BG60920B2 - Метод за стабилна ген амплификация на хромозомнаднк на прокариотични микроорганизми - Google Patents

Метод за стабилна ген амплификация на хромозомнаднк на прокариотични микроорганизми Download PDF

Info

Publication number
BG60920B2
BG60920B2 BG85832A BG8583288A BG60920B2 BG 60920 B2 BG60920 B2 BG 60920B2 BG 85832 A BG85832 A BG 85832A BG 8583288 A BG8583288 A BG 8583288A BG 60920 B2 BG60920 B2 BG 60920B2
Authority
BG
Bulgaria
Prior art keywords
dna
strain
gene
host cell
plasmid
Prior art date
Application number
BG85832A
Other languages
English (en)
Inventor
Eekelen Christiaan Van
Der Laan Johannes Van
Leonardus Mulleners
Original Assignee
Gist - Brocades B.V.
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Family has litigation
First worldwide family litigation filed litigation Critical https://patents.darts-ip.com/?family=8197582&utm_source=***_patent&utm_medium=platform_link&utm_campaign=public_patent_search&patent=BG60920(B2) "Global patent litigation dataset” by Darts-ip is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 International License.
Application filed by Gist - Brocades B.V. filed Critical Gist - Brocades B.V.
Publication of BG60920B2 publication Critical patent/BG60920B2/bg

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/24—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2)
    • C12N9/2402—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2) hydrolysing O- and S- glycosyl compounds (3.2.1)
    • C12N9/2405—Glucanases
    • C12N9/2408—Glucanases acting on alpha -1,4-glucosidic bonds
    • C12N9/2411—Amylases
    • C12N9/2414—Alpha-amylase (3.2.1.1.)
    • C12N9/2417—Alpha-amylase (3.2.1.1.) from microbiological source
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
    • C12N1/20—Bacteria; Culture media therefor
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/67—General methods for enhancing the expression
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/74—Vectors or expression systems specially adapted for prokaryotic hosts other than E. coli, e.g. Lactobacillus, Micromonospora
    • C12N15/75—Vectors or expression systems specially adapted for prokaryotic hosts other than E. coli, e.g. Lactobacillus, Micromonospora for Bacillus
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/87—Introduction of foreign genetic material using processes not otherwise provided for, e.g. co-transformation
    • C12N15/90—Stable introduction of foreign DNA into chromosome
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/48—Hydrolases (3) acting on peptide bonds (3.4)
    • C12N9/50—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25)
    • C12N9/52—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from bacteria or Archaea
    • C12N9/54—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from bacteria or Archaea bacteria being Bacillus

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Enzymes And Modification Thereof (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

Методът намира приложение в рекомбинантната днк технология за получаване на промишлено значими ензими. Постигната е устойчива интеграция най-малко надве копия днк структури като начин на генна амплификация чрез използване на комбинация от известни методики. Методът се осъществява чрез комбиниране на клетка гостоприемник, кодираща представляващия интерес полипептид с донорна клетка, която съдържанай-малко едно копие от днк последователност, кодираща същия полипептид при условия на трансформацияна клетката гостоприемник, с последваща селекция на трансформираните клетки.

Description

(54) МЕТОД ЗА СТАБИЛНА ГЕН АМПЛИФИКАЦИЯ НА ХРОМОЗОМНА ДНК НА ПРОКАРИОТИЧНИ МИКРООРГАНИЗМИ (57) Методът намира приложение в рекомбинантната ДНК технология за получаване на промишлено значими ензими. Постигната е устойчива интеграция най-малко на две копия ДНК структури като начин на ген амплификация чрез използване на комбинация от известни методики. Методът се осъществява чрез комбиниране на клетка гостоприемник, кодираща представляващия интерес полипептид с донорна клетка, която съдържа най-малко едно копие от ДНК последователност, кодираща същия полипептид при условия на трансформация на клетката гостоприемник, с последваща селекция на трансформираните клетки.
претенции, 10 фигури (54) МЕТОД ЗА СТАБИЛНА ГЕН АМПЛИФИКАЦИЯ НА ХРОМОЗОМНА ДНК ОТ ПРОКАРИОТИЧНИ МИКРООРГАНИЗМИ
Изобретението се отнася до метод за стабилна ген амплификация на хромозомна ДНК прокариотични микроорганизми, приложим в рекомбинантната ДНК-технология за получаване на промишлено значимии ензими.
Известни са няколко пътя за получаване на ензими, такива като алфа амилаза, неутрална пратеаза и алкална или серин протеаза от микроорганизми от род Bacillus с помощта на методите на класическата генетика - мутация и следващ подбор, а така също и чрез съвременните методи на молекулярната биология. В последния случай са описани няколко начина за получаване на големи количества ензими при експресия на хомоложни и хетероложни гени в проокариотни или еукариотни микроорганизми (1-4).
Един от начините за постигане на високо ниво на експресия на гена е да се осигури гена с ефективни регулаторни елементи. Друг начин, често използван в комбинация с първия е да се увеличи броя на копията на гена, който е от значение. Първоначално амплификацията се постига посредством инсерция на гена в мултикопийна екстрахромозомна ДНК молекула, например плазмид. Използването на плазмидите като вектори за експресия и амплификация на генетичната информация обаче има този недостатък, че са нестабилни. За производство в голям мащаб устойчивостта на амплифицирания ген е предпоставка за поддържане на продукция с висок добив от експресирания продукт, закодиран в амплифицирания ген. Нестабилността се изразява в две форми: сегрегационна неустойчивост, при която се появява загуба на плазмид по време на култивирането и структурна неустойчивост, при която част от плазмида се заличава.
Сегрегационната неустойчивост може да се прояви например, когато клетката-гостоприемник приютява вектор, носещ ген. който се свръхекспресира. Обикновено има селективен натиск към клетки, които са загубили способността да свръхекспресират гена, тъй като свръхекспресията влияе неблагоприятно на трансформираната клеткагостоприемник. Голямо количество метаболитна енергия се изразходва за свръхексп ресирания генен продукт,което влияе неблагоприятно върху конкурентоспособността на клетката в сравнение с клетките-гостоприемници, които не свръхекспресират по подобен начин.
Методът,използван за отчитане на сегрегационната неустойчивост, се състои в подбор на клетки, свързващи многокопийни плазмиди, които носят гени, придаващи им предимство спрямо съдържащата плазмид клетка, например - придаващи устойчивост спрямо антибиотик и след това към ферментационната среда се прибавя съответния антибиотик. Обаче при методите за продуцране в промишлен мащаб, антибиотиците не са подходящи за подбор.
Друг метод, използван за намаляване до минимум загубата на плазмид, дължаща се на сегрегационната неустойчивост, се състои в инсерция на гена, който е от функционална значимост за клетката-гостоприемник във векторна молекула /2/.
Този метод обаче не осигурява структурна устойчивост на вектора. Методиките, използвани за разрешаване на проблема за структурната неустойчивост на плазмидите, включват избягване на експресия на гена по време на фазата на експоненциален растеж, например чрез използване на регулиращи последователности, такива като чувствителни на температура е интеграция на екзогена ДНК в хромозомата на клетката-гостоприемник. Други методики пък включват избягване на употребата на автономно реплициращи се векторни молекули и вместо тях използват начини, благоприятстващи интегрирането на въведена в хромозомата на клетката-гостоприемник ДНК.
Методиките за постигане на интеграция на чужда ДНК в хромозомата на клеткатагостоприемник следва да включат хомоложна рекомбинация и нелегитимна рекомбинация. Съществуват два пътя за инсерция на ДНК последователности на специфични места върху хромозомата посредством хомоложна рекомбинация: Campbell — тип хомоложна рекомбинация и двойна реципрочна рекомбинация. илюстрирани на Фиг. 1А и 1В съответно. Трети път за въвеждане на ДНК последователности и хромозома е използването на механизма на двуетапно заместване, илюстриран на Фиг. 10. По принцип се използва Campbell - тип рекомбинация, но крайният резултат е хромозомна конструкция, която не съдържа дублирани последователности и по този начин няма единица, която да може да се амплифицира в рекомбинантната част на хромозомата. Поради това тя прилича на двойно реципрочна рекомбинация.
Освен използването на хомоложна рекомбинация за интеграция на чужда ДНК в хромозомата, възможно е също така ДНК да се интегрира чрез нелегитимна рекомбинация, илюстрирано на Фиг. 1Д. Липсата на тандемни дубликати в получената хромозомна последователност прави пътищата, показани на Фиг. 1А, IB, 1С и 1Д предпочитани за устойчиво въвеждане на ДНК-последователности в генома. Хромозомно интегрираните гени включват както хомоложни, така и хетероложни гени, при което увеличението на хромозомно интегрираната ДНК е в тандемен порядък. Тези хромозомно амплифицирани последователности са описани като нестабилни, въпреки че в някои случаи има съобщения, че са устойчиви.
Известно е интегрирането на екзогенна ДНК в хромозома на Bacillus subtilis /3/, a също така и на Anacystis nigulans /4/ и /5/. Известно е интегрирането посредством хомоложна рекомбинация на хетероложен ген, която е неустойчива когато е върху плазмиден вектор в хромозома на микроорганизъм /6/.
Амплификация на хромозомно интегрирани гени, както хомоложни, така и хетероложни също е описано в литературата /7/, /8/, /9/, /10/, /11/, /12/, /13/, /14/ и /15/ . Спонтанна амплификация в прокариотни клетки също е известно /16/.
Във всички изброени случаи амплификацията на хромозомно интегрирана ДНК е от порядъка на тандемно свързване. В литературата е описано обаче, че този тип хромозомна амплификация е неустойчива /17/.
Стабилизация на природно срещащи се амплифицирани гени, дължащо се на присъствието на други важни гени между тези амплифицирани последователности също е известно. Например от 9 до 10 копия на рибозомния РНК ген, срещащ се в Вас. subtilis, две тандемно разположени вериги са разделени от снопче тРНК гени /18/. В други случаи, природно срещащи се тандемно повтарящи се РНК оперони са заличени, както в Е. coli, така и в Вас. subtilis с малък ефект върху фенотипичните качества на организма /19/ и /20/.
Интегриране на плазмиди върху хромозома на Вас. subtilis посредством нелегитимирана рекомбинация при използването на вектора рЕ194 е известно от /21/ и /22/.
Известно е успешно клониране на някои гени за екзогенни ензими,такива като алфаамилазни гени на Вас. amyloliquefaciens /23/, В. Licheniformis /24/, В. stearothermophilus /25/ и /26/ и Вас. subtilis /27/; леванзахарозният ген на В. subtilis /28/, гените, кодиращи неутрални протеази на Вас. stearothermophilus /29/, Вас. amyloliquefaciens /30/ и Вас. subtilis /31/; гените, кодиращи серии или алкална протеаза на Вас. subtilis /32/, Вас. licheniformis 13Ъ1 и Вас. amyloliquefaciens /34/.
Известно е също за протопластна трансформация на някои видове грам положителни микроорганизми, напр. Вас. subtilis /35/. Подобни успешни опити са описани за трансформацията на протопласти от Вас. megaterium /36/, Вас. amyloliquefaciens /37/, Вас. thuringiensis /38/, Вас. sphaericus /39/ и Вас. larvae /40/. /В същата публикация се съобщава ии за неуспешни опити с Вас. popillae./ Успешни са опитите с Вас. polymyxa, Вас. licheniformis. Вас. macerans и Вас. laterosporus. но не и с Вас. coagulaus. Вас. cereus и Вас. pumilus, макар че е наблюдавано образуването на добри протопласти /41/.
Други методи за интродукция на ДНК в протопласти включва фузия с ДНК-съдържащи липозоми /42/ иили фузия с лесно трансформируем организъм като междинна клетка-гостоприемник /43/.
Недостатък на всички изброени методи е, че не осигуряват стабилна експресия на гена за получаване на желания продукт.
Задача на изобретението е да се създаде метод за устойчива амплификация на гени в хромозомна ДНК на прокариотични клеткигостоприемници, който да осигурява стабилна експресия на гена за получаване на желания продукт.
Задачата се решава чрез метод, съгласно който най-малко две копия на ДНК последователност, кодираща представляващия интерес полипептид, са устойчиво интегрирани в хромозомата на клетка-гостоприемник. Устойчивото съхранение на екзогенната ДНК-последователност се постига посредством интегриране на две или повече копия на последователността в хромозомата на клетка-гостоприемник, при което копията са разделени с помощта на ендогенни хромозомни ДНК-последователности.
На Фиг. 1А до 1Д са представени схематично четири пътя за интегриране на екстрахромозомни ДНК последователности в хромозома на прокариотични микроорганизми.
Т представлява планова последователност, т. е. последователности от ДНК, налични в хромозомата и плазмида. между които може да се осъществи хомоложна рекомбинация.
S заема място за ДНК последователноста, която трябва да бъде интегрирана в хромозомата.
М заема място за маркерна генна последователност, използвана за селекция на рекомбинантния вид.
Фиг. 2А и 2В представляват схематична илюстрация на два пътя за получаване на устойчива ген амплификация в прокариотична хромозома.
Фиг. 3 илюстрира резултатите от хистидин /MOPS гел електрофореза, осъществена на супернатанта от култури на Вас. subtilis ДВ104, съдържаща съответно pUBl 10 и рМ58, сравнени с няколко субтилизини:
Линия I: Carlsbeig субтилизин
Линия 2: Bacillus РВ92 протеаза
Линия 3: Bacillus subtilis субтилизин Линия 4: Вас. subtilis ДВ104 /рМ58/ Линия 5: Вас. subtilis ДВ104 /pLfBl 10/ Фиг. 4 илюстрира рестрикционната карта на плазмда рМ58, като на горната част е показана стратегията за определяне на последователността. Непрекъснатите линии със стрелки сочат клонирани фрагменти във фага М13 с векторите мрЮ, мр!1 и мр18. Долната част на фигурата илюстрира стратегията за определяне на последователността при използване на десет олигонуклеотида, разположени на равни разстояния върху протеазния ген.
Фиг. 5 илюстрира нуклеотидна последователност на кодиращата нишка, която се намира в корелация с аминокиселинната последователност на Вас. РВ92 серин протеазата. Показани са също промотори /Р и Р2/, рибозома-свързващия сайт /rbs/ и терминалните региони /term/ на ДНК последователността. Номерираните непрекъснати линии илюстрират разположението на десетте олигонуклеотида, използвани за определяне на последователността.
Фиг. 6А илюстрира строежа на плазмид рЕ194-пео.
Фиг. 6В илюстрира строежа на плазмид рМАХ-4.
Фиг. 7А: дайджести, приготвени с рестрикционната ендонуклеаза Hind III от хромозомна ДНК на щама РВ92, РВТ109 и РВТ108, които са подложени на електрофореза върху 0,5% агарозен гел, прехвърлен върху нитроцелулоза по описан от Southern начин и хибридизиран с белязана с i2P и преведена в рМ58 ДНК. Фигурата илюстрира една авторадиография.
Фигурите 7В и 7С илюстрират случаите на интегриране, проявяващи се при хомолоожна /В/ рекомбинация и при нелегитимирана /С/ рекомбинация между рМАХ-4 и Bacillus РВ92 хромозома.
Фиг. 8 илюстрира строежа на интегрирания вектор pElatB
Фиг. 9А показва интегрирането на плазмида pElatB в хромозома на Вас. licheniformis щам T9, резултиращ в Вас. licheniformis щам ТВ13.
Фиг. 9В илюстрира хромозомната рекомбинация на В. licheniformis щам ТВ 13 и Т5 при протопластна фузия на тези щамове, резултиращи в Вас. licheniformis щам ТВ 13.
Фиг. 10 показва хромозомен анализ на девет различни колонии, изолирани чрез ферментация на щамовете T13F. Изолираната хромозомна ДНК под въздействие на EcoRI се сепарира върху 0,8% агарозн телове и нитроцелулоза. Хибридизацията се осъществява с белязана с 32Р и преведена /транслирана/ в pElatB ДНК. Фигурата показва една автодиаграма. Горната стрелка показва мястото, където един фрагмент от ДНК, срязан с EcoRI с големина от порядъка на 15 кб, който съдържа цялата ElatB последователност. интегрирана в хромозомата, мигрира към мястото, което не е съседно на първоначалния алфа-амилазен ген, както е описано за щам ТВ13 на Фиг. 9А. Долната стрелка сочи мястото, където EcoRI фрагмента с около 33 кб дължина, който съдържа целия алфа-амилазен ген, присъстващ първоначално в Вас. licheniformis щам Т5 /виж също Фиг. В/ е мигрирал. Анализирани са следните ДНК проби:
Линия 1: Вас. licheniformis Т5 ДНК
Линия 2: Вас. licheniformis ТВ 13 ДНК Линия 3: Вас. licheniformis Т390 ДНК Линия 4: ДНК от чувствително на неомицин производно на Вас. licheniformis 390.
изолирано чрез ферментация.
Линия 1: Вас. licheniformis T13F ДНК
Линия 6-14: ДНК от девет различни колонии, изолирани при ферментация на щам T13F.
Съгласно изобретението са създадени прокариотични клетки, които съдържат две или повече копия на ДНК последователности, интегрирани устойчиво в техния хромозомен апарат. Клетката-гостоприемник, която кодира представляващия интерес полипептид, се трансформира с ДНК структура, включваща споменатата ДНК последователност. Трансформираните клетки, в които интегрираните ДНК последователности са сепарирани от ендогенните хромозомни последователности на гена с оглед амплификация са селекционирани с тази цел. Споменатите ендогенни последователности са жизнено необходими за клетката-гостоприемник. Загубата на амплифицираните последователности посредством хомоложна рекомбинация би била летална за гостоприемника. Така, селекцията на клетки, носещи амплифицирани последователности става независима от използването на антибиотици или други средства за подбор. Интегрирането може да бъде осъществено или посредством хомоложна рекомбинация или чрез нелегитимирана рекомбнация. Методиките,по които могат да се получат желаните клетки са илюстрирани на Фиг. 2А и 2В съответно.
Когато се използва хомоложна рекомбинация във векторната молекула могат да присъстват няколко удължения на ДНК последователностите, които са хомоложни на хромозомата на клетката-гостоприемник, поспециално, когато един или повече от амплифицирания ген вече са въведени в клетката. Така векторната молекула може да включва желаната ДНК-последователност, мишенната ДНК последователност и маркерна ДНК-последовател ност.
Желателно е да се обръща особено внимание на това да се подбират камо желаните хромозомни гарнитури. То може да се постигне чрез използване на линейни ДНК молекули за рекомбинация. За да бъде интегрирана пръстеновидна ДНК молекула, тя трябва да бъде срязана с рестрикционна ендонуклеаза в областта, хомоложна на мишенната последователност. По този начин може с предпочитание да се осъществи рекомбинация и интегриране на това специ фично място. Допълнително, за да присъства във векторната молекула желаната ДНК последователност тя може също да е налице в хромозомата на клетката-гостоприемник. ДНК последователността може да бъде ДНК последователност, кодираща който и да е структурен ген, който да бъде амплифициран. Тя може да бъде ендогенна за гостоприемника или може да бъде инсертирана в хромозомата на този гостоприемник, както и да бъде инсертирана в хромозомата на гостоприемника на предишен етап на трансформацията.
Мишенни последователности за нетандемна ген амплификация за предпочитане е да бъдат избрани измежду неесенциални гени, например в случая Bacillus, използван като гостоприемник. Гените, кодиращи екстрацелуларни ензими или гените, включени в спорулацията, могат да бъдат използвани като мишенни последователности. Интегрирането на ДНК последователности в тези гени обикновено инактивира тези гени. Тогава може да се наблюдава загуба на експресия на гена и да се използва за селекция на желаните рекомбинантни щамове.
Когато за ген амплификация се използва нелигитимирана рекомбинация, както е посочено на Фиг. 10 и на Фиг. 2А, предпочитани са тези условия за интеграция и подбор, при които хомоложната рекомбинация няма да преобладава над нелигитимираната рекомбинация. Предпочитан начин за избягване на хомоложната рекомбинация е да се трансформират първата и втора клетка-гостоприемник, на които липсва желания структурен ген, с вектор, съдържащ ДНК последователност, кодираща представляващия интерес полипептид и маркерен ген. Първата и втора клетка гостоприемници, в които ДНК последователност присъства на различни нива, могат след това да бъдат селекционирани и комбинирани при условията на фузия до получаване на трансформирана клетка, която притежава най-малко две копия на ДНК последователността, кодираща желания структурен ген на различни места от генома на втория гостоприемник. За улеснение на селекцията, първия гостоприемник може да бъде умъртвен преди фузията.
Представляващите интерес гени могат да бъдат които и да са прокариотични или еукариотични ген. Те могат да включват бактериални гени, гени на едноклетъчни мик5 роорганизми, гени на бозайници или други подобни. Структурните гени могат да бъдат получени по различни начини, вкл. синтез, изолиране на геномна ДНК, получаване от сДНК или комбинация от тях. Методите за манипулация с гените са добре известни и включват рестрикция, усвояване, резекция, лигатиране, in vitro мутагенеза, възстановяване на праймера, използване на линкери и адаптери и др. Така ДНК последователности, получени от гостоприемник, могат да бъдат обработени по различен начин в зависимост от ДНК-конструкцията /44/.
Структурните гени могат да експресират различни полипептиди или проетини, такива като ензими, хормони, лимфокинини, имуноглобулини или друг подобни от бозайници, едноклетъчни микроорганизми, растения или други източнинии на ДНК. От особен интерес са ензимите, по-специално амилазите и протеазите. Примери за такива ензими са серинови или несеринови протеази, вкл. няколко вида алкални протеази, алфа и бета амилази и др. Предпочитан източник на серин протеази е Вас. novo sp. РВ92 и за алфа амилазата - Вас. licheniformis щам Т5, както и мутантите и вариантите на тези щамове.
Генът, който формира част от вектора, може да бъде получен по методи, които са познати в тази област Hii техниката. Найобщо, методите предвиждат получаване на геномна енциклопедия от организма, експресиращ силно алкална протеза. Геномната енциклопедия се приготвя удобно например посредством лигатиране на ДНК фрагменти от донорния щам в подходящ вектор.
С термина подходящ вектор се обозначава ДНК структура, включваща структурен ген, който кодира протеин или полипептид, представляващ интерес. Структурният ген се свързва при правилна ориентация към контролиращи области, като промоторна последователност, рибозомасвързващото място, области, контролиращи завършването /терминацията/ на транскрибцията и транслацията на структурния ген, които области са функционални в клетката на гостоприемника. Векторът може да съдържа допълнително източник на репликация, когато клеткатагостоприемник има трансформационни и интеграционни честоти,твърде ниски, за да позволят директен подбор за интегриране без междинно изолиране на плазмидосъдържащи клетки, такива като промишлените видове Bacillus.
Когато генът е получен от донорна клетка, която има регулаторни сигнали за иницииране на транскрибция и транслация и за терминация, които се разпознават от прокариотичния клетъчен щам-гостоприемник, удобно е да се съхрани оригиналната регулаторна последователност на структурния ген. В допълнение, областта, инициираща транскрибциията маже да осигури конститутивна или индукативна експресия, така че при подходяща ситуация, гостоприемникът да бъде култивиран до висока плътност, преди да бъде получено високо ниво на експресия на желания стурктурен ген.
Когато структурният ген е от източник, чиито регулаторни сигнали не са разпознати от клетката -гостопиремник, явява се необходимост от получаване на регулаторни области, разпознаваеми от клетката-гостоприемник и инсерцията им между иницииращия и терминаторен сигнали. В някои случаи може да бъде вмъкнат екзогенен структурен ген с неговия собствен стоп-кодон в рамката за четене зад П-терминиращите колони на ендогенен структурен ген, който запазва естествените си регулаторни сигнали.
Желателно е секретираният продукт да може да бъде секретиран. Когато експресионният продукт се секретира по естествен начин и водещите и обработващи сигнали са разпознаваеми от клетката-гостоприемник. това не представлява трудност. Когато обаче продуктът не се секретира, т. к. клетката не разпознава сигналите или тези сигнали не са функционални в задоволителна степен в клетката, тогава се налага да се изолират или секретират ДНК-последователности, кодиращи секреторни водещи сигнали или обработващи сигнали, които да се свържат в правилна четяща рамка към 5' - края на структурния ген.
Векторът допълнително може да включва генен маркер, придаващ устойчивост срещу антибиотик, спрямо който клетката е чувствителна. Маркерният ген трябва да задоволи изискването селекцията да е възможна дори ако само едно или няколко копия на този ген да са налице в щамагостоприемник. Под маркерен ген се разбира структурен ген, способен на експресия в гостоприемник, който осигурява селекцията. Различните ДНК-последователности мо6 гат да имат различен произход и, свързани заедно, да осигуряват вектор, който включва едно или повече подходящи, за предпочитане единствени, рестрикционни места, позволяващи инсерция или субституция на структурните гени на тези места или на мястото на загубени фрагменти с оглед осигуряване на плазмидната конструкция.
Подборът на хромозомна интеграция може да бъде насочван посредством използване на плазмид с източник на репликация, който притежава мутация, която осигурява функцията „чувствителност спрямо температура“ на клетката-гостоприемник.
След като веднъж е изготвена, конструкцията на плазмида трябва да бъде клонирана в клетка-гостоприемник. Може да бъде използван всеки гостоприемник, който е подходящ за трансформиране и позволява репликация на плазмидната конструкция и трансфер в клетката на гостоприемника. Налице са голям брой щамове с висока ефектвност на трансформация и които обикновено са ауксотрофни и/или чувствителни към антибиотици. Когато клетката-гостоприемник е промишлен вид Bacillus, използването на същия организъм като гостоприемник за клониране на плазмида има редица предимства в това, че позволява използването на единствена репликационна система, както и на същия маркер за селекция както в клониращия гостоприемник, така и в щама-гостоприемник.
Плазмидната структура може да бъде въведена в клониращия гостоприемник в съответствие с обичайните методики, след което последният се развива върху подходяща култивационна среда. Като гостоприемници могат да бъдат използвани Е. coli, щамове от род Bacillus, по-специално Вас. subtilis, Pseudomonas и Streptomyces. При избора на клетките-гостоприемници се взимат под внимание фактори като: влияние върху експресията на гена,продукция на желания препарат и др. Така, желателно е да се използват клетки, които да разпознават регулаторни сигнали, които да секретират лесно, при които има понижено разграждане на желания продукт и др. Предпочитана клеткагостоприемник е тази, която продуцира желания полипептид, независимо дали е див тип или е мутантен организъм. Когато се касае до продуциране на протеаза или амилаза, предпочитани са щамове на Вас. novo sp. РВ92 и Вас. licheniformis Т5, както мутантите и вариантите на тези щамове. Могат да бъдат използвани и промишлени щамове, които притежават желаните характеристики на промишлен щам. Примери за такива са микроорганизмите, като Вас. licheniformis. Вас. amyloliquefaciens и алкалофилни бацилуси.
Промишлените щамове се подбират от организми, които могат да бъдат от почвата или се намират на съхранение в съответни депозитни организации, а така също и да бъдат получени чрез модификация на такива щамове. Промишлените щамове са твърде устойчиви и жизнени - те са устойчиви на фагови инфекции и на генетичен обмен, те са фототрофни. което позволява да се оскъпяват култивационните среди със скъпи аминокиселини. Освен това промишлените щамове са високопродуктивни до края на ферментационния период, което може да продължи до около една седмица.
Трансформанти могат да бъдат получени при наличие на гени, които да са тандемно свързани или да са разпръснати в хромозомата. Възможно е подбора да се осъществи от двата типа трансформанти посредством изолиране на хромозомна ДНК от всеки от отделните трансформанти, последващо анализиране на споменатите ДНК по отношение на местата на съответните гени по метода на Southern /47/ например, или с други средства, известни на специалистите, последвано от интегриране на идентифицираните споменати гени.
Като начин за получаване на трансформанти с разпръснати гени /т. е. нетандемно свързани/ е например използването на двойна реципрочна рекомбинация, както е посочено на Фиг. 1В и 2В, използване на линеализирани ДНК-структури, включващи ДНКпоследователността, която трябва да бъде амплифицирана, маркерен ген и мишенни последователности за рекомбинация.
По-нататък получените трансформанти се подлагат на нелегитимирана рекомбинация, както е посочено на Фиг. 2А, при което изолирането на тандемни трансформанти се избягва чрез селекция, посредством диференциална експресия на маркерен ген, например - кодиращ устойчивост спрямо антибиотик, при което чувствителността спрямо антибиотика е различна в щамовете с тендемно интегриране от щамовете с нетандем но интегриране. Общо, дължината на въвежданите ендогенно ДНК последователности ще бъде по-малка от 10 квр.
В допълнение средствата за получаване на трансформанти с разпръснати гени при избягване на тандемна дубликация включват: използване на умъртвени протопласти на хомоложен донорен щам, носещ ДНК структура, която включва структурния ген и маркерния ген.
Трансформацията на клетките-гостоприемници се осъществява за предпочитане с използване на протопласти, изолирани от щам-гостоприемник. Те се изолират по обичайни методики, напр. третиране с лизозим или цимолиаза, суспендиране в подходяща среда с добра осмотичност за поддържане на протопласта. За промишлените щамове методиките за изолиране от Вас са описани в /48/ - когато щамът-гостоприемник е алкалофилен щам Bacillus, обикновено протопластите се получават при алкално pH за предпочитане около 8,0.
Друг начин за селекция на трансформанти е използването на плазмид, съдържащ чувствителен спрямо температура източник на репликация. Трансформантите се развиват в селективна среда при допустима температура, след което се поставят на недопустима температура, след което се поставят на недопустима температура. Колониите, експресиращи маркерния ген при недопустима температура се изолират и се култивират при недопустима температура. Отсъствието на плазмид може да се докаже например посредством изолиране на общата ДНК от колониите и да се анализира върху агарозен гел чрез електрофореза или посредством демонстриране липсата на способност за трансформация на конкурентни клетки. Определянето на пътя, по който се е извършило интегрирането в хромозомата, може да се осъществи посредством анализиране на хромозомната ДНК с помощта на известни методики /47/.
Друг начин за получаване на трансформанти с разпръснато интегриране на копия от ДНК последователността, която представлява интерес, е използването на протопласт, получен от хомоложна донорна клетка, съдържащ поне едно копие на ДНК последователността в място от хромозомата, различно от това в реципииращата клеткагостоприемник. Хомоложната донорна клет ка може да бъде получена например посредством трансформиране на клетка, която не съдържа интересуващия ни структурен ген с вектор, включващ структурния ген. Интегрирането на ДНК последователността в хромозомата на донорната клетка може да бъде улеснено посредством използване на плазмид, съдържащ чувствителен на температура източник на репликация и нарастване на трансформантите при селективни условия, първо при допустима, после при недопустима температура, както е описано по-горе, последвано от изолиране на колонии, експресиращи маркерния ген.
За последващото удостоверяване на отсъствието на плазмидна ДНК, хромозомната ДНК може да бъде изолирана и анализирана по известните методики /47/ посредством хибридизиране с белязана проба, напр. с !2Р или с биотинирани нуклеотиди. Пробата може да бъде сДНК, кодираща представляващия интерес полипептид или нейни фрагменти, както и ДНК структури и нейни фрагменти, напр. вектор. Трансформанти. съдържащи представляващия интерес ген на различно място спрямо това на донорния щам, могат да бъдат използвани като хомоложна донорна клетка. Щамът-реципиент е същият като този, използван като източник на ДНК-последователността, представляваща интерес или като щама, при който ДНК последователността е разположена в различна област на хромозомата в сравнение с тази на трансформираната донорна клетка.
За подпомагане на селекцията донорната клетка се умъртвява с цитоскопично средство преди или по време на образуването на протопластите. Като най-подходящо средство е установен йодацетамида, тъй като е ефективен и не влияе върху последващата фузия. Когато се използват умъртвени клонирани гостоприемници-протопласти, отношението на умъртвения протопласт към приемащия щам е за предпочитане най-малко 1:1, но може да бъде и в полза на излишък от умъртвения протопласт.
Следва фузия на умъртвените донорни протопласти и протопластите на реципиента, при което трансформантите могат да бъдат подбирани с помощта на маркерния ген. ДНК може след това да бъде изолирана и анализирана по описания по-горе начин за идентифициране на трансформантите, при които повече от едно копие от представлява щия интерес ген са включени в генома и са отделени с помощта на ендогенни хромозомни последователности. След това трансформантите се подбират за установяване на повишена експресия на представляващия интерес полипептид. То се осъществява с участието на ензими, антитела, ДНК и РНК хибридизация, чрез биоанализ и т. н.
Клетката-гостоприемник, съдържаща хромозомно интегрирани плазмидни структури или техни фрагменти, след това се култивира в хранителна среда при обичайните условия за ферментация. Ферментацията може да продължи до пълно изтощаване на хранителната среда. Продуктът се изолира от хранителната среда с обичайните методи, напр. екстракция, хроматография, електрофореза и др. Ако продуктът се съдържа в цитоплазмата, клетките могат да се лизират с помощта на механично разкъсващи средства, с лизозим или с помощта на други методики и да бъде изолиран по описания по-горе начин.
Предимствата на метода съгласно изобретението се състоят в това, че се постига устойчива интеграция на най-малко две копия на ДНК структури като начин за генна амплификация, което е осъществимо с използването на комбинация от известни методики.
Изобретението се илюстрира със следните примерни изпълнения:
Пример 1:
Изготвяне на геномна ДНК енциклопедия от алкалофилен Bacillus novo Sp. РВ92 и изолиране на серин протеазния ген.
Хромозомна ДНК, изолирана от Вас. novo sp. РВ92 /депозиран под N ОР-60 в Laboratorium voor Microbiologie, Technical University of Dely. Netherlands /50/ по описаната в литературата методика /51/, се обработва с рестрикционния ензим Sau ЗА и се лигатира в BamHI място на плазмид pUB 110 /52/. pUBllO плазмидна ДНК се получава по описан в литературата /5Ъ/ начин. Лигатираната смес се трансформира в В. subtilis 1А40 /Bacillus Genetic Stock Centre/ в съответствие c известния метод /54/ при използване на 0,6-1 мг ДНК на милилитър компетентни клетки. Клетките от трансформираната смес се посяват върху хранителна среда,съдържаща: 2,8% К2НРО4, 1,2% КН2РО4, 0,4% /NH4/2SO4, 0,2% три-натриев цитрат с две молекули вода, 0,04% MgSO4.7H2O,
0,00005% MnSO4.4H2O, 0,4%L-глутаминова киселина, 0,5% глюкоза, 0,02% квазиаминокиселини, 50цг/мл неомицин, 0,4% казеин и 1,5% агар. След инкубиране на посявките при температура 37С в продължение на една нощ, една от 5000 устойчиви на неомицин колонии показва повишена продукция на протеаза. Плазмидната ДНК се изолира от тази колония в съответствие с описан в литературата метод /55%/ и е наречен рМ58.
Експресия на серин протеазният ген: Bacillus subtilis 1А40, който съдържа рМ58, се култивира върху минимална хранителна среда /56/, към която са добавени 0,02% квазиаминокиселини, 50цг/мл триптофан, 20 цг/мл метионин, 20цг/мл лизин и 20цг/ мл неомицин. След 24 часа културата се центрофугира и супернатанта се анализира за протеазна активност при използване на диметилказеин като субстрат /57/. Културата от Вас. subtilis 1А40, съдържаща плазмида pUBl 10. използван като контрола показва по-ниска от 1/60 от протеазната активност на рМ58 трансформирана култура. Протеазната активност се инхибира напълно посредством обработка с 1 мМ фенилсулфонилфлуорид /PMSF/. но не при третиране с 20 мМ ЕТОК /етилен тетраоцетна киселина/.
Еднакви части от споменатата по-горе супернатанта се подлагат на анализи върху протеинов гел в съответствие с метода на Laemmli /58/. Проби за анализ върху такива гелове се приготвят посредством третиране с 5%-на трихлороцетна киселина /ТОК/. След центрофугиране на пробата, пелетата от утаен протеин се промива двукратно с ацетон, след това се се разтваря в 40 мл буфер /0.5 Tris /НС1 при рН 7,5, 10% обемни 2-меркаптоетанол. 50% обемни глицерин и 0,05% Bromophenol Blue при кипене в подължение на 10 мин. След електрофорезата теловете се оцветяват с участието на Coomassie Brilliant Blue. Пробите от културалната супернатанта след това се анализират чрез електрофореза. Използвани са три различни щама на Вас. subtilis: щам. съдържащ pUBllO,pM58 или без плазмид. както и Bacillus РВ92 протеаза като контрола. След електрофорезата теловете се оцветяват при използване на Coomassie Brilliant Blue и се обезцветяват. Пробата от щам Вас. subtilis 1А40, съдържащ рМ58 включва 31 кД протеин, който мигри ра заедно c P Bacillus B92 протеаза. Този протеин не е открит върху контролната линия на щама В. subtilis 1А40, съдържащ, pUBl 10.
Всички серин протеази имат подобни молекулни тегла. Затова клонираната серин протеаза на Bacillus РВ92 е диференцирана от известните серин протеази /Вас. subtilis субтилизин, Carlsberg субтилизин/ посредством трансформация на рМ58 и pUBllO спрямо протеазно негативния щам Вас. subtilis ДВ104 /59/ и анализ на продуцираните екстрацелуларни ензими. Получените трансформанти нарастват в минимална хранителна среда /54/, съдържаща 0,02% квазиаминокиселини, 50 рг/мл хистидин и 20 мг/мл неомицин. След 24 часа се вземат проби, които се центрофугират и без предварителна обработка се анализират върху хистидин /MOPS гелове,съдържащи 75мМ КОН, 40 мМ хистидин, ЮОмМ MOPS /3-/Nморфолино/-пропан сулфонова киселина, pH 7,5 и 5% полиакриламид. Буферът за електрофореза съдържа 40мМ хистидин, ЮОмМ MOPS при pH 6,6. Пробите се поставят в направление към електрода /катода/. Ивиците на протеазата се откриват с Agfa Рап 100 Professional films /60/. Тези резултати са отразени на Фиг. 3. Както е посочено на Фиг. 4, рМ58 приютява гена, кодиращ Вас. subtilis РВ92 протеаза.
Определяне последователността на Bacillus РВ92 серин протеазния ген.
Цялата последователност на Ball-Hpal протеазния фрагмент се определя по известен метод /61/. Рестрикционните фрагменти на рМ58 се клонират във фага М13 - вектори мрЮ, мр! 1 и мр18 /62/. Инсерцията на рМ58 фрагмента се скринира чрез плакова хибридизация. След определяне на последователността, десет олигонуклеотида, разположени на равни разстояния върху гена се приготвят и определянето на последователността се повтаря, потвърждавайки последователността, посочена на Фиг. 5.
Конструиране на плазмида рМАХ-4, съдържащ информация за серин протеаза:
За изграждане на плазмида pUCN710 /Фиг. 6А/, pUel 10 се третира с TagI и PvuII. Фрагментът, съдържащ гена за устойчивост спрямо неомицин се пречиства върху нискотопяща се агароза и се прави сляп с Klenow полимераза и NTP’s /62/. Плазмидът pUC7 /63/ се линеализира със Sall и се прави сляп, както е показано по-горе. Двата фрагмента се лигатират с Т4 лигаза /62/ и се трансформират в Е. coli JM103. Селекцията се осъществява върху 2хТУ блюда /1,6% тегло/ обем Bacto-триптон, 1 % тегло /обем клетъчен екстракт, 0,5% натриев хлорид/, съдържащи 50 цг/мл ампицилин и 10 мг/мл неомицин. Полученият в резултат плазмид, наречен pUCN710 се третира с BamHI. Плазмидът /64/ се третира с Bell. Фрагментите от двете третирания се лигатират с Т4 лигаза и се трансформират в Вас. subtilis 1А40. Подборът се осъществява върху минимална хранителна среда, съдържаща 20 рг/мл неомицин. Полученият плазмид, рЕ194-пео /Фиг. 6А/ съдържа гена за неомицин и чувствителен на температура източник на репликация.
Субклонирането на протеазния ген се осъществява по следния начин: рМ58 се третира с Hpal и Ball и Bglll. Плазмидът рЕ 194-пео се третира с Hpal. Тези фрагменти се лигатират с Т4 - лигаза и се трансформират в Вас. subtilis 1А40. Трансформантите се подбират на базата на устойчивост^рпрямо неомицин и на повишена протеазна активност, което се преценява с помощта на утаяване с казеин. Структурата на получения плазмид рМАХ-4 се потвърждава с рестрикционен ензимен анализ. /Фиг. 6В/.
Протопластна трансформация на Bacillus щам РВ92 с помощта на рМАХ-4:
Bacillus РВ92 се култивира в продължение на една нощ в 100 мл NBSC хранителна среда /65/. Културата се центрофугира в продължение на 10 мин при 4500 оборота в минута в ротор модел SorVal GSA. Протопластите се приготвят чрез инкубиране на Bacillus в продължение на I час при температура 37С в 10 мл алкална поддържаща среда /АНМ/. съдържаща 0.5 М захароза, 0,02М магнезиев хлорид и 0.02 М Tris /малеат. pH 8, в стерилна вода, към която е добавен лизозим в количество 0.4 цг/мл. Протопластите се пелетират в продължение на 10 мин при 4500 об/мин. суспендират се отново в 5 мл АНМ+ pH 8.0 буфер /АНМ буфер/, към който се добавя 3.5% тегло/ обем Bacto Penassay хранителна среда и 0,04% обем/тегло Albumine Merieux смесват се, след това се пелетират отново по описания по-горе начин. След като отново се суспендират в 0,5 мл алкална поддържаща среда 0,5 мл от тази суспензия на протоп ласти се смесват с 5 рг деминерализирана вода, съдържаща 1 рг плазмиднаДНК и се инкубират в продължение на 2 минути в присъствие на 30% тегло/обем полиетиленгликол 8000 при рН 8,0. След разреждане 1:3 с АНМ+, рН 8,0 и центрофугиране, пелетите се суспендират отново в малък обем /1 мл/ АНМ3 и се инкубират отново в продължение на 2-3 часа. Една стотна част от микролитъра се посява върху прясно приготвени блюда с регенеративна смес, съдържаща 0,5 М натриев сукцинат /HCI, рН 8,0, 1,5% тегло/ обем агар, 0,5% тегло/обем квазиаминокиселини, 0,5% тегло/обем дрожден екстракт, 0,031 М фосфатен буфер, рН 8,0, 0,5% тегло/обем глюкоза, 0,02 М магнезиев двухлорид и 0,02% тегло/обем Albumine Merienx. Тези блюда също съдържат 1000 рг/мл неомицин за подбор. След инкубиране при температура 37С в продължение най-малко на 72 часа, колониите се посяват повторно върху твърди инфузионни агарови блюда, съдържащи 20 рг/мл неомицин.
Трансформант на Bacillus РВ92, съдържащ плазмид рМАХ-4 се инкубира в триптон соева среда /TSB/, съдържаща или 1 рг/ мл или 20 мг/мл неомицин в продължение на 24 часа при температура 37С. Порции от по 2 мл клетъчна суспензия се разреждат в 100 мл TSB, съдържаща 1 рг/мл или 20 мг/ мл неомицин съответно, и се инкубират в продължение на 24 часа при температура 50С. След 24 часа проби от по 5 мл от културалната среда се разреждат отново по описания по-горе начин и се инкубират в продължение на 24 часа при температура 50С, отново в присъствие на 1 рг/мл или съответно 20 рг/мл неомицин. Последната процедура се повтаря още веднъж. След това клетъчната суспензия се разрежда стократно и се посява върху твърда инфузия /Н1/, съдържаща 1 мг/мл неомицин или 20 мг/мл съответно. Пробите се инкубират при температура 50С в продължение на 16 часа. Устойчивите на неомицин колонии се изолират и култивират в 10 мл TSB хранителна среда, съдържаща 1 рг/мл неомицин в продължение на 16 часа при 37С. От тези култури се изолира общата ДНК /66/. Отсъствието на плазмид се доказва посредством ДНК електрофореза върху агарозен гел. Отсъствието на ДНК от пробите, в които не се открива плазмидна ДНК, се потвърждава посредством трансформация на общата ДНК в Вас. subtilis 1А40. Пробите, които не притежават способността да трансформират Вас. subtilis 1А40 се считат за свободни от плазмид.
За да се порвери дали и по какъв начин се осъществява интегриране на рМАХ-4 в хромозома, хромозомната ДНК се изолира, усвоява се с Hind III, разлива се върху 0,5% ДНК агарозни гелове и се оцветява на нитроцелулоза /67/, хибридизира се с белязан с 32Р рМ58 /44/. Резултатите, получени от този анализ са отразени на Фиг. 7А.
Подборът, осъществен върху 1 рг/мл неомицин резултира в протеазен ген, тандемно локализиран в хромозомата и сепариран с плазмидни последователности като резултат от хомоложна рекомбинация. При натрупване на 30 независимо изолирани интегранта, селекцията се осъществява с I рг/мл неомицин. Изолиран е и един интегрант. който съдържа плазмида рМАХ-4, локализиран на случайно място в хромозомата като резултат от нелегитимирана рекомбинация /щам РВТ122/. Селекцията при 20 рг/мл неомицин води в резултат до копие на плазмид рМАХ-4, разположена случайно върху хромозомата след нелегитимирана рекомбинация. Последният щам се нарича РВ108. Генетичната организация на щамовете РВ109 и 108 е посочена на Фиг. 7В и 7С. Хромозомният анализ сочи, че интегрирането на РВТ122 и РВТ108 се явява на различни места в хромозомата.
Устойчивостта на гените за дубликатни протеази в щамовете РВТ108 и РВТ109 се изпитва по следния начин:
Сто мл продуцираща среда, съдържаща: 1% нишесте, 4% лактоза, 0,87 кисел калиев фосфат, 0,5% дрождев екстракт, 0.5% кисел диамониев фосфат, 0,2% тринатриев цитрат с две молекули вода, 0.05%, магнезиев сулфат със седем молекули вода, 0,07% калциев двухлорид, 0,068 железен сулфат със седем молекули вода и антипенител 1 мл/л без неомицин се инокулират с 0,2 мл от преседялата една нощ култура TSB /37С/ на щамовете РВ108 или РВ109 в 500 мл стъкла за клатене. След инкубиране в продължение на 44 часа при температура 37С при постоянно аериране, културата се изпитва за устойчиви на неомицин колонии и за протеазна активност.
Двата щама РТ108 и РВТ 109 също се изпитват в Eschweiler ферментатори, съдър11 жащи същата продуцираща среда, за да се щението до 101. Резултатите са сумирани на определи ефекта от увеличаване на съотно- Табл. 1.
Табл. 1
Щамове
Относителна продуктивност на протеаза % на устойчиви на неомицин клетки след ферментация
Контрола РВ92
РВТ108
РВТ109
100%
120%
100%
75-97%
Протеазната активност се изследва при използване на диметил казеин като субстрат по известни методи.
Анализирането на колониите, произвеждащи от Eschweiler ферментацията на РВТ109 след два дни култивиране показва, че 3 до 25% от тези колонии продуцират само при щамове, съдържащи само единичен протеазен ген. Установено е, че тези колонии са чувствителни на неомицин. което се дължи на отстраняване на рМАХ-4 последователността посредством хомоложна рекомбинация. Изследването на колониите, произхождащи от ферментацията на щама РВТ109 обаче показва, че всички клетки са устойчиви на неомицин. Сто от тези колонии се вземат без избор и всяка от тях се подлага на изпитване на възможността й да произвежда протеазна активност за определяне наличието на един или два продуциращи протеазни гена. Всичките сто отделно изследвани колони продуцират количества, характерни за щама, като по този начин се доказва, че двата интегрирани на случайно място гена са устойчиви на неомицин при използваните условия на ферментация.
Изграждане на интеграционен вектор pElatB:
Плазмидът pGB34 /69/ се обработва с рестрикционни ензими BG1I, Bgll и Bglll. Получените рестрикционни фрагменти се обработват с оглед получаване на слепи краища с Klenow - полимераза, след това се лигатират в Hpal място на рЕ194-пео и плазмидната рЕ194-пео ДНК се изолира по познат начин /70/.
Лигатираната смес се трасформира в Вас. subtilis 1А 40 по известен начин /71/ при използване на 0,5-1 рг/мл ДНК способни клетки. Клетките от трансформираната смес се посяват върху блюда с минимална хранителна среда, съдържаща 2,8% кисел дикалиев фосфат, 1,4% дикисел монокалиев фосфат, 0,4% диамониев сулфат. 0,2% тринатриев циитрат с две молекули вода, 0,04% 20 магнезиев сулфат със седем молекули вода.
0,00005% манганов сулфат с четири молекули вода, 0,4% глутаминова киселина, 0,5% глюкоза, 0,02% квазиаминокиселини, 50 рг/ мл триптофан, 20рг/мл метионин, 20 рг/мл 25 лизин, 20 рг/мл неомицин. 0,4% казеин.
0,5% нишесте и 1,5%агар.
ДНК на продуциращите алфа-амилаза колонии се изолира по известен метод /70/ и се проверява в рестрикционни ензими. От 30 един от тези трансформанти се изолира плазмид ElatB /виж фиг. 8/.
Последващата трансформация на щама Вас. licheniformis T9 се осъществява по познат начин /72/ с изключение на това, че 33 цялата процедура се осъществява върху посявки в минимална хранителна среда, съдържаща 20 рг/мл неомицин. Всички трансформанти продуцират алфа амилаза. Анализът с рестрикционен ензим на ДНК, из40 готвена по метода на Birnboim /70/ показва, че всички трансформанти съдържат pElatB.
Плазмидът pEtatB сее интегрира в хромозомата на Вас. licheniformis щам T9 по следния начин: Вас. Licheniformis щам T9. 45 съдържащ плазмида pElatB се инокулира в триптон-соя хранителна среда /TSB/, съдържаща 20 рг/мл неомицин и се инкубира в продължение на 16 часа при температура 30С. Петмилилитрова порция от клетъчната 50 суспензия се разрежда в 100 мл от същата хранителна среда и се инкубира в продължение на 24 часа при температура 50С. Тази процедура се повтаря, след което клетъчната суспензия се разрежда стократно и се пося ва върху блюда с твърд инфузионен агар, съдържащ 10 рг/мл неомицин. След инкубация в продължение на 40 часа при температура 50С, устойчивите на неомицин колонии се изолират и се култивират в 10 мл Т в 5 хранителна среда, съдържаща 10 рг/мл неомицин в продължение на 16 часа при температура 30С. Общата ДНК от тези култури се изолира по познат начин /73/. Отсъствието на плазмиди в тези клетки се доказва с Ю ДНК електрофореза върху агарови гелове. Проби, в които ДНК с ниско молекулно тегло отсъства, се проверяват отново за наличие на плазмидна ДНК чрез трансформациия на Вас. licheniformis 1А40 по познат 15 начин /71/. Проби, които нямат способността да трансформират Вас. licheniformis 1А40 в устойчиви на неомицин щамове, се счита, че не съдържат плазмиди.
За да се провери дали е осъществено 20 интегрирането на pElatB и по какъв начин е осъществено, от трансформантите се изолира хромозомната ДНК /74/, обработва се с EcoRI, фракциониран върху агарозни гелове /0,5%/, оцветява се върху нитроцелулоза 25 по познат начин /67/ и се хибридизира с белязан с 32Р pGB33 /75/. Резултатите от този анализ са отразени на Фиг. 9А. Данните сочат, че нелигитимираната рекомбинация на pElatB намира място в щам, съдържащ 30 единичен амилазен ген на място в генома, различно от това в сравнение с първоначалния амилазен щам Вас. licheniformis Т5. Полученият щам, съдържащ pElatB е наречен ТВ13. 35
Получаване на щам T13F, съдържащ два амилазни гена, отделени посредством хромозомни последователности
За получаване на щам, съдържащ два амилазни гена, разделени с ендогенни 40 хромозомни ДНК последователности, се осъществява фузия между Вас. licheniformis Т5 /първоначален амилазен щам, съдържащ ген за амилаза /75/ и щама ТВ13 /щам, който съдържа ген за амилаза, който е интегриран на случайно място в хромозомата/. Протопластната фузия се осъществява по познат начин /75/. Подборът се осъществява върху регенеративни блюда, съдържащи 10 мг/мл неомицин.
За да се проверят и идентифицират потенциалните продукти от фузията, хромзомната ДНК се изолира, обработва се с EcoPI, фракционира се върху 0,5% агарозни гелове, оцветява се върху нитроцелулозни филтри /67/ и се хибридизира с белязан с 32р рСВЗЗ /75/. Резултатите от този анализ са посочени на Фиг. 9В. Един от получените продукти от фузията, а именно T13F, съдържа два амилазни гена, разделени посредством ендогенни хромозомни последователности.
Устойчивостта на щама T13F, щам, който съдържа два амилазни гена, разделени посредством важни хромозомни последователности, се сравнява с тази на щам Т390, щам с два хромозомни амилазни гена, тандемно свързани един с друг. Изготвянето на Т390 е илюстрирано с Табл. I, където щама е отнесен към Вас. Licheniformis Т5 /рСВЗЗ/. Щамовете T13F и Т390 се изпитват във ферментационни условия, по-точно 0,2 милилтрова култура от една нощ /37“С/ в TSB инокулира 500 милилитрови колби, продуцираща среда без неомицин. След инкубиране в продължение на 6 дни при температура 40С и при непрестанно аериране, културата се изпитва за устойчиви на неомицин колонии и за амилазна активност. Резултатите са сумирани на Табл. 2.
Табл. 2
Щам Относителна амилазна активност % устойчиви на неомицин клетки след ферментация
Т5 юо% -
ТВ13 20% 100%
T13F 120% 100%
Т390 200% 88%
+ Изследвани са повече от хиляда колонии за щам
С оглед изключване възможността от изрязване на един амилазен ген без съответната загуба на неомициновия ген в щам T13F,анализират се 20 колонии, произхождащи от ферментация на щам T13F. Хромозомната ДНК от безразборно подбраните 20 колонии се изолира и охарактеризира с помощта на хибридизационни експерименти, както е описано по-горе. Получените резултати от 9 от тези анализа са илюстрирани с Фиг. 10. Всички изследвани щамове съдържат два амилазни гена, демонстрирано с наличието на два EcoRI фрагмента, които съдържат два алфа-амилазни гена /Фиг. 10, линия 4/. Това показва, че интегрираните на случайно място амилазни гени са поустойчиви, отколкото интегрираните тандемно гени при условията на ферментация.
Очевидно е от изложените по-горе резултати, че може да бъде получена прокариотна клетка, в която е постигнато устойчива амплификация на гена посредством подбиране на трансформирани клетки, в които има нетандемно интегриране най-малко на две копия на структурния ген, който подлежи на амплификация. Интегрирането може да се осъществи с помощта на нелегитимирана или на хомоложна рекомбинации.

Claims (17)

  1. ПАТЕНТНИ ПРЕТЕНЦИИ
    1. Метод за стабилна ген амплификация на хромозомна ДНК от прокариотични микроорганизми, характеризиращ се с това, че клетка-гостоприемник, съдържаща най-малко едно копие от ДНК последователност, кодираща представляващ интерес полипептид, интегрирано с нейната хромозома, както и най-малко един маркерен ген и чувствителен спрямо температура източник на репликация, се комбинира с донорна клетка, която съдържа най-малко едно копие от ДНК последователност за същия полипептид, при условия за трансформация на клетката-гостоприемник, след което се осъществява селекция на трансформираните клетки, които съдържат най-малко две копия на желаната ДНК последователност, разделени чрез ендогенни последователности.
  2. 2. Метод съгласно претенция 1, характеризиращ се с това, че клетката-гостоприемник еалкалофилен микроорганизъм от рода Bacillus.
  3. 3. Метод съгласно претенция 2, характеризиращ се с това, че клетката-гостоприемник е щам Bacillus licheniformis.
  4. 4. Метод съгласно претенция 2, характеризиращ се с това, че клетката-гостоприемник е щам Вас. novo sp. РВ92, негов мутант или вариант.
  5. 5. Метод съгласно претенция 2, характеризиращ се с това, че клетката-гостоприемник е щам Вас. licheniformis Т5, негов мутант или вариант.
  6. 6. Метод съгласно претенция 1, характеризиращ се с това, че клетката-гостоприемник съдържа най-малко едно копие от ДНК последователност, кодираща протео.Ттичен или амилолитичен ензим.
  7. 7. Метод съгласно претенция 6, характеризиращ се с това, че протеолитичният ензим е серин протеаза.
  8. 8. Метод съгласно претенция 1, характеризираш се с това, че клетките-гостоприемници се подбират посредством култивиране на клетките, съдържащи ДНК структура, включваща генен маркер в присъствието на биоцид. към който генният маркер осигуря-
    Лг· ва устойчивост и идентифициране и изолиране на клетките, свободни от плазмид.
  9. 9. Метод съгласно претенция 8, характеризиращ се с това, че изолирането се осъществява посредством изолиране на хромозомна ДНК от подлежащите на подбор клетки, и хибридизиране на хромозомната ДНК с белязана проба, съдържаща ДНК структурата.
  10. 10. Метод съгласно претенция 2. характеризиращ се с това, че донорната клетка се получава посредством комбиниране на прокариотичен микроорганизъм, който не съдържа ДНК последователност, кодираща желания полипептид с ДНК структура съгласно претенция 8 при условията на фузия, изолиране на трансформираните клетки, култивиране на трансформираните клетки при недопустима температура, идентифициране и изолиране на трансформираните клетки, при които ДНК структурата е интегрирана на място, различно от това в споменатата клетка-гостоприемник.
  11. 11. Метод съгласно претенция 1 и 10. характеризиращ се с това, че донорната клетка е алкалофилен микроорганизъм от род Bacillus.
  12. 12. Метод съгласно претенция 11, характеризиращ се с това, че алкалофилният мик роорганизъм е щам Вас. licheniformis Т5 или щам Вас. novo sp. РВ92.
  13. 13. Метод съгласно претенция 10, характеризиращ се с това, че ДНК структурата е рМАХ4 или pElatB.
  14. 14. Метод съгласно претенция 10, характеризиращ се с това, че ДНК последователността е интегрирана чрез нелегитимна рекомбинация или чрез хомоложна рекомбинация.
  15. 15. Метод съгласно претенция 10, характеризиращ се с това, че ДНК структурата включва чувствителен спрямо температура източник на репликация.
  16. 16. Метод съгласно претенция 15, характеризиращ се с това, че чувствителният на температура източник на репликация е плазмид рЕ194.
  17. 17. Метод съгласно претенция 1, характеризиращ се с това, че трансформираните клетки, които съдържат най-малко две копия на желаната ДНК последователност, разпределени чрез ендогенни последователности, са щамове Bacillus РВТ108, РВТ122 или T13F.
BG85832A 1987-02-27 1988-10-25 Метод за стабилна ген амплификация на хромозомнаднк на прокариотични микроорганизми BG60920B2 (bg)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
EP87200356 1987-02-27
PCT/NL1988/000006 WO1988006623A1 (en) 1987-02-27 1988-02-26 Stable gene amplification in chromosomal dna of prokaryotic microorganisms

Publications (1)

Publication Number Publication Date
BG60920B2 true BG60920B2 (bg) 1996-06-28

Family

ID=8197582

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
BG85832A BG60920B2 (bg) 1987-02-27 1988-10-25 Метод за стабилна ген амплификация на хромозомнаднк на прокариотични микроорганизми

Country Status (20)

Country Link
US (2) US5733723A (bg)
EP (1) EP0284126B1 (bg)
JP (1) JP2637532B2 (bg)
KR (1) KR970000188B1 (bg)
CN (1) CN1049247C (bg)
AU (1) AU620326B2 (bg)
BG (1) BG60920B2 (bg)
BR (1) BR8805646A (bg)
CA (1) CA1327175C (bg)
DE (1) DE3883041T2 (bg)
ES (1) ES2045081T3 (bg)
FI (1) FI104326B1 (bg)
HU (1) HUT50877A (bg)
IE (1) IE61743B1 (bg)
LT (1) LT4001B (bg)
LV (1) LV10791B (bg)
NO (1) NO300382B1 (bg)
PT (1) PT86863B (bg)
RU (1) RU2091487C1 (bg)
WO (1) WO1988006623A1 (bg)

Families Citing this family (33)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
ES2134186T3 (es) * 1987-02-27 1999-10-01 Genencor Int Clonaje molecular y expresion de genes que codifican enzimas proteoliticas.
JP2637532B2 (ja) * 1987-02-27 1997-08-06 ギスト ブロカデス ナームローゼ フェンノートチャップ 原核微生物の染色体ｄｎａにおける安定した遺伝子増幅
US4914031A (en) * 1987-04-10 1990-04-03 Amgen, Inc. Subtilisin analogs
US6287841B1 (en) 1988-02-11 2001-09-11 Genencor International, Inc. High alkaline serine protease
ES2095233T3 (es) * 1989-08-11 1997-02-16 Gist Brocades Nv Produccion eficaz de proteasa mutante.
US5695976A (en) * 1989-12-18 1997-12-09 Novo Nordisk A/S Stable integration of DNA in bacterial genomes
JP3046344B2 (ja) * 1990-10-24 2000-05-29 塩野義製薬株式会社 新規プロテアーゼ
WO1993010248A1 (en) * 1991-11-14 1993-05-27 Novo Nordisk A/S A PROCESS FOR EXPRESSING GENES IN $i(BACILLUS LICHENIFORMIS)
DE4216246A1 (de) * 1992-05-16 1993-11-18 Solvay Enzymes Gmbh & Co Kg Einfaches Verfahren zur stabilen chromosomalen Genamplifikation
US5395763A (en) * 1992-06-24 1995-03-07 Monsanto Company Chromosomal expression vector
DK153992D0 (da) * 1992-12-22 1992-12-22 Novo Nordisk As Metode
US5861273A (en) * 1993-12-21 1999-01-19 Celtrix Phamraceuticals, Inc. Chromosomal expression of heterologous genes in bacterial cells
US6723550B1 (en) 1997-07-15 2004-04-20 Genencor International, Inc. Proteases from gram-positive organisms
GB9724627D0 (en) 1997-11-20 1998-01-21 Genencor Int Bv Gram positive microorganism formate pathway
US6465186B1 (en) 1997-12-30 2002-10-15 Genecor International, Inc. Proteases from gram positive organisms
US6599731B1 (en) 1997-12-30 2003-07-29 Genencor International, Inc. Proteases from gram positive organisms
GB9727470D0 (en) 1997-12-30 1998-02-25 Genencor Int Bv Proteases from gram positive organisms
US6528255B1 (en) 1997-12-30 2003-03-04 Genencor International, Inc. Proteases from gram positive organisms
EP1062318B1 (en) * 1998-02-12 2004-04-28 Novozymes A/S A prokaryotic cell comprising two copies of a gene transcribed in different directions
US6100063A (en) * 1998-02-12 2000-08-08 Novo Nordisk A/S Procaryotic cell comprising at least two copies of a gene
US6156514A (en) * 1998-12-03 2000-12-05 Sunol Molecular Corporation Methods for making recombinant cells
US6544792B1 (en) 1999-12-21 2003-04-08 Genencor International, Inc. Production of secreted polypeptides
JP2004501651A (ja) * 2000-06-23 2004-01-22 ノボザイムス　アクティーゼルスカブ 遺伝子の安定した染色体多コピー組み込みのための方法
BRPI0416797A (pt) 2003-11-19 2007-04-17 Genencor Int serina proteases, ácidos nucléicos codificando enzimas de serina e vetores e células hospedeiras incorporando as mesmas
US7985569B2 (en) 2003-11-19 2011-07-26 Danisco Us Inc. Cellulomonas 69B4 serine protease variants
US20050227356A1 (en) * 2004-04-07 2005-10-13 Lessard Philip A Novel compositions and methods for genetic manipulation of Rhodococcus bacteria
WO2006065272A2 (en) * 2004-05-21 2006-06-22 Idaho Research Foundation, Inc. Methods for altering acetic acid production and enhancing cell death in bacteria
EP1766002B1 (en) * 2004-06-21 2015-11-18 Novozymes A/S Stably maintained multiple copies of at least two orf in the same orientation
US20080085535A1 (en) 2004-10-22 2008-04-10 Novozymes A/S Stable Genomic Integration of Multiple Polynucleotide Copies
DE102007021001A1 (de) 2007-05-04 2008-11-06 Ab Enzymes Gmbh Expressionssystem zur antibiotikafreien Produktion von Polypeptiden
CN103290048B (zh) * 2013-06-27 2015-07-15 天津科技大学 一种适用于芽孢杆菌属同源重组的质粒及工程菌
US11046732B2 (en) 2015-12-11 2021-06-29 Wacker Chemie Ag Microorganism strain and method for antibiotic-free, fermentative preparation of low molecular weight substances and proteins
CN114032189B (zh) * 2021-05-10 2024-02-06 盐城师范学院 一种降解木质素的融合子菌株r3及其应用

Family Cites Families (14)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US30602A (en) * 1860-11-06 Improvement in revolver fire-arms
GB1519148A (en) * 1974-11-19 1978-07-26 Gist Brocades Nv Compositions of matter
NO159863C (no) * 1980-01-07 1989-02-15 Univ Rochester Fremgangsm te for fremstilling og seleksjon av en rant bakteriofag som inneholder et genetisk fragment og koder for alfa-amylase, egnet for bruk i heterolog transformering av en bacillus-verts-mikroorganisme.
IL61982A (en) * 1980-02-15 1984-01-31 Cpc International Inc Genetically engineered microorganisms for massive production of amyloytic enzymes and process for preparing same using the corresponding recombinant dnas containing amylase coding genes
EP0074553A3 (en) * 1981-09-11 1985-01-09 The University Of Rochester Method of increasing the yield of a product by altering a microorganism
JPS59205983A (ja) * 1983-04-28 1984-11-21 ジエネツクス・コ−ポレイシヨン 異種遺伝子を原核微生物で発現させる方法
US4617266A (en) * 1983-04-28 1986-10-14 Genex Corporation Production of Protein A
NZ208612A (en) * 1983-06-24 1991-09-25 Genentech Inc Method of producing "procaryotic carbonyl hydrolases" containing predetermined, site specific mutations
EP0134048B2 (en) * 1983-07-06 1996-08-14 Gist-Brocades N.V. Molecular cloning and expression in industrial microorganism species
FR2563533B1 (fr) * 1984-04-27 1986-08-22 Centre Nat Rech Scient Procede d'amplification de l'expression d'un gene determine chez bacillus subtilis et souches obtenues
US4828994A (en) * 1984-09-21 1989-05-09 Genex Corporation Bacillus strains with reduced extracellular protease levels
FR2582316B1 (fr) * 1985-05-22 1988-12-02 Centre Nat Rech Scient Vecteurs d'expression de l'a-amylase dans bacillus subtilis, souches obtenues et procede de preparation d'a-amylase
EP0254735B2 (en) * 1986-01-15 1998-06-17 Amgen Inc. METHOD FOR PRODUCTION OF THERMALLY STABLE AND pH STABLE SUBTILISIN ANALOGS
JP2637532B2 (ja) * 1987-02-27 1997-08-06 ギスト ブロカデス ナームローゼ フェンノートチャップ 原核微生物の染色体ｄｎａにおける安定した遺伝子増幅

Also Published As

Publication number Publication date
EP0284126B1 (en) 1993-08-11
JP2637532B2 (ja) 1997-08-06
KR970000188B1 (en) 1997-01-06
JPH01502398A (ja) 1989-08-24
WO1988006623A1 (en) 1988-09-07
DE3883041T2 (de) 1994-01-20
EP0284126A1 (en) 1988-09-28
KR890700664A (ko) 1989-04-26
ES2045081T3 (es) 1994-01-16
CA1327175C (en) 1994-02-22
RU2091487C1 (ru) 1997-09-27
IE61743B1 (en) 1994-11-30
NO884422D0 (no) 1988-10-05
DE3883041D1 (de) 1993-09-16
LV10791B (en) 1995-12-20
US6124097A (en) 2000-09-26
PT86863B (pt) 1992-05-29
FI884903A (fi) 1988-10-24
AU620326B2 (en) 1992-02-20
BR8805646A (pt) 1989-10-17
LT4001B (en) 1996-06-25
IE880558L (en) 1988-08-27
FI104326B (fi) 1999-12-31
PT86863A (pt) 1988-03-01
HUT50877A (en) 1990-03-28
CN1030787A (zh) 1989-02-01
FI884903A0 (fi) 1988-10-24
US5733723A (en) 1998-03-31
NO300382B1 (no) 1997-05-20
AU1398188A (en) 1988-09-26
NO884422L (no) 1988-10-05
FI104326B1 (fi) 1999-12-31
LV10791A (lv) 1995-08-20
LTIP1826A (en) 1995-08-25
CN1049247C (zh) 2000-02-09

Similar Documents

Publication Publication Date Title
BG60920B2 (bg) Метод за стабилна ген амплификация на хромозомнаднк на прокариотични микроорганизми
FI119028B (fi) Menetelmä alkalofiilisten Bacillus-kantojen transformoimiseksi
FI85287B (fi) Molekulaer kloning och expression i industriella mikro-organismarter.
US5843720A (en) Introduction of DNA into bacillus strains by conjugation
EP0127328A2 (en) The use of chromosomal integration to stabilize heterologous genes
EP0479396A2 (en) Transformation of alkalophilic bacillus strains
US5716807A (en) Transformed industrial bacillus strains and methods for making and using them
US5238833A (en) Molecular cloning and expression in industrial Bacillus species
EP0900271B1 (en) Bacterial donor cell useful in conjugation
US6770475B1 (en) Promoters
JP2002508669A (ja) 所望の遺伝子の複数コピー、及び選択マーカーではなく、スクリーニング可能マーカーを含むタンパク質産生細胞
US5763187A (en) Bacterial donor cell useful in conjugation
WO1997026361A9 (en) Bacterial donor cell useful in conjugation