CN1049247C - 在原核微生物的染色体dna中进行稳定的基因放大 - Google Patents

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Abstract

提供了包含两个或多个稳定地保留在其染色体内之DNA序列拷贝的转化的原核宿主细胞，所说的DNA序列包含一编码有用多肽的基因，其中所说的拷贝是被内源性染色体DNA序列分隔开的。还提供了生产所说已转化之宿主菌株的方法。所说的转化的宿主菌株与已经产生所说多肽的宿主菌株比较，其提高了有用多肽的生产量。优选的宿主菌株是产生高碱性蛋白水解酶的芽孢杆菌新种PB92和产生耐热α淀粉酶的地衣形芽孢杆菌菌株T5以及它们的突变株或变异株。优选的多肽编码基因是来源于芽孢杆菌PB92的蛋白酶编码基因和来源于地衣形芽孢杆菌菌株T5或其衍生株的α淀粉酶编码基因。

Description

在原核微生物的染色体DNA中进行稳定的基因放大
本发明涉及基因工程技术以及以该技术在原核微生物中进行DNA的染色体放大方面的应用。本发明特别涉及通过基因工程获得原核微生物的方法，而所说微生物的染色体中整合了一个以上有确定之DNA序列的拷贝，且能在其中稳定地保留。
重组DNA技术在生产蛋白质中的工业应用，关键是要得到克隆基因的高水平地稳定表达。文献中已充分介绍过以基因工程手段在某些原核和真核微生物中，获得同源或异源基因之高水平表达的几种方法。
达到基因之高水平表达的方法之一是提供具有有效调节序列的基因。另一种方法——常常与第一种方法结合使用，则是增加所需基因的拷贝数。放大作用大多是通过将基因***多拷贝染色体外DNA分子(如质粒)中达到的。使用质粒作为所说载体分子来表达和放大遗传信息的缺点在于它们的不稳定性。
不稳定性表现有两种形式：(1)结构不稳定性，是指质粒的若干部分被删除；(2)分离不稳定性，即培养期间质粒游离于宿主细胞外。因为许多细胞***必定发生在足够的生物量形成之前(以达到大量产品生成)，所以对于大规模应用来说，已放大之基因的稳定性是维持高水平产生放大基因编码的功能性产品的先决条件。在许多情况下，向发酵液内加入抗生素或类似物是有用的，因为这样便能够选择那些含有多拷贝质粒的细胞，而这些质粒是携带抗这些因子的抗性基因的。然而，因为受到有关发酵方法和其产品获得批准之规定的限制，所以在大规模生产过程中，一般不适于使用抗生素。
已发现了另一种避免由于分离不稳性而造成质粒丢失的方法，即将功能上对于宿主细胞必不可少的基因加到载体分子上(E.Ferrariet al.，Biotechnology，3，1003-1007，1985)。但这种方法仍不能确保载体分子的结构稳定性。
如果宿主细胞中包藏有携带可超表达基因的载体分子，则通常将会对已失去超表达该基因能力的细胞产生选择压力。因为超表达将使宿主细胞与未超表达宿主细胞的竞争性(成长速率)，并因为其大量代谢能量消耗在该超表达之基因产物上，故这种超表达对于已转化的宿主细胞确实是一个不利性质。
还有人提出了其他解决结构质粒不稳定性问题的方法。可以争论的是，避免载带于质粒上之基因的表达，能够在指数生长期降低这种选择压力，并从而降低结构不稳定性。其他解决方法是避免使用自主复制的载体分子。一旦已引入的DNA整合到宿主细胞染色体中，就可阻止由载体分子的自主复制引起的不稳定性。
C.H.Duncan等人(Proc.Natl.Acad.Sci.USA，75，3664-3668，1978)已描述了通过同源重组将外来DNA整合到枯草杆菌染色体中的方法，J.G.K.Williams和A.A.Szalay(Gcne，24，37-51，1983)及国际专利申请WO83/00381号中则公开了以同一技术将外来DNA整合到Anacystis nidulans之染色体中的方法。
欧洲专利申请-0127328号描述了通过外源基因的同源重组将携带于质粒载体上时不能稳定保留的基因整合到微生物染色体内的方法。
J.Hofemeister等人(Mol.Gen.Genet.，189，58-68，1983)和A.A.Prorozov等人(Gene，34，39-46，1985)描述了不依赖同源重组，而使用载体PE194，通过非寻常重组将质粒整合到枯草杆菌染色体中的方法。
有关染色体整合之基因的放大，无论是同源的还是异源的，均已有详尽的文献报导(H.Saito et al.，in：Proceedings ofthe forth Internatinal Symposium on Geneticsof Industrial Microorganisms，Kyoto，Japan，PP125130，1982；M.young，J.Gen.Microbiol.130，1613-1621，1984；L.Janniere et al.，Gene，40，47-55，1985；M.G.Sargent and M.F.Bennett，J.Bacteriol.，161，589-595，1985；N.I.Gutterson and D.E.Koshland，Proc，Natl.Acad.Sci.USA；80，4894-4898，1983；K.Hashiguchi et al.，Agric.Biol.Ghem.，49，545-550，1985；C.R.Wilson and A.E.Morgan，J.Bacteriol.，163，445-453，1985；法国专利申请84.06701号和欧洲专利申请0134048号)。
在上述例子中，经染色体整合的DNA的放大都是串联排列的。所谓串联排列是指染色体放大的基因的两个相邻拷贝具有同样定向，并且仅仅被如同载体DNA序列这样的非必要DNA序列所分隔。一般对于染色体放大来说，可放大的单位是在染色体中产生的，它是由一个串联重复的、被将要放大的序列分隔的DNA序列组成。后一序列亦可以是其串联重复序列的一部分。再者，为提供选择放大的可能性，可放大单位大多含有赋予抗生素抗性的基因。据报导，染色体放大之序列的这种状态是不稳定的，不过也有人发现，在某些情况下却有相当好的稳定性(L.Jamniere et al.，Gene，40，47-55，1985)。
因为已放大序列的丢失(例如因DNA复制期间的不均等交迭或因分子内同源重组所引起的丢失)，所以串联放大之基因的不稳定性是可以预料到的，这样便导致基因组织与更大的放大状态相比，其相等于或更有利于重组的宿主。
本领域内的熟练技术人员会理解到，还可使其他方法将DNA序列整合到染色体中，如双股交互重组(double reciprocalrecombination)——该方法并不能导致DNA序列的串联重复，以及通过非寻常重组进行整合，例如使用某种质粒如质粒PE194(Hofemeister，出处同上)的温度敏感性复制原点。
已知在真核以及原核微生物体内可自然发生遗传信息的染色体放大。据报导，原核细胞中可产生自发放大，并可对其进行选择(参见R.P.Anderson and J.R.Roth，Ann.Rev.Microbiol.31，473-505，1977)。
可因在被放大的序列之间存在其他必要基因，而确保放大之原核基因的稳定性。例如，出现于枯草杆菌染色体中的核糖体RNA基因组的9至10个拷贝中，发现有两个串联定位的基因组被一串tRNA基因所隔开(E.F.Wawrousek and J.M.Handemly，J.Biol.Chem.，258，291-298，1983)。在其他情况下，发现大肠杆菌和枯草杆菌中，串联重复的核糖体RNA操纵子被删除，而没有严重影响到表型性质(分别见M.Ellwood and M.Momura，J.Bacteriol.，143，1077-1080，1980和K.Longhneyel al.，J.Bacteriol.，154，529-532，1983所述)。
芽孢杆菌已被广泛地用于生产工业上重要的酶类，如α淀粉酶、中性蛋白酶和碱性蛋白酶或丝氨酸蛋白酶(参见Debabov，“TheIndustrial Use of Bacilli”，in：The MolecularBiology of Bacilli，Acad.Press，New York，1982)。
枯草杆菌蛋白酶为细菌丝氨酸蛋白酶，其一般作用是裂解蛋白质或肽类的内部肽键。这些酶可由许多原核生物体得到，例如由革兰氏阴性菌(如沙雷氏菌或假单孢菌)及革兰氏阳性菌(如细球菌和芽孢杆菌)制得。
有价值的工业枯草杆菌蛋白酶是用各种芽孢杆菌如枯草杆菌、地衣形芽孢杆菌、淀粉液化杆菌、嗜碱芽孢杆菌以及其他种芽孢杆菌生产的(见美国专利3674643、3723250及4480043号)。一种称为“高碱性蛋白水解酶”的重要的枯草杆菌蛋白酶是用工业芽孢杆菌新种PB92菌株生产的，该菌株已在美国专利再版号30602中公开。
高碱性蛋白水解酶是一类在碱性介质中具有高度活性的丝氨酸蛋白酶或枯草杆菌蛋白酶。更具体地说，高碱性蛋白酶在PH大于9时具有最佳活性，在PH约为11或更高时至少可保留80％的最佳活性。高碱性蛋白酶通常是由能在碱性PH条件下生长的某些芽孢杆菌菌株产生的(如美国专利3723250、4480037号及美国专利再版号30602中所述)。这些产生高碱性蛋白酶的芽孢杆菌在分类学上尚无明确的分类，本说明书中将其称为嗜碱芽孢杆菌菌株。
可利用传统的遗传学技术如突变和继后的选择，以及近代分子生物学技术来改善芽孢杆菌酶的生产过程。本发明属于后一种可能性的具体实例。
使用分子生物学序列改善酶生产的方法大都涉及克隆编码所说酶的基因。已经成功地克隆出芽孢杆菌胞外酶的几种基因，如淀粉液化芽孢杆菌的α淀粉酶基因(Palva et al.，Gene，15，43-51，1981)；地衣形芽孢杆菌(Ortlepp， Gene，23，267，1983)、嗜热脂肪芽孢杆菌(Mielenz et al.，Proc.Natl.Acad.Sci，USA，80，5975-5979，1983；欧洲专利申请-0057976号)和枯草杆菌(Yang et al.，NucleicAcids Res.，11，237，1983)的α淀粉酶基因；枯草杆菌的果聚糖蔗糖酶基因(Gay et al.J.Bacteriol.153，1424，1983)；嗜热脂肪芽孢杆菌(Fuji et al.，J.Bacteriol.，156，831，1983)、淀粉液化芽孢杆菌(Honjo et al.，J.Biotech.1，165，1984)和枯草杆菌(Yang et al.，J.Bacteriol.160，115，1984)的中性蛋白酶编码基因；枯草杆菌(Wong et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，81，1184，1984)、地衣形芽孢杆菌(Jacobs et al.，NucleicAcids Res.13，8913，1985)和淀粉液化芽孢杆菌(Wellset al.，Nucleic Acids Res.，11，7911，1983)的丝氨酸或碱性蛋白酶编码基因。
这些胞外蛋白质的基因编码位于加工后成熟酶之氨基末端氨基酸前面的信号肽，这些信号肽则与分泌机制有关。据报导，来源于地衣形芽孢杆菌、淀粉液化芽孢杆菌和枯草杆菌的蛋白酶在成熟蛋白酶之氨基末端的前面有一特别长的氨基酸序列。这表明存在有常见于真核蛋白酶的早前期结构。进而可使用上述已克隆的基因在实验室规模在枯草杆菌中产生由几个不同种芽孢杆菌之基因编码的这些酶。因对枯草杆菌的性质研究较为清楚，易于获得突变体，而且遗传学上易受反应潜能细胞之转化作用的影响，所以常被用作这一规模上的宿主微生物。
在工业发酵中，通常使用更为强壮和稳定的菌株。但由于这些工业菌株的抗遗传修变性质及原养型特点，所以不易于饥饿并常常显示出抗转化性。
有人提出不采用传统的涉及反应潜能细胞的转化操作而将DNA引入芽孢杆菌内的技术。已报导了几种革兰氏阳性微生物的原生质体转化作用。Chang和Cohen(Mol.Gen.Genet.168，111-115，1979)介绍了枯草杆菌的原生质体转化方案并已被广泛采用。也已描述了有关巨大芽孢杆菌(B.megaterium)原生质体(Vorobjeva et al.，FEMS Microbiol.Letter.1，261-263，1980)、淀粉液化芽孢杆菌原生质体(Smith et al.，Appl.and Env.Microbiol.51，634，1986)、苏云金芽孢杆菌(B.thuringensis)原生质体(Fisher et al.，Arch.Microbiol.139.213-217，1981)、园形芽孢杆菌(B.Sphaericus)原生质体(McDonald，J.Gen.Microbiol.130，203，1984)和幼虫芽孢杆菌(B.larvae)原生质体(Bakhiet et al.，Appl.and Env.Microbiol.49，577，1985)成功地进行转化的类似操作方案；但在同一出版物中也提到使用日本甲虫芽孢杆菌(B.popilae)没有获得成功的结果。该方案对于多粘芽孢杆菌(B.polymyxa)、地衣形芽孢杆菌、软化芽孢杆菌(B.macerans)和侧孢芽孢杆菌(B.laterosporus)来说是成功的，但对于凝结芽孢杆菌(B.coagulans)、蜡样芽孢杆菌(B.cereus)和短小芽孢杆菌(B.pumilus)却不是这样，不过也已观察到良好的原生质体生成(Mann et al.，currentMicrobiol.13，131-135，1986)。
除了聚乙二醇诱导的原生质体转化以外，还发展了将DNA引入原生质体中的其他一些方法，例如与包含DNA的脂质体融合(Holubova，Folia Microbiol.30，97，1985)，或使用易于转化的微生物作为中间宿主细胞进行原生质体融合(EPA-0134048)。
进行微生物原生质体转化时，无论使用裸核DNA、或借助用于通过融合作用将DNA转移到最终宿主菌株内的易于转化之宿主菌株的原生质体，或是使用包装有DNA的脂质体，其关键的要素均在于(1)原生质体的形成；(2)找到维持原生质体稳定的条件；以及(3)使所得之已转化的原生质体能够再生形成活细胞的发育条件。
通过放大编码这种酶的基因，改进用现有工业芽孢杆菌生产高碱性蛋白酶的方法，最好包括用作为这一基因之来源的杆菌菌株作重组体宿主菌株，其理由是：——所说的菌株具有有效合成并分泌该蛋白酶的天然能力，——该蛋白酶基因的原始调节序列将在这一宿主菌株中有效地发挥功
能，——存在于原始菌株和重组菌株所产生的胞外酶中的非蛋白酶付组分
是完全相同的，因为不存在新的、具有潜在变应原的蛋白质成分，
故可允许将这些酶应用于洗涤剂中得到简单地认可。
迄今尚未见报导过嗜碱杆菌的转化作用。根据我们自己的经验，传统的操作方法是无效的。因此没有关于在这些芽孢杆菌中进行质粒载体的自发复制、维持这些载体的稳定性或其染色体整合等方面的现成资料。
本发明提供了包含两个或多个稳定地保留于其染色体中的DNA序列之拷贝的转化的原核宿主菌株，所说的DNA序列包括一个编码有用多肽的基因，其中所说的拷贝是被内源性染色体DNA序列分隔开的。
在本发明的一个优选实施方案中，所说的转化的宿主菌株是芽孢杆菌菌株，特别是嗜碱芽孢杆菌菌株或地衣形芽孢杆菌菌株，最好是芽孢杆菌新种PB92或地衣形芽孢杆菌菌株T5，或它们各自的衍生菌株。
根据本发明的一个方面，所说的序列编码一种酶，较好是一种蛋白水解酶，最好是丝氨酸蛋白酶。
在本发明的另一优选实施方案中，所说的原核宿主菌株，特别是芽孢杆菌PB92或地衣形芽孢杆菌菌株是用一来源于相应菌株的DNA序列转化了的。
本发明进一步提供了一种生产原核微生物的方法，在培养这些微生物期间可使编码功能性基因产物的同源或异源性DNA序列以一种放大了的状态保留在其中。该方法是通过构建含这一DNA序列的宿主细胞染色体来完成的，其中所说的DNA序列是以一种使这些序列被基本的和独特的内源性染色体序列所分隔的方式被整合的。通过同源重组过程丢失已放大的序列对宿主细胞将是致命性的，这样在培养期间就造成对携带放大之序列的宿主细胞的积极选择。
根据本发明的优选实施方案，该方法包括转化一原核宿主菌株，而该菌株于转化之前即通过表达存在于所说宿主菌株之染色体中的编码所说多肽的基因而产生有用的多肽，其包括将包含编码所说多肽之基因的DNA序列的一个或多个拷贝引入所说的原核宿主菌株内，并选择其中所说的DNA序列已被引入染色体中并且其中所说DNA序列的其他拷贝被内源性染色体DNA序列所分隔的所说原核宿主菌株的转化细胞。
根据本发明，编码有用多肽的DNA序列通过同源重组机制或通过非寻常重组机制被整合到原核宿主菌株的染色体内。本发明的再一个方面包括使用含有温度敏感性复制原点的载体，以有利于选择具有一个以上编码有用多肽之DNA序列拷贝(作为其染色体的整合部分)的转化了的宿主菌株细胞。
完成所说方法的优选宿主菌株是芽孢杆菌菌株，特别是嗜碱芽孢杆菌菌株，最好是芽孢杆菌PB92和地衣形芽孢杆菌菌株。
用于转化生产丝氨酸蛋白酶之芽孢杆菌菌株的优选DNA序列是编码基本上具有下列一级结构之丝氨酸蛋白酶的DNA序列：H2N-AlaGlaSerValProTrpGlyIleSerArgValGlnAlaProAlaAlaHisAsnArgGlyLeuThrGlySerGlyValLysValAlaValLeuAspThrGlyIleSerThrHisProAspLeuAsnIleArgGlyGlyAlaThrPheValProGlyGluProSerThrGlnAspGlyAsnGlyHisGlyThrHisValAlaGlyThrIleAlaAlaLeuAsnAsnSerIleGlyValLeuGlyValAlaProAsnAlaGluLeuTyrAlaValLysValLeuGlyAlaSerGlySerGlySerValSerSerIleAlaGlnGlyLeuGluTrpAlaGlyAsnAsnGlyMetHisValAlSernLeuSerLeuGlySerProSerProSerAlaThrLeuGluGlnAlaValAsnSerAlaThrSerArgGlyValLeuValValAlaAlaSerGlyAsnSerGlyAlaGlySerIleSerTyrProAlaArgTyrAlaAsnAlaMetAlaValGlyAlaThrAspGlnAsnAsnAsnArgAlaSerPheSerGlnTyrGlyAlaGlyLeuAspIleValAlaProGlyValAsnValGlnSerAsnTyrProGlySerThrTyrAlaSerLeuAsnGlyThrSerMetAlaThrProHisValAlaGlyAlaAlaAlaLeuValLysGlnLysAsnProSerTrpSerAsnValGluIleArgAsnHisLeuLysAsnThrAlaThrSerLeuGlySerThrAsnLeuTyrGlySerGlyLeuValAsnAlaGluAlnAlaThrArg-COOH.
根据本发明的另一方面，所说的DNA序列依靠克隆和表达载体被引入宿主菌株内。用于本发明这一目的的适当载体包含：(a)一个细菌质粒的复制原点；(b)一个细菌启动子，并处于所说启动子的控制之下；(c)所说的DNA序列；及(d)一个选择标志基因。
完成本发明之方法的优选质粒包括得自质粒PUB110的质粒DNA和/或得到具有温度敏感性复制原点之质粒(如质粒PE194)的质粒DNA。
根据本发明的另一实施方案，使用了一种增加原核宿主菌株内产生有用多肽的方法，该宿主菌株已通过表达存在于所说宿主菌株之染色体内的、编码所说多肽的基因产生所说的多肽，所说的方法包括：
(a)将包含一编码所说多肽之基因的DNA序列引入所说的宿主菌株内；
(b)选择所说宿主菌株的转化细胞，其中所说的DNA序列被整合到了染色体中并由内源性染色体DNA序列将其与所说DNA序列的其他拷贝分隔开；
(c)在适当的培养基中培养所说的已转化的宿主菌株；以及
(d)分离培养基中由所说已转化宿主菌株产生的蛋白酶。
对附图的简要说明：
图9A-D图解说明了染色体外DNA序列整合到原核微生物之染色体内的4种方式。
T是靶序列，即存在于染色体和质粒上的DNA序列，它们之间可以发生同源重组。
S代表将被整合到染色体中的DNA序列。
M代表用于选择重组菌株的标志基因序列。
图10A和B图解显示了在原核细胞染色体中获得基因放大的两种方式。
图1显示分别对含有PUB110和PM58的枯草杆菌DB104培养物的上清液所作组氨酸/MOPS凝胶电泳的结果，同时与几种枯草杆菌蛋白酶的电泳结果进行比较。
泳道1：Carlsberg芽孢杆菌蛋白酶
泳道2：芽孢杆菌PB92蛋白酶
泳道3：枯草杆菌枯草杆菌蛋白酶
泳道4：枯草杆菌DB104(PM58)
泳道5：枯草杆菌DB104(PUB110)
图2显示质粒PM58的限制图谱。此外，在图的上部分显示了测定序列的战略。带箭头的实线代表在噬菌体M13载体mp10、mp11和mp18中克隆的片段。图的下部分显示了使用定位于蛋白酶基因上规则距离处的10个寡核苷酸测定序列的战略。
图3显示与芽孢杆菌PB92丝氨酸蛋白酶的氨基酸序列相关之编码链的核苷酸序列。还显示了DNA序列的启动子(P1、P2)、核糖体结合位点(rbs)及终止区(term)。编号的实线代表用于序列测定的10个寡核苷酸的定位。
图4A显示质粒PE194-neo的构建。
图4B显示质粒PMAX-4的构建。
图5A：用HindIII制备菌株PB92、PBT109和PBT108之染色体DNA的消化产物，在0.5％琼脂糖凝胶上作电泳分离，然而按Southern所述方法转移到硝酸纤维素膜上并与32P标记的、缺口转译的PM58DNA杂交。本图显示了所得放射自显影图谱。
图5B和5C说明PMAX-4和芽孢杆菌PB92染色体之间发生同源重组(B)和非寻常重组(C)情况下的整合过程。
图6显示整合载体PElatB的构建。
图7A说明质粒PElatB整合到地衣形芽孢杆菌菌株T9的染色体中，得到地衣形芽孢杆菌菌株TB13。
图7B说明通过菌株间的原生质体融合发生的地衣形芽孢杆菌菌株TB13和T5的染色体重组，结果得到地衣形芽孢杆菌菌株T13F。
图8显示按实施例12所述方法发酵菌株T13F分离到的9个不同克隆的染色体分析结果。用EcoRI消化分离的染色体DNA，分别加到0.8％琼脂糖凝胶上电泳分离并印迹转移到硝酸纤维素滤膜上。使印迹与32P标记之缺口转译的PElatBDNA杂交。图中显示所得放射自显影图谱。上面的箭头指出长约15Kb之EcoRI DNA片段泳动的位置，该片段含有完整的PElatB序列，如图7A中所示的菌株TB13的情况一样，它在并不相邻于原始α淀粉酶基因的位置上被整合到染色体中。下面的箭头指出长约33Kb之EcoRI DNA片段泳动的位置，该片段含有原存在于地衣形芽孢杆菌菌株T5中的完整的α淀粉酶基因(参见图7B)。
分析的DNA样品如下：
泳道1：地衣形芽孢杆菌T5DNA
泳道2：地衣形芽孢杆菌TB13DNA
泳道3：地衣形芽孢杆菌T390DNA
泳道4：得自地衣形芽孢杆菌T390之新霉素敏感性衍生菌株
       的DNA；上述菌株是按实施例12所述方法发酵后分离的。
泳道5：地衣形芽孢杆菌T13FDNA
泳道6-14：按实施例12所述方法发酵菌株T13F后分离
       之9个不同菌株的DNA。
一般说来，有两种方式通过同源重组使DNA序列以一步骤***染色体的特定位置上。这两种方式即Campbell型同源重组和双交互重组(double reciprocal recombination)，已在图1A和B中作了图解说明。
示意图1c显示了使用两步骤置换机制，将DNA序列引入染色体的第三种方式，其中原理上是利用了Campbell型重组，但它导致这样一种染色体排列：即不含有重复的序列，并因而在染色体的重组部分中没有可放大的单位。就这一点来说，它类似于双交互重组。
除了利用同源重组将外来DNA整合到染色体中以外，还有可能通过非寻常重组整合DNA。例如，当使用芽孢杆菌菌株作为宿主微生物并使用质粒PE194作载体时，可以在抑制未整合的载体分子自发复制的条件下选择已整合的载体分子。图1D中图解说明了使用非寻常重组方式进行的整合。
在所得染色体序列排布中没有串联重复，从而使得示意图1B、C和D中所示的途径成为将DNA序列稳定地引入基因组内的优选途径。本技术领域内的普通技术人员将会理解到，携带功能性基因之已整合序列的重复或进一步放大对获得这些基因的高水平表达是必要的。
迄今为止，在原核生物体内只得到了串联排列的染色体基因放大，为此必须有一个串联重复的DNA序列(放大单位)。已发现常常会发生回复现象，即通过缺失而失去已放大的状态。
本发明确保了已整合序列的更稳定的放大。图10中显示了这一新方法的原理。根据本发明，提供了能够通过两种方式将DNA序列的两个或多个拷贝引入原核生物染色体中的方法；(1)被引入的DNA序列侧接有串联重复的序列；(2)被整合的DNA序列被内源性染色体序列所分隔。因为后一种序列对于宿主细胞的生存是攸关重要的，所以通过重组丢失已放大的序列将造成致死性刺激。这就是说，在培养携带已按着本发明方法放大了的DNA序列的微生物期间，将对携带该已放大之序列的细胞产生一种选择压力，而不必加入抗生素或其类似物。
根据本发明的一个方面，图2A图解说明了如何将非寻常重组过程用于稳定的染色体基因放大。
根据本发明的另一个方面，图2B显示了使用同源重组方法进行稳定的染色体基因放大的两种途径。
在所用的载体分子中可能存在几个DNA序列伸延部分(这些部分是与宿主细胞染色体同源的)，特别是在将要放大的基因的一个或多个拷贝已经被引入的情况下。因此，必须特别注意的是，只有预期的重组染色排列才能被选择。这一点可使用线性DNA分子进行重组来达到(如图1B所示)。
图9C中说明了在选择的靶序列上进行重组的优越方法：用限制性内切酶在与这一靶序列同源的区域中切断将被整合的环形载体分子。这样，重组和整合便优先发生于这一特定位点。当按照图9D和10A所示的方式使用非寻常重组途径进行染色体基因放大时，应选用这样的整合和选择条件，即同源重组方式没有超越非寻常重组方式而占优势。
当采用同源重组时，用于非串联基因放大的靶序列将优先从非必需基因中选择，例如在用芽孢杆菌作宿主的情况下，可用编码胞外酶的基因或参予孢子形成的基因作靶序列。DNA序列整合到这些基因中一般将使基因失活。然后可以监测基因之表达的丧失并用于选择所需的重组菌株。
根据本发明的一个特定实施方案，所用重组体宿主细胞是嗜碱型的芽孢杆菌菌株和地衣形芽孢杆菌菌株，它们分别稳定地保留作为它们的染色体之整合部分的、编码高碱性蛋白酶或α淀粉酶之基因的一个以上的拷贝。通过用适当的载体转化所说的宿主细胞并将所说的载体整合到染色体内，而使附加的基因拷贝(一个或多个)引入其中。
本说明书中使用的术语“适当的载体”是指这样一种DNA构建物，即其包含：——使宿主菌株对某抗生素(宿主菌株对其有敏感性)产生抗性的基
因。当用于载体的染色体整合时，该标志基因必须满足这样的要求：
即如果宿主菌株内只有一个或很少几个标志基因的拷贝时，仍可
以进行存活性的选择；——一个能够自发复制的复制原点；——一个编码所需蛋白质或多肽、特别是编码一种酶的结构基因。所
说的结构基因最好编码选自一组包括高碱性蛋白酶(来源于嗜碱
芽孢杆菌)和α淀粉酶(来源于地衣形芽孢杆菌)的酶，并且具有分
别在嗜碱芽孢杆菌及地衣形芽孢杆菌中有功能活性的所说基因的
控制区，如启动子序列、形成核糖体结合位点的序列及控制所说
基因之转录和翻译终止的序列。
对于芽孢杆菌新种PB92和地衣形芽孢杆菌菌株T9来说，发现适于使用得自质粒PUB110、赋予抗新霉素抗性的基因。
根据本发明的一个方面，已令人惊奇地发现，使用具有突变之复制原点的质粒，可使质粒在枯草杆菌中功能上表现为温度敏感性的，并可借以提高对染色体整合的选择(见Ehrlich对质粒PE194的描述，Proc.Natl.Acad.Sci.USA75，1433，1978)，亦可在嗜碱芽孢杆菌菌株和地衣形芽孢杆菌菌株中完成对在其染色体中具有载体整合的分离物菌株的选择。
本技术领域内的普通技术人员将会认识到，作为适当载体之一部分的高碱性蛋白酶的表达可受到其原始调节序列的控制，后者作为内源性序列将会在嗜碱芽孢杆菌或地衣形芽孢杆菌宿主菌株内很好地发挥功能作用。当然，亦可使用其他来自芽孢杆菌或其他微生物的控制区，条件是这些控制区应能在选择的芽孢杆菌宿主菌株中发挥功能活性。
可用本领域内已知方法制得形成适当载体之一部分的蛋白酶或淀粉酶基因。一般说来，该方法包括分别由表达高碱性蛋白酶或热稳定性α淀粉酶的生物体制备基因组文库。提供蛋白酶基因的优选菌株是芽孢杆菌新种PB92(参见上文)。提供α淀粉酶基因的优选菌株是地衣形芽孢杆菌菌株T5，它是按照欧洲专利申请EPA-0134048号中所述的方法分离的。基因组文库是用常规方法制备的，例如将所说菌株的DNA片段连接到可在枯草杆菌中发挥功能活性的复制原点及赋予芽孢杆菌以抗新霉素抗性之基因的载体PUB110中，并用该连接混合物转化枯草杆菌的反应潜能细胞。
使用质粒PUB110时，可在含有酪蛋白的基本琼脂平皿上分析，因其产生一个酪蛋白沉淀环(晕圈)，从而分离出可过量产生蛋白酶的抗新霉素菌落，其中来自芽孢杆菌新种PB92的DNA被加到连接混合物中。分离由所说菌落得到的重组质粒(称为PM58)，经限制性酶切分析对其定性并进行序列测定(见实施例3)。与已公开发表的枯草杆菌、地衣形芽孢杆菌及淀粉液化芽孢杆菌之芽孢杆菌蛋白酶的DNA序列相一致，发现在芽孢杆菌新种PB92之成熟高碱性蛋白酶(269个氨基酸)N末端氨基酸的前面有一信号肽和肽原(Propeptide)。信号肽长度为27个氨基酸，肽原长84个氨基酸。与已公布的枯草杆菌蛋白酶蛋白质序列有低同源性(60％)、较之已公布的枯草杆菌蛋白酶(总正电荷数为+5)所带正电荷数高(+10)、并且缺失了成熟蛋白质的6个氨基酸，这些均表明本发明的枯草杆菌蛋白酶是新的。
本领域内的普通技术人员可以理解到，可由其他嗜碱芽孢杆菌制得基本上同样的丝氨酸蛋白酶。这些可表达与芽孢杆菌PB92的氨基酸序列至少有70％、最好有大约80％同源性之蛋白质的蛋白酶基因亦应视为属于本发明范围内的。
起始密码子前面的启动子区域由一个含有核糖体结合位点的独特的DNA序列及一个能在芽孢杆菌新种PB92中被有效识别的启动子区组成。通过在有利于酶合成的条件下、通常是在保留质粒的选择压力(如由抗生素——新霉素所提供的选择压力)下，培养包含质粒PM58的枯草杆菌，以确定高碱性蛋白酶的表达。由于在这些条件下进行培养，从而导致培养基中蛋白酶水平的显著增加，并且足够用于对这些蛋白酶进行定性分析。除了在应用条件下有同样性能(洗衣清洁作用)外，通过SDS聚丙烯酰胺凝胶及组氨酸-MOPS凝胶电泳测定分子量(参见实施例2)、并基于合成底物琥珀酰-L-丙氨酰-L-丙氨酰-L-脯氨酰-L-苯丙氨酰-对位硝基苯胺分析以检测动力学参数Km和Vmax，对所产生的蛋白酶进行生物化学定性，结果表明克隆的蛋白酶与芽孢杆菌PB92的高碱性蛋白酶是完全相同的。
确定了质粒PM58包含编码芽孢杆菌菌株PB92之丝氨酸蛋白酶的整个基因后，即可以将形成该基因的DNA序列转移到其他适当载体内。载体PE194-neo是由其中***了来自质粒PUB110的抗新霉素抗性基因的质粒PE194(见实施例4)的完整序列构成的。据报导，质粒PE194含有一个在枯草杆菌内表现有温度敏感性功能活性的复制原点(J.Hofemeister et al.，Mol.Gen.Genet.189，58-68，1985)。
在本发明的一个优选实施方案中，将芽孢杆菌PB92的丝氨酸蛋白酶基因***到质粒PE194-neo中，并用所得到的质粒(称为PMAX-4)将其引入不同的芽孢杆菌菌株内。
在另一优选实施方案中，将地衣形芽孢杆菌菌株T5的α淀粉酶基因***质粒PE194-neo中，并用所得质粒(称为PElatB)将其引入不同的芽孢杆菌菌株内。
在本发明的一个特定实施方案中，用于引入编码嗜碱芽孢杆菌丝氨酸蛋白酶基因的宿主菌株是一种工业菌株。发酵罐中所用的菌株是很强壮而且稳定的。所说的菌株能对抗噬菌体的感染，另外还对使用常规转化方法引入DNA所造成的基因交换有抗性。常用的工业菌株是原养型的，所以避免了在培养基中另外添加昂贵的氨基酸。工业菌株的其他特性是，它们在发酵终止前一直保有高度生产能力(可长达一周)、在消耗培养液的情况下保有稳定的细胞浓度及高度的生产能力(一般特定的分泌蛋白浓度至少达0.5％W/V)。本发明的分泌蛋白主要是丝氨酸蛋白酶或α淀粉酶，特别分别是高碱性蛋白水解酶或耐热的α淀粉酶。
嗜碱芽孢杆菌菌株如芽孢杆菌PB92和地衣形芽孢杆菌菌株T5或其衍生菌株等工业菌株的转化作用，最好包括使用得自所说菌株的原生质体。很显然，Cohen等人所描述的常规原生质体转化方法并不适用于芽孢杆菌菌株PB92和地衣形芽孢杆菌T5及其衍生菌株。欧洲专利申请EPA-0134048号中已描述了通过地衣形芽孢杆菌菌株T5的原生质体融合进行基因转化的方法。
根据本发明的一个方面，特别令人惊奇地发现，芽孢杆菌菌株PB92之原生质体的形成和再生有利于在高PH、最好在PH8.0左右发生。这一点是令人惊奇的，因为芽孢杆菌菌株在中性PH下也具有很高的生长速率。因此，本发明需要使用适于原生质体形成的其他新方法及再生平皿。为了进行选择，发现适于在再生平皿中使用相对高浓度的抗生素。例如，当用PMAX-4转化芽孢杆菌PB92时，可用浓度高达1000μg/ml的新霉素来反选择未转化的细胞，而来自所说再生平皿的复制培养的转化体在正常富琼脂平皿(如心脏浸液琼脂平皿)上则产生了低的新霉素(1μg/ml)抗性。
根据本发明的另一个方面，发现使用PMAX-4上的温度敏感性复制原点，有可能选择发生于嗜碱菌株及地衣形芽孢杆菌菌株中的染色体整合。另外还发现，通过依据所用选择条件而定的同源重组或非寻常重组，有可能分别实现PMAX-4和PElatB在嗜碱芽孢杆菌菌株及地衣形芽孢杆菌菌株之染色体中的整合。同时发现这些整合过程可产生两个只被PE194-neo质粒序列分隔的串联排列的丝氨酸蛋白酶或α-淀粉酶基因，或者产生两个被内源性染色体序列分隔的丝氨酸蛋白酶或α淀粉酶基因。
本说明书中所用说的“已转化的宿主菌株”是指经过遗传操作的菌株，即借用人的操作处理将某DNA序列引入所说菌株的细胞内。
本说明书中所描述的开发携带放大基因之稳定菌株的发明思想是普遍适用的。实施例1-7中，通过芽孢杆菌新种PB92的碱性丝氨酸蛋白酶基因显示了经放大的原核生物基因当在这些放大之序列之间存在其他基本基因情况下的稳定性。实施例8-12中，则通过地衣形芽孢杆菌菌株T5的α淀粉酶基因证实了同一事实。
如实施例7中所示，嗜碱芽孢杆菌中多个丝氨酸蛋白酶基因拷贝的稳定性取决于这些序列的定位。当其存在于嗜碱芽孢杆菌PB92中自发复制的质粒PMAX-4上时，要在10升使用生产培养基的培养物中确保稳定地保留PMAX-4，则只有向培养基内添加新霉素。
比较两种在其染色体中包含质粒PMAX-4的嗜碱芽孢杆菌菌株，发现当其中两个丝氨酸蛋白酶拷贝并非串联定位时，则这一载体即可稳定地保留于该菌株内。如菌株中所含有的这样两个蛋白酶基因是串联定位时，发现它们实质上是不稳定的，将通过同源重组导致一个蛋白酶基因拷贝的丢失并伴有新霉素抗性基因的丢失。
实施例13中给出了几种基因放大形式中α淀粉酶基因之稳定性的比较实验的结果，从中可以明显看出，在发酵条件下通过分散的放大来确保染色体稳定性是普遍适用的。
以下实施例旨在进一步阐明本发明，而不是限定本发明。
                    实施例1
制备嗜碱芽孢杆菌新种PB92的基因组库并分离其丝氨酸蛋白酶基因
依照Saito-Miuva所述的方法(Biochim.Biophys.Acta 72，619-632，1963)自芽孢杆菌新种PB92(寄存于Laboratorium Voor Microbiologie，TechnicalUniversity of Delft，the Netherlands，寄存号OR-60，见美国专利再股版号30，602)中分离染色体DNA用限制性内切酶Sau3A部分消化并连接到质粒PUB110(Gryczan et al.，J.Bacteriol.134，318-329，1978)的Bam HI位点上。按Birnboim和Doly所述方法(Nucl.Acids Res.7，1513-1523，1979)制备PUB110质粒DNA。
按照Spizizen等人的方法(J.Bacteriol.81，741-746，1961)，每毫升反应潜能细胞用600-1000ng DNA，将连接混合物转化到枯草杆菌1A40(Bacillus GeneticStock Centre)中。将得自转化混合物的细胞铺敷在含有2.8％K2HPO4、1.2％KH2PO4、0.4％(NH4)2SO4、0.2％二水合柠檬酸三钠、0.04％MgSO4·7H2O、5.10-5％MnSO4·4H2O、0.4％L-谷氨酸、0.5％葡萄糖、0.02％酪蛋白氨基酸、50μg/ml色氨酸、20μg/ml蛋氨酸、20μg/ml赖氨酸、20μg/ml新霉素、0.4％酪蛋白和1.5％琼脂的基本培养皿上。于37℃保温过夜后，50,000个新霉素抗性菌落中有一个表现增加了蛋白酶产量，此可由琼脂平皿上菌落周围增加了酪蛋白的沉淀(晕图)判断出来。按照Birnboim和Doly所述的方法(Nucleic Acids Res.7，513，1979)由该菌落中分离质粒DNA并将其定名为PM58。
              实施例2
PB92丝氨酸蛋白酶基因的表达
使含有PM58的枯草杆菌1A40生长于添加了0.02％酪蛋白氨基酸、50μg/ml色氨酸、20μg/ml蛋氨酸、20μg/ml赖氨酸和20μg/ml新霉素的基本培养基中(Spizizen et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA44，1072-1078，1958)。24小时后，离心分离培养物，用二甲基酪蛋白作底物分析上清液的蛋白酶活性(Lin et al.，J.Biol.Chem.244，789-793，1969)。用含有质粒PUB110的枯草杆菌1A40的培养物作为对照，结果表明其蛋白酶活性低于由PM58转化之培养物所示活性的1/60。用1mM苯磺酰氟(PMSF)处理可使蛋白酶活性完全抑制，但用20mMEDTA处理则不会呈现这一抑制效果。
按Laemmli的方法(Nature 227.680，1970)在蛋白质凝胶上分析上述上清液的等分样品。经用5％三氯醋酸(TCA)处理这些上清液，在凝胶上制得用于分析的样品。离心后，用丙酮将沉淀的蛋白质洗两次并经煮沸10分钟使之溶解于40μl样品缓冲液(0.5M Tris/HCI PH7.5，10％V/V2-巯基乙醇，50％V/V甘油和5.10-2％溴酚兰)中。电泳后用考马斯亮兰对凝胶染色。所得电泳图形(其中被分析的培养物上清液得自3个分别含有PUB110、PM58和不含质粒的不同的枯草杆菌1A40菌株，并以芽孢杆菌PB92蛋白酶作为对照)表明，来自含PM58之枯草杆菌菌株1A40的样品含有31KD蛋白质，并且它与枯草杆菌PB92蛋白酶共迁移。在含PUB110之枯草杆菌1A40菌株的对照泳道上则没有检测到这种蛋白质。
因为所有丝氨酸蛋白酶均具有相似的分子量，所以可通过将PM58和PUB110转化到蛋白酶阴性枯草杆菌菌株DB104(R.Doi，J.Bacteriol.160，442-444，1984)中并分析所产生的胞外蛋白酶，而将克隆的芽孢杆菌PB92丝氨酸蛋白酶与已知丝氨酸蛋白酶(枯草杆菌的枯草杆菌蛋白酶、Garlsberg枯草杆菌蛋白酶)明确地鉴别开。使所得转化体生长于含有0.02％酪蛋白氨基酸、50μg/ml组氨酸和20μg/ml新霉素的基本培养基(Spizizen et al.)上。24小时后取样，离心并在没有预处理的情况下在含有75mM KOH、40mM组氨酸、100mM MOPS(3-(N-吗啉代)-丙磺酸)(PH7.5)和5％聚丙烯酰胺的组氨酸/MOPS凝胶上进行电泳分析。电泳缓冲液含有40mM组氨酸、100mM MOPS(PH6.6)。样品沿阴极方向泳动。
用Agfa Pan 100 Professionnel胶片检测蛋白酶泳带(Zuidweg et al.，Biotechnol。and Bioengin.Vol.XIV，685-714，1972)(见图1)。图1表明PM58中包含编码芽孢杆菌PB92蛋白酶的基因。
                  实施例3
芽孢杆菌PB92丝氨酸蛋白酶基因的序列测定
用F.Sanger的方法(Proc.Natl.Acad.Sci。USA74，6463，1977)测定PM58之BalI/HpoI片段的完整序列。在噬菌体M13载体mp10、mp11和mp18(Messing et al.，Nucleic Acids Res.9，309-321，1981)中克隆PM58的限制性片段。通过噬菌斑杂交法筛选PM58的***情况。测定序列后，在基因的规则距离上定位10个寡核苷酸并重复进行序列测定，从而进一步肯定了图3中所示的序列。
                        实施例4
质粒PMAX-4的构建
为了构建质粒PUCN710(图4A)，首先用TagI和PvuII消化PUB110。在低熔点琼脂糖凝胶上纯化含抗新霉素抗性基因的片段并用Klenow聚合酶及MTP1s(Maniatis，Molecular Cloning，A Laboratory Manual.ColdSpring Harbor，1982)将其末端填成平头。用SalI将质粒PUC7(Vieira et al.，Gene 19，259-268，1982)切成线形并按上述方法填成平头。用T4连接酶连接上述两个片段(Maniatis)并转化到JM103中。在含有50μg/ml氨苄青霉素和10μg/ml新霉素的2xTY平皿(1.6％W/VBacto-trypton、1％W/V酵母提取物、0.5％Nacl)上进行选择。用BamHI消化所得质粒(定名为pUCN710)；用BclI消化质粒pE194(Jordanescu，Plasmid1，468-479，1978)。用4T连接酶连接两次消化所得片段并转化到枯草杆菌1A40中。在含有20μg/ml新霉素的基本平皿上选择(见实施例1)。所得质粒pE194-neo(图4A)包含新霉素抗性基因及温度敏感性复制原点。
按下述方法在整合载体pE194-neo中完成蛋白酶基因的再克隆：用HPaI、BalI和BglII消化PM58(见实施例1)。用HpaI消化质粒pH194-neo。用T4连接酶连接这些片段并转化到枯草杆菌1A40中。基于新霉素抗性选择转化体并根据酪蛋白沉淀(晕圈形成，见实施例1)来判断蛋白酶产量的增加。以这种方法得到质粒pMAX-4，经限制性酶切分析进一步证实其结构(见图4B)。
               实施例5
用pMAX-4进行芽孢杆菌菌株pB92的原生质体转化
芽孢杆菌新种pB92在100ml NBSG-X培养基(Thorne et al.，J.Bacteriol.91，1012-1020，1966)中生长过夜。在Sorvall型GSA转子中以4,500rpm将培养物离心10分钟。细胞重新悬浮于含0.5M蔗糖、0.02MMgCl2和0.02M Tris/马来酸盐(PH8.0)(在无菌水中配制)的10ml Alkalic Holding培养基(AHM)中后，在0.4mg/ml溶菌酶存在下于37℃保温1小时，使细胞原生质体化。离心(4,500rpm，10分钟)后将原生质体再悬浮于5ml AHM+(PH8.0)缓冲液(加有3.5％W/VBacto Penassay培养液和0.04％W/V AlbumineMerieux的AHM缓冲液)中，混合并再次离心得到沉淀饼。重新悬浮后，将0.5ml原生质体与1μg质粒DNA混合并在30％W/V聚乙二醇8,000(PH8.0)存在下保温2分钟。用AHM+(PH8.0)培养基作1∶3稀释并离心后，将沉淀饼再悬浮于小体积(1ml)AHM+中并保温2-3小时。然后将100μl等分样品铺敷在新发展的、含0.5M琥珀酸钠/HCl(PH8.0)、1.5％W/V琼脂、0.5％W/V酪蛋白氨基酸、0.5％W/V酵母提取物、0.031M磷酸盐缓冲液(PH8.0)、0.5％W/V葡萄糖、0.02M MgCl2和0.02％W/V AlbumineMerieux的再生平皿上。此外，在使用pMAX-4的情况下，这些平皿还含有相关的抗生素——1000μg/ml新霉素。于37℃至少保温72小时后，在含有20μg/ml新霉素的心脏浸液琼脂平皿上复制培养这些菌落。
                 实施例6
pMAX-4在芽孢杆菌菌株pB92染色体中的整合
将已经确定含有质粒pMAX-4之芽孢杆菌菌株pB92的转化体接种在含有1μg/ml或20μg/ml新霉素的胰酶解胨-大豆培养液(Tryptone Soya Broth，TSB)中并于37℃保温24小时。在分别含有1μg/ml或20μg/ml新霉素的100ml同种培养基中稀释2ml细胞悬液并于50℃保温24小时。24小时后，再按上述方法稀释5ml细胞悬液，并分别在1μg/ml或20μg/ml新霉素存在下于50℃保温24小时。再次重复后一操作。将细胞悬液稀释100倍并铺敷于含有1μg/ml新霉素(用于取自含1μg/ml新霉素之***样品)和含有20μg/ml新霉素(用于取自含20μg/ml新霉素之***样品)的心脏浸液(HI)琼脂平皿上。之后将平皿置于50℃下保温16小时。分离新霉素抗性菌落并于37℃在含有1μg/ml新霉素的10ml TSB培养基中培养16小时。分离这些培养物的总DNA(Holmes et al.，Anal.Biochem.114，193-197，1981)并经在琼脂糖凝胶上作DNA电泳分析检知没有质粒存在。将总DNA转化到枯草杆菌1A40中以再次检查没有可见质粒的样品。将缺乏转化枯草杆菌1A40之能力的样品看作是质粒-的。
为了检验pMAX-4是否并以何种方式整合到染色体内，分离染色体DNA并用HindIII消化，在0.5％DNA琼脂糖凝胶上跑电泳并印迹转移到硝酸纤维素滤膜上(Southern，J.Mol.Biol.98，503-517，1975)，然后与32P标记的缺口转译的PM58杂交(Maniatis，1982)。图5A中显示了这一分析的结果。
在含1μg/ml新霉素的平皿上选择，则作为同源重组(Campbell型机制)的结果，在染色体中产生了被质粒序列分隔的串联定位的蛋白酶基因(菌株PBT109)。对30个各自分离的整合体(integrants)集群于含1μg/ml新霉素条件下进行选择。分离到一个含有在染色体中呈随机定位(作为非寻常重组的结果)之质粒pMAX-4的整合体(菌株PBT122)。经染色体分析，结果表明在PBT122和PBT108中整合作用可发生于染色体的不同位置上。
在含20μg/ml新霉素的平皿上选择，作为非寻常型重组的结果，产生了一个在染色体中呈随机定位的质粒pMAX-4的拷贝。后一菌株称为PBT108。图5B和5C中分别显示了菌株PBT109和108的基因组织。
               实施例7
重复的蛋白酶基因在菌株PBT108和PBT109中的稳定性
在含有100ml无新霉素生产培养基(见美国专利No.Re.30，602)的500ml振荡瓶中对菌株进行试验，其中接种0.2ml菌株的过夜TSB培养物(37℃)。在恒定通气下，于37℃保温44小时后，检测培养物形成的新霉素抗性菌落和蛋白酶活性。
亦在含有生产培养基(见上述参考文献)的Eschweiler发酵罐中对菌株PBT108和PBT109进行试验，以检测生产体积增至10升时的影响。下列表1中总结了发酵实验的结果。
                       表1
    菌株 蛋白酶相对产量* 发酵后新霉素抗性细胞的百分数
对照(PB92)PBT108PBT109     100％120％115-120％     -100％75-97％
*按Lin等所述方法(J.Biol.Chem.244，789-793，1969)用二甲基酪蛋白作底物检测蛋白酶活性。
得自PBT109之Eschweiler发酵的菌落在振荡中发酵，培养2天后，表明这些菌落中3-25％是在菌株只含有单一蛋白酶基因的水平上产生的。发现这些菌落是对新霉素敏感的。这是由于经同源重组切去了pMAX-4序列造成的。相似地，对得自菌株PBT108发酵的菌落进行分析，结果表明这些菌落是有新霉素抗性的。随机采取100个这样的新霉素抗性菌落，分别试验它们的蛋白酶生产能力，以鉴定它们是否含有一个或两个生产性蛋白酶基因。结果所有这100个单独被试的菌落均是在菌株含有两个基因的水平上产生的。这表明在所用发酵条件下，这两个随机整合的蛋白酶基因(PB 108)均得以稳定地保留。
                  实施例8
整合载体PElatB的构建
用限制性内切酶BclI、BglI和BglII消化质粒PGB34(见欧洲专利申请EPA-0134048)。用Klenow聚合酶将所得限制性片段填成平头并连接到PE194-neo(见实施例4)的HpaI位点中。按Birnboim和Doly所述方法(Nucl.Acids Res.7，1513-1523，1979)分离质粒PE194-neo DNA。
按照Spizizen等人的方法(J.Bacteriol，81，741-746，1961)，使用每毫升反应潜能细胞0.5-1μg DNA将连接混合物转化到枯草杆菌1-A40中。将得自转化混合物中的细胞铺敷在含有2.8％K2HPO4、1.2％KH2PO4、0.4％(NH4)2SO4、0.2％二水合柠檬酸三钠、0.04％MgSO4·7H2O、5.10-5％MnSO4·4H2O、0.4％谷氨酸、0.5％葡萄糖、0.02％酪蛋白氨基酸、50μg/ml色氨酸、20μg/ml蛋氨酸、20μg/ml赖氨酸、20μg/ml新霉素、0.4％酪蛋白、0.5％淀粉和1.5％琼脂的基本平皿上。
按Birnboim和Doly所述方法分离α淀粉酶生产菌落的DNA并用限制性酶切方法进行检验。由其中一个转化体中分离到质粒PElatB(参见图6)。
                  实施例9
用PElatB转化α淀粉酶阴性菌株地衣形芽孢杆菌T9
按欧洲专利申请EPA-0253455号中所述方法转化地衣形芽孢杆菌菌株T9，所不同的是整个过程均在30℃进行。在含有20μg/ml新霉素的上述基本平皿上选择转化体。所有转化体均可产生淀粉酶。对按Birnboim和Doly所述方法制得的DNA作限制性酶切分析，证明它们均含有pElatB。
              实施例10
pElatB整合到地衣形芽孢杆菌T9染色体中
将已被质粒pElatB转化了的地衣形芽孢杆菌菌株T9接种在含有20μg/ml新霉素的胰酶解胨-大豆培养液(TSB)中并于30℃保温16小时。然后取5ml细胞悬液稀释到100ml同种培养基中并于50℃保温24小时。
保温后再次重复上述过程。然后将细胞悬液稀释100倍并铺敷在含有10μg/ml新霉素的心脏浸液琼脂平皿上。于50℃保温40小时后分离新霉素抗性菌株并在10ml含10μg/ml新霉素的TSB培养基中于30℃培养16小时。由这些培养物中分离总DNA(Holmes et al.，Anal.Biochem.114，193-197，1981)并经在琼脂糖凝胶上作DNA电泳测知不存在质粒。
通过将DNA转化到枯草杆菌1-A40(Spizizen etal.，1961)，再次检验真正没有低分子量DNA的样品中有无质粒DNA存在。将缺乏转化枯草杆菌1-A40能力(使之产生新霉素抗性)的样品视为质粒-的。
为了检验是否发生了pElatB的整合，并且了解该整合过程是以何种方式进行的，则要分离并用EcoRI消化染色体DNA(Saito-Minwa，Biochem.Biophys.Acta 72，619-632，1963)，在0.5％琼脂糖凝胶上跑电泳并印迹转移到硝酸纤维素滤膜上(Southern，J.Mol.Biol.98，503-517，1975)，然后与32P标记的缺口转译的PGB33杂交(见EPA0134048)。该项分析的结果示于图7A中。由这些结果可以看出，与原始的地衣形芽孢杆菌T5淀粉酶基因菌株相比，因发生了PElatB的非寻常组合，即产生出在基因组的一不同位点上含有单一淀粉酶基因的菌株。
                 实施例11
含有两个被内源性染色体序列分离之淀粉酶基因的菌株T13F的构建
为了开发含有两个被内源性染色体DNA序列分离之淀粉酶基因的菌株，在地衣形芽孢杆菌菌株T5(含有原始淀粉酶基因的淀粉酶菌株，见EPA0134048)和菌株TB13(含随机整合之淀粉酶基因的菌株)之间进行融合实验。按欧洲专利申请0134048中所述方法进行原生质体融合。在原生质体形成前用碘乙酰胺杀死菌株TB13，而菌株T5(新霉素敏感菌株)则不被杀死。选择那些产生于含10μg/ml新霉素之再生平皿上的融合体(fusants)。
为了检验和鉴定潜在的融合体，分离染色体DNA并用EcoRI消化，在0.8％琼脂糖凝胶上电泳分离并印迹转移到硝化纤维素膜上(Southern，J.Mol.Biol.98，503-517，1975)，然后与32P标记的缺口转译的PGB33杂交(见EPA0134048号)。图7B中显示了这一分析的结果。发现所得融合体之一——F13F即是含有两个被内源性染色体序列分隔之淀粉酶基因的菌株。
             实施例12
菌株T390和T13F中重复的淀粉酶基因的稳定性
比较菌株T13F(含有两个被基本染色体序列分隔的染色体淀粉酶基因的菌株)的稳定性与菌株T390(有两个呈串联排列之染色体淀粉酶基因的菌株)的稳定性。于发酵条件下，即在含100ml无新霉素生产培养基(含有：1％淀粉、4％乳糖、0.87％K2HPO4、0.5％酵母提取物、0.5％(NH4)2HPO4、0.2％二水合柠檬酸三钠、0.05％MgSO4·7H2O、0.07％Cacl2、0.068％FeSO4·7H2O和1ml消泡剂/L；灭菌后加KOH将PH调到6.9)的500ml振荡瓶中接种0.2ml过夜TSB培养物(37℃)。于持续通气条件下40℃保温6天后，检验新霉素抗性菌落及淀粉酶活性。下列表2中总结了发酵实验的结果。
                 表2菌株    相对淀粉酶活性       发酵后新霉素抗性细胞的百分数*T5         100％                        —TB13       20％                         100％T13F       120％                        100％T390       200％                        88％*每种菌株检测1000个以上的菌落。
为了排除菌株T13F中在没有同时丢失新霉素抗性基因的情况下切掉一个淀粉酶基因的可能性，分析了20个得自T13F发酵的菌落。分离随机采取的20个菌落的染色体DNA并按前述方法进行杂交实验以确定其特征。图8中显示了对其中9个菌落所作分析的结果。由于在所有菌株的染色体DNA中存在两个含有EcoRI片段的α淀粉酶基因，从而证实它们仍保留了两个淀粉酶基因。
与菌株T13F的遗传稳定性相反，发现菌株T390在发酵时是不稳定的，其产生了12％的新霉素敏感菌落。分析其中一个菌株并发现只含有一个α淀粉酶基因(图8，泳道4)。这证明了在发酵条件下，与串联整合的基因相比较时随机整合的淀粉酶基因的稳定性。

Claims (19)

1.一种制备在其染色体中包含至少两个DNA序列拷贝的转化的原核宿主细胞的方法，所说的DNA序列编码一种有用的多肽，其中所说的拷贝被对宿主细胞是极端重要的内源性染色体DNA分隔开，所说的方法包括：
在转化条件下，使包含至少一个整合到其染色体中的所说的DNA序列拷贝的受体宿主细胞与(a)包含至少一个所说DNA序列拷贝和至少一个标志基因及一个温度敏感性复制原点的DNA构建物或(b)包含所说DNA构建物的供体宿主细胞结合；
以足够高浓度的抗生素为基础，对其中所说的DNA构建物被整合到所说转化体的染色体中的转化体进行选择；和
从所说的转化体中分离包含至少两个所说的被对宿主细胞是极端重要的内源性DNA分隔开的DNA序列拷贝的转化的真核宿主细胞。
2.根据权利要求1的方法，其中所说的选择包括：
在一种所说的标志基因对其有抗性的生物杀伤剂存在下培养所说的转化的细胞；并
确定是否存在所说的DNA构建物，或是否提高了所说有用多肽的表达。
3.根据权利要求1的方法，其中所说的鉴定和分离包括：
分离质粒-的转化的细胞；
由所说的质粒-细胞中分离染色体DNA；
使所说的染色体DNA与包含所说DNA构建物或其片段的标记的探针杂交；
在培养基中培养包含至少两个所说DNA序列之拷贝的转化的细胞，其中所说的拷贝是被内源性DNA序列分隔开的。
4.根据权利要求1的方法，其中所说的原核细胞是芽孢杆菌属细胞。
5.根据权利要求1的方法，其中所说的芽孢杆菌是嗜碱芽孢杆菌菌株或地衣形芽孢杆菌菌株。
6.根据权利要求5的方法，其中所说的嗜碱芽孢杆菌菌株是芽孢杆菌新种PB92，所说的地衣形芽孢杆菌菌株是地衣形芽孢杆菌菌株T5。
7.根据权利要求1的方法，其中所说的有用多肽是一种酶。
8.根据权利要求7的方法，其中所说的酶是丝氨酸蛋白酶或淀粉酶。
9.根据权利要求8的方法，其中所说的丝氨酸蛋白酶在核苷酸序列上与来自芽孢杆菌新种PB92的蛋白水解酶编码基因至少有70％的同源性。
10.根据权利要求8的方法，其中所说的丝氨酸蛋白酶基本上具有下列氨基酸序列：H2N-A-Q-B-V-b-W-G-I-S-R-V-Q-A-P-A-A-H-N-R-G-L-T-G-S-G-V-K-V-A-V-L-D-T-G-I-S-T-H-P-D-L-N-I-R-G-G-A-S-F-V-P-G-E-P-S-T-Q-D-G-N-G-H-G-T-H-V-A-G-T-I-A-A-L-N-N-S-I-G-V-L-G-V-A-P-N-A-E-L-Y-A-V-K-V-L-G-A-S-G-S-G-S-V-S-S-I-A-Q-G-L-E-W-A-G-N-N-G-M-H-V-A-N-L-S-L-G-S-P-S-P-S-A-T-L-E-Q-A-V-N-S-A-T-S-R-G-V-L-V-V-A-A-S-G-N-S-G-A-G-S-I-S-Y-P-A-R-Y-A-N-A-M-A-V-G-A-T-D-Q-N-N-N-R-A-S-F-S-Q-Y-G-A-G-L-D-I-V-A-P-G-V-N-V-Q-S-T-Y-P-G-S-T-Y-A-S-L-N-G-T-S-M-A-T-P-H-V-A-G-A-A-A-L-V-K-Q-K-N-P-S-W-S-N-V-Q-I-R-N-H-L-K-N-T-A-T-S-L-G-S-T-N-L-Y-G-S-G-L-V-N-A-E-A-A-T-R-COOH.
11.根据权利要求1的方法，其中所说的DNA构建物选自：
大小为7.6Kb，物理图谱如图6B所示的重组质粒pMAX-4，该质粒包含编码芽孢杆菌新种PB92菌株中所含有的芽孢杆菌PB92蛋白酶的基因，衍生于质粒pE194的温度敏感性复制原点和新霉素抗性基因，或
大小为8.2Kb，物理图谱如图8所示的重组质粒pE1atB，该质粒包含编码贮存于枯草芽孢杆菌1S-53(CBS467.83)中的质粒pGB34中所含有的α-淀粉酶的基因，衍生于质粒pE194的温度敏感性复制原点和新霉素抗性基因。
12.根据权利要求1的方法，其中所说的DNA序列是通过非寻常重组被整合的。
13.根据权利要求1的方法，其中所说的DNA序列是通过同源重组被整合的。
14.根据权利要求1的方法，其中所说的DNA构建物进一步包含一温度敏感性复制原点。
15.根据权利要求14的方法，其中所说的温度敏感性复制原点是由质粒pE194衍生的。
16.一种制备芽孢杆菌菌株PBT108的方法，该方法包括下列步骤：
将权利要求11所限定的质粒pMAX-4整合到芽孢杆菌新种PB92中，和
以20μg/ml新霉素选择含有两个被对该菌株是极端重要的内源性染色体DNA序列分隔开的编码碱性蛋白酶的基因的细胞。
17.一种制备芽孢杆菌菌株PBT122的方法，该方法包括下列步骤：
将权利要求11所限定的质粒pMAX-4整合到芽孢杆菌新种PB92中，和
以1μg/ml新霉素选择含有两个被对该菌株是极端重要的内源性染色体DNA序列分隔开的编码碱性蛋白酶的基因的细胞。
18.一种制备芽孢杆菌菌株T13F的方法，该方法包括下列步骤：
通过原生质体融合，使地衣形芽孢杆菌菌株T5和地衣形芽孢杆菌菌株T9的原生质体融合，地衣形芽孢杆菌T9是地衣形芽孢杆菌T5的α-淀粉酶缺陷性突变菌株，其中已整合了权利要求11所限定的其基因组质粒pElatB，和
选择含有两个被对该菌株是极端重要的内源性染色体DNA序列分隔开的编码α-淀粉酶的基因的细胞。
19.一种制备有用多肽的方法，该方法包括：
在常规的发酵条件下，培养编码所说有用多肽的转化的原核宿主细胞，该宿主细胞是用权利要求1所述的方法获得的，和
分离所说的有用多肽。
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