; oder pM58; oder kein Plasmid; und Bacillus PB92-Protease als Kontrolle. Nach der Elektrophorese wurden die Gele unter Verwendung von Coomassie Brillantblau angefärbt und entfärbt. Die Probe aus B. subtilis Stamm 1A40 enthaltend pM58 enthielt ein 31 kd- Protein, das mit Bacillus PB92-Protease mitwandert. Dieses Protein wurde auf der Kontrollbahn von Stamm B. subtilis 1A40 enthaltend pUB110 nicht nachgewiesen.
- Alle Serin-Proteasen haben ähnliche Molekulargewichte. Die klonierte Serin-Protease von Bacillus PB92 wurde daher unterschieden von bekannten Serin-Proteasen (B. subtilis-Subtilisin, Carlsberg-Subtilisin) durch Transformation von pM58 und pUB11O in den proteasenegativen B. subtilis Stamm DB104 [R. Doi, J. Bacteriol. 160 (1984) 442-444] und Analyse der erzeugten extrazellulären Proteasen. Die erhaltenen Transformanten wurden kultiviert in Minimalmedium (Spizizen et al., oben), enthaltend 0,02% Casamino Acids, 50 ug/ml Histidin und 20 ug/ml Neomycin. Nach 24 Stunden wurden Proben entnommen, zentrifugiert und ohne Vorbehandlung analysiert auf Histidin/MOPS-Gelen, enthaltend 75 mMol/l KOH, 40 mMol/l Histidin, 100 mMol/l MOPS [3- (N-Morpholino)-propansulfonsäure], pH 7,5, und 5% Polyacrylamid. Der Elektrophoresepuffer enthielt 40 mMol/l Histidin, 100 mMol/l MOPS, pH 6,6. Die Proben liess man in Richtung der Kathode laufen. Proteasebanden wurden mit Agfa Pan 100 professional films [Zuidweg et al., Biotechnol. and Bioengin. 14 (1972) 685-714] nachgewiesen. Diese Resultate sind in Figur 3 gezeigt. Wie in Figur 4 gezeigt, enthält pM58 das Gen, das für Bacillus PB92-Protease codiert.
- Die gesamte Sequenz eines BalI-HpaI-Fragments von pM58 wurde bestimmt mittels der Methode von Sanger, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 74 (1977) 6463. Restriktionsfragmente von pM58 (s. Figur 4) wurden kloniert in den M13-Phagenvektoren mp10' mp11 und mp18 [Messing et al., Nucleic Acids Res. 9 (1981) 309-321]. Insertionen von pM58-Fragmenten wurden durchgetestet durch Plaquehybridisierung. Nach dem Sequenzieren wurden zehn in regelmässigen Abständen auf dem Gen angeordnete Oligonucleotide hergestellt, und das Sequenzieren wurde wiederholt, wodurch die in Figur 5 gezeigte Sequenz bestätigt wurde.
- Um das Plasmid pUCN710 (Figur 6A) zu konstruieren, wurde pUB110 mit TaqI und PvuII gespalten. Das Fragment, das das Gen enthielt, das Neomycinresistenz verleiht, wurde auf niedrigschmelzender Agarose gereinigt und glatt gemacht mit Klenow-Polymerase und NTP's (Maniatis, Molecular Cloning: A Laboratory Manual. Cold Spring Harbor 1982). Das Plasmid pUC7 [Vieira et al., Gene 19 (1982) 259-268] wurde linearisiert mit SalI und wie oben beschrieben glatt gemacht. Beide Fragmente wurden mit T4-Ligase (Maniatis) ligasiert und in E. coli JM1O3 transformiert. Die Selektion fand statt auf 2xTY-Platten (1,6% Gew./Vol. Bacto-Trypton, 1% Gew./Vol. Hefeextrakt, 0,5% NaCl), enthaltend 50 ug/ml Ampicillin und 10 ug/ml Neomycin. Das resultierende Plasmid, das pUCN710 genannt wurde, wurde mit BamHI gespalten. Das Plasmid pE194 [Jordanescu, Plasmid 1 (1978) 468-479] wurde mit BclI gespalten. Die Fragmente aus beiden Spaltungen wurden mit T4-Ligase ligasiert und in B. subtilis 1A40 transformiert. Die Selektion fand statt auf Minimalplatten, die 20 ug/ml Neomycin enthielten (s. Beispiel 1). Das erhaltene Plasmid, pE194- neo (Figur 6A) enthält das Neomycingen und einen temperaturempfindlichen Replikationsstart.
- Die Subklonierung des Proteasegens in den Integrationsvektor pE194-neo wurde folgendermassen ausgeführt: pM58 (s. Beispiel 1) wurde mit HpaI und BalI und BglII gespalten. Das Plasmid pE194-neo wurde mit HpaI gespalten. Diese Fragmente wurden mit T4-Ligase ligasiert und in B. subtilis 1A40 transformiert. Die Transformanten wurden selektioniert auf Basis der Neomycinresistenz und einer Erhöhung der Proteaseproduktion, beurteilt durch Fällung von Caseinspaltprodukten (Halobildung, s. Beispiel 1). Das Plasmid pMAX-4 wurde erhalten, dessen Struktur durch Restriktionsenzymanalyse bestätigt wurde (s. Figur 6B).
- Bacillus Stamm PB92 wurde über Nacht kultiviert in 100 ml NBSG-X-Medium [Thorne et al., J. Bacteriol. 91 (1966) 1012-1020]. Die Kultur wurde 10 Minuten lang bei 4500 Umdrehungen/Minute in einem Sorvall Modell GSA-Rotor zentrifugiert. Protoplasten wurden hergestellt, indem man die Bacilli eine Stunde lang bei 37ºC in 10 ml Alkalic Holding Medium (AHM), enthaltend 0,5 Mol/l Saccharose, 0,02 Mol/l MgCl&sub2; und 0,02 Mol/l Tris/Maleat, pH 8,0, in sterilem Wasser, dem 0,4 mg/ml Lysozym zugesetzt waren, inkubierte. Die Protoplasten wurden abzentrifugiert (10 Minuten bei 4500 Umdrehungen/Minute), erneut in 5 ml AHM+-pH 8,0-Puffer [AHM- Puffer, dem 3,5% (Gew./Vol.) Bacto Penassay Broth und 0,04% (Gew./Vol.) Albumine Merieux zugesetzt worden waren] suspendiert und gemischt, dann erneut wie oben abzentrifugiert. Nach dem erneuten Suspendieren in 5,0 ml Alkaline Holding Medium wurden 0,5 ml dieser Protoplastensuspension mit 5 ug entmineralisiertem Wasser, das 1 ug Plasmid-DNA enthielt; gemischt und 2 Minuten lang in Gegenwart von 30% (Gew./Vol.) Polyethylenglycol 8000, pH 8,0, inkubiert. Nach 1:3-Verdünnung mit AHM&spplus;- pH 8,0-Medium und Zentrifugieren wurde der Niederschlag erneut in einem kleinen Volumen (1 ml) AHM&spplus; suspendiert und 2 bis 3 Stunden lang inkubiert. Aliquote Teile von 100 Mikroliter wurden auf frisch hergestellten Regenerationsplatten ausplattiert, die 0,5 Mol/l Na-Succinat/HCl pH 8,0, 1,5% (Gew./Vol.) Agar, 0,5% (Gew./Vol.) Casamino Acids, 0,5% (Gew./Vol.) Hefeextrakt, 0,031 Mol/l Phosphatpuffer pH 8,0, 0,5% (Gew./Vol.) Glucose, 0,02 Mol/l MgCl&sub2; und 0,02% (Gew./Vol.) Albumine Merieux enthielten. Diese Platten enthielten auch 1000 ug/ml Neomycin für die Selektion. Nach Inkubation bei 37ºC während mindestens 72 Stunden wurden die Kolonien auf Herzinfusionsagarplatten replika-plattiert, die 20 g/ml Neomycin enthielten.
- Ein Transformant von Bacillus PB92, enthaltend das Plasmid pMAX-4, wurde bei 37ºC 24 Stunden lang in Tryptone Soya Broth (TSB), enthaltend entweder 1 ug/ml oder 20 ug/ml Neomycin, inkubiert. 2 ml-Portionen der Zellsuspensionen wurden dann in 100 ml TSB, enthaltend 51 ug/ml bzw. 20 ug/ml Neomycin, verdünnt und 24 Stunden lang bei 50ºC inkubiert. Nach 24 Stunden wurden 5 ml- Proben beider Kulturen wieder wie oben beschrieben verdünnt und 24 Stunden lang bei 50ºC inkubiert, wiederum in Gegenwart von 1 ug/ml bzw. 20 ug/ml Neomycin. Die letzte Prozedur wurde noch einmal wiederholt. Die Zellsuspensionen wurden dann 100-fach verdünnt und ausplattiert auf Heart Infusion (HI) Agar-Platten, die 1 ug/ml Neomycin enthielten für die Proben aus den Kolben, die 1 ug/ml Neomycin enthielten, und 20 ug/l Neomycin enthielten für die Proben aus den Kolben, die 20 ug/ml Neomycin enthielten. Die Platten wurden 16 Stunden lang bei 50ºC inkubiert. Neomycinresistente Kolonien wurden isoliert und bei 37ºC 16 Stunden lang kultiviert in 10 ml TSB-Medium, enthaltend 1 ug/ml Neomycin. Aus diesen Kulturen wurde die gesamte DNA isoliert [Holmes et al., Anal. Biochem. 114 (1981) 193-197]. Die Abwesenheit von Plasmid wurde verifiziert durch DNA- Elektrophorese auf Agarosegel. Die Abwesenheit von Plasmid-DNA aus Proben, in denen Plasmid-DNA nicht nachweisbar war, wurde durch Transformation der gesamten DNA in B. subtilis 1A40 bestätigt. Proben, denen die Fähigkeit fehlte, B. subtilis 1A40 zu transformieren, wurden als plasmidfrei angesehen.
- Um zu überprüfen, ob und in welcher Weise eine Integration von pMAX-4 in das Chromosom stattfand, wurde chomosomale DNA isoliert, mit HindIII gespalten, auf 0,5%-igen DNA-Agarosegelen laufen gelassen und auf Nitrozellulose geblottet [Southern, J. Mol. Biol. 98 (1975) 503-517] und mit mit ³²P markiertem Nick-translatiertem pM58 (Maniatis, 1982) hybridisiert. Das Ergebnis dieser Analyse ist in Figur 7A gezeigt.
- Die Selektion bei 1 ug/ml Neomycin führte zu Proteasegenen, die in dem Chromosom hintereinander gelegen und durch Plasmid-Sequenzen (Stamm PBT109) getrennt waren als Ergebnis von homologer Rekombination (Mechanismus vom Campbell-Typ). In einer Ansammlung von 30 unabhängig isolierten Eingebauten wurde die Selektion bei 1 ug/ml Neomycin ausgeführt. Es wurde ein Eingebauter isoliert, der das Plasmid pMAX-4 an einem zufälligen Ort in dem Chromosom enthielt als Ergebnis einer illegitimen Rekombination (Stamm PBT122). Die Selektion bei 20 ug/ml Neomycin führte zu einer Kopie von Plasmid pMAX-4 an einem zufälligen Ort in dem Chromosom als Resultat eines illegitimen Typs von Rekombination. Der letztere Stamm wurde PBT108 genannt. Die genetischen Anordnungen der Stämme PBT109 und 108 sind in den Figuren 7B bzw. 7C wiedergegeben. Die chromosomale Analyse zeigte, dass die Integration in PBT122 und PBT108 an verschiedenen Stellen in dem Chromosom eintrat.
- 100 ml Produktionsmedium (enthaltend: 1% Stärke, 4% Lactose, 0,87% K&sub2;HPO&sub4;, 0,5% Hefeextrakt, 0,5% (NH&sub4;)&sub2;HPO&sub4;, 0,2% Tri-Na-citrat.2H&sub2;O, 0,05% MgSO&sub4;.7H&sub2;O, 0,07% CaCl&sub2;, 0,068% FeSO&sub4;.7H&sub2;O und Antischaummittel 1 ml/l) ohne Neomycin wurde mit 0,2 ml einer über Nacht- TSB-Kultur (37ºC) von Stamm PBT108 oder PBT109 in 500 ml-Schüttelkolben geimpft. Nach Inkubation während 44 Stunden bei 37ºC unter konstanter Belüftung wurde die Kultur auf neomycinresistente Kolonien und auf Proteaseaktivität getestet.
- Beide Stämme PBT108 und PBT109 wurden auch in Eschweiler-Fermentern getestet, die das gleiche Produktionsmedium enthielten, um den Effekt der Massstabvergrösserung auf 10 l zu prüfen. Die Resultate der Fermentierungsexperimente sind in der folgenden Tabelle 1 zusammengefasst. Tabelle 1 Stamm Relative Produktion von Protease * Prozent neomycinresistente Zellen nach Fermentation Kontrolle (PB92) * Die Proteaseaktivität wurde unter Verwendung von Dimethylcasein als Substrat analysiert wie von Lin et al., J. Biol. Chem. 244 (1969) 789-793 beschrieben.
- Die Analyse von Kolonien, die aus der Eschweiler- Fermentation von PBT109 nach zwei Tagen Kultivieren erhalten wurden, zeigte, dass 3 bis 25% dieser Kolonien auf dem Niveau eines Stammes produzierten, der nur ein einziges Proteasegen enthält. Es wurde gefunden, dass diese gleichen Kolonien infolge der Excision der pMAX- 4-Sequenz durch homologe Rekombination neomycinempfindlich waren. Jedoch zeigte die Analyse der Kolonien, die aus der Fermentierung des Stammes PBT108 herrührten, dass diese Zellen alle neomycinresistent waren. 100 dieser neomycinresistenten Kolonien wurden wahllos entnommen und individuell auf die Proteaseproduktionsmöglichkeit getestet, um zu bestimmen, ob sie ein oder zwei produktive Proteasegene enthielten. Alle 100 individuell getesteten Kolonien erzeugten auf dem Niveau eines Stammes, der zwei Gene enthielt, was zeigte, dass die beiden zufällig eingebauten Proteasegene in PBT108 unter den angewandten Fermentierungsbedingungen in der Zelle stabil manifestiert und an die Nachkommen weitergegeben werden.
- Das Plasmid pGB34, beschrieben in EP-A-0 134 048, wurde gespalten mit den Restriktionsenzymen BclI, BglI und BglII. Die erhaltenen Restriktionsfragmente wurden mit Klenow-Polymerase abgestumpft und dann in die HpaI- Schnittstelle von pE194-neo ligasiert (s. Beispiel 6). Plasmid pE194-neo-DNA wurde wie von Birnboim und Doly [Nucl. Acids Res. 7 (1979) 1513-1523] beschrieben isoliert.
- Das Ligasierungsgemisch wurde in B. subtilis 1A40 transformiert gemäss der Methode von Spizizen et al. [J. Bacteriol. 81 (1961) 741-146] unter Verwendung von 0,5 bis 1 ug DNA Pro ml aufnahmefähige Zellen. Zellen aus dem Transformationsgemisch wurden ausplattiert auf Minimalplatten, enthaltend 2,8% K&sub2;HPO&sub4;, 1,2% KH&sub2;PO&sub4;, 0,4% (NH&sub4;)&sub2;SO&sub4;, 0,2% Tri-Na-citrat.2H&sub2;O, 0,04% MgSO&sub4;.7H&sub2;O, 0,00005% MnSO&sub4;.4H&sub2;O, 0,4% Glutaminsäure, 0,5% Glucose, 0,02% Casamino Acids, 50 ug/ml Tryptophan, 20 ug/ml Methionin, 20 ug/ml Lysin, 20 ug/ml Neomycin, 0,4% Casein, 0,5% Stärke und 1,5% Agar.
- DNA von alpha-Amylase erzeugenden Kolonien wurde wie von Birnboim und Doly beschrieben isoliert und mit Restriktionsenzymen geprüft. Aus einem dieser Transformanten wurde das Plasmid pElatB, s. Figur 8, isoliert.
- Die Transformation von Bacillus licheniformis Stamm T9 wurde wie in der EP-A-0 253 455 beschrieben ausgeführt mit der Ausnahme, dass die gesamte Prozedur bei 30ºC statt bei 37ºC ausgeführt wurde. Die Selektion auf Transformanten wurde auf Minimalplatten ausgeführt, die 20 ug/ml Neomycin enthielten. Alle Transformanten erzeugten Amylase. Die Restriktionsenzymanalyse, die mit DNA ausgeführt wurde, die wie von Birnboim und Doly beschrieben hergestellt war, zeigte, dass die Transformanten alle pElatB enthielten.
- Bacillus licheniformis Stamm T9, enthaltend Plasmid pElatB, wurde in Tryptone Soya Broth (TSB), enthaltend 20 ug/ml Neomycin, geimpft und 16 Stunden lang bei 30ºC inkubiert. Ein 5 ml-Teil der Zellsuspension wurde in 100 ml des gleichen Mediums verdünnt und 24 Stunden lang bei 50ºC inkubiert.
- Diese Prozedur wurde einmal wiederholt. Die Zellsuspension wurde dann 100-fach verdünnt und ausplattiert auf Heart Infusion Agar-Platten, die 10 ug/ml Neomycin enthielten. Nach 40 Stunden Inkubation bei 50ºC wurden neomycinresistente Kolonien isoliert und in 10 ml TSB-Medium, enthaltend 10 ug/ml Neomycin, 16 Stunden lang bei 30ºC kultiviert. Die gesamte DNA aus diesen Kulturen wurde isoliert [Holmes et al., Anal. Biochem. 114 (1981) 193-197]. Die Abwesenheit von Plasmiden in diesen Zellen wurde verifiziert durch DNA- Elektrophorese auf Agarosegelen. Proben, in denen niedermolekulare DNA praktisch abwesend war, wurden erneut auf das Vorhandensein von Plasmid-DNA geprüft durch DNA-Transformation in B. subtilis 1A40 (Spizizen et al., 1961). Proben, denen die Fähigkeit fehlte, B. subtilis 1A40 zu Neomycinresistenz zu transformieren, wurden als Plasmid minus angesehen.
- Um zu prüfen, ob Integration von pElatB stattfand und wie sie stattfand, wurde chromosomale DNA aus den Transformanten isoliert [Saito-Minwa, Biochem. Biophys. Acta 72 (1963) 619-632], mit EcoRI gespalten, auf 0,5%- igen Agarosegelen fraktioniert, auf Nitrozellulose geblottet [Southern, J. Mol. Biol. 98 (1975) 503-517] und mit mit ³²P markiertem Nick-translatiertem pGB33 (s. EP-A-0 134 048) hybridisiert. Die Resultate aus dieser Analyse sind in Figur 9A gezeigt. Die Daten zeigen, dass illegitime Rekombination von pElatB stattfand, was zu einem Stamm führte, der ein einziges Amylasegen auf einer anderen Stelle des Genoms enthielt, verglichen mit dem ursprünglichen Bacillus licheniformis T5-Amylasestamm. Der erhaltene Stamm, der pElatB enthielt, wurde TB13 genannt.
- Um einen Stamm zu entwickeln, der zwei Amylasegene enthält, die durch endogene chromosomale DNA- Sequenzen getrennt sind, wurde ein Fusionsexperiment ausgeführt zwischen Bacillus licheniformis Stamm T5 (dem ursprünglichen das Amylasegen enthaltenden Amylasestamm, s. EP-A-0 134 048) und Stamm TB13 (dem ein zufällig eingebautes Amylasegen enthaltenden Stamm). Die Protoplastenfusion wurde ausgeführt wie in der EP-A-0 134 048 beschrieben, deren Offenbarung durch diesen Hinweis eingefügt wird. Stamm TB13 wurde vor der Protoplastenbildung mit Iodacetamid abgetötet. Der Stamm T5 (neomycinempfindlich) wurde nicht abgetötet.
- Die Selektion auf Fusionen fand auf den Regenerationsplatten statt, die 10 ug/ml Neomycin enthielten.
- Um potentielle Fusionen zu überprüfen und identifizieren, wurde chromosomale DNA isoliert, mit EcoRI gespalten, auf 0,5%-igen Agarosegelen fraktioniert, auf Nitrocellulosefilter geblottet [Southern, J. Mol. Biol. 98 (1975) 503-517] und mit mit ³²P markiertem Nicktranslatiertem pGB33 (s. EP-A-0 134 048) hybridisiert. Das Resultat dieser Analyse ist in Figur 9B gezeigt. Eine der erhaltenen Fusionen, T13F, enthielt zwei Amylasegene, die durch endogene chromosomale Sequenzen getrennt waren.
- Die Stabilität von Stamm T13F, einem Stamm, der zwei chromosomale Amylasegene enthält, die durch unentbehrliche chromosomale Sequenzen getrennt sind, wurde verglichen mit derjenigen von Stamm T39O, einem Stamm mit zwei chromosomalen Amylasegenen, die hintereinander angeordnet sind. Die Herstellung von Stamm T39O ist in der EP-A-0 134 048 (Seite 17, Tabelle I) offenbart, wo er als B. licheniformis T5 (pGB33) bezeichnet wurde. Die Stämme T13F und T39O wurden unter Fermentierungsbedingungen getestet; 0,2 ml einer über Nacht-TSB-Kultur (37ºC) wurden nämlich in 500 ml-Schüttelkolben geimpft, die 100 ml Produktionsmedium (s. Beispiel 7; nach Sterilisation wurde der pH-Wert mit NaOH auf 6,9 eingestellt) ohne Neomycin enthielten. Nach Inkubation während 6 Tagen bei 40ºC unter dauernder Belüftung wurde die Kultur auf neomycinresistente Kolonien und Amylaseaktivität getestet. Die Resultate der Fermentierungsexperimente sind in der folgenden Tabelle 2 zusammengefasst. Tabelle 2 Stamm Relative Amylaseaktivität Prozent neomycinresistente Zellen nach Fermentation * * Mehr als tausend Kolonien wurden pro Stamm getestet.
- Um die Möglichkeit der Excision eines der Amylasegene ohne gleichzeitigen Verlust des Neomycingens in Stamm T13F auszuschliessen, wurden 20 Kolonien, die aus der T13F-Fermentation stammten, analysiert. Chromosomale DNA aus 20 zufällig gewählten Kolonien wurde isoliert und durch Hybridisierungsexperimente wie oben beschrieben charakterisiert. Die Resultate von 9 dieser Analysen sind in Figur 10 gezeigt. Alle getesteten Stämme enthielten zwei Amylasegene, wie bewiesen durch das Vorhandensein von zwei alpha-Amylasegene enthaltenden EcoRI-Fragmenten in ihrer chromosomalen DNA.
- Im Gegensatz zu der genetischen Stabilität von Stamm T13F wurde gefunden, dass der Stamm T39O bei der Fermentierung unstabil ist, was zu 12% neomycinempfindlichen Kolonien führt. Eine dieser Kolonien wurde analysiert, und es wurde gefunden, dass sie nur ein alpha- Amylasegen enthielt (Figur 10, Bahn 4). Dies zeigt, dass zufällig eingebaute Amylasegene unter Fermentierungsbedingungen stabiler sind als hintereinander eingebaute Gene.
- Es ist aus den obigen Resultaten ersichtlich, dass eine prokaryotische Zelle erhalten werden kann, in der stabile Genamplifikation erzielt wird, indem man auf transformierte Zellen selektioniert, in denen nicht hintereinanderliegender Einbau von mindestens zwei Kopien des zu amplifizierenden Strukturgens eingetreten ist. Die Integration kann durch homologe Rekombination oder illegitime Rekombination eintreten.
- Alle in dieser Beschreibung erwähnten Publikationen und Patentanmeldungen zeigen das Niveau des Könnens der Fachleute auf dem Gebiet, auf das sich diese Erfindung bezieht. Alle Publikationen und Patentanmeldungen werden in dieses Patent durch Hinweis in dem gleichen Ausmass eingefügt, als ob jede einzelne Publikation oder jede einzelne Patentanmeldung spezifisch und individuell als durch Hinweis eingefügt bezeichnet worden wäre.
Claims (34)
1. Transformierte prokaryotische Wirtszelle, die
in ihrem Chromosom mindestens zwei Kopien einer DNA-
Sequenz aufweist, wobei die DNA-Sequenz für ein
interessierendes Polypeptid codiert, wobei die genannten
Kopien durch endogene chromosomale DNA getrennt sind,
die für die Wirtszelle lebenswichtig ist.
2. Transformierte prokaryotische Wirtszelle, die
in ihrem Chromosom mindestens zwei Kopien einer DNA-
Sequenz aufweist, wobei die DNA-Sequenz für ein
interessierendes Polypeptid codiert, wobei die genannten
Kopien durch endogene chromosomale DNA getrennt sind,
die für die Wirtszelle lebenswichtig ist, wobei die
Zelle mittels der Methode erhältlich ist, die aufweist:
das Kombinieren einer Empfängerwirtszelle, die
mindestens eine Kopie der genannten DNA-Sequenz in ihr
Chromosom eingebaut aufweist, mit
(a) einem DNA-Konstrukt, das mindestens eine Kopie der
genannten DNA-Sequenz und ein Markergen und/oder einen
temperaturempfindlichen Replikationsstart aufweist,
oder
(b) einer Spenderwirtszelle, die das genannte
DNA-Konstrukt aufweist, unter transformierenden Bedingungen;
das Selektionieren auf e.inen Transformanten,
wobei das genannte DNA-Konstrukt in das Chromosom des
genannten Transformanten eingebaut ist; und
das Isolieren aus den Transformanten von
transformierten prokaryotischen Wirtszellen, die mindestens
zwei Kopien der genannten DNA-Sequenz aufweisen, die
durch endogene DNA-Sequenzen getrennt sind, die
lebenswichtig für die Wirtszelle sind.
3. Transformierte prokaryotische Wirtszelle nach
Anspruch 1 oder 2, wobei die genannte prokaryotische
Zelle ein Bacillus-Stamm ist.
4. Transformierte prokaryotische Wirtszelle nach
Anspruch 3, wobei der genannte Bacillus-Stamm ein
alkalophiler Bacillus-Stamm oder ein Bacillus
licheniformis-Wirtsstamm ist.
5. Transformierte prokaryotische Wirtszelle nach
Anspruch 4, wobei der genannte alkalophile Bacillus-
Stamm Bacillus novo species PB92 oder eine Mutante oder
Variante davon ist.
6. Transformierte prokaryotische Wirtszelle nach
Anspruch 4, wobei der genannte Bacillus licheniformis-
Wirtsstamm Bacillus licheniformis T5 oder eine Mutante
oder Variante davon ist.
7. Transformierte prokaryotische Wirtszelle nach
Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass das
interessierende Polypeptid ein Enzym ist.
8. Transformierte prokaryotische Wirtszelle nach
Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, dass das Enzym ein
proteolytisches Enzym oder ein amylolytisches Enzym
ist.
9. Transformierte prokaryotische Wirtszelle nach
Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, dass das
proteolytische Enzym eine Serin-Protease ist.
10. Transformierte prokaryotische Wirtszelle nach
Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, dass die genannte
Serin-Protease im wesentlichen die folgende Aminosäure-
Sequenz aufweist:
11. Transformierte prokaryotische Wirtszelle nach
Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, dass das
amylolytische Enzym alpha-Amylase ist.
12. Transformierte prokaryotische Wirtszelle nach
Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass das
Genom von Bacillus novo species PB92 oder einer Mutante
oder Variante davon die genannte DNA-Sequenz aufweist.
13. Transformierte prokaryotische Wirtszelle nach
Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass das
Genom von Bacillus licheniformis Stamm T5 oder einer
Mutante oder Variante davon die genannte DNA-Sequenz
aufweist.
14. Verfahren zur Herstellung einer
transformierten prokaryotischen Wirtszelle, die in ihrem Chromosom
mindestens zwei Kopien einer DNA-Sequenz aufweist,
wobei die genannte DNA-Sequenz für ein interessierendes
Polypeptid codiert, wobei die genannten Kopien durch
endogene chromosomale DNA getrennt sind, die für die
Wirtszelle lebenswichtig ist, wobei das Verfahren
aufweist:
das Kombinieren einer Empfängerwirtszelle, die
mindestens eine Kopie der genannten DNA-Sequenz in ihr
Chromosom eingebaut aufweist, mit
(a) einem DNA-Konstrukt, das mindestens eine Kopie der
genannten DNA-Sequenz und ein Markergen und/oder einen
temperaturempfindlichen Replikationsstart aufweist,
oder
(b) einer Spenderwirtszelle, die das genannte
DNA-Konstrukt aufweist, unter transformierenden Bedingungen;
das Selektionieren auf einen Transformanten,
wobei das genannte DNA-Konstrukt in das Chromosom des
genannten Transformanten eingebaut ist; und
das Isolieren aus den genannten Transformanten
von transformierten prokaryotischen Wirtszellen, die
mindestens zwei Kopien der genannten DNA-Sequenz
aufweisen, die durch endogene DNA getrennt sind, die für
die Wirtszelle lebenswichtig ist.
15. Verfahren nach Anspruch 14, dadurch
gekennzeichnet, dass das Selektionieren aufweist:
das Kultivieren des genannten Transformanten, der
ein DNA-Konstrukt aufweist, das ein Markergen aufweist,
in Gegenwart eines Biozides, gegen das das genannte
Markergen Resistenz verleiht; und
das Identifizieren und Isolieren von
plasmidfreien Transformanten aus den genannten Transformanten.
16. Verfahren nach Anspruch 14, dadurch
gekennzeichnet, dass das Selektionieren aufweist:
das Kultivieren des genannten Transformanten, der
ein DNA-Konstrukt aufweist, das ein Markergen und einen
temperaturempfindlichen Replikationsstart aufweist, in
Gegenwart eines Biozides bei einer nicht-permissiven
Temperatur; und
das Selektionieren von plasmidfreien
Transformanten aus den genannten Transformanten.
17. Verfahren nach Anspruch 14, dadurch
gekennzeichnet, dass das Isolieren aufweist:
das Isolieren von chromosomaler DNA aus den
genannten Transformanten; und
das Hybridisieren der genannten chromosomalen DNA
mit einer markierten Sonde, die das genannte
DNA-Konstrukt oder ein Fragment davon aufweist, wodurch die
genannten transformierten prokaryotischen Wirtszellen
durch Nachweis der Markierung selektioniert werden.
18. Verfahren nach Anspruch 14, dadurch
gekennzeichnet, dass die genannte Spenderwirtszelle erhalten
wird mittels eines Verfahrens, das aufweist:
das Kombinieren einer prokaryotischen Zelle, der
eine DNA-Sequenz fehlt, die für das interessierende
Polypeptid codiert, mit dem genannten DNA-Konstrukt
unter Fusionsbedingungen;
das Isolieren von transformierten Zellen;
das Kultivieren der genannten transformierten
Zellen bei einer nicht-permissiven Temperatur; und
das Identifizieren und Isolieren von
transformierten Zellen, in denen das genannte DNA-Konstrukt in
eine Stelle auf dem Chromosom eingebaut ist, die von
derjenigen in der Empfängerwirtszelle verschieden ist.
19. Verfahren nach einem der Ansprüche 14 bis 18,
dadurch gekennzeichnet, dass die genannte
prokaryotische Zelle ein Bacillus ist.
20. Verfahren nach Anspruch 19, dadurch
gekennzeichnet, dass der genannte Bacillus ein alkalophiler
Bacillus-Stamm oder ein B. licheniformis-Stamm ist.
21. Verfahren nach Anspruch 20, dadurch
gekennzeichnet, dass der genannte alkalophile Bacillus-Stamm
Bacillus novo species PB92 und der genannte B.
licheniformis-Stamm B. licheniformis T5 ist.
22. Verfahren nach einem der Ansprüche 14 bis 21,
dadurch gekennzeichnet, dass das interessierende
Polypeptid ein Enzym ist.
23. Verfahren nach Anspruch 22, dadurch
gekennzeichnet, dass das Enzym eine Serin-Protease oder eine
Amylase ist.
24. Verfahren nach Anspruch 23, dadurch
gekennzeichnet, dass die genannte Serin-Protease mindestens
70% Homologie in Nucleotidsequenz mit einem für ein
proteolytisches Enzym codierenden Gen aus Bacillus novo
species PB92 hat.
25. Verfahren nach Anspruch 23 oder 24, dadurch
gekennzeichnet, dass die genannte Serin-Protease im
wesentlichen die folgende Aminosäuresequenz hat:
26. Verfahren nach einem der Ansprüche 14 bis 25,
dadurch gekennzeichnet, dass das genannte DNA-Konstrukt
gewählt ist aus der Gruppe, die besteht aus:
dem rekombinanten Plasmid pMAX-4 mit einer Grösse
von 7,6 kb und einer physikalischen Karte, wie sie in
der beiliegenden Fig. 6B dargestellt ist, das das für
Bacillus PB92-Protease codierende Gen, das in dem Stamm
Bacillus novo species PB92 enthalten ist, einen
temperaturempfindlichen Replikationsstart, der von dem
Plasmid pE194 abgeleitet ist, und ein Neomycinresistenzgen
aufweist, oder
dem rekombinanten Plasmid pElatB mit einer Grösse
von 8,2 kb und einer physikalischen Karte, wie sie in
der beiliegenden Figur 8 dargestellt ist, das das für
alpha-Amylase codierende Gen, das in dem Plasmid pGB34,
hinterlegt in Bacillus subtilis 15-53 unter No. CBS
467.83, enthalten ist, einen temperaturempfindlichen
Replikationsstart, der von dem plasmid pEl94 abgeleitet
ist, und ein Neomycinresistenzgen aufweist.
27. Verfahren nach einem der Ansprüche 14 bis 26,
dadurch gekennzeichnet, dass die genannte DNA-Sequenz
durch illegitime Rekombination eingebaut wird.
28. Verfahren nach einem der Ansprüche 14 bis 26,
dadurch gekennzeichnet, dass die genannte DNA-Sequenz
durch homologe Rekombination eingebaut wird.
29. Verfahren nach einem der Ansprüche 14 bis 26,
dadurch gekennzeichnet, dass das genannte DNA-Konstrukt
weiter einen temperaturempfindlichen Replikationsstart
aufweist.
30. Verfahren nach Anspruch 29, dadurch
gekennzeichnet, dass das genannte temperaturempfindliche
Plasmid von dem Plasmid pE194 abgeleitet ist.
31. Bacillus Stamm PBT108, der erhältlich ist
durch Einbau von Plasmid pMAX-4, wie es in Anspruch 26
definiert ist, in Bacillus novo species PB92, gefolgt
von Selektion bei 20 ug/ml Neomycin, und der zwei Gene
enthält, die für alkalische Protease codieren und durch
endogene chromosomale DNA getrennt sind, die für den
Stamm lebenswichtig ist.
32. Bacillus Stamm PBT122, der erhältlich ist
durch Einbau von Plasmid pMAX-4, wie es in Anspruch 26
definiert ist, in Bacillus novo species PB92, gefolgt
von Selektion bei 1 ug/ml Neomycin, und der zwei Gene
enthält, die für alkalische Protease codieren und durch
endogene chromosomale DNA getrennt sind, die für den
Stamm lebenswichtig ist.
33. Bacillus Stamm T13F, der zwei Gene enthält,
die für alpha-Amylase codieren und durch endogene
chromosomale DNA-Sequenzen getrennt sind, die für den Stamm
lebenswichtig sind, und der erhältlich ist durch
Protoplastenfusion von Protoplasten von B. licheniformis
Stamm T5 und B. licheniformis Stamm T9, der ein alpha-
Amylase-defizienter Mutantenstamm von B. licheniformis
T5 ist, der in das Genom eingebaut das Plasmid pElatB,
wie es in Anspruch 26 definiert ist, enthält.
34. Verwendung einer transformierten
prokaryotischen Wirtszelle, wie sie in einem der Ansprüche 1 bis
13 definiert ist, für die Herstellung eines
interessierenden Polypeptids.
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