DE69723855T2 - Verfahren zur herstellung von polypeptiden in surfaktinmutanten von bacillus zellen - Google Patents

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    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
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    • C12N15/75—Vectors or expression systems specially adapted for prokaryotic hosts other than E. coli, e.g. Lactobacillus, Micromonospora for Bacillus

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Description

  • Hintergrund der Erfindung
  • Gebiet der Erfindung
  • Die vorliegende Erfindung betrifft Verfahren zum Herstellen eines Polypeptids in einer Mutante einer Bacillus Zelle, Verfahren zum Erhalten der Mutanten von Bacillus Zellen und die Mutanten von Bacillus Zellen.
  • Beschreibung des betreffenden Standes der Technik
  • Surfaktin ist ein cyclisches Lipopeptid mit bemerkenswerten oberflächenaktiven Eigenschaften, welches in erster Linie während der stationären Phase des Wachstums von verschiedenen Bacillus Arten hergestellt wird (Carswell et al., 1994, Applied Microbiology and Biotechnology 41: 281–285; Lin et al., 1994, Applied and Environmental Microbiology 60: 31–38; Morikawa et al., 1992, Journal of Fermentation and Bioenginnering 74: 255–261; Arima et al., 1968, Biochemiical Biophysical Research Communications 31: 488–494). Das Lipopeptid enthält sieben Aminosäuren, L-Glu-L-Leu-D-Leu-L-VaI-L-Asp-D-Leu-L-Leu, die mit 3-Hydroxy-13-methyltetradecansäure verbunden sind, durch eine Amidbindung zwischen der Carboxylgruppe der Fettsäure und der Aminogruppe der Glutaminsäure und einer Esterbindung zwischen der Carboxylgruppe des letzten Leu und der Hydroxylgruppe der Fettsäure. Eine homologe Abfolge mit Lipidkettenlängen von 13, 14 und 15 Kohlenstoffen (Hosono und Suzuki, 1983, Journal of Antibiotics 36: 667–673; Razafindralambo et al., 1993, Journal of Chromatography 639: 81–85) und Isoformen, benannt als [Val7]-, [Ile7]-, und [Ala4]-Surfaktin, welche sich durch die siebte oder vierte Aminosäure unterscheiden, (Peypoux et al., 1994, European Journal of Biochemistry 224: 89–96; Baugmart et al., 1991, Biochemical Biophysical Research Communications 177: 998–1005) sind bekannt.
  • Von einem Multienzymkomplex, welcher durch das srf-Operon kodiert wird, wird berichtet, dass er verantwortlich für die nicht-ribosomale Biosynthese des Surfaktins über den sogenannten Thiotemplatemechanismus ist. Das Operon enthält mindestens vier Gene, srfA, srfB, srfC und srfD. Die Gene, srfA, srfB, srfC und srfD, waren vorher bekannt als jeweils srfAA, srfAB, srfAC und srfAD, SrfA, srfB und srfC kodieren die Surfaktinsynthetase-Untereinheiten, von denen jede eine oder mehrere Aminosäure-aktivierende Domänen enthält, welche für die Aktivierung der Surfaktinsubstrataminosäuren erforderlich sind, um Surfaktin herzustellen (van Sinderen et al., 1993, Molecular Microbiology 8: 833–841; Nakano und Zuber, 1998, Journal of Bacteriology 8: 821–831; Cosmina et al., 1993, Molecular Microbiology 8: 821–831). Der Multienzymkomplex ist in sieben großen Domänen organisiert, welche auf drei separaten Proteinen angehäuft sind (Menkhaus et al., 1993, Journal of Biological Chemistry 268: 7678–7684; Gulli et al., Biochimica et Biophysica Acta 1205: 19–28). Die sieben Domänen sind verantwortlich für die Aktivierung und Bindung der sieben Aminosäuren von Surfaktin. Gemäß des Thiotemplatemechanismus erfolgt die Adenylierung und Bindung einer spezifischen Aminosäure an die entsprechende Aminosäure-aktivierende Domäne, ein Prozess, der den Cofaktor 4-Phosphopantethein erfordert. Nachfolgende trans-Thioveresterungsreaktionen resultieren in einer wachsenden Peptidkette, deren Reihenfolge durch die räumliche Anordnung der Multienzymeinheiten bestimmt wird. Es ist gegenwärtig nicht bekannt, wie und wann der Fettsäureanteil mit dem Peptid verknüpft wird und wie die Esterbindung gebildet wird, um das Molekül cyclisch zu machen. Weiterhin wird von dem sfp Gen angenommen, dass es in die _ Expression (Sekretion) des Surfaktins involviert ist (Nakano et al., 1992, Molecular General Genetics 232: 313–323).
  • Bacilli sind sehr gut als Wirtszellsysteme für die Herstellung von nativen und rekombinanten Proteinen erwiesen. Jedoch können Bacillus Wirte mit den wünschenswerten Eigenschaften einer erhöhten Proteinexpression und -sekretion, nicht notwendigerweise die am meisten gewünschten Charaktermerkmale für eine erfolgreiche Fermentation besitzen. Speziell kann die Fermentation wegen einer Erhöhung der Schaumentwicklung, während die Biomasse sich erhöht, nicht optimal sein. Eine erhöhte Schaumentwicklung begrenzt die Produktivität der Fermentation.
  • Es ist daher eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung, verbesserte Bacillus Wirte bereitzustellen, welche die Kapazität zur Expression von herkömmlichen Mengen an Protein mit befriedigenden Fermentationscharaktermerkmalen kombinieren, wie ein schnelles Wachstum bei einer geringen Schaumentwicklung und dadurch verstärkter fermentativer Produktivität.
  • Zusammenfassung der Erfindung
  • Die vorliegende Erfindung betrifft Verfahren zum Herstellen eines Polypeptids, umfassend: (a) Kultivieren einer Mutante von einer Bacillus Zelle, wobei (i) die Mutante eine erste Nukleinsäuresequenz, welche das Polypeptid kodiert, und eine zweite Nukleinsäuresequenz, umfassend eine Modifikation von mindestens einem der Gene, welche für die Biosynthese oder Sekretion eines Surfaktins oder einer Isoform hiervon verantwortlich sind, unter Bedingungen, welche förderlich für die Herstellung des Polypeptids sind umfasst, und (ii) die Mutantenzelle weniger des Surfaktins oder der Isoform hiervon herstellt als die Bacillus Zelle, wenn diese unter den gleichen Bedingungen kultiviert wird; und (b) Isolieren des Polypeptids aus dem Kultivierungsmedium.
  • Die vorliegende Erfindung betrifft ebenfalls Mutanten von Bacillus Zellen und Verfahren zum Erhalten der Mutanten von Bacillus Zellen.
  • Kurze Beschreibung der Figuren
  • 1 stellt eine Restriktionskarte von pShv2 dar.
  • 2 stellt eine Restriktionskarte von pSJ3200 dar.
  • 3 stellt eine Restriktionskarte von pSJ2662 dar.
  • 4 stellt die Konstruktion der amyQ Promotor-amyM Genfusion in pSJ2882-MCS dar.
  • 5 stellt eine Restriktionskarte von pPL2419 dar.
  • 6 stellt eine Restriktionskarte von pCAsub2 dar.
  • 7 stellt eine Restriktionskarte von pBAN-NOV dar.
  • 8 stellt eine Restriktionskarte von pPL2541-tet dar.
  • Detaillierte Beschreibung der Erfindung
  • Die vorliegende Erfindung betrifft Verfahren zum Herstellen eines Polypeptids, umfassend: (a) Kultivieren einer Mutante von einer Bacillus Zelle, wobei (i) die Mutante die Bacillus Zelle durch die Modifikation betrifft, z. B. Zerstörung von mindestens einem der Gene, welche für die Biosynthese oder Sekretion eines Surfaktins oder einer Isoform hiervon unter Bedingungen, welche förderlich für die Herstellung des Polypeptids sind, betrifft, und (ii) die Mutante weniger des Surfaktins oder der Isoform hiervon herstellt, als die Bacillus Zelle, wenn diese unter den gleichen Bedingungen kultiviert wird; und (b) Isolieren des Polypeptids aus dem Kultivierungsmedium.
  • Der Begriff "Surfaktin" wird hierin definiert als ein cyclisches Lipopeptid mit einer Aminosäuresequenz L-Glu-L-Leu-D-Leu-L-VaI-L-Asp-D-Leu-L-Leu, veknüpft mit einer geraden oder verzweigten b-Hydrosyfettsäure mit einer variierenden Kettenlänge von 13–15 Kohlenstoffatomen. Der Begriff "Isoform" wird hierin definiert als Varianten eines Surfaktins, in welchen eine oder mehrere Aminosäurereste mit einem verschiedenen Aminosäurerest, z. B. [Val7]-, [Ile7]-, und [Ala4]-Surfaktin substituiert worden sind.
  • In den Verfahren der vorliegenden Erfindung kann die Bacillus Zelle eine Wildtyp Bacillus Zelle oder eine Mutante hiervon sein. Bacillus Zellen, welche in der Praxis dieser Erfindung verwendbar sind, schließen ein, sind jedoch nicht begrenzt auf, Bacillus alkalophilus, Bacillus amyloliquefaciens, Bacillus brevis, Baillus circulans, Bacillus coagulans, Bacillus firmus, Bacillus lautus, Bacillus lentus, Bacillus licheniformis, Bacillus megaterium, Bacillus pumilus, Bacillus stearothermophilus, Bacillus subtilis, Bacillus thuringiensis Zellen. In einer bevorzugteren Ausführungsform ist die Bacillus Zelle Bacillus subtilis ATCC 6051 oder 6051A oder Bacillus subtilis NCFB 736 (früher NCDO 736).
  • Die Mutanten der Bacillus Zellen können konstruiert werden durch ein Reduzieren oder einem Elimitieren der Expression von einem oder mehreren Genen, welche für die Biosynthese oder Sekretion des Surfaktins oder einer Isoform hiervon verantwortlich sind, wofür Verfahren verwendet werden, welche im Stand der Technik gut bekannt sind für Insertionen oder Deletionen. Zum Beispiel kann eines der Gene durch Einfügen eines integrativen Plasmids in das Gen zerstört werden, welches ein Nukleinsäurefragment enthält, das homolog zu dem Gen ist, welches eine Duplikation der Homologieregion erzeugt, und Einbauen von Vektor-DNA zwischen die duplizierten Regionen. Dies kann die Genexpression eliminieren, wenn der eingefügte Vektor den Promotor des Gens von der kodierenden Region separiert oder die kodierende Sequenz unterbricht, so dass ein nichtfunktionelles Genprodukt resultiert. Zusätzlich können eine oder mehrere Kontrollsequenzen, welche notwendig oder vorteilhaft für die Expression eines oder mehrerer der Gene sind, welche verantwortlich für die Biosynthese oder Sekretion eines Surfaktins oder einer Isoform hiervon sind, z. B. Promotor, modifiziert werden. Alternativ kann die Genexpression durch den Prozess der Genkonversion reduziert oder eliminiert werden (siehe zum Beispiel Iglesias und Trautner, 1983, Molecular General Genetics 189: 73–76) oder durch einen Genersatz. In dem letztgenannten Prozess wird eine mutierte Version des Gens in ein nichtreplizierendes oder Temperatur-sensitives Plasmid in Verbindung mit einem se lektierbaren Marker eingefügt. Eine Selektion für die Integration des Plasmids wird durch eine Selektion für den Marker, unter Bedingungen, welche eine Plasmidreplikation nicht erlauben, ausgeführt. Eine Selektion für ein zweites Rekombinationsereignis, welches zu einem Genersatz führt, wird durch Überprüfung von Kolonien auf einen Verlust des selektierbaren Markers hin und dem Erwerben des mutierten Gens ausgeführt (siehe zum Beispiel Perego, 1993, In A. L. Sonneshein, J. A. Hoch, und R. Losick, Herausgeber, Bacillus subtilis and Other Gram-Positive Bacteria, Kapitel 42, American Society of Microbiology, Washington, D. C., 1993). Weiterhin kann eine Reduzierung oder Eliminierung der Expression eines oder mehrerer Gene, welches) für die Biosynthese oder Sekretion des Surfaktins verantwortlich ist/sind, durch eine Zufallsmutagenese erreicht werden, unter Verwenden von Verfahren, welche im Stand der Technik gutbekannt sind, einschließlich, jedoch nicht hierauf begrenzt, Transposition und chemische Mutagenese.
  • Die Mutanten von Bacillus Zellen können ebenfalls konstruiert werden, um eine Variante oder Isoform des Surfaktins herzustellen. Die Variante oder Isoform wird von dem Peptid, welches aus seiner nativen Quelle isoliert wird, dadurch verschieden sein, dass die Variante nicht-schaumentwickelnd ist oder reduzierte oberflächenaktive Eigenschaften besitzt. Die Modifikation einer Nukleinsäuresequenz eines oder mehrere Gene, welche verantwortlich für die Biosynthese von Surfaktin ist/sind, kann durch Verfahren erreicht werden, welche im Stand der Technik gutbekannt sind, z. B. einem Austausch von Domän-kodierenden Regionen, welches zu der Konstruktion von Hybridgenen führt, welche Peptidsynthethasen mit veränderten Aminosäurespezifitäten kodieren und die Herstellung von Peptiden mit modifizierten Aminosäuresequenzen (siehe zum Beispiel Stachelhaus et al., 1995, Science 269: 60–72). Im einem weiteren Aspekt der vorliegenden Erfindung kann die Aminosäuresubstitution einen Surfaktin-negativen Phänotyp, wie eine Ser-in-Ala-Substitution, verleihen (D'Souza et al., 1993, Journal of Bacteriology 175: 3502–3510; Vollenbroich et al., 1993, FEBS Letters 325: 220–224; Stachelhaus et al., 1995, supra). Die analoge Nukleinsäuresequenz kann auf der Basis der Nukleinsäuresequenzen von Genen konstruiert werden, welche verantwortlich für die Biosynthese des Surfaktinlipopeptids sind, durch Einführung von Nukleotidsubstitutionen, welche in einer verschiedenen Aminosäureseguenz als der Aminosäuresequenz des nativen Surfaktinmoleküls resultieren. Für eine allgemeine Beschreibung einer Nukleotidsubstitution siehe z. B. Ford et al., 1991, Protein Expression and Purification 2: 95–107.
  • Es wird für einen Fachmann offensichtlich sein, dass solche Substitutionen außerhalb und innerhalb von Regionen, die für die Funktion des Moleküls kritisch sind, gemacht werden können. Aminosäurereste, welche wesentlich für die oberflächenaktive Eigenschaft eines Peptids sind, können gemäß Vorgehensweisen, welche im Stand der Technik bekannt sind, wie einer ortsgerichteten Mutagenese oder einer Alanin-Scanning Mutagenese, identifiziert werden (siehe z. B. Cunningham und Wells, 1989, Science 244: 1081–1085). Bei der letztgenannten Technik werden Mutationen an jedem Rest des Moleküls eingefügt und das resultierende Mutantenmolekül wird auf die oberflächenaktive Aktivität hin überprüft, um Aminosäurereste zu identifizieren, die kritisch für die Aktivität des Moleküls sind.
  • In den Verfahren der vorliegenden Erfindung kann ein beliebiges Gen einer Bacillus Zelle, welches verantwortlich für die Biosynthese oder Sekretion eines Surfaktins oder einer Isoform hiervon ist, modifiziert werden. Zum Beispiel kann das Gen ein beliebiges Gen des srf Operons sein, z. B. srfA, srfB, srfC und srfD. Alternativ kann das sfp Gen modifiziert werden.
  • In einem weiteren Aspekt der vorliegenden Erfindung kann/können das/die Gen(e), welche(s) für ein Verknüpfen des Fettsäureanteils mit dem Peptid oder ein Bilden der Esterbindung, um das Molekül cyclisch zu machen, verantwortlich ist sind, das Subjekt der Modifikation sein, um eine Bacillus Mutantenzelle, welche defizient in Schaumentwicklungseigenschaften ist, möglich zu machen.
  • In einem noch weiteren Aspekt der vorliegenden Erfindung können die Mutanten der Bacillus Zellen zusätzlich Deletionen oder Insertionen von anderen Genen enthalten, welche nachteilig für die Herstellung, Wedererlangung oder Applikation eines Polypeptids sein können. Zum Beispiel kann die Bacillus Zelle in einer bevorzugten Ausführungsform eine Protease-defiziente Zelle sein. In einer anderen bevorzugten Ausführungsform stellt die Bacillus Zelle keine Sporen her, z. B. aufgrund einer Deletion spoIIAC. Andere Gene, z. B. das amyE Gen, welche nachteilig für die Herstellung, Rückgewinnung oder Applikation eines Polypeptides sind, können deletiert sein.
  • In den Verfahren der vorliegenden Erfindung besitzen die Mutanten der vorliegenden Erfindung nicht-schaumentwickelnde oder reduzierte schaumentwickelnde Eigenschaften, wenn diese unter Bedingungen kultiviert werden, welche förderlich für die Herstellung des Polypeptids sind. Der Level an Surfaktinlipopeptid, welches durch eine Mutante einer Bacillus Zelle der vorliegenden Erfindung hergestellt wird, kann unter Verwenden von Verfahren, welche im Stand der Technik gut bekannt sind, bestimmt werden (siehe zum Beispiel Ohno et al., 1995, Biotechnology and Bioengineering 47: 209–124 und Grossman et al., 1993, Journal of Bacteriology 175: 6203–6211). Die Mutantenzelle stellt bevorzugt mindestens circa 25% weniger, bevorzugter mindestens circa 50% weniger, noch bevorzugter mindestens circa 75% weniger und am meisten bevorzugt mindestens circa 95% weniger Surfaktinlipopeptid her, als eine entsprechende Bacillus Elternzelle, wenn diese unter identischen Herstellungsbedingungen kultiviert wird. Die Mutantenzelle stellt bevorzugt mindestens circa 25% mehr, bevorzugter mindestens circa 50% mehr, noch bevorzugter mindestens circa 75% mehr und am meisten bevorzugt mindestens circa 95% mehr des Polypeptids her, als eine entsprechende-Bacillus Elternzelle, wenn diese unter identischen-Herstellungsbedingungen kultiviert wird.
  • Die Zellen werden in einem Nährmedium kultiviert, welches zur Herstellung des Polypeptids unter Verwenden von im Stand der Technik bekannter Verfahren ge eignet ist. Zum Beispiel kann die Zelle durch eine Schüttelflaschenkultivierung, in einer Fermentation in kleinem Maßstab oder in großem Maßstab (einschließlich kontinuierlichen, batch-, „fed-batch-„, oder Festzustand-Fermentationen) im Labor oder in industriellen Fermentatoren, ausgeführt in einem geeigneten Medium und unter Bedingungen, die es ermöglichen, dass das Polypeptid exprimiert und/oder isoliert wird. Die Kultivierung findet in einem geeigneten Nährmedium statt, welches Kohlenstoff- und Stickstoffquellen und anorganische Salze umfasst, unter Verwenden von im Stand der Technik bekannter Vorgehensweisen. Geeignete Medien sind von kommerziellen Anbietern erhältlich oder können gemäß veröffentlichter Zusammensetzungen (z. B. in Katalogen der American Type Culture Collection) zubereitet werden. Das sekretierte Polypeptid kann direkt aus dem Medium zurückgewonnen werden.
  • Die Polypeptide können unter Verwenden von im Stand der Technik bekannter Verfahren, welche spezifisch für die Polypeptide sind, detektiert werden. Diese Detektionsverfahren können das Verwenden von spezifischen Antikörpern, die Bildung eines Enzymprodukts, das Ausbleiben eines Enzymsubstrats oder SDS-PAGE einschließen. Zum Beispiel kann ein Enzymtest verwendet werden, um die Aktivität des Polypeptids zu bestimmen. Vorgehensweisen zum Bestimmen einer Enzymaktivität sind im Stand der Technik für viele Enzyme bekannt.
  • Das resultierende Polypeptid kann durch Verfahren, welche im Stand der Technik bekannt sind, isoliert werden. Zum Beispiel kann das Polypeptid aus dem Nährmedium durch herkömmliche Vorgehensweisen isoliert werden, einschließlich jedoch nicht hierauf begrenzt, Zentrifugation, Filtration, Extraktion, Spray-Trocknen, Evaporation oder Präzipitation. Das isolierte Polypeptid kann dann durch eine Vielfalt chromatographischer Vorgehensweisen weiter aufgereinigt werden, z. B. Ionenaustauschchromatographie, Gelfiltrationschromatographie, Affinitätschromatographie und dergleichen.
  • Das Polypeptid kann durch eine Vielfalt von im Stand der Technik bekannter Vorgehensweisen aufgereinigt werden, einschließlich, jedoch nicht hierauf begrenzt, Chromatographie (z. B. Ionenaustausch-, Affinitäts-, hydrophobe, chromatofokussierende und Größenausschluss-), elektrophoretische Vorgehensweisen (z. B. präparative isoelektrische Fokussierung (IEF), verschiedene Löslichkeiten (z. B. Ammoniumsulfatpräzipitationen) oder Extraktion (siehe z. B. Protein Purification, J.-C. Jepson und Lars Rydon, Herausgeber, VCH Publishers, New York, 1989).
  • Das Polypeptid kann ein beliebiges Polypeptid sein. Weiterhin kann das Polypeptid nativ oder heterolog zu der Bacillus Zelle sein. Der Begriff "Polypeptid" bedeutet hierin nicht, sich auf eine spezifische Länge des kodierten Produkts zu beziehen und umfasst daher Peptide, Oligopeptide und Proteine. Der Begriff "Polypeptid" umfasst ebenfalls zwei oder mehrere Polypeptide, welche verbunden sind, um das kodierte Produkt zu bilden. Polypeptide schließen ebenfalls Hybridpolypeptide ein, welche eine Kombination von teilweisen oder vollständigen Polypeptidsequenzen umfassen, welche von mindestens zwei verschiedenen Polypeptiden erhalten werden, wobei eines oder mehrere heterolog zu der Bacillus Zelle sein kann/können. Polypeptide schließen ferner natürlich vorkommende allelische und gentechnisch hergestellte Variationen der oben erwähnten Polypeptide und Hybridpolypeptide ein.
  • Bevorzugt ist das Polypeptid ein Hormon, eine Hormonvariante, ein Enzym, ein Rezeptor oder ein Teil hiervon, ein Antikörper oder ein Teil hiervon oder ein Reporter. In einer bevorzugteren Ausführungsform ist das Polypeptid eine Oxidoreduktase, eine Transferase, eine Hydrolase, eine Lyase, eine Isomerase oder eine Ligase. In einer noch bevorzugteren Ausführungsform ist das Polypeptid eine Aminopeptidase, eine Amylase, eine Carbohydrase, eine Carboxypeptidase, eine Catalase, eine Cellulase, eine Chitinase, eine Cutinase, eine Cyclodextringlycosyltransferase, eine Desoxyribonuklease, eine Esterase, eine alpha-Galaktosidase, eine Beta-Galaktosidase, eine Glucoamylase, eine alpha-Glucosidase, eine beta- Glucosidase, eine Invertase, eine Laccase, eine Lipase, eine Mannosidase, eine Mutanase, eine Oxidase, ein pektinolytisches Enzym, eine Perosidase, eine Phytase, eine Polyphenoloxidase, ein proteolytisches Enzym, eine Ribonuklease, eine Transglutaminase oder eine Xylanase.
  • In den Verfahren der vorliegenden Erfindung kann die Mutante der Bacillus Zelle eine rekombinante Zelle sein, welche eine Nukleinsäuresequenz umfasst, welche ein heterologes Polypeptid kodiert, welches vorteilhafterweise in der rekombinanten Herstellung des Polypeptids verwendet wird. Die Zelle wird bevorzugt mit einem Vektor transformiert, welcher die Nukleinsäuresequenz umfasst, welche das heterologe Polypeptid kodiert, gefolgt von einer Integration des Vektors in das Chromosom. "Transformation" bedeutet Einführen eines Vektors, welcher die zweite Nukleinsäuresequenz umfasst, in eine Wirtszelle, so dass der Vektor als ein chromosomaler Integrant oder als ein selbst-replizierender extrachromosomaler Vektor beibehalten wird. Eine Integration wird im Allgemeinen als ein Vorteil betrachtet, da es wahrscheinlicher ist, dass die Nukleinsäure in der Zelle stabil beibehalten wird. Eine Integration des Vektors in das Chromosom erfolgt durch homologe Rekombination, nicht-homologe Rekombination oder Transposition.
  • Die Nukleinsäuresequenz, die ein heterologes Polypeptid kodiert, kann von einer beliebigen prokaryotischen, eukaryotischen oder anderen Quelle, z. B. Archaeabakterien erhalten werden. Für Zwecke der vorliegenden Erfindung soll der Begriff "erhalten von", wie hierin in Verbindung mit einer gegebenen Quelle verwendet, bedeuten, dass das Polypeptid durch die Quelle oder durch eine Zelle, in welche ein Gen von der Quelle eingefügt worden war, hergestellt wird.
  • In den Verfahren der vorliegenden Erfindung können die Mutanten von Bacillus Zellen ebenfalls für die rekombinante Herstellung von Polypeptiden, welche nativ zu der Bacillus Zelle sind, verwendet werden. Die nativen Polypeptide können rekombinant hergestellt werden durch, z. B. Stellen eines Gens, welches das Po lypeptid kodiert, unter die Kontrolle eines verschiedenen Promotors, um die Expression des Polypeptids zu verstärken, um den Expon eines nativen Polypeptids von Interesse aus der Zelle zu beschleunigen durch Verwenden einer Signalsequenz und um die Kopienanzahl eines Gens zu erhöhen, welches das Polypeptid kodiert, das normalerweise durch die Bacillus Zelle hergestellt wird. Die vorliegende Erfindung umfasst ebenfalls innerhalb des Schutzbereichs des Begriffes "heterologes Polypeptid" solche rekombinante Herstellung von homologen Polypeptiden zu dem Ausmaß, dass solche Expression die Verwendung von genetischen Elementen involviert, welche nicht nativ zu der Bacillus Zelle sind oder die Verwendung von nativen Elementen, welche manipuliert worden sind, um in einer Weise zu funktionieren, die sich in der Wirtszelle normalerweise nicht ereignet.
  • Die Techniken, welche verwendet werden, um eine Nukleinsäuresequenz, welche ein heterologes Polypeptid kodiert, zu isolieren oder klonieren, sind im Stand der Technik bekannt und schließen eine Isolierung von genomischer DNA, Präparation von cDNA oder eine Kombination hiervon ein. Die Klonierung der Nukleinsäuresequenzen von solcher genomischen DNA kann zum Beispiel durch Verwenden der gut bekannten Polymerasekettenreaktion (PCR) ausgeführt werden. Siehe zum Beispiel Innis et al., 1990, PCR Protocols: A Guide to Methods and Application, Academic Press, New York. Die Klonierungsvorgehensweisen können ein Ausschneiden und eine Isolierung eines gewünschten Nukleinsäurefragments involvieren, welches die Nukleinsäuresequenz umfasst, welche das Polypeptid kodiert, ein Einfügen des Fragments in ein Vektormolekül und ein Einbau des rekombinanten Vektors in eine Bacillus Zelle, in der mehrfache Kopien oder Klone der Nukleinsäuresequenz repliziert werden. Die Nukleinsäuresequenz kann von genomischer, cDNA, RNA, semisynthetischer, synthetischer Herkunft oder beliebigen Kombinationen hiervon sein.
  • In den Verfahren der vorliegenden Erfindung können die heterologen Polypeptide ebenfalls fusionierte Polypeptide einschließen, in welchen ein anderes Polypeptid an den N-Terminus oder den C-Terminus des Polypeptids oder Fragments hiervon fusioniert ist. Ein fusioniertes Polypeptid wird durch Fusionieren einer Nukleinsäuresequenz (oder eines Teils hiervon), welches ein Polypeptid kodiert, zu einer Nukleinsäuresequenz (oder eines Teils hiervon), welche ein anderes Polypeptid kodiert, hergestellt. Techniken zur Herstellung von Fusionspolypeptiden sind im Stand der Technik bekannt und schließen ein Legieren der kodierenden Sequenzen, welche die Polypeptide kodieren, ein, so dass sie im Rahmen sind, und eine Expression des fusionierten Polypeptids steht unter der Kontrolle desselben/derselben Promotors/Promotoren und Terminators.
  • "Nukleinsäurekonstrukt" wird hierin definiert als ein Nukleinsäuremolekül, entweder einzel- oder doppelsträngig, welches von einem natürlich vorkommenden Gen isoliert wird oder welches modifiziert worden ist, um Segmente einer Nukleinsäure zu enthalten, welche in einer Weise verbunden und nebeneinander gestellt sind, die in der Natur ansonsten nicht existiert. Der Begriff Nukleinsäurekonstrukt kann synonym mit dem Begriff Expressionskassette sein, wenn das Nukleinsäurekonstrukt all die Kontrollsequenzen enthält, welche für die Expression einer Kodierungssequenz der vorliegenden Erfindung erforderlich sind. Der Begriff "Kodierungssequenz", wie hierin definiert, ist eine Sequenz, welche in mRNA transkribiert wird und in ein Polypeptid der vorliegenden Erfindung translatiert wird, wenn sie unter die Kontrolle der oben erwähnten Kontrollsequenzen gestellt wird. Die Begrenzungen der Kodierungssequenz werden im Allgemeinen durch ein Translations-Startcodon ATG an dem 5'-Terminus und einem Translations-Stoppcodon an dem 3'-Terminus bestimmt. Eine Kodierungssequenz kann einschließen, ist jedoch nicht hierauf begrenzt, DNA, cDNA und rekombinante Nukleinsäuresequenzen.
  • Eine isolierte Nukleinsäureseguenz, welche ein Polypeptid kodiert, kann auf eine Vielfalt von Wegen manipuliert werden, um für die Expression des Polypeptids bereitgestellt zu werden. Eine Manipulation der Nukleinsäuresequenz vor ihrer Insertion in einen Vektor kann wünschenswert oder erforderlich sein, abhängig von dem Expressionsvektor. Die Techniken zum Modifizieren von Nukleinsäure sequenzen unter einem Nutzen von Klonierungsverfahren sind im Stand der Technik gut bekannt.
  • Ein Nukleinsäurekonstrukt, welches eine Nukleinsäuresequenz umfasst, welche ein Polypeptid kodiert, kann mit einer oder mehreren Kontrollsequenzen operabel verknüpft sein, welche in der Lage sind, die Expression der Kodierungssequenz in einer Mutante einer Bacillus Zelle zu lenken, unter Bedingungen, welche mit den Kontrollsequenzen kompatibel sind.
  • Der Begriff "Kontrollsequenzen" wird hierin verwendet, um alle Komponenten einzuschließen, welche notwendig oder vorteilhaft für die Expression der Kodierungssequenz der Nukleinsäuresequenz sind. Jede Kontrollsequenz kann nativ oder fremd zu der Nukleinsäuresequenz, welche das Polypeptid kodiert, sein. Solche Kontrollsequenzen schließen ein, sind jedoch nicht beschränkt auf einen Leader, einen Promoter, eine Signalsequenz und einen Transkriptionsterminator. Als ein Minimum schließen die Kontrollsequenzen einen Promoter und Transkriptions- und Translations-Stoppsignale ein. Die Kontrollsequenzen könne mit Linkem bereitgestellt werden, für den Zweck, spezifische Restriktionsstellen, welche die Ligation der Kontrollsequenzen mit der Kodierungsregion der Nukleinsäuresequenz, welche ein Polypeptid kodier, erleichtern, einzuführen.
  • Die Kontrollsequenz kann eine passende Promotorsequenz, eine Nukleinsäuresequenz, welche von einer Bacillus Zelle zur Expression der Nukleinsäuresequenz erkannt wird, sein. Die Promotersequenz enthält Transkriptions-Kontrollsequenzen, welche die Expression des Polypeptids vermitteln. Der Promoter kann eine beliebige Nukleinsäuresequenz sein, welche eine Transkriptionsaktivität in der Bacillus Zelle der Wahl zeigt und kann von Genen erhalten werden, welche extrazelluläre oder intrazelluläre Polypeptide kodieren, entweder homolog oder heterolog zu der Bacillus Zelle. Beispiele für geeignete Promotoren für ein Lenken der Transkription des Nukleinsäuresequenz der vorliegenden Erfindung, besonders in einer Bacillus Zelle, sind die Promotoren, welche von dem E. coli lac-Operon, dem Streptomyces coelicolor Agarasegen (dagA), dem Bacillus subtilis Levansucrasegen (sacB), dem Bacillus lichenioformus alpha-Amylasegen (amyL), dem Bacillus stearothermophilus maltogenische Amylasegen (amyM), dem Bacillus amyloliquefaciens alpha-Amylasegen (amyQ), dem Bacillus licheniformis Penicillinasegen (penP), den Bacillus subtilis xylA- und xylB-Genen und dem prokaryotischen Beta-Lactamasegen erhalten werden (Villa-Kamaroff et al., 1978, Proceedings of the National Academy of Sciences USA 75: 3727–3731), ebenso wie der tac Promotor (DeBoer et al., 1983, Proceeding of the National Academy of Sciences USA 80: 21–25). Weitere Promotoren werden in "Useful proteins from recombinant bacteria" in Scientific American, 1980, 242: 74–94; und in Sambrook et al., 1989, supra beschrieben.
  • Die Kontrollsequenz kann ebenfalls eine geeignete Transkriptions-Terminatorsequenz sein, eine Sequenz, welche durch eine Bazilluszelle erkannt wird, um die Transkription zu beenden. Die Terminatorsequenz ist mit dem 3'-Terminus der Nukleinsäuresequenz, welche das Polypeptid kodiert, operabel verknüpft. Es kann ein beliebiger Terminator verwendet werden, welcher in der Bacillus Zelle der Wahl funktionell ist, in der vorliegenden Erfindung verwendet werden.
  • Die Kontrollsequenz kann ebenso eine geeignete Leadersequenz sein, eine nichttranslatierte Region einer mRNA, welche wichtig für eine Translation durch die Bacillus Zelle ist. Die Leadersequenz ist mit dem 5'-Terminus der Nukleinsäuresequenz, welche das Polypeptid kodiert, operabel verknüpft. Es kann eine beliebige Leadersequenz in der vorliegenden Erfindung verwendet werden, welche in der Bacillus Zelle der Wahl funktionell ist.
  • Die Kontrollsequenz kann ebenfalls eine Signalpeptid-Kodierungsregion sein, welche für eine Aminosäuresequenz kodiert, welche mit dem Aminoterminus des Polypeptids verknüpft ist, welche das exprimierte Polypeptid in den Sekretionsweg der Zelle leiten kann. Die Signalpeptid-Kodierungsregion kann nativ zu dem Polypeptid der Erfindung sein oder kann von fremder Quelle erhalten werden. Das 5'-Ende der Kodierungsseguenz der Nukleinsäuresequenz kann inhärent eine Signalpeptid-Kodierungsregion enthalten, welche natürlicherweise in dem Translationsleserahmen mit dem Segment der Kodierungsregion, welche das sekretierte Polypeptid kodiert, verknüpft ist. Alternativ kann das 5'-Ende der Kodierungssequenz eine Signalpeptid-Kodierungsregion enthalten, welche zu dem Teil der Kodierungssequenz fremd ist, welche das sekretierte Polypeptid kodiert. Die fremde Signalpeptid-Kodierungsregion kann erforderlich sein, wenn die Kodierungssequenz nicht normalerweise eine Signalpeptid-Kodierungsregion enthält. Alternativ kann die fremde Signalpeptid-Kodierungsregion die natürliche Signalpeptid-Kodierungsregion einfach ersetzen, um eine verstärkte Sekretion des Polypeptids zu erhalten, in Beziehung zu der natürlichen Signalpeptid-Kodierungsregion, die normalerweise mit der Kodierungssequenz assoziiert ist. Die Signalpeptid-Kodierungsregion kann von einem Amylase- oder einem Proteasegen von einer Bacillus Art erhalten werden. Jedoch kann eine beliebige Signalpeptid-Kodierungsregion, welche in der Lage ist, das exprimierte Polypeptid in den Sekretionsweg einer Bacillus Zelle der Wahl zu leiten, in der vorliegenden Erfindung verwendet werden.
  • Eine effektive Signalpeptid-Kodierungsregion für Bacillus Zellen ist die Signalpeptid-Kodierungsregion, welche von dem maltogenischen Amylasegen von Bacillus NCIB 11837, dem Bacillus stearothermophilus alpha-Amylasegen, dem Bacillus licheniformis Subtilisingen, dem Bacillus licheniformis beta-Lactamasegen, dem Bacillus stearothermophilus neutralen Proteasegenen (nprT, nprS, nprM) und dem Bacillus subtilis prsA Gen erhalten wird. Weitere Signalpeptide werden von Simonen und Palva, 1993, Microbiological Reviews 57: 109– 137 beschrieben.
  • In den Verfahren der vorliegenden Erfindung kann ein rekombinanter Expressionsvektor, welcher die Nukleinsäureseguenz, einen Promotor und ein Transkriptions- und Translations-Stoppsignal umfasst, für die rekombinante Herstellung ei nes Polypeptids, verwendet werden. Die oben beschriebenen verschiedenen Nukleinsäure- und Kontrollsequenzen können zusammen vereinigt werden, um einen rekombinanten Expressionsvektor herzustellen, welcher eine oder mehrere brauchbare Restriktionsstellen einschließt, um eine Insertion oder Substitution der Nukleinsäuresequenz, welche das Polypeptid kodiert, an solchen Stellen zu ermöglichen. Alternativ kann die Nukleinsäuresequenz exprimiert werden durch ein Einfügen der Nukleinsäuresequenz oder eines Nukleinsäurekonstruktes, welches die Nukleinsäuresequenz umfasst, in einen passenden Vektor für die Expression. Beim Schaffen des Expressionsvektors wird die Kodierungssequenz in dem Vektor so lokalisiert, dass die Kodierungssequenz mit der passenden Kontrollsequenz für die Expression und möglicherweise Sekretion verknüpft ist.
  • Der rekombinante Expressionsvektor kann ein beliebiger Vektor sein, welcher rekombinanten DNA-Vorgehensweisen brauchbar unterworfen werden kann und die Expression der Nukleinsäuresequenz veranlassen kann. Die Wahl des Vektors wird typischerweise von der Kompatibilität des Vektors mit der Bacillus Zelle, in welche der Vektor einzuführen ist, abhängig sein. Die Vektoren können linear oder geschlossen circuläre Plasmide sein. Der Vektor kann ein autonom replizierender Vektor sein, d. h. ein Vektor, welcher als eine extrachromosomale Einheit existiert, dessen Replikation unabhängig von der chromosomalen Replikation ist, z. B. ein Plasmid, ein extrachromosomales Element, ein Minichromosom oder ein artifizielles Chromosom. Der Vektor kann beliebige Mittel enthalten, um eine Selbstreplikation sicherzustellen. Alternativ kann der Vektor einer sein, welcher, wenn er in die Bacillus Zelle eingeführt wird, in das Genom integriert wird und zusammen mit dem/den Chromosom(en), in welches) er eingeführt worden ist, repliziert wird. Das Vektorsystem kann ein einzelner Vektor oder ein einzelnes Plasmid oder zwei oder mehrere Vektoren oder Plasmide sein, welche zusammen die Gesamt-DNA, die in das Genom der Bacillus Zelle einzuführen ist, enthalten, oder ein Transposon.
  • Die Vektoren können in das Bacillus Zellgenom integriert werden, wenn sie in eine Bacillus Zelle eingeführt werden. Für eine Integration kann der Vektor auf die Nukleinsäureseguenz, welche das Polypeptid kodiert, oder ein beliebiges anderes Element des Vektors zur stabilen Integration des Vektors in das Genom durch homologe Rekombination, angewiesen sein. Alternativ kann der Vektor zusätzliche Nukleinsäuresequenzen für ein Lenken der Integration in das Genom der Bacillus Zelle durch homologe Rekombination enthalten. Die zusätzlichen Nukleinsäuresequenzen setzen den Vektor in die Lage, in das Bacillus Zellgenom an einem präzisen Ort in dem Chromosom integriert zu werden. Um die Wahrscheinlichkeit der Integration an einem präzisen Ort zu erhöhen, sollten die Integrationselemente vorzugsweise eine ausreichende Anzahl von Nukleinsäuren enthalten, wie 100 bis 1.500 Basenpaare, bevorzugt 400 bis 1.500 und am meisten bevorzugt 800 bis 1.500 Basenpaare, welche hoch homolog mit der entsprechenden Zielsequenz sind, um die Wahrscheinlichkeit einer homologen Rekombination zu verstärken. Die Integrationselemente könne eine beliebige Sequenz sein, welche homolog mit der Zielsequenz in dem Genom von der Bacillus Zelle ist. Weiterhin können die Integrationselemente nicht-kodierende oder kodierende Nukleinsäuresequenzen sein.
  • Für eine autonome Replikation kann der Vektor ferner einen Replikationsursprung umfassen, welcher den Vektor in die Lage versetzt, sich in der in Frage stehenden Bacillus Zelle autonom zum replizieren. Beispiele für bakterielle Replikationsursprünge sind die Replikationsursprünge der Plasmide pBR322, pUC19, pACYC177 und pACYC184, welche eine Replikation in E. coli erlauben und pUB110, pE194, pTA1060 und pAMβ1, welche eine Replikation im Bacillus erlauben. Der Replikationsursprung kann einer sein, welcher eine Mutation besitzt, um seine Funktion Temperatur sensitiv in der Bacillus Zelte zu machen (siehe z. B., Ehrlich, 1978, Proceedings of the National Academy of Sciences USA 75 1433).
  • Es kann mehr als eine Kopie einer Nukleinsäuresequenz, welche ein Polypeptid der vorliegenden Erfindung kodiert, in die Bacillus Zelle eingefügt werden, um die Expression der Nukleinsäuresequenz zu amplifizieren. Eine stabile Amplifikation der Nukleinsäureseguenz kann durch ein Integrieren von mindestens einer zusätzlichen Kopie der Sequenz in das Bacillus Zellgenom erhalten werden, unter Verwenden von Methoden, welche im Stand der Technik gut bekannt sind, und einem Selektieren nach Transformanten. Ein brauchbares Verfahren zum Erreichen einer Amplifikation genomischer DNA-Sequenzen wird in WO 94/14968 beschrieben.
  • Der Vektor enthält vorzugsweise einen oder mehrere selektierbare Marker, welcher eine leichte Selektion der transformierten Zellen erlaubt/erlauben. Ein selektierbarer Marker ist ein Gen, dessen Produkt eine Biozidresistenz, eine Resistenz gegenüber Schwermetallen, Prototrophy bei Auxotrophen und dergleichen bereitstellt. Beispiele von bakteriellen selektierbaren Markern sind die dal Gene von Bacillus subtilis oder Bacillus licheniformis oder Marker, welche eine antibiotische Resistenz verleihen, wie eine Ampicillin-, Kanamycin-, Erythromycin-, Chloramphenicol- oder Tetracyclinresistenz. Weiterhin kann die Selektion durch eine Co-Transformation erreicht werden, zum Beispiel wie in WO 91/09129 beschrieben, wo der selektierbare Marker auf einem separaten Vektor liegt.
  • Die Vorgehensweisen, welche verwendet werden, um die oben beschriebenen Elemente zu legieren, um den rekombinanten Expressionsvektor der vorliegenden Erfindung zu konstruieren, sind dem Fachmann im Stand der Technik gut bekannt (siehe z. B., Sambrook et al., 1989, supra).
  • Die Transformation der Bacillus Zelle kann zum Beispiel durch eine Protoplastentransformation ausgeführt werden (siehe z. B. Chang und Cohen, 1979, Molecular General Genetics 168: 111–115), durch Verwenden von kompetenten Zellen (siehe z. B. Young und Spizizin, 1961, Journal of Bacteriology 81: 823–829, oder Dubnau und Davidoff-Abelson, 1971, Journal of Molecular Biology 56: 209–221), durch eine Elektroporation (siehe z. B. Shigekawa und Dower, 1983, Biotechniques 6: 742–751), oder durch eine Konjugation (siehe z. B. Koehler und Thome, 1987, Journal of Bacteriology 169: 5271–5278).
  • Die vorliegende Erfindung wird weiter beschrieben durch die folgenden Beispiele, welche nicht als Begrenzung des Schutzbereichs der Erfindung konstruiert sein sollten.
  • Beispiele
  • Alle Primer und Oligos wurden in einem Applied Biosystems Model 394-Synthetisierer (Applied Biosystems Inc., Forster City, CA) gemäß den Instruktionen des Herstellers synthetisiert.
  • Beispiel 1: Konstruktion eines Bacillus subtilis Donorstammes BW154
  • Einige Gene (spoIIAC, aprE, nprE, amyE und srfC) wurden in den Bacillus subtilis A164 (ATCC 6051A) und 1630 (NCFB 736) Wirtsstämmen deletiert, wie hierin beschrieben. Um diese Aufgabe zu lösen, wurden Plasmide, welche deletierte Versionen dieser Gene enthielten, in diese Stämme unter Verwenden des pLS20-vermittelten Konjugationssystem eingeführt (Koehler und Thorne, 1987, supra). Kurz, dieses System wird von einem Bacillus subtilis "Donor"-Stamm umfasst, welcher ein großes Plasmid enthält, welches als pLS20 bezeichnet wird. pLS20 kodiert die Funktionen, welche notwendig sind, pLS20 in einen "Rezipienten"-Stamm von Bacillus subtilis zu mobilisieren. Zusätzlich ist gezeigt worden, dass Plasmide, wie pUB110 und pBC16, ebenfalls durch diese Konjugationssysteme (in der Gegenwart von pLS20) mobilisierten. Diese Plasmide enthielten eine cis-wirkende Region (oriT) und ein Gen (orf-beta), welches eine transwirkende Funktion kodiert, welches auf die oriT Stelle wirkt und die Mobilisierung dieser Plasmide in einen Rezipientenstamm erleichtert. Plasmide, welche lediglich oriT enthalten, können ebenfalls mobilisiert werden, wenn der Donor stamm sowohl pLS20 und entweder pUB110 oder pBC16 enthält (in diesem Fall wird die orf-beta Funktion in trans bereitgestellt).
  • Das pLS20 Plasmid oder ein Derivat, wie pXO503 (Koehler und Thorne, 1987, supra) muss vorhanden sein, damit ein Stamm ein befähigter Donor ist. Zusätzlich ist es ebenfalls wünschenswert, ein Mittel zum Gegenselektieren ("counterselecting") gegen den Donorstamm zu besitzen, nachdem die Konjugation vervollständigt worden ist. Es ist ein Gegenselektionsschema entwickelt worden, das sehr "sauber" ist (kein Hintergrund) und leicht zu implementieren ist. Dieses schließt das Einführen einer Deletion in das dal Gen des Donorstammes (welcher das D-Alanin Racemaseenzym kodiert, welches für eine Zellwandsynthese erforderlich ist) und ein Selektieren gegen den Donorstamm durch ein Wachsen der Zellmischung aus einem Konjugationsexperiment auf festen Nährmedien frei von D-Alanin (diese Aminosäure muss exogen zu den Medien hinzugefügt werden, damit ein dal Stamm von Bacillus subtilis wächst) ein.
  • Um die oben erwähnten Gene zu deletieren, sind pE194 Replicons (Erythromycinresistenz) (Gryczan et al., 1982, Journal of Bacteriology 152: 722– 735), welche deletierte Versionen der Gene und oriT Sequenz enthalten, in die Bacillus subtilis A164 und A1630 Stämme zu mobilisieren gewesen. Ein geeigneter Donorstamm sollte die folgenden Charaktermerkmale besitzen: 1) eine Deletion in dem daß Gen (zur Gegenselektion) und 2) es muss ebenfalls pLS20 enthalten (pXO503 würde in diesem Fall ungeeignet sein, da die pE194 Replicons durch Erythromycinselektion beibehalten werden müssen und pXO503 bereits eine Resistenz gegenüber diesem Antibiotikum verleiht) und entweder pUB110 oder pBC16, um die orf-Beta-Funktion in trans zu liefern. Eine Beschreibung, wie ein Bacillus subtilis BW154 als ein Donorstamm konstruiert wurde; folgt.
  • (A) Einführung einer dal Deletion in Bacillus subtilis, um Bacillus subtilis BW96 zu gewinnen.
  • Zuerst wurde ein Stamm von Bacillus subtilis mit einer Mutation in dem bac-1 Gen (diese Mutation hebt die Fähigkeit des Stammes auf, das Dipeptid Antibiotikum Bacilysin zu synthetisieren) ausgewählt, da es vorher gezeigt worden ist, dass Wildtyp Bacillus subtilis Zellen tatsächlich andere Arten von Bacillus abtöten während des Konjugationsprozesses, und dieses Abtötungspotential ist weitgehend reduziert in Zellen, welche bac-1 sind. Daher sind alle Donorstämme mit einem bac-1 Hintergrund konstruiert worden.
  • Der erste Schritt beim Konstruieren eines geeigneten Donorstammes war es, einen Teil des dal Gens in dem Bacillus subtilis Stamm 1A758, welcher bac-1 ist, zu deletieren (Bacillus Stock Center, Columbus, OH). Eine deletierte Version des dal Gens wurde in vitro konstruiert, welches für das Wildtyp dal Gen auf dem Bakterienchromosom ausgetauscht werden konnte. Die 5'- und 3'- Teile des dal Gens wurden PCR-amplifiziert unter Verwenden der Primer 1 und 2, um den 5'-Teil des Gens (Nukleotide 19–419, das A von dem ATG-Codon ist +1) zu amplifizieren und den Primern 3 und 4, um den 3'-Teil des Gens (Nukleotide 618–1037) zu amplifizieren.
    Primer 1: 5'-GAGCTCACAGAGATACGTGGGC-3' (SEQ ID NO: 1)
    Primer 2: 5'-GGATCCACACCAAGTCTGTTCAT-3' (SEQ ID NO: 2) (BamHI-Stelle unterstrichen)
    Primer 3: 5'-GGATCCGCTGGACTCCGGCTG-3' (SEQ ID NO: 3) (BamHI-Stelle unterstrichen)
    Primer 4: 5'-AAGCTTATCTCATCCATGGAAA-3' (SEQ ID NO: 4) (HindIII-Stelle unterstrichen)
  • Die Amplifikationsreaktionen (100 μl) enthielten die folgenden Komponenten: 200 ng Bacillus subtilis 168 chromosomale DNA, 0,5 μM von jedem Primer, 200 μM von jedem dATP, dCTP, dGTP und dTTP, 1 × Taq Polymerasepuffer und 1 U Taq DNA-Polymerase. Die Bacillus subtilis 168 chromosomale DNA wurde gemäß der Vorgehensweise von Pitcher et al., 1989, Letters in Applied Microbio logy 8: 151–156 erhalten. Die Reaktionen wurden unter folgenden Bedingungen durchgeführt: 95°C für 3 Minuten, dann 30 Cyclen, jeder bei 95°C für 1 Minute, 50°C für 1 Minute und 72°C für 1 Minute, gefolgt von 5 Minuten bei 72°C. Die Reaktionsprodukte wurden durch Agarosegelelektrophorese analysiert. Sowohl die 5'- als auch die 3'-PCR-Produkte wurde in den pCRII Vektor des TA-Klonierungskit ("TA Cloning Kit", Invitrogen, San Diego, CA) gemäß den Instruktionen des Herstellers kloniert. Ein pCRII Klon wurde identifiziert, welcher die 5'-Hälfte des dal Gens in einer Orientierung enthielt, dass die BamHI Stelle, welche durch den PCR-Primer eingeführt wurde, benachbart zu der BamHI Stelle des pCRII Polylinkers war (die andere Orientierung würde die BamHI Stellen viel weiter auseinander platzieren). Der pCRII Klon, welcher die 3'-Hälfte des dal Gens enthielt, wurde dann mit BamHI und HindIII verdaut und das dal Genfragment wurde dann in die BamHI-HindIII Stelle des vorgenannten pCRII Klons, welcher die 5'-Hälfte des dal Gens enthielt, kloniert, welches einen PCRII Vektor erzeugte, welcher das dal Gen mit einer 200 Bp Deletion in der Mitte enthält, welche durch eine NotI Stelle an dem 5'-Ende (Teil des pCRII Polylinkers) und eine HindIII Stelle an dem 3'-Ende des Gens flankiert wird.
  • Um diese dal Deletion in das Bakterienchromosom einzuführen, wurde das deletierte Gen in das Temperatur-sensitive Bacillus subtilis Replicon PE194 kloniert (Gryczan et al., 1982, supra). Das deletierte dal Gen wurde dann in das Chromosom in zwei Schritten eingeführt: Zuerst durch ein Integrieren des Plasmids über homologe Rekombination in den chromosomalen dal Locus, gefolgt von dem nachfolgenden Entfernen des Plasmids (wiederum über homologe Rekombination), welches die deletierte Version des dal Gens auf dem Bakterienchromosom hinterlässt. Dies wurde wie folgt erreicht: Das deletierte dal Genfragment (oben beschrieben) wurde in die NotI HindIII Stelle des Temperatur sensitiven Plasmids pSK+/pE194 kloniert (im Wesentlichen durch ein Ersetzen der pSK+ Vektorsequenzen mit dem dalΔ Fragment). Das Plasmid pSK+/pE194 wurde wie folgt konstruiert: Sowohl Bluescript SK+ (Stratagene, La Jolla, CA) als auch pE194 wurden mit XbaI verdaut. Der pSK+ Vektor wurde dann mit Kälberdarm alkalischer Phos phatase behandelt und die beiden Plasmide wurden zusammen ligiert. Der Ligationsmix wurde verwendet, um den E. coli Stamm DH5α zu transformieren und die Transformanten wurden auf LB-Platten, welche Ampicilin (100 μg/ml) und Xgal enthielten, selektiert. Das Plasmid wurde aus einigen "weißen Kolonien" aufgereinigt und ein Chimer, welches sowohl pE194 als auch pSK+ umfasste, wurde durch eine Restriktionsenzymverdauung, gefolgt von einer Gelelektrophorese identifiziert. Das Plasmid wurde mit HindIII und NotI verdaut. Das Fragment, welches das pE194 Replicon umfasste, wurde dann Gel-aufgereinigt und ligiert mit dem Gel-aufgereinigten dalΔ Genfragment (HindIII-NotI). Der Ligationsmix wurde verwendet, um den bac-1 Stamm Bacillus subtilis 1A758 (Bacillus Stock Center, Columbus, OH) zu transformieren und die Transformanten wurden auf Tryptonblutagarbasis (TBAB) plus Erythromycin (5 μg/ml)-Platten selektiert und bei der permissiven Temperatur von 34°C wachsen gelassen. Plasmid-DNA wurde aus fünf Erythromycin-resistenten Transformanten aufgereinigt und durch eine Restriktionsenzymverdauung/Gelelektrophorese analysiert. Ein Plasmid wurde identifiziert, welches dem pE194, welches das dal-deletierte Fragment enthält, entsprach. Der Stamm, welcher dieses Plasmid beherbergte, wurde nachfolgend für die Einführung der dal Deletion in das Chromosom über eine homologe Rekombination verwendet.
  • Um das erste Cross-Over zu erhalten (Integration des dal Deletionsplasmids in das dal Gen auf dem Chromosom) wurde der transformierte Stamm auf eine TBAB-Platte, welche D-Alanin (0,1 mg/ml) und Erythromycin (5 μg/ml) enthielt, ausgestrichen und über Nacht bei der nicht-permissiven Temperatur von 45°C wachsen gelassen. Eine große Kolonie wurde unter den gleichen Bedingungen wieder ausgestrichen, wodurch eine homologe Population von Zellen gewonnen wurde, welche das Temperatur-sensitive Plasmid enthielt, welches in das dal Gen auf dem Chromosom integriert war. Bei der nicht-permissiven Temperatur waren lediglich Zellen, welche das Plasmid in dem Chromosom enthalten, in der Lage, auf Erythromycin zu wachsen, da das Plasmid nicht in der Lage war, sich zu replizieren. Um das zweite Cross-Over-Ereignis (resultierend in einem Ausschnei den des Plasmids aus dem Chromosom, welches die deletierte Version des dal Gens hinterlässt) zu erhalten, wurde eine „loopful" von Zellen in 20 ml Luria-Brühe, ergänzt mit D-Alanin (0,1 mg/ml) transferiert und bis zur späten Log-Phase wachsen gelassen, ohne eine Selektion bei der permissiven Temperatur von 34°C, um eine Funktion des Replikationsursprungs und das Vorkommen des zweiten Cross-Over-Ereignisses zu verhindern. Die Zellen wurden 4 weitere Mal (1/100-Verdünnung, jeder Transfer) transferiert, um dem Plasmid zu ermöglichen, sich aus dem Chromosom auszuschneiden und aus der Population auszusekretieren. Schließlich wurden die Zellen für Einzelkolonien bei 34°C auf TBAB-Platten, ergänzt mit D-Alanin (0,1 mg/ml) ausplattiert und Replik-ausplattiert auf TBAB-Platten ohne D-Alanin (0,1 mg/ml) und TBAB-Platten mit D-Alanin (0,1 mg/ml) und Erythromycin (5 μg/ml), um Kolonien zu erzielen, welche dal- und ermS waren. Zwei von 50 Kolonien erzielten diesen Phänotyp. Der resultierende Stamm wurde Bacillus subtilis BW96 genannt, ein bac-1, dal- Stamm.
  • (B) Einführen von pLS20 und pBC16 in den bac-1, dal-deletierten Bacillus subtilis Stamm, um den Konjugations-befähigten Donorstamm Bacillus subtilis BW154 zu erzielen.
  • Es wurde ein Donorstamm ausgewählt zum Einführen der Plasmide pLS20 und pBC16 in Bacillus subtilis BW96, wobei der Donorstamm die folgenden Charaktermerkmale besitzen sollte: Ein im Grunde Erythromycin-sensitiver Bacillus subtilis Stamm (um eine Gegenselektion fegen den Donorstamm bereitzustellen), welcher sowohl pLS20 als pBC16 enthält. Ein dal-deletierter Bacillus subtilis Stamm, welcher pLS20 und pBC16 enthält, wurde als ein geeigneter Donorstamm ausgewählt, welcher wie folgt konstruiert wurde: Bacillus subtilis DN1686 (U.S. Patent Nr. 4,920,048) wurde mit pHV1248 (Petit et al. 1990, Journal of Bacteriology 172: 6736–6740) transformiert, um die Zellen Erythromycinresistent zu machen. Das konjugative Element pLS20 wurde in den Bacillus subtilis DN1686 (pHV1248) Stamm entlang mit pBC16 transferiert durch eine Konjugation mit Bacillus subtilis (natto) 3335 UM8 (Koehler und Thorne, 1987, su pra). Die Transkonjuganten wurden als Tetracyclin- und Erythromycin-resistente Kolonien selektiert, eine dal Deletion besitzend. Kolonien, welche pLS20 trugen, wurden durch ihre Fähigkeit, pBC16 auf andere Bacillus subtilis Stämme durch Konjugation zu transferieren, erzielt. Schließlich wurde der konjugative Stamm auf pHV12 48 „cured" durch Erhöhen der Temperatur auf 50°C, welches den Donorstamm: Bacillus subtilis DN1686, enthaltend pLS20 und pBC16, erzielte.
  • Um diese Plasmide in Bacillus subtilis BW96 einzuführen, musste ein Gegenselektionsschema vollzogen werden, und deshalb wurde Bacillus subtilis BW96 mit einem Temperatur-sensitiven Plasmid pSK+/pE194, welches eine Erythromycin-Resistenz überträgt, transformiert, welches nachfolgend durch ein Wachstum bei einer nicht-permissiven Temperatur entfernt werden konnte. Die pLS20 und pBC16 Plasmide wurden von Bacillus subtilis DN1686, welcher pLS20 und pBC16 enthielt, mobilisiert in Bacillus subtilis BW96 (pSK+/pE194 beherbergend) gemäß der folgenden Vorgehensweise. Eine „loopful" von jedem Zelltyp wurde auf einer TBAB-Platte, ergänzt mit D-Alanin (50 μg/ml), zusammengemischt und bei 33°C für 5 Stunden inkubiert. Die Zellen wurden von der Platte gekratzt und in 1 ml LB-Medium transformiert. Die Zellen wurden bei verschiedenen Verdünnungen auf TBAB-Platten, ergänzt mit Tetracyclin (10 μg/ml), Erythromycin (5 μg/ml) und D-Alanin (50 μg/ml), ausgebreitet und bei 34°C wachsen gelassen, um Rezipientenzellen zu selektieren, welche pBC16, und in vielen Fällen ebenso pLS20, erwerben. Um zu testen, ob pLS20 ebenfalls in beliebigen der Transkonjuganten vorhanden war, wurden zehn Kolonien auf ihre Fähigkeit hin überprüft, pBC16 in Bacillus subtilis PL1801 zu transferieren. Bacillus subtilis PL1801 ist Bacillus subtilis 168 (Bacillus Stock Center, Colombos, OH) mit Deletionen der Gene apr und npr. Es kann jedoch ebenfalls Bacillus subtilis 168 verwendet werden. Donatoren, welche in der Lage sind, pBC16 zu mobilisieren, müssen ebenfalls pLS20 enthalten. Sowie ein Konjugationsbefähigter Stamm identifiziert wurde (Bacillus subtilis bac-1, dal-, enthaltend pL20 plus pBC16 plus pSK+/pE194) identifiziert wurde, wurde das pSK+/pE194 Plasmid von dem Stamm durch Verbreiten der Zellen in LB-Medium, ergänzt mit Tetracyclin (5 μg/ml) und D-Alanin (50 μg/ml) über Nacht bei 45°C, ausplattiert für Einzelkolonien bei 33°C auf TBAB-Platten, ergänzt mit D-Alanin (50 μg/ml) „cured" und Erythromycin-sensitive Kolonien wurden identifiziert. Diese Vorgehensweise erzielte Bacillus subtilis BW154, welcher Bacillus subtilis bac-1, dal- ist, enthaltend pLS20 und pBC16.
  • Eine Zusammenfassung der Bacillus Stämme und Plasmide wird in Tabelle I präsentiert. Tabelle I: Bakterienstämme und Plasmide Bacillus subtilis Stämme:
    B. subtilis (natto) pLS20
    DN1686 dal-
    DN1280 dal-
    MT101 DN1280 (pXO503)
    1A758 168 bac-1 (Bacillus Stock Center, Columbus, Ohio)
    BW96 1A758 dalΔ
    BW97 1A758 dalΔ::cat (pXO503)
    BW99 1A758 dalΔ (pPL2541-tet)
    BW100 1A758 dalΔ (pXO503), (pPL2541-tet)
    PL1801 aprΔ, nprΔ
    Plasmide:
    pBC 16 Mob+, Tcr
    pE 194 Temperatur-sensitiv
    pLS2U Tra+
    pXO503 Tra+, MLSr (= pLS20::Tn917)
    pPL2541-tet Mob+, Tcr (pE194 ts ori)
    pCAsub2 Mob+, Cmr, Apr, (pE194 ts ori)
    pSK+/pE194 Emr, Apr, Temperatur-sensitiv
    pShv2 Tra+, Emr, Cmr, Temperatur-sensitiv
    pHV1248 Emr, Temperatur-sensitiv
  • Tra+ impliziert, dass das Plasmid auf einen beliebigen Bacillus subtilis Stamm die Fähigkeit zu konjugieren überträgt, das ist, dass das Plasmid alle Funktionen zum Mobilisieren eines konjugationsfähigen Plasmids von der Donor- auf eine Rezipientenzelle kodiert.
  • Mob+ impliziert, dass ein Plasmid in der Lage ist, über eine Konjugation durch einen Stamm, welcher ein Tra+ Plasmid (pLS20 oder pXO503) enthält, in der Lage ist, mobilisiert zu werden. Das Plasmid muss eine cis-wirkende Sequenz und ein Gen, welches ein trans-wirkendes Protein kodiert, enthalten (jeweils oriT und orf-beta, im Fall von pBC16) oder nur eine oriT Sequenz (in dem Fall von pPL254-tet, hier muss ebenfalls eine Plasmid-ergänzende orf-beta Funktion in trans, wie pBC16, in den Zellen vorhanden sein).
  • Beispiel 2: Deletion des spoIIAC Gens von Bacillus subtilis A164 (ATCC 6051A)
  • Eine deletierte Version des spoIIAC Gens, welches Sigma F kodiert, welches den Zellen erlaubt, durch das Stadium II der Sporulation zu laufen, wurde durch ein Spleißen durch eine Überlappungsextension ("splicing by overlap extension", SOE)-Technik (Horton et al., 1989, Gene 77: 61–68) geschaffen. Bacillus subtilis A164 (ATCC 6051A) chromosomale DNA wurde durch das Verfahren von Pitcher et al., 1989, supra, erhalten. Die Primer 5 und 6, unten gezeigt, wurden für die PCR-Amplifikation einer Region von Bacillus subtilis A164 chromosomaler DNA, sich ausdehnend von 205 Nukleotiden-stromaufwärts des ATG-Startcodons des spoIIAC Gens bis 209 Nukleotiden stromabwärts des ATG-Starts. Die unterstrichenen Nukleotide des Stromaufwärts-Primers wurden hinzugefügt, um eine HindIII Stelle zu schaffen. Die unterstrichenen Nukleotide des Stromabwärts-Primers sind komplementär zu den Basen 507 bis 524 stromabwärts des ATG- Translations-Startcodons. Die Primer 7 und 8 wurden synthetisiert, um eine Region PCR zu amplifizieren, welche sich von 507 bis 884 Nukleotiden stromabwärts des ATG-Translations-Startcodons ausdehnt. Die unterstrichene Region des Primers 7 ist exakt komplementär zu der 3'-Hälfte des Primers 6, welcher verwendet wird, um das Stromaufwärts-Fragment zu amplifizieren.
    Primer 5: 5'-AAGCTTAGGCATTACAGATC-3' (SEQ ID NO: 5)
    Primer 6: 5'-CGGATCTCCGTCATTTTCCAGCCCGATGCAGCC-3' (SEQ ID NO: 6)
    Primer 7: 5'-GGCTGCATCGGGCTGGAAAATGACGGAGATCCG-3' (SEQ ID NO: 7)
    Primer 8: 5'-GATCACATCTTTCGGTGG-3' (SEQ ID NO: 8)
  • Die beiden Sätze Primer wurden verwendet, um die Stromaufwärts- und Stromabwärts- spoIIAC Fragmente in separaten PCR-Amplifikationen zu amplifizieren. Die Amplifikationsreaktionen (25 μl) enthielten die folgenden Komponenten: 200 ng Bacillus subtilis A164 chromosomale DNA, 0,5 μM von jedem Primer, 200 μM von jedem dATP, dCTP, dGTP und dTTP, 1 × Taq Polymerase-Puffer und 0,625 U Taq-DNA-Polymerase. Die Reaktionen wurden unter folgenden Bedingungen durchgeführt: 96°C für 3 Minuten, dann 30 Zyklen, jeder bei 96°C für 1 Minute, 50°C für 1 Minute und 72°C für 1 Minute, gefolgt von 3 Minuten bei 72°C, um die Zugabe eines terminalen Adeninrestes zu den amplifizierten Fragmenten zu versichern (Invitrogen, San Diego, CA). Die Amplifikation der erwarteten Produkte wurde durch eine Gelelektrophorese durch ein 1,5%-iges Agarosegel verifiziert.
  • Eine neue PCR-Mischung, welche 2,5 μl von jeder obigen-Amplifikationsreaktion enthielt, wurde dann unter den gleichen Bedingungen durchgeführt, jedoch lediglich die Primer 5 und 8 enthaltend, welches ein "gespleißtes" Fragment von 1089 Nukleotiden herstellte, welches das spoIIAC Gen mit fehlenden 298 inneren Nukleotide darstellt. Dieses Fragment wurde in den pCRII Vektor kloniert unter Verwenden des Invitrogen TA Coning Kits, gemäß den Instruktionen des Herstellers, ausgeschnitten als ein HixdIII-EcoRI-Fragment, und dann in HixdIII/EcoRI-verdauten pShv2 kloniert. pShv2 ist ein Shuttle-Vektor, welcher konstruiert wird durch ein Ligieren von XbaI-geschnittenem pBCSK+ (Stratagene, La Jolla, CA), enthaltend oriT von pUB110, mit XbaI-geschnittenem pE194 ( 1), gefolgt von einer Ligation von oriT von pUB110 als ein PCR-amplifiziertes Fragment, welches SstI-kompatible Enden enthält. Das oriT Fragment erlaubt eine Mobilisierung des Plasmids in Bacillus subtilis A164 durch pLS20-vermittelte Konjugation (Battisti et al., 1985, Journal of Bacteriology 162: 543–550). pShv2-ΔspoIIAC wurde in den Donorstamm Bacillus subtilis BW154 (Beispiel 1) transformiert. Bacillus subtilis BW154 (pShv2-ΔspoIIAC) wurde als ein Donorstamm verwendet, um den Shuttle-Vektor, welcher das deletierte Gen enthält, in Bacillus subtilis A164 einzuführen.
  • Ein Austausch des deletierten Gens mit dem intakten chromosomalen Gen wurde durch eine Konjugation von Bacillus subtilis BW154, welcher mit pShv2-ΔspoIIAC transformiert wurde, mit Bacillus subtilis A164, einer Selektion von Erythromycin-resistenten Transkonjuganten und einem Wachstum bei 45°C, bewirkt. Bei dieser Temperatur ist das pE194 Replikon inaktiv und die Zellen sind lediglich in der Lage, eine Erythromycin-Resistenz zu behalten, durch eine Campbell-Integration des Plasmids, welches das deletierte Gen an dem spoIIAC Locus enthält. Ein zweites rekombinantes Ereignis, welches in „loopout" der Vektor-DNA und einem Ersatz des intakten spoIIAC Gens durch das deletierte Gen resultiert, wurde durch ein Wachsen des Stammes für zwei Runden in LBMedium ohne antibiotische Selektion bei 34°C, eine Temperatur, welche permissiv für die Funktion des pE194 Replikons ist, bewirkt. Kolonien, in welchen ein Genersatz stattgefunden hat, wurden gemäß der folgenden Kriterien selektiert: 1) Abwesenheit von Erythromycin (erm)-Resistenz, kodiert durch den Shuttle, Vektor pShv2, 2) herabgesetzte Undurchsichtigkeit des Sporulationsmediums, welches ein Versagen zu sporulieren anzeigt, und 3) PCR-Amplifikation mit den Primern 5 und 8, um ein Fragment von 791 Nukleotiden anstelle von 1089 Nukleotiden zu erhalten, welches die undeletierte Version des Gens darstellt.
  • Beispiel 3: Deletion des npr Gens von Bacillus subtilis A164 ΔspoILAC
  • Ein Stromaufwärtsteil des neutralen Protease (nprE) Gens (Nukleotide 40–610 stromabwärts des GTG-Startcodons) wurde PCR-amplifiziert von Bacillus subtilis A164 ΔspoIIAC chromosomaler DNA, welche zubereitet wurde wie in Beispiel 2 beschrieben, unter Verwenden der Primer 9 und 10, unten gezeigt. Ein Stromabwärtsteil des nprE Gens (Nukleotide 1040–1560) wurde PCR-amplifiziert unter Verwenden der Primer 11 und 12, unten gezeigt. Die Primer 10 und 11 wurden so gestaltet, dass dort eine 15 Basenpaar lange Überlappung zwischen den beiden Fragmenten sein würde (angedeutet durch Unterstreichen). Die Amplifikationsreaktionen (25 μl) enthielten die gleichen Komponenten und wurden unter den gleichen Bedingungen, wie in Beispiel 2 spezifiziert, durchgeführt.
    Primer 9: 5'-CGTTTATGAGTTTATCAATC-3' (SEQ ID NO: 9)
    Primer 10: 5'-AGACTTCCCAGTTTGCAGGT-3' (SEQ ID NO: 10)
    Primer 11: 5'-CAAACTGGGAAGTCTCGACGGTTCATTCTTCTCTC-3' (SEQ ID NO: 11)
    Primer 12: 5'-TCCAACAGCATTCCAGGCTG-3' (SEQ ID NO: 12)
  • Die amplifizierten Stromaufwärts- und Stromabwärts-Fragmente wurden Gelaufgereinigt mit dem Qiax II-Kit, gemäß den Instruktionen des Herstellers (Qiagen, Chatsworth, CA). Eine neue PCR-Mischung (100 μl), welche ungefähr 20 ng von jedem aufgereinigten Fragment enthielt, wurde durchgeführt. Die SOE-Reaktion wurde unter den folgenden Bedingungen durchgeführt: Cyclen 1–3 in der Abwesenheit von Primern, um ein "gespleißtes" Fragment zu erzeugen und Cyclen 4–30 in der Gegenwart der Primer 9 und 12, unter Bedingungen, wie in Beispiel 2 spezifiziert. Das amplifizierte SOE-Fragment wurde in den PCRII-Vektor kloniert und durch Restriktionsanalyse verifiziert. Das Fragment wurde dann in pShv2 als ein BamHI-XhoI Fragment kloniert. Dieses Plasmid, pShv2-ΔnprE wurde in Bacillus subtilis BW154 transformiert, um einen geeigneten Donorstamm für eine Konjugation zu erzeugen. Das Plasmid wurde dann in Bacillus subtilis A164 ΔspoIIAC mobilisiert. Das ΔnprE Gen wurde in das Chromosom von Bacillus subtilis A164 ΔspoIIAC eingeführt durch eine Temperaturveränderung, wie in Beispiel 2 beschrieben. Ein nprE-Phänotyp wurde erzielt durch ein "patching" von erms Kolonien auf TBAB-Agarplatten, ergänzt mit 1% Nicht-Fetttrockenmilch und über Nacht bei 37°C inkubiert. (Ein nprE Stamm besaß eine bemerkenswerte reduzierte Klärungszone.) Die 430 Basenpaardeletion wurde durch eine PCR-Analyse auf chromosomaler DNA unter Verwenden der Primer 9 und 12 verifiziert.
  • Beispiel 4: Deletion des aprE Gens von Bacillus subtilis A164 ΔspoIIAC ΔnprE
  • SOE wurde verwendet, um eine deletierte Version des Bacillus subtilis aprE Gens zu schaffen, welches eine alkalische Subtilisinprotease kodiert. Ein Stromaufwärtsteil von aprE wurde PCR-amplifiziert unter Verwenden der Primer 13 und 14, unten gezeigt, von Bacillus subtilis A164 chromosomaler DNA, zubereitet wie in Beispiel 2 beschrieben, um ein Fragment zu schaffen, welches von 189 Nukleotiden stromaufwärts des Translations-Startcodons bis 328 Nukleotide strornabwärts des Starts ausdehnt. Die unterstrichenen Nukleotide des Primers 13 wurden eingeschlossen, um eine EcoRI-Stelle hinzuzufügen. Die unterstrichenen Nukleotide des Primers 14 wurden hinzugefügt, um eine Komplementarität zu dem Stromabwärts-PCR-Fragment bereitzustellen und um eine SaII-Stelle hinzuzufügen. Ein Stromabwärtsteil des aprE Gens wurde PCR-amplifiziert unter Verwenden der Primer 15 und 16, um ein Fragment zu schaffen, welches von 789 Nukleotiden bis 1306 Nukleotiden stromabwärts des aprE Translations-Startcodons ausdehnt. Unterstrichene Regionen der Primer 14 und 15 wurden hinzugefügt, um eine Komplementarität zwischen den Stromaufwärts- und den Stromabwärts-Fragmenten bereitzustellen. Die unterstrichenen Nukleotide des Primers 16 wurden eingeschlossen, um eine HindIII-Stelle hinzuzufügen. Die Amplifikationsre aktionen (25 μl) enthielten die gleichen Komponenten und wurden unter den gleichen Bedingungen, wie in Beispiel 2 beschrieben, durchgeführt.
    Primer 13: 5'-GCGAATTCTACCTAAATAGAGATAAAATC-3' (SEQ ID NO: 13)
    Primer 14: 5'-GTTTACCGCACCTACGTCGACCCTGTGTAGCCTTGA-3' (SEQ ID NO: 14)
    Primer 15: 5'-TCAAGGCTACACAGGGTCGACGTAGGTGCGGTAAAC-3' (SEQ ID NO: 15)
    Primer 16: 5'-GCAAGCTTGACAGAGAACAGAGAAGCCAG-3' (SEQ ID NO: 16)
  • Die amplifizierten Stromaufwärts- und Stromabwärts-Fragmente wurden aufgereinigt unter Verwenden des Qiaquick PCR-Aufreinigungskits, gemäß den Instruktionen des Herstellers (Qiagen, Chatsworth, CA). Die zwei aufgereinigten Fragmente wurden dann zusammen gespleißt unter Verwenden der Primer 13 und 16. Die Amplifikationsreaktion (50 μl) enthielt die gleichen Komponenten wie oben, mit der Ausnahme, dass die chromosomale DNA durch 2 μl von jedem des Stromaufwärts- und Stromabwärts-PCR-Produkts ersetzt wurde. Die Reaktionen wurden für 1 Cyclus bei 96°C für 3 Minuten (ohne die dNTPs und die Taq Polymerase) und dann für 30 Cyclen, jeder bei 96°C, für 1 Minute und 72°C für 1 Minute inkubiert. Dies resultierte in einer deletierten Version von aprE, welchem 460 Nukleotiden von der Kodierungsregion fehlten. Das Reaktionsprodukt wurde durch Agaroseelektrophorese isoliert, kloniert in pCRII, ausgeschnitten als ein EcoRI-HindIII Fragment und dann in EcoRI/HinDIII-verdautem pShv2 kloniert, um pShv2-ΔaprE zu erzielen. Dieses Plasmid wurde in den oben beschriebenen Donorstamm eingeführt, für einen konjugalen Transfer in Bacillus subtilis A164 ΔspoIIAC ΔnprE.
  • Ein Ersatz von aprE durch das deletierten Gen wurde wie oben für spoIIAC und nprE beschrieben bewirkt. Kolonien, in welchen aprE deletiert worden war, wur den selektiert durch eine Erythromycinsensitivität und reduzierten Klärungszonen auf Agarplatten mit einer Deckschicht, welche 1% Nicht-Fetttrockenmilch enthielt. Die Deletion von aprE wurde durch PCR bestätigt. Bacillus subtilis A164 ΔspoIIAC ΔnprE ΔaprE wird hierin als Bacillus subtilis A164 Δ3 bezeichnet.
  • Beispiel 5: Deletion des amyE Gens von Bacillus subtilis A164 ΔspoIIAC ΔnprE ΔaprE
  • Es wurde SOE verwendet, um eine deletierte Version des amyE Gens zu schaffen, welches die Bacillus subtilis alpha-Amylase kodiert. Ein Stromaufwärtsteil der amyE wurde PCR-amplifiziert von Bacillus subtilis A164 chromosomaler DNA unter Verwenden der Primer 17 und 18, unten gezeigt. Dies schaffte ein Fragment, welches sich von 421 Nukleotiden stromaufwärts des amyE Translations-Startcodons bis Nukleotid 77 der amyE Kodierungssequenz ausdehnte, welches eine SalI-Stelle an dem Stromaufwärtsende und SfiI und NotI-Stellen an dem Stromabwärtsende hinzufügte. Ein Stromabwärtsteil von amyE wurde PCRamplifiziert unter Verwenden der Primer 19 und 20, unten gezeigt. Dies schaffte ein Fragment, welches sich von Nukleotid 445 bis Nukleotid 953 der amyE Kodierungssequenz ausdehnte und fügte SfiI und NotI-Stellen an dem Stromaufwärtsende und eine HindIII-Stelle an dem Stromabwärtsende hinzu. Die Restriktionsstellen sind durch Unterstreichen angezeigt. Die Amplifikationsreaktionen (25 μl) enthielten die gleichen Komponenten und wurden unter den gleichen Bedingungen durchgeführt, wie in Beispiel 2 beschrieben.
  • Die zwei Fragmente wurden dann zusammen gespleißt durch eine PCR unter Verwenden der Primer 17 und 20. Die Amplifikationsreaktion (25 μl) enthielt die gleichen Komponenten wie oben, mit der Ausnahme, dass die chromosomale-DNA durch 2 μl von jedem der Stromaufwärts und Stromabwärts-PCR-Produkte ersetzt wurde. Die Reaktionen wurden inkubiert für 1 Cyclus bei 96°C für 3 Minuten (ohne die dNTPs und die Taq Polymerase) und dann bei 96°C für 1 Minute und 72°C für 1 Minute für 30 Cyclen. Diese Reaktion fusionierte die beiden Fragmente durch ein Überlappen in der komplementären Region zwischen den zwei (den SfiI- und NotI-Stellen) und resultierte in einem Fragment von amyE, welchem 367 Nukleotide von der Kodierungssequenz fehlten, und welches eine SfiI-Stelle und eine NotI-Stelle zwischen den zwei Teilen von amyE eingebaut hat. Das Reaktionsprodukt wurde isoliert durch eine Elektrophorese unter Verwenden eines 1%-igen Agarosegels gemäß Standardverfahren. Dieses Fragment wurde in pCRII gemäß der Instruktionen des Herstellers kloniert, um pCRII-ΔamyE zu erzielen.
    Primer 17: 5'-CGTCGACGCCTTTGCGGTAGTGGTGCTT-3' (SEQ ID NO: 17) (SalI Stelle unterstrichen)
    Primer 18: 5'-CGCGGCCGCAGGCCCTTAAGGCCAGAACCAAATGAA-3' (SEQ ID NO: 18) (SfiI und NotI Stellen unterstrichen)
    Primer 19: 5'-TGGCCTTAAGGGCCTGCGGCCGCGATTTCCAATG-3' (SEQ ID NO: 19) (SfiI und NotI Stellen unterstrichen)
    Primer 20: 5'-GAAGCTTCTTCATCATCATTGGCATACG-3' (SEQ ID NO: 20) (HindIII Stelle unterstrichen)
  • pShv2.1 wurde durch ein Verdauen von pShv2 mit NotI, einem Auffüllen der kohäsiven Enden mit Klenow-Fragment und dNTPs und einem Religieren des Plasmids geschaffen. Diese Vorgehensweise zerstörte die NotI-Erkennungsstelle von pShv2. Das deletierte amyE-Fragment wurde aus pCRII-ΔamyE als ein SalI/HindIII-Fragment ausgeschnitten und in SalI/HindIII-verdautem pShv2.1 kloniert, um pShv2.1-ΔamyE zu erzielen. Dieses Plasmid wurde in Bacillus subtilis BW154 eingeführt für einen konjugalen Transfer in Bacillus subtilis A164 ΔspoIIAC, ΔnprE, ΔaprE.
  • Ein Ersatz von amyE durch das deletierte Gen wurde wie oben für spoIIAC, nprE und aprE beschrieben bewirkt. Kolonien, in welchen ein Genersatz stattgefunden hatte, wurden durch Erythromycinsensitivität und die Unfähigkeit, eine Klärungszone auf Stärke-Azur überschichteten Platten zu bilden, selektiert. Die Deletion von amyE wurde durch eine PCR-Amplifikation des deletierten Gens von chromosomaler DNA unter Verblenden der Primer 17 und 20 bestätigt.
  • Beispiel 6: Deletion des sfrC Gens von Bacillus subtilis A164 ΔspoIIAC Δnpr ΔaprE ΔamyE, um Bacillus subtilis A164 ΔspoIIAC ΔnprE ΔaprE ΔamyE ΔsrfC herzustellen
  • Die Primer 21–24, unten gezeigt, wurden synthetisiert für die Schaffung einer Deletion in sfrC des Surfaktinoperons. Der Primer 21 überlappt eine existierende HindIII-Stelle (unterstrichen) in dem srfC Gen und erlaubt in Verbindung mit Primer 22 die PCR-Amplifikation einer Region, welche sich von 410 Nukleotiden bis 848 Nukleotiden stromabwärts des Translationsstarts von srfC ausdehnt. Der unterstrichene Teil des Primers 22 ist komplementär zu den Nukleotiden 1709– 1725 stromaufwärts des ATG-Startcodons. Die Primer 23 und 24 erlauben die PCR-Amplifikation einer Region von 1709–2212 Nukleotiden stromabwärts des Translationsstarts von srfC. Der unterstrichene Teil des Primers 23 ist komplementär zu den Nukleotiden 835–848 stromabwärts des ATG-Codons. Die Amplifikationsreaktionen (25 μl) enthielten die gleichen Komponenten und wurden unter den gleichen Bedingungen durchgeführt, wie in Beispiel 2 beschrieben.
    Primer 21: 5'-AAGCTTTGAATGGGTGTGG-3' (SEQ ID NO: 21)
    Primer 22: 5'-CCGCTTGTTCTTTCATCCCCTGAAACAACTGTACCG-3' (SEQ ID NO: 22)
    Primer 23: 5'-CAGTTGTTTCAGGGGATGAAAGAACAAGCGGCTG-3' (SEQ ID NO: 23)
    Primer 24: 5'-CTGACATGAGGCACTGAC-3' (SEQ ID NO: 24)
  • Die Primer und andere Kontaminanten wurden aus dem PCR-Produkt über eine Qiagen-PCR-Spinsäule (Qiagen, Chatsworth, CA) entfernt. Die Komplementarität zwischen den zwei PCR-erzeugten Fragmenten erlaubte ein Spleißen durch SOE. Die PCR-Produkte (2 μl oder ungefähr 50 mg von jedem) wurden zusammenge spleißt unter den gleichen PCR-Bedingungen wie oben beschrieben mit den "Außenprimern", den Primern 21 und 24, mit der Ausnahme, dass die ersten drei Cyclen vor der Zugabe der Primer durchgeführt wurden, um die überlappenden Regionen auszudehnen. Die SOE-Reaktion resultierte in einem 955 Nukleotidfragment, welchem 859 Nukleotide innerhalb des srfC Gens fehlten. Der deletierte Teil repräsentierte die Region von srfC, welche für die Zugabe der siebten Aminosäure Leucin zu dem Surfaktinmolekül verantwortlich ist und resultierte ferner in einer Rasterschubmutation, welche in einer Termination des Peptids vor der Thioesterase aktiven Stelle-ähnlichen Region resultiert, von der angenommen wird, dass sie in die Surfaktinfreisetzung aus dem srfC Protein involviert ist (Cosmina et al., 1993, supra).
  • Ein Ersatz von srfC durch das deletierte Gen wurde bewirkt, wie oben beschrieben für spoIIAC, nprE und aprE und amyE. Kolonien, in denen ein Genersatz stattgefunden hat, wurden selektiert durch Erythromycinsensitivität, die Unfähigkeit, eine Klärungszone auf Blutagarplatten herzustellen (Grossman et al., 1993, Journal of Bacteriology 175: 6203–6211) und dem Fehlen einer Schaumentwicklung bei einer Kultivierung für 4 Tage bei 37°C und 250 rpm in 250 ml-Schüttelflaschen, welche 50 ml PS-1-Medium enthielten, welches zusammengesetzt war aus 10% Sucrose, 10% Sojabohnenmehl, 0,42% wasserfreies Dinatriumphosphat und 0,5% Calciumcarbonat, ergänzt mit 5 μg Chloramphenicol pro ml. Die Deletion von srfC wurde durch eine PCR-Amplifikation des deletierten Gens von chromosomaler DNA unter Verwenden der Primer 21 und 24 bestätigt.
  • Bacillus subtilis A164 ΔspoIIAC ΔnprE ΔaprE ΔamyE ΔsrfC wird hierin als Bacillus subtilis A164 Δ5 bezeichnet.
  • Beispiel 7: Konstruktion von Bacillus subtilis A1630 ΔspoIIAC ΔnprE ΔaprE ΔamyE ΔsrfC
  • Bacillus subtilis A1630 ΔspoIIAC ΔaprE ΔaprE ΔamyE ΔsrfC wurde von Bacillus subtilis A1630 (NCFB 736, früher NCDO 736) konstruiert gemäß der gleichen Vorgehensweise, wie in den Beispielen 1–6 für Bacillus subtilis A164 ΔspoIIAC ΔaprE ΔaprE ΔamyE ΔsrfC (Bacillus subtilis A164 ΔspoIIAC ΔnprE ΔaprE ΔamyE ΔsrfC (Bacillus subtilis A164Δ5) beschrieben, unter Verwenden der Deletionsplasmide, welche für die Bacillus subtilis A164-Deletionen konstruiert wurde.
  • Bacillus subtilis A1630 ΔspoIIAC Δnpr Δapr ΔamyE ΔsrfC wird hierin als Bacillus subtilis A1630 Δ5 bezeichnet.
  • Beispiel 8: Konstruktion eines Vektors zur Integration einer amyQ Promotor-amyM Transkriptionskassette in Bacillus subtilis A164-Stämme
  • Eine Transkriptionsfusion wurde konstruiert, welches das NOVAMYLTM (amyM) Gen und seine native Ribosomenbindungsstelle unmittelbar stromabwärts des Promotors des amyQ Gens, welches eine Bacillus amyloliquefaciens Amylase (BANTM, Novo Nordisk A/S, Bagsvaerd, Dänemark) kodiert, platzierte. Der amyQ Promotor (BANTM Promotor) wurde PCR-amplifiziert unter Verwenden der Primer 25 und 26, unten aufgelistet, und der gleichen Bedingungen wie in Beispiel 2 oben, kloniert in den PCRII-Vektor, sequenziert, um eine fehlerfreie Amplifikation zu verifizieren und dann ligiert in die Mehrfachklonierungsstelle ("multiple cloning site") des E. coli-Bacillus subtilis Shuttlevektors pHP 13-ampMCS, der mit SfiI und SstI geschnitten worden war.
    Primer 25:
    5'-TTTGGCCTTAAGGGCCTGCAATCGATTGTTTGAGAAAAGAAG-3' (SfiI und ClaI Stellen jeweils unterstrichen) (SEQ ID NO: 25)
    Primer 26:
    5'-TTTGAGCTCATTTTCTTATACAAATTATATTTTACATATCAG-3' (SstI Stelle unterstrichen) (SEQ ID NO: 26)
  • pHP13-ampMCS, eine Variante von pHP13 (Haima et al., 1987, Molecular and General Genetics 209: 335–342) wurde konstruiert durch ein Schneiden von pUC9 mit AatII, stumpfendig gemacht („blunting") mit Klenow-Fragment und Desoxyribonukleotiden, dann einem Schneiden mit HindIII. Das größere 2,2 kb-Fragment wurde Gel-aufgereinigt mit einem Qiaex-Kit (Qiagen, Thousand Oaks, CA). pHP13 wurde mit HpaI geschnitten (welches in dem Erythromycin-Resistenzgen schneidet), stumpfendig gemacht, und dann mit HindIII geschnitten. Das größere 3,0 kb-Fragment, welches von pHP 13 freigesetzt wurde, wurde dann mit dem 2,1 kb pUC9-Fragment, welches den pUC9-Replikationsursprung und ein Ampicilin-Resistenzgen enthält, ligiert. Schließlich wurde pUC9 MCS durch eine neue MCS ersetzt, welche durch Annealing von 100 pmol von jedem der folgenden zwei Oligonukleotide 28 und 28 in 50 mM NaCl, 10 mM Tris pH 7,5 und 1 mM EDTA, einem Kochen für 5 Min und einem langsamen Abkühlen auf Raumtemperatur über einen 2 Stunden-Zeitraum geschaffen wurde.
    Oligo 27: 5'-AGCTAGGCCTTAAGGGCCCGGGACGTCGAGCTCAAGCTT GCGGCCGCCATGGTCGACG-3' (SEQ ID NO: 27)
    Oligo 28: 5'-AATTCGTCGACCATGGCGGCCGCAAGCTTGAGCTCGACGT CCCGGGCCCTTAAGGCC-3' (SEQ ID NO: 28)
  • Da die Primer, welche zum PCR-Amplifizieren des BANTM (amyQ) Promotors verwendet werden, SfiK- und SstI-Stellen einführten, war es erforderlich, eine SstI-Stelle stromaufwärts des NOVAMYLTM (amyM) offenen Leserahmens zu platzieren, um die Transkriptionsfusion zu konstruieren. Daher wurde ein 5'-PCR-Primer (Primer 27, unten aufgelistet), welcher einen SstI Linker enthielt, gestaltet, um 4 Nukleotide-stromaufwärts der NOVAMYLTM (amyM) Ribosombindestelle zu annealen. Dieser PCR-Primer lag unmittelbar stromabwärts und wurde daher von der Amplifikation ausgelassen eine potentielle Stammstruktur. Ein PCR-Primer (Primer 28, unten aufgelistet), welcher eine PvuII Stelle überlappte, wurde in Verbindung mit dem SstI-enthaltenden Primer verwendet, um unter den Bedin gungen, wie in Beispiel 2 beschrieben, und einem Verwenden von 200 ng pSJ3200 (2) als Template-DNA, ein 327 Nukleotidfragment, welches den N-Terminus von NOVAMYLTM kodiert, zu amplifizieren.
    Primer 29: 5'-CTGAGCTCTACG4A4GGAGACACACATGC-3' (SstI Stelle unterstrichen) (SEQ ID NO: 29)
    Primer 30: 5'-ACGCCCAGCTGTTTAAGATAAG-3' (PvuII Stelle unterstrichen (SEQ ID NO: 30)
  • Das Plasmid pSJ3200 (2) wurde durch ein Klonieren des NOVAMYLTM-Gens als ein PstI-BglII Fragment in pSJ2662 (3), einem Derivat von pUB110, welches eine größere MCS enthält, konstruiert.
  • Um das amyM Gen zu rekonstruieren, wurde das 327 Nukleotid PCRamplifizierte Fragment als ein SstI-PvuII Fragment ausgeschnitten und zusammen kloniert mit dem stromabwärts 2,2 kb PvuII-SstI Fragment (den letztgenannten Teil von amyM kodierend) in einer 3-Weg-Ligation in SstI-geschnittenem pUC118. Das rekonstruierte amyM Gen wurde dann als ein SstI-Fragment entfernt und stromabwärts des amyQ Promotors, welcher in pSJ2882-MCS enthalten ist, kloniert. 4 fasst diese Klonierungsschritte zusammen. pSJ2882-MCS ist abgeleitet von pHO13 (Haima et al., 1987, Molecular General Genetics 209: 335– 342), enthält jedoch eine SfcI-NotI-flankierte MCS und ebenfalls ein SstI 0,5 kb-Fragment, welches die oriT Region von pUB110 enthält. Dieses letztgenannte Fragment erlaubt eine Mobilisierung des Plasmids in Bacillus subtilis A164 durch pLS20-vermittelte Konjugation (Battisti et al., 1985, Journal of Bacteriology 162: 543–550).
  • Die Ligationsreaktionen wurden direkt in Bacillus subtilis PL1801 spoIIE transformiert. Die saubere Orientierung des amyM offenen Leserahmens relativ zu dem amyQ Promotor in pSJ2882-MCS wurde durch die Gegenwart oder Abwesenheit von Halo-umgebenen Kolonien, welche auf Stärke-Azur Platten, welche 5 μg Chloramphenol pro ml enthielten, bestimmt.
  • Um den Integrationsvektor pCAsub2 zu konstruieren, wurde das Neomycinresistenzgen von pPL2419 (5) ausgeschnitten durch eine Verdauung mit BclI und BglII und durch das Chloramphenicolacetyltransferase (cat) Gen-enthaltende BamHI-Fragment aus pMI1101 (Youngman et al., 1984, Plasmid 12: 1–9) ersetzt, um das Plasmid pPL2419-cat zu schaffen (BamHI-klebrige Enden sind kompatibel mit BclI- und BglII-klebrigen Enden). Dann wurde die Mehrfachklonierungsstelle (MCS) von pPL2419-cat ersetzt durch eine neue MCS, welche SfiI- und NotI-Stellen enthielt, welche geschaffen wurden durch ein Annealen der zwei Oligonukleotide, zusammen unten gezeigt (SEQ ID NO: 31 und SEQ ID NO: 32) durch ein Mischen von 100 pmol von jedem Oligo in 50 mM NaCl, 10 mM Tris pH 7,5, 1 mM EDTA, einem Kochen für 5 Minuten und einem langsamen Abkühlen auf Raumtemperatur über 2 Stunden.
    5'-AGCTTGGCCTTAAGGGCCCGATATCGGATCCGCGGCCGCT GCAGGTAC-3' (HindIII- und KpnI-kompatible Stellen sind unterstrichen, SfiI und Not I Stellen sind doppelt unterstrichen)
    5'-CTGCAGCGGCCGCGGATCCGATATCGGGCCCTTAAGGCCA-3' (SEQ ID NO: 32)
  • Die annealten Oligonukleotide (2 μl) wurden mit HindIII- und KpnIgeschnittenem pPL2419-cat (0,2 μg) legiert, um p2419MCS5-cat zu erzeugen. Dann wurden die Nukleotide 942 bis 1751 von amyE (GenBank Locus BSAMYL, Zugangsnummern V00101, J01547), PCR-amplifiziert, wie in Beispiel 2 beschrieben, unter Verwenden der unten beschriebenen Primer, welche NotI- und KpnI-(Asp718)-Linker (SEQ ID NO: 33 und SEQ ID NO: 34) enthielten und Bacillus subtilis Stamm A164 Δ5 chromosomaler DNA (zubereitet wie in Beispiel 2 beschrieben) als Template und in den NotI- und Asp718-verdauten p2419MCS5 eingefügt, wodurch der Integrationsvektor pCAsub2 (6) erzeugt wurde, CA-sub bezieht sich auf Chloramphenicol-Resistenz, Amylasehomologie, zur Verwendung in einem subtilis Wirt.
    5'-GCGGCCGCGATTTCCAATGAG-3' (Nukleotide, welche hinzugefügt wurden, um die NotI-Stelle zu schaffen, sind unterstrichen) (SEQ ID NO: 33)
    5'-GGTACCTGCATTTGCCAGCAC-3' (Nukleotide, welche hinzugefügt wurden, um die AspI-Stelle zu schaffen, sind unterstrichen) (SEQ ID NO: 34)
  • Eine Integration dieses Vektors allein in Bacillus subtilis 168 und einem Ausplattieren auf Stärke-Azur-überschichteten Platten zeigte eine vollständige Eliminierung der Amylaseaktivität.
  • Die amyQ Promotor – amyM Konstruktion wurde von pSJ2882-MCS als eine SfiI-NotI-Kassette entfernt und in pCAsub2 kloniert, welcher mit den gleichen Enzymen geschnitten wurde, um einen vollständigen Integrationsvektor pBAN-NOV (7) zu erzeugen.
  • Beispiel 9: Konstruktion des Bacillus subtilis Donorstammes BW100
  • Ein geeigneter Donorstrang wurde konstruiert, welcher in der Lage war, ein pE194-basiertes "Slave"-Integrationsplasmid, wie pCAsub2 (eine Chloramphenicolresistenz übertragend und oriT enthaltend), beschrieben in Beispiel 8, beizubehalten und zu mobilisieren. Solch ein Donorstamm sollte die folgenden Charaktermerkmale besitzen: bac-1-, dal-deletiert, pLS20 oder pXO503 und ein pE194-basiertes "Helfer"-Plasmid enthaltend (welches sowohl oriT als auch orf-beta zur Mobilisierung sowohl des "Helfers" als auch des "Slaves" und ebenfalls repF zum Bereitstellen eines repF Proteins in trans, um das "Slave"-Plasmid zu replizieren und als Plasmidreplikon beibehalten zu werden), (WO 91/09129). Der Stamm wurde wie folgt konstruiert: Bacillus subtilis BW96 wurde mit dem Helferplasmid pPL2541-tet (8) transformiert, welches eine Gegenauswahl gegen den Do norstamm bereitstellt, um Bacillus subtilis BW99 herzustellen. Als nächstes wurde das Plasmid pXO503 in Bacillus subtilis BW99 über eine Konjugation unter Verwenden von Bacillus subtilis BW97 als ein Donorstamm eingeführt. Bacillus subtilis BW97 wurde wie folgt konstruiert: Zuerst wurde das pXO503-Plasmid von einem Bacillus subtilis MT101-Donorstamm in den bac-1 Stamm Bacillus subtilis 1A758 mobilisiert und für die Transkonjuganten auf TBAB plus Erythromycin (5 μg/ml) Platten selektiert (der dal Donor wird nicht wachsen, da D-Alanin in dem Medium nicht enthalten ist). Dies erzielte einen bac-1 Stamm von Bacillus subtilis, welcher das pXO503 Plasmid beherbergte. Bacillus subtilis MT101 wird von Bacillus subtilis DN1280 erhalten, welches ein Derivat von Bacillus subtilis 168, welcher eine Deletion in dem dal Gen enthält, ist (Diderichse, In A. T. Ganesan und J. A. Hoch, Herausgeber, Bacillus Molecular Genetics and Biotechnology Applications, Academic Press, Inc., New York, 1986).
  • Als nächstes wurde die cat Genkassette (Chloramphenicolresistenz übertragend), welche durch BamHI-Stellen flankiert ist, beschrieben in Beispiel 8, in die Bam-HI-Stelle des pCRII-dalΔ Plasmids eingefügt. Dieses Plasmid wurde mit ScaI linearisiert und in den bac-1 Stamm transformiert, welcher das Konjugationsplasmid pXO503 enthielt, selektierend für eine Chloramphenicolresistenz (über doppelte Cross-over homologe Rekombination) auf TBAB plus D-Alanin (0,1 mg/ml) plus Chloramphenicol (5 μg/ml), welches Bacillus subtilis BW97 erzielte, ein bac-1, dalΔ::cat Konjugations-befähigter Donorstamm. Schließlich wurde Bacillus subtilis BW97 mit Bacillus subtilis BW99, welcher pPL2541-tet enthält, welches für Transkonjuganten auf TBAB-Platten plus D-Alanin (0,1 mg/ml) plus Tetracyclin (10 μg/ml) plus Erythromycin (5 μg/ml) selektiert, wodurch der Donorstamm Bacillus subtilis BW100 erzielt wurde, ein bac-1, dal-deletierter Bacillus subtilis Stamm; welcher pXO503 und das Helferplasmid pPL2541-tet enthält.
  • Beispiel 10: Integration und Amplifikation der amyQ Promotor – amyM Kassette in Bacillus subtilis A164 Stämmen
  • Der Bacillus subtilis BW100 Dunorstamm, beschrieben in Beispiel 9, welcher die amyQ Promotor – amyM Kassette in pBAN-NOV enthält, ebenso wie das Helferplasmid pPL2541-tet wurde durch eine pLS20-vermittelte Konjugation konjugiert (Battisti et al., 1985, supra) mit den Bacillus subtilis A164 Δ3 und Bacillus subtilis A164 Δ5 Stämmen.
  • Bacillus subtilis A164 Δ3 und Δ5 Transkonjuganten wurden dann in 125 ml Schüttelflaschen, welche 10 ml LB-Brühe, ergänzt mit 5 μg Chloramphenicol pro ml enthielten bei 45°C für zwei aufeinanderfolgende Passagen wachsen gelassen und dann bei 45°C ausplattiert, um die Replikation des pPL2541-tet Helferplasmids zu blockieren und um für eine Integration des Integrationsplasmids an dem amyE Locus zu selektieren. Integranten wurden dann ausplattiert bei sukzessiv höheren Chloramphenicolkonzentrationen von 15, 30, 45, 60 und 80 μg Chloramphenicol pro ml, um für eine Amplifikation der Chloramphenicol-enthaltenden amyQ Promotor – amyM Kassette zu selektieren.
  • Beispiel 11: Schüttelflaschenkultivierung von Bacillus subtilis A164 Stämmen, welche mit der amyQ Promotor – amyM Kassette transformiert sind
  • Bacillus subtilis A164 Δ3 und Bacillus subtilis A164 Δ5, welche chromosomal integrierte Kopien der amyQ Promotor – amyM Kassette oder dem Integrationsvektor alleine enthalten, wurden für 4 Tage bei 37°C und 250 rpm in 250 ml Schüttelflaschen, welche 50 ml PS-1-Medium enthielten, kultiviert.
  • Die Kulturüberstände wurden bei ungefähr 50 und 100 Stunden gesammelt, mit 2 mM-PMSF-Endkonzentration behandelt und gefroren. Um eine NOVAMYLTM Expression zu bewerten, wurden die Überstände mit einem gleichen Volumen von 2 × Laemmli-Ladepuffer gemischt, unmittelbar gekocht und auf 14%-ige oder 8– 16%-ige Acrylamid-TRIS-Glycingele, bezogen aus einer kommerziellen Quelle (NOVEX, San Diego, CA) geladen. Bekannte Mengen von einem NOVAMYLTM Standard wurden ebenfalls auf dasselbe Gel geladen, um die hergestellte Menge an NOVAMYLTM zu bewerten. In einigen Fällen wurde der NOVAMYLTM Titer unter Verwenden von Maltotriose als Substrat bestimmt. Speziell wird eine Probe des Enzyms mit Maltotriose bei pH 5,0 und 37°C für 30 Minuten inkubiert. Die Reaktion wird dann gestoppt durch ein Einstellen des pH bei ungefähr 11. Die Menge an hergestellter Glucose aus dem Zusammenbruch von Maltotriose zu Glucose und Maltose wird dann mit Glucosedehydrogenase und NADH bei 340 nm unter Standardbedingungen gemessen. Bekannte Mengen von NOVAMYLTM Standard (Novo Nordisk, A/S, Bagsvaerd, Dänemark) werden ebenfalls mitlaufen gelassen. Die Resultate zeigten, dass der Stamm nicht in sfrC deletiert war und 8 cm Schaumkrone, verglichen zu einer 0,5 cm Schaumkrone für den srfC-deletierten Stamm nach 2 Tagen Kultivierung besaß. Das Fehlen der Herstellung von Surfaktin durch den srfC-deletierten Stamm wurde bestätigt durch das Fehlen einer Hämolyse auf den Blutagarplatten. Die Resultate zeigten ferner an, dass beide Stämme gleiche Mengen NOVAMYLTM herstellten, jedoch der srfC deletierte Stamm eine merkliche Reduktion einer Schaumentwicklung aufwies, verglichen mit dem nicht-deletierten Stamm.
  • Beispiel 12: Fermentation von Bacillus subtilis A164 Stämmen
  • Bacillus subtilis A164 Δ3 und Bacillus subtilis A164 Δ5, integriert/amplifiziert und integriert/amplifiziert mit dem Slave-Plasmid pCAsub2 alleine, wurden jeder in einem 3 Liter Fermentor kultiviert, weicher 1,5 Liter Medium enthielt, welches zusammengesetzt war sowohl aus typischen Kohlenstoff- und Stickstoffquellen als auch aus Mineralsalzen, Spurenelementen und mindestens 3 ml Antischaum ("antifoam") (Sigma gemischter Typ 289, Sigma Chemical Company, St. Louis, MO) pro-Liter Medium. Die Kulturen wurden mit Luft bei 1,5 Litern pro Minute versprengt und mit zwei Standard Rushtonturbinen bei 1000 bis 1500 rpm bewegt. Die Fermentationen wurden bei Raumtemperatur zwischen 37°C und 39°C beibehalten.
  • Die Menge an Schaumentwicklung wurde quantitativ bewertet durch ein Messen des Flüssigkeitsvolumens, welches aus dem Fermentor durch die Wirkung der Schaumentwicklung herausgetragen wurde. NOVAMYLTM-Aktivität wurde, wie in Beispiel 11 beschrieben, gemessen.
  • Die Resultate zeigten an, dass Bacillus subtilis A164 Δ3 innerhalb von 5 Stunden der Fermentation begann, Schaum herzustellen, wobei der Schaum die 1,5 Liter Kopfraum des Fermentors füllte und begann, über die Ausströmlinien überzulaufen in eine maßeingeteilte Fängerflasche. Innerhalb von 10 bis 20 Stunden gingen typischerweise zwischen 700 bis 900 ml Flüssigkeitsvolumen aus dem Fermentor durch ein Überschäumen verloren. Nach diesem Zeitraum stabilisierte sich das System, jedoch lediglich 45% bis 60% des Originalvolumens verblieben in dem Fermentor, welches den Stamm für eine Herstellung in großem Maßstab ungeeignet macht. Bei ähnliche Fermentationen mit Bacillus subtilis A164 Δ5 geschah kein Verlust irgendeines Volumens aufgrund einer Schaumbildung während mindestens 50 Stunden Fermentation. Die Menge von NOVAMYLTM, welche pro ml hergestellt wurde, war bei beiden Stämmen gleich.
  • SEQUENZPROTOKOLL
    Figure 00470001
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  • Figure 00500001
  • Figure 00510001
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  • Figure 00540001
  • Figure 00550001

Claims (19)

  1. Verfahren zum Herstellen eines Polypeptids, umfassend: (a) Kultivieren einer Mutantenzelle von einer Bacillus Zelle unter Bedingungen, welche förderlich für die Herstellung des Polypeptids sind, in welchem (i) die Mutantenzelle eine erste Nukleinsäuresequenz, welche das Polypeptid kodiert, und eine zweite Nukleinsäuresequenz, umfassend eine Modifikation von mindestens einem der Gene, welche für die Herstellung eines Surfaktins oder einer Isoform hiervon verantwortlich sind, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus einem srfA, srfB, srfC, srfD und sfp-Gen, umfasst, (ii) die Mutantenzelle weniger des Surfactins oder der Isoform hiervon herstellt, als die Bacillus Zelle, wenn diese unter den gleichen Bedingungen kultiviert wird, und (iii) das Polypeptid heterolog zu der Bacillus Zelle ist; und (b) Isolieren des Polypeptids aus dem Kultivierungsmedium.
  2. Verfahren nach Anspruch 1, in welchem die Bacillus Zelle eine Bacillus alkalophilus, Bacillus a0myloliquefaciens, Bacillus brevis, Bacillus circulars, Bacillus coagulans, Bacillus firmus, Bacillus lautus, Bacillus lentus, Bacillus licheniformis, Bacillus megaterium, Bacillus pumilus, Bacillus stearothermophilus, Bacillus subtilis oder Bacillus thuringiensis Zelle ist.
  3. Verfahren nach Anspruch 2, in welchem die Bacillus Zelle eine Bacillus subtilis Zelle ist.
  4. Verfahren nach Anspruch 3, in welchem die Bacillus subtilis Zelle Bacillus subtilis ATCC 6051 oder Bacillus subtilis ATCC 6051A ist.
  5. Verfahren nach Anspruch 3, in welchem die Bacillus subtilis Zelle Bacillus subtilis NCFB 736 ist.
  6. Verfahren nach Anspruch 1, in welchem das Gen srfA ist.
  7. Verfahren nach Anspruch 1, in welchem das Gen srfB ist.
  8. Verfahren nach Anspruch 1, in welchem das Gen srfC ist.
  9. Verfahren nach Anspruch 1, in welchem das Gen srfD ist.
  10. Verfahren nach Anspruch 1, in welchem das Gen sfp ist.
  11. Verfahren nach Anspruch 1, in welchem die Mutantenzelle mindestens ungefähr 25% weniger des Surfaktins oder der Isoform hiervon herstellt, als die Bacillus Zelle, wenn diese unter identischen Bedingungen kultiviert wird.
  12. Verfahren nach Anspruch 1, in welchem die Modifikation in der Herstellung einer nicht-schäumenden Variante des Surfaktins oder der Isoform hiervon resultiert.
  13. Verfahren nach Anspruch 1, in welchem die Mutantenzelle ferner eine Modifikation von einem oder mehreren Gen(en), welche eine Protease kodieren, umfasst.
  14. Verfahren nach Anspruch 13, in welchem die Gene nprE und/oder aprE sind.
  15. Verfahren nach Anspruch 1, in welchem die Mutantenzelle ferner eine Modifikation der spoIIAC und/oder amyE Gene umfasst.
  16. Mutante einer entsprechenden Bacillus Elternzelle, umfassend mindestens zwei Kopien einer ersten Nukleinsäuresequenz, welche ein heterologes Polypeptid kodiert, und eine zweite Nukleinsäuresequenz, umfassend eine Modifikation von mindestens einem der Gene, welche für die Herstellung eines Surfaktins oder einer Isoform hiervon verantwortlich sind, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus einem srf4, srfB, srfC, srfD und sfp Gens, wobei die Mutantenzelle weniger des Surfaktins oder der Isoform hiervon herstellt, als die Bacillus Zelle, wenn diese unter den gleichen Bedingungen kultiviert wird.
  17. Mutante einer Bacillus Zelle, umfassend mindestens zwei Kopien einer ersten Nukleinsäuresequenz, welche ein natives Polypeptid kodiert, und einer zweiten Nukleinsäuresequenz, umfassend eine Modifikation von mindestens einem der Gene, welche verantwortlich für die Herstellung eines Surfaktins oder einer Isoform hiervon verantwortlich sind, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus srfA, srfB, srfC, srfD und sfp Gens, wobei die Mutantenzelle weniger des Surfaktins oder der Isoform hiervon herstellt, als die Bacillus Zelle, wenn diese unter den gleichen Bedingungen kultiviert wird.
  18. Verfahren zum Erhalten der Mutante nach Anspruch 16, umfassend: (a) Einführen in die Bacillus Zelle einer ersten Nukleinsäuresequenz, umfassend eine Modifikation von mindestens einem der Gene, welche verantwortlich für die Herstellung eines Surfaktins oder einer Isoform hiervon sind, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus einem srfA, srfB, srfC, srfD und sfp Gens und mindestens zwei Kopien einer zweiten Nuklein-säuresequenz, welche ein Polypeptid kodiert, welches heterolog zu der Bacillus Zelle ist; und (b) Identifizieren der Mutantenzelle aus Schritt (a), umfassend die Nukleinsäuresequenzen, wobei die Mutantenzelle weniger des Surfaktins oder der Isoform hiervon herstellt, als die Bacillus Elternzelle, wenn diese unter den gleichen Bedingungen kultiviert wird.
  19. Verfahren zum Erhalten der Mutantenzelle nach Anspruch 17, umfassend: (a) Einführen in die Bacillus Zelle einer ersten Nukleinsäuresequenz, umfassend eine Modifikation von mindestens einem der Gene, welche verantwortlich für die Herstellung eines Surfaktins oder einer Isoform hiervon sind, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus einem srfA, srfB, srfC, srfD und sfp Gens, und mindestens zwei Kopien einer zweiten Nukleinsäuresequenz, welche ein Polypeptid kodiert, welches nativ zu der Bacillus Zelle ist; und (b) Identifizieren der Mutante aus Schritt (a), umfassend die Nukleinsäuresequenzen, wobei die Mutantenzelle weniger des Surfaktins oder der Isoform hiervon herstellt, als die Bacillus Elternzelle, wenn diese unter den gleichen Bedingungen kultiviert wird.
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